RS64256B1

RS64256B1 - Ham15-52 analozi sa poboljšanom potentnošću sa amilinskim receptorom (hamy3r)

Info

Publication number: RS64256B1
Application number: RS20230442A
Authority: RS
Inventors: Jens Christian Frøslev Nielsen; Kristoffer Tobias Gustav Rigbolt; Esben Matzen Bech; Morten Lundh; Paola Magotti; Borja Ballarín-Gonzáles; Søren Ljungberg Pedersen; Niels Vrang
Original assignee: Gubra Aps
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2023-07-31
Also published as: CA3189267A1; AU2021350396A1; CN116322741A; IL300620B2; IL300620A; JP2023544959A; ZA202301635B; HRP20230534T1; BR112023002525A2; WO2022063925A1; KR20230073176A; HUE062560T2; IL300620B1; US20240101634A1; PL4021929T3; FI4021929T3; PT4021929T; SI4021929T1; ES2950137T3; DK4021929T5

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na hAM15-52analoge sa poboljšanom potentnošću sa amilinskim receptorom (hAMY3R) (hAMY3R-EC50≤ 250 pM) i koji se u najvećoj meri baziraju na sekvenci čovečijeg adrenomedulinskog fragmenta hAM15-52. Pronalazak se dalje odnosi na hAM15-52analoge koji su selektivni agonisti amilinskog receptora (hAMY3R) (hAMY3R-EC50≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM). Konkretno, predmetni pronalazak se zasniva na uviđanju da čovečiji adrenomedulinski fragment hAM15-52može da se konvertuje u visoko selektivne agoniste amilinskog receptora (hAMY3R-EC50≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM) tako što se amino kiselina na poziciji X11u hAM15-52zameni zajedno sa jednom ili više aminokiselina na pozicijama X4, X37i/ili X38u hAM15-52. Tako zamena najmanje dve aminokiseline na hAM15-52za rezultat ima hAM15-52analoge sa AMY3R i AM1R potentnošću koja je uporediva sa hAMY1-37(amilin). Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže ove hAM15-52analoge i na njihovu medicinsku upotrebu u lečenju medicinskog stanja kao što je gojaznost i/ili dijabetes.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Gojaznost je medicinsko stanje kod koga se višak telesne masti nagomilava u toj meri da ima negativan uticaj na zdravlje. Ona pogađa veliki broj pojedinaca širom sveta i u naglom je porastu u nekim delovima sveta. Svetska zdravstvena organizacija (SZO) procenila je da je 2016. u svetu bilo približno 650 miliona gojaznih ljudi. Gojaznost se definiše kao indeks telesne mase (BMI) preko 30. Smatra se da je gojaznost glavni faktor rizika za razvoj niza medicinskih stanja, kao što su kardiovaskularne bolesti (npr. hipertenzija, ateroskleroza, srčani udar ili šlog), NASH mišićno-skeletni poremećaji, neke vrste kancera, depresija i dijabetes tipa II, i otuda je štetna po ljudsko zdravlje. Kardiovaskularne bolesti i dijabetes su dve glavne bolesti povezane sa gojaznošću. U oblasti koja se bavi gojaznošću, u potrazi za novim lekovima za gojaznost ili bolesti i poremećaje povezane sa gojaznošću, sprovodi se veliki broj istraživanja.

[0003] Dijabetes je grupa metaboličkih poremećaja koje karakteriše visok nivo šećera u krvi. Od 2019. postoji procena Međunarodne federacije za dijabetes da u svetu 463 miliona ljudi pati od dijabetesa, pri čemu je kod približno polovine postavljena dijagnoza. Dijabetes se deli na dva tipa, naime na dijabetes tipa I i tipa II. Dijabetes tipa I nastaje usled nemogućnosti pankreasa da proizvede dovoljno insulina usled gubitka beta ćelija izazvanog autoimunim odgovorom. Sa druge strane, dijabetes tipa II je stanje koje počinje sa insulinskom rezistencijom kod koje ćelije ne uspevaju pravilno da odgovore na insulin, a kako bolest napreduje, može da dođe i do nedostatka insulina.

[0004] Čovečiji amilin (hAMY1-37ili amilin) je peptidni hormon sa 37 ostataka koji se luči zajedno sa insulinom iz β-ćelija pankreasa, sa aminokiseinskom sekvencom Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr koja ima disulfidni most između ostataka 2 i 7. Amilin suprimira oslobađanje glukagona i inhibira pražnjenje želuca i tako igra važnu ulogu u održavanju homeostaze glukoze putem snižavanja koncentracije šećera u krvi. Dakle, amilin je potencijalni kandidat za lečenje dijabetesa. Dalje, pokazano je da amilin smanjuje unos hrane i igra važnu ulogu kod sitosti, zbog čega je potencijalno kandidat i za lečenje gojaznosti. Međutim, amilin poseduje neke nedostatke, kao što je visoka tendencija za fibrilaciju, kratak polu život in vivo i hemijska nestabilnost na pH 7. Dakle, nativni amilin je suboptimalan za upotrebu kao farmaceutski aktivan sastojak.

[0005] U stanju tehnike je poznat veliki broj amilinskih derivata, kao što su derivati prikazani u WO2016/146739. Ovi amilinski analozi predstavljaju pokušaj da se reše neki od poznatih nedostataka koje ima čovečiji amilin. Jedan uspešan primer je amilinski analog pramlintid, koji je odobren od strane FDA za upotrebu kod dijabetesa tipa I i tipa II. Međutim, pramlintid je formulisan na pH 4 i podleže fibrilaciji na pH 7. Stoga i dalje postoji potreba za novim amilinskim analozima sa povećanom hemijskom stabilnošću, povećanom metaboličkom stabilnošću i/ili smanjenom tendencijom da fibriliše. Konkretno, poželjni su amilinski analozi koji su stabilni u većem opsegu pH vrednosti. Štaviše, postoji potreba za novim amilinskim analozima sa povećanom efikasnošću usled npr. povećane potentnosti, veće efikasnosti i/ili dužeg polu života, kako bi bilo moguće manje često doziranje i povećana komplijansa kod pacijenata. Predmetni pronalazak ima zadatak da primenom nove hemijske strategije reši jedan ili više problema koji su poznati u stanju tehnike.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] U prvom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na hAM15-52analoge sa poboljšanom potentnošću pri interakciji sa amilinskim receptorom (hAMY3R) (hAMY3R-EC50≤ 250 pM). Dakle, u prvom aspektu, prikaz se odnosi na hAM15-52analoge ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, koji sadrže 38 aminokiselina (X1-X38), pri čemu je aminokiselina na poziciji X11izabrana od R, W ili Cit i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1), recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1). Pronalazači su iznenađujuće utvrdili da je aminokiselinska pozicija X11bila izuzetno važna za povećanje potentnosti hAM15-52sa amilinskim receptorom. Tako je pojedinačna supstitucija u X11iz K u R, W ili Cit bila dovoljna da značajno poboljša potentnost hAM15-52sa amilinskim receptorom (hAMY3R-EC50≤ 250 pM), zadržavajući u isto vreme adrenomedulinsku potentnost (hAM1R).

[0007] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje selektivne hAM15-52analoge (hAMY3R-EC50≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM) koji deluju kao agonisti na amilinski receptor hAMY3R, ali koji se, za razliku od stanja tehnike (npr. WO2016/146739), izvode od okosnice adrenomedulinskog fragmenta hAM15-52. Pronalazači su iznenađujuće utvrdili da je svaka od pozicija X4, X37i X38od velikog značaja za hAM1R potentnost hAM15-52i da hAM1R potentnost hAM15-52može da se izgubi ili smanji (hAM1R-EC50≥ 25 nM) nekim aminokiselinskim supstitucijama na bilo kojoj od pozicija X4, X37i/ili X38. Dakle, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na hAM15-52analoge koji sadrže 38 aminokiselina (X1-X38), ili na njihovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu je aminokiselina na poziciji X11izabrana od R, W ili Cit i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1), recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1) i dalje, pri čemu je X4odabrano kao F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je odabrano kao G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je odabrano kao Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K, po uslovom da najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji. Pronalazači su iznenađujuće utvrdili da čovečiji adrenomedulinski fragment hAM15-52može da se konvertuje u visoko selektivne agoniste amilinskog receptora (hAMY3R-EC50vrednost ≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM) tako što se aminokiselina na poziciji X11u hAM15-52zameni zajedno sa jednom ili više aminokiselina na pozicijama X4, X37i/ili X38u hAM15-52. Tako zamena najmanje dve aminokiseline na hAM15-52za rezultat ima hAM15-52analoge sa hAMY3R i hAM1R potentnošću koja je uporediva pre sa amilinom nego sa hAM15-52. Jedna prednost ovog pristupa je to što, za razliku od čovečijeg amilina hAM15-52nije sklon fibrilaciji i upotrebom ove nove hemijske strategije, pronalazači su dalje predvideli da dobra svojstva fibrilacije koja ima hAM15-52mogu da se zadrže u novim hAM15-52analozima. Stoga, hAM15-52analozi prema pronalasku sadrže značajan deo okosnice molekula prisutne u hAM15-52kao važan deo sekvence (tj. najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1)). Tako u drugom aspektu pronalaska prvi rešeni problem predstavlja obezbeđivanje novih potentnih hAMY3R agonista sa visokom selektivnošću u odnosu na hAM1R, koji se dobijaju finim izmenama polifarmakologije hAM15-52fragmenta u hAMY3R agonizam. Drugi problem, rešen drugim aspektom, predstavlja obezbeđivanje hAMY3R agonista koji su manje skloni fibrilaciji, čime se prevazilazi problem inherentan čovečijem amilinu. Za razliku od amilinskih derivata poznatih u prethodnom stanju tehnike, hAM15-52analozi prema predmetnom pronalasku poseduju strukturno različitu sekvencu koja pripada hAM15-52fragmentu. Dakle, hAM15-52analozi prema pronalasku poseduju različite fizičko-hemijske osobine u poređenju sa amilinskim derivatim iz prethodnog stanja tehnike, kao što su različita rastvorljivost, hemijska, fizička i/ili metabolička stabilnost.

[0008] U terećem aspektu, pronalazak se odnosi na hAM15-52analoge prema drugom aspektu, za upotrebu kao medikamenata. Konkretnije, treći aspekt prema pronalasku se odnosi na hAM15-52analoge prema drugom aspektu, za upotrebu u lečenju, prevenciji ili poboljšavanju niza različitih bolesti, poremećaja ili stanja, kao što su, ali ne ograničeno na, prekomerni unos hrane, prekomerna telesna težina, gojaznost, poremećaj kompulzivnog prejedanja, Prader-Vilijev sindrom, dislipidemija, metaboličke bolesti/poremećaji, dijabetes I ili II, narušena tolerancija na glukozu, sindrom insulinske rezistencije i/ili NASH.

[0009] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili više hAM15-52analoga prema drugom aspektu i njihovu medicinsku upotrebu(e) u lečenju, prevenciji ili poboljšavanju niza različitih bolesti, poremećaja ili stanja prema trećem aspektu. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač (vehikulum) i/ili jedan ili više ekscipijens(asa).

[0010] Pronalazak će sada biti objašnjen detaljnije na osnovu poravnanja amilinskog (hAMY1-37) i adrenomedulinskog fragmena (hAM15-52), kao što je prikazano u tabeli 1 u nastavku teksta.

DEFINICIJE

[0011] U predmetnom kontekstu, kada se prikaz odnosi na pozicije aminokiselina u hAM15-52analozima (tj. X1-X38) koji su izvedeni/izabrani od hAMY1-37ili zadržani/izabrani od hAM15-52fragmenta, važi sledeće poravnanje, prikazano u tabeli 1. Dakle, pozicija X1u hAM15-52analozima prema pronalasku odgovara prvoj aminokiselini u čovečijem amilinu (hAMY1-37) i aminokiselini broj 15 (hAM15) u hAM15-52fragmentu.

P

Tabela 1

[0012] Prema predmetnom pronalasku, hAM15-52analozi su u principu amidovani na C-terminusu (-CONH2), kao i nativni peptidi; amilin i adrenomedulin. Međutim, hAM15-52analozi prema predmetnom pronalasku mogu takođe da imaju, ili slobodnu karboksilnu kiselinu (-COOH), ili neku drugu post-translacionu modifikaciju kao što je metil estar (-COOMe). U veoma poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, hAM15-52analozi su amidovani na C-terminusu. hAM15-52analozi prema predmetnom pronalasku mogu da imaju slobodan amin (-NH2), da budu N-acilovani (-NHCOR), N-metilovani (-NHCH3ili -N(CH3)2) ili deaminovani na N-terminusu. hAM15-52analozi takođe mogu da budu lipidovani, npr. na N-terminusu kao što je ovde prikazano, u zavisnosti od željenog poluživota polipeptida.

[0013] Prema predmetnom pronalasku, lipidacija ima uobičajeno značenje u tehnici. Dakle, lipidacija se u predmetnom kontekstu odnosi na kovalentno vezivanje lipida opciono preko linkera za hAM15-52analoge prema pronalasku. Lipidacija se obično izvodi kako bi se poboljšao farmakokinetički profil polipeptida npr. poboljšanjem metaboličke stabilnosti, smanjenjem enzimske degradacije, snižavanjem izlučivanja i metabolizma, što u celini rezultira produženim in vivo poluživotom (t1/2) hAM15-52analoga. hAM15-52analozi prema pronalasku mogu da budu lipidovani ili nelipidovani. Lipidovani hAM15-52analozi čiji su primeri ovde prikazani, lipidovani su zasićenom C20-dikiselinom preko različitih linkera kao što je prikazano u tabeli 2. Prema predmetnom pronalasku, skraćenice Hyp, Cit, Aib, Aad, (NMe)G/Sar, (NMe)I imaju uobičajeno značenje koje imaju u oblasti. Dakle, Hyp se odnosi na L-hidroksiprolin, Cit se odnosi na L-citrulin, Aib se odnosi na 2-aminoizobuternu kiselinu, Aad se odnosi na L-homoglutaminsku kiselinu, (NMe)G se odnosi na N-metilglicin koji je poznat i kao Sar ili sarkozin i (NMe)I se odnosi na N-metil-L-izoleucin.

[0014] Prema predmetnom pronalasku, EC50vrednosti se koriste kao mera potentnosti agonista na datom receptoru. EC50vrednost je mera koncentracije jedinjenja koja je potrebna za postizanje polovine maksimalne aktivnosti tog jedinjenja u određenom testu. Dakle, smatra se da hAM15-52analog prema pronalasku, koji ima hAMY3R-EC50nižu nego hAMY3R-EC50od hAM15-52u datom testu, ima višu potentnost ili aktivnost na hAMY3R receptoru od adrenomedulinskog fragmenta hAM15-52. Slično tome, može se smatrati da hAM15-52analog prema pronalasku, koji ima hAM1R-EC50višu nego hAM1R-EC50od hAM15-52, u datom testu, ima nižu potentnost ili aktivnost na hAM1R receptoru od adrenomedulinskog fragmenta hAM15-52.

[0015] Prema predmetnom pronalasku, hAM15-52analog ili njegov derivat može da bude u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Prema tome, predviđeno je da farmaceutski prihvatljive soli obuhvate sve soli koje se obično koriste u formulacijama peptida. Ove soli uključuju i kisele adicione soli i bazne soli, a primeri mogu da se nađu npr. u publikaciji Remington's Pharmaceutical Sciences, 17<th>edition. Slično tome, različiti solvati hAM15-52analoga ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, takođe se nalaze u obimu zaštite pronalaska.

[0016] Prema predmetnom pronalasku, hAM15-52analozi su kratki lanci aminokiselina koji su povezani amidnim vezama. U najpoželjnijem primeru izvođenja prema pronalasku, hAM15-52analozi imaju dužinu od 38 aminokiselina, ne uključujući aminokiseline koje funkcionišu kao spejseri između opcionog lipida i hibridnih polipeptida.

[0017] U predmetnom kontekstu, osim ako nije drugačije navedeno, sve amino kiseline su L-amino kiseline (L-stereoizomer, prirodne amino kiseline). Dakle, apsolutna konfiguracija aminokiselina je (S)-konfiguracija sa izuzetkom L-cisteina i L-selenocisteina koji imaju (R) konfiguraciju.

[0018] U predmetnom kontekstu, treba razumeti da su aminokiseline Cys (X2) i Cys (X7) u hAM15-52analozima kovalentno povezane mostom, poželjno disulfidnim mostom (-S-S-) kao što je prisutan u hAMY1-37i hAM15-52. Ciklizacija disulfidnog mosta može da se izvede nakon prečišćavanja hibridnih polipeptida ili pre odvajanja od smole kod sinteze peptida u čvrstoj fazi, opciono u prisustvu pogodnih zaštitnih grupa. Disulfidni most može da se formira spontano, mešanjem hibridnog polipeptida u prisustvu kiseonika, ili može da se formira tretiranjem hibridnih polipeptida sa drugim pogodnim oksidansom kao što je jod (I2), opciono u prisustvu baze.

[0019] U predmetnom kontekstu, hAM15-52analozi ili njihovi derivati prema prvom ili drugom aspektu imaju hAMY3R potentnost (EC50) ≤ 250 pM, recimo ≤ 200 pM, poželjno hAMY3R-EC50≤ 150 pM, recimo ≤ 125 pM, poželjnije hAMY3R-EC50≤ 100 pM, recimo ≤ 75 pM, još poželjnije hAMY3R-EC50≤ 50 pM, recimo ≤ 25 pM, najpoželjnije hAMY3R-EC50≤ 15 pM, recimo ≤ 10 pM. Tako hAM15-52analozi koji su najpotentniji sa hAMY3R mogu da budu više ili manje ekvipotentni sa nativnim čovečijim amilinom hAMY1-37. Na primer, sekvence SEQ ID NO: 3-44 imaju hAMY3R-EC50između 6,0-10 pM, i stoga su više ili ekvipotentne u poređenju sa hAMY1-37(hAMY3R-EC50= 10 pM) kada se meri pod istim uslovima testa.

[0020] U predmetnom kontekstu, hAM15-52analozi ili njihovi derivati prema drugom aspektu imaju nepostojeću ili smanjenu EC50kada je EC50vrednost na hAM1R ≥ 25 nM, recimo EC50vrednost na hAM1R ≥ 50 nM, recimo hAM1R-EC50≥ 100 nM, poželjno hAM1R-EC50≥ 150 nM, recimo ≥ 200 nM, poželjnije hAM1R-EC50≥ 250 nM, recimo ≥ 300 nM, još poželjnije hAM1R-EC50≥ 350 nM, recimo ≥ 400 nM, još više poželjno hAM1R-EC50≥ 450 nM, recimo ≥ 500 nM, još više poželjno hAM1R-EC50≥ 600 nM, recimo ≥ 700 nM, još više poželjno hAM1R-EC50≥ 800 nM, recimo ≥ 900 nM, još više poželjno hAM1R-EC50≥ 1000 nM, najpoželjnije hAM1R-EC50≥ 5000 nM. Tako u predmetnom kontekstu, selektivno u smislu potentnosti prema amilinskom receptoru hAMY3R u odnosu na adrenomedulinski receptor hAM1R (tj. selektivni agonist amilinskog receptora) treba razumeti kao hAM15-52analog ili njegov derivat prema drugom aspektu, koji ima hAMY3R-EC50vrednost ≤250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM. Dakle, selektivni hAM15-52analog ili njegov derivat ima odnos selektivnosti (hAM1R EC50/hAMY3R EC50) od najmanje 100. Poželjno, hAM15-52analozi ili njihovi derivati imaju hAMY3R-EC50vrednost ≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 50 nM, a time i odnos selektivnosti (hAM1R EC50/hAMY3R EC50) ≥200. Poželjnije, hAM15-52analozi ili njihovi derivati imaju hAMY3R-EC50≤ 200 pM, hAM1R- EC50≥ 100 nM, a time i odnos selektivnosti (hAM1R EC50/hAMY3R EC50) ≥ 500. Poželjnije, hAM15-52analog, ili njegov derivat, ima hAMY3R-EC50≤ 125 pM, hAM1R-EC50≥ 200 nM, a time i odnos selektivnosti (hAM1R EC50/hAMY3R EC50) ≥ 1600. Još poželjnije, hAM15-52analog, ili njegov derivat, ima hAMY3R-EC50≤ 100 pM, hAM1R-EC50≥ 500 nM, a time i odnos selektivnosti (hAM1R EC50/hAMY3R EC50) ≥ 5000. Najpoželjnije, hAM15-52analog, ili njegov derivat, ima hAMY3R-EC50≤ 50 pM, hAM1R-EC50≥ 1000 nM, a time i odnos selektivnosti (hAM1R EC50/hAMY3R EC50) ≥ 20000. Na primer, bilo koja od sekvenci SEQ ID NO: 3-42 ima odnos selektivnosti od najmanje 6000, a većina i mnogo viši.

[0021] Stručnjaku u oblasti je dobro poznato da EC50vrednosti zavise od vrste testa i uslova prilikom testiranja. Dakle, u predmetnom kontekstu, kada se prikaz odnosi na EC50vrednost, treba smatrati da je to EC50vrednost dobijena kada se meri prema proceduri opisanoj u primerima u okviru opštih protokola za cAMP testove kojima se meri in vitro aktivacija receptora. Međutim, varijacija može takođe da bude prisutna u okviru istog testa pod naizgled identičnim uslovima testiranja zbog varijacija u npr. ekspresiji receptora u ćelijama (tj. gustine receptora). Dakle, da bi se uporedile EC50vrednosti, hAMY1-37(SEQ ID NO: 2) i hAM15-52(SEQ ID NO: 1) su testirane kao interni standardi za poređenje različitih testiranja ili čak različitih testova. Utvrđeno je da su hAMY3R-EC50i hAM1R-EC50za hAMY1-37(SEQ ID NO: 2) 10 pM i 5000 nM, redom, kada se koriste isti uslovi testiranja i ćelijska linija kao i za hAM15-52analoge (SEQ ID NO: 3-392). Slično tome, utvrđeno je da su hAMY3R-EC50i hAM1R-EC50za hAMY15-52(SEQ ID NO: 1) 1,3 nM i 1,1 nM, redom, kada se koriste isti uslovi testiranja i ćelijska linija kao i za hAM15-52analoge (SEQ ID NO: 3-392). Dakle, sledi da hAM15-52analozi ili njihovi derivati prema prvom ili drugom aspektu imaju relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3REC50)/(hAMY1-37-hAMY3R-EC50) ≤(250 pM)/(10 pM) ≤ 25. Poželjno, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAMY1-37-hAMY3R-EC50) ≤ 20. Poželjnije, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAM1-37-hAMY3R-EC50) ≤ 12,5. Još poželjnije, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAMY1-37-hAMY3R-EC50) ≤ 10. Još poželjnije, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAMY1-37-hAMY3R-EC50) ≤ 5. Još više poželjno, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAMY1-37-hAMY3R-EC50) ≤ 2. Najpoželjnije, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAMY1-37-AMY3R-EC50) ≤ 1 tako da su hAM15-52analozi ili njihovi derivati ekvipotentni ili potentniji od hAMY1-37. Slično tome, selektivni hAM15-52analozi ili njihovi derivati prema drugom aspektu imaju relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAM15-52-AMY3R-EC50) ≤ (250 pM)/(1300 pM) ≤ 0,19 i relativni hAM1R-EC50odnos (hAM1R-EC50)/(hAM15-52-hAM1R-EC50) ≥ (25 nM)/(1,1 nM) ≥ 22,7. Poželjno, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAM15-52-hAMY3R-EC50) ≤ (250 pM)/(1300 pM) ≤ 0,19 i relativni hAM1R-EC50odnos (hAM1R-EC50)/(hAM15-52-hAM1R-EC50) ≥ (50 nM)/(1,1 nM) ≥ 45,5. Poželjnije, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAM15-52-hAMY3R-EC50) ≤ 0,15 i relativni hAM1R-EC50odnos (hAM1R-EC50)/(hAM15-52-hAM1R- EC50) ≥ 76,9. Još više poželjno, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAM15-52-hAMY3R-EC50) ≤ 0,096 i relativni hAM1R-EC50odnos (hAM1R-EC50)/(hAM15-52-hAM1R-EC50) ≥ 154. Još poželjnije, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAM15-52-hAMY3R-EC50) ≤ 0,077 i relativni hAM1R-EC50odnos (hAM1R- EC50)/(hAM15-52-hAM1R-EC50) ≥ 384. Još više poželjno, relativni hAMY3R-EC50odnos (hAMY3R-EC50)/(hAM15-52-AMY3R-EC50) ≤ 0,038 i relativni hAM1R-EC50odnos (hAM1R-EC50)/(hAM15-52-hAM1R-EC50) ≥ 769. Najpoželjnije, relativni hAM1R-EC50odnos (hAM1R-EC50)/(hAM15-52-hAM1R-EC50) ≥ 2000.

[0022] Prema predmetnom pronalasku, termin "lečenje" treba razumeti u najširem smislu kao prevenciju, poboljšanje ili lečenje. Prema tome, lečenje takođe treba da uključi profilaktički tretman.

[0023] Prema predmetnom pronalasku, sa aspekta(ata)/primera izvođenja koji se odnose na “pri čemu hAM15-52analog ima (npr.) najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1)” ili “njegov derivat sa (npr.) najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52”, potrebno je smatrati da hAM15-52analog ili njegov derivat ima najmanje 50 % identičnosti sekvence sa

1

hAM15-52(SEQ ID NO: 1) kada je poravnan. Kao primer, SEQ ID NO: 169 koja je ilustrovana u nastavku teksta, razlikuje se u dve aminokiseline (X11i X38) od hAM15-52(SEQ ID NO: 1) i stoga ima (38-2)/38 = 94,7 % identičnosti sekvence sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1).

SEQ ID NO:1 G C R F G T C T V Q K L A H Q I Y Q F T D K D K D N V A P R S K I S P Q G Y

Derivat X: G C R F G T C T V Q R L A H Q I Y Q F T D K D K D N V A P R S K I S P Q G Hyp

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Porodica kalcitoninskih peptida

[0024] Porodica peptida kalcitonina sastoji se od hormonskih peptida kalcitonina (CT), peptida povezanog sa genom za kalcitonin (CGRP), amiloidnog polipeptida ostrvaca (IAPP, amilin ili hAMY1-37) i adrenomedulina (hAM), kao i njihovih prekursora. hAMY1-

37je peptidni hormon sa 37 ostataka koji se luči zajedno sa insulinom iz β-ćelija pankreasa, sa aminokiselinskom sekvencom Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr. Amilin suprimira oslobađanje glukagona i inhibira pražnjenje želuca i tako igra važnu ulogu u održavanju homeostaze glukoze putem snižavanja koncentracije šećera u krvi. Dalje, pokazano je da amilin smanjuje unos hrane i igra važnu ulogu kod sitosti, što ga čini potencijalnim kandidatom za lečenje npr. gojaznosti i/ili dijabetesa. hAM je peptidni hormon sa 52 ostatka koji je eksprimiran u svim tkivima, sa aminokiselinskom sekvencom Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe- Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser- Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr. On je potentan vazodilatator i ima demonstriran pozitivan uticaj kod kardiovaskularnih bolesti, recimo kod infarkta miokarda, ishemije udova i hipertenzije.

[0025] Biološka aktivnost porodice proteina kalcitonina je generalno posredovana vezivanjem za kalcitoninski receptor (CTR) i receptor sličan kalcitoninskom receptoru (CRLR), gde oba pripadaju porodici 2 receptora kuplovanih sa G-proteinom (GPCR). Ovi receptori mogu da budu ko-eksprimirani u kombinaciji sa različitim proteinima koji modifikuju receptor (RAMP1-3), koji generišu funkcionalne receptore za pojedinačne peptide u porodici proteina kalcitonina. Ko-ekspresija CTR sa RAMP1 dovodi do formiranja receptora za amilin i CGRP (AMY1R), ko-ekspresija CTR sa RAMP2 dovodi do amilinskog receptora 2 (AMY2R) i ko-ekspresija CTR sa RAMP3 dovodi do amilinskog receptora (AMY3R ). Ko-ekspresija CRLR sa RAMP1 dovodi do formiranja receptora za CGRP (CGRP1R), ko-ekspresija CRLR sa RAMP2 dovodi do formiranja receptora za adrenomedulin (AM1R) i ko-ekspresija CRLR sa RAMP3 dovodi do formiranje receptora za adrenomedulin i CGRP (AM2R).

[0026] Nekoliko nativnih peptida u porodici proteina kalcitonina pokazuje značajno preklapanje farmakologije za različite receptore. Na primer, adrenomedulin je približno 100 puta manje potentan na AMY3R u poređenju sa hAMY1-37. Adrenomedulinski fragment (hAM15-52) je skoro ekvipotentan na AMY3R i AM1R sa EC50od 1,3 nM na AMY3R i EC50vrednošću od 1,1 nM na AM1R (pri čemu je navedena EC50vrednost izmerena u skladu sa ovde datim primerima). hAMY1-37sa druge strane, ima EC50vrednost od 10 pM na AMY3R dok je neaktivan na AM1R.

Određivanje važnih aminokiselinskih pozicija u hAM15-52

[0027] Pronalazači su prvobitno pretpostavili da, pošto hAM15-52i hAMY1-37pripadaju istoj porodici hormona, porodici kalcitonin/CGRP/IAPP, potentnost hAM15-52sa AMY3R može da se poboljša ili čak pretvori u selektivni AMY3R agonizam u odnosu na hAM1R agonizam, ako se zamene određene aminokiseline u hAM15-52sa aminokiselinama izvedenim iz hAMY1-37, čime se prevazilaze neki nedostaci koji su inherentni segmentu hAMY1-37. Svih 37 hAMY1-37aminokiselina je sistematično zamenjeno u hAM15-52. Štaviše, X38je izabrana kao Hyp (hidroksiprolin), koji nije prisutan ni u hAMY1-37ni u hAM15-52. Pronalazači su konstruisali modele slučajnih šuma (Breiman, L. (2001), Random Forests, Machine Learning 45(1), 5-32.) koji opisuju odnos između sekvence peptida i hAMY3R i hAM1R potentnosti, redom, i sistematski sintetisanih i pregledanih peptidnih sekvenci. Za svaki hAM15-52analog, aminokiselina na svakoj poziciji sekvence je korišćena kao karakteristika, a EC50vrednosti za receptore su korišćene kao odgovor za konstruisanje modela. Paket „randomForest“ implementiran u statističkom programskom jeziku R korišćen je za izračunavanje važnosti svake pozicije i identifikovane su najvažnije pozicije kao kritične za aktivnost hAMY3R i/ili hAM1R (A. Liaw i M. Wiener (2002). Classification and Regression by randomForest. R News 2(3), 18-22.). Na osnovu ove sistematske analize pronalazači su identifikovali da su X4, X37i X38važni za aktivnost hAM1R, dok su manje važni za aktivnost hAMY3R. Pronalazači su identifikovali da je X11kritičan za aktivnost hAMY3R, dok je manje važan za aktivnost hAM1R. I na kraju, pronalazači su identifikovali da je X17od izvesnog značaja za aktivnost hAMY3R, dok je od manjeg značaja za aktivnost hAM1R. Stoga su pronalazači identifikovali X11kao ključnu poziciju za poboljšanje hAMY3R potentnosti u hAM15-52i X4, X37i X38kao ključne pozicije za eliminaciju hAM1R potenosti u hAM15-52. Pošto je X17bio samo od neke važnosti za aktivnost hAMY3R, ova pozicija se nije razmatrala kao ključna, već samo kao poželjna pozicija za dalje poboljšanje AMY3R potentnosti hAM15-52analoga.

[0028] Sistematično ispitivanje je pokazalo da je hAMY3R potentnost hAM15-52mogla da se poboljša supsitucijom aminokiseline K prisutne u hAM15-52na poziciji X11sa aminokiselinom R prisutnom u hAMY1-37. Štaviše, sistematično ispitivanje je pokazalo da je hAM1R potentnost hAM15-52mogla da se smanji supstitucijom aminokiselina prisutnih na pozicijama X4, X37i X38u hAM15-52sa odgovarajućim aminokiselinama koje se nalaze u predmetnom hAMY1-37.

Detaljnije ispitivanje aminokiselina na poziciji X4, X11, X17, X37i X38.

[0029] Pronalazači su sistematično supstituisali reprezentativne aminokiseline koje obuhvataju reprezentativne aminokiseline za sve poznate aminokiseline, na 5 identifikovanih pozicija, jednu po jednu poziciju (tabela 6). Kao što je prikazano u primeru 1, sve (SEQ ID: 1-360 su izgubile svoju aktivnost na hAM1R, sa različitim stepenom potentnosti na AMY3R. Kako bi se odredio skor za pojedinačne aminokiseline na 5 pozicija, prosečna EC50vrednost za peptide koji sadrže datu aminokiselinu na datoj poziciji, poređene su sa prosečnom EC50vrednošću hAM15-52analoga koji sadrže referentnu aminokiselinu na toj poziciji. Pod uslovom da je granična vrednost 4-orostruka

1

promena potentnosti, za svaku aminokiselinu na svakoj poziciji skor je određen kao povećana (I), smanjena (D) ili nepromenjena (U) potentnost, u odnosu na referentnu aminokiselinu, na hAMY3R. Pregled rezultata je dat u tebeli 6 koja sledi. Iz ovih podataka je pokazano da je bilo koja od aminokiselina R, W ili Cit bila u stanju da održava AMY3R potentnost, kada je prisutna na poziciji X11, u poređenju sa referencom, dok su druge reprezentativne amonokiseline smanjivale potentnost. Dalje je pokazano da je bilo koja od aminokiselina Y, W, T, M, I, F, A ili C na X4, bilo koja od aminokiselina Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K na X37i bilo koja od aminokiselina Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K na X38mogla da održi ili poboljša AMY3R potentnost, dok je ostajala neaktivna na hAM1R.

Aspekt 1: hAM15-52analozi sa poboljšanom amilinskom potentnošću

[0030] Dakle, u prvom aspektu se prikaz odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži 38 aminokiselina (X1-X38) sa hAMY3R-EC50≤ 250 pM, pri čemu je aminokiselina na poziciji X11izabrana od R, W ili Cit i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, (SEQ ID NO: 1). Iz primera 1 (tabela 2), može se videti da skoro svi sintetisani hAM15-52analozi imaju najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, da velika većina sintetisanih hAM15-52analoga ima najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, i da veliki deo sintetisanih hAM15-52analoga ima najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1). Svi ovi hAM15-52analozi zadržavaju dobra svojstva fibrilacije koja ima hAM15-52(SEQ ID NO: 1) u poređenju sa hAMY1-37(SEQ ID NO: 2) (videti primer 2, tabela 3). Npr., SEQ ID NO: 32 pokazuje da dobra fizička stabilnost (tj. niska fibrilacija) koju ima hAM15-52može da se zadrži sve dok hAM15-52analozi imaju najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52.

[0031] Dakle, u prvom aspektu, prikaz se odnosi na način kojim se u velikoj meri poboljšava hAMY3R potentnost hAM15-52fragmenta putem pojedinačne supstitucije R, W ili Cit na poziciji X11, uz zadržavanje dobre fizičke stabilnosti (tj. dobrih svojstava fibrilacije koja ima hAM15-52). Ovi hAM15-52analozi će stoga biti visoko potentni agonisti i na hAMY3R i na hAM1R (videti SEQ ID NO: 361-392).

[0032] U najpoželjnijem primeru izvođenja prema prikazu, X11je izabrana kao R. U drugom primeru izvođenja, X11je izabrana kao W. U još jednom primeru izvođenja, X11je izabrana kao Cit. Pronalazači su utvrdili da je ova pojedinačna aminokiselinska supstitucija u X11obezbedila povećanu hAMY3R potentnost sa hAM15-52analogom(ozima) uz zadržavanje hAM1R potentnosti. Pronalazači su dalje utvrdili da je hAMY3R potentnost mogla da se zadrži kada je X17bila Y, T, Q, M, I, F, A, R ili K, ili da se čak dodatno poboljša ako se X17izabere kao W ili H. Tako je u primeru izvođenja X17izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K. U poželjnom primeru izvođenja, X17je izabrana kao Y, W ili H, poželjnije W ili H.

[0033] U primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog koji sadrži 38 aminokiselina (X1-X38) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu, aminokiselina na poziciji X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K, poželjno X17je izabrana kao W ili H i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-

52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1).

[0034] U još jednom primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog koji sadrži 38 aminokiselina (X1-X38) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu, aminokiselina na poziciji X11je R; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K, poželjno X17je izabrana kao W ili H i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50% identičnosti sa hAM15-

52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, (SEQ ID NO: 1).

[0035] U još jednom primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog koji sadrži 38 aminokiselina (X1-X38) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu, aminokiselina na poziciji X11je W; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K, poželjno X17je izabrana kao W ili H i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50% identičnosti sa hAM15-

1

[0036] U još jednom primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog koji sadrži 38 aminokiselina (X1-X38) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu, aminokiselina na poziciji X11je Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K, poželjno X17je izabrana kao W ili H i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-

52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, (SEQ ID NO: 1).

[0037] U poželjnom primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana

1

od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K.

[0038] U drugom poželjnom primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K.

[0039] U poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

1

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K.

[0040] U još poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od

1

R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K.

[0041] U još poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K.

[0042] U još poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

1

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F.

[0043] U još poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

2

R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K.

[0044] U još poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F.

[0045] U još poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F.

[0046] U jednom još poželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R;

X17je izabrana kao Y, W ili H;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 60% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70% identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R; X17je izabrana kao Y, W ili H; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F.

[0047] U još više poželjnom primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog koji sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit

ili njegov derivat sa najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52sa hAM15-52, recimo najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit.

[0048] U najpoželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog sekvence SEQ ID NO: 3-392 ili na njegov derivat sa najmanje 90 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-392, poželjno najmanje 95 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-392, poželjnije najmanje 96 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-392 najpoželjnije najmanje 97 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-392 pod uslovom da njegov derivat ima R, W ili Cit na poziciji X11, poželjno R na poziciji X11.

[0049] U najpoželjnijem primeru izvođenja, prikaz se odnosi na hAM15-52analog sekvence SEQ ID NO: 3-392 ili njegov derivat sa najmanje 90 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-392, poželjno najmanje 95 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-392, poželjnije najmanje 96 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-392, najpoželjnije najmanje 97 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-278, pod uslovom da njegov derivat ima istu aminokiselinu na

2

poziciji X11, kao i respektivna sekvenca SEQ ID NO: 3-392 iz koje je izveden.

Aspekt 2: Selektivni hAM15-52analozi sa poboljšanom amilinskom potentnošću

Broj pozicija neophodan da se anulira ili smanji AM1R potentnost kod hAM15-52.

[0050] Pronalazači su utvrdili da je hAM1R potentnost mogla da se anulira ili smanji kod hAM15-52izmenom najmanje jedna aminokiseline na bilo kojoj od pozicija X4, X37ili X38pošto su sve one kritične za hAM1R potentnost.

Smanjenje hAM1R potentnosti aminokiselinama na poziciji X4X37ili X38.

[0051] X4: Pronalazači su utvrdili da su aminokiseline Y, W, T, M, I, A ili C na poziciji X4bile u stanju da smanje hAM1R potentnost. Tako, u jednom primeru izvođenja, X4je izabrana od Y, W, T, M, I, A ili C. Štaviše, aminokiseline W, M, I ili C na poziciji X4bile su najefikasnije u poboljšavanju hAMY3R potentnosti (videti primer 5, tabela 6). Tako, u veoma poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, X4je izabrana kao W, M, I ili C. Pošto su pronalazači utvrdili da je samo jedna pozicija izabrana od X4, X37ili X38bila dovoljna da se anulira ili smanji AM1R potentnost, sledi da je u nekim primerima izvođenja X4F (tj. nativna aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji) i AM1R potentnost se anulira ili smanjuje pomoću pozicija X37i/ili X38. Dakle, u bilo kom od prethodnih primera izvođenja, X4, F može da bude uključena, a AM1R potentnost anulirana ili smanjena pomoću pozicija X7i/ili X38.

[0052] X37: Slično tome, pronalazači su utvrdili da su aminokiseline Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C na poziciji X37bile u stanju da smanje hAM1R potentnost. Tako, u jednom primeru izvođenja, X37je izabrana od Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C. Štaviše, aminokiseline Y, W, P, H ili F na poziciji X37su bile najefikasnije u poboljšavanju hAMY3R potentnosti (videti primer 5, tabela 6). Tako, u veoma poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, X37je izabrana kao Y, W, P, H ili F. Pošto su pronalazači utvrdili da je samo jedna pozicija izabrana od X4X37ili X38bila dovoljna da se anulira ili smanji AM1R potentnost, sledi da je u nekim primerima izvođenja X37G (tj. nativna aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji) i AM1R potentnost se anulira ili smanjuje pomoću pozicija X37i/ili X38. Dakle, u bilo kom od prethodnih primera izvođenja, X4, F može da bude uključena, a AM1R potentnost anulirana ili smanjena pomoću pozicija X4i/ili X38.

[0053] X38: Slično tome, pronalazači su utvrdili da su aminokiseline Hyp, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K na poziciji X38bile u stanju da smanje hAM1R potentnost. Tako, u jednom primeru izvođenja, X38je izabrana od Hyp, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K. Štaviše, aminokiseline Hyp, W, M ili F su bile najefikasnije u poboljšavanju hAMY3R potentnosti (videti primer 5, tabela 6). Tako, u veoma poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, X38je izabrana kao Hyp, W, M ili F. U najpoželjnijem primeru izvođenja prema pronalasku, X38je izabrana kao Hyp. Pošto su pronalazači utvrdili da je samo jedna pozicija izabrana od X4, X37ili X36bila dovoljna da se anulira ili smanji AM1R potentnost, sledi da je u nekim primerima izvođenja X38Y (tj. nativna aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji) i AM1R potentnost se anulira ili smanjuje pomoću pozicija X4i/ili X37. Dakle, u bilo kom od prethodnih primera izvođenja za X38, Y može da bude uključena, a AM1R potentnost anulirana ili smanjena pomoću pozicija X4i/ili X37.

[0054] Jednostavna ilustracija aspekta 2 prema pronalasku može da se uoči ako se poredi poravnanje hAM15-52(SEQ ID NO: 1) i SEQ ID NO: 169 koja je prikazana u nastavku teksta.

SEQ ID NO:1 G C R F G T C T V Q K L A H Q I Y Q F T D K D K D N V A P R S K I S P Q G Y SEQ ID NO:169 G C R F G T C T V Q KRL A H Q I Y Q F T D K D K D N V A P R S K I S P Q G Hyp

SEQ ID NO:1 hAMY3R EC501,274 nM i hAM1R EC501,113 nM

SEQ ID NO:169 hAMY3R EC500,063 nM i hAM1R EC502981,0 nM

[0055] Kao što može da se vidi, R na poziciji X11ima poboljšanu potentnost na AMY3R približno 20 puta, a Hyp na poziciji X38ima poboljšanu potentnost na AM1R približno 2500 puta. Dakle, samo dve supstitucije konvertovale su hAM15-52u amilinski agonist sa istim farmakološkim profilom kao hAMY1-37. U isto vreme, SEQ ID NO: 169 je zadržala fizičku stabilnost (ThT signal: 2,700 %) hAM15-52(ThT signal: 2,600 %) u poređenju sa

2

hAMY1-37(ThT signal: 100,0 %) (videti primer 2, tabela 3). Tako se u drugom aspektu pronalazak odnosi na način da se više ili manje potpuno anulira hAM1R potentnost hAM15-

52fragmenta putem jedne ili više supstitucija X4, X37i/ili X38i da se u isto vreme poboljša ili zadrži dovoljna AMY3R potentnost. Ovi hAM15-52analozi će stoga biti veoma potentni i selektivni hAMY3R analozi. U isto vreme ovi hAM15-52analozi zadržavaju fizičku stabilnost hAM15-52zahvaljujući identičnosti sekvence sa hAM15-52. Kao što je prikazano u primeru 2, tabela 3, dobra fizička stabilnost hAM15-52može da se održi ili čak i poboljša u peptidima (zahvaljujući najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52), uz istovremeno obezbeđivanje novih hAMY3R agonista koji su jednako potentni i selektivni kao i čovečiji amilin. Drugim rečima, drugi aspekt predmetnog pronalska je kreirao funkcionalni analog čovečijeg amilina preprušen u adrenomedulinsku okosnicu.

Povećavanje hAMY3R potentnosti sa aminokiselinama na poziciji X17.

[0056] Pronalazači su dalje utvrdili da je hAMY3R potentnost mogla da se zadrži kada je X17bila Y, T, Q, M, I, F, A, R ili K, ili da se čak dodatno poboljša kada je X17bila W ili H. Tako je u primeru izvođenja X17izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K. U poželjnom primeru izvođenja, X17je izabrana kao W ili H.

[0057] Dakle, u drugom aspektu se pronalazak odnosi na hAM15-52analoge koji sadrže 38 aminokiselina (X1-X38) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je aminokiselina na poziciji X11izabrana od R, W ili Cit i pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50% identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, (SEQ ID NO: 1) i dalje, pri čemu je X4izabrana kao F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana kao G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana kao Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K, po uslovom da najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji, poželjnije, najmanje dve od pozicija X4, X37ili X38nisu aminokiseline

2

prisutne u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji. U drugom aspektu, hAM15-52analozi imaju hAMY3R-EC50≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM.

[0058] U jednom primeru izvođenja, X4je izabrana kao F, W, M, I ili C; X37je izabrana kao G, Y, S, W, T, Q P, H ili F; X38je izabrana kao Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K, pod uslovom da najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji, poželjnije, najmanje dve od pozicija X4, X37ili X38nisu aminokiseline prisutne u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0059] U jednom primeru izvođenja, X4je izabrana kao F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana kao G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana kao Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K, pod uslovom da najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji, poželjnije, najmanje dve od pozicija X4, X37ili X38nisu aminokiseline prisutne u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0060] U jednom primeru izvođenja, X4je izabrana kao F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana kao G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana kao Hyp, Y, W, M ili F, pod uslovom da najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji, poželjnije, najmanje dve od pozicija X4, X37ili X38nisu aminokiseline prisutne u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0061] U jednom primeru izvođenja, X4je izabrana kao F, W, M, I ili C; X37je izabrana kao G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana kao Hyp, Y, W, M ili F, pod uslovom da najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji, poželjnije, najmanje dve od pozicija X4, X37ili X38nisu aminokiseline prisutne u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0062] U poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

2

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R, K;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

i, dalje, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji;

ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti, još poželjnije najmanje 85 % identičnosti, recimo najmanje 90 % identičnosti, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti, pri čemu X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R, K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F,E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0063] U još poželjnijem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

2

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji;

ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti, recimo najmanje 85 % identičnosti, poželjnije najmanje 90 % identičnosti, najpoželjnije najmanje 95 % identity, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0064] U drugom poželjnijem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F Y W T M I A ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

2

ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti, recimo najmanje 85 % identičnosti, poželjnije najmanje 90 % identičnosti, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0065] U još poželjnijem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti, recimo najmanje 85 % identičnosti, poželjnije najmanje 90 % identičnosti, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0066] U još poželjnijem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K;

ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F,

1

E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0067] U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, odnosi se na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njen derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52,, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0068] U poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

2

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-

52, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0069] U poželjnijem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

pri čemu

X11je izabrana od R, W ili Cit;

X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K;

X4je izabrana od F, W, M, I ili C;

X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F;

X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F;

ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 85 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, najpoželjnije najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, W, M, I ili C; X37je izabrana od G, Y, W, P, H ili F; X38je izabrana od Hyp, Y, W, M ili F; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0070] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja, X11je najpoželjnije R, i/ili X17je najpoželjnije Y, W ili H. Osim toga, u bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja, najpoželjnije najmanje dve od pozicija X4, X37ili X38nisu aminkiseline prisutne u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0071] U više poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog sa sekvencama SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, ili njegov derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1), pri čemu, u derivatu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je

4

izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, Mv, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0072] U još više poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog sa sekvencama SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360 ili njegov derivat sa najmanje 90 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, poželjno najmanje 95 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, najpoželjnije najmanje 97 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, pod uslovom da u derivatu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0073] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja, X4je poželjno izabrana kao F, W, M, I ili C; X11je poželjno izabrana kao R; X37je poželjno izabrana kao G, Y, W, P, H ili F; X38je poželjno izabrana kao Hyp, Y, W, M ili F; X17je poželjno izabrana kao W ili H. Štaviše, u bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja, najpoželjnije, najmanje dve od pozicija X4, X37ili X38nisu aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji.

[0074] U najpoželjnijem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na hAM15-52analog sa sekvencama SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, ili njegov derivat sa najmanje 90 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, poželjno najmanje 95 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, najpoželjnije najmanje 97 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, pod uslovom da njegov derivat ima iste aminokiseline na pozicijama X4, X11, X37i X38, poželjno iste aminokiseline na poziciji X4, X11, X17, X37, i X38, kao i respektivni hAM15-52analog sekvence SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360 iz koje je izveden.

Medicinska upotreba

[0075] U terećem aspektu, pronalazak se odnosi na hAM15-52analoge prema drugom aspektu, za upotrebu kao medikament. Konkretnije, treći aspekt prema pronalasku se odnosi na hAM15-52analoge prema drugom aspektu, za upotrebu u lečenju, prevenciji ili poboljšavanju niza različitih bolesti, poremećaja ili stanja, kao što su, ali ne ograničeno na, prekomerni unos hrane, prekomerna telesna težina, gojaznost, poremećaj kompulzivnog prejedanja, Prader-Vilijev sindrom, dislipidemija, metaboličke bolesti/poremećaji, dijabetes I ili II, narušena tolerancija na glukozu, sindrom insulinske rezistencije i/ili NASH. Poželjan primer izvođenja se odnosi na jedan ili više hAM15-52analoga za upotrebu u lečenju gojaznosti, dijabetesa, NASH ili njihovih kombincija.

Farmaceutske kompozicije

[0076] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili više hAM15-52analoga prema drugom aspektu i njihovu medicinsku upotrebu(e) u lečenju, prevenciji ili poboljšavanju niza različitih bolesti, poremećaja ili stanja prema trećem aspektu. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač (vehikulum) i/ili jedan ili više ekscipijens(asa) u skladu sa konvencionalnim tehnikama u oblasti, kao što su tehnike prikazane u publikaciji 'Remington: Essentials of Pharmaceutics’, Ed. by Linda A. Felton, Pharmaceutical press 2012.

[0077] Pogodne formulacije uključuju, ali nisu ograničene na tablete, pilule, kapsule, emulzije, suspenzije, usporeno oslobađanje ili rastvore. Potrebno je imati u vidu da mogu da se koriste različite rute administracije u zavisnosti od izbora formulacije i hemijske i/ili metaboličke stabilnosti polipeptida. Ove rute primene mogu da uključuju, ali nisu ograničene na oralnu primenu, parenteralnu primenu (intravensku (IV), potkožnu (SC), intradermalnu (ID) i intramuskularnu (IM)) ili inhalaciju. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, ruta primene je parenteralna primena. U još poželjnijem primeru izvođenja, ruta primene je potkožna.

PRIMERI

Opšti protokoli za sintezu hibridnih polipeptida

[0078] Peptidi su sintetisani pomoću potpuno automatizovanog paralelnog sintetizera peptida Syroll (MultiSynTech GmbH, Nemačka), opremljenog termo-blokom, na Tentagel 5 RAM uz nanošenje 0,23-0,25 mmol/g (Rapp polymer GmbH, Nemačka). N<α>-Fmoc deprotekcija je izvedena u dva stadijuma tako što je smola tretirana sa 40 % piperidina/DMF (0,2 M HOBt (1-hidroksibenzotriazol) 3 min na 45°C i nakon toga sa 20 % piperidina/DMF (0,1 M HOBt) 7-12 min na 75°C. Osim Asp, Cys i His ostataka koji su bili N<α>-Fmoc deprotektovani na sobnoj temperaturi; tj.40 % piperidin/DMF (0,2 M HOBt) 3 min, a zatim 20 % piperidin/DMF (0,1 M HOBt) 15 min. Hemija kuplovanja je bila (N,N’-diizopropilkarbodiimid)/Oxyma (etil cijano(hidroksiimino)acetat) u DMF uz pomoć rastvora aminokiselina od 0,5 M u DMF i molarnom višku od 6 puta. Korišćene su standardne Fmoc zaštićene aminokiseline. Uslovi kuplovanja su bili jednostruko ili dvostruko kuplovanje tokom 15 min na 75°C. Osim His i Cys ostataka koji su bili dvostruko kuplovani tokom 15 min na 50°C. Fmoc-aminokiseline su rastvorene u 0,5 M u DMF koji je sadržao 0,5 M Oxyma, osim His koji je rastvoren u NMP. Smola je isprana 4x sa NMP nakon N<α>-Fmoc deprotekcije i 3x nakon kuplovanja.

[0079] Disulfidni most je formiran na smoli uz pomoć Tritila (Trt) kao zaštitne grupe za cistein i tretmanom sa 1% jodom u 75% HFIP (heksafluoroizopropanol) u DCM tokom 1 min. Smola je isprana 3x sa 75% HFIP u DCM, a zatim 4x sa DCM.

[0080] Nakon sinteze, smola je isprana sa DCM i osušena, i polipeptid je odvojen od smole tretmanom sa TFA (trifluorosirćetna kiselina)/TES (trietilsilan)/voda (95/2,5/2,5) u trajanju od 35 min na 42°C, nakon čega je usledila precipitacija sa 4 zapremine hladnog dietil etra, dodatno ispiranje dietil etrom i sušenje.

[0081] Peptidi su okarakterisani pomoću LC-MS (Waters, Danska) i kvantifikovani pomoću LC-CAD (ThermoFisher scientific, Danska). Na kraju, peptidi su osušeni liofilizacijom kako bi dali beli prah, pomoću Telstar laboratorijskog liofilizatora.

Opšti protokoli za cAMP testove za merenje in vitro aktivacije receptora

hAMY3-R:

[0082] Ćelije sa stabilnom prekomernom ekspresijom hAMY3 receptora dobijene su od firme Ogeda (sada Astellas Pharma), subklonirane, i monoklonska ćelijska linija sa pogodnim karakteristikama za testiranje je umnožena, alikvotirana i zamrznuta. Alikvot je otopljen i zasejan u DPBS sa 0,05 % kazeina i 0,5 mM IBMX sa 2000 ćelija/bunarčiću u formatu sa 384 bunarčića. Ćelije su zatim odmah stimulisane tokom 30 min na sobnoj temperaturi sa postepeno doziranim testiranim jedinjenjem, sa čovečijim amilinom (Bachem, kat. br. H-7905) kao pozitivnom kontrolom. Akumulacija cAMP je merena pomoću Cisbio testa za Gs-kuplovane receptore (kat. br.62AM4PEC), gde su test reagensi dodavani po uputstvima proizvođača i posle jednog sata je zabeležen vremenski profil energetskog transfera fluorescencije.

hAM1-R:

[0083] Ćelije sa stabilnom prekomernom ekspresijom hAM1 receptora dobijene su od firme Ogeda (sada Astellas Pharma), subklonirane, i monoklonska ćelijska linija sa pogodnim karakteristikama za testiranje je umnožena, alikvotirana i zamrznuta. Alikvot je otopljen i zasejan u DPBS sa 0,05 % kazeina i 0,5 mM IBMX sa 8000 ćelija/bunarčiću u formatu sa 384 bunarčića. Ćelije su zatim odmah stimulisane tokom 30 min na sobnoj temperaturi sa postepeno doziranim testiranim jedinjenjem, sa čovečijim adrenomedulinom 1-52 (Bachem, kat. br. H-2932) kao pozitivnom kontrolom. Akumulacija cAMP je merena pomoću Cisbio testa za Gs-kuplovane receptore (kat. br.62AM4PEC), gde su test reagensi dodavani po uputstvima proizvođača i posle jednog sata je zabeležen vremenski profil energetskog transfera fluorescencije.

Opšti protokoli za određivanje fizičke stabilnosti peptidnih analoga

[0084] Peptidi su rastvoreni u puferima (50 mM natrijum acetat na pH 4 ili 50 mM natrijum fosfat na pH 7) i inkubirani jedan sat. Uzorci su zatim podeljeni na dva replikata od po 80 μl u crnoj ploči sa 384 bunarčića (μ-clear, Greiner Bio-One) i pomešani sa reagensom Thioflavin T (ThT) do finalne koncentracije od 4 μm. Ploča je hermetički zatvorena i smeštena u čitač ploča (CLARIOstar, BMG), pri čemu je temperatura podešena na 40°C tokom eksperimenta. Uzorci su dodatno izloženi stresu tako što je ploča mućkana na 700 rpm (linearno) tokom pet minuta pre svakog merenja. Fluorescencija je merena svakih 10 min tokom četiri dana putem pobuđivanja ThT na 450 nM i merenjem emisije na 480 nM. Za svaki peptid, ThT signal u vremenu je prečišćen pomoću podešavanja lokalne polinomske regresije (LOESS) primenjene u okruženju statističkog programiranja R. Za prečišćene podatke, maksimalni ThT signal je normalizovan u procentima između maksimalnog ThT signala za hAMY i osnovne vrednosti za pufer. Dakle, visoke vrednosti ozanačavaju svojstva fibrilacije slična kao kod hAMY, dok niske vrednosti označavaju odsustvo fibrilacije.

Opšti protokoli za proučavanje akutnog unosa hrane

[0085] Efekat na kumulativni unos hrane je meren kod mužjaka Sprague Dawley pacova (6 nedelja starosti, Taconic, Danska) nakon jedne doze, pomoću potpuno automatizovanog sistema za praćenje unosa hrane (HM-2; MBRose ApS, Faaborg, Danska), koji omogućava napredno sinhrono praćenje ponašanja u vezi sa unosom hrane kod pojedinačnih životinja, u realnom vremenu. Životinje su gajene u grupama od 4 jedinke u sobi sa kontrolom svetlosti, temperature i vlažnosti (12/12 LD ciklus, svetla se pale u 02:00 AM; 22 ± 2 C; 50 % relativne vlažnosti). Miševi su imali ad libitum pristup uobičajenoj hrani (Altromin 1324, Brogaarden A/S, Lynge, Danska) i tekućoj vodi istog kvaliteta kao u domaćinstvima. Miševi su stigli 7. dana i ostavljeno im je minimalno 5 dana navikavanja na sistem pre nego što su ispitivanja otpočela. Tokom ovih dana životinjama se svakodnevno rukovalo kako bi se navikle na eksperimentalni okvir. Na dan doziranja, životinje su nasumično raspoređene u grupe na osnovu telesne težine. Životinje su bile bez hrane četiri sata pre doziranja. Životinje su dozirane SC 30 ili 180 min pre gašenja svetla, a podaci o unosu hrane su sakupljani automatski, ukupno 48 h nakon doziranja sa automatskim beleženjem hrane na svakih 5 min.

Opšti protokoli za ispitivanje hronične ishranom indukovane gojaznosti (DIO)

[0086] Sprague-Dawley pacovi (Taconic, Danska) stigli su u starosnoj dobi od 5 nedelja. Nakon jedne nedelje aklimatizacije, grupisani su ravnomerno prema osnovnim vrednostima svoje telesne težine i ponuđene su im dve mogućnosti ad libitum pristupa hrani, koja se sastojala od peleta (Altromin #1324, Brogaarden, Lynge, Danska) i vrlo ukusne hrane sa visokim sadržajem šećera/masti (1:1:1 smeša namaza Nutella (Ferrero, Alba, Italija), kikiriki putera (PCD, Rotterdam, Holandija) i standardne hrane u prahu (Altromin #1324, Brogaarden, Lynge, Danska); 29,3 % masti, 33,2 % ugljenih hidrata i 18 % proteina) tokom najviše 36 nedelja. Tokom cele studije pacovi su bili smešteni u kaveze u parovima, pod kontrolisanim uslovima sredine (svetlo/tama ciklus na 12 sati, gašenje svetla u 15:00; 22 ± 1 °C; 50 ± 10% relativne vlažnosti). Telesna težina, unos hrane i vode, praćeni su svakodnevno tokom celog perioda ispitivanja. Jedan dan pre eksperimenta, pacovi su randomizovani prema telesnoj težini u eksperimentalne grupe (n = 9-10), koje su primale jedinjenje ili vehikulum SC. QD (jednom dnevno) tokom 28 dana.

Primer 1

[0087] EC50vrednosti na hAMY3R i hAM1R merene su prema opštim protokolima navedenim prethodno u tekstu. Procenat identičnosti za hAM15-52analoge je izračunat u poređenju sa hAM15-52. Pregled rezultata je dat u tebeli 2 koja sledi.

Tabela 2. Tabela 2 pokazuje da hAM15-52analozi (SEQ ID NO: 3-392) sa poboljšanom potentnošću sa hAMY3R u poređenju sa hAM15-52mogu da se dobiju zamenom aminokiseline K prisutne u hAM15-52na poziciji X11sa R, W ili Cit. Tabela 2 dalje pokazuje da visoko selektivni (hAMY3R-EC50≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM) hAMY3R hAM15-52analozi (SEQ ID NO: 3-360) mogu da se dobiju kada se anulira ili smanji hAM1R potentnost, koristeći pozicije X4, X3, i/ili X38. Sve lipidacije na poziciji 1 se izvode na N-terminusu, a lipidacija na drugim pozicijama se izvodi na epsilon N u Lys. AMCHC se odnosi na trans-4(aminometil)cikloheksankarboksilnu kiselinu. OEG se odnosi na 8-amino-3,6-dioksaoktansku kiselinu ili 8Ado.

4

1

2

4

Primer 2.

[0088] Fibrilacija je određena u skladu sa opštim protokolom za određivanje fizičke stabilnosti peptidnih analoga. Kratak pregled podataka za odabrane hAM15-52analoge je dat u tabeli 3 u nastavku teksta.

Tabela 3. Tabela 3 pokazuje da hAM15-52analozi prema pronalasku zadržavaju dobra svojstva fibrilacije koja ima hAM15-52. Najveći broj podataka vezanih za fibrilaciju je uporediv sa, a neki su čak i bolji od hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na pH 7 (ThT signal od 2,6 %). Svi podaci vezani za fibrilaciju su daleko bolji u poređenju sa referencom hAMY1-37(SEQ ID NO: 2) (ThT signal na 100 %).

1

2

Primer 3.

[0089] Određen je efekat odabranih hAM15-52analoga na akutni unos hrane kod mršavih pacova. Pregled rezultata je dat u tebeli 4 koja sledi.

Tabela 4. Tabela 4 pokazuje da hAM15-52analozi imaju potentan anoreksični efekat i do 48 sati nakon samo jedne SC injekcije kod mršavih zdravih pacova (n=7-8), čime je obezbeđen dokaz za princip. Dunetov test jednofaktorskog linearnog modela*: P < 0,001 u poređenju sa vehikulumom (sprovedena su tri nezavisna testiranja). ;; ;;;; 4 ; ;; Primer 4. ;[0090] Određen je efekat hroničnog tretmana odabranih hAM15-52analoga prema pronalasku kod pacova sa gojaznošću koja je indukovana ishranom (DIO). Pregled rezultata je dat u tebeli 5 koja sledi. ;;Tabela 5. Tabela 5 pokazuje da svakodnevne SC injekcije sekvence SEQ ID NO: 46 ili 78 izazivaju značajno smanjenje telesne težine kod pacova (n=10) sa gojaznošću koja je indukovana ishranom, nakon tretmana u periodu od 28 dana, čime je obezbeđen dokaz za koncept. Dunetov test jednofaktorskog linearnog modela*: P < 0,001 u poređenju sa vehikulumom (sprovedena su dva nezavisna testiranja).

Primer 5

[0091] Temeljnije ispitivanje reprezentativnih aminokiselina na poziciji X4, X11, X17, X37i X38i odgovarajuća promena potentnosti. Pregled rezultata je dat u tebeli 6 koja sledi.

Tabela 6. Tabela 6 pokazuje da li izmena aminokiseline dovodi do povećanja (I) hAMY3R potentnosti, nepromenjene potentnosti (U) ili smanjene potentnosti (D), u poređenju sa referentnom (R) aminokiselinom. N/A Nije dostupno.

Tabela 7. SPISAK SEKVENCI

�

Nastavak tabele 7

�

Claims

Patentni zahtevi 1. hAM15-52analog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so koja sadrži 38 aminokiselina (X1-X38) sa hAMY3R-EC50≤ 250 pM i hAM1R-EC50≥ 25 nM, pri čemu je aminokiselina na poziciji X4izabrana kao F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana kao G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana kao Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; X11je R, W ili Cit i pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji i, dalje, pri čemu hAM15-52analog ima najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1). 2. hAM15-52analog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što hAM15-52analog ima najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52(SEQ ID NO: 1). 3. hAM15-52analog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (I):

naznačen time što X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je zabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dalje, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji; ili njen derivat sa najmanje 50 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 55 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 60 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 65 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 70 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 75 % identičnosti sa hAM15-52, poželjnije najmanje 80 % identičnosti sa hAM15-52, recimo najmanje 90 % identičnosti sa hAM15-52, poželjno najmanje 95 % identičnosti sa hAM15-52, pri čemu, u derivatu, X11je izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dalje, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji. 4. hAM15-52analog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1, sa sekvencama SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, ili derivat bilo koje od njih sa najmanje 90 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, poželjno najmanje 95 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305 ili 308-360, najpoželjnije najmanje 97 % identičnosti sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243,246-305 ili 308-360, pod uslovom da je u derivatu X11izabrana od R, W ili Cit; X17je izabrana kao Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R ili K; X4je izabrana od F, Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; i, dodatno, pri čemu najmanje jedna od pozicija X4, X37ili X38nije aminokiselina prisutna u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji. 5. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što najmanje dve od pozicija X4, X37i X38nisu aminokiseline prisutne u hAM15-52(SEQ ID NO: 1) na navedenoj poziciji. 6. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što su sve pozicije X4, X37i X38izabrane na sledeći način: X4je izabrana od Y, W, T, M, I, A ili C; X37je izabrana od Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C ili K; X38je izabrana od Hyp, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R ili K; 7. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je X4izabrana kao F, W, M, I ili C. 8. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je X37izabrana kao G, Y, W, P, H ili F. 9. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je X38izabrana kao Hyp, Y, W, M ili F. 10. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je X17izabrana kao W ili H. 11. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je X11R. 12. hAM15-52analog ili njegov derivat prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11 za upotrebu kao medikament. 13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži hAM15-52analog ili njegov derivat prema patentnim zahtevima 1-11, farmaceutski prihvatljiv nosač i, opciono, jedan ili više ekscipijens(asa). Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5