RS64008B1 - Rep protein kao antigen proteina za upotrebu u dijagnostičkim testovima - Google Patents

Rep protein kao antigen proteina za upotrebu u dijagnostičkim testovima

Info

Publication number
RS64008B1
RS64008B1 RS20230165A RSP20230165A RS64008B1 RS 64008 B1 RS64008 B1 RS 64008B1 RS 20230165 A RS20230165 A RS 20230165A RS P20230165 A RSP20230165 A RS P20230165A RS 64008 B1 RS64008 B1 RS 64008B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rep
protein
antibody
sample
seq
Prior art date
Application number
RS20230165A
Other languages
English (en)
Inventor
Hausen Harald Zur
Villiers Ethel-Michele De
Timo Bund
Sebastian Eilebrecht
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Dkfz
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Dkfz filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Dkfz
Publication of RS64008B1 publication Critical patent/RS64008B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material
    • G01N2496/80—Multi-analyte reference solutions containing cholesterol, glucose and the like
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za dijagnostikovanje multiple skleroze (MS) pri čemu najmanje 2-struko povećanje količine sa proteinom povezanim sa DNK replikacijom (Rep) ili najmanje 2-struko povećanu količinu anti-Rep antitela u uzorku od subjekta u poređenju sa količinom u kontrolnom uzorku se dovodi u vezu sa dijagnozom multiple skleroze (MS). Specifično, ovaj se pronalazak odnosi na Rep protein kodiran MSBI1 genomom. Ovaj pronalazak se definiše priloženim patentnim zahtevima. Izvođenja pronalaska i opisi koji više ne spadaju pod obim priloženih patentnih zahteva se posmatraju samo kao primeri pogodni za razumevanje ovog pronalaska.
[0002] Povod za pojavu multiple skleroze (MS) nije ustanovljen. Dakle, postoji potražnja za biomarkerom za multipla sklerozu (MS) koji bi se mogao koristiti za dijagnostikovanje MS i/ili nadgledanje MS ili lečenje MS i/ili procenu predispozicije za MS.
[0003] Multipla skleroza (MS) se karakteriše demijelinizacijom MS lezija koje oštećuju nervne ćelije u mozgu i kičmenoj moždini. MS simptomi se javljaju kao epizode iznenadnog pogoršanja (relapsa, pogoršanja zdravstvenog stanja, napad bolesti, oboljenja organa) ili kao postepeno pogoršanje tokom vremena (progresivni oblici). Demijelinizacija počinje upalne procese koji aktiviraju T ćelije i otpuštaju citokine i antitela. Za dijagnozu multiple skleroze (MS), između ostalog, neurološko snimanje, analiza cerebrospinalnog fluida i izazvao potencijale se koriste.
[0004] Spektar od 17 različitih, ali delimično srodnih DNK molekula su izolovani iz različitih testnih materijala (tkivo mozga sa multipla sklerozom (MS), serumi goveda, mleko) (Funk, Gunst et al.2014, Gunst, Zur Hausen et al.2014, Lamberto, Gunst et al. 2014, Whitley, Gunst et al. 2014). Među ovim izolatima dva DNK molekula su blisko povezana sa prenosivom encefalopatijom sunđerastog oblika (TSE)-povezanog izolata Sfinge Sphinx 1.76 (1.758 bp; pristupni broj HQ444404, (Manuelidis L.2011)) su izolovani iz moždanog tkiva pacijenata obolelih od multiple skleroze (MS). Ovi izolati su MSBI1.176 (MSBI, multipla skleroza izolata mozga) (1.766 bp) i MSBI2.176 (1.766 bp) koji su naznačeni kao "MSBI1 genom" i "MSBI2 genom", prema opisanom redosledu. MSBI 1.176 deli 98%-nu sličnost nukleotida sa sekvencom Sfinge Sphinx 1.76. Veliki otvoreni otvoreni okviri čitanja (ORFs) izolata kodiraju pretpostavljenu DNK replikaciju proteina koji dela visoku sličnost između njih. Još jedna zajednička karakteristika je prisustvo iteronu sličnih tandem ponavljanja. Poravnanje ovog regiona ponavljanja ukazuje na varijaciju u jezgru pojedinačnih nukleotida. Ova ponavljanja slična iteronu mogu da čine mesta vezivanja za Rep proteine. Sekvence izolata su deponovane u bazi podataka EMBL Databank pod pristupnim brojevima LK931491 (MSBI1.176) i LK931492 (MSBI2.176) (Whitley C. et al.2014) i poravnate su i opisane u WO 2016/005064.
[0005] Dalji izolati su dobijeni iz kravljeg mleka. Ovi izolati kravljeg mleka (CMI) su bili CMI1.252, CMI2.214 i CMI3.168 koji su naznačeni kao "CMI1 genom", "CMI2 genom" i "CMI3 genom", prema opisanom redosledu. Sekvence izolata su deponovane u bazu podataka EMBL Databank pod pristupnim brojevima LK931487 (CMI1.252), LK931488 (CMI2.214) i LK931489 (CMI3.168) i poravnate su i opisane u WO 2016/005064.
[0006] EP 2868751 opisuje postupak za detektovanje polipeptida kodiranog HCBI polinukleinskom kiselinom.
[0007] EP 2966176 analize za nukleinske kiseline u uzorcima kod ljudi i životinja koji liče na virusne ili bakterijske patogenei opisuje izolat MSBI1.176. MSBI1
[0008] Ovi pronalazači su utvrdili da MSBI1 genom pokazuje značajnu proizvodnju transkribovane RNK i MSBI1 genomom kodiranog Rep proteina se eksprimuje u ćelijama čoveka. Ovi pronalazači su utvrdili da MSBI1 i MSBI2 genomom kodiran Rep protein (MSBI1 Rep i MSBI2 Rep) predstavlja biomarker u ogledima testova za utvrđivanje patogenosti. Kako protein povezan sa DNK replikacijom (RepB) Rep protein ima DNK aktivnost vezivanja i može da bude ključan za inicijaciju replikacije epizomalnih ili virusnih DNK molekula. Rep proteini, koji su strukturno slični MSBI1 genomom kodiran Rep prema ovom pronalasku, pokazuju označen potencijal samooligomerizacije i agregacije, što je opisano unutar prokariotskih sistema in vivo i in vitro (Giraldo, Moreno-Diaz de la Espina et al. 2011, Torreira, Moreno-Del Alamo et al. 2015).
[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje platformu za oglede specifičnih patogena, dijagnostičkog pregledanja na osnovu upotrebe Rep proteina kao antigena.
[0010] U izvesnim izvođenjima anti-Rep antitela se koriste kao patogeni markeri usled veze patogene aktivnosti izolovanog DNK (MSBI1) agensa sa eksprimovanjem Rep proteina. Serumi pacijenta koji sadrže povećane količine anti-Rep antitela ukazuju da je odgovarajući pacijent bio definitivno izložen proteinima povezanim sa Rep-om ili samom eksprimovanom Rep-u tokom vremenskog perioda dovoljno dugo da se pokrene odgovor imunog sistema specifičan za Rep. Kao cilj za humana antitela Rep protein se koristi kao antigen. Na osnovu kvantifikovanja količine anti Rep antitela akutne multiple skleroze (MS) kao i predisponiranost za multiplu sklerozu (MS) može da se dijagnostikuje ili nadgleda. Zbog toga što je prepoznato da je povećana količina indukovanih anti-Rep antitela ili eksprimovanog Rep proteina u uzorku ukazuje na pojavu i/ili status multiple skleroze (MS), povećana količina anti-Rep antitela i Rep proteina, prema opisanom redosledu, moguće je koristiti kao patogeni biomarker za dijagnozu multiple skleroze (MS).
[0011] Kao prednost, patogeni biomarker za multiplu sklerozu moguće je detektovati u uzorcima krvi, kao što su uzorci seruma ili plazme, i nije neophodno dobiti uzorke iz cerebrospinalnog fluida.
[0012] Otuda, ovaj pronalazak obezbeđuje protein povezan sa DNK replikacijom (Rep) za upotrebu u dijagnozi multiple skleroze (MS). Rep protein se kodira MSBI1 genomom i obuhvata (i) sekvencu aminokiseline prikazanu u SEK ID BR:1;
(ii) fragment SEK ID BR:1 koji je sposoban za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline: kako je prikazano u SEK ID BR: 1; ili
(iii) sekvenca aminokiseline ima 90% ili više homologa na sekvencu aminokiseline (i) ili (ii) i sposoban je za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR: 1.
[0013] Još jedan Rep protein nije deo ovog pronalaska za koji se traži zaštita je kodiran pomoću MSBI2 genoma i obuhvata (i) sekvencu aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR: 8;
(ii) fragment SEK ID BR:8 koji je sposoban za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline: kako je prikazano u SEK ID BR: 8; ili
(iii) sekvence aminokiseline koja ima 90% ili veću homologiju na sekvenci aminokiseline od (i) ili (ii) i sposoban je za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline: kako je prikazano u SEK ID BR: 8.
[0014] Još jedan Rep protein koji nije deo ovog pronalaska za koji se traži zaštita je kodiran pomoću CMI1 genoma i obuhvata (i) sekvencu aminokiseline kao što je prikazano u SEK ID BR:10;
(ii) fragment SEK ID BR:10 koji je sposoban za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline: kako je prikazano u SEK ID BR: 10; ili
(iii) sekvenca aminokiseline ima 90% ili više homologa na sekvencu aminokiseline iz (i) ili (ii) i sposobna je za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR: 10.
[0015] Još jedan Rep protein nije deo ovog pronalaska za koji se traži zaštita je kodiran pomoću CMI2 genoma i obuhvata (i) sekvencu aminokiseline kao što je prikazano u SEK ID BR:11;
(ii) fragment SEK ID BR:11 koji je sposoban za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline: kako je prikazano u SEK ID BR: 11; ili
(iii) sekvencu aminokiseline koja ima 90% ili više homologa prema sekvenci aminokiseline (i) ili (ii) i sposoban je za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR: 11.
[0016] Još jedan Rep protein nije deo ovog pronalaska za koji se traži zaštita je kodiran pomoću CMI3 genoma i obuhvata (i) sekvencu aminokiseline kao što je prikazano u SEK ID BR:12;
(ii) fragment SEK ID BR:12 koji je sposoban za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline: kako je prikazano u SEK ID BR: 12; ili
(iii) sekvencu aminokiseline koja ima 90% ili više homologa na sekvencu aminokiseline iz (i) ili (ii) i sposobna je za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji obuhvata sekvence aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR: 12.
[0017] Povećana količina Rep proteina u uzorku iz subjekta u poređenju sa količinom Rep proteina u kontrolnom uzorku se dovodi u vezu sa dijagnozom multiple skleroze (MS), t.j ukazuje na multipla sklerozu (MS). Prema ovom pronalasku dijagnoza multiple skleroze (MS) ili predispozicija za oboljevanje od multiple skleroze (MS) se vidi iz povećane količine Rep proteina najmanje 2-struke vrednosti u poređenju sa kontrolnim uzorkom.
[0018] U drugim izvođenjima povećana količina anti-Rep antitela u uzorku iz subjekta u poređenju sa količinom anti-Rep antitela u kontrolnom uzorku se dovodi u vezu sa dijagnozom multiple skleroze (MS), t.j. pokazatelj je multiple skleroze (MS). Prema ovom pronalasku dijagnoza multiple skleroze (MS) ili predispozicija za oboljevanje od multiple skleroze (MS) se vidi iz povećane količine anti-Rep antitela čija je najmanja 2-struka vrednost u poređenju sa kontrolnim uzorkom.
[0019] Rep protein iz ovog pronalaska moguće je koristiti u zapravo bilo kom formatu ogleda koji koristi poznat antigen da bi se detektovala antitela ili ćelijom posredovani odgovori imunog sistema. Dakle, ovaj pronalazak takođe obuhvata detekciju ćelijom posredovanih, npr. T ćelijom posredovanih odgovora imunog sistema naspram Rep proteina.
[0020] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak dijagnostikovanja multiple skleroze (MS) kod subjekta koji obuvhata korake
(a) inkubacije uzorka dobijenog iz subjekta sa Rep proteinom;
(b) detektovanje količine antitela u uzorku iz subjekta koji formira imunološki kompleks sa Rep proteinom; i
(c) dovođenje u vezu najmanje 2-struko povećane količine antitela vezanog na Rep protein, u poređenju sa količinom u kontrolnom uzorku, sa dijagnozom multiple skleroze (MS).
[0021] U specifičnim izvođenjima Rep protein se imobiliše, npr. spojen je na potporu ili nosač, posle čega sledi inkubacija imobilisanog Rep proteina sa uzorkom uzetim iz subjekta.
[0022] U nekim drugim izvođenjima Rep protein je eksprimovan u ćelijama posle čega sledi inkubacija ćelija sa uzorkom uzetim iz subjekta.
[0023] U izvesnim izvođenjima količina antitela koji formiraju imunološki kompleks sa Rep proteinom se kvantifikuje dodatnim agensom vezivanja spojenim na jedinjenje koje proizvede signal koji može da se veže na anti-Rep antitela imunološkog kompleksa, na primer detektibilno označeno sekundarno antitelo, poželjno anti-humano antitelo.
[0024] U drugim izvođenjima antitela u uzorku iz subjekta se imobilišu posle inkubacije sa definisanom količinom Rep proteina.
[0025] Uzorak iz subjekta i kontrolni uzorak u uzorku krvi kao što je uzorak seruma ili uzorak plazme.
[0026] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak dijagnostikovanja multiple skleroze (MS) kod pacijenta koji obuhvata korake
(a) detektovanja količine Rep proteina u uzorku iz subjekta pomoću anti-Rep antitela koja se vezuju na epitop sadržan u SEK ID BR:2 ili SEK ID BR:3, i (b) dovođenje u vezu najmanje 2-struko povećane količine antitela vezanog na Rep protein, u poređenju sa količinom u kontrolnom uzorku, sa dijagnozom multiple skleroze (MS).
[0027] U takvim izvođenjima uzorak iz subjekta i kontrolni uzorak se biraju iz grupe koja obuhvata uzorak seruma, uzorak plazme ili uzorak tkiva.
[0028] U specifičnim izvođenjima anti-Rep antitelo se vezuje na epitop koji je unutar sekvence aminokiseline izabrane iz grupe koja obuhvata aminokiseline od 1 do 136, od 137 do 229 i od 230 do 324 iz SEK ID BR:1.
[0029] U nekim daljim izvođenjima pronalazak obezbeđuje pribor za upotrebu u dijagnozi multiple skleroze (MS) koji obuhvata (a) MSBI1 Rep protein, (b) antihumano antitelo prema Tabeli 1 spojeno na detektibilnu oznaku i sposobnu za vezivanje na anti-Rep antitelo prema ovom pronalasku, i (c) čvrstu matricu pogodnu za imobilizovanje Rep proteina prema (a) ili anti-Rep antitelima, pri čemu se smatra da se u nekom uzorku nalaze pomoćna antitela, a specifično u uzorku seruma ili plazme.
[0030] U specifičnim izvođenjima pribor se sastavlja za upotrebu u imunoogledu, na primer izabran iz grupe koja obuhvata sa enzimom povezanim imunosorbensnim ogledom (ELISA), radioimunoogledom (RIA), enzimski imunim ogledom (EIA), fluorescentno imunim ogledom (FIA), luminescentno imunim ogledom (LIA) i trakastom ogledu reverzne hibridizacije.
Kratak opis slika nacrta:
[0031]
Slika 1 pokazuje primer pretrage uzoraka seruma od 2 X 8 inkubacijom seruma trakastim ogledom reverzne hibridizacije membrane Rep proteina rastvorenog u 1D veličini. Nitrocelulozne trake u ogledu reverzne hibridizacije koje sadrže Rep protein su inkubirane svaka sa dva različita razblaženja seruma/plazme (1:500 i 1:2000) iz raspoloživog skupa seruma multiple skleroze ili iz skupa zdravih donora plazme. Humani IgGs vezani na Rep su detektovani sa anti-humanim IgG HRP spojenim sekundarnim antitelima. Signali antitela veličine Rep ciljnog proteina pune dužine (videti Kumasi (Coomassie) bojenje proteina i anti-Rep WB kontrolni uzorci sa desne strane) su kvantifikovani denzitometrijom.
Slika 2 pokazuje kvantifikaciju Rep specifičnih odgovora seruma na bazi ELISA pretrage uzoraka.50, 100, 200, 400, ili 800 ng Rep proteina (ciljni antigen) je uočeno na ploči sa 96 pregada. Posle blokiranja i pranja taj antigen Rep proteina je inkubiran sa bilo raspoloživom skupinom MS uzorka iz seruma ili uzorkom raspoloživim iz kontrolne plazme u razblaženju od 1:500 tokom 6 sati na sobnoj temperaturi (RT). Posle pranja i inkubacije sa HRP-om spojenim anti-humanim IgG HRP sekundarnim antitelom i poslednjeg koraka pranja, prisustvo Rep- vezanih humanih IgGs je kvantifikovano pomoću reakcije TMB substrata i merenja apsorbacije na 450 nm. Kvantifikacija otkriva dobru vezu intenziteta signala i količine Rep proteina (antigen). U proseku, nivoi intenziteta signala skupine multiple skleroze (MS) su prekoračili intenzitete kontrolne skupine najmanje za faktor 1,9. Generalno, pretraga uzorka seruma na bazi ELISA tehnike je otkrilo detektibilna antitela seruma za najmanje razblaženje seruma od 1:1000 (podaci nisu prikazani), tako da je verovatno da će titar za ovaj eksperiment biti veći 1:1000 u opsegu od 1:2000-1:4000 ili čak i više posle optimizacije platforme.
Slika 3 pokazuje kvantifikaciju Rep specifičnih odgovora seruma na bazi ELISA pretrage uzoraka.200 ng Rep proteina (ciljni antigen) su uočeni na ploči sa 96 pregada. Posle blokiranja i pranja antigen Rep proteina je inkubiran sa bilo 7 individualnih seruma multiple skleroze (MS) ili 7 pojedinačnih kontrolnih seruma u duplikatima u razblaženju od 1:500 tokom 6 sati na sobnoj temperaturi (RT). Posle pranja i inkubacije sa HRP-om spojenim anti-humanim IgG HRP sekundarnim antitelom i poslednjeg koraka pranja, prisustvo Rep- vezanih humanih IgGs je kvantifikovano pomoću reakcije TMB substrata i merenja apsorbacije na 450 nm. Prosečni intenziteti uzoraka multiple skleroze (MS) su prekoračili prosečan intenzitet kontrolnih seruma za barem faktor 8 sa nekim uzorcima multiple skleroze (MS) koji otkrivaju faktor od 10-16 preko prosečnih intenziteta kontrolnih uzoraka.
Slike 4 do 6 pokazuju podatke sa slike imunofluorescencije dobijene korišćenjem anti-Rep antitela A, B, C, D1 i D2 koji su naznačeni na y koordinatama.
Slika 7 pokazuje analizu Western Blot (Vestern blot) tehnikom, pri čemu A, B, C i D1 označavaju grupe korišćenih anti- Rep antitela.
Slika 8 pokazuje poravnavanje sekvence "optimizovano" (=SEK ID BR:13) vs.
"originalno" (=divlji tip; SEK ID BR:15) MSBI1 sekvence. Optimizovani kodoni su označeni.
[0032] Ovaj pronalazak obezbeđuje dijagnostičke testove pretrage za prisustvo anti-Rep antitela kao patogenih markera. Uzorci koji sadrže povećane količine anti-Rep antitela ukazuju da je odgovarajući pacijent definitivno bio izložen proteinu povezanom sa Rep-om ili samom eksprimovanom Rep poteinu tokom nekog vremenskog perioda dovoljno dugo da se pokrene odgovor imunog sistema specifičan za Rep protein. Sa takvim ogledima pretrage moguće je izvesti dijagnozu, prognozu i monitoring multiple skleroze (MS) na bazi kvantifikacije anti-Rep antitela. U alternativnim izvođenjima Rep protein je moguće direktno detektovati i kvantifikovati u uzorcima pomoću anti-Rep antitela.
[0033] "Rep protein" kako je ovde korišćeno se odnosi na protein povezan sa DNK replikacijom (RepB). Rep protein obuhvata aktivnost DNK vezivanja i mogao bi biti ključan za pokretanje replikacije epizomalnih/virusnih DNK molekula. Generalno Rep protein se odnosi na Rep protein iz grupe genoma malih Sfingi (Whitley et al., 2014). Rep protein prema ovom pronalasku je MSBI1 genomom kodiran Rep protein (MSBI1 Rep). Nije deo pronalaska za koji se traži zaštita patentom je MSBI2 genomkodiran Rep protein (MSBI2 Rep), CMI1 genom-kodiran Rep protein (CMI1 Rep), CMI2 genom-kodiran Rep protein (CMI2 Rep) ili CMI3 genom-kodiran Rep protein (CMI3 Rep). Preporučljivo, MSBI1 Rep protein se kodira pomoću MSBI1.176 deponovanog u EMBL bazi podataka pod pristupnim brojem LK931491 i ima sekvencu aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR:1 (Whitley, Gunst et al.
2014). Nije deo pronalaska za koji se traži zaštita patentom je CMI1 Rep protein kodiran pomoću CMI1.252, deponovan u EMBL bazi podataka pod pristupnim brojem LK931487 i ima sekvencu aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR:10; CMI2 Rep protein je kodiran pomoću CMI2.214, deponovanim u EMBL bazi podataka pod pristupnim brojem LK931488 i ima sekvencu aminokiseline prikazanu u SEK ID BR:11; CMI3 Rep protein je kodiran pomoću CMI3.168, deponovanog u EMBL bazi podataka pod pristupnim brojem LK931489 i ima sekvencu aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR:12. Posebno poželjno izvođenje Rep proteina koji obuhvata N-terminalni region sačuvan među genomima male Sfinge (Sphinx) se u suštini sastoji od aminokiselina od 1 do 229 iz SEK ID BR:1 i C-terminalni promenljivi region specifičan za MSBI1.176 koji se u suštini sastoji od aminokiselina 230 do 324 iz SEK ID BR:1. N-terminalni sačuvani region obuhvata pretpostavljeni, prvi domen vezivnja DNK koji se u suštini sastoji od aminokiselina od 1 do 136 iz SEK ID BR: 1 i drugi pretpostavljeni domen vezivanja DNK koji se u suštini sastoji od aminokiselina od 137 do 229 iz SEK ID BR: 1.
[0034] "Rep protein" takođe obuhvata fragmente i varijante proteina sa SEK ID BR:1 koji su sposobni za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za Rep protein sa sekvencom aminokiseline iz SEK ID BR:1. Poželjno, takav fragment je imunogeni fragment proteina sa sekvencom aminokiseline iz SEK ID BR:1 koji obuhvata najmanje jedan epitop za anti-Rep protein antitelo naspram Rep proteina iz SEK ID BR:1 i, poželjno, obuhvata najmanje 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili 50 dodirnih aminokiselina. U specifičnim izvođenjima fragment obuhvata ili se sastoji u suštini od domena Rep proteina, na primer, N terminalni konzervisan region, C terminalni promenljivi region, prvi ili drugi domen vezivanja DNK. Varijanta proteina sa SEK ID BR:1 obuhvata jednu ili više delecija , supstitucija ili adicija aminokiseline u poređenju sa SEK ID BR:1 i ima homologiju od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% na sekvenci aminokiseline iz SEK ID BR:1, pri čemu je ta varijanta sposobna za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za Rep protein koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR:1. Ovom definicijom varijante su obuhvaćeni, na primer, polipeptidi koji obuhvataju jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokisleine, peptidnu nukleinsku kiselinu (PNA) itd.), polipeptide sa supstituisanim vezama, kao i druge modifikacije poznate u ovoj oblasti, obe se javljaju prirodno i neprirodno. Pojam Rep protein uključuje proteine fuzije sa heterolognom sekvencom aminokiseline, sa vodećom sekvencom ili sa Tag-
1
sekvencom i sličnim. U izvesnim izvođenjima oznake proteina iz ovog pronalaska se genetski ugraviravaju na gore opisan Rep protein. Specifično najmanje jedna oznaka proteina se spaja na polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiseline kako je prikazana u SEK ID BR:1, i SEK ID BR:14. Takve oznake proteina je moguće ukloniti hemijskim agensima ili enzimskim sredstvima. Primeri oznaka proteina su afinitet ili hromatografske oznake za prečišćavanje. Na primer Rep protein je moguće spojiti fuziono na Tag-sekvencu, na primer, izabranu iz grupe koja obuhvata His6-Tag (SEK ID BR:4), T7-Tag (SEK ID BR:5), FLAG-Tag (SEK ID BR:6) i Strep-II-Tag (SEK ID BR:7). His-Tag (SEK ID BR:4), T7-Tag (SEK ID BR:5), FLAG-Tag (SEK ID BR:6) ili StrepII-Tag (SEK ID BR:7). Pored toga, fluorescentne oznake kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP) ili njegove varijante mogu biti spojene na Rep protein prema ovom pronalasku.
[0035] U specifičnom poželjnom izvođenju MSBI1 genomom kodiran Rep protein (MSBI1 Rep) je kodon optimizovan za proizvodnju u humanim linijama ćelije (npr. HEK-293, HEK293TT, HEK293T, HEK293FT, HaCaT, HeLa, SiHa, CaSki, HDMEC, L1236, L428, BJAB, MCF7, Colo678, bilo koje primarne linije ćelije) kao i goveđe (npr. MAC-T) ili mišje linije ćelije (npr. GT1-7). Što se tiče optimizacije kodona, sekvence nukleotida koje kodiraju antigene mogu da se projektuju da koriste kodone koji se koriste u genima subjekta u kojima taj antigen treba da se proizvede. U poželjnom izvođenju, korišćeni kodoni su "humanizovani" kodoni. Takva upotreba kodona obezbeđuje efikasno eksprimovanje antigena u humanim ćelijama. Bilo koji pogodan postupak optimizacije kodona moguće je koristiti. Takvi postupci i odabir takvih postupaka su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Prema ovom pronalasku, takva kodonom optimizovana varijanta MSBI1 genomom kodiranog rep proteina (MSBI1 Rep) obuhvata ili ima sekvencu kako je prikazano u SEK ID BR.: br.: 13 i obuhvata ili ima sekvencu aminokiseline kako je prikazano u SEK ID. BR.: br.: 14. Ukupno, izvestan broj 686 nukleotida od 927 nukleotida MSBI1 Rep gena koji kodiraju Rep protein (od početnog do zaustavnog kodona) su supstituisani da bi se poboljšala upotreba kodona. Savršena upotreba kodona sa optimalnom adaptacijom prema npr. upotrebi humanog kodona je opisana indeksom adaptacije kodona (CAI) iz 1 koji ukazuje da su svi kodoni optimizovani za humanu ekspresiju. Za originalni MSBI1-om kodiran Rep gen, CAI od 0,67 za humani sistem je izračunat, što je daleko ispod CAI od 0,8, što se posmatra kao niža granična vrednost za dobru adaptaciju kodona. Posle optimizacije kodona iz MSBI1 rep gena, CAI od 0,94 je izračunat za optimizovanu DNK koja ukazuje da je skoro optimalna adaptacija kodona za humani sistem. Posebno, nekih 18 veoma retko korišćenih kodona su modifikovani, od tih većina predstavlja kodone koji kodiraju leucin sa veoma niskom frekvencijom upotrebe (< 10%) u organizmu čoveka. Poravnavanje sekvence kodonom optimizovane MSBI1 sekvence iz SEK ID BR:13 naspram MSBI1 sekvence divljeg tipa iz SEK ID BR:15 je prikazano na Slici 8.
[0036] Rep protein iz ovog pronalaska, uključujući Rep fragmente i Rep varijante kako je definisano gore u tekstu, moguće je pripremiti klasičnom hemijskom sintezom. Tu sintezu je moguće izvesti u homogenom rastvoru u čvrstoj fazi. Polipeptidi prema ovom pronalasku mogu da budu pripremljeni i tehnikama rekombinantne DNK. Primer za proizvodnju i prečišćavanje Rep proteina prema ovom pronalasku je prikazan u Primeru 1.
[0037] "Subjekat" kako je ovde korišćeno se odnosi na pojedinca sisara ili pacijenta, uključujući, miševe, stoku, na primer goveda, simijane i ljude. Preporučljivo, subjekat je ljudski pacijent.
[0038] "Uzorak" kako je ovde korišćeno se odnosi na biološki uzorak koji obuhvata tečne i čvrste uzorke. Tečni uzorci obuhvataju krvne tečnosti kao što je, na primer, serumi, plazma i cerebrospinalni fluid (CSF). Čvrsti uzorci obuhvataju uzorke tkiva kao što su kulture tkiva ili uzorci biopsije.
[0039] "Se dovodi u vezu sa" kako je ovde korišćeno se odnosi na količinu, t.j. nivo ili titar anti-Rep antitela i Rep protein, prema opisanom redosledu, sa značajnom korelacijom sa statusom bolesti od, multiple skleroze (MS). Korelacija se određuje detektovanjem nivoa razlike u količini prisutnoj u uzorku iz subjekta da budu testirani i u količini prisutnoj u kontrolnom uzorku. "Kontrolni uzorak" znači jedan uzorak ili prosek različitih, t.j. više od dva, kontrolna uzorka. Kontrolni uzorak se uzima od zdravog pojedinca koji nije dijagnostikovan za multiplu sklerozu (MS). Alternativno, korelacija može da bude teoretski određena detektovanjem nivoa razlike u količini prisutnoj u uzorku za subjekta kog treba testirati sa unapred određenom graničnom vrednošću. Granična vrednost je referentna vrednost sa statistički značajnim odvajanjem između različitog statusa bolesti, npr. između statusa zdravog i statusa obolelog. Granična vrednost može da se odredi statističkom analizom dovoljno velikog panela testnih uzoraka iz pacijenata sa istorijom bolesti i uzorcima iz testne grupe zdravih korišćenjem statističkih testova poznatih u ovoj oblasti.
[0040] U izvesnim izvođenjima dijagnoza, na primer multiple skleroze (MS), je ukazala na najmanje 2-struko, 3-struko, 4-struko, 5-struko, 10-struko, 50-struko, 100-struko, 500-struko ili 1000-struko povećanu količinu proteina, t.j Rep protein i antiRep-antitela, prema opisanom redosledu, u uzorku iz subjekta u poređenju sa kontrolnim uzorkom.
[0041] "Anti-Rep antitelo" kako je ovde korišćeno se odnosi na antitelo koje se vezuje na detektibilnom nivou na Rep protein u postupcima pronalaska čiji je afinitet jači na Rep protein iz ovog pronalaska u odnosu na ne-Rep protein. Preporučljivo, afinitet antigena za Rep protein je najmanje 2-struko veći u odnosu na vezivanje u pozadini. Posebno anti-Rep antitelo je specifično za MSBI1 Rep sa sekvencom aminokiseline iz SEK ID BR:1. U specifičnim izvođenjima antitelo je unakrsno specifično za MSBI1 Rep, MSBI2 Rep, CMI1 Rep, CMI2 Rep i/ili CMI3 Rep. U izvesnim izvođenjima anti-Rep antitelo se vezuje na epitop unutar aminokiselina od 1 do 136 iz SEK ID BR: 1.
[0042] Zajedničko svojstvo svih ogleda je da se Rep protein dovodi u vezu sa uzorkom za koji se sumnja da sadrži antitela anti- Rep proteina pod uslovima koji dozvoljavaju da se Rep protein veže na bilo koje takvo antitelo prisutno u uzorku. Takvi uslovi će uobičajeno biti fiziološka temperatura, pH i jonska jačina korišćenjem viška Rep proteina. Posle inkubacije Rep proteina sa uzorkom sledi detekcija imunih kompleksa koje čini antigen. U izvesnim izvođenjima bilo Rep protein se spaja na jedinjenje koje generiše signal, npr. detektibilnu oznaku, ili dodatni agens vezivanja, npr. sekundarno anti-humano antitelo, spojeno na jedinjenje koje generiše signal se koristi za detektovanje kompleksa imunog sistema.
[0043] Anti-Rep antitela moguće je detektovati i kvantifikovati u ogledima zasnovanim na Rep proteinu kao antigenu proteina, koji služi kao cilj za sisare, npr. humanim, antitelima za koje postoji sumnja na prisustvo u tom uzorku. Preporučljivo, Rep protein je prečišćen (npr. videti Primer 1) i uzorci mogu da budu, na primer, uzorci seruma ili uzorci plazme. Ti postupci uključuju imobilizaciju Rep proteina na matrici prikupljenoj inkubacijom imobilizovanog Rep proteina sa uzorcima. Najzad, na Rep vezana antitela formiranog imunološkog kompleksa između Rep proteina i antitela iz uzoraka se kvantifikuju detekcijom agensa vezivanja spojenog na jedinjenje koje proizvodi signal, npr. sekundarno HRP-(peroksidazom rena)-spojeno antitelo za detekciju koje omogućava kvantifikaciju zasnovanu na HRP supstratu. Ovo jedinjenje koje generiše signal ili oznaka je samo po sebi moguće detektovati ili može da se dovede u reakciju sa dodatnim jedinjenjem da se generiše proizvod koji je moguće detektovati.
[0044] U drugim izvođenjima anti-Rep antitela se indirektno kvantifikuju tako što se prvo antitela iz uzorka imobilišu na matrici, posle čega sledi inkubacija sa definisanom količinom Rep proteina koju je moguće označiti ili obuhvataju Tag
1
protein, pri čemu se anti-Rep antitela imobilišu i prisutna su na matrici koja registruje Rep iz tečne mešavine uzorka tog proteina, posle čega sledi kvantifikacija vezanog Rep proteina.
[0045] U drugim izvođenjima Rep protein može da bude eksprimovan u ćeijama i ove ćelije se inkubiraju sa tim uzorkom. Posle toga, anti-Rep antitela iz uzorka vezana na Rep protein eksprimovan pomoću ćelija se detektuju i kvantifikuju. [0046] Struktura ili dizajn imunoogleda je podložna varijaciji u velikoj meri, i brojni formati su poznati u ovoj oblasti. Protokoli mogu, na primer, da koriste čvrste potpore, ili imunotaloženje. Većina ogleda uključuje upotrebu agenasa vezivanja spojenih na jedinjenja koja generišu signal, na primer označeno antitelo ili označen Rep protein; te oznake mogu biti, na primer, enzimski, fluorescentni, hemiluminiscentni, radioaktivni, ili obojeni molekuli. Ogledi koji pojačavaju signale iz kompleksa imunog sistema su takođe poznati; primeri za njih su ogledi koji koriste biotin i avidin ili streptavidin, i enzim označene i posredovane imunooglede, kao što su ELISA ogledi.
[0047] Imunoogled može da bude heterogenog ili homogenog formata, i standardnog ili konkurentnog tipa. U heterogenom formatu, polipeptid (Rep protein ili anti-Rep antitelo) se obično vezuje na čvrstu matricu ili potporu ili nosač da bi se olakšalo odvajanje uzorka sa tog polipeptida posle inkubacije. Primeri čvrstih potpora koje je moguće koristiti su nitroceluloza (npr., u obliku membrane ili u obliku mikrotitrar pregrade), polivinil hlorid (npr., na pločama ili mikrotitar pregradama), polistiren lateks (npr., u perlicama ili mikrotitar pločama, polivinilidin fluorid (poznat kao imunolon), diazotizovan papir, najlon membrane, aktivirane perlice, i Proteinske A perlice. Čvrsta podloga koja obuhvata antigenske polipeptide je uobičajeno oprana posle odvajanja sa testnog uzorka, i pre detekcije vezanih anti-Rep antitela. I standardni i konkurentni formati su poznati u ovoj oblasti.
[0048] U homogenom formatu, testni uzorak se inkubira sa Rep proteinom u rastvoru. Na primer, može da bude u uslovima da će se istaložiti bilo šta od Rep proteinskih antitelo kompleksa koji se formiraju. I standardni i konkurentni formati za ove ogledi su poznati u ovoj oblasti.
[0049] U standardnom formatu, količina anti-Rep antitela u antitelo-Rep kompleksima proteina se direktno nadgleda. Ovo je moguće izvršiti određivanjem da li (označena) anti-ksenogena (npr. anti-humana) antitela koja prepoznaju epitop na anti-Rep antitelima će se vezati usled formiranja kompleksa. U konkurentnom formatu, količina anti-Rep antitela u uzorku se oduzima nadgledanjem konkurentnog dejstva na vezivanje poznate količine označenog antitela (ili drugog konkurentnog liganda) u kompleksu.
[0050] Formirani kompleksi koji obuhvataju anti-Rep antitelo (ili u slučaju konkurentnih ogleda, količina antitela) se detektuje pomoću neke od brojnih poznatih tehnika, zavisno od formata. Na primer, neoznačena anti-Rep antitela u ovom kompleksu je moguće detektovati korišćenjem konjguata anti-ksenogenog Ig kompleksiranog sa oznakom (npr. oznakom enzima, kao što je, na primer, HRP).
[0051] U formatu ogleda za imunotaloženje ili aglutinaciju, reakcija između Rep proteina i anti-Rep antitela formira mrežu koja se istaloži iz rastvora ili suspenzije i formira vidljiv sloj ili tanak sloj istaloženog sadržaja. Ako u uzorku nije prisutno anti-Rep antitelo, ne formira se vidljivo istaloživanje sadržaja.
[0052] Izabrana čvrsta faza može da uključi polimerne ili staklene perlice, nitrocelulozu, mikročestice, tacne sa mikorpregradama za reakcije, testne epruvete i magnetne perlice. Jedinjenje koje generiše signal može uključiti enzim, luminiscentno jedinjenje, hromogen, radioaktivni element i hemiluminiscentno jedinjenje. Primeri enzima uključuju alkalin fosfatazu, peroksidazu rena (HRP) i betagalaktozidazu. Primeri jedinjenja pojačavača uključuju biotin, anti-biotin i avidin. Primeri elemenata vezivanja jedinjenja pojačavača uključuju biotin, anti-biotin i avidin.
[0053] U daljim izvođenjima ovaj pronalazak, daje postupke pri čemu se povećana količina Rep proteina u uzorku dovodi u vezu sa dijagnozom ili predispozicijom za multiplu sklerozu (MS).
[0054] U takvim izvođenjima Rep protein u uzorku se detektuje pomoću anti-Rep antitela.
[0055] Takvi postupci obuhvataju korake
(a) detektovanja količine Rep proteina u uzorku iz subjekta pomoću anti-Rep antitela; i
(b) dovođenje u vezu količine Rep proteina detektovane u uzorku iz subjekta u koraku (a) u poređenju sa količinom u kontrolnom uzorku sa dijagnozom multiple skleroze (MS).
[0056] Uzorci za oglede koje je moguće koristiti u takvim postupcima za detektovanje Rep proteina u uzorcima seruma ili plazme uključuju, ali se ne ograničavaju na imunoistaloživanje, imunofluorescenciju, dot (tačkasti) bloting i Vestern blota (Western Blot).
1
[0057] Na primer, uzorak seruma moguće je inkubirati sa antitelima anti-Rep proteina da bi se registrovao Rep protein u tom uzorku, posle čega sledi korak imunoistaloživanja Rep proteina i, posle toga, korak detekcije SDS-PAGE i Vestern blota (Western Blot).
[0058] U još jednom primeru, membrana dot blota može da se inkubira sa serumom, posle čega sledi korak SDS-PAGE i Vestern blot (Western Blot).
[0059] U još jednom primeru, razblaženja seruma iz uzorka su učitana na SDS-stranicu posle čega sledi Vestern blot (Western Blot).
[0060] U još nekim izvođenjima Rep protein je detektovan u uzorcima tkiva imunohistohemijskim postupcima ili imunofluorescentnom mikroskopijom.
[0061] U izvesnim izvođenjima anti-Rep antitela se koriste za detektovanje ili registrovanje Rep proteina u uzorku.
[0062] Pojam "antitelo" se, poželjno, odnosi na antitela koja se sastoje u suštini od skupine poliklonalnih antitela sa različitim epitopnim specifičnostima, kao i preparatima distinktivnih monoklonalnih antitela. Kako se ovde koristi, pojam "antitelo" (Ab) ili "monoklonalno antitelo" (Mab) se koristi u značenju da obuhvati nedirnute molekule imunoglobulina kao i fragmente antitela (kao što su, na primer, Fab i F(ab’)2 fragmenti) koji su sposobni da se vežu specifično na Rep protein. Fab i F(ab’)2 fragmenti nemaju Fc fragment nedirnutog antitela, se brišu mnogo brže iz krvotoka, i mogu da imaju manje nespecifičnog vezivanja tkiva nego neko nedirnuto antitelo. Dakle, ovi fragmenti su poželjni, kao i proizvodi FAB ili druge biblioteke eksprimovanja imunoglobulina. Pored toga, antitela korisna u svrhe ovog pronalaska uključuju himerna, jednolančana, višefunkcionalna (npr. bispecifična) i humanizovana antitela ili humana antitela.
[0063] U nekim izvođenjima antitelo ili njegov antigen vezujući fragment se spaja na jedinjenje koje stvara signal, npr., nosi detektibilnu oznaku. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može biti direktno ili indirektno detektibilno označen, na primer, sa radioizotopom, fluorescentnim jedinjenjem, bioluminiscentnim jedinjenjem, hemiluminiscentnim jedinjenjem, helatorom metala ili enzimom. Prosečni stručnjaci u ovoj oblasti će znati druge pogodne oznake za vezivanje na antitelo, ili će moći da potvrde takve, upotrebom rutinskih eksperimenata.
[0064] Anti-Rep antitela su, poželjno, uzgajana (stvorena) naspram Rep proteina koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR:1 ili njen fragmet postupcima dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.
[0065] U izvesnim izvođenjima anti-Rep antitela u upotrebi u postupcima iz ovog
1
pronalaska su sposobna za vezivanje na nekoliko ili sve vrste Rep proteina iz grupe genoma male Sfinge (anti-Rep antitelo slično maloj sfingi (anti-Small-Sphinx-like Rep antibody) ili anti-SSLRep antitelo). Takvo anti-SSLRep antitelo se vezuje na epitop unutar konzervisanog N-terminalnog regiona iz Rep proteina iz aminokiselina 1 do 229 iz SEK ID BR:1. U specifičnim izvođenjima koriste anti-Rep antitela iz anti-SSLRep tipa koja se vezuju na epitop unutar SEK ID BR:2 (aminokiselina 32-49 iz SEK ID BR:1) ili SEK ID BR:3 (aminokiselina 197-216 iz SEK ID BR:1). Fragmenti peptida iz SEK ID BR:2 i SEK ID BR:3 su visoko konzervisani među Rep proteinima iz grupe genoma male Sfinge i čini se da se izlažu zbog svog hidrofilnog karaktera. Anti-Rep antitela anti-SSLRep tipa moguće je proizvesti imunizacijom, na primer iz miševa ili gvineja prasteta, pomoću peptida koji obuhvataju u suštini sekvence aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR:2 ili 3; ili pomoću drugih imunogenih fragmenata, preporučljivo obuhvataju najmanje 8-15 aminokiselina, izvedenih iz regiona Rep proteina konzervisanog N- terminala iz aminokiselina 1 do 229 iz SEK ID BR:1.
[0066] Koriste se anti-Rep antitela specifična za MSBI1 Rep protein. Takva antitela je moguće proizvesti, na primer, imunizacijom sisara kao što su miševi ili Gvineja prase sa Rep proteinom pune dužine koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR:1.
[0067] Postupci iz ovog pronalaska koriste anti-Rep antitela koja su sposobna da detektuju Rep protein sve do opsega od pikograma do femtograma različitih vrsta telesnih tečnosti kao što je, na primer, krv, serum, spinalna tečnost ili cerebralni fluid.
[0068] U postupcima iz ovog pronalaska moguće je koristiti bilo specifične vrste anti-Rep antitela ili skupine dva ili više različitih vrsta anti-Rep antitela. Ako se koristi skupina različitih vrsta anti-Rep antitela, skupina anti-Rep antitela može obuhvatati različita anti-Rep antitela koja se vezuju na različite epitope unutar različitih domena Rep proteina, npr. prvi domen DNK vezivanja (npr. aa 1-136 iz SEK ID BR:1), drugi domen DNK vezivanja (npr. aa 137-229 iz SEK ID BR:2) i/ili promenljivi domen (npr. aa 230-324 iz SEK ID BR:1), posebno, od MSBI1 Rep proteina (SEK ID BR:1).
[0069] U još nekom izvođenju anti-Rep antitela se koriste za skeniranje sondi iz pacijenata i/ili zdravih pojedinaca za Rep protein. Selektivna detekcija Rep proteina u tkivima pacijenata, npr. neurodegenerativna bolest, je indikator uzročnosti između izolovanog DNK genoma Rep proteina je detektovala u uzorku od pacenta iz kog je uzet taj uzorak.
[0070] Za detekciju Rep proteina postupcima pomoću anti-Rep antitela kao što su,
1
na primer, Vestern blot, imunofluorescentna mikroskopija ili imunohistohemijski potupci mogu da se koriste.
[0071] U izvesnim izvođenjima anti-Rep antitela se koriste koja mogu da detektuju Rep protein na izvesnim ćelijskim lokalizacijama. Na primer anti-Rep antitelo može detektovati Rep protein u citoplazmi, nuklearnoj membrani i nukleusu ili detektovati pegice u citoplazmi. Primeri takvih grupa anti-Rep antitela su prikazani u Tabeli 1:
[0072] Anti-Rep antitela iz grupe A imaju epitop sekvence aminokiseline prikazane u SEK ID BR:3 (aa 198-217 iz SEK ID BR:1) i sposobni su da detektuju MSBI1 Rep i Rep proteine koji obuhvataju ovaj konzervisani epitop grupa genoma male Sfinge (npr. MSBI2, CMI1, CMI4). U ogledima imunofluoresencije kao anti-Rep antitela detektuju specifičan obrazac Rep lokalizacije, pri čemu je glavna lokalizacija homogeno raspoređena preko citoplazme i nuklearne membrane; i dodatna slaba i homogeno rasprostranjena lokalizacija se vidi u nukleusu. Primer takve grupe A antitela je antitelo AB01523-1-1 (DSM ACC3327) koje je korišćeno u primerima kao grupa A antitela.
[0073] Anti-Rep antitela iz grupe B epitop sekvence aminokiseline prikazane u SEK ID BR:2 (aa 33-50 iz SEK ID BR:1) i sposobni su da detektuju MSBI1 Rep i Rep proteine koji obuhvataju ovaj konzervisani epitop grupa genoma male Sfinge (npr. MSBI2, CMI1, CMI4). U ogledima imunofluoresencije kao anti-Rep antitela kao anti-Rep antitela detektuju specifično pegice (skupine citoplazme) Rep protein (često na periferiji nuklearne membrane). Primer takve grupe B antitela je antitelo projektovano kao AB02304-4-1 (DSM ACC3328) što je korišćeno u primerima kao antitelo grupe B.
[0074] Anti-Rep antitela iz grupe C detektuju specifično strukturni epitop MSBI1
1
(SEK ID BR:1). U ogledima imunofluorescencije takva anti-Rep antitela detektuju specifičan obrazac Rep lokalizacije, pri čemu je glavna lokalizacija homogeno raspoređena preko citoplazme i nuklearne membrane; i dodatna slaba i homogeno rasprostranjena lokalizacija se vidi u nukleusu. Primer takvog antitela grupe C je antitelo MSBI1381-6-2 (DSM ACC3329) koje je korišćeno u primerima kao antitelo grupe C.
[0075] Anti-Rep antitela iz grupe D detektuju specifično strukturni epitop MSBI1 (SEK ID BR:1), pri čemu antitelo MSBI1961-2-2 označeno kao "D1" detektuje epitop prikazan u SEK ID BR:9 (aa 281-287) u C-terminalnom domenu MSBI1. Antitelo MSBI1 761-5-1 (DSM ACC3328) označeno kao "D2" detektuje 3D strukturni epitop MSBI1 koji je ekskluzivno dostupan pod in vivo uslovima i nije pristupačan u Vestern blotovima. U ogledima imunofluoresencije kao anti-Rep antitela takva anti-Rep antitela detektuju specifično pegice (skupine citoplazme) Rep proteina (često na periferiji nuklearne membrane).
[0076] U izvesnim izvođenjima anti-Rep antitela iz grupa A, B, C ili D; ili kombinacija anti-Rep antitela najmanje dve različite grupe A, B, C ili D se koriste da bi se odredila vrsta lokalizacije Rep proteina u sondi i ako se takva lokalizacija Rep proteina dovodi u vezu sa funkcijom patogena. Na primer, ako su pegice prisutne. Kod izvesnih izvođenja, t.j., postupaka ili pribora iz ovog pronalaska, najmanje jedno anti-Rep antitelo je izabrano iz grupa A i B se kombinuje sa najmanje jednim anti-Rep antitelom izabranim iz grupa C i D. U specifičnim izvođenjima, t.j., postupci ili pribori iz ovog pronalaska, anti-Rep antitelo iz grupe A se kombinuje sa najmanje još jednim anti-Rep antitelom izabranim iz grupa B, C, i D. Na primer, anti-Rep antitelo iz grupe A može de se kombinuje sa još nekim anti-Rep antitelima iz grupa C i D. Takve kombinacije anti-Rep antitela iz različitih grupa povećavaju distinktivnost dijagnostičke procene, posebno za dijagnozu multiple skleroze (MS). Ove grupe A, B, C ili D antitela su poželjne za upotrebu u dijagnostici multiple skleroze (MS).
[0077] Sledeća antitela su deponovana u Nemačkoj zbirci mikroorganizama i kultura ćelije (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures] 28. septembra 2017:
antitelo AB01523-1-1 pod DSM ACC3327;
antitelo AB02304-4-1 pod DSM ACC3328;
antitelo MSBI1381-6-2 pod DSM ACC3329; i
antitelo MSBI1761-5-1 pod DSM ACC3330.
1
[0078] Antitelo MSBI1961-2-2 je deponovano pod pristupnim brojem DSM ACC3331 sa DSMZ 6. oktobra 6, 2017.
[0079] U još nekim izvođenjima se daje pribor za upotrebu u dijagnozi multiple skleroze. Taj pribor može da uključi materijal za detektovanje anti-Rep antitela i/ili Rep proteina zajedno sa instrukcijama za upotrebu materijala u ogledima za dijagnozu multiple skleroze (MS). Pribor može da obuhvati jednu ili više sledećih komponenata: biomarker prema ovom pronalasku, t.j. Rep protein i anti-Rep antitela, npr. antitela iz Tabele 1, prema opisanom redosledu; jedinjenje koje proizvodi signal, čvrstu matricu za spajanje senzornog agensa, razblaživač za uzorke, pufersko sredstvo za pranje. Jedinjenje koje generiše signal se odnosi na detektibilnu oznaku koja je ili spojena na agens dodatnog vezivanja koje može da se vezuje na biomarker pronalaska ili direktno spojen na biomarker iz ovog pronalaska.
[0080] Ovaj pronalazak se još prikazuje pomoću, ali ne i ograničeno na, sledeće primere:
Primer 1:
Prečišćavanje MSBI1 Rep proteina
[0081] Molekul nukleotidne kiseline koja kodira Rep otvoreni okvir čitanja (ORF) punom dužinom identifikovan unutar MSBI1 genoma se klonira u plazmid ekspresije (pEXP5-CT, Invitrogen) koji omogućava ekspresiju proteina na osnovu E. coli slobodnog visokog prinosa ćelije in vitro sistema translacije (ExpresswayTM Cell-Free E. coli Expression System, Invitrogen). Sintetisani Rep protein ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR:1 unutar in vitro reakcije translacije je denaturisan dodavanjem 20 reakcionih zapremina 8 M uzorka urea puferskog sredstva pH 8,0 obuhvata 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 5 mM imidazola. Rep protein se naknadno prečišćava pod uslovima denaturisanja (20 mM imidazola za pranje i 300 mM imidazola za eluaciju proteina) na osnovu oznake C-terminalne His6-tag spojene na Rep protein. Kvalitet prečišćavanja se određuje bojenjem proteina Komasi plavom (Coomassie protein staining) i Vestern blotingom sa antitelima anti-Rep proteina. Čistoća Rep proteina se denzitometrijski izračunava i veća je od 95%. Prečišćeni protein je bilo direktno korišćen za pretragu seruma na bazi ELISA postupka ili podvrgnut SDS-Page metodi posle čega sledi prenos blotinga na nitrocelulozne membrane za inkubaciju seruma jednodimenziono rastvorenih (1D)
2
traka membrane Rep proteina.
Primer 2:
Generisanje glavnih ploča seruma
[0082] Uzorci seruma su prvo alikvotovani da bi se smanjili ciklusi zamrzavanjaotapanja uzorka. Zatim, glavna ploča se uspostavlja generisanjem 1:1 razblaženja seruma u PBS pH 7,2 stabilizovanom pomoću 0,02% (w/v) finalne koncentracije natrijum azida u U-obliku ploče sa 96-pregrada. Ova ploča je stabilna tokom barem 2 meseca kada se čuva na 4°C i uruči pod sterilnim uslovima i koristi se kao šablon za dalje razblaženje seruma (1:20 finalno razblaženje) pre eksperimenta pojedinačne pretrage.
Primer 3:
Pretraga seruma inkubacijom seruma jednodimenziono (1D) rastvorenih traka membrane Rep proteina
[0083] Za oglede pregledanja na osnovu inkubacije 1D-rastvorenih traka membrane Rep proteina sa serumom, 20 µg prečišćenog Rep proteina se puni na Sigma Tru-PAGE 4-20% prethodno brizganih gelova. Zidovi koji odvajaju džepove gela se uklanjaju pre punjenja gela da bi se proizveo jedan veliki džep i jedan džep za oznaku veličine. Posle 1D-veličina rastvaranja SDS-PAGE, protein je prenet blotovanjem na nitrocelulozne membrane korišćenjem standardnog blot protokola za vlažan prenos u rezervoaru. Posle toga, protein na blot membrani (u suštini jedna traka pune dužine Rep proteina na oko 40 kDa radne visine) se vizualizuje sa PonceauS da bi se proverio kvalitet transfera i da bi se pripremilo sečenje traka membrane od 2 mm širine i visine pune jednodimenziono (1D) rastvorene membrane. Trake su zatim blokirane 1 sat svaka sa 500 µl blokirajućim reagensom bez seruma (Genetex Trident univerzalni blokirajući reagens). Posle toga, serum se karakteriše na osnovu dva različita razblaženja seruma. Inkubacija seruma se izvodi tokom 14 sati (tokom noći) na 4°C na linearnom uređaju sa vibracijom. Posle toga, trake membrane se peru sa PBS-T pH7,2 0,1%, sredstvom Tween-20 i to 3x5 min i na sobnoj temperaturi. Detekcija Rep specifičnih vezanih humanih IgGs unutar tih seruma se radi inkubacijom sa HRP-spojenim kozjim anti-humanim IgG (H+L) sekundarnim antitelom tokom 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle tri pranja sa PBS-T pH7,20,1% Tween-20 tokom 3x5 min na sobnoj temperaturi, trake svake pojedinačne inkubacije seruma su pričvršćene samolepljivom trakom na plastičnu foliju. Folija se zatim inkubira sa ECL supstratom (Biorad Clarity) da bi se vizuelizovali vezani humani IgGs na sistem detekcije Vestern blot kompanije BioRad (BioRad WesternBlot). Signali koji odgovaraju količini IgG koji se specifično vezuju na Rep traku na membrani proteina se kvantifikuju denzitometrijom.
[0084] Primer za rezultat 1D-veličine rastopljenih traka membrane Rep proteina je prikazan na Slici 1 i kvantifikacija seropozitivnih uzoraka seruma/plazme je prikazana u Tabeli 2: Skoro 50% uzoraka seruma je dalo veoma jake signale za oba razblaženja (1:500 i 1:2000) i samo 3 od 21 su potpuno negativni. Od kontrola plazme, 7 uzoraka je dalo prelazne signale pri razblaženju od 1:500 (nekoliko dodatnih sa veoma slabim signalima) pri čemu je pri razblaženju u odnosu od 1:2000 samo 3 uzorka dalo veoma slab signal, pri čemu su svi drugi bili seronegativni. Sve kvantifikacije izdržavaju tendenciju da intenziteti seruma multiple skleroze (MS) pokazuju barem 30-struki višak signala kada se uporede sa kontrolnim intenzitetima plazme.
Tabela 2: Kvantifikacija uzoraka seropozitivnog seruma/plazme.
[0085] Serumi/plazma sa detekcijom humanih za Rep specifičnih IgG su prebrojani prema intenzitetu signala za razblaženje seruma/plazme od 1:500 i 1:2000 za tu skupinu seruma multiple skleroze (MS) i kontrolnu skupinu plazme zdravih jedinki (svaki 21 ukupno). Skoro 50% uzoraka seruma je dalo veoma jake signale za oba razblaženja (1:500 i 1:2000) i samo 3 od 21 su bili potpuno negativni. Od kontrolnih plazmi, 7 uzoraka je dalo prelazne signale pri razblaženju od 1:500 (nekoliko dodatnih sa veoma slabim signalima) pri čemu je pri razblaženju u odnosu od 1:2000 samo 3 uzorka dalo veoma slab signal, pri čemu su svi drugi bili seronegativni. Sve kvantifikacije podržavaju tendenciju da intenziteti seruma multiple skleroze (MS) pokazuju barem 30-struki višak signala kada se uporede sa kontrolnim intenzitetima plazme.
Primer 4:
Pretraga seruma ELISA postupkom
[0086] Odgovarajuća količina prečišćenog Rep proteina (obično između 50 i 200 ng po pregradi) se doda u mešavinu u odnosu od 1:1 i to 8 M uree pH 8,0 i PBS pH 7,2 predisponiranu u Maxisorp ELISAploču sa 96 pregrada (Fisher Scientific). Protein je ostavljen da se veže na matricu ploče tokom 14 sati na 4°C na linearnom uređaju sa vibracijom. Onda se ploča pere sa PBS-T pH 7,20,1% Tween-20 tokom 3x5 min na sobnoj temperaturi posle čega sledi blokiranje tokom najmanje 14 sati na 4°C sa PBS pH 7,21%(w/v) BSA koja konačno sadrži 0,02% natrijum azida. Pošto je serum dodat u razblaženje od 1:500 i inkubacija se izvodi tokom 6 sati na sobnoj temperaturi. Posle toga, ploča je oprana sa PBS-T pH 7,20,1% Tween-20 tokom 3x5 min na sobnoj temperaturi. Detekcija Rep specifičnih vezanih humanih IgGs unutar tih seruma se radi inkubacijom sa HRP-spojenim kozjim anti-humanim IgG (H+L) sekundarnim antitelom tokom 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle tri pranja sa PBS-T pH 7,20,1% Tween-20 tokom 3x5 min na sobnoj temperaturi, 100 µl TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina, HRP- senzitivan) rastvor supstrata se doda po pregradi i inkubira tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 100 µl 8M sirćetne kiseline/1M sumporne kiseline. Intenzitet signala se kvantifikuje na Perkin Elmer ELISA kompatibilnom uređaju merenjem apsorpcije na 450 nm.
[0087] Rezultat iz primera kvantifikacije Rep specifičnih odgovora seruma na osnovu ELISA pretraga je prikazan na Slici 2: Kvantifikacija otkriva dobru vezu intenziteta signala i količine Rep proteina (antigen). U proseku, nivoi intenziteta signala skupine multiple skleroze (MS) prekoračuju intenzitete kontrolne skupine najmanje za faktor 1,9. Generalno, pretraga na bazi seruma ELISA postupkom je otkrila detektibilna antitela seruma tokom barem razblaženja seruma od 1:1000 (podaci nisu prikazani), tako da je verovatno da će titar za ovaj eksperiment da bude veći 1:1000 u opsegu 1:2000-1:4000 ili čak veći posle optimizacije platforme.
Primer 5:
Analiza imunofluorescencije
2
[0088] HEK293TT ćelije (125.000/ pregradi) su kultivisane tokom 24 sata u komorama sa 8 pregrada za imunofluorescenciju u DMEM 10% FCS (suplementirano sa 1 X Glutamaks (Glutamax) (Gibco) i 1 X neesencijalnih aminokiselina (Gibco)) posle čega je usledila DNK transfekcija sa polietileniminom (PEI) od bilo kontrolnog plazmida ZsGreenlCI (Clontech) koji eksprimuje autofluorescencioni marker protein ZsGreen ili isti plazmid koji nosi punu dužinu MSBI1 Rep ORF na 3-prime završnom kodiranju za ZsGreen- Rep proteini fuzije.48 sati posle DNK transfekcije, ćelije su oprane sa PBS, fiksirane tokom 20 min na RT sa PBS 4% PFA na RT i natapane sa PBS 0,5% Triton X-100 tokom 10 min na RT na uređaju sa vibracijom. Ćelije su oprane sa PBS i blokiranje je izvedeno sa PBS 1% BSA tokom 45 min na RT. Inkubacija sa mišjim monoklonalnim anti-Rep antitelima (c.f. Tabela 1) je izvedena tokom 1 sat na 37 °C u PBS 1% BSA sa 1:500 razblaženja antitela (obuhvaćeni su kontrolni uzorci bez primarnih antitela). Ćelije su oprane tri puta sa PBS posle čega je usledila inkubacija sa PBS 1% BSA tokom 15 min na RT. Zatim, inkubacija sa sekundarnim antitelom (AlexaFluor546 kozji antimišji, 1:500; DNKmarker Hoechst 33342, 1:5.000) je izveden tokom 45 min na RT u PBS 1% BSA. Ćelije su oprane tri puta sa PBS 1% BSA i tri puta sa PBS pre montaže sa pokrivnim omotačima (Dako montažna podloga). Slike imunofluorescencije su napravljene na mikroskopu kompanije Cajs (Zeiss Cell Observer) (20x objektiv, fiksno vreme izloženosti za uzorak i kontrolne dublete).
[0089] Slike imunofluorescencije (Sl.4) pokazuju da tretiranje antitela grupom A i C antitela dovodi do specifične detekcije citoplam nuklearne membrane (+nukleus)-lokalizovanog ciljnog proteina bez detekcije agregata. Nasuprot tome, antitela grupa B i D pokazuju specifičnu smeštanje sa proteinom sa pegicama, i bez ili sa slabim nivoima signala citoplazme. Kontrolna inkubacija antitela samo na ZsGreen proteinu fuzije nije dala kao rezultat značajnu detekciju signala (isti vremenski periodi ekspozicije korišćeni za vizualizaciju signala antitela).
Primer 6:
Analiza imunofluorescencije
[0090] HEK293TT ćelija (125.000/ pregradi) je kultivisano tokom 24 sata u pregradama za imunofluorescenciju sa 8 komora u DMEM 10% FCS (suplementiran sa 1X Glutamaks (Gibco) i 1 X neesencijalnih aminokiselina (Gibco)) posle čega je usledila DNK transfekcija sa polietileniminom (PEI) od bilo kontrolnog plazmida ZsGreenlCI (Clontech) koji eksprimuje protein marker autofluorescencije ZsGreen ili isti nosač plazmida pune dužine CMI1 Rep ORF na 3-prime kraju kodiranju kraja za ZsGreen- Rep protein fuzije.48 sati posle DNK transfekcije, ćelije su oprane sa PBS, fiksirane tokom 20 min na RT sa PBS 4% PFA na RT i natapane sa PBS 0,5% Triton X-100 tokom 10 min na RT na uređaju sa vibracijom. Ćelije su oprane sa PBS i blokiranje je izvedeno sa PBS 1% BSA tokom 45 min na RT. Inkubacija sa mišjim monoklonalnim anti- Rep antitelima (Tabela 1) je izvedena tokom 1 sat na 37 °C u PBS 1% BSA sa 1:500 razređenjima antitela (kontrolni uzorci bez primarnih antitela su bili uključeni). Ćelije su oprane tri puta sa PBS posle čega je usledila inkubacija sa PBS 1% BSA tokom 15 min na RT. Zatim, inkubacija sa sekundarnim antitelom (AlexaFluor546 kozji anti-mišji, 1:500; DNK marker Hoechst 33342, 1:5.000) je izveden tokom 45 min na RT u PBS 1% BSA. Ćelije su oprane tri puta sa PBS 1% BSA i tri puta sa PBS pre montaže sa pokrivnim omotačima (Dako montažna podloga). Slike imunofluorescencije su napravljene na mikroskopu kompanije Cajs (Zeiss Cell Observer) (20x objektiv, fiksno vreme izloženosti za uzorak i kontrolne dublete).
[0091] Slike imunofluorescencije (Sl. 5) pokazuju da dok antitelo iz grupe A specifično detektuje citoplazmu nuklearnu membranu (+nukleus)-lokalizovan ciljni protein bez detekcije agregata, antitelo grupe B detektuje ciljni protein sa pegicama sa minimalnom pozadinom od citoplazmom lokalizovanog ciljnog proteina. Ta MSBI1 specifična antitela iz grupe C i D ne dovode do specifične detekcije signala. Oba antitela D1 i D2 pripadaju "D" grupi ali imaju blago različito prepoznavanje epitopa.
Primer 7:
Analiza imunofluorescencije
[0092] HEK293TT ćelije (125.000/ pregradi) su kultivisane tokom 24 sata u komorama sa 8 pregrada za imunofluorescenciju u DMEM 10% FCS (suplementirano sa 1 X Glutamaks (Glutamax) (Gibco) i 1 X neesencijalnih aminokiselina (Gibco)) posle čega je usledila DNK transfekcija sa polietileniminom (PEI) od bilo kontrolnog plazmida pcDNA3.1(-) (Invitrogen) ili isti plazmid koji eksprimuje kodonom optimizovanu varijantu MSBI1 Rep ORF pune dužine (SEK ID BR.: br.: 13).48 sati posle DNK transfekcije, ćelije su oprane sa PBS, fiksirane tokom
2
20 min na RT sa PBS 4% PFA na RT i natapane sa PBS 0,5% Triton X-100 tokom 10 min na RT na uređaju sa vibracijom. Ćelije su oprane sa PBS i blokiranje je izvedeno sa PBS 1% BSA tokom 45 min na RT. Inkubacija sa mišjim monoklonalnim anti- Rep antitelima (Tabela 1) je izvedena tokom 1 sat na 37 °C u PBS 1% BSA sa 1:500 razređenjima antitela (kontrolni uzorci bez primarnih antitela su bili uključeni). Ćelije su oprane tri puta sa PBS posle čega je usledila inkubacija sa PBS 1% BSA tokom 15 min na RT. Zatim, inkubacija sa sekundarnim antitelom (AlexaFluor488 kozji anti-mišji, 1:500; DNK marker Hoechst 33342, 1:5.000) je izveden tokom 45 min na RT u PBS 1% BSA. Ćelije su oprane tri puta sa PBS 1% BSA i tri puta sa PBS pre montaže sa pokrivnim omotačima (Dako montažna podloga). Slike imunofluorescencije su napravljene na mikroskopu kompanije Cajs (Zeiss Cell Observer) (20x objektiv, fiksno vreme izloženosti za uzorak i kontrolne dublete).
[0093] Slike imunofluorescencije (Sl.6) pokazuju da tretiranje antitela grupom A i C antitela dovodi do specifične detekcije citoplam nuklearne membrane (+nukleus)-lokalizovanog ciljnog proteina bez detekcije agregata. Nasuprot tome, antitela grupa B i D pokazuju specifičnu smeštanje sa proteinom sa pegicama, i bez ili sa slabim nivoima signala citoplazme. Kontrolna inkubacija antitela samo na ZsGreen proteinu fuzije nije dala kao rezultat značajnu detekciju signala (isti vremenski periodi ekspozicije korišćeni za vizualizaciju signala antitela).
Primer 8:
Vestern blot analiza
[0094] HEK293TT (1,5 Mio/6-pregrada) su kultivisane tokom 24 sata u kulturi ćelija na pločama sa 6 pregrada u DMEM 10% FCS (suplementirano sa 1X Glutamaksa (Gibco) i 1 X neesencijalnih aminokiselina (Gibco)) posle toga je usledila transfekcija sa DNK sa polietileniminom (PEI) od ZsGreenlCI kodirajućih plazmida za prekomernu ekspresiju pune dužine MSBI1, CMI1 ili MSBI2 Rep protein kao protein fuzije sa N-terminalnom ZsGreen oznakom.48 sati posle DNK transfekcije, ćelije su oprane sa PBS, odvojene tripsinacijom, oprane ponovo sa PBS i lizovane u SDS-PAGE Lämmli puferskom sredstvu (ključalom tokom 5 min na 98 °C). Uzorci su dodati na u kalupu prethodno brizgane 12,5% SDS-PAGE gelove sa jednim velikim džepom. Posle transferblota, svake dve trake membrane su isečene za pojedinačnu inkubaciju traka sa različitim mišjim monoklonalnim antitelima iz Tabele 1 (1:1000
2
razblaženja u PBS 5% obranog mleka) posle blokiranja sa PBS 5% obranog mleka. Trake su oprane tri puta sa PBS 0,1% Tween20 i inkubirane sa HRP-spojenim antimišjim sekundarnim antitelom koje dozvoljava analizu Vesternblot tehnikom (Westernblot) antitela koja detektuju različite ZsGreen-Rep proteine fuzije na Biorad ChemiDoc uređaju. Pozitivna detekcija kontrolnih uzoraka je izvedena na bazi inkubacije sa ZsGreen antitelom (OriGene, 1:2000)
[0095] Sl.7 pokazuje dok grupe A i B specifično detektuju sva tri Rep proteina fuzije, uključujući CMI1 i MSBI2 Rep proteina fuzije pored MSBI1 Rep protein fuzije, MSBI1 specifična antitela iz grupe C i D eksluzivno detektuju MSBI1 Rep protein fuzije. Antitelo D2 je Vestern blot (WB) negativno najverovatnije usled detekcije 3D strukture epitopa, što ne preovladava pod uslovima denaturisanja u SDS-PAGE i nije ovde testiran.
SAŽETAK SEKVENCI
2
96]
[00k)va a st a (n
k)tava s(na
� REFERENCE:
[0097]
Funk, M., et al. (2014). "Isolation of protein-associated circular DNA from healthy cattle serum". Genome Announc 2(4)
Giraldo, R., et al. (2011). "RepA-WH1 prionoid: a synthetic amyloid proteinopathy in a minimalist host." Prion 5(2):60-64
Gunst, K., et al. (2014). "Isolation of bacterial plasmid-related replicationassociated cirular DNA from a serum sample of a multiple sclerosis patient." Genome Announc 2(4).
Lamberto, I., et al. (2014). "Mycovirus-like DNA virus sequences from cattle serum and human brain and serum samples from multiple sclerosis patients." Genome Announc 2(4).
Manuelidis L., 2011. "Nuclease resistant circular DNAs co-purify with infectivity in scrapie and CJD". J. Neurovirol. 17:131-145.
Torreira, E., et al. (2015). "Amyloidogenesis of bacterial prionoid RepA-WH1 recaptiulates dimer to monomer tran- sitions of RepA in DNA replication initiation." Structure 23(1):183-189
Whitley, C., et al. (2014). "Novel replication-competent cirulara DNA molecules from healthy cattle serum and milk and multiple sclerosis-affected human brain tissue." Genome Announc 2(4).
2

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Postupak za dijagnostikovanje multiple skleroze (MS), pri čemu
(A) najmanje 2-struko povećana količina sa DNK replikacijom povezanog (Rep) proteina ili njegovih fragmenata ima najmanje 8 dodirnih aminokiselina u uzorku iz subjekta u poređenju sa količinom kontrolnog uzorka; ili
(B) barem 2-struko povećanu količinu anti-Rep antitela u uzorku iz subjekta u poređenju sa količinom u kontrolnom uzorku
se dovodi u vezu sa dijagnozom multiple skleroze (MS), pri čemu
- taj Rep protein obuhvata
(i) sekvencu aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR: 1;
(ii) fragment SEK ID BR:1 koji je sposoban za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 1; ili (iii) sekvencu aminokiseline koja ima 90% ili veću homologiju na sekvenci aminokiseline od (i) ili (ii) i sposoban je za vezivanje anti-Rep antitela specifičnog za protein koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 1, i
- taj uzorak je (a) uzorak tečnosti izabran iz seruma, plazme ili cerebrospinalnog fluida ili (b) čvrstog uzorka izabranog iz kultura tkiva ili uzoraka biopsije.
2. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu fragment iz SEK ID BR:1 obuhvata epitop unutar sekvence aminokiseline koji obuhvata aminokiseline 1 do 229 od SEK ID BR:1.
3. Postupak iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu povećana količina Rep proteina ili njegovog fragmenta ili anti-Rep antitela od najmanje 5-strukog u poređenju sa kontrolnim uzorkom ukazuje na multiplu sklerozu (MS).
4. Postupak iz patentnog zahteva 1, pri čemu se Rep protein kodira sekvencom polinukleotida kako je prikazano u SEK ID BR:13.
5. Anti-Rep antitelo izabrano iz grupe koja obuhvata antitelo DSM ACC3327 (AB01 523-1-1), antitelo DSM ACC3328 (AB02 304-4-1), antitelo DSM ACCC3329 (MSBI1 381-6-2), antitelo DSM ACC 3330 (MSBI761-5-1) i antitelo DSM ACC 3331 (MSBI1961-2-2).
6. Upotreba anti-Rep antitela iz patentnog zahteva 5 u postupku iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4.
7. Postupak dijagnostikovanja multiple skleroze (MS) kod subjekta koji obuhvata korake
(a) inkubacije uzorka izabranog iz uzorka seruma ili plazme dobijenog iz subjekta sa Rep proteinom kako je definisano u patentnom zahtevu 1;
(b) detektovanje količine antitela u uzorku iz subjekta koji formira imunološki kompleks sa Rep proteinom; i
(c) dovođenje u vezu najmanje 2-struko povećane količine antitela vezanog na Rep protein u tom uzorku iz subjekta, u poređenju sa količinom u kontrolnom uzorku, sa dijagnozom multipleskleroze (MS).
8. Postupak iz patentnog zahteva 7, pri čemu se u koraku (a) taj Rep protein imobiliše posle čega sledi inkubacija imobilisanog Rep proteina sa uzorkom iz subjekta.
9. Postupak iz patentnog zahteva 7, pri čemu se u koraku (a) taj Rep protein eksprimuje u ćelijama posle čega sledi inkubacija ćelija sa uzorkom iz subjekta.
10. Postupak iz patentnog zahteva 8 ili 9, pri čemu se u koraku (b) količina antitela koja formiraju imunološki kompleks sa Rep proteinom kvantifikuje detektovanjem agensa vezivanja spojenog na jedinjenje koje generiše signal.
11. Postupak iz patentnog zahteva 7, pri čemu u koraku (a) antitela u uzorku iz subjekta jesu imobilisana posle čega sledi inkubacija sa definisanom količinom Rep proteina.
4
12. Postupak dijagnostikovanja multiple skleroze (MS) kod pacijenta koji obuhvata korake
(a) detektovanja količine Rep proteina u uzorku izabranom iz seruma, plazme ili uzorka tkiva iz subjekta pomoću anti-Rep antitela koja se vezuju na epitop obuhvaćen SEK ID BR:2 ili SEK ID BR:3, i
(b) dovođenje u vezu najmanje 2-struko povećane količine Rep proteina detektovanog u uzorku iz subjekta u koraku (a) u poređenju sa količinom u kontrolnom uzorku sa dijagnozom multiple skleroze (MS).
13. Postupak iz patentnog zahteva 12, pri čemu se antitelo specifično za Rep protein vezuje na epitop koji je unutar sekvence aminokiseline izabrane iz grupe koja obuhvata aminokiseline od 1 do 136, od 137 do 229 i od 230 do 324 iz SEK ID BR:1.
14. Pribor za upotrebu u dijagnozi multiple skleroze (MS) obuhvata
(a) Rep protein, pri čemu taj Rep protein obuhvata:
(i) sekvencu aminokiseline kako je prikazano u SEK ID BR: 1;
(ii) fragment SEK ID BR:1 koji je sposoban za vezivanje anti-Rep antitela sa specifičnošću za protein koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 1; ili (iii) sekvencu aminokiseline koja ima 90% ili više homologije prema sekvenci aminokiseline iz (i) ili (ii) i sposobna je za vezivanje anti-Rep antitela sa specifičnošću za protein koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 1,
(b) anti-humano antitelo spojeno na detektibilnu oznaku izabranu iz grupe koja obuhvata antitelo DSM ACC3327 (AB01 523-1-1), antitelo DSM ACC3328 (AB02 304-4-1), antitelo DSM ACCC3329 (MSBI1381-6-2), antitelo DSM ACC 3330 (MSBI761-5-1) i antitelo DSM ACC 3331 (MSBI1961-2-2) i
(c) čvrstu matricu pogodnu za imobilizaciju Rep proteina prema (a) ili anti-Rep antitelima sa specifičnošću za protein koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 1 čije se postojanje pretpostavlja u uzorku seruma ili plazme.
15. Pribor prema patentnom zahtevu 14 za upotrebu u ogledu izabranom iz grupe koja obuhvata sa enzimom povezanim imunosorbensni ogled (ELISA), radioimunoogled (RIA), enzimskim imunogled (EIA), imunogled fluorescencije (FIA), imunogled luminescencije (LIA) i ogled sa trakom.
RS20230165A 2016-10-10 2017-10-10 Rep protein kao antigen proteina za upotrebu u dijagnostičkim testovima RS64008B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16193119.1A EP3306316A1 (en) 2016-10-10 2016-10-10 Rep protein as protein antigen for use in diagnostic assays
EP17791958.6A EP3523653B1 (en) 2016-10-10 2017-10-10 Rep protein as protein antigen for use in diagnostic assays
PCT/EP2017/075774 WO2018069296A1 (en) 2016-10-10 2017-10-10 Rep protein as protein antigen for use in diagnostic assays

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64008B1 true RS64008B1 (sr) 2023-03-31

Family

ID=57123880

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230165A RS64008B1 (sr) 2016-10-10 2017-10-10 Rep protein kao antigen proteina za upotrebu u dijagnostičkim testovima

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11718662B2 (sr)
EP (2) EP3306316A1 (sr)
JP (2) JP6983881B2 (sr)
KR (1) KR102262876B1 (sr)
CN (1) CN110914685A (sr)
AU (1) AU2017341952B2 (sr)
DK (1) DK3523653T3 (sr)
ES (1) ES2939643T3 (sr)
FI (1) FI3523653T3 (sr)
HR (1) HRP20230217T1 (sr)
HU (1) HUE061544T2 (sr)
LT (1) LT3523653T (sr)
PL (1) PL3523653T3 (sr)
PT (1) PT3523653T (sr)
RS (1) RS64008B1 (sr)
RU (1) RU2769568C2 (sr)
SI (1) SI3523653T1 (sr)
SM (1) SMT202300125T1 (sr)
WO (1) WO2018069296A1 (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3517960A1 (en) * 2018-01-30 2019-07-31 Deutsches Krebsforschungszentrum Use of bmmf rep protein as biomarker for colon cancer
EP3653702A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-20 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Crystal structure of a replication protein encoded by a plasmid isolated from a multiple sclerosis patient
EP3699595A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-26 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Use of bmmf1 rep protein as a biomarker for breast cancer
EP3699594A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-26 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Use of bmmf1 rep protein as a biomarker for prostate cancer
CN113820382A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用
CA3243853A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts METHOD FOR DIAGNOSING MULTIPLE SCLEROSIS

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756302A (en) * 1996-07-16 1998-05-26 Pel-Freez Rabbit Meat, Inc. Human herpesvirus 6 detection assay
US6348344B1 (en) * 1997-09-02 2002-02-19 Insight Strategy & Marketing Ltd. Genetically modified cells and methods for expressing recombinant heparanase and methods of purifying same
US20060105419A1 (en) * 2004-08-16 2006-05-18 Biosite, Inc. Use of a glutathione peroxidase 1 as a marker in cardiovascular conditions
EP2335066B1 (en) * 2008-09-19 2016-12-28 University of Utah Research Foundation Methods for prediction of multiple sclerosis disease and therapy response
EP2868751A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-06 Deutsches Krebsforschungszentrum HCBI sequences as an early marker for the future development of cancer and diseases of the CNS and as a target for cancer treatment and prevention
EP2966176A1 (en) * 2014-07-10 2016-01-13 Deutsches Krebsforschungszentrum HCBI, MSBI, MSSI and CMI sequences as an early marker for the future development of cancer and diseases of the CNS and as a target for the treatment and prevention of these diseases
DE102014213512A1 (de) 2014-07-11 2016-01-14 Voith Patent Gmbh Maschine zur Herstellung einer Faserstoffbahn
PL3018478T3 (pl) * 2014-11-04 2021-02-22 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Nowe diagnostycznie istotne autoprzeciwciało
EP3424942A1 (en) * 2017-07-07 2019-01-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Improved rep protein for use in a diagnostic assay

Also Published As

Publication number Publication date
CA3039138A1 (en) 2018-04-19
US20190270795A1 (en) 2019-09-05
SI3523653T1 (sl) 2023-04-28
LT3523653T (lt) 2023-03-10
EP3306316A1 (en) 2018-04-11
AU2017341952B2 (en) 2021-10-14
US11718662B2 (en) 2023-08-08
US20240018223A1 (en) 2024-01-18
RU2769568C2 (ru) 2022-04-04
RU2019113127A3 (sr) 2020-11-13
JP6983881B2 (ja) 2021-12-17
WO2018069296A1 (en) 2018-04-19
HUE061544T2 (hu) 2023-07-28
FI3523653T3 (fi) 2023-03-16
EP3523653B1 (en) 2022-12-07
HRP20230217T1 (hr) 2023-04-14
JP7529639B2 (ja) 2024-08-06
KR20190066027A (ko) 2019-06-12
PL3523653T3 (pl) 2023-03-27
JP2022036996A (ja) 2022-03-08
RU2019113127A (ru) 2020-11-13
EP3523653A1 (en) 2019-08-14
US12534523B2 (en) 2026-01-27
ES2939643T3 (es) 2023-04-25
AU2017341952A1 (en) 2019-04-18
DK3523653T3 (da) 2023-02-20
SMT202300125T1 (it) 2023-05-12
CN110914685A (zh) 2020-03-24
PT3523653T (pt) 2023-03-06
JP2019536006A (ja) 2019-12-12
KR102262876B1 (ko) 2021-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7529639B2 (ja) 診断アッセイに使用するためのタンパク質抗原としてのｒｅｐタンパク質
CN113557431A (zh) 诊断SARS-CoV-2感染的方法和试剂
US10907141B2 (en) Rep protein for use in a diagnostic assay
CA3039138C (en) Rep protein as protein antigen for use in diagnostic assays
US11174310B2 (en) Disulfide-type HMGB1-specific antibody, method for measuring disulfide-type HMGB1 and kit for said measurement, and measurement method capable of quantitating all of HMGB1 molecules including reduced HMGB1, disulfide-type HMGB1 and thrombin-cleavable HMGB1 and kit for said measurement
HK40016702A (en) Rep protein as protein antigen for use in diagnostic assays
JP2024022080A (ja) ポリペプチド、抗ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、抗ｅ型肝炎ウイルス抗体及びｅ型肝炎ウイルスの同時検出方法、及びキット
JP2001510553A (ja) 組換え蛋白質を用いたｈｔｌｖ抗体の検出法
WO2025255297A1 (en) Anti-human tigit antibodies for in vitro diagnostics
HK40021801B (zh) 用於诊断分析的改进的rep蛋白
HK40021801A (en) Improved rep protein for use in a diagnostic assay
IL295754A (en) Methods and reagents for the diagnosis of sars-cov-2 infection