RS64192B9 - Metode lečenja cistične fibroze - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova prijava ima pravo prvenstva po osnovu provizorne prijave US 62/767,202, podnete 14. novembra 2018.

[0002] Ovde je opisan modulator regulatora transmembranske provodljivosti cistične fibroze (CFTR), farmaceutske kompozicije koje sadrže modulator, metode lečenja cistične fibroze i postupak za pravljenje modulatora.

[0003] Cistična fibroza (CF) je recesivna genetska bolest koja pogađa oko 70.000 dece i odraslih širom sveta. Uprkos napretku u lečenju CF, ne postoji lek.

[0004] Kod pacijenata sa CF, mutacije u CFTR endogeno eksprimirane u respiratornom epitelu dovode do smanjene apikalne sekrecije anjona izazivajuć i neravnotežu u transportu jona i tečnosti. Nastalo smanjenje transporta anjona doprinosi poveć anom akumulaciji sluzi u plu ć ima i prate ć im mikrobnim infekcijama koje na kraju izazivaju smrt kod pacijenata sa CF. Pored respiratorne bolesti, pacijenti sa CF obično pate od gastrointestinalnih problema i insuficijencije pankreasa koji, ako se ne leče, dovode do smrti. Pored toga, već ina muškaraca sa cističnom fibrozom je neplodna, a plodnost je smanjena među ženama sa cističnom fibrozom.

[0005] Analiza sekvence CFTR gena je otkrila razne mutacije koje izazivaju bolesti (Cutting, G. R. et al. (1990) Nature 346:366-369; Dean, M. et al. (1990) Cell 61:863: 870; i Kerem, B-S i saradnici (1989) Science 245:1073-1080; Kerem, BS i saradnici (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8447-8451). Do danas je identifikovano više od 2000 mutacija u genu CF. CF mutacije su navedene u „Bazi podataka o mutacijama cistične fibroze“, koja se nalazi na http://www.genet.sickkids.on.ca/app. Najčešć a mutacija koja izaziva bolest je delecija fenilalanina na poziciji 508 CFTR aminokiselinske sekvence i obično se naziva mutacija F508del. Ova mutacija se javlja u približno 90 % slučajeva cistične fibroze i povezana je sa teškom bolešć u.

[0006] Brisanje ostatka 508 u CFTR sprečava pravilno savijanje nastalog proteina. Ovo rezultira nemoguć noš ć u mutantnog proteina da izađe iz endoplazmatskog retikuluma (ER) i da se prometuje do membrane plazme. Kao rezultat toga, broj CFTR kanala za transport anjona prisutnih u membrani je daleko manji nego što je primeć eno u ć elijama koje eksprimiraju CFTR divljeg tipa, tj. CFTR bez mutacija. Pored poreme ć ene, mutacija dovodi do neispravno gajtovanja kanala. Zajedno, smanjeni broj kanala u membrani i neispravna kapija kanala dovode do smanjenog transporta anjona i tečnosti kroz epitel. (Quinton, P. M. (1990), FASEB J. 4: 2709-2727). Kanali koji su defektni zbog F508del mutacije su i dalje funkcionalni, iako manje funkcionalni od CFTR kanala divljeg tipa. (Dalemans et al. (1991), Nature Lond. 354: 526-528; Pasyk i Foskett (1995), J. Cell. Biochem. 270: 12347-50). Pored F508del, druge mutacije koje izazivaju bolest u CFTR-u koje dovode do neispravnog prometa, sinteze i/ili gajtanja kanala mogu se regulisati naviše ili naniže da bi se promenila sekrecija anjona i modifikovala progresija i/ili težina bolesti.

[0007] CFTR je cAMP/ATP-posredovani anjonski kanal koji se eksprimuje u različitim tipovima ć elija, uključuju ć i ć elije apsorpcionog i sekretornog epitela, gde reguliše fluks anjona kroz membranu, kao i aktivnost drugih jonskih kanala i proteina. U epitelnim ć elijama, normalno funkcionisanje CFTR-a je kritično za održavanje transporta elektrolita u celom telu, uključujuć i respiratorno i digestivno tkivo. CFTR se sastoji od 1480 aminokiselina koje kodiraju protein koji se sastoji od tandem ponavljanja transmembranskih domena, od kojih svaki sadrži šest transmembranskih spirala i domen za vezivanje nukleotida. Dva transmembranska domena su povezana velikim, polarnim, regulatornim (R)-domenom sa višestrukim mestima fosforilacije koja regulišu aktivnost kanala i ć elijski promet.

[0008] Transport hlorida se odvija koordinisanom aktivnošć u ENaC i CFTR prisutnih na apikalnoj membrani i Na+-K+-ATPaznom pumpom i Cl-kanalima eksprimiranim na bazolateralnoj površini ć elije. Sekundarni aktivni transport hlorida sa luminalne strane dovodi do akumulacije intracelularnog hlorida, koji onda može pasivno napustiti ć eliju preko Clkanala, što rezultira vektorskim transportom. Raspored Na<+>/2Cl-/K<+>ko-transportera, Na<+>-K<+>-AT- Pase pumpe i K<+>kanala bazolateralne membrane na bazolateralnoj površini i CFTR na luminalnoj strani koordinišu lučenje hlorida preko CFTR na luminalnoj strani. Pošto se voda verovatno nikada sama po sebi ne transportuje aktivno, njen tok kroz epitel zavisi od malih transepitelijalnih osmotskih gradijenata generisanih velikim protokom natrijuma i hlorida.

[0009] Jedan broj CFTR modulirajuć ih jedinjenja je nedavno identifikovan. Međutim, jedinjenja koja mogu da leče ili smanje ozbiljnost cistične fibroze i drugih bolesti posredovanih CFTR, i čestica I dalje su potrebna kod težih oblika ovih bolesti.

[0010] Sve reference u opisu na metode lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0011] Dakle, jedan aspekt pronalaska obezbeđuje jedinjenje koje modulira CFTR, (14S)-8-[3-(2-{Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il}etoksi)-1H-pirazol-1-il]-12,12-dimetil-2l6-tia-3,9,11,18,23-pentaazatetraciklo [17.3.1.111,14.05,10]tetra-koza-1(22),5,7,9,19(23),20-heksan-2,2,4-trion (Jedinjenje I) i njegove farmaceutski prihvatljive soli. Jedinjenje I može se prikazati kao da ima sledeć u strukturu:

[0012] Drugi aspekti pronalaska obezbeđuju farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje I i/ili najmanje jednu njegovu farmaceutski prihvatljivu so, koje kompozicije mogu dalje da sadrže najmanje jedan dodatni aktivni farmaceutski sastojak i/ili najmanje jedan nosač. Još drugi aspekti pronalaska su metode lečenja cistične fibroze izazvane CFTR-om koje se sastoje od davanja jedinjenja I i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli, opciono kao dela farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jednu dodatnu komponentu, subjektu kod koga postoji potreba za tim. Dalji aspekt pronalaska opisuje procese pravljenja jedinjenja I i/ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli.

[0013] Jedna realizacija daje metod lečenja cistične fibroze posredovane CFTR-om, koji obuhvata primenu (14S)-8-[3-(2-{Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il}etoksi)-1H-pirazol-1-il]-12,12-dimetil-2λ6-tia-3,9,11,18,23-pentaazatetraciklo [17.3.1.111,14.05,10]tetrakoza-1(22),5,7,9,19(23),20-heksan-2,2,4-triona (Jedinjenje I), samostalno ili u kombinaciji sa (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroksipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroksi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5-il)ciklopropankarboksamidom (Jedinjenje II), i/ili N-[2,4-bis(1,1-dimetiletil)-5-hidroksifenil]-1,4-dihidro-4-oksohinolin-3-karboksamidom (Jedinjenje III) ili N-(2-(terc-butil)-5-hidroksi-4-(2-(metil-d3) propan-2-il-1,1,1,3,3,3-d6)fenil)-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksamidom (Jedinjenje III-d). U određenim realizacijama, metod lečenja cistične fibroze posredovane CFTR-om obuhvata primenu Jedinjenja I u kombinaciji sa Jedinjenjem III ili III-d i 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzojevom kiselinom (Jedinjenje IV). U nekim realizacijama, Jedinjenje I se primenjuje u istoj kompoziciji sa Jedinjenjem II i Jedinjenjem III. U nekim realizacijama, Jedinjenje I se primenjuje u istoj kompoziciji sa Jedinjenjem II i Jedinjenjem III-d. U nekim realizacijama, Jedinjenje I se primenjuje u istoj kompoziciji sa Jedinjenjem III i Jedinjenjem IV. U nekim realizacijama, Jedinjenje I se primenjuje u istoj kompoziciji sa Jedinjenjem III-d i Jedinjenjem IV. U nekim realizacijama, kompozicija koji sadrži Jedinjenje I se primenjuje zajedno sa odvojenom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje II i/ili Jedinjenje III. U nekim realizacijama, kompozicija koja sadrži Jedinjenje I se primenjuje zajedno sa odvojenom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje II i/ili Jedinjenje III-d. U nekim realizacijama, kompozicija koja sadrži Jedinjenje I se primenjuje zajedno sa odvojenom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje III i Jedinjenje IV. U nekim realizacijama, kompozicija koja sadrži Jedinjenje I se primenjuje zajedno sa odvojenom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje III-d i Jedinjenje IV.

Definicije

[0014] „Jedinjenje I“, kako se koristi u ovom pronalasku, odnosi se na (14S)-8-[3-(2-{Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il}etoksi-1H-pirazol-1-il]-12,12-dimetil-2λ6-tia-3,9,11,18,23-pentaazatetraciklo[17.3.1.111,14.05,10]tetrakoza 1(22), 5,7,9,19(23),20-heksan-2,2,4-trion, koji se može prikazati kao da ima sledeć u strukturu:

Jedinjenje I može biti u obliku izomerne smeše ili enantioobogać enih (npr. >90% ee, >95% ee, >98% ee) izomera. Jedinjenje I može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

[0015] "Jedinjenje II" kako se ovde koristi, odnosi se na (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)-N-(1-(2,3-) dihidroksipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroksi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5-il)ciklopropankarboksamid, koji se može prikazati sledeć om strukturom:

Jedinjenje II može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

[0016] "Jedinjenje III" kako se koristi u ovom pronalasku odnosi se na N-(5-hidroksi-2,4-di-terc-butil-fenil)-4-okso-1H-hinolin-3-karboksamid koji je prikazan u struktiri:

[0017] Jedinjenje III takođe može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli. U nekim realizacijama, deuterovani derivat Jedinjenja III (Jedinjenje III-d) se koristi u kompozicijama i postupcima koji su ovde prikazani. Hemijsko ime za Jedinjenje III-d je N-(2-(terc-butil)-5-hidroksi-4-(2-(metil-d3)propan-2-il-1,1,1,3,3,3-d6)fenil)-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksamid, kao što je prikazano strukturom:

Jedinjenje III-d može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

[0018] "Jedinjenje IV" kako se ovde koristi, odnosi se na 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin- 2-il)benzojeve kiseline, koja je prikazana hemijskom strukturom:

Jedinjenje IV može biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

[0019] Kako se ovde koristi, "CFTR" označava transmembranski regulator provodljivosti cistične fibroze.

[0020] Kako se ovde koristi, "mutacije" se mogu odnositi na mutacije u CFTR genu ili CFTR proteinu. "Mutacija CFTR gena" se odnosi na mutaciju CFTR gena, a "mutacija CFTR proteina" se odnosi na mutaciju u CFTR proteinu. Genetski defekt ili mutacija, ili promena nukleotida u genu uopšteno dovodi do mutacije CFTR proteina prevedenog sa tog gena, ili promene okvira.

[0021] Termin "F508del" se odnosi na mutantni CFTR protein kome nedostaje aminokiselina fenilalanin na poziciji 508.

[0022] Kako se ovde koristi, pacijent koji je "homozigot" za određenu mutaciju gena ima istu mutaciju na svakom alelu.

[0023] Kako se ovde koristi, pacijent koji je "heterozigotan" za određenu mutaciju gena ima određenu mutaciju na jednom alelu i drugačiju mutaciju na drugom alelu.

[0024] Kako se ovde koristi, izraz "modulator" se odnosi na jedinjenje koje poveć ava aktivnost biološkog jedinjenja kao što je protein. Na primer, CFTR modulator je jedinjenje koje poveć ava aktivnost CFTR. Pove ć anje aktivnosti koje je rezultat CFTR modulatora uključuje, ali nije ograničeno na jedinjenja koja koriguju, potenciraju, stabilizuju i/ili pojačavaju CFTR.

[0025] Kako se ovde koristi, termin "CFTR korektor" se odnosi na jedinjenje koje olakšava obradu i promet CFTR-a radi pove ć anja količine CFTR-a na površini ć elije. Jedinjenja I i II koja su ovde otkrivena su CFTR korektori.

[0026] Kako se ovde koristi, termin "CFTR potenciator" se odnosi na jedinjenje koje poveć ava aktivnost kanala CFTR proteina koji se nalazi na površinić elije, što rezultira pojačanim transportom jona. Jedinjenje III i III-d ovde otkriveno su CFTR potenciatori. Bić e cenjeno da kada je ovde dat opis kombinacije jedinjenja I i drugih specificiranih sredstava za modulaciju CFTR, referenca na "jedinjenje III ili III-d" u vezi sa kombinacijom znači da ili jedinjenje III ili jedinjenje III-d, ali ne oboje, uključeno je u kombinaciju.

[0027] Kako se ovde koristi, termin "aktivni farmaceutski sastojak" ili "terapeutsko sredstvo" ("API") se odnosi na biološki aktivno jedinjenje.

[0028] Kako se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na oblik soli jedinjenja prema ovom pronalasku gde je so netoksična. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja prema ovom pronalasku uključuju one izvedene iz pogodnih neorganskih i organskih kiselina i baza. Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u tehnici. Na primer, S. M. Berge, et al. opisuje farmaceutski prihvatljive soli detaljno u J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19.

[0029] Kako se ovde koristi, izraz "amorfan" se odnosi na čvrsti materijal koji nema daljinski poredak u položaju svojih molekula. Amorfne čvrste materije su generalno prehlađene tečnosti u kojima su molekuli raspoređeni na nasumičan način tako da nema dobro definisanog rasporeda, na primer, molekularnog pakovanja i reda dugog dometa. Amorfne čvrste materije su generalno izotropne, tj. pokazuju slična svojstva u svim pravcima i nemaju određene tačke topljenja. Na primer, amorfni materijal je čvrst materijal koji nema oštre karakteristične kristalne vrhove u svom uzorku difrakcije snage rendgenskih zraka (XRPD) (tj. nije kristalan kako je određeno XRPD). Umesto toga, jedan ili nekoliko širokih pikova (npr. oreola) se pojavljuju u njegovom XRPD obrascu. Široki vrhovi su karakteristični za amorfnu čvrstu materiju. Videti US 2004/0006237 za poređenje XRPD-a amorfnog materijala i kristalnog materijala. U nekim realizacijama, čvrst materijal može da sadrži amorfno jedinjenje, a materijal može, na primer, da se karakteriše nedostatkom oštrih karakterističnih kristalnih pikova u svom XRPD spektru (tj. materijal nije kristalan, već je amorfan, kako je utvrđeno XRPD). Umesto toga, jedan ili nekoliko širokih pikova (npr. oreola) se mogu pojaviti u XRPD obrascu materijala. Videti US 2004/0006237 za poređenje XRPD-a amorfnog materijala i kristalnog materijala. Čvrsti materijal, koji sadrži amorfno jedinjenje, može da se karakteriše, na primer, širim temperaturnim opsegom za topljenje čvrstog materijala, u poređenju sa opsegom za topljenje čiste kristalne čvrste supstance. Druge tehnike, kao što su, na primer, Ramanova spektroskopija, infracrvena spektroskopija i NMR u čvrstom stanju, mogu se koristiti za karakterizaciju kristalnih ili amorfnih oblika.

[0030] U nekim realizacijama, čvrsti materijal može da sadrži mešavinu kristalnih čvrstih materija i amorfnih čvrstih materija. Čvrsti materijal pripremljen da sadrži amorfno jedinjenje može takođe, na primer, da sadrži do 30 % kristalne čvrste supstance. U nekim realizacijama, čvrsti materijal pripremljen da sadrži amorfno jedinjenje može takođe, na primer, da sadrži do 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % ili 2 % kristalne čvrste supstance. U realizacijama u kojima čvrsti materijal sadrži mešavinu kristalnih čvrstih materija i amorfnih čvrstih materija, podaci za karakterizaciju, kao što je XRPD, mogu sadržati indikatore i kristalnih i amorfnih čvrstih materija.

[0031] Kako se ovde koristi, izraz "u suštini amorfan" se odnosi na čvrsti materijal koji ima mali ili nikakav dalekosežni poredak u položaju svojih molekula. Na primer, suštinski amorfni materijali imaju manje od 15 % kristalnosti (npr. manje od 10 % kristalnosti, manje od 5 % kristalnosti ili manje od 2 % kristalnosti). Takođe je primeć eno da izraz „uglavnom amorfan“ uključuje opis „amorfan“, koji se odnosi na materijale koji nemaju (0 %) kristalnosti.

[0032] Kako se ovde koristi, termin "disperzija" se odnosi na disperzni sistem u kome je jedna supstanca, disperzovana faza, raspoređena, u diskretnim jedinicama, kroz drugu supstancu (kontinuirana faza ili nosač). Veličina dispergovane faze može značajno da varira (npr. koloidne čestice nanometarske dimenzije, do veličine od više mikrona). Generalno, dispergovane faze mogu biti čvrste materije, tečnosti ili gasovi. U slučaju čvrste disperzije, i disperzovana i kontinuirana faza su čvrste materije. U farmaceutskim primenama, čvrsta disperzija može uključivati kristalni lek (disperzovanu fazu) u amorfnom polimeru (kontinuirana faza); ili alternativno, amorfni lek (disperzovana faza) u amorfnom polimeru (kontinuirana faza). U nekim realizacijama, čvrsta disperzija uključuje polimer koji čini dispergovanu fazu, a lek čini kontinuiranu fazu. Ili, čvrsta disperzija uključuje lek koji čini dispergovanu fazu i polimer koji čini kontinuiranu fazu.

[0033] Termini "pacijent" i "subjekat" se koriste naizmenično i odnose se na životinju uključujuć i ljude.

[0034] Kako se ovde koristi, termini "lečenje", "tretman" i slično generalno označavaju poboljšanje CF ili njegovih simptoma ili smanjenje težine CF ili njegovih simptoma kod subjekta. "Lečenje", kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničeno na, sledeć e: pove ć an rast subjekta, pove ć ano pove ć anje telesne težine, smanjenje sluzi u plu ć ima, poboljšanu funkciju pankreasa i/ili jetre, smanjenje infekcija grudnog koša i/ili smanjenje kašlja ili kratkog daha. Poboljšanja ili smanjenje težine bilo kog od ovih simptoma mogu se lako proceniti prema standardnim metodama i tehnikama poznatim u tehnici.

[0035] Kako se ovde koristi, termin "u kombinaciji sa", kada se odnosi na dva ili više jedinjenja, agenasa ili dodatnih aktivnih farmaceutskih sastojaka, označava davanje dva ili više jedinjenja, agenasa ili aktivnih farmaceutskih sastojaka pacijentu pre, istovremeno ili naknadno jedan nakon drugog.

[0036] Termini "oko" i "približno", kada se koriste u vezi sa dozama, količinama ili težinskim procentima sastojaka kompozicije ili doznog oblika, uključuju vrednost određene doze, količine ili procenta težine ili opseg doze, količine ili težinskog procenta koji je prepoznat od strane prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti da bi se obezbedio farmakološki efekat ekvivalentan onom dobijenom iz specificirane doze, količine ili težinskog procenta. Termini "oko" i "približno" mogu se odnositi na prihvatljivu grešku za određenu vrednost koju odredi stručnjak u ovoj oblasti, što delimično zavisi od toga kako se vrednosti mere ili određuju. U nekim realizacijama, izrazi "oko" i "približno" znače unutar 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili 0,5% date vrednosti ili opsega.

[0037] Stručnjak u ovoj oblasti bi prepoznao da, kada se otkrije količina "jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli", količina farmaceutski prihvatljivog oblika soli jedinjenja je količina ekvivalentna koncentraciji slobodnoj bazi jedinjenja. Primeć eno je da su ovde opisane količine jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli zasnovane na njihovom obliku slobodne baze. Na primer, "100 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli" uključuje 100 mg Jedinjenja I i koncentraciju farmaceutski prihvatljive soli Jedinjenja I koja je ekvivalentna 100 mg Jedinjenja I.

[0038] Pogodne farmaceutski prihvatljive soli su, na primer, one otkrivene u S.M. Berge, et al. J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Na primer, tabela 1 tog članka opisuje sledeć e farmaceutski prihvatljive soli:

Tabela 1:

[0039] Neograničavajuć i primeri farmaceutski prihvatljivih kiselinskih adicijskih soli obuhvataju: soli formirane sa neorganskim kiselinama, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina ili perhlorna kiselina; soli formirane sa organskim kiselinama, kao što su sirć etna kiselina, oksalna kiselina, maleinska kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, jantarna kiselina ili malonska kiselina; i soli formirane korišć enjem drugih metoda koje se koriste u tehnici, kao što je razmena jona. Neograničavaju ć i primeri farmaceutski prihvatljivih soli obuhvataju adipat, alginat, askorbat, aspartat, benzensulfonat, benzoat, bisulfat, borat, butirat, kamforat, kamforsulfonat, citrat, ciklopentanpropionat, diglukonat, glukonat, dodecetankonsulfat, glukofonat, dodecetankonsulfat , hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hidrojodid, 2-hidroksi-etansulfonat, laktobionat, laktat, laurat, lauril sulfat, malat, maleat, malonat, metansulfonat, 2-naftalen-sulfonat, 2-naftalensulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat-ni-onisulfonat, nikotinat-pamo-oniat pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, fosfat, pikrat, pivalat, propionat, stearat, sukcinat, sulfat, tartarat, tiocijanat, p-toluensulfonat, undekanoat i valeratne soli. Farmaceutski prihvatljive soli izvedene iz odgovarajuć ih baza uključuju soli alkalnih metala, zemnoalkalnih metala, amonijuma i N+ (C1-4alkil)4. Ovaj pronalazak takođe predviđa kvaternizaciju bilo koje osnovne grupe koje sadrže azot jedinjenja koja su ovde otkrivena. Pogodni neograničavajuć i primeri soli alkalnih i zemnoalkalnih metala uključuju natrijum, litijum, kalijum, kalcijum i magnezijum. Dalji neograničavajuć i primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju amonijum, kvaternarni amonijum i amin katjone formirane korišć enjem kontrajona kao što su halid, hidroksid, karboksilat, sulfat, fosfat, nitrat, niži alkil sulfonat i aril sulfonat. Drugi pogodni, neograničavajuć i primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju soli bezilata i glukozamina.

Kombinovane terapije

[0040] Jedan aspekt koji je ovde otkriven obezbeđuje metode lečenja cistične fibroze i drugih bolesti posredovanih CFTR sa Jedinjenjem I u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim agensima, uključujuć i agense za modulaciju CFTR. U nekim realizacijama, Jedinjenje I (i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so) se može primeniti u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim aktivnim farmaceutskim sastojkom, kao što je, na primer, agens za modulaciju CFTR. U nekim realizacijama, najmanje jedan dodatni aktivni farmaceutski sastojak je izabran između (a) Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; i (b) Jedinjenja III ili Jedinjenja III-d i farmaceutski prihvatljivih soli Jedinjenja III ili Jedinjenja III-d. Prema tome, u nekim realizacijama, metode lečenja koje su ovde date obuhvataju davanje pacijentu kome je to potrebno najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II, (Jedinjenje III ili III-d), i njegove farmaceutski prihvatljive soli. U nekim realizacijama, metode lečenja koje su ovde date obuhvataju davanje pacijentu kome je to potrebno najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; i najmanje jedno jedinjenje izabrano između (Jedinjenja III ili III-d), Jedinjenja IV, i/ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0041] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u kombinaciji sa najmanje jednim jedinjenjem izabranim od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u kombinaciji sa najmanje jednim jedinjenjem izabranim od Jedinjenja III i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u kombinaciji sa najmanje jednim jedinjenjem izabranim iz Jedinjenja III-d i njegovim farmaceutski prihvatljivim solima. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano između Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u kombinaciji sa Jedinjenjem II ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli i najmanje jednim jedinjenjem izabranim između Jedinjenja III i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u kombinaciji sa najmanje jednim jedinjenjem izabranim iz Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jednim jedinjenjem izabranim iz Jedinjenja III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli.

[0042] Svako od Jedinjenja I, II, i III ili III-d, i njihove farmaceutski prihvatljive soli nezavisno, mogu se davati jednom dnevno, dva puta dnevno ili tri puta dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje jednom dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje dva puta dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se daju jednom dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se daju dva puta dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se daju jednom dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se daju dva puta dnevno.

[0043] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d i njihove farmaceutski prihvatljive soli se daju jednom dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja IV i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli , daju se jednom dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli daju se dva puta dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja IV i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, daju se dva puta dnevno.

[0044] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, daju se jednom dnevno i najmanje jedno jedinjenje izabrano iz Jedinjenja III-d i njegove farmaceutski prihvatljive soli, daju se dva puta dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja IV i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, se daju jednom dnevno i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III-d i njegove farmaceutski prihvatljive soli, daju se dva puta dnevno.

[0045] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u količini od 5 mg do 20 mg. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u količini od 5 mg, 10 mg, 15 mg ili 20 mg dnevno. U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u količini od 5 mg, 10 mg ili 20 mg jednom dnevno. U nekim realizacijama, 5 mg ili 10 mg Jedinjenja I ili ekvivalentna količina njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se daje dva puta dnevno.

[0046] Jedinjenja I, II, (III ili III-d), i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu se davati u jednoj farmaceutskoj kompoziciji ili u odvojenim farmaceutskim kompozicijama. Takve farmaceutske kompozicije se mogu davati jednom dnevno ili više puta dnevno, kao što je dva puta dnevno. Kako se ovde koristi, fraza da se data količina API-ja (npr. Jedinjenja I, II, (III, III-d) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli) primenjuje jednom ili dva puta dnevno ili dnevno znači da se navedena količina primenjuje po dozi jednom ili dva puta dnevno. Na primer, fraza da se 50 mg jedinjenja II ili njegove farmaceutski prihvatljive soli daje dva puta dnevno ili jednom dnevno znači da 50 mg Jedinjenja II ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje po dozi dva puta dnevno (npr. 50 mg Jedinjenja II ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje ujutru i 50 mg Jedinjenja II ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje uveče).

[0047] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u prvoj farmaceutskoj kompoziciji; najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u drugoj farmaceutskoj kompoziciji; i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u treć oj farmaceutskoj kompoziciji.

[0048] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u prvoj farmaceutskoj kompoziciji; najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u drugoj farmaceutskoj kompoziciji; najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u treć oj farmaceutskoj kompoziciji.

[0049] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u prvoj farmaceutskoj kompoziciji; najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u drugoj farmaceutskoj kompoziciji; najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja IV i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u treć oj farmaceutskoj kompoziciji.

[0050] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u prvoj farmaceutskoj kompoziciji; i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III ili III-d, i njegove farmaceutski prihvatljive soli daju se u drugoj farmaceutskoj kompoziciji. U nekim realizacijama, druga farmaceutska kompozicija sadrži polovinu dnevne doze navedenog najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja III, III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i drugu polovinu navedenog najmanje jednog jedinjenja izabranog iz Jedinjenja III , III-d, i njihove farmaceutski prihvatljive soli se primenjuje u treć oj farmaceutskoj kompoziciji.

[0051] U nekim realizacijama, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III, III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se daju u prvoj farmaceutskoj kompoziciji. U nekim realizacijama, prva farmaceutska kompozicija se daje pacijentu dva puta dnevno. U nekim realizacijama, prva farmaceutska kompozicija se primenjuje jednom dnevno. U nekim realizacijama, prva farmaceutska kompozicija se primenjuje jednom dnevno, a druga kompozicija koja sadrži samo Jedinjenje III koje se primenjuje jednom dnevno.

[0052] Bilo koja pogodna farmaceutska kompozicija poznata u tehnici se može koristiti za Jedinjenje I, Jedinjenje II, Jedinjenje III, Jedinjenje III-d i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Neki primeri farmaceutskih kompozicija za Jedinjenje I i njegove farmaceutski prihvatljive soli su opisane u Primerima. Neki primeri farmaceutskih kompozicija za Jedinjenje II i njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu se nać i u WO 2011/119984 i WO 2014/014841. Neki primeri farmaceutskih kompozicija za Jedinjenje III i njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu se nać i u WO 2007/134279, WO 2010/019239, WO 2011/019413, WO 2012/0277201, i neke kompozicije WO 277201, i WO 2013/130669, i neke kompozicije Jedinjenja III-d i njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu se nać i u US 8,865,902, US 9,181,192, US 9,512,079, WO 2017/053455 i WO 2018/080591. Neki primeri farmaceutskih kompozicija za Jedinjenje IV i njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu se nać i u WO 2010/037066, WO 2011/127241 i WO 2014/071122.

[0053] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje sa farmaceutskom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje II i Jedinjenje III ili III-d. Farmaceutske kompozicije koje sadrže Jedinjenje II i Jedinjenje III su opisane u PCT publikaciji br. WO 2015/160787. Primer izvođenja je prikazan u tabeli 2.

Tabela 2. Primer tablete koja sadrži 100 mg Jedinjenja II i 150 mg Jedinjenja III.

[0054] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija koja sadrži Jedinjenje I se primenjuje sa farmaceutskom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje III ili III-d. Farmaceutske kompozicije koje sadrže Jedinjenje III su opisane u PCT publikaciji br. WO 2010/019239. Primer izvođenja je prikazan u Tabeli 3 ispod.

Tabela 3: Sastojci za primernu tabletu Jedinjenja III.

[0055] Dodatne farmaceutske kompozicije koje sadrže Jedinjenje III su otkrivene u PCT publikaciji br. WO 2013/130669. Primeri mini tableta (prečnik ~2 mm, debljina ~2 mm, svaka mini tableta teška oko 6,9 mg) je formulisana tako da sadrži približno 50 mg Jedinjenja III na 26 mini tableta i približno 75 mg Jedinjenja III na 39 minitableta koristeć i količine sastojaka navedene u Tabeli 4.

Tabela 4: Sastojci za mini tablete za od 50 mg i 75 mg potencije

[0056] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija koja sadrži Jedinjenje I se primenjuje sa farmaceutskom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje III i Jedinjenje IV. Farmaceutske kompozicije koje sadrže Jedinjenje III i Jedinjenje IV su otkrivene u PCT publikaciji br. WO 2014/071122. Primer izvođenja je prikazan u Tabeli 5 ispod.

Tabela 5: Sastojci za primernu tabletu Jedinjenja III i Jedinjenja IV

[0057] U nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije koje se koriste u kombinovanim terapijama prema pronalasku su tablete. U nekim realizacijama, tablete su pogodne za oralnu primenu. Ove kompozicije i kombinacije su korisne za lečenje cistične fibroze.

Metodi lečenja

[0058] CFTR mutacija može da utiče na CFTR količinu, tj. na broj CFTR kanala na površini ć elije, ili može da utiče na CFTR funkciju, tj. funkcionalnu sposobnost svakog kanala da se otvara i transportuje jone. Mutacije koje utiču na količinu CFTR uključuju mutacije koje uzrokuju defektnu sintezu (defekt klase I), mutacije koje uzrokuju defektnu obradu i promet (defekt klase II), mutacije koje uzrokuju smanjenu sintezu CFTR (defekt klase V) i mutacije koje smanjuju površinu stabilnosti CFTR (defekt klase VI). Mutacije koje utiču na funkciju CFTR uključuju mutacije koje uzrokuju defektni gajting (defekt klase III) i mutacije koje uzrokuju defektnu provodljivost (defekt klase IV). Neke CFTR mutacije pokazuju karakteristike više klasa.

[0059] U nekim realizacijama, ovde opisani postupci za lečenje, smanjenje težine ili simptomatsko lečenje cistične fibroze kod pacijenata koji se sastoje od primene efikasne količine jedinjenja, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili deuterovanog analoga bilo kog od ovih jedinjenja prethodno navedenog; ili farmaceutski preparat, ovog pronalaska za pacijenta, kao što je čovek, pri čemu navedeni pacijent ima cističnu fibrozu. U nekim realizacijama, pacijent ima genotip F508del/minimalne funkcije (MF), genotip F508del/F508del (homozigot za mutaciju F508del), genotip F508del/gating ili genotip F508del/rezidualne funkcije (RF). U nekim realizacijama pacijent je heterozigot i ima jednu F508del mutaciju.

[0060] Kako se ovde koristi, "mutacije minimalne funkcije (MF)" odnose se na mutacije gena CFTR povezane sa minimalnom funkcijom CFTR (malo ili bez funkcionisanja CFTR proteina) i uključuju, na primer, mutacije povezane sa ozbiljnim defektima sposobnosti CFTR kanala za otvaranje i zatvaranje, poznatog kao defektni gajting kanala ili „mutacije gajta“; mutacije povezane sa teškim defektima u ć elijskoj obradi CFTR i njegovom isporukom na površinu ć elije; mutacije povezane bez (ili minimalne) CFTR sinteze; i mutacije povezane sa ozbiljnim defektima u provodljivosti kanala.

[0061] U nekim realizacijama, pacijent je heterozigotan i ima F508del mutaciju na jednom alelu i mutaciju na drugom alelu odabranom iz Tabele 6:

Tabela 6: CFTR mutacije

Ĩnastavak)

[0062] U nekim realizacijama, pronalazak je takođe usmeren na metode lečenja korišć enjem jedinjenja obeleženih izotopom napred navedenih jedinjenja, koja se, u nekim realizacijama, nazivaju Jedinjenje I’, Jedinjenje II’, Jedinjenje III’, Jedinjenje III-d. U nekim realizacijama, Jedinjenje I', Jedinjenje II', Jedinjenje III', Jedinjenje III-d, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu su formula i varijable takvih jedinjenja i soli svakog i nezavisno kao što je napred opisano ili bilo koja druga varijanta napred opisana, pod uslovom da je jedan ili više atoma u njemu zamenjeno atomom ili atomima koji imaju atomsku masu ili maseni broj koji se razlikuje od atomske mase ili masenog broja atoma koji se obično javlja u prirodi (označen izotopom). Primeri izotopa koji su komercijalno dostupni i pogodni za otkrivanje uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora i hlora, na primer<2>H,<3>H,<13>C,<14>C,<15>N,<18>O,<17>O,<31>P,<32>P ,<35>S,<18>F i<36>Cl, respektivno.

[0063] Jedinjenja i soli obeležena izotopom mogu se koristiti na brojne korisne načine. Oni mogu biti pogodni za lekove i/ili različite vrste testova, kao što su testovi distribucije supstratnog tkiva. Na primer, jedinjenja obeležena tricijumom (<3>H) i/ili ugljenikom-14 (<14>C) su posebno korisna za različite tipove testova, kao što su testovi distribucije tkiva podloge, zbog relativno jednostavne pripreme i odlične detekcije. Na primer, one sa deuterijumom (<2>H) su terapeutski korisne sa potencijalnim terapeutskim prednostima u odnosu na jedinjenja koja nisu obeležena sa<2>H. Generalno, jedinjenja i soli obeležena deuterijumom (<2>H) mogu imati već u metaboličku stabilnost u poređenju sa onima koje nisu obeležene izotopom zahvaljujuć i kinetičkom izotopskom efektu opisanom u nastavku. Ve ć a metabolička stabilnost se direktno prevodi u produženi poluživot in vivo ili niže doze, što bi se moglo poželjeti. Jedinjenja i soli obeležena izotopom se obično mogu pripremiti izvođenjem postupaka otkrivenih u šemama sinteze i povezanom opisu, u delu za primer i u delu za pripremu u ovom tekstu, zamenjujuć i reaktant koji nije obeležen izotopom sa lako dostupan reaktantom obeležen izotopom.

[0064] U nekim realizacijama, jedinjenja i soli obeležena izotopom su ona obeležena deuterijumom (<2>H). U nekim specifičnim realizacijama, jedinjenja i soli obeležena izotopom su obeležena deuterijumom (<2>H), pri čemu je jedan ili više atoma vodonika u njima zamenjeno deuterijumom. U hemijskim strukturama, deuterijum je predstavljen kao "D".

[0065] Jedinjenja i soli obeležena deuterijumom (<2>H) mogu da manipulišu oksidativnim metabolizmom jedinjenja putem primarnog kinetičkog izotopskog efekta. Primarni kinetički izotopski efekat je promena brzine hemijske reakcije koja je rezultat razmene izotopskih jezgara, što je zauzvrat uzrokovano promenom energija osnovnog stanja neophodnih za formiranje kovalentne veze nakon ove izotopske razmene. Razmena težeg izotopa obično dovodi do smanjenja energije osnovnog stanja za hemijsku vezu i na taj način uzrokuje smanjenje kidanja veze koja ograničava brzinu. Ako se prekid veze dogodi u ili u blizini regiona osnovne tačke duž koordinate višeproizvodne reakcije, odnosi distribucije proizvoda mogu se značajno promeniti. Za objašnjenje: ako je deuterijum vezan za atom ugljenika na nezamenljivoj poziciji, tipične su razlike u brzini od kM/kD= 2-7. Za dalju diskusiju, videti S. L. Harbeson i R. D. Tung, Deuterium in Drug Discovery and Development, Ann. Rep. Med. Chem.2011, 46, 403-417.

[0066] Koncentracija izotopa(a) (npr. deuterijuma) ugrađenih u jedinjenja obeležena izotopima i so prema pronalasku može biti definisana faktorom obogać ivanja izotopom. Termin "faktor oboga ć ivanja izotopom" kako se ovde koristi označava odnos između izotopskog izobilja i prirodnog izobilja određenog izotopa. U nekim realizacijama, ako je supstituent u jedinjenju prema pronalasku označen kao deuterijum, takvo jedinjenje ima faktor obogać ivanja izotopom za svaki naznačeni atom deuterijuma od najmanje 3500 (52,5 % inkorporacije deuterijuma na svakom naznačenom atomu deuterijuma), najmanje 4000 (60 % ugradnje deuterijuma), najmanje 4500 (67,5 % ugradnje deuterijuma), najmanje 5000 (75 % ugradnje deuterijuma), najmanje 5500 (82,5 % ugradnje deuterijuma), najmanje 6000 (90 % ugradnje deuterijuma), najmanje 33 % (39 %) inkorporacije deuterijuma), najmanje 6466,7 (97 % ugradnje deuterijuma), najmanje 6600 (99 % ugradnje deuterijuma), ili najmanje 6633,3 (99,5 % ugradnje deuterijuma).

[0067] Prilikom otkrivanja i razvoja terapeutskih agenasa, stručnjak u ovoj oblasti pokušava da optimizuje farmakokinetičke parametre uz zadržavanje poželjnih in vitro osobina. Može biti razumno pretpostaviti da su mnoga jedinjenja sa lošim farmakokinetičkim profilima podložna oksidativnom metabolizmu.

Farmaceutske kompozicije

[0068] Još jedan aspekt ovog pronalaska daje farmaceutske kompozicije koje sadrže Jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i najmanje jedan dodatni aktivni farmaceutski sastojak. U nekim realizacijama, najmanje jedan dodatni aktivni farmaceutski sastojak je CFTR modulator. U nekim realizacijama, najmanje jedan dodatni aktivni farmaceutski sastojak je CFTR korektor. U nekim realizacijama, najmanje jedan dodatni aktivni farmaceutski sastojak je CFTR potenciator. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži Jedinjenje I i najmanje dva dodatna aktivna farmaceutska sastojka, od kojih je jedan CFTR korektor, a jedan CFTR potenciator.

[0069] U nekim realizacijama, najmanje jedan dodatni aktivni farmaceutski sastojak je izabran između mukolitičkih agenasa, bronhodilatatora, antibiotika, antiinfektivnih sredstava i antiinflamatornih agenasa.

[0070] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0071] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0072] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja III, III-d i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli i najmanje jednog farmaceutski prihvatljivog nosača.

[0073] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jednog farmaceutski prihvatljivog nosača.

[0074] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jednog farmaceutski prihvatljivog nosača.

[0075] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja III ili III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja IV i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0076] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i opciono sadrži jedan ili više dodatnih sredstava za modulaciju CFTR. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži oko 5 mg, oko 10 mg ili oko 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i opciono sadrži jedan ili više dodatnih sredstava za modulaciju CFTR. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, 50 mg do 100 mg Jedinjenja II i 150 mg do 300 mg Jedinjenja III ili 50 mg do 150 mg Jedinjenja III-d. U nekim realizacijama kompozicija sadrži oko 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, 100 mg Jedinjenja II i 150 mg Jedinjenja III ili 150 mg Jedinjenja III-d.

[0077] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i opciono sadrži jedan ili više dodatnih sredstava za modulaciju CFTR. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži oko 10 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i opciono sadrži jedan ili više dodatnih sredstava za modulaciju CFTR. U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i opciono sadrži jedan ili više dodatnih sredstava za modulaciju CFTR. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži 5 mg, 10 mg ili 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, 50 mg ili 100 mg Jedinjenja II i 150 mg ili 300 mg Jedinjenja III ili 50 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg ili 150 mg Jedinjenja III-d.

[0078] Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim realizacijama, najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač se bira između farmaceutski prihvatljivih nosača i farmaceutski prihvatljivih pomoć nih sredstava. U nekim realizacijama, najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač je izabran između farmaceutski prihvatljivih punila, dezintegranata, surfaktanata, veziva, maziva.

[0079] Farmaceutske kompozicije opisane ovde su korisne za lečenje cistične fibroze i drugih bolesti izazvanih CFTR.

[0080] Kao što je napred opisano, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu opciono dalje da sadrže najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač. Najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač se može izabrati između pomoć nih sredstava i nosača. Najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, kako se ovde koristi, uključuje bilo koji i sve rastvarače, razblaživače, druge tečne nosače, pomoćni disperzoŕ , pomo ć na sredstva za suspenziju, površinske aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje, agense za emulgovanje, konzervanse, čvrsta veziva i maziva, kako odgovaraju određenom željenom obliku doze. Remington: Nauka i praksa farmacije, 21. izdanje, 2005, ur. D.B. Troy, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, and Enciclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick i J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nev York otkrivaju različite nosače koji se koriste u formulisanju farmaceutskih kompozicija i poznate tehnike za njihovu pripremu. Osim u meri u kojoj bilo koji konvencionalni nosač nije kompatibilan sa jedinjenjima iz ovog pronalaska, kao što je stvaranje bilo kakvog neželjenog biološkog efekta ili drugih štetnih interakcija sa bilo kojom drugom komponentom(ima) farmaceutske kompozicije, smatra se da je njegova upotreba unutar obim ovog pronalaska. Neograničavajuć i primeri pogodnih farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju, ali nisu ograničeni na, izmenjivače jona, glinicu, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine (kao što je albumin humanog seruma), puferske supstance (kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina i kalijum sorbat), delimične mešavine glicerida zasić enih biljnih masnih kiselina, vode, soli i elektrolita (kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid), koloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, poliakrilati, voskove, polietilen-polioksipropilen blok polimere, vunena mast, šeć eri (kao što su laktoza, glukoza i saharoza), skrobovi (kao što su kukuruzni skrob i njegov skrob), i potatoza derivati (kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat), tragakant u prahu, slad, želatin, talk, ekscipijenti (kao što su kakao puter i voskovi supozitorija), ulja (kao što je ulje od kikirikija, ulje od pamučnog semena, ulje safta , maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje), glikoli (kao što su propilen glikol i polietilen glikol), estri (kao što su etil oleat i etil laurat), agar, puferska sredstva (kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid), alginska kiselina, voda bez pirogena, izotonični fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, etil alkohol, rastvori fosfatnog pufera, netoksična kompatibilna maziva (kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat), sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, arome, parfemi agensi, konzervansi i antioksidansi.

Metode pripreme jedinjenja

Opšte eksperimentalne procedure

[0081] Reagensi i početni materijali su nabavljeni iz komercijalnih izvora, osim ako nije drugačije naznačeno, i korišć eni su bez prečiš ć avanja. Protonski i ugljenični NMR spektri su dobijeni ili na Bruker Biospin DRX 400 MHz FTNMR spektrometru koji radi na rezonantnoj frekvenciji<1>H i<13>C od 400 i 100 MHz respektivno, ili na 300 MHz NMR spektrometru. Jednodimenzionalni protonski i ugljenični spektri su dobijeni korišć enjem širokopojasne BBFO (broadband observation) sonde sa rotacijom uzorka od Hz pri digitalnoj rezoluciji od 0,1834 i 0,9083 Hz/Pt, respektivno. Svi protonski i ugljenični spektri su dobijeni uz kontrolu temperature na 30 °C korišć enjem standardnih, prethodno objavljenih impulsnih sekvenci i rutinskih parametara obrade. Konačna čistoć a jedinjenja određena je UPLC-om sa obrnutom fazom koristeć i Acquity UPLC BEH C18kolonu (50 × 2,1 mm, čestice 1,7 µm) proizvođača Waters (pn: 186002350), i dvostruki gradijentni ciklus od 1-99% mobilne faze B tokom 3,0 minuta. Mobilna faza A = H2O (0,05 % CF3CO2H). Mobilna faza B = CH3CN (0,035 % CF3CO2H). Brzina protoka = 1,2 mL/min, zapremina ubrizgavanja = 1,5 µL i temperatura kolone = 60 °C. Konačna čistoć a je izračunata usrednjavanjem površine ispod krive (AUC) dva UV traga (220 nm, 254 nm). Maseni spektri niske rezolucije dobijeni su korišć enjem jednokvadrupolnog masenog spektrometra sa tačnošć u mase od 0,1 Da i minimalnom rezolucijom od 1000 amu u opsegu detekcije koriš ć enjem elektrosprej jonizacije (ESI) koristeć i vodonikov jon (H+). Optička čisto ć a metil (2S)-2,4-dimetil-4-nitro-pentanoata određena je korišć enjem hiralne gasne hromatografije (GC) na Agilent 7890A/MSD 5975C instrumentu, koriste ć i Restek Rt- βDEXcst (30m × 0.25mm × 0.25um_df) kolonu, sa brzinom protoka od 2.0 mL/min (noseć i gas H2), na temperaturi ubrizgavanja od 220°C i temperaturi pe ć i od 120°C, 15 minuta. Čisto ć a Jedinjenja I je određena HPLC-om sa obrnutom fazom koriš ć enjem Poroshell 120 EC-C8 kolone (4,6 × 150 mm, čestice 2,7 µm, i dvostrukog gradijenta od 30-95% mobilne faze B tokom 40 minuta. Mobilna faza A = 5 mM amonijum acetat pH 4,50 i mobilna faza B = acetonitril. Brzina protoka = 1,0 mL/min, zapremina ubrizgavanja = 5 µL, 254 nm i temperatura kolone = 30 °C.

[0082] Jedinjenja II, III, III-d i IV mogu se dobiti bilo kojim pogodnim metodom u struci, na primer, onim iz PCT publikacije br. WO 2011/133751, WO 2011/133951, WO 2015/160787 i US 8,865,902.

Primer 1: Sinteza (14S)-8-[3-(2-{dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il}etoksi)-1H-pirazol-1-il]-12,12-dimetil-2l6- tia-3,9,11,18,23-pentaazatetraciklo [17.3.1.111,14.05,10]tetrakoza-1(22),5,7,9,19(23),20-heksan-2,2,4- trion (Jedinjenje I)

Opšte UPLC/HPLC analitičke metode:

[0083] Osim ako nije naznačeno, prinosi enantiomera razdvojenih hiralnim SFC su dati kao procenat teoretskog prinosa za jedan enantiomer racemata.

[0084] LC metod A: Analitička UPLC sa obrnutom fazom korišć enjem kolone Acquity UPLC BEH C18(30 × 2,1 mm, čestice 1,7 µm) proizvođača Waters (pn: 186002349), i dvostrukim gradijentnim strujanjem od 1-99% mobilne faze B tokom 1,2 minuta. Mobilna faza A = voda (0,05% trifluorosirć etna kiselina). Mobilna faza B = acetonitril (0,035% trifluorosir ć etna kiselina). Brzina protoka = 1,5 mL/min, zapremina ubrizgavanja = 1,5 µL i temperatura kolone = 60 °C.

[0085] LC metod B: Analitička UPLC sa obrnutom fazom korišć enjem kolone Acquity UPLC BEH C18 (50 × 2,1 mm, čestice 1,7 µm) proizvođača Waters (pn: 186002350), i dvostrukim gradijentnim strujanjem od 1-99% mobilne faze B tokom 3,0 minuta. Mobilna faza A = voda (0,05% trifluorosirć etna kiselina). Mobilna faza B = acetonitril (0,035% trifluorosir ć etna kiselina). Brzina protoka = 1,2 mL/min, zapremina ubrizgavanja = 1,5 µL i temperatura kolone = 60 °C.

[0086] LC metoda D: Analitička UPLC sa obrnutom fazom korišć enjem Acquity UPLC BEH C18kolone (50 × 2,1 mm, čestice 1,7 µm) proizvođača Waters (pn: 186002350), i dvostrukog gradijentnog toka od 1-99% mobilne faze B tokom 5,0 minuta. Mobilna faza A = voda (0,05% trifluorosirć etna kiselina). Mobilna faza B = acetonitril (0,035% trifluorosir ć etna kiselina). Brzina protoka = 1,2 mL/min, zapremina ubrizgavanja = 1,5 µL i temperatura kolone = 60 °C.

[0087] LC metod F: Analitička UPLC sa obrnutom fazom korišć enjem Acquity UPLC BEH C18kolone (50 × 2,1 mm, čestice 1,7 µm) proizvođača Waters (pn: 186002350), i dvostrukog gradijentnog obrade od 1-99% mobilne faze B tokom 15,0 minuta. Mobilna faza A = voda (0,05% trifluorosirć etna kiselina). Mobilna faza B = acetonitril (0,035% trifluorosir ć etna kiselina). Brzina protoka = 1,2 mL/min, zapremina ubrizgavanja = 1,5 µL i temperatura kolone = 60 °C.

[0088] LC metod Q: Merckmillipore Chromolith SpeedROD C18kolona (50 × 4,6 mm) i dvostrukog gradijentnog obrade od 5 - 100% mobilne faze B tokom 12 minuta. Mobilna faza A = voda (0,1% trifluorosirć etna kiselina). Mobilna faza B = acetonitril (0,1% trifluorosirć etna kiselina).

Deo A: Sinteza 2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksilne kiseline

[0089]

Korak 1: 7-(bromometil)dispiro[2.0.2.1]heptan

[0090]

[0091] Balon sa okruglim dnom od 1000 mL sa 3 grla je opremljen mehaničkom mešalicom, posudom za hlađenje, levkom za dodavanje, J-Kem temperaturnom sondom i ulazom/izlazom azota. Posuda je napunjena u atmosferi azota sa trifenilfosfinom (102,7 mL, 443,2 mmol) i dihlorometanom (1 L) koji je dao bistar bezbojni rastvor. Započelo je mešanje i rashladno kupatilo je napunjeno acetonom. Suvi led je dodavan u porcijama u posudu za hlađenje dok se ne postigne temperatura posude od -15 °C. Levak za dodavanje je napunjen sa rastvorom broma (22,82 mL, 443,0 mmol) u dihlorometanu (220 mL, 10 mL/g) koji je zatim dodat u kapima tokom 1 h. Suvi led je dodat u porcije u kupatilo za hlađenje tokom dodavanja da bi se održala temperatura posude na -15 °C. Nakon što je dodavanje broma završeno, bledo žuta suspenzija je nastavljena da se meša na -15 °C tokom 15 minuta u kom trenutku je suspenzija ohlađena na -30 °C. Levak za dodavanje je napunjen sa rastvorom dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il metanola (50 g, 402,6 mmol), piridina (35,82 mL, 442,9 mmol) i dihlorometana (250 mL, 5 mL/g). Bistri bledo žuti rastvor je zatim dodat u kapima tokom 1,5 h održavajuć i temperaturu posude na -30 °C. Dobijena bistra svetlo žuta reakciona smeša je ostavljena da se postepeno zagreje do temperature posude od -5 °C, a zatim je nastavljena sa mešanjem na -5 °C tokom 1 h. Reakciona smeša je zatim sipana u heksan (2000 mL) što je rezultiralo formiranjem precipitata. Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi 30 min, a zatim filtrirana kroz Buhnerov levak od staklene frite sa slojem celita od 20 mm. Bistri filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom (temperatura vodenog kupatila na 20 °C) da bi se dobilo žuto ulje sa prisutnim precipitatom. Ulje je razblaženo sa malo heksana, ostavljeno da stoji na sobnoj temperaturi 15 min i zatim filtrirano kroz stakleni frit Buchner levak sa slojem celita od 20 mm. Bistri filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom (temperatura vodenog kupatila na 20 °C) da bi se dobio 7-(bromometil)dispiro[2.0.2.1]heptan (70 g, 93%) kao bistro žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 3,49 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 1,90 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 1,06 - 0,84 (m, 4H), 0,71 (ddd, J = 9.1, 5.1, 4.0 Hz, 2H), 0.54 (dddd, J = 8.6, 4.8, 3.8, 1.0 Hz, 2H).

Korak 2: 2-Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-ilacetonitril

[0092]

[0093] Balon sa okruglim dnom od 1000 mL sa 3 grla je opremljen mehaničkom mešalicom, kupatilom za hlađenje koje se koristi kao sekundarna posuda, J-Kem temperaturnom sondom i ulazom/izlazom azota. Posuda je napunjena u atmosferi azota sa 7-(bromometil)dispiro[2.0.2.1]heptanom (35 g, 187,1 mmol) i dimetil sulfoksidom (245 mL) koji je dao bistar rastvor ć ilibara. Započeto je mešanje i temperatura posude je zabeležena na 19 °C. Posuda je zatim napunjena natrijum cijanidom (11,46 g, 233,8 mmol) koji je dodat kao čvrsta supstanca u jednom delu, što je rezultiralo tamnim rastvorom i postepenom egzotermnom temperaturom do 49 °C tokom 15 min. Posle nekoliko minuta temperatura posude je počela da opada i smeša je nastavljena da se meša na sobnoj temperaturi preko noć i (oko 15 h). Tamna reakciona smeša je ugašena ledeno hladnim zasić enim rastvorom natrijum karbonata (500 mL), a zatim prebačena u levak za odvajanje i podeljena dietil etrom (500 mL). Organski sloj je uklonjen, a zaostali vodeni sloj je ekstrahovan dietil etrom (2 x 250 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani vodom (500 mL), osušeni preko natrijum sulfata (200 g) i zatim filtrirani kroz Buhnerov levak od staklene frite. Čisti filtrat boje ć ilibara je koncentrovan pod sniženim pritiskom (temperatura vodenog kupatila 20 °C) da bi se dobio 2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-ilacetonitril (21 g, 84%) kao bistro ulje tamne boje ć ilibara.<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 2,42 (d, J =6,6 Hz, 2H), 1,69 (t, J =6,6 Hz, 1H), 1,02 - 0,88 (m, 4H), 0,79 - 0,70 (m, 2H), 0,66-0,55 (m, 2H).

Korak 3: 2-Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-ilsir ć etna kiselina

[0094]

[0095] U rastvor 2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-ilacetonitrila (2,1 g, 14,19 mmol) u EtOH (32 mL) dodat je natrijum hidroksid (5,12 g, 128,0 mmol), a zatim L vode (13 mL) i dobijeni rastvor je mešan i zagrevan na 70 °C preko noć i. Smeša je zatim ohlađena do sobne temperature, razblažena vodom i ekstrahovana dietil etrom. Vodena faza je podešena na pH = 1 dodatkom 6 N hlorovodonične kiseline (što rezultira mutnim precipitatom) i ekstrahovana dietil etrom (3x). Organske faze su osušene (magnezijum sulfat), filtrirane i koncentrovane dajuć i 2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iloctenu kiselinu (2,19 g, 99% prinos, 98% čistoć e) kao narandžastu čvrstu supstancu koja je koriš ć ena u slede ć em koraku bez daljeg prečiš ć avanja.<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 2,44 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 1,67 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 0,91 (ddd, J = 9,0, 5,2, 3,9 Hz, 2H) , 0,81 (dddd, J = 8,9, 5,2, 3,9, 0,5 Hz, 2H), 0,69 (ddd, J = 8,9, 5,2, 3,9 Hz, 2H), 0,56 - 0,44 (m, 2H).

Korak 4: 2-Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletanol

[0096]

[0097] Litijum aluminijum hidridu (827,4 mg, 902,3 mL, 21,80 mmol) rastvorenom u tetrahidrofuranu (33,71 mL) ohlađenom u kupatilu led/voda dodata je 2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-ila55cetinska kiselina (2.0.2.1)g, 16,77 mmol) u tetrahidrofuranu (7,470 mL) ukapavanjem tokom 15 minuta održavajuć i temperaturu reakcije < 20 °C. Smeša je ostavljena da se meša ukupno 18 h, postepeno zagrevajuć i do sobne temperature. Smeša je ohlađena u kupatilu led/voda i uzastopno ugašena sporim dodavanjem vode (838,4 mg, 838,4 mL, 46,54 mmol), a zatim natrijum hidroksida (1,006 mL 5 M, 5,031 mmol), zatim vode (2,493 g, 2,493 mL, 138,4 mmol) dajuć i belu, zrnastu suspenziju koja je filtrirana preko celita. Filtrirana čvrsta supstanca je isprana dietil etrom. Filtrat je koncentrovan in vacuo na ~ 300 mbar i vodenom kupatilu na 30 °C. Ostatak je razblažen dietil etrom, osušen (magnezijum sulfat), filtriran i koncentrovan u vakuumu na ~ 300 mbar i 30 °C u vodenom kupatilu, a zatim ~ 30 sekundi pod vakuumom da bi se dobio 2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletanol (2,318 g, 100%) koji je korišć en direktno u slede ć em koraku bez daljeg prečiš ć avanja.<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 3,64 (s, 2H), 1,68 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 1,39 (s, 1H), 1,31 (s, 1H), 0,82 (d, J = 14,0 Hz, 4H), 0,65 (s, 2H), 0,50 (d, J = 3,6 Hz, 2H).

Korak 5: terc-butil 3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-karboksilat

[0098]

[0099] U rastvor terc-butil 5-okso-1H-pirazol-2-karboksilata (2,942 g, 15,97 mmol) i 2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletanola (2,318 g, 16,77 mmol) u tetrahidrofuranu (36.78 mL) je dodat trifenilfosfin (4.399 g, 16.77 mmol). U smešu je polako dodat diizopropil azodikarboksilat (3,391 g, 3,302 mL, 16,77 mmol) kap po kap tokom 10 min (zabeležena blaga egzotermna reakcija). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 min, a zatim na 50 °C tokom 30 min. Tetrahidrofuran je uklonjen u vakumu. Sirovom ostatku je dodat toluen (23,54 mL) i smeša je mešana preko noć i dok je talog postepeno kristalisao. Razmu ć en sa celitom, a zatim je talog odfiltriran i ispran toluenom (8,705 mL) i ponovo toluenom (8,705 mL). Filtrat je koncentrovan in vacuo. Sirovi proizvod je prečišć en hromatografijom na silika gelu koristeć i plitki gradijent od 100 % heksana do 100 % etil acetata daju ć i terc-butil 3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-karboksilat (3.449 g, 71%). ESI-MS m/z izrač. 304,17868, nađeno 305,1 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 0,82 min (LC metoda A).

Korak 6: 3-(2-Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)-1H-pirazol

[0100]

terc-butil 3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-karboksilat (5,304 g, 17,43 mmol) rastvoren je u dihlorometanu (53,04 mL) sa trifluorosirć etnom kiselinom (29,40 g, 29,04 mL). mL, 261,4 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 120 min. Reakcija je uparena i dobijeno ulje je podeljeno između etil acetata i zasić enog rastvora natrijum bikarbonata i slojevi su razdvojeni. Vodeni deo je ekstrahovan još dva puta etil acetatom, zatim su organski slojevi kombinovani, isprani slanim rastvorom, osušeni iznad natrijum sulfata, filtrirani i upareni da bi se dobilo ulje, 3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)-1H-pirazol (3,56 g, 100%). ESI-MS m/z izrač. 204,12627, nađeno 205,1 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 0,59 min (LC metoda A).

Korak 7: terc-butil 2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksilat

[0101]

terc-butil 2,6-dihloropiridin-3-karboksilat (4,322 g, 17,42 mmol), 3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)-1H-pirazol (3,559 g, 17,42 mmol) i kalijum karbonat (2,891 g, 20,92 mmol) su kombinovani u anhidrovanom dimetil sulfoksidu (71,18 mL). Dodan je 1,4-Diazabiciklo[2.2.2]oktan (391,1 mg, 3,487 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi. temperatura pod azotom 16 h. Reakciona smeša je razblažena vodom (136,9 mL) i mešana 15 min. Dobijena bela čvrsta supstanca je filtrirana i isprana vodom. Čvrsta supstanca je rastvorena u dihlorometanu i osušena iznad magnezijum sulfata. Smeša je filtrirana i uparena da bi se dobio terc-butil 2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksilat (5,69 g, 79%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 8,35 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 8,18 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,94 (d , J = 2,9 Hz, 1H), 4,25 (s, 2H), 1,90 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 1,62 (s, 9H), 1,49 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 0,85 (d , J = 1,5 Hz, 4H), 0,65 (d, J = 1,5 Hz, 2H), 0,52 (d, J = 1,1 Hz, 2H). ESI-MS m/z izrač.415,16626, nađeno 360,0 (M-tBu)+; Vreme zadržavanja: 2,09 min (LC metoda B).

Korak 8: 2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksilna kiselina

[0102]

terc-butil 2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksilat (5,85 g, 14,07 mmol) je rastvoren u dihlorometanu (58,5 ml) sa trifluorosirć etnom kiselinom (16,26 ml, 211,1 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 16 sati. Reakcija je isparena i dobijenoj čvrstoj supstanci je dodat etar, a zatim je etar uklonjen pod sniženim pritiskom. Ovo isparavanje iz etra je ponovljeno još dva puta, što je rezultiralo belom čvrstom supstancom, 2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksilnom kiselinom (5,06 g, 100%).<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 8,41 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,37 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 4,27 (s, 2H), 1,91 (d, J = 6,7 Hz, 2H), 1,50 (s, 1H), 0,85 (d, J = 1,5 Hz, 4H), 0,71-0,62 (m, 2H), 0,52 (d, J = 1,1 Hz, 2H). ESI-MS m/z izračunato 359,10367, pronađeno 360,2 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 2,16 min (LC metod B).

Deo B: Sinteza terc-butil (4S)-2,2-dimetil-4-[3-[(6-sulfamoil-2-piridil)amino]propil]pirolidin-1-karboksilata

[0103]

Korak 1: (E)-(2-oksotetrahidropiran-3-iliden)metanolat (natrijumova so)

[0104]

[0105] Balon sa okruglim dnom od 5 L sa 3 grla je opremljen mehaničkom mešalicom, poklopcem za grejanje, levkom za dodavanje, J-Kem temperaturnom sondom/kontrolorom i ulazom/izlazom azota. Posuda je napunjena u atmosferi azota sa natrijum hidridom (59,91 g 60% tež/tež, 1,498 mol), a zatim heptanom (1,5 L) koji je dao sivu suspenziju. Započeto je mešanje i temperatura posude je zabeležena na 19 °C. Posuda je zatim napunjena etil alkoholom (3,451 g, 74,91 mmol) koji je dodat preko šprica, što je rezultiralo razvijanjem gasa. Levak za dodavanje je napunjen sa bistrim bledo žutim rastvorom tetrahidropiran-2-ona (150 g, 1,498 mol) i etil formata (111 g, 1,50 mol). Rastvor je dodat u kapima tokom 1 h, što je rezultiralo evolucijom gasa i postepenom egzotermom do 45 °C. Dobijena gusta bela suspenzija je zatim zagrevana na 65 °C tokom 2 h, a zatim ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu. Smeša je nastavljena da se meša na sobnoj temperaturi preko noć i (oko 10 h). Reakciona smeša je filtrirana pod vakuumom kroz Buhnerov levak od staklene frite (srednje poroznosti) pod strujom azota. Filterski kolač je ispran heptanom (2 x 250 mL) i vučen nekoliko minuta. Blago vlažni kolač od heptana je prebačen u staklenu tacnu i sušen u vakuum peć nici na 45 °C tokom 15 h da bi se dobila bela čvrsta supstanca (205 g, 1,36 mol, 91% prinos) kao željeni proizvod, (E)-( 2-oksotetrahidropiran-3-iliden)metanolat (natrijumova so).

Korak 2: 3-metilentetrahidropiran-2-on

[0106]

[0107] Posuda sa okruglim dnom sa 3 grla, zapremine 5 litara, opremljena je mehaničkom mešalicom, grejnim plaštom, levkom za dodatak, J-Kem temperaturnom sondom/kontrolerom i ulazom/izlazom za azot. Posuda je napunjena pod atmosferom azota sa (E)-(2-oksotetrahidropiran-3-iliden)metanolatom (natrijumova so) (205 g, 1,366 mol) (205 g, 1,366 mol) i tetrahidrofuranom (1640 ml), što je dalo belu suspenziju. Mešanje je započeto i temperatura posude je zabeležena na 19 °C. Posuda je zatim napunjena paraformaldehidom (136,6 g, 4,549 mol) dodatim kao čvrsta supstanca u jednoj porciji. Dobijena suspenzija je zagrejana na 63 °C i uslovi su održavani 15 sati. Nakon zagrevanja, reakciona smeša je postala blago želatinozna. Bela želatinozna smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio već i deo tetrahidrofurana. Preostali ostatak je podeljen sa etil acetatom (1000 ml), zasić enim natrijum hloridom (500 ml) i zasi ć enim natrijum hidrogenkarbonatom (500 ml) u levku za odvajanje. Organski sloj je uklonjen, a preostali vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom (5 × 300 ml). Spojeni organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata (500 g), a zatim vakuumski filtrirani kroz stakleni frit Buhnerovog levka sa slojem celita od 20 mm. Filter kolač je ispran etil acetatom (250 ml). Bistri filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo bistro bledo žuto ulje (135 g) kao željeni sirovi proizvod. Materijal je prečišć en fleš hromatografijom na koloni silika gela (tečno punjenje) eluirajuć i gradijentom od 100% heksana do 60% etil acetata u heksanu tokom 1 sata, sakupljajuć i frakcije od 450 ml. Proizvod je detektovan TLC analizom na silika gelu eluiraju ć i sa 3:1 heksani/etil acetat i vizualizovan pod UV zračenjem. Frakcije proizvoda su spojene i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobilo bistro, bezbojno ulje (132 g, 1,18 mol, prinos 72 % koji sadrži 16 % težine rezidualnog etil acetata prema NMR) kao željeni proizvod, 3-metilentetrahidropiran-2-on.<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ 6,18 (q, J = 1,9 Hz, 1H), 5,60 (q, J = 1,9 Hz, 1H), 4,40 - 4,26 (m, 2H), 2,61 (ddt, J = 7,0, 6,3, 2,0 Hz, 2H), 1,90 - 1,75 (m, 2H).

Korak 3: 3-(2-metil-2-nitro-propil)tetrahidropiran-2-on

[0108]

[0109] Balon sa okruglim dnom od 5000 mL sa 3 grla je opremljen mehaničkom mešalicom, kupatilom za hlađenje koje se koristi kao sekundarni kontejner, J-Kem temperaturnom sondom, levkom za dodavanje i ulazom/izlazom azota. Posuda je napunjena u atmosferi azota sa 2-nitropropanom (104,9 g, 1,177 mol). Započeto je mešanje i temperatura posude je zabeležena na 19 °C. U posudu je zatim napunjen 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (22,41 g, 147,2 mmol) dodat u čistom obliku u jednoj porciji što je rezultiralo bistrim svetlo žutim rastvorom. Nije primeć ena egzotermna pojava. Levak za dodavanje je napunjen sa rastvorom 3-metilentetrahidropiran-2-ona (110 g, 981,0 mmol) u acetonitrilu (1100 mL) koji je dodat u kapima tokom 1 h, što je rezultiralo bistrim svetlo žutim rastvorom i postepenom egzotermom do 24. °C. Reakciona smeša je nastavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 3,5 h i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Preostali ostatak je rastvoren u dihlorometanu (1000 mL) i podeljen sa 500 mL mešavine 3:21 molarni rastvor limunske kiseline/zasić eni rastvor natrijum hlorida. Dobijena organska faza je bila bistar rastvor bledo plave boje, a vodena faza je bila blago zamuć ena, veoma bled plavi rastvor. Organski sloj je uklonjen, a zaostali vodeni sloj je ekstrahovan dihlorometanom (300 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani zasić enim rastvorom natrijum hlorida (300 mL), osušeni preko natrijum sulfata (250 g) i zatim filtrirani kroz Buchnerov levak od staklene frite. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom do zapremine od oko 200 mL. Bistri bledoplavi rastvor dihlorometana je razblažen metil terc-butil etrom (1500 mL) i zamuć eni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom do zapremine od oko 200 mL, čime se dobija suspenzija. Smeša je ponovo razblažena sa metil terc-butil etrom (1500 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom do zapremine od oko 250 mL. Dobijena suspenzija je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi preko noć i (oko 12 h). Čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom u Buhnerov levak od staklene frite i filterski kolač je ispran hladnim metil terc-butil etrom (23150 mL) i zatim vučen 30 min. Materijal je dalje sušen u vakuum peć nici na 45 °C tokom 5 h da bi se dobilo (160 g, 0,795 mol, 81% prinos) bele čvrste supstance kao željenog proizvoda, 3-(2-metil-2-nitro-propil). )tetrahidropiran-2-on.<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ 4,34 (ddd, J = 11,1, 9,3, 4,3 Hz, 1H), 4,20 (dt, J = 11,1, 5,1 Hz, 1H), 2,75 - 2,62 , 2,56 (dd, J = 14,9, 5,2 Hz, 1H), 2,01 - 1,89 (m, 2H), 1,89 - 1,67 (m, 2H), 1,55 (d, J = 6,0 Hz, 6H), 1,44 (dddd, J). = 12,8, 11,5, 8,1, 6,6 Hz, IH).

Korak 4: 3-(3-hidroksipropil)-5,5-dimetil-pirolidin-2-on

[0110]

[0111] Balon sa okruglim dnom od 1000 mL sa 3 grla je opremljen teflonskom mešalicom, grejnim poklopcem, J-Kem temperaturnom sondom/kontrolorom i gumenim septumima. Posuda je napunjena sa 3-(2-metil-2-nitropropil)tetrahidropiran-2-onom (25 g, 124,2 mmol) i etil alkoholom (375 mL) koji je dao belu suspenziju. Započeto je mešanje i suspenzija je zagrevana na 40 °C tokom 10 min, što je dalo bistar bezbojni rastvor. U posudu je zatim postavljena cev za disperziju gasa i rastvor je degaziran azotom 15 min. Posuda je zatim napunjena Raney niklom (8,019 g 50% tež/tež, 68,31 mmol) i posuda je zatim opremljena septumima. Posuda je evakuisana i stavljena u atmosferu vodonika. Proces je ponovljen tokom tri ciklusa. Sud je zatim stavljen pod vodonik sa 1 atmosferom i reakciona smeša je postepeno zagrevana do 60 °C. Reakcija je nastavljena da se meša na 60 °C tokom 24 h. Posle hlađenja na sobnu temperaturu, posuda je opremljena cevi za disperziju gasa i reakciona smeša je degazirana azotom tokom 15 min. Smeša je filtrirana u vakuumu kroz Buchnerov levak od staklene frite sa slojem celita od 20 mm. Filterski kolač je ispran etanolom (2 x 100 mL) i povučen dok se malo etil alkohol ne pokvasi, zatim navlažen vodom i korišć eni Raney nikl katalizator je stavljen pod vodu. Bistri bledo jantarni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom do bistrog viskoznog ulja svetlog ć ilibara. Ulje je razblaženo metil terc-butil etrom (1500 mL) i zamu ć eni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom do zapremine od oko 150 mL, čime se dobija suspenzija. Smeša je ponovo razblažena sa metil terc-butil etrom (1500 mL) i koncentrovana pod sniženim pritiskom do zapremine od oko 150 mL. Dobijena suspenzija je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi preko noć i (oko 12 h). Čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom u Buhnerov levak od staklene frite, a kolač od filtera je ispran hladnim metil terc-butil etrom (2 x 50 mL) i zatim vučen 30 min. Materijal je dalje sušen u vakumskoj peć i na 45 °C tokom 3 h da bi se dobila bela čvrsta supstanca (19 g, 0,111 mol, 89% prinos) kao proizvod, 3-(3-hidroksipropil)-5,5-dimetil-pirolidin-2-on.<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ 7,63 (s, 1H), 3,38 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,37 (tdd, J = 9,8, 8,5, 4,4 Hz, 1H), 2,02 (dd , J = 12,3, 8,6 Hz, IH), 1,72 (tdd, J = 9,6, 7,5, 4,4 Hz, 1H), 1,52 - 1,32 (m, 3H), 1,28 - 1,03 (m, 7H).

Korak 5: 3-(5,5-dimetilpirolidin-3-il)propan-1-ol

[0112]

[0113] Balon sa okruglim dnom od 5 L, sa 3 grla je opremljen mehaničkom mešalicom, poklopcem za grejanje, levkom za dodavanje, J-Kem temperaturnom sondom/kontrolorom i ulazom/izlazom azota. Posuda je napunjena u atmosferi azota sa litijum-aluminijum-hidridnim peletima (19,39 g, 510,9 mmol). Posuda je zatim napunjena tetrahidrofuranom (500 mL, 20 mL/g). Započeto je mešanje i temperatura posude je zabeležena na 20 °C. Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi 0,5 h da bi se omoguć ilo da se peleti rastvore. Temperatura lonca dobijene sive suspenzije je zabeležena na 24 °C. Levak za dodavanje je napunjen sa rastvorom 3-(3-hidroksipropil)-5,5-dimetilpirolidin-2-ona (25 g, 146,0 mmol) u tetrahidrofuranu (500 mL) i bistri bledo žuti rastvor je dodat u kapima preko 90 min. Za postizanje homogenosti bilo je potrebno blago zagrevanje. Nakon završenog dodavanja, temperatura lonca dobijene sivkaste suspenzije je zabeležena na 24 °C. Smeša je zatim zagrejana do temperature posude od 65 °C i stanje je održavano 72 h. Analiza reakcione smeše u ovom trenutku pokazala je da je još preostao neki preostali početni materijal i da nema promene u formiranju proizvoda. Reakcija je naknadno zaustavljena u ovom trenutku. Omotač za grejanje je uklonjen i posuda je opremljena rashladnim kupatilom. Suspenzija je ohlađena na 0 °C u kupatilu za hlađenje smrvljenog leda/vode, a zatim je ugašena veoma sporo dodavanjem vode u kapima (19,93 mL), prać eno 15 % težine rastvora natrijum hidroksida (19,93 mL) i na kraju vodom (59,79 mL). Temperatura lonca dobijene bele suspenzije je zabeležena na 5°C. Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i posuda je ponovo opremljena grejnim omotačem. Suspenzija je zagrejana na 60°C i stanje je održavano 30 min. Topla suspenzija je vakumski filtrirana kroz Buchnerov levak od staklene frite sa slojem celita od 20 mm. Filterski kolač je zatim ispran sa tetrahidrofuranom na 60 °C (23250 mL), a zatim vučen 30 min. Bistri filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo (23,5 g, 0,149 mol, 99 % prinos) bistro svetlo žuto viskozno ulje kao željeni proizvod, 3-(5,5-dimetilpirolidin-3-il)propan-1- ol.

<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ 3,37 (dt, J = 8,3, 6,4 Hz, 3H), 2,95 (dd, J = 10,6, 7,6 Hz, 1H), 2,40 (dd, J = 10,7 Hz, 7 Hz , 1H), 2,04 (dt, J = 16,1, 8,1 Hz, IH), 1,69 (dd, J = 12,2, 8,2 Hz, 1H), 1,50 - 1,24 (m, 5H), 1,11 - 0,94 (m, 7H).

Korak 6: terc-butil 4-(3-hidroksipropil)-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat

[0114]

[0115] Balon sa okruglim dnom od 1 L sa 3 grla je opremljen mehaničkom mešalicom, kupatilom za hlađenje, levkom za dodavanje, J-Kem temperaturnom sondom i ulazom/izlazom azota. Posuda je napunjena u atmosferi azota sa 3-(5,5-dimetilpirolidin-3-il)propan-1-olom (15 g, 95,39 mmol) i dihlorometanom (225 mL, 15 mL/g) koji je davao jasno svetlo žuti rastvor. Započeto je mešanje i temperatura posude je zabeležena na 19 °C. Kupatilo za hlađenje je napunjeno usitnjenim ledom/vodom i temperatura posude je spuštena na 0 °C. Levak za dodavanje je napunjen trietilaminom (12,55 g, 124,0 mmol) koji je zatim dodat čisto u kapima tokom 5 min. Nije primeć ena egzotermna pojava. Levak za dodavanje je zatim napunjen sa di-terc-butil dikarbonatom (22,89 g, 104,9 mmol) rastvorenim u dihlorometanu (225 mL). Bistri bledo žuti rastvor je zatim dodat u kapima tokom 30 minuta što je rezultiralo blagim razvijanjem gasa. Nije primeć ena egzotermna pojava. Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i dobijeni bistri svetlo žuti rastvor je ostavljen da se zagreje do sobne temperature i nastavio da se meša na sobnoj temperaturi 3 h. Reakciona smeša je prebačena u levak za odvajanje i podeljena sa vodom (75 mL). Organski sloj je uklonjen i ispran zasić enim rastvorom natrijum hlorida (75 mL), osušen preko natrijum sulfata (150 g) i zatim filtriran kroz Buchnerov levak od staklene frite. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo (30 g) bistro svetlo žuto ulje kao željeni sirovi proizvod. Materijal je prečišć en fleš hromatografijom na silika gel koloni (punjenje tečnosti sa dihlorometanom) eluiranjem sa gradijentom od 100 % dihlorometana do 10 % metil alkohola u dihlorometanu tokom 60 minuta, sakupljanjem frakcija od 50 mL. Željene frakcije proizvoda su kombinovane i koncentrovane pod sniženim pritiskom da bi se dobio terc-butil 4-(3-hidroksipropil)-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat (22 g, 0,0855 mol, 90 % prinos) kao bistro bledo žuto viskozno ulje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4,38 (td, J = 5,2, 1,4 Hz, 1H), 3,54 (dt, J = 10,3, 6,7 Hz, 1H), 3,38 (td, J = 6,6, 3,5) 2H), 2,76 (q, J = 10,3 Hz, 1H), 2,07 (td, J = 11,6, 5,7 Hz, 1H), 1,87 (ddd, J = 16,7, 12,1, 6,0 Hz, 1H), 1,37 (dd, J = 1H), 2,76 (k, J = 10,3 Hz, 1H), 1,37 (dd, J = 14,2, 10.4 Hz, 17H), 1.24 (s, 3H).

Korak 7: terc-butil 2,2-dimetil-4-(3-metilsulfonil oksipropil)pirolidin-1-karboksilat

[0116]

terc-butil 4-(3-hidroksipropil)-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat (50,5 g, 196,22 mmol) i trietilamin (39,711 g, 54,698 mL, 392,44 mmol) rastvoreni su u dihlorometanu (500 mL) dobijeni rastvor je hlađen u kupatilu sa ledenom vodom 30 min. Mezil hlorid (24,725 g, 16,706 mL, 215,84 mmol) je dodat u kapima tokom perioda od 30 minuta, zatim je ledeno kupatilo uklonjeno i smeša je mešana na sobnoj temperaturi jedan sat. Reakcija je zatim ugašena zasić enim rastvorom natrijum bikarbonata (200 mL). Faze su razdvojene i organska faza je ekstrahovana sa zasić enim natrijum bikarbonatom (200 mL) i vodom (2 x 100 mL). Vodene faze su odbačene, a organska faza je osušena iznad natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana u vakumu da bi se dobio terc-butil 2,2-dimetil-4-(3-metilsulfonil oksipropil)pirolidin-1-karboksilat (64,2 g, 93% ) kao bledožuto ulje. ESI-MS m/z izrač. 335,1766, nađeno 336,4 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 5,54 min (LC metoda K).

Korak 8: terc-butil 4-(3-aminopropil)-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat

[0117]

terc-butil 2,2-dimetil-4-(3-metilsulfoniloksipropil)pirolidin-1-karboksilat (64,2 g, 191,38 mmol) je rastvoren u dioksanu (650 mL), a zatim je dodat amonijum hidroksid (650 mL) i nastala smeša zagreva se na 45 °C 18 h. Posle 18 h, reakcija je ohlađena do sobne temperature. Rastvor je razblažen sa 1M natrijum hidroksidom (200 mL), a zatim ekstrahovan dietil etrom (33650 mL). Vodena faza je odbačena i kombinovane organske faze su ekstrahovane vodom (2 x 200 mL). Vodene faze su odbačene, a organska faza je osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana u vakumu da bi se dobio terc-butil 4-(3-aminopropil)-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat (48,9 g, 95 % ) kao bledožuto ulje. ESI-MS m/z izrač.256,2151, nađeno 257,3 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 3,70 min (LC metoda K).

Korak 9: terc-butil 2,2-dimetil-4-[3-[(6-sulfamoil-2-piridil)amino]propil]pirolidin-1-karboksilat

[0118]

[0119] U terc-butil 4-(3-aminopropil)-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat (8,91 g, 34,8 mmol) i 6-fluoropiridin-2-sulfonamid (6,13 g, 34,8 mmol) u dimetil sulfoksidu (75 ml) dodat je kalijum karbonat (4,91 g, 35,5 mmol) i smeša je mešana na 100 °C tokom 12 sati, a zatim je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i mešana još 4 sata (ukupno 16 sati). Reakciona smeša je polako sipana u hlorovodoničnu kiselinu (35 ml 1 M, 35,00 mmol) u vodi (200 ml) (uz blago penjenje) i razblažena etil acetatom (250 ml). Organska faza je odvojena i isprana sa 100 ml slanog rastvora. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana preko celita i koncentrovana u vakuumu da bi se dobilo tamno žuto ulje. Sirovi proizvod je prečišć en hromatografijom na silika gelu eluiraju ć i sa 0% - 100% etil acetata u heksanima. Sakupljene su i čiste (9,0 g) i nečiste (3 g) frakcije. Nečiste frakcije su prečišć ene hromatografijom na silika gelu eluirajuć i sa 0% - 100% etil acetata u heksanima, što je dalo ukupno terc-butil 2,2-dimetil-4-[3-[(6-sulfamoil-2-piridil)amino]propil]pirolidin-1-karboksilata (10,0 g, 69%).<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ 7,52 (dd, J = 8,5, 7,2 Hz, 1H), 7,07 (s, 2H), 6,95 (dd, J=7,2, 0,7 Hz, 2H), 6,61 (d, J=8,5 Hz, 1H), 3,55 (g, J=9,1 Hz, 1H), 3,32-3,24 (m, 2H), 2,79 (q, J= 10,0 Hz, 1H), 2,13 (d, J = 16,1 Hz, 1H), 1,96 - 1,82 (m, 1H), 1,51 (dt, J = 18,0, 9,3 Hz, 2H), 1,37 (dd, J = 12,9, 10,6 Hz, 15H), 1,24 (s, 3H). ESI-MS m/z izračunato 412,21442, pronađeno 413,1 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 2,34 min (LC metod D).

Korak 10: terc-butil (4S)-2,2-dimetil-4-[3-[(6-sulfamoil-2-piridil)amino]propil]pirolidin-1-karboksilat

[0120]

[0121] Racemski terc-butil 2,2-dimetil-4-[3-[(6-sulfamoil-2-piridil)amino]propil]pirolidin-1-karboksilat (7 g, 16,97 mmol) je podvrgnut hiralnom razdvajanju SFC hromatografijom korišć enjem ChiralPak IG (kolona 250 × 21,2 mm, veličina čestica 5 µm) sa mobilnom fazom 40% metanol/60% ugljen-dioksid pri 70 ml/min tokom 11,0 min (zapremina ubrizgavanja = 500 µL rastvora od 32 mg/ml u metanolu) dajuć i kao prvi pik koji se eluira, terc-butil (4S)-2,2-dimetil-4-[3-[(6-sulfamoil-2-piridil)amino]propil]pirolidin-1-karboksilat (3,4481 g, 99%). ESI-MS m/z izračunato 412,21442, pronađeno 413,2 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 0,63 min (LC metod A).

Deo C: Sinteza (14S)-8-[3-(2-{dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il}etoksi)-1H-pirazol-1-il]-12,12-dimetil-2λ6-tia-3,9, 11,18,23-pentaazatetraciklo [17.3.1.111,14.05,10]tetrakoza-1(22),5,7,9,19(23),20-heksan-2,2,4-triona (Jedinjenje I)

[0122]

Korak 1: terc-butil (45)-4-[3-[[6-[[2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karbonil]sulfamoil]-2-piridil]amino]propil]-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat

[0123]

[0124] U rastvor 2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksilne kiseline (5,2 g, 14,45 mmol) u tetrahidrofuranu (100 ml) dodat je karbonil diimidazol (2,8 g, 16,51 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Ovoj smeši je dodat terc-butil (4S)-2,2-dimetil-4-[3-[(6-sulfamoil-2-piridil)amino]propil]pirolidin-1-karboksilat (6,0 g, 14,54 mmol) u tetrahidrofuranu (15 ml), a zatim 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (6,5 ml, 43,47 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 sati. Reakcija je razblažena vodom (150 mL) i smeša je zakiseljena vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (15 mL 6 M, 90,00 mmol). Smeša je ekstrahovana etil acetatom (300 mL) i organska faza je odvojena. Organska faza je isprana rastvorom soli, osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana preko celita i koncentrovana u vakuumu, što je dalo beli talog. Talog je razblažen acetonitrilom, a čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom pomoć u srednje staklene frite i isprana acetonitrilom. Filtrat je koncentrovan u vakuumu, što je dalo žuto ulje. Sirovo ulje je razblaženo acetonitrilom i malo N-metil-2-pirolidona i hromatografisano na 415 g reverzno-faznoj C18koloni eluirajuć i sa 50% - 100% acetonitrila u vodi, dajuć i terc-butil (4S)-4-[3-[[6-[[2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karbonil]sulfamoil]-2-piridil]amino]propil]-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat (4,5 g, 41%). ESI-MS m/z izračunato 753.30756, pronađeno 754.4 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 3,79 min (LC metod D).

Korak 2: 2-hloro-N-[[6-[3-[(3S)-5,5-dimetilpirolidin-3-il]propilamino]-2-piridil]sulfonil]-6-[3-(2-dis – piro[2.0.2.1] heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksamid (trifluoroacetatna so)

[0125]

[0126] U rastvor terc-butil (4S)-4-[3-[[6-[[2-hloro-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazola -1-il]piridin-3-karbonil]sulfamoil]-2-piridil]amino]propil]-2,2-dimetil-pirolidin-1-karboksilat (5,9 g, 7,821 mmol) u dihlorometanu (30 mL ) i toluenu (15 mL) je dodata trifluorosirć etna kiselina (6.0 mL, 77.88 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Rastvarač je uklonjen in vacuo sa temperaturom kupatila postavljenom na 45 °C dajuć i gusto, žuto ulje. Ulje je razblaženo toluenom (125 mL) i rastvarač je uklonjen in vacuo sa temperaturom kupatila podešenom na 45 °C. Ulje je razblaženo toluenom i rastvarač je uklonjen in vacuo dajuć i gusto, viskozno žuto ulje, 2-hloro-N-[[6-[3-[(3S)-5,5-dimetilpirolidin-3-il]propilamino]-2-piridil]sulfonil]-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il] piridin-3-karboksamid (trifluoroacetatna so) (6,0 g, 100 %) koji je korišć en u slede ć em koraku bez daljeg prečišć avanja. ESI-MS m/z izrač.653,2551, nađeno 654,3 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 2,6 min (LC metoda B).

Korak 3: (14S)-8-[3-(2-{Dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il}etoksi)-1H-pirazol-1-il]-12,12-dimetil-2l6-tia- 3,9,11,18,23-pentaazatetraciklo[17.3.1.111,14.05,10]tetrakoza-1(22),5,7,9,19(23),20-heksan-2,2,4-trion (Jedinjenje I)

[0127]

[0128] U rastvor 2-hloro-N-[[6-[3-[(3S)-5,5-dimetilpirolidin-3-il]propilamino]-2-piridil]sulfonil]-6-[3-(2-dispiro[2.0.2.1]heptan-7-iletoksi)pirazol-1-il]piridin-3-karboksamida (trifluoroacetatna so) (6,0 g, 7,810 mmol) u NMP (140 ml) dodat je kalijum karbonat (5,3 g, 38,35 mmol). Smeša je produvana azotom tokom 5 minuta. Smeša je zatim zagrejana na 150 °C tokom 22 sata. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i dodata u vodu (300 ml) dajuć i beličastu čvrstu masu. Smeša je pažljivo zakiseljena vodenom hlorovodoničnom kiselinom (12 ml 6 M, 72,00 mmol) dajuć i penastu suspenziju. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom pomo ć u srednje staklene frite. Vlažni filter kolač je rastvoren u etil acetatu (500 ml) i ispran sa 200 ml slanog rastvora. Vodena faza je bila blago zamuć ena, pa je zakiseljena malom količinom 6N hlorovodonične kiseline i vrać ena u organsku fazu. Vodena faza je odvojena, a organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i koncentrovana u vakuumu, dajuć i svetlo žuto ulje. Ovaj sirovi proizvod je razblažen acetonitrilom i hromatografisan na 415 g C18reverzno-faznoj koloni eluirajuć i sa 50% - 100% acetonitrila u vodi. Proizvod je izolovan kao pena krem boje. Pena je sušena u vakuumu na 45 °C tokom 48 sati, dajuć i (14S)-8-[3-(2-{dispiro[2.0.2.1]heptan-7-il}etoksi)-1H-pirazol-1-il]-12,12-dimetil- 2λ6-tia-3,9,11,18,23-pentaazatetraciklo[17.3.1.111,14.05,10]tetrakoza-1(22),5,7,9,19(23),20-heksan-2,2,4-trion (Jedinjenje I) (3,32 g, 68%).<1>H NMR (400 MHz, dimetil sulfoksid-d6) δ 12,48 (s, 1H), 8,20 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,57 (dd, J=8,5, 7,2 Hz, 1H), 7,05 (d, J=7,1 Hz, 1H), 6,97 (d, J=8,5 Hz, 1H), 6,91 (d, J=8,2 Hz, 1H), 6,71 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 6,08 (d, J=2,7 Hz, 1H), 4,21 (td, J=6,7, 1,3 Hz, 2H), 3,92 (d, J=12,0 Hz, 1H), 3,16 (s, 1H), 2,95 (d, J=13,3 Hz, 1H), 2,78 - 2,66 (m, 1H), 2,07 (s, 1H), 1,92 - 1,72 (m, 4H), 1,60 (s, 6H), 1,51 (s, 3H), 1,47 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 1,31 (q, J = 12,2 Hz, 1H), 0,89 - 0,77 (m, 4H), 0,69 - 0,61 (m, 2H), 0,53 - 0,45 (m, 2H). ESI-MS m/z izračunato 617,27844, pronađeno 618,4 (M+1)+; Vreme zadržavanja: 10,29 min (LC metod F).

[0129] Ca<2+>, Na<+>i K<+>soli Jedinjenja I su napravljene mešanjem Jedinjenja I sa Ca(OCH3)2, Na(OCH3) i KOH, respektivno: mešanjem Jedinjenja I (1g) i Ca(OCH3)2(83 mg) u metanolu (65 mL) na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, a zatim na 65 °C tokom 30 minuta; mešanje Jedinjenja I (0,6 g (1 mMol)) u MeOH (40 mL) sa 25 % težine Na(OCH3) u MeOH (250 mL (1 molarni ekvivalent)) na 60 °C tokom 20 minuta; i mešanje Jedinjenja I (0.6 g) u acetonu (11 mL) sa 1N KOH (1 molarni ekvivalent) na 50 °C tokom 1 sata. Posle filtracije dobijenih vruć ih rastvora, filtrati su upareni do suvih da bi se dobile željene amorfne soli, respektivno (PXRD podaci nisu prikazani).

Primer 2: Sinteza (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroksipropil)-6-fluoro-2 -(1-hidroksi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5-il)ciklopropankarboksamid (Jedinjenje II)

[0130]

Korak 1: (R)-benzil 2-(1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil)-6-fluoro-5-nitro-1H-indol-2-il) -2-metilpropanoat i ((S)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil 2-(1-(((R)-2,2-dimetil-1,3- dioksolan-4-il)metil)-6-fluoro-5-nitro-lH-indol-2-il)-2-metilpropanoat

[0131] Cezijum karbonat (8,23 g, 25,3 mmol) je dodat u smešu benzil 2-(6-fluoro-5-nitro-lH-indol-2-il)-2-metilpropanoata (3,0 g, 8,4 mmol) i (S)-(2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil 4-metilbenzensulfonat (7,23 g, 25,3 mmol) u DMF (17 mL). Reakcija je mešana na 80 °C tokom 46 sati u atmosferi azota. Smeša je zatim podeljena između etil acetata i vode. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom. Kombinovani etilacetatni slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrovani. Sirovi proizvod, viskozno smeđe ulje koje sadrži oba gore prikazana proizvoda, direktno je odveden u sledeć i korak bez daljeg prečiš ć avanja. (R)-benzil 2-(1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil)-6-fluoro-5-nitro-1H-indol-2-il)-2- metilpropanoat, ESI-MS m/z izrač. 470,2, nađeno 471,5 (M+1)+. Vreme zadržavanja 2,20 minuta. ((S)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil 2-(1-(((R)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil )-6-fluoro-5-nitro-lH-indol-2-il)-2-metilpropanoat, ESI-MS m/z izrač. 494,5, nađeno 495,7 (M+1)+. Vreme zadržavanja 2,01 minuta.

Korak 2: (R)-2-(1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil)-6-fluoro-5-nitro-1H-indol-2-il)- 2-metilpropan-1-ol

[0132] Sirova reakciona smeša dobijena u koraku (A) je rastvorena u THF (42 mL) i ohlađena u posudi sa ledom i vodom. LiAlH4(16,8 mL 1 M rastvora, 16,8 mmol) je dodat u kapima. Nakon što je dodavanje završeno, smeša je bila mešana dodatnih 5 minuta. Reakcija je ugašena dodavanjem vode (1 mL), 15 % rastvora NaOH (1 mL) i zatim vode (3 mL). Smeša je filtrirana preko celita, a čvrste materije su isprane sa THF i etil acetatom. Filtrat je koncentrovan i prečišć en hromatografijom na koloni (30-60 % etil acetat-heksani) da bi se dobio (R)-2-(1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil)-6-fluoro-5-nitro-1H-indol-2-il)-2-metilpropan-1-ol kao smeđe ulje (2,68 g, 87 % u 2 koraka). ESI-MS m/z izrač. 366,4, nađeno 367,3 (M+1)+. Vreme zadržavanja 1,68 minuta.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,34 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,65 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 6,57 (s, 1H), 4,94 (t, J = 5,4 Hz , 1H), 4,64 - 4,60 (m, 1H), 4,52 - 4,42 (m, 2H), 4,16 -4,14 (m, 1H), 3,76 - 3,74 (m, 1H), 3,63 - 3,53 (m, 2H), m. (s, 3H), 1,38 - 1,36 (m, 6H) i 1,19 (s, 3H) ppm

Korak 3: (R)-2-(5-amino-1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil)-6-fluoro-1H-indol-2-il)- 2-metilpropan-1-ol

[0133] (R)-2-(1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil)-6-fluoro-5-nitro-1H-indol-2-il)-2-metilpropan-1-ol (2,5 g, 6,82 mmol) je rastvoren u etanolu (70 ml) i reakcija je isprana N2. Zatim je dodat Pd-C (250 mg, 5% težine.). Reakcija je ponovo isprana N2, a zatim mešana pod vodom (atm). Posle 2,5 sata, LCMS je pokazala samo delimičnu konverziju u proizvod. Reakcija je filtrirana kroz celit i koncentrovana. Ostatak je ponovo podvrgnut napred navedenim uslovima. Posle 2 sata, LCMS je pokazao potpunu konverziju u proizvod. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit. Filtrat je koncentrovan da bi se dobio proizvod kao crna čvrsta supstanca (1,82 g, 79%). ESI-MS m/z izračunato 336,2, pronađeno 337,5 (M+1)+. Vreme zadržavanja 0,86 minuta.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,17 (d, J = 12,6 Hz, 1H), 556,76 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,03 (s, 1H), 4,79 - 4,76 (m, 1H), 4,46 (s, 2H), 4,37 - 4,31 (m, 3H), 4,06 (dd, J = 6,1, 8,3 Hz, 1H), 3,70 -3,67 (m, 1H), 3,55 - 3,52 (m, 2H), 1,41 (s, 3H), 1,32 (s, 6H) i 1,21 (s, 3H) ppm.

Korak 4: (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d] [1,3]dioksol-5-il)-N-(1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4) -il)metil)-6-fluoro-2-(1-hidroksi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5-il)ciklopropankarboksamid

[0134] DMF (3 kapi) je dodat u mešavinu 1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksilne kiseline (1,87 g, 7,7 mmol) i tionil hlorida ( 1,30 mL, 17,9 mmol). Posle 1 sata formirao se bistar rastvor. Rastvor je koncentrovan pod vakuumom, a zatim je dodat toluen (3 mL) i smeša je ponovo koncentrovana. Korak toluena je ponovljen još jednom i ostatak je stavljen na visoki vakuum tokom 10 minuta. Hlorid kiseline je zatim rastvoren u dihlorometanu (10 mL) i dodat u smešu (R)-2-(5-amino-1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil )-6-fluoro-lH-indol-2-il)-2-metilpropan-1-ol (1,8 g, 5,4 mmol) i trietilamin (2,24 mL, 16,1 mmol) u dihlorometanu (45 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakcija je isprana sa 1N rastvorom HCl, zasić enim rastvorom NaHC03i slanim rastvorom, osušena preko MgS04i koncentrovana da bi se dobio proizvod kao crna penasta čvrsta supstanca (3 g, 100%). ESI-MS m/z izrač.

560,6, nađeno 561,7 (M+1)+. Vreme zadržavanja 2,05 minuta.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,31 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,42 - 7,40 (m, 2H), 7,34 - 7,30 (m, 3H), 6,24 (s, 1H), 4,51 - 4,48 (m, 1H), 4,39 - 4,34 (m, 2H), 4,08 (dd, J = 6,0, 8,3 Hz, 1H), 3,69 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 3,58 - 3,51 (m, 2H), 1,48 - 1,45 (m, 2H), 1,39 (s, 3H), 1,34 - 1,33 (m, 6H), 1,18 (s, 3H) i 1,14 - 1,12 (m, 2H) ppm

Korak 5: (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroksipropil)-6-fluoro-2-( 1-hidroksi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5-il)ciklopropankarboksamid

[0135] (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)-N-(1-((2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4)-il)metil)-6-fluoro-2-(1-hidroksi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5-il)ciklopropankarboksamid (3,0 g, 5,4 mmol) je rastvoren u metanolu (52 mL). Dodata je voda (5,2 mL), a zatim p-TsOH.H20 (204 mg, 1,1 mmol). Reakcija je zagrevana na 80 °C tokom 45 minuta. Rastvor je koncentrovan i zatim podeljen između etil acetata i zasić enog rastvora NaHC03. Etil acetatni sloj je osušen preko MgS04i koncentrovan. Ostatak je prečišć en hromatografijom na koloni (50-100 % etil acetat - heksani) da bi se dobio proizvod kao kremasta penasta čvrsta supstanca. (1,3 g, 47 %, ee >98 % prema SFC). ESI-MS m/z izrač. 520,5, nađeno 521,7 (M+1)+. Vreme zadržavanja 1,69 minuta.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,31 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,42 - 7,38 (m, 2H), 7,33 - 7,30 (m, 2H), 6,22 (s, 1H), 5,01 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,90 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,75 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 4,40 (dd, J = 2,6, 15,1 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 8,7, 15,1 Hz, 1H), 3,90 (s, 1H), 3,65 - 3,54 (m, 2H), 3,48 - 3,33 (m, 2H), 1,48 -1,45 (m, 2H), 1,3 s, 3H), 1,32 (s, 3H) i 1,14 - 1,11 (m, 2H) ppm.

Primer 3: Sinteza N-(2,4-di-terc-butil-5-hidroksifenil)-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksamida (Jedinjenje III)

Deo A: Sinteza 4-okso-1,4-dihidrokvinaolin-3-karboksilna kiselina

[0136]

Korak 1: Dietil estar 2-fenilaminometilen-malonske kiseline

[0137] Smeša anilina (25,6 g, 0,275 mol) i dietil 2-(etoksimetilen)malonata (62,4 g, 0,288 mol) je zagrevana na 140-150 °C tokom 2 h. Smeša je ohlađena do sobne temperature i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobio dietil estar 2-fenilaminometilen-malonske kiseline kao čvrsta supstanca, koji je korišć en u slede ć em koraku bez daljeg prečiš ć avanja.<1>H NMR (DMSO-d6) δ 11,00 (d, 1H), 8,54 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 7,36-7,39 (m, 2H), 7,13-7,17 (m, 3H), 4,17-4,33 (m , 4H), 1,18-1,40 (m, 6H).

Korak 2: etil estar 4-hidroksihinolin-3-karboksilne kiseline

[0138] Balon sa tri grla od 1 L opremljen mehaničkom mešalicom je napunjen dietil estrom 2-fenilaminometilenmalonske kiseline (26,3 g, 0,100 mol), polifosfornom kiselinom (270 g) i fosforil hloridom (750 g). Smeša je zagrejana do 70 °C i mešana 4 h. Smeša je ohlađena do sobne temperature i filtrirana. Ostatak je tretiran vodenim rastvorom Na2C03, filtriran, ispran vodom i osušen. Etil estar 4-hidroksihinolin-3-karboksilne kiseline je dobijen kao bledo braon čvrsta supstanca (15,2 g, 70%). Sirovi proizvod je korišć en u slede ć em koraku bez daljeg prečiš ć avanja.

Korak 3: 4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina

[0139] Etil estar 4-hidroksihinolin-3-karboksilne kiseline (15 g, 69 mmol) je suspendovan u rastvoru natrijum hidroksida (2N, 150 mL) i mešan 2 sata na refluksu. Nakon hlađenja, smeša je filtrirana, a filtrat je zakiseljen do pH 4 sa 2N HCl. Dobijeni talog je sakupljen filtracijom, ispran vodom i osušen pod vakuumom da bi se dobila 4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina kao bledo bela čvrsta supstanca (10,5 g, 92%).<1>H NMR (DMSO-d6) δ 15,34 (s, 1H), 13,42 (s, 1H), 8,89 (s, 1H), 8,28 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,88 (m, 1H), 7,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,60 (m, 1H).

Deo B: Sinteza N-(2,4-di-terc-butil-5-hidroksifenil)-4-okso-1,4-dihidro hinolin-3-karboksamida

[0140]

Korak 1: Metil estar 2,4-di-terc-butil-fenil estra ugljene kiseline

[0141] Metil hloroformat (58 mL, 750 mmol) je dodat kap po kap rastvoru 2,4-di-terc-butil-fenola (103,2 g, 500 mmol), Et3N (139 mL, 1000 mmol) i DMAP (3,05 g, 25 mmol) u dihlorometanu (400 mL) ohlađenom u ledeno-vodenom kupatilu na 0 °C. Smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature uz mešanje preko noć i, a zatim je filtrirana kroz silika gel (približno 1 L) koristeć i 10% etil acetat - heksan (~ 4 L) kao eluent. Kombinovani filtrati su koncentrovani da bi se dobio metil estar 2,4-di-terc-butil-fenil estra ugljene kiseline kao žuto ulje (132 g, kvantitativno).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,35 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,29 (dd, J = 8,5, 2,4 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,85 (s, 3H), 1,30 (s, 9H), 1,29 (s, 9H).

Korak 2: 2,4-di-terc-butil-5-nitro-fenil estar metil estar ugljene kiseline i 2,4-di-terc-butil-6-nitro-fenil estar metil estar ugljene kiseline

[0142] U mešavinu 2,4-di-terc-butil-6-nitro-fenil estar metil estra ugljene kiseline (4,76 g, 180 mmol) u koncentrovanoj sumpornoj kiselini (2 ml), ohlađenoj u kupatilu sa ledenom vodom, dodata je ohlađena smeša sumporne kiseline (2 ml) i azotne kiseline (2 ml). Dodavanje je vršeno polako tako da temperatura reakcije ne pređe 50 °C. Reakcija je ostavljena da se meša 2 sata dok se zagreva do sobne temperature. Reakciona smeša je zatim dodata u ledenu vodu i ekstrahovana u dietil etar. Etarski sloj je osušen (MgSO4), koncentrovan i prečišć en kolonskom hromatografijom (0 - 10% etil acetat - heksani) da bi se dobila smeša metil estra 2,4-di-tert-butil-5-nitro-fenil estra ugljene kiseline i metil estra 2,4-di-tert-butil-6-nitro-fenil estra ugljene kiseline kao bledo žuta čvrsta supstanca (4,28 g), koja je direktno korišć ena u slede ć em koraku.

Korak 3: 2,4-di-terc-butil-5-nitro-fenol i 2,4-di-terc-butil-6-nitro-fenol

[0143] Mešavina metil estra 2,4-di-terc-butil-5-nitro-fenil estra ugljene kiseline i metil estra 2,4-di-terc-butil-6-nitrofenil estra ugljene kiseline (4,2 g , 14,0 mmol) je rastvorena u MeOH (65 mL) pre nego što je dodat KOH (2,0 g, 36 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h. Reakciona smeša je zatim zakiseljena (pH 2-3) dodavanjem koncentacije HCl i podeljena između vode i dietil etra. Etarski sloj je osušen (MgSO4), koncentrovan i prečišć en hromatografijom na koloni (0 - 5 % etil acetat - heksani) da bi se dobio 2,4-di-terc-butil-5-nitro-fenol (1,31 g, 29% preko 2 koraci) i 2,4-di-terc-butil-6-nitro-fenol. 2,4-di-terc-butil-5-nitro-fenol:<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,14 (s, 1H, OH), 7,34 (s, 1H), 6,83 (s, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,30 (s, 9H). 2,4-Di-terc-butil-6-nitro-fenol:<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) d 11,48 (s, 1H), 7,98 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 2,4 Hz, IH), 1,47 (s, 9H), 1,34 (s, 9H).

Korak 4: 5-amino-2,4-di-terc-butil-fenol

[0144] U reluksni rastvor 2,4-di-terc-butil-5-nitro-fenola (1,86 g, 7,40 mmol) i amonijum formata (1,86 g) u etanolu (75 mL) je dodat Pd-5 % težine na aktivnom uglju (900 mg). Reakciona smeša je mešana na refluksu 2 h, ohlađena do sobne temperature i filtrirana kroz celit. Celit je ispran metanolom i kombinovani filtrati su koncentrovani da bi se dobio 5-amino-2,4-di-terc-butil-fenol kao siva čvrsta supstanca (1.66 g, kvant.).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,64 (s, IH, OH), 6,84 (s, IH), 6,08 (s, 1H), 4,39 (s, 2H, NH2), 1,27 (m, 18H); HPLC ret. vreme 2,72 min, 10-99 % CH3CN, 5 min rada; ESI-MS 222,4 m/z [M+H]+.

Korak 5: N-(5-hidroksi-2,4-di-terc-butil-fenil)-4-okso-1H-hinolin-3-karboksamid

[0145]

[0146] U suspenziju 4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilne kiseline (35,5 g, 188 mmol) i HBTU (85,7 g, 226 mmol) u DMF (280 mL) dodat je Et3N (63,0 mL, 451 mmol) na temperaturi okoline. Smeša je postala homogena i ostavljena je da se meša 10 min pre nego što je u malim porcijama dodat 5-amino-2,4-di-terc-butil-fenol (50,0 g, 226 mmol). Nakon što je sva kiselina potrošena (LC-MS analiza, MH+ 190, 1,71 min), rastvarač je uklonjen u vakumu. EtOH je dodat u narandžasti čvrsti materijal da bi se dobila suspenzija. Smeša je mešana na rotacionom isparivaču (temperatura kupatila 65 °C) tokom 15 min bez stavljanja sistema pod vakum. Smeša je filtrirana i uhvać ena čvrsta supstanca je isprana heksanom da bi se dobila bela čvrsta supstanca koja je bila EtOH kristalat. Et20je dodat u čvrstu materiju koja je gore dobijena sve dok se ne formira suspenzija. Smeša je mešana na rotacionom isparivaču (temperatura kupatila 25 °C) tokom 15 min bez stavljanja sistema pod vakum. Smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je uhvać ena. Ova procedura je izvedena ukupno pet puta. Čvrsta supstanca dobijena nakon petog taloženja je stavljena pod vakum preko noć i da bi se dobio N-(5-hidroksi-2,4-di-terc-butil-fenil)-4-okso-1H-hinolin-3-karboksamid kao bela praškasta čvrsta supstanca (38 g, 52%). HPLC ret. vreme 3,45 min, 10-99% CH3CN, 5 min rada;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,88 (s, 1H), 11,83 (s, 1H), 9,20 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,33 (dd, J = 8,2, 1,0 Hz, 1H), 7,83-7,79 (m, 1H), 7,76 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,54-7,50 (m, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,10 (s, 1H), 1,38 (s , 9H), 1,37 (s, 9H); ESI-MS m/z izračunato 392,21; nađeno 393,3 [M+H]+.

Primer 4: Sinteza N-(2-(terc-butil)-4-(terc-butil-d,)-5-hidroksifenil)-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksamida (Jedinjenje III-d )

Korak 1.2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-fenol

[0147] U rastvor 4-terc-butil fenola (3,43 g, 22,7 mmol) i terc-butil alkohola-d10 (3,00 mL, 31,8 mmol, 98 % D, Cambridge Isotop Laboratories, Inc.) u dihlorometanu (40. mL) je dodat D2SO4(1,50 mL, 99,5 atom% D, Sigma-Aldrich). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 15 sati, zatim je razblažena vodom i ekstrahovana dihlorometanom (3 x 100 mL). Organski slojevi su kombinovani, isprani zasić enim NaHC03, osušeni (Na2S04), filtrirani i koncentrovani u vakumu. Dobijeno ulje je prečišć eno hromatografijom na koloni (SiO2, 0-15% etil acetat/heptani) da bi se dobio 2-(terc-butild9)-4-(terc-butil)-6-d-fenol (4,04 g , 83% prinos) kao bistro ulje.<1>HNMR (d6-DMSO, 400MHz) δ 9,04 (s, 1H), 7,12 (d, J=2,4 Hz, 1H), 6,98 (dd, J=3,8, 2,5 Hz, 1H), 6,67 (d, J=8,3 Hz , 0,3 H), 1,22 (s, 10 H).

Korak 2: 2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-fenil metil karbonat

[0148] U rastvor 2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-fenola (4,04 g, 18,8 mmol), trietilamina (5,24 ml, 37,6 mmol) i N,N-dimetilaminopiridina (115 mg, 0,940 mmol) u CH2Cl2(40,0 ml) na 0 °C dodat je metil hloroformat (2,17 ml, 28,2 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 15 sati, a zatim je dodato još trimetilamina (1,30 ml, 9,33 mmol) i metil hloroformata (0,550 ml, 7,15 mmol). Nakon mešanja tokom dodatnog sata, reakcija je razblažena sa 10% etil acetata/heptana i filtrirana kroz čep od silicijum dioksida. Čep od silicijum dioksida je zatim ispran sa dodatnih 10% etil acetata/heptana. Filtrat je spojen i koncentrovan u vakuumu da bi se dobio 2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-dfenil metil karbonat (4,69 g, prinos 91%) kao svetlo žuto ulje koje je dalje koriš ć eno bez prečiš ć avanja.<1>H NMR (d6-DMSO, 400 MHz) δ 7,33 (d, J=2,4 Hz, 1H), 7,30-7,20 (m, 1H), 7,06 (d, J=8,5 Hz, 0,3H), 3,84 (d, J=0,7 Hz, 3H), 1,28 (s, 9H).

Korak 3: 2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-5-nitro-fenol

[0149] U rastvor 2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-fenil metil karbonata (4,69 g, 17,2 mmol) u sumpornoj kiselini (2,00 mL) na 0 °C je dodata 1:1 smeša sumporne kiseline i azotne kiseline (4,00 mL) u kapima. Reakcija je zatim mešana na sobnoj temperaturi dva sata, a zatim polako dodata u ledenu vodu uz snažno mešanje. Dobijena suspenzija je ekstrahovana etil acetatom (3 x 100 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni (Na2S04), filtrirani i koncentrovani da bi se dobilo ulje boje ć ilibara koje sadrži smešu regioizomera. Ovo sirovo ulje je zatim rastvoreno u MeOH (100 mL) i dodat je KOH (3,50 g). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata, a zatim je zakiseljena do pH=2 sa koncentrovanom HCl. Dobijeni rastvor je ekstrahovan dietil etrom (3 x 100 mL), osušen (MgS04), filtriran i koncentrovan. Ostatak je zatim prečišć en hromatografijom na koloni (Si02, 0-5% etil acetat/heptani) da bi se dobio 2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-5-nitro-fenol ( 1,33 g, 30%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. MS (ESI) 260,2 [(M-H)-].

Korak 4: 5-amino-2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-fenol

[0150] Rastvor 2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-d-5-nitro-fenola (1,33 g, 5,11 mmol) i amonijum formata (1,29 g, 20,4 mmol) u etanolu (60.0 mL) je zagrejan do refluksa. U to vreme, 10% Pd/C (650 mg, 50% vlažno) je dodato u malim porcijama i reakcija je nastavljena da se meša na refluksu dva sata. Reakcija je zatim ohlađena do sobne temperature, razblažena sa THF, filtrirana kroz Celite<®>i koncentrovana in vacuo da bi se dobio 5-amino-2-(terc-butild9)-4-(terc-butil)-6-d-fenol (1,19 g, 100%) kao ružičasta čvrsta supstanca. MS (ESI) 232,3 [(M+H)+].

Korak 5: 5-amino-2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-fenol

[0151] 5-amino-2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-6-dfenol (298 mg, 1,29 mmol) rastvoren je u 5M HCl u 2-propanolu (20 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 15 sati. Reakcija je zatim koncentrovana in vacuo i ponovo uzeta u 5M HCl u 2-propanolu (20 mL). Posle mešanja dodatnih 15 sati na sobnoj temperaturi, reakcija je koncentrovana in vacuo i razblažena zasić enim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (100 mL). Dobijeni vodeni rastvor je ekstrahovan dihlorometanom (3 x 50 mL). Organski slojevi su kombinovani, osušeni (Na2S04), filtrirani i koncentrovani in vacuo da bi se dobio 5-amino-2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-fenol (240 mg, 81%) kao roze čvrsta.<1>H NMR (d6-DMSO, 400 MHz) δ 8,62 (s, IH), 6,83 (s, IH), 6,08 (s, IH), 1,27 (s, 9H).

Korak 6: N-(2-(terc-butil)-4-(terc-butil-d9)-5-hidroksifenil)-4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksamid (Jedinjenje III-d)

[0152] U rastvor 5-amino-2-(terc-butil-d9)-4-(terc-butil)-fenola (240 mg, 1,04 mmol), 4-okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksilna kiselina (kupljena od Matrix Scientific, 99 mg, 0,521 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (181 ml, 1,04 mmol) u DMF (6,00 mL) su dodati HATU (198 mg, 0,521 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tri sata, zatim je razblažena zasić enim NaHC03i ekstrahovana etil acetatom (3 x 50 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom (3 x 20 mL), osušeni (Na2S04), filtrirani i koncentrovani in vacuo. Dobijeni ostatak je prečišć en hromatografijom na koloni (Si02, 0-70% etil acetat/heptani) da bi se dobio N-(2-(terc-butil)-4-(terc-butil-d9)-5-hidroksifenil)-4- okso-1,4-dihidrohinolin-3-karboksamid (Jedinjenje III-d) (80 mg, 38% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (d6-DMSO, 400 MHz) δ 12,88 (s, 1H), 11,81 (s, 1H), 9,19 (s, 1H), 8,86 (s, 1H), 8,32 (dd, J=8,1, 1,4 Hz, 1H), 7,86-7,77 (m, 1H), 7,75 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,09 (s, 1H) 1,37 (s, 9H) ; MS (ESI) 402,3 [(M+H)+].

Primer 5: Sinteza 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzojeve kiseline (Jedinjenje IV)

[0153] Vitride<®>(natrijum bis(2-metoksietoksi)aluminijum hidrid [ili NaAlH2(OCH2CH2OCH3)2], 65 % težine rastvora u toluenu) je kupljen od Aldrich Chemicals.2,2-Difluoro-1,3-benzodioksol-5-karboksilna kiselina je kupljena od Saltigo-a (filijala kompanije Lanxess Corporation).

Korak 1: (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-metanol

[0154]

[0155] Komercijalno dostupna 2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-karboksilna kiselina (1,0 ekv.) je razmuć ena u toluenu (10 vol). Vitride® (2 ekv.) je dodat preko levka za dodavanje brzinom koja održava temperaturu na 15-25 °C. Na kraju dodavanja, temperatura je poveć ana na 40 °C tokom 2 sata (h), zatim je pažljivo dodato 10% (tež/tež) vodenog NaOH (4,0 ek) preko levka za dodavanje, održavajuć i temperaturu na 40-50 °C. Posle mešanja dodatnih 30 minuta (min), slojevi su ostavljeni da se razdvoje na 40 °C. Organska faza je ohlađena na 20 °C, zatim isprana vodom (2 x 1,5 vol), osušena (Na2SO4), filtrirana i koncentrovana da bi se dobio sirovi (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-metanol koji je direktno korišć en u slede ć em koraku.

Korak 2: 5-hlorometil-2,2-difluoro-1,3-benzodioksol

[0156]

[0157] (2,2-Difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-metanol (1,0 ekv.) je rastvoren u MTBE (5 vol). Dodata je katalitička količina 4-(N,N-dimetil)aminopiridina (DMAP) (1 mol %) i dodat je SOCl2(1.2 ekv.) preko levka za dodavanje. SOCl2je dodat brzinom da se održava temperatura u reaktoru na 15-25 °C. Temperatura je poveć ana na 30 °C tokom 1 h, a zatim je ohlađena na 20 °C. Voda (4 zapremine) je dodata preko levka za dodavanje uz održavanje temperature na nižoj od 30 °C. Posle mešanja dodatnih 30 min, slojevi su ostavljeni da se razdvoje. Organski sloj je mešan i dodat je 10 % (tež/tež) vodeni NaOH (4.4 zap). Posle mešanja od 15 do 20 min, slojevi su ostavljeni da se razdvoje. Organska faza je zatim osušena (Na2S04), filtrirana i koncentrovana da bi se dobio sirovi 5-hlorometil-2,2-difluoro-1,3-benzodioksol koji je direktno korišć en u slede ć em koraku.

Korak 3: (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-acetonitril

[0158]

[0159] Rastvor 5-hlorometil-2,2-difluoro-1,3-benzodioksola (1 ekvivalent) u DMSO (1,25 vol.) dodat je u suspenziju NaCN (1,4 ekvivalenta) u DMSO (3 vol.), uz održavanje temperature između 30-40 °C. Smeša je mešana 1 sat, a zatim je dodata voda (6 vol.), a zatim metil tert-butil etar (MTBE) (4 vol.). Nakon mešanja tokom 30 minuta, slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa MTBE (1,8 vol.). Kombinovani organski slojevi su isprani vodom (1,8 vol.), osušeni (Na2SO4), filtrirani i koncentrovani da bi se dobio sirovi (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-acetonitril (95%) koji je direktno koriš ć en u slede ć em koraku.<1>H NMR (500 MHz, DMSO) δ 7,44 (br s, 1H), 7,43 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,22 (dd, J = 8,2, 1,8 Hz, 1H), 4,07 (s, 2H).

Korak 3b: Alternativna sinteza (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-1-etilacetat-acetonitrila

[0160]

[0161] Reaktor je produvan azotom, a zatim napunjen toluenom (900 ml). Rastvor je degasiran produvavanjem azotom tokom ne manje od 16 sati. U reaktor je zatim dodat Na3PO4(155,7 g, 949,5 mmol), a zatim bis(dibenzilidenaceton)paladijum (0) (7,28 g, 12,66 mmol). Rastvor terc-butilfosfina u heksanima (51,23 g, 25,32 mmol) koncentracije od 10% tež/tež je dodavan tokom 10 minuta na 23 °C iz levka za dodavanje produvanog azotom. Smeša je ostavljena da se meša 50 minuta, nakon čega je dodat 5-bromo-2,2-difluoro-1,3-benzodioksol (75 g, 316,5 mmol) tokom 1 minuta. Nakon mešanja tokom dodatnih 50 minuta, smeši je dodat etil cijanoacetat (71,6 g, 633,0 mmol) tokom 5 minuta, a zatim je dodata voda (4,5 ml) u jednoj porciji. Smeša je zagrejana na 70 °C tokom 40 minuta i analizirana HPLC-om svakih 1 do 2 sata na procenat konverzije reaktanta u proizvod. Nakon što je primeć ena potpuna konverzija (obično 100% konverzija posle 5 do 8 sati), smeša je ohlađena na 20 do 25 °C i filtrirana kroz celitni jastučić . Celitni jastuči ć je ispran toluenom (2 × 450 ml), a spojeni organski delovi su koncentrovani na 300 ml pod vakuumom na 60 do 65 °C. U koncentrat je dodat DMSO (225 ml) i koncentrovan pod vakuumom na 70 do 80 °C dok aktivna destilacija rastvarača nije prestala. Rastvor je ohlađen na 20 do 25 °C i razblažen do 900 mL sa DMSO u pripremi za korak 3c.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,16 - 7,10 (m, 2H), 7,03 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,63 (s, 1H), 4,19 (m, 2H), 1,23 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

Korak 3c: Alternativna sinteza (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-acetonitrila

[0162]

[0163] DMSO rastvor (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-1-etilacetat-acetonitrila odozgo je napunjen sa 3N HCl (617,3 mL, 1,85 mol) tokom 20 minuta uz održavanje unutrašnje temperature manja od 40 °C. Smeša je zatim zagrevana do 75 °C tokom 1 sata i analizirana HPLC svakih 1 do 2 sata za procentualno konverziju. Kada je uočena konverzija već a od 99 % (obično nakon 5 do 6 sati), reakcija je ohlađena na 20 do 25 °C i ekstrahovana sa MTBE (2 x 525 mL), sa dovoljno vremena da se omoguć i potpuno odvajanje faza tokom ekstrakcije. Kombinovani organski ekstrakti su isprani sa 5% NaCl (2 x 375 mL). Rastvor je zatim prebačen u opremu prikladnu za vakuum destilaciju od 1,5 do 2,5 TORR koja je opremljena ohlađenom bocom za prijemnik. Rastvor je koncentrovan pod vakuumom na manje od 60 °C da bi se uklonili rastvarači. (2,2-Difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-acetonitril je zatim destilovan iz dobijenog ulja na 125 do 130 °C (temperatura peć nice) i 1,5 do 2,0 TORR. (2,2-Difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-acetonitril je izolovan kao bistro ulje sa 66% prinosa iz 5-bromo-2,2-difluoro-1,3-benzodioksola (2 koraka) i sa HPLC čistoć om od 91,5 % AUC (odgovara tež/tež testu od 95%).<1>H NMR (500 MHz, DMSO) δ 7,44 (br s, IH), 7,43 (d, J = 8,4 Hz, IH), 7,22 (dd, J = 8,2, 1,8 Hz, 1H), 4,07 (s, 2H).

Korak 4: (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonitril

[0164]

[0165] Smeša (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-acetonitrila (1,0 ekv.), 50 % težine vodenog KOH (5,0 ekv.) 1-bromo-2-hloroetana (1,5 ekv.) i Oct4NBr (0,02 ekv.) je zagrevana na 70 °C tokom 1 h. Reakciona smeša je ohlađena, zatim obrađena sa MTBE i vodom. Organska faza je isprana vodom i slanim rastvorom. Rastvarač je uklonjen da bi se dobio (2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonitril.<1>H NMR (500 MHz, DMSO) δ 7,43 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,30 (dd, J = 8,4, 1,9 Hz, 1H), 1,75 (m , 2H), 1,53 (m, 2H).

Korak 5: 1-(2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonska kiselina

[0166]

[0167] (2,2-Difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonitril je hidrolizovan korišć enjem 6 M NaOH (8 ekviv.) u etanolu (5 vol) na 80 °C preko noć i. Smeša je ohlađena do sobne temperature i etanol je uparen pod vakumom. Ostatak je rastvoren u vodi i MTBE, dodat je 1 M HCl i slojevi su razdvojeni. MTBE sloj je zatim tretiran sa dicikloheksilaminom (DCHA) (0,97 ekviv.). Suspenzija je ohlađena na 0 °C, filtrirana i isprana heptanom da bi se dobila odgovarajuć a DCHA so. So je stavljena u MTBE i 10 % limunske kiseline i mešana dok se sve čvrste materije ne rastvore. Slojevi su razdvojeni i MTBE sloj je ispran vodom i slanim rastvorom. Zamena rastvarača u heptanu, a zatim filtracija dala je 1-(2,2-difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarboksilnu kiselinu nakon sušenja u vakum peć nici na 50 °C preko no ć i. ESI-MS m/z izrač. 242,04, nađeno 241,58 (M+1)+;<1>HNMR (500 MHz, DMSO) δ 12,40 (s, 1H), 7,40 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,30 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 8,3, 1,7 Hz, 1H), 1,46 (m, 2H), 1,17 (m, 2H).

Korak 6: 1-(2,2-Difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonil hlorid

[0168]

[0169] 1-(2,2-Difluoro-1,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarboksilna kiselina (1,2 ekv.) je razmuć ena u toluenu (2,5 vol) i smeša je zagrejana do 60 °C. SOCl2(1.4 ek) je dodat preko levka za dodavanje. Toluen i SOCl2su destilovani iz reakcione smeše posle 30 minuta. Dodato je još toluena (2,5 vol) i dobijena smeša je ponovo destilisana, ostavljajuć i kao proizvod kiseli hlorid kao ulje, koje je korišć eno bez daljeg prečiš ć avanja.

Korak 7: terc-butil-3-(3-metilpiridin-2-il)benzoat

[0170]

[0171] 2-Bromo-3-metilpiridin (1.0 ekv.) je rastvoren u toluenu (12 vol). Dodan je K2CO3(4,8 ekv.), a zatim voda (3,5 vol). Dobijena smeša je zagrevana do 65 °C pod strujom N2tokom 1 sata. Zatim su dodati 3-(t-butoksikarbonil)fenilborna kiselina (1,05 ekv.) i Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(0,015 ekv.) i smeša je zagrejana do 80 °C. Posle 2 sata, grejanje je isključeno, dodata je voda (3,5 vol) i ostavljeni su slojevi da se razdvoje. Organska faza je zatim isprana vodom (3.5 vol) i ekstrahovana sa 10 % vodenim rastvorom metansulfonske kiseline (2 ek MsOH, 7.7 vol). Vodena faza je razvodnjena sa 50% vodenim rastvorom NaOH (2 ekv.) i ekstrahovana sa EtOAc (8 vol). Organski sloj je koncentrovan da bi se dobio sirovi terc-butil-3-(3-metilpiridin-2-il)benzoat (82%) koji je direktno korišć en u slede ć em koraku.

Korak 8: 2-(3-(terc-butoksikarbonil)fenil)-3-metilpiridin-1-oksid

[0172]

[0173] terc-butil-3-(3-metilpiridin-2-il)benzoat (1.0 ekv.) je rastvoren u EtOAc (6 vol). Dodata je voda (0.3 vol), a zatim urea-vodonik peroksid (3 ekv.). Ftalni anhidrid (3 ekv.) je zatim dodat u porcijama u smešu kao čvrsta supstanca brzinom koja održava temperaturu u reaktoru ispod 45 °C. Nakon završetka dodavanja ftalnog anhidrida, smeša je zagrejana do 45 °C. Posle mešanja još 4 sata, toplota je isključena.10% tež/tež vodeni Na2S03(1.5 ek) je dodat preko levka za dodavanje. Po završetku dodavanja Na2S03, smeša je mešana dodatnih 30 min i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je mešan i 10 % tež/tež u vodi. Dodan je Na2CO3(2 ekv.). Posle mešanja tokom 30 minuta, slojevi su ostavljeni da se razdvoje. Organska faza je isprana 13% tež/tež vodenim NaCl. Organska faza je zatim filtrirana i koncentrovana da bi se dobio sirovi 2-(3-(terc-butoksikarbonil)fenil)-3-metilpiridin-1-oksid (95%) koji je direktno korišć en u slede ć em koraku.

Korak 9: terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il)benzoat

[0173]

[0174] Rastvor 2-(3-(terc-butoksikarbonil)fenil)-3-metilpiridin-1-oksida (1 ekv.) i piridina (4 ekv.) u acetonitrilu (8 vol) je zagrejan do 70 °C. Rastvor anhidrida metansulfonske kiseline (1,5 ekv.) u MeCN (2 vol) je dodat tokom 50 min preko levka za dodavanje uz održavanje temperature na nižoj od 75 °C. Smeša je mešana dodatnih 0,5 sati nakon završetka dodavanja. Smeša je zatim ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu. Etanolamin (10 ekv.) je dodat preko levka za dodavanje. Posle mešanja tokom 2 sata, dodata je voda (6 zapremina) i smeša je ohlađena na 10 °C. Posle mešanja tokom 3 sata, čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana vodom (3 zapremine), 2:1 acetonitril/voda (3 zapremine) i acetonitrilom (2 3 1,5 zapremina). Čvrsta supstanca je osušena do konstantne težine (<1% razlika) u vakumskoj peć i na 50 °C sa blagim ispuštanjem N2da bi se dobio terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il)benzoat kao crveno-žuta čvrsta supstanca (prinos 53 %).

Korak 10: 3-(6-(1-(2,2-Difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)-ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-t-butilbenzoat

[0175]

[0176] Sirovi kiseli hlorid opisan gore je rastvoren u toluenu (2,5 vol na osnovu kiselog hlorida) i dodat preko levka za dodavanje u smešu terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il)benzoata (1 ekv.), DMAP, (0,02 ekv.) i trietilamin (3,0 ekv.) u toluenu (4 zapremine na bazi terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il)benzoata). Posle 2 sata, u reakcionu smešu je dodata voda (4 zapremine na bazi terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il)benzoata). Posle mešanja tokom 30 minuta, slojevi su razdvojeni. Organska faza je zatim filtrirana i koncentrovana da bi se dobilo gusto ulje 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-t-butilbenzoat (kvantitativni sirovi prinos). Dodat je acetonitril (3 zapremine na osnovu sirovog proizvoda) i destilovan dok ne dođe do kristalizacije. Dodata je voda (2 zapremine na osnovu sirovog proizvoda) i smeša je mešana 2 h. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana sa 1:1 (po zapremini) acetonitril/voda (2 x 1 zapremine na osnovu sirovog proizvoda), i delimično osušena na filteru pod vakumom. Čvrsta supstanca je osušena do konstantne težine (<1% razlika) u vakum peć nici na 60°C sa blagim ispuštanjem N2da bi se dobio 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3)]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-t-butil-benzoat kao smeđa čvrsta supstanca.

Korak 11: 3-(6-(1-(2,2-Difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeva kiselina • HCl so

[0177]

[0178] U smešu 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-tbutilbenzoata (1.0 ekv.) u MeCN (3.0 zapremine) dodata je voda (0.83 zapremina), a zatim koncentrovani vodeni rastvor HCl (0.83 vol). Smeša je zagrejana do 45 ± 5 °C. Posle mešanja od 24 do 48 h, reakcija je završena i smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature. Dodata je voda (1,33 zapremine) i smeša je mešana. Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana vodom (2 x 0,3 zapremine) i delimično osušena na filteru pod vakumom. Čvrsta supstanca je osušena do konstantne težine (<1% razlika) u vakum peć nici na 60 °C sa blagim ispuštanjem N2da bi se dobio 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3)]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeva kiselina • HCl kao prljavo bela čvrsta supstanca.

Tabela 7: Fizički podaci za Jedinjenje IV

Primer 6. Priprema tablete koja sadrži 5 mg Jedinjenja I

[0179] Mikrokristalna celuloza je propuštena kroz sito od nerđajuć eg čelika (30 mesh) i 210,1 g je stavljeno u 10L Bohle posudu. Jedinjenje I se propušta kroz sito od nerđajuć eg čelika (30 mesh) i 210,0 g se puni u 10L Bohle posudu. Kanta je zapečać ena i komponente su mešane 2 min pri brzini od 32 RPM da bi se dobila mešavina mikrokristalne celuloze/Jedinjenja I. Mešavina mikrokristalne celuloze/Jedinjenja I se ispušta u posudu od nerđajuć eg čelika. Slede ć i materijali se prosejaju kroz sito od nerđajuć eg čelika od 30 mesh i dodaju u kantu Bohle od 10 L ovim redosledom: laktoza (približno polovina od 1022,2 g), mikrokristalna celuloza (približno polovina od 812 g), mikrokristalna celuloza/jedinjenje mešavina, polivinilpirolidon/vinil acetat (210,1 g), kroskarmeloza natrijum (133 g), mikrokristalna celuloza (preostala polovina od količine od 812 g) i laktoza (preostala polovina od količine od 1022,2 g). Posuda je zapečać ena i komponente se mešaju 18,5 min pri brzini od 32 o/min. Natrijum stearil fumarat pruv<®>se propušta kroz 60 mesh nerđajuć i čelik i 53,1 g se sipa u Bohle posudu. Posuda je zapeča ć ena i komponente se mešaju 4 min pri brzini od 32 RPM. Kanta se testira na homogenost. Mešavina se dodaje u Piccola tablet presu i komprimuje u tablete težine 67,0 mg.

Tabela 8: Kompozicija tablete Jedinjenja I

Primer 7. Ispitivanje bioaktivnosti

Rastvori

[0180] Bazni medijum (ADF+++) se sastojao od Advanced DMEM/Ham’s F12, 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 1 µ/ml penicilina/streptomicina.

[0181] Intestinalni enteroidni medijum za održavanje (IEMM) se sastojao od ADF+++, 1 X dodatka B27, suplementa 13 N2, 1,25 mM N-acetil cisteina, 10 mM nikotinamida, 50 ng/mL hEGF, 10 nM gastrina, 10 nM gastrina, 1 µg/hR -1, 100 ng/mL hNoggin, TGF-b tip 1 inhibitor A-83-01, 100 µg/mL Primocin, 10 µM P38 MAPK inhibitor SB202190.

[0182] Pufer za pranje 1 se sastojao od 1 mM MgCl2, 160 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glukoze, 2 mM CaCl2.

[0183] Pufer bez hlorida se sastojao od 1 mM magnezijum glukonata, 2 mM kalcijum glukonata, 4,5 mM kalijuma Glukonata, 160 mM natrijum glukonata, 10 mM HEPES, 10 mM glukoza.

[0184] Rastvor boje kupke 1 se sastojao od Pufera za pranje 1, 0,04 % Pluronic F127, 20 mM metil oksonola, 30 mM CaCCinh-A01, 30 µM Čikago nebo plavog.

[0185] Rastvor boje bez hlorida se sastojao od pufera bez hlorida, 0,04% pluronik F127, 20 µM metil oksonola, 30 µM CaCCinh-A01, 30 µM čikago nebo plavog.

[0186] Rastvor za stimulaciju boje bez hlorida sastojao se od rastvora boje bez hlorida, 10 µM forskolina, 100 µM IBMX i 300 nM Jedinjenja III.

Ć elijska kultura

[0187] Epitelne enteroidne ć elije ljudskog creva su dobijene od Hubreht instituta za razvojnu biologiju i istraživanje matičnih ć elija, Utreht, Holandija i proširene u T-bočice kao što je prethodno opisano (Dekkers JF, Wiegerinck CL, de Jonge HR, Bronsveld I, Janssens HM, de Winter-de Groot KM, Brandsma AM, de Jong NWM, Bijvelds MJC, Scholte BJ, Nieuvenhuis EES, van den Brink S, Clevers H, van der Ent CK, Middendorp S i M Beekman JM. Funkcionalni CFTR test koji koristi primarne cistične fibroze intestinalni organoidi Nat Med.2013 Jul;19(7):939-45.

Sakupljanje i sejanje enteroidnih ć elija

[0188] Ć elije su dobijene u rastvoru za obnavljanje ć elija, sakupljene centrifugiranjem na 650 rpm tokom 5 min na 4°C, resuspendovane u TriPLE i inkubirane 5 min na 37°C. Ć elije su zatim sakupljene centrifugiranjem na 650 rpm tokom 5 minuta na 4°C i resuspendovane u IEMM koji sadrži 10 µM inhibitor ROCK (RI). Suspenzija ć elija je propuštena kroz cediljku od 40 µm i resuspendovana na 1x106 ć elija/mL u IEMM koji sadrži 10 µM RI. Ć elije su zasejane na 5000 ć elija/bunari ć u u ploče sa više rupica i inkubirane preko no ć i na 37°C, 95% vlažnosti i 5% CO2pre analize.

Ispitivanje membranskog potencijala boje

[0189] Enteroidne ć elije su inkubirane sa test jedinjenjem u IEMM 18-24 sata na 37°C, 95% vlažnosti i 5% CO2. Posle inkubacije jedinjenja, korišć en je test bojenja membranskog potencijala koriš ć enjem FLIPR Tetra za direktno merenje snage i efikasnosti test jedinjenja na transport hlorida posredovanog CFTR-om nakon akutnog dodavanja 10 µM forskolina i 300 nM Jedinjenja III. Ukratko, ć elije su isprane 5 puta u puferu za posudu 1. Dodan je rastvor boje za posudu 1 i ć elije su inkubirane 25 minuta na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije boje, ć elije su isprane 3 puta u rastvoru boje bez hlorida. Transport hlorida je pokrenut dodavanjem rastvora za stimulaciju boje bez hlorida i fluorescentni signal je očitan 15 min. CFTR-posredovani transport hlorida za svako stanje je određen iz AUC fluorescentnog odgovora na akutni forskolin i 300 nM stimulacije Jedinjenja III. Transport hlorida je zatim izražen kao procenat transporta hlorida posle tretmana sa 3 µM Jedinjenja I, 3 mM Jedinjenja II i 300 nM akutne kontrole trostruke kombinacije Jedinjenja III (% aktivnosti).

[0190] Sledeć e predstavlja podatke u Tabeli 9:

Maksimalna aktivnost: ++ je >60%; + je 30-60%; je <30%. EC50: ++ je <1 µM; + je 1-3 µM; je >3 µM; a ND „nije utvrđeno“.

Tabela 9: Podaci testa za Jedinjenje I

Primer 8.

Jedinjenje I poveć ava transport hlorida samostalno i u kombinaciji sa Jedinjenjem II i/ili Jedinjenjem III u F508del/F508del HBE i F508del/MF HBE

[0191] Sprovedene su studije pomoć u komore za merenje transporta hlorida posredovanog F508del CFTR u HBE ć elijama dobijenim od 3 F508del homozigotna donora i 5 F508del/MF donora (G542X, 3 donora; E585X, 1 donor; 3905InsT). Kao pozitivna kontrola, maksimalno efikasne koncentracije N-(benzensulfonil)-6-[3-[2-[1-(trifluorometil)ciklopropil]etoksi]pirazol-1-il]-2-[(4S)-2,2,4-trimetilpirolidin-1-il]piridin-3-karboksamid (videti WO 2018/064632) i N-[(6-amino-2-piridil)sulfonil]-6-(3-fluoro-5-izobutoksi- fenil)-2-[(4S)-2,2,4-trimetilpirolidin-1-il]piridin-3-karboksamid (videti WO 2016/057572) u kombinaciji sa Jedinjenjem II/Jedinjenjem III uključeni su u svaki eksperiment.

[0192] U ovim CFć elijskim linijama, CFTR-posredovani transport hlorida bio je nizak u odsustvu CFTR modulatora, što je u skladu sa malim ili bez CFTR-a na površini ć elije. Tretman samo sa Jedinjenjem I tokom 16 do 24 sata je prouzrokovao skromno poveć anje transporta hlorida u F508del/F508del HBE i F508del/MF HBE ć elijama. Kombinacija Jedinjenja I i Jedinjenja II dodatno je pove ć ala transport hlorida u poređenju sa samim Jedinjenjem I i bila je slična Jedinjenju II/Jedinjenju III. Dodatak Jedinjenja III snažno potencira transport hlorida u prisustvu Jedinjenja I ili u kombinaciji sa Jedinjenjem I/Jedinjenjem II. Sinergijske analize su pokazale da je efekat Jedinjenja I bio visoko sinergistički sa fiksnom koncentracijom Jedinjenja III ili Jedinjenja II/Jedinjenja III i bio je umereno sinergistički sa fiksnom kombinacijom Jedinjenja II. U ve ć ini koncentracija Jedinjenja I, Jedinjenje I/Jedinjenje II/Jedinjenje III pove ć ava transport hlorida više nego Jedinjenje I/Jedinjenje II ili Jedinjenje I/Jedinjenje III. Međutim, efikasnost Jedinjenja I/Jedinjenja III i Jedinjenja I/Jedinjenja II/Jedinjenja III bila je slična na njihovim odgovarajuć im EC90 vrednostima. Odgovarajuć e vrednosti EC90 pod uslovima koji maksimalno aktiviraju CFTR za Jedinjenje I/Jedinjenje III i Jedinjenje I/Jedinjenje II/Jedinjenje III bile su 0,848 µM i 0,152 µM u F508del/F508del HBE i 1,15 µM i 0,122 µM/del u F5BE.

[0193] Posle jednokratne oralne primene Jedinjenja I kod muških životinja, vrednosti tmaxJedinjenja I bile su 9 sati kod pacova, 4 sata kod pasa i 3 sata kod majmuna. Srednja oralna bioraspoloživost (F) bila je niska do umerena kod pacova (76,9%), pasa (49,7%) i majmuna (12,9%).

Farmakokinetički parametri Jedinjenja I nakon jedne oralne primene Jedinjenja I kod mužjaka pacova, pasa i majmuna

[0194]

[0195] Kako se doza poveć avala, sistemska izloženost Jedinjenju I porasla je na način koji je više nego proporcionalan dozi kod pacova i pasa. Izloženost normalizovana dozom bila je već a kod ženkih pacova nego kod mužjaka pacova. Kod pasa, sistemska izloženost Jedinjenju I bila je slična kod oba pola. Posle ponovljenog oralnog davanja Jedinjenja I tokom 28 dana kod pacova i pasa, prime ć ena je akumulacija izloženosti Jedinjenju I. Sistemska izloženost Jedinjenju I 28. dana bila je već a nego 1. dana (odnos AUC0-24h28. dana/1. dana kretao se od 1,63 do 2,70 kod mužjaka pacova, 5,01 do 8,26 kod ženki pacova, 1,73 do 2,64 kod mužjaka pasa i 1.2.23 kod ženskih pasa).

Primer 9. Studija bezbednosti i efikasnosti Jedinjenja I

[0196] Bezbednosna analiza tekuć e kliničke studije je izvršena za 37 subjekata u kohorti A1 do A5, 33 subjekta u kohorti B i 17 subjekata u kohorti C, koji su bili izloženi najmanje 1 dozi ispitivanog leka (Jedinjenje I ili placebo) kao monoterapija i kao deo trostruke kombinacije sa Jedinjenjem II ili Jedinjenjem III. Jedinjenje I je generalno bilo bezbedno i dobro se podnosilo do doze od 60 mg qd u monoterapiji i 20 mg qd u trostrukoj kombinaciji sa Jedinjenjem II i Jedinjenjem III.

Planirane studije efikasnosti

[0197] Ovo je studija faze 2, od 3 dela, randomizovana, dvostruko slepa, placebo i TEZ/IVA kontrolisana, radi dokazivanja koncepta Jedinjenja I. Delovi studije mogu se sprovoditi paralelno ili sekvencijalno. Randomizacijać e biti stratifikovana prema ppFEV1.

Deo 1: Subjekti sa genotipovima F508del/MF

[0198] Deo 1 ocenjuje Jedinjenje I u trostrukoj kombinaciji sa Jedinjenjem II i Jedinjenjem III-d kao što je prikazano u tabeli ispod.

[0199] Period ispiranja (18 ± 3 dana) je uključen da bi se omogu ć ila detaljnija procena odnosa izlaganja Jedinjenju I i odgovoru sprovođenjem PK i PD procena tokom ispiranja Jedinjenja I.

Planirane doze

[0200]

• Planirane doze Jedinjenja I od 5 mg, 10 mg i 20 mg qd mogu se prilagoditi na osnovu podataka koji se pojavljuju.

• Doza Jedinjenja II bi ć e 100 mg qd (jednom dnevno) i Jedinjenja III-dć e biti 150 mg qd.

Deo 2 (opciono): Subjekti sa genotipom F508del/ F508del

[0201] Od svih subjekata se zahteva da završe period uvođenja Jedinjenja II/Jedinjenja III da bi se uspostavila pouzdana početna linija na tretmanu (Jed II/Jed III). Period ispiranja od 4 nedelje je uključen da bi se procenio efekat na PD i krajnje tačke efikasnosti pošto subjekti prelaze sa trostruke kombinacije na Jed II/Jed III, nakon ispiranja Jedinjenja I.

Planirane doze

[0202]

• Deo 2 ć e proceniti istu dozu Jedinjenja I (20 mg qd) korišć enu u delu 1. Ova doza se može prilagoditi naniže na osnovu novih podataka iz dela D studije 001.

• Doza Jedinjenja II bi ć e 100 mg qd i Jedinjenja III-dć e biti 150 mg qd.

• Doza Jedinjenja II/Jedinjenja III bi ć e Jedinjenje II 100 mg qd/Jedinjenje III 150 mg na svakih 12 sati (q12h)

Deo 3 (opciono): Subjekti sa F508del/MF genotipovima

[0203] Period ispiranja (18 ± 3 dana) je uključen da bi se omogu ć ila detaljnija procena odnosa izloženosti Jedinjenju I odgovora sprovođenjem PK i PD procena tokom ispiranja Jedinjenja I.

Planirane doze

[0204]

• Deo 3 ć e proceniti istu dozu Jedinjenja I (20 mg qd) korišć enu u delu 1. Ova doza se može prilagoditi na osnovu podataka koji se pojavljuju.

• Doza Jedinjenja II/Jedinjenja III bi ć e Jedinjenje II 100 mg qd/Jedinjenje III 150 mg svakih 12 sati (q12h)

Ostala ostvarenja

[0205] Prethodna diskusija otkriva i opisuje samo primere izvođenja ovog pronalaska. Stručnjak u ovoj oblasti lako ć e prepoznati iz takve diskusije i iz prateć ih crteža i zahteva da se mogu napraviti razne promene, modifikacije i varijacije. Obim pronalaska je definisan u sledeć im patentnim zahtevima.

Claims (29)

1. Patentni zahtevi 1. Najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u metodi lečenja cistične fibroze pri čemu metoda obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno: (A) 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli dnevno; i (B) najmanje jednog jedinjenja izabranog od: (i) Jedinjenja II:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (ii) (a) Jedinjenja III:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli ili (b) Jedinjenja III-d:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli.
2. 2. Najmanje jedno jedinjenje izabrano od (i) i (ii): (i) Jedinjenja II:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (ii) (a) Jedinjenja III:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli ili (b) Jedinjenja III-d:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u postupku lečenja cistične fibroze pri čemu metoda obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno: (A) 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli dnevno; i (B) najmanje jedno jedinjenje izabrano između: (i) Jedinjenja II:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (ii) (a) Jedinjenja III:

   i njihove farmaceutski prihvatljive soli ili (b) Jedinjenje III-d:

   i njihove farmaceutski prihvatljive soli.
3. 3. Najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i najmanje jedno jedinjenje izabrano između (i) i (ii): (i) Jedinjenja II:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (ii) (a) Jedinjenja III:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli ili (b) Jedinjenja III-d:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u postupku lečenja cistične fibroze pri čemu metoda obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno: (A) 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I:

   i njihove farmaceutski prihvatljive soli dnevno; i (B) najmanje jedno jedinjenje izabrano od: (i) Jedinjenja II:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (ii) (a) Jedinjenja III:

   i njihove farmaceutski prihvatljive soli ili (b) Jedinjenja III-d:

   i njegove farmaceutski prihvatljive soli.
4. 4. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-3, pri čemu obuhvata davanje navedenom pacijentu: (A) (a) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; (b) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; i (c) najmanje jednog jedinjenja izabranog od (i) Jedinjenja III i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, ili (ii) Jedinjenja III-d i njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (B) (a) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; (b) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; i (c) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja III i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; ili (C) (a) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; (b) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; i (c) najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli.
5. 5. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-3, pri čemu: (a) najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u jednoj kompoziciji sa najmanje jednim jedinjenjem izabranim od Jedinjenja II, Jedinjenja III, Jedinjenja III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; ili (b) najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II, Jedinjenja III, Jedinjenja III-d i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, daju se u jednoj ili više odvojenih kompozicije; ili (c) prva farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli se primenjuje u kombinaciji sa drugom farmaceutskom kompozicijom koja sadrži najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II, Jedinjenja III, Jedinjenja III-d, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.
6. 6. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-3, pri čemu se prva farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli primenjuje u kombinaciji sa: (i) drugom farmaceutskom kompozicijom koja sadrži (a) najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja II i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli; i (b) najmanje jednim jedinjenjem izabranim između Jedinjenja III, Jedinjenja III-d i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli; ili (ii) drugom farmaceutskom kompozicijom koja sadrži Jedinjenje II i Jedinjenje III-d.
7. 7. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-3, obuhvatajući primenu jedne kompozicije koja sadrži Jedinjenje I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, Jedinjenje II i Jedinjenje III-d.
8. 8. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-7, pri čemu se dnevno daje 5 mg, 10 mg ili 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli.
9. 9. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu se daje Jedinjenje I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so: (a) kao pojedinačna doza, jednom dnevno; ili (b) u dve doze dnevno.
10. 10. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-8, pri čemu se 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli primenjuje u jednoj do četiri doze dnevno.
11. 11. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-10, pri čemu se 50 mg do 150 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli daje dnevno, opciono pri čemu se 50 mg po dozi Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli daje jednom dnevno ili dva puta dnevno.
12. 12. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-10, pri čemu se 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli primenjuje dnevno.
13. 13. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu: (a) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje kao pojedinačna doza, jednom dnevno; ili (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje u dve doze dnevno.
14. 14. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-12, pri čemu: (a) 150 mg do 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje dnevno; ili (b) 50 mg do 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje dnevno.
15. 15. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu: (a) 150 mg do 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje dnevno; ili (b) 50 mg do 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje dnevno.
16. 16. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu: (i) (a) 150 mg Jedinjenja III ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje dva puta dnevno; ili (b) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje dnevno; ili (ii) dnevna količina od 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje u jednoj, dve ili tri doze dnevno; ili (iii) dnevna količina od 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentna količina njegove farmaceutski prihvatljive soli se daje u jednoj, dve, tri ili četiri doze.
17. 17. Najmanje jedno jedinjenje izabrano od: (A) Jedinjenja I i njegove farmaceutski prihvatljive soli, (B) Jedinjenja II i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (C) Jedinjenje III i njegove farmaceutski prihvatljive soli ili Jedinjenje III-d i njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (A), (B) i (C), za upotrebu u metodu lečenja cistične fibroze pri čemu metod obuhvata svakodnevno davanje pacijentu kome je to potrebno: (a) 5 mg do 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 50 mg do 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) (i) 150 mg do 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (ii) 50 mg do 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli.
18. 18. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu metod obuhvata davanje: (A) (a) 5 mg, 10 mg ili 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) (i) 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (ii) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (B) (a) 5 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (C) (a) 10 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (D) (a) 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (E) (a) 5 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (F) (a) 10 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (G) (a) 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli.
19. 19. Najmanje jedno jedinjenje izabrano od: (A) Jedinjenja I i njegove farmaceutski prihvatljive soli, (B) Jedinjenja II i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (C) Jedinjenja III i njegove farmaceutski prihvatljive soli ili Jedinjenja III-d i njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (A), (B) i (C), za upotrebu u metodu lečenja cistične fibroze pri čemu metod obuhvata svakodnevno davanje pacijentu kome je to potrebno: (a) prve farmaceutske kompozicije koja sadrži 5 mg do 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) druge farmaceutske kompozicije dnevno koja sadrži (i) 50 do 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (ii) ili (1) 150 mg do 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli ili (2) 50 mg do 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli.
20. 20. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, pri čemu postupak obuhvata: (A) (a) svakodnevno davanje pacijentu kome je to potrebno prve farmaceutske kompozicije koja sadrži 5 mg, 10 mg ili 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) dnevno davanje pacijentu druge farmaceutske kompozicije koja sadrži (i) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (ii) 150 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (c) dnevno davanje pacijentu tre ć e farmaceutske kompozicije koja sadrži 150 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (B) (a) prvu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 5 mg, 10 mg ili 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentnu količinu njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) drugu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži (i) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentnu količinu njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (ii) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentnu količinu njegove farmaceutski prihvatljive soli.
21. 21. Najmanje jedno jedinjenje izabrano od: (i) Jedinjenja I i njegove farmaceutski prihvatljive soli, (ii) Jedinjenja II i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (iii) Jedinjenja III i njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (i), (ii) i (iii), za upotrebu u metodu lečenja cistične fibroze pri čemu postupak obuhvata svakodnevno davanje pacijentu kome je to potrebno prve farmaceutske kompozicije koja sadrži (a) 5 mg do 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli, (b) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli i (c) 150 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i naknadno dnevno davanje pacijentu druge farmaceutske kompozicije koja sadrži 150 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli.
22. 22. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-21, pri čemu je pacijent: (a) heterozigot za F508del CFTR mutaciju; ili (b) homozigot za F508del CFTR mutaciju.
23. 23. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-22, pri čemu metod obuhvata primenu farmaceutski prihvatljive soli Jedinjenja I, opciono pri čemu postupak obuhvata primenu Jedinjenja II.
24. 24. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu po bilo kojem od patentnih zahteva 1-6 i 8-21, pri čemu metod obuhvata primenu Jedinjenja III.
25. 25. Jedinjenje ili jedinjenja za upotrebu po bilo kojem od patentnih zahteva 1-6 i 8-20, pri čemu metod obuhvata primenu Jedinjenja III-d.
26. 26. Farmaceutska kompozicija koja sadrži 5 mg do 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentnu količinu njegove farmaceutski prihvatljive soli, i opciono koja sadrži jedan ili više dodatnih sredstava za modulaciju CFTR.
27. 27. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 26 koja dalje sadrži: (A) (a) 50 do 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) (i) 150 mg do 300 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli ili (ii) 50 mg do 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (B) (a) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) (i) 150 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili (ii) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (C) (a) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) 150 mg Jedinjenja III ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; ili (D) (a) 100 mg Jedinjenja II ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli; i (b) 150 mg Jedinjenja III-d ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli.
28. 28. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 26 ili 27, pri čemu kompozicija sadrži 5 mg, 10 mg ili 20 mg Jedinjenja I ili ekvivalentne količine njegove farmaceutski prihvatljive soli.
29. 29. Proizvodi koji sadrže: (A) najmanje jedno jedinjenje izabrano od Jedinjenja I:

    i njihove farmaceutski prihvatljive soli, i (B) najmanje jedno jedinjenje izabrano između (i) i (ii): (i) Jedinjenje II:

    i njegove farmaceutski prihvatljive soli, i (ii) (a) Jedinjenje III:

    i njegove farmaceutski prihvatljive soli ili (b) Jedinjenje III-d:

    i njegove farmaceutski prihvatljive soli, kao kombinovani proizvod za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu u metodu lečenja cistične fibroze pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno: (A) 5 mg do 20 mg najmanje jednog jedinjenja izabranog od Jedinjenja I:

    i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli dnevno; i (B) najmanje jedno jedinjenje izabrano između: (i) Jedinjenja II:

    i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i (ii) (a) Jedinjenja III:

    i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli ili (b) Jedinjenja III-d:

    aceutski prihvatljivih soli. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd 52