RS64105B1 - Antitela protiv spajk glikoproteina sars-cov-2 i fragmenti za vezivanje antigena - Google Patents

Antitela protiv spajk glikoproteina sars-cov-2 i fragmenti za vezivanje antigena

Info

Publication number
RS64105B1
RS64105B1 RS20230266A RSP20230266A RS64105B1 RS 64105 B1 RS64105 B1 RS 64105B1 RS 20230266 A RS20230266 A RS 20230266A RS P20230266 A RSP20230266 A RS P20230266A RS 64105 B1 RS64105 B1 RS 64105B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cov
antigen
antibody
binding
sars
Prior art date
Application number
RS20230266A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Babb
Alina Baum
Gang Chen
Cindy Gerson
Johanna Hansen
Tammy Huang
Christos Kyratsous
Wen-Yi Lee
Marine Malbec
Andrew Murphy
William Olson
Neil Stahl
George D Yancopoulos
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS64105B1 publication Critical patent/RS64105B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/102—Coronaviridae (F)
    • C07K16/104—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antitela i fragmente koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za spajk proteine koronavirusa i postupke za lečenje ili prevenciju infekcija koronavirusom sa pomenutim antitelima i fragmentima.
STANJE TEHNIKE
[0002] Novoidentifikovane viruse, kao što su koronavirusi, je teško lečiti zbog toga što nisu u dovoljnoj meri okarakterisani. Pojavljivanje ovih novoidentifikovanih virusa naglašava potrebu za razvojem novih antivirusnih strategija. Teški koronavirusni akutni respiratorni sindrom 2 (SARS-CoV-2) je novonastali koronavirus koji uzrokuje tešku akutnu respiratornu bolest, COVID-19. SARS-CoV-2 je prvobitno identifikovan od izbijanja bolesti u Vuhanu, Kini i od 20. marta, 2020. Svetska zdravstvena organizacija je prijavila 209,839 povrđenih slučaja u 168 zemlje, oblasti, ili teritorije, rezultujući sa 8,778 smrti. Kliničke karakteristike COVID-19 uključuju groznicu, suvi kašalj, i zamor, i bolest može uzrokovati repiratornu insuficijenciju koja dovodi do smrti.
[0003] Do sada, ne postoji vakcina ili terapijski agens za prevenciju ili lečenje SARS-CoV-2 infekcije. S obzirom na kontinuiranu pretnju po zdravlje ljudi, postoji urgentna potreba za preventivnim i terapijskim antivirusnim terapijama za kontrolisanje SARS-CoV-2. Zbog toga što ovaj virus koristi njegov spajk (eng. Spike) glikoprotein za interakciju sa ćelijskim receptorom ACE2 i serin proteazu TMPRSS2 za ulazak u ciljnu ćeliju, ovaj spajk protein predstavlja atraktivnu metu za antitela kao terapeutike. Naročito, potpuno humana antitela koja se specifično vežu za SARS-CoV-2-Spajk protein (SARS-CoV-2-S) sa visokim afinitetom i koja inhibiraju infektivnost virusa bi mogla da budu od važnosti za prevenciju i lečenje COVID-19.
[0004] Wang et al (2020) bioRxiv, "A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection" prikazuje unakrsno-neutrališuće antitelo koje cilja zajednički epitop na SARS-CoV-2 i SARS-CoV. Tian et al (2020), Emerging Microbes & Infections, 9, 382-385 prikazuje vezivanje 2019 koronavirusnog spajk proteina sa humanim monoklonskim antitelom specifičnim za SARS koronavirus.
SUŠTINA PRONALASKA
[0005] Postoji potreba za neutrališućim terapijskim antitelima protiv SARS-CoV-2-Spajk proteina (SARS-CoV-2-S) i njihovoj upotrebi za lečenje ili prevenciju virusne infekcije. Ovo izlaganje se bavi ovom potrebom, delom, obezbeđivanjem humanih anitela protiv SARS-CoV-2-S, kao što su ona koja su predstavljena u Tabeli 1, i njihovih kombinacija uključujući, na primer, kombinacije sa drugim terapeuticima (npr., anti-inflamatornim agensima, antimalarijskim agensima, antivirusnim agensima, ili drugim antitelima ili fragmentima koji vezuju antigen), i postupcima njihove upotrebe za lečenje virusnih infekcija.
[0006] Ovo izlaganje obezbeđuje neutrališuće humane antigen-vezujuće proteine koji se vezuju specifično za SARS-CoV-2-S, na primer, antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen.
[0007] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje izolovano rekombinantno antiteo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično veže za spajk protein koronavirusa (CoV-S), pri čemu antitelo ima jednu ili više od sledećih karakteristika: (a) vezivanje za CoV-S sa EC50manjom od oko 10<-9>M; (b) prikazuje povećanje u preživljavaju u životinji koja je inficirana koronavirusom nakon davanja pomenutoj životinji koja inficirana koronavirusom, u poređenju sa uporedivom životinjom koja je inficirana koronavirusom bez pomenutog davanja; i/ili (c) obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDRs) (CDR-H1, CDR-H2, i CDR-H3) koji se nalaze u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar oko 90% identična u sekvenci sa HCVR iz Tabele 1; i tri CDR-a lakog lanca (CDR-L1, CDR-L2, i CDR-L3) koji se nalaze u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar oko 90% identična u sekvenci sa LCVR iz Tabele 1.
[0008] U nekim aspektima izlaganja, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2, i CDR-H3 antitela iz Tabele 1; i/ili (b) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2, i CDR-L3 antitela iz Tabele 1.
[0009] U nekim aspektima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se sastoji iz: (a) varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90% identična u sekvenci aminokiselina sa sekvencom HCVR iz Tabele 1; i/ili (b) varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90% identična u sekvenci aminokiselina sa sekvencom LCVR iz Tabele 1.
[0010] U nekim aspektima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, i CDR-L3 pojedinačnog antitela iz Tabele 1. U nekim aspektima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži imunoglobulin koji se sastoji iz HCVR i LCVR pojedinačnog antitela iz Tabele 1.
[0011] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezeđuje protein koji vezuje antigen koji je u kompeticiji sa bilo kojim od antitela ili fragmentima koji vezuju antigen koji su razmotreni iznad ili ovde za vezivanje sa CoV-S.
[0012] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje protein koji vezuje antigen koji se veže za isti epitop kao, ili za preklapajući epitop na, CoV-S kao bilo koje od antitela ili fragmenata koji se vežu za antigen koji su razmotreni gore ili ovde.
[0013] U bilo kom od različitih izvođenja, antitelo ili fragment koji vezuje antigen može biti multispecifično.
[0014] U bilo kom od različitih aspekata, antitelo ili fragment koji vezuje antigen može sadržati jednu ili više od sledećih osobina: a) inhibiciju rasta koronavirusa; b) vezivanje za površinu koronavirusa; c) ograničavanje širenja koronavirusne infekcije ćelija in vitro; i d) zaštitu miševa koji su izmenjeni da eksprimuju humani ACE2 ili TMPRSS2 protein od smrti i/ili gubitka težine koja je uzrokovana infekcijom koronavirusom.
[0015] U bilo kom od različitih aspekata, CoV-S je SARS-CoV-2-S.
[0016] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje kompleks koji se sastoji iz antitela ili fragmenta koji vezuje antigen kao što je gore razmotreno ili ovde koji je vezan za CoV-S polipepid. U nekim aspektima, CoV-S je SARS-CoV-2-S.
[0017] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje postupak za dobijanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen kao što je gore razmotreno ili ovde, koji obuhvata: (a) uvođenje u ćelije domaćina jednog ili više polinukleotida koji kodira pomenuto antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen; (b) kultivisanje ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za ekspresiju jednog ili više polinukleotida; i (c) opciono, izolovanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen iz ćelije domaćina i/ili medijuma u kome je uzgajana ćelija domaćina. U nekim aspektima, ćelija domaćina je ćelija jajnika kineskog hrčka.
[0018] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je proizvod postupaka koji su gore razmotreni.
[0019] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje polipeptid koji se sastoji iz: (a) CDR-H1, CDR-H2, i CDR-H3 domena HCVR antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu HCVR koja je predstavljena u Tabeli 1; ili (b) CDR-L1, CDR-L2, i CDR-L3 domena LCVR imunoglobulinskog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu LCVR koja je predstavljena u Tabeli 1.
[0020] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje polipeptid koji kodira polipeptid koji se razmatra gore u tekstu.
[0021] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje vektor koji sadrži polinukleotid koji se razmatra gore u tekstu.
[0022] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili polipeptid ili polinukleotid ili vektor kao što je razmotreno gore ili ovde.
[0023] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje kompoziciju ili kit koji sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji su razmotreni gore u tekstu ili ovde zajedno sa drugim terapijskim agensom.
[0024] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač i, opciono, drugi terapijski agens. U nekim izvođenjima, drugi terapeutski agens je anti-virusni lek ili vakcina. U nekim izvođenjima, drugi terapijski agens je izabran iz grupe koja se sastoji iz: anti-inflamatornog agensa, antimalarijskog agensa, antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen koji specifično veže TMPRSS2, i antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen koji se specifično veže za CoV-S. U nekim slučajima, antimalarijski agens je hlorokin ili hidroksihlorokin. U nekim slučajima, anti-inflamatorni agens je antitelo, kao što je sarilumab, tocilizumab, ili gimsilumab. U nekim izvođenjima, drugi terapetuski agens je drugo antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se sastoji iz HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, i LCDR3 sekvenci kao što je predstavljeno u Tabeli 1.
[0025] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje nosač ili uređaj za injekciju koji se sastoji iz proteina koji se vezuje za antigen, antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, ili kompozicije kao što je razmotreno ovde ili gore.
[0026] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju koronavirusne infekcije, kod subjekta kome je potrebno, koji obuhvata davanje terapijski efikasne količine proteina koji se vezuje za antigen, antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen kao što je razmotreno gore ili ovde. U nekim aspektima, koronavirus je odabran iz grupe koja se sastoji iz SARS-CoV-2, SARS-CoV, i MERS-CoV.
[0027] U nekim aspektima postupka za lečenje ili prevenciju infekcije koronavirusom, subjektu su davani jedan ili više drugih terapijskih agenasa. U nekim slučajima, jedan ili više drugih terapijskih agenasa je anti-virusni lek ili vakcina. U nekim slučajima, jedan ili više drugih terapijskih agenasa je odabran iz grupe koja se sastoji iz: anti-inflamatornog agensa, antimalarijskog agensa, antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen koji specifično veže TMPRSS2, i antitela ili njegovog fragmenta koji se specifično veže za CoV-S. U nekim slučajima, antimalarijski agens je hlorokin ili hidroksihlorokin. U nekim slučajima, anti-inflamatorni agens je antitelo, kao što je na primer, sarilumab, tocilizumab, ili gimsilumab. U nekim aspektima, drugi terapijski angens je drugo antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se sastoji iz HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, i LCDR3 sekvenci iz Tabele 1. Druga antitela koja se mogu koristiti pojedinačno ili u kombinaciji jedan sa drugim ili sa jednim ili više od ovde prikazanih antitela za upotrebu u kontekstu postupaka ovog izlaganja uključuju, npr., LY-CoV555 (Eli Lilly); 47D11 (Wang et al Nature Communications Article No. 2251); B38, H4, B5 i/ili H2 (Wu et al., 10.1126/science.abc2241 (2020); STI-1499 (Sorrento Therapeutics); VIR-7831 i VIR-7832 (Vir Biotherapeutics).
[0028] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje postupak za davanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji su gore razmotreni ili ovde u telo subjekta koji obuhvata injekciju antitela ili fragmenta koji vezuje antigen u telo subjekta. U nekim aspektima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen je davan injekcijom subkutano, intravenozno ili intramuskularno u telo subjekta.
[0029] U bilo kom od različitih aspekata koji su razmotreni gore ili ovde, antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži VH3-66 ili Vk1-33 sekvencu varijabilnog domena.
[0030] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se veže za SARS-CoV-2 spajk protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 832, pri čemu pomenuto izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDRs) (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 202, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (CDRs) (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 210.
[0031] U nekim aspektima, HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 204, i HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 206, i HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 208, LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 212, LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 55, i LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 214. U nekim aspektima, izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 202. U nekim aspektima, izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 210. U jednom izvođenju iz pronalaska, izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 202 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 210.
[0032] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje izolovano antitelo koje vezuje SARS-CoV-2 spajk protein koje se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 832, pri čemu pomenuto izolovano antitelo sadrži konstantni region imunoglobulina, tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDRs) (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i koji se nalaze u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 202, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (CDRs) (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 210.
[0033] U nekim aspektima, HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 204, HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 206, HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 208, LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 212, i LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 55, i LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 214. U jednom izvođenju, izolovano antitelo sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 202 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 210. U nekim izvođenjima, izolovano antitelo sadrži težak lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 216 i laki lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 218. U nekim slučajima, konstantni region imunoglobulina je konstantni region IgG1. U nekim slučajima, izolovano antitelo je rekombinantno antitelo. U nekim slučajima, izolovano antitelo je multispecifično.
[0034] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo iz pronalaska, kao što je gore razmotreno, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
[0035] U nekim izvođenjima, farmaceutska kompozicija dalje sadrži drugi terapijski agens. U nekim slučajima, drugi terapijski agens je odabran iz grupe koja sadrži: drugo antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se veže za SARS-CoV-2 spajk protein koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 832, anti-inflamatorni agens, antimalarijski agens, i antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se veže za TMPRSS2.
[0036] U nekim izvođenjima, drugi terapijski agens je drugo antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se veže za SARS-CoV-2 spajk protein koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 832. U nekim slučajima, drugo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži CDR-a teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se nalaze u HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 640, i tri CDR-a lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se nalaze u LCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 646. U nekim slučajima, drugo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži: HCDR1, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 642; HCDR2, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 499; HCDR3, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 644; LCDR1, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 648; LCDR2, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO: 650; i LCDR3, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 652. U nekim slučajima, drugo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 640 i LCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 646. U nekim slučajima, drugo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži težak lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 654 i laki lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 656.
[0037] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji veže SARS-CoV-2 spajk protein koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 832, pri čemu pomenuto izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDRs) (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se nalazi u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 640, i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (CDRs) (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 646.
[0038] U nekim aspektima, HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 642, HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 499, HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 644, LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 648, LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 650, i LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 652. U nekim aspektima, izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 640. U nekim aspektima, izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži LCVR koji sadrži sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 646. U jednom izvođenju iz pronalaska, izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 640 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 646.
[0039] U jednom aspektu, ovo izlaganje obezbeđuje izolovano antitelo koje veže SARS-CoV-2 spajk protein koje se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 832, pri čemu pomenuto izolovano antitelo sadrži konstantni region imunoglobulina, tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDRs) (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 640, I tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (CDRs) (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se nalaze u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 646.
[0040] U nekim aspektima, HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana SEQ ID NO: 642, HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana SEQ ID NO: 499, HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana SEQ ID NO: 644, LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana SEQ ID NO: 648, LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 650, i LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 652. U jednom izvođenju, izolovano antitelo sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 640 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 646. U nekim izvođenjima, izolovano antitelo sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 654 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 656. U nekim slučajevima, konstantni region imunoglobulina je konstantni region IgG1. U nekim slučajima, izolovano antitelo je rekombinantno antitelo. U nekim slučajima, izolovano antitelo je multispecifično.
[0041] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji iz izolovanog antitela iz pronalaska, kao što je gore razmotreno, i farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača.
[0042] U nekim izvođenjima, farmaceutska kompozicija dalje sadrži drugi terapijski agens. U nekim slučajevima, drugi terapijski agens je odabran iz grupe koja se sastoji iz: drugog antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji se veže za SARS-CoV-2 spajk protein koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 832, anti-inflamatornog agensa, antimalarijskog agensa, i antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen koji veže TMPRSS2.
[0043] U nekim izvođenjima, drugi terapijski agens je drugo antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji veže SARS-CoV-2 spajk protein koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 832. U nekim slučajevima, drugo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži tri CDR-a teškog lanca (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) koji se nalaze u HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 202, i tri CDR-a lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) koji se nalaze u LCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 210. U nekim slučajevima, drugo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži: HCDR1, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 204; HCDR2, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 206; HCDR3, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 208 LCDR1, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 212; LCDR2, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 55; i LCDR3, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 214. U nekim slučajevima, drugo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 202 i LCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 210. U nekim slučajevima, drugo antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži težak lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 216 i laki lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana a u SEQ ID NO: 218. Bilo koja pozivanja u opisu na postupke lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekovi iz predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).
KRATAK OPIS NACRTA
[0044]
Slika 1 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 2 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv-SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 3 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv-SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 4 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 5 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 6 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 7 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 8 prikazuje podatke ELISA blokiranja za odabrana antitela protiv SARS-CoV-2-S protiv SARS-CoV-2 spajk proteina, sprečavajući vezivanje spajk proteina za njegov receptor ACE2.
Slika 9A i Slika 9B predstavljaju učestalosti V gena za uparene Težak (X-osa) i Laki (Y-osa) lance izolovanih neutrališućih antitela na SARS-CoV-2 za VelocImmune<®>miševe (Slika 9A; N=185) i konvalescentne humane donore (Slika 9B; N=68). Zasenčenost i veličina krugova odgovara broju parova Teškog i Lakog lanca prisutnih u repertoaru izolovanih neutrališućih antitela. Neutralizacija je definisana kao >70% sa 1:4 razblaženjem antitela (~2 µg/ml) u testu neutralizacije VSV pseudočestice.
Slika 10A i Slika 10B predstavljaju potenciju neutralizacije. Slika 10A predstavlja potenciju neutralizacije anti-SARS-CoV-2 Spajk mAt-a. Serijska razblaženja anti-Spajk mAt-a, IgG1 izotip kontrole, i rekombinantnog dimera ACE2 (hACE2.hFc) su dodata sa pVSV-SARS-CoV-2-S-mNeon u Vero ćelije i ekspresija mNeon je merena 24 h posle infekcije kao očitavanje za infektivnost virusa. Podaci su prikazani grafički kao procenat neutralizacije u odnosu na kontrolu infekcije samo virusom. Slika 10B predstavlja potenciju neutralizacije pojedinačnih anti-Spajk mAt-a i kombinacija mAt-a protiv SARS-CoV-2-S virusa u VeroE6 ćelijama.
Slika 11 prikazuje analizu bina epitopa iz matriksa pre-miksa testa vezivanja za različita anti-SARS-CoV-2 mAt-a. Binovanje epitopa je sprovedeno protiv devet anti-SARS-CoV-2 mAt-a kao što je opisano. Postoje tri faze (I, II, i III) za svaki grafik. U fazi I anti-SARS-CoV-2 mAt (20ug/ml) je naneto na anti-humanu Fc probu. U fazi II rastvor humanog IgG1 blokirajućeg mAt-a (100ug/ml). U fazi III rastvor 100nM SARS CoV-2 RBD-MMH pre-miksa kompleksa od svakog 600 nM anti-SARS-CoV-2 mAt mesta vezivanja protekao je preko probe mAt za hvatanje.
Slika 12 prikazuje 3D površinki model za strukturu RBD domena Spajk proteina koji prikazuje ACE2 interfejs i rezulate mapiranja HDX-MS epitopa. Ostaci RBD su zaštićeni sa anti-SARS-CoV2-Spajk antitelima su naznačeni zasenčivanjem koje predstavlja stepen zaštite kao što je određeno sa HDX-MS eksperimentima. Struktura RBD je reprodukovana iz PDB 6M17.
Slika 13A i Slika 13B prikazuje kompleks mAt10933 i mAt10987 sa SARS-CoV-2 RBD. Slika 13A prikazuje 3.9 Å krioEM mapu kompleksa mAt10933 RBD mAt10987, koji je zasenčen prema lancima u prerađenom modelu na Slici 13B.RBD, teški i laki lanci mAt10933, i tešak i laki lanac mAt10987 su identifikovani.
Slika 14 prikazuje krioEM statističke podatke. Prikupljanje i obrada statističkih podataka su prijavljeni za strukturu mAt10987 mAt10933 SARS-CoV-2 RBD kompleksa koja je prikazana na Slici 13A i Slici 13B.
DEALJAN OPIS PRONALASKA
[0045] Pre nego što su ovi postupci opisani, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen određenim postupcima, i opisanim eksperimentalnim uslovima, jer se takvi postupci i uslovi mogu razlikovati. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija je za svrhu opisivanja samo određenog izvođenja, i nije namenjena da bude ograničavajuća, s obzirom na to da će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo pripadajućim patentnim zahtevima.
[0046] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što je obično jasno stručnjaku iz oblasti tehnike kojoj ovaj pronalazak i pripada. Iako bilo koji postupci i materijali slični ili evivalentni sa onima koji su ovde opisani mogu se koristiti u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska, poželjni postupci i materijali su sada opisani.
[0047] Termin "koronavirus" ili "CoV" se odnosi na bilo koji virus iz koronavirusne familije, uključujući ali nije ograničeno na SARS-CoV-2, MERS-CoV, i SARS-CoV. SARS-CoV-2 se odnosi na novonastali koronavirus koji je identifikovan uzročnik ozbiljne epidemije koja počinje u Vuhanu, Kina, i koja se brzo proširila na druge oblasti širom planete. SARS-CoV-2 je takođe poznat pod imenom 2019-nCoV i Vuhanski koronavirus. Veže se preko virusnog spajk proteina za receptor angiotenzin-konvertujući enzim 2 (ACE2) ćelija humanog domaćina. Protein spajk takođe se veže za i cepa od strane TMPRSS2, koji aktivira protein spajk za fuziju virusa sa membranom.
[0048] Termin "CoV-S", takođe podznat pod "S" ili "S protein" se odnosi na spajk protein koronavirusa, i može se odnositi na specifične S proteine kao što su SARS-CoV-2-S, MERS-CoV S, i SARS-CoV S. SARS-CoV-2-Spajk protein je 1273 aminokiselina tip I membranski glikoprotein koji se sklapa u trimere koji čine spajkove ili peplomere na površini omotača koronavirusne čestice. Protein ima dve suštinske funkcije, vezivanje za receptor domaćina i fuziju sa membranom, koji se prepisuju N-terminalnim (S1) i C-terminalnim (S2) polovinama S proteina. CoV-S se veže za njegov srodni receptor preko receptor vezujućeg domena (eng. receptor binding domain) (RBD) koji se nalazi u podjedinici S1. Amiokiselinska sekvenca pune dužine SARS-CoV-2 spajk proteina je predstavljena primerom aminokiselinske sekvence koja je obezbeđena u SEQ ID NO: 832. Termin "CoV-S" uključuje varijante proteina CoV spajk proteina koji su izolovani iz različitih CoV izolata kao i rekombinantni CoV spajk protein ili njegov fragment. Termin takođe obuhvata CoV spajk protein ili njegov fragment koji je spojen sa, na primer, histidinskim tag-om, mišjim ili humanim Fc, ili signalnom sekvencom kao što je ROR1.
[0049] Termin "infekcija koronavirusom" ili "CoV infekcija," kao što je ovde korišćen, se odnosi na infekciju sa koronavirusom kao što je SARS-CoV-2, MERS-CoV, ili SARS-CoV. Termin uključuje koronavirusne infekcije respiratornog trakta, često u nižem delu respiratornog trakta. Simptomi mogu uključiti groznicu, suvi kašalj, kratak dah, pneumoniju, gastro-intestinalne simptome kao što je dijareja, prestanak rada organa (insuficijencija bubrega i disfunkcija bubrega), septički šok, i smrt kod teških slučaja.
Virusi
[0050] Predmetni pronalazak se odnosi na postupke za lečenje ili prevenciju virusne infekcije kod subjekta. Termin "virus" uključuje bilo koji virus čija se infekcija u telu subjekta može lečiti ili se može izvršiti prevencija davanjem anti-CoV-S antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen (npr., pri čemu je infektivnost virusa bar delom zavisna od CoV-S). U aspektu iz prikaza, "virus" je bilo koji virus koji eksprimira spajk protein (npr., CoV-S). Termin "virus" takođe uključuje CoV-S-zavisni respiratorni virus koji je virus koji inficira respiratorno tkivo subjekta (npr., gornji i/ili donji respiratorni trakt, traheja, bronhije, pluća) i može se lečiti ili se može izvršiti prevencija davanjem anti-CoV-S antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. Na primer, u aspektu iz prikaza, virus uključuje koronavirus, SARS-CoV-2 (teški akutni respiratorni koronavirusni sindrom 2), SARS-CoV (teški akutni respiratorni koronavirusni sindrom), i MERS-CoV (srednje istočni respitratorni koronavirusni sindrom (MERS)). Koronavirusi mogu uključiti rod alfakoronavirusa, betakoronavirusa, gamakoronavirusa, i deltakoronavirusa. U nekim aspektima, antitela ili ovde obezbeđeni fragmenti koji vezuju antigen mogu se vezati za i/ili neutralizovati alfakoronavirus, betakoronavirus, gamakoronavirus, i/ili deltakoronavirus. U određenim aspektima, ovo vezivanje i/ili neutralizacija može biti specifična za za određeni rod koronavirusa ili za određenu podgrupu roda. "Virusna infekcija" se odnosi na invaziju i multiplikaciju virusa u telu subjekta.
[0051] Virioni koronavirusa su sferični sa prečnicima od približno 125 nm. Najistaknutija osobina koronavirusa su projekcije spajka u obliku štapa koji proizilaze sa površine viriona. Ovi spajkovi su karakteristike koje definišu virion i omogućuju mu izgled solarne korone, od čega proističe ime, koronavirusi. U omotaču viriona se nalazi nukleokapsid. Koronavirusi imaju spiralno simetrične nukleokapside, koji nisu uobičajeni kod pozitivnih-sens RNK virusa, ali je daleko češće za negativnesens RNK viruse. SARS-CoV-2, MERS-CoV, i SARS-CoV pripadaju familiji koronavirusa. Početno vezivanje viriona za ćeliju domaćina je inicirano interakcijama između S proteina i njegovog receptora. Mesta domena za vezivanje receptora (RBD) unutar regiona S1 proteina S koronavirusa se razlikuje u zavisnosti od virusa, pri čemu neki imaju RBD na C-terminusu S1. Interakcija protein S /receptor je primarna determinanta za koronavirus da inficira vrste domaćina i takođe reguliše tkivni tropizam virusa. Mnogi koronavirusi koriste peptidaze kao njihov receptor na ćelijama. Nakon vezivanja za receptor, virus mora nakon toga steći pristup u citoplazmu ćelije domaćina. Ovo se generalno postiže kiselinski zavisnim proteolitičkim cepanjem S proteina od strane katepsina, TMPRRS2 ili drugom proteazom, koje prati spajanje virusnih i ćelijskih membrana.
Antitela protiv-CoV-S i fragmenti koji vezuju antigen
[0052] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, kao što je definisano u pratentnim zahtevima, koji se specifično vežu za CoV spajk protein ili njegov antigenski fragment.
[0053] Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, odnosi se na molekule imunoglobulina koji se sastoje iz četiri polipeptidna lanca, dva teška lanca (HCs) i dva laka lanca (LCs) međusobno povezana disulfidnim vezama (tj., "puni molekuli antitela"), kao i njihovi multimeri (npr. IgM). Primeri antitela
1
uključuju, na primer, one koji su navedeni u Tabeli 1. Svaki težak lanac sadrži varijabilni region teškog lanca ("HCVR" ili "VH") i konstantni region teškog lanca (koji se sastoji iz domena CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac se sastoji iz varijabilnog regiona lakog lanca ("LCVR ili "VL") i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Regioni VHi VLse dalje mogu dodatno podeliti u regione hipervarijabilnosti, koji su poznati pod imenom regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), koji su rasejani između regiona koij su konzerviraniji, poznati pod imenom regioni okvira (FR). Svaki VHi VLsadrži tri CDRs i četiri FRs, koja su preuređena od amino-terminusa ka karboksi-terminusu u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR-i teškog lanca mogu takođe biti označeni kao HCDR-i ili CDR-Hs, i numerisani kao što je gore opisano (npr., HCDR1, HCDR2, i HCDR3 ili CDR-H1, CDR-H2, i CDR-H3). Slično tome, CDR-i lakog lanca mogu biti označeni sa LCDR-i ili CDR-L-i, i numerisani sa LCDR1, LCDR2, i LCDR3, ili CDR-L1, CDR-L2, i CDR-L3. U određenim aspektima prikaza, FR-i antitela (ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen) su identični sa humanim germinativnim sekvencama, ili su prirodno ili veštački modifikovane. Primeri humanih germinativnih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, VH3-66 i Vk1-33. Prema tome, ovo izlaganje obezbeđuje anti-CoV-S antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen (npr., anti-SARS-CoV-2-S antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen) koji se sastoje iz HCDR i LCDR sekvenci iz Tabele 1 unutar VH3-66 ili Vk1-33 regiona varijabilnog teškog lanca ili lakog lanca. Ovo izlaganje dalje obezbeđuje anti-CoV-S antitela ili njegove fragmente za vezivanje antigena (npr., anti-SARS-CoV-2-S antitela ili njihove fragmente za vezivanje antigena) koji se sastoje iz HCDR i LCDR sekvenci iz Tabele 1 u kombinaciji lakog lanca koji je odabran iz IgKV4-1, IgKV 1-5, IgKV1-9, IgKV1-12, IgKV3-15, IgKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, IgKV2-24, IgKV1-33, IgKV1-39, IgLV1-40, IgLV1-44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2-8, IgKV3-11, IgLV2-11, IgLV2-14, IgLV2-23, ili IgLV6-57, i teškog lanca koji je izabran iz IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, IgHV3-53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, IgHV3-15, IgHV3-11, IgHV3-9, IgHV1-8, IgHV3-7, IgHV2-5, IgHV1-2, IgHV2-70, IgHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, IgHV4-39, IgHV4-31, IgHV3-30-3, IgHV2-26, ili IgHV7-4-1. Ovo izlaganje dalje obezbeđuje anti-CoV-S antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen (npr., anti-SARS-CoV-2-S antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen) koji se sastoje iz HCVR i LCVR sekvenci iz Tabele 1 u kombinaciji sa lakim lancem koji je odabran iz IgKV4-1, IgKV 1-5, IgKV1-9, IgKV1-12, IgKV3-15, IgKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, IgKV2-24, IgKV1-33, IgKV1-39, IgLV1-40, IgLV1-44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2-8, IgKV3-11, IgLV2-11, IgLV2-14, IgLV2-23, ili IgLV6-57, i teškog lanca koji je odabran od IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, IgHV3-53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, IgHV3-15, IgHV3-11, IgHV3-9, IgHV1-8, IgHV3-7, IgHV2-5, IgHV1-2, IgHV2-70, IgHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, IgHV4-39, IgHV4-31, IgHV3-30-3, IgHV2-26, ili IgHV7-4-1.
[0054] Uobičajeno, varijabilni domeni teških i lakih lanaca imunoglobulina sadrže tri hipervarijabilna regiona, koji su takođe poznati pod imenom regioni koji određuju komplementarnost (CDR-i), koji su locirani u relativno konzerviranim regionima okvira (FR). Generalno, od N-terminusa ka C-terminusu, varijabilni domeni i lakih i teških lanaca se sastoje iz FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. U aspektu iz prikaza, dodeljivanje aminokiselina u svaki domen je u skladu sa definicijama Sekvenci proteina od imunološkog interesa, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem.
252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 ili Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.
[0055] Ovo izlaganje uključuje monoklonalne anti-CoV-S antigen-vezujuće proteine, npr., antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, kao i monoklonalne kompozicije koje se sastoje iz mnoštva izolovanih monoklonalnih antigen-vezujućih proteina. Termin "monoklonalno antitelo", kao što se ovde koristi, odnosi se na populaciju suštinski homogenih antitela, tj., molekula antitela koji su obuhvaćeni populacijom su identični u sekvenci aminokiseline izuzev za moguće mutacije koje se dešavaju prirodno koje mogu biti prisutne u manjim količinama. "Mnoštvo" takvih monoklonskih antitela i fragmenata u kompoziciji se odnosi na koncentraciju identične (tj., kao što je gore razmotreno, u aminokiselinskoj sekvenci osim za moguće mutacije koje se pojavljuju u prirodi koje mogu biti prisutne u manjoj količini) antitela i fragmenata što je iznad onog koji bi mogao da se prirodno pojavi u prirodi, npr., u krvi ćelija domaćina kao što je miš ili humano biće.
[0056] U izvođenju iz pronalaska, anti-CoV-S antigen-vezujući protein, tj. antitelo ili fragment antitela koji vezuje antigen sadrži konstantni domen teškog lanca, npr., tipa IgA (npr., IgA1 ili IgA2), IgD, IgE, IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) ili IgM. U izvođenju iz pronalaska, antigen-vezujući protein, tj., antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži konstantni domen lakog lanca, npr., tipa kapa ili lambda.
[0057] Termin "humani" antigen-vezujući protein, kao što je antitelo, kao što se ovde koristi, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstane regione koji su izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci bilo u humanoj ćeliji ili su transplantirane na ne-humanu ćeliju, npr., ćeliju miša. Videti npr., US8502018, US6596541 ili US5789215. Humana mAt-a iz pronalaska mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sa humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije koje su uvedene slučajnom ili mutagenezom koja je specifična za mesto in vitro ili somatoskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-a i, posebno, CDR3. Međutim, termin "humano antitelo", kao što se ovde koristi, nije namenjen da uključi mAt-a u kojima su sekvence CDR-a izvedene iz germinativnih drugih sisarskih vrsta (npr., miša) koji su transplantirani na sekvence humanog FR. Termin uključuje rekombinantno proizvedena antitela u ne-humanom sisaru ili u ćelijama ne-humanog sisara. Termin nije namenjen da uključi antitela koja su izolovana iz ili su dobijena u humanom subjektu. Videti ispod.
[0058] Predmetni pronalazak uključuje anti-CoV-S himerna antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, i postupke za njihovu upotrebu. Kao što se ovde koristi, "himerno antitelo" je antitelo koje ima varijabilni domen iz prvog antitela i konstantni domen iz drugog antitela, pri čemu su prvo i drugo antitelo iz različitih vrsta. (US4816567; i Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
[0059] Ovaj pronalazak uključuje anti-CoV-S hibridna antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, i postupke za njihovu upotrebu. Kao što se ovde koristi, "hibridno antitelo" je antitelo koje ima varijabilni domen iz prvog antitela i konstantni domen iz drugog antitela, pri čemu su prvo i drugo antitelo iz različitih životinja, ili gde varijabilni domen, ali ne konstantni region, je iz prve životinje. Na primer, varijabilni domen se može uzeti iz antitela koje je izolovano iz humanog bića i eksprimirano je sa fiksiranim konstantnim regionom koji nije izolovan iz tog antitela. Primeri hibridnih antitela su opisani u Primeru 1, koji se odnosi na varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca izvedeni PCR proizvodi koji su klonirani u ekspresione vektore koji sadrže konstantni region teškog lanca i konstantni region lakog, redom. Hibridna antitela su sintetička i ne pojavljuju se u prirodi zbog toga što varijabilni i konstantni regioni koji oni sadrže nisu izolovani iz pojedinačnog prirodnog izvora.
[0060] Termin "rekombinantni" antigen-vezujući proteini, kao što su antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, se odnosi na takve molekule koji su dobijeni, eksprimovani, izolovani ili dobijeni upotrebom tehnologija ili postupaka koji su poznati u oblasti tehnike kao tehnologija rekombinantne DNK koja uključuje, npr., spajanje DNK i ekspresiju transgena. Termin uključuje antitela koja su eksprimovana u ne-humanom sisaru (uključujući transgene ne-humane sisare, npr., transgene miševe), ili ćelijski (npr., CHO ćelije) sistem za ekspresiju, ili ne-humani ćelijski ekspresioni sistem, ili izolovan iz rekombinantne kombinatorne biblioteke humanog antitela. U nekim izvođenjima, rekombinantno antitelo deli sekvencom koja je izolovana iz organizma (npr., miša ili humanog bića), ali je eksprimovana pomoću tehnologije rekombinantne DNK. Takva antitela mogu sadržati posttranslacione modifikacije (npr., glikozilacija) čime se razlikuju od antitela kao što je izolovano iz organizma.
[0061] Rekombinantni anti-CoV-S antigen-vezujući proteini, npr., antitela i fragmenti koji vezuju antigen, koji su ovde prikazani mogu se takođe proizvesti u E. coli/T7 ekspresionom sistemu. U ovom aspektu, nukleinske kiseline koje kodiraju molekule imunoglobulina anti-CoV-S antitela iz prikaza (npr., kao što se može videti u Tabeli 1) mogu se insertovati u pET-zasnovani plazmid i eksprimirati u sistemu E. coli/T7. Na primer, ovo izlaganje uključuje postupke ekspresije antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ili njegovog imunoglobulinskog lanca u ćeliji domaćina (npr., bakterijskoj ćeliji domaćina kao što je E. coli kao što je BL21 ili BL21DE3) koji obuvata ekspresiju T7 RNK polimeraze u ćeliji što takođe uključuje polinukleotid koji kodira lanac imunoglobulina koji je operativno u vezi sa promotorom T7. Na primer, u aspektu iz prikaza, bakterijska ćelija domaćina, kao što je E. coli, uključuje polinukleotid koji kodira gen za T7 RNK polimerazu operativno u vezi sa lac promotorom i ekspresiju polimeraze i lanca je indukovana inkubacijom ćelije domaćina sa IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozidom). Videti US4952496 i US5693489 ili Studier & Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 1986 May 5;189(1): 113-30.
[0062] Postoji nekoliko postupaka kojima se proizvode rekombinantna antitela koja su poznata u oblasti tehnike. Jedan primer postupka za rekombinantnu proizvodnju antitela je prikazan u US4816567.
[0063] Transformacija se može izvesti pomoću bilo kog poznatog postupka za uvođenje polinukleotida (npr., DNK ili RNK, uključujući iRNK) u ćeliju domaćina. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznati u oblasti tehnike i uključuju transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, spajanje protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotid(a) u lipozomima, tehnologiju lipidnih nanočetica, biolističko ubrizgavanje i diretno mikroinjektiranje DNK u nukleuse. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline se mogu uvesti u sisarske ćelije korišćenjem virusnih vektora kao što su lentivirusi ili adenopovezani virus. Postupci transformisanja ćelija su dobro poznati u oblasti tehike. Videti, na primer, U.S. Pat. Nos.4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 i 4,959,455. U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema ovom izlaganju može se uvesti u subjekt u obliku nukleinske kiseline (npr, DNK ili RNK, uključujući iRNK), tako da sopstvene ćelije subjekta proizvode antitelo. Ovo izlaganje dalje obezbeđuje modifikacije na sekvence nukleotida koje kodiraju ovde opisana anti-CoV-S antitela koja rezultuju u povećanoj ekspresiji antitela, povećanoj stabilnosti antitela, povećanoj stabilnosti nukleinske kiseline (npr., iRNK), ili unapređenom afinitetu ili specifičnosti antitela za CoV spajk protein.
[0064] Prema tome, ovo izlaganje obuhvata rekombinantne postupke za dobijanje anti-CoV-S antigenvezujućeg proteina, kao što je antitelo ili njegov fragment koji veže antigen iz ovog izlaganja, ili njegov lanac imunoglogulina, koji sadrži (i) uvođenje jednog ili više polinukleotida (npr., uključujući sekvencu nukleotida prema bilo kojoj ili više sekvenci iz Tabele 2) koja kodira lake i/ili teške lance imunoglobulina, ili CDR-e, antigen-vezujućeg proteina, npr., iz Tabele 1, na primer, pri čemu je polinukleotid u vektoru; i/ili je integrisan u hromozom ćelije domaćina i/ili je operativno u vezi sa promotorom; (ii) kultivisanje ćelije domaćina (npr., CHO ili Pichia ili Pichia pastoris) u uslovima koji su povoljni za ekspresiju polinukleotida i, (iii) opciono, izolovanje antigen-vezujućeg proteina, (npr., antitela ili fragmenta) ili lanca iz ćelije domaćina i/ili medijum u kome je ćelija domaćina uzgajana. Na primer, polinukleotid može biti integrisan u hromozom ćelije domaćina putem ciljane insercije sa vektorom kao što je adeno-povezani virus (AAV), npr., nakon cepanja hromozoma korišćenjem sistema za editovanje gena (npr., CRISPR (na primer, CRISPR-Cas9), TALEN, megaTAL, cinkani prsti, ili Argonaut). Ciljane insercije se mogu desiti, na primer, u lokusima ćelije domaćina kao što su lokusi
1
genoma za albumin ili imunoglobulin. Alternativno, insercija može biti na slučajnom lokusu, npr., upotrebom vektora kao što je lentivirus. Kada se pravi antigen-vezujući protein (npr., antitelo ili antigen-vezujući fragment) koji se sastoji iz jednog ili više od jednog lanca imunoglobulina, npr., antitelo koje sadrži dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina, zajedničku ekspresiju lanaca u pojedinačnoj ćeliji dovodi do udruživanja lanaca, npr., u ćeliji ili na ćelijskoj površini ili izvan ćelije ukoliko dolazi do lučenja takvih lanaca, tako da se obrazuje antigen-vezujući protein (npr., antitelo ili fragment za vezivanje antigena). Postupci uključuju one postupe u kojima je eksprimiran samo težak lanac imunoglobulina ili samo laki lanac imunoglobulina (npr., bilo koji od ovde razmotrenih uključujući zrele fragmente i/ili njihove varijabilne domene). Takvi lanci su korisni, na primer, kao intermedijeri u ekspresiji antitela ili fragmenta koji vezuje antigen koji uključuje taj lanac. Na primer, ovo izlaganje takođe uključuje anti-CoV-S antigen-vezujuće proteine, kao što su antitela i njihovi fragmenti za vezivanje antigena, koji se sastoje iz teškog lanca imunoglobulina (ili njegovog varijabilnog domena ili se sastoje iz njegovih CDR-a) koji su kodirani od strane polinukleotida koji se sastoji iz sekvence nukleotida koja je predstavljena u Tabeli 2 i lakog lanca imunoglobulina (ili njegovog varijabilnog domena ili se sastoje iz njegovih CDR-a) koji su kodirani od strane nukleotidne sekvence koja je predstavljena u Tabeli 2 koji su proizvod takvih postupaka proizvodnje, i, opciono, postupaka za prečišćavanje kao što je ovde predstavljeno. Na primer, u nekim aspektima, proizvod postupka je anti-CoV-S antigen-vezujući protein koji je antitelo ili fragment koji se sastoji iz HCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u Tabeli 1 i LCVR koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u Tabeli 1, pri čemu sekvence HCVR i LCVR su odabrane iz pojedinačnog antitela koje je navedeno u Tabeli 1. U nekim aspektima, proizvod iz postupka je anti-CoV-S antigen-vezujući protein koji je antitelo ili fragment koji se sastoji iz HCDR1, HCDR2, i HCDR3 koji sadrži sekvence aminokiselina koje su prikazane u Tabeli 1 i LCDR1, LCDR2, i LCDR3 koji sadrži sekvence aminokiselina koje su prikazane u Tabeli 1, pri čemu šest sekvenci CDR su odabrane iz pojedinačnog antitela koje je navedeno u Tabeli 1. U nekim aspektima, proizvod iz postupka je anti-CoV-S antigen-vezujući protein koji je antitelo ili fragment koji se sastoji iz teškog lanca koji sadrži HC sekvencu aminokiselina koja je prikazana u Tabeli 1 i laki lanac koji sadrži LC sekvencu aminokiselina koja je prikazana u Tabeli 1.
[0065] Eukariotske i prokariotske ćelije domaćini, uključujući sisarske ćelije, mogu se koristiti kao domaćini za ekspresiju anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina. Takve ćelije domaćini su dobro poznate u oblasti tehnike i mnogi su dostupni iz američke kolekcije vrsta tkiva (eng. American Type Culture Collection) (ATCC). Ove ćelije domaćina uključuju, između ostalog, ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), NS0, SP2 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije, 3T3 ćelije, HEK-293 ćelije i brojne druge ćelijske linije. Sisarske ćelije domaćina uključuju ćelije čoveka, miša, pacova, psa, majmuna, svinje, koze, goveda, konja i hrčka. Druge ćelijske linije koje se mogu koristiti su ćelijske linije insekta (npr., Spodoptera frugiperda or Trichoplusiani), ćelije vodozemaca, bakterijske ćelije, biljne ćelije i ćelije gljiva. Ćelije gljiva uključuju ćelije kvasca i ćelije filamentoznih gljiva uključujući, na primer, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens i Neurospora crassa. Ovo izlaganje uključuje izolovanu ćeliju domaćina (npr., CHO ćeliju) koja se sastoji iz antigen-vezujućeg proteina, kao što su oni iz Tabele 1; ili polinukleotid koji kodira takav njegov polipeptid.
[0066] Termin "specifično vezuje" se odnosi na one antigen-vezujuće proteine (npr., mAt-a) sa afinitetom vezivanja za antigen, kao što je CoV-S protein (npr., SARS-CoV-2-S), izraženim kao KD, od najmanje oko 10<-8>M, kao što je mereno u realnom vremenu, oslobođenom od obeleživača bio-slojnim interferometrijskim testom, na primer, na 25°C ili 37°C, npr., Octet<®>HTX biosenzor, ili sa površinskom plazmonskom rezonancijom, npr., BIACORE<™>, ili sa ELISA sa afinitetom prema rastvoru. Ovo izlaganje uključuje antigen-vezujuće proteine koji se specifično vežu za CoV-S protein.
[0067] Termini "deo koji vezuje antigen" ili "fragment koji vezuje antigen" antitela ili antigenvezujućeg proteina, i slično, kao što je ovde korišćeno, uključuje bilo koji koji se pojavljuje u prirodi, koji se može dobiti enzimski, sintetički, ili genetički modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji specifično veže antigen da bi se obrazovao kompleks. Ne-ograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAt fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje iz ostataka aminokiselina koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi modifikovani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa obrisanim domenom, himerna antitela, antitela sa prenetim CDR-om, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr., kao što je definisano u WO08/020079 ili WO09/138519) (npr., monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIPs), i varijabilni IgNAR domeni ajkule, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment za vezivanje antigena," kao što je ovde korišćen. U aspektu izlaganja, fragment koji vezuje antigen sadrži tri ili više CDR-a antitela iz Tabele 1 (npr., CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3; ili CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3).
[0068] Fragment antitela koji vezuje antigen će, u aspektu izlaganja, sadržati bar jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i generalno će sadržati bar jedan CDR, koji je susedan sa ili je u okviru sa jednom ili više sekvenci regiona okvira. U antigen-vezujućim fragmentima koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni se mogu nalaziti jedan u odnosu na drugi u bilo kom drugom pogodnom uređenju. Na primer, varijabilni region može biti dimerni i sadržati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment za vezivanje antigena antitela može sadržati monomerni VHili VLdomen.
[0069] U određenim aspektima, antigen-vezujući fragment antitela može sadržati najmanje jedan varijabilni domen u kovalentnoj vezi sa najmanje jednim konstantnim domenom. Ne-ograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji se mogu pronaći u antigen-vezujućem fragmentu antitela iz predmetnog pronalaska uključuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od primera gore navedenih konfiguracija, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno vezani jedan sa drugim ili mogu biti vezani sa punim ili parcijalnim zglobom ili regionom linkera. Region zgloba može da se sastoji iz najmanje 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina, koje rezultiraju fleksibilnom ili polu-fleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Osim toga, fragment za vezivanje antigena antitela iz ovog izlaganja može sadržati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnog i konstantnog domena koje su gore navedene u ne-kovalentnoj vezi jedan sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernim VHili VLdomenom (npr., pomoću disulfidne veze(a)).
[0070] Antigen-vezujući proteini (npr., antitela i fragmenti za vezivanje antigena) mogu biti monospecifični ili multi-specifični (npr., bi-specifičnoi). Multispecifični antigen-vezujući proteini su ovde dalje razmotreni.
1
[0071] U specifičnim izvođenjima, antitelo ili fragmenti antitela iz pronalaska mogu biti konjugovani sa ostatkom kao što je ligan ili terapeutska grupa ("imunokonjugat"), kao što je anti-virusni lek, drugo anti-influenca antitelo, ili bilo koja druga terapeutska grupa koja je korisna za lečenje virusne infekcije, npr., influenca virusne infekcije. Videti ispod.
[0072] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje kompleks koji oduhvata anti-CoV-S antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koji su ovde kompleksirani sa CoV-S polipeptidom ili njegovim antigenskim fragmentom i/ili sa sekundarnim antitelom ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena (npr., detektabilno obeleženo sekundarno antitelo) koje se specifično veže za anti-CoV-S antitelo ili fragment. U aspektu iz izlaganja, antitelo ili fragment je in vitro (npr., imobilizovan je na čvrstom supstratu) ili je u telu subjekta. U aspektu iz prikaza, CoV-S je in vitro (npr., imobilizovan je na čvrstom supstratu) ili je na površini virusa ili je u telu subjekta. Immobilizovana anti-CoV-S antitela i njihovi fragmenti za vezivanje antigena koji su kovalentno vezani sa nerastvorljivim materijalom matriksa (npr., staklo ili polisaharid kao što je agaroza ili sefaroza, npr., perla ili druga njegova čestica) su takođe deo ovog izvođenja; opciono, gde je imobilizovano antitelo u kompleksu sa CoV-S ili njegovim antigenskim fragmentom ili sekundarno antitelo ili njegov antigenski fragment.
[0073] "Izolovani" antigen-vezujući proteini, antitela ili njegovi fragmenti za vezivanje antigena, polipeptidi, polinukleotidi i vektori, su bar delom oslobođeni od drugih biloških molekula iz ćelija ili ćelijske kulture iz koje su proizvedeni. Takvi biološki molekuli uključuju nukleinske kiseline, proteine, druga antitela ili fragmente za vezivanje antigena, lipide, ugljenehidrate, ili drugi materijal kao što je ćelijski debris i medijum za rast. Izolovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena može dalje biti bar delom oslobođen od komponenata sistema za ekspresiju kao što su biološki molekuli iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma rasta. Generalno, termin "izolovani" nije namenjen da se odnosi na potpuno odsustvo takvih bioloških molekula ili na odsustvo vode, pufera, ili soli ili komponenata farmaceutske kompozicije koja uključuje antitela ili fragmente.
[0074] Termin "epitop" se odnosi na antigensku determinantu (npr., CoV-S polipeptid) koji interaguje sa specifičnim antigen-vezujućim mestom antigen-vezujućeg proteina, npr., varijabilni region molekula antitela, koji je poznat kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Termin "epitop" se takođe odnosi na mesto na antigen na kome B i/ili T ćelije reaguju. Takođe se odnosi na region u antigenu koji je vezan antitelom. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitope su generalno podset strukturalnih epitope i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi mogu biti linearni ili konformacioni, to jest, sastavljeni iz ne-linearnih aminokiselina. U određenim aspektima, epitopi mogu uključiti determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fosforil grupe, ili sulfonil grupe, i, u određenim aspektima, mogu imati specifične tridimenzionalne strukturalne karakteristike, i/ili specifične osobine naelektrisanja.
[0075] Postupci za određivanje epitopa antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili fragmenta ili polipeptida, uključuju mutacionu analizu skeniranja alanina, analizu peptidnog blota (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), analizu peptidnog cepanja, kristalografske studije i NMR analizu. Dodatno, postupci kao što je isecanje epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena se može koristiti (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Drugi postupak koji se može koristiti za identifikovanje aminokiselina u polipeptidu sa kojima antigen-vezujući protein (npr., antitelo ili fragment ili polipeptid) (npr., koverzin) interaguje je izmena vodonik/deuterijum koja se detektuje masenom spektrometrijom. U opštim terminima, postupak izmene vodonik/deuterijum uključuje obeležavanje proteina od interesa deuterijumom, zatim vezivanje antigen-vezujućeg proteina, npr.,
1
antitela ili fragmenta ili polipeptida, sa proteinom koji je obeležen deuterijumom. Sledeće, CoV-S protein / antigen-vezujući proteinski kompleks je prenet u vodu i izmenjivi protoni u aminokiselinama koji su zaštićeni sa kompleksom antitela prolaze kroz deuterijum-u-vodonik povratnu izmenu sporijom brzinom u odnosu na izmenjive protone u aminokiselinama koje nisu deo interfejsa. Kao rezultat, aminokiseline koje čine deo interfejsa proteina / antigen-vezujućeg proteina mogu zadržati deuterijum i prema tome ispoljiti relativno veću masu u poređenju sa aminokiselinama koje nisu obuhvaćene interfejsom. Nakon disocijacije antigen-vezujućeg proteina (npr., antitela ili fragmenta ili polipeptida), ciljni protein je izložen cepanju proteazom i analizom masenom spektrometrijom, na taj način otkrivajući ostatke koji su obeleženi deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima interaguje antigen-vezujući protein. Videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem.73: 256A-265A.
[0076] Termin"koji je u kompeticiji" kao što se ovde koristi, odnosi se na antigen-vezujući protein (npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena) koji se veže za antigen (npr., CoV-S) i inhibira ili blokira vezivanje drugog antigen-vezujućeg proteina (npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena) za antigen. Termin takođe uključuje kompeticiju između dva antigen-vezujuća proteina npr., antitela, u obe orijentacije, tj., prvog antitela koje veže i blokira vezivanje drugog antitela i obrnuto. U određenim aspektima, prvi antigen-vezujući protein (npr., antitelo) i drugi antigen-vezujući protein (npr., antitelo) može se vezati za isti epitop. Alternativno, prvi i drugi antigen-vezujući proteini (npr., antitela) mogu se vezati za različite, ali, na primer, preklapajuće epitope, pri čemu vezivanje jednog inhibira ili blokira vezivanje drugog antitela, npr., pomoću sterne smetnje. Kompeticija između antigen-vezujućih proteina (npr., antitela) se može izmeriti pomoću postupaka koji su poznati u oblasti tehnike, na primer, u realnom vremenu, oslobođenom od obeleživača bio-slojnim interferometrijskim testom. Mapiranje epitopa (npr., pomoću skeniranja alanina ili izmenom vodonik deuterijum (HDX)) može se koristiti za određivanje da li dva ili više antitela nisu u kompeticiji (npr., na monomer domena vezivanja receptora za spajk protein (RBD)), u kompeticiji za isti epitop, ili u kompeticiji ali sa različitim mikro-epitopima (npr., identifikovanih preko HDX). U aspektu izlaganja, kompeticija između prvog I drugog anti-CoV-Santigen-vezujućeg proteina (npr., antitela) je određena merenjem sposobnosti imobilizovanog prvog anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina (npr., antitela) (nije inicijalno kompleksiran sa CoV-S proteinom) da se veže za rastvorljivi CoV-S protein kompleksiran sa drugim anti-CoV-S antigen-vezujućim proteinom (npr., antitelo). Smanjenje u sposobnosti prvog anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina (npr., antitelo) da bi se vezao za kompleksirani CoV-S protein, u odnosu na nekompleksirani CoV-S protein, ukazujući da prvi i drugi anti-CoV-S antigen-vezujući proteini (npr., antitela) jesu u kompeticiji. Stepen kompeticije može biti izražen kao procenat smanjenja u vezivanju. Takva kompeticija može biti izmerena upotrebom u realnom vremenu, oslobođenom od obeleživača bio-slojnim interferometrijskim testom, npr., na Octet RED384 biosenzoru (Pall ForteBio Corp.), ELISA (enzimski-vezani imunosorbentni testovi) ili SPR (površinska plazmonska rezonanca).
[0077] Kompeticija vezivanja između anti-CoV-S antigen-vezujućih proteina (npr., monoklonskih antitela (mAt-a)) može se odrediti korišćenjem interferometrijskog testa biosloja bez obeleživača u realnom vremenu na Octet RED384 biosenzoru (Pall ForteBio Corp.). Na primer, da bi se odredila kompeticija između dva anti-CoV-S monoklonska antitela, anti-CoV-S mAt može biti prvo uhvaćeno na anti-hFc antitelom obloženi Octet biosenzor vrhova (Pall ForteBio Corp., # 18-5060) potapanjem vrhova u rastvor anti-CoV-S mAt-a (naknadno naznačen sa "mAt1"). Kao pozitivna kontrola za blokiranje, antitelo koje je uhvatilo vrhove biosenzora može nakon toga biti zasićen sa poznatim blokirajućim kontrolnim izotipom mAt (naknadno označen kao "blokirajuće mAt") potapanjem u rastvor blokirajućeg mAt-a. Da bi se odredilo da li je mAt2 u kompeticiji sa mAt1, vrhovi biosenzora mogu se zatim potopiti u ko-kompleksirani rastvor CoV-S polipeptida i drugog anti-CoV-S mAt-a (naknadno označen kao "mAt2"), koji su bili prethodno inkubirani u određenom vremenskom periodu
1
i vezivanje mAt1 za CoV-S polipeptid može biti određeno. Vrhovi biosenzora mogu biti isprani u puferu između svakog koraka u eksprerimentu. Odgovor vezivanja u realnom vremenu se može pratiti tokom eksperimenta i odgovor vezivanja na kraju svakog koraka može biti zabeležen.
[0078] Na primer, u aspektu izlaganja, kompetitivni test je sproveden na 25 °C i pH oko 7, npr., 7.4, npr., u prisustvu pufera, so, surfaktant i ne-specifični protein (npr., serumski albumin govečeta).
[0079] Obično, antitelo ili antigen-vezujući fragment iz ponalaska koji je modifikovan na neki način zadržava sposobnost da se specifično veže za CoV-S, npr., zadržava najmanje 10% njegove aktivnosti vezivanja CoV-S (kada se poredi sa parentalnim antitelom) kada je aktivnost izražena na molarnoj osnovi. Poželjno, antitelo ili antigen-vezujući fragment iz pronalaska zadržava najmanje 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% ili više CoV-S vezujućeg afiniteta kao parentalno antitelo. Takođe je namenjeno da antitelo ili antigen-vezujući fragment iz pronalaska može uključiti konzervativne ili nekonzevativne aminokiselinske supstitucije (naznačene kao "konzervativne varijante" ili "funkcionalno konzervirane varijante" antitela) koje ne menjaju suštinski njegovu biološku aktivnost.
[0080] "Varijanta" polipeptida, kao što je lanac imunoglobulina (npr., mAt8021 VH, VL, HC, ili LC, mAt8028 VH, VL, HC, ili LC, ili mAt8029 VH, VL, HC, ili LC), odnosi se na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 70-99.9% (npr., 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) identična ili slična sa referentnom sekvencom aminokiselina koja je ovde predstavljena (npr., SEQ ID NO: 2, 10, 18, 20, 22, 30, 38, 40, 42, 50, 58, ili 60); gde je poređenje sprovedeno sa BLAST algoritmom u kome su parametri algoritma odabrani da se dobije najveće poklapanje između respektivnih sekvenci preko čitave dužine respektivnih referentnih sekvenci (npr., očekivani prag: 10; veličina reči: 3; maksimum poklapanja u ispitivanom opsegu: 0; BLOSUM 62 matriks; “gap costs”: postojanje 11, ekstenzija 1; prilagođavanje matrice uslovnog kompozicionog rezultata).
[0081] "Varijanta" polinukleotida se odnosi na polinukleotid koji sadrži sekvencu nukleotida koja je najmanje oko 70-99.9% (npr., najmanje oko 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, ili 99.9%) identična sa naznačenom sekvencom nukleotida koja je ovde predstavljena (npr., SEQ ID NO: 1, 9, 17, 19, 21, 29, 37, 39, 41, 49, 57, ili 59); gde je poređenje izvedeno upotrebom BLAST algoritma pri čemu su parametri algoritma odabrani da daju najveće poklapanje između odgovarajućih sekvenci preko cele dužine odgovarajućih referentnih sekvenci (npr., očekivani prag: 10; veličina reči: 28; maksimum poklapanja u ispitivanom opsegu: 0; rezultati poklapanja/nepoklapanja: 1, -2; “gap costs”: linearni).
[0082] Anti-CoV-S antigen-vezujući proteini, npr., antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti iz ovog izlagnaja, u aspektu izlaganja, uključuju varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji je najmanje 70% (npr., 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili više) identičan u sekvenci aminokiselina sa HCVR sekvencama aminokiselina koje su predstavljene u Tabeli 1; i/ili varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji je najmanje 70% (npr., 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili više) identičan u sekvenci aminokiselina sa LCVR sekvencama aminokiselina predstavljenim u Tabeli 1. U nekim slučajevima antitelo zadržava iste sekvence CDR prema Tabeli 1. Drugim rečima, promene se nalaze izvan regiona CDR. Varijante antitela obično zadržavaju specifičnost vezivanja uz određene druge osobine polaznog kandidata antitela.
[0083] Dodatno, varijanta anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina može uključiti polipeptid koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je ovde predstavljena izuzev jedne ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) mutacija kao što su, na primer, mutacije promenjenog smisla (npr., konzervativne supstitucije), mutacije pogrešnog smisla, delecije, ili insercije. Na primer, ovo izlaganje uključuje
1
antigen-vezujuće proteine koji uključuju varijantu lakog lanca imunoglobulina koja sadrži LCVR aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u Tabeli 1 ali koja ima jednu ili više takvih mutacija i/ili varijantu teškog lanca imunoglobulina koja sadrži HCVR aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u Tabeli 1 ali koja ima jednu ili više takvih supstitucija. U aspektu iz prikaza, varijanta anti-CoV-S antigenvezujućeg proteina uključuje varijantu lakog lanca imunoglobulina koja sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 pri čemu jedan ili više (npr., 1 ili 2 ili 3) takvih CDR-a ima jednu ili više takvih mutacija (npr., konzervativne supstitucije) i/ili varijantu teškog lanca imunoglobulina koja sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 gde jedan ili više (npr., 1 ili 2 ili 3) takvih CDR-a ima jednu ili više takvih mutacija (npr., konzervativne supstitucije). Supstitucije mogu biti u CDR, regionu okvira, ili konstantnom regionu. U nekim slučajevima, antitela iz prikaza zadržavaju tačne sekvence CDR iz Tabele 1 ali mogu imati gore opisane mutacije u ostatku HCVR/LCVR, ili teškom/lakom lancu. Varijanta antitela može zadržati funkcije polaznog kandidata antitela (videte ispod).
[0084] Prikaz dalje obezbeđuje variante anti-CoV-S antigen-vezujućih proteina, npr., antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, koji se sastoje iz jedne ili više varijanti CDR-a (npr., bilo koju ili više od CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i/ili CDR-H3) koje su ovde prikazane sa najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 99.9% identitetom u sekvenci ili sličnosti sa, npr., CDR-a teškog lanca i lakog lanca iz Tabele 1. Još jednom, takve varijante mogu zadržati funkciju polaznog kandidata antitela (videti ispod).
[0085] Aspekti iz ovog izlaganja takođe uključuju varijante antigen-vezujućih proteina, npr., anti-CoV-S antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena, koji obuhvataju imunoglobulin VHs i VLs; ili HCs i LCs, koji sadrže aminokiselinsku sekvencu sa 70% ili više (npr., 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili većim) sveukupnim identitetom ili sličnosti u aminokiselinama sa aminokiselinskim sekvencama odgovarajućih VHs, VLs, HCs ili LCs koji su ovde specifično prikazani, ali u kojima CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 takvih imunoglobulina nisu varijante i sadrže aminokiselinsku sekvencu CDR koja je prikazana u Tabeli 1. Prema tome, u takvim aspektima, CDR-i u okviru varijanti antigen-vezujućih proteina nisu, sami po sebi, varijante.
[0086] Konzervativno modifikovane varijante anti-CoV-S antitela i njihovih fragmenata koji vezuju antigen su takođe deo predmetnog pronalaska. "Konzervativno modifikovana varijanta" ili "konzervativna supstitucija" se odnosi na varijantu u kojoj su jedna ili više supstitucija aminokiselina u polipeptidu sa drugim aminokiselinama koje imaju slične karakteristike (npr. naelektrisanje, veličinu bočnog lanca, hidrofobnost/hidrofilnost, konformaciju okosnice i rigidnost, itd.). Takve promene se često mogu dobiti bez značajnog narušavanja biološke aktivnosti antitela ili fragmenta. Stručnjaci iz oblasti tehnike će prepoznati da, uopšteno, pojedinačne aminokiselinske supstitucije u neesencijalnim regionima polipeptida ne menjaju suštinski biološku aktivnost (videti, npr., Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)). Dodatno, supstitucije strukturno ili funkcionalno sličnih aminokiselina su manje verovatne da u značajnoj meri narušavaju biološku aktivnost.
[0087] Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alaninvalin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja izmena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log-matrici verovatnoće prikazanoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345.
1
[0088] Varijante konzervativne za funkciju anti-CoV-S antitela i njihovih fragmenata za vezivanje antigena su takođe deo predmetnog pronalaska. Bilo koja od varijanti anti-CoV-S antitela i njihovih fragmenata za vezivanje antigena (kao što je ovde razmotreno) mogu biti "varijante konzervativne za funkciju". Takve varijante konzervativne za funkciju mogu, u nekim slučajevima, takođe biti karakterisane kao konzervativno modifikovane varijante. "Varijante konzervativne za funkciju," kao što su ovde korišćene, odnose se na varijante anti-CoV-S antitela ili njegovih fragmenata za vezivanje antigena u kojima jedna ili više aminokiselinskih ostataka je izmenjena bez značajne promene jedne ili više funkcionalnih osobina antitela ili fragmenta. U izvođenju iz pronalaska, varijanta konzervativna za funkciju anti-CoV-S antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen iz predmetnog pronalaska obuhvata varijantu aminokiselinske sekvence i ispoljava jednu ili više od sledećih funkcionalnih osobina:
• Inhibira rast koronavirusa (npr., SARS-CoV-2, SARS-CoV, i/ili MERS-CoV) u ACE2-i/ili ćelijama koje eksprimiraju TMPRSS2 (npr., Calu-3 ćelije);
• Ne vezuje se značajno za MDCK/Tet-on ćelije koje ne eksprimiraju ACE2 i/ili TMPRSS2;
• Ograničava širenje koronavirusne infekcije (npr., sa SARS-CoV-2, SARS-CoV, i/ili MERS-CoV) ćelija, npr., Calu-3, in vitro; i/ili
• Štiti miša koji je modifikovan da eksprimuje humani TMPRSS2 i/ili ACE2 protein od smrti uzrokovane sa koronavirusnom infekcijom (npr., SARS-CoV-2, SARS-CoV, ili MERS-CoV), na primer, pri čemu su miševi inficirani sa inače smrtonosnom dozom virusa, opciono kada su kombinovani sa drugim terapeutskim sredstvom.
• Štiti miša koji je modifikovan da eksprimira humani TMPRSS2 i/ili ACE2 protein od gubitka težine uzrokovane koronavirusnom infekcijom (npr., SARS-CoV-2, SARS-CoV, ili MERS-CoV), na primer, pri čemu su miševi inficirani sa dozom virusa koja bi inače uzrokovala gubitak u težini, po potrebi kada se kombinuje sa drugim terapeutskim sredstvom.
• U nekim slučajevima, antitelo može imati sekvence CDR polaznog kandidata antitela i može biti funkcionalno konzervirano antitelo. Na primer, antitelo iz prikaza može sadržati šest CDR sekvenci mAt10933 antitela i (i) ispoljiti neutrališuću potenciju (IC50) protiv divljeg tipa VSV-SARS-CoV-2-S pseudočestica u Vero ćelijama manjim od 50 pM (npr., kao u Primeru 12), (ii) ispoljiti relativnu neutralizaciju VSV-SARS-CoV-2 varijanti koje kodiraju S protein od bar 95% u poređenju sa divljim tipom (npr., od varijanti koje su identifikovane u Tabeli 27 iz Primera 12), (iii) ispoljiti neutrališuću potenciju (IC50) protiv VSV-SARS-CoV-2 varijanti koje kodiraju spajk protein manji od 150 pM (npr., varijante koje su identifikovane u Tabeli 28 iz Primera 12), (iv) ispoljiti potenciju blokiranja (IC50) manju od oko 7.1 pM (npr., manju od 7.0 pM, manju od 6.5 pM, manju od 6.0 pM, manju od 5.5 pM, manju od 5.0 pM, manju od 4.5 pM, ili manju od 4.0 pM) u ELISA-zasnovanom testu kojim se meri sposobnost antitela za blokiranje vezivanja SARS-CoV-2 S protein RBD za humani ACE2 (npr., kao u Primeru 14), i/ili (v) ispoljiti neutralizaciju živog SARS-CoV-2 virusa. Slično, antitelo može sadržati šest CDR sekvenci mAt10987 antitela i (i) ispoljiti neutrališuću potenciju (IC50) protiv divljeg tipa VSV-SARS-CoV-2-S pseudočestica u Vero ćelijama manju od 50 pM (npr., kao u Primeru 12), (ii) ispoljava relativnu neutralizaciju VSV-SARS-CoV-2 varijanti koje kodiraju spajk protein od bar 95% u poređenju sa divljim tipom (npr., od varijanata koje su identifikovane u Tabeli 27 iz Primera 12), (iii) ispoljava potenciju neutralizacije (IC50) protiv VSV-SARS-CoV-2 varianti koje kodiraju S protein manji od 55 pM (npr., varijante koje su identifikovane u Tabeli 28 iz Primera 12), (iv) ispoljavaju potenciju blokiranja (IC50) manju od 185 pM (npr., manju od 180 pM, manju od 170 pM, manju od 160
2
pM, manju od 150 pM, manju od 140 pM, manju od 130 pM, manju od 120 pM, manju od 110 pM, manju od 100 pM, ili manju od 90 pM) u ELISA-zasnovanom testu kojim se meri sposobnost antitela da blokira vezivanje SARS-CoV-2 S protein RBD-a za humani ACE2 (npr., kao u Primeru 14), i/ili (v) ispoljava neutralizaciju živog virusa. Ove osobine takođe važe za varijante 10933 i 10987 antitela.
[0089] "Neutrališući" ili "antagonist" anti-CoV-S antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili antigenvezujući fragment, odnosi se na molekul koji inhibira aktivnost CoV-S u bilo kom detektabilnom stepenu, npr., inhibira sposobnost CoV-S da se veže za receptor kao što je ACE2, da se cepa dejstvom proteaze kao što je TMPRSS2, ili da posreduje virusnom ulazu u ćeliju domaćina ili virusnoj reprodukciji u ćeliji domaćina.
[0090] Tabela 1 se odnosi na antigen-vezujuće proteine, kao što su antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže težak lanac ili VH(ili njegovu varijantu) i laki lanac ili VL(ili njegovu varijantu) kao što je predstavljeno u tekstu ispod; ili koji sadrže VHkoji obuhvata njegove CDR-e (CDR-H1 (ili njegovu varijantu), CDR-H2 (ili njegovu varijantu) i CDR-H3 (ili njegovu varijantu)) i VLkoji sadrži njegove CDR-e (CDR-L1 (ili njegovu varijantu), CDR-L2 (ili njegovu varijantu) i CDR-L3 (ili njegovu varijantu)), npr., gde imunoglobulinski lanci, varijabilni regioni i/ili CDR-i sadrže specifične sekvence aminokiselina koje su opisane.
[0091] Ovde opisana antitela takođe uključuju izvođenja gde je VHspojen sa divljim tipom IgG4 (npr., gde ostatak 108 je S) ili sa varijantama IgG4 (npr., gde ostatak 108 je P).
[0092] Antitela i fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska sadrže imuoglobulinske lance uključujući sekvence aminokiselina iz pronalaska kao i ćelijske i in vitro post-translacione modifikacije na antitelu. Na primer, ovo izlaganje uključujuje antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen koji se specifično vežu za CoV-S koji se sastoji iz sekvenci aminokiselina teškog i/ili lakog lanca kao što su ovde predstavljene (npr., CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i/ili CDR-L3) kao i antitela i fragmente u kojima je jedna ili više ostataka aminokiselina glikozilovana, gde su jedan ili više Asn ostataka deamidovani, jedan ili više ostataka (npr., Met, Trp i/ili His) je oksidovan, N-terminalni Gln je piroglutamat (pyroE) i/ili C-terminalni Lizin nedostaje.
[0093] Aminokiselina i nukleotidne sekvence primera antitela anti-SARS-CoV-2-Spajk proteina (SARS-CoV-2-S) su prikazane u Tabeli primera sekvenci, ispod.
Tabela primera sekvenci
(nastavak)
2 (nastavak)
(nastavak)
2
2 (nastavak)
2 (nastavak)
(nastavak)
2
2 (nastavak)
(nastavak)
1 (nastavak)
2 (nastavak)
(nastavak)
Davanje antitela
[0094] Ovo izlaganje obezbeđuje postupke za primenu anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina iz ovog izlaganja, npr., onih iz Tabele 1, koji obuhvataju uvođenje antigen-vezujućeg proteina u telo subjekta (npr., čoveka). Na primer, postupak obuhvata probijanje tela subjekta iglom šprica i ubrizgavanjem antigen-vezujućeg proteina u telo subjekta, npr., u venu, arteriju, tumor, mišićno tkivo ili potkožno tkivo subjekta.
[0095] Ovo izlaganje obezbeđuje posudu (npr., plastičnu ili staklenu bočicu, npr., sa kapom ili hromatografskom kolonom, igla sa šupljim otvorom ili cilindar šprica) koji sadrži anti-CoV-S antigenvezujući protein iz ovog izlaganja, npr., oni koji su navedeni u Tabeli 1.
[0096] Ovo izlaganje takođe obezbeđuje uređaj za ubrizgavanje koji se sastoji iz jednog ili više antigenvezujućih proteina (npr., antitelo ili fragment za vezivanje antigena) koji se veže specifično za CoV-S, npr., oni iz Tabele 1, ili njihova farmaceutska kompozicija. Uređaj za ubrizgavanje može biti spakovan u komplet. Uređaj za ubrizgavanje je sprava koja uvodi supstancu u telo subjekta preko parenteralne rute, npr., intramuskularno, subkutanozno ili intravenozno. Na primer, uređaj za ubrizgavanje može biti špric (npr., prethodno napunjen sa farmaceutskom kompozicijom, kao što je auto-injektor) koji, na primer, uključuje cilindar ili bure za zadržvanje tečnosti za ubrizgavanje (npr., koji sadrži antitelo ili
4
fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju), iglu za proboj kože i/ili krvne sudove za ubrizgavanje tečnosti; i klip za potiskivanje tečnosti iz cilindra i kroz otvor igle. U aspektu izlaganja, uređaj za ubrizgavanje koji sadrži antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, iz kombinacije ovog izlaganja, ili njegova farmaceutska kompozicija je uređaj za intravenozno ubrizgavanje (IV). Takav uređaj antigen-vezujućeg proteina ili njegova farmaceutska kompozicija u kanuli ili trokar/igla koji mogu biti vezani za cev koja se može vezati za kesu ili rezervoar za držanje tečnosti (npr., slani rastvor) koji su uvedeni u telo subjekat kroz kanulu ili trokar/iglu. Antitelo ili fragment ili njegova farmaceutska kompozicija se mogu, u aspektu iz ovog izlaganja, uvesti u uređaj onda kada se trokar ili kanula insertuju u venu subjekta i trokar se ukloni iz insertovane kanule. IV uređaj može, na primer, biti insertovan u perifernu venu (npr., u ruku ili rame); gornoj vena cava ili donjoj vena cava, ili unutar desne pretkomore srca (npr., centralni IV); ili u subklavijalnu, unutrašnju jugularnu, ili femorlanu venu i, na primer, napreduje prema srcu sve dok ne dostigne gornu vena cava ili desnu pretkomoru (npr., centralnu vensku liniju). U aspektu izlaganja, uređaj za ubrizgavanje je autoinjektor; mlazni injektor ili eksterna pumpa za infuziju. Mlazni injektor koristi uski mlaz tečnosti pod visokim pristiskom koji prodire kroz epidermis da uvede u telo subjekta antitelo ili fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju. Eksterne pumpe za infuziju su medicinski uređaji koji isporučuju antitelo ili fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u telo subjekta u kontrolisanim količinama. Eksterne pumpe za infuziju se mogu napajati električno ili mehanički. Različite pume rade na različite načina, na primer, pumpa za špric drži tečnost u rezervoaru šprica, a pokretni klip kontroliše isporuku tečnosti, elastomerna pumpa drži tečnost u rastezljivom balonskom rezervoaru, i pritisak sa elastičnih zidova balona pokreće isporuku tečnosti. U peristaltičkoj pumpi, set valjaka rasteže dužinom fleksibilne cevi, gurajući tečnost napred. U višekanalnoj pumpi, tečnosti se mogu isporučiti iz višestrukih rezervoara sa više brzina.
Dobijanje humanih antitela
[0097] Postupci za dobijanje humanih antitela kod transgenih miševa su poznati u oblasti tehnike. Bilo koji poznati postupci se mogu koristiti u kontekstu ovog izlaganja da bi se dobila humana antitela koja se specifično vežu za CoV-S. Imunogen koji sadrži bilo koju od sledećih koji se mogu koristiti da generišu antitela na CoV-S. U određenim aspektima iz izlaganja, antitela iz izlaganja koji su dobijeni iz miševa koji su imunozovani sa punom dužinom, nativim CoV-S, ili sa živim atenuisanim ili inaktivisanim virusom, ili sa DNK koja kodira protein ili njegov fragment. Alternativno, CoV-S protein ili njegov fragment se mogu proizvesti upotrebom standardnih biohemijskih postupaka i modifikovani i korišćeni kao imunogen. U jednom aspektu izlaganja, immunogen je rekombinantno proizvedeni CoV-S protein ili njegov fragment. U određenim aspektima izlaganja, imunogen može biti CoV-S polipeptidna vakcina. U određenim aspektima, mogu se primeniti jedna ili više dopunskih injekcija. U određenim aspektima, immunogen može biti rekombinantni CoV-S polipeptid eksprimiran u E. coli ili u bilo kojoj drugoj eukariotskoj ili sisarskim ćelijama kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).
[0098] Upotrebom VELOCIMMUNE<®>tehnologije (videti, na primer, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE<®>) ili bilo kog drugog poznatog postupka za dobijanje monoklonskih antitela, visokoafinitetna himerna antitela na CoV-S mogu se inicijalno izolovati tako da imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. The VELOCIMMUNE<®>tehnologija uključuje dobijanje transgenog miša koji ima genom koji se sastoji iz varijabilnih regiona humanog teškog i lakog lanca u operativnoj vezi sa endogenim lokusima mišjeg konstantnog regiona kao što je miš koji proizvodi antitelo koje se sastoji iz humanog varijabilnog regiona i mišjeg konstantnog regiona u odgovoru na stimulacijom antigenom. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela su izolovani i u operativnoj vezi sa DNK koja kodira konstantne regione humanog teškog i lakog lanca. DNK je zatim eksprimirana u ćeliji koja je sposobna da eksprimira potpuno humano antitelo.
[0099] Generalno, VELOCIMMUNE<®>miš je izazvan sa antigenom od interesa, i limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) su oporavljene iz miševa koji eksprimiraju antitela. Limfatične ćelije mogu biti spojene sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se pripremile besmrtne ćelijske linije hibrodoma, i takve ćelijske linije hibridoma su pretražene i selektovane za identifikovanje ćelijskih linija hibridoma koji proizvode antitela koja su specifična za antigen od interesa. DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca može se izolovati i spojiti sa željenim izotipskim konstantnim regionima teškog lanca i lakog lanca. Takav protein antitela se može proizvesti u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerna antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može se direktno izolovati iz antigen-specifičnih limfocita.
[0100] Početno, izolovana su visokoafinitetna himerna antitela koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao u eksperimentalnom odeljku ispod, antitela su karakterisana i odabrana za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisalo puno humano antitelo iz pronalaska, na primer divlji tip ili modifikovani IgG1 ili IgG4. Dok odabrani konstantni region može da se razlikuje prema određenoj upotrebi, visokoafinitetni antigen-vezujući i karakteristike ciljne specifičnosti nalaze se u varijabilnom regionu.
Antitela protiv spajk proteina koronavirusa koja sadrže Fc varijante
[0101] Prema određenim izvođenjima iz predmetnog pronalaska, anti-CoV-S antigen-vezujući proteini, tj., antitela ili antigen-vezujući fragmenti, su obezbeđeni koji sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija, koje, na primer, pojačavaju ili umanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Na primer, predmetni pronalazak uključuje anti-CoV-S antitela koji sadrži mutaciju u CH2 ili CH3 regionu domena Fc, pri čemu mutacija(e) povećavaju afinitet Fc domena za FcRn u kiselom okruženju (npr., u endozomu gde su pH opsezi od oko 5.5 do oko 6.0). Takve mutacije mogu rezultovati u povećanju poluživota antitela u serumu kada su primenjeni životinji. Neograničavajući primeri Fc modifikacija uključuju, npr., modifikacija na položaju 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikacija na položaju 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., A, W, H, F ili Y [N434A, N434W, N434H, N434F ili N434Y]); ili modifikacija na položaju 250 i/ili 428; ili modifikacija na položaju 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom izvođenju, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikacija; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikacija; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikacija; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikacija; 250Q i 428L modifikacija (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikacija (npr., 308F ili 308P). U još drugim izvođenjima, modifikacija sadrži 265A (npr., D265A) i/ili 297A (npr., N297A) modifikacija.
[0102] Na primer, ovaj pronalazak uključuje anti-CoV-S antigen-vezujuće proteine, tj., antitela ili antigen-vezujuće fragmente, koji se sastoje iz Fc domena koji sadrži jedan ili više parova ili grupa ili mutacija odabranih iz grupe koja se sastoji iz: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); 257I i 311I (npr., P257I i Q311I); 257I i 434H (npr., P257I i N434H); 376V i 434H (npr., D376V i N434H); 307A, 380A i 434A (npr., T307A, E380A i N434A); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F).
[0103] Anti-CoV-S antigen-vezujući proteini, npr., antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji sadrže VHi/ili VLkao što je ovde predstavljeno sadrže bilo koje moguće kombinacije gore navedenih mutacija Fc domena, su razmatrani u okviru ovog otkrića.
[0104] Ovaj pronalazak takođe uključuje anti-CoV-S antitela ili antigen-vezujuće fragmente, koji sadrže VHiz pronalaska i konstantni region (CH) himernog teškog lanca, pri čemu himerni CHregion sadrži segmente koji su izvedeni iz CHregiona više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, antitela iz pronalaska mogu sadržati himerni CHregion koji sadrži deo ili ceo CH2 domen izveden iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula, kombinovan sa delom ili celim CH3 domenom koji je izveden iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula. U skladu sa određenim izvođenjima, antitela iz pronalaska sadrže himerni CHregion koji ima himerni region zgloba. Na primer, himerni zglob može sadržati "gornji zglob" aminokiselinske sekvence (aminokiselinski ostaci iz položaja 216 do 227 u skladu sa EU numerisanjem) koji su izvedeni iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humani IgG4 region zgloba, u kombinaciji sa sekvencom "donjeg zgloba" (aminokiselinski ostaci iz položaja 228 do 236 prema EU numerisanju) koji su izvedeni iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zgloba. U skladu sa određenim izvođenjima, himerni region zgloba sadrži aminokiselinske ostatke koji su izvedeni iz gornjeg zgloba humanog IgG1 ili humanog IgG4 i aminokiselinski ostaci koji su izvedeni iz donjeg zgloba humanog IgG2. Antitelo koje sadrži himerni CHregion kao što je ovde opisan može, u određenim izvođenjima, ispoljiti modifikovane Fc efektorske funkcije bez negativnog uticaja na terapeutske ili farmakokinetičke osobine antitela. (Videti, npr., WO2014/022540).
Imunokonjugati
[0105] Pronalazak obuhvata anti-CoV-S antigen-vezujuće proteine, tj. antitela ili antigen-vezujuće fragmente, konjugovane za drugi ostatek, npr., terapeutski ostatak ("imunokonjugat"), kao što je toksoid ili antivirusni lek za lečenje infekcije virusom influence. U izvođenju iz pronalaska, anti-CoV-S antitelo ili fragment je konjugovan sa bilo kojim od drugih ovde predstavljenih terapijskih agenasa. Kao što je ovde korišćeno, termin "imunokonjugat" se odnosi na antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili antigen-vezujući fragment, koji je hemijski ili biološki povezan sa radioaktivnim sredstvom, citokinom, interferonom, meta ili reporterski ostatak, enzim, peptid ili protein ili terapeutsko sredstvo. Antigen vezujući protein može biti povezan sa radioaktivnim sredstvom, citokinom, interferonom, meta ili reporterski ostatak, enzim, peptid ili terapeutsko sredstvo na bilo kom položaju duž molekula sve dok je u stanju da se veže za svoju metu (CoV-S). Primeri imunokonjugata uključuju konjugate antitela sa lekom i spojene proteine antitela sa toksinom. U jednom izvođenju iz pronalaska, sredstvo može biti drugo, različito antitelo koje se specifično veže za CoV-S. Tip terapijskog ostatka može biti konjugovano sa anti-CoV-S antitelom ili fragmentom će uzeti u obzir stanje koje treba lečiti i željeni terapijski efekat koji je potrebno postići. Videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., "The PrepaOdnosn And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Multispecifična antitela
[0106] Ovo izlaganje uključuje anti-CoV-S antigen-vezujuće proteine, npr., antitela i njihove antigenvezujuće fragmente, kao i postupke za njihovu upotrebu i postupke za dobijanje takvih antigenvezujućuh proteina. Izraz "anti-CoV-S" antigen-vezujući proteini, npr., antitela ili antigen-vezujući fragmenti, uključuje monospecifične (npr., bispecifične ili biparatopične) molekule koji uključuju bar jedan prvi antigen-vezujući domen koji se specifično veže za CoV-S (npr., antigen-vezujući domen iz antitela iz Tabele 1) i bar jedan drugi antigen-vezujući domen koji se veže za različiti antigen ili za epitop u CoV-S koji se razlikuje od onog u prvom antigen-vezujućem domenu. U nekim izvođenjima, prvi antigen-vezujući domen i drugi antigen-vezujući domen su oba selektovana iz antigen-vezujućih domena iz Tabele 1. U aspektu izlaganja, prvi i drugi epitopi se preklapaju. U drugom aspektu izlaganja, prvi i drugi epitopi se ne preklapaju. Na primer, u aspektu izlaganja, multispecifično antitelo je bispecifično IgG antitelo (npr., IgG1 ili IgG4) koje uključuje prvi antigen-vezujući domen koji se specifično veže za CoV-S uključujući težak i laki lanac imunoglobulina antitela iz Tabele 1, i drugi antigen-vezujući domen koji se veže specifično za različiti epitop na CoV-S. U nekim izvođenjima, bispecifično IgG antitelo (npr., IgG1 ili IgG4) uključuje prvi antigen-vezujući domen koji se specifično vezuje za CoV-S i drugi vezujući domen koji se veže za protein ćelije domaćina, npr., ACE2 ili TMPRSS2.
[0107] Antitela iz Tabele 1 uključuju multispecifične molekule, npr., antitela ili antigen-vezujuće fragmente, koji uključuju CDR-H-ove i CDR-L-ove, VHi VL, ili HC i LC ovih antitela, tim redom (uključujući njihove varijante kao što su ovde predstavljene).
[0108] U aspektu izlaganja, antigen-vezujući domen koji se specifično veže za CoV-S, koji može biti uključen u multispecifični molekul, sadrži:
(1)
(i) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR-H1, CDR-H2, i CDR-H3 aminokiselinske sekvence prikazane u Tabeli 1, i
(ii) sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži CDR-L1, CDR-L2, i CDR-L3 aminokiselinske sekvence prikazane u Tabeli 1; ili,
(2)
(i) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u Tabeli 1, i
(ii) sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u Tabeli 1; ili,
(3)
(i) sekvencu teškog lanca imunoglobulina koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u Tabeli 1, i
(ii) sekvencu lakog lanca imunoglobulina koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u Tabeli 1.
[0109] U izvođenju pronalaska, multispecifično antitelo ili fragment uključuje više od dve različite specifičnosti vezivanja (npr., trispecifični molekul), na primer, jedan ili više dodatnih antigen-vezujućih domena koji su isti ili se razlikuju od prvog i/ili drugog antigen-vezujućeg domena.
[0110] U jednom aspektu iz prikaza, bispecifični antigen-vezujući fragment sadrži prvi scFv (npr., koji sadrži VHi VLsekvence iz Tabele 1) koji ima specifičnost vezivanja za prvi epitop (npr., CoV-S) i drugi scFv koji ima specifičnost vezivanja za drugi, različit epitop. Na primer, u izvođenju iz pronalaska, prvi i drugi scFv su vezani preko linkera, npr., peptidnog linkera (npr., GS linker kao što je (GGGGS)n (SEQ ID NO: 834) gde n je, na primer, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10). Drugi bispecifični antigen-vezujući fragmenti uključuju F(ab)2bispecifično IgG antitelo koje sadrži CDR-e teškog i lakog lanca iz Tabele 1 I drugo antitelo koje se veže za različit epitop.
Terapijski postupci
[0111] Ovo izlaganje obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju virusne infekcije (npe., koronavirusne infekcije) davanjem terapeutski efikasne količine anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta, (npr., iz Tabele 1) subjektu (npr., humanom) kome je potreban takav tretman ili prevencija.
[0112] Koronavirusna infekcija se može lečiti ili prevenirati, kod subjekta, primenom anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina iz predmetnog pronalaska subjektu.
[0113] Efikasna ili terapeutski efikasna doza anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili fragmenta za vezivanje antigena (npr., iz Tabele 1), za lečenje ili prevenciju virusne infekcije se odnosi na količinu antitela ili fragmenta koja je dovoljna da bi se ublažili jedan ili više znakova i/ili simptoma infekcije kod lečenog subjekta, bilo indukovanjem regresije ili eliminacijom takvih znakova i/ili simptoma ili inhibicijom progresije takvih znakova i/ili simptoma. Količina doze se može razlikovati u zavisnosti od godina i veličine subjekta kome je namenjeno davanje, ciljane bolesti, stanja, načina davanja, i slično. U aspektu iz ovog prikaza, efikasna ili terapeutski efikasna doza antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena iz predmetnog pronalaska, za lečenje ili prevenciju virusne infekcije, npr., u odraslom humanom subjektu, je oko 0.01 do oko 200 mg/kg, npr., do oko 150 mg/kg. U aspektu iz prikaza, doza je do oko 10.8 ili 11 grama (npr., oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 grama). U zavisnosti od težine infekcije, učestalost i trajanje tretmana može biti prilagođeno. U određenim aspektima, antigen-vezujući protein iz predmetnog pronalaska može se primeniti u početnoj dozi, nakon čega slede jedna il više sekundarnih doza. U određenim aspektima, početna doza se može pratiti sa davanjem druge ili mnoštva dodatnih doza antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen u količini koja može biti približno ista ili manja u odnosu na početnu dozu, pri čemu su dodatne doze odvojene sa najmanje 1 danom do 3 dana; najmanje jednu nedelju, najmanje 2 nedelje; najmanje 3 nedelje; najmanje 4 nedelje; najmanje 5 nedelja; najmanje 6 nedelja; najmanje 7 nedelja; najmanje 8 nedelja; najmanje 9 nedelja; najmanje 10 nedelja; najmanje 12 nedelja; ili najmanje 14 nedelja.
[0114] Kao što je ovde korišćen, termin "subjekt" se odnosi na sisara (npr., pacov, miš, mačka, pas, krava, svinja, ovca, konj, koza, zec), poželjno humano biće, na primer, u potrebi za prevenciji i/ili lečenje bolesti ili poremećaja kao što je virusna infekcija ili kancer. Subjekt može imati virusnu infekciju, npr., infekcija influencom, ili koji je u predispoziciji za razvoj infekcije. Subjekti koji se nalaze u predispoziciji za razvijanje infekcije, ili subjekti koji se mogu nalaziti u povećanom riziku za dobijanje infekcije (npr., koronavirus ili virus influence), uključuju subjekte sa kompromitovanim imunskim sistemom zbog autoimunske bolesti, subjekti koji prijamu imunosupresivnu terapiju (na primer, koje sledi nakon transplantiranja organa), subjekti koji su pogođeni sindromom imunodeficijencije kod čoveka (HIV) ili sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS), subjekti sa oblicima antemije koja iscrpljuje ili uništava ćelije belih krvnih zrnaca, subjekti koji primaju zračenje ili hemioterapiju, ili subjekti koji su pogođeni sa inflamatornim poremećajem. Dodatno, subjekti koji su veoma mladi (pr., 5 godina starosto ili mlađi) ili stariji (npr., 65 godina stari ili stariji) su u povećanom riziku. Osim toga, subjekt može biti u riziku da dobije virusnu infekciju zbog blizine izbijanja bolesti, npr. subjekt koji se nalazi u gusto-naseljenom gradu u blini subjekata koji imaju potvrđenu ili se sumnja da imaju virusnu infekciju, ili izbor posla, npr. radnik u bolnici, farmaceutski istraživač, putnik u inficiranim oblastima, ili osoba koja često leti.
[0115] "Lečenje" ili "lečiti" se odnosi na primenu anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili fragmenta za vezivanje antigena iz predmetnog pronalaska (npr., iz Tabele 1), subjektu koji ima jedan ili više informacija ili simptoma bolesti ili infekcije, npr., virusne infekcije, za koju je efikasan antigen-vezujući protein kada se daje subjektu u efikasnoj ili terapeutski efikasnoj količini ili dozi (kao što je ovde razmatrano).
[0116] Ovo izlaganje takođe obuhvata profilaktičku primenu anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena ovog izlaganja (npr., Tabela 1), subjektu koji je u riziku od virusne infekcije tako da bi se sprečila takva infekcija. Pasivna imuoprofilaksa koja je zasnovana na antitelu je dokazana kao efikasna strategija za prevenciju virusne infekcije kod subjekta. Videti npr., Berry et al., Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis. Influenza Res Treat.
2014; 2014:267594. Epub 2014 Sep 22; i Jianqiang et al., Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections, Immunotherapy. 2012 February; 4(2): 175-186; Prabhu et al., Antivir Ther. 2009;14(7):911-21, Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenza. "Sprečiti" ili "prevencija" znači primenu anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta iz ovog izlaganja (npr., iz Tabele 1), subjektu za inhibiciju ispoljavanja bolesti ili infekcije (npr., virusne infekcije) u telu subjekta, za koje je antigen-vezujući protein efikasan kada se primenjuje subjektu u efikasnoj ili terapeutski efikasnoj količini ili dozi (kao što je ovde razmotreno).
[0117] U aspektu iz prikaza, znak ili simptom virusne infekcije kod subjekta je preživljavanje ili proliferacija virusa u telu subjekta, npr., kao što je određeno testom virusnog titra (npr., propagacija koronavirusa u embrionisanim kokošjim jajima ili testu koronavirusnog spajk proteina). Drugi znaci i simptomi virusne infekcije su ovde razmatrani.
[0118] Kao što je gore naznačeno, u nekim aspektima subjekat može biti ne-humana životinja, I antigen-vezujući proteini (npr., antitela i antigen-vezujući fragmenti) koji su ovde razmotreni mogu se koristiti u veterinarskom kontekstu za lečenje i/ili prevenciju bolesti u ne-humanim životinjama (npr., mačke, psi, svinje, krave, konji, koze, zečevi, ovca, i slično).
[0119] Ovo izlaganje obezbeđuje postupak za lečenje ili sprečavanje virusne infekcije (npr., koronavirusna infekcija) ili za indukciju regresije ili eliminacije ili inhibiranja progresije najmanje jednog znaka ili simptoma virusne infekcije kao što je:
• groznica ili osećaj groznice/jeza;
• kašalj;
• upaljeno grlo;
• curenje ili zapušen nos;
• kijanje;
• bolovi u mišićima ili telu;
• glavobolje;
• umor (zamor);
• povraćanje;
• dijareja;
• infekcija respiratornog trakta;
• nelagoda u grudima;
• kratak dah;
• bronhitis; i/ili
• pneumonija,
koji znak ili simptom je sekundaran u odnosu na virusnu infekciju, kod subjekta kome je potrebno (npr., čovek), davanjem terapijski efikasne količine anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina (npr., iz Tabele 1) subjektu, na primer, ubrizgavanjem proteina u telo subjekta.
4
Kombinacije i farmaceutske kompozicije
[0120] Da bi se pripremile farmaceutske kompozicije anti-CoV-S antigen-vezujućih proteina, npr., antitela i njihovi fragmenti za vezivanje antigena (npr., iz Tabele 1), antigen-vezujući protein je pomešan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences i U.S. Farmakopeja: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman i Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner i Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. U izvođenju iz pronalaska, farmaceutska kompozicija je sterilna. Takve kompozicije predstavljaju deo ovog pronalaska.
[0121] Obim ovog izlaganja uključuje isušene, npr., osušene zamrzavanjem, kompozicije koje sadrže anti-CoV-S antigen-vezujuće proteine, npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena (npr., iz Tabele 1), ili njegovu farmaceutsku kompoziciju koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač ali suštinski nedostaje voda.
[0122] U daljem aspektu izlaganja, drugo terapijsko sredstvo koje je davano subjektu zajedno sa anti-CoV-S antigen-vezujućim proteinom, npr., antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., iz Tabele 1), koji je ovde prikazan je davan subjektu u skladu sa Physicians’ Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (Nov.1,2002)).
[0123] Način davanja se može razlikovati. Načini davanja uključuju oralno, rektalno, transmukozalno, intestinalno, parenteralno; intramuskularno, subkutano, intradermalno, intramedularno, intratekalno, direktno intraventrikularno, intravenozno, intraperitonealno, intranazalno, intraokularno, inhalacijom, insuflacijom, lokalno, kutanozno, transdermalno ili intra-arterijski.
[0124] Ovo izlaganje obezbeđuje postupke za davanje anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena (npr., iz Tabele 1), koji sadrži uvođenje proteina u telo subjekta. Na primer, postupak sadrži probijanje tela subjekta iglom šprica i ubrizgavanje antigenvezujućeg proteina u telo subjekta, npr., u venu, arteriju, tumor, mišićno tkivo ili subkutis subjekta.
[0125] Ovo izlaganje obezbeđuje posudu (npr., plastičnu ili staklenu bočicu, npr., sa kapom ili hromatografskom kolonom, igla sa šupljim otvorom ili cilindar šprica) koji sadrži bilo koji od anti-CoV-S antigen-vezujućih proteina (npr., antitela ili njihove fragmente za vezivanje antigena (npr., iz Tabele 1), polipeptide (npr., HC, LC, VHili VLiz Tabele 1) ili polinukleotide (npr., iz Tabele 2) ili ovde prikazane vektore ili njihovu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0126] U aspektu iz ovog izlaganja, anti-CoV-S antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigen iz ovog izlaganja (npr., iz Tabele 1), je davan zajedno sa jednim ili više drugih terapijskih sredstava. Drugo terapijsko sredstvo uključuje, ali bez ograničenja na: antiinflamatorno sredstvo, antimalarijsko sredstvo, drugo antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji specifično veže TMPRSS2, i drugo antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično veže za CoV-S. U nekim aspektima, antimalarijsko sredstvo je hlorokin ili hidroksihlorokin. U nekim aspektima, antiinflamatorno sredstvo je antitelo kao što je sarilumab, tocilizumab, ili gimsilumab. U nekim aspektima, drugo terapeutsko sredstvo je drugo antitelo ili ovde prikazani fragment za vezivanje antigena, npr., iz Tabele 1. U određenim aspektima, jedan, dva, tri, četiri, ili više antitela, ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena, iz Tabele 1 mogu se davati u kombinaciji (npr., istovremeno ili sekvencijalno). Određene kombinacije antitela iz Tabele 1 su navedene ispod u Tabeli primera kombinacija antitela, (svaki broj predstavlja specifičnu kombinaciju, npe., mAt10989 i mAt10987 je Kombinacija 1, mAt10989 i mAt10934 je Kombinacija 2, i tako dalje). U nekim aspektima, kombinacija antitela može biti odabrana između onih koji se vezuju za različite klastere epitopa. Na primer, određena ovde opisana antitela pripadaju klasterima epitopa kao što sledi: Klaster 1, mAt10987, mAt10922, mAt10936, i mAt10934; Klaster 2, mAt10989, mAt10977, i mAt10933; Klaster 3, mAt 10920; Klaster 4, mAt10954, mAt10986, i mAt10964; i Klaster 5, mAt10984. Prema tome, kombinacija dva antitela može biti odabrana iz, na primer, Klastera 1 i Klastera 2, Klastera 1 i Klastera 3, Klastera 1 i Klastera 4, Klastera 1 i Klastera 5, Klastera 2 i Klastera 3, Klastera 2 i Klastera 4, Klastera 2 i Klastera 5, Klastera 3 i Klastera 4, Klastera 3 i Klastera 5, i Klastera 4 i Klastera 5. U nekim aspektima, antitelo koje se specifično veže za TMPRSS2 je H1H7017N, kao što se opisuje u Međunarodnoj objavi patenta Br. WO/2019/147831.
la itetanija ac bin
ko a erpri ela ab T
[0127] U nekim aspektima, anti-CoV-S antigen-vezujući proteini (npr., antitela protiv SARS-CoV-2-S ili njegovi fragmenti za vezivanje antigena) iz različitih humanih donora mogu biti kombinovani. Ovo izlaganje uključuje kompoziciju koja sadrži dva (ili više) anti-SARS-CoV-2-S antitela ili antigen-vezujuća fragmenta koji sadrže varijabilne domene iz humanih subjekata, pri čemu dva (ili više) antitela ili antigen-vezujuća fragmenta su izvedena iz različitih subjekata (npr., dva različita humana subjekta). Razmatrani su varijabilni regioni antitela koji su izvedeni iz humanih B ćelija, npr., u Primerima 1 i 2 (Tabela 3), koji opisuju da varijabilni domeni klonirani iz takvih B ćelija su kombinovani sa konstantnim regionom ne iz onih B ćelija da bi se proizvela hibridna antitela. Izvor (Donor) takvih varijabilnih regiona antitela je prikazan u Tabeli Primera Humanih-izvedenih varijabilnih regiona antitela, ispod. U nekim aspektima, kompozicija može sadržati kombinaciju antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena sa varijabilnim domenima koji su izvedeni iz donora 1 i antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena sa varijabilnim domenima koji su izvedeni iz donora 2. U nekim aspektima, kompozicija može sadržati kombinaciju antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena sa varijabilnim domenima koji su izvedeni iz donora 1 i antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena sa varijabilnim domenima koji su izvedeni iz donora 3. U nekim aspektima, kompozicija može sadržati kombinaciju antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena sa varijabilnim domenima koji su izvedeni iz donora 2 i antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena sa varijabilnim domenima koji su izvedeni iz donora 3. U nekim aspektima, kompozicija može sadržati kombinaciju mAt10987 (npr., antitela koje sadrži CDRs, varijabilne regione, ili sekvence teškog i lakog lanca koje su prikazane u Tabeli 1) iz Donora 1, i mAt10989 (npr., antitelo koje sadrži CDRs-e, varijabilne regione, ili sekvence teškog i lakog lanca koje su prikazane u Tabeli 1) iz Donora 3.
Tabela primera Humanih-izvedenih
varijabilnih regiona antitela
mAt Donor
mAt10954 Donor 3
mAt10955 Donor 3
mAt10956 Donor 3
mAt10957 Donor 3
mAt10964 Donor 1
mAt10965 Donor 2
mAt10966 Donor 3
mAt10967 Donor 3
mAt10970 Donor 1
mAt10971 Donor 1
mAt10977 Donor 1
mAt10984 Donor 1
mAt10985 Donor 1
mAt10986 Donor 1
mAt10987 Donor 1
mAt10988 Donor 3
mAt10989 Donor 3
mAt10969 Donor 1
[0128] U nekim aspektima, drugo terapijsko sredstvo je anti-virusni lek i/ili vakcina. Kao što je ovde korišćen, termin "anti-virusni lek" se odnosi na bilo koji anti-infektivni lek ili terapiju koja je korišćena za lečenje, prevenciju, ili ublažavanje virusne infekcije kod subjekta. Termin "anti-virisni lek" uključuje, ali nije ograničen na katjonski steroid antimiktobni, leupeptin, aprotinin, ribavirin, ili interferon-alfa2b. Postupci za lečenje ili prevenciju virusne (npr., koronavirusne) infekcije kod subjekta kome je potreban takav tretman ili prevencija davanjem antitela ili fragmenta za vezivanje antigena iz Tabele 1 zajedno sa drugim terapijskim sredstvom su deo ovog izlaganja.
[0129] Na primer, u aspektu ovog izlaganja, drugo terapijsko sredstvo je vakcina, npr., koronavirusna vakcina. U aspektu izlaganja, vakcina je vakcina inaktivisanog/ubijenog virusa, vakcina život atenuiranog virusa ili vakcina virusne pojedinice.
[0130] Na primer, u aspektu izlaganja, drugo terapeutsko sredstvo je:
(kamostat mezilat);
(nafamostat mezilat);
(bromheksin hidrohlorid (BHH));
(4-(2-aminometil)benzensulfonil fluorid hidrohlorid (AEBSF));
4
ili
(poliamid). Videti Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017).
[0131] U aspektu izlaganja, anti-virusni lek je antitelo ili fragment za vezivanje antigena koji se specifično veže za koronavirus, npr., SARS-CoV-2, SARS-CoV, ili MERS-CoV. Primer anti-CoV-S antitela uključuje, ali nije ograničen na: H4sH15188P; H1H15188P; H1H15211P; H1H15177P; H4sH15211P; H1H15260P2; H1H15259P2; H1H15203P; H4sH15260P2; H4sH15231P2; H1H15237P2; H1H15208P; H1H15228P2; H1H15233P2; H1H15264P2; H1H15231P2; H1H15253P2; H1H15215P; i H1H15249P2, kao što je predstavljeno u objavi br. WO/2015/179535 Međunarodne prijave patenta, ili njegovom fragmentu za vezivanje antigena, npr., gde antitelo ili fragment sadrži laki lanac imunoglobulina koji uključuje CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 (npr., VLili njegov laki lanac); i težak lanac koji uključuje CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 (npr., VHili njegov težak lanac) bilo kojih od prethodno navedenih anti-CoV-S antitela.
[0132] U određenom aspektu izlaganja, drugo terapeutsko sredstvo nije aprotinin, leupeptin, katjonski steroid antimikrobni, influenca vakcine (npr., ubijeni, živi, atenuirani celi virus ili podjedinica vakcine), ili antitelo protiv virusa influence (npr., anti-hemaglutinin antitelo).
[0133] Termin "u vezi sa" označava da komponente, anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena iz predmetnog pronalaska, zajedno sa drugim sredstvom, mogu biti formulisani u pojedinačnoj kompoziciji, npr., za istovremenu isporuku, ili formulisani odvojeno u dve ili više kompozicija (npr., kit). Svaka komponenta se može davati subjektu u različitom vremenu u odnosu na to kada se daje druga komponenta; na primer, svako davanje se može primeniti ne-istovremeno (npr., odvojeno ili sekvencijalno) u intervalima tokom datog vremenskog perioda. Osim toga, odvojene komponente se mogu davati subjektu istim ili različitim načinom primene (npr., gde anti-CoV-S antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena.
4
Kitovi
[0134] Dalje su obezbeđeni kitovi koji sadrže jednu ili više komponenti koje uključuju, ali nisu ograničene na, anti-CoV-S antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili antigen-vezujući fragment kao što je ovde razmatrano (npr., u Tabeli 1), u vezi sa jedno ili više dodatnih komponenti uključujući, ali bez ograničenja na, drugo terapeutsko sredstvo, kao što je ovde razmotreno. Antigen-veujući protein i/ili drugo terapeutskog sredstvo može biti formulisano kao pojedinačna kompozicija ili odvojeno u dve ili više kompozicija, npr., sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, u farmaceutskoj kompoziciji.
[0135] U jednom aspektu iz izlaganja, kit uključuje anti-CoV-S antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena iz izlaganja (npr., iz Tabele 1), ili njegova farmaceutska kompozicija u jednom kontejneru (npr., u sterilnoj staklenoj ili plastičnoj bočici) i drugo terapeutsko sredstvo u drugom kontejneru (npr., u sterilnoj staklenoj ili plastičnoj bočici).
[0136] U drugom izvođenju, kit sadrži kombinaciju iz izlaganja, uključujući anti-CoV-S antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena iz izlaganja (npr., iz Tabele 1), ili njegova farmaceutska kompozicija u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava formulisanih zajedno, po potrebi, u farmaceutskoj kompoziciji, u pojedinačnom, zajedničkom kontejneru.
[0137] Ukoliko kit uključuje farmaceutsku kompoziciju za parenteralno davanje subjektu, kit može uključiti uređaj (npr., uređaj za ubrizgavanje) za sprovođenje takvog davanja. Na primer, kit može uključiti jednu ili više hipodermičnih igala ili druge uređaje za ubrizgavanje kao što je gore razmatrano koji sadrže anti-CoV-S antigen-vezujući protein, npr., antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema ovom izlaganju (npr., iz Tabele 1).
[0138] Kit može sadržati umetak za pakovanje uključujući informaciju koja se tiče farmaceutskih kompozicija i doznih oblika u kitu. Generalno, takva informacija pomaže pacijentima i lekarima u upotrebi priloženih farmaceutskih kompozicija i doznih oblika efikasno i bezbedno. Na primer, sledeća informacija koja se odnosi na kombinaciju iz pronalaska može biti dopunjena u insertu: farmakokinetike, farmakodinamike, kliničke studije, parametri efikasnosti, indikacije i upotreba, kontraindikacija, upozorenja, mere predostrožnosti, neželjene reakcije, predoziranje, odgovarajuća doza i primena, način snabdevanja, odgovarajući uslovi skladištenja, reference, proizvođač/distributer informacija i informacija o patentu.
Diagnostičke upotrebe antitela
[0139] Anti-CoV-S antigen-vezujući proteini, npr., antitela ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena iz ovog izlaganja (npr., iz Tabele 1), mogu se koristiti za detekciju i/ili merenje CoV-S u uzorku. Primeri testova za CoV-S mogu uključiti, npr., dovođenje u kontakt uzorka sa anti-CoV-S antigen-vezujućim proteinom iz izlaganja, pri čemu anti-CoV-S antigen-vezujući protein je obeležen sa detektabilnim obeleživačem ili reporterskim molekulom ili je korišćen kao ligand za hvatanje da bi se CoV-S selektivno izolovao iz uzorka. Prisustvo anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina kompleksiranog sa CoV-S ukazuje na prisustvo CoV-S u uzorku. Alternativno, neobeleženo anti-CoV-S antitelo se može korisiti u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo po sebi detektabilno obeleženo. Detektabilni obeleživač ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, or<125>I; fluorescentni ili hemiluminiscentni ostatak kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Specifični primeri testova koji se mogu koristiti za detekciju ili merenje CoV-S u uzorku uključuju testove neutralizacije, enzimski-vezan imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA), i fluorescentno-aktivisano ćelijsko sortiranje (FACS). Prema tome, ovo izlaganje uključuje postupak za detekciju prisustva polipeptida spajk proteina u uzorku koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka sa anti-CoV-S antigen-vezujućim proteinom i
4
detekciju prisustva CoV-S/anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina pri čemu prisustvo kompleksa ukazuje na prisustvo CoV-S.
[0140] Anti-CoV-S antigen-vezujući protein iz prikaza (npr., iz Tabele 1) može se koristiti u “Western” blotu ili postupku imuno-proteinskog blota za detekciju prisustva CoV-S ili njegovog fragmenta u uzorku. Takav postupak obrazuje deo ovog izlaganja i uključuje korake npr.:
(1) obezbeđivanja membrane ili drugog čvrstog supstrata koji sadrži uzorak koji je potrebno testirati za prisustvo CoV-S, npr., opciono uključujući korak prenošenja proteina iz uzorka koji je namenjen ispitivanju za prisustvo CoV-S (npr., iz PAGE ili SDS-PAGE elektroforetskog razdvajanja proteina u uzorku) na membranu ili drugi čvrsti supstrat upotrebom postupaka koji su poznati u oblasti tehnike (npr., polu-suvo blotovanje ili blotovanje u rezervoaru); i dovođenja membrane u kontakt ili drugog čvrstog supstrata koji je namenjen za testiranje za prisustvo CoV-S ili njegovog fragmenta sa anti-CoV-S antigen-vezujućim proteinom iz izlaganja. Takva membrana može imati oblik, na primer, nitroceluloze ili zasnovana na vinilu (npr., poliviniliden fluorid (PVDF)) membrana na koju su preneti proteini koje je potrebno ispitati za prisustvo CoV-S u nedenaturišućem PAGE (poliakrilamidnoj gel elektroforezi) gelu ili SDS-PAGE (natrijum dodecil sulfatnoj poliakrilamidnoj gel elektroforezi) gelu (npr., nakon elektroforetskog razdvajanja u gelu). Pre dovođenja u kontakt membrane sa anti-CoV-S antigen-vezujućim proteinom, membrana je po potrebi blokirana, npr., sa nemasnim suvim mlekom ili sličnim da bi se omogućilo vezivanje nespecifičih mesta vezivanja na membrane.
(2) ispiranje membrane jednom ili više puta da bi se uklonio nevezani anti-CoV-S antigenvezujući protein i druge nevezane supstance; i
(3) detekcija vezanog anti-CoV-S antigen-vezujućeg proteina.
[0141] Detekcija vezanog antigen-vezujućeg proteina ukazuje na CoV-S protein koji se nalazi na membrani ili supstratu i u uzorku. Detekcija vezanog antigen-vezujućeg proteina može biti pomoću vezivanja antigen-vezujućeg proteina sa sekundarnim antitelom (anti-imunoglobulinsko antitelo) koje je detektabilno obeleženo i, zatim, detekcija prisustva sekundarnog obeleženog antitela.
[0142] Anti-CoV-S antigen-vezujući proteini (npr., antitela i antigen-vezujući fragmenti (npr., iz Tabele 1)) koji su ovde prikazani mogu se takođe korstiti za imunohistohemiju. Takav postupak obrazuje deo predmetnog pronalaska i sadrži, npr.,
(1) dovođenja u kontakt tkiva koje je namenjeno ispitivanju za prisustvo CoV-S proteina sa anti-CoV-S antigen-vezujućim proteinom iz pronalaska; i
(2) detekcije antigen-vezujućeg proteina na ili u tkivu.
[0143] Ukoliko je sam antigen-vezujući protein detektabilno obeležen, može se detektovati direktno. Alternativno, antigen-vezujući protein se može vezati detektabilno obeleženim sekundarnim antitelom pri čemu se obeleživač nakon toga detektuje.
PRIMERI
[0144] Sledeći primeri su predstavljeni da bi se obezbedilo pojedincima koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike potpuno izlaganje i opis kako napraviti i upotrebiti postupke i kompozicije iz pronalaska i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Uloženi su napori da bi se osigurala tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperatura, itd.) ali određene eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su delovi u odnosu na masu, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, sobna temperatura je oko 25°C, i pritisak je na ili je blizu atmosferskom.
4
Primer 1: Generisanje humanih antitela na SARS-CoV-2 spajk protein (SARS-CoV-2-S)
[0145] Humana antitela na SARS-CoV-2-Spajk protein (SARS-CoV-2-S) su generisana u VELOCIMMUNE<®>mišu koji sadrže DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina ili varijabilne regione teškog i lambda lakog lanca humanog imunoglobulina. Svaki miš je imunizovan sa vektorom koji eksprimira SARS-CoV-2-S receptor vezujući domen (RBD) (Aminokiseline 1-1273 NCBI pristupnog broja (MN908947.3), SEQ ID NO: 832), nakon čega sledi pojačanje sa SARS-CoV-2-S vektorom ili SARS-CoV-2-S proteinom. Imuni odgovor antitela je praćen sa SARS-CoV-2-S-specifičnim imunskim testom. Kada je postignut željeni imunski odgovor, limfociti su sakupljeni i spojeni su sa ćelijama mijeloma miša da bi se sačuvala njihova vijabilnost i formirale linije ćelija hibridoma. Sproveden je skrining linija ćelija hibridoma i odabrane su za identifikovanje ćelijskih linija koje proizvode SARS-CoV-2-S-specifična antitela. Anti-SARS-CoV-2-S antitela su takođe direktno izolovana iz antigen-pozitivnih B ćelija miša bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u U.S. Patentu 7582298, ovde specifično uključeno referencom u njenoj celosti. Uportebom ovog postupka, potpuno humana anti-SARS-CoV-2-S antitela (tj., dobijena su antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene).
[0146] Varijabilni regioni antitela su takođe izolovani iz uzoraka humane krvi. Puna krv je dobijena iz pacijenata 3-4 nedelja posle laboratorijski-potvrđenog PCR pozitivnog testa ua SARS-CoV-2 i simptomatske COVID-19 bolesti. Crvena krvna zrnca su lizirana upotrebom pufera za lizu zasnovanog na amonijum hloridu (Life Technologies) i B ćelije su obogaćene negativnom selekcijom. Pojedinačne B ćelije koje vežu SARS-CoV-2 spajk protein su izolovane upotrebom fluorescentno-aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS). Izolovane B ćelije su zasejane u jedan bunarčić i pomešane sa PCR prajmerima specifičnim za laki i težak varijabilni region antitela. cDNK za svaku pojedinačnu B ćeliju su sintetisane preko reakcije reverznom transkriptazom (RT). Svaki dobijeni RT proizvod je nakon toga podeljen i prenet u dva odgovarajuća bunarčića za sledeće PCR-e teškog i lakog lanca antitela. Jedan set dobijenih RT proizvoda je prvo amplifikovan sa PCR upotrebom 5’ degenerisanog prajmera specifičnog za lider sekvencu teškog varijabilnog regiona antitela ili 5’ degenerisani prajmer specifičan za lider sekvencu lakog varijabilnog regiona antitela i 3’ prajmer specifičan a konstantni region antitela, da bi se obrazovao amplikon. Amplikoni su zatim ponovo amplifikovani korišenjem PCR upotrebom 5’ degenerisanog prajmera specifičnog za region okvira 1 teškog varijabilnog regiona antitela ili 5’ degenerisanog prajmera specifičnog za region okvira 1 lakog varijabilnog regiona antitela i 3’ prajmer specifičan za konstantni region antitela, da bi se generisali amplikoni za kloniranje. PCR proizvodi izvedeni iz teškog lanca i lakog lanca antitela su klonirani u ekspresione vektore koji sadre teški konstantni region i laki konstantni region, tim redom, time proizvodeći ekspresione vektore za hibridna antitela. Ekspresioni vektori koji eksprimiraju pune dužine parove teškog i lakog lanca su transfektovani u CHO ćelije da bi se proizveli proteini antitela za testiranje.
[0147] Biološke osobine primera antitela generisanih u skladu sa postupcima iz ovog Primera su detaljno opisani u Primerima predstavljenim u tesktu ispod.
Primer 2: Aminokiselinske i nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca
[0148] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca i CDR-a, kao i sekvence teškog i lakog lanca, primera anti-SARS-CoV-2-S antitela. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su predstavljeni u Tabeli 2.
4
Tabela 1: Identifikatori aminokiselinske sekvence
(nastavak)
1 (nastavak)
Tabela 2: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline
2
(nastavak)
(nastavak)
4 (nastavak)
[0149] Antitela koja su ovde izvedena imaju potpuno humane varijabilne regione ali mogu imati mišje konstantne regione (npr., mišji IgG1 Fc ili mišji IgG2 Fc (a ili b izotipa)) ili humane konstantne regione (npr., humani IgG1 Fc ili humani IgG4 Fc). Kao što će biti jasno osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo sa određenim Fc izotipom može se prevesti u antitelo sa različitim Fc izotipom (npr., antitelo sa mišjim IgG1 Fc može se prevesti u antitelo sa humanim IgG4, itd.), ali u bilo kom događaju, varijabilni domeni (uključujući CDR-e) – koji su naznačeni numeričkim identifikatorima prikazanim u Tabelama 1 i 2 će ostati isti, i osobine vezivanja za antigen su očekivane da budu identične ili suštinski slične bez obzira na prirodu konstantnog domena.
[0150] Varijabilni regioni antitela poreklom iz VELOCIMMUNE® miševa i iz humanih uzoraka su sekvencirani korišćenjem sekvenciranja sledeće generacije i identifikovan je repertoar za parove teškog i lakog lanca (Slika 10A i Slika 10B). Predominantna linija VI antitela koristiala je VH3-53 uparene sa VK1-9, VK1-33, ili VK1-39 dok su antitela izvedena iz čoveka koristila VH3-66 uparene sa VK1-33 ili VH2-70 uparene sa VK1-39. Dalja analiza preklapajućih sekvenci pokazala je snažno preklapanje u repertoaru izolovanih kapa lanaca između VI i antitela izvedenih iz čoveka. Iako repertoar lambda lanaca se nije tako dobro poklapao, što može biti zbog toga što su samo dva lambda miša bila uključena u ovo ispitivanje. Prosečna dužina CDR za težak lanac je bila slična između VI i antitela izvedenih iz čoveka sa prosečnom dužinom 13 i 14.5 aminokiselina, tim redom. Prosečna dužina kapa CDR bila je ista za VI i antitela izvedena iz čoveka na 9 aminokiselina i bila je blizu lambda lanaca sa prosečnom dužinom od 11.1 i 10.6 aminokiselina, tim redom. Dostupnost humanizovanih miševa i antitela izvedenih iz čoveka omogućava veću raznolikost V gena i omogućava kasniju idenitifikaciju nekompetitivnih antitela.
[0151] Kao što je gore opisano, antitela su dobijena iz hibridoma koji su generisani iz VELOCIMMUNE® miševa, direktnom izolacijom iz antigen-pozitivnih VELOCIMMUNE® mišjih B ćelija, ili su izvedena iz varijabilnih regiona kloniranih iz antigen-pozitivnih humanih B ćelija. Sažetak ovih izvora je prikazan u Tabeli 3.
Tabela 3: Izvori Antitela/Varijabilnih regiona
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
Primer 3: Karakterizacija supernatanata hibridoma pomoću ELISA vezujućeg testa
[0152] ELISA test vezivanja je sproveden da bi se identifikovala antitela supernatanata koja se vežu za domen za vezivanje receptora za SARS-CoV-2-Spajk (RBD). Protein koji se sastoji iz RBD SARS-CoV-2 (aminokiseline 319-541) eksprimiran sa 6X histidinskim tag-om i dva myc epitop tag-a na C-terminusu (SARS-CoV-2-S-RBD-mmH; videti pristupni broj NCBI MN908947.3) je obložen na 1 µg/ml na ploči sa 96-bunarčića u PBS puferu preko noći na 4°C. Nespecifična mesta vezivanja su naknadno blokirana upotrebom 0.5% (mas/v) rastvora BSA u PBS. Supernatanti antitela ili sam medijum su razblaženi 1:40 ili 1 :50 u PSA+0.5% BSA blokirajućem puferu i preneti su na isprane mikrotitarske ploče. Nakon jednog sata inkubacije na sobnoj temperaturi, bunarčići su isprani, i supernatant koji je vezan za ploču je detektovan pomoću kozjeg-anti-humanog IgG antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson Immunoresearch), ili anti-mišjim IgG antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson Immunoresearch). Ploče su zatim razvijene pomoću rastvora TMB supstrata (BD Biosciences) u skladu sa preporukom proizvođača i izmerena je apsorbanca na 450nm na Viktor X5 čitaču ploča.
[0153] Ispitana je sposobnost anti-SARS-CoV-2-S antitela da vežu domen vezivanja receptora za SARS-CoV-2-S (SARS-CoV-2-S-RBD), kao što je gore opisano, upotrebom ELISA vezivanja sa SARS-CoV-2-S-RBD-mmH proteinom obloženim na mikroploči. Vezivanje u jednoj tački supernatanta antitela za SARS-COV-2-S-RBD-mmH obloženim na mikrotitarskim pločama sa 96-bunaričića je detektovano sa HRP konjugovanim anti-hFc ili anti-mFc antitelom.
[0154] Rezultati vezivanja tri ispitivanja su predstavljeni u Tabeli 4. Signali vezivanja SARS-CoV-2 (absorbancija 450nm) su naznačeni, sa pozadinom samo medijuma koja je obezbeđena kao negativna referenca po eksperimentu. Uzorak koji je označen sa IC (Nepotvrđen) imao je eksperimentalnu anomaliju na ploči i zbog toga je prijavljen bez vrednosti. Kao što je prikazano u poređenju sa kontrolom samog medijuma, ispitani supernatanti su pokazali suštinsko vezivanje za SARS-CoV-2-S-RBD.
Tabela 4: Vezivanje supernatanta za domen vezivanja receptora za SARS-CoV-2 spajk protein
(nastavak)
Primer 4: Vezivanje antitela za česticu sličnu virusu koja eksprimira SARS-CoV-2-S
[0155] Dа bi se ispitala sposobnost panela anti-SARS-CoV-2-S monoklonskih antitela da se vežu za SARS-CoV-2 spajk glikoprotein, razvijen je in vitro test vezivanja korišćenjem čestica sličnih virusu koje eksprimiraju SARS-CoV-2 spajk (VLPs) u platiformi za detekciju koja je zasnovana na elektrohemiluminisceniji (MSD).
[0156] Da bi se prolazno eksprimirao SARS-CoV-2 spajk protein (NCBI pristupni broj MN908947.3, aminokiseline 16-1211; SEQ ID NO: 833), Vezikularni stomatitis virus (VSV) kome nedostaje glikoprotein G (VSV delta G) je pseudotipizovan sa SARS-CoV-2 spajk proteinom (VSV-SARS-CoV-2-S) i generisan u HEK293T ćelijama. Kao negativna kontrola vezivanja, VSV delta G je pseudotipizovan sa VSV G proteinom (VSV-G).
[0157] Eksperimenti su sprovedeni u skladu sa procedurom koja sledi. Dva tipa gore opisanih VLP-ova je razblaženo u PBS-u, zasejani u ploče sa ugljeničnim elektrodama sa 96-bunarčića (MULTI-ARRAY ploča visokog vezivanja, MSD), i inkubirani su preko noći na 4 °C da bi se mogućila adhezija VLP-ova. Nespecifična mesta vezivanja su blokirana sa 2% BSA (mas/v) u PBS-u u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi. Supernatanti koji sadrže antitela proizvedena iz SARS CoV-2-imunizovanih miševa ili inficiranih humanih seruma, zajedno sa kontrolama koje sadrže samo medijum koje su razblažene 1:10 ili 1:20 u 1x PBS 0.5% BSA puferu, su dodate na čestice koje su vezane za ploču. Ploče su nakon toga inkubirane tokom 1 h na sobnoj temperaturi uz mešanje, nakon čega su ploče isprane sa 1x PBS kako bi se uklonila nevezana antitela upotrebom perača za ploču AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Antitela koja su vezana za ploču su detektovana sa SULFO-TAGTM-konjugovanim antihumanim IgG antitelom (Jackson Immunoresearch) ili SULFO-TAGTM-konjugovanim anti-mišjem IgG antitelom (Jackson Immunoresearch) u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon pranja, ploče su razvijene sa Read Buffer (MSD) u skladu sa procedurom koja je preporučena od strane proizvođača i luminiscentni signali su zabeleženi sa SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development) instrumentom. Signali direktnog vezivanja (u RLU) su uhvaćeni, i izračunat je odnos VLP-ova koji eksprimiraju SARS-CoV-2-S prema irelevantnim VLP.
[0158] Sposobnost anti-SARS-CoV-2-S monoklonskih antitela da se vežu za VLP-ove koji eksprimiraju SARS-CoV-2-S u poređenju sa vezivanjem za irelevantne VLP-ove koje eksprimiraju VSV procenjena je upotrebnom testa imunskog vezivanja, kao što je gore opisano. Vezivanje u jednoj tački za imobilizovane VLP-ove na pločama visokog vezivanja sa 96-bunaričića (MSD) je sprovedeno sa supernatantom antitela razblaženja 1:10 ili 1:20, vezanog 1 h, i detektovanog upotrebom SULFO-TAGTM-konjugovanog anti-humanog IgG ili anti-mišjeg IgG antitela. Signali vezivanja iz elektrohemiluminescencije su zabeleženi na Sector Imager 600 (MSD). RLU vrednosti su određivane za vezivanje antitela sa VLP-ovima. Odnosi su izračunati poređenjem signala vezivanja VLP koji eksprimiraju SARS-CoV-2-S sa kontrolnim VLP-ovima.
[0159] Rezultati vezivanja iz tri eksperimenta su prikazani u Tabeli 5. Signal uočen iz SARS-COV-2-S-eksprimiranih VLPs označava vezivanje, dok poređenje sa negativnim VLPs obezbeđuje relativnu pozadinu. Uzorci samog medijuma obezbeđuju osnovne signale sekundarnog antitela koji se vezuju za uzorke bez supernatanta.46 antitela vezuju specifično na >4-puta većoj u odnosu na uzorke koji sadrže samo medijum (20-35 RLU) na SARS-CoV-2-S-koje eksprimiraju VLPs, sa opsegom signala vezivanja od 85-13,600 RLU. Odnosi SARS-CoV-2-S-eksprimiranih VSV: VSV-VLPs (negativna kontrola) u opsegu od 1.1-22.7, pri čemu mnogi imaju visoku pozadinu na VSV-VLPs. Odnos mAt11002 od 0.9 je verovatno usled niske koncentracije monoklonskih antitela u uzorku supernatanta.
Tabela 5: Vezivanje SARS-CoV-2-S VLP
1
(nastavak)
2 Primer 5: Neutralizacija antitelom VSV-SARS-CoV-2-S pseudovirusne infektivnosti
[0160] Da bi se ispitala sposobnost panela monoklonskih antitela protiv -SARS-CoV-2-S da bi se neutralisao SARS-CoV-2, razvijen je test in vitro neutralizacije korišćenjem VSV-SARS-CoV-2-S pseudovirusa.
[0161] Kao što je gore opisano, VSV pseudotip virusi su generisani prolaznom transfekcijom 293T ćelija sa plazmidom koji kodira za SARS-CoV-2 spajk protein. Ćelije su zasejane u ploče od 15 cm na 1.2X10<7>ćelija po ploči u DMEM kompletnom medijumu jedan dan pre transfekcije sa 15 µg/ploči DNK spajk proteina korišćenjem 125 µL Lipofektamina LTX, 30 µL PLUS reagensa, i do 3 mL Opti-Mem.24 h posle transfekcije, ćelije su isprane sa 10 mL PBS, zatim su inficirane sa MOI of 0.1 VSV<ΔG:mNeon>virusom u 10 mL Opti-Mem. Virus je inkubiran na ćelijama tokom 1 h, sa nežnim ljuljanjem svakih 10 minuta. Ćelije su isprane 3 puta sa 10 mL PBS-a, nakon čega su prekrivene sa 20 mL medijuma za infekciju pre inkubacije na 37 C, 5% CO2tokom 24 h. Supernatant je sakupljen u 250 mL epruvete za centrifugu na ledu, zatim je centrifugiran na 3000 oum u trajanju od 5 minuta do peleta bilo kojeg ćelijskog debrisa, alikvot na ledu, zatim je zamrznut na -80 °C. Infektivnost je ispitana na Vero ćelijama pre upotrebe u neutrališućim testovima. Ovaj materijal će biti označen sa VSV-SARS-CoV-2-S.
Test neutralizacije sa VSV-SARS-CoV-2-S
[0162] U danu 1, Vero ćelije su zasejane u 80% konfluentnosti u balonima T225. Da bi se ćelije zasejale, medijum je uklonjen sa ćelija, ćelije su isprane sa 20mL PBS (Gibco: 20012-043), i 5mL TrypLE je dodat i inkubiran tokom ~5 minuta na 37 °C dok se ćelije ne pomeraju.5 mL kompletnog DMEM je dodat za inaktivaciju tripsina, i pipetiran je gore i dole da bi se ćelije rasporedile. Da bi se resuspendovane ćelije izbrojale, 20,000 Vero ćelija je zasejano u 100 µL prethondno zagrejanog kompletnog DMEM po bunarčiću u crnu mikroploču od polistirena sa 96 bunarčića (Corning: 3904).
[0163] U danu 2, VSV-SARS-CoV-2-S je otopljen na ledu i razblažen 1:1 sa medijumom za infekciju.
[0164] U ploču sa V-dnom sa 96 bunarčića, razblaženje svakog supernatante je napravljeno u 60ul medijuma infekcije. Za medijume (negativih) kontrola, 60 µl razblaženog kondicioniranog medijuma je dodato u bunarčiće.60 µL razblaženih VSV-SARS-CoV-2-S je dodato u svaki bunarčić izuzev bunarčića sa kontrolnim medijumom. U takve bunarčiće, dodato je 60 µL medijuma za infekciju. Pseudo-virusi su nakon toga inkubirani sa razblaženjima supernatanta u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi. Medijumi su uklonjeni sa ploča Vero ćelija, 100 µL smeša supernatant/pseudovirus je preneto na ćelje, i ploča je inkubirana na 37 °C, 5% CO2tokom 24 h. Finalna razblaženja supernatanta 1:4 i 1:20, i za neke uzorke 1:100, su korišćeni sa procenu neutralizacije VSV-SARS-CoV-2-S pseudovirusa.
[0165] U danu 3, nakon inkubacije od 24 h, supernatant je uklonjen iz bunarčića sa ćelijama i zamenjen je sa 100 µL PBS-a. Ploče su nakon toga očitane na SpectraMax i3 sa MiniMax citometrom za snimanje.
[0166] Sposobnost anti-SARS-CoV-2-S antitela da neutralizuju VSV-zasnovan SARS-CoV-2-S-eksprimirani pseudo-tipizirani virus je procenjena korišćenjem testa fokusa neutralizacije fluorescencije. Rezultati vezivanja iz tri testa su prikazani u tabeli ispod. Potencija neutralizacije antitela na svakom razblaženju je predstavljena kao procenat u poređenju sa lažnom kontrolom supernatanta. Sva antitela su pokazala neutrališući kapacitet, i naročito za set antitela koja su procenjena 1:100, ona koja pokazuju veću neutralizaciju mogu predstavljati potentniji neutrališući kapacitet.
Tabela 6: Neutralizacija VLP-ova
(nastavak)
4
[0167] Sposobnost antitela da ciljaju na spajk protein SARS-CoV-2 da interaguje sa FcyR3a, Fc-receptor koji je stabilno eksprimiran na prirodnim ćelijama ubicama (NK) da indukuje citotoksičnost posredovanu ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC), je izmerena u zamenskom biotestu korišćenjem reporterskih ćelija i ciljnih ćelija koje su vezane za antitela. U ovom testu su korišćene Jurkatove T ćelije koje su modifikovane da eksprimiraju reporterski gen luciferazu pod kontrolom faktora transkripcije NFAT (NFAT-Luc) zajedno sa visokoafinitetnim humanim FcγR3a<176>Val alotip receptorom (Jurkat/NFAT-Luc/hFcyR3a<176>Val). Ciljne ćelije su bile modifikovane Jurkatove T ćelije koje eksprimiraju humani CD20 (korišćen kao pozitivna kontrola sa CD20-ciljajućim humanim IgG1 antitelom) i SARS-CoV-2 spajk protein pune dužine koji je kontrolisan od strane doksiciklininducibilnim promotorom. Reporterske ćelije su inkubirane sa ciljnim ćelijama i angažman FcyR3a preko domena Fc humanih IgG1 antitela vezanih za ciljne ćelije je doveo do aktivacije transkripcionog faktora NFAT u reporterskim ćelijama i pokrenuo je ekspresiju luciferaze koja je nakon toga izmerena preko očitavanja luminiscencije.
[0168] Jurkatove T ćelije su modifikovane da konstitutivno eksprimiraju humani CD20 pune dužine (aminokiseline M1-P297 NCBI pristupni broj NP_690605.1), Tet3G transaktivatorski protein (kloniran korišćenjem Takara pEF1α-Tet3G Vektora, Katalog # 631167), kao i doksiciklinom-inducibilni pune dužine SARS-CoV-2 spajk protein (aminokiseline M1-T1273 NCBI pristupni broj YP_009724390.1). Modifikovane ćelije koje eksprimiraju Jurkat/Tet3G/hCD20/SARS-CoV2 spajk protein su sortirane za visoku ekspresiju spajk proteina nakon čega su održavane u RPMI 10% Tet-oslobođenom FBS P/S/G 500 µg/ml G418 1 µg/ml puromicin 250 µg/ml higromicin medijumu rasta.
[0169] Jurkatove T ćelije su modifikovane da stabilno eksprimiraju luciferazni reporterski konstrukt nuklearnog faktora aktiviranih T-ćelija (NFAT) zajedno sa visokoafinitenim humanim FcyR3a<176>Val alotip receptorom (aminokiseline M1-K254 NCBI pristupnog broja P08637 VAR_003960). Modifikovane reporterske ćelije su održavane u RPMI1640 10% FBS P/S/G 0.5 µg/ml puromicinu 500 µg/ml G418 medijumu za rast.
[0170] 36 h pre početka zamenskog ADCC testa, 5 X 10<5>ciljnih ćelija/ml je indukovano u RPMI 10% Tet-oslobođenim FBS P/S/G medijumu ćelijske kulture koji sadrži 1 µg/ml doksiciklina (Sigma). Dan pre početka eksperimenta, reporterske ćelije su podeljene u gustini od 7.5 X 10<5>ćelija/ml u RPMI 1640 10% FBS P/S/G 0.5 µg/ml puromicina 500 µg/ml G418 medijumu za rast.
[0171] Ukratno, u danu izvođenja eksperimenta, ciljne i reporterske ćelije su prenete u medijum testa (RPMI 10% Tet-oslobođen FBS P/S/G) i dodate su u odnosu 3:2 (3 X 10<4>/bunarčiću ciljne ćelije i 2 X 10<4>/bunarčiću reporterske ćelije) u bele mikrotitarske ploče sa 384 bunarčića, nakon čega sledi dodavanje supernatanta anti-SARS-CoV-2-S antitela u različitim koncentracijama. Pozitivna kontrola (CD20 antitelo sa humanim IgG1) uzorkom i uzorkom negativne kontrole koji ne sadrži antitelo je uključen na svakoj ploči da bi se normalizovale detektovane ADCC aktivnosti supernatanata anti-SARS-CoV-2-S antitela. Ploče su inkubirane na 37 °C/5% CO2tokom 5 h nakon čega sledi dodavanje jednake zapremine ONE-Glo<™>(Promega) reagensa za liziranje ćelija i detekciju aktivnosti luciferaze. Emitovana svetlost je uhvaćena u Relativnim Svetlosnim Jedinicama (RLU) na čitaču ploča sa više obeleživača Envision (PerkinElmer), i podaci su analizirani i normalizovani upotrebom sledeće jednačine:
Aktivnost (%) ADCC (Srednja RLU (ispitivani uzorci) – Srednja RLU (pozadinski signal))
(Srednja RLU (pozitivna kontrola) – Srednja RLU (pozadinski signal))
[0172] Sposobnost anti-SARS-COV-2-S antitela da aktiviraju FcγR3a receptore je procenjena u surogat ADCC testu upotrebom Jurkat/NFAT-Luc/FcyR3a<176>Val) kao reporterskim ćelijama i Jurkat/hCD20/SARS-CoV2 Spajk kao ciljnim ćelijama. Svako ispitano antitelo je sadržalo domen IgG1.
[0173] Tabela 7 daje pregled rezultata, pokazujući neobrađenu aktivnost luciferaze i označeni su izračunati % pozitivne kontrole. Opseg % ADCC aktivnosti je uočen ukazujući na FcyR3a aktivaciju pomoću supernatanata antitela. Svi uzorci su pokazali određenu meru surogat ADCC aktivnosti, i 10 antitela supernatanata je pokazalo bolju surogat ADCC aktivnost od one koja je uočena u pozitivnim kontrolama.
Tabela 7: ADCC surogat aktivnost supernatananta antitela protiv-SARS-CoV-2-S.
Primer 7: Test specifičnosti vezivanja antitela protiv-SARS-CoV-2-S
[0174] Luminex test vezivanja je izveden da bi se odredilo vezivanje antitela protiv-SARS-COV-2-S sa panelom antitela. Za ovaj test, antigeni su kuplovani aminom ili uhvaćeni streptavidinom za Luminex mikrosfere prema sledećem: približno 10 miliona MagPlex mikrosfera (Luminex Corp., MagPlex Mikrosfere, Kat. Br. MC10000 and MC12000), je resuspendovano vorteksovanjem u 500 µL 0.1M NaPO4, pH 6.2 (pufer za aktivaciju) i nakon toga je centrifugirano da se ukloni supernatant. Mikrosfere su zaštićene od svetla, zbog osetljivosti na svetlost. Mikrosfere su resuspendovane u 160 µL pufera za aktivaciju i karboksilne grupe (-COOH) su aktivirane dodavanjem 20 µL od 50 mg/mL N-hidroksisukcinimida (NHS, Thermo Scientific, Kat. Br.24525) zatim dodavanjem 20 µL 50 mg/mL 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimida (EDC, ThermoScientific, Kat. Br. 22980) na 25 °C. Nakon 10 minuta, pH reakcije je smanjena na 5.0 sa dodavanjem 600 µL 50 mM MES, pH 5 (pufer za kuplovanje), i mikrosfere su vorteksovane i centrifugirane da bi se uklonio supernatant. Aktivisane mikrosfere su trenutno pomešane sa 500 µL 25 µg/mL proteinskog antigena ili Streptavidina u puferu za kuplovanje i inkubirane su u trajanju od dva sata na 25 °C. Reakcija kuplovanja je zaustavljena dodavanjem 50 µL 1M Tris-HCl, pH 8.0 i mikrosfere su vorteksovane, centrifugirane, i isprane su tri puta sa 800 µL PBS 0.005% (Tween20 0.05%), da bi se uklonili nekuplovani proteini i druge komponente reakcije. Mikrosfere su resuspendovane u 1 mL PBS-a 2% BSA 0.05% Na Azida na 10 miliona mikrosfera/mL. Za hvatanje antigena streptavidinom, 500 µL 12.5 µg/mL biotinilovanog proteina u PBS-u je dodato na mikrosfere kuplovane streptavidinom i inkubirnao jedan sat na 25 °C. Mikrosfere su vorteksovane, centrifugirane, i isprane tri puta sa 800 µL PBS-a, i nakon toga blokirane korišćenjem 500 µL 30mM Biotina (Millipore-Sigma, Cat. No. B4501) u 0.15M Tris pH 8.0. Mikrosfere su inkubirane u trajanju od 30 minuta zatim su vorteksovane, centrifugirane, i isprane tri puta sa 800 µL PBS-a. Microsfere su resuspendovane u 1 mL PBS-a 2% BSA 0.05% Na Azida na 10 milion mikrosfera/mL.
[0175] Mikrosfere za različite proteine i biotinilovane proteine su pomešane na 2700 čestica/ml, i 75 µL mikrosfera je zasejano po bunarčiću na ProcartaPlex ploču sa ravnim dnom 96 bunarčića (ThermoFisher, Kat. Br: EPX-44444-000) i pomešane su sa 25 µL pojedinačnog anti-SARS-CoV-2 supernatanta koji sadrži antitelo. Uzorci i mikrosfere su inkubirani u trajanju od dva sata na 25°C i nakon toga su dva puta isprane sa 200 µL DPBS sa 0.05% Tween 20. Da bi detektovali nivoi vezanog antitela za pojedinačne mikrosfere, 100 µL 2.5 µg/mL R-Fikoeritrin konjugovanog kozjeg F(ab’)2 antihumanog kapa (Southern Biotech, Cat# 2063-09) u blokirajućem puferu (za antitela sa mišjim Fc regionima) ili 100 µL 1.25 µg/mL R-Fikoeritrin AffiniPure F(ab’)2Fragment kozijum anti-mišjim IgG, F(ab’)2fragment specifičnim (Jackson Immunoresearch, Kat. Br: 115-116-072) u blokirajućem puferu (za antitela sa humanim Fc regionom), je dodato i inkubirano u trajanju od 30 minuta na 25 °C. Nakon 30 minuta, uzorci su dva puta isprani sa 200 µl pufera za ispiranje i resuspendovani su u 150 µL pufera za ispiranje. Ploče su očitane u Luminex FlexMap 3D<®>(Luminex Corp.) i Luminex xPonent<®>softverska verzija 4.3 (Luminex Corp.). SARS-CoV-2 proteini korišćeni su u testu prema sledećem:
RBD_ (R319-F541).mmh: SEQ ID NO: 829
RBD_ (R319-F541).mFc: SEQ ID NO: 830
RBD_ (R319-F541).hFc): SEQ ID NO: 831
[0176] Rezultati Luminex vezivanja su prikazani u Tabeli 8 i Tabeli 9 kao srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI). Rezultati pokazuju da supernatanti 46 anti-SARS-CoV-2-S antitela vezuju specifično SARS-CoV-2-S RBD proteine. Ovi rezultati takođe pokazuju pet od ovih navedenih antitela unakrsno reaguje sa SARS koronavirus spajk RBD proteinima sa signalom vezivanja većim od 1000 MFI.
�
�
� Primer 8: Test raznovrsnosti anti-SARS-CoV-2-S antitela
[0177] Test vezivanja je izveden da bi se odredio profil vezivanja antitela protiv-SARS-COV-2-S. Za ovaj test, antigeni su kuplovani aminom kao što je gore opisano za Luminex test vezivanja. Ukratko, približno 9 miliona MagPlex mikrosfera za 16 različitih regiona čestica (Luminex Corp., MagPLex Mikrosfere, Kat. Br. MagPLex MC10000 i MC12000), je resuspendovano vorteksovanjem u 500 µL 0.1M NaPO4, pH 6.2 i nakon toga je centrifugirano da bi se uklonio supernatant. Mikrosfere su resuspendovane u 160 µL aktivacionog pufera i karboksilne grupe (-COOH) su aktivirane dodavanjem od 20 µL od 50 mg/mL N-hidroksisukcinimida (NHS, Thermo Scientific, Kat# 24525) nakon čega sledi dodavanje 20 µL od 50 mg/mL 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimida (EDC, ThermoScientific, Kat# 22980) na 25°C. Nakon 10 minuta, pH reakcije je smanjen na 5.0 sa dodavanjem 600 µL 50 mM MES, pH 5 (pufera za kuplovanje), i mikrosfere su vorteksovane i centrifugirane da bi se uklonio supernatant. Aktivirane mikrosfere su trenutno pomešane sa 500 µL 20 µg/mL SARS-CoV-2 Spajk Proteinom (RBD)(R319-F541)-mmH u puferu za kuplovanje i inkubirane su dva put na 25°C. Reakcija kuplovanja je zaustavljena (ugašena) dodavanjem 50 µL 1M Tris-HCl, pH 8.0 i mikrosfere su vorteksovane, centrifugirane, i isprane tri puta sa 1000 µL PBS. Mikrosfere su resuspendovane u 250 µL PBS na 9 miliona mikrosfera/mL.
[0178] 15 od 16 regiona mikrosfera sa amin-kuplovanim proteinom su modifikovani za test bininga kao što sledi: mikrosfere su dva puta isprane sa PBS 5% DMSO, i 500 µl hemijskog sredstva ili enzima je rastvoreno prema preporukama proizvođača i dodato je na 10 nM na gore opisane aminomkuplovane mikrosfere. Nakon toga su vorteksovani i inkubirani u trajanju od 2 h na sobnoj temperaturi sa rotacijom. Mikrosfere su isprane 3 puta sa PBS 2% BSA. Mikrosfere su resuspendovane u 1 mL PBS na 9 miliona mikrosfera/mL.
[0179] Mikrosfere sa modifikovanim proteinom i nemodifikovanim proteinom (intaktnim) su pomešane na 2700 čestica/ml, i 75 µL mikrosfera je zasejano po bunarčiću na ProcartaPlex ploču sa ravnim dnom sa 96 bunarčića (ThermoFisher, Kat. Br: EPX-44444-000) i pomešane su sa 25 µL pojedinačnog anti-SARS-CoV-2-S supernatanta koji sadrži antitelo. Uzorci i mikrosfere su inkubirani u trajanju od 2 h na 25 °C i nakon toga su dva puta isprani sa 200 µL DPBS sa 0.05% Tween 20. Da bi se detektovali nivoi vezanog antitela na pojedinačnim mikrosferama, 100 µL 2.5 µg/mL R-Fikoeritrinom konjugovani kozji F(ab’)2 anti-humani kapa (Southern Biotech, Cat# 2063-09) u blokirajućem puferu (za antitela sa hFc), ili 100 µL 1.25 µg/mL R-Fikoeritrin AffiniPure F(ab’)2Fragment kozje anti-mišje IgG, F(ab’)2fragment specifično (Jackson Immunoresearch, Kat. Br: 115-116-072) u blokirajućem puferu (za antitela sa mFc), ili 100 µL 1.25 µg/mL R-Fikoeritrin Anti-His (Biolegend, Kat. Br: 362603) u blokirajućem puferu (za ACE-2 kontrolu, R&D, Kat. br.933-ZN), je dodat i inkubiran tokom 30 minuta na 25 °C. Nakon 30 minuta, uzorci su dva puta isprani sa 200 µl pufera za ispiranje i resuspendovani su u 150 µL pufera za ispiranje. Ploče su očitane u FlexMap 3D<®>(Luminex Corp.) i Luminex xPonent<®>softverska verzija 4.3 (Luminex Corp.).
[0180] Rezultati Luminex bininga su prikazani u Tabeli 10 kao srednji intenziteti signala fluorescencije (MFI). Za određivanje grupacija klastera, podatak je normalizovan sa intaktnim proteinom (nemodifikovane mikrosfere) i grupisani su.46 anti-SARS-CoV-2 antitela je klasifikovano u 9 grupa sa 2 ili više antitela, i 11 antitela su klasifikovani kao pojedinačni čvorovi. Grupe klastera su dodeljene na osnovu ovih rezultata hijerarhijskog grupisanja i dendrograma. Ovi rezultati pokazuju da supernatanti 46 anti-SARS-CoV-2-S antitela su imali raznovrsne karakteristike vezivanja i profile, što ukazuje na to da kolekcija je antitela vezanih za različite epitope na SARS-CoV-2 spajk proteinu.
Primer 9: Biacore kinetike vezivanja monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S
[0181] Konstante ravnoteže disocijacije (KD) za različita SARS-CoV-2-S antitela iz primarnih supernatanata iz CHOt ćelija ili iz hibridoma su određivane korišćenjem Biacore T200/Biacore 8K biosenzora zasnovanog na površinskoj plazmonskog rezonanciji u realnom vremenu. Sve studije ispitivanja su sprovedene u 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, i 0.05% v/v Surfaktant Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET) puferu za pokretanja na 25 °C. Površina Biacore CM5 senzor čipa je prvo derivatizovana kuplovanjem aminom sa ili mišjim anti-humanim Fc specifičnim mAt ili zečjim antimišjim Fcγ monoklonskim antitelom (GE, Katalog # BR-1008-38) da bi se uhvatila anti-SARS-CoV-2 antitela. Studije vezivanja su izvedene na humanom SARS-CoV-2 RBD vanćelijskom domenu koji je eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc-heksahistidinskim tagom (SARS-COV-2 RBD-MMH), SARS-CoV-2 RBD vanćelijskom domenu koji je eksprimiran sa C-terminalnim mišjim IgG2a (SARS-COV-2 RBD-mFc), ili SARS-CoV-2 RBD vanćelijskom domenu koji je eksprimiran sa C-terminalnim humanim IgG1 (SARS-COV-2 RBD-hFc). Pojedinačne koncentracije SARS-COV-2 RBD-MMH, (100nM); SARS-COV-2 RBD-mFc (50nM), ili SARS-COV-2 RBD-hFc (50nM), pripremljene u HBS-ET puferu za pokretanje, su ubrizgavane tokom 1.5 minuta na brzini protoka od 30µL/min dok je disocijacija antitelo-vezanih različitih SARS-CoV-2 RBD reagenasa je praćeno u trajanju od 2 minuta u HBS-ET puferu za pokretanje. Na kraju svakog ciklusa, površina za hvatanje SARS-CoV-2 RBD antitela je regenerisana korišćenjem ili 10 sec injekcije 20mM fosforne kiseline za površinu mišjeg anti-humanog Fc specifičnog monoklonskog antitela ili 40 sec injekcija 10mM Glicin, HCl, pH1.5 za zečje anti-mišje Fcγ specifično poliklonsko antitelo. Brznina vezivanja (ka) i brzina disocijacije (kd) su određeni uklapanjem senzograma vezivanja u realnom vremenu na 1:1 model vezivanja sa ograničenjem u transport mase upotrebom BiaEvaluation softvera v3.1 ili Biacore Insight Evaluation softvera v2.0. ili softvera za uklapanje krive. Konstanta ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i polu-život disocijacije (t<1/>2) su izračunati iz kinetičkih brzina kao:
[0182] Parametri kinetika vezivanja za različita SARS-CoV-2 monoklonska antitela koja se vežu za različite anti-SARSCOV-2 RBD reagense iz pronalaska na 25°C su prikazani u Tabelama 11 i 12.
Tabela 11: Kinetike vezivanja SARS-COV-2 RBD-MMH vezivanje za monoklonska antitela protiv-SARS-CoV-2 na 25 °C
(nastavak)
(nastavak)
1 Tabela 12: Kinetike vezivanja SARS-COV-2 RBD-mFc ili SARS-COV-2 RBD-hFc vezivanja monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S na 25 °C
(nastavak)
2
(nastavak)
Karakterizacija monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S blokirajućom ELISA
[0183] ELISA-zasnovani blokirajući test je razvijen da bi se odredila sposobnost antitela protiv-SARS-CoV2-S da bi se blokiralo vezivanje SARS-CoV-2 spajk protein receptor vezujućeg domena (RBD) za humani angiotenzin konvertujući enzim 2 (hACE2).
[0184] SARS-CoV-2 protein koji je korišćen u eksperimentima se sastoji iz domena za vezivanje receptora (RBD) dela SARS-CoV-2 spajk proteina (Aminokiseline Arg319 do Phe541) eksprimirane sa Fc delom humanog IgG1 na c-terminusu (SARS-CoV-2 RBD-hFc; videti NCBI pristupni broj MN908947.3) Humani ACE2 protein koji je korišćen u eksperimentima je kupljen od R&D sistema i sastoji se iz aminokiselina glutamin 18 do serin 740 sa c-terminalni 10X-Histidin tag (hACE2-His; NCBI pristupni broj Q9BYF1).
[0185] Eksperimenti su sprovedeni upotrebom sledeće procedure. Monoklonsko anti-Penta-His antitelo (Qiagen) je obloženo u 1 µg/ml u PBS na mikrotitarskoj ploči sa 96-bunarčića preko noći na 4 °C. hACE2-His receptor je dodat na 0.2 µg/ml u PBS i vezan od 2 h na sobnoj temperaturi. Nespecifična vezujuća mesta su nakandno blokirana upotrebom 0.5% (mas/v) rastvora BSA u PBS. U drugim mikrotitarskim pločama, konstantna količina 10 pM ili 15 pM (kao što je naznačeno u Tabeli 13) SARS-CoV-2 RBD-hFc proteina je vezan sa antitelima koja su razblažena 1:10 ili 1:20 u PBS 0.5% BSA. Ovi kompleksi antitela-protein, nakon inkubacije od jednog sata, su preneti na mikrotitarsku ploču obloženu sa hACE2-His. Nakon 1.5 h inkubacije na RT, bunaričići su isprani, i SARS-CoV-2 RBD-hFc protein vezan za ploču je detektovan sa kozjim-anti-humanim IgG antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson). Ploče su zatim razvijene upotebom rastvora TMB supstrata (BD Biosciences, katalog #555214) u skladu sa preporukama proizvođača i apsorbanca na 450nm je merena na Victor X5 čitaču ploča.
[0186] Analiza podataka je sprovedena izračunavanjem % smanjenja signala fiksne SARS-CoV-2-S RBD-hFc koncentracije u prisustvu antitela vs u odsustvu antitela. U izračunavanju, vezujući signal uzorka konstantnog SARS-CoV-2-S RBD-hFc bez prisustva antitela za svaku ploču je naznačeno kao 100% vezivanje ili 0% blokiranje; i osnovni signal uzorka samog medijuma bez prisustva SARSCoV-2 RBD-hFc je naznačen kao 0% vezivanje ili 100% blokiranje.
[0187] Sposobnost anti-SARS-CoV-2-S antitela da blokiraju SARS-CoV-2-S RBD od vezivanja za humani ACE2 je procenjena korišćenjem blokirajućeg ELISA formata. Blokiranje supernatanta antitela u pojedinačnoj tački od ili 10 pM ili 15 pM SARS-CoV-2-S RBD-hFc vezivanjem za hACE2-His, koje je predstavljeno na anti-His antitelu obloženom na mikrotitarskim pločama sa 96-bunarčića, je detektovano sa HRP konjugovanim anti-hFc antitelom.
[0188] Rezultati blokiranja iz tri testova su prikazani u Tabeli 13. Označeni su SARS-CoV-2-S vezujući signal (450 nm) i G izračunati % blokiranja. Opseg blokiranja je uočen za ispitivane uzorke. Za uzorke u kojima je naznačen NA u kolonama 6 i 7, ispravljena vrednost za ploču je uključena u kolonama 4 i 5, kako su podaci bili u skladu sa jednim prekidačem ploće koji se javljaju za te uzorke. 43 od 46 supernatanta antitela su blokirali više od 50% SARS-CoV-2-S RBD-hFc vezivanja za humani ACE2 koji je obložen na ploči, sa 16 od njih koji su blokirali >90% signala.
Tabela 13: Blokirajući ELISA Rezulati
4
(nastavak)
Primer 11: Mapiranje epitopa monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S na spajk glikoprotein sa masenom spektometrijom izmenene vodonika-deuterijuma
[0189] Masena spektometrija izmenene vodonika-deuterijuma (HDX-MS) je sprovedena da bi se odredili aminokiselinski ostaci SARS-CoV-2 domena vezivanja receptora za spajk protein (RBD (aminokiseline R319-F541)) koji interaguje sa mAt10989, mAt10987, mAt10934, mAt10933, mAt10920, mAt10922, mAt10936, mAt10954, mAt10964, mAt10977, mAt10984, i mAt10986. Opšti opis HDX-MS postupka je predstavljen kod npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; i Engen and Smith (2001) Anal. Chem.73:256A-265A.
[0190] HDX-MS eksperimenti su sprovedeni na integrisanoj HDX-MS platformi, koja se sastoji iz Leaptec HDX PAL sistema za obeležavanje deuterijumom i gašenje, Waters Acquity I-Class (Binary Solvent Manager) za digestiju uzorka i nalivanje, Waters Acquity I-Class (Binary Solvent Manager) za analitički gradijent, i Thermo Q Exactive HF maseni spektrometar za merenja mase peptida.
[0191] Rastvor za obeležavanje je pripremljen kao PBS pufer u D2O na pD 7.0 (10 mM fosfatni pufer, 140 mM NaCl, i 3 mM KCl, ekvivalent sa pH 7.4 na 25°C). Za obeležavanje deuterijumom, 10 µL RBD proteina ili RBD protein pomešan sa svakim od 12 antitela koji su gore navedeni su inkubirani na 20 °C sa 90 µL D2O rastvora za obeležavanje za različite vremenske tačke, u duplikatu. Za mAt10989, mAt10987, mAt10934, i mAt10933, vremenske tačke su bile 0 min (nedeuterisana kontrola), 5 min, i 10 min. Za mAt10920, mAt10922, mAt10936, mAt10954, mAt10964, mAt10977, mAt10984, i mAt10986, vremenske tačke su bile 0 min (nedeuterisana kontrola) i 10 min. Reakcija deuteracije je ugašena dodavanjem 90 µL prethodno ohlađenog pufera za gašenje (0.5 M TCEP-HCl, 4 M urea i 0.5% mravlja kiselina) u svaki uzorak u trajanju od 90 sekundi inkubacije na 20 °C. Ugašeni uzorci su zatim ubrizgani u Leaptec
[0192] HDX PAL sistem za online (na mreži) pepsin/proteza XIII digestiju. Digestirani peptide su zarobljeni sa C18 kolonom (2.1 mm x 5 mm, Waters) i razdvojeni sa drugom C18 kolonom (2.1 mm x 50 mm, Waters) na -5 °C sa 20 minutnim gradijentom (za mAt10989, mAt10987, mAt10934, i mAt10933) ili 10 minutnim gradijentom (za mAt10920, mAt10922, mAt10936, mAt10954, mAt10956, mAt10964, mAt10977, i mAt10984) od 0% do 90% rastvora mobilne faze B (rastvor A: 0.5% mravlja kiselina i 4.5% acetonitril u vodi, rastvor mobilne faze B: 0.5% mravlja kiselina u acetonitrilu). Eluirani peptidi su analizirani sa Thermo Q Exactive HF masenom spektrometrijom u LC-MS/MS ili LC-MS načinu.
[0193] LC-MS/MS podaci iz uzorka nedeuterisanog RBD proteina su pretraženi protiv baze podataka uključujući aminokiselinske sekvence RBD proteina, pepsina, proteaze XIII, i njihovih reverznih sekvenci korišćenjem Byonic pretraživača (Protein Metrics). Parametri za pretragu su podešeni kao podrazumevani korišćenjem nespecifične enzimske digestije i humane glikozilacije kao zajedničke varijabilne modifikacije. Popis identifikovanih peptida je nakon toga uvežen u HDExaminer softver (verzija 3.1) da bi se izračunalo preuzimanje deuterijoma (D-unos) i razlike u procentu unosa deuterijuma (Δ%D) za sve deuterisane uzorke. Razlika u procentu unosa deuterijuma (Δ%D) je izračunata kao što sledi.
Razlika u unosu deuterijuma Sam RBD
Razlika u procentu unosa deuterijuma
Teorijski maksimum unosa D peptida
[0194] Ukupno 190 peptida iz RBD su identifikovani iz oba, RBD samog i RBD u kompleksu sa mAt10989 uzorcima, koji predstavljaju 86.06% pokrivenost sekvence RBD. Bilo koji peptid koji ispoljava smanjenje u unosu deuterijuma od 5% ili većem (tj., Δ%D vrednosti manji od -5%, kao što je -6%, -10%, i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisano kao značajno zaštićen. Peptidi kojima odgovaraju aminokiseline 467-513 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCY-FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 835) RBD su značajno bili zaštićeni sa mAt10989.
[0195] Ukupno 187 peptida iz RBD su identifikovani iz oba, RBD samog i RBD u kompleksu sa mAt10987 uzorcima, koji predstavljaju 86.06% pokrivenost sekvence RBD. Bilo koji peptid koji ispoljava smanjenje u unosu deuterijuma od 5% ili većem (tj., Δ%D vrednost manja od -5%, kao što je -6%, -10%, i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisano kao značajno zaštićen. Peptidi kojima odgovaraju aminokiseline 432-452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) RBD su značajno bili zaštićeni sa mAt10987.
[0196] Ukupno 188 peptida iz RBD su identifikovani iz oba, RBD samog i RBD u kompleksu sa mAt10934 uzorcima, koji predstavljaju 86.06% pokrivenost sekvence RBD. Bilo koji peptid koji ispoljava smanjenje u unosu deuterijuma od 5% ili većem (tj., Δ%D vrednost manja od -5%, kao što je -6%, -10%, i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisano kao maksimalno zaštićen. Peptidi kojima odgovaraju aminokiseline 432-452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836), 467-474 (DISTEIYQ) (SEQ ID NO: 837), i 480-513 (CNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGV-GYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 838) RBD su značajno bili zaštićeni sa mAt10934.
[0197] Ukupno 188 peptida iz RBD su identifikovani iz oba, RBD samog i RBD u kompleksu sa mAt10933 uzorcima, koji predstavljaju 86.06% pokrivenost sekvence RBD. Bilo koji peptid koji ispoljava smanjenje u unosu deuterijuma od 5% ili većem (tj., Δ%D vrednost manja od -5%, kao što je -6%, -10%, i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisano kao maksimalno zaštićeno. Peptidi kojima odgovaraju aminokiseline 467-510 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCY-FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV) (SEQ ID NO: 839) RBD su značajno bili zaštićeni sa mAt10933.
[0198] Ukupno 75 peptida iz RBD su identifikovani iz oba, RBD samog i RBD u kompleksu sa mAt10920 uzorcima, koji predstavljaju 83.27% pokrivenost sekvence RBD. Bilo koji peptid koji ispoljava smanjenje u unosu deuterijuma od 5% ili većem (tj., Δ%D vrednost manja od -5%, kao što je -6%, -10%, i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisano kao značajno zaštićeno. Peptidi kojima odgovaraju aminokiseline 471-486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840), i 491-515 (PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 841) RBD su značajno bili zaštićeni sa mAt 10920.
[0199] Ukupno 86 peptida iz RBD je identifikovano iz oba, RBD samog i RBD u kompleksu sa mAt10922 uzorcima, koji predstavljaju 87.25% pokrivenost sekvence RBD. Bilo koji peptid koji ispoljava smanjenje u unosu deuterijuma od 5% ili većem (tj., Δ%D vrednost manja od -5%, kao što je -6%, -10%, i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisano kao značajno zaštićeno. Peptidi kojima odgovaraju aminokiseline 432-452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) RBD su značajno bili zaštićeni sa mAt10922.
[0200] Ukupno 81 peptid iz RBD je identifikovano i iz RBD samog i iz RBD u kompleksu sa uzorcima mAt10936, što predstavlja 82,07% pokrivenost sekvence RBD-a. Svaki peptid koji je pokazao smanjenje unosa deuterijuma od 5% ili više (tj. Δ%D vrednost manju od -5%, kao što je -6%, -10% i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisan kao značajno zaštićeni. Peptidi koji odgovaraju aminokiselinama 351-360 (YAWNRKRISN) (SEQ ID NO: 842), 432-452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836), 467-486 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 843), and 491-513 (PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 844) RBD-a su značajno zaštićeni mAt10936.
[0201] Ukupno 84 peptida iz RBD-a su identifikovana i iz RBD-a i iz RBD-a u kompleksu sa uzorcima mAt10954, što predstavlja 87,25% pokrivenost sekvence RBD-a. Svaki peptid koji je pokazao smanjenje uzimanja deuterijuma od 5% ili više (tj. Δ%D vrednost manju od -5%, kao što je -6%, -10% i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisan kao značajno zaštićeni. Peptidi koji odgovaraju aminokiselinama 400-422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453-486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846), and 490-515 (FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) RBD-a su značajno zaštićeni sa mAt10954.
[0202] Ukupno 109 peptida iz RBD-a je identifikovano i iz RBD samo i iz RBD u kompleksu sa uzorcima mAt10964, što predstavlja 83,67% pokrivenost sekvence RBD-a. Svaki peptid koji je pokazao smanjenje uzimanja deuterijuma od 5% ili više (tj. Δ%D vrednost manju od -5%, kao što je -6%, -10% i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisan kao značajno zaštićeni. Peptidi koji odgovaraju aminokiselinama 401-424 (VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYK) (SEQ ID NO: 848), i 471-513 (EIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 849) RBD-a značajno su zaštićeni od strane mAt 10964.
[0203] Ukupno 78 peptida iz RBD-a je identifikovano i iz RBD samo i iz RBD u kompleksu sa uzorcima mAt10977, što predstavlja 87,25% pokrivenost sekvence RBD-a. Svaki peptid koji je pokazao smanjenje uzimanja deuterijuma od 5% ili više (tj. Δ%D vrednost manju od -5%, kao što je -6%, -10% i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisan kao značajno zaštićeni. Peptidi koji odgovaraju aminokiselinama 351-364 (YAWNRKRISNCVAD) (SEQ ID NO: 850), i 471-486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840) RBD-a su značajno zaštićeni sa mAt10977.
[0204] Ukupno 88 peptida iz RBD-a je identifikovano i iz RBD samog i iz RBD u kompleksu sa uzorcima mAt10984, što predstavlja 87,25% pokrivenost sekvence RBD-a. Svaki peptid koji je pokazao smanjenje uzimanja deuterijuma od 5% ili više (tj. Δ%D vrednost manju od -5%, kao što je -6%, -10% i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisan kao značajno zaštićeni. Peptidi koji odgovaraju aminokiselinama 400-422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), i 453-486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) od RBD-a su značajno zaštićeni sa mAt10984.
[0205] Ukupno 84 peptida iz RBD-a je identifikovano i iz RBD-a i iz RBD-a u kompleksu sa uzorcima mAt10986, što predstavlja 87,25% pokrivenost sekvence RBD-a. Svaki peptid koji je pokazao smanjenje uzimanja deuterijuma od 5% ili više (tj. Δ%D vrednost manju od -5%, kao što je -6%, -10% i tako dalje) nakon vezivanja mAt je definisan kao značajno zaštićeni. Peptidi koji odgovaraju aminokiselinama 400-422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453-486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846), i 490-515 (FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) RBD-a su značajno zaštićeni sa mAt10986.
[0206] Zbirno, većina testiranih neutrališućih antitela dolazi u kontakt sa RBD na način koji preklapa ostatke RBD koji čine ACE2 interfejs; osim togа, antitela se mogu grupisati na osnovu njihovog obrasca kontakta sa površinom RBD-a, kao što je prikazano na slici 15. Gore navedeni podaci su takođe sumirani u Tabelama 14-25.
Tabela 14: Peptidi domena vezivanja za receptor (RBD) spajk proteina sa značajnom zaštitom nakon formiranja RBD-mAt u poređenju sa samim RBD
(nastavak)
Tabela 15: RBD peptid spajk proteina sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10987 u oređenu sa samim RBD
Tabela 16: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10934 u poređenju sa samim RBD
(nastavak)
Tabela 17: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10933 u poređenju sa samim RBD
Tabela 18: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10920 u poređenju sa samim RBD
Tabela 19: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10922 u poređenju sa samim RBD
Tabela 20: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10936 u poređenju sa samim RBD
1
Tabela 21: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10954 u poređenju sa samim RBD
(nastavak)
Tabela 22: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10964 u poređenju sa samim RBD
2
Tabela 23: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10977 u poređenju sa samim RBD
Tabela 24: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10984 u poređenju sa samim RBD
(nastavak)
Tabela 25: RBD peptidi sa značajnom zaštitom nakon formiranja kompleksa RBD-mAt10986 u
poređenju sa samim RBD
[0207] Da bi se ispitalo da li antitela na anti-SARS-CoV-2 spajk protein mogu neutralisati SARS-CoV-2 varijante, sproveden je skrining ovih antitela protiv panela VSV pseudotip virusa koji eksprimiraju divlji tip i varijante spajk proteina. VSV pseudotip virusi su generisani privremenom transfekcijom 293T ćelija sa plazmidom koji kodira SARS-CoV-2 spajk protein ili istim plazmidom koji sadrži varijacije nukleotida koji kodiraju za poznate varijante sekvenci aminokiselina SARS-CoV-2 spajk proteina. Svi plazmidi su potvrđeni Sanger sekvenciranjem. Ćelije su zasejane u ploče od 15 cm na 1.2X10<7>ćelija po ploči u DMEM kompletnom medijumu (1000 mL DMEM, Gibco; 100 mL FBS, Gibco; 10 mL PSG, Gibco) jedan dan pre transfekcije sa 15 µg spajk DNK/ploči upotrebom 125 µL Lipofektamina LTX, 30 µL PLUS reagensa, i do 3 mL Opti-Mem.24 h nakon transfekcije, ćelije su isprane sa 10 mL PBS, nakon čega su inficirane sa MOI od 0.1 VSV<ΔG:mNeon>virusom u 10 mL Opti-Mem. Virus je inkubiran na ćelijama u trajanju od 1 h, sa nežnim ljuljanjem na svakih 10 minuta. Ćelije su isprane 3 puta sa 10 mL PBS, zatim su prekrivene sa 20 mL medijuma za infekciju (1000 mL DMEM, Gibco; 10 mL Natrijum piruvat, Gibco; 7 mL BSA, Sigma; 5 mL Gentamicin, Gibco) pre inkubacije na 37 °C, 5% CO2tokom 24 h. Supernatant pseudovirusa je sakupljen u epruvete za centrifugu zapremine 250 mL na ledu, zatim je centrifugiran na 3000 oum tokom 5 minuta do peleta bilo kog ćelijskog debrisa, alikvot na ledu, zatim je zamrznut na -80 °C. Infektivnost je ispitivana na Vero ćelijama pre upotrebe u testovima neutralizacije. Ovaj materijal će biti označen sa VSV<ΔG:mNeon>/Spajk pseudovirus, ili VSV<ΔG:mNeon>/Spajk_(mutacija varijante aminokiseline) (na primer, VSV<ΔG:mNeon>/Spajk-H49Y).
4
[0208] U danu 1, Vero ćelije su zasejane do 80% konfluentnosti u balonu T225 , ćelije su isprane sa PBS-om (Gibco: 20012-043), dodat je TripLE da bi se ćelije odvojile od balona i dodat je kompletan DMEM da inaktivira tripsin. 20 000 Vero ćelija je postavljeno u 100 µL prethodno zagrejanog kompletnog DMEM po bunarčiću u crnoj polistirenskoj mikroploči sa 96 bunarčića (Corning: 3904). U danu 2, VSV<ΔG:mNeon>/Spajk pseudovirus je otopljen na ledu i razblažen medijumom za infekciju. Antitela su razblažena u ploči sa 96 bunarčića sa U-dnom, stvarajući razblaženje svakog antitela u 210 µl medijuma za infekciju pri 2X koncentraciji za analizu.120 µL razblaženih antitela je prebačeno na svežu ploču sa U-dnom, a na svaku ploču su zatim dodatni medijum i kontrolno antitelo IgG1. 120 µl razblaženog pseudovirusa je dodato u svaki bunarčić izuzev kontrolnih bunarčiča koji sadrže medijum. U navedene bunarčiće je dodato 120 µL medijuma za infekciju. Pseudovirus sa antitelima je inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim je medijum uklonjen iz Vero ćelija. 100 µL smeše antitelo/pseudovirus je dodato ćelijama, a zatim je inkubirano na 37 °C, 5% CO2 u trajanju od 24 h. U danu 3, supernatant je uklonjen iz ćelijskih bunarčića i zamenjen je sa 100 µL PBS-a. Ploče su očitane na SpectraMax i3 sa MiniMax citometrom za snimanje.
[0209] Pored ispitivanja kapaciteta neutralizacije virusom VSV-SARS-CoV-2-S koji se ne replicira, antitela su takođe testirana virusom SARS-CoV-2. Monoklonska antitela i kombinacije antitela su serijski razblažene u DMEM-u (Quality Biological), dopunjenom sa 10% (v/v) toplotno inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (Sigma), 1% (v/v) penicilin/streptomicinom (Gemini Bio-products) i 1% (v/v) L-glutamina (2 mM konačna koncentracija, Gibco) (VeroE6 medijum) do konačne zapremine od 250 µL. Zatim, 250 µL VeroE6 medijuma koji sadrži SARS-CoV-2 (WA-1) (1000 PFU/mL) je dodato svakom razblaženju seruma i u 250 µL medijuma kao netretirane kontrole. Mešavine virus-antitelo su inkubirane u trajanju od 60 minuta na 37 °C. Posle inkubacije, virusni titri smeša su određivani testom plaka. Konačno, vrednosti titra neutralizacije smanjenja plaka (PRNT50) od 50% (razblaženja seruma pri kojima je formiranje plaka smanjeno za 50% u odnosu na netretiranu kontrolu) su izračunate korišćenjem logističke krive od 4 parametra koja odgovara podacima o procentu neutralizacije (GraphPad Software, La Jolla, CA).
[0210] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije pojedinačnog monoklonskog antitela (IC50) protiv pseudovirusa koji eksprimira VSV-SARS-CoV-2 spajk protein (S) koji kodira Vuhan-Hu-1 (NCBI pristupni broj MN908947.3) Sekvenca spajk proteina (S-Wt) određivana je u Vero ćelijama (Tabela 26). Većina antitela je ispoljila potenciju neutralizacije u pikomolarnom opsegu (pM), dok su neka pokazala potenciju neutralizacije u nanomolarnom (nM) opsegu.
[0211] Dok je rekombinantni ACE2 bio u stanju da posreduje u neutralizaciji pseudočestica VSV-spajka, kao što je ranije prijavljeno, njegova potencija je bila daleko inferiorna u odnosu na monoklonska antitela, sa više od 1000 puta smanjenjem potenicje u odnosu na najbolje neutrališuća mAt-a (Slika 10A). Pored toga, potentna neutralizujuća aktivnost mAt10987, mAt10989, mAt10933 i mAt10934 potvrđena je u testovima neutralizacije, uključujući neutralizaciju SARS-CoV-2 u VeroE6 ćelijama (Slika 10B). Svi testovi neutralizacije su generisali sličnu potenciju za četiri mAt (mAt10987, mAt10989, mAt10933 i mAt10934) i nijedna od prikazanih kombinacija nije pokazala sinergističku aktivnost neutralizacije (Slika 10B).
Tabela 26: potencija neutralizacije mAt (IC50 (M)) protiv soja divljeg tipa VSV-SARS-CoV-2-S pseudočestica u Vero ćelijama
(nastavak)
(nastavak)
[0212] Varijante aminokiselina u spajk (S) proteinu identifikovane su iz preko 7000 javno dostupnih sekvenci SARS-CoV-2, koje predstavljaju globalno cirkulišuće izolate, i klonirane u VSV pseudočestice. Testovi neutralizacije sa pseudočesticama koje kodiraju varijante su izvedeni da bi se procenio uticaj svake varijante na potencijal neutralizacije monoklonskih antitela. Tabela 27 ilustruje relativnu potenciju neutralizacije monoklonskih antitela protiv varijanti koje kodiraju pseudočestice u odnosu na SARS-CoV-2 spajk (S-Wt) pri jednoj koncentraciji od 5 µg/ml. Procenat neutralizacije u odnosu na S-wt je uhvaćen za svako pojedinačno antitelo i varijantu. Nijedno od antitela nije pokazalo gubitak potencije neutralizacije pri koncentraciji od 5 µg/ml, sa izuzetkom mAt 10985 i R408I varijante. Ovi podaci pokazuju široku pokrivenost funkcionalnom neutralizacijom monoklonskih antitela protiv globalno cirkulišućih varijanti spajka SARS-CoV-2.
[0213] Da bi se dalje ispitao uticaj varijanti S proteina na potencijal neutralizacije monoklonskih antitela, rađene su krive pune neutralizacije da bi se odredila vrednost IC50 najpotentnijih neutrališućih antitela protiv podskupa varijanti lokalizovanih unutar domena vezivanja za receptor (RBD) S proteina. Tabela 28 prikazuje vrednosti IC50 neutralizacije za svaku varijantu psuedočestice. Intrinzična varijabilnost do 3 puta može se primetiti između testova neutralizacije pseudočestica i ne ukazuje na promenu u potenciji neutralizacije. Ovi podaci pokazuju da su antitela zadržala svoju potenciju neutralizacije protiv raznovrsnog panela RBD varijanti S proteina.
Tabela 27. Relativna neutralizacija VSV-SARS-CoV-2 varijanti koje kodiraju S protein na koncentraciji antitela od 5 mg/ml u Vero ćelijama
Tabela 27 (nastavak)
Tabela 28. Neutralizacija IC50 (M) VSV-SARS-CoV-2-S RBD varijanti u Vero ćelijama
1
Tabela 28 (nastavak)
Primer 13: Biacore kinetike vezivanja prečišćenih monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S
[0214] Konstanta ravnoteže disocijacije (KD) za različite SARS-COV-2 RBD reagense koji se vezuju za prečišćena CHOt anti/SARS-COV-2 monoklonska antitela (mAt/a) određena je korišćenjem Biacore T200/Biacore 8K biosenzora zasnovanog na površini plazmonske rezonancije u realnom vremenu. Sve studije vezivanja su izvedene u 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA i 0,05% v/v surfaktanta Tveen-20, pH 7,4 (HBS-ET) u tekućem puferu na 25 °C i 37 °C. Površina senzorskog čipa Biacore CM5 je prvo derivatizovana spajanjem amina sa bilo kojim mišjim anti-humanim Fc specifičnim mAt-om (Regeneron, mAt2567) da bi se uhvatila anti-SARS-COV-2bmAt-a. Studije vezivanja su sprovedene na humanom SARS-COV-2 RBD vanćelijskom domenu eksprimiranom sa C-terminalnim mic-micheksahistidinom (SARS-COV-2 RBD-MMH) i SARS-COV-2 RBD vanćelijskim domenom eksprimiranim sa C-terminalnim mišjim IgG2a (SARS-COV-2 RBD-mFc). Upotreba ovih reagenasa je omogućila testiranje sposobnosti antitela da vežu monomere i dimere RBD peptidа, tim redom.
[0215] Različite koncentracije hSARS-COV-2 RBD-MMH, (90nM-3,33nM, trostruko razblaživanje) i SARS-COV-2 RBD-mFc (30nM-1,11nM trostruko razblaživanje) pripremljene u puferu za rad HBS-ET, su injektirane 3 minuta pri brzini protoka od 50 µL/min dok je disocijacija mAt vezanih različitih SARS-COV-2 RBD reagensa praćena 6-10 minuta u HBS-ET puferu. Na kraju svakog ciklusa, SARS-COV-2 RBD mAt površina za hvatanje je regenerisana upotrebom bilo 12 sekundi injekcije 20 mM fosforne kiseline za mišju anti-humanu Fc specifičnu površinu mAt-a. Brzina vezivanja (k) i brzina disocijacije (kd) su
1 1
određivane prilagođavanjem senzorgrama vezivanja u realnom vremenu na model vezivanja 1:1 sa ograničenjem transporta mase korišćenjem softvera BiaEvaluation v3.1 ili softvera Biacore Insight Evaluation v2.0. ili softvera za podešavanje krive. Konstanta ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživot (t<1>/2) su izračunati iz kinetičkih brzina kao:
[0216] Parametri kinetike vezivanja za različita SARS-COV-2 mAt-a koja se vezuju za različite anti-SARS-COV-2 RBD reagense pronalaska na 25 °C i 37 °C prikazani su u tabelama 29 do 32, tim redom.
Tabela 29: Parametri kinetike vezivanja SARS-COV-2 RBD-MMH vezivanja za monoklonska antitela protiv-SARS-COV-2-S na 25 °C.
1 2
(nastavak)
Tabela 30: Parametri kinetike vezivanja SARS-COV-2 RBD-MMH vezivanja za monoklonska antitela protiv-SARS-COV-2-S na 37 °C.
1
(nastavak)
14
Tabela 31: Parametri kinetike vezivanja SARS-COV-2 RBD-mFc vezivanja za monoklonska antitela protiv-SARS-COV-2-S na 25 °C.
(nastavak)
1
(nastavak)
Tabela 32: Parametri kinetike vezivanja SARS-COV-2 RBD-mFc vezivanja za monoklonska antitela protiv-SARS-COV-2-S na 37 °C
1
(nastavak)
1 Primer 14: Anti-SARS-CoV-2 Antitela blokiraju RBD vezivanje za hACE2 kao što je određeno sa ELISA
[0217] Blokirajući test zasnovan na ELISA-i je korišćen za određivanje sposobnosti anti-SARS-CoV-2 antitela da blokiraju vezivanje vezujućeg domena receptora za spajk protein SARS-COV-2 (RBD) za njegov receptor, humani enzim koji konvertuje angiotenzin 2 (hACE2).
[0218] Protein SARS-CoV-2 koji se koristi u ovom testu sastojao se od dela domena vezivanja za receptor (RBD) SARS-CoV-2 Spajk proteina (aminokiseline Arg319-Phe541) eksprimiranog sa Fc delom humanog IgG1 na c-terminusu (SARS-CoV-2 RBD-hFc) Humani ACE2 protein korišćen u eksperimentima kupljen je od R&D Systems i sastojao se od aminokiselina Gln18-Ser740 sa C-terminalnim tagom 10X-histidina (hACE2-His; NCBI Pristupni br. Q9BIF1).
[0219] Eksperimenti su izvedeni korišćenjem sledećeg postupka. Monoklonsko anti-Penta-His antitelo (Qiagen) je obloženo sa 1 µg/ml u PBS-u na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića preko noći na 4 °C. hACE2-His receptor je dodat u količini od 0,2 ug/ml u PBS-u i vezan dva sata na sobnoj temperaturi (RT). Nespecifična mesta vezivanja su naknadno blokirana korišćenjem 0,5% (mas/v) rastvora BSA u PBS-u. U drugim mikrotitarskim pločama, konstantna količina od 100 pM SARS-CoV-2 RBD-hFc proteina bila je vezana za anti-SARS-COV-2 antitela i kontrolu antitela izotipa IgG1 u razblaženjima od 0,0008nM do 50nM u PBS 0,5% BSA. Posle inkubacije od jednog sata, rastvori smeše su prebačeni na mikrotitarsku ploču obloženu hACE2-His. Posle 1.5 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, bunarčići su isprani, a SARS-COV2 vezan za ploču je detektovan sa kozjim anti-humanim IgG antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson). Ploče su zatim razvijene korišćenjem rastvora TMB supstrata (BD Biosciences, #555214) prema preporuci proizvođača, a apsorbancija na 450 nm je izmerena na Victor X5 čitaču ploča.
[0220] Podaci o vezivanju su analizirani korišćenjem sigmoidnog modela doza-odgovor u okviru softvera PrismTM (GraphPad). Izračunata vrednost IC50, definisana kao koncentracija antitela potrebna da se blokira 50% vezivanja SARS-CoV-2 RBD-hFc za hACE2-His obloženog na pločama, korišćena je kao indikator potencije blokiranja. Procenat blokiranja je definisan na osnovu signala vezivanja korigovanog pozadinom uočenog pri najvišoj koncentraciji antitela koja je testirana korišćenjem ove formule i prijavljena za sva ispitana antitela:
[0221] Antitela koja su blokirala vezivanje manje od ili jednako 50% pri najvišoj testiranoj koncentraciji klasifikovana su kao neblokatori i vrednosti IC50 nisu prijavljene za ta antitela.
[0222] Sposobnost anti-SARS-CoV-2 antitela da blokiraju vezivanje SARS-CoV-2 RBD za humani ACE2 procenjena je korišćenjem ELISA za blokiranje. U ovom testu 100 pM SARS-COV-2 RBD-hFc titriran je širokim opsegom koncentracija anti-SARS-CoV-2-S antitela i inhibicija prisustva antitela na vezivanju RBD za hACE2-His je bila procenjivana. RBD-hFc vezan za ploču je detektovan sa HRP konjugovanim anti-hFc antitelom.
[0223] Blokirajući IC50s i maksimalno blokiranje pri najvišim testiranim koncentracijama anti-SARS-CoV-2-S antitela su sumirani u Tabeli 33, a krive blokiranja prikazane na Slikama 1-8. Od 46 testiranih antitela, 44 je pokazalo blokiranje vezivanja RBD.hFc za hACE-2 zavisno od koncentracije antitela. IC50 vrednosti su se kretale od 41 pM do 4,5 nM i maksimalno blokiranje u rasponu od 55% do oko 100% pri najvišoj testiranoj koncentraciji antitela. Dva antitela od 46 testiranih nisu pokazala aktivnost
1
blokiranja u uslovima testa. Irelevantno kontrolno antitelo izotipa nije pokazalo aktivnost blokiranja, kao što se očekivalo.
Tabela 33: Blokirajuća potencija antitela protiv-SAR-COV-2 na vezivanje RBD-hFc spajka za imobilizovani humani ACE-2
(nastavak)
1
(nastavak)
11
Primer 15: Unakrsna kompeticija između mAt10987, mAt10989, mAt10933, i mAt10934
[0224] mAt10987, mAt10989, mAt10933, i mAt10934 su ispitani u testovima vezivanja unakrsne kompeticije (Slika 11), identifikujući nekoliko parova mAt-a koja nisu u kompeticiji sa pikomolarnom potencijom neutralizacije koja bi se potencijalno mogla kombinovati da bi se obrazovali kokteli antitela, npr., mAt10987 i mAt0933.
[0225] Biniranje epitopa anti-SARS-CoV-2-S mAt-a je sprovedeno u premiksu sendvič formata koji uključuje mAt-a u kompeticiji jedan protiv drugog na kombinatorni način u paru za vezivanje za SARS-CoV-2 RBD-MMH protein koristeći ForteBio Octet HTKS bioslojni interferometrijski instrument (Molecular Devices ForteBio LLC, Fremont, CA) sa tekućim puferom od 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% (v/v) Tween-20, pH 7,4, 1 mg/mL BSA. Testovi su izvedeni na 30 °C uz kontinuirano mešanje na 1000 oum. Nakon dobijanja inicijalne osnovne vrednosti u puferu za rad, 20 µg/mL anti-COVID19 mAta je uhvaćeno na vrhove biosenzora protiv humanog Fc (AHC) tokom 300 s. Da bi se blokirala preostala slobodna nezasićena mesta vezivanja na vrhovima AHC biosenzora, svi senzori su bili izloženi 240 s blokatorskom rastvoru koji sadrži 100 µg/mL irelevantnog IgG1. Nakon ovog procesa, biosenzori su uronjeni u bunarčiće koji sadrže premiks rastvora 100 nM SARS CoV-2 RBD-MMH proteina i 600 nM anti-COVID19 mAt vezivnog mesta drugog mAt-a tokom 300 s. Odgovor vezivanja u svakom koraku je zabeležen i specifični signal je normalizovan oduzimanjem samoblokirajuće mAt kompetitivne kontrole iz skupa podataka. Analiza podataka je izvršena pomoću softvera Octet Data Analisis HT 10.0 korišćenjem “Epitope Binning”.
[0226] Upoređivanje testova vezivanja unakrsne kompeticije sa gore opisanim HDKS-MS rezultatima pruža strukturalne uvide u mehanizam kojim nekompetitivni parovi antitela mogu istovremeno da vežu RBD, i stoga mogu biti idealni partneri za terapeutski koktel antitela. mAt10987 i mAt10933 predstavljaju takav par antitela. mAt10933 cilja na region petlje nalik spajku na jednoj ivici ACE2 interfejsa. Unutar tog regiona, ostaci koji pokazuju najznačajniju HDX zaštitu od mAt10933 okrenuti su nagore, što sugeriše da Fab region mAt10933 vezuje RBD iz gornjeg pravca, gde će mAt10933 imati značajne kolizije sa ACE2. Da bi izbegla kompeticija sa sa mAt10933, mAt10987 se vezuje samo za HDX-definisane zaštićene regione sa prednje ili donje leve strane (u pogledu spreda mAt10987 na Slici 12). Ovo je u skladu sa gore opisanim podacima o neutralizaciji, jer bi se mAt10987 orijentisalo u poziciju koja ima veliku verovatnoću da interferira sa ACE2.
Primer 16: Određivanje strukture spajk proteina vezanog za antitelo
[0227] Da bi se bolje razumelo vezivanje mAt10933 i mAt10987 za spajk protein RBD, izvršena je strukturna analiza pomoću krio-elektronske mikroskopije (crioEM). Fab fragmenti mAt10933 i mAt10987 su izolovani korišćenjem kompleta FabALACTICA (Genovis).600 µg mAt10933 Fab i 600 µg mAt10987 Fab pomešano je sa 300 µg SARS-CoV-2-S RBD i inkubirano na ledu približno 1 sat, a zatim ubrizgano u Superdex 200 povećanje kolone za gel filtraciju uravnoteženu do pH 50 mM Tri 7,5, 150 mM NaCl. Frakcije pikova koje sadrže mAt10933 Fab - mAt10987 Fab - RBD kompleks su sakupljene i koncentrovane korišćenjem 10 kDa MWCO centrifugalnog filtera. Za pripremu krioEM mreže, uzorak proteina je razblažen do 1,5 mg/mL i dodat je 0,15% PMAL-C8 amfipola.3,5 µL proteina je deponovano na sveže očišćenu plazmom UltrAufoil rešetku (1,2/1,3, 300 meša). Višak rastvora je uklonjen pomoću filter papira i zamrznut uronjen u tečni etan pomoću Vitrobot Mark IV. krioEM mreža je prebačena na Titan Krios (Thermo Fisher) opremljen detektorom K3 (Gatan). Filmovi su prikupljeni korišćenjem EPU (Thermo Fisher) pri uvećanju od 105,000x, što odgovara veličini piksela od 0.85 Å. Korišćena je brzina doze od 15 elektrona po pikselu u sekundi i svaki film je bio 2 sekunde, što odgovara ukupnoj dozi od ~40 elektrona po Å2.
[0228] Sva obrada krioEM podataka izvedena je korišćenjem krioSPARC v2.14.2.2.821 film je poravnat korišćenjem korekcije pokreta zakrpa i CTF procene zakrpe. Odabrano je 2.197 poravnatih mikrografija za dalju obradu na osnovu procenjenih vrednosti defokusa i rezolucija uklapanja CTF-a. Početni skup čestica odabranih pomoću birača blobova podvrgnut je 2D klasifikaciji da bi se generisale matrice za odabir matrica.989,553 čestica odabranih odabirom matrica podvrgnuto je višestrukim krugovima 2D klasifikacije da bi se uklonile nevezane fabs i čestice koje sadrže nekompletan kompleks. Ab initio rekonstrukcija sa tri klase je generisala jednu klasu koja sadrži 61,707 čestica koje su odgovarale kompleksu mAt10933 Fab - mAt10987 Fab - RBD. Heterogeno prečišćavanje čestica u ovoj klasi praćeno neuniformnim prečišćavanjem rezultiralo je mapom rezolucije 3,9 Å (FSC=0.143) koja sadrži 48,140 čestica koja je korišćena za pravljenje modela. U ovu mapu, modeli RBD-a (preuzeti iz PDB kod 6M17) i dva Fabs-a (preuzeti iz prethodnih struktura antitela, osim lambda lakog lanca mAt10987 koji dolazi iz PDB koda 5U15), su postavljeni manuelno. Ovi modeli su zatim manuelno ponovo napravljeni pomoću Coot-a i prerađeni u realnom prostoru u odnosu na mapu koristeći Phenix.
[0229] Potvrđujući gore opisane podatke, krioEM sa jednom česticom kompleksa SARS-CoV-2 spajk RBD-a vezanog za Fab fragmente mAt10933 i mAt10987 pokazuje da se dva antitela u ovom koktelu mogu istovremeno vezati za različite regione RBD-a (Slika 13A, Slika 13B i Slika 14).3D rekonstruisana mapa kompleksa sa nominalnom rezolucijom od 3.9 Å pokazuje da se oba Fab fragmenta vezuju za različite epitope na RBD, potvrđujući da su antitela koja nisu u kompeticiji. mAt10933 se vezuje na vrhu RBD-a, u velikoj meri preklapajući mesto vezivanja za ACE2. S druge strane, epitop za mAt10987 se nalazi na strani RBD-a, daleko od epitopa mAt10933, i ima malo ili nimalo preklapanja sa mestom vezivanja ACE2.
Primer 17: Unakrsna kompeticija između anti-SARS-CoV-2-S mAt-a
[0230] Kompeticija vezivanja između anti-SARS-CoV-2-S monoklonskih antitela (mAt-a) određivana je korišćenjem testa interferometrije bio-sloja bez obeleživača (BLI) u realnom vremenu na Octet HTX biosenzorskoj platformi (Pall ForteBio Corp.). Ceo eksperiment je izveden na 25 °C u 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA i 0,05% v/v Surfaktant Tween-20, 1mg/mL BSA, pH 7,4 (HBS-EBT) puferu uz trešenje ploče brzinom od 1000 oum. Da bi se procenilo da li su dva mAt bila u stanju da za kompeticiju jedno sa drugim za vezivanje za svoje epitope na SARS-COV-2-S RBD ekstracelularnom domenu eksprimiranom sa C-terminalnim myc-myc-heksahistidinom (SARS-COV-2 RBD-MMH ), ~0,51 nm SARS-COV-2-S RBD-MMH je prvo uhvaćeno na vrhove okteta biosenzora obložene anti-Penta-His antitelom (Fortebio Inc, # 18-5122) potapanjem vrhova biosenzora na 1 minut u bunarčiće koji sadrže rastvor od 10 µg/mL SARS-COV-2-S RBD-MMH. SARS-COV-2-S RBD-MMH uhvaćeni vrhovi biosenzora su zatim zasićeni sa prvim anti-SARS-CoV-2-S monoklonskim antitelom (nakon toga nazvanim mAt-1) potapanjem u bunarčiće koji sadrže 50 µg/mL rastvora mAt-1 u trajanju od 5 minuta. Vrhovi biosenzora su zatim uronjeni u bunarčiće koji sadrže 50 µg/mL rastvora drugog anti-SARS-CoV-2 monoklonskog antitela (nakon toga nazvanog mAt-2) na 5 minuta. Vrhovi biosenzora su isprani u HBS-ETB puferu između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom celog toka eksperimenta i zabeležen je odgovor vezivanja na kraju svakog koraka. Odgovor vezivanja mAt-2 za SARS-COV-2 RBD-MMH prethodno kompleksiran sa mAt-1 je upoređen i utvrđeno je kompetitivno/nekompetitivnim ponašanjem različitih anti-SARS-CoV-2 monoklonskih antitela kao što je prikazano u Tabeli 34.
Tabela 34: Unakrsna kompeticija između antitela protiv-SARS-CoV-2-S
(nastavak)
11
(nastavak)
(nastavak)
11
(nastavak)
11
(nastavak)
11
(nastavak)
11
(nastavak)
11
(nastavak)
12
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
12
(nastavak)
(nastavak)
12
(nastavak)
12
(nastavak)
12
(nastavak)
12
(nastavak)
12
(nastavak)
1
(nastavak)
11
(nastavak)
12
(nastavak)
1
(nastavak)
14
(nastavak)
1
(nastavak)
1
(nastavak)
1
(nastavak)
1
(nastavak)
1
(nastavak)
14
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
14
(nastavak)
(nastavak)
14
(nastavak)
14
(nastavak)
14
(nastavak)
14
(nastavak)
14
Primer 18: pH osetljivost monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S koja se vezuju za monomerne SARS-CoV-2-S RBD reagense merena na 37 °C
[0231] Konstante brzine disocijacije (kd) za različita monoklonska antitela protiv-SARS-CoV-2-S u puferima pH 7.4, pH 6.0 i pH5.0 su određivane korišćenjem biosenzora Biacore T200 zasnovanog na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) u realnom vremenu. Sve studije vezivanja su izvedene na 37 °C korišćenjem tri pufera za pokretanje, (i) PBS, 0.05% v/v Surfaktant Tween-20, pH7.4 (PBS-T-pH7.4) (ii) PBS, 0.05% v/v Surfaktant Tween-20, pH6.0 (PBS-T-pH6.0), i (iii) PBS, 0.05% v/v Surfaktant Tween-20, pH5.0 (PBS-T-pH5.0). Površina senzorskog čipa Biacore CM5 je prvo derivatizovana spajanjem amina sa mišjim anti-humanim Fc specifičnim mAt (Regeneron) da bi se uhvatila anti-SARS-CoV-2-S monoklonska antitela. Studije vezivanja su sprovedene na humanom SARS-COV-2-S RBD vanćelijskom domenu eksprimiranom sa C-terminalnom myc-myc-heksahistidinom (SARS-COV-2 RBD-MMH), pojedinačne koncentracije SARS-COV-2-S RBD-MMH (90nM) pripremljene u PBS-T-pH 7.4 puferu su ubrizgane pri brzini protoka od 25 µL/min tokom 3 minuta nakon čega je usledila disocijacija vezanog SARS-COV-2-S RBD-MMH u PBS-T-pH 7.4, PBS-T-pH 6.0 ili PBS-T PBS-T-pH 5.0 puferima za nalivanje tokom 5 minuta.
1
[0232] Konstante brzine disocijacije (kd) u četiri pH pufera za nalivanje određivane su uklapanjem senzorgrama vezivanja u realnom vremenu na model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za uklapanje krive Scrubber 2.0c. Disocijativni poluživot (t<1>/2) je izračunat iz vrednosti kdkao:
[0233] Vrednosti kdi t<1>/2za vezivanje SARS-COV-2-S RBD-MMH za različita anti-SARS-CoV-2-S monoklonska antitela u PBS-T-pH 7.4, nakon čega sledi disocijacija u PBS-T-pH 7.4 i PBS -T-pH 6.0 na 37 °C prikazane su u Tabeli 35. Vrednosti kdi t<1>/2za vezivanje SARS-COV-2-S RBD-MMH za različita anti-SARS-CoV-2-S monoklonska antitela u PBS-T-pH 7.4 praćeno disocijacijom u PBS-T-pH 7.4 i PBS-T-pH 5.0 na 37 °C prikazani su u Tabeli 36. Poređenje disocijativnog poluživota (t<1>/2) SARS-COV-2 RBD-MMH u puferima pH 7.4, pH 6.0 i pH 5.0.
1 1
-S-T
PB
u ijajac ci so idiuferpu
4
7.
H
-p
-T
PBS
u . -S
-2 37°oV na C-ru RS SA ufev- 0 oti 6.pra i<m>4 el
7.
antit imsk onkl
ono m sa H M M
D-RB
-S
-2 V O
RS-C
SA
jevanzi Ve
:
35
ela ab
T
)vak taas(n
)vak taas n(
ak) av ast
(n
H
-p
S-T
PB
u ija acocij
idis u
pufer
7.4
T-pH
PBS-u . V-2°Co 37 -SR naSArutiv- ufe 0 5.pro ali<m>ite
.4 7 antm kins klo no o m sa H M M
D-RB
-S V-2 O
RS-C
SA
jevanzi Ve
:
36
ela ab
T
)vak ta(nas
)vak ta(nas
Primer 19: Vezivanje Anti-SARS-CoV-2-S antitela za čestice koje su slične virusu
[0234] Da bi se ispitala sposobnost panela monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2 da vežu SARS-CoV-2 spajk glikoprotein, razvijen je in vitro test vezivanja koji koristi virus vezikularnog stomatitisa (VSV) pseudotipizovan sa SARS-CoV-2 spajk proteinom u platformi za detekciju koja je zasnovana na elektrohemiluminiscenciji (MSD).
[0235] Virusu slične čestice (VLP) pseudotipizovanog virusa vezikularnog stomatitisa (VSV) su generisane iz ćelija HEK293T za prolaznu ekspresiju SARS-CoV-2 spajk proteina (Pristupni broj MN908947.3, aminokiseline 16-1211). VLP koje eksprimiraju samo VSV takođe su generisane kao negativna kontrola vezivanja.
[0236] Eksperimenti su izvedeni prema sledećoj proceduri. VLP-ovi iz dva gore opisana izvora su razblaženi u PBS-u, zasejani u ploče sa ugljeničnim elektrodama sa 96 bunarčića (MULTI-ARRAY ploča visokog vezivanja, MSD) i inkubirani preko noći na 4 °C da bi se omogućilo da se VLP adheriraju. Nespecifična mesta vezivanja su blokirana sa 2% BSA (mas/v) u PBS-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Česticama vezanim za ploču, dodata su anti-SARS-CoV-2 antitela i nevezujuća kontrola humanog IgG1, razblažena u PBS-u 0,5% BSA u opsegu koncentracija od 0.0008nM do 50nM, i pufer bez antitela su dodati u duplikatu i ploče inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploče su zatim isprane sa 1X PBS da bi se uklonila nevezana antitela korišćenjem AquaMax2000 uređaja za pranje ploča (MDS Analytical Technologies). Antitela vezana za ploču su detektovana sa SULFO-TAGTM-konjugovanim anti-humanim IgG antitelom (Jackson Immunoresearch) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, ploče su razvijene sa Read Bufferom (MSD) prema proceduri koju je preporučio proizvođač, a luminiscentni signali su zabeleženi instrumentom SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Signali direktnog vezivanja (u RLU) su uhvaćeni za VLP-e koji eksprimiraju SARS-CoV-2 i VLP-e samo za VSV.
[0237] Sposobnost monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S da se vežu za VLP-e koji eksprimiraju SARS-CoV-2-S u poređenju sa vezivanjem za VLP koji eksprimiraju irelevantne VSV procenjivana je korišćenjem imuno-vezujućeg testa. Vezivanje za imobilizovane VLP-e na pločama visokog vezivanja sa 96 bunarčića (MSD) izvedeno je sa serijom razblaženja antitela i vezana antitela su detektovana korišćenjem SULFO-TAGTM-konjugovanog anti-humanog IgG. Signali vezivanja iz elektrohemiluminiscencije su snimljeni na Sector Imager 600 (MSD). Određene su vrednosti RLU za vezivanje antitela za VLP. Sva antitela su pokazala vezivanje zavisno od koncentracije, a odnosi vezivanja za SARS-COV-2-S koji eksprimiraju VLP i VSV analizirani su samo na 5.5 nM i 0.20 nM.
[0238] Rezultati vezivanja mAt-a protiv-SARS-CoV-2-S u dve koncentracije za VSV/spajk i VLP samo za VSV su sažeti u Tabeli 37. Od 46 ispitanih antitela, 44 antitela su se specifično vezala za VSV/spajk sa odnosom prema VSV od 3 ili više u bilo kojoj koncentraciji. Kod 0.2 nM antitela, odnos VSV/spajk i VSV se kretao od 3 do 56, a kod 5 nM odnos se kretao od 3 do 303. Iako su dva antitela (mAt10998 i mAt11002) pokazala slabo vezivanje za VSV/Spajk VLP-e, sa od manje od 3 do VSV VLP-e, signali na 5nM su bili viši na VSV/spajku nego na VSV. Irelevantno antitelo izotipa IgG1 pokazalo je minimalno vezivanje, kao što je bilo očekivano.
1
Tabela 37: Specifičnost antitela protiv-SARS-COV-2-S koja se vezuju za spajk proteine koji eksprimiraju VSV VLP u odnosu VSV elektrohemiluminiscencijom
nastavak
1 1
nastavak
Primer 20: Antitela protiv-SARS-CoV-2-S koja se vezuju za ćelije koje eksprimiraju spajk protein
[0239] Da bi se ispitala sposobnost panela monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2-S da se vežu za ćelije koje eksprimiraju SARS-CoV-2-S, razvijen je in vitro test vezivanja koji koristi ćelije koje eksprimiraju SARS-CoV-2-S u platformi za detekciju zasnovanu na elektrohemiluminiscenciji (MSD).
[0240] Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G inducibilne ćelije su konstruisane da prolazno eksprimiraju SARS-CoV-2 spajk protein (Pristupni broj MN908947.3, aminokiseline 16-1211, Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet Inducibilni COVID-19 Spike Protein visoko sortirani) i protočna citometrija sortirana za selekciju visoke ekspresije proteina SARS-CoV-2. Roditeljske Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G su takođe uključene u eksperimente kao negativna kontrola vezivanja.
1 2
[0241] Eksperimenti su izvedeni prema sledećoj proceduri. Ćelije iz dve gore opisane linije su indukovane sa 1 µg/ml doksiciklina na 37 °C tokom 36 sati pre sakupljanja, centrifugirane su, isprane sa PBS-om, zatim razblažene u PBS-u, zasejane u ploče sa ugljeničnim elektrodama sa 96 bunarčića (MULTI-ARRAY ploča sa visokim vezivanjem, MSD) i inkubirana preko noći na 4 °C da bi se omogućilo ćelijama da se adheriraju. Nespecifična mesta vezivanja su blokirana sa 2% BSA (mas/v) u PBS tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Ćelijama vezanim za ploču, dodata su anti-SARS-CoV-2 antitela i nevezujuća humana IgG1 kontrole, razblaženi u PBS 0,5% BSA u opsegu koncentracija od 0.0008nM do 50nM, i pufer bez antitela su dodati duplikatu i ploče inkubirane jedan sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploče su zatim isprane sa 1X PBS da bi se uklonila nevezana antitela korišćenjem uređaja za pranje ploča AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Antitela vezana za ploču su detektovana sa SULFO-TAGTM-konjugovanim anti-humanim IgG antitelom (Jackson Immunoresearch) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, ploče su razvijene sa Read Bufferom (MSD) prema proceduri koju je preporučio proizvođač, a luminiscentni signali su zabeleženi instrumentom SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Signali direktnog vezivanja (u RLU) su uhvaćeni za ćelije koje eksprimiraju SARS-CoV-2-S i ćelijsku liniju negativne kontrole.
[0242] Sposobnost monoklonskih antitela protiv-SARS-CoV-2 da se vežu za ćelije koje eksprimiraju SARS-CoV-2 Spajk Protein u poređenju sa vezivanjem za roditeljske ćelije procenjena je korišćenjem imuno-vezujućeg testa. Vezivanje za imobilizovane ćelije na pločama sa visokim stepenom vezivanja (MSD) sa 96 bunarčića je izvedeno sa serijom razblaženja antitela i vezana antitela su detektovana korišćenjem SULFO-TAGTM-konjugovanog anti-humanog IgG. Signali vezivanja iz elektrohemiluminiscencije su zabeleženi na Sector Imager 600 (MSD). Sva antitela su pokazala vezivanje zavisno od koncentracije i odnos vezivanja ćelija koje eksprimiraju spajk i roditeljskih ćelija su analizirani na koncentraciji od 5.5 nM i 0.20 nM.
[0243] Rezultati vezivanja mAt-a protiv-SARS-COV-2-S u dve koncentracije za Spajk protein koji eksprimiraju i roditeljske Jurkat ćelije su sumirani u Tabeli 38. Od 46 testiranih antitela, 44 antitela su se specifično vezala za Jurkat/spajk ćelije (Jurkat /Tet3G/hCD20/Tet-On 3G inducibilne SARS-CoV-2 spajk protein visoko sortirane ćelije) sa odnosom prema roditeljskim ćelijama od 4 ili više u bilo kojoj koncentraciji. Na 0.2 nM, odnos signala vezivanja na Jurkat/spajk ćelijama prema roditeljskim ćelijama kretao se od 4 do 36, a na 5 nM odnos se kretao od 4 do 63. Iako su dva antitela (mAt10998 i mAt11002) pokazala slabo vezivanje za Jurkat/spajk ćelije sa odnosom vezivanja za roditeljske ćelije manjim od 4, na 5 nM signali vezivanja su bili veći na Jurket/spajk nego na roditeljskim ćelijama. Irelevantno antitelo IgG1 izotipa pokazalo je minimalno vezivanje, kao što je bilo očekivano.
Tabela 38: Specifičnost antitela protiv-SARS-CoV-2-S koja se vezuju za Jurkat ćelije koje eksprimiraju spajk protein u odnosu na roditeljske ćelije elektrohemiluminiscencijom
1
(nastavak)
14
1

Claims (12)

  1. Patentni zahtevi 1. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji vežu SARS-CoV-2 spajk protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 832, pri čemu pomenuto izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 202, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 210.
  2. 2. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 1, koji sadrži: (a) konstantni region imunoglobulina; (b) konstantni region IgG1; ili (c) konstantni region humanog IgG1.
  3. 3. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, koji sadrži težak lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 216.
  4. 4. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-3, koji sаdrži laki lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 218.
  5. 5. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena: (a) je multispecifično; i/ili (b) je rekombinantno antitelo ili fragment za vezivanje antigena.
  6. 6. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži: i) izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-5; i ii) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
  7. 7. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koje veže SARS-CoV-2 spajk koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 832, pri čemu pomenuto izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 640, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO: 646.
  8. 8. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 7, koje sadrži: (a) konstantni region imunoglobulina; (b) konstantni region IgG1; ili (c) konstantni region humanog IgG1.
  9. 9. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 7 ili zahtevu 8, koje sadrži težak lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 654.
  10. 10. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 7-9, koje sadrži laki lanac koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 656.
  11. 11. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 7-10, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena: (a) je multispecifično; i/ili (b) je rekombinantno antitelo ili fragment za vezivanje antigena.
  12. 12. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži: i) izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 7-11; i ii) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. 1
    �
    �
    �
    11
    ��
    �
    ��
    �
    �
    �
    � Pogled sa Odozo<Pogled sa>
    Slika 12 1
    �
    kompleks Sakuljanje podataka i obrada Uvećanje Voltaža (kV) Izlaganje elektronima (e-/Å<2>) Defoksni opseg (um) Veličina piksela (Å) Nametnuta simetrija Početni broj čestica Finalni broj odabranih čestica Rezolucija mape (Å) FSC granica
    Prečišćavanje
    Faktor B izoštravanja mape (Å<2>) Kompozicija modela (#atoma)
    Model vs. koeficijent korelacije mape
    R.m.s. devijacije Dužina veza (Å)
    Uglovi veza (<0>) Validacija MolProbity rezultat Rotamer van opsega Ramačandranov dijagram Favorizovan (%)
    Dozvoljen (%)
    Nedozvoljen (%) Slika 14 1 1
    ��
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    11
    ��
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    21
    21
    21
    21
    21
    21
    22
    22
    22
    22
    22
    22
    22
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    ��
    ��
    ��
    ��
    ��
    ��
    ��
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    11
    ��
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    41
    41
    41
    41
    41
    41
    42
    42
    42
    42
    42
    42
    42
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    44
    44
    44
    44
    44
    44
    44
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    11
    ��
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    11
    ��
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    22
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    41
    42
    �
    44
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 1
RS20230266A 2020-04-02 2020-07-20 Antitela protiv spajk glikoproteina sars-cov-2 i fragmenti za vezivanje antigena RS64105B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063004312P 2020-04-02 2020-04-02
US202063014687P 2020-04-23 2020-04-23
US202063025949P 2020-05-15 2020-05-15
US202063034865P 2020-06-04 2020-06-04
PCT/US2020/039707 WO2021045836A1 (en) 2020-04-02 2020-06-25 Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US16/912,678 US10787501B1 (en) 2020-04-02 2020-06-25 Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
EP20186667.0A EP3889177B1 (en) 2020-04-02 2020-07-20 Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64105B1 true RS64105B1 (sr) 2023-04-28

Family

ID=72614999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230266A RS64105B1 (sr) 2020-04-02 2020-07-20 Antitela protiv spajk glikoproteina sars-cov-2 i fragmenti za vezivanje antigena

Country Status (30)

Country Link
US (5) US10787501B1 (sr)
EP (2) EP4209507A1 (sr)
JP (4) JP7116256B1 (sr)
KR (2) KR20250107297A (sr)
CN (1) CN113766928B (sr)
AU (1) AU2020340881B2 (sr)
CA (2) CA3115553C (sr)
CL (2) CL2021000997A1 (sr)
CO (1) CO2021005072A2 (sr)
CR (1) CR20220552A (sr)
DK (1) DK3889177T5 (sr)
ES (1) ES2939895T3 (sr)
FI (1) FI3889177T3 (sr)
HR (1) HRP20230338T1 (sr)
HU (1) HUE061425T2 (sr)
IL (1) IL282060A (sr)
LT (1) LT3889177T (sr)
MA (1) MA54405B1 (sr)
MX (1) MX2021004130A (sr)
MY (1) MY197648A (sr)
PE (1) PE20221893A1 (sr)
PH (1) PH12021550793A1 (sr)
PL (1) PL3889177T3 (sr)
PT (1) PT3889177T (sr)
RS (1) RS64105B1 (sr)
SG (1) SG11202103404PA (sr)
SI (1) SI3889177T1 (sr)
SM (1) SMT202300061T1 (sr)
TW (2) TWI785350B (sr)
WO (1) WO2021045836A1 (sr)

Families Citing this family (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8986704B2 (en) 2012-07-06 2015-03-24 Valneva Austria Gmbh Mutant fragments of OspA and methods and uses relating thereto
WO2014159990A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Yale University Interferon production using short rna duplexes
US20180128545A1 (en) 2016-11-08 2018-05-10 Berry Metal Company Modular furnace cooling wall
ES2957939T3 (es) 2017-04-13 2024-01-30 Valneva Austria Gmbh Polipéptidos de OspA multivalentes y métodos y usos relacionados con los mismos
JP7621270B2 (ja) 2019-04-05 2025-01-24 アカデミア シニカ シアリダーゼ耐性糖およびその調製および使用方法
AU2020384498A1 (en) 2019-11-12 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for identifying, classifying, and/or ranking genetic sequences
JP2023510289A (ja) * 2020-01-09 2023-03-13 ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド ワクチン送達のための自己組織化自己アジュバント系
EP3872091B1 (en) * 2020-02-26 2023-06-14 VIR Biotechnology, Inc. Antibodies against sars-cov-2
EP4114458A4 (en) * 2020-03-05 2024-04-17 New York Blood Center, Inc. IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AGAINST CORONAVIRUS-2 RESPONSIBLE FOR SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME
US11365239B2 (en) * 2020-03-20 2022-06-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-SARS-COV-2 antibodies and uses thereof
WO2021190980A1 (en) * 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
WO2021194886A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Centivax, Inc. Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 3bgf
WO2021194965A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Centivax, Inc. Superhuman anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof
WO2021194985A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Centivax, Inc. Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 6nb6
WO2021194891A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Centivax, Inc. Anti-sars-cov-2 antibodies derived from cr3022
WO2021194951A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Centivax, Inc. Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 2dd8
WO2021194896A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Centivax, Inc. Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 2ghw
CN111349150B (zh) * 2020-03-24 2021-02-09 北京中科微盾生物科技有限责任公司 一种抑制新型冠状病毒的多肽及其用途
DK4045533T5 (da) 2020-03-26 2024-07-29 Univ Vanderbilt Humane monoklonale antistoffer mod svær akut respiratorisk syndrom-coronavirus 2 (sars-cov-2)
CR20220552A (es) 2020-04-02 2023-01-17 Regeneron Pharma Anticuerpos contra glicoproteína de espícula anti-sars-cov-2 y fragmentos de unión al antígeno
WO2021198999A1 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Axon Neuroscience Se Epitope-based vaccines for treatment of coronavirus associated diseases
CN115698044A (zh) 2020-04-09 2023-02-03 瓦尔尼瓦奥地利有限责任公司 用于医学用途的包含三种OspA融合蛋白的组合物
US20240026412A1 (en) * 2020-04-09 2024-01-25 Valneva Austria Gmbh Improved methods of producing a lipidated protein
WO2021217062A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Kevin Fialko Sars-cov-2 susceptibility detection
CN115461364B (zh) * 2020-04-28 2025-12-16 北京大学 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
JP7038367B2 (ja) * 2020-05-01 2022-03-18 花王株式会社 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
WO2021226123A1 (en) * 2020-05-06 2021-11-11 Academia Sinica Recombinant antibodies, kits comprising the same, and uses thereof
US20230357364A1 (en) * 2020-05-06 2023-11-09 International Aids Vaccine Initiative, Inc. Covid-19 antibodies and uses thereof
US20250195501A1 (en) * 2020-05-07 2025-06-19 Griffith University Cell entry-modulating agents and uses therefor
WO2021226533A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Academia Sinica Chimeric influenza vaccines
WO2021231659A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 Sapphire Biotech, Inc. Neutralizing antibody testing and treatment
WO2021242815A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
JP2023528441A (ja) 2020-06-03 2023-07-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及びＣＯＶＩＤ－１９を治療又は予防するための方法
EP4176262B1 (en) 2020-07-02 2025-06-25 King Abdullah University Of Science And Technology Nanobody functionalized electrochemical transistors and methods of making and using thereof
WO2022006562A1 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Multispecific coronavirus antibodies
EP4175983A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Antigen binding molecules targeting sars-cov-2
KR20230035346A (ko) 2020-07-06 2023-03-13 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 SARS-CoV-2를 표적으로 하는 항원 결합 분자
US11740240B2 (en) * 2020-07-20 2023-08-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Immunoassay for SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and materials therefor
US20230295274A1 (en) 2020-07-27 2023-09-21 Single Cell Technology, Inc. Anti-sars coronavirus-2 spike protein antibodies
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
WO2022032139A1 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Neutralizing antibodies that bind the sars-cov-2 s protein
CN111978378B (zh) * 2020-08-10 2022-02-01 武汉大学 SARS-CoV-2抗原多肽及其应用
US20220056111A1 (en) * 2020-08-11 2022-02-24 Yurogen Biosystems Llc MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST SPIKE S1 PROTEIN OF SARS-CoV-2 AND USE THEREOFOF
EP4204446A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Antigen binding molecules targeting sars-cov-2
WO2022044573A1 (ja) * 2020-08-26 2022-03-03 国立大学法人熊本大学 コロナウイルススパイク蛋白に対するヒト抗体またはその抗原結合断片
US20220074882A1 (en) * 2020-09-04 2022-03-10 Fraunhofer Usa, Inc. Electrochemical-based sensor for rapid and direct detection of sars-cov-2
WO2022054068A1 (en) * 2020-09-14 2022-03-17 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Antibodies for the prevention, treatment and detection of coronavirus infection
US20240262892A1 (en) * 2020-09-14 2024-08-08 Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd. Neutralizing antibodies against sars-cov-2
EP4214242A1 (en) 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
TWI796597B (zh) * 2020-09-21 2023-03-21 長庚大學 使用紫蘇之經水萃取的產物來對抗冠狀病毒感染的方法
CN112125973B (zh) * 2020-09-30 2022-02-01 上海市公共卫生临床中心 冠状病毒的特异性抗体或其抗原结合片段
CN116419971A (zh) * 2020-09-30 2023-07-11 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体及其应用
WO2022068844A1 (en) * 2020-09-30 2022-04-07 Vazyme Biotech Co., Ltd. Neutralizing antibody against sars-cov-2
CN112175073B (zh) * 2020-09-30 2022-08-02 上海市公共卫生临床中心 冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段
EP4221749A4 (en) * 2020-09-30 2024-11-27 The Research Foundation for The State University of New York FORMULATIONS BASED ON SARS-CoV-2 RECEPTOR-BINDING DOMAIN PARTICLES
CN112159469B (zh) * 2020-09-30 2022-08-02 上海市公共卫生临床中心 冠状病毒的抗体或其抗原结合片段
CN116348486A (zh) * 2020-10-02 2023-06-27 伊莱利利公司 在蛋白质纯化过程中降低宿主细胞蛋白质含量的方法
WO2022075921A1 (en) * 2020-10-08 2022-04-14 Hummingbird Bioscience Holdings Limited Sars-cov-2 spike protein antigen-binding molecules
MX2023004023A (es) * 2020-10-09 2023-07-07 Hospital For Sick Children Polipéptidos que eligen como objetivo a sars-cov-2 y composiciones y métodos relacionados.
WO2022079606A1 (en) * 2020-10-12 2022-04-21 Icosagen Cell Factory Oü Sars cov-2 neutralizing antibodies
CN112251414A (zh) * 2020-10-12 2021-01-22 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种杂交瘤细胞株、其制备方法和应用
CN112194711A (zh) * 2020-10-15 2021-01-08 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 一种新型冠状病毒s蛋白的b细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方法及应用
US20230382978A1 (en) * 2020-10-15 2023-11-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibody specific for sars-cov-2 receptor binding domain and therapeutic methods
AU2021362007A1 (en) 2020-10-16 2023-06-22 Invisishield Technologies Ltd. Compositions for preventing or treating viral and other microbial infections
WO2022084817A1 (en) * 2020-10-19 2022-04-28 Lay Sciences Inc. Protein drugs for prevention and treatment of covid-19
GB202016650D0 (en) * 2020-10-20 2020-12-02 Primer Design Ltd Kit and method
WO2022087127A1 (en) * 2020-10-20 2022-04-28 Duke University Replication incompetent influenza vaccine platform for foreign protein delivery
US20230398204A1 (en) * 2020-10-21 2023-12-14 La Jolla Institute For Immunology Coronavirus Spike Glycoprotein With Improved Expression and Stability
US20240025971A1 (en) * 2020-10-23 2024-01-25 Atreca, Inc. Antibodies to coronavirus sars-cov-2
CN112409488B (zh) * 2020-10-23 2022-07-01 中国科学院上海药物研究所 针对多种冠状病毒的单克隆抗体及应用
KR20220054080A (ko) * 2020-10-23 2022-05-02 주식회사 와이바이오로직스 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
US20230391852A1 (en) * 2020-10-26 2023-12-07 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
WO2022093895A1 (en) * 2020-10-27 2022-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric coronavirus s protein compositions and methods of use
WO2022094343A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 Adaptive Biotechnologies Corporation Anti-sars-cov-2 antigen antibodies and related compositions and methods
WO2022094287A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 Achelois Biopharma, Inc. Multivalent particles compositions and methods of use
US11872279B2 (en) 2020-10-30 2024-01-16 Massachusetts Institute Of Technology SARS-CoV-2 antigens and uses thereof
CN112358533B (zh) * 2020-10-30 2023-07-14 上海泽润生物科技有限公司 重组刺突蛋白及其制备方法和用途
WO2022094009A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Single domain antibodies to sars-cov-2 nucleocapsid protein
EP4237444A4 (en) * 2020-11-02 2024-11-27 The University of Chicago POLYPEPTIDES FOR THE DETECTION AND TREATMENT OF SARS-COV-2
CA3197391A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 Dan KULP Dna encoded nanoparticles and method of use thereof as a coronavirus disease 2019 (covid-19) vaccine
CN112098660B (zh) * 2020-11-03 2021-02-09 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒
WO2022098870A1 (en) * 2020-11-04 2022-05-12 The Rockefeller University Neutralizing anti-sars-cov-2 antibodies
JP2023549677A (ja) * 2020-11-06 2023-11-29 チョ ファーマ インコーポレイテッド 抗原およびその糖鎖操作抗体を含む免疫組成物
US20230417748A1 (en) * 2020-11-06 2023-12-28 Green Cross Corporation Coronavirus Spike Protein-Specific Antibody and Use Thereof
WO2022095045A1 (zh) * 2020-11-09 2022-05-12 上海济煜医药科技有限公司 SARS-CoV-2抗体及其应用
JP2023550094A (ja) * 2020-11-12 2023-11-30 ティースキャン セラピューティクス インコーポレイテッド Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２免疫優性ペプチドの構築物及びその使用
WO2022101839A1 (en) * 2020-11-12 2022-05-19 Cadila Healthcare Limited Anti-sars-cov-2 monoclonal antibodies and cocktail thereof
WO2022102744A1 (ja) * 2020-11-13 2022-05-19 株式会社ハカレル ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する抗体
CN112625136B (zh) * 2020-11-18 2022-02-11 三优生物医药(上海)有限公司 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途
CN112409479B (zh) * 2020-11-23 2022-04-26 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-121及其应用
WO2022109441A1 (en) * 2020-11-23 2022-05-27 Genentech, Inc. Methods for modulating host cell surface interactions with sars-cov-2
US20230408517A1 (en) * 2020-11-24 2023-12-21 Bio-Techne Corporation Anti-severe acute respiratory syndrome coronavirus antibodies
CA3199988A1 (en) * 2020-11-25 2022-06-02 Daniel L. Flynn Pyridylpyridone derivatives as vsp34 inhibitors for use in the treatment of a viral infection
JP2023550638A (ja) * 2020-11-25 2023-12-04 デシフェラ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー ウイルス感染症の処置に使用するための、ｖｓｐ３４阻害剤としてのモルホリノ誘導体
CN112442120A (zh) * 2020-11-25 2021-03-05 苏州大学 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体
JP2023550641A (ja) * 2020-11-25 2023-12-04 デシフェラ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー ウイルス感染症の治療に使用するためのｖｓｐ３４阻害剤としてのモルホリノ誘導体
CN112439058A (zh) * 2020-11-25 2021-03-05 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 基于外泌体为载体的重组新型冠状病毒纳米疫苗方法
WO2022112392A1 (en) 2020-11-26 2022-06-02 Memo Therapeutics Ag Anti-sars-cov-2 antibody molecules
KR20230117152A (ko) 2020-12-03 2023-08-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 코로나바이러스 감염 발생 위험이 증가한 대상체의 식별 및 이의 치료 방법
WO2022120375A1 (en) * 2020-12-04 2022-06-09 The University Of Chicago Polypeptides for detection and treatment of coronavirus infection
US20240044896A1 (en) * 2020-12-09 2024-02-08 The University Of Chicago Methods and systems for detection and analysis of angiotensin binding antibodies
WO2022122788A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Institute For Research In Biomedicine Multispecific antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
US20240035035A1 (en) * 2020-12-09 2024-02-01 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
US11693011B2 (en) * 2020-12-14 2023-07-04 Inbios International, Inc. Neutralizing antibody immunoassays
WO2022132887A1 (en) * 2020-12-15 2022-06-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Human monoclonal antibodies targeting the sars-cov-2 spike protein
WO2022132904A1 (en) * 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022139680A1 (en) * 2020-12-21 2022-06-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Sars-cov-2 binding molecules and uses thereof
KR102779353B1 (ko) * 2020-12-22 2025-03-12 한국과학기술원 컴퓨터를 이용해 디자인된 SARS-CoV-2 수용체결합 도메인 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편
EP4267611A4 (en) * 2020-12-23 2024-11-27 Garvan Institute of Medical Research ANTI-SARS-COV-2 ANTIBODIES
CN112794884B (zh) * 2020-12-28 2022-02-18 中国科学院微生物研究所 新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒
CN112326973B (zh) * 2020-12-31 2021-03-23 北京金沃夫生物工程科技有限公司 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用
US20240294613A1 (en) * 2020-12-31 2024-09-05 The Broad Institute, Inc. Cross-neutralizing sars-cov2 antibodies
TW202241497A (zh) * 2021-01-05 2022-11-01 美商伊米若梅有限公司 針對SARS-CoV-2棘蛋白之抗體雞尾酒療法
TW202241928A (zh) * 2021-01-08 2022-11-01 美商１０Ｘ基因組學有限公司 對冠狀病毒具有特異性的抗原結合多肽及其用途
US20240301037A1 (en) * 2021-01-22 2024-09-12 La Jolla Institute For Immunology Chimeric anti-coronavirus spike protein antibodies
WO2022158497A1 (ja) * 2021-01-22 2022-07-28 株式会社mAbProtein ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する抗体
WO2022162587A1 (en) * 2021-01-27 2022-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection
AR124707A1 (es) * 2021-01-28 2023-04-26 Talem Therapeutics Llc Anticuerpos antiglicoproteína de espiga y su uso terapéutico
CN113264998B (zh) * 2021-01-28 2023-02-28 四川大学华西医院 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
JP7598538B2 (ja) * 2021-01-29 2024-12-12 東亞合成株式会社 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のアミノ酸配列およびその利用
CN115141272B (zh) * 2021-01-31 2024-06-25 中南大学湘雅医院 新型冠状病毒单克隆抗体xy1及其应用
RU2771288C1 (ru) * 2021-02-02 2022-04-29 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2
JP2024509055A (ja) * 2021-02-04 2024-02-29 アールキュー・バイオテクノロジー・リミテッド 抗体
CN117642178A (zh) * 2021-02-09 2024-03-01 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向冠状病毒刺突蛋白的抗体
WO2022171904A1 (en) 2021-02-15 2022-08-18 Livingmed Biotech S.R.L. Genetically modified clostridium strains expressing recombinant antigens and uses thereof
WO2022182662A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for mapping antigen-binding molecule affinity to antigen regions of interest
EP4297786A4 (en) * 2021-02-23 2025-01-22 Pandion Operations, Inc. PD-1 ANTIBODIES, POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
CN113009153B (zh) * 2021-02-25 2023-12-15 山东莱博生物科技有限公司 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用
US12024551B1 (en) * 2021-03-04 2024-07-02 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Coronavirus neutralizing humanized antibodies and uses thereof
CA3177045A1 (en) * 2021-03-15 2022-09-22 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for treating coronavirus infection
CN112679605B (zh) * 2021-03-15 2021-07-09 安源医药科技（上海）有限公司 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用
EP4063384A1 (en) * 2021-03-23 2022-09-28 Ceinge Biotecnologie Avanzate SCarl Human neutralizing antigen specific proteins for spike-rbd of sars-cov-2
CN113092776B (zh) * 2021-03-24 2024-12-10 苏州携创生物技术有限公司 一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
WO2022204713A2 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 Atreca, Inc. Antibodies to sars-cov-2
CN115141270A (zh) * 2021-03-29 2022-10-04 深圳市康麦生物技术有限公司 特异性结合新型冠状病毒的抗体
WO2022210830A1 (ja) * 2021-03-30 2022-10-06 国立大学法人 富山大学 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
KR20220136945A (ko) * 2021-04-01 2022-10-11 (주)셀트리온 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자
US20250302942A1 (en) * 2021-04-05 2025-10-02 Lg Chem, Ltd. Vaccine composition against coronavirus
WO2022216028A1 (ko) * 2021-04-08 2022-10-13 한국생명공학연구원 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방용 중화능 개량 백신 조성물
IL318755A (en) 2021-04-12 2025-04-01 Academia Sinica Improved vaccine for the coronavirus
WO2022220603A1 (ko) * 2021-04-16 2022-10-20 고려대학교 산학협력단 코로나-19 바이러스 표적 인간 항체
WO2022224271A1 (en) * 2021-04-19 2022-10-27 Bharat Serums And Vaccines Limited Polyclonal antibodies against sars-cov-2 and implementations thereof
WO2022226079A1 (en) * 2021-04-20 2022-10-27 Inbios International, Inc. Neutralizing antibodies against sars-cov-2
MX2023012530A (es) * 2021-04-20 2024-01-08 D4 Labs Llc Composición y metodos de vacuna adyuvada.
JP2024518335A (ja) * 2021-04-26 2024-05-01 アンスティチュ パスツール ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するヒト中和モノクローナル抗体、及びそれらの使用
WO2023033363A1 (ko) * 2021-09-06 2023-03-09 국민대학교산학협력단 Sars-cov-2에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
WO2022231320A1 (ko) * 2021-04-27 2022-11-03 국민대학교산학협력단 Sars-cov-2 s 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도
KR102426782B1 (ko) * 2021-04-27 2022-07-28 국민대학교산학협력단 SARS-CoV-2 RBD 항원 특이적 항체를 포함하는 진단용 조성물 또는 키트
CN117616040A (zh) * 2021-04-28 2024-02-27 纽约市哥伦比亚大学理事会 用于治疗和预防covid-19和新出现的变体的抗体
WO2022235678A1 (en) * 2021-05-03 2022-11-10 Ohio State Innovation Foundation Human anti-coronavirus peptide vaccines and methods of their use
WO2022235960A1 (en) * 2021-05-06 2022-11-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Neutralizing antibodies that bind variant sars-cov-2 spike proteins
US20240262893A1 (en) * 2021-05-12 2024-08-08 Applied Biomedical Science Institute Binding polypeptides against sars cov-2 and uses thereof
CN112981011B (zh) * 2021-05-12 2021-08-17 广东凯普生物科技股份有限公司 一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用
EP4089112A1 (en) * 2021-05-14 2022-11-16 Ustav organicke chemie a biochemie AV CR, v.v.i. Antibody binding to rbd of spike protein of sars-cov-2 and a method for quantifying protective antibodies against sars-cov-2
GB202107057D0 (en) 2021-05-18 2021-06-30 Univ York Glycosylation method
CA3212678A1 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Sars-cov-2 polypeptides
WO2022251403A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-01 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Sars-cov-2 antibodies and uses thereof
CN113354733B (zh) * 2021-06-04 2022-02-18 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2流行突变株的单克隆抗体20D8
WO2022261153A1 (en) * 2021-06-08 2022-12-15 Eli Lilly And Company 2019 novel coronavirus antibody-containing pharmaceutical formulations
CN113416245A (zh) * 2021-06-15 2021-09-21 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种可结合SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的中和抗体及其应用
WO2022263638A1 (en) * 2021-06-17 2022-12-22 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection
US12201857B2 (en) * 2021-06-22 2025-01-21 Twist Bioscience Corporation Methods and compositions relating to covid antibody epitopes
WO2022271258A1 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 La Jolla Institute For Immunology Chimeric anti-sars-cov2 nucleoprotein antibodies
CN113584223B (zh) * 2021-06-28 2024-01-12 中国人民解放军疾病预防控制中心 基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法
WO2023275538A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 Diosynvax Ltd Beta-coronavirus vaccines
CN115594758A (zh) * 2021-06-28 2023-01-13 南京晶准生物科技有限公司（Cn） 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的纳米抗体及其制备方法和用途
US20240316169A1 (en) 2021-07-05 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Utilization of antibodies to shape antibody responses to an antigen
WO2023285620A2 (en) * 2021-07-14 2023-01-19 Alchemab Therapeutics Ltd. Compositions and methods for targeting viral proteins
CA3225575A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN113621651A (zh) * 2021-07-19 2021-11-09 南昌五元生物科技有限公司 一种基于s-tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法
GB202110391D0 (en) 2021-07-19 2021-09-01 Tissue Click Ltd A detection kit and methods of detection of infectious agents
WO2023002944A1 (ja) * 2021-07-19 2023-01-26 公立大学法人福島県立医科大学 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）およびＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）に結合する抗体
WO2023004431A2 (en) * 2021-07-23 2023-01-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Characterization of potent and broadly neutralizing monoclonal antibodies against sars-cov-2, its variants, and related coronaviruses and methods of use
US11724077B2 (en) * 2021-07-28 2023-08-15 Subhash Dhawan Therapeutic swabs for treating upper respiratory infections
WO2023008463A1 (ja) * 2021-07-28 2023-02-02 株式会社イーベック ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株および変異株に対する中和ヒト抗体およびその抗原結合性断片
WO2023004477A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-02 The University Of Melbourne Neutralising antibodies and uses thereof
CN113512113B (zh) * 2021-08-03 2024-07-05 浙江大学医学院附属第一医院 人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用
EP4380954A4 (en) * 2021-08-04 2025-07-09 Univ California SARS-COV-2 PSEUDO-VIRAL PARTICLES
US20230192818A1 (en) * 2021-08-17 2023-06-22 Twist Bioscience Corporation Sars-cov-2 antibodies and related compositions and methods of use
WO2023026207A1 (en) * 2021-08-25 2023-03-02 Translational Health Science And Technology Institute Potently neutralizing novel human monoclonal antibodies against sars-cov-2 (covid-19)
EP4395826A1 (en) * 2021-09-03 2024-07-10 The UAB Research Foundation Human neutralizing antibodies against sars-cov-2 spike s2 domain and uses thereof
WO2023048656A2 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Chulalongkorn University Human monoclonal antibodies against the receptor-binding domain of sars-cov-2 spike protein
TW202334429A (zh) * 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途
WO2023064717A2 (en) * 2021-10-08 2023-04-20 Augmenta Bioworks, Inc. Antibodies for sars-cov-2 and uses thereof
WO2023064435A2 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 The Children's Medical Center Corporation Compositions and methods relating to sars-cov-2 neutralizing antibodies
US20240408194A1 (en) * 2021-10-20 2024-12-12 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University DNA ORIGAMI SUBUNIT VACCINE FOR PREVENTION OF SARS-CoV-2 VARIANT INFECTION
WO2023081434A2 (en) * 2021-11-07 2023-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing sars-cov-2 infections and covid-19 with anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies
JP2024544936A (ja) * 2021-11-12 2024-12-05 アールキュー・バイオテクノロジー・リミテッド 組成物
US20250026814A1 (en) * 2021-11-16 2025-01-23 The University Of Chicago Polypeptides for detection and treatment of coronavirus infection
EP4190810A1 (en) * 2021-12-01 2023-06-07 Universität zu Köln Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus
EP4441090A1 (en) * 2021-12-01 2024-10-09 Universität zu Köln Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus
CN113862286B (zh) * 2021-12-03 2022-03-04 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司 编码sars-cov-2病毒c.37突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用
WO2023104904A2 (en) * 2021-12-08 2023-06-15 Genclis The sars-cov-2 and variants use two independent cell receptors to replicate
WO2023108936A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 杭州安旭生物科技股份有限公司 一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用
WO2023113094A1 (ko) * 2021-12-16 2023-06-22 주식회사 씨티씨백 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물
US20230212610A1 (en) * 2021-12-20 2023-07-06 DNARx Nucleic acid expression using subcutaneous administration
JP2025501775A (ja) * 2021-12-27 2025-01-23 アカデミア シニカ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対して特異的な抗体及びその使用
AU2023208050A1 (en) 2022-01-14 2024-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Verrucarin a derivatives and antibody drug conjugates thereof
TWI868567B (zh) * 2022-01-26 2025-01-01 中央研究院 冠狀病毒之特異性抗體及其用途
WO2023145859A1 (ja) 2022-01-28 2023-08-03 株式会社イーベック 変異株交差性を有する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヒト中和抗体およびその抗原結合性断片
EP4476546A1 (en) * 2022-02-11 2024-12-18 Attana AB Analytical method
WO2023156186A1 (en) * 2022-02-16 2023-08-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Markers for high-affinity sars-cov-2 spike protein antibodies
CR20240389A (es) * 2022-02-18 2025-05-05 Rqbio Covid Ltd Anticuerpos capaces de unirse a la proteína de la espícula de coronavirus sars-cov-2
TW202342510A (zh) * 2022-02-18 2023-11-01 英商Ｒｑ生物科技有限公司 抗體
CN114231497B (zh) * 2022-02-24 2022-05-20 广州伯尼兹生物科技有限公司 一株表达SARS-CoV-2 S1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及中和活性抗体
WO2023178182A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for detection and treatment of coronavirus infection
JP2025081789A (ja) * 2022-03-31 2025-05-28 公立大学法人福島県立医科大学 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に結合する抗体
WO2023190852A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 公立大学法人福島県立医科大学 新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に結合する抗体
JP2025512512A (ja) 2022-04-14 2025-04-17 インビジシールド テクノロジーズ リミテッド コロナウイルス感染症の予防又は治療のための組成物
CA3256034A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Invisishield Technologies Ltd. COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR TREATMENT OF INFLUENZA INFECTIONS
US11993644B2 (en) 2022-05-06 2024-05-28 Generate Biomedicines, Inc. Antigen binding molecules targeting SARS-CoV-2
CN115287265B (zh) * 2022-07-12 2023-05-23 四川大学华西医院 多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠突变体的免疫防治模型
EP4335870A1 (en) * 2022-09-06 2024-03-13 NantCell, Inc. Peptide therapeutics against sars-cov-2 spike protein
EP4349860A1 (en) 2022-10-06 2024-04-10 Fundació Institut Hospital Del Mar D'Investigacions Mèdiques (IMIM) Anti-sars-cov-2 antibodies
TW202426045A (zh) * 2022-10-07 2024-07-01 高端疫苗生物製劑股份有限公司 抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2) Omicron變異株之免疫組合物
KR102879761B1 (ko) * 2022-12-13 2025-11-07 대한민국 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 백신 조성물
EP4673462A2 (en) 2023-02-28 2026-01-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent anti-spike protein binding molecules and uses thereof
JP2026507138A (ja) 2023-02-28 2026-02-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 多価抗スパイクタンパク質結合分子およびその使用
WO2024211317A2 (en) * 2023-04-07 2024-10-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Monoclonal antibodies to cadherin 11 and methods of use
WO2024215614A2 (en) 2023-04-08 2024-10-17 Rock Biomedical Inc. Methods and compositions for dendritic cell targeting nano-delivery
WO2024215612A2 (en) 2023-04-08 2024-10-17 Roc Biomedical Inc. Methods and compositions for targeted delivery by polymersomes
KR20260013456A (ko) 2023-05-17 2026-01-28 락 바이오메디컬 인크. Mgat1 결핍 세포 및 이의 용도
US20250011449A1 (en) 2023-06-11 2025-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Circularized antibody molecules
KR20260025141A (ko) * 2023-06-12 2026-02-23 인테리우스 바이오테라퓨틱스, 인코포레이티드 면역 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법
CN117379399A (zh) * 2023-06-27 2024-01-12 江生(深圳)生物技术研发中心有限公司 马源免疫球蛋白吸入液体制剂及其制备和使用方法
WO2025064752A1 (en) * 2023-09-20 2025-03-27 La Jolla Institute For Immunology Human anti-sars-cov-2 spike (s) antibodies
WO2025227010A1 (en) * 2024-04-26 2025-10-30 Eli Lilly And Company Protein tyrosine kinase 7 antibodies and antibody-drug conjugates

Family Cites Families (209)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5693489A (en) 1984-03-30 1997-12-02 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5908635A (en) 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7892563B2 (en) 2003-05-20 2011-02-22 Wyeth Holdings Corporation Methods for treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
US7750123B2 (en) * 2003-11-25 2010-07-06 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against SARS-CoV and methods of use thereof
US7629443B2 (en) * 2004-06-02 2009-12-08 New York Blood Center, Inc. Neutralizing monoclonal antibodies against severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus
RS52176B (sr) 2006-06-02 2012-08-31 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Antitela visokog afiniteta prema humanom il-6 receptoru
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
GB0624500D0 (en) 2006-12-07 2007-01-17 Istituto Superiore Di Sanito A novel passive vaccine for candida infections
US20110159001A1 (en) 2008-01-17 2011-06-30 Institute For Research In Biomedicine CROSS-NEUTRALIZING HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO SARS-CoV AND METHODS OF USE THEREOF
AU2009248049B2 (en) 2008-05-16 2015-07-23 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against CXCR4 and other GPCRs and compounds comprising the same
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
WO2015143335A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for chimeric coronavirus spike proteins
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
CA2874083C (en) 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
MX2019000935A (es) 2016-08-16 2019-07-04 Regeneron Pharma Metodos para cuantificar anticuerpos individuales de una mezcla.
SMT202100307T1 (it) 2018-01-26 2021-07-12 Regeneron Pharma Anticorpi e frammenti di legame di anti-tmprss2
JP7700092B2 (ja) 2019-07-03 2025-06-30 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング グリコフォームの精製
US20220273718A1 (en) 2019-08-02 2022-09-01 University Of Virginia Patent Foundation Bispecific antibody targeting of t regulatory cells for treatment of inflammatory conditions
KR20220066276A (ko) 2019-08-22 2022-05-24 시다라 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변이체 fc 도메인 및 이의 용도
EP3795163A1 (en) 2019-09-23 2021-03-24 The Ceutics Company GesmbH A topical plant extract formulation comprising urtica dioica and vitamin a
US12048741B2 (en) 2019-09-27 2024-07-30 George Mason University Recombinant host cell with heterologous nucleic acids encoding SHREK proteins
CN111748571B (zh) 2019-10-11 2022-05-03 浙江禾霖生物科技有限公司 一种将枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的方法
AU2020384498A1 (en) 2019-11-12 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for identifying, classifying, and/or ranking genetic sequences
EP4093873A4 (en) * 2020-01-24 2024-07-10 AIM ImmunoTech Inc. Methods, compositions, and vaccines for treating a virus infection
WO2021148884A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 Tychan Pte. Ltd. Anti-wuhan coronavirus antibodies
CN113201068A (zh) 2020-02-03 2021-08-03 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 基因重组抗2019-nCoV和其它冠状病毒IgY及其小分子抗体以及应用
AU2021220847A1 (en) 2020-02-11 2022-09-01 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV- 2)
CN113248579B (zh) 2020-02-12 2022-10-18 重庆医科大学 新型冠状病毒（2019-ncov）抗原表位、抗体及其应用
CN111303254A (zh) 2020-02-20 2020-06-19 北京新创生物工程有限公司 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原检测试剂盒
DE202020105116U1 (de) 2020-02-20 2020-10-06 Charité - Universitätsmedizin Berlin Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion
US11369592B2 (en) * 2020-02-21 2022-06-28 Florida State University Research Foundation, Inc. Treatment of human coronavirus infections using alpha-glucosidase glycoprotein processing inhibitors
US20210260201A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Physis Biotechnologies, Llc Extracellular vesicles for the treatment and prevention of infections and other diseases
CN111333704B (zh) 2020-02-24 2021-01-12 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 新型冠状病毒covid-19疫苗、制备方法及其应用
CN113292650B (zh) 2020-02-24 2022-08-12 中国科学院微生物研究所 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用
CN113292649B (zh) 2020-02-24 2022-08-12 中国科学院微生物研究所 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用
IL295863A (en) 2020-02-25 2022-10-01 Ligandal Inc Identification of biomimetic viral peptides and their uses
EP3872091B1 (en) 2020-02-26 2023-06-14 VIR Biotechnology, Inc. Antibodies against sars-cov-2
CN113307865B (zh) 2020-02-26 2022-12-13 复旦大学 新型冠状病毒的全人源单域抗体及应用
EP3885361A1 (en) 2020-02-27 2021-09-29 Macrofarm Srl Monoclonal-type synthetic antibodies obtained by molecular imprinting and their use for the treatment and preventive medicine of covid-19
CN113354731B (zh) 2020-03-02 2026-02-03 中国科学院微生物研究所 冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用
CN111333722A (zh) 2020-03-03 2020-06-26 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) SARS-CoV-2抑制剂及其应用
US11376320B2 (en) 2020-03-05 2022-07-05 Iowa State University Research Foundation, Inc. Immunogenic and vaccine compositions against SARS-CoV-2
CN111285933A (zh) 2020-03-09 2020-06-16 四川省人民医院 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒
WO2021183556A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Adma Biologics, Inc. Immunotherapeutic compositions and methods of production for coronavirus
WO2021183195A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 1.Abcellera Biologics Inc. Anti-coronavirus antibodies and methods of use
CN111420048B (zh) 2020-03-11 2023-09-19 中国人民解放军第四军医大学 抗basigin人源化抗体用于制备治疗新型冠状病毒肺炎药物的应用
GB202003632D0 (en) 2020-03-12 2020-04-29 Harbour Antibodies Bv SARS-Cov-2 (SARS2, COVID-19) antibodies
WO2021183790A1 (en) 2020-03-12 2021-09-16 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method for treatment of covid-19-associated conditions
US10822379B1 (en) 2020-03-12 2020-11-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to SARS-CoV-2
CN111592594B (zh) 2020-03-13 2022-05-10 北京大学 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN112557645B (zh) 2020-03-13 2022-03-08 珠海碳云智能科技有限公司 抗原表位多肽的筛选方法及装置
CN114163523B (zh) 2020-03-17 2023-07-18 北京凯因科技股份有限公司 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用
CN111088283B (zh) * 2020-03-20 2020-06-23 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
CN111303280B (zh) 2020-03-22 2022-01-07 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用
KR102205028B1 (ko) 2020-03-22 2021-01-20 (주)셀트리온 사스-코로나바이러스-2에 중화 활성을 갖는 결합 분자
US11021531B1 (en) 2020-03-23 2021-06-01 Centivax, Inc. Anti-SARS-Cov-2 antibodies derived from 2GHW
US11021532B1 (en) 2020-03-23 2021-06-01 Centivax, Inc. Superhuman anti-SARS-CoV-2 antibodies and uses thereof
US11028167B1 (en) 2020-03-23 2021-06-08 Centivax, Inc. Anti-SARS-Cov-2 antibodies derived from 3bgf
US11028150B1 (en) 2020-03-23 2021-06-08 Centivax, Inc. Anti-SARS-CoV-2 antibodies derived from 2DD8
CN111690058B (zh) 2020-03-30 2021-02-05 三优生物医药(上海)有限公司 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途
CN111848750B (zh) 2020-03-31 2023-09-12 浙江聚康生物工程有限公司 一种快速富集和检测2019-nCoV的方法及试剂盒
CN111423508A (zh) 2020-03-31 2020-07-17 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种分离的抗病毒感染的SARS-CoV-2蛋白结合分子
CR20220552A (es) 2020-04-02 2023-01-17 Regeneron Pharma Anticuerpos contra glicoproteína de espícula anti-sars-cov-2 y fragmentos de unión al antígeno
CA3174212A1 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Blis Technologies Limited Antiviral treatment comprising blis containing probiotic products
WO2021203053A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Vir Biotechnology, Inc. Immunotherapy targeting a conserved region in sars coronaviruses
CN111499765B (zh) 2020-04-08 2022-04-08 四川携光生物技术有限公司 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用
CN111440229B (zh) 2020-04-13 2021-08-03 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 新型冠状病毒t细胞表位及其应用
WO2021207962A1 (en) 2020-04-15 2021-10-21 Active Motif Shanghai Limited Antibodies to sars-coronavirus (covid-19) s1 spike protein
CN111647053A (zh) 2020-04-16 2020-09-11 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 多肽及其在新型冠状病毒检测、抗体或疫苗筛选中的应用
CN111647076B (zh) 2020-04-27 2021-02-26 南京医科大学 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用
CN111592595B (zh) 2020-04-27 2021-02-19 南京医科大学 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性抗体及其应用
KR20230002261A (ko) 2020-04-28 2023-01-05 더 락커펠러 유니버시티 항-sars-cov-2 중화 항체 및 이의 사용 방법
CN111471105A (zh) 2020-05-05 2020-07-31 广西医科大学 新冠病毒银治疗性中和抗体制备及应用
PH12022500020A1 (en) 2020-05-08 2024-05-06 Vir Biotechnology Inc Antibodies against sars-cov-2
CN111662379B (zh) 2020-05-09 2021-03-02 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 抗新型冠状病毒的抗体、制备方法和应用
CN111620945B (zh) 2020-05-09 2021-01-15 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其衍生体
CN111620946B (zh) 2020-05-09 2020-12-22 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 分离的新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合部分
CN111518773B (zh) 2020-05-09 2023-01-03 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗新型冠状病毒s蛋白的car-t细胞、制备方法及其应用
CN112010966B (zh) 2020-05-15 2021-03-19 潍坊医学院 一种针对新冠病毒棘突蛋白非rbd区的单克隆抗体及其应用
EP4153312A1 (en) 2020-05-17 2023-03-29 AstraZeneca UK Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of selecting and using the same
CN111607003B (zh) 2020-05-21 2022-08-23 上海百英生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用
CN111560399B (zh) 2020-05-22 2021-07-06 苏州君盟生物医药科技有限公司 细胞大规模瞬时转染方法
CN111574614A (zh) 2020-05-23 2020-08-25 湖南源品细胞生物科技有限公司 一种tcr富集克隆型及其获取方法与应用
WO2021242815A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN111748032B (zh) 2020-05-27 2021-03-16 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测
US20210371503A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 University Of Cologne Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus
CN111647077B (zh) 2020-06-02 2021-02-09 深圳市因诺赛生物科技有限公司 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用
US20230242624A1 (en) 2020-06-02 2023-08-03 Neurimmune Ag HUMAN ANTIBODIES AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS-2 (SARS-CoV-2)
JP2023528441A (ja) 2020-06-03 2023-07-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及びＣＯＶＩＤ－１９を治療又は予防するための方法
CN113429478B (zh) 2020-06-04 2023-11-10 山东宽和正生物医药有限公司 针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体H9
WO2021249547A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-coronavirus antibodies and uses thereof
CN113151184B (zh) 2020-06-15 2023-03-21 上海市公共卫生临床中心 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法
CN111499692B (zh) 2020-06-16 2020-12-04 国家纳米科学中心 靶向新型冠状病毒covid-19的多肽及其应用
CN111825762A (zh) 2020-06-17 2020-10-27 武汉华美生物工程有限公司 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途
CN111848751B (zh) 2020-06-18 2023-09-29 河南省生物工程技术研究中心 一种新冠病毒s蛋白优势抗原表位肽及其用途
CN111718411B (zh) 2020-06-19 2022-03-08 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1F2
CN111690059B (zh) 2020-06-19 2022-03-08 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1D7
CN112521494B (zh) 2020-06-19 2021-06-25 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体2B11
CN111732654B (zh) 2020-06-19 2021-05-25 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1E10
US11020474B1 (en) 2020-06-25 2021-06-01 Abclonal Science, Inc. Producing recombinant SARS-CoV-2 spike protein in a pre-fusion state
CN111714621B (zh) 2020-06-29 2021-04-27 中国科学院昆明动物研究所 转铁蛋白、转铁蛋白受体及其抗体在制备抗SARS-CoV-2病毒的药物中的应用
CN111732655B (zh) 2020-07-01 2021-10-22 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用
CN111848789B (zh) 2020-07-02 2022-04-22 武汉华美生物工程有限公司 抗sars-cov-2病毒s蛋白的单链抗体及其用途
CN111690060A (zh) 2020-07-06 2020-09-22 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 能够特异性识别RBD蛋白的IgA抗体以及试剂盒
CN111732664B (zh) 2020-07-06 2020-12-01 北京金智准科技有限公司 一种新型冠状病毒重组蛋白、兔-人嵌合抗体、其制备方法及应用
CN111978377B (zh) 2020-07-09 2022-05-31 苏州和锐生物科技有限公司 Covid-19抗原、制备方法和应用
CN113072640A (zh) 2020-07-16 2021-07-06 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 抗突变SARS-CoV-2多结合位点IgY及其制备以及抗体组合疗法和应用
CN112500480B (zh) 2020-07-17 2022-04-01 上海洛启生物医药技术有限公司 针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用
CN111978395B (zh) 2020-07-20 2022-06-10 四川大学 抗新型冠状病毒rbd结构域抗原的单克隆抗体
CN111978396B (zh) 2020-07-20 2022-05-20 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 特异性结合sars-cov-2 np蛋白的抗体及其用途
CN111978399B (zh) 2020-07-20 2022-05-20 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 特异性结合sars-cov-2抗原蛋白的抗体及其用途
CN111995672B (zh) 2020-07-20 2022-05-20 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 冠状病毒sars-cov-2 s蛋白特异性抗体及其用途
CN112010962B (zh) 2020-07-20 2022-05-20 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 用于检测covid-19的抗体及其医学用途
CN111978397B (zh) 2020-07-20 2022-05-20 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 特异性结合sars-cov-2 s蛋白的抗体及其用途
CN112010963B (zh) 2020-07-20 2022-05-20 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 Sars-cov-2抗体及其用途
CN112210004B (zh) 2020-07-20 2021-06-29 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 冠状病毒病covid-19检测抗体及其用途
CN111978398B (zh) 2020-07-20 2022-05-20 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 针对冠状病毒sars-cov-2的抗体及其医学用途
CN111825771A (zh) 2020-07-23 2020-10-27 白涛 一种抗病毒抗细菌生物导弹
CN112062859B (zh) 2020-07-24 2022-08-09 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病原体清除的嵌合抗原受体及其应用
CN111793129B (zh) 2020-07-28 2021-09-24 上海市公共卫生临床中心 一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段
CN112094340B (zh) 2020-07-31 2023-06-20 王跃驹 植物作为宿主在表达新型冠状病毒肺炎中和抗体b38抗体和/或h4抗体中的应用
CN112300274B (zh) 2020-08-10 2022-05-31 苏州方科生物科技有限公司 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
CN111875701A (zh) 2020-08-14 2020-11-03 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2病毒的单链抗体及用途
CN111909261B (zh) 2020-08-19 2022-10-04 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN115304671B (zh) 2020-08-19 2023-10-17 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体及其应用
CN111909263B (zh) 2020-08-19 2022-10-11 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN115340601B (zh) 2020-08-19 2024-10-29 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN115477698B (zh) 2020-08-19 2024-10-25 重庆医科大学 一种rbd特异性单克隆抗体和应用
CN115340602B (zh) 2020-08-19 2024-07-30 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN115340600B (zh) 2020-08-19 2025-01-24 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN111925443B (zh) 2020-08-19 2022-10-11 重庆医科大学 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN111944026B (zh) 2020-08-19 2023-10-20 重庆医科大学 一种新冠病毒rbd特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用
CN118206645A (zh) 2020-08-19 2024-06-18 重庆医科大学 新型冠状病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
CN111925439A (zh) 2020-08-19 2020-11-13 重庆医科大学 快速筛选新冠病毒rbd特异性全人源中和性单克隆抗体方法
CN112062838B (zh) 2020-08-25 2021-03-23 南京医科大学 一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用
CN112010964A (zh) 2020-09-02 2020-12-01 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 一种新冠病毒羊驼抗体及其制备方法和应用
CN111995674B (zh) 2020-09-03 2022-02-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用
KR102229225B1 (ko) 2020-09-04 2021-03-19 (주)셀트리온 사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질에 결합하는 사스-코로나바이러스 감염증의 진단용 결합 분자
CN112010967B (zh) 2020-09-07 2021-03-23 康维众和(中山)生物药业有限公司 新型冠状病毒SARS-Cov-2中和毒性的纳米抗体及其制备方法与应用
CN112076316B (zh) 2020-09-21 2022-10-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种双抗体组合物及在制备covid-19治疗药物中的应用
CN112062840A (zh) 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白的纳米抗体及其应用
CN112062839A (zh) 2020-09-22 2020-12-11 石河子大学 一种基于新型冠状病毒s蛋白s1亚基的纳米抗体及其应用
CN112175071A (zh) 2020-09-22 2021-01-05 通用生物系统（安徽）有限公司 一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法
CN114292326B (zh) 2020-09-23 2023-05-12 深圳市因诺赛生物科技有限公司 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用
CN112094327A (zh) 2020-09-25 2020-12-18 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 基于新型冠状病毒rbd-sd1蛋白的截短体及其应用
CN112094342B (zh) 2020-09-25 2022-05-13 中国科学技术大学 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN112094343B (zh) 2020-09-25 2022-05-13 中国科学技术大学 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN112094326B (zh) 2020-09-25 2023-06-02 河南省生物工程技术研究中心 一种新冠病毒抗原及其应用
CN112125973B (zh) 2020-09-30 2022-02-01 上海市公共卫生临床中心 冠状病毒的特异性抗体或其抗原结合片段
CN112159469B (zh) 2020-09-30 2022-08-02 上海市公共卫生临床中心 冠状病毒的抗体或其抗原结合片段
CN112175073B (zh) 2020-09-30 2022-08-02 上海市公共卫生临床中心 冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段
CN112251414A (zh) 2020-10-12 2021-01-22 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种杂交瘤细胞株、其制备方法和应用
CN112194711A (zh) 2020-10-15 2021-01-08 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 一种新型冠状病毒s蛋白的b细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方法及应用
CN112409488B (zh) 2020-10-23 2022-07-01 中国科学院上海药物研究所 针对多种冠状病毒的单克隆抗体及应用
GB202017058D0 (en) 2020-10-27 2020-12-09 Kymab Ltd Antibodies and uses thereof
CN112225806B (zh) 2020-11-13 2021-04-13 李亚峰 一种人源抗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的中和活性单克隆抗体
CN112625136B (zh) 2020-11-18 2022-02-11 三优生物医药(上海)有限公司 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途
RU2744274C1 (ru) 2020-11-20 2021-03-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2
CN112430265B (zh) 2020-11-23 2022-04-12 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61及其应用
CN112522203B (zh) 2020-11-23 2023-08-11 中山大学附属第五医院 表达嵌合抗原受体的细胞囊泡及其制备方法和应用
CN112409479B (zh) 2020-11-23 2022-04-26 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-121及其应用
CN112341541B (zh) 2020-11-23 2022-05-06 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用
CN112442120A (zh) 2020-11-25 2021-03-05 苏州大学 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体
CN112574299B (zh) 2020-11-25 2023-03-21 苏州方科生物科技有限公司 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
KR102233689B1 (ko) 2020-11-26 2021-03-30 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 이용
CN112500481B (zh) 2020-11-29 2021-08-20 山西省人民医院 一种人源抗新型冠状病毒的中和活性单克隆抗体
CN112574300B (zh) 2020-12-02 2022-03-08 深圳先进技术研究院 抗sar-cov-2全人源单克隆抗体及其制法与应用
CN112661841B (zh) 2020-12-04 2022-10-14 广州市第八人民医院 一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用
CN112626089B (zh) 2020-12-08 2022-03-11 杭州百凌生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2病毒S蛋白受体结合区域编码基因、抗体及应用
CN112538111B (zh) 2020-12-09 2022-04-29 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 新冠病毒单链抗体及质控品和制备方法
CN112485455B (zh) 2020-12-09 2022-11-01 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 新冠病毒抗体质控品及其制备方法
CN112250763B (zh) 2020-12-21 2021-03-26 三优生物医药(上海)有限公司 靶向SARS-CoV-2冠状病毒的抗体及其诊断和检测用途
CN112724247A (zh) 2020-12-25 2021-04-30 江苏中方基因生物医学科技有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒IgA抗体及其在ELISA检测试剂盒中的应用
CN112626030A (zh) 2020-12-31 2021-04-09 深圳市第二人民医院 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法
CN112341542B (zh) 2021-01-08 2021-05-14 清华大学 一种3-羟基丁酰化修饰蛋白质药物及其制备方法和应用
CN112625125B (zh) 2021-01-18 2021-12-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一株中和新型冠状病毒感染的单抗
CN112390879B (zh) 2021-01-21 2021-04-02 上海科技大学 靶向SARS-CoV-2的抗体及其制备方法和应用
WO2022162587A1 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection
CN112724248A (zh) 2021-01-28 2021-04-30 南京拓峰生物科技有限公司 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用
CN113150129B (zh) 2021-01-28 2023-02-28 四川大学华西医院 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S2蛋白的单链抗体及其应用
CN113264998B (zh) 2021-01-28 2023-02-28 四川大学华西医院 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
CN112521496B (zh) 2021-01-29 2022-09-06 中国人民解放军空军军医大学 特异性结合SARS-CoV-2 Spike RBD的单克隆抗体及其应用
CN115141272B (zh) 2021-01-31 2024-06-25 中南大学湘雅医院 新型冠状病毒单克隆抗体xy1及其应用
CN112552399B (zh) 2021-02-24 2021-07-20 恒翼生物医药科技(上海)有限公司 抗sars-cov-2中和抗体
CN113150132B (zh) 2021-03-11 2022-05-31 苏州携创生物技术有限公司 一种抗SARS-CoV-2重组抗体及其应用
CN112794899B (zh) 2021-03-16 2021-09-24 易康生物(苏州)有限公司 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆中和抗体及其应用
CN112794898B (zh) 2021-03-16 2021-08-03 易康生物(苏州)有限公司 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用
CN112980885B (zh) 2021-03-18 2022-04-15 恒翼生物医药科技(上海)有限公司 抗sars-cov-2中和抗体的表达载体
CN113045647B (zh) 2021-03-22 2022-04-26 南京传奇生物科技有限公司 新冠病毒SARS-CoV-2的中和性抗体及其应用
CN113150135B (zh) 2021-04-14 2022-09-20 中山大学 抗新型冠状病毒受体结合区域中和抗体及其应用
CN113173995B (zh) 2021-04-30 2022-09-23 上海市公共卫生临床中心 一种结合冠状病毒的双特异性抗体
CN113214389A (zh) 2021-05-19 2021-08-06 武汉菲沙基因组医学有限公司 全人源的新冠IgL单链抗体及其应用
CN113185609A (zh) 2021-05-19 2021-07-30 武汉菲沙基因组医学有限公司 全人源的新冠IgG2单链抗体及其应用
CN113234150A (zh) 2021-05-19 2021-08-10 武汉菲沙基因组医学有限公司 全人源的新冠IgG1单链抗体及其应用
CN113234149B (zh) 2021-05-19 2023-06-16 武汉菲沙基因组医学有限公司 全人源的新冠IgA单链抗体及其应用
CN113234148A (zh) 2021-05-19 2021-08-10 武汉菲沙基因组医学有限公司 全人源的新冠IgK单链抗体及其应用
CN113215106B (zh) 2021-05-20 2022-04-01 广东省公共卫生研究院 杂交瘤细胞、抗SARS-CoV-2的单克隆抗体及其应用
CN113354733B (zh) 2021-06-04 2022-02-18 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2流行突变株的单克隆抗体20D8
CN113234151B (zh) 2021-06-08 2022-02-15 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种基于靶向SARS-CoV2病毒S蛋白的三聚体纳米抗体的CAR-NK的研制
CN113248581A (zh) 2021-06-15 2021-08-13 江西浩然生物制药有限公司 用于产生新冠病毒中和抗体的新冠s抗原及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR102831970B1 (ko) 2025-07-11
CO2021005072A2 (es) 2021-04-30
US12251440B2 (en) 2025-03-18
IL282060A (en) 2021-05-31
JP2024038003A (ja) 2024-03-19
TW202138004A (zh) 2021-10-16
SI3889177T1 (sl) 2023-03-31
EP3889177A1 (en) 2021-10-06
WO2021045836A1 (en) 2021-03-11
AU2020340881A1 (en) 2021-10-21
PH12021550793A1 (en) 2022-02-28
US20230348569A1 (en) 2023-11-02
LT3889177T (lt) 2023-02-10
CA3115553A1 (en) 2021-03-11
US10954289B1 (en) 2021-03-23
US10787501B1 (en) 2020-09-29
PL3889177T3 (pl) 2023-05-08
CR20220552A (es) 2023-01-17
ES2939895T3 (es) 2023-04-27
BR112020015534A2 (pt) 2021-10-05
CA3192925A1 (en) 2021-03-11
JP2022536429A (ja) 2022-08-17
SMT202300061T1 (it) 2023-03-17
CA3115553C (en) 2023-04-25
TWI858423B (zh) 2024-10-11
AU2020340881B2 (en) 2025-03-06
TWI785350B (zh) 2022-12-01
KR20250107297A (ko) 2025-07-11
KR20210134300A (ko) 2021-11-09
DK3889177T3 (da) 2023-02-13
US11732030B2 (en) 2023-08-22
CL2021000997A1 (es) 2021-09-10
EP3889177B1 (en) 2023-01-11
FI3889177T3 (fi) 2023-03-19
TW202308686A (zh) 2023-03-01
CL2023000705A1 (es) 2023-08-25
DK3889177T5 (da) 2024-08-05
EP4209507A1 (en) 2023-07-12
JP7684379B2 (ja) 2025-05-27
US20220356230A1 (en) 2022-11-10
JP2025134090A (ja) 2025-09-16
JP2022160520A (ja) 2022-10-19
MA54405A (fr) 2022-01-26
HRP20230338T1 (hr) 2023-05-26
PT3889177T (pt) 2023-02-02
CN113766928B (zh) 2024-10-25
JP7116256B1 (ja) 2022-08-09
MX2021004130A (es) 2021-06-15
PE20221893A1 (es) 2022-12-13
MY197648A (en) 2023-06-30
JP7411029B2 (ja) 2024-01-10
SG11202103404PA (en) 2021-04-29
US10975139B1 (en) 2021-04-13
MA54405B1 (fr) 2023-05-31
CN113766928A (zh) 2021-12-07
HUE061425T2 (hu) 2023-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7684379B2 (ja) 抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２－スパイク糖タンパク質抗体および抗原結合断片
US20240043504A1 (en) Anti-SARS-CoV-2-Spike Glycoprotein Antibodies and Antigen-Binding Fragments
JP2024527607A (ja) 抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２－スパイク糖タンパク質抗体及び抗原結合断片
HK40096787A (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
HK40054577A (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
HK40054577B (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
WO2022187626A1 (en) Anti-sars-cov-2-variant-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
BR112020015534B1 (pt) Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seu método de fabricação, seus usos, bem como composição farmacêutica
BR122023004078B1 (pt) Composição farmacêutica, seu uso e método para fabricar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo
JP7834965B2 (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ２抗体および抗原結合断片
CN118302440A (zh) 抗sars-cov-2-刺突糖蛋白抗体及抗原结合片段
JP2021511058A (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ２抗体および抗原結合断片