RS64053B1 - Polipeptidi koji reaguju na transformišući faktor rasta – beta i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Polipeptidi koji reaguju na transformišući faktor rasta – beta i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS64053B1
RS64053B1 RS20230155A RSP20230155A RS64053B1 RS 64053 B1 RS64053 B1 RS 64053B1 RS 20230155 A RS20230155 A RS 20230155A RS P20230155 A RSP20230155 A RS P20230155A RS 64053 B1 RS64053 B1 RS 64053B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
cells
seq
tgf
optionally
Prior art date
Application number
RS20230155A
Other languages
English (en)
Inventor
Yvonne Yu-Hsuan Chen
Zenan Li Chang
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of RS64053B1 publication Critical patent/RS64053B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/20—Cellular immunotherapy characterised by the effect or the function of the cells
    • A61K40/22—Immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/416—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4225—Growth factors
    • A61K40/4229—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
1. Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi generalno na oblast biotehnologije i medicine. Određenije, odnosi se na polipeptide i ćelije koje sadrže polipeptide koji se mogu upotrebiti za stimulisanje imunološkog odgovora u prisustvu TGF-β (Transforming Growth Facor-beta – Transformišući faktor rasta – beta).
2. Stanje tehnike
[0002] TGF-β je pleiotropni citokin koji se pronalazi u visokim nivoima u različitim patogenim stanjima, uključujući čvrste tumore, fibrozu i neregulisane rane. Nacrt terapije za čvrste tumore bio je usmeren na neutralisanje TGF-β u tumorskom mikrookruženju. Dok postoje mnoga anti-TGF-β antitela, antitela kao terapijska sredstva imaju neke nedostatke. Na primer, antitela mogu biti velika u poređenju sa drugim molekulima koji vezuju antigen i predstavljaju proteine sa više lanaca koji su kodirani pomoću više gena. Oba ta aspekta vode do većih troškova proizvodnje. Takođe su identifikovana hemijska sredstva koje inhibiraju TGF-β, ali njih tipično prate problemi toksičnosti uzrokovani metaboličkim nusproizvodima u jetri. WO 2013/123061 se odnosi na bispecifični himerni antigenski receptor. WO 2005/097832 se odnosi na TGF-β antitelo. WO 2014/172584 se odnosi na himerni receptor T ćelija sa vanćelijskim TGF-β specifičnim domenom.
[0003] Istraživane su strategije koje upotrebljavaju adoptivnu terapiju T ćelijama sa T ćelijama neosetljivim na TGF-β koje eksprimiraju dominantno negativni TGF-β receptor. Međutim, može se desiti da samo neutralisanje TGF-β signala nije dovoljno, i preusmeravanje TGF-β signala iz imunosupresora u imunostimulator može obezbediti terapijske strategije koje više obećavaju.
[0004] Stoga u oblasti tehnike postoji potreba za efikasnijim terapijama koje se suprotstavljaju delovanju TGF-β i takođe obezbeđuju prednost u troškovima efikasnije proizvodnje.
SUŠTINA PRONALASKA
[0005] Pronalazak se definiše u nezavisnim patentnim zahtevima. Dalji aspekti i poželjna izvođenja definišu se u zavisnim patentnim zahtevima. Bilo koji aspekti, izvođenja i primeri predmetnog prikaza koji ne ulaze u obim priloženih patentnih zahteva ne čine deo pronalaska i dati su samo u svrhu ilustrovanja. Pozivanja na postupke lečenja u sledećim pasusima ovog opisa treba tumačiti kao pozivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela pomoću terapije (ili za dijagnozu).
[0006] Pronalazak obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR – chimeric antigen receptor) koji obuhvata signalni peptid, domen za vezivanje TGF-β antigena sa varijabilnim teškim (VH) i varijabilnim lakim (VL) regionom antitela, peptidni spejser, transmembranski domen, i endodomen koji prenosi aktivacioni signal do T ćelije nakon vezivanja antigena; pri čemu se domen za vezivanje TGF-β antigena specifično vezuje za rastvoran TGF-β i pri čemu: (a) VH region obuhvata SEQ ID NO:5 kao HCDR1, SEQ ID NO:6 kao HCDR2; i SEQ ID NO:7 kao HCDR3 i VL region obuhvata SEQ ID NO:8 kao LCDR1, SEQ ID NO:9 kao LCDR2; i SEQ ID NO:10 kao LCDR3; ili (b) VH region obuhvata SEQ ID NO:11 kao HCDR1, SEQ ID NO:12 kao HCDR2; i SEQ ID NO:13 kao HCDR3 i VL region obuhvata SEQ ID NO:14 kao LCDR1, SEQ ID NO:15 kao LCDR2; i SEQ ID NO:16 kao LCDR3; ili (c) VH region obuhvata SEQ ID NO:21 kao HCDR1, SEQ ID NO:22 kao HCDR2; i SEQ ID NO:23 kao HCDR3 i VL region obuhvata SEQ ID NO:24 kao LCDR1, SEQ ID NO:25 kao LCDR2; i SEQ ID NO:26 kao LCDR3; i pri čemu CAR ima strukturu: S-X-PL-Y-PS-T-E ili S-YPL-X-PS-T-E pri čemu je S signalni peptid, X je VH, PL je peptidni linker, Y je VL, PS je peptidni spejser, T je transmembranski domen, i E je endodomen.
[0007] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira CAR prema pronalasku.
[0008] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju koja sadrži CAR prema pronalasku ili nukleinsku kiselinu prema pronalasku, pri čemu: (A) opciono ćelija dalje sadrži himerni antigenski receptor (CAR) specifičan za kancer, i opciono se CAR specifičan za kancer specifično vezuje za: (i) Her2 ili (ii) specifično vezuje za CD19 ili CD20, pri čemu, opciono, ćelija je imunska ćelija; i (B) opciono: (a) ćelija je T ćelija, opciono CD4+ ili CD8+ T ćelija; ili T regulatorna ćelija; ili (b) ćelija je ćelija prirodni ubica.
[0009] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje ćeliju prema pronalasku za upotrebu u postupku za stimulisanje imunološkog odgovora, pri čemu navedeni postupak obuhvata dovođenje u kontat ćelije prema pronalasku sa TGF-β, pri čemu opciono: (i) stimulisanje imunološkog odgovora obuhvata sve veće eksprimiranje i/ili lučenje imuno stimulišućih citokina i/ili molekula, pri čemu opciono imuno stimulišući citokini i/ili molekuli su jedan ili više od TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 i faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga; ili (ii) stimulisanje imunološkog odgovora obuhvata sve veću proliferaciju imunskih ćelija, pri čemu, opciono, imunske ćelije su T ćelije.
[0010] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju prema pronalasku, za upotrebu u postupku stimulisanja imunološkog odgovora, pri čemu navedeni postupak obuhvata dovođenje u kontakt ćelije prema pronalasku sa TGF-β, pri čemu je ćelija in vivo u subjektu kome je potrebna imunološka stimulacija i opciono je TGF-β endogeni TGF-β proizveden u subjektu kome je potrebna imunološka stimulacija, pri čemu opciono: (i) ljudski subjekat ima kancer, fibrozu, ili otvorenu ranu, pri čemu opciono kancer je melanom; (ii) ljudski subjekat ima malignitet B-ćelija; ili (iii) ljudski subjekat ima čvrsti tumor; i pri čemu opciono: (iv) postupak dalje obuhvata davanje ćelije ljudskom subjektu; i/ili (v) postupak dalje obuhvata davanje TGF-β subjektu.
[0011] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ex vivo postupak za detektovanje TGF-β u rastvoru koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelija prema pronalasku sa rastvorom i merenje imunološke stimulacije; pri čemu povećanje u imunološkoj stimulaciji ukazuje na prisustvo TGF-β i odsustvo povećanja u imunološkoj stimulaciji ukazuje na odsustvo TGF-β, pri čemu opciono: (i) imunološka stimulacija obuhvata ekspresiju imuno stimulišućih citokina i/ili molekula, pri čemu su opciono imunostimulišući citokini i/ili molekuli jedan ili više od TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 i faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga; ili (ii) imunološka stimulacija obuhvata povećanje u proliferaciji imunskih ćelija, pri čemu, opciono, imunske ćelije su T ćelije.
[0012] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje postupak za dobijanje CAR prema pronalasku koji obuhvata eksprimiranje nukleotida koji kodiraju CAR u ćeliji.
[0013] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za ekspanziju T ćelija in vitro, postupak koji obuhvata dovođenje u kontakt in vitro T ćelija prema pronalasku sa kompozicijom koja sadrži TGF-β, pri čemu opciono kompozicija: (a) sadrži 1-50 ng/mL TGF-β; i/ili (b) sadrži IL-2 i opciono kompozicija sadrži 20-400 U/mL IL-2, pri čemu opciono: (a) (i) postupak dalje obuhvata dovođenje u kontakt ćelija sa hraniteljskim ćelijama, pri čemu opciono hraniteljske ćelije su ozračene; ili (ii) postupak isključuje kontakt T ćelija sa hraniteljskim ćelijama; i/ili (b) T ćelija je regulatorna T ćelija, pri čemu opciono umnožene regulatorne T ćelije obuhvataju manje od 10% neregulatornih T ćelija.
[0014] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili patološkog stanja kod pacijenta, pri čemu opciono: (a) ćelija je T regulatorna ćelija, pri čemu je opciono bolest: autoimuna bolest; ili (b) bolest je kancer; pri čemu opciono postupak dalje obuhvata umnožavanje ćelija in vitro postupkom koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije in vitro sa kompozicijom koja sadrži TGF-β; pri čemu opciono: (a) kompozicija sadrži 1–50 ng/mL TGF-β; i/ili (b) kompozicija dalje sadrži IL-2, i opciono kompozicija sadrži 20–400 U/mL IL-2; pri čemu opciono: (a) postupak dalje obuhvata dovođenje u kontakt ćelija sa hraniteljskim ćelijama, pri čemu opciono hraniteljske ćelije su ozračene; ili (b) postupak isključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa hraniteljskim ćelijama; pri čemu opciono T ćelija je regulatorna T ćelija, pri čemu, opciono, umnožene regulatorne T ćelije sadrže manje od 10% neregulatornih T ćelija; pri čemu opciono autoimuna bolest je reumatoidni artritis; i pri čemu opciono postupak dalje obuhvata davanje TGF-β pacijentu.
KRATAK PREGLED TEHNIČKIH SAZNANJA
[0015] Polipeptidi opisani ovde zadovoljavaju potrebu u oblasti tehnike obezbeđivanjem polipeptida koji su, kada se eksprimiraju u ćeliji, sposobni ne samo da neutrališu TGF-β već i da specifično izazivaju aktiviranje T ćelija u prisustvu TGF-β. Aktivacija T ćelija podstiče imunsku ćeliju da proizvodi imuno stimulišuće citokine i da proliferiše, pretvarajući tako TGF-β iz imunosupresivnog signala u aktivirajući stimulans. U skladu s tim, aspekti prikaza odnose se na polipeptide koji sadrže signalni peptid, domen za vezivanje antigena sa varijabilnim teškim (VH) i varijabilnim lakim (VL) regionom, peptidni spejser, transmembranski domen, i endodomen; pri čemu se domen za vezivanje antigena specifično vezuje za TGF-β.
[0016] U nekim aspektima prikaz se odnosi na polipeptid koji sadrži signalni peptid, domen za vezivanje antigena sa varijabilnim teškim (VH) i varijabilnim lakim (VL) regionom, peptidni spejser, transmembranski domen, i endodomen; pri čemu VH region sadrži SEQ ID NO:5 (HCDR1), SEQ ID NO:6 (HCDR2); i SEQ ID NO:7 (HCDR3) i VL region sadrži SEQ ID NO:8 (LCDR1), SEQ ID NO:9 (LCDR2); i SEQ ID NO:10 (LCDR3). U nekim izvođenjima, VH sadrži SEQ ID NO:1 i VL sadrži SEQ ID NO:2.
[0017] U nekim aspektima prikaz se odnosi na polipeptid koji sadrži signalni peptid, domen za vezivanje antigena sa varijabilnim teškim (VH) i varijabilnim lakim (VL) regionom, peptidni spejser, transmembranski domen, i endodomen; pri čemu VH region sadrži SEQ ID NO:11 (HCDR1), SEQ ID NO:12 (HCDR2); i SEQ ID NO:13 (HCDR3) i VL region sadrži SEQ ID NO:14 (LCDR1), SEQ ID NO:15 (LCDR2); i SEQ ID NO:16 (LCDR3). U nekim izvođenjima, VH sadrži SEQ ID NO:3 i VL sadrži SEQ ID NO:4.
[0018] U nekim aspektima prikaz se odnosi na polipeptid koji sadrži signalni peptid, domen za vezivanje antigena sa varijabilnim teškim (VH) i varijabilnim lakim (VL) regionom, peptidni spejser, transmembranski domen, i endodomen; pri čemu VH region sadrži SEQ ID NO:21 (HCDR1), SEQ ID NO:22 (HCDR2); i SEQ ID NO:23 (HCDR3) i VL region sadrži SEQ ID NO:24 (LCDR1), SEQ ID NO:25 (LCDR2); i SEQ ID NO:26 (LCDR3). U nekim izvođenjima, VH sadrži SEQ ID NO:19 i VL sadrži SEQ ID NO:20.
[0019] Polipeptidi opisani gore i ovde jesu polipeptidi koji su kontinualan, jedan lanac.
[0020] Polinukleotid ili polinukleotidni region (ili polipeptid ili polipeptidni region) ima izvestan broj procenata (na primer, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% – ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti) „identičnosti sekvenci“ ili „homologije“ sa drugom sekvencom znači da je, kada se poravnaju, taj broj procenata baza (ili aminokiselina) isti u poređenju dve sekvence. To poravnavanje i homologija procenata ili identičnost sekvenci može se odrediti pomoću softverskih programa poznatih u oblasti tehnike, na primer onih opisanih u Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology.
[0021] Polipeptidi prema trenutnom prikazu mogu imati region, domen, linker, spejser, itd. koji ima najmanje, najviše, ili tačno 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100 % identičnosti (ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti) sa svim ili delom aminokiselinskih sekvenci opisanih ovde. U izvesnim aspektima, polipeptidi opisani u ovom prikazu jesu izolovani, što znači da nisu pronađeni u ćelijskom miljeu. U nekim slučajevima, oni su prečišćeni, što znači da su uglavnom ako ne u potpunosti odvojeni od polipeptida koji imaju drugačiju aminokiselinsku sekvencu i/ili hemijsku formulu.
[0022] U nekim aspektima, VH i VL su odvojeni pomoću peptidne grupe za spajanje. Razmatrano je da se peptidna grupa za spajanje može odvojiti bilo koji domen/region opisan kod polipeptida prema ovom prikazu. U nekim aspektima, peptidna grupa za spajanje je peptid sastavljen samo od ostataka glicina i serina (glicinsko-serinska grupa za spajanje). U nekim aspektima, peptidna grupa za spajanje je najmanje, najviše ili tačno 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, ili 200 aminokiselina (ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti). U nekim aspektima, peptidna grupa za spajanje je ona koja je poznata u oblasti tehnike ili opisana ovde.
[0023] CAR iz predmetnog pronalaska ima strukturu: S-X-PL-Y-PS-T-E ili S-Y-PL-X-PS-T-E pri čemu S je signalni peptid, X je VH, PL je peptidni linker, Y je VL, PS je peptidni spejser, T je transmembranski domen, i E je endodomen. U nekim aspektima, polipeptid ima strukturu: S-X-Y-PS-T-E ili S-Y-X-PS-T-E, pri čemu su S, X, Y, PS, T, i E definisani gore. Kada se ovde poziva na peptide i polipeptide, sekvence i strukture su napisane i interpretirane tako da polaze od N-terminusa do C-terminusa, što je standardna praksa u oblasti tehnike.
[0024] U nekim aspektima, polipeptid dalje sadrži kostimulatorni region. U nekim aspektima, kostimulatorni region je između transmembranskog regiona i endodomena. U nekim aspektima, polipeptidi sadrže najmanje, najviše ili tačno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 (ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti) kostimulatornih regiona. U nekim aspektima, kostimulatorni region je onaj koji je poznat u oblasti tehnike ili opisan ovde.
[0025] U nekim aspektima, transmembranski domen sadrži transmembranski domen iz CD28. U nekim aspektima transmembranski domen je ceo ili deo transmembranskog domena poznatog u oblasti tehnike ili opisanog ovde.
[0026] U nekim aspektima, endodomen sadrži CD28 ili CD3-zeta signalni domen ili oba. U nekim aspektima endodomen je ceo ili deo endodomena koji je poznat u oblasti tehnike ili opisan ovde. U nekim aspektima, endodomen je CD3-zeta signalni domen. U nekim aspektima, endodomen sadrži jedan ili više, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 delova pogodnih endodomena opisanih ovde.
[0027] U nekim aspektima, peptidni spejser sadrži zglobni region. U nekim aspektima, zglobni region je zglobni region molekula IgG. U nekim aspektima, zglobni region je zglobni region poznat u oblasti tehnike ili opisan ovde. U nekim aspektima, peptidni spejser sadrži ili dalje sadrži region CH2CH3molekula IgG. U nekim aspektima, peptidni spejser sadrži jedan ili više zglobnih regiona, regiona CH1, CH2, i CH3. U nekim aspektima, peptidni spejser se izvodi iz zglobnog regiona, regiona CH1, CH2, i/ili CH3 ili drugog regiona od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, ili IgM od čoveka, miša, pacova, psa, magarca, koze, ili kunića. U nekim aspektima, peptidni spejser sadrži zglobni region i region CH2CH3 molekula IgG. U nekim aspektima, region CH2CH3molekula IgG ima dodatne L235E/N297Q ili L235D/N297Q mutacije da bi se sprečilo vezivanje Fc receptora. U nekim aspektima, peptidni spejser se sastoji od zglobnog regiona molekula IgG. U nekim aspektima, peptidni spejser je manje od 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, ili 4 aminokiseline. U nekim aspektima, peptidni spejser je manje od, više od, ili tačno 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 225, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 450, 500, 550, 600, ili 700 aminokiselina (ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti). U nekim aspektima, peptidni spejser sadrži manje od 50 aminokiselina. U nekim aspektima, peptidni spejser sadrži više od 50 aminokiselina.
[0028] U nekim aspektima, polipeptid dalje sadrži peptid za detekciju. U nekim aspektima, peptid za detekciju je peptid iz SEQ ID NO:17, HA tag (SEQ ID NO:94), ili cMyc tag (SEQ ID NO:95). U nekim aspektima, peptid za detekciju je oivičen linkerima. U nekim aspektima, linker (npr. peptidni linker kao što je opisan ovde) jeste na amino delu peptida za detekciju. U nekim aspektima, linker (npr. peptidni linker kao što je opisan ovde) jeste na karboksi delu peptida za detekciju. U nekim aspektima, linker je amino i karboksi deo peptida za detekciju. U nekim aspektima, peptid za detekciju je na amino delu VH i VL regiona. U nekim aspektima, peptid za detekciju je između signalnog peptida i domena za vezivanje antigena.
[0029] U nekim aspektima, signalni peptid sadrži SEQ ID NO:18. U nekim aspektima, signalni peptid je onaj koji je poznat u oblasti tehnike ili opisan ovde.
[0030] U nekim aspektima, polipeptid dalje sadrži domen za vezivanje antigena specifičan za molekule kancera. Na primer, polipeptid može biti bispecifičan himerni antigenski receptor (CAR) pri čemu polipeptid sadrži domen za vezivanje antigena za TGF-β i domen za vezivanje antigena za molekul kancera ili antigen kancera. Domeni za vezivanje antigena mogu se odvojiti pomoću peptidnog spejsera/linkera. U nekim aspektima, molekul kancera sadrži Her2. U nekim aspektima, molekul kancera sadrži CD19 ili CD20. U nekim aspektima, molekul kancera ili antigen kancera jeste onaj koji je poznat u oblasti tehnike ili opisan ovde.
[0031] Domen za vezivanje antigena specifično se vezuje za rastvorni TGF-β. Prethodno nije bilo poznato da se polipeptidi slični onima iz ovog prikaza mogu vezivati za rastvorne antigene i transdukovati signale u odgovor na rastvorne antigene.
[0032] Polipeptidi opisani ovde mogu uključivati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili više varijantnih aminokiselina u okviru najmanje, ili najviše 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 ili više susednih aminokiselina, ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti, iz SEQ ID NO: 1-95.
[0033] Dalji aspekti prikaza odnose se na nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid opisan ovde. U nekim aspektima, prikaz se odnosi na ćeliju koja sadrži jedan ili više polipeptida opisanih ovde. U nekim aspektima, ćelija dalje sadrži CAR specifičan za kancer. U nekim aspektima, CAR specifičan za kancer je odvojen polipeptid iz TGF-β CAR. U nekim aspektima, CAR specifičan za kancer se specifično vezuje za Her2. U nekim aspektima, CAR specifičan za kancer se specifično vezuje za CD19 ili CD20. U nekim aspektima, CAR specifičan za kancer se specifično vezuje za molekul kancera ili antigen poznat u oblasti tehnike i/ili opisan ovde. U nekim aspektima, ćelija je imunska ćelija. U nekim aspektima, ćelija je progenitorna ćelija ili matična ćelija. U nekim aspektima, progenitorna ćelija ili matična ćelija se in vitro diferenciraju u imunsku ćeliju. U nekim aspektima, ćelija je T ćelija. U nekim aspektima, ćelija je CD4+ ili CD8+ T ćelija. U nekim aspektima, ćelija je ćelija prirodni ubica. U nekim aspektima, ćelija je ex vivo. Termin imunska ćelija uključuje ćelije imunskog sistema koje su uključene u odbranu tela kako od infektivnih bolesti tako i stranih materijala. Imunske ćelije mogu uključivati, na primer, neutrofile, eozinofile, bazofile, ćelije prirodne ubice, limfocite kao što su B ćelije i T ćelije, i monocite. T ćelije mogu uključivati, na primer, CD4+, CD8+, T pomoćničke ćelije, citotoksične T ćelije, γδ T ćelije, regulatorne T ćelije, supresorske T ćelije, i T ćelije prirodne ubice. U specifičnom aspektu, T ćelija je regulatorna T ćelija.
[0034] Dalji aspekti prikaza odnose se na postupke za stimulisanje imunološkog odgovora koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije prema ovom prikazu (tj. ćelije koja sadrži polipeptid koji vezuje antigen i koji je opisan ovde) sa TGF-β. U nekim aspektima, stimulisanje imunološkog odgovora obuhvata povećanje ekspresije i/ili lučenja imuno stimulišućih citokina i/ili molekula. U nekim aspektima, citokin i/ili molekul je pro-inflamatorni citokin i/ili molekul. U nekim aspektima, imuno stimulišući citokini i/ili molekuli su jedan ili više od TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 i faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga. U nekim aspektima, stimulisanje imunološkog odgovora obuhvata povećanje proliferacije imunskih ćelija. U nekim aspektima, imunske ćelije su T ćelije. U nekim aspektima, TGF-β je endogeni TGF-β proizveden u ljudskom subjektu kome je potrebna imunološka stimulacija. U nekim aspektima, ljudski subjekat ima kancer, fibrozu, ili otvorenu ranu. U nekim aspektima, ljudski subjekat ima malignitet B ćelija. U nekim aspektima, ljudski subjekat ima čvrsti tumor. Čvrsti tumor je abnormalna masa tkiva koja obično ne sadrži ciste ili tečne oblasti. Čvrsti tumori mogu biti benigni (nisu kancer), ili maligni (kancer). Različiti tipovi čvrstih tumora nazvani su po tipu ćelija koje ih obrazuju. Primeri čvrstih tumora su sarkomi, karcinomi, i limfomi. U nekim aspektima, postupci su za lečenje osobe sa indikacijom, pri čemu je indikacija naznačena patogenskim nivoom ekspresije TGF-β. U nekim aspektima, ćelije i polipeptidi opisani ovde mogu se upotrebiti za lečenje kancera, neregulisanih rana, fibroza, otvorenih rana, čvrstih tumora, itd… gde se etiologija stanja, barem delimično, zasniva na ekspresiji TGF-β. U nekim aspektima, ćelija (tj. ćelija prema ovom prikazu koja sadrži polipeptid za vezivanje antigena) nalazi se u ljudskom subjektu kome je potrebna imunološka stimulacija. U nekim aspektima, postupak dalje obuhvata davanje ljudskom subjektu ćelije opisane ovde koja sadrži polipeptide ili nukleinske kiseline prema pronalasku.
[0035] Dalji aspekti postupka odnose se na postupak za detektovanje TGF-β u rastvoru koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelija prema pronalasku i merenje imunološke stimulacije: pri čemu povećanje u imunološkoj stimulaciji ukazuje na prisustvo TGF-β i odsustvo imunološke stimulacije ukazuje na odsustvo TGF-β. U nekim aspektima, imunološka stimulacija obuhvata ekspresiju imuno stimulišućih citokina i/ili molekula. U nekim aspektima, imuno stimulišući citokini i/ili molekuli su jedan ili više od TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 i faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga. U nekim aspektima, imunološka stimulacija obuhvata povećanje u proliferaciji imunskih ćelija. U nekim aspektima, imunske ćelije su T ćelije. U nekim aspektima, ćelije su ex vivo.
[0036] Povećanje u ekspresiji ili proliferaciji kao što je opisano ovde može biti najmanje, najviše ili tačno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 500, ili 1000-struko povećanje preko osnovnog nivoa ekspresije kao što je kontrolni (kontrolni bez bolesti, bez TGF-β ili bez polipeptida koji vezuju antigen).
[0037] Dalji aspekti prikaza odnose se na postupke za dobijanje polipeptida prema ovom prikazu koji obuhvataju ekspresiju nikleotida koji kodiraju polipeptid u ćeliji. Dalji aspekti odnose se na kultivisane ćelije, zamrznute ćelije, suspendovane ćelije, ili adherentne ćelije koje obuhvataju polipeptid opisan ovde.
[0038] Aspekti prikaza odnose se na postupak za lečenje bolesti ili patološkog stanja koji obuhvata davanje pacijentu ćelije prema ovom prikazu. U nekim aspektima, pacijent je ljudski pacijent.
[0039] U nekim aspektima, ćelija je T regulatorna ćelija (tj., regulatorna T ćelija koja sadrži polipeptid koji vezuje TGF-β opisan ovde). U nekim aspektima, bolest je autoimuna bolest. U nekim aspektima, autoimuna bolest je reumatoidni artritis. U nekim aspektima, autoimuna bolest je ona koja je opisana ovde.
[0040] U nekim aspektima aspekata postupka, postupak dalje obuhvata davanje TGF-β subjektu.
[0041] U nekim aspektima, postupak obuhvata ili dalje obuhvata umnožavanje i/ili indukovanje proliferacije T ćelija in vitro, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt in vitro T ćelija prema ovom prikazu sa kompozicijom koja sadrži TGF-β. U nekim aspektima, T ćelija je regulatorna ćelija. U nekim aspektima, T ćelija je T ćelija opisana ovde. U nekim aspektima, umnožene regulatorne T ćelije sadrže manje od 10% neregulatornih T ćelija. U nekim aspektima, umnožene regulatorne T ćelije sadrže manje od 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, ili 50% ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti.
[0042] U nekim aspektima, kompozicija sadrži 1–50 ng/mL TGF-β. U nekim aspektima, kompozicija sadrži najmanje, najviše, ili oko 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili 100 ng/mL TGF-β (ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti).
[0043] U nekim aspektima, kompozicija dalje sadrži IL-2. U nekim aspektima, kompozicija sadrži 20–400 U/mL IL-2. U nekim aspektima, kompozicija sadrži najmanje, najviše, ili oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600 U/mL IL-2 (ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti).
[0044] U nekim aspektima, postupak dalje obuhvata dovođenje u kontakt ćelija sa hraniteljskim ćelijama. U nekim aspektima, hraniteljske ćelije su ozračene. Hraniteljske ćelije ili potporne ćelije mogu uključivati, na primer, fibroplaste, mišje embrionske fibroplaste, JK1 ćelije, SNL 76/7 ćelije, ćelije kože ljudskog fetusa, humane fibroplaste, i humani fibroplasti kožice.
[0045] U nekim aspektima, postupak isključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa hraniteljskim ćelijama. U nekim slučajevima, isključene hraniteljske ćelije su od različitih životinjskih vrsta kao T ćelije.
[0046] U jednom aspektu postupka opisanog ovde, subjekt je ljudski subjekt. Termini „pojedinac“, „subjekat“, „domaćin“ i „pacijent“, koji se ovde upotrebljavaju naizmenično, odnose se na sisara, uključujući, ali bez ograničavanja na, vrste iz porodice miševa (npr., pacove, miševe), lagomorfe (npr., kunići), ne-ljudske primate, ljudska bića, vrste iz porodice pasa, vrste iz porodice mačaka, kopitare (npr., vrste iz porodice konja, vrste iz porodice goveda, vrste iz porodice ovaca, vrste iz porodice svinja, vrste iz porodice koza, itd.).
[0047] Tamo gde je obezbeđen opseg vrednosti, razume se da svaka interventna vrednost, do desetine jedinice donje granice osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, uzmeđu gornje i donje granice tog opsega i bilo koja druga navedena ili interventna vrednost u tom navedenom opsegu, obuhvaćena je u okviru prikaza. Gornje i donje vrednosti tih manjih opsega mogu biti nezavisno uključene u manje opsege, i takođe su obuhvaćene u okviru prikaza, koji podležu bilo kojoj specifično isključenoj granici u navedenom opsegu. Tamo gde navedeni opseg uključuje jednu ili obe granice, opsezi koji isključuju bilo koju ili obe od tih uključenih granica takođe su uključeni u prikaz.
SAŽET OPIS SLIKA NACRTA
[0048] Sledeće slike nacrta čine deo predmetne specifikacije i uključuju se da bi dalje pokazale izvesne aspekte predmetnog prikaza. Prikaz se može bolje razumeti pozivanjem na jednu ili više tih slika nacrta u kombinaciji sa detaljnim opisom specifičnih aspekata predstavljenih ovde.
SL.1 prikazuje da TGF-β scFv fragmenti neutrališu humani TGF-β. Indikovane količine TGF-β i anti-TGF-β scFv fragmenata dodate su HepG2 ćelijama u kulturu u trajanju od 30 min. Na neutralizaciju TGF-β ukazuje gubitak u fosfo-SMAD2 odgovoru, kao što je detektovano „Western“ Blot-om.
SL.2 prikazuje da se TGF-β CAR receptori eksprimiraju na površinu ćelije. TGF-β CAR je kreiran pomoću scFv#2. Površinsko bojenje i protočna citometrija pokazuju da se TGF-β CAR receptori javljaju na površini ćelije CD4+ i CD8+ T ćelija. Vanćelijski domen receptora sadrži FLAG epitop. EGFRt je skraćeni receptor epidermalnog faktora rasta koji je indikator ćelijske transdukcije.
SL. 3A-B pokazuje da TGF-β CAR receptori blokiraju signalizaciju endogenog TGF-β u CD8+ (A) i CD4+ (B) T ćelijama. TGF-β CAR ekspresija u T ćelijama blokira TGF-β signalizaciju preko SMAD puta. T ćelije koje eksprimiraju naznačeni receptor inkubirane su sa TGF-β u trajanju od 30 min i sondirane na fosfoSMAD2 „Western“ blot-om. „bez scFv (eng. „scFv-less“) se odnosi na CAR kome nedostaje bilo koji scFv domen za vezivanje liganda (antigena), EGFRt se odnosi na skraćeni receptor epidermalnog faktora rasta koji je irelevantan za druge komponente ovde.
SL.4A-C. (A) Jurkat ćelije stabilno eksprimiraju TGF-β CAR i NFAT reporter (EGFP eksprimiran iz NFAT-inducibilnog promotera) pokazuje povećanu aktivaciju kao odgovor na povećane koncentracije TGF-β. (B, C) primarne humane CD4+ T ćelije koje stabilno eksprimiraju TGF-β CAR ushodno regulišu (B) ekspresiju CD69 i (C) proizvodnju citokina Th1 kao odgovor na stimulaciju TGF-β faktorom. Ushodna regulacija CD69 praćena je pomoću površinskog bojenja nakon jednodnevne inkubacije sa ili bez TGF-β. Proizvodnja citokina detektovana je primenom inhibitora transporta proteina Brefeldin A i izvođenjem unutarćelijskog bojenja nakon jednodnevne inkubacije sa ili bez TGF-β. „Simulirane (mock)“ označava T ćelije transdukovane pomoću irelevantnog konstrukta. „Bez scFv“ označava T ćelije koje eksprimiraju CAR koji je identičan sa TGF-β CAR receptorom osim što mu nedostaje scFv domen i prema tome se ne može vezivati za TGF-β. „DNR“ je dominantno-negativan TGFβ receptor, koji je skraćen lanac 2 TGF-β receptora kome nedostaje citoplazmatski signalni domen. Prikazane vrednosti su srednje vrednosti triplikata sa stupcima grešaka koji ukazuju na ± 1 standardnu devijaciju (s.t.d.).<∗>p < 0,05;<∗∗>p < 0,005,<∗∗∗>p < 0,0005,<∗∗∗∗ ∗>p ≤ 0,0005.
SL. 5 prikazuje da dominantno-negativan TGF-β receptor nije u stanju da izaziva proizvodnju citokina. Iako je zabeleženo da dominanto-negativni TGF-β receptor takođe inhibira TGF-β signalizaciju, on ne izaziva imunostimulatorna dejstva kao što je proizvodnja TNF-α. Tβ kratki i Tβ dugi su dva različita TGF-β CAR receptora, Dom-Neg se odnosi na dominantno-negativni TGF-β receptor, i „bez scFv“ se odnosi na CAR kome nedostaje bilo koji scFV domen za vezivanje liganda. Tβ kratki se odnosi na TGF-β CAR polipeptid sa peptidnim spejserom koji se sastoji samo od IgG4 zglobnog regiona. Tβ dugi se odnosi na TGF-β CAR polipeptid sa peptidnim spejserom koji sadrži IgG4 zglobni region i CH2CH3regione.
SL.6 pokazuje da TGF-β CAR-T ćelije proliferišu kao odgovor na TGF-β.
SL. 7 prikazuje inhibiciju signalizacije mišjeg TGF-β/SMAD. Naznačene količine scFv i mišjeg TGF-β1 primenjene su na NIH3T3 fibroblaste u trajanju od 30 min. Ćelije su lizirane i sondirane na SMAD2 fosforilaciju.
SL. 8. Jurkat ćelije koje stabilno eksprimiraju TGF-β CAR i NFAT reporter (EGFP eksprimiran iz NFAT-inducibilnog promotera) pokazuju povećanu aktivaciju kao odgovor na povećan unos mišjeg TGF-β1, ukazujući na to da TGF-β CAR promenjen da prepoznaje humani TGF-β takođe unakrsno reaguje sa mišjim TGF-β.
SL.9. TGF-β CAR se pojavljuje na površini ćelije efikasnije nego dominantno-negativni TGF-β receptor.
SL.10. TGF-β CAR funkcija se može podešavati izborom kostimulatornog domena.
SL.11. TGF-β konzistentno izaziva proizvodnju TNF-α zavisno od doze po ćelijama od različitih donora.
SL.12. Dužina peptidnog spejsera TGF-β CAR receptora moduliše prag izazivanja.
SL. 13. CAR signalizacija zahteva dimerizaciju CAR receptora posredovanu ligandom, ali nije nužno da ligand ili sam CAR prethodno postoje kao dimer. Površinsko bojenje CD69 izvedeno je na linijama Jurkat ćelija koje nose naznačeni CAR receptor (receptore). GFP CAR #1 i GFP CAR #3 oba postoje pretežno kao homodimeri, i dva CAR receptora se vezuju za različite epitope na EGFP i mogu istovremeno vezivati monomerni EGFP molekul. GFP CAR #1 i GFP CAR #2 se vezuju za isti epitop na EGFP, ali CAR #2 postoji pre kao monomer nego kao homodimer.
SL.14. Rastvorni, dimerni antigenski molekuli mogu izazvati signalizaciju pomoću ligirajućih receptora na različitim ćelijama.
SL.15. TGF-β CAR se može izazvati i na način koji zavisi od kontakta ćelija-ćelija i na način koji ne zavisi od tog kontakta.
SL.16. TGF-β CAR-T ćelije se mogu aktivirati u odsustvu kontakta ćelija-ćelija.
OPIS ILUSTRATIVNIH ASPEKATA
[0049] Polipeptidi, ćelije i postupci opisani ovde mogu se upotrebiti za neutralisanje TGF-β i specifično izazivanje aktivacije T ćelija u prisustvu TGF-β.
I. Definicije
[0050] Peptidi prema ovom prikazu odnose se na peptide koji sadrže CAR receptore ili himerne antigenske receptore. CAR receptori su promenjeni receptori, koji prenose arbritrarnu specifičnost na imunsku efektorsku ćeliju. Tipično, ti receptori se upotrebljavaju da prenesu specifičnost monoklonskog antitela na T ćeliju. Receptori se nazivaju himerni zato što su sastavljeni od delova iz različitih izvora.
[0051] Termin „protein“, „polipeptid“ i „peptid“ ovde se mogu naizmenično smenjivati kada se odnose na genski proizvod.
[0052] „Homologija“, „identičnost“, ili „sličnost“ odnose se na sličnost sekvenci između dva peptida ili između dva molekula nukleinske kiseline. Identičnost se može odrediti poređenjem položaja u svakoj sekvenci koja se može poravnati za svrhe poređenja. Kada je položaj u poređenoj sekvenci zauzet istom bazom ili aminokiselinom, onda molekuli dele identičnost sekvence na tom položaju. Stepen identičnosti između sekvenci je funkcija broja poklapanja ili homolognih položaja koje sekvence dele. „Nepovezana“ ili „nehomologna“ sekvenca deli manje od 40% identičnosti, ili manje od 25% identičnosti, sa jednom od sekvenci prema trenutnom prikazu.
[0053] Termini „amino deo“, „N-terminus“, „amino terminus“ i slično kako se upotrebljavaju ovde upotrebljavaju se tako da se odnose na regione polipeptida. Nadalje, kada je nešto N-terminalno za region nije nužno na terminusu (ili kraju) celog polipeptida, već samo na terminusu regiona ili domena. Slično tome, termini „karboksi deo“, „C-terminus“, „karboksi terminus“ i slično kako se upotrebljavaju ovde upotrebljavaju se tako da se odnose na raspored regiona polipeptida, i kada je nešto C-terminalno za region nije nužno na terminusu (ili kraju) celog polipeptida, već samo na terminusu regiona ili domena.
[0054] Termini „polinukleotid“, „nukleinska kiselina“ i „oligonukleotid“ ovde se mogu naizmenično smenjivati i odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide ili njihove analoge. Polinukleotidi mogu imati bilo koju trodimenzionalnu strukturu i mogu izvoditi bilo koju funkciju, poznatu ili nepoznatu. Sledeći primeri su neograničavajući primeri polinukleotida: gen ili fragment gena (na primer, sonda, prajmer, EST ili SAGE tag), egzoni, introni, informaciona RNK (iRNK), transportna RNK, ribozomalna RNK, ribozimi, cDNK, dsRNK, siRNK, miRNK, rekombinantni polinukleotidi, razgranati polinukleotidi, plazmidi, vektori, izolovana DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, sonde nukleinske kiseline i prajmeri. Polinukleotid može sadržati modifikovane nukleotide, kao što su metilisani nukleotidi i analozi nukleotida. Ako su prisutne, modifikacije se u strukturu nukleotida mogu uneti pre ili nakon sastavljanja polinukleotida. Sekvenca nukleotida može se prekinuti nenukleotidskim komponentama. Polinukleotid se može dalje modifikovati nakon polimerizacije, kao konjugacijom sa komponentama za označavanje. Termin se takođe odnosi i na molekule sa dve zavojnice i na molekule sa jednom zavojnicom. Osim ako se ne naznači ili ne zahteva drugačije, bilo koji aspekat ovog prikaza koji je polinukleotid obuhvata i oblik sa dve zavojnice i svaki od dva komplementarna oblika sa jednom zavojnicom za koje je poznato ili utvrđeno da sačinjavaju oblik sa dve zavojnice.
[0055] Termini „subjekat“, „pojedinac“, ili „pacijent“ upotrebljavaju se ovde naizmenično i odnose se na kičmenjake, na primer primata, sisara ili poželjno čoveka. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na vrste iz porodice konja, vrste iz porodice pasa, vrste iz porodice goveda, vrste iz porodice ovaca, vrste iz porodice miševa, pacove, majmune, ljudska bića, domaće životinje, sportske životinje i kućne ljubimce.
[0056] Termin „bez kseno komponenata (xeno-free – XF)“ ili „bez životinjskih kompoenanta (animal component-free – ACF)“ ili „bez upotrebe životinja (animal free)“ kada se upotrebljava u vezi sa medijumom, vanćelijskim matriksom, ili stanjem kulture, odnosi se na medijum, vanćelijski matriks, ili stanje kulture koji su suštinski bez heterogenih komponenata izvedenih iz životinja. Za kultivisanje humanih ćelija, bilo koji proteini ne-ljudske životinje, kao što je miš, bili bi kseno komponente. U izvesnim aspektima, matriks bez kseno komponenata može biti suštinski bez ikakvih komponenata izvedenih od ne-™ ™
ljudskih životinja, isključujući stoga hraniteljske ćelije miša ili Matrigel . Matrigel je preparat solubilizovane bazalne membrane ekstrahovan iz Engelbret-Holm-Svarmovog (Engelbreth-Holm-Swarm) (EHS) mišjeg sarkoma, tumora bogatog proteinima vanćelijskog matriksa da bi se uključio laminin (glavna komponenta), kolagen IV, heparin sulfat proteoglikan i entaktin/nidogen. U nekim aspektima, kompozicije opisane ovde ili ćelije prema ovom prikazu kultivišu se u i/ili se pripremaju u/sa medijumom bez kseno komponenata ili bez životinjskih komponenata ili bez upotrebe životinja.
[0057] Ćelije su „suštinski bez“ izvesnih reagenasa ili elemenata, kao što je serum, inhibitori signalizacije, životinjske komponente ili hraniteljske ćelije, egzogeni genski elementi ili vektorski elementi, kako se upotrebljavaju ovde, kada imaju manje od 10% elementa (elemenata), i kada su „suštinski bez“ izvesnih reagenasa ili elemenata kada imaju manje od 1% elementa (elemenata). Međutim, još su poželjnije ćelijske populacije u kojima manje od 0,5% ili manje od 0,1% ukupne ćelijske populacije sadrži egzogene genske elemente ili vektorske elemente.
[0058] Kultura, matriks ili medijum su „suštinski bez“ izvesnih reagenasa ili elemenata, kao što je serum, inhibitori signalizacije, životinjske komponente ili hraniteljske ćelije, kada kultura, matriks ili medijum redom imaju nivo tih reagenasa niži od nivoa koji se može detektovati pomoću konvencionalnih postupaka detekcije poznatih osobi uobičajene stručnosti u oblasti tehnike ili ta sredstva nisu ekstrinzično dodata kulturi, matriksu ili medijumu. Bezserumski medijum može biti suštinski bez seruma.
[0059] „Gen“, „polinukleotid“, „kodirajući region“, „sekvenca“, „segment“, „fragment“, ili „transgen“ koji „kodira“ poseban protein, jeste molekul nukleinske kiseline koji se transkribuje i opciono takođe prevodi u genski proizvod, npr., polipeptid, in vitro ili in vivo kada se stavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Kodirajući region može biti prisutan u obliku bilo cDNK, genomske DNK, ili RNK. Kada je prisutan u obliku DNK, molekul nukleinske kiseline može biti sa jednom zavojnicom (tj., sens lanac) ili sa dve zavojnice. Granice kodirajućeg regiona određene su start kodonom na 5’ (amino) terminusu i stop kodonom za zaustavljenje translacije na 3’ (karboksi) terminusu. Gen može uključivati, ali nije ograničen na, cDNK iz prokariotske ili eukariotske iRNK, sekvence genomske DNK iz prokariotske ili eukariotske DNK, i sintetičke DNK sekvence. Sekvenca za terminaciju transkripcije obično će biti locirana na 3’ u odnosu na sekvencu gena.
[0060] Termin „ćelija“ se ovde upotrebljava u svom najširem smislu u oblasti tehnike i odnosi se na živo telo koje je strukturna jedinica tkiva višećelijskog organizma, koja je okružena membranskom strukturom koja je izoluje od spoljašnjosti, ima sposobnost samoreplikacije, i ima genetičku informaciju i mehanizam za njeno eksprimiranje. Ćelije koje se ovde upotrebljavaju mogu biti ćelije koje se javljaju prirodno ili veštački modifikovane ćelije (npr., fuzione ćelije, genetički modifikovane ćelije, itd.).
[0061] Kako se upotrebljava ovde, termin „matična ćelija“ se odnosi na ćeliju koja je sposobna za samoreplikaciju i pluripotenciju ili multipotenciju. Tipično, matične ćelije mogu regenerisati povređeno tkivo. Matične ćelije ovde mogu biti, ali nisu ograničene na, embrionalne matične (ES) ćelije (eng. embryonic stem cells), indukovane pluripotentne matične ćelije ili matične ćelije tkiva (takođe nazvane matične ćelije specifične za tkivo, ili somatske matične ćelije).
[0062] „Embrionalne matične (ES) ćelije“ su pluripotentne matične ćelije izvedene iz ranih embiona. ES ćelija je prvi put ustanovljena 1981, što je takođe primenjeno na proizvodnju nokaut miševa od 1989. Godine 1998, ustanovljena je humana ES ćelija, koja trenutno postaje dostupna za regenerativnu medicinu.
[0063] Za razliku od ES ćelija, matične ćelije tkiva imaju odgraničen potencijal diferencijacije. Matične ćelije tkiva su prisutne na posebnim lokacijama u tkivima i imaju nediferenciranu unutraćelijsku strukturu. Stoga, pluripotencija matičnih ćelija tkiva tipično je niska. Matične ćelije tkiva imaju viši odnos nukleusa/citoplazme i imaju više unutarćelijskih organela. Većina matičnih ćelija tkiva imaju nisku pluripotenciju, dug ćelijski ciklus, i proliferativnu sposobnost dužu od života pojedinca. Matične ćelije tkiva se dele u kategorije, na osnovu mesta sa kojih se ćelije izvode, kao što je dermalni sistem, digestivni sistem, sistem koštane srži, nervni sistem, i slično. Matične ćelije tkiva u dermalnom sistemu uključuju epidermalne matične ćelije, matične ćelije folikula kose, i slično. Matične ćelije tkiva u digestivnom sistemu uključuju pankreasne (obične) matične ćelije, matične ćelije jetre, i slično. Matične ćelije tkiva u sistemu koštane srži uključuju hematopoetske matične ćelije, mezenhimske matične ćelije, i slično. Matične ćelije tkiva u nervnom sistemu uključuju neuralne matične ćelije, matične ćelije retine, i slično.
[0064] „Indukovane pluripotentne matične ćelije“, uobičajeno skraćeno kao iPS ćelije ili iPSCs, odnose se na tip pluripotentne matične ćelije veštački pripremljene od nepluripotentne ćelije, tipično odrasle somatske ćelije, ili terminalno diferencirane ćelije, kao što je fibroplast, hematopoetska ćelija, miocit, neuron, ćelija epiderma, ili slično, uvođenjem izvesnih faktora, na koje se poziva kao na faktore reprogramiranja.
[0065] „Pluripotencija“ se odnosi na matičnu ćeliju koja ima potencijal da se diferencira u sve ćelije koje konstituišu jedno ili više tkiva ili organa, ili posebno, bilo koji od tri germinativna sloja: endoderm (unutrašnja sluznica želuca, gastrointestinalni trakt, pluća), mezoderm (mišićni, koštani, krvni, urogenitalni), ili ektoderm (epidermalna tkiva i nervni sistem). „Pluripotentne matične ćelije“ upotrebljene ovde odnose se na ćelije koje mogu da se diferenciraju u ćelije izvedene iz bilo kog od tri germinativna sloja, na primer, direktne potomke totipotentnih ćelija ili indukovanih pluripotentnih ćelija.
[0066] Kako se upotrebljaju ovde, termini „lečenje“, „lečiti“ i slično, odnose se na dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktičan u smislu potpune ili delimične prevencije bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapijski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili neželjenih posledica koje se mogu pripisati bolesti. „Lečenje“, kako se upotrebljava ovde, pokriva bilo koje lečenje bolesti kod sisara, npr., kod čoveka, a isključuje: (a) prevenciju pojavljivanja bolesti kod subjekta koji može imati predispoziciju za bolest ali dijagnozom još nije utvrđeno da je subjekt ima; (b) inhibiranje bolesti, tj., zaustavljanje njenog razvoja; i (c) olakšavanje bolesti, tj., izazivanje regresije bolesti.
[0067] U nekim aspektima, postupci se mogu upotrebiti za redukovanje veličine i/ili broja ćelija čvrstog tumora. U nekim aspektima, postupak prema ovom prikazu se može upotrebiti za inhibiranje rasta tumora, kao što su čvrsti tumori, kod subjekta.
[0068] Termin „antigen“ se odnosi na bilo koju supstancu koja izaziva imunski sistem da proizvodi antitela protiv nje, ili na koju reaguje T ćelija. U nekim aspektima, antigen je peptid koji je 5–50 aminokiselina u dužini ili je najmanje, najviše, ili tačno 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, ili 300 aminokiselina, ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti.
[0069] Termin „antitelo“ uključuje monoklonska antitela, poliklonska antitela, dimere, multimere, multispecifična antitela i fragmente antitela koji mogu biti humani, mišji, humanizovani, himerni, ili izvdeni od drugih vrsta. „Monoklonsko antitelo“ je antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela koje je usmereno protiv specifičnog antigenskog mesta.
[0070] „Antitelo ili njegov funkcionalni fragment“ znači molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje za, ili je imunološki reaktivan sa posebnim antigenom ili epitopom, i uključuje i poliklonska i monoklonska antitela. Termin antitelo uključuje genetički promenjene ili na drugi način modifikovane oblike imunoglobulina, kao što su intratela, peptitela, himerna antitela, potpuno humana antitela, humanizovana antitela, i heterokonjugovana antitela (npr., bispecifična antitela, diatela, triatela i tetratela). Termin funkcionalni fragment antitela uključuje fragmente antitela koji vezuju antigen, uključujući npr., Fab’, F(ab’)2, Fab, Fv, rlgG, i scFv fragmente. Termin scFv se odnosi na jedan lanac Fv antitela u kome su varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca tradicionalnog dvonlančanog antitela spojeni da bi obrazovali jedan lanac.
[0071] Upotreba jednolančanog varijabilnog fragmenta (scFv – single chain variable fragment) od posebnog je interesa. scFv fragmenti su rekombinantni molekuli u kojima su varijabilni regioni lakih i teških imunoglobulinskih lanaca koji kodiraju domene za vezivanje antigena promenjeni u jedan polipeptid. Generalno, VHi VLsekvence su povezane pomoću sekvence linkera. Videti, na primer, Ahmad (2012) Clinical and Developmental Immunology Article ID 980250.
[0072] „Terapijski efikasna količina“ ili „delotvorna količina“ odnosi se na količinu sredstva, ili na kombinovane količine dva sredstva, koja je, kada je data sisaru ili drugom subjektu radi lečenja bolesti, dovoljna da proizvede takvo lečenje za bolest. „Terapijski efikasna količina“ variraće zavisno od sredstva (sredstava), bolesti i njene ozbiljnosti, i starosti, mase, itd., subjekta koga treba lečiti.
[0073] Kako se upotrebljava ovde, određenje „neki“ ili „jedan“ može značiti jedan ili više. Kako se upotrebljava ovde u patentnom zahtevu (zahtevima), kada se upotrebljava u konjunkciji sa rečju „sadrži“, reči „neki“ ili „jedan“ mogu značiti jedan ili više od jednog.
[0074] Upotreba termina „ili“ u patentnim zahtevima upotrebljava se da znači „i/ili“ osim ako nije eksplicitno naznačeno da se odnosi samo na alternative ili na to da se alternative međusobno isključuju, premda prikaz podržava definiciju koja se odnosi samo na alternative i „i/ili“. Kako se upotrebljava ovde, „drugi“ može značiti najmanje drugi ili više.
[0075] U ovoj prijavi, termin „oko“ se upotrebljava da ukazuje da vrednost uključuje inherentnu varijaciju greške za uređaj, postupak koji se upotrebljava za određivanje vrednosti, ili varijaciju koja postoji među subjektima studije.
II. Polipeptidi
A. Signalni peptidi
[0076] „Signalni peptid“ se odnosi na peptidnu sekvencu koja usmerava transport i lokalizaciju proteina unutar ćelije, npr. do izvesne ćelijske organele (kao što je endoplazmatični retikulum) i/ili površine ćelije. Signalni peptid usmerava nascentni protein u endoplazmatični retikulum. To je od suštinskog značaja ako receptor treba da bude glikozilovan i usidren u ćelijskoj membrani. Generalno, upotrebljava se signalni peptid koji je prirodno vezan za većinu komponenata amino-terminala (npr. u scFv sa orijentacijom lak lanac – linker – teški lanac, upotrebljava se nativni signal lakog lanca). U nekim aspektima signalni peptid je SEQ ID NO:18.
[0077] U nekim aspektima, signalni peptid se cepa nakon prolaza endoplazmatičnog retikuluma (ER), tj. predstavlja signalni peptid koji se može cepati. U nekim aspektima, restrikciono mesto je na karboksi kraju signalnog peptida da bi olakšao cepanje.
B. Domen za vezivanje antigena
[0078] Domen za vezivanje antigena je jednolančani varijabilni fragment (scFv – single-chain variable fragment) na bazi TGF-β antitela. „Jednolančani Fv“ ili „scFv“ fragmenti antitela sadrže VHi VLdomene antitela, pri čemu su ti domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. U nekim aspektima, domen za vezivanje antigena dalje sadrži peptidni linker između VHi VLdomena, što omogućava da scFv obrazuje željenu strukturu za vezivanje antigena.
[0079] Varijabilni regioni domena za vezivanje antigena polipeptida prema ovom prikazu mogu se modifikovati mutiranjem ostataka aminokiselina unutar VH i/ili VL CDR 1, CDR 2 i/ili CDR 3 regiona da bi se unapredilo jedno ili više vezujućih svojstava (npr., afinitet) antitela. Termin „CDR“ se odnosi na region za određivanje komplementarnosti koji se bazira na delu varijabilnih lanaca u imunoglobulinima (antitelima) i receptorima T ćelija, koji generišu B ćelije i T ćelije redom, gde se ti molekuli vezuju za svoj specifični antigen. Kako se većina varijacija sekvenci povezanih sa imunoglobulinima i receptorima T ćelija pronalazi u CDR regionima, na te regione se ponekad poziva kao na hipervarijabilne regione. Mutacije se mogu uvesti pomoću mutageneze usmerene na mesto ili mutageneze posredovane PCR-om, i efekat na vezivanje antitela, ili drugo funkcionalno svojstvo od interesa, može se evaluirati u odgovarajućim in vitro ili in vivo testovima. Poželjno se uvode konzervativne modifikacije i tipično se ne menja više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka unutar CDR regiona. Mutacije mogu biti supstitucije aminokiselina, adicije ili delecije.
[0080] Modifikacije okvira mogu se izvesti na antitelima da bi se umanjila imunogenost, na primer, pomoću „povratnog mutiranja“ jednog ili više ostataka okvira do odgovarajuće sekvence germinativne linije.
[0081] Takođe se razmatra da domen za vezivanje antigena može biti multispecifičan ili multivalentan multimerizovanjem domena za vezivanje antigena pomoću parova VH i VL regiona koji vezuju bilo isti antigen (multivaletni) ili različiti antigen (multispecifični).
[0082] Kako se upotrebljava ovde, termin „afinitet“ odnosi se na konstantu ravnoteže za reverzibilno vezivanje dva agensa i izražava se kao konstanta disocijacije (Kd). Afinitet može biti 1 put veći, najmanje 2 puta veći, najmanje 3 puta veći, najmanje 4 puta veći, najmanje 5 puta veći, najmanje 6 puta veći, najmanje 7 puta veći, najmanje 8 puta veći, najmanje 9 puta veći, najmanje 10 puta veći, najmanje 20 puta veći, najmanje 30 puta veći, najmanje 40 puta veći, najmanje 50 puta veći, najmanje 60 puta veći, najmanje 70 puta veći, najmanje 80 puta veći, najmanje 90 puta veći, najmanje 100 puta veći, ili najmanje 1000 puta veći, ili više (ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti), nego afinitet antitela za nepovezane aminokiselinske sekvence. Kako se upotrebljava ovde, termin „aviditet“ se odnosi na rezistentnost kompleksa dva ili više sredstava na disocijaciju nakon rastvaranja. Termini „imunoreaktivan“ i „preferencijalno se vezuje“ upotrebljavaju se ovde naizmenično s obzirom na antitela i/ili fragmente koji vezuju antigen.
[0083] Termin „vezivanje“ se odnosi na direktno povezivanje između dva molekula, usled, na primer, kovalentnih, elektrostatičkih, hidrofobnih i jonskih i/ili interakcija vodonične veze, uključujući interakcije kao što su soni mostovi i vodeni mostovi.
C. Peptidni spejser
[0084] Region spejsera povezuje domen za vezivanje antigena sa transmembranskim domenom. Treba da bude dovoljno fleksibilan kako bi domenu za vezivanje antigena omogućio orijentisanje u različitim smerovima da bi se olakšalo prepoznavanje antigena. Najjednostavniji oblik je zglobni region iz IgG. Alternative uključuju CH2CH3region imunoglobulina i delove CD3. U nekim aspektima, CH2CH3region može imati modifikacije L235E/N297Q ili L235D/N297Q, ili najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci CH2CH3regiona. Za većinu konstrukta baziranih na scFv, dovoljan je IgG zglobni region. Međutim, najbolji spejser se često mora odrediti empirijski. U nekim aspektima, spejser je iz IgG4.
[0085] Kako se upotrebljava ovde, termin „zglobni“ se odnosi na fleksibilni polipeptidni konektorski region (na koji se ovde takođe poziva kao na „zglobni region“ ili „spejser“) koji obezbeđuju strukturnu fleksibilnost i razmak za bočne polipeptidne regione i može se sastojati od prirodnih ili sintetičkih polipeptida. „Zglobni region“ izveden iz imunoglobulina (npr., IgGl) generalno se definiše kao region koji se proteže od Glu216 do Pro230 humanog IgGl (Burton (1985) Molec. Immunol., 22: 161-206). Zglobni regioni drugih IgG izotipova mogu biti poravnati sa IgGl sekvencom postavljanjem prvih i poslednjih cisteinskih ostataka koji obrazuju disulfidne (S-S) veze među teškim lancima na istim položajima. Zglobni region se može javljati prirodno ili se javljati neprirodno, uključujući ali bez ograničenja na izmenjeni zglobni region kako je opisano u U.S. Pat. No. 5,677,425. Zglobni region može uključivati kompletan zglobni region izveden iz antitela različite klase ili potklase od onog u CH1domenu. Termin „zglobni“ može takođe uključivati regione izvedene iz CD8 i druge receptore koji obezbeđuju sličnu funkciju u obezbeđivanju fleksibilnosti i razmaka za bočne regione.
[0086] Polipeptidni spejser može imati dužinu od najmanje, najviše, ili tačno 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325, 350, ili 400 aminokiselina (ili bilo koji raspon koji se u tome može izvesti). U nekim aspektima, peptidni spejser se sastoji od ili obuhvata jedan zglobni region iz imunoglobulina. Aminokiselinske sekvence imunoglobulinskog zglobnog regiona poznate su u oblasti tehnike; videti, npr., Tan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 162; i Huck et al. (1986) Nucl. Acids Res.
[0087] Dužina peptidnog spejsera može delovati na odgovor na TGF-β i/ili svojstva ekspanzije. U nekim aspektima, kraći spejser kao što je manje od 50, 45, 40, 30, 35, 30, 25, 20, 15, ili 10 aminokiselina može imati prednost smanjenja u koncentraciji TGF-β koja se traži za efikasan aktivacioni odgovor. U nekim aspektima, duži spejser, kao što je onaj koji je najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 260, 270, 280, ili 290 aminokiselina može imati prednost povećane ekspanzije in vivo ili in vitro.
[0088] Kao neograničavajući primeri, imunoglobulinski zglobni region može uključivati jednu od sledećih aminokiselinskih sekvenci: DKTHT (SEQ ID NO:27); CPPC (SEQ ID NO:28); CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO:29); ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO:30); KSCDKTHTCP (SEQ ID NO:31); KCCVDCP (SEQ ID NO:32); KYGPPCP (SEQ ID NO:33); EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:34) (humani IgGl zglobni region); ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:35) (humani IgG2 zglobni region); ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:36) (humani IgG3 zglobni region); SPNMVPHAHHAQ (SEQ ID NO:37); ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO:98) ili ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:99) (humani IgG4 na bazi zglobnog regiona) i slično. U nekim aspektima, zglobni region je SEQ ID NO:98 ili SEQ ID NO:99. U nekim aspektima, zglobni region je SEQ ID NO:99.
[0089] Zglobni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu humanog IgGl, IgG2, IgG3, ili IgG4, zglobnog regiona. Zglobni region može uključivati jednu ili više supstitucija aminokiselina i/ili insertovanja i/ili delecija u poređenju sa zglobnim regionom divljeg tipa (koji se javlja u prirodi). Na primer, His229 humanog IgGl zglobnog regiona može se supstituisati sa Tyr, tako da zglobni region obuhvata sekvencu EPKSCDKTYTCPPCP (SEQ ID NO:38).
[0090] Zglobni region može sadržati aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz humane CD8; npr., zglobni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu: TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:39), ili njenu varijantu.
D. Transmembranski domen
[0091] Transmembranski domen je hidrofobni alfa heliks koji se proteže kroz membranu. Generalno, upotrebljava se transmembranski domen iz komponente endodomena koja je najproksimalnija u odnosu na membranu. Različiti transmembranski domeni kao rezultat imaju različitu stabilnost receptora.
[0092] Transmembranski domen se umeće između peptidnog spejsera i endodomena. U nekim aspektima, transmembranski domen se umeće između peptidnog spejsera i kostimulatornog regiona. U nekim aspektima, linker je između transmembranskog domena i kostimulatornog regiona ili endodomena.
[0093] Bilo koji transmembranski domen koji obezbeđuje insertovanje polipeptida u ćelijsku membranu eukariotske ćelije (npr., sisara) pogodan je za upotrebu. Kao jedan neograničavajući primer, može se upotrebiti transmembranska sekvenca IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO:48). U nekim aspektima, transmembranski domen je izveden iz CD8 beta: LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (SEQ ID NO:49); izvedeni iz CD4: ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC (SEQ ID NO:50); izvedeni iz CD3 zeta: LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV (SEQ ID NO:51); izvedeni iz CD28: WVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:52); izvedeni iz CD134 (OX40): VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (SEQ ID NO:53); ili izvedeni iz CD7: ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA (SEQ ID NO:54).
E. Endodomen
[0094] Nakon prepoznavanja antigena, receptori se grupišu i signal se prenosi do ćelije preko endodomena i/ili kostimulatornog domena. U nekim aspektima, kostimulatorni domeni opisani ovde deo su endodomena. Najčešće upotrebljavana komponenta endodomena je CD3-zeta, koja sadrži 3 ITAM motiva. Ona prenosi aktivacioni signal do T ćelije nakon vezivanja antigena. Može se desiti da CD3-zeta ne obezbedi potpuno kompetentan aktivacioni signal i tada je potrebna dodatna kostimulatorna signalizacija. Na primer, mogu se upotrebiti himerni CD28 i OX40 sa CD3-Zeta da se prenese signal za proliferaciju/preživljavanje, ili se sva tri mogu upotrebiti zajedno.
[0095] Dalji endodomeni pogodni za upotrebu u polipeptidima prema ovom prikazu uključuju bilo koji željeni signalni domen koji obezbeđuje jasan signal koji se može detektovati (npr., povećana proizvodnja jednog ili više citokina od strane ćelije; promena u transkripciji ciljnog gena; promena u aktivnosti proteina; promena u ponašanju ćelije; npr., smrt ćelije; ćelijska proliferacija; ćelijska diferencijacija; preživljavanje ćelije; modulacija ćelijskih signalnih odgovora; itd.) kao odgovor na aktivaciju tako što vezuju antigen za domen za vezivanje antigena. U nekim aspektima, endodomen uključuje najmanje jedan (npr., jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, itd.) ITAM motiva kako je opisano ovde. U nekim aspektima, endodomen uključuje signalne lance tipa DAP10/CD28.
[0096] Endodomen pogodan za upotrebu u polipeptidima prema ovom prikazu uključuje unutarćelijske signalne polipeptide koji sadrže aktivacioni motiv na bazi tirozina (ITAM). ITAM motiv je YX1X2(L/I), gde su X1i X2nezavisno bilo koja aminokiselina (SEQ ID NO:64). U nekim slučajevima, endodomen sadrži 1, 2, 3, 4, ili 5 ITAM motiva. U nekim slučajevima, ITAM motiv se ponavlja dvaput u endodomenu, gde su prva i druga instanca ITAM motiva odvojene jedna od druge pomoću 6 do 8 aminokiselina, npr., (YX1X2(L/I))(X3)n(YX1X2(L/I)), gde je n ceo broj od 6 do 8, i svaki od 6–8 X3može biti bilo koja aminokiselina (SEQ ID NO:65).
[0097] Pogodan endodomen može biti deo koji sadrži ΓΓAM motiv, pri čemu je taj deo izveden iz polipeptida koji sadrži ITAM motiv. Na primer, pogodan endodomen može biti domen koji sadrži ITAM motiv iz bilo kog proteina koji sadrži ITAM motiv. Prema tome, pogodan endodomen ne mora da sadrži celu sekvencu celog proteina iz koga je izveden. Primeri pogodnih polipeptida koji sadrže ITAM motiv uključuju, ali nisu ograničeni na: DAP12; FCER1G (gama lanac Fc epsilon receptora I); CD3D (CD3 delta); CD3E (CD3 epsilon); CD3G (CD3 gama); CD3Z (CD3 zeta); i CD79A (alfa lanac proteina povezan sa kompleksom receptora antigena).
[0098] U nekim slučajevima, endodomen se izvodi iz DAP12 (takođe poznat kao TYROBP; protein koji vezuje TYRO protein tirozin kinazu; KARAP; PLOSL; protein 12 za aktivaciju DN AX; protein povezan sa KAR receptorom; protein koji vezuje TYRO protein tirozin kinazu; protein povezan sa receptorom koji aktivira ubicu/; protein povezan sa receptorom-koji-aktivira-ubicu; itd.). Na primer, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati sekvencu aminokiseline koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa
[0099] U nekim aspektima, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati deo koji sadrži ITAM motiv pune dužine DAP12 aminokiselinske sekvence. Prema tome, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa ESPYOELOGORSDVYSDLNTO (SEQ ID NO: 70).
[0100] U nekim aspektima, endodomen se izvodi iz FCER1G (takođe poznat kao FCRG; gama lanac Fc epsilon receptora I; gama lanac Fc receptora; fc-epsilon Rl-gama; fcRgama; fceRI gama; podjedinica gama receptora imunoglobulina epsilon visokog afiniteta; receptor imunoglobulina epsilon, visokog afiniteta, gama lanac; itd.). Na primer, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa
[0101] U nekim aspektima, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati deo koji sadrži ITAM motiv pune dužine FCERIG aminokiselinske sekvence. Prema tome, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa DGVYTGLSTRNOETYETLKHE (SEQ ID NO: 72).
[0102] U nekim aspektima, endodomen se izvodi iz glikoproteinskog CD3 delta lanca sa površine T ćelija (takođe poznat kao CD3D; CD3-DELTA; T3D; CD3 antigen, podjedinica delta; CD3 delta; CD3d antigen, delta polipeptid (TiT3 kompleks); OKT3, delta lanac; receptorski T3 delta lanac T ćelija; glikoproteinski CD3 delta lanac sa površine T ćelija; itd.). Na primer, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa susednim nizom koji sadrži od oko 100 aminokiselina do oko 110 aminokiselina (aa), od oko 110 aa do oko 115 aa, od oko 115 aa do oko 120 aa, od oko 120 aa do oko 130 aa, od oko 130 aa do oko 140 aa, od oko 140 aa do oko 150 aa, or od oko 150 aa do oko 170 aa, bilo od sledećih aminokiselinskih sekvenci (2 izooblika): MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLD LGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLL LALGVFCFAGHETGRLSGAADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAOYSHLGGNWARNK (SEQ ID NO:73) ili MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLD LGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVOVHYRTADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAQ YSHLGGNWARNK (SEQ ID NO: 74).
[0103] U nekim aspektima, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati deo koji sadrži ITAM motiv pune dužine CD3 delta aminokiselinske sekvence. Prema tome, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa DOVYOPLRDRDDAOYSHLGGN (SEQ ID NO:75).
[0104] U nekim aspektima, endodomen se izvodi iz glikoproteinskog CD3 epsilon lanca sa površine T ćelija (takođe poznat kao CD3e, antigenski T3/Leu-4 epsilon lanac sa površine T ćelija, glikoproteinski CD3 epsilon lanac sa površine T ćelija, AI504783, CD3, CD3epsilon, T3e, itd.). Na primer, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa susednim nizom koji sadrži od oko 100 aminokiselina do oko 110 aminokiselina (aa), od oko 110 aa do oko 115 aa, od oko 115 aa do oko 120 aa, od oko 120 aa do oko 130 aa, od oko 130 aa do oko 140 aa, od oko 140 aa do oko 150 aa, ili od oko 150 aa do oko 205 aa, od sledećih aminokiselinskih sekvenci:
[0105] U nekim aspektima, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati deo koji sadrži ITAM motiv pune dužine CD3 epsilon aminokiselinske sekvence. Prema tome, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR (SEQ ID NO:77).
[0106] U nekim aspektima, endodomen se izvodi iz glikoproteinskog CD3 gama lanca sa površine T ćelija (takođe poznat kao CD3G, receptorski T3 gama lanac T ćelija, CD3-GAMA, T3G, gama polipeptid (TiT3 kompleks), itd.). Na primer, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa susednim nizom koji sadrži od oko 100 aminokiselina do oko 110 aminokiselina (aa), od oko 110 aa do oko 115 aa, od oko 115 aa do oko 120 aa, od oko 120 aa do oko 130 aa, od oko 130 aa do oko 140 aa, od oko 140 aa do oko 150 aa, ili od oko 150 aa do oko 180 aa, od sledećih aminokiselinskih sekvenci:
[0107] U nekim aspektima, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati deo koji sadrži ITAM motiv pune dužine CD3 gama aminokiselinske sekvence. Prema tome, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa DOLYOPLKDREDDOYSHLOGN (SEQ ID NO:79).
[0108] U nekim aspektima, endodomen se izvodi iz glikoproteinskog CD3 zeta lanca sa površine T ćelije (takođe poznat kao CD3Z, receptorski T3 zeta lanac T ćelija, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ, itd.). Na primer, pogodan polipeptid unutarćelijskog signalnog domena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa susednim nizom koji sadrži od oko 100 aminokiselina do oko 110 aminokiselina (aa), od oko 110 aa do oko 115 aa, od oko 115 aa do oko 120 aa, od oko 120 aa do oko 130 aa, od oko 130 aa do oko 140 aa, od oko 140 aa do oko 150 aa, ili od oko 150 aa do oko 160 aa, bilo od sledećih aminokiselinskih sekvenci (2 izooblika): MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELO KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 80) ili MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNEL OKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR( SEQ ID NO: 81).
[0109] U nekim aspektima, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati deo koji sadrži ITAM motiv pune dužine CD3 zeta aminokiselinske sekvence. Prema tome, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa bilo kojom od sledećih aminokiselinskih sekvenci: RVKFSRSADAPAYOQGONOLYNELNLGRREEYDVLDKR-RGRDPEMGGKPRRKNPO EGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALP PR (SEQ ID NO: 82); NOLYNELNLGRREEYDVLDKR (SEQ ID NO:83); EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK (SEQ ID NO:84); ili DGLYOGLSTATKDTYDALHMO (SEQ ID NO:85).
[0110] U nekim aspektima, endodomen se izvodi iz CD79A (takođe poznat kao proteinski alfa lanac povezan sa kompleksom receptora antigena B ćelija; CD79a antigen (alfa povezan sa imunoglobulinom); MB-1 membranski glikoprotein; ig-alfa; protein povezan sa imunoglobulinom vezanim za membranu; protein povezan sa površinskim IgM-om; itd.). Na primer, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa susednim nizom koji sadrži od oko 100 aminokiselina do oko 110 aminokiselina (aa), od oko 110 aa do oko 115 aa, od oko 115 aa do oko 120 aa, od oko 120 aa do oko 130 aa, od oko 130 aa do oko 150 aa, od oko 150 aa do oko 200 aa, ili od oko 200 aa do oko 220 aa, bilo od sledećih aminokiselinskih sekvenci (2 izooblika): MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGN ESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWO NEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLOGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO:86); ili MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIIL LFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYE DISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO:87).
[0111] U nekim aspektima, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati deo koji sadrži ITAM motiv pune dužine CD79A aminokiselinske sekvence. Prema tome, pogodan polipeptid endodomena može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa sledećom aminokiselinskom sekvencom: ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG (SEQ ID NO:88).
[0112] U nekim aspektima, pogodni endodomeni mogu obuhvatati signalni lanac tipa DAP10/CD28. Primer signalnog lanca DAP 10 je aminokiselinska sekvenca: RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO:89). U nekim aspektima, pogodan endodomen obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa punom dužinom aminokiselinske sekvence RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO:90).
[0113] Primer signalnog lanca CD28 je aminokiselinska sekvenca FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR-SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:91). U nekim aspektima, pogodan endodomen obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa punom dužinom aminokiselinske sekvence FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 92).
[0114] Dalji endodomeni pogodni za upotrebu u polipeptidima prema ovom prikazu uključuju polipeptid ZAP70, npr., polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100%, identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa susednim nizom koji sadrži od oko 300 aminokiselina do oko 400 aminokiselina, od oko 400 aminokiselina do oko 500 aminokiselina, ili od oko 500 aminokiselina do 619 aminokiselina, sledeće aminokiselinske sekvence: MPDPAAHLPFFYGSIS RAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAG GKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQ
TWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGK FLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKA DGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSP DKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRM RKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVME MAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLV NRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYG VTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWE DRPDFLTVEQRMRACYYS-LASKVEGPPGSTQKAEAACA (SEQ ID NO:93).
F. Peptidi za detekciju
[0115] Pogodni peptidi za detekciju uključuju hemaglutinin (HA; npr., YPYDVPDYA (SEQ ID NO:94); FLAG (npr., DYKDDDDK (SEQ ID NO:17); c-myc (npr., EQKLISEEDL; SEQ ID NO:95), i slično. Drugi pogodni peptidi za detekciju poznati su u oblasti tehnike.
G. Linkeri
[0116] U nekim aspektima, polipeptidi prema ovom prikazu uključuju peptidne linkere (na koje se ponekad poziva kao na linker). Peptidni linker može odvajati bilo koji od peptidnih domena/regiona opisanih ovde. Kao primer, linker može biti između signalnog peptida i domena za vezivanje antigena, između VH i VL domena za vezivanje antigena, između domena za vezivanje antigena i peptidnog spejsera, između peptidnog spejsera i transmembranskog domena, bočno od kostimulatornog regiona ili na N-regionu ili C-regionu kostimulatornog regiona, i/ili između transmembranskog domena i endodomena. Peptidni linker može imati bilo koju od različitih aminokiselinskih sekvenci. Domeni i regioni mogu se povezati peptidnim linkerom koji je generalno fleksibilne prirode, premda druge hemijske veze nisu isključene. Linker može biti peptid od između oko 6 i oko 40 aminokiselina u dužini, ili između oko 6 i oko 25 aminokiselina u dužini. Ti linkeri se mogu proizvesti tako što se sintetički oligonukleotidi koji kodiraju linkere upotrebljavaju da kupluju proteine.
[0117] Mogu se upotrebiti peptidni linkeri sa izvesnim stepenom fleksibilnosti. Peptidni linkeri mogu imati praktično bilo koju aminokiselinsku sekvencu, imajući na umu da će pogodni peptidni linkeri imati sekvencu koja kao rezultat daje generalno fleksibilan peptid. Upotreba malih aminokiselina, kao što su glicin i alanin, korisni su za kreiranje fleksibilnog peptida. Kreiranje takvih sekvenci je rutina za one koji su stručni u oblasti tehnike.
[0118] Pogodni linkeri se mogu lako izabrati i mogu biti bilo koje pogodne od različitih dužina, kao što je od 1 aminokiseline (npr., Gly) do 20 aminokiselina, od 2 aminokiseline do 15 aminokiselina, od 3 aminokiseline do 12 aminokiselina, uključujući 4 aminokiseline do 10 aminokiselina, 5 aminokiselina do 9 aminokiselina, 6 aminokiselina do 8 aminokiselina, ili 7 aminokiselina do 8 aminokiselina, i mogu biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 aminokiselina.
[0119] Primeri fleksibilnih linkera uključuju glicinske polimere (G)n, glicinsko-serinske polimere (uključujući, na primer, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO:40) i (GGGS)n (SEQ ID NO:41), gde je n ceo broj od najmanje jedan, glicinsko-alaninske polimere, alaninsko-serinske polimere, i druge fleksibilne linkere poznate u oblasti tehnike. Mogu se upotrebiti glicinski i glicinsko-serinski polimeri; i Gly i Ser su relativno nestrukturisani, i stoga mogu služiti kao neutralna veza (eng. tether) između komponenata. Mogu se upotrebiti glicinski polimeri; glicin pristupa znatno više „fi-psi“ prostoru nego čak i alanin, i mnogo je manje ograničen od ostataka sa dužim bočnim lancima. Primeri spejsera mogu obuhvatati aminokiselinske sekvence uključujući, ali bez ograničenja na, GGSG (SEQ ID NO:42), GGSGG (SEQ ID NO:43), GSGSG (SEQ ID NO:44), GSGGG (SEQ ID NO:45), GGGSG (SEQ ID NO:46), GSSSG (SEQ ID NO:47), i slično.
H. Kostimulatorni region
[0120] Neograničavajući primeri pogodnih kostimulatornih regiona uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide od 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, OX-40, BTLA, CD27, CD30, GITR, i HVEM.
[0121] Kostimulatorni region može imati dužinu od najmanje, najviše, ili tačno 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, ili 300 aminokiselina ili bilo koji opseg koji se u tome može izvesti. U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina 4-1BB (takođe poznat kao TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDwl37; ILA; itd.). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinih sekvenci sa KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:55).
[0122] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina CD28 (takođe poznat kao Tp44). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:56).
[0123] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina ICOS (takođe poznat kao AILIM, CD278, i CVID1). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO:57).
[0124] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina OX-40 (takođe poznat kao TNFRSF4, RP5-902P8.3,ACT35, CD134, OX40,TXGP1L). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:58).
[0125] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina BTLA (takođe poznat kao BTLA1 i CD272). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa
[0126] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina CD27 (takođe poznat kao S 152, T14, TNFRSF7, i Tp55). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO:60).
[0127] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina CD30 (takođe poznat kao TNFRSF8, D1S166E, i Ki-1). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa
[0128] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina GITR (takođe poznat kao TNFRSF18, RP5-902P8.2, AITR, CD357, i GITR-D). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO:62).
[0129] U nekim aspektima, kostimulatorni region se izvodi iz unutarćelijskog dela transmembranskog proteina HVEM (takođe poznat kao TNFRSF14, RP3-395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR, i TR2). Na primer, pogodan kostimulatorni region može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% identičnosti aminokiselinskih sekvenci sa
I. Dodatne modifikacije
[0130] Dodatno, polipeptidi prema ovom prikazu mogu biti hemijski modifikovani. Glikozilacija polipeptida može se izmeniti, na primer, modifikovanjem jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence polipeptida da bi se povećao afinitet polipeptida prema antigenu (U.S. Pat. Nos.5,714,350 and 6,350,861).
[0131] Polipeptidi prema ovom prikazu mogu se pegilovati da bi se povećao biološki poluživot reagujućeg polipeptida sa polietilen glikolom (PEG) ili reaktivnim estrom ili aldehidom derivatom PEG, pod uslovima u kojima jedna ili više PEG grupa postaje pričvršćena za polipeptid. Pegilacija polipeptida može se izvesti pomoću reakcije acilacije ili reakcije alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvornim u vodi). Kako se upotrebljava ovde, predviđeno je da termin „polietilen glikol“ obuhvata bilo koji od oblika PEG koji je upotrebljavan za derivatizaciju drugih proteina, kao što su mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. Postupci za pegilizovanje proteina poznati su u oblasti tehnike i mogu se primeniti na polipeptide prema ovom prikazu (EP 0154316 and EP 0 401384).
[0132] Dodatno, polipeptidi mogu biti hemijski modifikovani konjugovanjem ili fuzijom polipeptida sa serumskim proteinom, kao što je humani serumski albumin, da bi se povećao poluživot dobijenog molekula. Takav pristup je na primer opisan u EP 0322094 and EP 0486525.
[0133] Polipeptidi prema ovom prikazu mogu biti konjugovani sa dijagnostičkim ili terapijskim sredstvom i upotrebljeni dijagnostički, na primer, za praćenje razvoja ili progresije bolesti i određivanje efikasnosti datog režima lečenja. Polipeptidi takođe mogu biti konjugovani sa terapijskim sredstvom kako bi se obezbedila terapija u kombinaciji sa imunostimulišućim efektom polipeptida. Primeri dijagnostičkih sredstava uključuju enzime, protetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale, radioaktivne materijale, metale koji emituju pozitrone pomoću različitih pozitronskih emisionih tomografija, i neradioaktivne paramagnetne metalne jone. Supstanca koja se može detektovati može se povezati ili konjugovati bilo direktno sa polipeptidom, ili indirektno, preko linkera postupcima poznatim u oblasti tehnike. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galktozidazu, ili acetilholinesterazu. Primeri pogodnih kompleksa protetičke grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin. Primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin. Primer luminiscentnog materijala uključuje luminol. Primeri bioluminiscentnog materijala uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin. Primeri pogodnih radioaktivnih materijala uključuju .sup.125I, .sup.131I, indijum-111, lutecijum-171, bizmut-212, bizmut-213, astatin-211, bakar-62, bakar-64, bakar-67, itrijum-90, jod-125, jod-131, fosfor-32, fosfor-33, skandijum-47, srebro-111, galijum-67, prazeodimijum-142, samarijum-153, terbijum-161, disprozijum-166, holmijum-166, renijum-186, itenijum-188, renijum-189, olovo-212, radijum-223, aktinijum-225, gvožđe-59, selenijum-75, arsenik-77, stroncijum-89, molibden-99, rodijum-1105, paladijum-109, prazeodimijum-143, prometijum-149, erbijum-169, iridijum-194, zlato-198, zlato-199, i olovo-211. Helatna sredstva mogu se pričvrstiti preko srodnih grupa (Meares et al., 1984 Anal. Biochem.142: 68-78); sulfhidrilnih grupa (Koyama 1994 Chem. Abstr.120: 217262t) ostataka aminokiselina i grupe ugljenih hidrata (Rodwell et al.1986 PNAS USA 83: 2632-2636; Quadri et al.1993 Nucl. Med. Biol.20: 559-570).
[0134] Polipeptidi takođe mogu biti konjugovani sa terapijskim sredstvom kako bi se obezbedila terapija u kombinaciji sa imunostimulišućim efektom polipeptida.
[0135] Dodatni pogodni konjugovani molekuli uključuju ribonukleazu (RNaza), DNazu I, antisens nukleinsku kiselinu, inhibitorni RNK molekul kao što je siRNK molekul, imunostimulatornu nukleinsku kiselinu, aptamere, ribozime, molekule koji obrazuju tripleks, i spoljašnje vodič-sekvence. Aptameri su male nukleinske kiseline u opsegu od 15–50 baza u dužini koje se savijaju u definisane sekundarne i tercijarne strukture, ko što su „stern“petlje ili G-kvarteti, i mogu da vezuju manje molekule, kao što su ATP (U.S. Pat. No. 5,631,146) i teofilin (U.S. Pat. No. 5,580,737), kao i velike molekule, kao što je reverzna transkriptaza (U.S. Pat. No.5,786,462) i trombin (U.S. Pat. No.5,543,293). Ribozimi su molekuli nukleinskih kiselina koji su sposobni za katalizovanje hemijske reakcije, bilo intramolekularno ili inermolekularno. Ribozimi tipično cepaju supstrate nukleinskih kiselina preko prepoznavanja i vezivanja ciljnog supstrata sa naknadnim cepanjem. Molekuli nukleinske kiseline sa funkcijom obrazovanja tripleksa mogu da interaguju sa nukleinskom kiselinom sa dve zavojnice ili jednom zavojnicom tako što obrazuju tripleks, u kome tri zavojnice DNK obrazuju kompleks koji zavisi i od Votson-Krikovog (Watson-Crick) i Hugstinovog (Hoogsteen) baznog kuplovanja. Molekuli tripleksa mogu da vezuju ciljne regione sa visokim afinitetom i specifičnošću.
[0136] Funkcionalni molekuli nukleinske kiseline mogu delovati kao efektori, inhibitori, modulatori i stimulatori specifične aktivnosti koju poseduje ciljni molekul, ili funkcionalni molekuli nukleniske kiseline mogu posedovati aktivnost de novo nezavisnu od bilo kojih drugih molekula.
J. Himerni antigenski receptori specifični za kancer
[0137] U nekim aspektima, ćelije mogu dalje obuhvatati himerni antigenski receptor (CAR) specifičan za kancer. Termin „specifičan za kancer“ u kontekstu CAR receptora odnosi se na CAR receptore koji imaju specifičnost vezivanja antigena za molekule specifične za kancer, kao što je antigen specifičan za kancer. U nekim aspektima, CAR specifičan za kancer je u ćeliji sa TGF-β CAR. U nekim aspektima, CAR specifičan za kancer i TGF-β care su na zasebnim polipeptidima. U nekim aspektima, CAR je bispecifični CAR sa antigenskim vezivanjem za molekule specifične za kancer i za TGF-β. Na primer, bispecifični CAR može imati signalni peptid, scFv specifičan za molekul kancera, opciono peptidni linker/spejser, koga prati TGF-β scFv, koga prati spejser, transmembranski domen i kostimulatorni domen. U nekim aspektima, bispecifični CAR obuhvata jedan ili više dodatnih peptidnih segmenata opisanih ovde.
[0138] U nekim aspektima, polipeptidi prema ovom prikazu moraju obuhvatati CD20 scFv. Primer CD20 scFv obuhvata sledeće:
[0139] U nekim aspektima, polipeptidi prema ovom prikazu mogu obuhvatati CD19 scFv. Primer CD19 scFv obuhvata sledeće:
[0140] Drugi molekuli specifični za kancer (uz CD19 i CD20) mogu uključivati CAIX, CD33, CD44v7/8, CEA, EGP-2, EGP-40, erb-B2, erb-B3, erb-B4, FBP, fetalni acetiholinski receptor, GD2, GD3, Her2/neu, IL-13R-a2, KDR, k-laki lanac, LeY, L1 molekul ćelijske adhezije, MAGE-A1, mezotelin, MUC1, NKG2D ligandi, onkofetalni antigen (h5T4), PSCA, PSMA, TAA na koje ciljaju mAb IgE, TAG-72, i VEGF-R2. U nekim aspektima, molekul specifičan za kancer obuhvata Her2.
III. Ćelije
[0141] Izvesni aspekti se odnose na ćelije koje sadrže polipeptide ili nukleinske kiseline prema ovom prikazu. U nekim aspektima ćelija je imunska ćelija ili T ćelija. „T ćelija“ uključuje sve tipove imunskih ćelija
koje eksprimiraju CD3 uključujući T pomoćničke ćelije (CD4 ćelije), citotoksične T ćelije (CD8 ćelije), T
regulatorne ćelije (Treg) i gama-delta T ćelije. „Citotoksićna ćelija“ uključuje CD8 T ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), i neutrofile, pri čemu su te ćelije sposobne za posredovanje citotoksičnih odgovora.
[0142] Pogodne ćelije sisara uključuju linije primarnih ćelija i imortalizovanih ćelija. Pogodne linije ćelija sisara uključuju linije humanih ćelija, linije ćelija ne-ljudskih primata, linije ćelija glodara (npr., miš, pacov), i slično. Pogodne linije ćelija sisara uključuju, ali nisu ograničene na, HeLa ćelije (npr., American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), CHO ćelije (npr., ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), ćelije 293 bubrega ljudskog embriona (HEK) (npr., ATCC No. CRL-1573), Vero ćelije, NIH 3T3 ćelije (npr., ATCC No. CRL-1658), Huh-7 ćelije, BHK ćelije (npr., ATCC No. CCL10), PC12 ćelije (ATCC No. CRL1721), COS ćelije, COS-7 ćelije (ATCC No. CRL1651), RATI ćelije, mišje L ćelije (ATCC No. CCLI.3), HLHepG2 ćelije, Hut-78, Jurkat, HL-60, NK ćelijske linije (npr., NKL, NK92, i YTS), i slično.
[0143] U nekim slučajevima, ćelija nije linija imortalizovanih ćelija, već je umesto toga ćelija (npr., primarna ćelija) dobijena od pojedinca. Na primer, u nekim slučajevima, ćelija je imunska ćelija dobijena od pojedinca. Kao primer, ćelija je T limfocit dobijen od pojedinca. Kao drugi primer, ćelija je citotoksična ćelija dobijena od pojedinca. Kao drugi primer, ćelija je matična ćelija ili progenitorna ćelija dobijena od pojedinca.
IV. POSTUPCI
[0144] Aspekti trenutnog prikaza odnose se na postupke za stimulisanje imunološkog odgovora. Stimulisanje imunološkog odgovora može se izvesti in vitro, in vivo, ili ex vivo. U nekim aspektima, postupci se odnose na ćelije sposobne za stimulisanje imunološkog odgovora u prisustvu TGF-β. Postupak generalno uključuje genetičko modifikovanje ćelije sisara sa vektorom ekspresije, ili RNK (npr., in vitro transkribovanu RNK), koja obuhvata sekvence nukleotida koje kodiraju polipeptid prema ovom prikazu ili koje direktno transportuju polipeptid do ćelije. Ćelija može biti imunska ćelija (npr., T limfocit ili NK ćelija), matična ćelija, progenitorna ćelija, itd. U nekim aspektima, ćelija je ćelija opisana ovde.
[0145] U nekim aspektima, genetička modifikacija se izvodi ex vivo. Na primer, T limfocit, matična ćelija, ili NK ćelija (ili ćelija opisana ovde) dobija se od pojedinca; i ćelija dobijena od pojedinca jeste genetički modifikovana da eksprimira polipeptid prema ovom prikazu. U nekim slučajevima, genetički modifikovana ćelija aktivira se ex vivo (tj., TGF-β se dovodi u kontakt sa ćelijom ex vivo). U drugim slučajevima, genetički modifikovana ćelija uvodi se u pojedinca (npr., pojedinca od koga je ćelija dobijena); i genetički modifikovana ćelija se aktivira in vivo (tj., pomoću endogeno proizvedene TGF-β).
[0146] U nekim aspektima, postupak dalje obuhvata davanje dodatnog terapijskog sredstva, kao što su aktivatori bispecifične T ćelije (BITE). Takva terapijska sredstva pacijentu se mogu davati u obliku peptida ili eksprimirati u ćelijama prema ovom prikazu, kao što su one koje obuhvataju TGF-β CAR. BITE može imati antigensku specifičnost za antigen kancera / molekul kancera poznat u oblasti tehnike i/ili opisan ovde i može takođe imati antigensku specifičnost za molekul T ćelije kao što je CD3.
[0147] U nekim aspektima, postupak se odnosi na davanje ćelija ili peptida opisanih ovde za lečenje kancera ili davanje osobi sa kancerom. U nekim aspektima kancer je kancer nadbubrežne žlezde, analni kancer, kancer žučnog kanala, kancer bešike, kancer kostiju, moždani/CNS tumori kod dece ili odraslih, kancer dojke, cervikalni kancer, kancer kolona/rektuma, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, Juingova (Ewing) porodica tumora, kancer oka, kancer žučne kese, gastrointestinalni karcinoidni tumori, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), gestacijska trofoblastna bolest, Hodžkinova (Hodgkin) bolest, Kapošijev (Kaposi) sarkom, kancer bubrega, kancer larinksa i hipofarinksa, leukemija, akutna limfocitna leukemija, akutna mijeloidna leukemija, hronična limfocitna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, hronična mijelomonocitna leukemija, kancer jetre, kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, karcionidni tumor pluća, limfom, maligni mezoteliom, multipli mijelom, mijelodisplastični sindrom, kancer nosne šupljine i paranazalnog sinuma, nazofaringealni kancer, neuroblastom, ne-Hodžkinov (Hodgkin) limfom, kancer usne duplje ili orofaringealni kancer, osteosarkom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer penisa, tumori hipofize, kancer prostate, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer pljuvačnih žlezda, kancer kože, sarkom, bazalni kancer kože, kancer skvamoznih ćelija kože, melanom, kancer Merkelovih (Merkel) ćelija kože, kancer tankog creva, kancer želuca, kancer testisa, kancer timusa, tiroidni kancer, sarkom materice, vaginalni kancer, kancer vulve, Valdenstromova (Waldenstrom) makroglobulinemija, ili Vilmsov (Wilms) tumor.
[0148] Aspekti se mogu upotrebljavati za lečenje ili poboljšavanje niza imunski posredovanih, inflamatornih, ili autoimuno-inflamatornih bolesti, npr., alergija, astme, dijabetesa (npr. dijabetesa tipa 1), odbacivanje grafta, itd. Primeri takvih bolesti ili poremećaja takođe uključuju, ali nisu ograničeni na artritis (reumatoidni artritis kao što je akutni artritis, hronični reumatodini artritis, giht ili gihtni artritis, akutni gihtni artritis, akutni imunološki artritis, hronični inflamatorni artritis, degenerativni artritis, artritis izazvan kolagenom tipa II, infektivni artritis, lajmski artritis, proliferativni artritis, psorijazni artritis, Stilova (Still) bolest, vertebralni artritis, i sistemski juvenilni reumatoidni artritis, osteoartritis, arthritis chronica progrediente, arthritis deformans, polyarthritis chronica primaria, reaktivni artritis, i ankilozirajući spondilitis), inflamatorne hiperproliferativne kožne bolesti, psorijazu kao što je psorijaza plaka, gutatna psorijaza, pustularna psorijaza, i psorijaza noktiju, atopija uključujući atopijske bolesti kao što su polenska groznica i Jobov sindrom, dermatitis uključujući kontaktni dermatitis, hronični kontaktni dermatitis, eksfolijativni dermatitis, alergijski dermatitis, alergijski kontaktni dermatitis, dermatitis herpetiformis, numularni dermatitis, seboreični dermatitis, nespecifični dermatitis, primarni iritirajući kontaktni dermatitis, i atopijski dermatitis, X-vezani sindrom povišenog IgM, alergijske intraokularne inflamatorne bolesti, urtikariju kao što je hronična alergijska urtikarija i hronična idiopatska urtikarija, uključujući hroničnu autoimunu urtikariju, miozitis, polimiozitis/dermatomiozitis, juvenilni dermatomiozitis, toksičnu epidermalnekrolizu, sklerodermu (uključujući sistemsku sklerodermu), sklerozu kao što je sistemska skleroza, multipla skleroza (MS) kao što je spino-optička MS, primarno progresivna MS (PPMS), i relapsnoremitentna MS (RRMS), progresivna sistemska skleroza, ateroskleroza, arterioskleroza, sclerosis disseminata, ataksična skleroza, neuromyelitis optica (NMO), inflamatornu bolest creva (IBD) (na primer, Kronova bolest, autoimuno posredovane gastrointestinalne bolesti, kolitis kao što je ulcerativni kolitis, colitis ulcerosa, mikroskopski kolitis, kolageni kolitis, colitis polyposa, nekrotizirajući enterokolitis, i transmuralni kolitis, i autoimuna inflamatorna bolest creva), zapaljenje creva, pyoderma gangrenosum, erythema nodosum, primarni sklerozirajući holangitis, sindrom respiratornog distresa, uključujući akutni respiratorni distres sindrom ili akutni respiratorni distres sindrom odraslih (ARDS), meningitis, zapaljenje cele ili dela uvee, iritis, horoiditis, autoimuni hematološki poremećaj, reumatoidni spondilitis, reumatoidni sinovitis, nasledni angioedem, oštećenje kranijalnog nerva kao kod meningitisa, herpes gestationis, pemphigoid gestationis, pruritis scroti, autoimuno prevremeno otkazivanje jajnika, iznenadni gubitak sluha usled autoimunog stanja, bolesti posredovane IgE antitelima kao što su anafilaksa i alergijski i atopijski rinitis, encefalitis kao što je Rasmusenov (Rasmussen) encefalitis i limbički i/ili encefalitis moždanog stabla, uveitis, kao što je prednji uveitis, akutni prednji uveitis, granulomatozni uveitis, negranulomatozni uveitis, fakoantigeni uveitis, zadnji uveitis, ili autoimuni uveitis, glomerulonefritis (GN) sa nefrotskim sindromom i bez nefrotskog sindroma kao što su hronični ili akutni glomerulonefritis kao što je primarni GN, imunski posredovani GN, membranozni GN (membranozna nefropatija), idiopatski membranozni GN ili idiopatska membranozna nefropatija, membrano- ili membranski proliferativni GN (MPGN), uključujući Tip I i Tip II, i brzo napredujući GN, proliferativni nefritis, autoimuno poliglandularno endokrino otkazivanje, balanitis uključujući balanitis circumscripta plasmacellularis, balanopostitis, erythema annulare centrifugum, erythema dyschromicum perstans, erythema multiform, granuloma annulare, lichen nitidus, lichen sclerosus et atrophicus, lichen simplex chronicus, lichen spinulosus, lichen planus, lamelarna ihtioza, epidermolytic hyperkeratosis, premaligna keratoza, pyoderma gangrenosum, alergijska stanja i odgovori, alergijske reakcije, ekcem uključujući alergijski ili atopijski ekcem, asteatotički ekcem, dishidrotični ekcem, i vezikularni palmoplantarni ekcem, astma kao što je asthma bronchiale, bronhijalna astma, i autoimuna astma, stanja koja uključuju infiltraciju T ćelija i hronične inflamatorne odgovore, imunološke reakcije protiv stranih antigena kao što su fetalne krvne grupe A-B-O tokom trudnoće, hronične plućne inflamatorne bolesti, autoimuni miokarditis, nedostatak adhesije leukocita, lupus, uključujući lupus nefritis, lupus cerebritis, pedijatrijski lupus, nebubrežni lupus, ekstrarenalni lupus, diskoidni lupus i diskoidni lupus erythematosus, alopecija lupus, sistemski eritematozni lupus (SLE) kao što je kožni SLE ili subakutni kožni SLE, neonatalni lupus sindrom (NLE), i lupus erythematosus disseminatus, juvenilni (Tip I) dijabetes melitus, uključujući pedijatrijski insulin-zavisni dijabetes melitus (IDDM), i dijabetes melitus kod odraslih (dijabetes Tipa II) i autoimuni dijabetes. Takođe su razmatrani imunološki odgovori povezani sa akutnom i odloženom preosetljivošću posredovanom citokinima i T limfocitima, sarkoidoza, granulomatoza uključujući limfomatoidnu granulomatozu, Vegenerova (Wegener) granulomatoza, agranulocitoza, vaskulitisi, uključujući vaskulitis, vaskulitis velikih krvnih sudova (uključujući polymyalgia rheumatica i (Takajasuov (Takayasu)) arteritis džinovskih ćelija), vaskulitis srednjih krvnih sudova (uključujući Kavasakijevu (Kawasaki) bolest i nodozni poliarteritis / nodozni periarteritis), mikroskopski poliarteritis, imuni vaskulitis, CNS vaskulitis, kutani vaskulitis, hipersenzitivni vaskulitis, nekrotizirajući vaskulitis kao što je sistemski nekrotizirajući vaskulitis, i vaskulitis povezan sa ANCA, kao što je Čarg-Štrausov (Churg-Strauss) vaskulitis ili sindrom (CSS) i vaskulitis malih krvnih sudova povezan sa ANCA, temporalni arteritis, aplastična anemija, autoimuna aplastična anemija, anemija pozitivna na Kumsovom (Coombs) testu, Dajmond-Blekfan (Diamond Blackfan) anemija, hemolitička anemija ili imunološka hemolitička anemija uključujući autoimunu hemolitičku anemiju (AIHA), Adisonova (Addison) bolest, autoimuna neutropenija, pancitopenija, leukopenija, bolesti koje uključuju dijapedezu leukocita, CNS inflamatorne poremećaje, Alchajmerovu (Alzheimer) bolest, Parkinsonovu (Parkinson) bolest, sindrom povreda više organa kao što su one sekundarne za septikemiju, traumu ili krvarenje, bolesti posredovane kompleksom antigen-antitelo, anti-glomerularna bolest bazalne membrane, sindrom anti-fosfolipidnih antitela, alergijski neuritis, Behcetova (Behcet) bolest/sindrom, Kastelmanov (Castleman) sindrom, Gudpasturov (Goodpasture) sindrom, Rejnoov (Reynaud) sindrom, Šegrenov (Sjögren) sindrom, Stivens-Džonsonov (Stevens-Johnson) sindrom, pemfigoid kao što su bulozni pemfigoid i pemfigoid kože, pemfigus (uključujući pemfigus vulgaris, pemfigus foliaceus, pemfigus pemfigoid mukozne membrane, i eritematozni pemfigus), autoimune poliendokrinopatije, Rajterova (Reiter) bolest ili sindrom, termička povreda, preeklampsija, poremećaj imunološkog kompleksa kao što je nefritis imunskih kompleksa, nefritis posredovan antitelima, polineuropatije, hronična neuropatija kao što su IgM polineuropatije ili neuropatija posredovana IgM-om, autoimuna ili imunski posredovana trombocitopenija kao što je idiopatska trombocitopenična purpura (ITP) uključujući hroničnu ili akutnu ITP, skleritis kao što je idiopatski cerato-skleritis, episkleritis, autoimuna bolest testisa i jajnika uključujući autoimuni orhitis i ooforitis, primarni hipotiroidizam, hipoparatiroidizam, autoimune endokrine bolesti uključujući tiroiditis kao što je autoimuni tiroiditis, Hašimotovu (Hashimoto) bolest, hronični tiroiditis (Hašimotov (Hashimoto) tiroiditis), ili subakutni tiroiditis, autoimuna tiroidna bolest, idiopatski hipotiroidizam, Grejvova (Grave) bolest, poliglandularni sindromi kao što su autoimuni poliglandularni sindromi (ili sindromi poliglandularne endokrinopatije), paraneoplastični sindromi, uključujući neurološke paraneoplastične sindrome kao što su Lambert-Itonov (Lambert-Eaton) mijastenični sindrom ili Iton-Lambertov (Eaton-Lambert) sindrom, sindrom ukočenog čoveka ili ukočene osobe, encefalomijelitis kao što je alergijski encefalomijelitis ili encephalomyelitis allergica i eksperimentalni alergijski encefalomijelitis (EAE), eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, myasthenia gravis kao što je mijastenija gravis povezana sa timomom, cerebelarna degeneracija, neuromiotonija, opsoklonus ili sindrom opsoklonus-mioklonus (OMS), i senzorna neuropatija, multifokalna motorna neuropatija, Šihanov (Sheehan) sindrom, autoimuni hepatitis, hronični hepatitis, lupoidni hepatitis, hepatitis džinovskih ćelija, hronični aktivni hepatitis ili autoimuni hronični aktivni hepatitis, limfoidni intersticijski pneumonitis (LIP), bronhiolitis obliterans (koji nije povezan sa transplantacijom) vs NSIP, Gijen-Bareov (Guillain-Barré) sindrom, Bergerova (Berger) bolest (IgA nefropatija), idiopatska IgA nefropatija, linearna IgA dermatoza, akutna febrilna neutrofilna dermatoza, subkornealna pustularna dermatoza, tranzitorna akantolitička dermatoza, ciroza kao što su primarna bilijarna ciroza i pneumociroza, sindrom autoimune enteropatije, celijaklija ili celijakija, celijačni spru (glutenska enteropatija), refraktorni spru, idiopatski spru, krioglobulinemija, amiotrofična lateralna skleroza (ALS; Lu Gerigova (Lou Gehrig) bolest), koronarna arterijska bolest, autoimuna bolest uha kao što je autoimuna bolest unutrašnjeg uha (AIED), autoimuni gubitak sluha, polihondritis kao što je refraktorni ili relapsni ili relapsirajući polihondritis, plućna alveolarna proteinoza, Koganov (Cogan) sindrom/nesifilitički intersticijalni keratitis, Belova (Bell) paraliza, Svitova (Sweet) bolest/sindrom, autoimuna rozacea, bol povezan sa zosterom, amiloidoza, ne-kancerozna limfocitoza, primarna limfocitoza, koja uključuje monoklonsku limfocitozu B ćelija (npr., benignu monoklonsku gramapatiju i monoklonsku gramapatiju neodređenog značaja, MGUS), periferna neuropatija, paraneoplastični sindrom, kanalopatije kao što su epilepsija, migrena, aritmija, mišićni poremećaji, gluvoća, slepilo, periodična paraliza, i kanalopatije CNS-a, autizam, inflamatorna miopatija, fokalna ili segmentna ili fokalna segmentna glomeruloskleroza (FSGS), endokrina oftalmopatija, uveoretinitis, horioretinitis, autoimuni hepatološki poremećaj, fibromijalgija, višestruko endokrino otkazivanje, Šmitov (Schmidt) sindrom, adrenalitis, gastrička atrofija, presenilna demencija, demijelinizirajuće bolesti kao što su autoimune demijelinizirajuće bolesti i hronična inflamatorna demijelinizirajuća polineuropatija, Dreslerov (Dressler) sindrom, alopecia greata, alopecia totalis, CREST sindrom (kalcinoza, Rejnoov (Raynaud) fenomen, ezofagusni dismotilitet, sklerodaktilija), i telangiektazija), muška i ženska autoimuna neplodnost, npr., usled anti-spermatozoidnih antitela, mešovita bolest vezivnog tkiva, Čagasova (Chagas) bolest, reumatska groznica, rekurentni abortus, farmerska pluća, multiformni eritem, postkardiotomijski sindrom, Kušingov (Cushing) sindrom, pluća ljubitelja ptica, alergijski granulomatozni angiitis, benigni limfocitni angiitis, Alportov (Alport) sindrom, alveolitis kao što je alergijski alveolitis i fibrozirajući alveolitis, intersticijska bolest pluća, transfuzijska reakcija, lepra, malarija, parasitske bolesti kao što su lajšmanijaza, kipanosomijaza, šistosomijaza, askarijaza, aspergiloza, Samterov (Sampter) sindrom, Kaplanov (Caplan) sindrom, denga groznica, endokarditis, endomiokardijalna fibroza, difuzna intersticijska plućna fibroza, intersticijska fibroza pluća, plućna fibroza, idiopatska plućna fibroza, cistična fibroza, endoftalmitis, erythema elevatum et diutinum, erythroblastosis fetalis, eosinophilic faciitis, Šulmanov (Shulman) sindrom, Feltijev (Felty) sindrom, flarijaza, ciklitis kao što je hronični ciklitis, heterohronični ciklitis, iridociklitis (akutni ili hronični), ili Fuksov (Fuch’s) ciklitis, Henoh-Šonlajnova (Henoch-Schonlein) purpura, infekcija humanim virusom imunodeficijencije (HIV), SCID, stečeni sindrom imunodeficijencije (AIDS), infekcija ehovirusom, sepsa, endotoksemija, pankreatitis, tireoksikoza, infekcija parvovirusom, infekcija virusom rubele, postvakcinacijski sindromi, kongenitalna infekcija rubelom, infekcija Epštajn-Barovim virusom, zauške, Evanov (Evan) sindrom, autoimuno otkazivanje gonada, Sidenhamova (Sydenham) horeja, poststreptokokni nefritis, thromboangitis ubiterans, tireotoksikoza, tabes dorsalis, horioiditis, polimialgija džinovskih ćelija, hronični hipersenzitivni pneumonitis, keratoconjunctivitis sicca, epidemijski keratokonjuktivitis, idiopatski nefrotski sindrom, nefropatija minimalnih promena, benigna porodična i ishemijsko-reperfuziona povreda, reperfuzija transplantiranog organa, retinalna autoimunost, zapaljenje zglobova, bronhitis, hronična opstruktivna bolest disajnih puteva/pluća, silikoza, afte, aftozni stomatitis, arteriosklerotski poremećaji, aspermiogeneza, autoimuna hemoliza, Bekova (Boeck) bolest, krioglobulinemija, Dipitrenova (Dupuytren) kontraktura, endophthalmia phacoanaphylactica, enteritis allergica, erythema nodosum leprosum, idiopatska facijalna paraliza, sindrom hroničnog umora, febris rheumatica, Haman-Ričova (Hamman-Rich) bolest, senzoneuralni gubitak sluha, haemoglobinuria paroxysmatica, hipogonadizam, ileitis regionalis, leukopenija, mononucleosis infectiosa, transverzalni mijelitis, primarni idiopatski miksedem, nefroza, ophthalmia symphatica, orchitis granulomatosa, pankreatitis, polyradiculitis acuta, pyoderma gangrenosum, Kervenov (Quervain) tireoditis, stečena atrofija slezine, nemaligni timom, vitiligo, sindrom toksičnog šoka, trovanje hranom, stanja koja uključuju infiltraciju T ćelija, nedostatak adhezije leukocita, imunološki odgovori povezani sa akutnom i odloženom preosetljivošću posredovanom citokinima i T-llimfocitima, bolesti koje uključuju dijapedezu leukocita, sindrom povreda više organa, bolesti posredovane kompleksom antigen-antitelo, antiglomerularna bolest bazalne membrane, alergijski neuritis, autoimune poliendokrinopatije, ooforitis, primarni miksedem, autoimuni atrofični gastritis, simpatička oftalmija, reumatske bolesti, mešovita bolest vezivnog tkiva, nefrotski sindrom, insulitis, poliendokrino otkazivanje, autoimuni poliglandularni sindrom tipa I, idiopatski hipoparatiroidizam kod odraslih (AOIH), kardiomiopatija kao što je proširena kardiomiopatija, epidermolisis bullosa acquisita (EBA), hemohromatoza, miokarditis, nefrotski sindrom, primarni sklerozirajući holangitis, purulentni ili nepurulentni sinuzitis, akutni ili hronični sinuzitis, etmoidni, frontalni, maksilarni ili sfenoidni sinuzitis, poremećaj povezan sa eozinofilima kao što je eozinofilija, eozinofilija koja prati plućnu infiltraciju, sindrom eozinofilije-mijalgije, Loflerov (Löffler) sindrom, hronična eozinofilna pneumonija, tropska plućna eozinofilija, bronhopneumonična aspergiloza, aspergilom, ili granulomi koji sadrže eozinofile, anafilaksa, seronegativni spondiloartrititisi, poliendokrina autoimuna bolest, sklerozirajući holangitis, sklera, episklera, hronična mukokutana kandidijaza, Brutonov (Bruton) sindrom, prolazna hipogamaglobulinemija u ranom detinjstvu, Viskot-Aldričov (Wiskott-Aldrich) sindrom, sindrom ataksija-telangiektazija, angiektazije, autoimuni poremećaji povezani sa kolagenom bolešću, reumatizam, neurološka bolest, limfadenitis, smanjenje u odgovoru krvnog pritiska, vaskularna disfunkcija, povreda tkiva, kardiovaskularna ishemija, hiperalgezija, ishemija bubrega, cerebralna ishemija, i bolest koja prati vaskularizaciju, poremećaji alergijske preosetljivosti, glomerulonefritisi, reperfuziona povreda, ishemijsko-reperfuzioni poremećaj, reperfuziona povreda miokarda ili drugih tkiva, limfomatozni traheobronhitis, inflamatorne dermatoze, dermatoze sa akutnim inflamatornim komponentama, otkazivanje više organa, bulozne bolesti, kortikalna nekroza bubrega, akutni gnojni meningitis ili drugi inflamatorni poremećaji centralnog nervnog sistema, očni i orbitalni inflamatorni poremećaji, sindromi povezani sa transfuzijom granulocita, toksičnost izazvana citokinom, narkolepsija, akutna ozbiljna inflamacija, hronična neizlečiva inflamacija, pijelitis, endarterijska hiperplazija, peptički ulkus, valvulitis, bolest graft protiv domaćina, kontaktna preosetljivost, astmatična hiperreakcija disajnih puteva, i endometrioza.
V. Farmaceutske kompozicije
[0149] Predmetni prikaz uključuje postupke za modulisanje imunološkog odgovora kod subjekta kome je to potrebno. Prikaz uključuje ćelije koje mogu biti u obliku farmaceutske kompozicije koja se može upotrebljavati za indukovanje ili modifikovanje imunološkog odgovora.
[0150] Davanje kompozicije u skladu sa trenutnim prikazom tipično će se izvoditi bilo kojim opšte prihvaćenim putem. To uključuje, ali nije ograničeno na, parenteralno, ortotopsko, intradermalno, supkutano, intramuskularno, intraperitonealno, intranazalno, ili intravenozno ubrizgavanje.
[0151] Tipično, kompozicije prema ovom prikazu daju se na način koji je kompatibilan sa formulacijom doze, i u takvoj količini koja će biti terapijski efikasna i imuno modifikujuća. Količina koju treba davati zavisi od subjekta koga treba lečiti. Precizne količine aktivnog sastojka traženog da bude davan zavisi od procene stručnjaka.
[0152] Način primene može široko varirati. Može se primeniti bilo koji od konvencionalnih postupaka za davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži ćelijske komponente. Doza farmaceutske kompozicije zavisiće od načina davanja i variraće u skladu sa veličinom i zdravljem subjekta.
[0153] U mnogim slučajevima, biće poželjno primeniti višestruka davanja od najviše oko ili najmanje oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više. Davanja mogu biti u opsegu od 2-dnevnih do 12-nedeljnih intervala, što je uobičajenije od intervala od jedne do dve sedmice. Tok davanja mogu pratiti testovi na aloreaktivne imunološke odgovore i aktivnost T ćelija.
[0154] Fraze „farmaceutski prihvatljiv“ ili „farmakološki prihvatljiv“ ondose se na molekularne entitete i kompozicije koje ne proizvode štetnu, alergijsku, ili drugu nepovoljnu reakciju kada se daju životinji ili čoveku. Kako se upotrebljava ovde, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzioni medijum, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u oblasti tehnike. Osim ako bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nisu kompatibilni sa aktivnim sastojcima, razmatra se njihova upotreba u imunogenim i terapijskim kompozicijama. Farmaceutske kompozicije trenutnog prikaza farmaceutski su prihvatljive kompozicije.
[0155] Kompozicije prema ovom prikazu mogu se formulisati za parenteralno davanje, npr., formulisati za ubrizgavanje intravenskim, intramuskularnim, supkutanim, ili čak intraperitonealnim putem. Tipično, takve kompozicije mogu se pripremiti tako da se mogu ubrizgati, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije; takođe se mogu pripremati čvrsti oblici pogodni za upotrebu za pripremu rastvora ili suspenzija po dodavanju tečnosti pred ubrizgavanje; i, preparati se takođe mogu emulgovati.
[0156] Farmaceutski oblici pogodni za upotrebu koja se može ubrizgavati uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije koje uključuju susamovo ulje, ulje od kikirikija, ili vodeni propilen glikol. Oni takođe treba da su stabilni pod uslovima proizvodnje i skladištenja i moraju se čuvati od kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.
[0157] Sterilni rastvori koji se mogu ubrizgavati pripremaju se uključivanjem aktivnih sastojaka (tj. ćelija prema ovom prikazu) u traženu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa različitim drugim sastojcima nabrojanim gore, po potrebi, za čim sledi sterilizacija filtracijom. Generalno, disperzije se pripremaju uključivanjem različitih sterilizovanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač koji sadrži osnovni medijum disperzije i tražene druge sastojke od onih nabrojanih gore.
[0158] Efikasna količina kompozicije određuje se na osnovu predviđenog cilja. Termin „jedinična doza“ ili „doziranje“ odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne za upotrebu kod subjekta, pri čemu svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu kompozicije izračunatu tako da proizvede željene odgovore razmotrene ovde u vezi sa njenim davanjem, tj., odgovarajućim putem i režimom. Količina koju treba davati, u skladu i sa brojem lečenja i sa jediničnom dozom, zavisi od željenog rezultata i/ili zaštite. Precizne količine kompozicije takođe zavise od procene stručnjaka i posebne su za svakog pojedinca. Faktori koji utiču na dozu uključuju fizičko i kliničko stanje subjekta, način davanja, predviđeni cilj lečenja (olakšavanje simptoma u odnosu na lečenje), i potenciju, stabilnost i toksičnost posebne kompozicije. Po formulisanju, rastvori će se davati na način kompatibilan sa formulacijom doze i u takvoj količini koja je terapijski ili profilaktički efikasna. Formulacije se lako daju u različitim oblicima doziranja, kao što je ovde opisan tip rastvora koji se mogu ubrizgati.
VI. Sekvence
[0159] Domeni za vezivanje antigena prema ovom prikazu uključuju sledeće VH (varijabilne teške) i VL (varijabilne lake) regione:
scFv#1 VH:
scFv#1 VL:
[0160] Odgovarajući CDR regioni VH i VL regiona iz scFv#1 jesu sledeće aminokiselinske sekvence: scFv#1 HCDR1: GYAFTNYLIE (SEQ ID NO:5); scFv#1 HCDR2: VINPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO:6); scFv#1 HCDR3: SGGFYFDY (SEQ ID NO:7); scFv#1 LCDR1: RASQSVLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO:8); scFv#1 LCDR2: WASTRES (SEQ ID NO:9); scFv#1 LCDR3: HQYLSSDT (SEQ ID NO:10).
[0161] Odgovarajući CDR regioni VH i VL regiona iz scFv#2 jesu sledeće aminokiselinske sekvence: scFv#2 HCDR1: SNVIS (SEQ ID NO:11); scFv#2 HCDR2: GVIPIVDIANYAQRFKG (SEQ ID NO:12); scFv#2 HCDR3: PRAFVLDAMDY (SEQ ID NO:13); scFv#2 LCDR1: RASQSLGSSYLA (SEQ ID NO:14); scFv#2 LCDR2: GASSRAP (SEQ ID NO:15); and scFv#2 LCDR3: QQYADSPIT (SEQ ID NO:16).
[0162] Odgovarajući CDR regioni VH i VL regiona iz scFv#3 jesu sledeće aminokiselinske sekvence: scFv#3 HCDR1: SYGMH (SEQ ID NO:21); scFv#3 HCDR2: VISYDGSIKYYADSVKG (SEQ ID NO:22); scFv#3 HCDR3: TGEYSGYDTDPQYS (SEQ ID NO:23); scFv#3 LCDR1: RSSQGIGDDLG (SEQ ID NO:24); scFv#3 LCDR2: GTSTLQS (SEQ ID NO:25); and scFv#3 LCDR3: LQDSNYPLT (SEQ ID NO:26).
[0163] Peptidi za detekciju prema ovom prikazu mogu uključivati, na primer, HA: YPYDVPDYA (SEQ ID NO:94); FLAG: DYKDDDDK (SEQ ID NO:17); i c-myc: EQKLISEEDL; SEQ ID NO:95).
[0164] Primer signalnog peptida uključuje: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO:18). Drugi primeri signalnog peptida uključuju: MLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDT (SEQ ID NO:94) ili MGTSLLCWMALCLLGADHADG (SEQ ID NO:95).
[0165] Primeri peptidnih spejsera zglobnih regiona uključuju: DKTHT (SEQ ID NO:27), CPPC (SEQ ID NO:28), CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO:29), ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO:30), KSCDKTHTCP (SEQ ID NO:31), KCCVDCP (SEQ ID NO:32), KYGPPCP (SEQ ID NO:33), EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:34; humani IgGl zglobni region), ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:35; humani IgG2 zglobni region), ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:36; humani IgG3 zglobni region), SPNMVPHAHHAQ (SEQ ID NO:37); ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO:98), ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:99) (humani IgG4 na bazi zglobnog regiona), EPKSCDKTYTCPPCP (SEQ ID NO:38), i TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:39).
[0166] Primeri peptidnih linkera uključuju, na primer, (GSGGS)n (SEQ ID NO:40); (GGGS)n(SEQ ID NO:41); GGSG (SEQ ID NO:42); GGSGG (SEQ ID NO:43); GSGSG (SEQ ID NO:44); GSGGG (SEQ ID NO:45); GGGSG (SEQ ID NO:46); i GSSSG (SEQ ID NO:47).
[0167] Primeri transmembranskih domena uključuju IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO:48), izvedeni iz CD8 beta: LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (SEQ ID NO:49), izvedeni iz CD4: ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC (SEQ ID NO:50), izvedeni iz CD3 zeta: LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV (SEQ ID NO:51), izvedeni iz CD28: WVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:52), izvedeni iz CD134 (OX40): VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (SEQ ID NO:53), i izvedeni iz CD7: ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA (SEQ ID NO:54).
[0168] Primeri kostimulatornih regiona uključuju: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:55), FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:56), TKKKYSSS-VHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO:57), RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:58), CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDL TVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEE EGKEDPLPTAASGK (SEQ ID NO:61), HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO:62), i CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSP NH (SEQ ID NO:63).
[0169] U nekim aspektima, endodomen obuhvata ITAM motiv. ITAM motiv je YX1X2(L/I), gde su X1i X2nezavisno bilo koja aminokiselina (SEQ ID NO:64). U nekim slučajevima, ITAM motiv se ponavlja dvaput u endodomenu, gde su prve i druge instance ITAM motiva odvojene jedna od druge pomoću 6 do 8 aminokiselina, npr., (YX1X2(L/I))(X3)n(YX1X2(L/I)), gde je n ceo broj od 6 do 8, i svaki od 6–8 X3može biti bilo koja aminokiselina (SEQ ID NO:65).
[0170] Primeri endodomena uključuju polipeptide iz: MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSC-STVSPGVLAGIVMGDLVLTVLI ALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK
(SEQ ID NO:66), MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLI ALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO:67); MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVP RGRGAAEAATRKO-RITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO:68); MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLA-GIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVP RGRGAAEATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO:69); ESPYOELOGORSDVYSDLNTO (SEQ ID NO: 70); MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTL-LYCRLKIQVRKAAITSYE KSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (SEQ ID NO: 71); DGVYTGLSTRNOETYETLKHE (SEQ ID NO: 72); MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLD LGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLL LALGVFCFAGHETGRLSGAAD-TOALLRNDOVYOPLRDRDDAOYSHLGGNWAR NK (SEQ ID NO:73); MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELE-DRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLD LGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVOVHYRTADTOALLRNDOVYO-PLRDRDDAQ YSHLGGNWARNK (SEQ ID NO:74); DOVYOPLRDRDDAOYSHLGGN (SEQ ID NO:75); MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEI LWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLY LRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAG GRQRGQNKERPPPVP-NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ ID NO:76); NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR (SEQ ID NO:77); MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFK DGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNA ATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGODGVROSRASDKOTLLPNDOLYOPLKDREDDQ YSHLQGNQLRRN (SEQ ID NO:78); DOLYOPLKDREDDOYSHLOGN (SEQ ID NO:79); MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELO
NOLYNELNLGRREEYDVLDKR (SEQ ID NO:83); EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK (SEQ ID NO:84); DGLYO-GLSTATKDTYDALHMO (SEQ ID NO:85); MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGE-DAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGN ESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWO NEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLOGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO:86); MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIIL LFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYE DISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO:87); ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG (SEQ ID NO:88); RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO:89); RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO:90); FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMT-PRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:91); FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYM-NMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 92); and MPDPAAHLPFFYGSIS RAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAG GKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQ TWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGK FLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKA DGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSP DKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRM RKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVME MAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLV NRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYG
VTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWE DRPDFLTVEQRMRACYYS-LASKVEGPPGSTQKAEAACA (SEQ ID NO:93) ili njihove delove.
VII. Primeri
Primer 1
[0171] Ovaj prikaz opisuje jednolančane varijabilne fragmente (scFv fragmente) koji neutrališu humani i mišji TGF-β, kao i himerne antigenske receptore (CAR receptore) koji reaguju na humani i mišji TGF-β. Nivo konzervacije TGF-β kod sisara sugeriše da se opisani scFv fragmenti i CAR receptori mogu upotrebljavati da vezuju većinu sisarskih TGF-β faktora. Dva scFv fragmenta se konstruišu od anti-TGF-β atitela povezivanjem varijabilnog domena teškog lanca (VH) sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) pomoću (G4S)3 linkera tako da je finalna orijentacija N-terminus-VH-(G4S)3-VL-C-terminus. Ti scFv fragmenti se mogu proizvesti transfekcijom eukariotskih ćelija pomoću sekvenci DNK koje kodiraju aminokiselinske sekvence scFv faktora naznačene u donjoj tabeli:
[0172] Svaki scFv se može obeležiti vodećim (tj. signalnim) peptidom iz mišjeg kapa lakog lanca tako da su scFv fragmenti izlučeni i mogu se direktno sakupiti iz medijuma u kome se kultivišu ćelije producere. scFv fragmenti takođe mogu biti obeleženi na N-terminalnom kraju (posle vodećeg peptida, ali pre VH sekvence) markerima kao što su DYKDDDDK (SEQ ID NO:17) epitop, HA tag, ili cMyc tag koji se iviče sa GGS linkerima. Svaki scFv se može direktno davati radi neutralisanja humanog ili mišjeg TGF-β. scFv#1 i #2 su superiorni u odnosu na scFv#3 (SL.1 and 7). Nadalje, svaki scFv se može upotrebljavati za konstruisanje CAR receptora koji reaguje na TGF-β. CAR receptori su fuzioni proteini sastavljeni od vanćelijskog domena za vezivanje antigena, vanćelijskog spejsera, transmembranskog domena, koostimulatornih signalnih regiona (čiji broj varira zavisno od dizajna specifičnog CAR receptora), i CD3-zeta signalnih domena/endodomena. TGF-β CAR receptori se mogu konstruisati pomoću scFv fragmenata opisanih gore kao vanćelijski domen za vezivanje antigena. Imunske ćelije, uključujući T ćelije i ćelije prirodne ubice (NK), mogu se promeniti tako da eksprimiraju TGF-β CAR receptore različitim postupcima, uključujući virusnu transdukciju, nukleofekciju DNK i nukleofekciju RNK. Vezivanje TGF-β za TGF-β CAR može aktivirati humane T ćelije, čime se preusmerava TGF-β signalizacija iz imunosupresivnog odgovora u imunostimulatorni odgovor. TGF-β CAR se takođe može upotrebljavati kao dopunski receptor za suprotstavljanje imunosupresiji i pojačavanje odgovora posredovanih T ćelijama u svim adoptivnim terapijama T ćelijama, bilo na bazi limfocita koji se infiltriraju u tumor, promenom receptora T ćelija, ili drugim CAR receptorima.
[0173] Kako je prikazano na SL. 2, TGF-β CAR receptori se efikasno eksprimiraju na površini primarih humanih T ćelija. TGF-β CAR je kreiran pomoću scFv #2. Površinsko bojenje i protočna citometrija pokazuju da se TGF-β CAR receptori pojavljuju na površini primarnih humanih CD4+ i CD8+ T ćelija. Vanćelijski domen receptora sadrži N-terminalni FLAG epitop. EGFRt je skraćeni receptor epidermalnog faktora rasta koji je indikator ćelijske transdukcije. Dalje je ustanovljeno da se TGF-β CAR pojavljuje na površini ćelije efikasnije nego dominantno-negativni TGF-β receptor (SL.9). Zabeleženo je da dominantno-negativni TGF-β receptor (DNR) koji obuhvata skraćeni lanac II TGF-β receptora kome nedostaje unutarćelijski signalni domen inhibira TGF-β signalizaciju i poboljšava funkciju efektora T ćelija. Međutim, DNR se ne eksprimira efikasno na površini ćelije dok se TGF-β CAR eksprimira. Podaci prikazani na SL. 9 su iz transdukcije primarnih humanih CD4+ T ćelija pomoću lentivirusa koji kodiraju bilo TGF-β CAR receptore obeležene FLAG-om ili DNR obeležena FLAG-om. Svaki receptor je obeležen preko T2A peptida za cepanje do skraćenog receptora epidermalnog faktora rasta (EGFRt), tako da se transdukovane ćelije mogu identifikovati bojenjem EGFRt dok se površinska ekspresija receptora može identifikovati bojenjem FLAG. Rezultati sa SL.9 ukazuju da se TGF-β CAR receptori mnogo efikasnije eksprimiraju na površinama T ćelija nego DNR.
[0174] SL. 3 pokazuje da TGF-β CAR receptori blokiraju signalizaciju endogenog TGF-β. TGF-β CAR ekspresija u primarnim humanim T ćelijama blokira TGF-β signalizaciju preko SMAD puta. T ćelije koje ekprimiraju naznačeni receptor inkubirane su sa TGF-β u naznačenoj koncentraciji u trajanju od 30 min i sondirani na fosfo-SMAD2 pomoću Western Blot-a. EGFRt se odnosi na T ćelije koje eksprimiraju skraćeni receptor epidermalnog faktora rasta i služi kao kontrola „bez CAR receptora“; „bez scFv“ se odnosi na T ćelije koje eksprimiraju CAR kome nedostaje bilo koji scFv domen za vezivanje liganda ali je inače identičan sa TGF-β CAR dugim. Oznake „dugi“ i „kratki“ iza TGF-β CAR receptora odnose se na dužinu njihovih vanćelijskih peptidnih spejsera. Kako je prikazano na SL.6, TGF-β CAR-T ćelije proliferišu kao odgovor na TGF-β. T ćelije koje ekprimiraju TGF-β CAR receptore konvertuju TGF-β iz citokina koji inhibira rast u citokin koji podstiče rast.
[0175] Takođe je ustanovljeno da TGF-β CAR receptori aktiviraju T ćelije i izazivaju proizvodnju citokina (SL.4). Kako je prikazano na SL.4, TGF-β CAR-T ćelije ushodno regulišu ekspresiju CD69 markera aktivacije i proizvode imunostimulatorne citokine IFN-γ i TNF-α kao odgovor na izlaganje TGF-β. CD69 ushodna regulacija je praćena pomoću površinskog bojenja nakon inkubacije od 24 sata sa ili bez TGF-β. Proizvodnja citokina detektovana je primenom inhibitora transporta proteina Brefeldin A i izvođenjem unutarćelijskog bojenja nakon 24-časovne inkubacije sa ili bez TGF-β. „Bez scFv“ se odnosi na CAR kome nedostaje bilo koji scFv domen za vezivanje liganda.
[0176] Za razliku od TGF-β CAR receptora, dominantno-negativni TGF-β receptor ne može izazvati proizvodnju citokina. Iako je zabeleženo da dominantno-negativni TGF-β receptor takođe inhibira TGF-β signalizaciju, on ne izaziva imunostimulatorna dejstva kao što je proizvodnja TNF-α (SL.5). „Tβ kratki“ i „Tβ dugi“ su dva različita TGF-β CAR receptora, „Dom-Neg“ se odnosi na dominantno-negativni TGF-β receptor, i „bez scFv“ se odnosi na CAR kome nedostaje bilo koji scFv domen za vezivanje liganda.
[0177] Dalje je ustanovljeno da se funkcija TGF-β CAR može podesiti izborom kostimulatornog domena. Kako je prikazano na SL. 10, prebacivanje između CD28 i 4-1BB kostimulatornih domena menja nivoe proizvodnje citokina kao odgovor na TGF-β. Nadalje, ustanovljeno je da TGF-β konzistentno izaziva proizvodnju TNF-α u zavisnosti od doze po ćelijama sa TGF-β CAR receptorom od različitih donora, sugerišući da je delovanje CAR receptora dovoljno snažno da bi se na njega moglo osloniti za svrhe kliničkih primena (SL.11).
[0178] Dalje je ustanovljeno da dužina TGF-β CAR spejsera moduliše prag izazivanja. Povećavanje dužine vanćelijskog spejsera povećava TGF-β prag izazivanja CAR receptora (SL.12). To sugeriše da se reagovanje CAR receptora može prilagođavati prema potrebama primene menjanjem kuplovanja između domena za vezivanje liganda i unutarćelijskih signalnih domena. „Kratki spejser“ obuhvata zglobni deo humanog IgG4; „dugi spejser“ obuhvata IgG4 zglobni region CH2-CH3.
[0179] Dalje, otkriveno je da dimerizacija CAR receptora posredovana rastvornim ligandom izaziva CAR signalizaciju. Na SL.13 su prikazani linije Jurkat ćelija koje nose naznačeni CAR receptor (receptore). I GFP CAR #1 i GFP CAR #3 postoje uglavnom u obliku homodimera, i dva CAR receptora se vezuju za različite epitope na EGFP i mogu istovremeno vezivati pojedinačni EGFP molekul. GFP CAR #1 i GFP CAR #2 se vezuju za isti epitop na EGFP, ali CAR #2 postoji kao monomer pre nego kao homodimer. Rezultati ukazuju da se CAR signalizacija može olakšati dimerizacijom CAR receptora posredovanom ligandom, ali nije nužno da ligand ili sam CAR prethodno postoje kao dimer (SL. 13). Jedan mogući mehanizam po kome rastvorni ligandi mogu da izazovu CAR signalizaciju jeste pomoću ligirajućih receptora na dve različite ćelije, čime se obrazuje imunuloška sinapsa. Taj mehanizam je u skladu sa opservacijom da se Jurkat ćelije koje eksprimiraju jedan tip GFP CAR receptora mogu aktivirati dimernim ali ne monomernim EGFP. Takođe je u skladu sa opservacijom da se smeša dve linije Jurkat ćelija, pri čemu svaka eksprimira različit GFP CAR, može aktivirati i dimernim i monomernim EGFP. U tom slučaju, monomerni EGFP takođe može izazvati ligaciju ćelija-ćelija pošto se CAR receptori na dva niza Jurkat ćelija vezuju za dva različita epitopa na istom EGFP molekulu (SL.14).
[0180] Ustanovljeno je da se TGF-β CAR može izazvati i na način koji zavisi od kontakta ćelija-ćelija i na način koji ne zavisi od tog kontakta. Premda je kontakt ćelija-ćelija jedan mogući mehanizam pomoću koga rastvorni ligandi kao što su EGFP i TGF-β mogu da izazovu CAR signalizaciju, aktiviranje CAR-T ćelija takođe se može izazvati rastvornim ligandom u odsustvu kontakta ćelija-ćelija. Na SL. 15, Jurkat ćelije stabilno eksprimiraju TGF-β CAR i EGFP reporter eksprimiran iz NFAT promoter se zasejava u različitim gustinama ćelija i inkubira sa ili bez 5 ng/mL TGF-β. Čak i pri veoma niskim gustinama ćelija gde ćelije postoje uglavnom kao jednoćelijski izolati, jasan EGFP signal se posmatra u prisustvu TGF-β. Nadalje, za 10-struki opseg u gustini ćelija (od 500 do 5000 ćelija/cm^2), nema povećanja u EGFP izlazu sa gustinom ćelija (SL.
15). Ti rezultati ukazuju da rastvorni TGF-β može izazvati aktiviranje T ćelija nezavisno od kontakta ćelijaćelija. Međutim, EGFP izlaz znatno se povećava preko praga gustine ćelija, potvrđujući doprinos kontakta ćelija-ćelija na višim nivoima gustine ćelija. Da bi se to dalje testiralo, primarne humane CD4+ T ćelije koje eksprimiraju TGF-β CAR označene su indikatorom kalcijuma Fluo-4-AM i snimljene fluorescentnom mikroskopijom. Fluo-4-AM signali posmatrani nakon dodavnja TGF-β u odsustvu kontakta ćelija-ćelija potvrđuju da se TGF-β CAR-T ćelije mogu aktivirati rastvornim ligandima bez ligacije ćelija-ćelija (SL.16).
[0181] TGF-β CAR rešava potrebu da se imunske ćelije suprotstave ulozi TGF-β kao pokretača imunosupresije u tumorskom mikrookruženju. Dok je terapija CAR-T ćelijama urodila izvanrednim kliničkim ishodima protiv maligniteta B ćelija, njena efikasnost protiv čvrstih tumora bila je znatno ograničenija. Poznato je da čvrsti tumori generišu izrazito imunosupresivno mikrookruženje putem prekomerne proizvodnje TGF-β i drugih citokina, što na kraju dovodi do inaktivacije T ćelija. TGF-β CAR daje T ćelijama sposobnost ne samo da se suprotstave imunosupresiji redukovanjem signalizacije kroz endogeni TGF-β put, već takođe da specifično izaziva aktiviranje T ćelija u prisustvu TGF-β. Aktivacija T ćelija podstiče imunsku ćeliju da proizvodi imunostimulatorne citokine i da proliferiše, pretvarajući tako TGF-β iz imunosupresivnog signala u aktivirajući stimulans koji osnažuje anti-tumorski imunološki odgovor.
Primer 2: Promena multifunkcionalne terapije regulatornim T ćelijama za autoimune bolesti
[0182] Ovaj primer opisuje postupke koji se mogu upotrebljavati za promenu regulatornih T ćelija (Treg ćelije) koje eksprimiraju himerni antigenski receptor (CAR) koje se mogu aktivirati faktorom rasta tumora beta (TGF-β) da se selektivno ekspandiraju ex vivo, održavaju snažnu supresivnu funkciju in vivo, i luče jednolančane varijabilne fragmente (scFv fragmente) alfa receptora anti-interleukina 6 (IL-6Rα) da bi se efikasno redukovalo zapaljenje kod mišjeg modela reumatodnog artritisa (RA). Razmatrano je da se druge autoimune bolesti, kao što su one poznate u oblasti tehnike i/ili opisane ovde, takođe mogu lečiti postupcima opisanim u ovom primeru i prikazu.
[0183] Adoptivna terapija T ćelijama pomoću konvencionalnih T ćelija (Tconv ćelije) koje eksprimiraju himerne antigenske receptore (CAR receptore) pokazala je izvanrednu kliničku efikasnost protiv refraktornog kancera, posebno maligniteta B ćelija. Međutim, primena terapije CAR-T ćelijama u lečenju autoimunih bolesti još je u začetku.
[0184] Treg ćelije suprimiraju funkciju Tconv ćelija preko više mehanizama, jedan od kojih je lučenje TGF-β, potentnog imunosupresivnog citokina koji inhibira funkcije i efektorskih T ćelija i ćelija prirodnih ubica. Pronalazači su razvili TGF-β CAR koji specifično aktivira Tconv ćelije u prisustvu TGF-β (SL.4), i potvrdili da TGFβ CAR-T ćelije odgovaraju na TGF-β i u rastvornim i u imobilisanim oblicima. Humani CD4+ i CD8+ Tconv ćelije koje eksprimiraju TGF-β CAR izazivaju snažnu NFAT signalizaciju i proizvode Th2 citokine u prisustvu TGF-β, uprkos činjenici da je TGF-β noramlno visoko imunosupresivno sredstvo (SL.4).
[0185] Razmatra se da bi TGF-β CAR bio jedinstveno prilagođen za Treg terapiju iz sledećih razloga: 1) poznato je da TGF-β podstiče Treg diferencijaciju, prema tome ekspanzija posredovana faktorom TGF-β T ćelija koje eksprimiraju CAR predstavlja postupak za selektivnu ekspanziju Treg ćelija dok se sprečava preterani rast kontaminirajućih Tconv ćelija. Uočili smo da TGF-β pokreće snažnu proliferaciju Tconv ćelija koje eksprimiraju TGF-β CAR, ali samo u prisustvu ozračenih hraniteljskih ćelija. U odsustvu hraniteljskih ćelija, proliferacija TGF-β CAR-Tconv ćelija specifično se inhibira prisustvom TGFβ, i inhibicija je znatno jača protiv TGF-β CAR-Tconv ćelija u poređenju sa nemodifikovanim Tconv ćelijama ili Tconv ćelijama koje eksprimiraju receptore koji nisu TGFP CAR receptori. Eksperimentalni rezultati pronalazača sugerišu da TGF-β, koji postoji kao prirodni homodimer, može izazvati konjugaciju između dve T ćelije koje obe eksprimiraju TGF-β CAR. Ta konjugacija ćelija-ćelija može dovesti do fratricidne toksičnosti među Tconv ćelijama. Ta toksičnost može biti više nego kompenzovana proliferativnim odgovorom dobijenom kao rezultat CAR signalizacije, ali samo uz podršku ozračenih hraniteljskih ćelija. Za razliku od Tconv ćelija, Treg ćelije ne pokazuju citotoksičnost posredovanu granzimom i nisu supresovane signalizacijom endogenog TGF-β. Stoga, razmatra se da se – u odsustvu podrške hraniteljske ćelije – Treg ćelije koje eksprimiraju TGF-β CAR mogu selektivno ekspandirati na račun kontaminirajućih Tconv ćelija u protokolu ex vivo ekspanzije pokrenute TGF-β faktorom, čime se rešava jedna od glavnih prepreka u proizvodnji terapijskih Treg ćelija.
2) Aktivirane Treg ćelije prirodno proizvode TGF-β, obezbeđujući tako mehanizam za samoodrživo aktiviranje TGF-β CAR-Treg ćelija in vitro i in vivo. Pokazano je da su Treg ćelije specifične za antigen efikasnije u imunosupresiji nego poliklonske Treg ćelije. Sa druge strane, takođe je pokazano da kada se jednom aktiviraju, Treg ćelije mogu da vrše supresorsku funkciju na način koji nije specifičan za antigen. Nadalje, pokazalo se da, prethodno aktivirane, poliklonske Treg ćelije kod miševa inhibiraju artritis izazvan kolagenom. Sveukupno, ti rezultati sugerišu da Treg ćelije specifične za antigen mogu biti efikasnije jer će one pre biti aktivirane nego Treg ćelije koje nisu specifične za antigen, i da specifičnost prema ciljnoj ćeliji – premda moguće povoljna – nije suštinska za terapijsku funkciju. Treg ćelije prirodno specifične za antigen teško je izolovati i ekspandirati do količina koje su dovoljno velike za terapijske primene. Premda uvođenje transgenih receptora T ćelija (TCR receptori) pruža privlačnu alternativu, svaka bolest bi zahtevala sopstveni specifičan TCR i dostupnost pogodne antigenske mete, pri čemu je to drugo prepoznato kao glavno usko grlo u razvijanju terapija T ćelijama. Kako je proizvodnja TGF-β prirodan produkt Treg ćelija bez obzira na specifičnost TCR, TGF-β CAR predstavlja strategije koja se može generalizovati za omogućavanje samoodrživog aktiviranja Treg ćelija, koje bi moglo podržati supresiju posredovanu Treg ćelijama širokog spektra ciljeva koji se tiču bolesti bez potrebe za receptorima specifičnim za bolest.
[0186] Ovaj primer obezbeđuje inovativne metodologije i specifične Treg proizvode za imunoterapiju na bazi ćelija protiv autoimunih bolesti, sa RA kao modelom bolesti za početne studije. Celokupni cilj je uspostavljanje pristupa koji se može generalizovati generisanju terapijskih Treg ćelija sa odloženom terapijskom funkcijom, i pokazivanje korisnosti promenjenih Treg ćelija u modelu artritisa izazvanog kolagenom kod miševa.
A. Razvijanje protokola za ex vivo ekspanziju posredovanu TGF-β faktorom za snažnu propagaciju Treg ćelija
[0187] Primarne humane Treg ćelije mogu se izolovati iz uzoraka krvi zdravog donora pomoću RosetteSep kita za obogaćivanje CD4+ T ćelija za čim sledi obogaćivanje na bazi matnetnih perli CD127- i CD25+ ćelija. Izolovane ćelije mogu se aktivirati pomoću CD3/CD28 Dynabeads i kultivisati u kompletnom medijumu (RPMI 10% toplotno inaktivirani fetalni goveđi serum) dopunjen sa 300 U/ml IL-2 u trajanju od 2 dana pre lentivirusne transdukcije. Lentivirusni vektori koji kodiraju obeležen TGF-β CAR (preko peptida T2A za cepanje) sa skraćenim receptorom epidermalnog faktora rasta (EGFRt) već su konstruisani i validirani transdukcijom u primarne humane Tconv ćelije. Ćelije koje eksprimiraju CAR mogu se izolovati sortiranjem pomoću magnetnih perli za EGFRt+ ćelije. Takvom šemom sortiranja otklanja se potreba za direktnim vezivanjem antitela za CAR i redukuje se verovatnoća za neproduktivno aktiviranje T ćelija. Sortirane CAR-Treg ćelije mogu se ekspandirati na pločama sa 96 bunarčića u različitim uslovima za uzgajanje kultura: (a) 300 U/ml samo IL-2, (b) samo TGF-β u gradijentu koncentracija (1–20 ng/ml), (c) gradijent IL-2 (50–300 U/ml) plus TGF-β (1–20 ng/ml), i (d) gradijent IL-2 i TGF-β koncentracija plus ozračene hraniteljske ćelije (TM-LCL ćelije) u odnosu 1:7 T ćelija : TM-LCL. Brojevi živih ćelija mogu se kvantifikovati protočnom citometrijom tokom perioda od 3 sedmice. Nadalje, nivoi ekspresije Foxp3 mogu se kvantifikovati pomoću unutarćelijskog bojenja tokom procesa pripeme ćelija, počev od sveže izolovanih CD4+/CD25+/CD127 ćelija. Konstruisan je CAR „bez scFv“ koji je identičan sa TGF-β CAR receptorom osim što mu nedostaje scFv domen za vezivanje TGF-β i može se uključiti kao negativna kontrola.
[0188] Preko studija opisanih u ovom primeru, može se odrediti sledeće: (1) da li ekspresija TGF-β CAR receptora daje Treg ćelijama sposobnost da proliferišu specifično kao odgovor na dodavanje TGF-β i (2) identifikuju optimalnu kombinaciju IL-2, TGF-β, i/ili hraniteljskih ćelija za ex vivo ekspanziju Treg ćelija sa visokom efikasnošću (definisanom mnogostrukom ekspanzijom) i visokom prečišćenošću (definisanom minimalnim prisustvom kontaminirajućih Tconv ćelija). Pronalazači su razvili više TGF-β CAR receptora sa različitim strukturnim svojstvima, i uočili su distinktivne signalne pragove tih CAR receptora kao odgovor na TGF-β. Dva različita TGF-β CAR receptora, jedan sa kratkim (12 aminokiselina) vanćelijskim spejserom i drugi sa dugim (229 aminokiselina) venćelijskim spejserom mogu se evaluirati da bi se odredio optimalan konstrukt za primene Treg ćelije.
B. Optimizovanje supresorske funkcije TGF-β CAR-Treg ćelija in vitro i in vivo
[0189] Supresorske funkcije Treg ćelija koje stabilno eksprimiraju TGF-β CAR mogu se dalje istraživati. Treg ćelije će biti izolovane, transdukovane, i sortirane kako je opisano gore. Mogu se evaluirati i TGF-β CAR receptori sa dugim spejserima i TGF-β CAR receptori sa kraktim spejserima. Kao negativna kontrola, frakcija CD4+ T ćelija (pre obogaćivanja za CD127-/CD25+ fenotip) može se transdukovati i sortirati da bi se obezbedilo poređenje TGF-β CAR-Tconv sa promenjenim Treg ćelijama. Kao druga negativna kontrola, u studiju se mogu uključiti Treg ćelije transdukovane pomoću CAR receptora bez scFv opisanog gore. Sortirane CAR-Treg ćelije mogu se ekspandirati u kompletnom medijumu dopunjenom sa 300 U/ml IL-2, budući da je zabeleženo da ta koncentracija IL-2 podržava preživljavanje Treg ćelije i proliferaciju ex vivo i da je srednja koncentracija među onima koje su zabeležene u objavljenim studijama. Procedura ekspanzije može se ažurirati do uslova za koji je utvrđeno da podržava optimalna ekspanzija Treg ćelija. Tconv ćelije će se ekspandirati u kompletnom medijumu dopunjenom sa 50 U/ml IL-2 i 1 ng/ml IL-15.
[0190] Supresorska funkcija TGF-β CAR-Treg ćelija može se evaluirati u zajedničkim kulturama sa ciljnim Tconv ćelijama. Ciljne Tconv ćelije biće CD4+ T ćelije lentivirusno transdukovane da eksprimiraju CD19 CAR. Da bi se testirala funkcija Treg ćelije, TGF-β CAR-Treg ćelije mogu se ko-inkubirati i sa CFSE-om označene CD19 CAR-Tconv ćelijama i sa CD19+ ćelijama Raji limfoma u prisustvu ili odsustvu rastvornog TGF-β. Proliferacija CD19 CAR-Tconv ćelija može se evaluirati pomoću CFSE razblaživanja kao i brojanja živih ćelija protočnom citometrijom. Test proliferacije na bazi CFSE može se izvesti umesto uobičajeno upotrebljavanog testa inkorporacije 3H-timidina kako bi se jasno razlikovala proliferacija Treg naspram Tconv ćelija u toj postavci zajedničkih kultura. CFSE-om označene ćelije mogu se tačno kvantifikovati protočnom citometrijom počev od ranih vremenskih tačaka, dok će vršne vrednosti razblaženja CFSE otkriti dinamike ćelijskih deoba tokom perioda od 7 dana. Kao negativne kontrole, TGF-β CAR-Tconv ćelije ili CAR „bez scFv“ Treg ćelije mogu zameniti TGF-β CAR-Treg ćelije u ko-inkubiranim uzorcima. Očekuje se da će CAR „bez scFv“ Treg ćelije pokazati neke supresivne funkcije, ali da će TGF-β CAR-Treg ćelije pokazati poboljšanu supresiju usled proizvodnje TGF-β i naknadne autokrine aktivacije Treg ćelija preko TGF-β CAR. Nadalje, predviđa se da će dodavanje egzogenog TGF-β dalje pojačati supresorsku funkciju TGF-β CAR-Treg ćelija, što će dovešti do minimalne ekspanzije CD19 CAR-Tconv ćelija uprkos prisustvu CD19+ ciljnih ćelija.
[0191] Po verifikaciji supresorske funkcije TGF-β CAR-Treg ćelija in vitro, promenjena sposobnost Treg ćelija da izvršavaju supresorsku funkciju in vivo može se evaluirati. Za životinjske studije, mišje CD4+/CD25+ Treg ćelije biće izolovani iz limfnih čvorova i slezine DBA/1 miša sortiranjem ćelija na bazi magnetnih perli. Sortirane ćelije mogu se aktivirati mišjim CD3/CD28 Dynabeads i transdukovati, ekspandirati, i sortirati radi ekspresije TGF-β CAR receptora kao što je prethodno opisano za humane Treg ćelije. Premda se TGF-β CAR konstruiše sa scFv koji kao cilj ima humani TGF-β, pronalazači su potvrdili da taj receptor unakrsno reaguje sa mišjim TGF-β sa visokom efikasnošću (SL.8). Da bi se izazvao artritis izazvan kolagenom (CIA), DBA/1 miševima se u osnovu repa može ubrizgati emulzija od 100-ml koja sadrži kompletni Frojndov (Freund) adjuvans pomešan u odnosu 1:1 sa 2 mg/ml pilećeg kolagena tipa II rastvorenog u PBS sa 0,1 M sirćetne kiseline. Jedan milion Treg ćelije se mogu davati ubrizgavanjem u repnu venu bilo jedan dan pre CIA imunizacije ili dve sedmice nakon CIA imunizacije kako bi se evaluiralo delovanje Treg ćelija u različitim stupnjevima napredovanja bolesti. TGF-β CAR-Treg ćelije se mogu porediti sa CAR „bez scFv“ Treg ćelijama i sa kontrolom „bez Treg ćelija“ (tj., bez davanja Treg ćelija nakon CIA imunizacije) po njihovoj sposobnosti da spreče ili ublaže artritis. Miševi se mogu procenjivati na klinični artritis u šapama na osnovu skale od 4 tačke kako su prethodno opisali Kelchtermans, H. et al. (Arthritis Res Ther 7, R402-415 (2005)). Za svaki uslov testa može se uključiti po deset životinja (ukupno 40 životinja). Veličina uzorka n = 10 obezbediće 92% jačine da se detektuje razlika od 1,5 standardnih devijacija u bodovanju artritisa u dvostranom t-testu sa α = 0,05. Na osnovu dostupne literature, predviđa se da će CAR „bez scFv“ Treg ćelije postići primetnu supresiju simptoma artritisa u CIA modelu. Međutim, predviđa se da će dodavanje TGF-β CAR receptora kao rezultat imati poboljšanu funkcionalnost Treg ćelija, što dovodi do efikasnijeg inhibiranja CIA. Ostaje da se vidi da li će CAR sa dugim spejserom ili CAR sa kratkim spejserom pokazati superiornu funkcionalnost in vivo u CIA modelu.
REFERENCE
[0192]
US20110008364;
US7151169;
Yingling et al, Nat Rev Drug Discov 2004;
US8012482;
US20060135517;
US 2004026871;
US20070142376;
Gorelik and Flavell, Nat Med 2001;
Bollard et al, Blood 2002;
Zhang et al, Kancer Res 2005;
Foster et al, J Immunother 2008;
Zhang et al, Gene Ther 2012;
Quatromoni et al, J Transl Med 2012;
Bendle et al, J Immunol 2013
Brentjens, R.J. et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med 5, 177ra138 (2013).
Kalos, M. et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med 3, 95ra73 (2011).
Kochenderfer, J.N. et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood 119, 2709-2720 (2012).
Porter, D.L., Levine, B.L., Kalos, M., Bagg, A. & June, C.H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 365, 725-733 (2011).
Davila, M.L. et al. Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med 6, 224ra225 (2014).
Ellebrecht, C.T. et al. Reengineering chimeric antigen receptor T cells for targeted therapy of autoimmune disease. Science 353, 179-184 (2016).
Wright, G.P., Ehrenstein, M.R. & Stauss, H.J. Regulatory T-cell adoptive immunotherapy: potential for treatment of autoimmunity. Expert Rev Clin Immunol 7, 213-225 (2011).
Wright, G.P. et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigenspecific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci USA 106, 19078-19083 (2009).
Kelchtermans, H. et al. Activated CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit osteoclastogenesis and collageninduced arthritis. Ann Rheum Dis 68, 744-750 (2009).
Morgan, M.E. et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis Rheum 52, 2212-2221 (2005). Blat, D., Zigmond, E., Alteber, Z., Waks, T. & Eshhar, Z. Suppression of murine colitis and its associated kancer by carcinoembryonic antigen-specific regulatory T cells. Mol Ther 22, 1018-1028 (2014).
Tang, Q. & Bluestone, J.A. Regulatory T-cell therapy in transplantation: moving to the clinic. Cold Spring Harb Perspect Med 3 (2013).
Nakamura, K. et al. TGF-beta 1 plays an important role in the mechanism of CD4+CD25+ regulatory T cell activity in both humans and mice. J Immunol 172, 834-842 (2004).
Thornton, A.M. & Shevach, E.M. Suppressor effector function of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific. J Immunol 164, 183-190 (2000).
Brusko, T.M. et al. Human antigen-specific regulatory T cells generated by T cell receptor gene transfer. PLoS One 5, e11726 (2010).
Rosenberg, S.A. Finding suitable targets is the major obstacle to kancer gene therapy. Kancer Gene Ther 21, 45-47 (2014).
Myasoedova, E., Crowson, C.S., Kremers, H.M., Therneau, T.M. & Gabriel, S.E. Is the incidence of rheumatoid arthritis rising?: results from Olmsted County, Minnesota, 1955-2007. Arthritis Rheum 62, 1576-1582 (2010).
Widdifield, J. et al. The epidemiology of rheumatoid arthritis in Ontario, Canada. Arthritis Rheumatol 66, 786-793 (2014).
Lee, D.W. et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood 124, 188-195 (2014).
Brudno, J.N. & Kochenderfer, J.N. Toxicities of chimeric antigen receptor T cells: recognition and management. Blood 127, 3321-3330 (2016).
Brunstein, C.G. et al. Umbilical cord blood-derived T regulatory cells to prevent GVHD: kinetics, toxicity profile, and clinical effect. Blood 127, 1044-1051 (2016).
Kelchtermans, H. et al. Defective CD4+CD25+ regulatory T cell functioning in collagen-induced arthritis: an important factor in pathogenesis, counter-regulated by endogenous IFN-gamma. Arthritis Res Ther 7, R402-415 (2005).
Wu, Y. et al. FOXP3 controls regulatory T cell function through cooperation with NFAT. Cell 126, 375-387 (2006).

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži signalni peptid, domen za vezivanje antigena TGF-β sa varijabilnim teškim (VH) i varijabilnim lakim (VL) regionom antitela, peptidni spejser, transmembranski domen, i endodomen koji emituje aktivacioni signal T ćelijama nakon vezivanja antigena; pri čemu se domen za vezivanje antigena TGF-β specifično vezuje za rastvorni TGF-β i pri čemu:
(a) VH region sadrži SEQ ID NO:5 kao HCDR1, SEQ ID NO:6 kao HCDR2; i SEQ ID NO:7 kao HCDR3 i VL region sadrži SEQ ID NO:8 kao LCDR1, SEQ ID NO:9 kao LCDR2; i SEQ ID NO:10 kao LCDR3; ili (b) VH region sadrži SEQ ID NO:11 kao HCDR1, SEQ ID NO:12 kao HCDR2; i SEQ ID NO: 13 kao HCDR3 i VL region sadrži SEQ ID NO:14 kao LCDR1, SEQ ID NO:15 kao LCDR2; i SEQ ID NO:16 kao LCDR3; ili
(c) VH region sadrži SEQ ID NO:21 kao HCDR1, SEQ ID NO:22 kao HCDR2; i SEQ ID NO:23 kao HCDR3 i VL region sadrži SEQ ID NO:24 kao LCDR1, SEQ ID NO:25 kao LCDR2; i SEQ ID NO:26 kao LCDR3; i
pri čemu CAR ima strukturu: S-X-PL-Y-PS-T-E ili S-Y-PL-X-PS-T-E pri čemu je S signalni peptid, X je VH, PL je peptidni linker, Y je VL, PS je peptidni spejser, T je transmembranski domen, i E je endodomen.
2. CAR prema patentnom zahtevu 1(a), pri čemu VH region sadrži SEQ ID NO:1 i VL region sadrži SEQ ID NO:2.
3. CAR prema patentnom zahtevu 1, pri čemu:
(a) VH region prema patentnom zahtevu 1(b) sadrži SEQ ID NO:3 i VL region sadrži SEQ ID NO:4; ili (b) VH region prema patentnom zahtevu 1(c) sadrži SEQ ID NO: 19 i VL region sadrži SEQ ID NO:20.
4. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1–3, pri čemu:
(a) VH region i VL region su odvojeni pomoću peptidnog linkera; i/ili
(b) CAR dalje sadrži kostimulatorni region, opciono pri čemu je kostimulatorni region između transmembranskog domena i endodomena; i/ili
(c) transmembranski domen sadrži transmembranski domen iz CD28; i/ili
(d) endodomen sadrži CD28 ili CD3 zeta signalni domen; pri čemu je opciono peptidni linker glicinsko-serinski linker.
5. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1(b), 1(c), 2, 3 ili 4, pri čemu je peptidni linker najmanje 4 aminokiseline.
6. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1–5, pri čemu:
(a) endodomen je CD3-zeta signalni domen; i/ili
(b) peptidni spejser sadrži: (i) manje od 50 aminokiselina; ili (ii) više od 50 aminokiselina; i/ili (c) peptidni spejser sadrži zglobni region molekula IgG; i/ili
(d) peptidni spejser sadrži zglobni region i region CH2CH3 molekula IgG, pri čemu se opciono peptidni spejser sastoji od zglobnog regiona molekula IgG; i/ili
(e) CAR dalje sadrži peptid za detekciju, pri čemu je opciono peptid za detekciju peptid iz SEQ ID NO:17, 94, ili 95: i opciono: (i) peptid za detekciju je oivičen linkerima; i/ili (ii) peptid za detekciju je N-terminalni za VH i VL regione; i/ili (iii) peptid za detekciju je između signalnog peptida i domena za vezivanje antigena.
7. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1–6, pri čemu:
(a) signalni peptid sadrži SEQ ID NO:18; i/ili
(b) CAR dalje sadrži domen za vezivanje antigena specifičan za molekul kancera, pri čemu opciono molekul kancera sadrži Her2 ili sadrži CD19 ili CD20; ili
(c) CAR dalje sadrži domen za vezivanje antigena specifičan za molekul kancera, pri čemu se opciono domen za vezivanje antigena specifičan za molekul kancera vezuje za CAIX, CD33, CD44v7/8, CEA, EGP-2, EGP-40, erb-B2, erbB3, erb-B4, FBP, fetalni acetiholinski receptor, GD2, GD3, Her2/neu, IL-13Ralpha2, KDR, k-laki lanac, LeY, L1 molekul ćelijske adhezije, MAGE-A1, mezotelin, MUC1, NKG2D ligande, onkofetalni antigen (h5T4), PSCA, PSMA, TAA koji su ciljni za mAb IgE, TAG-72, ili VEGF-R2.
8. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1–7.
9. Ćelija koja sadrži CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1–7 ili nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 8, pri čemu:
(A) opciono ćelija dalje sadrži himerni antigenski receptor (CAR) specifičan za kancer, i opciono se CAR specifičan za kancer specifično vezuje za: (i) Her2 ili (ii) specifično vezuje za CD19 ili CD20, pri čemu opciono ćelija je imunska ćelija; i
(B) opciono: (a) ćelija je T ćelija, opciono CD4+ ili CD8+ T ćelija; ili T regulatorna ćelija; ili (b) ćelija je ćelija prirodni ubica.
10. Ćelija prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u postupku za stimulisanje imunološkog odgovora, pri čemu navedeni postupak obuhvata dovođenje u kontakt ćelije prema patentnom zahtevu 9 sa TGF-β, pri čemu opciono:
(i) stimulisanje imunološkog odgovora obuhvata povećanje ekspresije i/ili lučenja imuno stimulišućih citokina i/ili molekula, pri čemu su opciono imuno stimulišući citokini i/ili molekuli jedan ili više od TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 i faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga; ili (ii) stimulisanje imunološkog odgovora koji obuhvata povećanje proliferacije imunskih ćelija, opciono pri čemu imunske ćelije su T ćelije.
11. Ćelija prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u postupku za stimulisanje imunološkog odgovora, pri čemu navedeni postupak obuhvata dovođenje u kontakt ćelije prema patentnom zahtevu 9 ili patentnom zahtevu 10 sa TGF-β, pri čemu ćelija je in vivo u subjektu kome je potrebna imunološka stimulacija i opciono TGF-β je endogeni TGF-β proizveden u subjektu kome je potrebna imunološka stimulacija, pri čemu opciono:
(i) ljudski subjekat ima kancer, fibrozu, ili otvorenu ranu, pri čemu opciono kancer je melanom; (ii) ljudski subjekat ima malignitet B-ćelija; ili (iii) ljudski subjekat ima čvrsti tumor; i pri čemu opciono: (iv) postupak dalje obuhvata davanje ćelije ljudskom subjektu; i/ili (v) postupak dalje obuhvata davanje TGF-β subjektu.
12. Ex vivo postupak za detektovanje TGF-β u rastvoru koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije prema patentnom zahtevu 9 sa rastvorom i merenje imunološke stimulacije; pri čemu povećanje u imunološkoj stimulaciji ukazuje na prisustvo TGF-β i odsustvo povećanja u imunološkoj stimulaciji ukazuje na odsustvo TGF-β, pri čemu opciono:
(i) imunološka stimulacija obuhvata ekspresiju imuno stimulišućih citokina i/ili molekula, pri čemu opciono imuno stimulišući citokini i/ili molekuli su jedan ili više od TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 i faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga; ili (ii) imunološka stimulacija obuhvata povećanje u proliferaciji imunskih ćelija, pri čemu opciono imunske ćelije su T ćelije.
13. Postupak za dobijanje CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1–7 koji obuhvata eksprimiranje nukleotida koji kodira CAR u ćeliji.
14. Postupak za umnožavanje T ćelija in vitro, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt T ćelije prema patentnom zahtevu 9B sa kompozicijom koja sadrži TGF-β, pri čemu opciono kompozicija: (a) sadrži 1–50 ng/mL TGF-β; i/ili (b) sadrži IL-2 i opciono kompozicija sadrži 20–400 U/mL IL-2,
pri čemu opciono:
(a) (i) postupak dalje obuhvata dovođenje u kontakt ćelija sa hraniteljskim ćelijama, pri čemu opciono hraniteljske ćelije su ozračene; ili (ii) postupak isključuje kontakt T ćelija sa hraniteljskim ćelijama; i/ili
(b) T ćelija je regulatorna T ćelija, pri čemu opciono umnožene regulatorne T ćelije sadrže manje od 10% neregulatornih T ćelija.
15. Ćelija prema patentnom zahtevu 9B za upotrebu u postupku za lečenje bolesti ili patološkog stanja kod pacijenta,
pri čemu opciono: (a) ćelija je regulatorna T ćelija, pri čemu opciono bolest je: autoimuna bolest; ili (b) bolest je kancer;
pri čemu opciono postupak dalje obuhvata umnožavanje ćelija in vitro postupkom koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije in vitro sa kompozicijom koja sadrži TGF-β; pri čemu opciono: (a) kompozicija sadrži 1–50 ng/mL TGF-β; i/ili (b) kompozicija dalje sadrži IL-2, i opciono kompozicija sadrži 20–400 U/mL IL-2;
pri čemu opciono: (a) postupak dalje obuhvata dovođenje u kontakt ćelija sa hraniteljskim ćelijama, pri čemu opciono hraniteljske ćelije su ozračene; ili (b) postupak isključuje kontakt T ćelija sa hraniteljskim ćelijama;
pri čemu opciono T ćelija je regulatorna T ćelija, pri čemu opciono umnožene regulatorne T ćelije sadrže manje od 10% neregulatornih T ćelija;
pri čemu opciono autoimuna bolest je reumatoidni artritis; i
pri čemu opciono postupak dalje obuhvata davanje TGF-β pacijentu.
RS20230155A 2015-10-30 2016-10-28 Polipeptidi koji reaguju na transformišući faktor rasta – beta i postupci za njihovu upotrebu RS64053B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562248685P 2015-10-30 2015-10-30
PCT/US2016/059444 WO2017075433A1 (en) 2015-10-30 2016-10-28 Transforming growth factor-beta-responsive polypeptides and their methods for use
EP16860930.3A EP3368571B1 (en) 2015-10-30 2016-10-28 Transforming growth factor-beta-responsive polypeptides and their methods for use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64053B1 true RS64053B1 (sr) 2023-04-28

Family

ID=58631218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230155A RS64053B1 (sr) 2015-10-30 2016-10-28 Polipeptidi koji reaguju na transformišući faktor rasta – beta i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11014980B2 (sr)
EP (2) EP3368571B1 (sr)
JP (3) JP7104624B2 (sr)
KR (1) KR102771979B1 (sr)
CN (2) CN108884155B (sr)
DK (1) DK3368571T5 (sr)
ES (1) ES2935372T3 (sr)
FI (1) FI3368571T3 (sr)
HR (1) HRP20230239T1 (sr)
HU (1) HUE061424T2 (sr)
LT (1) LT3368571T (sr)
PL (1) PL3368571T3 (sr)
PT (1) PT3368571T (sr)
RS (1) RS64053B1 (sr)
SI (1) SI3368571T1 (sr)
SM (1) SMT202300027T1 (sr)
WO (1) WO2017075433A1 (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3234120B1 (en) 2014-12-15 2025-09-03 The Regents of the University of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective t cell mediated killing
EP4400516A1 (en) 2014-12-15 2024-07-17 The Regents of the University of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
DK3368571T5 (da) * 2015-10-30 2024-09-30 Univ California Transformerende, vækstfaktor-beta-responsive polypeptider og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN108883181A (zh) * 2016-04-05 2018-11-23 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 在免疫疗法中抑制TGFβ
JP2019530440A (ja) 2016-09-02 2019-10-24 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア インターロイキン６受容体α結合単鎖可変断片を含む方法および組成物
AU2018290628B2 (en) * 2017-06-30 2022-03-17 Kolon Life Science, Inc. Pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis
CN109486745A (zh) * 2017-09-12 2019-03-19 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 Fg-4592在促进表皮干细胞迁移方面的应用
ES2960686T3 (es) 2018-01-19 2024-03-06 Miltenyi Biotec Bv & Co Kg Células T reguladoras que expresan un receptor de antígeno quimérico
GB201807693D0 (en) * 2018-05-11 2018-06-27 Autolus Ltd Cell
US12590148B2 (en) 2018-11-26 2026-03-31 Nkarta, Inc. Methods for the simultaneous expansion of multiple immune cell types, related compositions and uses of same in cancer immunotherapy
AU2020232691B2 (en) 2019-03-05 2023-06-29 Nkarta, Inc. CD19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy
WO2021041806A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Allogene Therapeutics, Inc. Chimeric cytokine receptors comprising tgf beta binding domains
CN111748043B (zh) * 2020-07-03 2022-09-02 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CA3193009A1 (en) * 2020-08-26 2022-03-03 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating glioblastoma
CN112500491B (zh) * 2020-12-18 2022-04-08 深圳市迈加瑞生物技术有限公司 一种特异性中和辅助性T细胞TGF-β信号的双特异性抗体、其药物组合及其用途
WO2023023602A1 (en) * 2021-08-19 2023-02-23 Boan Boston Llc Fusion proteins for dephosphorylating proteins that regulate t cell activation through the tcr signaling pathway
US20250250329A1 (en) * 2022-04-11 2025-08-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cytokine adaptor proteins and uses thereof
EP4509522A1 (en) 2023-08-16 2025-02-19 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft A tgfbeta switch receptor, a nucleic acid encoding it, cells and pharmaceutical compositions comprising the same
WO2025096419A1 (en) * 2023-10-31 2025-05-08 Lyell Immunopharma, Inc. T cells comprising a chimeric antigen receptor targeting transforming growth factor beta and a t cell receptor targeting a tumor antigen, and use thereof

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5670373A (en) 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
ATE194384T1 (de) 1989-09-12 2000-07-15 Hoffmann La Roche Tnf-bindende proteine
US5503978A (en) 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5543293A (en) 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
EP0628639B1 (en) 1991-04-25 1999-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5138941A (en) 1991-06-28 1992-08-18 Strauss Frederick J Wooden crusher for recyclable metal cans
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5631146A (en) 1995-01-19 1997-05-20 The General Hospital Corporation DNA aptamers and catalysts that bind adenosine or adenosine-5'-phosphates and methods for isolation thereof
CA2289115A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Recombinant antibody-enzyme fusion proteins
DE69838483T2 (de) 1997-10-14 2008-07-03 Darwin Molecular Corp. Thymidinkinase mutanten und fusionproteine mit thymidinkinase und guanylatekinase aktivitäten
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US7066469B2 (en) 2002-08-06 2006-06-27 University of Kentucky Research Foundation Board of Supervisors of Louisiana State University Seal assembly for machinery housing
US20040043949A1 (en) 2002-08-30 2004-03-04 Christopher Richardson Therapeutic system targeting pathogen proteases and uses thereof
UA80296C2 (en) 2002-09-06 2007-09-10 Biogen Inc Imidazolopyridines and methods of making and using the same
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
WO2004085611A2 (en) 2003-03-21 2004-10-07 The Research Foundation Of State University Of New York Model for mutually exclusive domain folding molecular switch
WO2005000200A2 (en) * 2003-05-09 2005-01-06 Sugen, Inc. Novel kinases
KR20060041205A (ko) 2003-07-01 2006-05-11 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 양특이성 항체들의 다가 담체들
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
SG145712A1 (en) 2003-08-01 2008-09-29 Amgen Inc Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptides
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
EP1682890A2 (en) 2003-11-13 2006-07-26 Genentech, Inc. Screening assays and methods of tumor treatment
CN1961003B (zh) * 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
WO2006046661A1 (ja) 2004-10-28 2006-05-04 Osaka University インターロイキン－６阻害剤
WO2006086469A2 (en) 2005-02-08 2006-08-17 Genzyme Corporation Antibodies to tgfbeta
US20090068158A1 (en) 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
WO2007070866A2 (en) 2005-12-16 2007-06-21 Alcon, Inc. Control of intraocular pressure using alk5 modulation agents
US20110182848A1 (en) * 2007-08-03 2011-07-28 Asterion Limited Granulocyte colony stimulating factor
US8278065B2 (en) 2008-06-30 2012-10-02 Morphotek, Inc. Polynucleotides encoding anti-GD2 antibodies
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
EP2445530B1 (en) 2009-06-24 2016-09-07 The Feinstein Institute for Medical Research Method for treating chronic lymphocytic leukemia
KR101829073B1 (ko) 2009-06-26 2018-02-13 아이2 파마슈티컬스, 인크. 대리 경쇄의 발현
ES2686424T5 (es) 2010-05-04 2023-03-27 Yeda Res & Dev Inmunoterapia con células alogénicas redireccionadas
WO2011146862A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
MY165160A (en) 2010-09-01 2018-02-28 Genzyme Corp TREATMENT OF MYOCARDIAL INFARCTION USING TGF-ß ANTAGONISTS
EP3467101A3 (en) 2010-09-08 2019-06-19 Baylor College of Medicine Immunotherapy of brain tumor using geneticially engineered gd2-specific t cells
TWI603738B (zh) 2010-11-08 2017-11-01 建南德克公司 皮下投予抗－ｉｌ－６受體抗體
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
CN109517059B (zh) * 2011-06-30 2023-03-28 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
LT2794658T (lt) 2011-12-19 2017-05-10 Synimmune Gmbh Bispecifinė antikūno molekulė
JP6850528B2 (ja) 2012-02-13 2021-03-31 シアトル チルドレンズ ホスピタル ドゥーイング ビジネス アズ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート 二重特異性キメラ抗原受容体およびその治療的使用
GB201203051D0 (en) 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
KR20150029714A (ko) 2012-07-13 2015-03-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 이중특이적 항체의 공-도입에 의한 ｃａｒ 세포의 활성 증강
CA2881981A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
EP3456734B1 (en) 2012-10-04 2022-01-05 Research Development Foundation Serine protease molecules and therapies
KR101911438B1 (ko) 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
EP2730289A1 (en) 2012-11-07 2014-05-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel immunoproteases
CN104271602B (zh) 2012-11-21 2020-08-21 武汉友芝友生物制药有限公司 双特异性抗体
CN113201073A (zh) 2012-11-21 2021-08-03 詹森生物科技公司 双特异性EGFR/c-Met抗体
EP4303232A3 (en) 2013-02-15 2024-04-17 The Regents of The University of California Chimeric antigen receptor and methods of use thereof
PT2971048T (pt) 2013-03-11 2019-02-06 Genzyme Corp Anticorpos anti-tgf-beta manipulados e fragmentos de ligação a antigénios
CA2909701C (en) * 2013-04-17 2022-12-06 Baylor College Of Medicine Immunosuppressive tgf-.beta. signal converter
US20160333108A1 (en) 2014-01-13 2016-11-17 Stephen J. Forman CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs) HAVING MUTATIONS IN THE FC SPACER REGION AND METHODS FOR THEIR USE
ES3063961T3 (en) 2014-02-14 2026-04-21 Cellectis Cells for immunotherapy engineered for targeting antigen present both on immune cells and pathological cells
JP6556156B2 (ja) 2014-02-27 2019-08-07 ユーシーエル ビジネス ピーエルシー Ａｐｒｉｌバリアント
CA2943008C (en) * 2014-03-19 2021-03-30 Cellectis Cd123 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
EP3126390B2 (en) * 2014-04-03 2026-01-07 Cellectis Cd33 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
CA2945320A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Drug regulated transgene expression
WO2015158671A1 (en) * 2014-04-14 2015-10-22 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
AU2015343013B2 (en) 2014-11-05 2020-07-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Gene modified immune effector cells and engineered cells for expansion of immune effector cells
CA2969456A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for adoptive cell therapy
EA036379B1 (ru) 2014-12-12 2020-11-02 Блубёрд Био, Инк. Химерные антигенные рецепторы к bcma
EP3234120B1 (en) 2014-12-15 2025-09-03 The Regents of the University of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective t cell mediated killing
EP4400516A1 (en) 2014-12-15 2024-07-17 The Regents of the University of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
EP3256492A4 (en) 2015-02-09 2018-07-11 University of Florida Research Foundation, Inc. Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2016168773A2 (en) 2015-04-15 2016-10-20 The California Institute For Biomedical Research Optimized pne-based chimeric receptor t cell switches and uses thereof
WO2016174652A1 (en) 2015-04-30 2016-11-03 Technion Research & Development Foundation Limited Chimeric antigen receptors and methods of their use
WO2017027291A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific car t-cells for solid tumor targeting
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
DK3368571T5 (da) 2015-10-30 2024-09-30 Univ California Transformerende, vækstfaktor-beta-responsive polypeptider og fremgangsmåder til anvendelse deraf
MX2018005618A (es) 2015-11-05 2018-08-01 Juno Therapeutics Inc Receptores quimericos que contienen dominios inductores de traf y composiciones y metodos relacionados.
CN108884140B (zh) 2015-12-03 2022-10-25 朱诺治疗学股份有限公司 修饰的嵌合受体及相关组合物和方法
WO2017172981A2 (en) 2016-03-29 2017-10-05 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
PT3436079T (pt) 2016-04-01 2021-10-06 Kite Pharma Inc Recetores de antigénios quiméricos e de células t e métodos de uso
WO2017180993A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Bluebird Bio, Inc. Salvage chimeric antigen receptor systems
CN105837693A (zh) 2016-05-30 2016-08-10 李斯文 一种基于bcma的抗原嵌合受体及其制备方法和应用
JP7114490B2 (ja) 2016-06-24 2022-08-08 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の構成およびその使用方法
EP4282969A3 (en) 2016-09-02 2024-01-31 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with duocars
EP3523331A1 (en) 2016-10-07 2019-08-14 Novartis AG Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
CN110352068A (zh) 2016-12-02 2019-10-18 南加利福尼亚大学 合成的免疫受体及其使用方法
CN108148863B (zh) 2016-12-05 2019-12-17 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种封闭il6r的用于缓解crs的car-t转基因载体及其构建方法和应用
US10442867B2 (en) 2017-07-31 2019-10-15 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD19/CD20 immunotherapy
MX2020004185A (es) 2017-09-27 2021-01-08 Univ Southern California Nuevas plataformas para coestimulacion, nuevos diseños car y otras mejoras para terapia celular adoptiva.
MA51428A (fr) 2017-12-22 2020-11-04 Bluebird Bio Inc Récepteur d'antigène chimérique multivalent
JP2021508468A (ja) 2017-12-29 2021-03-11 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ メディトープ対応ｔ細胞
WO2019134866A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Molmed Spa Chimeric antigen receptors containing optimal spacer region
SG11202011383VA (en) 2018-05-31 2020-12-30 Univ Washington Chimeric antigen receptor t cells (car-t) for the treatment of cancer
US11123079B2 (en) 2018-06-08 2021-09-21 Boston Scientific Scimed, Inc. Occlusive device with actuatable fixation members
CN119529091A (zh) 2018-06-19 2025-02-28 南京传奇生物科技有限公司 工程化的细胞及其用途
US20210269525A1 (en) 2018-06-29 2021-09-02 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. ANTI-CD3e ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2020010235A1 (en) 2018-07-05 2020-01-09 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Car t cells that target b-cell antigens
KR20210074274A (ko) 2018-08-06 2021-06-21 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 합텐 표지된 세포로의 키메라 항원 수용체 t 세포의 자극을 위한 방법 및 조성물
CN113164576A (zh) 2018-10-05 2021-07-23 圣安娜儿童癌症研究中心 嵌合抗原受体(car)组
CA3112310C (en) 2018-10-05 2025-05-06 Universitat Fur Bodenkultur Wien CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR GROUP (CAR)
EP3876977A1 (en) 2018-11-06 2021-09-15 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
PL3886894T3 (pl) 2018-11-30 2024-07-01 Juno Therapeutics, Inc. Metody dawkowania i leczenia nowotworów b-komórkowych w adoptywnej terapii komórkowej
KR102840400B1 (ko) 2018-12-12 2025-08-04 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포 및 사용 방법
CA3130489A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combinations of multiple chimeric antigen receptors for immunotherapy
US20230348556A1 (en) 2019-02-21 2023-11-02 Arbele Limited Artificial immunosurveillance chimeric antigen receptor and cells expressing the same
CN113924103B (zh) 2019-03-06 2025-02-14 莱蒂恩技术公司 用于用自驱动的嵌合抗原受体来治疗癌症的组合物和方法
EP3959307A4 (en) 2019-04-22 2023-08-23 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
US20220218752A1 (en) 2019-05-16 2022-07-14 University Of Washington Lockr-mediated recruitment of car t cells
PE20220568A1 (es) 2019-05-21 2022-04-20 Novartis Ag Moleculas de union a cd19 y usos de las mismas
CN112111012B (zh) 2019-06-20 2023-07-04 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
KR20220044748A (ko) 2019-07-11 2022-04-11 우한 이지 바이오파마 씨오., 엘티디. 4가 대칭 이중 특이적 항체
CN112390891B (zh) 2019-08-14 2022-06-03 苏州方德门达新药开发有限公司 嵌合抗原受体及其构建方法和应用
WO2021030586A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 City Of Hope Dual bispecific antibody compounds and uses thereof
US10697749B1 (en) 2019-10-04 2020-06-30 William L. Richey, Sr. Reed tube cane diameter measurement tool

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20230239T1 (hr) 2023-04-14
JP7539434B2 (ja) 2024-08-23
WO2017075433A1 (en) 2017-05-04
KR102771979B1 (ko) 2025-02-21
US20210277099A1 (en) 2021-09-09
JP2024155943A (ja) 2024-10-31
JP7104624B2 (ja) 2022-07-21
SI3368571T1 (sl) 2023-04-28
EP3368571A4 (en) 2019-11-06
PT3368571T (pt) 2023-01-03
JP2022141761A (ja) 2022-09-29
CN108884155B (zh) 2022-12-06
KR20180092947A (ko) 2018-08-20
CN115960264A (zh) 2023-04-14
HUE061424T2 (hu) 2023-06-28
SMT202300027T1 (it) 2023-05-12
DK3368571T3 (da) 2023-01-23
FI3368571T3 (fi) 2023-02-28
PL3368571T3 (pl) 2023-05-02
LT3368571T (lt) 2023-02-10
EP4169945A1 (en) 2023-04-26
US20180312580A1 (en) 2018-11-01
EP3368571A1 (en) 2018-09-05
EP3368571B1 (en) 2022-12-07
CN108884155A (zh) 2018-11-23
ES2935372T3 (es) 2023-03-06
DK3368571T5 (da) 2024-09-30
US11014980B2 (en) 2021-05-25
JP2019500012A (ja) 2019-01-10
US12590145B2 (en) 2026-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12590145B2 (en) Bi-specific chimeric antigen receptor
US20230372400A1 (en) Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments
AU2023282255B2 (en) Methods and compositions for treating autoimmune and inflammatory conditions
US10167339B2 (en) Antagonistic anti-OX40L antibodies and methods of their use
US20260070970A1 (en) Methods and compositions involving chimeric binding polypeptides
US20150004178A1 (en) Anti-human sema4a antibodies useful to treat disease
HK40091180A (zh) 转化生长因子-β应答多肽及其使用方法