RS64179B1 - Dvostruko ciljanje - Google Patents

Description

OPIS

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na molekule sa dvostrukim ciljanjem zasnovane na antitelima i na metode za generisanje takvih molekula sa dvostrukim ciljanjem, uključujući pristup zasnovan na biblioteci.

Osnove pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na projektovanje bispecifičnih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

U literaturi su prijavljeni različiti pristupi generisanju molekula bispecifičnih antitela. Ovi pristupi se mogu podeliti u dve kategorije: 1) generisanje bispecifičnih formata antitela u kojima dva paratopa koja prepoznaju dva cilja ili dva epitopa leže unutar jednog varijabilnog regiona heterodimernog antitela formiranog jednim komplementarnim VH-VL parom i oba sadrže CDR ostatke koji pripadaju ovom komplementarnom VH-VL paru, i 2) generisanje drugih bispecifičnih formata antitela u kojima dva paratopa koja prepoznaju dva cilja ili dva epitopa ne leže unutar jednog varijabilnog regiona heterodimernog antitela formiranog jednim komplementarnim VH-VL parom i nijedan ne sadrži CDR ostatke koji pripadaju istom komplementarnom VH-VL paru.

U okviru prve kategorije pristupa, u literaturi su opisana samo dva metoda predvidljivog inženjeringa molekula bispecifičnih antitela, a o njima će se detaljno govoriti u nastavku u odeljcima [0014] do [0015]. Međutim, da bi se ovaj rad stavio u kontekst, prvo ćemo sažeti drugu kategoriju pristupa.

Ova druga kategorija pristupa (u kojoj dva paratopa koja prepoznaju dva cilja ili epitopa ne leže u okviru jednog varijabilnog regiona heterodimernog antitela formiranog jednim komplementarnim VH-VL parom i ne sadrže CDR ostatke koji pripadaju istom komplementarnom VH-VL paru) predstavlja veoma opsežan posao koji su obavili različiti prethodni radnici, a već su opisani brojni različiti primeri takvih bispecifičnih antitela.

U prvoj grupi primera koji pripadaju drugoj kategoriji pristupa, dva ili više fragmenata antitela (uključujući Fab fragmente, jednolančane Fv fragmente ili antitela sa jednim domenom) različitih specifičnosti kombinuju se hemijskom vezom ili genetskom fuzijom preko jednog ili više peptidnih veznika. Objavljeni formati bispecifičnih antitela u ovoj grupi primera uključuju sledeće:

a. Dijatela (Perisic et al., Structure.1994 Dec 15;2(12): 1217-26; Kontermann, Acta Pharmacol Sin. 2005 Jan;26(1):1-9; Kontermann, Curr Opin Mol Ther. 2010 Apr;12(2):176b. TandAbs etc. (Cochlovius et al., Cancer Res.2000 Aug 15;60(16):4336-41.) c. Pojedinačni domeni specifični za različite ciljeve genetski spojeni peptidnim veznicima (npr. Domantis: WO2008/096158; Ablynx: WO2007/112940)

d. Drugi (za kritike, pogledajte: Enever et al., Curr Opin Biotechnol.2009 Aug; 20(4): 405-11. Epub 2009 Aug 24.; Carter, Nat. Rev. Immunol.6, 343 (2006); P. Kufer et al., Trends Biotechnol. 22, 238 (2004)).

Da bi se poboljšala njihova potencijalna upotrebljivost u medicinskim primenama, in vivo serumski poluživot gore navedenih formata bispecifičnih antitela može da se produži primenom različitih tehnologija, uključujući sledeće:

a. dodavanje serumskog albumina ili entiteta koji vezuje serumski albumin, b. PEGilacija,

c. dodavanje proteinskog polimera genetskom fuzijom, kao što je HAPilacija (Schlapschy et al., Protein Eng Des Sel.2007 Jun; 20(6): 273-84. Epub 2007 Jun 26) ili XTEN (Schellenberger, Nat. Biotechnology 12 (2009) 1186).

U ovoj grupi primera, bispecifična antitela koja se sastoje od fragmenata antitela nemaju Fc region i stoga generalno ne pokazuju prirodno vezivanje za neonatalni Fc receptor FcRN, ne pokazuju prirodne efektorske funkcije (ADCC i CDC, ref.) punih IgG antitela i obično se ne mogu prečistiti preko afinitetnih smola izvedenih iz superantigena, kao što su proteinske A smole specifične za Fc region, na identičan način kao IgG antitela. Ove posledice nedostatka Fc regiona mogu da ograniče ostvarivi poluživot seruma, izvodljive primene kao aktivni sastojci lekova i ekonomsku proizvodnju takvih bispecifičnih antitela.

U drugoj grupi primera koji pripadaju drugoj kategoriji pristupa, bispecifična antitela sačinjavaju molekul sličan IgG-u i jedan ili više dodatnih pripojenih vezujućih domena ili entiteta. Takva antitela uključuju fuzione proteine IgG-scFv u kojima je jednolančani Fv spojen sa jednim od završetaka teških lanaca ili lakih lanaca (University of California, Biogen Idec, CAT/Medlmmune) i molekul dvostrukog varijabilnog domena (DVD-IgG) u kojima su dodatni VH domen i veznik spojeni sa N-krajem teškog lanca i dodatni VL domen i veznik su spojeni na N-kraj lakog lanca (Abbott). Uopšteno, ovi pristupi pate od nedostataka u pogledu proizvodnje, pristupačnosti i stabilnosti konstrukata.

U trećoj grupi primera koji pripadaju drugoj kategoriji pristupa, bispecifična antitela sačinjavaju antitela slična IgG-u koja su generisana ili modifikovana tako da ispoljavaju dve specifičnosti bez dodavanja daljeg vezujućeg domena ili entiteta. Takva antitela uključuju molekule IgG u kojima je prirodno homodimerni CH3 domen postao heterodimerni modifikacijom, npr. korišćenjem projektovane protuberacije (Ridgway et al., Protein Eng.

1996 Jul;9(7):617-21), razmene lanaca (Davis et al., Protein Eng Des Sel.2010 Apr;23(4):195-202. Epub 2010 Feb 4) ili konstruisanih suprotnih naboja (Novo Nordisk), čime se potencijalno omogućava da se dve polovine molekula sličnih IgG-u vežu za dva različita cilja putem vezivnih entiteta dodatih u Fc region, obično Fab regione sa N-krajem. Antitela u ovoj trećoj grupi primera takođe uključuju IgG molekule u kojima su neke strukturne petlje koje nisu prirodno uključene u kontakte antigena modifikovane da bi vezale dodatni cilj pored jedne koja je prirodno vezana putem CDR petlji varijabilnog regiona, na primer, tačkastim mutacijama u Fc regionu (npr. Xencor Fes vezivanje za FcgRIIb) ili diversifikacijom strukturnih petlji (npr. f-star Mab2 sa diversifikovanim CH3 domenom). Ovi pristupi imaju nedostatke u pogledu stabilnosti, proizvodnje, valencije i ograničenog afiniteta/primene.

Za razliku od svih gore navedenih primera bispecifičnih antitela u drugoj kategoriji, bispecifična antitela u prvoj kategoriji imaju dva paratopa specifična za dva cilja od kojih oba obuhvataju CDR ostatke koji se nalaze unutar istog heterodimernog VH-VL antitela varijabilnog regiona. U stručnoj literaturi su opisana samo četiri tipa molekula antitela koji se mogu pripisati ovoj prvoj kategoriji. Od ova četiri tipa, prvi tip antitela u suštini i nije bispecifičan jer ne može da specifično prepozna dva nepovezana cilja; drugi tip antitela se javlja prirodno, ali nije poznato da li se može predvidljivo projektovati jer nijedan primer takvog rada nije objavljen; i samo treći i četvrti tip antitela mogu se projektovati sa specifičnošću prema dva nepovezana cilja prema publikacijama. Četiri tipa molekula antitela koji se mogu pripisati prvoj kategoriji su sledeći:

unakrsno reaktivna antitela, koja imaju jednu široku specifičnost koja odgovara dvama ili više strukturno povezanih antigena ili epitopa. Za takva antitela dva antigena su povezana u sekvenci i strukturi. Na primer, antitela mogu da unakrsno reaguju sa srodnim ciljevima različitih vrsta, kao što su lizozim belanaca kokošijeg jajeta i ćureći lizozim (WO 92/01047) ili sa istim ciljem u različitim stanjima ili formatima, kao što su hapten i hapten konjugovan sa nosačem (Griffiths AD et al. EMBO J 199413: 143245-60). Moguće je namerno proizvesti antitela za unakrsnu reaktivnost. Na primer, antitela su projektovana da prepoznaju dva srodna antigena različitih vrsta (primer Genentech: ljudski LFA1 za vezivanje antitela projektovan da takođe veže rezus LFA1, čime se uspešno dobija lek Raptiva/Efalizumab). Slično tome, WO 02/02773 opisuje molekule antitela sa „dvostrukom specifičnošću“. Navedeni molekuli antitela su antitela dobijena ili izabrana u odnosu na više strukturno povezanih antigena, sa jednom specifičnošću vezivanja koja može da primi dva ili više strukturno povezanih ciljeva. Međutim, kao što je gore pomenuto, sva ova unakrsno reaktivna antitela nisu zaista bispecifična i nisu projektovana da posebno prepoznaju dva nepovezana cilja.

Nadalje, postoje polireaktivna autoantitela, koja se javljaju prirodno (Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531). Ova polireaktivna antitela imaju sposobnost da prepoznaju najmanje dva (obično više) različita antigena ili epitopa koji nisu strukturno povezani. Takođe je pokazano da će selekcije slučajnih peptidnih repertoara pomoću tehnologije prikaza faga na monoklonskom antitelu identifikovati niz peptidnih sekvenci koje odgovaraju mestu vezivanja antigena. Neke od sekvenci su veoma povezane, uklapaju se u konsenzus sekvencu, dok su druge veoma različite i zovu se mimotopi (Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271). Stoga je jasno da mesta vezivanja nekih heterodimernih VH-VL antitela imaju potencijal da se vežu za različite i ponekad nepovezane antigene. Međutim, kao što je gore pomenuto, takva polireaktivna antitela mogu se naći, ali nisu namerno projektovana korišćenjem predvidljivih metoda opisanih u stručnoj literaturi.

Jedan metod opisan u stručnoj literaturi koji omogućava inženjering bispecifičnih antitela sposobnih da vežu dva strukturno nepovezana cilja putem dva paratopa, pri čemu se oba nalaze unutar jednog komplementarnog heterodimernog VH-VL para i oba sadrže CDR ostatke koji pripadaju ovom komplementarnom VH-VL paru, odnosi se na antitela „dva u jednom”. Ova antitela „dva u jednom” su projektovana tako da se sastoje od dva paratopa koji se preklapaju korišćenjem metoda koji se donekle razlikuju od prethodnih metoda inženjeringa unakrsne reaktivnosti. Ovaj rad je opisan u WO 2008/027236 i Bostrom et al. (Bostrom et al., Science. 2009 Mar 20;323(5921):1610-4). U objavljenim primerima izolovan je heterodimerni VH-VL varijabilni region antitela specifičan za jedan cilj (HER2), a nakon toga je laki lanac ponovo diversifikovan da bi se postigla dodatna specifičnost za drugi cilj (VEGF ili receptor smrti 5). Za jedno od dobijenih antitela vezivanje je karakterisano rezolucijom strukture i utvrđeno je da je 11 od 13 VH i VL CDR ostataka koji su stupili u kontakt sa HER2 u jednom kompleksu antitela-antigena takođe stupilo u kontakt sa VEGF u alternativnom kompleksu antitela-antigena. Dok su objavljena antitela „dva u jednom” zadržala nanomolarne afinitete za HER2, samo jedan od klonova koje su objavili Bostrom et al. (2009) imao je nanomolarni afinitet od 300 nM za dodatni cilj, VEGF, dok su četiri ostala klona imala mikromolarne afinitete za dodatne ciljeve. Iako je ovaj pristup postigao vezivanje za dva strukturno nepovezana cilja, jasno je da je potreban stepen površinske kompatibilnosti između dva cilja kako bi se omogućile specifičnosti dva preklapajuća paratopa. Takođe nije detaljno opisano koliko su takva antitela „dva u jednom” visoko specifična za samo dva cilja i da li se može uočiti neko opšte nespecifično vezivanje ili „lepljivost“ takvih antitela, potencijalno izazvano potrebom za konformacionom fleksibilnošću bočnih lanaca smeštenih u preklapajućem delu dva paratopa.

Drugi metod opisan u stručnoj literaturi koji omogućava inženjering bispecifičnih antitela sposobnih da vežu dva strukturno nepovezana cilja putem dva paratopa, pri čemu se oba nalaze unutar jednog komplementarnog heterodimernog VH-VL para i oba sadrže CDR ostatke koji pripadaju ovom komplementarnom VH-VL paru, odnosi se na antitela koja sadrže komplementarne parove antitela sa jednim domenom. WO 2003/002609 i US 2007/026482 su opisali heterodimerna VH-VL antitela, u kojima varijabilni domen teškog lanca prepoznaje jedan cilj, a varijabilni domen lakog lanca prepoznaje drugi strukturno nepovezani cilj, i u kome su dva pojedinačna domena sa različitim specifičnostima kombinovana u jedan zajednički heterodimerni VH-VL varijabilni region. U objavljenim primerima takvih antitela, pojedinačni domeni su prvo odvojeno izabrani kao neupareni VH domen ili kao neupareni VL domen da bi vezali dva nepovezana cilja, a potom kombinovani u zajednički heterodimerni VH-VL varijabilni region specifičan za oba cilja.

Za sve molekule koji pripadaju prvoj kategoriji bispecifičnih antitela (koji su sposobni da vežu dva cilja kroz dva paratopa, oba borave unutar jednog komplementarnog heterodimernog VH-VL para i oba sadrže CDR ostatke koji pripadaju ovom komplementarnom VH-VL paru), nikakvi dodatni domeni ili entiteti ne moraju biti spojeni sa IgG molekulom, nijedna strukturna petlja molekula IgG ne mora se diversifikovati i ne moraju se koristiti ograničavajući hetero-bi-specifični Fc regioni da bi se postigla dvostruka specifičnost. Ovo ima nekoliko potencijalnih prednosti:

Rizik od smanjenja stabilnosti proteina je umanjen jer nijedna strukturna petlja ne mora se diversifikovati i ne moraju se modifikovati interfejsi konstantnih domena, što rezultira potencijalno znatno poboljšanim biofizičkim svojstvima antitela.

Nisu potrebni potencijalno lako proteolizovani ili potencijalno imunogeni veznici, što dovodi do poboljšanih mogućnosti razvoja antitela kao aktivnih sastojaka leka.

Ne može doći do neželjenog uparivanja VH i VL domena, čime se izbegavaju potencijalni nusproizvodi koji sadrže pogrešno uparene heterodimerne VH-VL varijabilne regione tokom ekspresije jer je potreban samo jedan jedinstveni VH region i jedan jedinstveni VL region.

Ne očekuje se redukovana ekspresija ili formiranje neobičnih kovalentnih agregata jer nisu potrebne dodatne disulfidne veze u poređenju sa konvencionalnim monospecifičnim antitelima.

Bispecifični heterodimerni varijabilni regioni koji se sastoje od dva paratopa unutar jednog komplementarnog heterodimernog VH-VL para mogu da se kombinuju sa različitim konstantnim domenima, uključujući Fc regione. Ovo nudi nekoliko prednosti:

a. Potencijalno poboljšana proizvodnja primenom potpuno utvrđenih metoda, na primer, metoda identičnih onima koji se koriste u proizvodnji konvencionalnih monospecifičnih IgG-ova.

b. FcRn posredovana modulacija poluživota u serumu kod pacijenata i životinjskih modela.

c. Slobodan izbor efektorskih funkcija povezanih sa različitim izotipovima, u rasponu od necitotoksičnog, u suštini inertnog ponašanja (na primer, kod antitela projektovanih za blokadu receptora) do agresivnog citotoksičnog ponašanja (na primer, kod antitela projektovanih za ubijanje tumorskih ćelija).

Gornji treći primer antitela „dva u jednom” izvedenih metodima vezanim za inženjering unakrsne reaktivnosti potencijalno je znatno ograničen u svojoj medicinskoj primenljivosti konkurencijom dva nepovezana cilja za preklapajuće, barem delimično deljene ostatke vezivanja unutar CDR petlji. Dalje, inherentno sekvencijalni selekcioni proces antitela „dva u jednom”, sa specifičnošću koja je prvo postignuta za jedan cilj, praćena ponovnom diversifikacijom i zatim otkrivanjem klonova specifičnih za dodatni cilj, dugotrajan je i nepredvidiv jer se samo ograničeni broj antitela specifičnih za prvi cilj može ponovo diversifikovati u biblioteke koje se mogu izabrati, ali nije poznato koji će od prvih specifičnih klonova biti najpogodniji za inženjering dodatne željene specifičnosti. Konačno, izolacija i sazrevanje afiniteta antitela „dva u jednom” ozbiljno su zakomplikovani činjenicom da svako poboljšanje sekvenci varijabilnih domena za povećanje vezivanja za jedan cilj može potencijalno izazvati smanjenje afiniteta za drugi cilj.

Gorenavedeni četvrti primer vezivanja jednog cilja putem ostataka CDR petlje lakog lanca i drugog cilja putem ostataka CDR petlje teškog lanca ozbiljno je zakomplikovan činjenicom da se neki od potencijalno važnih ostataka CDR lakog lanca odgovornih za vezivanje za prvi cilj nalaze direktno pored nekih od potencijalno važnih ostataka CDR teškog lanca odgovornih za vezivanje za drugi cilj u konačnom, upakovanom, bispecifičnom heterodimernom varijabilnom regionu antitela. To znači da se u svom vezanom stanju, zbog sterne smetnje prvi cilj koji takva antitela prepoznaju može potencijalno takmičiti sa drugim ciljem koji takva antitela prepoznaju, što potencijalno ograničava medicinsku primenljivost takvih antitela. Dalje, ako su laki lanci i teški lanci takvih antitela izolovani nezavisno metodima selekcije i skrininga kao što je opisano u istorijskom primeru US2007026482 (Abbott Laboratories), njihovo kombinovanje u bispecifična antitela može potencijalno uticati na afinitete prvobitno nezavisnih domena prema pojedinačnim ciljevima u kombinovanim bispecifičnim molekulima usled konformacionih promena u CDR-ovima koje bi potencijalno mogle da nastanu nakon uparivanja teških i lakih lanaca. Konačno, kombinovanje prethodno izolovanih VH i VL varijabilnih domena sa različitim CDR petljama verovatno će rezultirati nepredvidivom stabilnošću antitela, kao što su to opisali Wörn i Plückthun (1998) i Röthlisberger et al. (2005) da se važne interakcije i međusobna stabilizacija teških i lakih lanaca antitela javljaju između VH i VL domena.

Suprotno tome, bispecifični, heterodimerni varijabilni regioni koji sadrže dva paratopa unutar jednog komplementarnog heterodimernog VH-VL para mogu da se koriste kao fragmenti antitela kao što su Fab fragmenti ili jednolančani Fv fragmenti i ne bi zahtevali prisustvo Fc regiona da bi se postigla njihova dvostruka specifičnost, omogućavajući proizvodnju mikroba u odsustvu mehanizama N-glikozilacije sisara i njihovu upotrebu u terapijskim ili dijagnostičkim primenama gde je poželjna niska molekulska masa ili kratak poluživot u serumu.

Stoga, iako pristup sa dva paratopa unutar jednog komplementarnog heterodimernog VH-VL para nudi toliko prednosti, dosadašnji pokušaji, koji su gore opisani, imali su ograničen uspeh.

Stoga, još uvek postoji velika nezadovoljena potreba da se obezbedi poboljšani format za bispecifična antitela koji uključuje prednosti dva paratopa unutar jednog komplementarnog heterodimernog VH-VL para, istovremeno izbegavajući probleme primećene sa prethodnim konstruktima opisanim u stanju tehnike.

Rešenje za ovaj problem koje je obezbeđeno predmetnim pronalaskom, tj. projektovanjem dva paratopa za svaki komplementarni heterodimerni VH-VL par, pri čemu svaki paratop koristi ostatke iz CDR regiona iz oba VH i VL domena, do sada nije postignuto ili predloženo u stanju tehnike.

Sažetak pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na bispecifična antitela koja se karakterišu time što imaju dva paratopa za svaki komplementarni heterodimerni VH-VL par, pri čemu svaki paratop koristi ostatke iz CDR regiona iz oba VH i VL domena, kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

Stoga, u prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji sadrži najmanje jedan varijabilni vezujući domen koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL), pri čemu pomenuti vezujući domen obuhvata dva paratopa za dva nepovezana epitopa, pri čemu (i) vezivanje svakog paratopa za njegov epitop ne sprečava istovremeno vezivanje drugog paratopa za njegov odgovarajući epitop, i gde (ii) oba paratopa sadrže najmanje jedan ostatak od najmanje jednog VH CDR-a i najmanje jedan ostatak iz najmanje jednog VL CDR-a.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema predmetnom pronalasku.

U trećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku.

U četvrtom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku ili vektor prema predmetnom pronalasku.

U petom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metod za generisanje antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema predmetnom pronalasku, koji sadrži korak ekspresije sekvence nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku ili vektor prema predmetnom pronalasku, bilo in vitro ili iz odgovarajuće ćelije domaćina, uključujući ćeliju domaćina prema predmetnom pronalasku.

Takođe je opisana kolekcija antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata, pri čemu pomenuta kolekcija obuhvata diversifikovanu kolekciju sekvenci varijabilnog domena antitela gde su ili (i) najmanje 3 CDR ostatka sa Lib1 pozicija diversifikovana, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija se nalazi unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib2 pozicija nije diversifikovan, ili (ii) najmanje 3 CDR ostatka sa Lib2 pozicija su diversifikovana, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija se nalazi unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib1 pozicija nije diversifikovan.

Takođe je opisan postupak generisanja molekula bispecifičnog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji sadrži korake:

a. generisanje prve kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, sa diverzitetom u najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib1, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija je locirana unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib2 pozicija nije diversifikovan;

b. izbor prvog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za prvi cilj ili epitop iz navedene prve kolekcije;

c. generisanje druge kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, sa diverzitetom u najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib2, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija je locirana unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib1 pozicija nije diversifikovan;

d. izbor drugog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za drugi cilj ili epitop iz navedene druge kolekcije; i

e. generisanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira treći molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment koji sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, pri čemu treći molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment sadrži najmanje 3 ostatka pronađena u grupi Lib1 pozicija u prvom molekulu antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, od kojih se najmanje jedan ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedan ostatak se nalazi unutar VL domena, i gde treći molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment dalje obuhvata najmanje 3 ostatka pronađena u grupi Lib2 pozicija u drugom molekulu antitela ili njegovom funkcionalnom fragmentu, od kojih se najmanje jedan ostatak nalazi unutar VH domena, a najmanje jedan ostatak se nalazi unutar VL domena.

Takođe je opisan postupak generisanja molekula bispecifičnog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji sadrži korake:

a. generisanje prve kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, sa diverzitetom u najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib1, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija je locirana unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib2 pozicija nije diversifikovan;

b. izbor prvog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za prvi cilj ili epitop iz navedene prve kolekcije;

c. generisanje druge kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, od kojih svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, diversifikacijom pomenutog prvog molekula antitela njegovog funkcionalnog fragmenta uvođenjem diverziteta na najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib2, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija se nalazi unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib1 pozicija nije diversifikovan; i d. izbor drugog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za pomenuti prvi i drugi cilj ili epitop iz pomenute druge kolekcije; i

e. alternativno, izvođenje koraka a. do d. uz modifikaciju da se prva kolekcija u koraku a. generiše diversifikacijom najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib2, a u koraku c. diversifikacijom navedenog prvog antitela ili njegovog fragmenta antitela na

1

najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib1.

U šestom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske preparate koji sadrže molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens.

Kratak opis slika

Slika 1 ispod prikazuje listu poželjnih CDR pozicija od kojih sve ili podskup treba da se diversifikuju u bibliotekama antitela u nekim oblicima predmetnog pronalaska (A), listu poželjnih opcionih pozicija za poboljšanje u okvirnim regionima koji se takođe mogu diversifikovati u bibliotekama antitela u nekim oblicima predmetnog pronalaska (B) i listu CDR pozicija od kojih su sve ili podskup poželjno ostavljene nepromenljive u svim bibliotekama predmetnog pronalaska, tj. i u bibliotekama u kojima su Lib1 ostaci diversifikovani i u bibliotekama u kojima su Lib2 ostaci diversifikovani (C).

Slika 2 ispod na šematski način ilustruje proces otkrivanja novih bispecifičnih antitela, koristeći perspektivu pogleda odozgo (iz vazduha) kako bi se pokazalo kako se heterodimerni nosač VH-VL antitela prvo diversifikuje odvojeno u dva regiona koji predstavljaju ostatke Lib1 i Lib2 CDR; time se dobijaju dve biblioteke koje su odvojeno izabrane da dobiju dva klona antitela, pri čemu jedan klon vezuje prvi cilj ili epitop preko prvog paratopa, a drugi klon vezuje drugi cilj ili epitop preko drugog paratopa; ovi klonovi se zatim kombinuju u bispecifično antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom, uvođenjem ciljno specifičnih ostataka izabranih na Lib1 pozicijama u prvom klonu antitela u drugi klon antitela ili uvođenjem ciljno specifičnih ostataka izabranih na Lib2 pozicijama u drugom klonu antitela u prvi klon antitela. Slika 2 takođe na šematski način ilustruje lokaciju tih ostataka koji poboljšavaju potencijal prema trenutnom pronalasku u okvirnim regionima koji su vidljivi iz perspektive pogleda odozgo (iz vazduha).

Slika 3 prikazuje četiri poželjna dizajna biblioteke (biblioteke Lib D1L1, Lib D1L2, Lib D1H1 i Lib D1H2) koje smo testirali. Svaku od ove četiri biblioteke smo proizveli kao skup sintetičkih gena koji kodiraju ljudske Fab fragmente sa prikazanim VH3-VK1 uparivanjem kao heterodimernom VH-VL skelom. Sintetički geni u svakoj biblioteci bili su konstantni u pozicijama za koje se specifična amino-kiselina prikazuje u jednoslovnom kodu i diversifikovani u pozicijama označenim sa „X”. Svaka od četiri biblioteke je proizvedena kao biblioteka za prikaz faga i sortirana prema nekoliko antigena korišćenjem standardnih metoda poznatih u struci. Izabrani klonovi antitela iz ove četiri biblioteke su kombinovani u bispecifična antitela prikazana na slici 4. Slika 3 dalje prikazuje tri dodatna poželjna dizajna biblioteke (Lib D1H3, Lib D2L1 i Lib D2H1).

Slika 4 daje primere sekvenci bispecifičnih antitela, koji su generisani prema predmetnom pronalasku.

Slika 5 prikazuje specifičnost antitela otkrivenih na slici 4, demonstriranu ELISA analizom anti-MBP anti-GST klona HM2LG1 za dvostruko ciljanje.

Slika 6 prikazuje Biacore™ podatke koji ilustruju visoku specifičnost bispecifičnih konstrukata prema pronalasku.

Slika 7 prikazuje Biacore™ analizu roditeljskih i bispecifičnih antitela protiv VEGF i IL6.

Slika 8 prikazuje Biacore™ podatke koji ilustruju nezavisno istovremeno vezivanje dva cilja na bispecifični konstrukt prema pronalasku: A: istovremeno vezivanje GMCSF antitelo IL6; B: istovremeno vezivanje anti-LC antitelo IL6

Detaljan opis pronalaska

Specifičnost ovog pronalaska u poređenju sa ranijim pristupima za izgradnju bispecifičnih antitela je do sada nepoznata mogućnost da za svaki komplementarni heterodimerni VH-VL par postoje dva paratopa, pri čemu svaki paratop koristi ostatke iz CDR regiona iz VH i VL domena.

Stoga, u prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji sadrži najmanje jedan varijabilni vezujući domen koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL), pri čemu pomenuti vezujući domen obuhvata dva paratopa za dva nepovezana epitopa, pri čemu (i) vezivanje svakog paratopa za njegov epitop ne sprečava istovremeno vezivanje drugog paratopa za njegov odgovarajući epitop, i gde (ii) oba paratopa sadrže najmanje jedan ostatak od najmanje jednog VH CDR-a i najmanje jedan ostatak iz najmanje jednog VL CDR-a.

Kako se ovde koristi, termin „antitelo” se odnosi na molekul imunoglobulina (Ig) koji je definisan kao protein koji pripada klasi IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD (ili bilo kojoj njihovoj potklasi), koja uključuje sva konvencionalno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente. „Funkcionalni fragment” molekula antitela/imunoglobulina se ovde definiše kao fragment molekula antitela/imunoglobulina (npr. varijabilni region IgG) koji zadržava region koji se vezuje za antigen. „Antigen vezujući region” antitela se obično nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (ili regiona koji određuje komplementarnost, „CDR”) molekula antitela, tj. CDR-1, -2 i/ili -3 regiona; međutim, varijabilni „okvirni” regioni takođe mogu da imaju važnu ulogu u vezivanju antigena, kao što je obezbeđivanje skele za CDR-ove. Poželjno, „antigen vezujući region” sadrži najmanje aminokiselinske ostatke 4 do 103 varijabilnog lakog (VL) lanca i 5 do 109 varijabilnog teškog (VH) lanca, poželjnije aminokiselinske ostatke 3 do 107 VL i 4 do 111 od VH, a posebno poželjni su kompletni VL i VH lanci (pozicije aminokiselina 1 do 109 VL i 1 do 113 VH; numerisanje prema WO 97/08320). Poželjna klasa molekula antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku je IgG.

„Funkcionalni fragmenti” ovog pronalaska uključuju domen F(ab')2 fragmenta, Fab fragmenta, scFv ili konstrukte koji sadrže jednostruke imunoglobulinske varijabilne domene ili polipeptide antitela sa jednim domenom, npr. jednostruki varijabilni domeni teškog lanca ili jednostruki varijabilni domeni lakog lanca. F(ab')2 ili Fab mogu da budu projektovani da svedu na minimum ili potpuno uklone intermolekularne disulfidne interakcije koje se javljaju između CH1 i CL domena.

Antitelo može biti izvedeno imunizacijom životinje ili iz biblioteke rekombinantnih antitela, uključujući biblioteku antitela koja se zasniva na sekvencama amino-kiselina koje su dizajnirane in silico i kodirane nukleinskim kiselinama koje su dobijene sintetički. In silico dizajn sekvence antitela se postiže, na primer, analizom baze podataka humanih sekvenci i osmišljavanjem polipeptidne sekvence koristeći podatke dobijene iz njih. Metodi za projektovanje i dobijanje sekvenci kreiranih in silico opisane su, na primer, u Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; i pat. br.

6.300.064 u SAD izdat za Knappik et al.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „molekul bispecifičnog antitela” se odnosi se na molekul antitela, uključujući funkcionalni fragment molekula antitela, koji sadrži specifična mesta vezivanja za dva različita ciljna biomolekula ili dva različita epitopa, koji su prisutni na jednom ciljnom biomolekulu ili na dva različita molekula, kao što su ciljni biomolekul i drugi biomolekul.

Kako se ovde koristi, vezujući molekul je „specifičan za”, „specifično prepoznaje” ili „specifično se vezuje za” cilj, kao što je ciljni biomolekul (ili epitop takvog biomolekula), kada je takav vezujući molekul u stanju da razlikuje takav ciljni biomolekul i jedan ili više referentnih molekula, pošto specifičnost vezivanja nije apsolutna već relativna osobina. U svom najopštijem obliku (i kada se ne pominje nikakva definisana referenca), „specifično vezivanje” se odnosi na sposobnost vezujućeg molekula da razlikuje željeni ciljni biomolekul i nepovezani biomolekul, kao što je određeno, na primer, u skladu sa specifičnošću metoda ispitivanja poznatih u struci. Takvi metodi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, testove Western blot, ELISA, RIA, ECL, IRMA i skeniranje peptida. Na primer, može se obaviti standardni ELISA test. Bodovanje može da se sprovede standardnim razvojem boje (npr. sekundarno antitelo sa peroksidazom rena i tetrametil benzidin sa hidrogenperoksidom). Reakcija u određenim bunarčićima postiže se optičkom gustinom, na primer, na 450 nm. Tipična pozadina

1

(= negativna reakcija) može da bude oko 0,1 OG; tipična pozitivna reakcija može da bude oko 1 OG. To znači da odnos između pozitivnog i negativnog rezultata može da bude 10 puta veći ili više od toga. Tipično, određivanje specifičnosti vezivanja vrši se korišćenjem ne jednog referentnog biomolekula, već skupa od oko tri do pet nepovezanih biomolekula, kao što su mleko u prahu, BSA, transferin ili slično.

U kontekstu predmetnog pronalaska, pojam „oko” ili „približno” znači između 90% i 110% date vrednosti ili opsega.

Međutim, „specifično vezivanje” takođe može da se odnosi na sposobnost vezujućeg molekula da pravi razliku između ciljnog biomolekula i jednog ili više blisko srodnih biomolekula, koji se koriste kao referentne tačke. Dodatno, „specifično vezivanje” može da se odnosi na sposobnost vezujućeg molekula da pravi razliku između različitih delova svog ciljnog antigena, npr. različitih domena, regiona ili epitopa ciljnog biomolekula, ili između jednog ili više ključnih aminokiselinskih ostataka ili nizova aminokiselinskih ostataka ciljnog biomolekula.

U kontekstu predmetnog pronalaska, pojam „paratop” se odnosi na onaj deo datog molekula antitela koji je potreban za specifično vezivanje između cilja i molekula antitela. Paratop može da bude kontinuiran, tj. formiran od susednih aminokiselinskih ostataka prisutnih u molekulu antitela, ili diskontinuiran, tj. formiran od aminokiselinskih ostataka koji su na različitim pozicijama u primarnoj sekvenci aminokiselinskih ostataka, kao što je aminokiselinska sekvenca CDR-ova aminokiselinskih ostataka, ali u neposrednoj blizini trodimenzionalne strukture, koju molekul antitela usvaja.

U kontekstu predmetnog pronalaska, pojam „epitop” se odnosi na onaj deo datog cilja koji je potreban za specifično vezivanje između cilja i antitela. Epitop može da bude kontinuiran, tj. formiran od susednih strukturnih elemenata prisutnih u cilju, ili diskontinuiran, tj. formiran strukturnim elementima koji su na različitim pozicijama u primarnoj sekvenci cilja, kao što je aminokiselinska sekvenca proteina kao cilj, ali u neposrednoj blizini u trodimenzionalnoj strukturi, koju cilj usvaja u prirodnom okruženju, na primer, u telesnoj tečnosti.

U jednom obliku, antitelo ili njegov funkcionalni fragment je bispecifično antitelo. U daljim oblicima antitela ili funkcionalnog fragmenta predmetnog pronalaska, količina vezivanja svakog paratopa za odgovarajući epitop u istovremenom prisustvu oba epitopa je najmanje 25% količine vezivanja koja se postiže u odsustvu drugog epitopa pod inače identičnim uslovima.

U daljim oblicima antitela ili funkcionalnog fragmenta predmetnog pronalaska, količina vezivanja je najmanje 50%, naročito najmanje 75%, a tačnije najmanje 90%.

U daljim oblicima antitela ili funkcionalnog fragmenta predmetnog pronalaska, prvi paratop sadrži ostatke iz CDR1 i CDR3 VL domena i CDR2 VH domena, a drugi paratop sadrži ostatke iz CDR1 i CDR3 VH domena i CDR2 VL domena.

U određenim oblicima, antitelo ili njegov funkcionalni fragment je ljudsko antitelo ili njegov funkcionalni fragment.

U daljim oblicima, antitelo ili funkcionalni fragment predmetnog pronalaska zasniva se na humanoj sekvenci teškog lanca porodice VH3 i humanoj sekvenci lakog lanca porodice Vkappa1.

U daljim oblicima, antitelo ili funkcionalni fragment predmetnog pronalaska se zasniva na humanoj sekvenci teškog lanca porodice VH3 i humanom lakom lancu porodice Vlambda1.

U daljim oblicima, antitelo ili funkcionalni fragment predmetnog pronalaska je izabran iz jednolančanog Fv fragmenta, Fab fragmenta i IgG-a.

U daljim oblicima antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta u okviru ovog pronalaska, vezivanje za jedan epitop može da bude izbačeno mutiranjem jedne od Lib1 ili Lib2 pozicija, dok vezivanje za drugi epitop ostaje netaknuto.

U tom kontekstu, fraza „vezivanje ... [je] ... izbačeno” se odnosi na situaciju u kojoj je afinitet prema epitopu smanjen najmanje 10 puta (npr. od 1 nM do 10 nM), a fraza „vezivanje... ostaje netaknuto” se odnosi na situaciju u kojoj se afinitet prema epitopu smanjuje na maksimalno 3 puta (npr. od 1 nM do 3 nM).

U konkretnim takvim oblicima, vezivanje za jedan epitop može da bude izbačeno mutiranjem jedne od pozicija VL pozicije 27 ili VH pozicije 61, ili mutiranjem jedne od Lib2 pozicija VL pozicije 56 ili VH pozicije 28.

Posebno u takvim oblicima, vezivanje za jedan epitop može da bude izbačeno mutiranjem jednog od ostataka navedenih u odeljku [0066] do R, kada je ostatak izabran iz D, N, E i K, ili mutiranjem takvog ostatka na D, kada je ostatak različit od D, N, E ili K.

U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul koji sadrži najmanje jedan varijabilni domen antitela koji sadrži jedan varijabilni laki lanac i jedan varijabilni teški lanac, pri čemu se navedeni varijabilni domen antitela veže za najmanje prvi i drugi cilj, pri čemu je vezivanje navedenog varijabilnog domena antitela za navedeni prvi cilj nezavisno od vezivanja pomenutog varijabilnog domena antitela za navedeni drugi cilj i obrnuto, i pri čemu navedeni prvi i drugi cilj nisu ni antiidiotipska antitela niti nefiziološki peptidi, kao što su peptidi koji se koriste za mapiranje epitopa.

U kontekstu predmetnog pronalaska, vezivanje varijabilnog domena antitela za jedan

1

cilj je „nezavisno” od vezivanja za drugi cilj, kada je količina vezivanja prvog paratopa za odgovarajući epitop (prvi cilj) u istovremenom prisustvu oba cilja najmanje 25% količine vezivanja koja se postiže u odsustvu drugog cilja pod inače identičnim uslovima. Konkretno, količina vezivanja je najmanje 50%, naročito najmanje 75%, a tačno najmanje 90%.

U posebnim oblicima, navedeni prvi i navedeni drugi cilj su i fiziološki relevantni ciljevi i/ili njihovi epitopi, uključujući ciljeve povezane sa bolešću, kao što su antigeni vezani za rak, receptori ćelijske površine, citokini i/ili drugi signalni molekuli.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema predmetnom pronalasku.

U trećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku.

U četvrtom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku ili vektor prema predmetnom pronalasku.

U petom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metod za generisanje antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema predmetnom pronalasku, koji sadrži korak ekspresije sekvence nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku ili vektor prema predmetnom pronalasku, bilo in vitro ili iz odgovarajuće ćelije domaćina, uključujući ćeliju domaćina prema predmetnom pronalasku.

Takođe je opisana kolekcija antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata, pri čemu pomenuta kolekcija obuhvata diversifikovanu kolekciju sekvenci varijabilnog domena antitela gde su ili (i) najmanje 3 CDR ostatka sa Lib1 pozicija diversifikovana, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija se nalazi unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib2 pozicija nije diversifikovan, ili (ii) najmanje 3 CDR ostatka sa Lib2 pozicija su diversifikovana, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija se nalazi unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib1 pozicija nije diversifikovan.

Takođe opisana u kontekstu prethodnog odeljka je kolekcija antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu je u slučaju (i) najmanje jedan ostatak svakog od CDR1 i CDR3 VL domena i CDR2 VH domena diversifikovan, ili u slučaju (ii) najmanje jedan ostatak svakog od CDR1 i CDR3 VH domena i CDR2 VL domena je diversifikovan.

Takođe opisano u kontekstu odeljka 76 je kolekcija antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu je u slučaju (i) najmanje jedan ostatak Lib1E pozicija u navedenom

1

varijabilnom vezujućem domenu dodatno diversifikovan, i/ili pri čemu je u slučaju (ii) najmanje jedan ostatak Lib2E pozicija u navedenom varijabilnom vezujućem domenu dodatno diversifikovan.

Takođe je opisan postupak generisanja molekula bispecifičnog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji sadrži korake:

a. generisanje prve kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, sa diverzitetom u najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib1, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija je locirana unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib2 pozicija nije diversifikovan;

b. izbor prvog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za prvi cilj ili epitop iz navedene prve kolekcije;

c. generisanje druge kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, sa diverzitetom u najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib2, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija je locirana unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib1 pozicija nije diversifikovan;

d. izbor drugog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za drugi cilj ili epitop iz navedene druge kolekcije; i

e. generisanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira treći molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment koji sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, pri čemu treći molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment sadrži najmanje 3 ostatka pronađena u grupi Lib1 pozicija u prvom molekulu antitela ili njegov funkcionalni fragment, od kojih se najmanje jedan ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedan ostatak se nalazi unutar VL domena, i gde treći molekul antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta dalje obuhvata najmanje 3 ostatka pronađena u grupi Lib2 pozicija u drugom molekulu antitela ili njegovom funkcionalnom fragmentu, od kojih se najmanje jedan ostatak nalazi unutar VH domena, a najmanje jedan ostatak se nalazi unutar VL domena.

Takođe je opisan postupak generisanja molekula bispecifičnog antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji sadrži korake:

a. generisanje prve kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, pri čemu svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, sa diverzitetom u najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib1, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija je locirana unutar

1

VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib2 pozicija nije diversifikovan;

b. izbor prvog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za prvi cilj ili epitop iz navedene prve kolekcije;

c. generisanje druge kolekcije molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta, od kojih svaki sadrži heterodimerni VH-VL varijabilni region, diversifikacijom pomenutog prvog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta uvođenjem diverziteta na najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib2, pod uslovom da se najmanje jedan diversifikovani ostatak nalazi unutar VH domena i najmanje jedna diversifikovana pozicija se nalazi unutar VL domena, i pri čemu nijedan ostatak sa Lib1 pozicija nije diversifikovan;

d. izbor drugog molekula antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta specifičnog za pomenuti prvi i drugi cilj ili epitop iz pomenute druge kolekcije; i

e. alternativno, izvođenje koraka a. do d. uz modifikaciju da se prva kolekcija u koraku a. generiše diversifikacijom najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib2, a u koraku c. diversifikacijom navedenog prvog antitela ili njegovog fragmenta antitela na najmanje 3 CDR pozicije izabrane iz grupe Lib1.

Takođe opisan u kontekstu odeljaka 79 i 80 je metod koji dalje sadrži sledeći korak: f. ekspresija sekvence nukleinske kiseline generisane u koracima od a. do e. u ćeliji domaćina ili prevođenje nukleinske kiseline u protein koji predstavlja treći molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment.

Takođe je opisan metod, naznačen time što bilo koja od pomenute kolekcije čiji je diverzitet izabran iz grupe Lib1 uključuje dodatni diverzitet u najmanje jednoj poziciji za poboljšanje izabranoj iz grupe Lib1E i/ili pri čemu bilo koja od navedene kolekcije sa diverzitetom izabranim iz grupe Lib1 uključuje dodatni diverzitet u najmanje jednoj poziciji za poboljšanje izabranoj iz grupe Lib2E.

Takođe je opisan metod, pri čemu je navedena prva kolekcija identična biblioteci izabranoj iz grupe koju čine Lib D1L1, Lib D1L2 i Lib D2L1, ili je izvedena iz takve biblioteke koja ima diversifikovane pozicije prisutne u grupi koju čine Lib D1L1, Lib D1L2 ili Lib D2L1 u kombinaciji sa više od 90% identiteta sekvence, posebno više od 95% identiteta sekvence, u okvirnim regionima i pri čemu je navedena prva kolekcija identična biblioteci izabranoj iz grupe koju čine Lib D1H1, Lib D1H2, Lib D1H3 i Lib D2H1, ili je izvedena iz takve biblioteke koja ima diversifikovane pozicije prisutne u grupi koju čine Lib D1H1, Lib D1H2, Lib D1H3 ili Lib D2H1 u kombinaciji sa više od 90% identiteta sekvence, posebno više od 95% identiteta sekvence, u okvirnim regionima.

1

U određenim takvim oblicima, molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment je izabran iz jednolančanog Fv fragmenta, Fab fragmenta i IgG-a.

U devetom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske preparate koji sadrže molekul antitela ili njegov funkcionalni fragment, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijens. Preparati mogu da se formulišu npr. za primenu jednom dnevno, dva puta dnevno ili tri puta dnevno.

Fraza „farmaceutski prihvatljiv”, kao što se koristi u vezi sa preparatima iz pronalaska, odnosi se na molekularne entitete i druge sastojke takvih preparata koji su fiziološki podnošljivi i obično ne dovode do nepovoljnih reakcija kada se daju sisaru (npr. čoveku). Termin „farmaceutski prihvatljiv” takođe može da znači odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili naveden u američkoj farmakopeji ili drugoj opštepriznatoj farmakopeji za upotrebu kod sisara, a posebno kod ljudi.

U kontekstu predmetnog pronalaska, pojam „oko” ili „približno” znači između 90% i 110% date vrednosti ili opsega.

Termin „nosač” koji se primenjuje na farmaceutske preparate predmetnog pronalaska odnosi se na razblaživač, ekscipijens ili sredstvo sa kojim se primenjuje aktivno jedinjenje (npr. fragment bispecifičnog antitela). Takvi farmaceutski nosači mogu da budu sterilne tečnosti, kao što su voda, fiziološki rastvori, vodeni rastvori dekstroze, vodeni rastvori glicerola i ulja, uključujući ulja naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Pogodni farmaceutski nosači opisani su u delu „Remington's Pharmaceutical Sciences” autora A.R. Gennaro, 20. izdanje.

Aktivni sastojak (npr. fragment bispecifičnog antitela) ili preparat predmetnog pronalaska mogu da se koriste za lečenje najmanje jedne bolesti ili poremećaja, pri čemu je tretman prilagođen ili na odgovarajući način pripremljen za specifičnu primenu kako je ovde navedeno (npr. jednom dnevno, dva puta dnevno ili tri puta dnevno). U tu svrhu uputstvo za upotrebu i/ili informacije o pacijentu sadrže odgovarajuće informacije.

Aktivni sastojak (npr. molekul bispecifičnog antitela ili njegov fragment) ili sastav predmetnog pronalaska mogu da se koriste za proizvodnju medikamenta za lečenje najmanje jedne bolesti ili poremećaja, pri čemu je lek prilagođen ili na odgovarajući način pripremljen za specifičnu primenu kako je ovde navedeno (npr. jednom dnevno, dva puta dnevno ili tri puta dnevno). U tu svrhu uputstvo za upotrebu i/ili informacije o pacijentu sadrže odgovarajuće informacije.

Primeri

Sledeći primeri ilustruju pronalazak bez ograničavanja njegovog obima.

1

Dok prva kategorija molekula bispecifičnih antitela opisanih gore (sa dva paratopa specifična za dva cilja od kojih oba sadrže CDR ostatke koji se nalaze unutar istog heterodimernog VH-VL varijabilnog regiona antitela) nudi niz potencijalnih koristi kao što je gore opisano, pretpostavili smo da se može stvoriti potpuno nova klasa molekula antitela, koja pripada ovoj prvoj kategoriji molekula antitela, ali se u potpunosti razlikuje od gore pomenuta četiri primera koji su prijavljeni u literaturi. Pretpostavili smo da bi se sprovođenjem potpuno novog pristupa mogla postići drastična poboljšanja u inženjeringu antitela koja pripadaju ovoj prvoj kategoriji, u poređenju sa gore pomenutim primerima. Ova hipoteza uzela je u obzir činjenicu da gore pomenuti istorijski metodi imaju neka značajna potencijalna ograničenja u razvoju antitela kao aktivnih sastojaka leka.

Prema predmetnom pronalasku, opisujemo potpuno novu klasu bispecifičnih antitela, koja rešavaju ove probleme i imaju neočekivane i drastične prednosti. Pretpostavili smo da je moguće napraviti dva različita paratopa unutar VH-VL varijabilnog regiona heterodimernog antitela, od kojih svaki sadrži CDR ostatke i iz teškog lanca i lakog lanca, ali koji se ne preklapaju i poželjno se ne nalaze neposredno jedan pored drugog, kako bi se izbegle konformacione promene na jednom mestu vezivanja kao rezultat mutacija na drugom mestu vezivanja i kako bi se smanjila verovatnoća konkurencije između dva cilja u vezivanju za antitelo (smanjenjem moguće sterne smetnje između dva cilja u vezanom stanju). Dalje smo pretpostavili da bi ova nova klasa molekula antitela mogla da bude konstruisana tako što se prvo stvaraju dve biblioteke sintetičkih antitela, svaka u pozadini upakovanog heterodimernog VH-VL para, od kojih bi u jednoj prvi skup (Lib1) pozicija CDR teškog i lakog lanca mogao da bude diversifikovan, a u drugom nepreklapajućem skupu (Lib2) teškog i lakog lanca CDR pozicije mogu da budu diversifikovane. Zaključili smo da ako bi se takve biblioteke mogle formirati i uspešno izabrati paralelno u odnosu na dva nepovezana cilja, onda bi se potencijalno brzo mogla formirati bispecifična antitela uvođenjem specifičnih ostataka izabranih na Lib1 pozicijama tokom selekcija protiv prvog cilja u klon antitela sa specifičnim ostacima izabranim na Lib2 pozicijama tokom selekcija protiv drugog cilja. Suprotno tome, takođe smo zaključili da ako bi se takve biblioteke mogle formirati i uspešno izabrati protiv dva različita cilja, onda bi se mogla formirati bispecifična antitela uvođenjem ostataka izabranih na Lib2 pozicijama tokom selekcija protiv drugog cilja u klon antitela sa specifičnim ostacima izabranim na Lib1 pozicijama tokom selekcija protiv prvog cilja. Pretpostavili smo da bi ova strategija uvođenja skupa ostataka iz prvog antitela, kojim se definiše prva specifičnost, u drugo antitelo druge specifičnosti bila u velikoj meri potpomognuta stvaranjem obe biblioteke unutar identične ili vrlo slične skele koja definiše upakovani VH-VL par.

2

U ovoj primeni pokazujemo da smo uspešno implementirali ovaj pronalazak, stvarajući nekoliko bispecifičnih heterodimernih VH-VL antitela protiv dva potpuno nepovezana cilja. Važno je da su antitela brzo stvorena i bila izuzetno specifična za samo dva cilja, bez afiniteta za vezivanje za dodatne nepovezane ciljeve. Iznenađujuće, stvorena bispecifična antitela su pokazala ne samo visoku biofizičku stabilnost (koja nije dokazana za antitela koja vezuju jedan cilj kroz ostatke CDR petlje lakog lanca i drugi cilj kroz ostatke CDR petlje teškog lanca), već izuzetno visoku biofizičku stabilnost čak i u poređenju sa skelom koja se koristi u stvaranju antitela „dva u jednom” i u poređenju sa formiranim klonovima monospecifičnog antitela koji se koriste kao aktivni sastojci u lekovima dostupnim na tržištu. Konačno i iznenađujuće, koristeći primer bispecifičnog antitela protiv GM-CSF i TNF-alfa, uspeli smo da pokažemo da je jedna konzervativna tačkasta mutacija u CDR poziciji unutar Lib1 vezujućeg regiona koja pruža pretpostavljeni paratop uključen u TNF-alfa vezivanje u suštini ukinula vezivanje za TNF-alfa ostavljajući vezivanje za GM-CSF netaknutim, i da je drugačija konzervativna tačkasta mutacija u CDR poziciji unutar Lib2 vezujućeg regiona koja pruža pretpostavljeni paratop uključen u vezivanje GM-CSF potpuno ukinula vezivanje za GM-CSF ostavljajući vezivanje za TNF-alfa netaknutim. Ovo pokazuje da antitela našeg trenutnog pronalaska zaista mogu da vežu dva nepovezana cilja na visoko specifičan način, a ne putem opšte „lepljivosti” i da se, za razliku od gore navedenih bispecifičnih antitela poznatih u struci, dva mesta vezivanja koja su projektovana kao paratopi koji se ne preklapaju u suštini nezavisno ponašaju, mada se oba nalaze u jednom heterodimernom VH-VL varijabilnom regionu i oba sadrže CDR ostatke koji pripadaju istom heterodimernom varijabilnom regionu. Antitela predmetnog pronalaska stoga imaju ključne prednosti u odnosu na prethodna bispecifična antitela.

U poželjnim oblicima predmetnog pronalaska, poželjni proces otkrivanja obuhvata (1) korake generisanja para biblioteka zasnovanih na istoj ili veoma sličnoj heterodimernoj skeli VH-VL antitela diversifikacijom različitih CDR pozicija u prvoj i drugoj biblioteci, (2) korake opcionog uključivanja i diversifikacije izabranih okvirnih pozicija u VH-VL skeli u jednu ili obe biblioteke da potencijalno poboljšaju svojstva vezivanja klonova izabranih iz dve biblioteke, (3) korake nezavisnog izbora obe biblioteke protiv dva ciljna molekula ili epitopa i karakterizacije veziva za identifikaciju ciljnih klonova ili klonova antitela specifičnih za epitop sa željenim svojstvima, (4) korake uvođenja svih ostataka ili podskupova ostataka (poželjno većine ostataka, ali ne manje od 3 ostatka) izabranih u diversifikovanim pozicijama u klonu antitela izabranom iz jedne biblioteke i specifičnih za prvi cilj ili epitop u ciljno specifični klon antitela izabran iz druge biblioteke i specifičan za drugi cilj ili epitop. Da bi ovaj proces otkrivanja optimalno funkcionisao, neke grupe ključnih ostataka igraju važnu ulogu: Ispitivanjem molekularnih modela heterodimernih VH-VL antitela in silico i izvođenjem mutageneze neizabranih heterodimernih VH-VL „probnih” antitela bez specifičnosti (podaci nisu prikazani), izveli smo listu CDR ostataka koji bi se potencijalno mogli diversifikovati da bi se formiralo prvo potencijalno mesto vezivanja za prvi cilj (Lib1 ostaci) i listu CDR ostataka koji bi potencijalno mogli da se diversifikuju da bi formirali drugo potencijalno mesto vezivanja za drugi cilj (Lib2 ostaci). Takođe smo izveli listu potencijalnih ostataka koji vrše poboljšanje u okvirnim regionima antitela, koji su u presavijenom molekulu antitela u neposrednoj blizini ostataka Lib1 ili Lib2 CDR i koji potencijalno mogu da se diversifikuju kako bi modifikovali svojstva i poboljšali vezivanje prvog paratopa koji sadrži Lib1 CDR ostatke za prvi cilj (ostaci koji poboljšavaju Lib1E) i vezivanje drugog paratopa koji sadrži Lib2 CDR ostatke za drugi cilj (ostaci koji poboljšavaju Lib2E). Konačno, izveli smo listu CDR ostataka koji bi po mogućnosti ostali identični ili veoma slični u obe biblioteke kako bi održali invarijantno pakovanje centralnog jezgra regiona molekula antitela u obe biblioteke, koje bi tada takođe bile prisutne u svim kombinovanim klonovima bispecifičnih antitela koji sadrže skup ostataka Lib1 specifičnih za 1. cilj i opciono Lib1E, kao i skup Lib2 ostataka specifičnih za 2. cilj i opciono Lib2E ostataka. Zaključili smo da će ova invarijantna upakovana jezgra regiona štititi dva mesta vezivanja jedno od drugog, čineći prvi paratop protiv prvog cilja donekle imunim na štetne konformacione efekte koji su rezultat promena u drugom paratopu protiv drugog cilja. Zaista smo uspeli da pokažemo da se afiniteti i kinetika vezivanja klonova roditeljskih antitela obično usko podudaraju sa kombinovanim klonovima bispecifičnih antitela izvedenih iz roditeljskih klonova. Primer 8 ilustruje ovo korišćenjem tipičnih antigena VEGF i IL6 gde su roditeljska antitela IL6P sa afinitetom od 38 nM i VEGFP sa afinitetom od 11 nM kombinovana da bi se dobilo bispecifično antitelo VH6L sa afinitetom od 40 nM za IL6 i 7,8 nM za VEGF. Ovaj iznenađujuće visok nivo nezavisnosti dva mesta vezivanja omogućava im sazrevanje afiniteta i paralelno na način koji nije moguć za antitela „dva u jednom” (treći istorijski primer gore) ili bispecifične uparene heterodimere sa jednim domenom (četvrti istorijski primer gore). Takođe smo zaključili da invarijantna jezgra regiona mogu da ostvare razmak između dva mesta vezivanja, što im potencijalno omogućava da vežu dva cilja nezavisno bez konkurencije izazvane preklapanjem paratopa ili sternom smetnjom između prvog vezanog i drugog nevezanog cilja, u zavisnosti od prirode i molekularne veličine svakog ciljnog molekula. Zaista, koristeći tipične antigene GMCSF i IL6, prema pronalasku smo za novu klasu molekula bispecifičnih antitela uspeli da pokažemo da je za neke od kombinovanih klonova moguće istovremeno vezivanje oba antigena za jedan VH-VL varijabilni region. Štaviše, primer 9 ilustruje da afinitet istovremenog vezivanja drugog antigena na varijabilni region može da bude nezavisan od toga da li je prvi cilj prisutan ili odsutan. Mogućnost postizanja takvog istovremenog vezivanja za isti VH-VL varijabilni region i moguća nezavisnost vezivnih afiniteta istovremenog povezivanja nisu dokazane za druge tipove istorijskih bispecifičnih antitela i predstavljaju jedinstvenu prednost novih antitela prema predmetnom pronalasku. U nekim od novih bispecifičnih antitela, nezavisno ponašanje vezivanja može se dalje pokazati mutacijama poput onih navedenih u primeru 10. U takvim antitelima, moguće je izbaciti ili u velikoj meri smanjiti afinitet za prvi cilj, pritom ostavljajući afinitet za drugi cilj netaknutim, vršenjem tačkaste mutacije u Lib1 poziciji, i obrnuto, izbaciti ili u velikoj meri smanjiti afinitet za pomenuti drugi cilj, pritom ostavljajući afinitet za prvi cilj netaknutim, tačkastom mutacijom u Lib2 poziciji.

Primer 1: Izgradnja biblioteka

Sintetički genofondovi za biblioteke Lib D1L1 i Lib D1H1 nabavljeni su od GeneArta, dok su sintetički genofondovi za biblioteke D1L2 i D1H2 nabavljeni od Sloning Biotechnology. Sve četiri biblioteke su klonirane u novokonstruisani vektor za prikaz faga koji smo napravili od osnove pUC19 (koja je kupljena od NEB-a) dodavanjem M13 porekla, dva sintetička mesta vezivanja ribozoma koja pokreću ekspresiju teških i lakih lanaca antitela, i sintetičkih gena koji kodiraju dva signalna peptida koji pokreću sekreciju polipeptida antitela u periplazmu E. coli, humane CH1 i CK konstantne domene i skraćeni C-terminalni deo M13 proteina III fuzionisan sa C-terminusom humanog CH1 konstantnog domena. Biblioteke su transformisane u ćelije TG1 E. coli da bi se dobile 4 biblioteke sa transformisanim diverzitetima od po 109. Iz transformisanih ćelija TG1 E. coli, četiri biblioteke su proizvedene kao biblioteke faga koje prikazuju diversifikovane Fab fragmente, koristeći M13KO7 pomoćni fag i standardne metode molekularne biologije kako je opisano u (Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1<st>ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3<rd>ed., 2001).

Primer 2: Afinitetna selekcija

Veziva iz biblioteka fab-na-fag čestica mogu da se izaberu u skladu sa standardnim procedurama afinitetne selekcije (Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1<st>ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3<rd>ed., 2001) protiv imobilizovanih ciljeva MBP i GST.

Primer 3: Skrining

Čestice faga izabrane u primeru 2 mogu da se spasu inficiranjem bakterijskih ćelija

2

domaćina (Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1<st>ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3<rd>ed., 2001). Fab protein se ekspresuje iz pojedinačnih klonova i testira na specifično vezivanje na ciljeve MPB i GST. Pozitivni pogoci se koriste u sledećem koraku za kloniranje bispecifičnih konstrukata.

Primer 4: Kloniranje bispecifičnih antitela

Geni antitela su projektovani na osnovu željene aminokiselinske sekvence i kupljeni kao sintetički geni ili sintetički genski fragmenti od GeneArt-a ili DNK2.0. Geni koji kodiraju varijante antitela sa tačkastim mutacijama generisani su PCR-om ili PCR preklapanjem, korišćenjem polimeraze Pwo Master, kupljene od Roche-a, i sintetičkih oligonukleotida koji kodiraju željene tačkaste mutacije, kupljene od Thermo Fisher Scientific-a, prema uputstvima proizvođača. Vektor ekspresije E. coli Fab generisan je modifikacijom plazmida PuC19, koji je kupljen od New England Biolabs-a. Okosnica pUC19 je modifikovana dodavanjem dva sintetička mesta vezivanja ribozoma koja pokreću ekspresiju teških i lakih lanaca antitela, dve sintetičke sekvence signalnih peptida koje pokreću sekreciju lanaca antitela u periplazmu E. coli i jednog sa poreklom iz faga M13 koji potencijalno omogućava proizvodnju jednog lanca. Sintetički geni antitela, sintetički fragmenti gena antitela i PCR-om generisane varijante gena antitela koji kodiraju tačkaste mutacije su klonirani u ovaj vektor ekspresije E. coli Fab restrikcionom digestijom, korišćenjem restrikcionih endonukleaza kupljenih od Roche-a, nakon čega je usledila ligacija, korišćenjem LigaFast-a kupljenog od Promega-e, prema uputstvima proizvođača. Reakcije ligacije su transformisane u kompetentne ćelije TG1 E. coli kupljene od Stratagene-a ili Zimoresearch-a.

Primer 5: Ekspresija i prečišćavanje antitela

TG1 klonovi E. coli koji nose Fab ekspresione konstrukte su uzgajani u čvrstim i tečnim medijumima LB i TB, kupljenim od Carl Roth-a, koji su dopunjeni karbenicilinom i glukozom, kupljenim od VWR-a. Ekspresija antitela u tečnim kulturama izvedena je preko noći u Erlenmajer bocama u inkubatoru za mućkanje i indukovana je dodavanjem izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida (IPTG), kupljenog od Carl Roth-a, u medijum za rast. Supernatanti kulture koji sadrže izlučene Fab fragmente su prečišćeni centrifugiranjem ekspresionih kultura. Prečišćeni supernatanti kulture su dopunjeni sa 1% rastvorom streptomicina/penicilina, kupljenim od PAA Laboratories-a, 2% rastvorom 1M Tris pH 8,0, kupljenim od VWR-a, i 0,4% STREAMLINE rProtein A smole, kupljene od GE Healthcare-a. Dodatni supernatanti kulture su inkubirani u inkubatoru sa rolerom 3 sata ili preko noći kako bi se postiglo vezivanje Fab fragmenata na smolu proteina A. Smole su zatim prebačene u kolone sa gravitacionim protokom, jednom isprane korišćenjem 30 zapremina sloja 2x PBS pH 7,4, kupljenog od Invitrogen-a, isprane jednom upotrebom 5 zapremina sloja pufera koji sadrži 10 mM Tris pH 6,8 i 100 mM NaCl, kupljenog od VWR-a, i eluirane koristeći pufer koji sadrži 10 mM limunske kiseline pH3 i 100 mM NaCl, kupljen od VWR-a. Eluirani Fab fragmenti su neutralisani dodavanjem 8% 1M Tris pH 8,0. Neutralizovani prečišćeni Fab fragmenti su puferom promenjeni u čisti 1x PBS pH 7,4 (koji sadrži 1,06 mM KH2PO4, 2,97 mM Na2HPO4-7H2O, 155,17 mM NaCl i bez drugih dodataka; Invitrogen kataloški br. 10010056), koristeći kolone za odsoljavanje illustra NAP-5 kompanije GE Healthcare, prema uputstvima proizvođača.

Primer 6: Merenje stabilnosti antitela

Biofizička stabilnost prečišćenih, puferom razmenjenih Fab fragmenata je utvrđena u 1x PBS pH 7,4 (Invitrogen kataloški br. 10010056) korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). Za sva merenja korišćen je kapilarni ćelijski mikrokalorimetar opremljen autosamplerom i kontrolisan VPViewer2000 CapDSC softverom kompanije MicroCal. Svi Fab fragmenti su skenirani u odnosu na čist pufer koji ne sadrži antitela (1x PBS pH 7,4; Invitrogen kataloški br. 10010056). Parametri skeniranja su podešeni da analiziraju temperaturni prozor od 32 °C do između 105 °C i 115 °C, sa termostatom pre skeniranja od 2 minuta, termostatom nakon skeniranja od 0 minuta i bez pojačanja. Brzina skeniranja je postavljena na 250 °C na sat za skrining aplikacije i na 60 °C na sat za ponovnu analizu najstabilnijih kombinovanih mutanata. Apsolutna temperatura topljenja Fab fragmenata određena u režimu skrininga (brzina skeniranja 250 °C na sat) bila je za 3,7 °C do 4,5 °C viša nego u režimu ponovne analize (brzina skeniranja 60 °C na sat), ali rangiranje klonova je bilo isto u oba režima. Temperature topljenja Fab fragmenata su određene nakon PBS referentnog oduzimanja, korišćenjem Origin 7.0 softvera iz MicroCal-a.

Primer 7: Merenje specifičnosti antitela

Da bi se testirala specifičnost antitela izabranih iz biblioteka Lib1 i Lib2 protiv jednog cilja i specifičnosti bispecifičnih antitela dizajniranih da vežu oba cilja, sprovedeni su testovi imunog enzima (ELISA) primenom standardnih metoda. Ukratko, ploče Nunc Maxisorp pripremljene su premazivanjem Streptavidinom rastvorenim u 1x PBS-u, vezivanjem 20 nM biotinilovanih ciljeva (GST, MBP, HEL ili VEGF) u PBS-T (0,3% Tween-20 rastvoreno u 1x PBS-u) i blokiranjem sa 5% obranog mleka u prahu u PBS-T. Nakon toga, dodato je 50 µl supernatanta kulture E. coli TG1 koji eksprimuju klonove antitela kao rastvorljive Fab fragmente u mikrotitarskim pločama, nakon čega je usledila detekcija vezanih Fab fragmenata korišćenjem poliklonskog antitela lakog lanca kozjeg anti-humanog kapa (Sigma) ili mišjeg

2

anti-Strep antitela (IBA) specifičnog za Strep-II tag fuzionisan na C-terminus teškog lanca u rastvorljivom Fab ekspresionom konstruktu. Sekundarna antitela su otkrivena korišćenjem tercijarnih antitela označenih HRP-om, ELISA su razvijeni korišćenjem TMB supstrata (KPL), a signal je kvantifikovan korišćenjem čitača Victor ploča iz PerkinElmer-a podešenog na 450 nm. Utvrđeno je da probni Fab 1 izlučen u supernatant kulture E. coli ne vezuje nijedan od četiri cilja, Fab LG1 (koji je izabran iz biblioteke Lib D1L1) vezuje samo GST, Fab HM2 (koji je izabran iz biblioteke Lib D1H1) vezuje samo MBP, a Fab DT3 (koji je kombinovao sve ostatke specifične za cilj pronađene u Fabs LG1 i HM2) vezuje samo GST i MBP. Nijedan od klonova nije vezao kontrolne ciljeve HEL ili VEGF (slika 5). Eksperimenti su izvedeni u duplikatu koristeći dve nezavisne kolonije za svaki Fab.

Primer 8: Afiniteti roditeljskih i bispecifičnih antitela

Biblioteke antitela izabrane su protiv humanog VEGF (Peprotech kataloški broj 100-20) i humanog IL6 (Peprotech kataloški broj 200-06). Od izolovanih klonova roditeljskih antitela, IL6P i VEGFP su kombinovani u bispecifični klon antitela VH6L. Sekvenca VH6L je prikazana na slici 4, koja pokazuje dodatnu tačkastu mutaciju na amino-kiselini 4 lakog lanca. Da bi se procenili afiniteti roditeljskih i bispecifičnih antitela, izvršena je Biacore™ analiza kako bi se analiziralo ponašanje vezivanja IL6P, VH6L i VEGFP. Zbog toga je antitelo za hvatanje lakog lanca imobilisano na CM5 čip korišćenjem amin-sparivanja, što je rezultiralo sa 12000 RU. Fab fragmenti su uhvaćeni do nivoa od 400-500 RU i preko čipa je prošla serija koncentracija IL6 i VEGF, u rasponu od 0 do 450 nM. Kao što je prikazano na slici 7, klon IL6P se vezuje za IL6, ali ne i za VEGF, klon VEGFP se vezuje za VEGF, ali ne i za IL6, a kombinovani klon VH6L se vezuje i za IL6 i VEGF. Kao što je prikazano u tabeli 1, afiniteti prema ciljevima su slični za roditeljska i bispecifična antitela. Konstanta disocijacije, KD, je 38 nM i 40 nM za IL6P i VH6L, te 11 nM i 7,8 nM za VEGFP i VH6L, datim redosledom.

Tabela 1. Merenja afiniteta

2

Primer 9: Istovremeno vezivanje dva antigena na isti VH-VL varijabilni region Da bi se pokazalo da bispecifična antitela prema pronalasku mogu da istovremeno vezuju dva različita antigena kroz isti VH-VL varijabilni region, izveden je eksperiment Biacore™ koji koristi klon bispecifičnog antitela GH6L specifičan za humani GMCSF i humani IL6. Sekvenca GH6L je prikazana na slici 4, koja pokazuje dodatnu tačkastu mutaciju na amino-kiselini 4 lakog lanca. Antitelo je ekspresovano u humanom IgG1 formatu korišćenjem standardnih vektora ekspresije sisara koji nose GH6L teški i laki lanac i signalni peptidni cDNA, prolaznom transfekcijom ćelija HEK293-6E. Ekspresovani IgG je afinitetno prečišćen korišćenjem smole proteina A. Za Biacore™ analizu, GMCSF (Peprotech kataloški broj 300-03) ili antitelo za hvatanje lakog lanca je imobilizovano na CM5 čip korišćenjem amin-sparivanja, što je rezultiralo sa 4000 RU odnosno 12000 RU u slučaju imobilizovanog GMCSF i antitela za hvatanje lakog lanca.

GH6L je uhvaćen na pripremljenim površinama i u svakom slučaju je preko prešla serija koncentracija IL6 (Peprotech kataloški broj 200-06), a podaci su analizirani korišćenjem BIAevaluation softvera. Kao što se može videti na slici 8A, GH6L uhvaćen za GMCSF može da se vezuje za IL6. Kontrolni eksperiment ubrizgavanja GMCSF-a nije doveo do signala koji pokazuje da je signal vezivanja IL6 nastao zbog istovremenog vezivanja na istom VH-VL varijabilnom regionu, a ne zbog vezivanja „slobodnog kraka” GH6L koji nije u interakciji sa GMCSF-om na površini čipa. Na slici 8B, GH6L je uhvaćen generičkim antitelom za hvatanje lakog lanca da bi se izmerio afinitet vezivanja IL6 GH6L bez prisustva GMCSF-a. Upoređujući slike 8A i 8B, može se videti da se GH6L vezuje za IL6 sa sličnim afinitetom bez obzira na to da li je GH6L vezan za GMSCF ili ne.

Primer 10: Nezavisno ponašanje vezivanja

Za nekoliko bispecifičnih antitela prema pronalasku, nezavisno ponašanje dva mesta vezivanja može se pokazati korišćenjem mutageneze usmerene na mesto pojedinačnih ostataka lociranih unutar regiona vezivanja Lib1 ili Lib2. U jednom slučaju, mutiran je klon bispecifičnog antitela usmeren protiv cilja A i cilja B.

Ugrađivanjem jedne konzervativne LCDR3 tačkaste mutacije H93Y unutar regiona vezivanja Lib1 koji obezbeđuje pretpostavljeni paratop uključen u vezivanje za cilj A, afinitet za cilj A je u velikoj meri ukinut, dok je afinitet za cilj B ostavljen netaknut.

Sa druge strane, ugradnjom jedne konzervativne LCDR2 tačkaste mutacije W56Y unutar regiona vezivanja Lib2 tog klona antitela koji obezbeđuje pretpostavljeni paratop uključen u afinitet vezivanja za cilj B, potpuno je ukinut, dok je afinitet za cilj A ostavljen netaknut.

2

U drugom slučaju, mutiran je klon bispecifičnog antitela usmeren protiv cilja C i cilja D. Ugrađivanjem jedne konzervativne LCDR1 tačkaste mutacije N27D unutar regiona vezivanja Lib1 koji obezbeđuje pretpostavljeni paratop uključen u vezivanje za cilj C, afinitet za cilj C je u velikoj meri ukinut, dok je afinitet za cilj D ostavljen netaknut.

Sa druge strane, ugrađivanjem jedne HCDR1 tačkaste mutacije L28D ili jedne LCDR2 tačkaste mutacije Y56D unutar regiona vezivanja Lib2 ovog drugog klona antitela koji obezbeđuje pretpostavljeni paratop uključen u vezivanje cilja D, afinitet za cilj D je ukinut dok je afinitet za cilj C ostao netaknut.

2

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Bispecifično antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji sadrži najmanje jedan varijabilni vezujući domen koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL), pri čemu pomenuti vezujući domen sadrži dva paratopa za dva nepovezana epitopa, pri čemu (i) vezivanje svakog paratopa za njegov epitop ne sprečava istovremeno vezivanje drugog paratopa za njegov odgovarajući epitop, i pri čemu (ii) prvi paratop sadrži ostatke iz CDR1 i CDR3 VL domena i CDR2 VH domena, a drugi paratop obuhvata ostatke iz CDR1 i CDR3 VH domena i CDR2 iz VL domena.

2. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema patentnom zahtevu 1, koje je bispecifično antitelo, pri čemu su navedena dva nepovezana epitopa prisutna na dva različita molekula.

3. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je količina vezivanja svakog paratopa za njegov odgovarajući epitop u istovremenom prisustvu oba epitopa najmanje 25% količine vezivanja koja se postiže u odsustvu drugog epitopa pod inače identičnim uslovima.

4. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je količina vezivanja najmanje 50%, posebno najmanje 75%, a tačnije najmanje 90%.

5. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, koje je humano antitelo ili njegov funkcionalni fragment.

6. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema patentnom zahtevu 5 koje se zasniva na humanoj sekvenci teškog lanca porodice VH3 i humanoj sekvenci lakog lanca porodice Vkappal.

7. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema patentnom zahtevu 5 koje se zasniva na humanoj sekvenci teškog lanca porodice VH3 i humanoj sekvenci lakog lanca porodice Vlambdal.

8. Antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu je antitelo ili njegov funkcionalni fragment izabran iz jednolančanog Fv fragmenta, Fab fragmenta i IgG-a.

9. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov funkcionalni fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 8.

10. Vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 9.

11. Ćelija domaćin, koja je izolovana ćelija domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 9 ili vektor prema patentnom zahtevu 10.

12. Postupak generisanja antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta prema bilo

2

kojem od patentnih zahteva 1 do 8, sadrži korak ekspresije sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 9, ili vektor u skladu sa patentnim zahtevom 10, bilo in vitro ili iz odgovarajuće ćelije domaćina, koja je izolovana ćelija domaćina uključujući ćeliju domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 11.