RS64106B1 - Konstrukcija himernog antigenskog receptora koji ciljno deluje na cd20 antigen i identifikacija aktivnosti njegovih projektovanih t ćelija - Google Patents

Description

Opis

Tehnička oblast

[0001] Predmetni pronalazak obezbeđuje komponentu sekvence himernog antigenskog receptora koji ciljno deluje na CD20 antigen, i postupak pripreme za njegove modifikovane T ćelije (CART20) i identifikaciju njihove aktivnosti. Predmetni pronalazak identifikuje strukturu himernog antigenskog receptora za lečenje CD20 pozitivnog B ćelijskog limfoma.

Pozadina tehnike

[0002] Maligni tumori krvnog sistema čine oko 10% humanih malignih tumora, i 95% malignih tumora krvnog sistema su poreklom od B limfocita. Tradicionalna hemioterapija i radioterapija igraju važnu ulogu u lečenju malignih tumora krvnog sistema. Neki pacijenti takođe imaju značajne efekte, ali većinu njih je teško izlečiti. Nova i efikasna lečenja su aktuelna tema u ovoj oblasti.

[0003] Adoptivna T ćelijska terapija je pokazala svoju moćnu efikasnost i sjajnu perspektivu u kliničkom lečenju malignih tumora. Među njima, više centara koji nezavisno upotrebljavaju T ćelije modifikovane himernim antigenskim receptorom (CAR) za ciljanje rekurentnih, refraktornih malignih tumora CD19-eksprimirajućih B ćelija postiglo je uspeh bez presedana. Konkretno, u kliničkom ispitivanju koje je sprovedeno na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Pensilvaniji upotrebom CART19 u lečenju rekurentnog, refraktornog akutnog B-ćelijskog limfoma (R/R B-ALL), do 94% pacijenata je postiglo potpunu remisiju. Iako je inicijalna stopa odgovora u ovom kliničkom ispitivanju bila visoka, blizu 40% pacijenata koji su postigli potpun odgovor posle 1 meseca lečenja, imali su recidiv, i više od 60% pacijenata sa recidivom imalo je beg CD19-negativne tumorske ćelije. Prema tome, postoji hitna potreba da se pregledaju CART strukture koje ciljaju antigene asocirane sa B ćelijskim limfomom a koji nisu CD19 za lečenje pacijenata sa malignim limfomom.

[0004] CD20 je glikozilovani protein i prvi je identifikovani marker membrane B ćelija. CD20 je takođe poznat kao B1, i kodiran je od strane MS4A gena. CD20 molekul ima četiri transmembranska hidrofobna regiona, i njegov N-terminus i C-terminus su locirani na citoplazmatskoj strani, formirajući tako dve zatvorene petlje izvan ćelije, koje se respektivno nazivaju velika petlja i mala petlja. CD20 se specifično eksprimira u više od 95% normalnih i kancerskih B ćelija. Ove ćelije su u pre-B ćelijskom stadijumu i kasnijim razvojnim stadijumima, i CD20 zaustavlja ekspresiju sve dok se ćelije ne diferenciraju u plazmocite. Prema tome, CD20 je idealan cilj za imunoterapiju B ćelijskih maligniteta.

[0005] Rituksimab (MabThera<®>, Rituxan<®>) je prva generacija himernih monoklonalnih antitela koja ciljno deluju na CD20 koju su prvo odobrile FDA SAD i Evropska EMA za lečenje indolentnog limfoma. Rituksimab prepoznaje i vezuje se za strukturu velike petlje vanćelijskog domena CD20, i ubija tumorske ćelije ADCC-posredovanim ubijajućim efektom. Međutim, sam rituksimab pokazuje ograničenu aktivnost i kratko trajanje odgovora, ali njegova kombinacija sa hemioterapijom može značajno poboljšati efikasnost hemioterapije. Rituksimab se upotrebljava za lečenje limfoma, i polovina pacijenata ima potpun odgovor (CR) ili delimičan odgovor (PR).

[0006] Ofatumumab (Arzerra<®>) je prvo potpuno humanizovano CD20 terapijsko antitelo. Za razliku od rituksimaba, epitop koji prepoznaje ofatumumab sadrži delove velike petlje i male petlje CD20. Istovremeno, postupak ubijanja tumora ofatumumaba je uglavnom posredstvom puta zavisnog od komplementa, praćenog ADCC-zavisnim ubijajućim efektom tumora.

[0007] Obinutuzumab (Gazyvaro<®>, Gaziva<®>) je humanizovano CD20 antitelo tipa II koje redukuje nivoe fukozilacije i optimizuje afinitet FcyRIIIa. Obinutuzumab prepoznaje i vezuje se za veliku petlju vanćelijskog molekula CD20, i posreduje u ubijajućem efektu tumora uglavnom posredstvom ADCC efekta. Istovremeno, vezivanje obinutuzumaba za CD20 molekul takođe ima efekat indukovanja apoptoze tumorskih ćelija. Što se tiče NHL koji ne reaguje na lečenje rituksimabom, obinutuzumab se kombinuje sa bendamustinom, lekom azotnog iperita. U kliničkom ispitivanju faze III pronađeno je da je trajanje kombinovane terapije obinutuzumabom i bendamustinom bez pogoršanja bilo dvostruko duže od trajanja terapije samo bendamustinom (prethodna je 29 meseci i potonja 14 meseci). Obinutuzumab ima ukupnu stopu odgovora (ORR, uključujući CR i PR) od 77,3%, a za rituksimab je 65,7%.

[0008] U poređenju sa terapijskim antitelima, ćelijska imunoterapija je novi i veoma efikasan model lečenja tumora, i nova je vrsta autoimunoškog lečenja za kancer. To je postupak za in vitro kultivisanje i amplifikaciju imunskih ćelija sakupljenih od pacijenta upotrebom biotehnologije i bioloških agenasa, i zatim se ćelije ponovo vrate transfuzijom pacijentu kako bi se stimulisala i pojačala autoimunska funkcija tela, čime se postiže svrha lečenja tumora. Oni sa iskustvom u oblasti su radili na razvoju nove ćelijske imunoterapije kako bi povećali njenu efikasnost i redukovali njen sporedni efekat. Iako su mnoga terapijska antitela kao što je prethodno opisano razvijena u ovim godinama, njihovi klinički terapijski efekti nisu dostigli isti nivo terapijskih efekata kao CART19. Prema tome, razvoj CART terapije koja ciljno deluje na CD20 ima veliku tržišnu vrednost i društveni značaj.

[0009] Međunarodna patentna prijava WO2016/097231 objavljuje negativan T-ćelijski signal koji indukuje CAR sa anti-CD20 vanćelijskim domenom. Međunarodna patentna prijava WO00/23573, i Lihua Budde et al, PLOS One, 2013, 8(12):1-10, objavljuju CAR koji vezuju CD20.

Sažetak pronalaska

[0010] Imajući u vidu razlike u afinitetu i mehanizmima ubijanja terapijskih antitela koja ciljno deluju na CD20, konstruisali smo seriju himernih antigenskih receptora koji ciljno deluju na CD20 upotrebljavajući DNK sekvence antigen-vezujućih regiona različitih antitela, i završili identifikaciju antitumorske aktivnosti i diferencijalno poređenje ovih projektovanih T ćelija sa himernim antigenskim receptorom in vitro. Ovde su opisani efikasni postupci i preparati za kliničku primenu CAR-T u lečenju CD20-pozitivne leukemije i limfoma.

[0011] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi himerni antigenski receptor koji ciljno deluje na CD20, njegov postupak pripreme i primenu.

[0012] Predmetni pronalazak se odnosi na konstrukciju strukture himernog antigenskog receptora koja ciljno deluje na CD20, postupak pripreme projektovane T ćelije sa himernim antigenskim receptorom koji ciljno deluje na CD20, i identifikaciju njihove aktivnosti.

[0013] Pronalazak je definisan u priloženom skupu patentnih zahteva.

[0014] U prvom aspektu pronalaska, on obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR) pri čemu CAR ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5.

[0015] U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je molekul nukleinske kiseline, koji kodira himerni antigenski receptor (CAR) iz prvog aspekta pronalaska.

[0016] U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline je izolovan.

[0017] U trećem aspektu pronalaska, on obezbeđuje vektor, koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz drugog aspekta pronalaska.

[0018] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, vektor je lentivirusni vektor.

[0019] U četvrtom aspektu pronalaska, on obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži vektor iz trećeg aspekta pronalaska ili koja ima molekul egzogene nukleinske kiseline iz drugog aspekta pronalaska integrisan u svom genomu.

[0020] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ćelija je izolovana ćelija, i/ili ćelija je genetički projektovana ćelija.

[0021] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ćelija je ćelija sisara.

[0022] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ćelija je T ćelija.

[0023] U petom aspektu pronalaska, on obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i himerni antigenski receptor iz prvog aspekta pronalaska, molekul nukleinske kiseline iz drugog aspekta pronalaska, vektor iz trećeg aspekta pronalaska, ili ćeliju iz četvrtog aspekta pronalaska.

[0024] U šestom aspektu pronalaska, on obezbeđuje himerni antigenski receptor iz prvog aspekta pronalaska, molekul nukleinske kiseline iz drugog aspekta pronalaska, vektor iz trećeg aspekta pronalaska, ili ćeliju iz četvrtog aspekta pronalaska za upotrebu u lečenju tumora.

[0025] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, tumor sadrži CD20 pozitivan tumor.

[0026] U dodatnom aspektu pronalaska, on obezbeđuje postupak za pripremu CAR-T ćelije (CAR-modifikovane T ćelije) koja eksprimira himerni antigenski receptor iz prvog aspekta pronalaska,

koji sadrži korake: transdukcije molekula nukleinske kiseline iz drugog aspekta pronalaska ili vektora iz trećeg aspekta pronalaska u T ćeliju, čime se dobija CAR-T ćelija.

Opis crteža

[0027]

Slika 1 pokazuje strukturu himernog antigenskog receptora koji ciljno deluje na CD20. Svaki element dizajnirane CAR strukture je pokazan na slici, i navedeni elementi uključuju: lider sekvencu, sekvencu za prepoznavanje antigena (ofatumumaband, obinutuzumab, rituksimab), zglobni region, transmembranski region, signalni region kostimulatornog faktora, i CD3ζ signalni region. CAR-T20.14, CAR-T20.13 i CAR-T20.16 su CAR strukture konstruisane na osnovu sekvenci varijabilnog regiona antitela ofatumumaba, obinutuzumaba i rituksimaba, respektivno. CAR-T20.19 i CAR-20.20 su mutantni oblici CAR-T20.14, koji imaju L235E-N297Q mutaciju u IgG4 zglob-CH2-CH3 linker regionu. CAR-T20.20 je treća generacija strukture himernog antigenskog receptora sa kodirajućim sekvencama i CD28 i 4-1BB kostimulatornog signalnog molekula.

Slika 2 pokazuje detekciju efikasnosti transfekcije projektovane T ćelije sa himernim antigenskim receptorima koji ciljno deluju na CD20. Nivo ekspresije proteina kodiranog CAR genom na površini membrane T ćelije u CAR-T20 ćelijama kultivisanim na dan 7 (A) i dan 11 (B) identifikovan je pomoću Protein L postupka.

Slika 3. 1<∗>10<5>NT, CART-20.13, CART-20.14 i CAR-T20.16 ćelija (kultivisane na dan 6) kokultivisano je respektivno sa CD20-pozitivnim RAJI i RAMOS tumorskim ćelijskim linijama, i CD20-negativnom MOLT-4 tumorskom ćelijskom linijom u 200 µl GT-551 medijuma tokom 18 h u odnosu 1:1. Zatim su detektovani nivo ekspresije CD137 na površini membrane T ćelije (A) i nivo sekrecije IFNγ u supernatantu kokulture (B).

Slika 4 pokazuje detekciju nivoa apoptoze tumorskih ćelija indukovane od strane CART-20. 1<∗>10<4>CFSE-obeleženih CD20-negativnih (MOLT-4) ili CD20-pozitivnih (RAJI, RAMOS) tumorskih ćelijskih linija kokultivisano je respektivno sa NT, CART-20.13, CART-20.14 i CAR-T20.16 ćelijama (kultivisane na dan 11) u 200 µl GT-551 medijuma tokom 4 h u skladu sa odnosom kao što je pokazano na slici. Zatim su ćelijski peleti sakupljeni pomoću centrifugiranja. Ćelije su dva puta isprane sa PBS i bojene tokom 30 min sa Annexin V-APC bojom u odnosu 1:50 u 100 µl rastvora za bojenje. Posle ispiranja sa PBS 1 put, proporcija Annexin V pozitivnih ćelija u CFSE pozitivnim ćelijama analizirana je na protočnoj citometriji. Rezultati na slici pokazuju statističku analizu Annexin V pozitivnih ćelija u odgovarajućim uzorcima kokulture.

Slika 5 pokazuje identifikaciju sposobnosti aktivacije in vitro treće generacije himernog antigenskog receptora i himernog antigenskog receptora sa mutacijom u zglobnom regionu (koji su konstruisani na osnovu sekvence ofatumumaband antitela). Nivo ekspresije proteina kodiranog CAR genom (A) na površini membrane T ćelije u CAR-T20.14, CAR-T20.19 i CAR-T20.20 ćelijama kultivisanim na dan 7 identifikovan je pomoću Protein L postupka.1<∗>10<5>NT, CART-20.14, CART-20.19 i CAR-T20.20 ćelija (kultivisane na dan 7) kultivisano je respektivno sa K562, K562 stabilno transfektovanim ćelijama CD19 jednostruko pozitivnim, CD20 jednostruko pozitivnim, CD19 i CD20 dvostruko pozitivnim, i RAJI ciljnom ćelijom u 200 µl GT-551 medijuma tokom 18 h u odnosu 1:1. Zatim su detektovani nivo ekspresije CD137 na površini membrane T ćelije (B) i nivo sekrecije IFNγ u supernatantu kulture (C), respektivno. Slika 6 pokazuje rezultate detekcije sposobnosti CAR-T20 ćelija da počiste CD20-pozitivne ćelije in vivo. Rezultati ukazuju da CAR-T20.19 može efikasno inhibirati in vivo umnožavanje CD20-pozitivnih tumorskih ćelija.

Načini za sprovođenje predmetnog pronalaska

[0028] Posle opsežnih i intenzivnih studija, pronalazači su dobili himerni antigenski receptor koji ciljno deluje na CD20 i njegovu pripremu i primenu. Vanćelijski antigen-vezujući domen himernog antigenskog receptora uključuje varijabilni region teškog lanca antitela koji je pokazan u SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca antitela koji je pokazan u SEQ ID NO: 2. Eksperimentalni rezultati pokazuju da himerni antigenski receptor koji je obezbeđen predmetnim pronalaskom pokazuje izuzetno visoku sposobnost ubijanja prema tumorskim ćelijama.

[0029] Imajući u vidu razlike u afinitetu, mehanizmu ubijanja terapijskih antitela koja ciljno deluju na CD20, kao i značajne efekte različitih transmembranskih domena i unutarćelijskih domena na aktivnost himernih antigenskih receptora, konstruisana je serija himernih antigenskih receptora koji ciljno deluju na CD20 pomoću kombinovanja različitih transmembranskih i unutarćelijskih komponenata sa amino-kiselinskim sekvencama varijabilnih regiona u različitim anti-CD20 antitelima. Ekspresija takvih himernih antigenskih receptora u primarnim T ćelijama je završena. Ustanovljen je postupak detekcije intenziteta ekspresije receptora. Identifikovana je sposobnost CAR-T ćelija da prepoznaju CD20 antigen in vitro i in vivo, kao i razlika u aktivnosti čišćenja malignih tumora koji nose CD20 antigen in vitro i in vivo, što obezbeđuje nov efikasan postupak i pripremu za kliničku primenu CAR T u lečenju CD20 pozitivne leukemije i limfoma.

Himerni antigenski receptor

[0030] Pronalazak obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži vanćelijski domen, transmembranski domen, i unutarćelijski domen. Vanćelijski domen sadrži vezujući element specifičan za cilj (takođe poznat kao antigen-vezujući domen). Unutarćelijski domen uključuje kostimulatorni signalni region i funkcionalnu grupu ζ lanca. Kostimulatorni signalni region označava deo unutarćelijskog domena koji uključuje kostimulatorni molekul. Kostimulatorni molekul je molekul ćelijske površine potreban za efikasan odgovor limfocita na antigene, pre nego antigenski receptor ili njegov ligand.

[0031] Vanćelijski domen CAR obezbeđen pronalaskom sadrži antigen-vezujući domen koji ciljno deluje na CD20. Kada se CAR iz predmetnog pronalaska eksprimira u T ćeliji, prepoznavanje antigena se može izvesti na osnovu specifičnosti vezivanja antigena. Kada se veže za svoj srodni antigen, utiče na tumorsku ćeliju tako da tumorska ćelija ne uspeva da raste, podstiče je da umre, ili na neki drugi način utiče tako da se opterećenje tumorom kod pacijenta smanjuje ili eliminiše. Antigen-vezujući domen je poželjno fuzionisan sa unutarćelijskim domenom iz jednog ili više kostimulatornih molekula i ζ lanca. Poželjno, antigen-vezujući domen je fuzionisan sa unutarćelijskim domenom kombinacije 4-1BB signalnog domena i/ili CD28 signalnog domena, i CD3ζ signalnog domena.

[0032] U jednom primeru izvođenja, CAR koji ciljno deluje na CD20 iz pronalaska sadrži specifični signalni domen iz pronalaska (transmembranski region CD8, unutarćelijski signalni domeni CD137 i CD3ζ su napravljeni u seriji). Signalni domen iz pronalaska značajno povećava antitumorsku aktivnost i in vivo postojanost CAR-T ćelija u poređenju sa inače identičnim CAR koji ciljno deluje na CD20.

[0033] Amino-kiselinska sekvenca himernog antigenskog receptora (CAR) obezbeđena pronalaskom je kao što sledi:

CAR-T20.19 (SEQ ID NO: 5)

[0034] DNK sekvenca koja kodira CAR-T20.19 (SEQ ID NO: 6) je kao što sledi:

[0035] Druge CAR sekvence su ovde opisane, ali nisu deo predmetnog pronalaska:

CAR-T20.13 (amino-kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 29 i DNK sekvenca SEQ ID NO: 30)

CAR-T20.14 (amino-kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 1 i DNK sekvenca SEQ ID NO: 2):

CAR-T20.16 (amino-kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 3 i DNK sekvenca SEQ ID NO: 4)

CAR-T20.20 (amino-kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 31 i DNK sekvenca SEQ ID NO: 32)

Antigen-vezujući domen

[0036] CAR iz pronalaska sadrži ciljno-specifičan vezujući element koji se označava kao antigen-vezujući domen. Antigen-vezujući domen CAR iz pronalaska je specifičan vezujući element koji ciljno deluje na CD20.

[0037] Antigen-vezujući domen sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca anti-CD20 antitela.

Zglobni region i transmembranski region

[0038] Što se tiče zglobnog regiona i transmembranskog regiona (transmembranski domen), CAR može biti dizajniran tako da sadrži transmembranski domen fuzionisan za vanćelijski domen CAR. U jednom primeru izvođenja, upotrebljava se transmembranski domen koji je prirodno asociran sa jednim od domena u CAR. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domeni mogu biti odabrani ili modifikovani pomoću amino-kiselinskih supstitucija kako bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranski domen istih ili različitih proteina površine membrane, čime se minimalizuje interakcija sa drugim članovima receptorskih kompleksa.

[0039] U jednom aspektu, zglobni region sadrži sledeću amino-kiselinsku sekvencu (IgG4 zglob-CH2-CH3 zglobni region):

DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK 229 (SEQ ID NO: 17)

[0040] Njegova kodirajuća DNK sekvenca je kao što sledi:

1

ili, zglobni region sadrži sledeću amino-kiselinsku sekvencu (IgG4 zglob-CH2-CH3 (L235E, N297Q)):

[0041] Njegova kodirajuća DNK sekvenca je kao što sledi:

[0042] U jednom aspektu, amino-kiselinska sekvenca transmembranskog regiona poreklom iz CD8 (CD8TM) je kao što sledi:

IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYC 24 (SEQ ID NO: 21)

[0043] Njegova kodirajuća DNK sekvenca je kao što sledi:

[0044] U sledećem aspektu, amino-kiselinska sekvenca transmembranskog regiona poreklom iz CD28 (CD28TM) je kao što sledi:

FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV 27 (SEQ ID NO: 37);

DNK sekvenca koja kodira transmembranski region poreklom iz CD28 (CD28TM) je kao što sledi:

Unutarćelijski domen

[0045] Unutarćelijski domen u CAR koji je ovde opisan sadrži signalni domen 4-1BB i signalni domen CD3ζ.

[0046] Poželjno, unutarćelijski signalni domen 4-1BB sadrži sledeću amino-kiselinsku sekvencu:

KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL 42 (SEQ ID NO: 23)

[0047] Njegova kodirajuća DNK sekvenca je kao što sledi:

[0048] Poželjno, unutarćelijski signalni domen poreklom iz CD28 sadrži sledeću aminokiselinsku sekvencu:

RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S 41 (SEQ ID NO: 39)

[0049] Njegova kodirajuća DNK sekvenca je kao što sledi:

[0050] Poželjno, unutarćelijski signalni domen CD3ζ sadrži sledeću amino-kiselinsku sekvencu:

[0051] Njegova kodirajuća DNK sekvenca je kao što sledi:

Vektor

[0052] Pronalazak takođe obezbeđuje DNK konstrukt koji kodira CAR sekvence iz pronalaska.

[0053] Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju željene molekule mogu se dobiti upotrebom rekombinantnih postupaka koji su poznati u struci, kao što je, na primer, pregled biblioteka iz ćelija koje eksprimiraju gen, izvođenjem gena iz vektora za koji se zna da uključuje isti, ili pomoću izolovanja direktno iz ćelija i tkiva koja ih sadrže, upotrebom standardnih tehnika. Alternativno, gen od interesa se može proizvesti sintetički.

[0054] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektore u koje je insertovan DNK konstrukt iz predmetnog pronalaska. Vektori koji su poreklom iz retrovirusa kao što je lentivirus pogodni su alati za postizanje dugotrajnog transfera gena pošto omogućavaju dugotrajnu, stabilnu integraciju transgena i njegovu propagaciju u ćerkama ćelijama. Lentivirusni vektori imaju prednost u odnosu na vektore koji su poreklom iz onko-retrovirusa kao što su virusi murinske leukemije u tome što mogu da transdukuju neproliferišuće ćelije, kao što su hepatociti. Oni takođe imaju prednost niske imunogenosti.

[0055] Ukratko, ekspresija prirodnih ili sintetičkih nukleinskih kiselina koje kodiraju CAR se tipično postiže operativnim povezivanjem nukleinske kiseline koja kodira CAR polipeptid ili njegove delove sa promotorom, i inkorporisanjem konstrukta u ekspresioni vektor. Vektori mogu biti pogodni za replikaciju i integraciju kod eukariota. Tipični vektori za kloniranje sadrže terminatore transkripcije i translacije, inicijacijske sekvence, i promotore korisne za regulaciju ekspresije željene sekvence nukleinske kiseline.

[0056] Ekspresioni konstrukti iz predmetnog pronalaska se takođe mogu upotrebljavati za imunsku i gensku terapiju nukleinskom kiselinom, upotrebom standardnih protokola za

1

isporuku gena. Postupci za isporuku gena su poznati u struci. Videti, npr. S.A.D. patente br.

5,399,346, 5,580,859, 5,589,466. U sledećem primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje vektor genske terapije,

Nukleinska kiselina se može klonirati u više tipova vektora. Na primer, nukleinska kiselina se može klonirati u vektor uključujući, ali ne ograničavajući se na, plazmid, fagemid, derivat faga, životinjski virus, i kozmid. Vektori od posebnog interesa uključuju ekspresione vektore, vektore replikacije, vektore generisanja probe, i vektore sekvenciranja,

Dodatno, ekspresioni vektor se može obezbediti ćeliji u obliku virusnog vektora. Tehnologija virusnih vektora je dobro poznata u struci i opisana je, na primer, u Sambrook et al, (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), i u drugim priručnicima za virologiju i molekularnu biologiju. Virusi, koji su korisni kao vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, retroviruse, adenoviruse, adeno-asocirane viruse, herpes viruse, i lentiviruse. Generalno, pogodan vektor sadrži oridžin replikacije funkcionalan u najmanje jednom organizmu, sekvencu promotora, pogodna mesta restrikcione endonukleaze, i jedan ili više selektabilnih markera (npr. WO 01/96584; WO 01/29058; i S.A.D. pat. br.6,326,193).

[0057] Brojni sistemi zasnovani na virusima razvijeni su za transfer gena u ćelije sisara. Na primer, retrovirusi obezbeđuju pogodnu platformu za sisteme za isporuku gena. Odabrani gen može biti insertovan u vektor i upakovan u retrovirusne čestice upotrebom tehnika koje su poznate u struci. Rekombinantni virus se zatim može izolovati i isporučiti u ćelije subjekta bilo in vivo ili ex vivo. Brojni retrovirusni sistemi su poznati u struci. U nekim primerima izvođenja upotrebljavaju se adenovirusni vektori. Brojni adenovirusni vektori su poznati u struci. U jednom primeru izvođenja upotrebljavaju se lentivirusni vektori.

[0058] Dopunski promotorski elementi, npr. pojačivači, regulišu učestalost inicijacije transkripcije. Tipično, oni su locirani u regionu 30-110 bp uzvodno od početnog mesta, iako se nedavno pokazalo da brojni promotori sadrže funkcionalne elemente i nizvodno od početnog mesta. Razmak između promotorskih elemenata je često fleksibilan, tako da je funkcija promotora očuvana kada su elementi invertovani ili pomereni jedan u odnosu na drugi. U promotoru timidin kinaze (tk), razmak između promotorskih elemenata može se povećati na 50 bp pre nego što aktivnost počne da opada. U zavisnosti od promotora, čini se da pojedinačni elementi mogu funkcionisati bilo kooperativno ili nezavisno kako bi aktivirali transkripciju.

[0059] Jedan primer pogodnog promotora je neposredna rana promotorska sekvenca citomegalovirusa (CMV). Ova promotorska sekvenca je jaka konstitutivna promotorska sekvenca sposobna da pokrene visoke nivoe ekspresije bilo koje polinukleotidne sekvence koja je operativno povezana sa njom. Sledeći primer pogodnog promotora je Elongation Growth Factor-1α (EF-1α). Međutim, mogu se upotrebljavati i druge konstitutivne promotorske sekvence, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rani promotor simian virusa 40 (SV40), virusa tumora dojke miša (MMTV), promotor dugog terminalnog ponovka (LTR) virusa humane imunodeficijencije (HIV), MoMuLV promotor, promotor virusa ptičje leukemije, neposredni rani promotor Epštajn-Bar (Epstein-Barr) virusa, promotor virusa Rausovog (Rous) sarkoma, kao i promotori humanih gena kao što su, ali ne ograničavajući se na, promotor aktina, promotor miozina, promotor hemoglobina, i promotor kreatin kinaze. Dodatno, pronalazak ne treba da bude ograničen na upotrebu konstitutivnih promotora, inducibilni promotori se takođe razmatraju kao deo pronalaska. Upotreba inducibilnog promotora obezbeđuje molekulski prekidač sposoban da uključi ekspresiju polinukleotidne sekvence sa kojom je on operativno povezan kada je takva ekspresija poželjna, ili da isključi ekspresiju kada ekspresija nije poželjna. Primeri inducibilnih promotora uključuju, ali nisu ograničeni na promotor metalotioneina, promotor glukokortikoida, promotor progesterona, i promotor tetraciklina.

[0060] Kako bi se procenila ekspresija CAR polipeptida ili njegovih delova, ekspresioni vektor koji treba da se introdukuje u ćeliju takođe može sadržati bilo selektabilni markerski gen ili reporterski gen ili oba kako bi se olakšala identifikacija i selekcija eksprimirajućih ćelija iz populacije ćelija koje će biti transfektovane ili inficirane posredstvom virusnih vektora. U drugim aspektima, selektabilni marker se može nositi na odvojenom delu DNK i koristi u proceduri kotransfekcije. I selektabilni markeri i reporterski geni mogu biti omeđeni odgovarajućim regulatornim sekvencama kako bi se omogućila ekspresija u ćelijama domaćina. Korisni selektabilni markeri uključuju, na primer, gene rezistencije na antibiotike, kao što su neo i slično.

[0061] Reporterski geni se upotrebljavaju za identifikaciju potencijalno transfektovanih ćelija i za procenivanje funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Generalno, reporterski gen je gen koji nije prisutan u ili se ne eksprimira u organizmu ili tkivu primaoca i koji kodira polipeptid čija se ekspresija manifestuje nekim lako detektabilnim svojstvom, npr. enzimskom aktivnošću. Ekspresija reporterskog gena se testira u pogodno vreme pošto je DNK introdukovana u ćelije primaoca. Pogodni reporterski geni mogu uključivati gene koji

1

kodiraju luciferazu, beta-galaktozidazu, hloramfenikol acetil transferazu, sekretovanu alkalnu fosfatazu, ili gen za zeleni fluorescentni protein (npr. Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Pogodni ekspresioni sistemi su dobro poznati i mogu se pripremiti upotrebom poznatih tehnika ili dobiti komercijalno. Generalno, konstrukt sa minimalnim 5' bočnim regionom koji pokazuje najviši nivo ekspresije reporterskog gena identifikuje se kao promotor. Takvi regioni promotora mogu biti povezani sa reporterskim genom i korišćeni za procenu agenasa za sposobnost da modulišu promotorom vođenu transkripciju.

[0062] Postupci introdukovanja i ekspresije gena u ćeliji su poznati u struci. U kontekstu ekspresionog vektora, vektor se može lako introdukovati u ćeliju domaćina, npr. ćeliju sisara, bakterije, kvasca, ili insekta, bilo kojim postupkom u struci. Na primer, ekspresioni vektor se može preneti u ćeliju domaćina fizičkim, hemijskim, ili biološkim načinima.

[0063] Fizički postupci za introdukovanje polinukleotida u ćeliju domaćina uključuju precipitaciju sa kalcijum fosfatom, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjekciju, elektroporaciju, i slično. Postupci za proizvodnju ćelija koje sadrže vektore i/ili egzogene nukleinske kiseline su dobro poznati u struci. Videti, na primer, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Poželjan postupak za introdukovanje polinukleotida u ćeliju domaćina je transfekcija pomoću kalcijum fosfata.

[0064] Biološki postupci za introdukovanje polinukleotida od interesa u ćeliju domaćina uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori, i naročito retrovirusni vektori, postali su najčešće korišćeni postupak za insertovanje gena u ćelije sisara, npr. humane ćelije. Drugi virusni vektori mogu biti poreklom iz lentivirusa, poksvirusa, herpes simplex virusa I, adenovirusa i adeno-asociranih virusa, i slično. Videti, na primer, S.A.D. patente br.

5,350,674 i 5,585,362.

[0065] Hemijski načini za introdukovanje polinukleotida u ćeliju domaćina uključuju sisteme koloidne disperzije, kao što su kompleksi makromolekula, nanokapsule, mikrosfere, perle, i sisteme na bazi lipida, uključujući ulje u vodi emulzije, micele, mešovite micele, i lipozome. Primer koloidnog sistema za upotrebu kao vehikuluma za isporuku in vitro i in vivo je lipozom (npr. vezikula sa veštačkom membranom).

[0066] U slučaju kada se koristi nevirusni sistem isporuke, primer vehikuluma za isporuku je lipozom. Upotreba lipidnih formulacija se razmatra za introdukciju nukleinskih kiselina u ćeliju domaćina (in vitro, ex vivo ili in vivo). U sledećem aspektu, nukleinska kiselina može biti asocirana sa lipidom. Nukleinska kiselina asocirana sa lipidom može biti inkapsulirana u vodenoj unutrašnjosti lipozoma, isprepletena unutar lipidnog dvosloja lipozoma, prikačena za

1

lipozom putem vezujućeg molekula koji je asociran i sa lipozomom i sa oligonukleotidom, zarobljena u lipozomu, u kompleksu sa lipozomom, dispergovana u rastvoru koji sadrži lipid, pomešana sa lipidom, kombinovana sa lipidom, sadržana kao suspenzija u lipidu, sadržana ili u kompleksu sa micelom, ili na drugi način asocirana sa lipidom. Kompozicije asocirane sa lipidom, lipidom/DNK ili lipidom/ekspresionim vektorom nisu ograničene ni na jednu određenu strukturu u rastvoru. Na primer, one mogu biti prisutne u dvoslojnoj strukturi, kao micele, ili sa "kolabiranom" strukturom. One takođe mogu jednostavno biti umešane u rastvor, eventualno formirajući agregate koji nisu ujednačeni po veličini ili obliku. Lipidi su masne supstance koje mogu biti lipidi koji se javljaju u prirodi ili sintetički lipidi. Na primer, lipidi uključuju masne kapljice koje se javljaju u prirodi u citoplazmi, kao i klasu jedinjenja koja sadrže alifatične ugljovodonike dugog lanca i njihove derivate, kao što su masne kiseline, alkoholi, amini, amino alkoholi, i aldehidi.

[0067] U slučaju gde se koristi nevirusni sistem za isporuku, tehnika uređivanja genoma je primerno korišćena da se dovrši pronalazak, na primer CRISPR-Cas9, ZFN ili TALEN.

[0068] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, vektor je lentivirusni vektor.

[0069] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, DNK konstrukt dodatno sadrži sekvencu koja kodira signalni peptid. Poželjno, sekvenca signalnog peptida je vezana uzvodno od sekvence nukleinske kiseline antigen-vezujućeg domena. Poželjno, signalni peptid je humani CD8a signalni peptid.

[0070] Poželjno, amino-kiselinska sekvenca signalnog peptida je kao što sledi:

Amino-kiselinska sekvenca lider sekvence CD8 je:

MALPVTALLL PLALLLHAAR P 21 (SEQ ID NO: 27)

[0071] DNK sekvenca koja kodira CD8 lider sekvencu je:

Terapijska primena

[0072] Ovaj pronalazak obuhvata ćeliju (npr. T ćeliju) transdukovanu sa lentivirusnim vektorom (LV) koji kodira CAR iz pronalaska. Transdukovana T ćelija može izazvati CAR-posredovan T-ćelijski odgovor.

[0073] Stoga, takođe je opisan postupak za stimulisanje T ćelijski-posredovanog imunskog odgovora na ciljnoj ćelijskoj populaciji ili tkivu kod sisara koji sadrži korak primene sisaru T

1

ćelije koja eksprimira CAR iz pronalaska.

[0074] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak uključuje tip ćelijske terapije gde su T ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju CAR iz pronalaska i CAR-T ćelija se primenjuje infuzijom primaocu kome je to potrebno. Ćelija primenjena infuzijom je u stanju da ubije ćelije tumora u primaocu. Za razliku od terapija antitelima, CAR-T ćelije su u stanju da se repliciraju in vivo što rezultuje dugotrajnim opstankom koji može dovesti do neprekidne kontrole tumora.

[0075] U jednom primeru izvođenja, CAR-T ćelije iz pronalaska mogu da se podvrgnu robustnom in vivo umnožavanju T ćelija i mogu da opstanu tokom dužeg vremena. Pored toga, CAR-posredovan imunski odgovor može biti deo adoptivnog imunoterapijskog pristupa u kome CAR-modifikovane T ćelije indukuju imunski odgovor specifičan za antigenvezujuću funkcionalnu grupu u CAR. Na primer, anti-CD20 CAR-T ćelija izaziva imunski odgovor specifično prema ćelijama koje eksprimiraju CD20.

[0076] Adaptacijske bolesti koje se mogu lečiti uključuju CD20 pozitivne tumore. CD20 pozitivni tumori mogu uključivati CD20 pozitivne ne-čvrste tumore (kao što su hematološki tumori, na primer, leukemije i limfomi) ili čvrste tumore. Tipovi tumora ili kancera koji se leče sa CAR iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, blastom, i sarkom, i određene leukemije ili limfoidne malignitete, benigne i maligne tumore, i malignitete npr. sarkome, karcinome, i melanome. Tumori/kanceri odraslih i pedijatrijski tumori/kanceri su takođe uključeni.

[0077] Hematološki kanceri su kanceri krvi ili kostne srži. Primeri hematoloških (ili hematogenih) kancera uključuju leukemije, uključujući akutne leukemije (kao što je akutna limfocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija i mijeloblasti, promijelocitna, mijelomonocitna, monocitna i eritroleukemija), hronične leukemije (kao što je hronična mijelocitna (granulocitna) leukemija, hronična mijelogena leukemija, i hronična limfocitna leukemija), policitemija vera, limfom, Hočkinovu (Hodgkin's) bolest, ne-Hočkinov limfom (indolentni i visokostepeni oblici), multipli mijelom, Valdenstromovu (Waldenstrom's) makroglobulinemiju, bolest teškog lanca, mijelodisplastični sindrom, leukemiju dlakastih ćelija i mijelodisplaziju.

[0078] Čvrsti tumori su abnormalne mase tkiva koje uobičajeno ne sadrže ciste ili tečna područja. Čvrsti tumori mogu biti benigni ili maligni. Različiti tipovi čvrstih tumora su imenovani prema tipu ćelija koje ih formiraju (kao što su sarkomi, karcinomi, i limfomi). Primeri čvrstih tumora, kao što su sarkomi i karcinomi, uključuju fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, mezoteliom, maligni limfom, kancer pankreasa i kancer jajnika.

1

[0079] CAR-modifikovane T ćelije iz pronalaska mogu takođe da služe kao tip vakcine za ex vivo imunizaciju i/ili in vivo terapiju kod sisara. Poželjno, sisar je čovek.

[0080] Što se tiče ex vivo imunizacije, najmanje jedno od sledećeg se dešava in vitro pre primene ćelije sisaru: i) umnožavanje ćelija, ii) introdukovanje nukleinske kiseline koja kodira CAR u ćelije, i/ili iii) krioprezervacija ćelija.

[0081] Ex vivo procedure su dobro poznate u struci i o njima se detaljnije diskutuje u nastavku. Ukratko, ćelije su izolovane iz sisara (poželjno čoveka) i genetički modifikovane (tj. transdukovane ili transfektovane in vitro) sa vektorom koji eksprimira CAR koji je ovde objavljen. CAR-modifikovana ćelija može da se primeni primaocu sisaru kako bi se obezbedila terapijska korist. Primalac sisar može biti čovek i CAR-modifikovana ćelija može biti autologna u odnosu na primaoca. Alternativno, ćelije mogu biti alogene, singene ili ksenogene u odnosu na primaoca.

[0082] Pored upotrebe vakcine zasnovane na ćelijama u smislu ex vivo imunizacije, predmetna objava takođe obezbeđuje kompozicije i postupke za in vivo imunizaciju kako bi se izazvao imunski odgovor usmeren prema antigenu kod pacijenta.

[0083] Generalno, ćelije aktivirane i umnožene kao što je ovde opisano mogu se koristiti u lečenju i prevenciji bolesti koje nastaju kod osoba koje su imunokompromitovane. Posebno, CAR-modifikovane T ćelije iz pronalaska se upotrebljavaju u lečenju CCL. U određenim primerima izvođenja, ćelije iz pronalaska se upotrebljavaju u lečenju pacijenata sa rizikom od razvoja CCL. Stoga, ovde je opisana upotreba za lečenje ili prevenciju CCL koja sadrži primenu subjektu kome je to potrebno, terapijski efikasne količine CAR-modifikovanih T ćelija iz pronalaska.

[0084] CAR-modifikovane T ćelije iz predmetnog pronalaska mogu se primeniti bilo same, ili kao farmaceutska kompozicija u kombinaciji sa razblaživačima i/ili sa drugim komponentama kao što su IL-2, IL-17 ili drugi citokini ili ćelijske populacije. Ukratko, farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu sadržati ciljnu ćelijsku populaciju kao što je ovde opisano, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski ili fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa. Takve kompozicije mogu sadržati pufere kao što su neutralni puferisani fiziološki rastvor, fosfatom puferisani fiziološki rastvor i slično; ugljene hidrate kao što su glukoza, manoza, saharoza ili dekstrani, manitol; proteine; polipeptide ili aminokiseline kao što je glicin; antioksidanse; helatne agense kao što su EDTA ili glutation; adjuvanse (npr. aluminijum hidroksid); i konzervanse. Kompozicije iz predmetnog pronalaska su poželjno formulisane za intravensku primenu.

[0085] Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu se primeniti na način

1

pogodan bolesti koja se leči (ili prevenira). Količinu i učestalost primene odrediće faktori kao što su stanje pacijenta, tip i ozbiljnost pacijentove bolesti, mada se odgovarajuće doze mogu odrediti kliničkim ispitivanjima.

[0086] Kada je naznačena "imunološki efikasna količina", "antitumorski efikasna količina", "efikasna količina za inhibiciju tumora", ili "terapijska količina", preciznu količinu kompozicije iz predmetnog pronalaska koju treba primeniti može odrediti lekar uzimajući u obzir individualne razlike u starosti, težini, veličini tumora, stepenu infekcije ili metastaze, i stanju pacijenta (subjekta). Generalno se može reći da se farmaceutska kompozicija koja sadrži ovde opisane T ćelije može primeniti pri dozi od 10<4>do 10<9>ćelija/kg telesne težine, poželjno 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne težine, uključujući sve vrednosti celog broja unutar ovih opsega. Kompozicije T ćelija se takođe mogu primeniti više puta pri ovim dozama. Ćelije se mogu primeniti upotrebom tehnika infuzije koje su opšte poznate u imunoterapiji (videti, npr. Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319: 1676, 1988). Optimalno doziranje i režim lečenja za određenog pacijenta može lako da odredi onaj sa iskustvom u medicinskoj struci praćenjem pacijenta za znake bolesti i prilagođavanjem lečenja u skladu sa tim.

[0087] Primena predmetnih kompozicija može se izvršiti na bilo koji pogodan način, uključujući inhalaciju aerosola, injekciju, gutanje, transfuziju, implantaciju ili transplantaciju. Kompozicije koje su ovde opisane mogu se primeniti pacijentu subkutano, intradermalno, intratumoralno, intranodalno, intramedularno, intramuskularno, pomoću intravenske (i.v.) injekcije, ili intraperitonealno. U jednom primeru izvođenja, kompozicije T ćelija iz predmetnog pronalaska primenjuju se pacijentu pomoću intradermalne ili subkutane injekcije. U sledećem primeru izvođenja, kompozicije T ćelija iz predmetnog pronalaska poželjno se primenjuju pomoću i.v. injekcije. Kompozicije T ćelija mogu se injektirati direktno u tumor, limfni čvor, ili mesto infekcije.

[0088] U određenim aspektima, ćelije aktivirane i umnožene upotrebom postupaka koji su ovde opisani, ili drugih postupaka koji su poznati u struci gde se T ćelije umnožavaju do terapijskih nivoa, treba da se primene pacijentu zajedno sa (npr. pre, istovremeno ili nakon) bilo kojim brojem relevantnih modaliteta lečenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na lečenje agensima kao što su lečenje antivirusnom terapijom, cidofovirom i interleukinom-2, citarabinom (takođe poznat kao ARA-C) ili natalizumabom za pacijente sa MS ili lečenje efalizumabom za pacijente sa psorijazom ili drugim lečenjima za PML pacijente. U dodatnim primerima izvođenja, T ćelije iz pronalaska mogu da se upotrebljavaju u kombinaciji sa hemioterapijom, zračenjem, imunosupresivnim agensima, kao što su ciklosporin, azatioprin, metotreksat, mikofenolat, i FK506, antitelima, ili drugim imunoterapijskim agensima. U

2

dodatnom primeru izvođenja, ćelijske kompozicije iz predmetnog pronalaska primenjuju se pacijentu zajedno sa (npr. pre, istovremeno ili nakon) transplantacije kostne srži, ili upotrebom hemioterapijskih agenasa kao što je fludarabin, terapija zračenjem eksternim zrakom (XRT), ciklofosfamid. Na primer, u jednom primeru izvođenja, subjekti mogu biti podvrgnuti standardnom lečenju sa visokim dozama hemioterapije praćeno transplantacijom matičnih ćelija periferne krvi. U određenim primerima izvođenja, nakon transplantacije, subjekti primaju infuziju umnoženih imunskih ćelija iz predmetnog pronalaska. U dopunskom primeru izvođenja, umnožene ćelije se primenjuju pre ili nakon operacije.

[0089] Doziranje prethodno navedenih lečenja koje treba primeniti pacijentu variraće u zavisnosti od precizne prirode stanja koje se leči i primaoca lečenja. Skaliranje doza za primenu kod ljudi može se izvršiti u skladu sa praksama koje su prihvaćene u struci. Generalno, 1×10<6>do 1×10<10>modifikovanih T ćelija iz pronalaska (npr. CAR-T 20 ćelije) se može primeniti pacijentima pomoću, na primer, intravenske infuzije svakog lečenja ili svakog ciklusa lečenja.

Prednosti predmetnog pronalaska uključuju:

[0090]

(1) Što se tiče himernog antigenskog receptora iz predmetnog pronalaska, njegov vanćelijski antigen-vezujući domen je specifičan anti-CD20 scFv. CAR formiran vezivanjem specifičnog anti-CD20 scFv za specifičan zglobni region i unutarćelijski domen pokazuje veliku sposobnost ubijanja tumorskih ćelija sa niskom citotoksičnošću i niskim sporednim efektima.

(2) Himerni antigenski receptor obezbeđen pronalaskom može postići stabilnu ekspresiju i membransku lokalizaciju CAR proteina pošto su T ćelije inficirane lentivirusom koji nosi CAR gen.

(3) CAR-modifikovana T ćelija iz predmetnog pronalaska ima duže vreme preživljavanja in vivo i jaku antitumorsku efikasnost. Optimizovani CAR sa IgG4 zglob-CH2-CH3 linker regionom može izbeći vezivanje Fc receptora i naknadni ADCC efekat (citotoksičnost zavisna od antitela).

Primer 1 Konstrukcija lentivirusnog ekspresionog vektora

[0091] Sinteza DNK pune dužine i klonirajuća konstrukcija kodirajućih plazmida naručene su od Shanghai Boyi Biotechnology Co., Ltd. U svakom plazmidu upotrebljene su različite anti-CD20 scFv kodirajuće sekvence. Klonirajući vektor je odabran kao pWPT lentivirusni vektor. Klonirajuća mesta bila su BamH I i Sal I mesta. Specifična struktura sekvence je pokazana na Slici 1. Amino-kiselinske i nukleotidne sekvence svakog elementa su kao što je prethodno opisano.

[0092] U sledećim primerima, CAR-T20.13, CAR-T20.14, CAR-T20.16, CAR-T20.19, CAR-T20.20 sa boljim efektima su uzeti kao primeri.

Primer 2 Priprema CAR-T ćelije

[0093]

(1) Posle uzimanja venske krvi od zdravih ljudi, mononukleusne ćelije (PBMC) su izolovane centrifugiranjem u gradijentu gustine.

(2) Na dan 0, PBMC su kultivisane u GT-T551 medijumu za kulturu ćelija koji sadrži 2% humani albumin, i krajnja koncentracija ćelija je podešena na 2×10<6>ćelija/ml. Ćelije su zasejane u flask za ćelijsku kulturu prethodno obložen sa retronektinom (kupljen od TAKARA) pri krajnjoj koncentraciji od 10 µg/ml i CD3 monoklonalnim antitelom (OKT3) pri krajnjoj koncentraciji od 5 µg/ml. Rekombinantni humani interleukin 2 (IL-2) je dodat u medijum za kulturu pri krajnjoj koncentraciji od 1000 U/ml. Ćelije su kultivisane u inkubatoru sa zasićenom vlažnošću i 5% CO2na 37 °C.

(3) Na dan 2, dodati su svež medijum, koncentrovani i prečišćeni rastvor CAR20 lentivirusa, protamin sulfat (12 µg/ml), i IL-2 (pri krajnjoj koncentraciji od 1000 U/ml). Posle 12 sati infekcije u inkubatoru sa 5% CO2na 37 °C, medijum za kulturu je odbačen, dodat je svež medijum, i kultivacija je nastavljena u inkubatoru sa 5% CO2na 37 °C.

(4) Počevši od dana 6, CART20 ćelije se mogu uzimati za odgovarajući test aktivnosti.

[0094] U predmetnom pronalasku, postupak pripreme CAR-modifikovanih T ćelija koje ciljno deluju na CD20 antigen je poboljšan, i GT-551 medijum bez seruma suplementovan sa 2% humanim albuminom je odabran za kultivaciju limfocita in vitro.

Primer 3 Detekcija stope integracije CAR gena u genom T ćelije i nivo ekspresije njegovog kodiranog proteina na površini membrane

[0095] Uzeto je 0,5×10<6>uzoraka CART-20 ćelija kultivisanih na dan 7 (Sl.2A i Sl.5A) i dan 11 (Sl.2B) u Primeru 2, respektivno. Nivo ekspresije CAR20 proteina na površini membrane T ćelije analiziran je pomoću protočne citometrije posle bojenja Proteinom L. Rezultati su pokazali da, osim CAR-T20.13, sve CAR strukture dizajnirane u ovoj studiji mogu detektovati lokalizaciju himernog antigenskog receptora na površini ćelijske membrane odgovarajućih modifikovanih T ćelija upotrebom Proteina L.

Primer 4 Detekcija in vitro sposobnosti aktivacije CAR-T20

[0096] deCAR-T20 ćelije kultivisane na dan 6 u Primeru 2 su kokultivisane sa ciljnim ćelijama. Zatim su ispitani povišeni nivo CD137 i nivo sekrecije IFNγ u supernatantu kulture.

1×10<5>CART-20 ćelija (kultivisane na dan 6) su kultivisane respektivno sa CD20-pozitivnim RAJI i RAMOS tumorskim ćelijskim linijama, i CD20-negativnom MOLT-4 tumorskom ćelijskom linijom, ili bez tumorskih ćelija, u 200 µl GT-551 medijuma tokom 18 h u odnosu 1:1. Zatim je nivo ekspresije CD137 na površini membrane T ćelije detektovan pomoću protočne citometrije (Sl. 3A), i nivo sekrecije IFNγ u supernatantu kulture detektovan je pomoću ELISA testa (Sl.3B).

[0097] Iz rezultata na Slici 3, mogli bismo zaključiti da je CAR zasnovan na obinutuzumabu takođe postigao ekspresiju i lokalizaciju na površini membrane u odgovarajućim modifikovanim ćelijama, ali je CAR struktura zasnovana na sekvenci ofatumumaba pokazala bolju sposobnost aktivacije in vitro i specifičnost ciljnog delovanja na antigen u poređenju sa CAR konstruisanim na osnovu obinutuzumaba i rituksimaba.

Primer 5 Detekcija CAR-T20 ćelija indukovala je aktivnost rane apoptoze tumorskih ćelija

[0098] CART-20.13, CART-20.14 i CAR-T20.16 ćelije (kultivisane na dan 11) iz Primera 2 kokultivisane su respektivno sa 1×10<4>CFSE-obeleženim CD20-negativnim (MOLT-4) ili CD20-pozitivnim (RAJI, RAMOS) tumorskim ćelijskim linijama u 200 µl GT-551 medijuma tokom 4 h. Zatim je ćelijski pelet sakupljen pomoću centrifugiranja. Ćelije su dva puta isprane sa PBS i bojene tokom 30 min bojom Annexin V-APC u odnosu 1:50 u 100 µl rastvora za bojenje. Posle ispiranja sa PBS jedanput, proporcija Annexin V pozitivnih ćelija u CFSE

2

pozitivnim ćelijama analizirana je na protočnoj citometriji.

[0099] Rezultati na Slici 4 pokazuju da CAR struktura zasnovana na sekvenci ofatumumaba pokazuje bolju sposobnost indukcije rane apoptoze CD20 ciljnih ćelija in vitro u poređenju sa CAR konstruisanim na osnovu obinutuzumaba i rituksimaba.

Primer 6 Identifikacija in vitro sposobnosti aktivacije treće generacije himernog antigenskog receptora i himernog antigenskog receptora sa mutacijom u zglobnom regionu

[0100]

(1) Pod uslovom da je stopa transfekcije bila u osnovi jednaka (Sl.5A), CAR-T20 ćelije (pripremljene pomoću postupka iz Primera 2) kultivisane na dan 7 kultivisane su respektivno sa K562, K562 stabilno transfektovanim ćelijama CD19 jednostruko pozitivnim, CD20 jednostruko pozitivnim, CD19 i CD20 dvostruko pozitivnim, i RAJI ciljnom ćelijom (svake uzeto 1×10<5>ćelija) u 200 µl GT-551 medijuma tokom 18 h u odnosu 1:1. Zatim su detektovani povišeni nivo CD137 (Sl. 5B) i nivo sekrecije IFNγ u supernatantu kulture (Sl.5C).

(2) Rezultati pokazani na Slici 5 ukazuju da je in vitro sposobnost aktivacije (CD137 i IFNg) himernih antigenskih receptora CAR-T20.14 i CAR-T20.19 (koji imaju mutaciju u zglobnom regionu) suštinski ekvivalentna, u slučaju suštinski identične efikasnosti infekcije. CAR struktura treće generacije CAR-T20.20 pokazuje bolji in vitro kapacitet aktivacije (CD137 i IFNγ) od druge generacije CAR-T20.14 i CAR-T20.19.

Primer 7 Detekcija sposobnosti CAR-T20 ćelija da počiste CD20 pozitivne ćelije in vivo

[0101]

(1) Raji-Luc ćelije koje eksprimiraju luciferazu injektirane su u NCG miševe (5×10<5>/mišu) kroz repnu venu. Nedelju dana posle inokulacije, in vivo umnožavanje tumorskih ćelija uočeno je pomoću in vivo snimanja i zabeleženo kao dan 0. NT i CAR-T20.19 ćelije injektirane su u miševe na dan 0 (5×10<6>/mišu) kroz repnu venu. Na dan 0, dan 7, dan 14, dan 21, umnožavanje tumorskih ćelija kod miševa uočeno je pomoću in vivo snimanja i analizirano na osnovu promena u intenzitetu fluorescencije i promena telesne težine miševa.

(2) Rezultati pokazani na Slici 6 ukazuju da CAR-T20.19 može efikasno inhibirati in vivo umnožavanje CD20-pozitivnih tumorskih ćelija.

2

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Himerni antigenski receptor (CAR), naznačen time što CAR ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5.

2. Molekul nukleinske kiseline naznačen time što kodira himerni antigenski receptor (CAR) prema patentnom zahtevu 1.

3. Vektor naznačen time što sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2.

4. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži vektor prema patentnom zahtevu 3 ili koja ima molekul egzogene nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2 integrisan u svom genomu.

5. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, i himerni antigenski receptor prema patentnom zahtevu 1, molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2, vektor prema patentnom zahtevu 3 ili ćeliju prema patentnom zahtevu 4.

6. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 5, za upotrebu u lečenju tumora.

7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačena time što je tumor CD20 pozitivna leukemija ili limfom.

8. In vitro postupak za pripremu CAR-T ćelije (CAR-modifikovane T ćelije) koja eksprimira himerni antigenski receptor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sadrži korak: transdukcije molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2 ili vektora prema patentnom zahtevu 3 u T ćeliju, čime se dobija CAR-T ćelija.

2