RS64135B1 - Aza-heterobicklični inhibitori mat2a i metode upotrebe za lečenje raka - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

[0001] Metionin adenoziltransferaza (MAT), koja je takođe poznata i kao S-adenozilmetionin sintetaza, je ćelijski enzim koji katališe sintezu S-adenozil metionina (SAM ili AdoMet) iz metionina i ATP; kataliza se smatra korakom koji ograničava brzinu ciklusa metionina. SAM je propilamino donor u biosintezi poliamina, glavni donator metila za metilaciju DNK, i uključen je u transkripciju gena i ćelijsku proliferaciju kao i u proizvodnju sekundarnih metabolita.

[0002] Dva gena označena kao MAT1A i MAT2A kodiraju dve različite katalitičke MAT izoforme, respektivno. Treći gen, MAT2B, kodira MAT2A regulatornu podjedinicu. MAT1A je specifično izražen u jetri odrasle osobe, dok je MAT2A široko rasprostranjen. Pošto se MAT izoforme razlikuju po katalitičkoj kinetici i regulatornim svojstvima, ćelije koje eksprimiraju MAT1A imaju značajno više nivoe SAM u odnosu na ćelije koje eksprimiraju MAT2A. Utvrđeno je da hipometilacija promotora MAT2A i acetilacija histona izazivaju pojačanu regulaciju ekspresije MAT2A. Videti, na primer, M. Vázquez-Chantada et al., Gastroenterology 138 (2010) 1943-53; M. Frau et al., J. Hepatol. 59 (2013) 830-41; M. Frau et al., Hepatology 56 (2012) 165-75; and R. M. Pascale et al., Transl. Gastroenterol. Hepatol.3 (2018) 36.

[0003] Kod hepatocelularnog karcinoma (HCC), dolazi do smanjenja regulacije MAT1A i povećanja regulacije MAT2A, što je poznato kao MAT1A:MAT2A prebacivanje. Prebacivanje, uz pojačanu regulaciju MAT2B, dovodi do nižih sadržaja SAM, što daje prednost u rastu ćelija hepatoma. Iz razloga što MAT2A ima ključnu ulogu u olakšavanju rasta ćelija hepatoma, zbog toga je meta antineoplastične terapije. Skorašnja istraživanja su pokazala da utišavanje korišćenjem male interferirajuće RNK značajno suzbija rast i indukuje apoptozu u ćelijama hepatoma. Videti, na primer, T. Li et al., J. Cancer 7(10) (2016) 1317-1327.

[0004] Neke ćelijske linije karcinoma koje su deficijentne sa MTAP, su naročito senzitivne na inhibiciju MAT2A. Marjon et al. (Cell Reports 15(3) (2016) 574-587). MTAP (metiltioadenozin fosforilaza) je enzim široko izražen u normalnim tkivima koji katalizuje konverziju metiltioadenozina (MTA) u adenin i 5-metiltioriboz-1-fosfat. Adenin se spašava kako bi se generisao adenozin monofosfat, a 5-metiltioriboz-1-fosfat je konvertovan u metionin i format. Zbog ove putanje spasavanja, MTA može služiti kao alternativni izvor purina kada je de novo sinteza purina blokirana, na primer, antimetabolitima, kao što je L-alanozin.

[0005] MAT2A je disregulisan kod dodatnih karcinoma kojima nedostaje delecija MTAP, uključujući hepatocelularni karcinom i leukemiju. J. Cai et al., Cancer Res. 58 (1998) 1444-1450; T. S. Jani et al., Cell. Res. 19 (2009) 358-369. Utišavanje ekspresije MAT2A preko RNK interferencije dovodi do anti-proliferativnih efekata u nekoliko modela raka. H. Chen et al., Gastroenterology 133 (2007) 207-218; Q. Liu et al. Hepatol. Res.37 (2007) 376-388.

[0006] Mnogim ljudskim i mišjim malignim ćelijama nedostaje MTAP aktivnost. Nedostatak MTAP je otkriven ne samo u ćelijskoj kulturi tkiva već je prisutan i kod primarnih leukemija, glioma, melanoma, karcinoma pankreasa, nesitnoćelijskih karcinoma pluća (NSCLC), karcinoma bešike, astrocitoma, osteosarkoma, karcinoma glave i vrata, miksoidnih hondrosarkoma, karcinoma jajnika, karcinoma endometrijuma, karcinoma dojke, sarkoma mekih tkiva, ne-Hodžkinovog limfoma i mezotelioma. Gen koji kodira za ljudski MTAP se mapira u region 9p21 na ljudskom hromozomu 9p. Ovaj region takođe sadrži gene supresora tumora p16INK4A (takođe poznat kao CDKN2A) i pl5INK4B. Ovi geni kodiraju za p16 i p15, koji su inhibitori ciklinskih D-zavisnih kinaza cdk4 i cdk6, respektivno.

[0007] Transkript p16INK4A može alternativno biti alternativni okvir očitavanja (ARF) spojen u transkript koji kodira pl4ARF. pl4ARF se vezuje za MDM2 i sprečava degradaciju p53 (Pomerantz et al. (1998) Cell 92:713-723). Hromozomski region 9p21 je od interesa jer se često homozigotno briše kod različitih karcinoma, uključujući leukemije,NSLC, karcinome pankreasa, gliome, melanome i mezoteliom. Delecije često inaktiviraju više od jednog gena. Na primer, Caims et al. ((1995) Nat. Gen.11:210-212) su izvestili da su nakon proučavanja više od 500 primarnih tumora, gotovo sve delecije identifikovane kod takvih tumora uključivale 170 kb region koji sadrži MTAP, pl4ARF i P16INK4A. Carson et al. (WO 99/67634) navode da postoji korelacija između stadijuma razvoja tumora i gubitka homozigotnosti gena koji kodira MTAP i gena koji kodira p16. Na primer, delecija MTAP gena, ali ne p16INK4A, je prijavljena kao indikacija raka u ranoj fazi razvoja, dok je delecija gena koji kodiraju za p16 i MTAP prijavljena kao indikacija raka u naprednijoj fazi razvoja tumora. Kod nekih pacijenata sa osteosarkomom, MTAP gen je bio prisutan pri postavljanju dijagnoze ali je kasnije obrisan (Garcia-Castellano et al., Clin. Cancer Res.8(3) 2002782-787).

REZIME

[0008] Predmetno otkriće pruža jedinjenja koja inhibiraju MAT2A. Jedinjenja i njihove farmaceutske kompozicije su korisna u metodama za tretiranje različitih karcinoma, uključujući one koji su refraktorni na uobičajene tretmane, kao što je hirurgija, terapija zračenjem, hemoterapija i hormonska terapija.

[0009] Stoga, u skladu sa nekim izvedbama, predmetno otkriće pruža jedinjenje prema formuli I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, tautomer i/ili izotopolog:

[0010] U Formuli I, L je O, S, NR ili veza. R je H ili C1-C6-alkil.

[0011] R<1>je izabrano iz grupe koja se sastoji od C1-C6-alkila, C2-C6-alkenila, C3-C6-karbociklila, -(C1-C6-alkil)(C3-C6-karbociklila) i -(C1-C6-alkil)(C3-C6-cikloalkenila) pri čemu bilo koji alkil u R<1>je prav ili razgranat. U izvedbi, R<1>je opciono supstituisano sa 1-6 halo ili 1-6 deuterijumom.

[0012] Alternativno, u izvedbi, kada L je NR, onda R i R<1>u kombinaciji sa L predstavljaju tročlani do šestočlani heterocikloalkil (pri čemu 1-4 članovi prstena su nezavisno izabrani od N, O i S) opciono supstituisan jednim ili više R<A>.

[0013] R<2>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od C2-C6-alkinila, C6-C10-arila, C3-C6-karbociklila, petočlanog do desetočlanog heteroarila (pri čemu 1-4 člana heteroarila su nezavisno izabrani od N, O i S) i tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila (pri čemu 1-4 člana heterocikloalkila su nezavisno izabrani od N, O i S). R<2>and R<3>su nezavisno i opciono supstituisani jednim ili više supstituenata koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od R<A>, OR<A>, halo, -N=N-R<A>, -NR<A>R<B>, -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>, -C(O)OR<A>, -C(O)NR<A>R<B>, -OC(O)R<A>, -Si(C1-C6-alkil)3i -CN.

[0014] R<4>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkila (opciono supstituisano jednim ili više halo, hidroksi ili tročlanim do četrnaestočlanim heterocikloalkoksijem (pri čemu 1-4 člana heterocikloalkoksija su nezavisno izabrani od N, O i S)), -O(C1-C6-alkil) (opciono supstituisano jednim ili više halo), -OH, halo, -CN, -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>i - NR<A>R<B>.

[0015] R<5>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkila, C1-C6-alkoksija, C2-C6-alkenila, C2-C6-alkinila, halo, -CN i -NR<C>R<D>.

[0016] R<A>i R<B>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, -CN, -hidroksija, okso, C1-C6-alkila, C1-C6-alkoksija, C2-C6-alkenila, C2-C6-alkinila, -NH2, -S(O)0-2-(C1-C6-alkil), - S(O)0-2-(C6-C10-aril), -C(O)(C1-C6-alkil), -C(O)(C3-C14-karbociklil), -C3-C14-karbociklil, - (C1-C6-alkil)(C3-C14-karbociklil), C6-C10-aril, tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila i - (C1-C6-alkil)-(tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil) (pri čemu 1-4 heterocikloalkil člana su nezavisno izabrana od N, O i S), i petočlanog do desetočlanog heteroarila (pri čemu 1-4 heteroaril člana su nezavisno izabrana od N, O i S).

[0017] Svaka alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, aril, karbociklil, heterocikloalkil i heteroaril funkcionalna grupa R<A>i R<B>je opciono supstituisana jednim ili više supstituenata izabran ih grupe koja se sastoji od deuterijuma, hidroksija, halo, -NR’2(pri čemu svako R’ je nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od C1-C6-alkila, C2-C6-alkenila, C2-C6-alkinila, C6-C10-arila, tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila i -(C1-C6-alkil)-(tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila) (pri čemu 1-4 člana prstena su nezavisno izabrana od N, O i S), i petočlanog do desetočlanog heteroarila (pri čemu 1-4 člana heteroarila su nezavisno izabrana od N, O i S)), -NHC(O)(OC1-C6-alkil), -NO2, -CN, okso, -C(O)OH, -C(O)O(C1-C6-alkil), -C1-C6-alkil(C1-C6-alkoksi), -C(O)NH2, C1-C6-alkil, - C(O)C1-C6-alkil, -OC1-C6-alkil, -Si(C1-C6-alkil)3, -S(O)0-2-(C1-C6-alkil), C6-C10-aril, -(Ci-C6-alkil)(C6-C10-aril), tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila, i -(C1-C6-alkil)-(tročlani do četrnaestočlani heterocikl) (pri čemu 1-4 člana heterocikla su nezavisno izabrana od N, O i S), i -O(C6-C14-aril). Svaki alkil, alkenil, aril i heterocikloalkil supstituent u R<A>i R<B>je opciono supstituisan jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koja se sastoji od deuterijuma, hidroksija, -OC1-C6-alkila, halo, -NH2, -(C1-C6-alkil)NH2, -C(O)OH, CN i okso.

[0018] R<C>i R<D>su svako nezavisno izabrano od H i C1-C6-alkila.

[0019] Otkriće u sledećoj izvedbi pruža farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, tautomera i/ili izotopologa kao što je opisano u tekstu, i farmaceutski prihvatljivog nosača. Reference na metode tretmana u sledećim paragrafima ovog opisa treba da se tumače kao reference na jedinjenja, farmacetuske kompozicije i medikamente predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0020] U sledećoj izvedbi, otkriće pruža metodu za tretiranje kod subjekata koji boluju od raka, koja obuhvata primenu nad subjektom efikasne količine jedinjenja MAT2A inhibitora kao što je ovde opisano.

[0021] Sledeća izvedba otkrića predstavlja metodu za inhibiranje sinteze S-adenozil metionina (SAM) u ćeliji, koja obuhvata uvođenje efikasne količine jedinjenja u ćeliju, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, tautomera i/ili izotopologa, kao što je ovde opisano.

[0022] Otkriće, u sledećoj izvedbi, se odnosi na metodu za inhibiranje sinteze S-adenozil metionina (SAM) kod subjekta, koja obuhvata primenu nad subjektom efikasne količine najmanje jednog jedinjenja ili njegove soli, tautomera i/ili izotopologa kao što je u tekstu opisano.

[0023] U izvedbi, otkriće pruža metodu za tretiranje kod subjekata koji boluju od raka, pri čemu rak je karakterisan redukcijom ili odsustvom ekspresije gena metiltioadenozin fosforilaze (MTAP), odsustvom MTAP gena, ili redukovanom funkcijom MTAP proteina, u poređenju sa karcinomima gde je MTAP gen ili protein prisutan i/ili potpuno funkcionalan, metoda obuhvata primenu nad subjektom terapeutski efikasne količine jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, tautomera i/ili izotopologa, kao što je u tekstu opisano.

[0024] U još jednoj izvedbi, otkriće takođe pruža jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, tautomer i/ili izotopolog, kao što je ovde opisano, za inhibiranje sinteze S-adenozil metionina (SAM).

[0025] U sledećoj izvedbi, otkriće pruža jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, tautomer i/ili izotopolog, kao što je ovde opisano, za upotrebu u tretiranju subjekta koji boluje od raka.

[0026] Otkriće takođe pruža upotrebu jedinjenja kao što je opisano u tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenata za lečenje raka.

DETALJAN OPIS

[0027] Jedinjenja opisana u tekstu su inhibitori MAT2A. Predmetno otkriće se stoga odnosi ne samo na takva jedinjenja u skladu sa Formulom I, već takođe i na njihove farmaceutske kompozicije, tautomere i izotopologe. Jedinjenja i kompozicije su korisne u tretiranju karcinoma. Neki karcinomi uključuju karcinome sa obrisanim MTAP, tj., te karcinome karakteriše odsustvo ili delecija MTAP gena/proteina ili redukovana funkcija MTAP proteina.

Definicije

[0028] "Alkil" se odnosi na prav, razgranat lanac hidrokarbil grupa, od 1 do približno 20 atoma ugljenika. Na primer, alkil može imati od 1 do 10 atoma ugljenika ili 1 do 6 atoma ugljenika. Primerni alkil uključuje alkil grupe pravog lanca kao što su metil, etil, propil, butil, pentil, heksil, heptil, oktil, nonil, decil, undecil, dodecil, i slične, i takođe uključuje izomere razgranatog lanca alkil grupa pravog lanca, na primer, bez ograničavanja, -CH(CH3)2, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)3, -C(CH2CH3)3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH(CH2CH3)2, -CH2C(CH3)3, - CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH2CH3)2, -CH2CH2C(CH3)3, - CH2CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2, i slične. Stoga, alkil grupe uključuju primarne alkil grupe, sekundarne alkil grupe i tercijarne alkil grupe. Alkil grupa može biti nesupstituisana ili opciono supstituisana jednim ili više supstituenata kao što je opisano u nastavku teksta.

[0029] Fraza "supstituisani alkil" se odnosi na alkil supstituisan na jednoj ili više pozicija, na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili čak 6 pozicija, čiji supstituenti su prikačeni na bilo koji dostupni atom kako bi se proizvelo stabilno jedinjenje, sa supstitucijom kao što je opisano u tekstu. "Opciono supstituisan alkil" se odnosi na alkil ili supstituisani alkil.

[0030] Svaki od pojmova "halogen", "halid" i "halo" se odnosi na -F, -Cl, -Br ili -I.

[0031] Pojam "alkenil" se odnosi na hidrokarbil grupe pravog ili razgranatog lanca koje uključuju od 2 do približno 20 atoma ugljenika koji imaju 1-3, 1-2 ili najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik ugljenik. Alkenil grupa može biti nesupstituisana ili opciono supstituisana jednim ili više supstituenata kao što je opisano u nastavku teksta.

[0032] "Supstituisani alkenil" se odnosi na alkenil supstituisan na 1 ili više, na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili čak 6 pozicija, čiji supstituenti su prikačeni za bilo koji dostupni atom kako bi se proizvelo stabilno jedinjenje, sa supstitucijom kao što je opisana u tekstu. "Opciono supstituisan alkenil" se odnosi na alkenil ili supstituisani alkenil.

[0033] "Alkin" ili "alkinil" se odnosi na nezasićeni ugljovodonik pravog ili razgranatog lanca koji ima naznačen broj atoma ugljenika i najmanje jednu trostruku vezu. Primeri alkinil grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na, acetilen, propin, 1-butin, 2-butin, 1-pentin, 2-pentin, 1-heksin, 2-heksin, 3-heksin, 1-heptin, 2-heptin, 3-heptin, 1-oktin, 2-oktin, 3-oktin i 4-oktin. Alkinil grupa može biti nesupstituisana ili opciono supstituisana jednim ili više supstituenata kao što je opisano u nastavku teksta.

[0034] "Supstituisani alkinil" se odnosi na alkinil supstituisan na 1 ili više, na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili čak 6 pozicija, čiji supstituenti su prikačeni na bilo koji dostupni atom kako bi se proizvelo stabilno jedinjenje, sa supstitucijom kao što je opisano u tekstu. "Opciono supstituisan alkinil" se odnosi na alkinil ili supstituisani alkinil.

[0035] Pojam "alkoksi" se odnosi na -O-alkil grupu koja ima naznačen broj atoma ugljenika. Na primer, (C1-C6)alkoksi grupa uključuje -O-metil, -O-etil, -O-propil, -O-izopropil, -O-butil, -O-sek-butil, -O-terc-butil, -O-pentil, -O-izopentil, -O-neopentil, -O-heksil, -O-izoheksil i -O-neoheksil.

[0036] Pojam "karbociklil" se odnosi na monociklični, biciklični, triciklični ili policiklični, tročlani do četrnaestočlani prstenasti sistem, koji je ili zasićen, kao "cikloalkil", ili nezasićen, kao "cikloalkenil". Pojam "cikloalkenil" se odnosi specifično na ciklični alkenil, kao što je C3-C6-cikloalkenil. Karbociklil može biti prikačen preko bilo kog atoma. Karbociklil, na primer, takođe razmatra fuzionisane prstenove pri čemu, na primer, karbociklil je fuzionisan za aril ili heteroaril prsten kao što je definisano u tekstu. Reprezentativni primeri karbociklila uključuju, ali se ne ograničavaju na ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, ciklopropenil, ciklobutenil, ciklopentenil, cikloheksenil, fenil, naftil, antracil, benzofuranil i benzotiofenil. Karbociklil grupa može biti nesupstituisana ili opciono supstituisana jednim ili više supstituenata kao što je opisano u nastavku teksta.

[0037] "Supstituisani karbociklil" se odnosi na karbociklil supstituisan na 1 ili više, na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili čak 6 pozicija, čiji supstituenti su prikačeni za bilo koji dostupni atom kako bi se proizvelo stabilno jedinjenje, sa supstitucijom kao što je opisano u tekstu. "Opciono supstituisani karbociklil" se odnosi na karbociklil ili supstituisani karbociklil.

[0038] "Aril" kada se koristi sam ili kao deo drugog pojma znači karbociklična aromatična grupa bilo da jeste ili nije fuzionisana koja ima označen broj atoma ugljenika ili, ukoliko nije označen broj, do 14 atoma ugljenika, kao što je C6-C14-aril. Određene aril grupe su fenil, naftil, bifenil, fenantrenil, naftacenil i slične (videti, na primer, Lang’s Handbook of Chemistry (Dean, J. A., ed) 13th ed. Table 7-2 [1985]). Određeni aril je fenil. "Aril" takođe uključuje aromatične prstenaste sisteme koji su opciono fuzionisani sa karbociklil prstenom, kao što je u tekstu definisano. Aril grupa može biti nesupstituisana ili opciono supstituisana jednim ili više supstituenata kao što je opisano u nastavku teksta.

[0039] "Supstituisani aril" je aril koji je nezavisno supstituisan jednim ili više supstituenata prikačenih na bilo koji dostupni atom kako bi se proizvelo stabilno jedinjenje, pri čemu supstituenti su kao što je opisano u tekstu. "Opciono supstituisan aril" se odnosi na aril ili supstituisani aril.

[0040] Pojam "heteroatom" se odnosi na N, O i S. Jedinjenja koja sadrže N ili S atome se mogu opciono oksidovati u odgovarajuća N-oksid, sulfoksid ili sulfon jedinjenja.

[0041] "Heteroaril", sam ili u kombinaciji sa bilo kojom ovde opisanom funkcionalnom grupom, se odnosi na monocikličnu aromatičnu prstenastu strukturu koja sadrži 5 do 10, kao 5 ili 6 prstenastih atoma, ili bicikličnu aromatičnu grupu koja ima 8 do 10 atoma, koja sadrži jedan ili više, kao što je 1-4, 1-3 ili 1-2, heteroatoma nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od O, S i N. Heteroaril takođe treba da uključi oksidovano S ili N, kao što je sulfinil, sulfonil i N-oksid azota tercijarnog prstena. Ugljenik ili heteroatom je tačka prikačinjanja strukture heteroaril prstena na način da se dobije stabilno jedinjenje. Primeri heteroaril grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na, piridinil, piridazinil, pirazinil, hinoksalil, indolizinil, benzo[b]tienil, hinazolinil, purinil, indolil, hinolinil, pirimidinil, pirolil, pirazolil, oksazolil, tiazolil, tienil, izoksazolil, oksatiadiazolil, izotiazolil, tetrazolil, imidazolil, triazolil, furanil, benzofuril i indolil.

Heteroaril grupa može biti nesupstituisana ili opciono supstituisana jednim ili više supstituenata kao što je opisano u nastavku teksta.

[0042] "Supstituisani heteroaril" je heteroaril koji je nezavisno supstituisan, osim ukoliko nije naznačeno drugačije, sa jednim ili više, na primer, 1, 2, 3, 4 ili 5, takođe 1, 2 ili 3 supstituenta, takođe 1 supstituent, prikačen na bilo koji dostupni atom kako bi se dobilo stabilno jedinjenje, pri čemu supstituenti su kao što je opisano u tekstu. "Opciono supstituisani heteroaril" se odnosi na heteroaril ili supstituisani heteroaril.

[0043] "Heterocikloalkil" znači zasićeni ili nezasićeni nearomatični monociklični, biciklični, triciklični ili policiklični prstenasti sistem koji ima od 3 do 14, kao 3 do 6, atoma u kom su od 1 do 4 atoma ugljenika u prstenu zamenjeni heteroatomima O, S ili N. Heterocikloalkil je opciono fuzionisan sa arilom ili heteroarilom od 5-6 članova prstena, i uključuje oksidovano S ili N, kao što je sulfinil, sulfonil i N-oksid azota tercijarnog prstena. Tačka prikačinjanja heterocikloalkil prstena je na ugljeniku ili heteroatomu tako da se zadrži stabilan prsten. Primeri heterocikloalkil grupa uključuju, bez ograničavanja morfolino, tetrahidrofuranil, dihidropiridinil, piperidinil, pirolidinil, piperazinil, dihidrobenzofuril i dihidroindolil. Heterocikloalkil grupa može biti nesupstituisana ili opciono supstituisana jednim ili više supstituenata kao što je opisano u nastavku teksta.

[0044] "Opciono supstituisan heterocikloalkil" označava heterocikloalkil koji je supstituisan sa 1 do 3 supstituenta, na primer, 1, 2 ili 3 supstituenta, prikačen za bilo koji dostupni atom kako bi se dobilo stabilno jedinjenje, pri čemu supstituenti su kao što je opisano u tekstu.

[0045] "Heterocikloalkoksi" se odnosi na -O-heterocikloalkil grupu koja ima naznačen broj atoma članova u monocikličnom, bicikličnom, tricikličnom ili policikličnom prstenastom sistemu i gde su 1 do 4 atoma ugljenika u prstenu zamenjeni heteroatomima O, S ili N.

[0046] "Opciono supstituisan heterocikloalkoksi" se odnosi na heterocikloalkoksi grupu koja je supstituisana sa 1 do 3 supstituenta, na primer, 1, 2 ili 3 supstituenta, prikačena za bilo koji dostupni atom kako bi se dobilo stabilno jedinjenje, pri čemu supstituenti su kao što je opisano u tekstu.

[0047] Pojam "nitril" ili "cijano" se može koristiti naizmenično i odnosi se na -CN grupu koja je vezana za atom ugljenika heteroaril prstena, aril prstena i heterocikloalkil prsten.

[0048] Pojam "okso" se odnosi na =O atom prikačen za zasićenu ili nezasićenu funkcionalnu grupu. =O atom može biti prikačen za atom ugljenika, sumpora ili azota, koji je deo ciklične ili aciklične funkcionalne grupe.

[0049] "Hidroksil" ili "hidroksi" se odnosi na -OH grupu.

[0050] Supstituent -CO2H se može zameniti bioizosteričnim zamenama kao što su:

i sličnim, pri čemu R ima istu definiciju kao R<A>kao što je u tekstu definisano. Videti, na primer, THE PRACTICE OF MEDICINAL CHEMISTRY (Academic Press: New York, 1996), na strani 203.

[0051] Ovde opisana jedinjenja mogu postojati u različitim izomernim oblicima, uključujući konfiguracione, geometrijske i konformacione izomere, uključujući, na primer, cis- ili trans-konformacije. Jedinjenja mogu takođe postojati u jednom ili više tautomernih oblika, uključujući i pojedinačne tautomere i smeše tautomera. Pojam "izomer" treba da obuhvati sve izomerne forme jedinjenja ovog otkrića, uključujući tautomerne forme jedinjenja. Jedinjenja predmetnog otkrića mogu takođe postojati u otvorenim ili ciklizovanim oblicima. U nekim slučajevima, jedna ili više ciklizovanih formi može nastati usled gubitka vode. Specifična kompozicija otvorenih i ciklizovanih formi može biti zavisna od toga kako je jedinjenje izolovano, skladišteno ili primenjeno. Na primer, jedinjenje može postojati primarno u formi otvorenog lanca pod kiselim uslovima ali ciklizovati pod neutralnim uslovima. Sve forme su uključene u otkriću.

[0052] Neka od ovde opisanih jedinjenja mogu imati asimetrične centre i stoga postojati u različitim enantiomernim i dijastereomernim oblicima. Jedinjenje otkrića može biti u formi optičkog izomera ili dijastereomera. Shodno tome, otkrića obuhvata jedinjenja i njihove primene kao što je opisano u tekstu u formi njihovih optičkih izomera, dijastereoizomera i njihovih smeša, uključujući racemsku smešu. Optički izomeri jedinjenja otkrića se mogu dobiti putem poznatih tehnika kao što su asimetrična sinteza, hiralna hromatografija, tehnologiija stimulisanog pokretnog kreveta ili putem hemijske separacije stereoizomera primenom optički aktivnih agenasa za razdvajanje.

[0053] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam "stereoizomer" znači jedan stereoizomer jedinjenja koji je suštinski slobodan od drugih stereoizomera tog jedinjenja. Stoga, stereomerno čisto jedinjenje koje ima jedan hiralni centar će biti suštinski slobodno od suprotnog enantiomera jedinjenja. Stereomerno čisto jedinjenje koje ima dva hiralna centra će biti suštinski slobodno od ostalih dijastereomera jedinjenja. Uobičajeno stereomerno čisto jedinjenje obuhvata više od približno 80% težine jednog stereoizomera jedinjenja i manje od približno 20% težine drugih stereoizomera jedinjenja, na primer više od približno 90% težine jednog stereoizomera jedinjenja i manje od približno 10% po težini drugih stereoizomera jedinjenja, više od približno 95% težine jednog stereoizomera jedinjenja i manje od približno 5% težine drugih stereoizomera jedinjenja, više od približno 97% težine jednog stereoizomera jedinjenja i manje od približno 3% težine drugih stereoizomera jedinjenja, ili više od približno 99% težine jednog stereoizomera jedinjenja i manje od približno 1% težine drugih stereoizomera jedinjenja. Stereoizomer, kao što je opisan u prethodnom tekstu, se može posmatrati kao kompozicija koja sadrži dva stereoizomera koja su prisutna u njihovim respektivnim procentima težine koji su opisani u tekstu.

[0054] Kao što je korišćeno u tekstu, pojam "izotopolog" je izotopski obogaćeno jedinjenje. Kao što je korišćeno u tekstu, i osim ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam "izotopski obogaćeno" se odnosi na atom koji ima izotopsku kompoziciju drugačiju od prirodno bogate izotopske kompozicije tog atoma. "Izotopski obogaćen" se može takođe odnositi na jedinjenje koje sadrži najmanje jedan atom koji ima izotopsku kompoziciju drugačiju od prirodne izotopske kompozicije tog atoma. Kod izotopologa, "izotopsko obogaćivanje" se odnosi na procenat inkorporacije količine specifičnog izotopa datog atoma u molekulu na mestu prirodne izotopske kompozicije tog atoma. Na primer, obogaćivanje deuterijuma od 1% na datoj poziciji znači da 1% molekula u datom primeru sadrži deuterijum na naznačenoj poziciji. Iz razloga što je distribucija deuterijuma koja se prirodno javlja približno 0,0156%, obogaćivanje deuterijuma na bilo kojoj poziciji u jedinjenju sintetisanom korišćenjem neobogaćenih polaznih materijala je približno 0,0156%.

[0055] Stoga, kao što je korišćeno u tekstu, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam "faktor izotopskog obogaćivanja" se odnosi na odnos između izotopske kompozicije i prirodne izotopske kompozicije određenog izotopa.

[0056] U odnosu na jedinjenja data u tekstu, kada je određena pozicija atoma označena da ima deuterijum ili "D" ili "H<2>", podrazumeva se da je obilnost deuterijuma na toj poziciji suštinski veća u odnosu na prirodnu obilnost deuterijuma, koja je približno 0,015%. Pozicija označena da ima deuterijum obično ima minimalni faktor izotopskog obogaćivanja od, u određenim izvedbama, najmanje 1000 (15% inkorporacije deuterijuma), najmanje 2000 (30% inkorporacije deuterijuma), najmanje 3000 (45% inkorporacije deuterijuma), najmanje 3500 (52,5% inkorporacije deuterijuma), najmanje 4000 (60% inkorporacije deuterijuma), najmanje 4500 (67,5% inkorporacije deuterijuma), najmanje 5000 (75% inkorporacije deuterijuma), najmanje 5500 (82,5% inkorporacije deuterijuma), najmanje 6000 (90% inkorporacije deuterijuma), najmanje 6333,3 (95% inkorporacije deuterijuma), najmanje 6466,7 (97% inkorporacije detuerijuma), najmanje 6600 (99% inkorporacije detuerijuma) ili najmanje 6633,3 (99,5% inkorporacije deuterijuma) na svakom označenom atomu deuterijuma. Izotopsko obogaćivanje i faktor izotopskog obogaćivanja u tekstu datih jedinjenja se može odrediti upotrebom konvencionalnih analitičkih metoda koje su poznati nekome sa uobičajenim veštinama u praksi, uključujući spektrometriju mase i spektroskopiju nuklearne magnetne rezonance.

[0057] Ukoliko postoji neslaganje između prikazane strukture i naziva datog strukturi, onda prikazana struktura kontroliše. Pored toga, ukoliko stereohemija strukture ili dela strukture nije naznačena sa, na primer, podebljanim ili isprekidanim linijama, struktura ili deo strukture treba da se tumači kao da obuhvata sve njene stereoizomere. U nekim slučajevima, ipak, gde postoji više od jednog hiralnog centra, strukture i nazivi mogu biti predstavljeni kao pojedinačni enantiomeri kako bi se pomoglo opisivanje relativne stereohemije. Oni iskusni u praksi organske sinteze će znati ukoliko su jedinjenja pripremana kao pojedinačni enantiomeri metodama korišćenim za njihovu pripremu.

[0058] Kao što je korišćeno u tekstu i osim ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam "jedinjenje" je inkluzivno po tome što obuhvata jedinjenja ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, stereoizomer, izotopolog i/ili tautomer. Stoga, na primer, jedinjenje Formule I ili II uključuje farmaceutski prihvatljivu so izotopologa jedinjenja.

[0059] U ovom opisu, "farmaceutski prihvatljiva so" je farmaceutski prihvatljiva, organska ili neorganska kisela ili bazna so jedinjenja otkrića. Reprezentativne farmaceutski prihvatljive soli uključuju, na primer, soli alkalnih metala, zemnoalkalne soli, soli amonijuma, soli rastvorljive i nerastvorljive u vodi, kao što su acetat, amsonat (4,4-diaminostilben-2,2-disulfonat), benzensulfonat, benzonat, bikarbonat, bisulfat, bitartrat, borat, bromid, butirat, kalcijum, kalcijum edetat, kamzilat, karbonat, hlorid, citrat, klavularijat, dihidrohlorid, edetat, edizilat, estolat, ezilat, fumarat, gluceptat, glukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksafluorofosfat, heksilresorcinat, hidrabamin, hidrobromid, hidrohlorid, hidroksinaftoat, jodid, izotionat, laktat, laktobionat, laurat, malat, maleat, mandelat, mezilat, metilbromid, metilnitrat, metilsulfat, mukat, napsilat, nitrat, N-metilglukamin amonijum so, 3-hidroksi-2-naftoat, oleat, oksalat, palmitat, pamoat (1,1-meten-biz-2-hidroksi-3-naftoat, einbonat), pantotenat, fosfat/difosfat, pikrat, poligalakturonat, propionat, ptoluensulfonat, salicilat, stearat, subacetat, sukcinat, sulfat, sulfosalicilat, suramat, tanat, tartrat, teoklat, tozilat, trietiodid i soli valerata. Farmaceutski prihvatljiva so može imati više od jednog naelektrisanog atoma u svojoj strukturi. U ovom slučaju farmaceutski prihvatljiva so može imati više kontrajona. Stoga, farmaceutski prihvatljiva so može imati jedan ili više naelektrisanih atoma i/ili jedan ili više kontrajona.

[0060] Pojmovi "tretirati", "tretiranje" i "tretman" se odnose na poboljšavanje ili iskorenjivanje bolesti ili simptoma povezanih sa bolešću. U određenim izvedbama, takvi pojmovi se odnose na minimizovanje širenja ili pogoršavanja bolesti kao rezultat primene jednog ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa nad pacijentom koji boluje od takve bolesti.

[0061] Pojmovi "sprečavati", "sprečavanje" i "prevencija" se odnose na prevenciju nastanka, recidiva ili širenja bolesti kod pacijenta kao rezultat primene profilaktičkog ili terapeutskog agensa.

[0062] Pojam "efikasna količina" se odnosi na količinu jedinjenja otkrića ili drugog aktivnog sastojka dovoljnu da pruži terapeutsku ili profilaktičku korist u tretmanu ili prevenciji bolesti, ili da odloži ili minimizuje simptome povezane sa bolešću. Dalje, terapeutski efikasna količina u odnosu na jedinjenje otkrića znači količina samog terapeutskog agensa, ili u kombinaciji sa drugim terapijama, koja pruža terapeutsku korist u tretmanu ili prevenciji bolesti. Korišćeno u vezi sa jedinjenjem otkrića, pojam može obuhvatati količinu koja poboljšava ukupnu terapiju, redukuje ili izbegava simptome ili uzroke bolesti, ili poboljšava terapeutsku efikasnost ili sinerguje sa drugim terapeutskim agensom.

[0063] "Pacijent" ili "subjekt" uključuje životinju, kao što je čovek, krava, konj, ovca, jagnje, svinja, pile, ćurka, prepelica, mačka, pas, miš, pacov, zec ili zamorče. U skladu sa nekim izvedbama, životinja je sisar kao što su neprimat i primat (na primer, majmun i čovek). U jednoj izvedbi, pacijent je čovek, kao što je ljudsko novorođenče, dete, adolescent ili odrasla osoba.

[0064] "Inhibitor" znači jedinjenje koje sprečava ili redukuje količinu sinteze SAM. U izvedbi, inhibitor se vezuje za MAT2A. U jednoj izvedbi, inhibitor inhibira funkciju MAT2A.

JEDINJENJA

[0065] Kao što je uopšteno opisano u prethodnom tekstu, predmetno otkriće pruža jedinjenja i njegove farmaceutski prihvatljive soli, tautomere i/ili izotopologe, pri čemu jedinjenja su u skladu sa formulom I:

[0066] U Formuli I, L je O, S, NR ili veza. R je H ili C1-C6-alkil.

[0067] R<1>je izabrano iz grupe koja se sastoji od C1-C6-alkila, C2-C6-alkenila, C3-C6-karbociklila, -(C1-C6-alkil)(C3-C6-karbociklila) i -(C1-C6-alkil)(C3-C6-cikloalkenila) pri čemu bilo koji alkil u R<1>je prav ili razgranat. U izvedbi, R<1>je opciono supstituisano sa 1 - 6 halo ili 1 - 6 deuterijumom.

[0068] Alternativno, u izvedbi, gde L je NR, onda R i R<1>u kombinaciji sa L predstavljaju tročlani do šestočlani heterocikloalkil (pri čemu 1-4 člana prstena su nezavisno izabrana od N, O i S) opciono supstituisan jednim ili više R<A>.

[0069] R<2>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od C2-C6-alkinila, C6-C10-arila, C3-C6-karbociklila, petočlanog do desetočlanog heteroarila (pri čemu 1-4 heteroaril člana su nezavisno izabrani od N, O i S), i tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila (pri čemu 1-4 heterocikloalkil člana su nezavisno izabrani od N, O i S). R<2>i R<3>su nezavisno i opciono supstituisani jednim ili više supstituenata koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od R<A>, OR<A>, halo, -N=N-R<A>, -NR<A>R<B>, -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>, -C(O)OR<A>, -C(O)NR<A>R<B>, -OC(O)R<A>, -Si(C1-C6-alkil)3i -CN.

[0070] R<4>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkil (opciono supstituisan jednim ili više halo, hidroksi ili tročlanim do četrnaestočlanim heterocikloalkoksijem (pri čemu 1-4 heterocikloalkoksi člana su nezavisno izabrana od N, O i S)), -O(C1-C6-alkil) (opciono supstituisan jednim ili više halo), -OH, halo, -CN, -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>i -NR<A>R<B>.

[0071] R<5>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkila, C1-C6-alkoksija, C2-C6-alkenila, C2-C6-alkinila, halo, -CN i -NR<C>R<D>.

[0072] R<A>i R<B>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, -CN, -hidroksija, okso, C1-C6-alkila, C1-C6-alkoksija, C2-C6-alkenila, C2-C6-alkinila, -NH2, -S(O)0-2-(C1-C6-alkil), - S(O)0-2-(C6-C10-aril), -C(O)(C1-C6-alkil), -C(O)(C3-C14-karbociklil), -C3-C14-karbociklil, - (C1-C6-alkil)(C3-C14-karbociklil), C6-C10-arila, tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila i - (C1-C6-alkil)-(tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila) (pri čemu 1-4 heterocikloalkil člana su nezavisno izabrana od N, O i S), i petočlanog do desetočlanog heteroarila (pri čemu 1-4 heteroaril člana su nezavisno izabrana od N, O i S).

[0073] Svaka alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, aril, karbociklil, heterocikloalkil i heteroaril funkcionalna grupa R<A>i R<B>je opciono supstituisana jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koja se sastoji od deuterijuma, hidroksija, halo, -NR’2(pri čemu svako R’ je nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od C1-C6-alkila, C2-C6-alkenila, C2-C6-alkinila, C6-C10-arila, tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila i -(C1-C6-alkil)-(tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila) (pri čemu 1-4 člana prstena su nezavisno izabrana od N, O i S) i petročlanog do desetočlanog heteroarila (pri čemu 1-4 heteroaril člana su nezavisno izabrana od N, O i S), -NHC(O)(OC1-C6-alkil), -NO2, -CN, okso, - C(O)OH, -C(O)O(C1-C6-alkil), -C1-C6-alkil(C1-C6-alkoksi), -C(O)NH2, C1-C6-alkil, - C(O)C1-C6-alkil, -OC1-C6-alkil, -Si(C1-C6-alkil)3, -S(O)0-2-(C1-C6-alkil), C6-C10-aril, -(Ci-C6-alkil)(C6-C10-aril), tročlanog do četrnaestočlanog heterocikloalkila i -(C1-C6-alkil)-(tročlani do četrnaestočlani heterocikl) (pri čemu 1-4 heterocikl člana su nezavisno izabrani od N, O i S) i -O(C6-C14-aril). Svaki alkil, alkenil, aril i heterocikloalkil supstituent u R<A>i R<B>je opciono supstituisan jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koja se sastoji od hidroksija, -OC1-C6-alkila, halo, -NH2, -(C1-C6-alkil)NH2, -C(O)OH, CN i okso.

[0074] R<C>i R<D>su svako nezavisno izabrani od H i C1-C6-alkil.

[0075] U nekim izvedbama, R<4>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkila (opciono supstituisan jednim ili više halo, hidroksijem ili tročlanim do četrnaestočlanim heterocikloalkoksijem (pri čemu 1-4 heterocikloalkoksi člana su nezavisno izabrani od N, O i S)), -O(C1-C6-alkil), -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>i -NR<A>R<B>(pri čemu R<A>i R<B>su nezavisno izabrani od H i C1-C6-alkila); i R<5>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkila, C1-C6-alkoksija i -NR<C>R<D>.

[0076] U drugim izvedbama, najmanje jedno R<4>i R<5>je H. Na primer, R<4>je H ili R<5>je H. Alternativno, svako R<4>i R<5>je H.

[0077] Opciono u kombinaciji sa bilo kojom drugom izvedbom opisanom u tekstu, različite izvedbe daju jedinjenje Formule I pri čemu R<2>je opciono supstituisan C6-C10-aril ili opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril. U jednoj izvedbi, R<2>je opciono supstituisan C6-C10-aril, kao opciono supstituisani fenil. U sledećoj izvedbi, R<2>je opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril, i pri čemu 1 član prstena je N. Na primer, R<2>je opciono supstituisan petočlani ili šestočlani heteroaril, ili opciono supstituisan šestočlani heteroaril, primer u kom je opciono supstituisan piridil.

[0078] U nekim izvedbama, opciono u kombinaciji sa bilo kojim opisanim u tekstu, R<3>je opciono supstituisan tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opcio supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril. Neograničavajući primeri R<3>su izabrani iz grupe koja se sastoji od benzotiazolila, benzoizotiazolila, benzoksazolila, piridinila, piridinonila, piridazinila, benzimidazolila, benzotriazolila, indazolila, hinoksalinila, hinolinila, hinazolinila, imidazopiridinila, pirazolopiridinila, triazolopiridinila, cinolinila, izoksazolila, pirazolil, benzofuranila, dihidrobenzofuranila, dihidrobenzodioksinila i tetrahidrobenzodioksinila, od kojih svaki može biti opciono supstituisan.

[0079] U drugim izvedbama, R<3>je opciono supstituisan C6-C10-aril. Primer je opciono supstituisan fenil.

[0080] Otkriće pruža neka jedinjenja Formule I pri čemu R<2>je opciono supstituisan fenil a R<3>je opciono supstituisan tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril.

[0081] U različitim izvedbama, otkriće pruža jedinjenje Formule I pri čemu L je O ili NR. Dalje, u skladu sa dodatnim izvedbama, R<1>je opciono supstituisan C1-C6-alkil ili opciono supstituisan C3-C6-karbociklil. Primer R<1>je C1-C3-alkil koji je opciono supstituisan sa 1-3 F.

[0082] Podskup jedinjenja Formule I, u skladu sa izvedbom, su ona kod kojih L je O ili NR a R je H; R<1>je C1-C3-alkil koji je opciono supstituisan sa 1 - 3 F; R<2>je opciono supstituisan tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril (pri čemu 1 heterocikloalkil ili heteroaril član je N) ili opciono supstituisan C6-C10-aril; R<3>je opciono supstituisan tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril pri čemu 1 do 3 heterocikloalkil ili heteroaril člana su nezavisno izabrana od N, O i S; i svako R<4>i R<5>je H. U nekim izvedbama, L je NR.

[0083] U različitim izvedbama, otkriće pruža specifične primere jedinjenja Formule I, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, tautomera i/ili izotopologa kao što je navedeno u Tabeli 1 u nastavku:

Tabela 1

[0084] U drugim različitim izvedbama, otkriće pruža dodatne specifične primere jedinjenja Formule I, i njihove farmaceutski prihvatljive soli, tautomere i/ili izotopologe kao što je navedeno u Tabeli 2 u nastavku.

Tabela 2

FARMACEUTSKA KOMPOZICIJA

[0085] Otkriće takođe pruža farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapeutski efikasnu količinu jednog ili više jedinjenja u skladu sa Formulom I ili farmaceutski prihvatljivu so, stereoizomer, tautomer i/ili izotopolog, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. U nekim izvedbama, kompozicija dodatno sadrži, u skladu sa prihvaćenom praksom farmaceutskog kompaundiranja, jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa, farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, diluenata, ađuvanata, stabilizatora, emulgatora, konzervansa, bojila, pufera, agenasa za davanje ukusa.

[0086] U jednoj izvedbi, farmaceutska kompozicija sadrži jedinjenje izabrano od onih ilustrovanih u Tabeli 1 ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, stereoizomer, tautomer i/ili izotopolog, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0087] Farmaceutska kompozicija predmetnog otkrića je formulisana, dozirana, i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori razmatranja u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se tretira, određeni subjekt koji se tretira, kliničko stanje subjekta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, način primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima.

[0088] "Terapeutski efikasna količina" jedinjenja (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera, tautomera i/ili izotopologa koji se primenjuje je vođena takvim razmatranjima i predstavlja minimum količine neophodne za ispoljavanje citotoksičnog dejstva na rak, ili da inhibira aktivnost MAT2A, ili oba. Takva količina može biti ispod količine koja je toksična za normalne ćelije, ili subjekta u celosti. Generalno, inicijalna terapeutski efikasna količina jedinjenja (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera ili tautomera) predmetnog otkrića koja se primenjuje je u opsegu od približno 0,01 do približno 200 mg/kg ili približno 0,1 do približno 20 mg/kg telesne težine pacijenta dnevno, sa uobičajenim inicijalnim opsegom od približno 0,3 do približno 15 mg/kg/dan. Forme oralne jedinične doze, kao što su tablete i kapsule, mogu sadržati od približno 1 mg do približno 1000 mg jedinjenja (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera ili tautomera) predmetnog otkrića. U sledećoj izvedbi, takve dozne forme sadrže od približno 50 mg do približno 500 mg jedinjenja (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera ili tautomera) predmetnog pronalaska. U još jednoj izvedbi, takve dozne forme sadrže od približno 25 mg do približno 200 mg jedinjenja (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera ili tautomera) predmetnog otkrića. U još jednoj izvedbi, takve dozne forme sadrže od približno 10 mg do približno 100 mg jedinjenja (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera ili tautomera) predmetnog otkrića. U sledećoj izvedbi takve dozne forme sadrže od približno 5 mg do približno 50 mg jedinjenja (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera ili tautomera) predmetnog otkrića.

[0089] Kompozicije se mogu primeniti oralno, topikalno, parenteralno, inhalacijom ili sprejom ili rektalno u formulacijama dozne jedinice. Pojam parenteralno kao što se koristi u tekstu uključuje subkutane injekcije, intravensku, intramuskularnu, intrasternalnu injekciju ili tehnike infuzije.

[0090] Pogodne oralne kompozicije u skladu sa otkrićem uključuju, bez ograničavanja, tablete, pastile, lozenge, vodene ili uljane suspenzije, disperzibilne prahove ili granule, emulziju, tvrde ili meke kapsule, sirupe ili eliksire.

[0091] U okviru obima pronalaska su obuhvaćene farmaceutske kompozicije pogodne za pojedinačne jedinične doze koje sadrže jedinjenje otkrića ili njegov farmaceutski prihvatljiv stereoizomer, so ili tautomer i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0092] Kompozicije pogodne za oralnu upotrebu se mogu pripremiti u skladu sa bilo kojom metodom poznatom u tehnici prozivodnje farmaceutskih kompozicija. Na primer, tečne formulacije jedinjenja sadrže jedan ili više agenasa izabranih iz grupe koja se sastoji od zaslađivača, agenasa za aromu, bojenje i agenasa za konzerviranje kako bi se obezbedili farmaceutski prijatni preparati inhibitora MAT2A.

[0093] Kod kompozicija tableta, za proizvodnju tableta se koristi jedinjenje predmetnog otkrića u mešavini sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima. Primeri takvih ekscipijenata uključuju, bez ograničavanja, inertne diluente, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat, laktoza, kalcijum fosfat ili natrijum fosfat; agense za granulaciju i dezintegraciju, na primer, kukuruzni skrob ili algininska kiselina; agense za vezivanje, na primer, skrob, želatin ili akacija, i lubrikante, na primer magnezijum stearat, stearinsku kiselinu ili talk. Tablete mogu biti neobložene ili mogu biti obložene uz pomoć poznatih tehnika oblaganja kako bi se odložila dezintegracija i apsorpcija u gastrointestinalnom traktu i samim tim kako bi pružile neprekidno terapeutsko dejstvo tokom željenog vremenskog perioda. Na primer, može se koristiti materijal za vremensko odlaganje kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat.

[0094] Formulacije za oralnu primenu mogu takođe biti prisutne kao tvrde želatinske kapsule pri čemu aktivni sastojak je pomešan sa inertnim čvrstim diluentom, na primer, kalcijum karbonatom, kalcijum fosfatom ili kaolinom, ili kao meke želatinske kapsule pri čemu aktivni sastojak je pomešan sa vodom ili uljnim medijumom, na primer, ulje od kikirikija, tečni parafin ili maslinovo ulje.

[0095] Kod vodenih suspenzija, jedinjenje predmetnog pronalaska je pomešano sa ekscipijentima pogodnim za održavanje stabilne suspenzije. Primeri takvih ekscipijenata uključuju, bez ograničavanja, natrijum karboksimetilcelulozu, metilcelulozu, hidropropilmetilcelulozu, natrijum alginat, polivinilpirolidon, tragakantnu gumu i gumu bagrema.

[0096] Oralne suspenzije mogu takođe sadržati agense za dispergovanje ili vlaženje, kao što je fosfatid prirodnog porekla, na primer, lecitin, ili proizvodi kondenzacije alkilen oksida sa masnim kiselinama, na primer polioksietilen stearat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa dugolančanim alifatičnim alkoholima, na primer, heptadekaetilenoksicetanol, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa delimičnim estrima dobijenim iz masnih kiselina i heksitola kao što je polioksietilen sorbitol monooleat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa delimičnim estrima dobijenim iz masnih kiselina i heksitol anhidrida, na primer polietilen sorbitan monooleat. Vodene suspenzije mogu takođe sadržati jedan ili više konzervanasa, na primer etil, ili npropil p-hidroksibenzoat, jedan ili više agenasa za bojanje, jedan ili više agenasa arome i jedan ili više zaslađivača, kao što su sukroza ili saharin.

[0097] Uljane suspenzije mogu biti formulisane suspendovanjem jedinjenja predmetnog otkrića u biljnom ulju, na primer arahisovo ulje, maslinovo ulje, susamovo ili kokosovo ulje, ili u mineralnom ulju kao što je tečni parafin. Uljane suspenzije mogu sadržati agens za zgušnjavanje, na primer pčelinji vosak, tvrdi parafin ili cetil alkohol.

[0098] Zaslađivači kao što su oni navedeni u prethodnom tekstu, i agensi arome mogu biti dodati kako bi se obezbedili prijatni oralni preparati. Ove kompozicije se mogu sačuvati dodavanjem anti-oksidansa kao što je askorbinska kiselina.

[0099] Disperzibilni praškovi i granule pogodni za pripremanje vodene suspenzije dodavanjem vode pružaju jedinjenje predmetnog otkrića pomešano sa agensom za dispergovanje ili vlaženje, agensom za suspenziju i jednim ili više konzervanasa. Pogodni agensi dispergovanja ili vlaženja i agensi suspendovanja su primereni onima koji su već prethodno pomenuti. Dodatni ekscipijenti, na primer zaslađivači, agensi arome i bojenja, mogu takođe biti prisutni.

[0100] Farmaceutske kompozicije predmetnog otkrića mogu takođe biti u obliku emulzija ulje u vodi. Uljana faza može biti biljno ulje, na primer maslinovo ulje ili arahisovo ulje, ili mineralno ulje, na primer tečni parafin ili smeše ovih. Pogodni emulgatori mogu biti prirodne gume, na primer guma bagrema ili guma tragakanta, prirodni fosfatidi, na primer soja, lecitin, i estri ili delimični estri dobijeni iz masnih kiselina i heksitola, anhidridi, na primer sorbitan monooleat, i proizvodi kondenzacije pomenutih delimičnih estra sa etilen oksidom, na primer polioksietilen sorbitan monooleat. Emulzije mogu takođe sadržati zaslađivače i agense arome.

[0101] Sirupi i eliksiri mogu biti formulisani sa zaslađivačima, na primer glicerolom, propilen glikolom, sorbitolom ili sukrozom. Takve formulacije mogu takođe sadržati demulcent, konzervans i agense arome i bojenja. Farmaceutske kompozicije mogu biti o obliku sterilne injekcije, vodene suspenzije ili uljane suspenzije. Ova suspenzija može biti formulisana u skladu sa poznatom praksom korišćenjem tih pogodnih agenasa dispergovanja ili vlaženja i agenasa suspenzije koji su pomenuti u prethodnom tekstu. Sterilni preparat za injekcije može takođe biti sterilni rastvor ili suspenzija za injekcije u netoksičnom parentalno prihvatljivom diluentu ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim nosiocima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum suspendovanja. U ovu svrhu, može se koristiti bilo koje blago fiksirano ulje uključujući sintetičke mono ili digliceride. Dodatno, masne kiseline kao što je oleinska kiselina nalaze primenu u pripremi injekcija.

[0102] Jedinjenja opšte Formule I mogu takođe biti primenjena u formi supozitorija za rektalnu administraciju leka. Ove kompozicije se mogu pripremiti mešanjem leka sa pogodnim neiritirajućim ekscipijentom koji je u čvrstom stanju na uobičajenim temperaturama ali tečan na rektalnoj temperaturi i stoga će se istopiti u rektumu kako bi oslobodio lek. Takvi materijali su kakao puter i polietilen glikoli.

[0103] Kompozicije za parenteralne primene se primenjuju u sterilnom medijumu. U zavisnosti od nosača koji se koristi i koncentracije leka leka u formulaciji, parenteralna formulacija može biti ili suspenzija ili rastvor koji sadrži rastvoren lek. Ađuvansi kao što su lokalni anestetici, konzervansi i agensi puferovanja mogu takođe biti dodati parenteralnim kompozicijama.

NAČINI UPOTREBE

[0104] Enzim MAT2A katališe sintezu S-adenozil metionina (SAM) iz metionina i ATP u ćelijama. Shodno tome, u sledećoj izvedbi predmetnog otkrića dat je metod inhibiranja u ćeliji sinteze SAM što obuhvata uvođenje u ćeliju efikasne količine jedinjenja Formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, stereoizomera, tautomera, i/ili izotopologa. U jednoj izvedbi, ćelija je u subjektu. U nekim izvedbama, jedinjenje Formule I se koristi za identifikovanje drugih jedinjenja koja su inhibitori MAT2A, na primer, u kompeticionom testu vezivanja za MAT2A ili za inhibiciju proizvodnje SAM. Vezivanje za MAT2A ili inhibicija proizvodnje SAM test jedinjenjem koje ima detektabilnu oznaku se može meriti sa ili bez prisustva neoznačenog jedinjenja predmetnog otkrića.

[0105] Predmetno otkriće takođe pruža metodu tretiranja kod subjekta koji boluju od raka, koja obuhvata primenu nad subjektom efikasne količine jedinjenja MAT2A inhibitora kao što je opisano u tekstu. U nekim izvedbama, inhibitor MAT2A je jedinjenje Formule I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U jednoj izvedbi, opciono u kombinaciji sa bilo kojom drugom izvedbom, subjekat je sisar, kao što je čovek.

[0106] U izvedbi, rak je rak sa deletovanim MTAP. U nekim izvedbama, rak je kao jedan izabran iz grupe koja se sastoji od mezotelioma, neuroblastoma, karcinoma creva kao što je karcinom rektuma, karcinom debelog creva, karcinom adenomatozne polipoze i nasledni nepolipozni kolorektalni rak, karcinom jednjaka, karcinom usana, karcinom larinksa, karcinom hipofarinksa, karcinom jezika, karcinom pljuvačne žlezde, karcinom želuca, adenokarcinom, medularni karcinom štitne žlezde, papilarni karcinom štitne žlezde, karcinom bubrega, karcinom parenhima bubrega, karcinom jajnika, karcinom grlića materice, karcinom korpusa materice, karcinom endometrijuma, karcinom horiona, karcinom pankreasa, karcinom prostate, karcinom mokraćne bešike, karcinom testisa, karcinom dojke, urinarni karcinom, melanom, karcinomi mozga, karcinom glave i vrata, limfom, akutna limfna leukemija (ALL), hronična limfna leukemija (CLL), akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična mijeloidna leukemija (CML), hepatocelularni karcinom, karcinom žučne kese, bronhijalni karcinom, sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC), nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), multipli mijelom (MM), bazaliom, teratom, retinoblastom, melanom horoideje, seminom, rabdomio sarkom, osteosarkom, hondrosarkom, miosarkom, liposarkom, fibrosarkom, Juingov sarkom i plazmocitom.

[0107] U drugim izvedbama, rak je izabran od raka pluća, nesitnoćelijskog raka pluća, raka pluća bronhioloalveolarnih ćelija, raka kostiju, raka pankreasa, raka kože, raka glave i vrata, kožnog ili intraokularnog melanoma, raka materice, raka jajnika, raka rektuma, raka analnog regiona, raka stomaka, raka želuca, raka debelog creva, raka dojke, raka materice, karcinoma jajovoda, karcinoma endometrijuma, karcinoma grlića materice, karcinoma vagine, karcinoma vulve, Hodžkinove bolesti, raka jednjaka, raka tankog creva, raka endokrinog sistema, raka štitne žlezde, raka paratiroidne žlezde, raka nadbubrežne žlezde, sarkoma mekog tkiva, raka uretre, raka penisa, raka prostate, raka bešike, raka bubrega ili uretre, karcinoma bubrežnih ćelija, karcinoma bubrežne karlice, mezotelioma, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma žuči, hronične ili akutne leukemije, limfocitnog limfoma, neoplazmi centralnog nervnog sistema (CNS), tumora osovine kičme, glioma moždanog stabla, glioblastoma multiforme, astrocitoma, švanoma, ependimoma, meduloblastoma, meningioma, karcinoma skvamoznih ćelija, adenoma hipofize, uključujući rezistentne i/ili refraktorne verzije bilo kog od prethodno pomenutih karcinoma, i kombinaciju jednog ili više karcinoma pomenutih u prethodnom tekstu.

[0108] U nekim izvedbama, rak je izabran iz grupe koja se sastoji od B-ćelijske akutne limfocitne leukemije (B-ALL), mezotelioma, limfoma, karcinoma pankreasa, raka pluća, raka želuca, raka jednjaka, karcinoma bešike, raka mozga, raka glave i vrata, melanoma i raka dojke.

[0109] U drugim izvedbama, rak pluća je nesitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, adenokarcinom pluća i karcinom pluća skvamoznih ćelija.

[0110] U drugim izvedbama rak dojke je trostruki negativni rak dojke (TNBC).

[0111] U drugim izvedbama, rak mozga je tumor mozga izabran iz grupe koja se sastoji od glioma, glioblastoma, astrocitoma, meningioma, meduloblastoma, perifernih neuroektodermalnih tumora i kraniofaringioma.

[0112] U nekim drugim izvedbama, rak je limfom izabran iz grupe koja se sastoji od limfoma mantle ćelije, Hodžkinovog limfoma, nehodžkinovog limfoma, Burkitovog limfoma, difuznog velikog B-ćelijskog limfoma (DLBCL) i limfom leukemije T ćelije kod odraslih (ATLL). Kao što je korišćeno u tekstu, ekspresija T-ćelijske leukemije/limfoma se odnosi na redak i često agresivan T-ćelijski limfom koji se može pronaći u krvi (leukemija), limfnim čvorovima (limfom), koži ili višestrukim oblastima tela.

[0113] Kao što je uopšteno opisano u prethodnom tekstu, metiltioadenozin fosforilaza (MTAP) je enzim koji se nalazi u svim normalnim tkivima koji katališe konverziju metiltioadenozina (MTA) u adenin i 5-metiltioriboza-1-fosfat. Adenin se spašava kako bi se generisao adenozin monofosfat, i 5-metiltioriboz-1-fosfat je konvertovan u metionin i format. Zbog ove putanje spasavanja, MTA može služiti kao alternativni izvor purina kada je de novo sinteza purina blokirana, na primer, sa antimetabolitima, kao što je L-alanozin. Mnogim ljudskim i mišjim malignim ćelijama nedostaje MTAP aktivnost. Nedostatak MTAP se ne pronalazi samo u ćelijama kulture tkiva već je deficijencija takođe prisutna u primarnim leukemijama, gliomima, melanomima, karcinomima pankreasa, nesitnoćelijskim karcinomima pluća (NSCLC), karcinomima bešike, astrocitomima, osteosarkomima, karcinomima glave i vrata, miksoidnim hondrosarkomima, karcinomima jajnika, endometrijalnim karcinomima, karcinomima dojke, sarkomima mekih tkiva, ne-hodžkinovim limfomima i mezoteliomima. Na primer, proliferacija ćelija raka koje su MTAP null, tj.,deletovan MTAP, je inhibirana obaranjem MAT2A ekspresije sa shRNK koji je potvrđen korišćenjem malih molekulskih inhibitora MAT2A. K. Marjon et al., Cell Reports 15 (2016) 574-587, inkorporirano u tekstu referencom. MTAP null ili rak sa deletovanim MTAP je rak kod kog je MTAP gen obrisan ili izgubljen ili na drugi način deaktiviran ili rak kod kog MTAP protein ima redukovanu ili oštećenu funkciju, ili redukovano prisustvo.

[0114] Shodno tome, u izvedbi predmetnog pronalaska je dat metod za tretiranje raka kod subjekta pri čemu rak je karakterisan redukcijom ili odsustvom MTAP ekspresije ili odsustvom MTAP gena ili redukovanom funkcijom MTAP proteina u poređenju sa kancerima gde je MTAP gen i/ili protein prisutan i potpuno funkcionalan, ili u poređenju sa kancerima sa divljim tipom MTAP gena. Metoda obuhvata primenu nad subjektom terapeutski efikasne količine jedinjenja Formule I ili njegovog farmaceutski prihvatljive soli, tautomera i/ili izotopologa.

[0115] U sledećoj izvedbi, data je metoda za tretiranje raka sa deletovanim MTAP kod subjekta, koja obuhvata primenu nad subjektom efikasne količine jedinjenja Formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U izvedbi, rak sa deletovanim MTAP je izabran od leukemije, glioma, melanoma, raka pankreasa, nesitnoćelijskog raka pluća (NSCLC), raka bešike, astrocitoma, osteosarkoma, raka glave i vrata, miksoidnog hondrosarkoma, raka jajnika, endometrijalnog raka, raka dojke, sarkoma mekih tkiva, limfoma i mezotelioma.

[0116] U izvedbi, rak sa deletovanim MTAP je rak pankreasa. U drugoj izvedbi, rak sa deletovanim MTAP je izabran od raka bešike, melanoma, raka mozga, raka pluća, raka pankreasa, raka dojke, raka jetre, raka jednjaka, raka želuca, raka debelog creva, raka glave i vrata, raka bubrega, raka debelog creva, difuznog velikog B ćelijskog limfoma (DLBCL), akutne limfoblastne leukemije (ALL), limfoma ćelija omotača (MCL), glioblastoma multiforme (GBM) i nesitnoćelijskog raka pluća (NSCLC).

[0117] Genomska analiza MTAP nultih ćelijskih linija je otkrila da su ćelijske linije koje sadrže KRAS mutaciju ili p53 mutaciju senzitivne na inhibiciju MAT2A. Shodno tome, izvedba predmetnog otkrića pruža metodu za tretiranje raka kod subjekta pri čemu rak je karakterisan redukcijom ili odsustvom MTAP ekspresije ili odsustvom MTAP gena ili redukovanom funkcijom MTAP proteina, metoda obuhvata primenu nad subjektom terapeutski efikasne količine jedinjenja Formule I, pri čemu pomenuti rak je dalje karakterisan prisustvom mutantnog KRAS ili mutantnog p53. U izvedbi, data je metoda tretiranja raka nultog MTAP koji ima mutantni KRAS ili mutantni p53 kod subjekta, koja obuhvata primenu nad subjektom efikasne količine jedinjenja Formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, tautomera i/ili izotopologa. Na primer, rak je MTAP nulti i KRAS mutant, MTAP nulti i p53 mutant, ili svaki, MTAP nulti, KRAS mutant i p53 mutant.

[0118] Pojam „mutantni KRAS“ ili „KRAS mutacija“ se odnosi na KRAS protein koji uključuje aktivirajuću mutaciju koja menja njegovu normalnu funkciju i gen koji kodira takav protein. Na primer, mutantni KRAS protein može inkorporirati pojedinačnu aminokiselinsku supstituciju na poziciji 12 ili 13. U određenoj izvedbi, KRAS mutant inkorporira G12X ili G13X supstituciju, pri čemu X predstavlja bilo koju aminokiselinsku promenu na naznačenoj poziciji. U konkretnoj izvedbi, supstitucija je G12V, G12R, G12C ili G13D. U sledećoj izvedbi, supstitucija je G13D. Pod “mutantnim p53” ili “p53 mutacijom” se podrazumeva p53 protein (ili gen koji kodira pomenuti protein) koji inkorporira mutaciju koja inhibira ili eliminiše njegovu funkciju supresora tumora. U izvedbi, pomenuta p53 mutacija je, Y126_splice, K132Q, M133K, R174fs, R175H, R196*, C238S, C242Y, G245S, R248W, R248Q, I255T, D259V, S261_splice, R267P, R273C, R282W, A159V ili R280K. U izvedbi, prethodno pomenuti rak je nesitnoćelijski rak pluća (NSCLC), rak pankreasa, rak glave i vrata, rak želuca, rak dojke, rak debelog creva ili rak jajnika.

[0119] U sledećoj izvedbi, jedinjenja objavljena u tekstu su korisna kao ligandi za degradaciju proteina povezanih sa bolešću. Primer ovakvog pristupa je PROTACs (PROteolysis TArgeting Chimeras). PROTAC su bifunkcionalni molekuli koji obuhvataju i ligand funkcionalnu grupu izabranu od jednog od ovde opisanih jedinjenja, koja je sposobna za vezivanje ciljnog proteina, i funkcionalnu grupu koja cilja ligazu, kao što je deo peptida (koji se naziva degron) koji je prepoznat i poliubikvitiniran pomoću E3 ligaze. Stoga, PROTAC se nekovalentno vezuje za ciljni protein, i regrutuje E3 ligazu preko degrona, što dovodi do poliubikvinacije i degradacije vezane mete. Brojne publikacije opisuju pretkliničku upotrebu PROTAC u različitim terapijskim oblastima uključujući onkologiju. Videti, na primer, Lu et al. Chemistry & Biology 22 (2015) 755-763.

PRIMERI

[0120] Predmetno otkriće će biti potpunije shvaćeno referencom na sledeće primere. Primere, ipak, ne treba tumačiti kao ograničavanje obima ovog otkrića.

[0121] Spisak jedinica i pojmova:

anhy. anhidrovano

aq. vodeno

min minut (i)

mL millilitar

mmol millimol (ovi)

mol mol (ovi)

MS spektrometrija mase

NMR nuklearna magnetna rezonanca

TLC tankoslojna hromatografija

HPLC tečna hromatografija visokih performansi

RT(r.t.) sobna temperatura

[0122] NMR spektar

Hz herc

δ hemijska smena

J konstanta kuplovanja

s singlet

d dublet

t triplet

q kvartet

m multiplet

br broad

qd kvartet dubleta

dquin dublet kvinteta

dd dublet dubleta

dt dublet tripleta

[0123] Rastvarači i reagensi:

CHCl3hloroform

DCM dihlorometan

DMF dimetilformamid

Et2O dietil etar

EtOH etil alkohol

EtOAc etil acetat

EA etil acetat

MeOH metil alkohol

MeCN acetonitril

PE petroleum etar

THF tetrahidrofuran

AcOH acetatna kiselina

HCl hlorovodonična kiselina

H2SO4sumporna kiselina

NH4Cl amonijum hlorid

KOH kalijum hidroksid

NaOH natrijum hidroksid

K2CO3kalijum karbonat

Na2CO3natrijum karbonat

TFA trifluoroacetatna kiselina

Na2SO4natrijum sulfat

NaBH4natrijum borohidrid

NaHCO3natrijum bikarbonat

LiHMDS litijum heksametildisililamid

NaHMDS natrijum heksametildisililamid

LAH litijum aluminijum hidrid

NaBH4natrijum borohidrid

LDA litijum diizopropilamid

Et3N trietilamin

DMAP 4-(dimetilamino)piridin

DIPEA N,N-diizopropiletilamin

NH4OH amonijum hidroksid

EDCI 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid

HOBt 1-hidroksibenzotriazol

HATU O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetra-metiluronijum

Xphos 2-Dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropilbifenil

BINAP 2,2’-bis(difenilfosfanil)-1,1’-binaftil

Opšti eksperimentalni

[0124] U sledećim primerima, reagensi i rastvarači su kupljeni od komercijalnih izvora (kao što su Alfa, Acros, Sigma Aldrich, TCI i Shanghai Chemical Reagent Company), i korišćeni bez daljeg prečišćavanja osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Sprovedena je fleš hromatografija na Ez Purifier III korišćenjem kolone sa česticama silika gela od 200-300 meš. Ploče za analitičku i preparativnu tankoslojnu hromatografiju (TLC) su HSGF 254 (0,15-0,2 mm debljina, Shanghai Anbang Company, China). Spektri nuklearne magnetne rezonance (NMR) su dobijeni na Brucker AMX-400 NMR (Brucker, Switzerland). Hemijska pomeranja su prijavljena u delovima na milion (ppm, δ) levo od tetrametilsilana. Maseni spektri su dati sa elektrosprej jonizacijom (ESI) sa Waters LCT TOF masenog spektrometra (Waters, USA). HPLC hromatografi su zabeleženi na Agilent 1200 Liquid Chromatography (Agilent, USA, kolona: Ultimate 4,6 mm x 50 mm, 5um, mobilna faza A: 0,1% metanske kiseline u vodi; mobilna faza B: acetonitril). Mikrotalanse reakcije su sprovedene na Initiator 2.5 Microwave Synthesizer (Biotage, Sweden).

Opšti postupak I:

[0125] Jedinjenja strukture 1.9, 1.11 i 1.12 su dobijena kroz šemu prikazanu kao Opšti postupak I. Počinje sa piridazinonom 1.1, elektrofilno bromovanje je korišćeno kako bi se generisao heterociklični bromid 1.2. Željena R3grupa je instalirana korišćenjem Chan-Lam kuplovanja kako bi se generisalo jedinjenje 1.3. U ovoj fazi, željene R4i R5grupe su instalirane korišćenjem ili Suzuki unakrsnog kuplovanja sa reagensom 1.4 (metoda A), ili Stille unakrsnim kuplovanjem sa reagensom 1.5 (metoda B). Dobijeni intermedijer 1.6 je zatim ciklizovan u željeno biciklično jezgro 1.7 pod bazičnim uslovima. Željena R2grupa je instalirana korišćenjem Suzuki unakrsnog kuplovanja kako bi se generisalo jedinjenje 1.8. Jedinjenje 1.8 je zatim alkilovano kako bi se instalirala željena R1grupa i obezbedila finalna jedinjenja strukture 1.9. Alternativno, jedinjenje 1.8 je hlorisano kako bi se dobio aril-hlorid 1.10, i željena R1je instalirana nukleofilnom aromatičnom supstitucijom kako bi se dobila finalna jedinjenja strukture 1.11 (metoda C). Alternativno, jedinjenje 1.8 je aktivirano korišćenjem BOP, i željena N-povezana R1je instalirana nukleofilnom aromatičnom supstitucijom kako bi se dobila finalna jedinjenja strukture 1.12 (metoda D).

Pripremanje Primera 101 Opštim postupkom I (metoda A):

[0126]

Korak A: 5-amino-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on

[0127] Suspenziji 5-amino-4-hloropiridazin-3(2H)-on (1,2 g, 8,2 mmol, 1,0 ekv.) i NaOAc (0,74 g, 9,1 mmol, 1,1 ekv.) u MeCN (40 mL) je špricem dodavan Br2(1,45 g, 9,1 mmol, 1,1 ekv.) na 80 °C tokom 5 minuta. Dobijena smeša je mešana na 80 °C dodatnih sat vremena. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, isparljive materije su uklonjene pod redukovanim pritiskom, razblaženo je sa ledenom H2O (20 mL), dobijen precipitat bele boje je filtriran, i filter kolač je prikupljen i isušen pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 5-amino-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on (1,48 g, 80% prinos) kao čvrsta supstanca bele boje. LC-MS (ESI): m/z 224, 226 [M+H]<+>.

Korak B: 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)piridazin-3(2H)-on

[0128] Suspenziji 5-amino-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on (590 mg, 2,63 mmol, 1,0 ekv.) u DMF (15 mL) su dodati (2-metil-2H-indazol-5-il)boronska kiselina (555 mg, 3,15 mmol, 1,2 ekv.), Cu(OAc)2(478 mg, 2,63 mmol, 1,0 ekv.) i piridin (422 uL, 5,26 mmol, 2,0 ekv.). Dobijena smeša je mešana na 50 °C (atmosfera vazduha) tokom 8 sati, i reakcija je praćena putem TLC. Nakon završetka, reakciona smeša je razblažena sa H2O (30 mL), dobijena suspenzija je mešana dodatnih 30 minuta, prikupljen je precipitat i ispran preko ledene H2O (30 mL x 3) i osušen pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)piridazin-3(2H)-on (770 mg, 82% prinos) kao sivo-bela čvrsta supstanca. LC-MS (ESI): m/z 354, 356 [M+H]<+>.

Korak C: etil (E)-3-(4-amino-5-hloro-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat

[0129] Rastvoru 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)piridazin-3(2H)-on (500 mg, 1,41 mmol, 1,0 ekv.) u DMF (10 mL) su dodati etil (E)-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)akrilat (350 mg, 1,55 mmol, 1,1 ekv.), Pd(dppf)Cl2(103 mg, 0,14 mmol, 0,1 ekv.) i K2CO3(389 mg, 2,82 mmol, 2,0 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 80 °C tokom 16 sati pod N2atmosferom. Reakciona smeša je sipana u ledenu vodu (30 mL) i ekstraktovana EtOAc (50 mL x 3). Spojeni organski slojevi su osušeni nad Na2SO4, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio etil (E)-3-(4-amino-5-hloro-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat (316 mg, 60% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 374 [M+H]<+>.

Korak D: 4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0130] Rastvoru etil (E)-3-(4-amino-5-hloro-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat (400 mg, 1,07 mmol, 1,0 ekv.) u EtOH (10 mL) je dodato K2CO3(295 mg, 2,14 mmol, 2,0 ekv.) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na 80°C tokom 3 sata. Zatim je dodata ledena voda (30 mL) i smeša je ekstraktovana sa EtOAc (30 mL x 3). Spojeni organski slojevi su osušeni sa Na2SO4, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-hloro-2-(2-metil-2Hindazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (319 mg, 85% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 328 [M+H]<+>.

Korak E: 4-(4-hlorofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0131] Rastvor 4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (1 g, 3,05 mmol, 1,0 ekv.), (4-hlorofenil)boronska kiselina (954 mg, 6,1 mmol, 2,0 ekv.), Pd(OAc)2(68 mg, 0,3 mmol, 0,1 ekv.), S-Fos (251 mg, 0,61 mmol, 0,2 ekv.) i K2CO3(1,26 g, 9,15 mmol, 3,0 ekv.) u dioksanu/H2O (110 mL, 10/1, v/v) je mešan na 110°C pod N2atmosferom tokom 2 sata. Dodata je ledena voda (30 mL) i smeša je ekstraktovana sa EtOAc (30 mL x 3), spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(4-hlorofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (700 mg, 57% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS: m/z 404 [M+H]<+>.

Korak F: 4-(4-hlorofenil)-6-(ciklopropilmetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0132] Rastvor 4-(4-hlorofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (200 mg, 0,495 mmol, 1,0 ekv.), (bromometil)ciklopropan (0,2 mL, 2,0 mmol, 4,0 ekv.), Cs2CO3(484 mg, 1,5 mmol, 3,0 ekv.) u DMF (3 mL) je mešan na sobnoj temperaturi 16 sati. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i dobijen ostatak je prečišćen preparativnom HPLC kako bi se dobio 4-(4-hlorofenil)-6-(ciklopropilmetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 101).

[0133]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,55 (s, 1H), 8,07 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,51 (dd, J = 9,2 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,28 (s, 3H), 4,21 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 1,36-1,19 (m, 1H), 0,64-0,57 (m, 2H), 0,37-0,33 (m, 2H),

[0134] LC-MS (ESI): m/z 458 [M+H]<+>

Pripremanje Primera 102 Opštim postupkom I (metoda B):

[0135]

Korak C: 4-hloro-6-hidroksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-8-(trifluorometil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0136] Rastvor 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)piridazin-3(2H)-on (1 g, 2,8 mmol, 1,0 ekv.), etil (Z)-4,4,4-trifluoro-3-(tributilstanil)but-2-enoat (ref: Synlett, 2012, 23, 755-759) (2,6 g, 5,6 mmol, 2,0 ekv.), Pd(PPh3)4(655 mg, 0,567 mmol, 0,2 ekv.) i CuI (216 mg, 1,13 mmol, 0,4 ekv.) u DMF (10 mL) pod N2atmosferom je mešan na 100 °C tokom 16 sati. Reakciona smeša je ugašena sa CsF (zasićeno vodeno) (30 mL) i mešana tokom dodatnih 30 minuta, dobijena suspenzija je filtrirana, precipitat je sakupljen i trituriran sa EtOAc (20 mL) kako bi se dobio 4-hloro-6-hidroksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-8-(trifluorometil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (800 mg, 71% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 396 [M+H]<+>.

[0137] 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-8-(trifluorometil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 102) je sintetisan od 2-(4-(difluorometoksi)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan i 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonat pomoću opšteg postupka I (Korak E, F).

[0138]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,56 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 7,87 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 9,2 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,38 (t, JHF = 73,6 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,43 (tt, JHF = 54,0 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 4,63 (td, JHF = 14,8 Hz, J = 2,8 Hz, 2H), 4,25 (s, 3H).

[0139] LC-MS (ESI): m/z 568 [M+H]<+>.

Pripremanje Primera 103 pomoću opšte procedure I (metoda C):

[0140]

Korak G: 6-hloro-4-(4-hlorofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0141] Rastvor 4-(4-hlorofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (100 mg, 0,284 mmol 1,0 ekv.) u POCl3(5 mL) je mešan na 80°C tokom 2 sata. Višak POCl3je uklonjen pod redukovanim pritiskom i ostatak je sipan u ledom ohlađen NaHCOs (zasićen vodeni) (10 mL) pažljivo, dobijena smeša je ekstraktovana sa DCM (10 mL x 3), spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (10 mL) i osušeni preko Na2SO4, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-hloro-4-(4-hlorofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (60 mg, 57% prinos) kao čvrsta supstanca crvene boje. LC-MS (ESI): m/z 422 [M+H]<+>.

Korak H: 4-(4-hlorofenil)-6-(etilamino)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0142] Rastvor 6-hloro-4-(4-hlorofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (60 mg, 0,142 mmol, 1,0 ekv.), etilamine hidrohlorid (58 mg, 0,71 mmol, 5,0 ekv.), CsF (108 mg, 0,71 mmol 5,0 ekv.) i DIPEA (92 mg, 0,71 mmol, 5,0 ekv.) u THF (3 mL) je mešan na sobnoj temperaturi 16 sati. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, sirov ostatak je prečišćen preparativnom HPLC kako bi se dobio 4-(4-hlorofenil)-6-(etilamino)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 103).

[0143]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,46 (s, 1H), 8,34 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 7,94 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,67 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,45-7,40 (m, 3H), 6,79 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 4,22 (s, 3H), 3,37-3,30 (m, 2H), 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

[0144] LC-MS (ESI): m/z 431 [M+H]<+>.

Pripremanje Primera 301 pomoću opšte procedure I (metoda D):

Korak I: 2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-4-(6-metilpiridin-3-il)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 301)

[0146] Rastvoru 6-hidroksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-4-(6-metilpiridin-3-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (100 mg, 0,26 mmol, 1,0 ekv.), BOP (173 mg, 0,39 mmol, 1,5 ekv.), u DMF(5 mL) je dodato DIEA (0,13 mL, 0,78 mmol, 3,0 ekv.). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta nakon čega je dodat 2,2,2-trifluoroetan-1-amin (0,06 mL, 0,78 mmol, 3,0 ekv.) i mešana je dodatna 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon kompletiranja, reakcija je ugašena dodavanjem ledene vode (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3), osušena preko Na2SO4i koncentrovana pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-4-(6-metilpiridin-3-il)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 301).

[0147]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,86 (s, 1H), 8,80 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,02 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,77 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 4,30-4,22 (m, 2H), 4,21 (s, 3H), 2,51 (s, 3H).

[0148] LC-MS (ESI): m/z 466 [M+H]<+>.

[0149] Prethodno navedena procedura za Opštu proceduru I (metoda A) je korišćena za sintetisanje sledećih jedinjenja korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala:

[0150] Prethodno navedena procedura za Opštu proceduru I (metoda C) je korišćena za sintetisanje sledećih jedinjenja korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala:

[0151] Prethodno navedena procedura za Opštu proceduru I (metoda D) je korišćena za sintetisanje sledećih jedinjenja korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala:

Sinteza intermedijera (6-(metil-d3)piridin-3-il)boronska kiselina:

Korak A: 5-metoksi-2-(metil-d3)piridin

[0153] Rastvoru 2-bromo-5-metoksipiridin (7 g, 37,2 mmol, 1,0 ekv.) i Fe(acac)3(1,31 g, 3,71 mmol, 0,1 ekv.) u anhidrovanom THF (70 mL) je ukapavanjem dodato CD3MgI (1 M u THF) (93 mL, 93 mmol, 2,5 ekv.) na 0°C pod atmosferom N2, dobijena smeša je mešana 3 sata na 0 °C. Nakon kompletiranja, reakcija je ugašena dodavanjem NH4Cl (zasićeni vodeni) (200 mL), zatim ekstraktovana sa EtOAc (70 mL x 3), spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (100 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 5-metoksi-2-(metil-d3)piridin (4 g, 85%) kao bezbojno ulje. LC-MS (ESI):m/z 127 [M+H]<+>.

Korak B: 6-(metil-d3)piridin-3-ol

[0154] Rastvoru 5-metoksi-2-(metil-d3)piridin (1,6 g, 12,6 mmol, 1,0 ekv.) u suvom toluenu (20 mL) je dodato L-Selektrid (1 M u THF) (37,8 mL, 37,8 mmol, 3,0 ekv.) ukapavanjem pomoću spuštajućeg levka na 0 °C, nakon dodavanja, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu nakon čega je postavljena u prethodno zagrejanu uljanu kupku (110 °C) mešano dodatna 3 sata. Nakon kompletiranja, reakcija je ohlađena na 0 °C ponovo, ugašena pažljivim dodavanjem MeOH (10 mL), dobijena smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-(metil-d3)piridin-3-ol (1,2 g, 84,3%) kao bledo žuta čvrsta supstanca. LC-MS (ESI):m/z 113 [M+H]<+>.

Korak C: 6-(metil-d3)piridin-3-il trifluorometansulfonat

[0155] Rastvoru 6-(metil-d3)piridin-3-ol (500 mg, 4,46 mmol, 1,0 ekv.) i piridin (0,54 mL, 6,69 mmol, 1,5 ekv.) u suvom DCM (10 mL), je ukapavanjem pomoću šprica dodat triflični anhidrid (1,13 mL, 6,69 mmol, 1,5 ekv.) na 0 °C. Dobijena smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu i mešana dodatna 2 sata. Nakon završetka, reakcija je ugašena dodavanjem H2O (20 mL), zatim ekstraktovana sa EtOAc (20 mL x 3), spojeni organski slojevi su isprani sa razblaženim HCl (0,5 N, vodeni) (20 mL), slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-(metil-d3)piridin-3-il trifluorometansulfonat (1,0 g, 91%) kao bezbojno ulje. LC-MS (ESI): m/z 245 [M+H]<+>.

Korak D: (6-(metil-d3)piridin-3-il)boronska kiselina

[0156] Rastvoru 6-(metil-d3)piridin-3-il trifluorometansulfonat (1,0 g, 4,09 mmol, 1,0 ekv.) u suvom 1,4-dioksanu (10 ml), su dodati bis(pinakolato)diboron (2,08 g, 8,2 mmol, 2,0 ekv.), KOAc (1,6 g, 16,4 mmol, 4,0 ekv.) i Pd(dppf)Cl2(300 mg, 0,41 mmol, 0,1 ekv.). Dobijena smeša je mešana na 100°C pod atmosferom N2tokom 16 sati. Nakon završetka, sirova smeša je filtrirana kroz kratko jastuče Celite®, filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio (6-(metil-d3)piridin-3-il)boronska kiselina (460 mg, 80%). LCMS (ESI): m/z 141 [M+H]<+>.

Opšta procedura II:

[0157] Jedinjenja strukture 2.8 i 2.11 su dobijena preko šeme prikazane kao Opšta procedura II. Počevši sa piridazinonom 2.1, heterocikl je benziliran kako bi se generisalo jedinjenje 2.2. Željene R4i R5grupe su uvedene korišćenjem Suzuki unakrsnog kuplovanja kako bi se dobila jedinjenja strukture 2.3. Jedinjenje 2.3 je zatim ciklizovano pod bazičnim uslovima kako bi se generisalo biciklično jedinjenje 2.4. Željena R2grupa je uvedena korišćenjem Suzuki kuplovanja kako bi se generisalo jedinjenje 2.5. Jedinjenje 2.5 je zatim hlorisano kako bi se generisao aril-hlorid 2.6. Željena R1grupa je uvedena putem nukleofilne aromatične supstitucije, koja je istovremeno debenzilovala heterociklično jezgro kako bi se generisalo jedinjenje 2.7. Na kraju, željena R3grupa je uvedena korišćenjem Ullmann kuplovanja (metoda A) ili Chan-Lam kuplovanja (metoda B) da bi se dobila jedinjenja strukture 2.8. Alternativno, jedinjenje 2.5 bi se moglo aktivirati sa BOP i reagovati sa željenim Ri-aminom da bi se dobio heterocikl 2.9 (metoda C). Benzil grupa je uklonjena korišćenjem t-BuOK da bi se dobio heterocikl 2.10 i željena R3grupa je uvedena korišćenjem Ullmann kuplovanja kako bi se dobila jedinjenja strukture 2.11.

Opšta procedura Ila (metoda C):

[0159] Opšta procedura Ila (metoda C) je kasnije razvijena korišćenjem PMB kao alternativne zaštitne grupe za Bn zaštitnu grupu prikazanu u Opštoj proceduri II (metoda C). Uklanjanje zaštite heterocikla 2.16 u kiselim uslovima je dovelo do konvergentne sinteze jedinjenja struktura 2.11.

Pripremanje Primera 166 putem Opšte procedure II (metoda A):

Korak A: 5-amino-2-benzil-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on

[0161] Rastvoru 5-amino-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on (3 g, 13,4 mmol, 1,0 ekv.), K2CO3(3,7 g, 26,8 mmol, 2,0 ekv.) u DMF (50 mL) je dodato BnBr (2,5 g, 14,7 mmol, 1,1 ekv.), reakciona smeša je mešana na 80 °C tokom noći. Reakciona smeša je razblažena vodom (50 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (50 mL x 3), spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 5-amino-2-benzil-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on kao čvrsta supstanca bele boje (2,46 g, 59% prinos). LC-MS (ESI) m/z 314, 316 [M+H]<+>.

Korak B: etil (E)-3-(4-amino-1-benzil-5-hloro-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat

[0162] Rastvoru 5-amino-2-benzil-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on (2,46 g, 7,8 mmol, 1,0 ekv.), K2CO3(2,2 g, 15,6 mmol, 2,0 ekv.), etil (E)-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)akrilat (1,94 g, 8,6 mmol, 1,1 ekv.) u DMF (40 mL) je dodato Pd(dppf)Cl2(0,57 g, 0,8 mmol, 0,1 ekv.) pod atmosferom N2, reakciona smeša je mešana na 100°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je razblažena sa H2O (50 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (50 mL x 3), spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio etil (E)-3-(4-amino-1-benzil-5-hloro-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat kao čvrsta supstanca braon boje (1,89 g, 71% prinos). LC-MS (ESI): m/z 334 [M+H]<+>.

Korak C: 2-benzil-4-hloropirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0163] Mešanom rastvoru etil (E)-3-(4-amino-1-benzil-5-hloro-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat (1,89 g, 5,66 mmol, 1,0 ekv.) u EtOH (20 mL) je dodato K2CO3(2,34 g, 16,98 mmol, 3,0 ekv.), reakciona smeša je mešana na 80°C tokom noći. Reakciona smeša je razblažena vodom (30 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (30 mL x 3), spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov 2-benzil-4-hloropirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion kao čvrsta supstanca braon boje (1,5 g), koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS (ESI): m/z 288 [M+H]<+>.

Korak D: 2-benzil-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0164] Mešanom rastvoru 2-benzil-4-hloropirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (1,5 g, 5,2 mmol, 1,0 ekv.), 2-(4-(difluorometoksi)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (2 g, 7,2 mmol, 1,4 ekv.), K2CO3(1,54 g, 11,1 mmol, 2,1 ekv.), X-Phos (0,52 g, 1,1 mmol, 0,2 ekv.) u dioksan/H2O smeši (88 mL, 10/1, v/v) je dodato Pd(OAc)2(0,12 g, 0,55 mmol, 0,1 ekv.) pod atmosferom N2. Reakciona smeša je mešana na 110°C tokom noći. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, prečišćena kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 2-benzil-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (1,4 g, 68% prinos) kao čvrsta supstanca bele boje. LC-MS (ESI): m/z 396 [M+H]<+>.

Korak E: 2-benzil-6-hloro-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0165] 2-benzil-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (400 mg, 1,01 mmol, 1,0 ekv.) je rastvoren u POCl3(4 mL), dobijena smeša je mešana na 80°C tokom 4 sata. Višak POCl3je uklonjen pod redukovanim pritiskom i ostatak je sipan na ledom hlađeni NaHCOs (zasićen vodeni) (20 mL) i ekstraktovan sa DCM (30 mL x 3), spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov 2-benzil-6-hloro-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on, kao čvrsta supstanca žute boje (400 mg, 95% prinos). LC-MS (ESI): m/z 414 [M+H]<+>.

Korak F: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0166] Rastvoru 2-benzil-6-hloro-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (400 mg, 0,97 mmol, 1,0 ekv.), 2,2-difluoroetan-1-ol (396 mg, 4,8 mmol, 5,0 ekv.) u anhidrovanom THF (8 mL) je u nekoliko porcija dodat t-BuOK (541 mg, 4,8 mmol, 5,0 ekv.) na 0°C. Nakon dodavanja, reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Reakciona smeša je razblažena sa H2O (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (30 mL x 3), spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on kao čvrsta supstanca žute boje (150 mg, 42% prinos). LC-MS (ESI): m/z 370 [M+H]<+>.

Korak G: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2,3-dimetil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (metoda A)

[0167] Mešanoj suspenziji 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (70 mg, 0,19 mmol, 1,0 ekv.) u MeCN (3 mL) su dodati 5-bromo-2,3-dimetil-2H-indazol (64,0 mg, 0,28 mmol, 1,5 ekv.), CuI (36,2 mg, 0,19 mmol, 1,0 ekv.), N1,N2-dimetilcikloheksan-1,2-diamin (26,9 mg, 0,19 mmol, 1,0 ekv.) i CsF (57,6 mg, 0,38 mmol, 2,0 ekv.). Reakcija je mešana u zatvorenoj tubi na 85°C tokom noći pod atmosferom N2i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2,3-dimetil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 166).

[0168]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,07 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 7,98 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,42 (dd, J = 9,1 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,35 (t, JHF = 72,0 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,06 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 6,41 (tt, JHF = 54,4 Hz, J = 3,3 Hz, 1H), 4,59 (td, JHF = 15,1 Hz, J = 3,3 Hz, 2H), 4,10 (s, 3H), 2,64 (s, 3H).

[0169] LC-MS (ESI): m/z 514 [M+H]<+>.

Pripremanje Primera 167 pomoću Opšte procedure II (metoda B):

Korak G: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(1-metil-1H-benzo[d]imidazol-6-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (metoda B)

[0171] Suspenziji 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (70 mg, 0,19 mmol, 1,0 ekv.) u DMF (5 mL) su dodati 1-metil-1H-benzo[d]imidazol-6-ilboronska kiselina (33,4 mg, 0,23 mmol, 1,2 ekv.), Cu(OAc)2(34,5 mg, 0,19 mmol, 1,0 ekv.) i piridin (30,0 mg, 0,38 mmol, 2,0 ekv.). Nakon što je smeša mešana na 50 °C tokom noći pod atmosferom vazduha, reakciona smeša je ugašena dodavanjem H2O (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski sloj je osušen preko anhidrovanog Na2SO4i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(1-metil-1H-benzo[d]imidazol-6-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 167).

[0172]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,34 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,79 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,47 (dd, J = 8,6 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,35 (t, JHF= 72,0 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,07 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 6,41 (tt, JHF= 54,4 Hz, 3,3 Hz, 1H), 4,60 (td, JHF= 15,1 Hz, 3,3 Hz, 2H), 3,88 (s, 3H).

[0173] LC-MS (ESI): m/z 500 [M+H]<+>.

Pripremanje Primera 321 pomoću Opšte procedure II (metoda C):

Korak H Korak I

Korak J

Korak H: 2-benzil-4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0175] Rastvoru 2-benzil-4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (250 mg, 0,66 mmol, 1,0 ekv.) u DMF (2 mL) su dodati BOP (436 mg, 0,99 mmol, 1,5 ekv.) i DIEA (584 uL, 3,29 mmol, 5,0 ekv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi sat vremena nakon čega je dodat etilamin-ds hidrohlorid (86 mg, 0,99 mmol, 1,5 ekv.). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi još dodatna pola sata. Nakon završetka, reakcija je ugašena dodavanjem ledene vode (10 mL) i ekstraktovana EtOAc (10 mL x 3), osušena preko Na2SO4i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)piridopiridazin-3(2H)-on (234 mg, 86%) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 413 [M+H]<+>.

Korak I: 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0176] Rastvoru 2-benzil-4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)piridopiridazin-3(2H)-on (185 mg, 0,45 mmol, 1,0 ekv.) u THF/DMF (2 mL, 1/1) je dodato t-BuOK (251 mg, 2,25 mmol, 5,0 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 70 °C tokom 8 sati. Nakon završetka, pH je prilagođena na ~7 dodavanjem 1 N HCl (vodeni), nakon čega je smeša ekstraktovana sa DCM (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL) i osušeni preko Na2SO4, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kako bi se dobio 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)piridopiridazin-3(2H)-on (50 mg) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 323 [M+H]<+>.’

Korak J: 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)-2-(2-(metil-d3)-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0177] Rastvoru 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)piridopiridazin-3(2H)-on (50 mg, 0,16 mmol, 1,0 ekv.) i 5-bromo-2-(metil-d3)-2H-indazol (50 mg, 0,23 mmol, 1,5 ekv.) u ACN (1 mL) su dodati CuI (30 mg, 0,16 mmol, 1,0 ekv.), CsF (47 mg, 0,31 mmol, 2,0 ekv.), N1,N2-dimetilcikloheksan-1,2-diamin (22 mg, 0,16 mmol, 1,0 ekv.). Dobijena smeša je mešana na 85°C tokom 14 sati. Nakon završetka, reakciona smeša je razblažena sa H2O (5 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL) i osušeni nad Na2SO4, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, ostatak je prečišćen RP preparativne HPLC kako bi se dobio 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((etil-d5)amino)-2-(2-(metil-d3)-2H-indazol-5-il)piridopiridazin-3(2H)-on (Primer 321).

[0178]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9,06 (s, 1H), 8,46 (d, J = 2,6 Hz, 2H), 8,39 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,73 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 7,66 (dd, J= 11,5, 9,4 Hz, 2H), 7,42 (dd, J = 9,2, 1,9 Hz, 1H), 6,99 (t, J = 55,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 9,6 Hz, 1H).

[0179] LC-MS (ESI): m/z 456 [M+H]<+>.

Pripremanje Primera 322 pomoću Opšte procedure Ila (metoda C):

[0180]

Korak A: 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(4-metoksibenzil)piridazin-3(2H)-on

[0181] Rastvoru 5-amino-6-bromo-4-hloropiridazin-3(2H)-on (2,0 g, 8,91 mmol, 1,0 ekv.) i K2CO3(2,5 g, 17,8 mmol, 2,0 ekv.) u DMF (20 mL) je dodato PMBCl (1,3 mL, 9,8 mmol, 1,1 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 80°C tokom 14 sati. Nakon završetka, reakciona smeša je razblažena vodom (50 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (50 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(4-metoksibenzil)piridazin-3(2H)-on (2,0 g, 45%) kao čvrsta supstanca bele boje. LC-MS (ESI): m/z 344 [M+H]<+>.

Korak B: etil (E)-3-(4-amino-5-hloro-1-(4-metoksibenzil)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat

[0182] Rastvoru 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(4-metoksibenzil)piridazin-3(2H)-on (2,0 g, 5,8 mmol, 1,0 ekv.), K2CO3(2,0 g, 14,5 mmol, 2,5 ekv.) i etil (E)-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)akrilat (1,44 g, 6,4 mmol, 1,1 ekv.) u DMF (20 mL) je dodato Pd(dppf)Cl2(0,43 g, 0,6 mmol, 0,1 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 100°C pod atmosferom N2tokom 5 sati. Reakciona smeša je razblažena sa H2O (30 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (50 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (40 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio etil (E)-3-(4-amino-5-hloro-1-(4-metoksibenzil)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat kao čvrsta supstanca braon boje (1,4 g, 53%). LC-MS (ESI): m/z 364 [M+H]<+>.

Korak C: 4-hloro-2-(4-metoksibenzil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0183] Mešanom rastvoru etil (E)-3-(4-amino-5-hloro-1-(4-metoksibenzil)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-il)akrilat (1,4 g, 3,85 mmol, 1,0 ekv.) u EtOH (20 mL) je dodato K2CO3(1,6 g, 11,54 mmol, 3,0 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 80 °C tokom 14 sati. Reakciona smeša je razblažena vodom (30 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (30 mL x 3). Spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov 4-hloro-2-(4-metoksibenzil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (0,6 g, sirov) kao čvrsta supstanca braon boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LC-MS (ESI): m/z 318 [M+H]<+>.

Korak D: 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-metoksibenzil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0184] Rastvoru 4-hloro-2-(4-metoksibenzil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (0,2 g, 0,63 mmol, 1,0 ekv.), 2-(4-(difluorometoksi)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (152 mg, 0,88 mmol, 1,4 ekv.), K2CO3(217 mg, 1,57 mmol, 2,5 ekv.) i X-Phos (33 mg, 0,06 mmol, 0,1 ekv.) u 1,4-dioksan/H2O smeši (8 mL, 10/1, v/v) je dodato Pd(OAc)2(15 mg, 0,06 mmol, 0,1 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 110°C tokom noći pod atmosferom N2. Nakon završetka, reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-metoksibenzil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (120mg, 46%) kao čvrsta supstanca bele boje. LC-MS (ESI): m/z 411 [M+H]<+>.

Korak E: 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-metoksibenzil)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0185] Rastvoru 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-metoksibenzil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (100 mg, 0,24 mmol, 1,0 ekv.) u DMF (2 mL) su dodati BOP (180 mg, 0,36 mmol, 1,5 ekv.) i DIEA (157 mg, 1,22 mmol, 5,0 ekv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi sat vremena nakon čega je dodat 2,2,2-trifluoroetan-1-amin (36 mg, 0,36 mmol, 1,5 ekv.). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi dodatnih pola sata. Nakon završetka, reakcija je ugašena dodavanjem ledene vode (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3), osušena preko Na2SO4i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-metoksibenzil)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (80 mg, 67%) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 492 [M+H]<+>.

Korak F: 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0186] Rastvoru 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-metoksibenzil)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (80 mg, 0,16 mmol, 1,0 ekv.) u TFA (2 mL) su dodati TfOH (142 uL, 1,6 mmol, 10,0 ekv.) i Et3SiH (128 uL, 0,8 mmol, 5,0 ekv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata. Nakon završetka, reakcija je ugašena sa 10 mL NaHCO3(zasićen vodeni) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL) i osušeni preko Na2SO4, koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (40 mg, 66 %) kao čvrsta supstanca žute boje.

LC-MS (ESI): m/z 372 [M+H]<+>.

Korak G: 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-(metoksi-d3)fenil)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 322)

[0187] 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-2-(4-(metoksi-d3)fenil)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 322) je sintetisan iz 4-(6-(difluorometil)piridin-3-il)-6-((2,2,2-trifluoroetil)amino)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona & 1-bromo-4-(metoksid3)benzena pomoću Opšte procedure II (metoda C, korak J).

[0188]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,98 (s, 1H), 8,93 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 8,30 (dd, J= 8,0 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,79 (d, J= 9,5 Hz, 1H), 7,73 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 7,59-7,53 (m, 2H), 7,09-7,04 (m, 2H), 7,00 (t, JHF= 56,0 Hz, 1H), 6,93 (d, J= 9,5 Hz, 1H), 4,23-4,15 (m, 2H).

[0189] LC-MS (ESI): m/z 481 [M+H]<+>.

[0190] Prethodno navedena procedura za Opštu proceduru II (metoda A) je korišćena za sintetisanje sledećih jedinjenja

korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala:

[0191] Prethodno navedena procedura za Opštu proceduru II (metoda B) je korišćenja za sintetisanje sledećih jedinjenja korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala:

[0192] Prethodno navedena procedura za Opštu proceduru II (metoda C) je korišćena za sintetisanje sledećih jedinjenja

korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala:

Opšta procedura III:

[0193] Jedinjenja strukture 3.6 su dobijena preko šeme prikazane kao Opšta procedura III. Počinje sa supstituisanim piridazinonom 3.1 (sintetisan preko Opšte procedure I (koraci A-B)), željena R4grupa je uvedena korišćenjem Suzuki unakrsnog kuplovanja da bi se generisalo vinil jedinjenje 3.2. Dvostruka veza u 3.2 je zatim oksidovana da bi se dobio karbonil 3.3. Željena R2grupa je uvedena korišćenjem Suzuki unakrsnog kuplovanja kako bi se generisalo jedinjenje 3.4. Željena R5grupa je uvedena korišćenjem olefinacije Homer-Wadsworth-Emmons, što je dovelo do generisanja bicikličnog heterocikla nakon tandemske, intramolekularne ciklizacije. Na kraju, željena R1grupa je uvedena reakcijom alkilacije da bi se dobila jedinjenja strukture 3.6. Pripremanje Primera 194 putem Opšte procedure III:

[0194]

Korak A: 5-amino-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-vinilpiridazin-3(2H)-on

[0195] Rastvor 5-amino-6-bromo-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)piridazin-3(2H)-on (2 g, 5,67 mmol, 1,0 ekv., Opšta procedura I, (koraci A-B)), 4,4,5,5-tetrametil-2-vinil-1,3,2-dioksaborolan (1,738 g, 11,34 mmol, 2,0 ekv.), Pd(dppf)Cl2(0,826 g,1,13 mmol, 0,2 ekv.), K2CO3(2,336 g, 16,99 mmol, 3,0 ekv.) u dioksan/EtOH (48 mL, 3/1, v/v) pod N2atmosferom je mešan na 80 °C tokom 16 sati. Reakciona smeša je filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 5-amino-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-vinilpiridazin-3(2H)-on (1,02 g, 60% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 302 [M+H]<+>.

Korak B: 4-amino-5-hloro-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-karbaldehid

[0196] Rastvor 5-amino-4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-vinilpiridazin-3(2H)-on (1,6 g, 5,3 mmol, 1,0 ekv.), NaIO4(3,4 g, 15,9 mmol, 3,0 ekv.) i K2OSO4-2H2O (98 mg, 0,26 mmol, 0,05 ekv.) u THF/H2O (20 mL, 3:1) je mešan na sobnoj temperaturi 3 sata, i dobijena smeša je filtrirana i ekstraktovana sa DCM (50 mL x 3). Filtrat je ispran slanim rastvorom (30 mL) i spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-amino-5-hloro-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-karbaldehid kao čvrsta supstanca bele boje (1 g, 62% prinos). LCMS (ESI): m/z 304 [M+H]<+>.

Korak C: 4-amino-5-(4-(difluorometoksi)fenil)-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-karbaldehid

[0197] Rastvor 4-amino-5-hloro-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-karbaldehid (650 mg, 2,15 mmol, 1,0 ekv.), 2-(4-(difluorometoksi)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (934 mg, 3,46 mmol, 1,6 ekv.), Pd(OAc)2(52 mg, 0,215 mmol, 0,1 ekv.), X-Phos (205 mg, 0,43 mmol, 0,2 ekv.), K2CO3(594 mg, 4,3 mmol, 2,0 ekv.) u dioksan/H2O (11 mL, 10/1, v/v) je mešan na 110 °C pod atmosferom N2tokom 3 sata. Dodata je H2O i dobijena smeša je ekstraktovana sa EtOAc (30 mL x 3). Spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-amino-5-(4-(difluorometoksi)fenil)-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-karbaldehid (650 mg, 69% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 412 [M+H]<+>.

Korak D: 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-7-fluoro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0198] Suspenziji 4-amino-5-(4-(difluorometoksi)fenil)-1-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-okso-1,6-dihidropiridazin-3-karbaldehid (150 mg, 0,36 mmol, 1,0 ekv.) i etil 2-(dietoksifosforil)-2-fluoroacetat (132 mg, 0,55 mmol, 1,5 ekv.) u MeCN (5 mL) je iz nekoliko porcija dodat NaH (30% suspendovano u mineralnom ulju, 175 mg, 2,19 mmol, 6,0 ekv.) na 0°C pod atmosferom N2. Nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom noći, dobijena smeša je sipana na ledom ohlađeni NH4Cl (zasićen vodeni) (10 mL), zatim ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL) i osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-7-fluoro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (120 mg, 73% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 454 [M+H]<+>.

[0199] 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-7-fluoro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 194) je sintetisan iz 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-7-fluoro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona i 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonata pomoću slične procedure opisane u Opštoj proceduri I (korak F).

[0200]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,56 (s, 1H), 8,10 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 9,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,41 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 6,50 (tt, JHF= 54,0 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,71 (td, JHF= 15,2 Hz, J = 3,2 Hz, 2H), 4,28 (s, 3H).

[0201] LC-MS (ESI): m/z 518 [M+H]<+>.

[0202] Prethodno navedena procedura za Opštu proceduru III je korišćena za sintetisanje sledećih jedinjenja korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala:

Sinteza 4-(4-bromofenil)-6-etoksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 198)

Korak A: 4-(4-aminofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0204] Rastvor terc-butil (4-(2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3,6-diokso-2,3,5,6-tetrahidropirido[3,2-c]piridazin-4-il)fenil)karbamat (sintetisan iz 4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona & (4-((terc butoksikarbonil)amino)fenil)boronske kiseline pomoću Opšte procedure I (metoda A, korak E)) (180 mg, 0,372 mmol) u TFA/DCM (1 mL/5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi sat vremena. Reakciona smeša je ekstraktovana sa EtOAc (20 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(4-aminofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (116 mg, 79% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 385 [M+H]<+>.

Korak B: 4-(4-bromofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion

[0205] Rastvoru 4-(4-aminofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion (200 mg, 0,52 mmol, 1,0 ekv.) i CuBr (299 mg, 2,08 mmol, 4,0 ekv.) u ACN (10 mL) je ukapavanjem tokom 10 minuta dodavan terc-butil nitrit (215 mg, 2,08 mmol, 4,0 ekv.) na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 4 sata. Dobijena smeša je ugašena sa Na2SO3(zasićen vodeni) (20 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-(4-bromofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-dion kao čvrsta supstanca žute boje (70 mg, 30% prinos). LC-MS (ESI): m/z 448 [M+H]<+>.

Korak C:

[0206] 4-(4-Bromofenil)-6-etoksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 198) je sintetisan iz 4-(4-bromofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona & jodoetana putem Opšte procedure I (metoda A, korak F).

[0207]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,49 (s, 1H), 8,00 (d, J= 1,6 Hz, 1H), 7,97 (d, J= 9,6 Hz, 1H), 7,75 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,70 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,45 (dd, J= 8,8 Hz, 1,6 Hz, 1H), 6,95 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 4,33 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H), 1,32 (t, J= 7,2 Hz, 3H).

[0208] LC-MS (ESI): m/z 476, 478 [M+H]<+>.

Sinteza 4-(4-bromofenil)-6-izopropoksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 199)

[0209]

[0210] 4-(4-Bromofenil)-6-izopropoksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 199) je sintetisan iz 4-(4-bromofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona & 2-jodopropana pomoću Opšte procedure I (metoda A, korak F).

[0211]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,49 (s, 1H), 8,00 (dd, J= 2,0 Hz, 0,8 Hz, 1H), 7,96 (d, J= 9,4 Hz, 1H), 7,74-7,68 (m, 3H), 7,64 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 7,45 (dd, J = 9,1 Hz, 2,0 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 5,15 (hept, J = 6,2 Hz, 1H), 4,22 (s, 3H), 1,30 (d, J = 6,2 Hz, 6H).

[0212] LC-MS (ESI): m/z 490, 492 [M+H]<+>.

Sinteza 4-(4-bromofenil)-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 200)

[0213]

[0214] 4-(4-bromofenil)-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 200) je sintetisan iz 4-(4-bromofenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona & 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonata pomoću Opšte procedure I (metoda A, korak F).

[0215]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,51 (s, 1H), 8,07 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 8,03 (d, J= 1,6 Hz, 1H), 7,76 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,72 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,47 (dd, J= 9,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,08 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 6,41 (tt, JHF= 54,4 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,59 (td, JHF= 15,2 Hz, J = 3,2 Hz, 2H), 4,23 (s, 3H).

[0216] LC-MS (ESI): m/z 512, 514 [M+H]<+>.

Sinteza 2-(benzo[d]tiazol-6-il)-4-(4-bromofenil)-6-(2,2-difluoroetoksi)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 201)

[0217]

[0218] Praćene su procedure slične onima opisanim za Primer 198. 2-(Benzo[d]tiazol-6-il)-4-(4-bromofenil)-6-(2,2-difluoroetoksi)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 201) je sintetisan iz terc-butil (4-(2-(benzo[d]tiazol-6-il)-3,6-diokso-2,3,5,6-tetrahidropirido[3,2-c]piridazin-4-il)fenil)karbamata putem koraka A-B (Primer 198) i 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonata putem Opšte procedure I (metoda A, korak F).

[0219]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9,53 (s, 1H), 8,54 (d, J= 2,1 Hz, 1H), 8,25 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 8,07 (d, J= 9,4 Hz, 1H), 7,85 (dd, J= 8,7 Hz, 2,1 Hz, 1H), 7,76 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 7,66 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 7,09 (d, J= 9,4 Hz, 1H), 6,41 (tt, JHF= 54,4, 3,4 Hz, 1H), 4,60 (td, J = 15,2, 3,4 Hz, 2H).

[0220] LC-MS (ESI): m/z 515, 517 [M+H]<+>.

Sinteza 2-(benzo[d]tiazol-6-il)-4-(4-bromofenil)-6-izopropoksipirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 202)

[0222] 2-(Benzo[d]tiazol-6-il)-4-(4-bromofenil)-6-izopropoksipirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 202) je sintetisan iz 2-(benzo[d]tiazol-6-il)-4-(4-bromofenil)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona i 2-jodopropana pomoću Opšte procedure I (metoda A, korak F).

[0223]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,53 (s, 1H), 8,52 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 8,24 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 7,83 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,65 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 5,16 (hept, J = 6,4 Hz, 1H), 1,31 (d, J = 6,4 Hz, 6H).

[0224] LC-MS (ESI): m/z 493, 495 [M+H]<+>.

Sinteza 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(3-(dimetilamino)-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 203) & 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-6-(dimetilamino)-2-(3-(dimetilamino)-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 204)

[0225]

Korak A: 2-(3-bromo-2-metil-2H-indazol-5-il)-6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on [0226] Suspenziji 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 125) (200 mg, 0,4 mmol, 1,0 ekv.) u ACN (4 mL) je dodato NBS (75 mg, 0,42 mmol, 1,05 ekv.). Reakcija je zatim mešana na 80°C tokom 3 sata. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i ostatak je prečišćen direktno fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 2-(3-bromo-2-metil-2H-indazol-5-il)-6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (160 mg, 69% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 578; 580 [M+H]<+>.

Korak B: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(3-(dimetilamino)-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on & 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-6-(dimetilamino)-2-(3-(dimetilamino)-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0227] Suspenziji 2-(3-bromo-2-metil-2H-indazol-5-il)-6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (160 mg, 0,28 mmol, 1,0 ekv.) u toluenu (3 mL) su dodati Cs2CO3(90 mg, 0,28 mmol, 1,0 ekv.), Pd2(dba)3(25 mg, 0,028 mmol, 0,10 ekv.), Ru-Phos (26 mg, 0,055 mmol, 0,2 ekv.) i dimetilamin (2 M u THF) (1,4 mL, 2,8 mmol, 10,0 ekv.). Reakcija je zatim zatvorena u tubu otpornu na pritisak i mešana na 100°C tokom 5 sati pod atmosferom N2. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu i koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu i RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(3-(dimetilamino)-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 203) i 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-6-(dimetilamino)-2-(3-(dimetilamino)-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 204).

Primer 203:

[0228]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,11 (s, 1H), 8,08 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,55

(d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 7,35 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,06 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 6,41 (tt, JHF= 54,4 Hz, J= 3,3 Hz, 1H), 4,59 (td, JHF= 15,1 Hz, J= 3,3 Hz, 2H), 3,99 (s, 3H), 2,97 (s, 6H).

[0229] LC-MS (ESI): m/z 543 [M+H]<+>.

Primer 204:

[0230]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,04 (dd, J = 2,0, 0,8 Hz, 1H), 7,93-7,84 (m, 2H), 7,76 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 7,52 (dd, J = 9,1, 0,8 Hz, 1H), 7,33 (dd, J = 9,2, 2,0 Hz, 1H), 7,31 (t, JHF= 74,2, 1H), 7,27 (d, J= 9,8 Hz, 1H), 7,22-7,16 (m, 2H), 3,99 (s, 3H), 3,23 (s, 3H), 3,17 (s, 3H), 2,96 (s, 6H).

[0231] LC-MS (ESI): m/z 506 [M+H]<+>.

Sinteza 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-propilpirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 205)

[0232]

[0233] Smeši 6-hloro-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (sintetisano iz 4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona & 2-(4-(difluorometoksi)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolana pomoću Opšte procedure I (metoda C, koraci E, G) (120 mg, 0,26 mmol, 1,0 ekv.) i Fe(acac)3(93 mg, 0,26 mmol, 1,0 ekv.) u THF (5 mL) i NMP (1 mL) je ukapavanjem dodat n-propilmagnezijum bromid (1 M u dietil etru) (4,0 mL, 4,0 mmol, 15,4 ekv.) na 0°C pod atmosferom N2. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći i pažljivo ugašena ledenom vodom (10 mL). Sirova smeša je ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-6-propilpirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 205).

[0234]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,51 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,99 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,72 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,35 (t, JHF= 72,0 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 4,23 (s, 3H), 2,78 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 1,82-1,61 (m, 2H), 0,94 (t, J= 7,4 Hz, 3H).

[0235] LC-MS (ESI): m/z 462 [M+H]<+>.

Sinteza 4-cikloheksil-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 206)

[0236]

Korak A: 4-hloro-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0237] Smeša 4,6-dihloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (300 mg, 0,87 mmol, 1,0 ekv., sintetisano pomoću Opšte procedure I (metoda A, koraci A-D), 2,2-difluoroetil trifluorometansulfonat (278 mg, 1,3 mmol, 1,49 ekv.) i Cs2CO3(565 mg, 1,7 mmol, 1,95 ekv.) u DMF (8 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 3 sata i ugašena ledenom vodom (10 mL). Sirova smeša je ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 4-hloro-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (250 mg, 74% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 392 [M+H]<+>.

Korak B: 4-cikloheksil-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0238] Smeša 4-hloro-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-2H,3H-pirido[3,2-c]piridazin-3-on

(100 mg, 0,26 mmol, 1,0 ekv.), Fe(acac)3(90 mg, 0,26 mmol, 1,0 ekv.) i NMP/ THF mešavina (0,5mL/5 mL) je mešana na 0°C pod atmosferom N2. Ukapavanjem na 0°C je dodat cikloheksilmagnezijum bromid (1 M u dietil etru) (2,6 mL, 2,6 mmol, 10,0 ekv.) Smeša je zatim ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu i mešana je tokom noći. Reakcija je praćena pomoću TLC. Nakon završetka, reakcija je ugašena ledenom vodom (10 mL). Sirova smeša je ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (30 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 4-cikloheksil-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 206).

[0239]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 8,48 (s, 1H), 7,99-7,92 (m, 2H), 7,69 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,39 (dd, J =9,1, 2,0 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 6,50 (t, JHF= 54,2 Hz, 1H), 4,79 (td, JHF= 15,1, 3,2 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H), 2,36-2,32 (m, 1H), 1,88-1,69 (m, 4H), 1,63-1,55 (m, 2H), 1,43-1,19 (m, 4H).

[0240] LC-MS (ESI): m/z 439 [M+H]<+>.

Sinteza 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-hidroksifenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 207)

[0241]

[0242] Smeša 4-hloro-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (100 mg, 0,25 mmol, 1,0 ekv.), Pd(OAc)2(12 mg, 0,05 mmol, 0,2 ekv.), K2CO3(105 mg, 0,75 mmol, 3,0 ekv.) i (4-hidroksifenil)boronska kiselina (53 mg, 0,38 mmol) u mešavini dioksan/voda (5 mL, 10/1, v/v) je mešana na 100 °C pod atmosferom N2. Nakon toga je reakciona smeša sipana u ledenu vodu (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-hidroksifenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 207).

[0243]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,49 (s, 1H), 8,04-7,97 (m, 2H), 7,77-7,62 (m, 3H), 7,44 (dd, J = 9,1, 1,9 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,42 (tt, JHF= 54,5, 3,5 Hz, 1H), 4,61 (td, J = 15,0, 3,5 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H).

[0244] LC-MS (ESI): m/z 450 [M+H]<+>.

Sinteza 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(3-etil-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 208)

[0245]

Korak A: 1-(5-bromo-2-metil-2H-indazol-3-il)etanol

[0246] Rastvoru 5-bromo-2-metil-2H-indazol (500 mg, 2,37 mmol, 1 ekv.) u THF (10 mL) je ukapavanjem dodato n-BuLi (2,5 M u heksanu) (4,7 mL, 11,85 mmol, 5 ekv.) na -65°C pod atmosferom N2. Nakon 3 sata, dodat je acetaldehid (5 M u THF) (0,6 mL, 3,0 mmol, 1,27 ekv.). Zatim je reakciona smeša polako zagrejana na sobnu temperaturu i mešana 16 sati. Reakciona smeša je sipana u zasićen NH4Cl vodeni (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom.Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 1-(5-bromo-2-metil-2H-indazol-3-il)etanol (500 mg, 83% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 255, 257 [M+H]<+>.

Korak B: 5-bromo-3-etil-2-metil-2H-indazol

[0247] Smeša 1-(5-bromo-2-metil-2H-indazol-3-il)etanol (200 mg, 0,78 mmol, 1 ekv.), trietilsilan (453 mg, 3,9 mmol, 5 ekv.), TFA (889 mg, 7,8 mmol, 10 ekv.) u DCM (5 mL) je mešana na 40°C tokom 16 sati. Zatim je smeša sipana u zasićen NaHCO3vodeni (10 mL) na 0 °C, i ekstraktovana sa DCM (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 5-bromo-3-etil-2-metil-2H-indazol (80 mg, 43% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 239, 241 [M+H]<+>.

[0248] 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(3-etil-2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 208) je sintetisan iz 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona i 5-bromo-3-etil-2-metil-2H-indazola pomoću Opšte procedure II (metoda A, korak G).

[0249]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,13 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 8,07 (dd, J= 2,0 Hz, 0,8 Hz, 1H), 7,93 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,68 (dd, J= 9,2 Hz, 0,8 Hz, 1H), 7,48 (dd, J= 8,8 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,41 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,13 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,47 (tt, JHF= 54,4 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,65 (td, JHF= 15,2 Hz, 3,2 Hz, 2H), 4,20 (s, 3H), 3,17 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 1,33 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

[0250] LC-MS (ESI): m/z 528 [M+H]<+>.

Sinteza 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(hidroksimetil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 209) i 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(difluorometil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 210)

[0251]

Korak A: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(hidroksimetil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on [0252] Rastvoru 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-8-(((tetrahidro-2H-piran-2-il)oksi)metil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 142, sintetisano iz (E)-metil 4-(tetrahidro-2H-piran-2-iloksi)-3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)but-2-enoata (referenca: Tetrahedron 2012, 68, 3444-3449) pomoću Opšte procedure I (metoda A, koraci E-F) (180 mg, 0,3 mmol, 1,0 ekv.) u dioksanu (3 mL) je dodato 1N HCl (vodeno) (1 mL, 1 mmol, 3,3 ekv.) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata. Zatim je reakcija ugašena ledenom vodom (20 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (20 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(hidroksimetil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 209).

[0253]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,50 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,84 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,70 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,34 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,94 (s, 1H), 6,39 (tt, JHF= 54,4 Hz, 3,2 Hz, 1H), 5,63 (s, 1H), 4,83 (s, 2H), 4,58 (td, JHF= 15,2 Hz, 3,2 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H).

[0254] LC-MS (ESI): m/z 530 [M+H]<+>.

Korak B: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-karbaldehid

[0255] Rastvoru 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(hidroksimetil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (60 mg, 0,1 mmol, 1,0 ekv.) u CHCl3(5 mL) je iz jednog dela dodat sveže aktiviran MnO2(96 mg, 1,0 mmol, 10,0 ekv.). Dobijena smeša je zatim mešana na sobnoj temperaturi 16 sati. Napredak reakcije je praćen pomoću TLC. Nakon završetka, reakciona smeša je filtrirana kroz kratko jastuče Celite®. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-karbaldehid (50 mg) kao čvrsta supstanca žute boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LC-MS: m/z 528 [M+H]<+>.

Korak C: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(difluorometil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0256] Rastvoru 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-karbaldehid (50 mg, sirov) u DCM (3 mL) je dodato DAST (46 mg) na -60°C. Nakon dodavanja, ostavljen je da se zagreje na sobnu temperaturu i mešan dodatnih 16 sati. Nakon završetka reakcije, dodata je ledena voda (10 mL) i ekstraktovano sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(difluorometil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 210).

[0257]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,53 (s, 1H), 8,08 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 7,86 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,73 (d,

J= 9,2 Hz, 1H), 7,51 (dd, J= 9,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,45 (t, JHF= 53,6 Hz, 1H), 7,36 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,30-7,25 (m, 3H), 6,41 (tt, JHF= 54,4 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,61 (td, JHF= 15,2 Hz, 3,2 Hz, 2H), 4,23 (s, 3H).

[0258] LC-MS (ESI): m/z 550 [M+H]<+>.

Sinteza 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-((dimetilamino)metil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 211)

[0259]

Korak A: (6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-il)metil metansulfonat

[0260] Rastvoru 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-(hidroksimetil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (90 mg, 0,17 mmol, 1,0 ekv., Primer 209) u DCM (3 mL) su dodati MsCl (29 mg, 0,25 mmol, 1,47 ekv.) i TEA (34 mg, 0,34 mmol, 2,0 ekv.) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata. Reakciona smeša je zatim sipana u ledenu vodu (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio (6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-il)metil metansulfonat (90 mg, 87% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS: m/z 608 [M+H]<+>.

Korak B: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-((dimetilamino)metil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0261] Rastvoru (6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-il)metil metansulfonat (50 mg, 0,08 mmol, 1,0 ekv.) u DMSO (3 mL) su dodati NH(Me)2HCl so (33 mg, 0,41 mmol, 5,1 ekv.), NaI (23 mg, 0,16 mmol, 2,0 ekv.) i NaHCO3(14 mg, 0,16 mmol, 2,0 ekv.) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na 80 °C tokom 2 sata. Reakciona smeša je zatim sipana u ledenu vodu (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-8-((dimetilamino)metil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 211).

[0262]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 8,52 (s, 1H), 8,05 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 7,84 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,72 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 7,49 (dd, J= 9,2, 2,0 Hz, 1H), 7,36 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,25 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 6,96 (s, 1H), 6,40 (tt, JHF= 54,4, 3,4 Hz, 1H), 4,23 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 2,29 (s, 6H).

[0263] LC-MS (ESI): m/z 557 [M+H]<+>.

Sinteza 8-amino-6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 212)

[0264]

Korak A: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-karboksilna kiselina

[0265] Smeši 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-karbaldehid (120 mg, 0,23 mmol, 1,0 ekv., sintetisano kao u Primeru 210 korak B) i HCO2H (0,1 mL, 2,65 mmol, 11,5 ekv.) u H2O (0,5 mL) je lagano dodato H2O2(30 wt. % u H2O, 0,1 mL, 1,14 mmol, 5 ekv.) na 4 °C. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 6 sati. Smeša je zatim sipana u H2O (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-karboksilna kiselina (80 mg, 52% prinos) kao čvrsta supstanca žute boje. LC-MS (ESI): m/z 544 [M+H]<+>.

Korak B: 8-amino-6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on [0266] Rastvoru 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-8-karboksilna kiselina (80 mg, 0,15 mmol, 1,5 ekv.) u DMF (2 mL) su dodati TEA (22 mg, 0,22 mmol, 1,45 ekv.) i DPPA (61 mg, 0,22 mmol, 1,45 ekv.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 sata. Zatim je rastvoru dodato 0,3 mL vode i reakciona smeša je mešana na 100 °C tokom noći. Reakcija je ohlađena na sobnu temperaturu, sipana u H2O (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom TLC kako bi se dobio 8-amino-6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 212).

[0267]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,49 (s, 1H), 8,05 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,83 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,69 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 7,51 (dd, J= 9,2 Hz, 1,6 Hz, 1H), 7,32 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,23-7,14 (m, 4H), 6,31 (tt, JHF= 54,0 Hz, 3,6 Hz, 1H), 5,83 (s, 1H), 4,47 (td, J= 14,8 Hz, 3,6 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H).

[0268] LC-MS (ESI): m/z 515 [M+H]<+>.

Sinteza 6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-4-((trimetilsilil)etinil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 213), 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-etinil-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 214) & 4-((1H-pirazol-3-il)etinil)-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 215)

[0269]

Korak A: 6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-4-((trimetilsilil)etinil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0270] Smeša 4-hloro-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (180 mg, 0,46 mmol, 1,0 ekv., sintetisano kao u Primeru 206 korak A), trimetil((tributilstanil)etinil)silan (268 mg, 0,69 mmol, 1,5 ekv.) i Pd(PPh3)4(58 mg, 0,05 mmol, 0,11 ekv.) u dioksanu (5 mL) je mešana na 80°C pod atmosferom N2tokom 15 sati. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-4-((trimetilsilil)etinil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 213).

[0271]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,50 (s, 1H), 8,08 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,98 (d, J= 1,6 Hz, 1H), 7,70 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 7,41 (dd, J= 9,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,09 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,54 (tt, JHF= 54,8 Hz, 3,6 Hz, 1H), 4,82 (td, JHF= 14,4 Hz, 3,6 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H), 0,28 (s, 9H).

[0272] LC-MS (ESI): m/z 454 [M+H]<+>.

Korak B: 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-etinil-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0273] Smeša 6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-4-((trimetilsilil)etinil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (126 mg, 0,28 mmol, 1,0 ekv.) i Cs2CO3(183 mg, 0,56 mmol, 2,0 ekv.) u 2,2-difluoroetan-1-olu (4 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 4 sata. Dobijena smeša je sipana u H2O (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen fleš kolonskom hromatografijom na silika gelu kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-etinil-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 214).

[0274]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,51 (s, 1H), 8,08 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,72 (d, J= 9,6 Hz, 1H), 7,41 (dd, J= 9,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,52 (tt, JHF= 54,4 Hz, 3,2 Hz, 1H), 5,02 (s, 1H), 4,83 (td, JHF= 14,8 Hz, 3,2 Hz, 2H), 4,23 (s, 3H).

[0275] LC-MS (ESI): m/z 382 [M+H]<+>.

Korak C: 4-((1H-pirazol-3-il)etinil)-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on

[0276] Smeša 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-etinil-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (50 mg, 0,13 mmol, 1,0 ekv.), DIPEA (50 mg, 0,39 mmol, 3,0 ekv.), Pd(PPh3)2Cl2(10 mg, 0,013 mmol, 0,1 ekv.) i 3-jodo-1H-pirazol (101 mg, 0,52 mmol, 4,0 ekv.) i CuI (25 mg, 0,13 mmol, 1,0 ekv.) u DMF (5 mL) je mešana na sobnoj temperaturi pod atmosferom N2tokom 4 sata. Reakciona smeša je zatim sipana u H2O (10 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 4-((1H-pirazol-3-il)etinil)-6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 215).

[0277]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 13,39 (br, s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,09 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,91-7,81 (m, 1H), 7,72 (d, J= 9,2 Hz, 1H), 7,44 (dd, J = 9,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,11 (d, J= 9,2Hz, 1H), 6,62 (s, 1H), 6,55 (tt, JHF= 54,4 Hz, 3,2 Hz, 1H), 4,88 (td, JHF= 14,8 Hz, 3,2 Hz, 2H), 4,23 (s, 3H).

[0278] LC-MS (ESI): m/z 448 [M+H]<+>.

Sinteza 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(4-oksocikloheksil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 216)

[0279]

[0280] Rastvor 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(1,4-dioksaspiro[4.5]dec-7-en-8-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (sintetisan iz 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona & 1,4-dioksaspiro[4.5]dec-7-en-8-il trifluorometansulfonata pomoću Opšte procedure II (metoda A, korak G)) (10 mg, 0,0197 mmol) i konc. HCl (0,1 mL) u THF (1,5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi 2 sata. Reakcija je sipana u zasićen vodeni NaHCO3(5 mL) i ekstraktovana sa EA (5 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (20 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Zatim je smeša ostatka i Rh(PPh3)3Cl (18 mg, 0,0197 mmol) u toluenu (3 mL) mešana na sobnoj temperaturi tokom noći pod atmosferom H2. Smeša je zatim sipana u H2O (5 mL) i ekstraktovana sa EtOAc (5 mL x 3). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (10 mL), osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 6-(2,2-difluoroetoksi)-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(4-oksocikloheksil)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 216).

[0281]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,02 (d, J= 9,6 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,34 (t, JHF= 74,0 Hz, 1H), 7,24 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,02 (d, J= 9,6 Hz, 1H), 6,37 (tt, JHF= 54,4 Hz, 2,8 Hz, 1H), 5,62 (hept, J= 4,8 Hz, 1H), 4,54 (td, JHF= 14,8 Hz, 2,8 Hz, 2H), 2,78-2,63 (m, 2H), 2,45-2,23 (m, 2H), 2,29-2,14 (m, 1H) (HCO2H so).

[0282] LC-MS (ESI): m/z 466 [M+H]<+>.

Sinteza 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-6-etoksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-ona (Primer 217)

[0284] Smeša 6-hloro-4-(4-(difluorometoksi)fenil)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (sintetisana iz 4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona & 2-(4-(difluorometoksi)fenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolana pomoću Opšte procedure I (metoda C, koraci E, G) (120 mg, 0,26 mmol, 1,0 ekv.) i EtONa (177 mg, 2,6 mmol, 10,0 ekv.) u EtOH (8 mL) je mešana na 40°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je zatim sipana u ledenu vodu (10 mL) i ekstraktovana sa DCM (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi su osušeni preko Na2SO4i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Sirov ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 4-(4-(difluorometoksi)fenil)-6-etoksi-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3(2H)-on (Primer 217).

[0285]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8,49 (s, 1H), 8,04 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,97 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,86 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,70 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,45 (dd, J = 9,2 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,34 (t, JHF= 74,0, 1H), 7,24 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,95 (d, J= 9,6 Hz, 1H), 4,34 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H), 1,32 (t, J= 7,2 Hz, 3H).

[0286] LC-MS (ESI): m/z 464 [M+H]<+>.

Sinteza 5-(6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-4-il)-1H-indol-3-karbonitril (Primer 331)

[0287]

[0288] Rastvoru 7-(2,2-difluoroetoksi)-3-(2-metil-2H-indazol-5-il)-1-(1-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-indazol-5-il)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on (54 mg, 0,09 mmol, 1,0 ekv.) (sintetisano iz 4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,5H)-diona & 5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-indol-3-karbonitrila (referenca: WO2018215316) pomoću Opšte procedure I (metoda A, koraci E & F)) u DCM (3 mL) je dodato TFA (1 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 sata. Reakciona smeša je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, ostatak je ponovo rastvoren u MeOH (2 mL) i konc. NH4OH (1 mL). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Nakon završetka, reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 5-(6-(2,2-difluoroetoksi)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-4-il)-1H-indol-3-karbonitril (Primer 331).

[0289]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): δ 12,29 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,12 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 8,10-8,01 (m, 2H), 7,75 (dd, J = 8,6 Hz, 1,5 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,60 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,49 (dd, J = 9,1 Hz, 2,0 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 6,38 (tt, JHF= 54,5 Hz, J = 3,3 Hz, 1H), 4,54 (td, JHF= 15,0 Hz, J = 3,4 Hz, 2H), 4,22 (s, 3H).

[0290] LC-MS (ESI): m/z 498 [M+H]<+>.

Sinteza 5-(6-(etilamino)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-4-il)-1H-indol-3-karbonitrila (Primer 332)

[0291]

[0292] Rastvoru 5-(6-(etilamino)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-4-il)-1-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-indol-3-karbonitril (100 mg, 0,17 mmol) (sintetisano iz 4-hloro-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)pirido[3,2-c]piridazin-3,6(2H,SH)-diona & 5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-indol-3-karbonitrila (referenca: WO2018215316) pomoću Opšte procedure I (metoda A, korak E; metoda D, korak I)) u DCM (6 mL) je dodato TFA (6 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 12 sati. Reakciona smeša je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, ostatak je ponovo rastvoren sa MeOH (4 mL) i konc. NH4OH (2 mL). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi dodatnih 6 sati. Nakon završetka, reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen RP preparativnom HPLC kako bi se dobio 5-(6-(etilamino)-2-(2-metil-2H-indazol-5-il)-3-okso-2,3-dihidropirido[3,2-c]piridazin-4-il)-1H-indol-3-karbonitril (Primer 332).

[0293]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) (ppm): δ 12,17 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,76 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,21 (s, 3H), 3,31 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,14 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

[0294] LC-MS (ESI): m/z 461 [M+H]<+>.

Biohemijski test

[0295] Mat2a protein je eksprimiran rekombinantnim bakulovirusom u SF9 inficiranim ćelijama korišćenjem Bac u Bac sistema klonirano u pFASTBAC1 vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). Rekombinantni MAT2A je izolovan iz ćelijskog lizata 150g inficiranih ćelija upotrebom HP Ni sefarozne kolonske hromatografije. Rekombinantni MAT2A homodimer je eluiran sa 250 i 500 mM imidazola, i frakcije koje sadrže MAT2A su identifikovane elektroforezom natrijum dodecil sulfata u poliakrilamidnom gelu i spojene.

[0296] Za utvrđivanje inhibitorne potentnosti jedinjenja protiv MAT2A homodimera, protein je razblažen do 4 ug/mL u testnom puferu (50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,3 mM EDTA, 0,005% [w/v] albumin goveđeg seruma [BSA]). Testno jedinjenje je pripremljeno u 100% dimetil sulfoksida (DMSO) pri 50 x željene konačne koncentracije. 1 uL zapremine dilucije jedinjenja je dodato u 40 uL dilucije enzima i smeša je ostavljena da se uravnoteži tokom 60 minuta na 25 °C. Enzimski test je započet dodavanjem 10 uL mešavine supstrata (500 uM ATP, pH 7,0, 400 uM L-metionin u 1x testnom puferu), i smeša je inkubirana dodatnih 60 minuta na 25 °C. Reakcija je zaustavljena i oslobođeni fosfat koji oslobađa enzim u stehiometrijskim količinama proizvodnjom S-adenozil metionina (SAM) je izmeren upotrebom PiColorLock Gold kompleta (Innova Biosciences, UK). Količine apsolutnog proizvoda su utvrđene poređenjem sa standardnom krivom pufera kalijum fosfata, pH 8,0.

[0297] Specifična jedinjenja koja su otkrivena u tekstu su testirana u prethodnom testu i utvrđeno je da inhibiraju MAT2A sa IC50prema sledećim rezultatima: (A) manje od 100 nM (> 40% maksimuma inhibicije), (B) između 100 nM i 1 uM (> 40% maksimuma inhibicije) i (C) između 1 uM i 10 uM (> 40% maksimuma inhibicije), kao što je prikazano u Tabeli 2 u nastavku teksta.

Ćelijski test ciljnog angažovanja (SAM)

[0298] Merenje aktivnosti MAT2A u ćelijama je sprovedeno direktno kvantitacijom količine proizvoda njegove enzimske aktivnosti, SAM. Ćelije raka su tretirane sa kandidatnim MAT2A inhibitorima za odgovarajuć period inkubacije, i ćelije su zatim lizirane korišćenjem reagensa koji je ugasio svaku dalju aktivnost enzima. Rastvorljivi metaboliti uključujući SAM su sakupljeni i sam SAM je direktno izmeren iz lizata korišćenjem kvantitativne LC-MS/MS.

[0299] Uobičajeni test je sproveden korišćenjem ćelijske linije ljudskog karcinoma debelog creva HCT116 koja je genetski konstruisana da obriše MTAP gen (komercijalno dostupan od Horizon Discovery). Ova ćelijska linija je korišćena jer je utvrđeno da gubitak MTAP gena predviđa senzitivnost na inhibitore MAT2A. Ćelije su postavljene u posude sa 96 otvora pri odgovarajućoj ćelijskoj gustini. Nakon 24 sata, ćelije su zatim tretirane kandidatnim MAT2A inhibitorom. Pre dodavanja ćelijama, jedinjenje je prvo serijski razblaženo u 100% DMSO, obično kao trostruko serijsko razblaživanje počevši od 500 x gonje doze sa 10 doznih poena uključujući DMSO samo kontrolu. Jedinjenje je zatim prebačeno na radnu ploču materijala u medijumu ćelijske kulture dodavanjem 5 uL jedinjenja u DMSO u 495 uL medijuma ćelijske kulture. Ovaj radni materijal je zatim dodat ćelijama preko dalje petostruke dilucije, dodavanjem 25 uL radnog materijala u 100 uL ćelija u medijumu kulture. Nakon dodavanja jedinjenja, ćelije su inkubirane na 37 °C / 5% CO2tokom 72 sata.

[0300] Da bi se kvantifikovali nivoi SAM nakon tretmana jedinjenjem, ćelije su jednom nežno isprane u amonijum karbonat puferu (75mM pri pH 7,4), postavljene na suvi led i lizirane puferom za ekstrakciju metabolita (80% hladnog metanola i 20% vode (v/v) sa acetatnom kiselinom pri 1M konačne koncentracije sa 200 ng/mL deuterovanog d3-SAM kao interna kontrola). Nakon centrifugacije na 4 °C pri 3,200 rpm tokom 30 minuta, sakupljen je supernatant i skladišten na -80 °C do analize tečnom hromatografijom sa tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS). LC-MS/MS analiza je sprovedena upotrebom API6500 masenog spektrometra (Sciex, Framingham, MA, USA) koji radi u režimu raspršivanja pozivinih jona i koji je opremljen Waters UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) BEH Amide kolonom. Podaci praćenja višestrukih reakcija su dobijeni za SAM i d3-SAM standard, korišćenjem sprege tranzicije mase na m/z 399,2→250,1 i 402,2→250,1, respektivno. U tipičnoj LC-MS/MS analizi, inicijalna brzina protoka je bila 0,5 ml/min od 25% mobilne faze A (acetonitril i voda pri 5:95 (v/v) sa 1% metanske kiseline i 10 mM amonijum acetata) i 75% mobilne faze B (acetonitril i voda pri 95:5 (v/v) sa 1% metanske kiseline i 10 mM amonijum acetata), 0,2-0,5 minuta sa 75% - 35% mobilne faze B, 25% - 65% mobilne faze A, pri 0,5 min 65% mobilne faze A i 35% mobilne faze B.1,0 – 1,1 minuta sa 35% - 75% mobilne faze B, 65% - 25% mobilne faze A, pri 1,1 minuta 25% mobilne faze A i 75% mobilne faze B sa ukupnim vremenom rada 1,5 minuta.

[0301] Specifična jedinjenja otkrivena u tekstu su testirana u prethodno pomenutom testu i utvrđeno je da inhibiraju SAM sa IC50prema sledećim rezultatima: (A) manje od 100 nM (> 60% maksimuma inhibicije), (B) između 100 nM i 1 uM (> 60% maksimuma inhibicije), (C) veće od ili jednako 1 uM (> 60% maksimuma inhibicije) i (NT) nije testirano, kao što je prikazano u Tabeli 2 u nastavku.

Test za inhibiciju ćelijske proliferacije

[0302] Uticaj ispitivanog jedinjenja na rast ćelija raka je procenjivan tretiranjem ćelija raka sa jedinjenjem tokom 4 dana a zatim merenjem proliferacije korišćenjem očitavanja ćelijske proliferacije bazirane na ATP (Cell Titer Glo, Promega Corporation).

[0303] U uobičajenom testu, izogeni par ćelijskih linija ljudskog karcinoma debelog creva HCT116, koje variraju samo u statusu delecije MTAP (HCT116 MTAP+/+ i HCT116 MTAP-/-), je postavljen u posude sa 96 otvora u odgovarajućoj ćelijskoj gustini. Nakon 24 sata, ćelije su zatim tretirane sa kandidatnim inhibitorom MAT2A. Pre dodavanja ćelijama, jedinjenje je prvo serijski razblaženo u 100% DMSO, obično kao trostruka serijska dilucija počevši sa 500x gornje doze sa 10 doznih poena uključujući DMSO samo kontrolu. Jedinjenje je zatim prebačeno na ploču radnog materijala u medijumu ćelijske kulture dodavanjem 5 uL jedinjenja u DMSO u 495 uL medijuma ćelijske kulture. Ovaj radni materijal je zatim dodat ćelijama putem dalje petostruke dilucije, dodavanjem 25 uL radnog materijala u 100 uL ćelija u medijumu kulture. Nakon dodavanja jedinjenja, ćelije su inkubirane na 37 °C / 5% CO2 tokom 4 dana.

[0304] Kako bi se merila inhibicija ćelijske proliferacije, ćelije su ostavljene da se uravnoteže na sobnu temperaturu tokom 30 minuta, nakon čega su tretirane sa 125 uL Cell Titer Glo reagensa. Ploča je zatim pokrivena aluminijumskom folijom i trešena 15 minuta kako bi se osiguralo potpuno mešanje i potpuna ćelijska liza. Zatim je izmeren luminescentni signal upotrebom luminometra na bazi ploče Veritas version 1.9.2 korišćenjem ATP standardne krive da bi se potvrdila reproduktivnost testa od ciklusa do ciklusa. Ova mera luminiscencije je konvertovana u indeks proliferacije oduzimanjem od svake tačke podataka ATP luminiscencijski signal izmeren iz bank (bez ćelija) otvora, i deljenjem sa ATP luminiscencijskim signalom izmerenim u 0,2% DMSO kontrolnom otvoru prilagođenom za signal u praznom otvoru. Aktivnost jedinjenja je zatim predstavljena kao procentualna promena proliferacije u odnosu na DMSO kontrolu unutar ploče naspram log10 koncentracije jedinjenja u molarnim (M) jedinicama.

[0305] Specifična jedinjenja otkrivena u tekstu su testirana u prethodno pomenutom ispitivanju i utvrđeno je da inhibiraju ćelijsku proliferaciju sa IC50prema sledećim ocenama: (A) manje od 100 nM (> 30% maksimuma inhibicije za MTAP -/-; > 10% maksimuma inhibicije za MTAP /+), (B) između 100 nM i 1 uM (> 30% maksimuma inhibicije za MTAP -/-; > 10% maksimuma inhibicije za MTAP /+), (C) više od ili jednako 1 uM i (NT) nije testirano, kao što je prikazano u Tabeli 2 u nastavku.

Tabela 2

Claims (14)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje prema Formuli I:

   pri čemu L je O, S, NR ili veza; R je H ili C1-C6-alkil; R<1>je izabrano iz grupe koja se sastoji od C1-C6-alkil, C2-C6-alkenil, C3-C6-karbociklil, -(C1-C6-alkil)(C3-C6-karbociklil) i -(C1-C6-alkil)(C3-C6-cikloalkenil) pri čemu bilo koji alkil u R<1>je prav ili razgranat, i R<1>je opciono supstituisano sa 1 - 6 halo ili 1 - 6 deuterijum; ili kada L je NR, tada R i R<1>u kombinaciji sa L predstavljaju tročlani do šestočlani heterocikloalkil (pri čemu 1-4 člana prstena su nezavisno izabrana od N, O i S) opciono supstsituisan sa jednim ili više R<A>; R<2>i R<3>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od (C2-C6)alkinil, C6-C10-aril, C3-C6-karbociklil, petočlani do desetočlani heteroaril (pri čemu 1-4 heteroaril člana su nezavisno izabrani od N, O i S) i tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil (pri čemu 1-4 heterocikloalkil člana su nezavisno izabrana od N, O i S), pri čemu R<2>i R<3>su nezavisno i opciono supstituisani sa jednim ili više supstituenata koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od R<A>, OR<A>, halo, - N=N-R<A>, NR<A>R<B>, -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>, -C(O)OR<A>, -C(O)NR<A>R<B>, - OC(O)R<A>, -Si(C1-C6-alkil)3i -CN; R<4>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkil (opciono supstituisan sa jednim ili više halo, hidroksi ili tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkoksi (pri čemu 1-4 heterocikloalkoksi člana su nezavisno izabrani od N, O i S)), -O(C1-C6-alkil) (opciono supstituisan sa jednim ili više halo), -OH, halo, -CN, -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>i -NR<A>R<B>; R<5>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkil, C1-C6-alkoksi, C2-C6-alkenil, C2-C6-alkinil, halo, -CN i -NR<C>R<D>; R<A>i R<B>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, -CN, -hidroksi, okso, C1-C6-alkil, C1-C6-alkoksi, C2-C6-alkenil, C2-C6-alkinil, -NH2, -S(O)0-2-(C1-C6-alkil), -S(O)0-2-(C6-C10-aril), -C(O)(C1-C6-alkil), -C(O)(C3-C14-karbociklil), -C3-C14-karbociklil, -(C1-C6-alkil)(C3-C14-karbociklil), C6-C10-aril, tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil i -(C1-C6-alkil)-(tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil) (pri čemu 1-4 heterocikloalkil člana su nezavisno izabrana od N, O i S) i petočlani do desetočlani heteroaril (pri čemu 1-4 heteroaril člana su nezavisno izabrana od N, O i S); pri čemu svaka alkil, alkoksi, alkenil, alkinil, aril, karbociklil, heterocikloalkil i heteroaril funkcionalna grupa R<A>i R<B>je opciono supstituisana sa jednim ili više supstituenata izabranim iz grupe koja se sastoji od deuterijum, hidroksi, halo, -NR’2(pri čemu svako R’ je nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od C1-C6-alkil, C2-C6-alkenil, C2-C6-alkinil, C6-C10-aril, tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil i -(C1-C6-alkil)-(tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil) (pri čemu 1-4 člana prstena su nezavisno izabrana od N, O i S) i petočlani do desetočlani heteroaril (pri čemu 1-4 heteroaril člana su nezavisno izabrana od N, O i S), -NHC(O)(OC1-C6-alkil), -NO2, - CN, okso, -C(O)OH, -C(O)O(C1-C6-alkil), -C1-C6-alkil(C1-C6-alkoksi), -C(O)NH2, C1-C6-alkil, -C(O)C1-C6-alkil, -OC1-C6-alkil, -Si(C1-C6-alkil)3, -S(O)0-2-(C1-C6-alkil), C6-C10-aril, -(C1-C6-alkil)(C6-C10-aril), tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil, i -(C1-C6-alkil)-(tročlani do četrnaestočlani heterocikl) (pri čemu 1-4 heterocikl člana su nezavisno izabrana od N, O i S), i -O(C6-C14-aril), pri čemu svaki alkil, alkenil, aril i heterocikloalkil supstituent u R<A>i R<B>je opciono supstituisan sa jednim ili više supstituenata izabranih iz grupe koja se sastoji od hidroksi, -OC1-C6-alkil, halo, -NH2, -(C1-C6-alkil)NH2, -C(O)OH, CN i okso; R<C>i R<D>su svako nezavisno izabrano od H i C1-C6-alkil; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, gde: R<4>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkil (opciono supstituisano sa jednim ili više halo, hidroksi ili tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkoksi (pri čemu 1-4 heterocikloalkoksi člana su nezavisno izabrana od N, O i S)), -O(C1-C6-alkil), -(C1-C6-alkil)NR<A>R<B>, i -NR<A>R<B>(pri čemu R<A>i R<B>su nezavisno izabrani od H i C1-C6-alkil); i R<5>je izabrano iz grupe koja se sastoji od H, C1-C6-alkil, C1-C6-alkoksi i -NR<C>R<D>.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde: (a) najmanje jedno R<4>i R<5>je H; i/ili (b) R<4>je H; i/ili (c) R<5>je H; i/ili (d) svako R<4>i R<5>je H.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu R<2>je opciono supstituisan C6-C10-arilo ili opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril, opciono pri čemu R<2>je: (a) opciono supstituisan C6-C10-aril, opciono pri čemu R<2>je opciono supstituisan fenil; ili (b) opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril, i pri čemu 1 član prstena je N, opciono pri čemu: (i) R<2>je opciono supstituisan petočlani ili šestočlani heteroaril; i/ili (ii) R<2>je opciono supstituisan šestočlani heteroaril; i/ili (iii) R<2>je opciono supstituisan piridil.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu R<3>je: (a) opciono supstituisan tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opciono supstituisan petočlani do desetočlani heteroaril, opciono pri čemu R<3>je izabrano iz grupe koja se sastoji od benzotiazolila, benzoizotiazolila, benzoksazolila, piridinila, piridinonila, piridazinila, benzimidazolila, benzotriazolila, indazolila, hinoksalinila, hinolinila, hinazolinila, imidazopiridinila, pirazolopiridinila, triazolopiridinila, cinolinila, izoksazolila, pirazolila, benzofuranila, dihidrobenzofuranila, dihidrobenzodioksinila i tetrahidrobenzodioksinila, od kojih svaki može biti opciono supstituisan; ili (b) opciono supstituisan C6-C10-aril, opciono pri čemu R<3>je opciono supstituisan fenil.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu R<2>je opciono supstituisani fenil a R<3>je opciono supstituisani tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opciono supstituisani petočlani do desetočlani heteroaril.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu L je O ili NR, opciono pri čemu R<1>je: (a) opciono supstituisani C1-C6-alkil ili opciono supstituisani C3-C6-karbociklil; i/ili (b) C1-C3-alkil koji je opciono supstituisan sa 1 - 3 F.
8. 8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu L je O ili NR a R je H; R<1>je Ci-Cs-alkil koji je opciono supstituisan sa 1 - 3 F; R<2>je opciono supstituisani tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opciono supstituisani petočlani do desetočlani heteroaril (pri čemu 1 heterocikloalkil ili heteroaril član je N) ili opciono supstituisani C6-C10-aril; R<3>je opciono supstituisani tročlani do četrnaestočlani heterocikloalkil ili opciono supstituisani petočlani do desetočlani heteroaril pri čemu 1 do 3 heterocikloalkil ili heteroaril člana su nezavisno izabrana od N, O i S; i svako R<4>i R<5>je H, opciono pri čemu L je NR
9. 9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu jedinjenje je izabrano iz sledeće tabele:
10. 10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
11. 11. Jedinjenje inhibitora MAT2A ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 za upotrebu u metodi za tretiranje raka kod subjekta koji boluje od toga, obuhvata primenu nad subjektom efikasne količine jedinjenja inhibitora MAT2A ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9.
12. 12. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu rak je rak sa obrisanim MTAP.
13. 13. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretiranju raka kod subjekta koji boluje od toga.
14. 14. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je rak: (a) rak sa obrisanim MTAP; i/ili (b) izabran iz grupe koja se sastoji od mezotelioma, neuroblastoma, karcinoma rektuma, karcinoma debelog creva, familijarnog adenomatoznog polipoznog karcinoma i naslednog nepolipoznog kolorektalnog raka, karcinoma jednjaka, labijalnog karcinoma , karcinoma larinksa, karcinoma hipofarinksa, karcinoma jezika, karcinoma pljuvačne žlezde, karcinoma želuca, adenokarcinoma, medularnog karcinoma štitne žlezde, papilarnog karcinoma štitne žlezde, renalnog karcinoma, karcinoma parenhima bubrega, karcinoma jajnika, karcinoma grlića materice, karcinoma korpusa materice, karcinoma endometrijuma, karcinoma horiona, karcinoma pankreasa, karacinoma prostate, karcinoma mokraćne bešike, karcinoma testisa, karcinoma dojke, urinarnog karcinoma, melanoma, tumora mozga, limfoma, raka glave i vrata, akutne limfatične leukemije (ALL), hronične limfatične leukemije (CLL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične mijeloidne leukemije (CML), hepatocelularnog karcinoma, karcinoma žučne kese, bronhijalnog karcinoma, karcinoma maloh ćelija pluća, karcinoma nemalh ćelij pluća, multiple mijeloma, bazalioma, teratoma, retinoblastoma, melanoma horoideje, seminoma, rabdomiosarkoma, osteosarkoma, hondrosarkoma, miosarkoma, liposarkoma, fibrosarkoma, Juingovog sarkoma i plazmocitoma; i/ili (c) izabran iz grupe koja se sastoji od B-ćelijske akutne limocitne leukemije (B-ALL), mezotelioma, limfoma, karcinoma pankreasa, raka pluća, raka želuca, raka jednjaka, karcinoma mokraćne bešike, raka mozga, raka glave i vrata, melanoma i raka dojke, opciono pri čemu rak je: (i) rak pluća izabran iz grupe koja se sastoji od raka nemalih pluća, raka malih ćelija pluća, adenokarcinoma pluća i karcinoma skvamoznih ćelija pluća; ili (ii) trostruki negativni rak dojke (TNBC); ili (iii) tumor mozga izabran iz grupe koja se sastoji od glioma, glioblastoma, astrocitoma, meningeoma, meduloblastoma, perifernih neuroektodermalnih tumora i kraniofaringeoma; ili (iv) limfom izabran iz grupe koja se sastoji od limfoma mantl ćelija, Hodžkinovog limfoma, ne-Hodžkinovog limfoma, Burkitovog limfoma, difuznog limfoma velikih B-ćelija (DLBCL) i T-ćelijske leukemije/limfoma kod odraslih. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5