RS63836B1 - Proizvodi i sastavi - Google Patents

Proizvodi i sastavi

Info

Publication number
RS63836B1
RS63836B1 RS20221162A RSP20221162A RS63836B1 RS 63836 B1 RS63836 B1 RS 63836B1 RS 20221162 A RS20221162 A RS 20221162A RS P20221162 A RSP20221162 A RS P20221162A RS 63836 B1 RS63836 B1 RS 63836B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleic acid
strand
deoxy
nucleotide
modified
Prior art date
Application number
RS20221162A
Other languages
English (en)
Inventor
Judith Hauptmann
Dmitry Samarsky
Christian Frauendorf
Original Assignee
Silence Therapeutics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=61899311&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63836(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB1707203.4A external-priority patent/GB201707203D0/en
Priority claimed from GBGB1708397.3A external-priority patent/GB201708397D0/en
Application filed by Silence Therapeutics Gmbh filed Critical Silence Therapeutics Gmbh
Publication of RS63836B1 publication Critical patent/RS63836B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na proizvode i sastave i njihovu upotrebu. Pronalazak se posebno odnosi na proizvode nukleinske kiseline koji ometaju ekspresiju gena ili inhibiraju njegovu ekspresiju i terapeutske upotrebe kao što je za lečenje bolesti i poremećaja.
Pozadina
[0002] Pokazalo se da dvolančana RNK (dsRNK) blokira ekspresiju gena (Fire i dr., 1998 i Elbashir i dr., 2001) i to je nazvano interferencija RNK (RNKi). Kratke dsRNK usmeravaju gen-specifično, posttranskripciono utišavanje u mnogim organizmima, uključujući kičmenjake, i obezbedile su novi alat za proučavanje funkcije gena. RNKi je posredovan RNK-indukovanim kompleksom utišavanja (RISC), nukleazom specifičnom za sekvencu, višekomponentnom nukleazom koja uništava RNK glasnika homologne okidaču za utišavanje. Interferirajuća RNK (iRNK) kao što su nukleinska kiselina, antisens RNK i mikro-RNK su oligonukleotidi koji sprečavaju stvaranje proteina utišavanjem gena, tj. inhibiranjem translacije gena proteina. Sredstva za utišavanje gena postaju sve važnija za terapeutsku primenu u medicini.
[0003] Međutim, isporuka nukleinskih kiselina, kao što je RNK, u ćelije izbegavajući degradaciju ćelijskim nukleazama, uz održavanje efikasnosti i specifičnosti cilja, pokazala se izazovnom za one u oblasti razvoja molekula nukleinske kiseline za terapeutsku upotrebu.
[0004] Prema Watts i Corey in the Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379) postoje algoritmi koji se mogu koristiti za dizajniranje nukleinske kiseline, ali nijedan nije savršen. Za identifikaciju moćne nukleinske kiseline mogu biti potrebne različite eksperimentalne metode, pošto algoritmi ne uzimaju u obzir faktore kao što su tercijarna struktura ili učešće proteina koji vezuju RNK. Stoga je otkriće moćne nukleinske kiseline sa minimalnim efektima van cilja kompleksan proces, ali neophodan da bi se farmaceutski razvoj ovih visoko naelektrisanih molekula sintetizovao ekonomično, distribuirao u ciljna tkiva, ušao u ćelije i funkcionisao u okviru prihvatljivih granica toksičnosti. Stoga, sredstva za efikasnu isporuku oligonukleotida, posebno dvolančanih siRNK, u ćelije in vivo postaju sve važnija i zahtevaju specifično ciljanje i značajnu zaštitu od vanćelijskog okruženja, posebno serumskih proteina. Jedan postupak za postizanje specifičnog ciljanja je konjugacija ciljane grupe na sredstvo iRNK dupleksa. Ciljna grupa pomaže u ciljanju iRNK dupleks agensa na traženo ciljno mesto i postoji potreba da se dizajniraju odgovarajući ciljani delovi za željena mesta receptora za konjugovane molekule koje će preuzeti ćelije kao što je endocitoza.
[0005] Međutim, ciljani ligandi koji su do sada razvijeni ne prevode se uvek na in vivo postavljanje i postoji jasna potreba za efikasnijim iRNK dupleks agensima konjugovanim sa ligandom specifičnim za receptor i postupcima za njihovu pripremu za in vivo isporuku oligonukleotidnih terapeutika, nukleinskih kiselina i dvolančanih siRNK.
[0006] Umesto samog sistema za isporuku lipida, predmetni pronalazak se bavi strukturom same nukleinske kiseline.
[0007] Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu za inhibiciju ekspresije ciljnog gena u ćeliji, koja obuhvata najmanje jedan dupleks region koji sadrži najmanje deo prvog lanca i najmanje deo drugog lanca koji je bar delimično komplementaran prvom lancu, pri čemu je navedena prva nit barem delimično komplementarana najmanje delu RNK transkribovanog sa navedenog ciljnog gena,
pri čemu su svi nukleotidi nukleinske kiseline modifikovani na 2' poziciji šećera, pri čemu su pozicije 2 i 14 na prvom lancu počevši od 5' kraja modifikovani sa 2' fluoro,
pri čemu je nukleinska kiselina modifikovana na prvom lancu sa naizmeničnim 2' O-metil modifikacijama i 2' fluoro modifikacijama, i
pri čemu je druga nit modifikovana sa 2' fluoro modifikacijama na pozicijama 11-13, računajući od 3' kraja počevši od prve pozicije dvostrukog lanca regiona, a preostale modifikacije su 2' O-metil modifikacije.
[0008] Prva i druga nit mogu biti odvojene niti.
[0009] Nukleinska kiselina može da sadrži jednu nit koja obuhvata prvu nit i drugu nit.
[0010] Svaka prva nit i/ili pomenuta druga nit mogu biti dužine od 17-35 nukleotida, a najmanje jedan dupleks region može biti dužine od 10-25 nukleotida. Dupleks može da se sastoji od dve odvojene niti ili može da sadrži jednu nit koja se sastoji iz prve i druge niti.
[0011] U jednom aspektu, druga nit može biti kratka od 11 nukleotida u dužini, kao što je 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nukleotida ili više.
[0012] Nukelinska kiselina može: a) biti otvorena na oba kraja; b) na jednom kraju imati prepust, a na drugom otvoren kraj; ili c) imaju prepust na oba kraja.
[0013] Nukleinska kiselina pronalaska može da sadrži fosforotioatnu vezu između terminalnog jednog, dva ili tri 3' nukleotida i/ili jednog dva ili tri 5' nukleotida prve i/ili druge niti. Može da sadrži dve fosforotioatne veze između svakog od tri terminalna 3' i između svakog od tri terminalna 5' nukleotida na prvoj niti, i dve fosforotioatne veze između tri terminalna nukleotida 3' kraja druge niti.
[0014] Takva nukleinska kiselina može biti konjugovana sa ligandom.
[0015] Pronalazak dalje obezbeđuje nukleinsku kiselinu za inhibiciju ekspresije ciljnog gena u ćeliji, koja obuhvata najmanje jedan dupleks region koji obuhvata najmanje deo prve niti i najmanje deo drugog lanca koji je bar delimično komplementaran sa prvom niti, pri čemu je navedena prva nit barem delimično komplementarna sa najmanje delom RNK transkribovane sa navedenog ciljnog gena, pri čemu navedena prva nit uključuje modifikovane nukleotide ili nemodifikovane nukleotide na više pozicija kako bi se olakšala obrada nukleinske kiseline pomoću RISC, i pri čemu je nukleotidna sekvenca konjugovana sa ligandom.
[0016] Ligand može da sadrži (i) jedan ili više N-acetil galaktozamin (GalNac) ostataka i njihovih derivata, i (ii) veznik, pri čemu veznik konjuguje GalNac delove u sekvencu kao što je definisano u bilo kom od prethodnih aspekata. Veznik može biti dvovalentna ili trovalentna ili tetravalentna razgranata struktura. Nukleotidi mogu biti modifikovani kako je ovde definisano.
[0017] Ligand može da sadrži formulu I:
[S-X<1>-P-X<2>]3-A-X<3>- (I)
gde:
S predstavlja saharid, pri čemu je saharid N-acetil galaktozamin;
X<1>predstavlja C3-C6alkilen ili (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- gde je m 1, 2 ili 3;
P je fosfat ili modifikovani fosfat (poželjno tiofosfat);
X<2>je alkilen ili alkilen etar formule (-CH2)n-O-CH2- gde je n = 1- 6;
A je razgranata jedinica;
X<3>predstavlja jedinicu za premošćivanje;
pri čemu je nukleinska kiselina prema predmetnom pronalasku konjugovana sa X<3>preko fosfata ili modifikovanog fosfata (poželjno tiofosfata).
[0018] Predmetni pronalazak stoga dodatno obezbeđuje konjugovanu nukleinsku kiselinu koja ima jednu od sledećih struktura
gde Z predstavlja nukleinsku kiselinu kako je ovde ranije definisano.
[0019] Ligand može sadržati
[0020] Pronalazak takođe obezbeđuje sastav koji sadrži nukleinsku kiselinu ili konjugovanu nukleinsku kiselinu kako je ovde definisano i fiziološki prihvatljiv ekscipijens. Sastav može da sadrži sledeće ekscipijense:
i) katjonski lipid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;
ii) steroid;
iii) fosfatidiletanolamin fosfolipid;
iv) PEGilovani lipid.
[0021] Sadržaj katjonske lipidne komponente u sastavu može biti od oko 55 mol% do oko 65 mol% ukupnog sadržaja lipida u lipidnoj formulaciji, poželjno oko 59 mol% ukupnog sadržaja lipida u lipidnom sastavu.
[0022] Sastav može da sadrži katjonski lipid koji ima strukturu
steroid koji ima strukturu
fosfatidiletanolamin fosfolipid koji ima strukturu
I PEGilovani lipid koji ima strukturu
[0023] Takođe je obelodanjen postupak pravljenja nukleinske kiseline ili konjugovane nukleinske kiseline prema pronalasku.
Detaljni opis
[0024] Predmetni pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja je dvolančana i usmerena na eksprimirani RNK transkript ciljnog gena i njegovog sastava. Ove nukleinske kiseline se mogu koristiti u lečenju raznih bolesti i poremećaja gde je poželjna smanjena ekspresija ciljanog genskog proizvoda.
[0025] Pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu za inhibiciju ekspresije ciljnog gena u ćeliji, kao što je opisano u patentnim zahtevima.
[0026] Pod nukleinskom kiselinom podrazumeva se nukleinska kiselina koja se sastoji iz dva lanca koji sadrže nukleotide, koja je u stanju da ometa ekspresiju gena. Inhibicija može biti potpuna ili delimična i rezultira smanjenjem regulacije ekspresije gena na ciljani način. Nukleinska kiselina se sastoji od dva odvojena polinukleotidna lanca; prva nit, koja može biti i vodič; i druga nit, koja takođe može biti putnička. Prva nit i druga nit mogu biti deo istog polinukleotidnog lanca koji je samo-komplementaran i koji se 'savija' da bi formirao dvolančani molekul. Nukleinska kiselina može biti molekul siRNK.
[0027] Nukleinska kiselina može da sadrži ribonukleotide, modifikovane ribonukleotide, deoksinukleotide, deoksiribonukleotide ili nukleotidne analoge. Nukleinska kiselina može dalje da sadrži dvolančani deo nukleinske kiseline ili dupleks region formiran od cele ili dela prve niti (takođe poznate u tehnici kao vodeća nit) i cele ili dela druge niti (takođe poznate u umetnost kao putnička nit). Dupleks region se definiše kao početak sa prvim baznim parom formiranim između prve i druge niti i završavajući poslednjim baznim parom formiranim između prve niti i druge niti, uključujući.
[0028] Pod dupleks regionom se podrazumeva region u dva komplementarna ili suštinski komplementarna oligonukleotida koji formiraju parove baza jedan sa drugim, bilo Watson-Crick baznim uparivanjem ili bilo kojim drugim načinom koji dozvoljava dupleks između oligonukleotidnih lanaca koji su komplementarni ili suštinski komplementarni. Na primer, oligonukleotidni lanac koji ima 21 nukleotidnu jedinicu može da upari bazni par sa drugim oligonukleotidom od 21 nukleotidne jedinice, ali je samo 19 nukleotida na svakom lancu komplementarno ili suštinski komplementarno, tako da se „dupleks region“ sastoji od 19 parova. Preostali parovi baza mogu postojati kao 5' i 3' prepusti, ili kao regioni sa jednom niti. Dalje, unutar dupleks regiona, 100% komplementarnost nije potrebna; značajna komplementarnost je dozvoljena unutar dupleks regiona. Značajna komplementarnost se odnosi na komplementarnost između niti tako da su sposobni za prekaljivanje u biološkim uslovima. Tehnike za empirijski određivanje da li su dva lanca sposobna za prekaljivanje u biološkim uslovima dobro su poznate u struci. Alternativno, dva lanca se mogu sintetizovati i dodati zajedno u biološkim uslovima da bi se utvrdilo da li se spajaju jedan sa drugim.
[0029] Deo prve niti i druge niti koji formiraju najmanje jedan dupleks region mogu biti potpuno komplementarni i bar delimično komplementarni jedan drugom.
[0030] U zavisnosti od dužine nukleinske kiseline, savršeno podudaranje u smislu komplementarnosti baza između prvog i drugog lanca nije neophodno. Međutim, prva i druga nit moraju biti u stanju da se hibridizuju u fiziološkim uslovima.
[0031] Komplementarnost između prve niti i druge niti u najmanje jednom dupleks regionu može biti savršena u tome što nema nepodudaranja nukleotida ili dodatnih/izbrisanih nukleotida u obe niti.
Alternativno, komplementarnost možda nije savršena. Komplementarnost može biti najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%.
[0032] Svaka prva nit i druga nit mogu da sadrže region komplementarnosti koji sadrži najmanje 15 susednih nukleotida.
[0033] Nukleinska kiselina uključuje formiranje dupleks regiona između celog ili dela prvog lanca i dela ciljne nukleinske kiseline. Deo ciljne nukleinske kiseline koji formira dupleks region sa prvom niti, definisan kao početak sa prvim baznim parom formiranim između prve niti i ciljne sekvence i završavajući poslednjim baznim parom formiranim između prve niti i ciljne sekvence, uključujući, je ciljna sekvenca nukleinske kiseline ili jednostavno, ciljna sekvenca. Dupleks region formiran između prve niti i druge niti ne mora biti isti kao dupleks region formiran između prvog lanca i ciljne sekvence. To jest, druga nit može imati sekvencu različitu od ciljne sekvence, međutim, prva nit mora biti u stanju da formira dupleks strukturu i sa drugom niti i sa ciljnom sekvencom.
[0034] Komplementarnost između prve niti i ciljne sekvence može biti savršena (nema neusklađenosti nukleotida ili dodatnih/deletiranih nukleotida u bilo kojoj nukleinskoj kiselini).
[0035] Komplementarnost između prve niti i ciljne sekvence možda nije savršena. Komplementarnost može biti najmanje 70%, 80%, 85%, 90% ili 95%.
[0036] Identitet između prve niti i komplementarne sekvence ciljne sekvence može biti najmanje 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%, pod uslovom da je nukleinska kiselina sposobna da redukuje ili inhibira ekspresiju ciljnog gena.
[0037] Nukleinska kiselina može biti u stanju da smanji ekspresiju ciljnog gena za najmanje 25%, 50% ili 75% uporedne nukleinske kiseline sa savršenim identitetom sa prvom niti i ciljnom sekvencom.
[0038] Nukleinska kiselina može da sadrži prvu nit i drugu nit od kojih svaki ima dužinu od 17-35 ili 19-25 nukleotida. Prva i druga nit mogu biti različite dužine.
[0039] Nukleinska kiselina može biti dugačka 15-25 parova nukleotida. Nukleinska kiselina može biti dugačka 17-23 parova nukleotida. Nukleinska kiselina može biti dugačka 17-25 parova nukleotida.
Nukleinska kiselina može biti dugačka 23-24 parova nukleotida. Nukleinska kiselina može biti dugačka 19-21 parova nukleotida. Nukleinska kiselina može biti dugačka 21-23 parova nukleotida.
[0040] Nukleinska kiselina može da sadrži dupleks region koji se sastoji od 19-25 parova nukleotidnih baza. Dupleks region se može sastojati od 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 parova baza koji mogu biti susedni.
[0041] Nukleinska kiselina može imati otvoreni kraj na oba kraja; na jednom kraju ima prepust, a na drugom otvoren kraj; ili ima prepust na oba kraja.
[0042] "Prepust" kako se ovde koristi ima svoje normalno i uobičajeno značenje u struci, tj. deo nukleinske kiseline sa jednom niti koji se proteže izvan terminalnog nukleotida komplementarne niti u dvolančanoj nukleinskoj kiselini. Termin "otvoreni kraj" uključuje dvolančanu nukleinsku kiselinu pri čemu se obe niti završavaju na istoj poziciji, bez obzira na to da li su terminalni nukleotidi bazno upareni. Završni nukleotid prve niti i druge niti na otvorenom kraju mogu biti bazno upareni. Završni nukleotid prve niti i druge niti na otvorenom kraju ne moraju biti bazno upareni. Dva terminalna nukleotida prve niti i druge niti na otvorenom kraju mogu biti bazno upareni. Dva terminalna nukleotida prve niti i druge niti na otvorenom kraju ne moraju biti upareni.
[0043] Nukleinska kiselina može imati prepust na jednom kraju i otvoren kraj na drugom. Nukleinska kiselina može imati prepust na oba kraja. Nukleinska kiselina može imati otvoreni kraj na oba kraja.
Nukleinska kiselina može imati otvoreni kraj na kraju sa 5'-krajem prve niti i 3'-krajem druge niti ili na 3'-kraju prve niti i 5'-krajem druge niti.
[0044] Nukleinska kiselina može da sadrži prepust na 3'- ili 5'-kraju. Nukleinska kiselina može imati 3'-prepust na prvoj niti. Nukleinska kiselina može imati 3'-prepust na drugoj niti. Nukleinska kiselina može imati 5'-prepust na prvoj niti. Nukleinska kiselina može imati 5'-prepust na drugoj niti. Nukleinska kiselina može imati prepust i na 5'-kraju i na 3'-kraju prve niti. Nukleinska kiselina može imati prepust i na 5'-kraju i na 3'-kraju druge niti. Nukleinska kiselina može imati 5' prepust na prvoj niti i 3' prepust na drugoj niti. Nukleinska kiselina može imati 3' prepust na prvoj niti i 5' prepust na drugoj niti. Nukleinska kiselina može imati 3' prepust na prvoj niti i 3' prepust na drugoj niti. Nukleinska kiselina može imati 5' prepust na prvoj niti i 5' prepust na drugoj niti.
[0045] Prepust na 3'-kraju ili 5' kraju druge niti ili prve niti može biti izabran između dužine 1, 2, 3, 4 i 5 nukleotida. Opciono, prepust se može sastojati od 1 ili 2 nukleotida, koji mogu, ali i ne moraju biti modifikovani.
[0046] Nemodifikovani polinukleotidi, posebno ribonukleotidi, mogu biti skloni degradaciji ćelijskim nukleazama, i, kao takvi, modifikovani nukleotidi su uključeni u nukleinsku kiselinu pronalaska.
[0047] Nukleotidi nukleinske kiseline pronalaska su modifikovani najmanje kako je navedeno u patentnim zahtevima.
[0048] Modifikacije nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska generalno obezbeđuju moćno sredstvo za prevazilaženje potencijalnih ograničenja uključujući, ali ne ograničavajući se na, in vitro i in vivo stabilnost i biodostupnost svojstvenu prirodnim RNK molekulima. Modifikovana nukleinska kiselina takođe može da minimizira mogućnost indukovanja aktivnosti interferona kod ljudi. Modifikacija može dodatno poboljšati funkcionalnu isporuku nukleinske kiseline u ciljnu ćeliju.
[0049] Nukleinska kiselina može da sadrži nukleotid koji sadrži modifikovani nukleotid, pri čemu je baza izabrana između 2-aminoadenozina, 2,6-diaminopurina,inozina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenila, pseudouracila, 2, 4, 6-trimetoksi benzena, 3-metil uracila, dihidrouridina, naftila, aminofenila, 5-alkilcitidina (npr., 5-metilcitidina), 5-alkiluridina (npr., ribotimidina), 5-halouridina (npr., 5-bromouridina), 6-azapirimidina, 6-alkilpirimidina (npr.6-metiluridina), propina, kesozina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, vibutozina, vibutoksozina, 4-acetilcitidina, 5-(karboksihidroksimetil)uridina, 5'-karboksimetilaminometil-2-tiouridina, 5-karboksimetilaminometiluridina, beta-D-galaktosilkeozina, 1-metiladenozina, 1-metilinozina, 2,2-dimetilguanozina, 3-metilcitidina, 2-metiladenozina, 2-metilguanozina, N6-metiladenozina, 7-metilguanosina, 5-metoksiaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilkarbonilmetiluridina, 5-metiloksiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-izopenteniladenozina, beta-D-manosilkeozina, uridin-5-oksisirćetne kiseline i 2-tiocitidina. Nemodifikovana RNK se odnosi na molekul u kome su komponente nukleinske kiseline, odnosno šećeri, baze i fosfatni delovi, iste ili suštinski iste kao one koje se javljaju u prirodi, na primer, koje se prirodno javljaju u ljudskom telu. Modifikovani nukleotid kako se ovde koristi odnosi se na nukleotid u kome se jedna ili više komponenti nukleinske kiseline, naime šećeri, baze i fosfatni delovi, razlikuju od onih koji se javljaju u prirodi. Iako se pominju kao modifikovani nukleotidi, oni će naravno, zbog modifikacije, uključivati molekule koji nisu nukleotidi, na primer polinukleotidne molekule u kojima je ribofosfatni glavni lanac zamenjen neribofosfatnom konstrukcijom koja omogućava hibridizaciju između niti, tj. modifikovani nukleotidi oponašaju ribofosfatni glavni lanac.
[0050] Mnoge od ispod opisanih modifikacija koje se dešavaju unutar nukleinske kiseline će se ponoviti unutar polinukleotidnog molekula, kao što je modifikacija baze, ili fosfatnog dela, ili a ne vezujućeg O
1
fosfatnog dela. U nekim slučajevima će se modifikacija desiti na svim mogućim pozicijama/nukleotidima u polinukleotidu, ali u mnogim slučajevima neće. Modifikacija se može desiti samo na 3' ili 5' terminalnoj poziciji, može se desiti samo u krajnjim regionima, kao što je pozicija na terminalnom nukleotidu ili u poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija se može desiti u dvolančanom regionu, jednolančanom regionu ili u oba. Modifikacija se može desiti samo u dvolančanom regionu nukleinske kiseline pronalaska ili se može pojaviti samo u jednolančanom regionu nukleinske kiseline pronalaska.
Fosforotioatna modifikacija na ne vezujućoj O poziciji može se desiti samo na jednom ili oba kraja, može se pojaviti samo u terminalnom regionu, npr., na poziciji na terminalnom nukleotidu ili u poslednjih 2, 3, 4 ili 5 nukleotida lanac, ili se može pojaviti u dupleksu i/ili u jednolančanim regionima, posebno na krajevima.5' kraj ili 3' krajevi mogu biti fosforilovani.
[0051] Stabilnost nukleinske kiseline prema pronalasku može se povećati uključivanjem određenih baza u prepuste, ili uključivanjem modifikovanih nukleotida, u pregrade od jedne niti, npr., u 5' ili 3' prepustu, ili u oba. Purinski nukleotidi mogu biti uključeni u prepuste. Sve ili neke od osnova u prepustu od 3' ili 5' mogu biti modifikovane. Modifikacije mogu uključiti upotrebu modifikacija na 2' OH grupi riboze šećera, upotrebu deoksiribonukleotida, umesto ribonukleotida, i modifikacije u fosfatnoj grupi, kao što su fosfotioatne modifikacije. Prepusti ne moraju biti homologni sa ciljnom sekvencom.
[0052] 5'- ili 3'- prepusti na prvoj nit, drugoj niti ili obe niti sredstva dsRNK prema pronalasku mogu biti fosforilovani. U nekim otelotvorenjima, region prepusta sadrži dva nukleotida koji imaju fosforotioat između dva nukleotida, pri čemu dva nukleotida mogu biti ista ili različita. U jednom otelotvorenju, prepust je prisutan na 3'-kraju prve niti, druge niti ili obe niti. U jednom otelotvorenju, ovaj 3'-prepust je prisutan u prvoj niti. U jednom otelotvorenju, ovaj 3'-prepust je prisutan u drugoj niti.
[0053] Nukleaze mogu da hidrolizuju fosfodiestarske veze nukleinske kiseline. Međutim, hemijske modifikacije nukleinskih kiselina mogu dati poboljšana svojstva i mogu učiniti oligoribonukleotide stabilnijim na nukleaze.
[0054] Modifikovane nukleinske kiseline, kako se ovde koriste, mogu uključivati jednu ili više od:
(i) izmena, npr., zamena, jednog ili oba nevezana fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezanih fosfat kiseonika (koji se nazivaju povezivanje čak i ako su na 5' i 3' kraju nukleinske kiseline kiselina prema pronalasku);
(ii) izmena, npr., zamena, sastojka šećera riboze, npr., 2' hidroksila na šećeru riboze;
(iii) zamena fosfatnog dela sa "defosfo" veznicima;
(iv) modifikacija ili zamena baze koja se javlja u prirodi;
(v) zamena ili modifikacija riboza-fosfatnog glavnog lanca;
(vi) modifikacija 3' kraja ili 5' kraja RNK, npr., uklanjanje, modifikacija ili zamena krajnje fosfatne grupe ili konjugacija ostatka, npr., fluorescentno obeleženog dela, na 3' ili 5' kraju RNK.
[0055] Termini zamena, modifikacija, izmena ukazuju na razliku od prirodnog molekula.
[0056] Konkretne modifikacije su detaljnije razmotrene u nastavku.
[0057] Primeri modifikovanih fosfatnih grupa uključuju fosforotioate, fosforoselenoat, borano fosfate, borano fosfatne estre, vodonik fosfonate, fosforoamidat, alkil ili aril fosfonat i fosfotriest. Fosforoditioati imaju oba nevezujuća kiseonika zamenjena sumporom. Jedan, svaki ili oba nevezujuća kiseonika u fosfatnoj grupi mogu biti nezavisno bilo koji od S, Se, B, C, H, N ili OR (R je alkil ili aril).
[0058] Fosfatni veznik se takođe može modifikovati zamenom veznog kiseonika azotom (premošćeni fosforoamidati), sumporom (premošćeni fosforotioati) i ugljenikom (premošćeni metilenfosfonati). Zamena se može desiti na terminalnom kiseoniku. Moguća je zamena nevezujućih kiseonika sa azotom.
[0059] Šećerna grupa takođe može da sadrži jedan ili više ugljenika koji imaju suprotnu stereohemijsku konfiguraciju od one odgovarajućeg ugljenika u ribozi. Dakle, modifikovani nukleotidi mogu sadržati šećer kao što je arabinoza.
[0060] Modifikovani nukleotidi mogu takođe uključiti "abazične" šećere, kojima nedostaje nukleobaza na C-I'. Ovi abazični šećeri mogu dalje da sadrže modifikacije na jednom ili više konstitutivnih atoma šećera.
[0061] 2' modifikacije se mogu koristiti u kombinaciji sa jednom ili više modifikacija fosfatnog veznika (npr.
fosforotioat).
[0062] Fosfatna grupa se može zameniti konektorima koji ne sadrže fosfor.
[0063] Primeri ostataka koji mogu da zamene fosfatnu grupu uključuju siloksan, karbonat, karboksimetil, karbamat, amid, tioetar, etilen oksid veznik, sulfonat, sulfonamid, tioformacetal, formacetal, oksim, metileneminimino, metilemetiletilimino, metilemetiletilimino, metiletilnemetilimino. U određenim otelotvorenjima, zamene mogu uključivati metilenkarbonilamino i metilenmetilimino grupe.
[0064] Fosfatni veznik i riboza šećer mogu biti zamenjeni nukleotidima otpornim na nukleazu.
[0065] Primeri uključuju surogate nukleozida mofilino, ciklobutil, pirolidin i peptidne nukleinske kiseline (PNA). U određenim otelotvorenjima, PNA surogati se mogu koristiti.
[0066] 3' i 5' krajevi oligonukleotida mogu biti modifikovani. Takve modifikacije mogu biti na 3' kraju ili 5' kraju ili na oba kraja molekula. Oni mogu uključiti modifikaciju ili zamenu celog terminalnog fosfata ili jednog ili više atoma fosfatne grupe. Na primer, 3' i 5' krajevi oligonukleotida mogu biti konjugovani sa drugim funkcionalnim molekularnim entitetima kao što su obeleživači, npr., fluorofori (npr., piren, TAMRA, fluorescein, Cy3 ili Cy5 boje) ili zaštitne grupe (na bazi npr., sumpora, silicijuma, bora ili estara).
Funkcionalni molekularni entiteti mogu biti vezani za šećer preko fosfatne grupe i/ili veznika. Terminalni atom veznika može da se poveže sa ili da zameni vezni atom fosfatne grupe ili C-3' ili C-5' O, N, S ili C grupe šećera. Alternativno, veznik se može povezati sa ili zameniti terminalni atom nukleotidnog surogata (npr., PNA). Ovi distanceri ili veznici mogu uključivati npr., -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, - (CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH (e.g., n=3 ili 6), abazični šećeri, amid, karboksi, amin, oksiamin, oksiimin, tioetar, disulfid, tiourea, sulfonamid ili morfolino, ili reagensi za biotin i fluorescein.3' kraj može biti -OH grupa.
[0067] Drugi primeri krajnjih modifikacija uključuju boje, interkalirajuće agense (npr., akridini), unakrsne veznike (npr., psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, safirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr., EDTA), lipofilne nosače (npr., holesterol, holična kiselina, adamantane sirćetna kiselina, 1-piren maslačna kiselina, dihidrotestosteron, 1,3-bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupa, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-heksadetilpal grupa kiselina, miristinska kiselina, O3-(oleoil)litoholna kiselina, O3-(oleoil)holenska kiselina, dimetoksitritil ili fenoksazin) i konjugati peptida (npr., PEG (npr., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioaktivno obeleženi markeri, enzimi, hapteni (npr. biotin), olakšivači transporta/apsorpcije (npr., aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr., imidazol, bisimidazol, histamin, imidazol konjuga-imidazol klasteri, klasteri imidazola, amidazolina Eu<3+>kompleksi tetraazamakrociklusa).
[0068] Modifikacije terminala mogu se dodati iz više razloga, uključujući modulaciju aktivnosti ili modulaciju otpornosti na degradaciju. Terminalne modifikacije korisne za modulaciju aktivnosti uključuju modifikaciju 5' kraja pomoću fosfata ili fosfatnih analoga. Nukleinske kiseline pronalaska, na prvom ili drugom lancu, mogu biti 5' fosforilisane ili da uključuju fosforil analog na 5' primarnom terminusu.5'-fosfatne modifikacije uključuju one koje su kompatibilne sa RISC posredovanim utišavanjem gena.
Odgovarajuće modifikacije uključuju: 5'-monofosfat ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-difosfat ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfat ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-guanozin kapa (7-metilovana ili nemetilovana) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-adenozinska kapa (Appp), i svaka modifikovana ili nemodifikovana struktura nukleotidne kape (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfat (fosforotioat; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfat (fosforoditioat; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-fosforotiolat ((HO)2(O)P-S-5'); bilo koja dodatna kombinacija kiseonika/sumpora zamenjena monofosfatom, difosfatom i trifosfatom (npr., 5'-alfa-tiotrifosfat, 5'-gama-tiotrifosfat, itd.), 5'-fosforamidati ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-alkilfosfonati (R=alkil=metil, etil, izopropil, propil, itd., npr., RP(OH)(O)-O-5'-,
[0069] (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'vinilfosfonat, 5'-alkileterfosfonati (R=alkiletar=metoksimetil (MeOCH2-), etoksimetil, itd., npr., RP(OH)(O)-O-5'-).
[0070] Nukleinska kiselina predmetnog pronalaska može uključivati jednu ili više fosforotioatnih modifikacija na jednom ili više krajnjih krajeva prvog i/ili drugog lanca. Opciono, svaki ili bilo koji kraj prvog lanca može da sadrži jedan ili dva ili tri fosforotioatom modifikovana nukleotida. Opciono, svaki ili bilo koji kraj drugog lanca može da sadrži jedan ili dva ili tri fosforotioatom modifikovana nukleotida.
Opciono, oba kraja prvog lanca i 5' kraj drugog lanca mogu da sadrže dva fosforotioatom modifikovana nukleotida. Pod nukleotidom modifikovanim fosforotioatom podrazumeva se da veza između nukleotida i susednog nukleotida sadrži fosforotioatnu grupu umesto standardne fosfatne grupe.
[0071] Modifikacije terminala takođe mogu biti korisne za praćenje distribucije, i u takvim slučajevima grupe koje treba dodati mogu uključivati fluorofore, npr., fluorscein ili Aleksa boju. Terminalne modifikacije takođe mogu biti korisne za poboljšanje apsorpcije, korisne modifikacije za ovo uključuju holesterol.
Terminalne modifikacije takođe mogu biti korisne za umrežavanje RNK sredstva sa drugim delom.
[0072] Adenin, gvanin, citozin i uracil su najčešće baze koje se nalaze u RNK. Ove baze se mogu modifikovati ili zameniti da bi se obezbedila poboljšana svojstva RNK. Npr., oligoribonukleotidi otporni na nukleazu mogu se pripremiti sa ovim bazama ili sa sintetičkim i prirodnim nukleobazama (npr., inozin, timin, ksantin, hipoksantin, nubularin, izogvanizin ili tubercidin) i bilo kojom od iznad navedenih modifikacija. Alternativno, mogu se koristiti supstituisani ili modifikovani analozi bilo koje od gornjih baza i "univerzalnih baza". Primeri uključuju 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivate adenina i gvanina, 2-propil i i drugi alkil derivati adenina i gvanina, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 5-halouracil, 5-(2-aminopropil)uracil, 5-amino alil uracil, 8-halo, amino, tiol, tioalkil, hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i gvanine, 5-trifluorometil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilgvanin, 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenine, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin, dihidrouracil, 3-deaza-5-azacitozin, 2-aminopurin, 5-alkiluracil, 7-alkilgvanin, 5-alkiyl citozin, 7-deazaadenin, N6,N6-dimetiladenin, 2,6-diaminopurin, 5-amino-alil-uracil, N3-metiluracil, supstituisane 1,2,4-triazole, 2-piridinon, 5-nitroindol, 3-nitropirol, 5-metoksiuracil, uracil-5-oksisirćetnu kiselinu, 5-metoksikarbonilmetiluracil, 5-metil-2-tiouracil, 5-metoksikarbonilmetil-2-tiouracil, 5-metilaminometil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-karboksipropil)uracil, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N<4>-acetil citozin, 2-tiocitozin, N6-metiladenin, N6-izopentiladenin, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, N-metilgvanine, ili O-alkilovane baze.
[0073] Kako se ovde koristi, termini "analog nukleotida koji nije uparen" označava analog nukleotida koji uključuje ne bazni deo za uparivanje uključujući, ali ne ograničavajući se na: 6 des amino adenozin (nebularin), 4-Me-indol, 3-nitropirol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-MedT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC, N3-Me dC. U nekim otelotvorenjima analog nukleotida koji nije uparen sa bazama je ribonukleotid. U drugim otelotvorenjima to je dezoksiribonukleotid.
[0074] Kako se ovde koristi, termin "terminalna funkcionalna grupa" uključuje bez ograničenja halogen, alkohol, amin, karboksilnu, estarsku, amidnu, aldehidnu, ketonsku, etarsku grupu.
[0075] Određeni delovi mogu biti vezani za 5' terminus prve niti ili druge niti i uključuju abazičnu ribozu, abazičnu deoksiribozu, modifikacije abazičnu ribozu i abazičnu dezoksiribozu, uključujući 2'O alkil modifikacije; invertovane abazične riboze i abazične dezoksiriboze i njihove modifikacije, C6-imino-Pi; nukleotid ogledala uključujući L-DNK i L-RNK; 5'OMe nukleotid; i analozi nukleotida uključujući 4',5'-metilen nukleotid; 1-(β-D-eritrofuranozil)nukleotid; 4'-tio nukleotid, karbociklični nukleotid; 5'-amino-alkil fosfat; 1,3-diamino-2-propil fosfat, 3-aminopropil fosfat; 6-aminoheksil fosfat; 12-aminododecil fosfat; hidroksipropil fosfat; 1,5-anhidroheksitol nukleotid; alfa-nukleotid; treo-pentofuranozil nukleotid; aciklični 3',4'-seko nukleotid; 3,4-dihidroksibutil nukleotid; 3,5-dihidroksipentil nukleotid, 5'-5'-invertovani abazni deo; 1,4-butandiol fosfat; 5'-amino; i premošćujuće ili nepremostive metilfosfonate i 5'-merkapto delove.
[0076] Nukleinske kiseline pronalaska mogu biti uključene jedan ili više invertovanih nukleotida, na primer invertovani timidin ili invertovani adenin (na primer, videti Takei, i dr., 2002. JBC 277 (26):23800-06).
[0077] Kako se ovde koristi, termin "inhibirati", "regulisati naniže" ili "smanjiti" u odnosu na ekspresiju gena označava ekspresiju gena, ili nivo RNK molekula ili ekvivalentnih RNK molekula koji kodiraju jedan ili više proteina ili proteinskih podjedinica (npr., mRNK), ili aktivnost jednog ili više proteina ili proteinskih podjedinica, smanjena je ispod one koja je primećena u odsustvu nukleinske kiseline pronalaska; na primer, ekspresija se može smanjiti na 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% ili manje od one koja je primećena u odsustvu inhibitora.
[0078] Nukleinska kiselina predmetnog pronalaska može sadržati abazni nukleotid. Termin "abazičan" kako se ovde koristi, odnosi se na delove koji nemaju bazu ili imaju druge hemijske grupe umesto baze na 1' poziciji, na primer 3',3'-vezani ili 5',5'-vezani deoksiabazik derivat riboze.
[0079] "Naizmenično" kako je ovde opisano znači da se dešavaju jedno za drugim na regularan način.
Drugim rečima, naizmenično znači da se ponavljaju.
1
[0080] Termin "neparan broj" kako je ovde opisan označava broj koji nije deljiv sa dva. Primeri neparnih brojeva su 1, 3, 5, 7, 9, 11 i tako dalje. Termin "parno numerisan" kako je ovde opisan označava broj koji je jednako deljiv sa dva. Primeri parnih brojeva su 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 i tako dalje.
[0081] Nukleotidi za potrebe modifikacije kako je ovde opisano (osim ako nije drugačije naznačeno) su numerisani od 5' do 3' na prvom lancu i 3' i 5' na drugom lancu.
[0082] Jasno je da ako su prva i/ili druga nit kraće ili duže od 25 nukleotida, kao što je 19 nukleotida dužine, nema nukleotida sa brojem 20, 21, 22, 23, 24 i 25 koji treba modifikovati. Stručnjak razume da se opis primenjuje na kraće ili duže niti, shodno tome.
[0083] U celom opisu pronalaska, "ista ili uobičajena modifikacija" označava istu modifikaciju bilo kog nukleotida, bilo da je A, G, C ili U modifikovan sa grupom kao što je metil grupa ili fluoro grupa. Zar se ne uzima da znači isti dodatak na istom nukleotidu. Na primer, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG svi se smatraju istim ili uobičajenim modifikacijama, kao što su 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG.2'F modifikacija je drugačija modifikacija od 2'OMe modifikacije.
[0084] Neke reprezentativne modifikovane sekvence nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska su prikazane u primerima. Ovi primeri imaju za cilj da budu reprezentativni, a ne ograničavajući.
[0085] Nukleinska kiselina pronalaska može biti konjugovana sa ligandom.
[0086] Neki ligandi mogu imati endosomolitička svojstva. Endosomolitički ligandi promovišu lizu endozoma i/ili transport sastava pronalaska, ili njenih komponenti, od endozoma do citoplazme ćelije.
Endosomolitički ligand može biti polianjonski peptid ili peptidomimetik koji pokazuje pH-zavisnu membransku aktivnost i fuzogenost. Endosomolitička komponenta može da sadrži hemijsku grupu koja se podvrgava promeni naelektrisanja ili protonaciji kao odgovor na promenu pH. Endosomolitička komponenta može biti linearna ili razgranata.
[0087] Ligandi mogu uključivati terapeutske modifikatore, npr., za poboljšanje uzimanja; dijagnostička jedinjenja ili grupe reportera, npr., za praćenje distribucije;
sredstva za umrežavanje; sredstva za umrežavanje; i delove koji daju otpornost na nukleazu. Opšti primeri uključuju lipide, steroide, vitamine, šećere, proteine, peptide, poliamine i imitatore peptida. Ligandi mogu uključivati prirodnu supstancu, kao što je protein, ugljeni hidrat ili lipid. Ligand može biti rekombinantni ili sintetički molekul.
[0088] Ligandi takođe mogu uključiti ciljne grupe, npr., sredstvo za ciljanje ćelija ili tkiva. Ciljni ligand može biti lektin, glikoprotein, lipid ili protein.
[0089] Drugi primeri liganda obuhvataju boje, interkalirajuća sredstva, unakrsne veznike, porfirine, policiklične aromatične ugljovodonike, veštačke endonukleaze ili helatore, lipofilne molekule, agense za alkilovanje, fosfate, amino, merkapto, PEG, MPEG, supstituisane alkil-markere, radioaktivne markere, enzime, haptene, olakšavače transporta/apsorpcije, sintetičke ribonukelaze ili klasteri imidazola.
[0090] Ligandi mogu biti proteini, npr. glikoproteini ili peptidi. Ligandi mogu takođe biti hormoni ili hormonski receptori. Oni takođe mogu uključivati ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini ili kofaktori.
[0091] Ligand može biti supstanca kao što je lek koji može povećati unos nukleinske kiseline u ćeliju, na primer, ometanjem ćelijskog citoskeleta.
[0092] Ligand može povećati unos nukleinske kiseline u ćeliju aktiviranjem inflamatornog odgovora. Takvi ligandi uključuju faktor nekroze tumora alfa (TNF-alfa), interleukin-1 beta ili gama interferon.
[0093] Ligand može biti lipid ili molekul na bazi lipida. Lipid ili molekul na bazi lipida poželjno vezuje serumski protein. Poželjno, ligand na bazi lipida vezuje humani serumski albumin (HSA). Molekul na bazi lipida ili lipida može povećati otpornost na degradaciju konjugata, povećati ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju, i/ili može prilagoditi vezivanje za protein seruma. Ligand na bazi lipida može se koristiti za modulaciju vezivanja konjugata za ciljno tkivo.
[0094] Ligand može biti steroid. Poželjno, ligand je holesterol ili derivat holesterola.
[0095] Ligand može biti deo npr. vitamin, koji preuzima ciljna ćelija. Primeri vitamina uključuju vitamine A, E, K i vitamine B. Vitamini se mogu preuzeti u ćelijama koje se razmnožavaju, što može biti korisno za isporuku nukleinske kiseline ćelijama kao što su maligne ili nemaligne tumorske ćelije.
[0096] Ligand može biti sredstvo za ćelijsku permeaciju, kao što je spiralno sredstvo za ćelijsku permeaciju. Poželjno je da je takvo sredstvo amfipatsko.
[0097] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik je molekul sposoban da se savije u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Peptid ili peptidomimetički ligand može uključivati prirodne ili modifikovane peptide, ili oboje. Peptid ili peptidomimetik može biti peptid ćelijske permeacije, katjonski peptid, amfipatski peptid ili hidrofobni peptid. Peptidni deo može biti dendrimer peptid, ograničeni peptid ili umreženi peptid. Peptidni deo može uključiti sekvencu translokacije hidrofobne membrane. Peptidni deo može biti peptid sposoban da nosi velike polarne molekule kao što su peptidi, oligonukleotidi i proteini kroz ćelijske membrane, npr. sekvence iz HIV Tat proteina (GRKKRRQRRRPPQ) i protein Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK). Poželjno, peptid ili peptidomimetik je peptid koji cilja na ćeliju, npr. arginin-glicin-asparaginska kiselina (RGD)-peptid.
[0098] Ligand može biti peptid ćelijske permeacije koji je sposoban da prodre, na primer, u mikrobnu ćeliju ili ćeliju sisara.
[0099] Ligand može biti farmakokinetički modulator. Farmakokinetički modulator mogu biti lipofili, žučne kiseline, steroidi, analozi fosfolipida, peptidi, sredstva za vezivanje proteina, PEG, vitamini itd.
[0100] Kada su prisutna dva ili više liganda, svi ligandi mogu imati ista svojstva, svi imaju različita svojstva, ili neki ligandi imaju ista svojstva dok drugi imaju različita svojstva. Na primer, ligand može imati svojstva ciljanja, imati endosomolitičku aktivnost ili imati svojstva modulacije PK. U poželjnom otelotvorenju, svi ligandi imaju različita svojstva.
[0101] Ligandi se mogu vezati za nukleinsku kiselinu na 3'-kraju, 5'-kraju i/ili na unutrašnjoj poziciji.
Poželjno je da je ligand spojen sa nukleinskom kiselinom preko intervencione vezice ili veznika.
[0102] U nekim otelotvorenjima nukleinska kiselina je dvolančana nukleinska kiselina. U nukleinskoj kiselini od dve niti, ligand može biti vezan za jednu ili obe niti. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina od dve niti sadrži ligand konjugovan sa drugom niti. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina od dve niti sadrži ligand konjugovan sa prvom niti.
[0103] Ligandi mogu biti konjugovani sa nukleobazama, šećernim delovima ili internukleozidnim vezama molekula nukleinske kiseline. Konjugacija sa purinskim nukleobazama ili njihovim derivatima može se desiti na bilo kojoj poziciji uključujući endociklične i egzociklične atome. Konjugacija sa pirimidinskim nukleotidima ili njihovim derivatima se takođe može desiti na bilo kojoj poziciji. Konjugacija sa šećernim delovima nukleozida može se desiti na bilo kom atomu ugljenika. Konjugacija sa internukleozidnim vezama može se desiti na atomu fosfora veze koja sadrži fosfor ili na atomu kiseonika, azota ili sumpora koji je vezan za atom fosfora. Za internukleozidne veze koje sadrže amin ili amid, može doći do konjugacije na atomu azota amina ili amida ili na susednom atomu ugljenika.
[0104] Ligand je tipično ugljeni hidrat, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid ili polisaharid. Ligand može biti konjugovan sa nukleinskom kiselinom pomoću veznika. Saharid se može izabrati između N-acetil galaktoseamina, manoze, galaktoze, glukoze, glukozamina i fukoze. Saharid može biti N-acetil galaktoseamin (GaINAc).
[0105] Ligand za upotrebu u predmetnom pronalasku može stoga da sadrži (i) jedan ili više N-acetil galaktozamin (GaINac) delova i njihovih derivata, i (ii) veznik, pri čemu veznik konjuguje GalNac delove u sekvencu kako je definisano u bilo kom prethodni aspekti. Veznik može biti dvovalentna ili trovalentna ili tetravalentna razgranata struktura. Nukleotidi mogu biti modifikovani kako je ovde definisano.
[0106] Stoga, sredstva za efikasnu isporuku oligonukleotida, posebno dvolančanih siRNK, u ćelije in vivo postaju sve važnija i zahtevaju specifično ciljanje i značajnu zaštitu od vanćelijskog okruženja, posebno serumskih proteina. Jedan postupak za postizanje specifičnog ciljanja je konjugacija liganda sa nukleinskom kiselinom. Ciljni deo pomaže u ciljanju nukleinske kiseline na potrebno ciljno mesto i postoji potreba da se konjuguju odgovarajući ligandi za željena receptorska mesta da bi konjugovane molekule preuzele ćelije kao što je endocitoza. Ligand može biti bilo koji deo ili ligand koji je sposoban da cilja na specifični receptor.
[0107] Na primer, azialoglikoproteinski receptor (ASGP-R) je receptor velikog kapaciteta, koji je veoma zastupljen na hepatocitima. Jedno od prvih obelodanjivanja triantenarnih klaster glikozida bilo je u patentnom broju SAD US 5,885,968. Konjugati koji imaju tri GalNAc liganda i koji sadrže fosfatne grupe su poznati i opisani su u Dubber i dr. (2003). ASGP-R pokazuje 50 puta veći afinitet za N-acetil-D-galaktozilamin (GaINAc) nego D-Gal.
1
[0108] Hepatociti koji eksprimiraju lektin (asialoglikoproteinski receptor; ASGPR), koji prepoznaje specifično terminalne β-galaktozilne podjedinice glikozilovanih proteina ili drugih oligosaharida (P. H. Weigel i dr., 2002,) može se koristiti za ciljanje leka na jetru kovalentnim spajanjem galaktoze ili galaktoseamina sa lekovitom supstancom (S.Ishibashi, i dr.1994). Štaviše, afinitet vezivanja može biti značajno povećan efektom multivalentnosti, koji se postiže ponavljanjem ciljne jedinice (E. A. L. Biessen i dr., 1995).
[0109] ASGPR je posrednik za aktivni endosomalni transport glikoproteina koji sadrži terminalni βgalaktozil, tako da je ASGPR veoma pogodan za ciljanu isporuku kandidata za lek kao što je nukleinska kiselina, koji se moraju isporučiti u ćeliju (Akinc i dr.).
[0110] Saharid, koji se takođe može nazvati ligandom, može biti odabran tako da ima afinitet za najmanje jedan tip receptora na ciljnoj ćeliji. Konkretno, receptor se nalazi na površini ćelije jetre sisara, na primer, jetreni asialoglikoproteinski receptor (ASGP-R).
[0111] Saharid se može izabrati između N-acetil galaktoseamina, manoze, galaktoze, glukoze, glukozamina i fukoze. Saharid može biti N-acetil galaktoseamin (GaINAc).
[0112] "GaINAc" se odnosi na 2-(acetilamino)-2-deoksi-D-galaktopiranozu, koja se u literaturi obično naziva N-acetil galaktozamin. Pozivanje na „GaINAc“ ili „N-acetil galaktoseamin“ uključuje oba β-oblika: 2-(acetilamino)-2-deoksi-β-D-galaktopiranoza i α-oblik: 2-(acetilamino)-2-deoksi-α-D-galaktopiranoza. Oba β-oblika: 2-(acetilarnino)-2-deoksi-β-D-galaktopiranoza i α-oblik: 2-(acetilamino)-2-deoksi-α-D-galaktopiranoza se može koristiti naizmenično. Poželjno, jedinjenja pronalaska sadrže β-oblik, 2-(acetilarnino)-2-deoksi-β-D-galaktopiranozu.
[0113] Ligand može sadržati GaINAc.
[0114] Ligand može da sadrži jedinjenje formule I:
[S-X<1>-P-X<2>]3-A-X<3>- (I)
gde:
S predstavlja saharid, pri čemu je saharid N-acetil galaktozamin;
X<1>predstavlja C3-C6alkilen ili (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- gde je m 1, 2 ili 3;
P je fosfat ili modifikovani fosfat (poželjno tiofosfat);
X<2>je alkilen ili alkilen etar formule (-CH2)n-O-CH2- gde je n = 1- 6;
A je razgranata jedinica;
X<3>predstavlja jedinicu za premošćivanje;
pri čemu je nukleinska kiselina prema predmetnom pronalasku konjugovana sa X<3>preko fosfata ili modifikovanog fosfata (poželjno tiofosfata).
[0115] U formuli I, jedinica grananja "A" grana se na tri da bi se prilagodila tri saharidna liganda. Jedinica grananja je kovalentno vezana za ligande i nukleinsku kiselinu. Jedinica grananja može da sadrži razgranatu alifatičnu grupu koja sadrži grupe koje se biraju između alkil, amid, disulfid, polietilen glikol, etar, tioetar i hidroksiamino grupe. Jedinica grananja može da sadrži grupe izabrane od alkil i etarskih grupa.
[0116] Jedinica grananja A može imati strukturu izabranu između:
pri čemu svaki A1nezavisno predstavlja O, S, C=O ili NH; i
svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 20.
[0117] Jedinica grananja može imati strukturu izabranu između:
1
pri čemu svaki A1nezavisno predstavlja O, S, C=O ili NH; i
svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 20.
[0118] Jedinica grananja može imati strukturu izabranu između:
gde je A1O, S, C=O ili NH; i
svako n nezavisno predstavlja ceo broj od 1 do 20.
[0119] Jedinica grananja može imati strukturu:
[0120] Jedinica grananja može imati strukturu:
[0121] Jedinica grananja može imati strukturu:
[0122] Opciono, jedinica za grananje se sastoji samo od atoma ugljenika.
[0123] X<3>može biti izabran između -C1-C20alkilen-, -C2-C20alkenilen-, alkilen eter formule - (C1-C20alkilen)-O-(C1-C20alkilen)-, -C(O)-C1-C20alkilen-, -C0-C4alkilen(Cy)C0-C4alkilen- gde Cy predstavlja supstituisani ili nesupstituisani 5 ili 6-člani cikloalkilenski, arilen, heterociklilen ili heteroarilenski prsten, -C1-C4alkilen-NHC(O)-C1-C4alkilen-, -C1-C4alkilen-C(O)NH-C1-C4alkilen-, -C1-C4alkilen-SC(O)-C1-C4alkilen-, - C1-C4alkilen-C(O)S-C1-C4alkilen-, -C1-C4alkilen-OC(O)-C1-C4alkilen-, -C1-C4alkilen-C(O)O-C1-C4alkilen-, i -C1-C6alkilen-S-S-C1-C6alkilen-.
[0124] X<3>može biti alkilen etar formule -(C1-C20alkilen)-O-(C1-C20alkilen)-. X<3>može biti alkilen formule -(C1-C20alkilen)-O-(C4-C20alkilen)-, gde je pomenuti (C4-C20alkilen) vezna sa Z. X<3>mogu biti izabrani iz grupe koju čine -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- i -CH2-O-C8H16-, posebno -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- i - CH2-O-C8H16-, pri čemu je u svakom slučaju -CH2- grupa vezana za A.
[0125] Ligand može da sadrži jedinjenje formule (II):
[S-X<1>-P-X<2>]3-A-X<3>- (II)
gde:
1
S predstavlja saharid;
X<1>predstavlja C3-C6alkilen ili (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- gde je m 1, 2 ili 3;
P je fosfat ili modifikovani fosfat (poželjno tiofosfat);
X<2>je C1-C8alkilen;
A je jedinica grananja koja se bira između:
X<3>je jedinica za premošćavanje;
pri čemu je nukleinska kiselina prema predmetnom pronalasku konjugovana sa X<3>preko fosfata ili modifikovanog fosfata (poželjno tiofosfata).
[0126] Jedinica grana A može imati strukturu:
[0127] Jedinica grana A može imati strukturu:
pri čemu je X<3>vezan za atom azota.
[0128] X<3>može biti C1-C20alkilen. Poželjno, X<3>je izabran iz grupe koju čine -C3H6-, - C4H8-,-C6H12- i -C8H16-, posebno -C4H8-,-C6H12- i -C8H16-.
[0129] Ligand može da sadrži jedinjenje formule (III):
[S-X<1>-P-X<2>]3-A-X<3>- (III)
gde:
S predstavlja saharid;
X<1>predstavlja C3-C6alkilen ili (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- gde je m 1, 2 ili 3;
P je fosfat ili modifikovani fosfat (poželjno tiofosfat);
X<2>je alkilen etar formule -C3H6-O-CH2-;
A je razgranata jedinica;
X<3>je alkilen etar formule izabran iz grupe koju čine -CH2-O-CH2-, - CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, i -CH2-O-C8H16-, pri čemu je u svakom slučaju -CH2- grupa vezana za A, pri čemu je nukleinska kiselina prema predmetnom pronalasku konjugovana sa X<3>preko fosfata ili modifikovanog fosfata (poželjno tiofosfata).
[0130] Jedinica za grananje može da sadrži ugljenik. Poželjno, ugljenična jedinica je ugljenik.
[0131] X<3>može biti izabran iz grupe koju čine -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, i -CH2-O-C8H16-. Poželjno, X<3>je izabran iz grupe koju čine -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- i -CH2-O-C8H16.
[0132] Za bilo koji od gornjih aspekata, P predstavlja modifikovanu fosfatnu grupu. P se može predstaviti sa:
1
gde svaka Y<1>i Y<2>nezavisno predstavlja =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -[0133] OCH2CO2R<x>, -OCH2C(S)OR<x>, i -OR<x>, gde R<x>predstavlja C1-C6alkil i gde označava vezu za ostatak jedinjenja.
[0134] Na primer, Y<1>može predstavljati -OH i Y<2>može predstavljati =O ili =S; ili
Y<1>može predstavljati -O<->i Y<2>može predstavljati =O ili =S;
Y<1>može predstavljati =O i Y<2>može predstavljati -CH3, -SH, -OR<x>, ili -BH3
Y<1>može predstavljati =S i Y<2>može predstavljati -CH3, OR<x>ili -SH.
[0135] Stručnjak će razumeti da će u određenim slučajevima doći do delokalizacije između Y<1>i Y<2>.
[0136] Poželjno, modifikovana fosfatna grupa je tiofosfatna grupa. Tiofosfatne grupe uključuju bitiofosfat (tj. gde Y<1>predstavlja =S, a Y<2>predstavlja -S-) i monotiofosfat (tj. gde Y<1>predstavlja -O- a Y<2>predstavlja =S, ili gde Y<1>predstavlja =O, a Y<2>predstavlja -S-). Poželjno, P je monotiofosfat. Pronalazači su otkrili da konjugati koji imaju tiofosfatne grupe u zameni fosfatnih grupa imaju poboljšanu snagu i trajanje delovanja in vivo.
[0137] P može takođe biti etilfosfat (tj. gde Y<1>predstavlja =O i Y<2>predstavlja OCH2CH3).
[0138] Saharid, koji se takođe može nazvati ligandom, može biti odabran tako da ima afinitet za najmanje jedan tip receptora na ciljnoj ćeliji. Konkretno, receptor se nalazi na površini ćelije jetre sisara, na primer, jetreni azijaloglikoproteinski receptor (ASGP-R).
[0139] Za bilo koji od gornjih aspekata, saharid se može izabrati između N-acetila sa jednim ili više od galaktozamina, manoze, galaktoze, glukoze, glukozamina i fruktoze. Poželjno, saharid su dva molekula N-acetil galaktozamina (GaINAc). Jedinjenja pronalaska mogu imati 3 liganda od kojih je svaki poželjno N-acetil galaktozamin.
[0140] "GaINAc" se odnosi na 2-(acetilamino)-2-deoksi-D-galaktopiranozu, koja se u literaturi obično naziva N-acetil galaktozamin. Pozivanje na „GaINAc“ ili „N-acetil galaktozamin“ uključuje oba β-oblika: 2-(acetilamino)-2-deoksi-β-D-galaktopiranoza i α-oblik: 2-(acetilamino)-2-deoksi-α-D-galaktopiranoza. U određenim otelotvorenjima, oba β-oblika: 2-(acetilarnino)-2-deoksi-β-D-galaktopiranoza i α-oblik: 2-(acetilamino)-2-deoksi-α-D-galaktopiranoza se može koristiti naizmenično. Poželjno, jedinjenja pronalaska sadrže β-oblik, 2-(acetilarnino)-2-deoksi-β-D-galaktopiranozu.
2-(Acetilamino)-2-deoksi-D-galaktopiranoza
[0141]
2-(Acetilamino)-2-deoksi-β-D-galaktopiranoza
[0142]
1
2-(Acetilamino)-2-deoksi-α-D-galaktopiranoza
[0143] Za bilo koje od gornjih jedinjenja formule (III), X<1>može biti (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- gde je m 1, 2, ili 3. X<1>može biti (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X<1>može biti (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X<1>može biti (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-. Poželjno, X<1>je (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. Alternativno, X<1>predstavlja C3-C6alkilen. X<1>može biti propilen. X<1>može biti butilen. X<1>može biti pentilen. X<1>može biti heksilen. Poželjno, alkil je linearni alkilen. Naročito, X<1>može biti butilen. Za jedinjenja formule (III), X<2>predstavlja alkilen etar formule -C3H6-O-CH2-tj. C3alkoksi metilen, ili -CH2CH2CH2OCH2-.
[0144] Predmetni pronalazak stoga dodatno obezbeđuje konjugovanu nukleinsku kiselinu koja ima jednu od sledećih struktura
2
gde Z predstavlja nukleinsku kiselinu kako je ovde ranije definisano.
[0145] Ovde je opisana nukleinska kiselina ili konjugovana nukleinska kiselina za inhibiciju ekspresije ciljnog gena u ćeliji, koja sadrži najmanje jedan dupleks region koji sadrži najmanje deo prvog lanca i najmanje deo drugog lanca koji je najmanje delimično komplementaran prvom lancu, pri čemu je navedeni prva nit bar delimično komplementarna najmanje delu RNK transkribovanog sa ciljnog gena, pri čemu pomenuta prva nit sadrži modifikovani nukleotid na odabranoj poziciji da bi se olakšala obrada nukleinske kiseline pomoću RISC, pri čemu je nukleinska kiselina konjugovana indirektno ili direktno na ligand preko linkera. Nukleinska kiselina može biti konjugovana sa ligandom kao što je ovde opisano. Nukleotidi prvog i/ili drugog lanca mogu biti modifikovani, kao što je ovde opisano.
[0146] Ligand može biti konjugovan sa nukleinskom kiselinom preko veznika kao što je navedeno u formuli I i pri čemu je prva nit modifikovana sa 2'OMe modifikacijom na neparnim nukleotidima i modifikovan sa 2'F na parnim nukleotidima, a druga nit je modifikovana sa 2'OMe na parnim nukleotidima i modifikovan sa 2'F na neparnim nukleotidima.
[0147] Ligand može biti GalNac i biti vezan preko veznika.
[0148] Nukleinska kiselina kako je ovde opisana može biti formulisana sa lipidom u obliku lipozoma. Takva formulacija se u struci može opisati kao lipopleks. Formulacija sa lipidom/lipozomom može da se koristi da pomogne u isporuci nukleinske kiseline pronalaska do ciljnih ćelija. Ovde opisani sistem isporuke lipida
2
može se koristiti kao alternativa konjugovanom ligandu. Ovde opisane modifikacije mogu biti prisutne kada se koristi nukleinska kiselina pronalaska sa sistemom za oslobađanje lipida ili sa sistemom za oslobađanje konjugata liganda. Takav lipopleks može sadržati formulaciju lipida koja sadrži:
i) katjonski lipid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;
ii) steroid;
iii) fosfatidiletanolamin fosfolipid;
iv) PEGilovani lipid.
[0149] Katjonski lipid može biti aminokatjonski lipid.
[0150] Katjonski lipid može imati formulu (I):
ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde:
X predstavlja O, S ili NH;
R<1>i R<2>svaki nezavisno predstavlja C4-C22 linearni ili razgranati alkil lanac ili C4-C22 linearni ili razgranati alkenil lanac sa jednom ili više dvostrukih veza, pri čemu alkil ili alkenil lanac opciono sadrži intervencioni estar, amid ili disulfid;
kada X predstavlja S ili NH, R<3>i R<4>svaki nezavisno predstavlja vodonik, metil, etil, mono- ili poliaminski deo, ili R<3>i R<4>zajedno formiraju heterociklil prsten;
kada X predstavlja O, R<3>i R<4>svaki nezavisno predstavlja vodonik, metil, etil, mono- ili poliaminski deo, ili R<3>i R<4>zajedno formiraju heterociklil prsten, ili R<3>predstavlja vodonik i R<4>predstavlja C(NH)(NH2).
[0151] Katjonski lipid može imati formulu (IA):
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
[0152] Katjonski lipid može imati formulu (IB):
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
[0153] Sadržaj katjonske lipidne komponente može biti od oko 55 mol% do oko 65 mol% ukupnog sadržaja lipida u formulaciji. Konkretno, katjonska lipidna komponenta je oko 59 mol% ukupnog sadržaja lipida u formulaciji.
[0154] Formulacije dalje sadrže steroid. steroid može biti holesterol. Sadržaj steroida može biti od oko 26 mol% do oko 35 mol% ukupnog sadržaja lipida u lipidnoj formulaciji. Preciznije, sadržaj steroida može biti oko 30 mol% ukupnog sadržaja lipida u lipidnoj formulaciji.
[0155] Fosfatidiletanolamin fosfolipid može biti izabran iz grupe koju čine 1,2-difitanoil-sn-glicero-3fosfoetanolamin (DPhyPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DSPE), 1,2-Dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DLPE), 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DMPE), 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DPPE), 1,2-Dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DLoPE), 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (POPE), 1,2-Dierucoil-snglicero-3-fosfoetanolamin (DEPE), 1,2-Diskualeoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DSQPE) i 1-Stearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (SLPE). Sadržaj fosfolipida može biti oko 10 mol% ukupnog sadržaja lipida u formulaciji.
[0156] PEGilovani lipid može biti izabran iz grupe koju čine 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol (DMG-PEG) i C16-ceramid-PEG. Sadržaj PEGilovanog lipida može biti oko 1 do 5 mol% ukupnog sadržaja lipida u formulaciji.
[0157] Sadržaj katjonske lipidne komponente u formulaciji može biti od oko 55 mol% do oko 65 mol% ukupnog sadržaja lipida u lipidnoj formulaciji, poželjno oko 59 mol% ukupnog sadržaja lipida u lipidnom sastavu.
[0158] Formulacija može imati molarni odnos komponenti i):ii): iii): iv) izabran između 55:34:10:1;
56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; i 65:24:10:1.
[0159] Formulacija može da sadrži katjonski lipid koji ima strukturu
steroid koji ima strukturu
fosfatidiletanolamin fosfolipid koji ima strukturu
I PEGilovani lipid koji ima strukturu
[0160] Sastavi neutralnih lipozoma mogu se formirati od, na primer, dimiristoil fosfatidilholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonski sastavi lipozoma mogu se formirati od dimiristoil fosfatidilglicerola, dok anjonski fuzogeni lipozomi mogu biti formirani prvenstveno od dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Drugi tip lipozomalnog sastava može se formirati od fosfatidilholina (PC) kao što je, na primer, PC soje i PC jaja. Drugi tip se formira od mešavine fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili
2
holesterola.
[0161] Pozitivno naelektrisani sintetički katjonski lipid, N-[I-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA) može se koristiti za formiranje malih lipozoma koji spontano interaguju sa nukleinskom kiselinom da bi formirali lipidni kompleksi nukleinskih kiselina koji su sposobni da se stapaju sa negativno naelektrisanim lipidima ćelijskih membrana ćelija kulture tkiva. DOTMA analozi se takođe mogu koristiti za formiranje lipozoma.
[0162] Derivati i analozi lipida opisani ovde se takođe mogu koristiti za formiranje lipozoma.
[0163] Lipozom koji sadrži nukleinsku kiselinu može se pripremiti različitim postupcima. U jednom primeru, lipidna komponenta lipozoma je rastvorena u deterdžentu tako da se micele formiraju sa lipidnom komponentom. Na primer, lipidna komponenta može biti amfipatski katjonski lipid ili lipidni konjugat. Deterdžent može imati visoku kritičnu koncentraciju micela i može biti nejonski. Primeri deterdženata uključuju holat, CHAPS, oktilglukozid, deoksiholat i lauroil sarkozin. Preparat nukleinske kiseline se zatim dodaje u micele koje uključuju lipidnu komponentu. Katjonske grupe na lipidu stupaju u interakciju sa nukleinskom kiselinom i kondenzuju se oko nukleinske kiseline i formiraju lipozom. Posle kondenzacije, deterdžent se uklanja, na primer, dijalizom, da bi se dobio lipozomalni preparat nukleinske kiseline.
[0164] Ako je potrebno, jedinjenje nosača koje pomaže u kondenzaciji može se dodati tokom reakcije kondenzacije, na primer, kontrolisanim dodavanjem. Na primer, jedinjenje nosača može biti polimer koji nije nukleinska kiselina (npr. spermin ili spermidin). pH se takođe može podesiti tako da pogoduje kondenzaciji.
[0165] Formulacije nukleinske kiseline mogu uključivati surfaktant. U jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina je formulisana kao emulzija koja uključuje surfaktant.
[0166] Surfaktant koji nije jonizovan je nejonski surfaktant. Primeri uključuju nejonske estre, kao što su estri etilen glikola, propilen glikol estri, gliceril estri itd., nejonski alkanolamidi i etri kao što su etoksilati masnog alkohola, propoksilovani alkoholi i etoksilovani/propoksilovani blok polimeri.
[0167] Surfaktant koji nosi negativno naelektrisanje kada se rastvori ili rasprši u vodi je anjonski surfaktant. Primeri uključuju karboksilate, kao što su sapuni, acil laktilati, acil amidi aminokiselina, estri sumporne kiseline kao što su alkil sulfati i etoksilovani alkil sulfati, sulfonati kao što su alkil benzen sulfonati, acil izetionati, sulfosukcinati i sulfonati.
[0168] Surfaktant koji nosi pozitivno naelektrisanje kada se rastvori ili rasprši u vodi je katjonski surfaktant. Primeri uključuju kvaternarne amonijumove soli i etoksilovane amine.
[0169] Surfaktant koji ima sposobnost da nosi pozitivno ili negativno naelektrisanje je amfoterni surfaktant. Primeri uključuju derivate akrilne kiseline, supstituisane alkilamide, N-alkilbetaine i fosfatide.
[0170] "Micele" su ovde definisane kao poseban tip molekularnog sklopa u kome su amfipatski molekuli raspoređeni u sfernoj strukturi tako da su svi hidrofobni delovi molekula usmereni ka unutra, ostavljajući hidrofilne delove u kontaktu sa okolnom vodenom fazom. Obrnuti raspored postoji ako je sredina hidrofobna. Micela se može formirati mešanjem vodenog rastvora nukleinske kiseline, alkil sulfata alkalnog metala i najmanje jednog jedinjenja koje formira micele.
[0171] Primeri jedinjenja koja formiraju micele uključuju lecitin, hijaluronsku kiselinu, farmaceutski prihvatljive soli hijaluronske kiseline, glikolnu kiselinu, mlečnu kiselinu, ekstrakt kamilice, ekstrakt krastavca, oleinsku kiselinu, linoleinsku kiselinu, linolensku kiselinu, monoolein, monooleate, monolaurete i monolaurete ulje, mentol, trihidroksi okso holanil glicin i njihove farmaceutski prihvatljive soli, glicerin, poliglicerin, lizin, polilizin, triolein, polioksietilen etri i njihove analoge, polidokanol alkil etri, i njihove analoge, dezoholat, i njihove mešavine.
[0172] Fenol i/ili m-krezol se mogu dodati u mešani micelarni sastav da bi delovali kao stabilizator i konzervans. Može se dodati izotonično sredstvo kao što je glicerin.
[0173] Preparat nukleinske kiseline može biti ugrađen u česticu kao što je mikročestica. Mikročestice se mogu proizvesti sušenjem raspršivanjem, liofilizacijom, isparavanjem, sušenjem u fluidnom sloju, sušenjem u vakuumu ili kombinacijom ovih postupaka.
[0174] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske sastave koje sadrže nukleinsku kiselinu ili konjugovanu nukleinsku kiselinu prema pronalasku. Farmaceutski sastavi se mogu koristiti kao lekovi ili kao dijagnostička sredstva, sami ili u kombinaciji sa drugim sredstvima. Na primer, nukleinska kiselina ili
2
konjugovana nukleinska kiselina prema pronalasku može se kombinovati sa nosačem (npr., lipozomima) i ekscipijentima, kao što su nosači, razblaživači. Mogu se dodati i druga sredstva kao što su konzervansi i stabilizatori. Postupci za isporuku nukleinskih kiselina su poznati u tehnici i u okviru znanja stručnjaka u ovoj oblasti.
[0175] Nukleinska kiselina ili konjugovana nukleinska kiselina iz predmetnog pronalaska se takođe mogu primeniti u kombinaciji sa drugim terapeutskim jedinjenjima, bilo da se primenjuju odvojeno ili istovremeno, npr., kao kombinovana jedinična doza. Pronalazak takođe uključuje farmaceutski sastav koji sadrži nukleinsku kiselinu ili konjugovanu nukleinsku kiselinu prema predmetnom pronalasku u fiziološki/farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu, kao što je stabilizator, konzervans, razblaživač, pufer i slično.
[0176] Farmaceutski sastav može biti specijalno formulisana za primenu u čvrstom ili tečnom obliku. Sastav može biti formulisan za oralnu primenu, parenteralnu primenu (uključujući, na primer, subkutanu, intramuskularnu, intravenoznu ili epiduralnu injekciju), topikalnu primenu, intravaginalnu ili intrarektalnu primenu, sublingvalnu primenu, okularnu primenu, transdermalnu ili nazalnu primenu. Poželjna su davanja subkutanim ili intravenskim postupcima.
[0177] Nivoi doze za lek i farmaceutski sastavi pronalaska mogu odrediti stručnjaci iz ove oblasti rutinskim eksperimentisanjem. U jednom otelotvorenju, jedinična doza može da sadrži između oko 0,01 mg/kg i oko 100 mg/kg telesne mase nukleinske kiseline. Alternativno, doza može biti od 10 mg/kg do 25 mg/kg telesne mase, ili 1 mg/kg do 10 mg/kg telesne mase, ili 0,05 mg/kg do 5 mg/kg telesne mase, ili 0,1 mg/kg do 5 mg/kg telesne mase, ili 0,1 mg/kg do 1 mg/kg telesne mase, ili 0,1 mg/kg do 0,5 mg/kg telesne mase, ili 0,5 mg/kg do 1 mg/kg telesne mase. Nivoi doze se takođe mogu izračunati preko drugih parametara kao što je, na primer, površina tela.
[0178] Farmaceutski sastav može biti sterilna vodena suspenzija ili rastvor za injekcije, ili u liofilizovanom obliku. U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav može da sadrži liofilizovane lipoplekse ili vodenu suspenziju lipopleksa. Lipopleksi poželjno sadrže nukleinsku kiselinu predmetnog pronalaska. Takvi lipopleksi se mogu koristiti za isporuku nukleinske kiseline pronalaska u ciljnu ćeliju bilo in vitro ili in vivo.
[0179] Farmaceutski sastavi i lekovi iz predmetnog pronalaska mogu da se daju ispitaniku sisara u farmaceutski efikasnoj dozi. Sisar može biti izabran od ljudi, pasa, mačaka, konja, goveda, svinja, koza, ovaca, miša, pacova, hrčka i zamorca.
[0180] Farmaceutski prihvatljivi sastavi mogu da sadrže terapeutski efikasnu količinu nukleinske kiseline ili konjugovane nukleinske kiseline u bilo kojem otelotvorenju prema pronalasku, uzete same ili formulisane sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipijensa i/ili razblaživača.
[0181] Primeri materijala koji mogu poslužiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju: (1) šećere, kao što su laktoza, glukoza i saharoza; (2) skrobove, kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob; (3) celulozu i njene derivate, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celuloza acetat; (4) praškasti tragakant; (5) slad; (6) želatin; (7) sredstva za podmazivanje, kao što su magnezijum, natrijum lauril sulfat i talk; (8) ekscipijense, kao što su kakao maslac i voskovi za supozitorije; (9) ulja, kao što su ulje kikirikija, ulje pamučnog semena, ulje šafranike, ulje sezama, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; (10) glikole, kao što je propilen glikol; (11) poliole, kao što su glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; (12) estre, kao što su etil oleat i etil laurat; (13) agar; (14) puferirajuća sredstva, kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; (15) alginska kiselina; (16) voda bez pirogena; (17) izotonični rastvor soli; (18) Ringerov rastvor; (19) etil alkohol; (20) pH puferovane rastvore; (21) poliestere, polikarbonate i / ili polianhidride; (22) sredstva za povećanje zapremine, kao što su polipeptidi i aminokiseline (23) komponenta seruma, kao što su serumski albumin, HDL i LDL; i (22) druge netoksične kompatibilne supstance koje se koriste u farmaceutskim formulacijama.
[0182] Stabilizatori mogu biti sredstva koji stabilizuju nukleinsku kiselinu ili konjugovanu nukleinsku kiselinu, na primer protein koji može da kompleksira sa nukleinskom kiselinom, helatori (npr. EDTA), soli, inhibitori RNK-aze i inhibitori DNK-aze.
[0183] U nekim slučajevima je poželjno usporiti apsorpciju leka iz subkutane ili intramuskularne injekcije kako bi se produžio efekat leka. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala koji ima slabu rastvorljivost u vodi. Brzina upijanja leka će onda zavisiti od brzine rastvaranja koje, zauzvrat, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odloženo upijanje parenteralnog davanja oblika za doziranje ostvaruje se rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljanom
2
sredstvu za prenošenje.
[0184] Nukleinska kiselina opisana ovde može biti sposobna da inhibira ekspresiju ciljnog gena u ćeliji. Nukleinska kiselina opisana ovde može biti sposobna da delimično inhibira ekspresiju ciljnog gena u ćeliji. Inhibicija može biti potpuna, tj.0% nivoa ekspresije ciljnog gena u odsustvu nukleinske kiseline pronalaska. Inhibicija ekspresije ciljnog gena može biti delimična, odnosno može biti 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% cilja ekspresija gena u odsustvu nukleinske kiseline pronalaska. Inhibicija može trajati 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja, 13 nedelja, 14 nedelja ili do 3 meseca, kada se koristi kod ispitanika, kao što je čovek. Nukleinska kiselina ili konjugovana nukleinska kiselina ili sastav koji ih sadrži može biti za upotrebu jednom, svake nedelje, svake dve nedelje, svake tri nedelje, svake četiri nedelje, svakih pet nedelja, svakih šest nedelja, svakih sedam nedelja ili svakih osam nedelja. Nukleinska kiselina ili konjugovana nukleinska kiselina može biti za upotrebu subkutano ili intravenozno.
[0185] U ćelijama i/ili ispitanicima koji su tretirani ili primaju nukleinsku kiselinu ili konjugovanu nukleinsku kiselinu predmetnog pronalaska, ekspresija ciljnog gena može biti inhibirana u poređenju sa netretiranim ćelijama i/ili ispitanicima za najmanje oko 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 100%. Nivo inhibicije može dozvoliti lečenje bolesti povezane sa ekspresijom ciljnog gena ili prekomernom ekspresijom, ili može dozvoliti dalje istraživanje funkcija ciljanog genskog proizvoda.
[0186] Ciljni gen može biti Faktor VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF beta ge, Erb-B gene, Src gen, CRK gen, GRB2 gen, RAS gen, MEKK gen, JNK gen, RAF gen, Erkl/2 gen, PCNA(p21) gen, MYB gen, JU gen, FOS gen, BCL-2 gen, hepcidin, aktivirani protein C, ciklin D gen, VEGF gen, EGFR gen, ciklin A gen, ciklin E gen, WNT-1 gen, beta-katenin gen, c-MET gen, PKC gen, NFKB gen, STAT3 gen, survivin gen, Her2/Neu gen, gen topoizomeraze I, alfa gen topoizomeraze II, mutacije gena p73, mutacije u p21(WAF I/CIPI) gen, mutacije u p27(KIPI) genu, mutacije u PPM ID genu, mutacije u RAS genu, mutacije u genu kaveolina I, mutacije u genu MIB I, mutacije u genu MTAI, mutacije u genu M68, mutacije u genima za supresor tumora i mutacije u genu za supresor tumora p53. Konkretno, ciljni gen može biti TMPRSS6 ili ALDH2.
[0187] Postupak za lečenje bolesti ili poremećaja (nije u skladu sa patentnim pronalaskom) može da obuhvata davanje farmaceutskog sastava koji sadrži nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisano, pojedincu kome je potrebno lečenje. Sastav nukleinske kiseline se može primenjivati dva puta svake nedelje, jednom nedeljno, svake dve nedelje, svake tri nedelje, svake četiri nedelje, svakih pet nedelja, svakih šest nedelja, svakih sedam nedelja ili svakih osam nedelja. Nukleinska kiselina se može davati ispitaniku subkutano ili intravenozno.
[0188] Ispitaniku se može dati početna doza i jedna ili više doza održavanja nukleinske kiseline ili konjugovane nukleinske kiseline. Doza ili doze održavanja mogu biti iste ili niže od početne doze, na primer, upola manje od početne doze. Doze održavanja se, na primer, primenjuju ne više od jednom u 2, 5, 10 ili 30 dana. Režim lečenja može trajati vremenski period koji će varirati u zavisnosti od prirode određene bolesti, njene ozbiljnosti i ukupnog stanja pacijenta.
[0189] Sastav može uključivati više vrsta sredstava nukleinske kiseline. U drugom otelotvorenju, vrsta sredstva nukleinske kiseline ima sekvence koje se ne preklapaju i koje nisu susedne drugoj vrsti u odnosu na ciljnu sekvencu koja se javlja u prirodi. U drugom otelotvorenju, mnoštvo vrsta sredstava nukleinske kiseline je specifično za različite prirodno prisutne ciljne gene. U drugom otelotvorenju, sredstvo nukleinske kiseline je specifičan za alel.
[0190] Nukleinska kiselina ili konjugovana nukleinska kiselina iz predmetnog pronalaska se takođe može primeniti ili za upotrebu u kombinaciji sa drugim terapeutskim jedinjenjima, bilo da se primenjuje odvojeno ili istovremeno, npr. kao kombinovana jedinična doza.
[0191] Nukleinska kiselina ili konjugovana nukleinska kiselina iz predmetnog pronalaska može da se proizvede korišćenjem rutinskih postupaka u struci, uključujući hemijsku sintezu ili ekspresiju nukleinske kiseline bilo in vitro (npr., transkripcija u toku) ili in vivo. Na primer, korišćenjem hemijske sinteze čvrste faze ili korišćenjem vektora ekspresije. U jednom otelotvorenju, ekspresioni vektor može da proizvede nukleinsku kiselinu pronalaska u ciljnoj ćeliji. Postupci za sintezu ovde opisane nukleinske kiseline su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0192] Modifikacije prisutne u nukleinskim kiselinama pronalaska mogu olakšati obradu nukleinske kiseline
2
pomoću RISC.
[0193] U jednom aspektu "olakšati obradu pomoću RISC" znači da se nukleinska kiselina može obraditi pomoću RISC-a, na primer, bilo koja prisutna modifikacija će dozvoliti da nukleinska kiselina bude obrađena pomoću RISC-a, pogodno tako da može doći do aktivnosti SiRNK.
[0194] Nukleinske kiseline pronalaska mogu da sadrže jedan ili više LNA nukleotida. Nukleinske kiseline pronalaska mogu da sadrže LNA nukleotide na pozicijama 2 i/ili 14 prvog lanca računajući od 5' kraja prvog lanca. Nukleinske kiseline mogu sadržati LNA na drugom lancu koji odgovara položaju 11, ili 13, ili 11 i 13, ili 11-13 prvog lanca.
[0195] Poželjno, nukleinska kiselina kao što je ovde obelodanjena je SiRNK.
[0196] Nukleinska kiselina je modifikovana na prvom lancu sa naizmeničnim 2-O metil modifikacijama i 2 fluoro modifikacijama, a pozicije 2 i 14 (počev od 5' kraja) su modifikovane sa 2' fluoro. Druga nit je modifikovan sa 2' fluoro modifikacijama na pozicijama 11-13 računajući od 3' kraja počevši od prve pozicije komplementarnog (dvolančanog) regiona, a preostale modifikacije su 2' O-metil.
[0197] U jednom aspektu, nukleinska kiselina pronalaska sadrži jedan ili više invertovanih ribonukleotida, poželjno obrnuti adenin, koristeći 5'-5' vezu ili 3'-3' vezu, poželjno 3'-3' vezu na 3' kraj druge niti.
[0198] U jednom aspektu, nukleinska kiselina sadrži jednu ili više fosforoditioatnih veza, kao što su 1, 2, 3 ili 4 fosforoditioatne veze. Poželjno je da postoje do 4 fosforoditioatne veze, po jedna na 5' i 3' krajevima prvog i drugog lanca.
[0199] Sve karakteristike nukleinskih kiselina mogu se kombinovati sa svim drugim aspektima pronalaska koji su ovde obelodanjeni.
[0200] U jednom aspektu nukleinska kiselina nije bilo koji ili više ili ceo Patisiran, Revusiran, Fitusiran, Cemdisiran, Givosiran, Inclisiran, lumasiran, Votrisiran, Cosdosiran i Teprasiran.
[0201] Oni imaju sekvence ispod.
Patisiran 3'CAUUGGUUCUCAUAAGGUA 5' 5'GUAACCAAGAGUAUUCCAU 3'
Revusiran 3'-CUACCCUAAAGUACAUUGGUUCU- 5' 5'-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA 3' Fitusiran 3'-GACCAAUUGUGGUAAAUGAAGUU- 5' 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA 3' Cemdisiran 3'-TTUUUUCGUUCUAUAAAAAUAUUAU- 5' 5'-AAGCAAGAUAUUUUUAUAAUA 3'
Givosiran 3'-UGGUCUUUCUCACAGAGUAGAAU 5' 5'-CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA 3' Inclisiran 3'-AAGAUCUG G AC AAA ACG AAA AC A 5' 5'-CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU 3'
Sekvence ovih molekula su takođe dostupne na veb stranici SZO http://www.who.int/medicines/services/inn/en/
[0202] Na primer,
Cemdisian je
dupleks [(2S,4R)-1-{1-[(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil) oksi]-16,16-bis({3-[(3-{5-[(2-acetamido-2-deoksi-β-D-galaktopiranozil)oksi] pentanamido} propil)amino]-3-oksopropoksi}metil)-5,11,18-triokso-14-oksa-6, 10, 17 -triazanonakosan-29-oil}-4-hidroksipirolidin-2-il]metil vodonik sve-P-ambo-2'-O-metil-Ptioadenil-( 3'→5')-2'-O-metil-P-tioadenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-O-metil-3'-adenilat i all-P-ambo-timidilil-(5'→3')-timidilil-(5'→3')-2'-O-metil-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-Ometil-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-Ometilcitidilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-
2
metiladenilil-(5'→3')-2'-Ometiluridilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-Ometiluridina
Patisiran je
RNK dupleks guanilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-Ometilcitidilil-( 3'→5')-adenilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-Ometilcitidilil-( 3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-timidilil-(3'→5')-timidin sa timidilil-(5'→3')-timidilil-(5'→3')-citidilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-citidilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-citidilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-adenozina
Inclisiran je
dupleks [(2S,4R)-1-{1-[(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil) oksi]-16,16-bis({3-[(3-{5-[(2-acetamido-2-deoksi-β- D-galaktopiranozil)oksi] pentanamido} propil)amino]-3-oksopropoksi}metil)-5,11,18-triokso-14-oksa-6, 10, 17 -triazanonacosan-29-oyl}-4-hidroksipirolidin-2-il]metil vodonik sve-P-ambo-2'-O-metil-Pthiocitidilil-( 3'→5')-2'-O-metil-P-tiouridilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-timidilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-Ometilcitidilil-( 3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-Ometil-3'-uridilat i all-P-ambo-2'-O-metil-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-O-metil-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-Ometiladenilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metil-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-P-thiocitidilil-(5'→3')-2'-O-metiladenozina
Givosiran je
dupleks [(2S,4R)-1-{1-[(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil) oksi]-16,16-bis({3-[(3-{5-[(2-acetamido-2-deoksi-β-D-galaktopiranozil)oksi] pentanamido}propil) amino]-3-oksopropoksi}metil)-5,11,18-triokso-14-oksa-6,10,17 -triazanonacosan-29-oyl}-4-hidroksipirolidin-2-il]metil vodonik sve-P-ambo-2'-O-metil-P-thiocitidilil-(3'→5')-2'-O-metil-P-tioadenilil-(3'→5')-2'-Ometilguanilil-( 3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-O-metil-3'-adenilat i all-P-ambo-2'-O-metil-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-O-metil-P-thioguanilil-(5'→3')-2'-Ometilguanilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-Ometilcitidilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-O-metiluridina
Revusiran je
[(2S,4R)-1-{30-(2-acetamido-2-deoksi-β-D-galaktopiranozil)-14,14-bis[16-(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil)-5, 11-diokso-2, 16-dioksa-6, 10-diazaheksadecil]-12, 19,25-triokso-16,30-dioksa-13,20,24-triazatriacontanoil}-4-hidroksipirolidin-2-il]metil vodonik 2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilat dupleks sa 2'-O-metil-Pthiocitidilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-Ometiladenilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-Ometiladenilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-O-metiluridin
Fitusiran je
dupleks [(2S,4R)-1-{30-(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil)-14, 14-bis[16-(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil)-5,11-diokso-2,16-dioksa-6,10-diazaheksadecil]-12,19,25-triokso-16,30-dioksa-13,20,24-triazatriacontanoyl}-4-hidroksipirolidin-2-il]metil vodonik (P-RS)-2'-deoksi-2'-fluoro-P-thioguanilil-(3'→5')-(P-RS)-2'-O-metil-P-thioguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilat i (P-RS)-2'-O-metil-P-tiouridilil-(3'→5')-(P-RS)-2'-deoksi-2'-fluoro-P-tiouridilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-Ometilguanilil-( 3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-(P-RS)-2'-O-metil-P-thiocitidilil-(3'→5')-(P-RS)-2'-Ometil-P-tioadenilil-(3'→5')-2'-O-metilgvanozina
Lumasiran je
{(2S,4R)-1-{1-[(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil) oksi]-16,16-bis-({3-[(3-{5-[(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil) oksi]pentanamido}propil)amino]-3-oksopropoksi}metil)-5,11,18-triokso-14-oksa-6,10,17-triazanonacosan-29-oyl}-4-hidroksipirolidin-2-il}metil vodonik all-P-ambo-2'-O-metil-P-thioguanilil-(3'→5')-2'-O-metil-P-tioadenilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-Ometilguanilil-( 3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-2'-O-metil-3'-adenilat dupleks sa sve-P-ambo-2'-O-metil-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-O-metil-P-thiocitidilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-Ometilguanilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-Ometiladenilil-( 5'→3')-2'-O-metil-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-P-tioadenilil-(5'→3')-2'-Ometiluridin
(3'-5')G = A = C - U - U - U - C - A - U - C - C - U - G - G - A - A - A - U - A - U - A - (R1)
(5'-3')A = C = C - U - G - A - A - A - G - U - A - G - G - A - C - C - U - U - U - A - U = A = U
X: 2'-deoksi-2'-fluoro-X / X : 2'-désoksi-2'-fluoro-X
1
X : 2'-O-metil-X/X : 2'-O-métil-X
Votrisiran je:
{(2S,4R)-1-{1-[(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil) oksi]-16,16-bis-({3-[(3-{5-[(2-acetamido-2-deoksi-β-Dgalaktopiranozil) oksi]pentanamido}propil)amino]-3-oksopropoksi}metil)-5,11,18-triokso-14-oksa-6,10,17-triazanonacosan-29-oyl}-4-hidroksipirolidin-2-il}metil vodonik all-P-ambo-2'-O-metil-P-tiouridilil-(3'→5')-2'-O-metil-P-thioguanilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorocitidilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(3'→5')-2'-deoksi-2'-fluorouridilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-2'-O-metil-3'-adenilat dupleks sa all-P-ambo-2'-O-metil-P-thiocitidilil-(5'→3')-2'-O-metil-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-O-metiladenilil-(5'→3')-2'-O-metilcitidilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroadenilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-Ometiluridilil-( 5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoroguanilil-(5'→3')-2'-O-metilguanilil-(5'→3')-2'-O-metiluridilil-(5'→3')-2'-Ometil-P-tiouridilil-(5'→3')-2'-deoksi-2'-fluoro-Pthiocitidilil-( 5'→3')-2'-O-metiluridin
(3'-5')U = G = G - G - A - U - U - U - C - A - U - G - U - A - A - C - C - A - A - G - A - (R1)
(5'-3')C = U = A - C - C - C - U - A - A - A - G - U - A - C - A - U - U - G - G - U - U = C = U
X : 2'-deoksi-2'-fluoro-X/X: 2'-désoksi-2'-fluoro-x
X: 2'-O-metil-X/X: .2'-O-métil-X
Cosdosiran je:
adenilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-citidilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-Ometilcitidilil-( 3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-2'-O-metilcytidine dupleks sa [(2R,3S)-3-hydroksioksolan-2-il]metil vodonik uridilil-(5'→3')-2'-deoksicitidilil-(5'→3')-citidilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-citidilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-uridilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-guanilil-(5'→3')-adenilil-(5'→3')-citidilil-(5'→3')-citidilil-(5'→3')-5 '- gvanilat
Teprasiran je:
2
guanilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-O-m ethyluridilil-(3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-O-metiluridilil-(3'→5')-citidilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-citidilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-citidilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-adenozin dupleks sa 2'-O-metiluridilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-2'-O-metiladenilil-(3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-O-metilguanilil-(3'→5')-guanilil-(3'→5')-2'-Ometilguanilil-( 3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-Ometilguanilil-( 3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-Ometiladenilil-( 3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-Ometiluridilil-( 3'→5')-adenilil-(3'→5')-2'-O-m ethyluridilil-(3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-O-metilcitidilil-(3'→5')-uridilil-(3'→5')-2'-O-metilcytidine
[0203] U daljim otelotvorenjima pronalaska, terminalni nukleotid na 3' kraju najmanje jednog od prvog lanca i drugog lanca je obrnuti nukleotid i vezan je za susedni nukleotid preko 3' ugljenika terminalnog nukleotida i 3' ugljenik susednog nukleotida i/ili terminalni nukleotid na 5' kraju najmanje jednog od prvog lanca, a druga nit je obrnuti nukleotid i vezan je za susedni nukleotid preko 5' ugljenika terminalnog nukleotida i 5' ugljenik susednog nukleotida,
opciono gde
a. 3' i/ili 5' invertovani nukleotid prve i/ili druge niti je vezan za susedni nukleotid preko fosfatne grupe putem fosfodiestarske veze; ili
b. 3' i/ili 5' invertovani nukleotid prve i/ili druge niti je vezan za susedni nukleotid preko fosforotioatne grupe ili
c. 3' i/ili 5' invertovani nukleotid prve i/ili druge niti je vezan za susedni nukleotid preko fosforoditioatne grupe.
[0204] U daljim otelotvorenjima pronalaska, nukleinska kiselina sadrži fosforoditioatnu vezu, opciono pri čemu je veza između 2 najviše 5' nukleozida i/ili najviše 23' nukleozida drugog lanca, i/ili opciono pri čemu je nukleinska kiselina dodatno ne sadrži nikakve unutrašnje fosforotioatne veze.
[0205] Obelodanjivanje se takođe odnosi na bilo koji prva nit ili bilo koja druga nit nukleinske kiseline kako je ovde obelodanjeno, koji ne sadrži više od 2 promene baze u poređenju sa datim ID-om specifične sekvence. Na primer, jedna baza se može promeniti u bilo kojoj sekvenci.
[0206] U jednom slučaju, promena se može izvršiti na 5' najviše nukleotida antisens (prve) niti. U jednom slučaju, promena se može izvršiti na 3' najviše nukleotida antisens (prve) niti. U jednom primeru, promena se može izvršiti na 5' najviše nukleotida sens (druge) niti. U jednom primeru, promena se može izvršiti na 3' najviše nukleotida sens (druge) niti.
[0207] U jednom slučaju, promena se izvršava na 5' najviše nukleotida antisens (prve) niti. Baza 5' nukleotida može se promeniti u bilo koji drugi nukleotid. A ili U na 5' kraju su poželjni, a A ili U se ovde poučavaju kao potencijalna 5' terminalna baza za sve antisens sekvence koje su ovde obelodanjene.
[0208] Pronalazak će sada biti opisan pozivajući se na sledeće neograničavajuće slike i primere u kojima:
Slike 1a i 1b pokazuju in vitro nokaut aktivnost siRNK koje su modifikovane sa 2'-OMe ili 2'-OH na poziciji 14 prve niti;
Slike 2a i 2b pokazuju in vitro nokaut aktivnost siRNK sa 2'-OMe ili 2'-OH na poziciji 14 prve niti; Slike 3a i 3b pokazuju in vitro nokaut aktivnost siRNK sa 2'-OMe ili 2'-OH na pozicijama 2,3 i 4 prve niti;
Slike 4a i 4b pokazuju in vitro nokaut aktivnost siRNK sa 2'-OMe i 2'-OH na pozicijama 2,3 i 4 prve niti;
Slike 5a i 5b pokazuju in vitro nokaut aktivnost siRNK sa 2'-OMe i 2'-F na poziciji 2 prve niti;
Slika 6 a-c prikazuje nokaut aktivnost različito modifikovanih ALDH2 varijanti izvedenih iz jedne sekvence;
Slike 7a i b pokazuju aktivnost razbijanja različito modifikovanih ALDH2 sekvenci;
Slike 8a i b pokazuju aktivnost razbijanja različito modifikovanih ALDH2 sekvenci;
Slike 9a i b pokazuju aktivnost razbijanja različito modifikovanih DGAT2 sekvenci;
Slike 10a i b pokazuju efekat modifikacija DNK na određenim pozicijama TMPRSS6 siRNK sekvence;
Slike 11a i b pokazuju efekat modifikacija LNA na određenim pozicijama TMPRSS6 siRNK sekvence;
Slika 12a - d prikazuje aktivnost obaranja GalNAc konjugata sa različitim obrascima modifikacije kako u lipozomalnim transfekcijama, tako i u prijemu posredovanom receptorom;
Slika 13a i b pokazuju toleranciju za modifikaciju DNK na više od jedne pozicije u sekvenci TMPRSS6 siRNK;
Slike 14a i b obelodanjuju toleranciju za DNK u siRNK koja cilja ALDH2;
Slike 15 i b obelodanjuju toleranciju za DNK u drugoj siRNK koja cilja ALDH2;
Slike 16a i b obelodanjuju toleranciju za DNK u siRNK koja cilja DGAT2;
Slike 17a i b obelodanjuju efekat 2-O-MOE na određenim pozicijama; i
Slike 18a i b obelodanjuju toleranciju za 2'-OMe u siRNK koja cilja GHR.
Primeri
[0209] U nastavku, samo one nukleinske kiseline koje ispunjavaju zahteve patentnog zahteva 1 su nukleinske kiseline pronalaska. Ostali pružaju koristan kontekst.
Primer 1
[0210] Svi oligonukleotidi su ili dobijeni od komercijalnog proizvođača oligonukleotida (Eurogentec, Belgija) ili sintetizovani na AKTA oligopilot 10 sintetizatoru (GE Healthcare) u skali od 10 µmol korišćenjem hemije fosforamidita. Komercijalno dostupni CPG čvrsti nosač sa bazom (500A, 50 µmol/g), 2'O-metil RNK fosforamiditi i 2'Fluoro DNK fosforamiditi (ChemGenes i LinkTech) su korišćeni u skladu sa procedurama koje preporučuju proizvođači. Spajanje amidita je izvedeno korišćenjem 0,1 M rastvora fosforamidita u acetonitrilu u prisustvu 0,3 M benziltiotetrazolnog (BTT) aktivatora. Kao pomoćni reagensi, 0,05 M l2u piridin/H2O (9/1, v/v) kao oksidator, 40% Ac2O u acetonitrilu kao CapA, 20% N-metilimidazol u acetonitrilu kao CapB, 3% dihlorosirćetna kiselina u uklanjanju toluena kao DMT i 20% dietilamina u acetonitrilu kao završno ispiranje su korišćeni (EMP Biotech). EDITH (LinkTech) je korišćen kao reagens za tiolaciju. Acetonitril (<20 ppm H2O) je nabavljen od EMP Biotech. Svi ostali reagensi i rastvarači su bili komercijalno dostupni i korišćeni u standardnom kvalitetu reagensa.
[0211] ST23 je GalNac C4 fosforamidit (komponente strukture kao u nastavku, opisane u WO2017/174657):
[0212] ST41 je kao što sledi (i kao što je opisano u WO2017/174657):
[0213] Fosforotioati su uvedeni korišćenjem 50 mM EDITH u acetonitrilu. Svi oligonukleotidi su sintetizovani u DMT-off režimu. Ispiranje dietilaminom je izvedeno po završetku sklapanja oligonukleotidnog lanca na čvrstom nosaču.
[0214] Pojedinačni lanci su otcepljeni od CPG i sve preostale zaštitne grupe su uklonjene korišćenjem 40% vod. rastvor metilamina (90 min, ST). Sirovi proizvod je koncentrovan i prečišćen jonoizmenjivačkom hromatografijom (Resource Q, 6 mL, GE Healthcare) na AKTA Pure HPLC sistemu (GE Healthcare) korišćenjem gradijenta natrijum hlorida (10 mM Tris pufer pH = 7,5, 10% acetonitril). Frakcije koje sadrže proizvod su analizirane i objedinjene i koncentrovane. Uklanjanje soli je postignuto ekskluzionom hromatografijom (Zetadex, EMP Biotech). Konačno, pojedinačne jednolančane niti su liofilizovane.
4
[0215] Za formiranje dupleksa, pojedinačni lanci su rekonstituisani u koncentraciji od ~2mg/mL u vodi. Dodate su ekvimolarne količine odgovarajućih pojedinačnih niti, pomešane i zagrejane na 80°C tokom 5 min. Posle hlađenja, dobijena siRNK je analizirana na formiranje punog dvostrukog lanca pomoću izvorne IP-RP HPLC. Rastvori proizvoda su čuvani na -20°C do dalje upotrebe.
[0216] Sadašnji primeri koriste 19mer SiRNK, osim ako nije drugačije vidljivo iz opisa i slika.
Primer 2
[0217] Uticaj 2'-OMe na poziciji 14 prvog lanca na aktivnost siRNK je testiran korišćenjem sekvence koja cilja miša CLIC4. CLC01 je modifikovan sa naizmeničnim 2'-OMe/2'-OH. CLC15 je modifikovan sa 2'-OMe na poziciji 14 prvog lanca, dok CLC16 nije modifikovan sa 2'-OMe na ovoj poziciji. Sve ostale pozicije u CLC15 i CLC16 su modifikovane na sličan način. „UT“ označava neobrađen uzorak na koji su uzorci tretirani siRNK normalizovani. „Luc“ je korišćen kao kontrola bez ciljanja.
[0218] Eksperiment je sproveden u MS1. Ćelije su zasejane u gustini od 40.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 5 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi CLIC4 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0219] Podaci su prikazani na Slikama 1a i 1b.
Primer 3
[0220] Uticaj 2'-OMe na poziciji 14 prvog lanca na aktivnost siRNK je testiran korišćenjem sekvence koja cilja miša CLIC4. CLC01 je modifikovan sa naizmeničnim 2'-OMe/2'-OH. CLC22 je modifikovan sa 2'-OMe na pozicijama 4, 9 i 14 prvog lanca, dok je CLC28 modifikovan sa 2'-OMe na pozicijama 4, 9 i 15 prvog lanca. Druge niti u CLC22 i CLC28 su modifikovane na sličan način. „UT“ označava neobrađen uzorak na koji su uzorci tretirani siRNK normalizovani. „Luc“ je korišćen kao kontrola bez ciljanja.
[0221] Eksperiment je sproveden u MS1. Ćelije su zasejane u gustini od 40.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 5 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi CLIC4 i Actin mRNK su određeni Taqman qRT-PCR. Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0222] Podaci su prikazani na Slikama 2a i 2b.
Primer 4
[0223] Uticaj 2'-OMe na poziciji 2 prvog lanca na aktivnost siRNK je testiran korišćenjem sekvence koja cilja miša CLIC4. CLC56 je modifikovan sa 2'-OMe na poziciji 2 i 4 prvog lanca i 2'-OH na poziciji 3. Nasuprot tome, CLC57 ima 2'-OH na pozicijama 2 i 4, i 2'-OMe na poziciji 3. Svi ostali položaji prvog i drugog niza su modifikovani na sličan način. „UT“ označava neobrađen uzorak na koji su uzorci tretirani siRNK normalizovani. „Luc“ je korišćen kao kontrola bez ciljanja.
[0224] Eksperiment je sproveden u MS1. Ćelije su zasejane u gustini od 40.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 5 i 1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi CLIC4 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0225] Podaci su prikazani na Slikama 3a i 3b (A).
Primer 5
[0226] Uticaj 2'-OMe na poziciji 2 prvog lanca na aktivnost siRNK je testiran korišćenjem sekvence koja cilja miša CLIC4. CLC56 je modifikovan sa 2'-OMe na poziciji 2 i 4 prvog lanca i 2'-OH na poziciji 3. Nasuprot tome, CLC57 ima 2'-OH na pozicijama 2 i 4, i 2'-OMe na poziciji 3. Svi ostali položaji prvog i drugog niza su modifikovani na sličan način. „UT“ označava neobrađen uzorak na koji su uzorci tretirani siRNK normalizovani. „Luc“ je korišćen kao kontrola bez ciljanja.
[0227] Eksperiment je sproveden u MS1. Ćelije su zasejane u gustini od 40.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 1 do 0,008 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi CLIC4 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0228] Podaci su prikazani na Slikama 3a i 3b (B).
Primer 6
[0229] Uticaj 2'-OMe na poziciji 2 prvog lanca na aktivnost siRNK je testiran korišćenjem sekvence koja cilja miša CLIC4. CLC01 je modifikovan sa naizmeničnim 2'-OMe/2'-OH. CLC28 ima 2'-OMe na poziciji 4 prvog lanca, dok CLC59 ima 2'-OMe na poziciji 2, a CLC60 ima 2'-OMe na poziciji 3 prvog lanca. Svi ostali položaji prvog i drugog niza su modifikovani na sličan način. „UT“ označava neobrađen uzorak na koji su uzorci tretirani siRNK normalizovani. „Luc“ je korišćen kao kontrola bez ciljanja.
[0230] Eksperiment je sproveden u MS1. Ćelije su zasejane u gustini od 40.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transfektovane sa 5 i 1 nM siRNK (A) ili 1 do 0,008 nM siRNK (B) i 1 µg/ml Atufect-a i lizirane nakon 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi CLIC4 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0231] Podaci su prikazani na Slikama 4a i 4b.
Primer 7
[0232] Uticaj 2'-OMe na poziciji 2 prvog lanca na aktivnost siRNK je testiran korišćenjem sekvence koja cilja humani HFE2. U prvoj niti, HFE04 je modifikovan sa 2'-F na poziciji 2 i 2'-OMe na poziciji 3, dok je HFE06 modifikovan sa 2'-OMe na poziciji 2 i 2'-F na poziciji 3. Svi ostali položaji prvog i drugog niza su modifikovani na sličan način. „UT“ označava neobrađen uzorak na koji su uzorci tretirani siRNK normalizovani. „Luc“ je korišćen kao kontrola bez ciljanja.
[0233] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 120.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 72 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi HFE2 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0234] Podaci su prikazani na Slikama 5a i 5b.
Primer 8
[0235] Primeri 8a i 8b predstavljaju biološke replike istog eksperimenta.
[0236] Primer 8a Tolerancija za 2'-OMe je ispitana adresiranjem jedne po jedne pozicije u kontekstu naizmeničnog obrasca (promeniti 2'-OMe u 2'-F i obrnuto). ALD01 je potpuno naizmenično, ALD13 -ALD21 sadrži 2'-F u 2'-Me promene na svim parnim pozicijama prvog lanca, ALD22 - ALD31 sadrži 2'-OMe u 2'-F promene na svim neparnim pozicijama prvog lanca , ALD32 - ALD41 sadrži promene 2'-F u 2'-OMe na svim neparnim pozicijama drugog lanca, ALD42 - ALD50 sadrži promene 2'-OMe u 2'-F na svim parnim pozicijama drugog lanca. ALD13 sadrži 2'-OMe na poziciji prvog lanca 2, ALD19 sadrži 2'-OMe na poziciji prvog lanca 14, ALD35 sadrži 2'-OMe na drugom položaju 7, ALD36 sadrži 2'-OMe na poziciji drugog lanca 9.
[0237] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 0,1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i actin mRNK su određeni Taqman qRT-PCR. Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0238] Sekvence su navedene na Slici 6a, a rezultati su prikazani na Slici 6b.
Primer 8b:
[0239] Tolerancija za 2'-OMe je ispitana adresiranjem jedne po jedne pozicije u kontekstu naizmeničnog obrasca (promeniti 2'-OMe u 2'-F i obrnuto). ALD01 je potpuno naizmenično, ALD13 - ALD21 sadrži 2'-F u 2'-Me promene na svim parnim pozicijama prvog lanca, ALD22 - ALD31 sadrži 2'-OMe u 2'-F promene na svim neparnim pozicijama prvog lanca , ALD32 - ALD41 sadrži promene 2'-F u 2'-OMe na svim neparnim pozicijama drugog lanca, ALD42 - ALD50 sadrži promene 2'-OMe u 2'-F na svim parnim pozicijama drugog lanca. ALD13 sadrži 2'-OMe na poziciji prvog lanca 2, ALD19 sadrži 2'-OMe na poziciji prvog lanca 14, ALD35 sadrži 2'-OMe na položaju 7 druge niti, ALD36 sadrži 2'-OMe na poziciji 9 druge niti.
[0240] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 0,1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i actin mRNK su određeni Taqman qRT-PCR. Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0241] Sekvence su navedene na Slici 6a, a rezultati su prikazani na Slici 6c.
Primer 9
[0242] Uticaj modifikacija na aktivnost dve različite ALDH2 siRNK sekvence
[0243] Eksperiment 9-1 Analizirana je tolerancija položaja 2 i 14 za 2'-OMe u prvom lancu i tolerancija položaja 7 i 9 za 2'-OMe u drugom lancu siRNK protiv ALDH2. ALD58 sadrži naizmenično 2'-OMe/2'-F u oba lanca. ALD59 - ALD61 sadrže 2'-F na poziciji 2 i/ili 14 prvog lanca sa potpuno naizmeničnim drugim nizom, dok ALD62 - ALD64 sadrže 2'-F na poziciji 7 i/ili 9 druge niti sa potpuno naizmeničnom prvom niti. Pozicije 2 (ALD60) i 14 (ALD59) gube aktivnost nakon modifikacije sa 2'-OMe, dok nijedan 2'-OMe na pozicijama 2 i 14 ne obnavlja aktivnost (ALD61). Od drugog lanca, pozicija 7 (ALD63) i pozicija 9 (ALD62) gube aktivnost nakon modifikacije sa 2'OMe, dok nijedan 2'-OMe na pozicijama 7 i 9 ne obnavlja aktivnost (ALD64).
[0244] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 0,1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0245] Rezultati su prikazani na Slikama 7a i b.
Eksperiment 9-2
[0246] Analizirana je tolerancija položaja 2 i 14 za 2'-OMe u prvom lancu i tolerancija položaja 7 i 9 za 2'-OMe u drugoj niti različite siRNK protiv ALDH2. ALD72 sadrži naizmenično 2'-OMe/2'-F u oba lanca. ALD73 - ALD75 sadrže 2'-F na poziciji 2 i/ili 14 prvog lanca sa potpuno naizmeničnim drugim nizom, dok ALD76 - ALD78 sadrže 2'-F na poziciji 7 i/ili 9 druge niti sa potpuno naizmeničnom prvom niti. Pozicije 2 (ALD74) i 14 (ALD73) gube aktivnost nakon modifikacije sa 2'-OMe, dok nijedan 2'-OMe na pozicijama 2 i 14 ne obnavlja aktivnost (ALD75). Od drugog lanca, pozicija 7 (ALD77) i pozicija 9 (ALD76) gube aktivnost nakon modifikacije sa 2'OMe, dok nijedan 2'-OMe na pozicijama 7 i 9 ne obnavlja aktivnost (ALD78).
[0247] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 0,1 nM siRNK i 1µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0248] Rezultati su prikazani na Slikama 8a i b.
Primer 10
[0249] Uticaj modifikacija na aktivnost siRNK koja cilja na DGAT2
[0250] Analizirana je tolerancija položaja 2 i 14 za 2'-OMe u prvom lancu i tolerancija položaja 7 i 9 za 2'-OMe u drugoj niti siRNK protiv DGAT2. DGT01 sadrži naizmenično 2'-OMe/2'-F u oba lanca. DGT02 -DGT04 sadrže 2'-F na poziciji 2 i/ili 14 prvog lanca sa potpuno naizmeničnim drugim nizom, dok DGT05 -DGT07 sadrže 2'-F na poziciji 7 i/ili 9 druge niti sa potpuno naizmeničnom prvom niti. Pozicije 2 (DGT03) i 14 (DGT02) gube aktivnost nakon modifikacije sa 2'-OMe, dok nijedan 2'-OMe na pozicijama 2 i 14 obnavlja aktivnost bar delimično (DGT04). Od drugog lanca, Pozicija 7 (DGT06) i pozicija 9 (DGT05) gube aktivnost nakon modifikacije sa 2'OMe, dok nijedan 2'-OMe na pozicijama 7 i 9 ne obnavlja aktivnost (DGT07).
[0251] Eksperiment je sproveden u Huh-7. Ćelije su zasejane u gustini od 80.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0252] Rezultati su prikazani na Slikama 9a i b.
Primer 11
[0253] Uticaj modifikacija DNK na aktivnost siRNK
[0254] Analizirana je tolerancija pozicija 2 i 14 za modifikaciju DNK u prvom lancu i tolerancija pozicija 7 i 9 za modifikaciju DNK u drugom lancu siRNK prema TMPRSS6. TMP01 sadrži naizmenično 2'-OMe/2'-F u oba lanca. TMP93 sadrži 2'-OMe na poziciji 14 prve niti, dok TMP113 sadrži 2'-H na istoj poziciji. TMP94 sadrži 2'-OMe na poziciji 2 prve niti, dok TMP112 sadrži 2'-H na istoj poziciji. TMP97 sadrži 2'-OMe na poziciji 9 druge niti, dok TMP117 sadrži 2'-H na istoj poziciji. TMP98 sadrži 2'-OMe na poziciji 7 druge niti, dok TMP116 sadrži 2'-H na istoj poziciji.
[0255] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 0,1 nM siRNK i 1µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i Actin mRNK su određeni Taqman qRT-PCR. Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0256] Rezultati su prikazani na Slikama 10 a i b.
Primer 12
[0257] Uticaj modifikacija LNA na aktivnost siRNK
[0258] Analizirana je tolerancija pozicija 2 i 14 za modifikaciju LNA u prvom lancu i tolerancija pozicija 7 i 9 za modifikaciju LNA u drugom lancu siRNK prema TMPRSS6. TMP01 sadrži naizmenično 2'-OMe/2'-F u oba lanca. TMP93 sadrži 2'-OMe na poziciji 14 prve niti, dok TMP111 sadrži LNA na istoj poziciji. TMP94 sadrži 2'-OMe na poziciji 2 prve niti, dok TMP110 sadrži LNA na istoj poziciji. TMP97 sadrži 2'-OMe na poziciji 9 druge niti, dok TMP115 sadrži LNA na istoj poziciji. TMP98 sadrži 2'-OMe na poziciji 7 druge niti, dok TMP114 sadrži LNA na istoj poziciji.
[0259] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 0,1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i Actin mRNK su određeni Taqman qRT-PCR. Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0260] Rezultati su prikazani na Slikama 11a i b.
Primer 13
[0261] Nokaut aktivnost različitih GalNAc-siRNK konjugata koji ciljaju TMPRSS6
13A
[0262] Uticaj 2-O-metilacije na određenim pozicijama lanaca druge niti je istražen u kontekstu GalNAcsiRNK konjugata. Svi konjugati sadrže istu prvu nit. STS12009V23 sadrži potpuno 2'-O-metilovanu drugu nit, STS12009V25 ima jednu 2'-F modifikaciju na poziciji drugog lanca 9, STS12009V26 ima jednu 2'-F modifikaciju na drugom lancu 7, a STS12009V27 ima tri 2'- modifikacije na pozicijama drugog lanca 7-9.
[0263] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 5 do 0,005 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 72 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi TMPRSS6 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
13B
[0264] Uticaj 2-O-metilacije na određenim pozicijama niti druge niti je istražen u kontekstu GalNAc-siRNK konjugata. Svi konjugati sadrže istu prvu nit. STS12009V41L4 sadrže drugu nit sa naizmeničnim 2'-F/2'-OMe, STS12009V23 sadrži potpuno 2'-O-metilovanu drugu nit, STS12009V25 ima jednu 2'-F modifikaciju na drugom lancu 9, STS12009V26 ima jedan 2'-F modifikacija na drugom lancu 7, a STS12009V27 ima tri 2'-F modifikacije na pozicijama drugog lanca 7-9.
[0265] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 10 do 0,001 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 72 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi TMPRSS6 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
13C
[0266] Uticaj 2-O-metilacije na određenim pozicijama niti druge niti je istražen u kontekstu GalNAc-siRNK konjugata. Svi konjugati sadrže istu prvu nit. STS12009V23 sadrži potpuno 2'-O-metilovanu drugu nit, STS12009V25 ima jednu 2'-F modifikaciju na poziciji drugog lanca 9, STS12009V26 ima jednu 2'-F modifikaciju na drugom lancu 7, a STS12009V27 ima tri 2'- modifikacije na pozicijama drugog lanca 7-9.
[0267] Eksperiment je sproveden u primarnim hepatocitima miša. Ćelije su zasejane u gustini od 250.000 ćelija po 6-udubljenja i tretirane sa 100 do 0,25 nM GalNAc-siRNK. Transfekcije sa 10 nM GalNAc-siRNK i 1 µg/ml Atufect su služile kao kontrola.
[0268] Ćelije su lizirane nakon 24 h, ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi TMPRSS6 i mRNK aktina su određeni Taqman qRT-PCR. Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0269] Rezultati su prikazani na Slikama 12a - b.
Primer 14
[0270] Uticaj modifikacije DNK na više pozicija
[0271] Analizirana je tolerancija položaja 2 i 14 za DNK u prvom lancu i tolerancija položaja 7-9 za DNK u drugom lancu siRNK prema TMPRSS6. TMP70 sadrži naizmenično 2'-OMe/2'-F u oba lanca, dok TMP119 sadrži 2'-OMe na svim pozicijama osim na pozicijama prve niti 2 i 14 i pozicijama druge niti 7-9. TMP120-TMP126 sadrže različit broj DNK supstitucija na 2'-F pozicijama.
[0272] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 1 i 0,1 nM siRNK i 1µg/ml Atufect posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi TMPRSS6 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0273] Rezultati su prikazani na Slikama 13a i b.
Primer 15
[0274] Ugradnja DNK na ključne pozicije.
[0275] Tolerancija pozicija prve niti 2 i 14 za DNK i tolerancija položaja druge niti 7-9 za DNK je analizirana sa siRNK ciljanom na humani ALDH2. ALD58 sadrži naizmenične 2'-OMe/2'-F u obe niti, dok ALD61 i ALD90-ALD92 sadrže redukovani 2'-F obrazac u prvoj niti sa DNK na poziciji 2 (ALD90), DNK na poziciji 14 (ALD91) i DNK na pozicijama 2 i 14 (ALD92), ALD93-ALD96 sadrže smanjeni 2'-F obrazac u drugoj niti sa DNK na poziciji 7 (ALD94), DNK na poziciji 9 (ALD95) i DNK na pozicijama 7 i 9 ( ALD96). ALD97 sadrži 2'-F na pozicijama 7, 8 i 9 druge niti, dok ALD98 sadrži DNK na ovim pozicijama.
[0276] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 0,1 i 0,01 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0277] Podaci su prikazani na Slikama 14a i b.
Primer 16
[0278] Ugradnja DNK na ključne pozicije.
[0279] Tolerancija pozicija prve niti 2 i 14 za DNK i tolerancija položaja druge niti 7-9 za DNK je analizirana sa drugom siRNK ciljanom na humani ALDH2. ALD72 sadrži naizmenične 2'-OMe/2'-F u obe niti, dok ALD75 i ALD99-ALD101 sadrže smanjeni 2'-F obrazac u prvoj niti sa DNK na poziciji 2 (ALD99), DNK na poziciji 14 (ALD100) i DNK na pozicijama 2 i 14 (ALD101). ALD102-ALD105 sadrže smanjeni 2'-F uzorak u drugoj niti sa DNK na poziciji 7 (ALD103), DNK na poziciji 9 (ALD104) i DNK na poziciji 7 i 9 (ALD105). ALD106 sadrži 2'-F na pozicijama 7, 8 i 9 druge niti, dok ALD107 sadrži DNK na ovim pozicijama.
[0280] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 0,1 i 0,01 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0281] Podaci su prikazani na Slikama 15a i b.
Primer 17
[0282] Ugradnja DNK na ključne pozicije.
[0283] Tolerancija pozicija prve niti 2 i 14 za DNK i tolerancija položaja druge niti 7-9 za DNK je analizirana sa siRNK ciljanom na humani DGAT2. DGT01 sadrži naizmenične 2'-OMe/2'-F u obe niti, dok DGT04 i DGT11-DGT13 sadrže smanjeni 2'-F obrazac u prvoj niti sa DNK na poziciji 2 (DGT11), DNK na poziciji 14 (DGT12) i DNK na pozicijama 2 i 14 (DGT13). DGT14-DGT17 sadrže smanjeni 2'-F uzorak u drugoj niti sa DNK na poziciji 7 (DGT15), DNK na poziciji 9 (DGT16) i DNK na poziciji 7 i 9 (DGT17).
DGT18 sadrži 2'-F na pozicijama 7, 8 i 9 druge niti, dok DGT19 sadrži DNK na ovim pozicijama.
[0284] Eksperiment je sproveden u Huh7. Ćelije su zasejane u gustini od 80.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 10 i 1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect posle 24 h i lizirane posle 72 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi DGAT2 i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0285] Podaci su prikazani na Slikama 16a i b.
Primer 18
[0286] Inkorporacija 2'-O-metoksietil (MOE) na ključnim pozicijama.
[0287] Tolerancija položaja prvog lanca 2 i 14 za 2'-O-MOE i tolerancija položaja drugog lanca 7 i 9 za 2'-O-MOE analizirana je siRNK koja cilja ALDH2. ALD108 sadrži smanjen broj 2'-F u obe niti. U ovom kontekstu, 2'-O-MOE se postavlja na poziciju 2 (ALD115), na poziciju 14 (ALD116) ili na obe pozicije 2 i 14 prve niti (ALD117). Slično, 2'-O-MOE se postavlja na poziciju 7 (ALD118), poziciju 9 (ALD119) ili na obe pozicije 7 i 9 druge niti (ALD120). SiRNK protiv luciferaze je korišćena kao ne ciljana kontrola („Luc“).
[0288] Eksperiment je sproveden u Hep3B. Ćelije su zasejane u gustini od 150.000 ćelija po 6-udubljenja, transfektovane sa 0,1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect-a posle 24 h i lizirane posle 48 h. Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi ALDH2 i Actin mRNK su određeni Taqman qRT-PCR. Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0289] Podaci su prikazani na Slikama 17a i b.
Primer 19
[0290] Identifikacija ključnih pozicija u prvoj niti.
[0291] Tolerancija za 2'-OMe je istraživana adresiranjem jedne po jedne pozicije u kontekstu naizmeničnog obrasca (promena 2'-OMe u 2'-F i obrnuto) u siRNK koja cilja GHR. GHR03 sadrži potpuno naizmenične 2'-OMe/2'-F, GHR07 - GHR15 sadrže 2'-F u 2'-OMe promene na svim parnim pozicijama prve niti, GHR16 -GHR25 sadrže 2'-OMe u 2'-F menja na svim neparnim pozicijama prve niti. GHR07 sadrži 2'-OMe na poziciji prve niti 2, GHR13 sadrži 2'-OMe na poziciji prve niti 14. Kao kontrola je korišćena siRNK koja cilja Luciferazu („Luc“).
[0292] Eksperiment je sproveden u MCF-7 ćelijama. Ćelije su zasejane u gustini od 120.000 ćelija po 6 udubljenja 24 h pre transfekcije, transficirane sa 1 nM siRNK i 1 µg/ml Atufect i lizirane nakon 48 h.
Ukupna RNK je ekstrahovana i nivoi GHR i PTEN mRNK su određeni Taqman qRT-PCR Svaka traka predstavlja srednju vrednost ± SD od tri tehnička ponavljanja.
[0293] Podaci su prikazani na Slikama 18a i b.
4
4
Ključ
[0294]
A, U, C, G - RNK mA, mU, mC, mG - 2'-OMe RNK
fA, fU, fC, fG - 2'-F RNK
(ps) - fosforotioat
[A], [U], [C], [G] - 2'-H (DNK)
{A}, {U}, {C}, {G} - LNA
GalNAc - [ST23 (ps)]3 ST41 (ps)
(MOE-U), (MOE-C) - 2'metoksietil RNK
[0295] Iznad navedene sekvence mogu biti obelodanjene sa veznikom ili ligandom, kao što su GalNAC ili (ps) ili (ps2) veze, na primer. Oni čine opcioni, ali poželjni deo sekvence liste sekvenci.
[0296] Mogu se koristiti sledeće skraćenice:
4
4

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Nukleinska kiselina za inhibiciju ekspresije ciljnog gena u ćeliji, koja obuhvata najmanje jedan dupleks region koji sadrži najmanje deo prve niti i najmanje deo druge niti koji je bar delimično komplementaran prvoj niti, pri čemu je navedena prva nit barem delimično komplementarna najmanje delu RNK transkribovanog sa navedenog ciljnog gena,
pri čemu su svi nukleotidi nukleinske kiseline modifikovani na 2' poziciji šećera, pri čemu su pozicije 2 i 14 na prvoj niti počevši od 5' kraja modifikovani sa 2' fluoro,
pri čemu je nukleinska kiselina modifikovana na prvoj niti sa naizmeničnim 2' O-metil modifikacijama i 2' fluoro modifikacijama, i
pri čemu je druga nit modifikovana sa 2' fluoro modifikacijama na pozicijama 11-13, računajući od 3' kraja počevši od prve pozicije regiona dvostruke niti, a preostale modifikacije su 2' O-metil modifikacije.
2. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 1, gde je terminalni nukleotid na 3' kraju najmanje jedne od prve niti i druge niti invertovani nukleotid i vezan je za susedni nukleotid preko 3' ugljenika terminalnog nukleotida i 3' ugljenik susednog nukleotida i/ili terminalni nukleotid na 5' kraju najmanje jedne od prve niti, a druga niti je obrnuti nukleotid i vezan je za susedni nukleotid preko 5' ugljenika terminala nukleotida i 5' ugljenika susednog nukleotida, ili gde nukleinska kiselina sadrži fosforoditioatnu vezu.
3. Nukleinska kiselina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je nukleinska kiselina sa tupim krajevima na oba kraja.
4. Nukleinska kiselina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde su prva i druga nit dužine 19 nukleotida.
5. Nukleinska kiselina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je nukleinska kiselina sa tupim krajevima na oba kraja i svaka prva i druga nit imaju dužinu od 19 nukleotida.
6. Konjugovana nukleinska kiselina, koja sadrži nukleinsku kiselinu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, konjugovanu sa ligandom.
7. Konjugovana nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 6, gde je nukleinska kiselina konjugovana sa ligandom formule (III):
[S-X<1>-P-X2]3-A-X3- (III)
gde:
S predstavlja saharid;
X<1>predstavlja C3-C6alkilen ili (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- gde je m 1, 2 ili 3;
P je fosfat ili modifikovani fosfat;
X<2>je alkilen etar formule -C3H6-O-CH2-;
A je razgranata jedinica;
X<3>je alkilen etar formule izabran iz grupe koju čine -CH2-O-C4H8-, - CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, i -CH2-O-C8H16-, pri čemu je u svakom slučaju -CH2- grupa vezana za A, pri čemu je nukleinska kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 konjugovana sa X<3>preko fosfata ili modifikovanog fosfata.
8. Konjugovana nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 7, gde je P formule (III) tiofosfat.
9. Konjugovana nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 7 ili 8, pri čemu je nukleinska kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 konjugovana sa X<3>preko tiofosfata.
10. Sastav koji sadrži nukleinsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili konjugovanu nukleinsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 9 i fiziološki prihvatljiv ekscipijens.
11. Nukleinska kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili konjugovana nukleinska kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 9 ili sastav prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaja.
4
RS20221162A 2017-04-05 2018-04-05 Proizvodi i sastavi RS63836B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17165129 2017-04-05
GBGB1707203.4A GB201707203D0 (en) 2017-05-05 2017-05-05 Modified positions
GBGB1708397.3A GB201708397D0 (en) 2017-05-25 2017-05-25 Modified positions
EP17201352 2017-11-13
EP18715706.0A EP3607069B1 (en) 2017-04-05 2018-04-05 Products and compositions
PCT/EP2018/058766 WO2018185241A1 (en) 2017-04-05 2018-04-05 Products and compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63836B1 true RS63836B1 (sr) 2023-01-31

Family

ID=61899311

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221162A RS63836B1 (sr) 2017-04-05 2018-04-05 Proizvodi i sastavi

Country Status (16)

Country Link
US (3) US11015198B2 (sr)
EP (2) EP3607069B1 (sr)
JP (3) JP7155239B2 (sr)
CN (1) CN110520531A (sr)
AU (1) AU2018247925B2 (sr)
DK (1) DK3607069T3 (sr)
ES (1) ES2932831T3 (sr)
FI (1) FI3607069T3 (sr)
HR (1) HRP20221400T1 (sr)
HU (1) HUE061247T2 (sr)
IL (2) IL321221A (sr)
LT (1) LT3607069T (sr)
PL (1) PL3607069T3 (sr)
RS (1) RS63836B1 (sr)
SI (1) SI3607069T1 (sr)
WO (1) WO2018185241A1 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3277811B1 (en) 2015-04-03 2020-12-23 University of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
US10633653B2 (en) 2015-08-14 2020-04-28 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
WO2017132669A1 (en) 2016-01-31 2017-08-03 University Of Massachusetts Branched oligonucleotides
CA3033368A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
EP3483269A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-15 Silence Therapeutics GmbH Products and compositions
EP4029942A1 (en) 2017-04-05 2022-07-20 Silence Therapeutics GmbH Products and compositions
WO2018185240A1 (en) * 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Products and compositions
JP7155239B2 (ja) 2017-04-05 2022-10-18 サイレンス・セラピューティクス・ゲーエムベーハー 産物及び組成物
JP7406793B2 (ja) 2017-06-23 2023-12-28 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ ２テイル自己デリバリー型ｓｉＲＮＡおよび関連方法
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
MX2020004897A (es) 2017-11-13 2020-10-05 Silence Therapeutics Gmbh Acidos nucleicos para inhibir la expresion de lpa en una celula.
CA3083968C (en) * 2017-12-01 2024-04-23 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
WO2019143621A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting aldh2 expression
EP3598995A1 (en) * 2018-07-26 2020-01-29 Silence Therapeutics GmbH Products and compositions
JP7627042B2 (ja) * 2018-08-23 2025-02-05 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ Ｏ－メチルリッチ完全安定化オリゴヌクレオチド
BR112021009213A2 (pt) 2018-11-13 2021-08-10 Silence Therapeutics Gmbh ácidos nucleicos para inibição da expressão de lpa em uma célula
KR20210116509A (ko) * 2019-01-16 2021-09-27 젠자임 코포레이션 Serpinc1 irna 조성물 및 그의 이용 방법
CN113614232A (zh) 2019-01-18 2021-11-05 马萨诸塞大学 动态药代动力学修饰锚
CA3135402A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression in the central nervous system
MX2022001710A (es) 2019-08-09 2022-05-10 Univ Massachusetts Oligonucleótidos modificados químicamente dirigidos a los snp.
JP2022545118A (ja) * 2019-08-23 2022-10-25 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ Ｏ－メチルリッチ完全安定化オリゴヌクレオチド
US12365894B2 (en) 2019-09-16 2025-07-22 University Of Massachusetts Branched lipid conjugates of siRNA for specific tissue delivery
EP4048801A4 (en) * 2019-10-24 2023-11-22 Genevant Sciences Gmbh Conjugates and methods for treating acromegaly
KR20220163960A (ko) 2020-03-06 2022-12-12 알리고스 테라퓨틱스 인코포레이티드 변경된 짧은 개재성 핵산(siNA) 분자 및 이의 용도
WO2021242883A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 University Of Massachusetts Synthetic oligonucleotides having regions of block and cluster modifications
JP2023549011A (ja) 2020-09-15 2023-11-22 ヴァーヴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 遺伝子編集のための脂質製剤
AU2021373262A1 (en) 2020-11-04 2023-06-01 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acids for inhibiting expression of pros1 in a cell
MX2023008469A (es) * 2021-01-22 2023-11-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc Oligonucleotidos de doble hebra modificados.
WO2022184852A1 (en) * 2021-03-03 2022-09-09 Silence Therapeutics Gmbh Conjugated nucleic acids comprising a phosphorodithioate for inhibiting gene expression in a cell
WO2022204430A1 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Atalanta Therapeutics, Inc. Double-stranded sirna having patterned chemical modifications
AU2022299169A1 (en) 2021-06-23 2024-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Optimized anti-flt1 oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders
IL312811A (en) 2021-11-16 2024-07-01 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co Ltd Composition and method for inhibiting angiotensinogen (agt) protein expression
EP4493570A2 (en) 2022-03-16 2025-01-22 Empirico Inc. Galnac compositions for improving sirna bioavailability
KR20240163743A (ko) 2022-03-28 2024-11-19 엠피리코 인크. 변형된 올리고뉴클레오티드
EP4687983A1 (en) 2023-03-27 2026-02-11 Silence Therapeutics GmbH Compounds and compositions for use in stem cell transplantation
WO2024245151A1 (zh) * 2023-05-26 2024-12-05 维亚臻生物技术（苏州）有限公司 一种用于代谢疾病的双链核苷酸化合物及其应用
AU2024321098A1 (en) * 2023-08-09 2026-03-19 Beijing Foyou Pharma Co., Ltd Sirna for inhibiting dgat2 gene expression, sirna conjugate or prodrug and pharmaceutical composition thereof, and use thereof
TW202602463A (zh) 2024-03-22 2026-01-16 日商武田藥品工業股份有限公司 用於抑制細胞色素ｐ４５０家族７次家族ａ成員１（ｃｙｐ７ａ１）表現之組成物及方法
CN118460651B (zh) * 2024-07-10 2025-03-18 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 制备Cemdisiran的方法

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US7667030B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
KR20080036650A (ko) 2005-08-17 2008-04-28 시르나 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 Ｒｎａ 간섭을 매개하는 화학적으로 변형된 짧은 간섭 핵산분자
US20090306178A1 (en) * 2006-03-27 2009-12-10 Balkrishen Bhat Conjugated double strand compositions for use in gene modulation
US20110046206A1 (en) * 2007-06-22 2011-02-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
MX2010008394A (es) 2008-01-31 2010-11-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Metodos optimizados para administracion de arndc focalizando el gen pcsk9.
US10131904B2 (en) 2008-02-11 2018-11-20 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified RNAi polynucleotides and uses thereof
EP2342616A2 (en) 2008-09-23 2011-07-13 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
US9493774B2 (en) * 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
CA2812046A1 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified irna agents
WO2012094115A1 (en) 2010-12-17 2012-07-12 Arrowhead Research Corporation Compositions and methods for inhibiting expression of flt3 genes
CA2834610A1 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Rna interference mediated inhibition of isocitrate dehydrogenase (idh1) gene expression
HRP20181564T1 (hr) 2011-06-30 2018-11-30 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Pripravci i postupci za inhibiciju ekspresije gena virusa hepatitisa b
EP2780454A2 (en) * 2011-11-18 2014-09-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
HUE048622T2 (hu) * 2011-11-18 2020-08-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc RNSi szerek, készítmények és alkalmazási eljárások transztiretin (TTR) asszociált betegségek kezelésére
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9127274B2 (en) 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
US10125369B2 (en) * 2012-12-05 2018-11-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PCSK9 iRNA compositions and methods of use thereof
DK2991656T3 (da) * 2013-05-01 2020-03-23 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af apolipoprotein c-iii-ekspression
KR102486617B1 (ko) * 2013-05-22 2023-01-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｔｍｐｒｓｓ6 조성물 및 이의 사용 방법
JP6702862B2 (ja) 2013-07-11 2020-06-03 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチド−リガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法
WO2015188194A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
WO2016085852A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
US20160272970A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Arrowhead Madison Inc. RNA Interference Agents
JP2018509913A (ja) 2015-03-17 2018-04-12 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 第ｘｉｉ因子の遺伝子発現を阻害するための組成物と方法
EP3277811B1 (en) 2015-04-03 2020-12-23 University of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
SMT202000454T1 (it) 2015-04-03 2020-11-10 Univ Massachusetts Cmposti oligonucleotidici per bersagliare l'mrn della huntingtina
KR20180038465A (ko) 2015-08-07 2018-04-16 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 Ｂ형 간염 바이러스 감염에 대한 ｒｎａｉ 치료법
US10633653B2 (en) * 2015-08-14 2020-04-28 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
JOP20160211B1 (ar) 2015-10-01 2021-08-17 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
EP3228326A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
WO2017214112A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. 5'-cyclo-phosphonate modified nucleotides
JOP20190015A1 (ar) 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
BR112019014282A2 (pt) 2017-01-10 2020-03-03 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Agentes de rnai de antitripsina (aat) alfa-1, composições incluindo agentes de rnai de aat, e métodos de uso
AU2018213379A1 (en) 2017-01-30 2019-07-18 Arrowhead Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibition of factor XII gene expression
WO2018185240A1 (en) * 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Products and compositions
JP7155239B2 (ja) * 2017-04-05 2022-10-18 サイレンス・セラピューティクス・ゲーエムベーハー 産物及び組成物
US10597657B2 (en) 2017-09-11 2020-03-24 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents and compositions for inhibiting expression of apolipoprotein C-III (APOC3)
MX2020001912A (es) 2017-09-14 2020-03-24 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de iarn y composiciones para inhibir la expresion de la angiopoyetina tipo 3 (angptl3) y metodos de uso.
MX2020004897A (es) * 2017-11-13 2020-10-05 Silence Therapeutics Gmbh Acidos nucleicos para inhibir la expresion de lpa en una celula.
CA3083968C (en) 2017-12-01 2024-04-23 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
BR112021009213A2 (pt) * 2018-11-13 2021-08-10 Silence Therapeutics Gmbh ácidos nucleicos para inibição da expressão de lpa em uma célula

Also Published As

Publication number Publication date
ES2932831T3 (es) 2023-01-26
FI3607069T3 (fi) 2023-01-13
IL268828B1 (en) 2025-07-01
EP3607069B1 (en) 2022-11-02
US12084656B2 (en) 2024-09-10
JP7583005B2 (ja) 2024-11-13
EP4219713A3 (en) 2023-08-16
WO2018185241A1 (en) 2018-10-11
IL268828B2 (en) 2025-11-01
DK3607069T3 (da) 2022-11-21
PL3607069T3 (pl) 2023-03-06
SI3607069T1 (sl) 2023-02-28
IL321221A (en) 2025-07-01
AU2018247925A1 (en) 2019-10-03
US20200095580A1 (en) 2020-03-26
EP4219713A2 (en) 2023-08-02
JP2020516312A (ja) 2020-06-11
JP7155239B2 (ja) 2022-10-18
IL268828A (en) 2019-10-31
HRP20221400T1 (hr) 2023-01-06
US11015198B2 (en) 2021-05-25
JP2024147806A (ja) 2024-10-16
CA3057565A1 (en) 2018-10-11
CN110520531A (zh) 2019-11-29
US20250043288A1 (en) 2025-02-06
US20220090067A1 (en) 2022-03-24
JP7823127B2 (ja) 2026-03-03
EP3607069A1 (en) 2020-02-12
HUE061247T2 (hu) 2023-06-28
AU2018247925B2 (en) 2024-06-06
LT3607069T (lt) 2023-01-10
JP2022173554A (ja) 2022-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7823127B2 (ja) 産物及び組成物
US20240200071A1 (en) Nucleic acids for inhibiting expression of a target gene comprising phosphorodithioate linkages
JP7419252B2 (ja) アンチセンス鎖の５’末端でビニルホスホネートを有するｓｉＲＮＡ
EP3550021A1 (en) Products and compositions for inhibiting expression of a target gene
EP4029942A1 (en) Products and compositions
CA3057565C (en) Products and compositions
RU2812806C2 (ru) Нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии гена-мишени, содержащие фосфодитиоатные связи
HK40020523B (en) Products and compositions
HK40020523A (en) Products and compositions
HK40067116A (en) Products and compositions
HK40032259A (en) Nucleic acids for inhibiting expression of a target gene comprising phosphorodithioate linkages
HK40016476A (en) Products and compositions