RS64336B1 - Modulatori za trex1 - Google Patents

Description

Opis

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava traži priznanje datuma prioriteta za privremenu prijavu za priznanje zaštite, u SAD br. U.S.62/776,301, podneta 6. decembra 2018.

OBLAST TEHNIKE

[0002]Potencijalna terapija imunog sistema je potrebna za kancere koji se odnose na prepoznavanje uljeza prirodnog imunog sistema, i da detektuje i zaštiti se od potencijalne opasnosti. Ćelije kancera se razlikuju antigenski iz njihovih normalnih suprotstavljenih delova i emituju signale opasnosti da bi se upozorio imuni sistem slično virusnoj infekciji. Ovi signali, koji uključuju sa oštećenjem povezane molekularne obrasce (engl. DAMP) i sa patogenom povezane molekularne obrasce (eng. PAMP), dalji aktivni urođeni imuni sistem koji daje kao rezultat zaštitu domaćina od raznovrsnih opasnosti (Front. Cell Infect. Microbiol.2012, 2, 168).

[0003] Ektopično eksprimovane jednolančana DNK (engl. ssDNA) i dvolančana DNK (engl. dsDNA) su poznati molekularni obrasci povezani sa patogenom (PAMP) i/ili sa oštećenjem povezani molekularni obrasci (DAMP), koji se prepoznaju pomoću ciklične GMP-AMP sintaze (cGAS), senzor nukleinske kiseline (Nature 2011, 478, 515-518). Posle senzitizacije citosolnih DNK, cGAS katalizuje generisanje cikličnih dinukleotida 2’,3’- cGAMP, jakog drugog prenosioca poruke (engl. messenger) i activatora ER transmembranskog adaptera proteinskog stimulatora gena interferona (STING) (Cell Rep. 2013, 3, 1355-1361). STING aktivacija aktivira fosforilaciju od IRF3 preko TBK1 koji zauzvrat dovodi do proizvodnje interferona tipa I i aktivacije interferonom stimulisanih gena (ISGs); preduslov da se aktivira urođeni imunitet i pokretanje adaptivnog imuniteta. Proizvodnja interferona tipa I samim tim obuhvata ključni most između urođenog i adaptivnog imuniteta (Science 2013, 341, 903-906).

[0004] Višak tipa I IFN može biti štetan za domaćina i da indukuje autoimunitet, samim tim, mehanizmi negative povratne sprege postoje da kontrolišu tipom I IFN-a posredovanu aktivaciju imunog sistema. Tri primarne popravne egzonukleaze I (TREX1) je 3’-5’ DNK egzonukleaze odgovorne za uklanjanje ektopično eksprimovane ssDNK i dsDNK i samim tim su ključni potiskivač cGAS/STING putanje (PNAS 2015, 112, 5117-5122).

[0005] Interferoni tipa I i smanjeni proinflamatorni odgovori citokina su ključni za razvoj odgovora imunog sistema i njihove efikasnosti. Interferoni tipa I povećavaju i sposobnost dendritskih ćelija i makrofaga da preuzmu, obrade, prezentuju, i unakrsno prezentuju antigene T ćelijama, i njihova snaga da izmame stimulišu T ćelije pojačavanjem regulacije kostimulatornih molekula kao što je CD40, CD80 i CD86 (J. Exp. Med.2011, 208, 2005-2016). Interferoni tipa I se takođe vezuju sopstvenim primaocima i aktiviraju gene odgovorne za interferon koji doprinose aktivaciji ćelija uključenih u adaptivni imunitet (EMBO Rep.2015, 16, 202-212).

[0006] Sa stanovišta terapije, interferoni tipa I i jedinjenja koja mogu da indukuju proizvodnju interferona tipa I imaju potencijal za upotrebu u lečenju kancera kod ljudi (Nat. Rev Immunol. 2015, 15, 405-414). Interferoni mogu da inhibiraju direktno proliferaciju ćelija tumora kod ljudi. Pored toga, interferoni tipa I mogu da povećavaju imunitet organizma protiv tumora povlačenjem aktivacije ćelija iz prirodnog i adaptivnog imunog sistema. Važno, antitumorna aktivnost PD-1 blokade zahteva prethodno postojanje T ćelija unutar tumora (unutartumornih T ćelija). Pretvaranjem hladnih tumora u vruće i samim tim izmamljivanjem spontanog imuniteta protiv tumora, terapije indukovanja tip I interferona (IFN) imaju potencijal da prošire broj pacijenata koji reaguju na terapiju protiv PD-1 kao i da pospeše efikasnost anti-PD1 terapije.

[0007]Terapije čiji je razvoj u toku koje indukuju snažan odgovor tipa I interferona zahtevaju fokusiranu ili unutartumorsku isporuku pacijentu da bi se postigao prihvatljiv terapijski indeks. Shodno tome, ostaje potreba za novim agensima sa sistemskom isporukom i nižom toksičnošću da bi se proširila korisnost terapija indukovanja tipa I interferona (IFN) kod pacijenata bez perifernih lezija dostupnih za lečenje. Genetička proučavanja ljudi i miševa nagoveštavaju da TREX1 inhibicija može da bude prisupačna ruti isporuke u organizam i samim tim jedinjenja koja inhibiraju TREX1 bi mogla da igraju važnu ulogu u portretisanju terapije protiv tumora. TREX1 je ključni pokazatelj koji određuje ograničenu imunogenost ćelija kancera koje odgovaraju na terapiju zaračenjem [Trends in Cell Biol. (Aktuelnosti u biologiji ćelije), 2017, 27 (8), 543-4; Nature Commun., 2017, 8, 15618]. TREX1 je indukovan genotoksičnim stresom i uključen je u zaštitu ćelija glioma i melanoma od lekova protiv kancera [Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1833, 1832-43]. STACT-TREX1 terapija pokazuje veoma snažnu efikasnost protiv tumora na više modela kancera kod miševa [Glickman et al, Poster P235, 33rd Annual Meeting of Society for Immunotherapy of Cancer, Washington DC, Nov.7-11, 2018]. Brucet et al.

(Bruset i saradnici) opisuju strukturne i biohemijske studije TREX1 inhibicije pomoću metala [Protein Science, 2008, 17 (12), 2059-2069].

KRATAK OPIS

[0008]Ovde opisana izvođenja pronalaska se generalno odnose na agense, jedinjenja, supstance i jedinjenja za upotrebu u lečenju bolesti koje reaguju na TREX1 inhibitore. TREX1 inhibitori selektivni prema TREX2 inhibitorima su uspešno sintetisani u ovom pronalasku.

[0009] Ovde su data jedinjenja koja imaju Formulu I:

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i supstance, pri čemu A, R1, R2 i n jesu kao što je ovde opisano. Opisana jedinjenja i supstance modulišu TREX1, i korisna su za raznovrsne terapijske primene kao što je, na primer, za lečenje kancera.

KRATAK OPIS SLIKA

[0010]

SL. 1A ilustruje rezultate laboratorijskog eksperimenta za TREX1 u B16F10 tumoroznim ćelijama korišćenjem CRISPR.

SL. 1B ilustruje TREX1 oslabljenu aktivaciju cGAS/STING putanje za B16F10 tumorozne ćelije.

SL. 2: ilustruje da su tumori kod kojih je TREX utišan imali manje zapremine u poređenju sa roditeljskim B16F10 tumorima.

SL. 3: pokazuje da su TREX1 laboratorijski B16F10 tumori ispoljili značajno povećanje u ćelijama imunog sistema u celini. Ovo odražava povećanje broja tumora infiltracijom CD4 i CD8 T ćelija kao i kada je reč o plazmacitoidnim dendritskim ćelijama (pDC).

SL. 4: pokazuje aktivnost izvesnih inovativnih jedinjenja za HCT116 liniju ćelija karcinoma debelog creva i rektuma (kolorektalnih) karcinoma kod ljudi.

DETALJAN OPIS

1. Opšti opis jedinjenja

[0011]U prvom izvođenju, ovde je dato jedinjenje iz Formule I:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:

R<1>jeste vodonik, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, 3- do 4-člani cikloalkil, -ORf, - SRf, ili -NR<e>R<f>;

R<2>jeste vodonik, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, ili 3- do 4-člani cikloalkil;

X jeste veza, NR<3>, O, S, ili (C1-C4)alkilen, pri čemu je pomenuti (C1-C4)alkilen opciono supstituisan sa 1 do 2 grupe izabrane iz R<4>;

R<3>jeste vodonik, (C1-C4)alkil, -C(O)R<d>, ili -C(S)R<d>;

R<4>jeste halo, (C1-C4)alkil, fenil, -NHC(O)OR<a>, -NHC(S)OR<a>, -C(O)R<b>,-NHC(O)NHR<g>, -NHC(S)NHR<g>, -NHS(O)2NHR<g>, -C(S)R<b>, S(O)2R<c>, S(O)R<c>, -C(O)OR<d>, - C(S)OR<d>, -C(O)NHR<e>, -C(S)NHR<e>, -NHC(O)R<d>,

-NHC(S) R<d>, -OR<e>, -SR<e>, -O(C1-C4)alkilOR<e>, ili -NR<e>R<f>, pri čemu je pomenuti fenil za R<4>opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz halo, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, i halo(C1-C4)alkoksi;

Prsten A jeste fenil, 5- do 6-člani heteroaril, 4- do 7-člani heterociklil, ili 3-do 7-člani cikloalkil, od kojih je svaki opciono i nezavisno supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<5>;

R<5>jeste (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkoksi, halo, fenil, -NHC(O)OR<a>,-NHC(S)OR<a>,-C(O)R<b>,-NHC(O)NHR<g>, -NHC(S)NHRg, -NHS(O)2NHR<g>, -C(S)R<b>, S(O)2R<c>, S(O)R<c>, -C(O)OR<d>, -C(S)OR<d>, -C(O)NR<e>R<f>, -C(S)NHR<e>, -NHC(O)R<d>, -NHC(S)R<d>, -OR<e>, - SR<e>, -O(C1-C4)alkilOR<e>, -NR<e>R<f>, 4- do 6člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu pomenuti fenil za R<5>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, a pomenuti (C1-C4)alkil za R<5>jeste opciono suptituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz OR<h>, -NR<j>R<k>, fenila, i 5- do 6-članog heteroarila, pri čemu pomenuti 4- do 7-člani heterociklil i 4- do 6-člani heteroaril jesu svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<m>, i pri čemu pomenuti fenil i 5- do 6-člani heteroaril opcionih supstituenata na spisku za (C1-C4)alkil u R<5>jesu svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>;

R<g>, R<h>, R<j>, R<k>, i R<m>su svaki nezavisno vodonik, halo, (C1-C4)alkil, halo(Ci-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, halo(C1-C4)alkoksi, fenil, -( C1-C4)alkilfenil, 3- do 4-člani cikloalkil, 4- do 6-člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, i pri čemu pomenuti 4- do 7-člani heterociklil za R<g>, R<h>, R<j>i R<k>jeste još opciono supstituisan sa =O.

R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>i R<f>su svaki nezavisno vodonik, halo, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, halo(C1-C4)alkoksi, fenil, 3- do 4-člani cikloalkil, 4-do 6-člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu i) pomenuti (C1-C4)alkil za R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>i R<f>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz fenila, - ORh, -NR<j>R<k>; ii) pomenuti fenil, 4- do 6-člani heteroaril, i 4- do 7-člani heterociklil za R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>i R<f>su svaki opciono i nezavisno supsituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, i

iii) pomenuti 4- do 7-člani heterociklil za R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>i R<f>je opciono supstituisan i sa =O.

2. Definicije

[0012] Kada se koristi u vezi sa opisom hemijske grupe koja ima više tačaka spoja, crtica (-) označava tačku spoja međupovezanost te grupe sa promenljivom sa kojom se definiše. Na primer, -NHC(O)OR<a>i -NHC(S)OR<a>znače da tačka spoja za ovu grupu nastaje na atomu azota.

[0013]Pojmovi "halo" i "halogen" se odnose na atom izabran iz fluora (fluoro, -F), hlora (hloro, -Cl), broma (bromo, -Br), i joda (jodo, -I).

[0014] Pojam "alkil" kada se koristi sam ili kao deo veće celine, kao što je "haloalkil", i slični, znači zasićeni pravolinijski ili ragranati monovalentnog radikala ugljovodonika. Osim ako nije drugačije precizirano, alkil grupa obično ima 1-4 atoma ugljenika, t.j.., (C1-C4)alkil.

[0015]Pojam "alkilen" se odnosi na dvovalentni zasićeni ugljovodonik.

[0016]"Alkoksi" znači radikal alkila spojen kroz vezni atom kiseonika, predstavljen pomoću -O-alkil. Na primer, "( C1-C4)alkoksi" uključuje metoksi, etoksi, propoksi, i butoksi.

[0017]Pojam "haloalkil" uključuje mono, poli, i perhaloalkil grupa kod kojih su halogeni nezavisno izabrani iz fluora, hlora, broma, i joda.

[0018] "Haloalkoksi" je haloalkil grupa koja je spojena na drugu celinu preko atoma kiseonika kao što je, npr., ali nisu ograničeni na, -OCHCF2ili -OCF3.

[0019] Pojam "heteroaril" korišćen sam ili kao deo veće celine se odnosi na 5- do 6-člani aromatični radikal koji sadrži 1-4 heteroatoma izabranih iz N, O, i S. Heteroaril uključuje, na primer, tienil, furanil, pirolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, tetrazolil, oksazolil, izoksazolil, oksadiazolil, tiazolil, izotiazolil, tiadiazolil, piridil, piridazinil, pirimidinil, pirazinil, itd. Razumljivo je da kada se preciziraju, opcioni supstituenti na grupi heteroarila mogu biti prisutni na bilo kojoj supstituentom predviđenoj poziciji.

[0020] Pojam "heterociklil" znači 4- do 7-člani zasićeni ili delimično nezasićeni heterociklični prsten koji obuhvata 1 do 4 heteroatoma nezavisno izabrana iz N, O, i S. Prsten heterociklila može biti spojen na svoju bočnu (funkcionalnu) grupu na bilo koji heteroatom ili atom ugljenika koji daje kao rezultat stabilnu strukturu. Primeri takvih zasićenih ili delimično nezasićenih heterocikličnih radikala uključuju, bez ograničenja, tetrahidrofuranil, tetrahidrotienil, terahidropiranil, pirolidinil, piridinonil, pirolidonil, piperidinil, oksazolidinil, piperazinil, dioksanil, dioksolanil, morfolinil, dihidrofuranil, dihidropiranil, dihidropiridinil, tetrahidropiridinil, dihidropirimidinil, oksetanil, azetidinil i tetrahidropirimidinil. Jasno je i da kada je precizirano, opcioni supstituenti na heterociklil grupi mogu da budu prisutni na bilo kojoj pogodnoj poziciji i, uključuju, npr., poziciju u kojoj je heterociklil spojen (npr. u slučaju opciono supstituisanog heterociklila ili heterociklila koji je opciono supstituisan).

[0021]Pojam "cikloalkil" se odnosi na ciklični ugljovodonik koji ima od, osim ako nije drugačije precizirano, 3 do 10 atoma prstena ugljenika. Monociklične cikloalkil grupe uključuju, bez ograničenja, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil, cikloheksenil, cikloheptil, cikloheptenil, i ciklooktil. Jasno je da kada se preciziraju, opcioni supstituenti na grupi cikloalkila ili cikloalifatičnoj grupi mogu da budu prisutni na bilo kom pogodnom položaju i, uključe, npr., položaj na kom je cikloalkil ili cikloalifatna grupa spojena.

[0022] Pojam "TREX1" se odnosi na trostruko primarnu popravnu egzonukleazu 1 ili DNK popravnu egzonukleazu 1, koja je enzim koji je kod ljudi kodiran TREX1 genom. Mazur DJ, Perrino FW (Aug 1999). "Identification and expression of the TREX1 and TREX2 cDNA sequences encoding mammalian 3’-->5’ exonucleases (Identifikacija i eksprimovanje TREX1 i TREX2 cDNK sekvenci koje kodiraju 3’-->5’ egzonukleaze kod sisara". J Biol Chem. 274 (28): 19655-60. doi:10.1074/jbc.274.28.19655. PMID 10391904; Hoss M, Robins P, Naven TJ, Pappin DJ, Sgouros J, Lindahl T (Aug 1999). "A human DNA editing enzyme homologous to the Escherichia coli DnaQ/MutD protein (Humani DNK editujući enzim homolog proteina Escherichia coli DnaQ/MutD". EMBO J.

18 (13): 3868-75. doi:10.1093/emboj/18.13.3868. PMC 1171463. PMID 10393201. Ovaj gen kodira glavne 3’->5’ DNA eksonukleaze u ćelijama ljudi. Protein je neobradiva egzonukleaza koja može da služi funkciji potvrđivanja za DNK polimerazu kod ljudi. To je i komponenta SET kompleksa, i deluje da brzo razgradi 3’ krajeve urezane DNA tokom granzimom A-posredovane smrti ćelije. Ćelije kojima nedostaje funkcionalni TREX1 pokazuju hronična aktivacija kontrolne tačke oštećenja i akumulaciju endogenog supstrata jednolančane DNK izvan nukleusa. Čini se da TREX1 protein normalno deluje na vrste polinukleotida jednolančane DNK generisane iz procesiranja međuproizvoda nepravilne replikacije. Ova aktivnost TREX1 smanjuje signaliziranje kontrolne tačke aktivacije DNK i sprečava patološku aktivaciju imunog sistema. TREX1 metaboliše reverzno transkribovanu jednolančanu DNK endogenih retroelemenata kao funkcije ćelijama urođenog antivirusnog nadzora, što daje kao rezultat snažan odgovor interferona (IFN) tipa I. TREX1 pomaže da HIV-1 izbegne citosolno senzorisanje razgradnjom virusne cDNK u citoplazmi.

[0023] Pojam "TREX2" se odnosi na trostruko primarnu popravnu egzonukleazu 2 koja jeste enzim koji je kod ljudi kodiran TREX2 genom. Ovaj gen kodira protein nukleusa sa aktivnošću 3’ do 5’ egzonukleaze. Taj kodirani protein učestvuje u popravci pokidane dvolančane DNK, i može da reaguje sa DNK polimerazom delta. Enzimi sa ovom aktivnošću su uključeni u DNK replikaciju, popravku, i rekombinaciju. TREX2 je 3’-egzonukleaza koja je pretežno eksprimovana u keratinocitima i doprinosi epidermalnom odgovoru na UVB-om indukovano oštećenje DNK. TREX2 biohemijska i strukturna svojstva su slična TREX1, iako nisu identična. Dva proteina dele dimernu strukturu i mogu da procesiraju ssDNK i dsDNK supstrate in vitro sa skoro identičnim kcat vrednostima. Međutim, nekoliko karakteristika povezanih sa kinetikama enzima, strukturnim domenima, i podćelijska distribucija razlikuju TREX2 u odnosu na TREX 1. TREX2 prikazuje 10-struko niži afinitet za DNK supstrate in vitro u poređenju sa TREX1. Suprotno od TREX1, TREX2 nema COOH-terminalni domen koji može da posreduje proteinprotein interakcijama. TREX2 se lokalizuje i u citoplazmi i u nukleusu, dok se TREX1 nalazi u endoplazmatičnoj membrani (retikulumu), i mobiliše se u nukleus tokom granzimom A-posredovane smrti ćelije ili posle DNK oštećenja.

[0024]Pojmovi "subjekat" i "pacijent" su možda ravnopravno korišćeni, i znače sisara kom je potrebno lečenje, npr., životinja vodiča (npr., pasa, mačaka, i sličnih), životinja sa farmi (npr., krava, svinja, konja, ovaca, koza i sličnog) i laboratorijskih životinja (npr., pacova, miševa, morskih prasadi i sličnih). Najčešće, subjekat je ljudsko biće kom je potrebno lečenje.

[0025] Pojam "inhibira," "inhibicija" ili "inhibiranje" uključuje smanjenje u osnovnoj aktivnosti biološke aktivnosti ili procesa.

[0026]Kako je ovde korišćeno, pojmovi "postupanje ili lečenje," "lečiti," i "obrađivanje, lečenje" se odnose na reverziranje, ublažavanje, odlaganje pojave, ili inhibiranje napretka bolesti ili poremećaja, ili jednog ili više njegovih simptoma, kako je ovde opisano. Kod nekih aspekata ili u nekim varijantnim rešenjima, lečenje se može isporučiti pacijentu posle jednog ili više simptoma koji su se razvili, t.j., terapijsko lečenje. Kod drugih varijantnih rešenja, lečenje može biti isporučeno postupku u odsustvu simptoma. Na primer, lečenje može biti isporučeno pacijentu podložnom pojedincu pre pojave simptoma (npr., u svetlu istorije simptoma i/ili u svetlu izloženosti specifičnom organizmu, ili drugim činiocima podložnosti), t.j., profilaksnom lečenju. Lečenje je moguće nastaviti i pošto se simptomi razreše, na primer da bi se odložila njihova ponovna pojava.

[0027] Pojam "farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na netoksični nosač, adjuvans, ili pomoćno farmaceutsko sredstvo koje ne uništava farmakološku aktivnost jedinjenja sa kojim je formulisano. Farmaceutski prihvatljivi nosači, adjuvanski ili pomoćna farmaceutska sredstva koja je moguće koristiti u supstancama opisanim ovde uključuju, ali se ne ograničavaju na, izmenjivače jona, aluminijum, aluminijum stearat, lecitin, proteine seruma, kao što je albumin seruma iz ljudi, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične gliceridne mešavine zasićenih biljnih masnih kiselina, voda, soli ili elektroliti, kao što je protamin sulfat, dinatrijum vodonik fosfat, kalijum vodonik, natrijum hlorid, soli cinka, koloidna silika, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilceluloza, poliakrilati, voskovi, polimeri polietilen-polioksipropilen-bloka, polietilen glikol i vunena mast.

[0028] Za upotrebu u medicini, soli jedinjenja opisanih ovde se odnose na netoksične "farmaceutski prihvatljive soli." Farmaceutski prihvatljivi oblici soli uključuju farmaceutski prihvatljive kiselinske/anjonske ili bazne/katjonske soli. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli sa dodatkom kisleine iz ovde opisanih jedinjenja uključuju npr., soli neorganskih kiselina (kao što je hlorovodonična kiselina, bromvodonična, fosforna, azotna, i sumporna kiselina) i organske kiseline (kao što je, sirćetna kiselina, benzensulfonska, benzojeva, metansulfonska, i p-toluenesulfonska kiselina). Jedinjenja iz ovog opisa sa kiselinskim grupama kao što su karboksilne kiseline mogu da formiraju farmaceutski prihvatljive soli sa farmaceutski prihvatljivom bazom(ama). Pogodne farmaceutski prihvatljive bazne soli uključuju npr., soli amonijaka, soli alkalnog metala (kao što su soli natrijuma i kalijuma) i soli zemnoalkalnog metala (kao što su soli magnezijuma i kalcijuma). Jedinjenja sa kvaternarnom grupom amonijaka takođe sadrže kontraanjon kao što je hlorid, bromid, jodid, acetat, perhlorad i slično. Drugi primeri takvih soli uključuju hlorovodonike, bromvodonike, sulfate, metansulfonate, nitrate, benzoat i soli sa aminokiselinama kao što je glutarna kiselina.

[0029]Pojam "delotvorna količina" ili "terapijski delotvorna količina" se odnosi na količinu ovde opisanog jedinjenja koja će da izazove željeni ili korisni biološki ili medicinski odgovor subjekta npr., dozu od između 0,01 - 100 mg/kg telesne težine/dan.

3. Jedinjenja

[0030] U drugom izvođenju, ovde dato je jedinjenje iz Formule II:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu promenljive jesu kao što je opisano gore u prvom izvođenju.

[0031] U trećem izvođenju, R<2>je (C1-C4)alkil u jedinjenjima iz Formule I ili II.

[0032] U drugom izvođenju, datom ovde je jedinjenje iz Formule III:

1

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu su promenljive kako je opisano gore u tekstu u prvom, drugom, ili trećem izvođenju pronalaska.

[0033] U petom izvođenju, prsten A u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je fenil, piridil, pirazolil, ciklopropil, ciklobutil, azetidinil, ili piperidinil, od kojih je svaki opciono i nezavisno supstituisan sa jednom ili dve R<5>, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće ili četvrto izvođenje. Alternativno, kao deo petog izvođenja, prsten A u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je triazolil, piralidinil, diazepanil, ili piperazinil, od koji je svaki opciono i nezavisno supstituisan sa jednom ili dve R<5>, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće ili četvrto izvođenje.

[0034]U šestom izvođenju, R<5>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkoksi, halo, fenil, -NHC(O)OR<a>, -C(O)R<b>, S(O)2R<c>, S(O)R<c>, -C(O)OR<d>, -C(O)NR<e>R<f>, -NHC(O)R<d>, -OR<e>, -O(C1-C4)alkilOR<e>, -NR<e>R<f>, 4-do 6-člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu pomenuti fenil za R<5>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, pomenuti (C1-C4)alkil za R<5>je opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz -OR<h>, -NR<j>R<k>, fenila, i 5- do 6-članog heteroarila, pomenuti 4- do 6-člani heteroaril i 4 do 7-člani heterociklil su svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<m>, i pri čemu pomenuti fenil i 5- do 6-člani heteroaril opcionih supstituenata na spisku za (C1-C4)alkil u R<5>jesu svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>; R<a>je (C1-C4)alkil opciono supstituisan fenilom; R<b>je (C1-C4)alkil, fenil, 5- do 6-člani heteroaril ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu je pomenuti (C1-C4)alkil opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz fenila, -OR<h>, i -NR<j>R<k>, pri čemu pomenuti fenil, 6-člani heteroaril, i 4- do 7-člani heterociklil jesu svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, i pri čemu je pomenuti 4- do 7-člani heterociklil dodatno opciono supstituisan sa =O; svako R<c>je nezavisno fenil ili (C1-C4)alkil; svako R<d>je vodonik ili (C1-C4)alkil; svako R<e>je nezavisno vodonik ili (C1-C4)alkil opciono supstituisan sa OR<h>; svako R<f>je nezavisno vodonik, (C1-C4)alkil, fenil 3- do 4-člani cikloalkil, 4- do 6-člani heteroaril, ili 5- do 6-člani heterociklil, pri čemu pomenuti fenil, 3- do 4-člani cikloalkil, 4- do 6-člani heteroaril, i 5-do 6-člani heterociklil su svaki opciono i nezavisno supstituisani sa R<g>; svako R<g>je nezavisno (C1-C4)alkil,halo(C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, halo(C1-C4)alkoksi, ili halo; svako R<h>je vodonik, (C1-C4)alkil, ili -(C1-C4)alkilfenil; svako R<j>je nezavisno vodonik ili (C1-C4)alkil; svako R<k>je nezavisno vodonik, (C1-C4)alkil, ili 3- do 4-člani cikloalkil; i svako R<m>je (C1-C4)alkil, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto ili peto izvođenje.

[0035] U sedmom izvođenju, R<5>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je (C1-C4)alkil, halo(C1C4)alkil, halo, fenil, -NHC(O)OR<a>, -C(O)R<b>, S(O)2R<c>, -C(O)OR<d>, - C(O)NR<e>R<f>, -NHC(O)R<d>, -O(C1-C4)alkilOR<e>, -NR<e>R<f>, 4- do 6-člani heteroaril, ili 5- do 6-člani heterociklil, pri čemu je pomenuti (C1-C4)alkil za R<5>opciono supstituisan sa - OR<h>, fenilom, ili 5- do 6-članim heteroarilom, pomenuti 4- do 6-člani heteroaril i 5- do 6-člani heterociklil su svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<m>, i pri čemu su pomenuti fenili i 5-do 6-člani heteroaril od opcionih supstituenata na spisku za (C1-C4)alkil za R<5>svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto, peto ili šesto izvođenje pronalaska.

[0036] U osmom izvođenju, R<5>u jedinjenjima Formule I, II, ili III je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, halo, fenil, -NHC(O)OR<a>, -C(O)R<b>, S(O)2R<c>, -C(O)OR<d>, - C(O)NR<e>R<f>, -NHC(O)R<d>, ili -O(C1-C4)alkilOR<e>, -NR<e>R<f>, morfolinil, piperazinil, ili pirazolil, pri čemu su pomenuti morfolinil, piperazinil, i pirazolil svaki opciono supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<m>, pomenuti (C1-C4)alkil za R<5>je opciono supstituisan sa -OR<h>, fenilom, pirazolilom, pirimidinilom, ili piridinilom, i pri čemu su pomenuti fenil, pirazolil, pirimidinil, i piridinil od opcionih supstituenata u spisku za (C1-C4)alkil za R<5>svaki opciono i nezavisno supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano iznad za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, ili sedmo izvođenje pronalaska.

[0037] U devetom izvođenju, svako R<f>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je nezavisno vodonik, (C1-C4)alkil, fenil pirazolil, piridinil, tetrahidropiranil, piperidinil, pri čemu su pomenuti fenil pirazolil, piridinil, tetrahidropiranil, i piperidinil svaki opciono i nezavisno supstituisani sa (C1-C4)alkilom, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore iznad za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, ili osmo izvođenje.

[0038] U destom izvođenju, svako R<g>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je nezavisno (C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, ili halo, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, osmo, ili deveto izvođenje.

[0039] U jedanaestom izvođenju, R<b>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je (C1-C4)alkil, fenil, 5- do 6-člani heteroaril ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu su pomenuti fenil i 5-do 6-člani heteroaril za R<b>svaki opciono i nezavisno supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz halo i (C1-C4)alkoksi, pri čemu pomenuti 4- do 7- člani heterociklil za R<b>jeste opciono supstituisan sa =O, i pri čemu je pomenuti (C1-C4)alkil za R<b>opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz fenila, -OR<h>, i - NR<j>R<k>, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, osmo, deveto, ili deseto izvođenje.

[0040] U dvanaestom izvođenju, svako R<k>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je nezavisno vodonik ili (C1-C4)alkil, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, osmo, deveto, deseto, ili jedanaesto izvođenje.

[0041] U trinaestom izvođenju, R<b>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je (C1-C4)alkil, fenil, piridinil, pirazolil, pirimidinil, ili piperidinil, pri čemu su pomenuti fenil, piridinil, pirazolil, i pirimidinil za R<b>svaki opciono i nezavisno supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz halo i (C1-C4)alkoksi, pri čemu pomenuti (C1-C4)alkil za R<b>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz fenila, OH, i NMe2, i pri čemu je pomenuti piperidinil za R<b>opciono supstituisan sa =O, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, osmo, deveto, deseto, jedanaesto, ili dvanaesto izvođenje.

[0042] U četrnaestom izvođenju, svako R<3>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je vodonik, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, osmo, ili deveto, deseto, jedanaesto, dvanaesto, ili trinaesto izvođenje

[0043]U petnaestom izvođenju, R<4>u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je fenil ili -NHC(O)OR<a>, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore u tekstu za prvo, drugo, treće, četvrto, peto. šesto, sedmo, osmo, deveto, deseto, jedanaesto, dvanaesto, trinaesto, ili četrnaesto izvođenje.

[0044] U šesnaestom izvođenju, X u jedinjenjima iz Formule I, II, ili III je veza ili CH2, pri čemu su preostale promenljive kao što je opisano gore za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, osmo, deveto, desto, jedanaesto, dvanaesto, ili trinaesto izvođenje.

[0045] Ovde su takođe obezbeđene farmaceutske supstance obuhvata 1) jedinjenje sa Formulom I:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu promenljive su kao što je opisano gore u tekstu za prvo, drugo, treće, četvrto, peto, šesto, sedmo, osmo, deveto, deseto ili jedanaesto izvođenje; i 2) farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0046] Jedinjenja koja imaju Formulu I su detaljnije opisana u Primeru i uključena su ovaj

1

opis. Njihove farmaceutski prihvatljive soli kao i neutralni oblici su uključeni.

4. Upotrebe, formulacija i isporuka leka pacijentu

[0047] Jedinjenja i supstance opisani ovde su generalno korisni za modulisanje aktivnosti TREX1. U nekim varijantnim rešenjima, jedinjenja i farmaceutske supstance opisani ovde će inhibirati aktivnosti TREX1.

[0048] U nekim izvođenjima pronalaska, jedinjenja i farmaceutske supstance opisani ovde su korisni za lečenje poremećaja povezanog sa TREX1 funkcijom. Dakle, ovde su data jedinjenja za upotrebu za lečenje poremećaja povezanog sa TREX1 funkcijom, sa isporukom subjektu kom su potrebna, terapijski delotvorne količine ovde opisanog jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske supstance koja obuhvata opisano jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Ovde je data i upotreba ovde datog jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske supstance koja obuhvata opisano jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za proizvodnju leka za lečenje poremećaja povezanog sa TREX1 funkcijom. Ovde je dato i opisano jedinjenje, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska supstanca koja obuhvata opisano jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu za lečenje poremećaja povezanog sa TREX1 funkcijom.

[0049] U nekim varijantnim rešenjima, jedinjenja i farmaceutske supstance opisani ovde su korisni za lečenje kancera.

[0050]U nekim varijantnim rešenjima, kancer lečen jedinjenjima i ovde opisanim farmaceutskim supstancama je izabran iz kancera debelog kancera, kancera želuca, kancera tiroide, kancera pluća, leukemije, kancera pankreasa, melanoma, multiplog melanoma, kancera mozga, kancera centralnog nervnog sistema (CNS), kancera bubrega, kancera prostate, kancera jajnika, leukemije, i kancera dojke.

[0051] U nekim varijantnim rešenjima, kancer je lečen jedinjenjima i farmaceutskim supstancama opisanim ovde je izabran iz kancera pluća, kancera dojke, kancera pankreasa, kancera debelog creva i rektuma, i melanoma.

[0052]U izvesnim varijantnim rešenjima, farmaceutska supstanca opisana ovde se formuliše za isporuku pacijentu kom je potrebna takva supstanca. Ovde opisane farmaceutske supstance mogu da budu isporučene oralno, parenteralno, inhalacijom spreja, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili preko ugrađenog rezervoara. Pojam "parenteralno" kako se ovde koristi uključuje tehnike potkožne, intravenozne, intramuskularne, intraartikularne, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intrahepatične, intralezione i intrakranijalne injekcije ili infuzije. U nekim izvođenjima, supstance se isporučuju oralno, intraperitonealno ili intravenozno. Sterlini injektabilni oblici farmaceutskih supstanci opisanih ovde mogu biti vodenasta ili uljastu suspenziju. Ove suspenzije mogu biti formulisane prema tehnikama poznatim u ovoj oblasti korišćenjem agensa za raspršivanje ili vlaženje i suspenzione agense.

[0053] U nekim varijantnim rešenjima, farmaceutske supstance se isporučuju oralno.

[0054]Specifičini režim doze i lečenja za svakog specifičnog pacijenta će zavisiti od raznoraznih činilaca, uključujući aktivnost specifičnog korišćenog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, režim ishrane, vreme isporuke, brzinu izlučivanja, kombinaciju leka, i prosudu potrebne terapije za lečenje od strane lekara i ozbiljnost specifične bolesti koja se leči. Količina ovde opisanog jedinjenja u toj supstanci će takođe zavisiti od specifičnog jedinjenja u farmaceutskoj supstanci.

PRIMERI

Hemijska sinteza

[0055]Reprezentativni primeri u nastavku su predviđeni da pomognu da se ilustruje ovaj opis, i nisu predviđeni da, niti ih treba tumačiti, kao ograničenje obima pronalaska.

Opšti postupci sinteze

[0056]

1

2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid

[0057]

Korak 1: Sinteza metil 3-(3-bromo-5-metilfenil)-5-(2-metoksi-2-oksoetil)-2-metil-2,5-dihidro-1,2,4- oksadiazol-5-karboksilata

[0058]

[0059]U mešani rastvor SM (5,16 g, 26,341 mmol, 2 ekviv), N-metilhidroksilamin hidrohlorida (1,10 g, 13,170 mmol, 1,00 equiv) u H2O (25,00 mL), EtOH (25,00 mL) je dodato Na2CO3(0,837 g, 7,902 mmol, 0,6 ekviv) u delovima na sobnoj temperaturi. Rastvor dobijen kao rezultat je mešan tokom 2 sata na 80 °C. Sve dok reakciona smeša nije ohlađena do sobne temperature, 1,4-dimetil but-2-inedioat (2,06 g, 14,488 mmol, 1,1 ekviv) je dodat ukapavanjem. Zatim je reakciona smeša mešana tokom 0,5 sata na sobnoj temperaturi. Rastvor dobijen kao rezultat je ekstrahovan sa 3x30 mL etil acetata i organski slojevi su kombinovano oprani sa slavnim rastvorom i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je nanet na silika gel kolonu sa etil acetatom/petrolej etrom (1:5).

1

Ovo je kao rezultat dalo 1,3 g međuproizvoda A1 (25% prinosa)kao svetložutog ulja. ESI-MS m/z = 385.0 [M+H]+. Izračunato MW: 384,0.1H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 7.67 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.49 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.45 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 3.19 (s, 3H), 3.07 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 2.38 (d, J = 0.8 Hz, 3H).

[0060]Sledeći međuproizvodi su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku iznad zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

1

Tabela 1

1 (nastavak)

1 (nastavak)

Korak 2: Sinteza metila 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata B1

[0061]

[0062] U 100-mL laboratorijsku bocu okruglog dna, je stavljen metil 3-(3-bromo-5-metilfenil)-5-(2-metoksi-2-oksoetil)- 2-metil-2,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-5-karboksilat (1,00 g, 2,596 mmol, 1,00 ekviv), ksilen (20,00 mL). Rastvor dobijen kao rezultat je mešana tokom 5 sati na 145 °C. Mešavina dobijena kao rezultat je ohlađena do sobne temperature. Čvrste supstance su prikupljene filtracijom oprane sa heksanom. Čvrsta supstanca je osušena pod smanjenim pritiskom. Ovo je kao rezultat dalo 210 mg metil 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata (22% prinos) kao bele čvrste supstance. ESI-MS m/z = 353.0 [M+H]<+>. Izračunato MW: 352.0

2

(nastavak)

[0063]Sledeći međuproizvodi su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku iznad zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

Tabela 2

(nastavak)

Korak 3: Sinteza 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamida (Primer 1)

[0064]

[0065]U 8-mL zaptivenu epruvetu, je postavljen metil 2-(3-bromo-5-metilfenil)-5-

2

hidroksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilat (100,00 mg, 0,283 mmol, 1,00 ekviv), THF (2,50 mL), 1,2-oksazol-4-amin (71,42 mg, 0,849 mmol, 3,00 ekviv). Posle ovog sledi dodavanje rastvora iPrMgCl (2M, 0,64 mL, 4,50 ekviv) ukapavanjem uz mešanje na -70 stepeni C. Rastvor dobijen kao rezultat je mešan tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija je zatim ohlađena dodavanjem 2 mL zasićenog NH4Cl (akv.). Vrednost pH tog rastvora je podešena na 3 sa HCl (4 M). Rastvor dobijen kao rezultat je ekstrahovan sa 3x5 mL dihlorometana i organski slojevi su kombinovani i koncentrovani pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen pripremnom hromatografijom u koloni (Prep-HPLC) (CH3CN/H2O/FA). Ovo je kao rezultat dalo 32,9 mg 2-(3-bromo-5-metilfenil)- -5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4- karboksamid (28% prinos) kao bele čvrste supstance. ESI-MS m/z = 405.0 [M+H]<+>. Izračunato MW: 404.0.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.82 (s, 1H), 10.95 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 3.30 (s, 3H), 2.39 (s, 3H).

[0066] Sledeći primeri su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku iznad zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

Tabela 3

2 (nastavak)

Sinteza 5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-fenil-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamida (Primer 8).

[0067]

[0068] Metil 5-hidroksi-1-metil-6-okso-2-fenil-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilat (200 mg, 0,77 mmol, 1 ekviv) i izoksazol-4-amin (0,096 g, 1,15 mmol, 1,5 ekviv) su rastvoreni u toluenu (1 mL) i ta mešavina je ohlađena do 0 °C. U ovo je 2M trimetilaluminijuma u toluenu (0,768 ml, 1,53 mmol, 2,0 ekviv) je dodato ukapavanjem na 0 °C. Reakciona smeša je zatim zagrejana na 100 °C tokom 2 sata i zatim je ohlađena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (0,2 ml) i u to je dodat etil acetat (10 ml). Reakciona smeša je zatim osušena iznad anhidrovane Na2SO4i isfiltrirana. Čvrsta supstanca je oprana sa etil acetatom (3 x 10 ml) i kombinovani organski sloj je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen reverzno-faznom HPLC da bi se dobio 5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-fenil-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid, 8 (25 mg, 15%). ESI-MS m/z = 313.2 [M+H]+. Izračunato MW: 312.29.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.13 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 7.42-7.50 (m, 5H), 3.22 (s, 3H).

2

Šema: Sinteza 2-hloro-N-(izoksazol-4-il)-5-metoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamida (C)

Korak 1: Sinteza 1,4-dietil 2-metoksi-3-oksobutandioata (1)

[0069]

[0070] U 1000-mL laboratorijsku bocu o rugog dna sa 3 grla prečišćenu i održavanu sa inertnom atmosferom azota, je stavljen etanol (600,0 mL), natrijum etanolat (31,7 g, 0,470 mmol, 1,10 ekviv), etil oksalat (68,00 g, 465,6 mmol, 1,10 ekviv) je dodato na sobnoj temperaturi. Posle ovog je usledilo dodavanje etil 2-metoksiacetata (50,00 g, 423,3 mmol, 1,00 ekviv) ukapavanjem uz mešanje na sobnoj temperaturi. Rastvor dobijen kao rezultat je mešan tokom 1 sat tokom noći na 35°C. Mešavina dobijena kao rezultat je koncentrovana pod vakumom da bi se uklonila većina etanola. pH vrednost rastvora je podešena do 3 sa vodonik hloridom (1 mol/L) na 0 °C. Rastvor dobijen kao rezultat je ekstrahovan sa 4x500 mL etil acetata osušen iznad anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom. Ovo je dalo kao rezultat 90 g (sirovog) 1,4-dietil 2-metoksi-3-oksobutandioata (1) kao braon ulja.

Korak 2: Sinteza etil 2-metoksi-2-[(4E)-1-metil-2,5-dioksoimidazolidin-4-iliden]acetata (2)

2

[0072] U 2000-mL laboratorijsku bocu okruglog dna je stavljeno 1,4-dietil 2-metoksi-3-oksobutandioata (1) (90,00 g, 412,5 mmol, 1,00 ekviv), metiluree (30,60 g, 412,5 mmol, 1,00 ekviv), sirćetne kiseline (1200,0 mL), vodonik hlorida (400,0 mL, gasa, 4 mol u dioksanu). Rastvor dobijen kao rezultat je mešan tokom 3 sata na 105 °C. Mešavina dobijena kao rezultat je koncentrovana pod vakumom. Mešavina dobijena kao rezultat je oprana sa 1 x500 mL heksana. Ovo je kao rezultat dalo 90 g (sirovog) etil 2-metoksi-2-[(4E)-1-metil-2,5-dioksoimidazolidin-4-iliden]acetata (2) kao braon čvrste supstance. 1H NMR (300 MHz, hloroform- d) δ 8.75 (s, 1H), 7.47 (s, 0.4H), 5.09 (s, 2H), 4.51-4.30 (m, 3H), 3.85 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.12 (s, 3H), 3.07 (s, 1H), 2.14 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 1.45-1.42 (m, 2H), 1.42-1.37 (m, 3H).

Korak 3. Sinteza 2-hidroksi-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilne kiseline (3)

[0073]

ora

[0074] U 2000-mL laboratorijsku bocu okruglog dna je stavljen etil 2-metoksi-2-[(4E)-1-metil-2,5-dioksoimidazolidin-4-iliden]acetat (2) (80,00 g, 350,6 mmol, 1,00 ekviv), kalijum hidroksid (1M u vodi) (1400,0 mL). Rastvor dobijen kao rezultat je mešan tokom 3 sata na 105 °C. Mešavina dobijena kao rezultat je ohlađena do 0 °C kupkom vode/leda. pH vrednost rastvora je podešena do 3 sa vodonik hloridom (12 mol/L) na 0 °C, čvrste

2

supstance su prikupljene filtracijom i istaložene i osušene u vakuumu. Ovo je dalo kao rezultat 40 g 2-hidroksi-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilne kiseline (3) (prinos 57%) kao bele čvrste supstance.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.35 (s, 1H), 10.91 (s, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.14 (s, 3H).

Korak 4. Sinteza etil 2-hidroksi-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilata (4)

[0075]

[0076] U 1000-mL laboratorijsku bocu okruglog dna sa tri grla ispranu i održavanu sa inertnom atmosferom argona, je stavljen 2-hidroksi-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilna kiselina (3) (20 g, 0,10 mmol, 1,00 ekviv), etanol (400,0 mL). Usledilo je dodavanje acetil hlorida (117,7 g, 1,500 mmol, 15,00 ekviv) ukapavanjem uz mešanje na 0 °C. Rastvor dobijen kao rezultat je zagrejan do refluksa tokom noći. Reakciona mešavina je ohlađena da vodeno/ledenom kupkom. Čvrste supstance su prikupljene filtracijom. Ovo je kao rezultat dalo 16 g etil 2-hidroksi-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilata (4) (prinos: 70%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.08 (s, 1H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 3H).

Korak 5. Sinteza etil 2-hloro-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilata (5)

[0077]

[0078] U 1-L bocu okruglog dna sa tri grla ispranu i održavanu sa inertnom atmosferom argona, je stavljen 2-hidroksi-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilat(4) (16,0 g, 70,1 mmol,1,00 ekviv), dimetil-anilin (1,20 g, 98,2 mmol, 1,40 ekviv), fosforil trihlorid

2

(320,0 mL). Rastvor dobijen kao rezultat je mešan tokom 1 noći na 100 °C. Mešavina dobijena kao rezultat je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je nanet na silika gel kolonu sa etil acetatom/petrolej etrom (1/10 -1/4). Ovo je dalo kao rezultat 13,3 g etil 2-hloro-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilat (5) (prinos 77,0%) kao čvrste supstance žute boje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.54 (s, 3H), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3H).

Korak 6. Sinteza 2-hloro-5-metoksi-1-metil-N-(1, 2-oksazol-4-il)-6-oksopirimidin-4-karboksamida (6)

[0079]

1 equiv - 1 ekviv

(2 eq) Mircrowave irradiation, toluene - (2ek) mikrotalasno zračenje, toluen

Step 6=korak 6

[0080] U mešani rastvor etil 2-hloro-5-metoksi-1-metil-6-oksopirimidin-4-karboksilata (5) (1,00 g, 4,05 mmol, 1,00 ekviv) i 1,2-oksazol-4-amina (340,9 mg, 4,050 mmol, 1,00 ekviv) u toluenu (15,0 mL) je dodato trimetilaluminijum (2 mol u toluenu) (4,1 mL, 8,10 mmol, 2,00 ekviv) na sobnoj temperaturi pod atmosferom argona. Rastvor dobijen kao rezultat je mešan sa mikrotalasnim zračenjem tokom 15 min na 80 °C. Reakciona smeša je ohlađena sa vodom/ledom na 0 °C. Rastvor dobijen kao rezultat je ekstrahovan sa 3x40 mL etil acetata, kombinovani organski slojevi su oprani sa slanim rastvorom (1x30 mL), osušeni iznad anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je nanet na silika gel kolonu sa etil acetatom/petrolej etrom (1/ 10 -1/ 1). Ovo je dalo kao rezultat 650 mg 2-hloro-5-metoksi-1-metil- N-(1, 2-oksazol-4-il)-6-oksopirimidin-4-karboksamida (6) (prinos 53,0%) kao čvrsta supstanca svetložute boje. ESI-MS m/z = 285.2 [M+H]<+>. Izračunato MW: 284.2<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6 ) δ 10.84 (s, 1H), 9.28 (s, 1H), 8.78

[0081] Sledeći primeri i međuproizvodi su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku, iznad, zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

Tabela 4

(nastavak)

[0082]Sledeći međuproizvod je sintetisan korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku iznad zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

1

Tabela 5

Sinteza 2-(3-bromo-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamida (Primer 15).

[0083]

[0084]U 40 mL bočicu je dodat 2-(3-bromo-2-(2-((tert-butildimetilsilil)oksi) etoksi)fenil)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid (300 mg, 0,531 mmol, 1,0 ekviv) i THF (6,0 mL) na sobnoj temperaturi. U gornju mešavinu je dodato TBAF(1M)/CH3COOH =1:1 (1,20 mL, 2,0 ekviv) ukapavanjem tokom 2 min na 0°C. Mešavina dobijena kao rezultat je mešana tokom dodatnih 5 sati na sobnoj temperaturi. Mešavina dobijena kao rezultat je ekstrahovana sa etil acetatom (1 x12 mL). Vodenasti sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (3 x10). Kombinovana organska faza je oprana sa slanim rastvorom (2 x 7 mL), osušena iznad anhidrovanog natrijum sulfata. Posle filtriranja, filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Sirovi proizvod (300mg) je prečišćen pripremnom tečnom hromatogravijom u koloni (Prep-HPLC) (acetonitril/mravlja kiselina/ voda) da bi se dobilo 70 mg 2-(3-bromo-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid, 15, u 29% prinosa kao bela čvrsta supstanca. ESI-MS m/z = 451.0 [M+H]<+>.

2

Izračunato MW: 450.0.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.87 (s, 1H), 10.99 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.63 (t, J =5.4 Hz, 1H), 4.01-3.97 (m, 1H), 3.76-3.70 (m, 1H), 3.52-3.39 (m, 2H), 3.23 (s, 3H).

[0085]Sledeći primeri i međuproizvodi su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku iznad zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

Tabela 6

(nastavak)

4 (nastavak)

(nastavak)

(nastavak)

(nastavak)

(nastavak)

(nastavak)

4 (nastavak)

(nastavak)

(nastavak)

Sinteza tert-butil-3-(5-etoksi-4-(izoksazol-4-ilkarbamoil)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-2-il)piperidin-1-karboksilata (Izomer A1):

[0086]

4

Korak-1: Etil 2-(1-(tert-butoksikarbonil)-1,2,5,6-tetrahidropiridin-3-il)-5-etoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilat:

[0087] Mešavina etil 2-hloro-5-etoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata (2 g, 7,67 mmol), tert- butil 5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-3,6-dihidropiridin-1(2H)-karboksilata (2,96 g, 9,59 mmol) i natrijum karbonata (1,62 g, 15,34 mmol) u rastvoru dioksana/vode (4:1, 50 mL) je degazirana tokom 20 minuta sa gasom argon. PdCl2(dppf) (0,561 g, 0,76 mmol) je dodato i degaziranje je nastavljeno još 10 minuta. Reakciona smeša je zagrejana na 90 °C tokom 4 sata. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je stavljena u vodu (100 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 50 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa slanim rastvorom (30 mL), osušen iznad Na2SO4, i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni da se dobije jedinjenje iz naslova (2,57 g, 82%) kao čvrsta supstanca. LCMS: izračunato 408.3; ESI-MS m/z = 408.61 [M+H]<+ 1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.23-1.31 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 2.25-2.40 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.45-3.50 (m, 2H), 4.05-4.10 (m, 2H), 4.16 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.31 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 6.26 (bs, 1H).

Korak-2: Etil-2-(1-(tert-butoksikarbonil)piperidin-3-il)-5-etoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata:

[0088] U mešavinu etil 2-(1-(tert-butoksikarbonil)-1,2,5,6-tetrahidropiridin-3-il)-5-etoksi-1-metil-6-okso-1,6-di-hidropirimidin-4-karboksilata (2,57 g, 6,30 mmol) je rastvoreno i mešano u rastvoru metanol:etil acetata (1:3, 54 mL) je dodato 10% Pd/C (0,67 g, sa 50% vlažnosti). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperature pod atmosferom vodonika tokom 3,5 sata. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je filtrirana kroz celitnu podlogu i oprana sa etil acetatom (2 x 50 mL). Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Dobijeni sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2,35 g, 91%). LCMS: izračunato 409.3, ESI-MS m/z = 410.4 [M+H]<+>

Korak-3: 2-(1-(tert-butoksikarbonil)piperidin-3-il)-5-etoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilna kiselina:

[0089] U mešani rastvor etil-2-(1-(tert-butoksikarbonil)piperidin-3-il)-5-etoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata (1,9 g, 4,64 mmol) u smeši metanola:THF:HzO (1:1:1, 30 mL) je dodato NaOH (0,222 g, 5,56 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša dobijena kao rezultat je zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Posle završetka reakcije, reakcija je koncentrovana pod vakuumom. Reakciona smeša je rastvorena u vodi (10 mL) i acidifikovana sa 1N HCl (pH-6). Proizvod je ekstrahovan sa 10% metanola u dihlorometanu (2 x 30 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa slanim rastvorom (30 mL) i isparavan pod vakuumom da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova (1,67g, 94%) koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS: izračunato 381.3; ESI-MS m/z = 382.5 [M+H]<+>

Korak-4: tert-butil-3-(5-etoksi-4-(izoksazol-4-ilkarbamoil)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-2-il)piperidin- 1-karboksilat:

[0090]U mešani rastvor 2-(1-(tert-butoksikarbonil)piperidin-3-il)-5-etoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilne kiseline (1,67 g, 4,37 mmol) u suvom DMF (16 mL) je dodat HATU (2,49 g, 6,56 mmol) na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Zatim su dodati izoksazol-4-amin (0,441 g, 5,25 mmol) u DMF (0,5 mL) i DIPEA (1,5 mL, 8,75 mmol) na sobnoj temperaturi i reakciona smeša je mešana tokom 3 sata. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je razblažena sa vodom (20 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 30 mL). Kombinovani organski sloj je

4

osušen iznad anhidrovane Na2SO4, i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na kombinovanoj svetlećoj (Kombifleš) koloni da bi dao jedinjenje iz naslova (1,67 g, 85%) kao racemijska mešavina. Hiralni rastvor racemijskog čistog jedinjenja (1,2 g) je izveden korišćenjem hiralne pripremne HPLC da bi se dobilo 500 mg svakog enantiomera. LCMS: Izračunato 447.3; ESI-MS m/z = 448.60 [M+H]<+>hiralna HPLC: CHIRALPAK AD-H; 30% metanol u tečnom COz 0,1% DEA. FR-1 (Izomer-A1): RT= 7,66 min; FR-2 (Izomer-A2): RT= 8,81 min; A1:<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.21-1.25 (m, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.46-1.57 (m, 2H), 1.71-1.74 (m, 2H), 2.02-2.04 (m, 1H), 2.76-2.98 (m, 2H), 2.99-3.15 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.85-4.15 (m, 1H), 4.10-4.15 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 10.56 (s, 1H). A2:

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.21-1.29 (m, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.46-1.57 (m, 2H), 1.71-1.74 (m, 2H), 2.02-2.04 (m, 1H), 2.78-2.98 (m, 2H), 2.99-3.15 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.85-4.15 (m, 1H), 4.10-4.15 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 10.57 (s, 1H).

Sinteza od 1-((2-((R)-1-(3,4-dihlorobenzoil)piperidin-3-il)-4-(izoksazol-4-ilkarbamoil)-1-metil-6-okso-1,6-di-hidropirimidin-5-il)oksi)etil etil karbonata.

(PRIMER 131)

[0091]

Step - Korak; in Dioxane, DCM, Methanol – u dioksanu, DCM, metanolu; to RT 3h – do RT 3 sata; active isomer- aktivni izomer; Example - Primer

Korak-1: (R)-5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(piperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid hidrohloridna so:

[0092]U mešani rastvor tert-butil (R)-3-(5-etoksi-4-(izoksazol-4-ilkarbamoil)-1-metil-6-

4

okso-1,6-dihidropirimidin-2-il)piperidin-1-karboksilata (0,20 g, 0,44 mmol) u mešavini dihlorometana (1,32 mL) i metanola (0,66 mL) je dodato 4M HCl u dioksanu (1 mL) ukapavanjem na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sat i zagrejana do 40 °C tokom 10 min. Reakciona smeša je koncentrovana do suvoće i azeotropovana dvaput sa metanolom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0,17 g, 99%) kao čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS: izračunato 347.3, ESI-MS m/z = 348.48 [M+H]+

Korak-2: (R)-2-(1-(3,4-dihlorobenzoil)piperidin-3-il)-5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid:

[0093]U mešani rastvor 3,4-dihlorobenzojeve kiseline (0,101 g, 0,53 mmol) u suvom DMF (16 mL) je dodat HATU (0,252 g, 0,66 mmol) na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Zatim su dodati (R)-5-etoksi-N-(izoksazol- 4-il)-1-metil-6-okso-2-(piperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid hidrohloridna so (0,170 g, 0,44 mmol) i DIPEA (0,25 mL, 1,33 mmol) na sobnoj temperaturi i reakciona smeša je mešana tokom 3 sata. Posle završetka te reakcije, smeša je razblažena sa vodom (15 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 20 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa hladnim zasićenim natrijum bikarbonatom (20 mL), osušen iznad anhidrovane Na2SO4i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0,21 g, 89%) kao čvrsta supstanca. LCMS: Izračunato 519.3, ESI-MS m/z = 520.27 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.18-1.32 (m, 3H), 1.55-1.70 (m, 2H), 1.72-1.85 (m, 2H), 2.07-2.10 (m, 1H), 3.15-3.25 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.66-3.70 (m, 1H), 4.07-4.12 (m, 2H), 4.47-4.49 (m, 1H), 7.40-7.42(m, 1H), 7.70-7.73 (m, 2H), 8.74 (s, 1H,), 9.27 (s, 1H), 10.52 (s, 1H).

Korak-3: (R)-2-(1-(3,4-dihlorobenzoil)piperidin-3-il)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid:

[0094] U mešani rastvor (R)-2-(1-(3,4-dihlorobenzoil)piperidin-3-il)-5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso- 1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid (0,608 g, 1,16 mmol) je rastvoren u dihlorometanu (36 mL). Rastvor dobijen kao rezultat je ohlađen do 0 °C i 1M BBr3u dihlorometanu (4,67 mL, 4,67 mmol) je dodato ukapavanjem. Reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature i mešana tokom 5 sati. Posle završetka, reakciona mešavina je koncentrovana, i azeotropovana sa dihlorometanom (2 x 6 mL). Ostatak je

4

ohlađen do 0 °C i metanol (5 mL) je dodat polako. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom do suvoće. Ostatak je azeotropovan sa metanolom (2 x 6 mL) da bi se dobilo sirovo jedinjenje. Sirovo jedinjenje je raspoređeno na celit i prečišćeno u hromatografskom stubu reverznom fazom korišćenjem acetonitrila i 0,1% mravlje kiseline u vodi da bi se dobilo jedinjenje iz Primera 131 (0,246 g, 42%). LCMS: Izračunato 491.3, ESI-MS m/z = 492.3 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.44-1.62 (m, 2H), 1.80-1.95 (m, 2H), 2.07-2.10 (m, 1H), 3.15-3.25 (m, 2H), 3.57 (s, 3H), 3.60-3.70 (m, 1H), 4.34-4.52 (m, 1H), 7.40-7.42(m, 1H), 7.70-7.74 (m, 2H), 8.84-8.90 (m, 1H,), 9.30 (s, 1H), 10.42-10.55 (m, 1H), 11.48 (s, 1H).

[0095] Sledeći primeri i međuproizvodi su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku, iznad, zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

Tabela 7

4

4

Sinteza 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamida. (PRIMER 130)

[0096]

Step - Korak; to RT – do RT (sobne temperature); Ethanol – Etanol; xylene – ksilen; magnesium methoxide – magnezijum metoksid; solution in methanol – rastvora u metanolu; water – voda; Example – Primer;

Korak-1: tert-butil 3-cijano-3-metilpiperidin-1-karboksilat:

[0097] U mešani rastvor tert-butil 3-cijanopiperidin-1-karboksilata (5,0 g, 24 mmol) u suvom THF (100 mL) je dodat LiHMDS (30,9 mL, 1M u THF, 30,9 mmol) na -78 °C. Reakciona smeša je mešana na -78 °C tokom 30 min. Zatim je dodat MeI (2,22 mL, 35,7 mmol) na istoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrejana na 90 °C tokom 16 sata. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je stavljena u mešavinu ledeno-hladne vode (100

1

mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 150 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa slanim rastvorom (50 mL), osušen iznad Na2SO4, i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Ostatak dobijen kao rezultat je prečišćen hromatografski na silika gelu da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (3,5 g, 65%)<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.35 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.66-1.70 (m, 1H), 1.78-1.81 (m, 2H), 1.87-2.10 (m, 1H), 2.80 (s, 2H), 3.90-4.20 (m, 2H).

Korak-2: 3-metilpiperidin-3-karbonitril TFA so.

[0098] U mešani rastvor tert-butil 3-cijano-3-metilpiperidin-1-karboksilata (3,5 g, 15,6 mmol) u dihlorometanu (70 mL) je dodat TFA (12,7 mL) ukapavanjem na 0 °C. Mešavina dobijena kao rezultat je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi dala sirovo jedinjenje. Sirovo jedinjenje je triturisano sa dietil etrom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3,0 g, 81%) kao TFA so.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.40 (s, 3H), 1.63-1.69 (m, 2H), 1.76-1.81 (m, 1H), 1.91-2.06 (m, 1H), 2.82-2.89 (m, 1H), 3.01-3.09 (m, 1H), 3.19-3.22 (m, 1H), 3.56-3.59 (m, 1H), 9.20 (bs, 1H).

Korak-3: 1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-karbonitril.

[0099] U mešani rastvor 3, 4-dihloro benzojeve kiseline (2,88 g, 15,1 mmol) u suvom DMF (15 mL) je dodat HATU (7,18 g, 18,9 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. DIPEA (7 mL, 38 mmol) je dodata ukapavanjem posle čega je dodata 3-metilpiperidin-3-karbonitril TFA so (3,0 g, 12,6 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrejana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je razblažena vodom (30 mL) i vodenasti sloj je estrahovan sa etil acetatom (2 x 200 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa slanim rastvorom (50 mL), osušen iznad Na2SO4, i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Ostatak dobijen kao rezultat je prečišćen hromatografijom u koloni da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (2,8 g, 56%). LCMS: Izračunato 296.3, ESI-MS m/z = 297.2 [M+H]<+>.

Korak-4: 1-(3, 4-dihlorobenzoil)-N-hidroksi-3-metilpiperidin-3-karboksimidamid:

[0100] Mešavina 1-(3,4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-karbonitrila (4 g, 13,5 mmol), hidroksilamine hidrohlorida (2,80 g, 40,4 mmol) u etanolu (100 ml) je lagano dodat

2

trietilamin (5,8 ml, 40,4 mmol) na 0 °C. Mešavina dobijena kao rezultat je zagrejana na 70 °C tokom 16 sati, zatim je koncentrovana, razblažena vodom (100 mL) i ekstrahovana sa 10% metanola u dihlorometanu (2 x 150 mL). Kombinovani organski sloj je osušen iznad anhidrovane Na2SO4i koncentrovan pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (5,0 g, 69%) kao čvrsta supstanca. Sirovi proizvod je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS: Izračunato 329.3, ESI-MS m/z = 330.4 [M+H]<+>.

Korak-5: Dimetil 2-((E)-1-(3, 4-dihlorobenzoil)-N’-hidroksi-3-metilpiperidin-3-karboksimidamido) maleat:

[0101]U mešani rastvor 1-(3,4-dihlorobenzoil)-N-hidroksi-3-metilpiperidin-3-karboksimidamida (5,0 g, 15 mmol) u hloroformu (100 mL) je dodat dimetil acetilendikarboksilat (3,32 g, 23,4 mmol) ukapavanjem na 0 °C i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Reakcija je nadgledana pomoću TLC i zatim je koncentrovana da bi dala sirov proizvod koji je prečišćen hromatografski na koloni sa silika gelom da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (2,4 g, 33%) kao čvrsta supstanca. LCMS: Izračunato 471.2, ESI-MS m/z = 472.3 [M+H]<+>.

Korak-6: Metil 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroksi-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4- karboksilat.

[0102]Rastvor dimetil 2-((E)-1-(tert-butoksikarbonil)-N-hidroksipiperidin-3-karboksimidamido) maleata (2,0 g, 4,2 mmol) u ksilenima (15 mL) je zagrejan u mikrotalasnoj na 160 °C tokom 10 min. Reakciona smeša je koncentrovana i triturisana sa dietil etrom i heksanima da bi se dobila čvrsta supstanca. Sirovi ostatak je raspoređen na celit i prečišćen u hromatografskom stubu reverznom fazom korišćenjem acetonitrila i 0,1% mravlje kiseline u vodi da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (0,40 g, 21%). LCMS: LCMS: Izračunato 439.4, ESI-MS m/z = 440.5 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.10 (s, 2H), 1.27 (s, 3H), 1.58-1.75 (m, 3H), 2.00-2.16 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.60-3.64 (m, 1H), 4.01 (bs, 1H), 7.26 (d, J = 8.4, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.67 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 10.36 (s, 1H), 12.40-12.65 (m, 1H).

Korak-7: Metil 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroksi -1- -1-okso-6-dihidropirimidin-1,6- karboksilat.

[0103]Mešavina metil 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroksi-6-okso-1, 6-dihidropyrimidin- 4-karboksilata (0,200 g, 0,454 mmol) je rastvorena u DMSO (50 mL) i ohlađena je do 0 °C. U ovo je dodat rastvor magnezijum metoksida (1,30 mL, 0,908 mmol, 6 do 10% u metanolu) je dodato ukapavanjem na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Reakciona smeša je koncentrovana da bi se uklonio višak metanola. Reakciona smeša je ohlađena do 0 °C i Mel (0,116 mL, 1,81 mmol) je dodat ukapavanjem. Reakciona smešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati, zatim je ohlađena do 10 °C i brzo ugašena sa 1N HCl laganim dodavanjem. Proizvod je ekstrahovan sa etil acetatom (2 x 200 mL). Kombinovani organski sloj je osušen iznad anhidrovane Na2SO4, i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Sirovi ostatak je raspoređen na celit i prečišćen u hromatografskom stubu reverznom fazom korišćenjem acetonitrila i 0,1% mravlje kiseline u vodi da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (0,20 g, 97%). LCMS: Izračunato 453.4, ESI-MS m/z = 454.2 [M+H]+.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.39 (s, 3H), 1.59 (bs, 1H), 1.75 (bs, 1H), 2.01-2.07 (m, 2H), 3.15-3.25 (m, 1H), 3.32-3.52 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.83-3.86 (m, 1H), 3.99-4.02 (m, 1H), 7.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.69 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 10.32 (s, 1H).

Korak-8: metil 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-metoksi-1-metil-6-okso-1, 6-dihidropirimidin-4-karboksilat:

[0104] U mešani rastvor metil2-(1-(3,4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata (0,20 g, 0,44 mmol) u DMF (1 mL) je dodato K2CO3(0,121 g, 0,875 mmol) posle čega je usledilo dodavanje MeI (0,042 mL, 0,660 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrejana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je razblažena vodom (20 mL) i vodenasti sloj je estrahovan sa etil acetatom (2 x 20 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa slanim rastvorom (10 mL), osušen iznad Na2SO4, i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Ostatak dobijen kao rezultat je prečišćen hromatografijom u koloni da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (0,14 g, 67%). LCMS: Izračunato 467.4, ESI-MS m/z = 468.3 [M+H]<+>

Korak-9: 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-metoksi-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4- karboksilna kiselina:

4

[0105] U mešani rastvor metil 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-metoksi-1-metil-6-okso- 1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata (0,140 g, 0,298 mmol) u mešavini metanola:THF: vodi (1:1:1, 6 mL) je dodato NaOH (0,014 g, 0,36 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrejana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Posle završetka reakcije, reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom, razblažena sa ledenohladnom vodom (10 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 10 mL). Kombinovani vodenasti sloj je acidifikovan sa 1 N HCl na 0 °C i ekstrahovan sa 10% metanola u dihlorometanu (2 x 30 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa slanim rastvorom (20 mL), osušen iznad Na2SO4, i koncentrovan pod smanjenim pritiskom da bi omogućio dobijanje sirovog jedinjenja iz naslova. (0,130 g, 96%). LCMS: Izračunato 455.2, ESI-MS m/z = 456.6 [M+H]<+>

Korak-10: 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-N-(izoksazol-4-il)-5-metoksi-1-metil-6-okso-1, 6-dihidropirimidin-4-karboksamid.

[0106] U mešani rastvor 2-(1-(3,4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-metoksi-1-metil-6-okso- 1,6-dihidropirimidin-4-karboksilne kiseline (0,140 g, 0,308 mmol) u suvom DMF (1,4 mL) je dodato HATU (0,176 g, 0,462 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sat i zatim, DIPEA (0,17 mL, 0,99 mmol) i izoksazol-4-amin (0,038 g, 0,46 mmol) su dodati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, zatim je razblažena vodom (20 mL) i estrahovana sa etil acetatom (2 x 20 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa slanim rastvorom (10 mL), osušen iznad anhidrovane Na2SO4, i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Ostatak dobijen kao rezultat je prečišćen hromatografijom u koloni da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (0,135 g, 84%) kao čvrsta supstanca. LCMS: Izračunato 519.2, ESI-MS m/z = 520.4 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.16-1.19 (m, 3H), 1.19-1.23 (m, 2H), 1.42-1.56 (m, 2H), 3.32-3.52 (m, 2H) 3.62 (s, 3H), 4.01-4.02 (m, 1H), 4.03 (s, 3H), 4.70-4.77 (m, 1H), 7.25-7.27 (m, 1H), 7.59-7.67 (m, 2H), 8.74 (s, 1H), 9.27 (s, 1H), 10.58 (bs, 1H).Chiral HPLC: CHIRALPAK AD-H; 30% (MEOH) i tečnosti CO2 0,1% DEA: FR-1 (Izomer-1): RT=9,39; FR-2 (Izomer-2): RT=14,82.

Korak-11: 2-(1-(3, 4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-1, 6-dihidropirimidin-4-karboksamid.

[0107] Mešani rastvor 2-(1-(3,4-dihlorobenzoil)-3-metilpiperidin-3-il)-N-(izoksazol-4-il)-5metoksi-1-metil- 6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid FR-1 (0,030 g, 0,057 mmol) je rastvoren u dihlorometanu (2 mL) je ohlađen do 0 °C i 1M BBr3u dihlorometanu (0,28 mL, 0,29 mmol) je dodat ukapavanjem. Reakciona smeša je zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Posle završetka reakcije i zatim je koncentrovana pod vakuumom. Metanol (1 mL) je dodat i mešan tokom 30 min i isparavan. Ostatak je azeotropovan sa metanolom (2 x 1 ml) da bi se dobilo sirovo jedinjenje (120 mg). Sirovi ostatak je raspoređen na celit i prečišćen u hromatografskom stubu reverznom fazom korišćenjem acetonitrila i 0,1% mravlje kiseline u vodi da bi se dobilo jedinjenje iz Primera 130 (0,015 g, 51%). LCMS: Izračunato 505.2, ESI-MS m/z = 506.3 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.35-1.45 (m, 3H), 1.46-1.60 (m, 2H), 1.70-1.80 (m, 2H), 3.15-3.18 (m, 2H), 3.38-3.44 (m, 2H), 3.61 (s, 3H), 7.22-7.24 (m, 1H), 7.59-7.64 (m, 2H), 8.73 (s, 1H), 9.23 (s, 1H), 10.75 (bs, 1H), 11.58 (bs, 1H).

Sinteza 5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(1-fenetilpiperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4- karboksamida (PRIMER 129)

[0108]

Step – Korak; in Dioxane – u Dioksanu; Dioxane – Dioksan; Example – Primer

Korak-1: 5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(piperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid hidrohloridna so:

[0109] U mešani rastvor tert-butil 3-(5-etoksi-4-(izoksazol-4-ilkarbamoil)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-2-il)piperidin-1-karboksilata [od m sinteza A1] (0,35 g, 0,78 mmol) u mešavini dihlorometana (3 mL) i metanola (0,5 mL) je dodato 4M HCl u dioksanu (1 mL) ukapavanjem na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata i zagrejana do 40 °C tokom 10 min. Reakciona smeša je koncentrovana do suvoće i azeotropovana dvaput sa metanolom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0,290 g, 97%) koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS: Izračunato 347.5; ESI-MS m/z = 348.5 [M+H]<+>

Korak-2: 5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(1-fenetilpiperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid:

[0110] U mešani rastvor 5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(piperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4- karboksamid hidrohloridna so (0,050 g, 0,130 mmol) u DMF (0,5 mL) je dodat trietilamin (0,055 mL, 0,391 mmol) i mešan na sobnoj temperaturi tokom 30 min. (2-bromoetil)benzen (0,024 g, 0,130 mmol) je dodato i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata, zatim je koncentrovana. Dobijeni sirovi proizvod je triturisan sa heksanima (5 mL) i osušen pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0,050 g). Jedinjenje iz naslova je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS: Izračunato 451.3; ESI-MS m/z = 452.4 [M+H]<+>

Korak-3: 5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(1-fenetilpiperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid:

[0111] Mešavina 5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(1-penetilpiperidin-3-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamida (0,05 g, 0,110 mmol) je rastvorena u dihlorometanu (1 mL). Rastvor dobijen kao rezultat je ohlađen do 0°C i 1M BBr3u dihlorometanu (0,22 mL, 0,22 mmol) je dodato ukapavanjem. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 sati, zatim je zasićen natrijum bikarbonat (0,5 mL) je dodato i dodatno razblaženo sa 10% metanola u dihlorometanu. Ostatak je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan do suvoće. Sirovi ostatak je raspoređen na celit i prečišćen u hromatografskom stubu reverznom fazom korišćenjem acetonitrila i 0,1% mravlje kiseline u vodi da bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova (0,01 g, 21%). LCMS: Izračunato 423.4: ESI-MS m/z = 424.5 [M+H]<+ 1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.60-1.80 (m, 4H), 1.85-1.95 (m, 1H), 2.66-2.70 (m, 2H), 2.70-3.02 (m, 6H), 3.48 (s, 3H), 7.18-7.28 (m, 5H), 8.77 (s, 1H,), 9.13 (s, 1H), 10.25 (bs, 1H), 11.50 (bs, 1H).

[0112] Sledeći primeri i međuproizvodi su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku, iznad, zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

Tabela 8

Sinteza 5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(piridin-1-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamida (PRIMER 28)

Korak-1:

[0114] Mešavina C6 (200 mg, 0,769 mmol), piperidin (0,76 ml, 7,69 mmol) i DMSO je zagrevana na 110 °C tokom 1 sata. Napredak reakcije je nadgledan pomoću TLC i ohlađen je do sobne temperature posle potrošnje C6. Reakciona smeša je sipana u mešavinu ledene vode (25 ml) i mešana dobro tokom 15 min. Čvrsti materijal je isfiltriran, opran vodom (3 x 10 ml) i osušen dobro pod vakuumom da bi se dobio čist proizvod kao čvrsta supstanca (172 mg, 72%). ESI-MS m/z = 310.38 [M+H]<+>Izračunato MW: 309.37<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 4.00 (q, 2H), 4.26 (q, 2H), 3.38 (s, 3H), 3.04-3.06 (m, 4H), 1.57-1.62 (m, 6H), 1.20-1.30 (m, 6H).

[0115] Korak -2: U mešani rastvor etil 5-etoksi-1-metil-6-okso-2-(piperidin-1-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksilata (100 mg, 0,32 mmol), izoksazol-4-amin (35,3 mg, 0,42 mmol) u toluenu (1 mL) je dodat 2M trimetil aluminijum u toluenu (0,6 ml, 0,64 mmol) na 0 °C. Reakciona smeša je zagrejana na 80 °C tokom 30 min pod mikrotalasnim zračenjem. Završetak reakcije je potvrđen pomoću TLC i reakciona smeša je sipana u mešavinu ledenohladne vode i ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 10 ml). Organski sloj je opran slanim rastvorom (2 x 10 mL). Kombinovani organski sloj je osušen iznad Na2SO4i isparavan iznad vakuma da bi se dobilo sirovo jedinjenje kao svetlo braon čvrsta supstanca (104 mg).Sirovi materijal je korišćen u sledećem koraku bez ikakvog prečišćavanja. ESI-MS m/z = 348.5 [M+H]<+>Izračunato MW: 347.3

[0116] Korak-3: 5-etoksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(piperidin-1-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid (100 mg, 0,28 mmol) je rastvoreno u dihlorometanu (1 mL). U rastvor dobijen kao razultat, je ohlađeno do 0 °C i 1M BBr3u dihlorometanu (0,5 mL, 0,57 mmol) je dodato ukapavanjem. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakcija je nadgledana pomoću TLC (10% Metanola u dihlorometanu). Posle završetka, rastvor je uklonjen pod vakuumom. Ledenohladna voda je dodata u ostatak, i čvrsta supstanca je filtrirana da bi se dobio sirov proizvod (83 mg). Sirovi proizovd je dalje prečišćen RP-HPLC da bi se dobio Primer 28, 5-hidroksi-N-(izoksazol-4-il)-1-metil-6-okso-2-(piperidin- 1-il)-1,6-dihidropirimidin-4-karboksamid proizvod (10 mg, 0,032 mmol, 11%). ESI-MS m/z = 320.3 [M+H]<+>Izračunato MW: 319.3<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.19 (s, 1H), 10.54 (s, 1H), 9.31(s, 1H), 8.92 (s, 1H), 3.43 (s, 3H), 3.08 (s, 4H), 1.59-1.67 (m, 6H).

[0117] Sledeći primeri i međuproizvodi su sintetisani korišćenjem sličnih uslova kao onih opisanih u koraku iznad zajedno sa odgovarajućim početnim materijalima.

Tabela 9

(nastavak)

1

2

Biohemijski ogledi

1.Utišavanje TREX1 u ćelijama tumora

[0118] Aktivacija cGAS/STING putanje posle senzorisanja citosolne DNK i naknadni tip I IFN proizvodnje može nastati i u ćelijama tumora i u ćelijama prirodnog imunog sistema, naročito dendritskim ćelijama. Da bi se procenilo da li TREX1 redovno proverava proizvodnju tipa I IFN pomoću dobro opisanog, hladnog genetski identičnog (singeničnog) modela tumora koji prolazi odbijanje posredovano imunim sistemom posle aktivacije tipa I IFN pomoću STING agonista, TREX1 je laboratorijskim eksperimentom ispitan u B16F10 ćelijama tumora korišćenjem CRISPR (SL. 1A). Akcumulacija citosoličke DNK preko DNK transfekcije ćelija tumora dalo je kao rezultat oko 5-struko povećanje proizvodnje IFN β proizvodnju pomoću TREX1 laboratorijskih B16F10 ćelija u odnosu na roditeljske ćelije tog tumora, koje pokazuju da je TREX1 smanjio aktivaciju cGAS/STING putanje u B16F10 ćelijama tumora (SL. 1B).

4

2. Rast TREX1 kompetentnih i deficijentnih B16F10 ćelija tumora In Vivo

[0119] Rast TREX1-kompetentnih i deficijentnih B16F10 ćelija tumora in vivo je ocenjen. C57BL/6J miševi su imunizovani potkožno u desnu slabinu sa 300.000 parentalnih ili TREX1 laboratorijskih B16F10 ćelija tumora. Telesne težine su prikupljane dva puta nedeljno, i merenja tumora, dva do tri puta nedeljno, počevši kada su tumori postali merljivi i za preostalo trajanje studije. Tumori kod kojih je TREX1 bio utišan su predstavljeni sa značajno manjim zapreminama od roditeljskih B16F10 tumora (SL.2).

[0120] Tumori su prikupljeni 19. dana, posle završetka studije, i razgrađeni u jednoćelijske suspenzije da bi omogućili kvantifikaciju protočnom citometrijom prepara imunih na infiltriranje tumora. Za TREX1 laboratorijske B16F10 tumore je utvrđeno da ispoljavaju značajno povećanje u ukupnim ćelijama imunog sistema, koje odražavaju povećanje broja CD4 i CD8 T ćelija koje se infiltriraju u tumor kao i plazmacitoidnih dendritskih ćelija (pDCs) (SL. 3). pDCs su poznate po svojoj centralnoj ulozi u indukciji antitumorskih odgovora imunog sistema specifičnih za antigen pri čemu je za T ćelije poznato da su glavni činilac efikasnosti protiv tumora kod miševa i ljudi. Duboka promena za infiltrat imunog sistema tumora sa deficijentnim TREX1 tako nagoveštava da inhibicija rasta ovih drugih tumora jeste barem delimično posredovana imunim sistemom.

Biohemijski ogled za TREX1

[0121] Jačina jedinjenja je procenjena kroz ogled fluorescentnog merenja razgradnje prilagođenog dsDNK supstrata koji poseduje par fluorofor gasilaca na naspramnim nitima lanca. Razgradnja dsDNK oslobađa nevezani fluorofor da bi se proizveo fluorescentni signal. Specifično, 7,5 µL N- terminalni His-Tev oznake pune dužine humani TREX1(eksprimovan u E. coli i prečišćen u kući) u reakcionom puferskom sredstvu (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 mg/mL BSA, 0,01% (v/v) Tween-20 i 100 mM MgCl2su dodati u ploči sa 384 pregade Black ProxiPlate Plus (Perkin Elmer) koja je već sadržala jedinjenje (150 nL) u različitim koncentracijama kao 10 tačaka odgovora na dozu u DMSO. U ovo je dodato 7,5 µL dsDNK supstrata (Nit A lanca: 5’ TEX615/GCT AGG CAG 3’; Nit B lanca: 5’ CTG CCT AGC/IAbRQSp (Integrated DNA Technologies) u pufersko sredstvo reakcije. Krajnje koncentracije su bile 150 pM TREX1, 60 nM dsDNK supstrata u puferskom sredstvu reakcije sa 1,0% DMSO (v/v). Posle 25 minuta na sobnoj temperaturi, reakcije su ohlađene dodavanjem 5 µL zaustavnog puferskog sredstva (isto kao pufersko sredstvo reakcije plus 200 mM EDTA). Krajnje koncentracije u ohlađenoj reakcionoj mešavini su bile 112,5 pM TREX1, 45 nM DNK i 50 mM EDTA u zapremini od 20 µL. Posle 5-minutne inkubacije na sobnoj temperaturi, ploče su očitane u vizualizatoru sa laserskim izvorom Envision (Perkin-Elmer), merenjem fluorescencije na 615 nm posle pobuđivanja w/ 570 nm svetla. IC50vrednosti su izračunate upoređivanjem izmerene fluorescencije pri 615 nm u odnosu na kontrolna izvorišta prethodno ohlađenog w/ zaustavnog puferskog sredstva (100% inhibicija) i bez inhibitornih (0% inhibicija) kontrola kako korišćenjem nelinearni barem kvadrat četiri parametra staje i bilo Genedata ili GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).

Biohemijski ogled za TREX2

[0122] Jačina jedinjenja je procenjena kroz ogled fluorescentnog merenja razgradnje prilagođenog dsDNK supstrata koji poseduje par fluorofor gasilaca na naspramnim nitima lanca. Razgradnja dsDNK oslobađa nevezani fluorofor da bi se proizveo fluorescentni signal. Specifično, 7,5 µL N- terminalni His-Tev označen humani TREX2( M44-A279 (eksprimovan u E. coli i prečišćen u kući) u reakcionom puferskom sredstvu (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 mg/mL BSA, 0,01% (v/v) Tween-20 i 100 mM MgCh) su dodati u ploči sa 384 pregade Black ProxiPlate Plus (Perkin Elmer) koja je već sadržala jedinjenje (150 nL) u različitim koncentracijama kao 10 tačaka odgovora na dozu u DMSO. U ovo je dodato 7,5 µL dsDNK supstrata (Nit A lanca: 5’ TEX615/GCT AGG CAG 3’; Nit B lanca: 5’ CTG CCT AGC/IA- bRQSp (IDT)) u reakcionom puferskom sredstvu. Krajnje koncentracije su bile 2,5 nM TREX2, 60 nM dsDNK supstrata u reakcionom puferskom sredstvu sa 1,0% DMSO (v/v). Posle 25 minuta na sobnoj temperaturi, reakcije su ohlađene dodavanjem 5 µL zaustavnog puferskog sredstva (isto kao pufersko sredstvo reakcije plus 200 mM EDTA). Krajnje koncentracije u ohlađenoj reakcionoj mešavini su bile 1,875 pM TREX2, 45 nM DNK i 50 mM EDTA u zapremini od 20 µL. Posle 5-minutne inkubacije na sobnoj temperaturi, ploče su očitane u vizualizatoru sa laserskim izvorom Envision (Perkin-Elmer), merenjem fluorescencije na 615 nm posle pobuđivanja w/ 570 nm svetla. IC50vrednosti su izračunate upoređivanjem izmerene fluorescencije pri 615 nm odnosu u odnosu na kontrolna izvorišta prethodno ohlađenog w/ zaustavnog puferskog zaustavnog sredstva (100% inhibicija) i bez inhibitornih (0% inhibicija) kontrola kako korišćenjem nelinearni barem kvadrat četiri parametra odgovara i neki od: Genedata ili GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).

[0123] Rezultati su prikazani u Tabeli 1. TREX1 IC50: A = <0,1 µM; B = 0,1 do 1 µM; C = 1 do 10 µM; D = >10 µM. TREX2 IC50: A = <1 µM, B = 1 do 10 µM, C = 10 do 100 µM, D = >100 µM.

Tabela 10

(nastavak)

(nastavak)

[0124]HCT116 dualne ćelije kompanije Invivogen, San Dijego, SAD (Invivogen, San Diego, CA, USA) se izvode iz humane linije ćelija HCT116 karcinoma debelog creva i rektuma. Ćelije su izabrane za stabilnu integraciju SEAP i gena reportera luciferaze, čije je eksprimovanje pod kontrolom 5 tandem elemenata odgovora za NF-KB/AP1 i STAT1/STAT2, prema opisanom redosledu. Linija te ćelije je korišćena za nadgledanje tipa I indukcije interferona i naknadno signaliziranje merenjem aktivnosti Lucia luciferaze izlučene u podlozi kulture.

[0125]HCT116 ćelije su raspoređene na ploču(e) sa 96 pregrada i to kao 40.000 ćelija/pregradi u 100uL DMEM suplementirane sa 10% FBS i 25µM Hepes (pH 7,2 - 7,5). Posle taloženja tokom noći, ćelije su obrađivane sa TREXli tokom 4 sata (maksimalna DMSO frakcija je bila 0,1%) pre 1ug/mL pBR322/BstNI ograničene razgradnje (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) je transfektovana sa Lipofektaminom LTX (ThermoFisher, Grand Island, NY, USA), prema preporukama priručnika za proizvod. Ukratko, Lipofektamin LTX (0,35uL/pregradi) je razblažen u OptiMEM (5uL/pregradi). pBR322/BstNI (100ng/pregradi) je razblažen u OptiMEM (5uL/pregradi) pre Plus reagensa (0,1uL/100ng DNK) je dodato. Posle 5 min inkubacije na sobnoj temperaturi, DNK mešavina je mešana ukapavanjem sa razblaženim Lipofektaminom LTX. Posle dodatnih 10 min inkubacije, smeša transfekcije (10uL/pregradi) je dodata u ćelije. Ćelije su održavane na 37C tokom 48 sati pre nadgledanja aktivnosti iz podloge kulture te ćelije.

[0126]Kako smo mi opisali nekoliko izvođenja pronalaska, očigledno je da je naše osnovne primere moguće promeniti da bi se obezbedilo drugim izvođenjima da koriste jedinjenja i postupke iz ovog pronalaska. Dakle, jasno je da obim ovog pronalaska treba definisati pomoću priloženih patentnih zahteva pre nego specifičnih izvođenja pronalaska koja su data u vidu primera.

[0127] Osim ako nije drugačije definisano svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste su u usklađeni sa znančenjem koje uobičajeno poznaje prosečan stručnjak u ovoj oblasti.

1

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje sa formulom I:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: R<1>jeste vodonik, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, 3- do 4-člani cikloalkil, -OR<f>, - SR<f>, ili -NR<e>R<f>; R<2>jeste vodonik, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, ili 3- do 4-člani cikloalkil; X jeste veza, NR<3>, O, S, ili (C1-C4)alkilen, pri čemu je pomenuti (C1-C4)alkilen opciono supstituisan sa 1 do 2 grupe izabrane iz R<4>; R<3>je vodonik, (C1-C4)alkil, -C(O)R<d>, ili -C(S) R<d>; R<4>je halo, (C1-C4)alkil, fenil, -NHC(O)OR<a>, -NHC(S)OR<a>, -C(O)R<b>,-NHC(O)NH R<g>, - NHC(S)NHR<g>, -NHS(O)2NHR<g>, -C(S)R<b>, S(O)2R<c>, S(O)R<c>, -C(O)OR<d>, -C(S)OR<d>, -C(O)NHR<e>, - C(S)NHR<e>, -NHC(O)R<d>, -NHC(S)R<d>, -OR<e>, -SR<e>, -O(C1-C4)alkilOR<e>, ili -NR<e>R<f>, pri čemu pomenuti fenil za R<4>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz halo, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, i halo(C1-C4)alkoksi; Prsten A je fenil, 5- do 6-člani heteroaril, 4- do 7-člani heterociklil, ili 3- do 7-člani cikloalkil, od kojih je svaki opciono i nezavisno supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<5>; R<5>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkoksi, halo, fenil, -NHC(O)OR<a>,-NHC(S)OR<a>, -C(O)R<b>,-NHC(O)NHR<g>, -NHC(S)NHR<g>, -NHS(O)2NHR<g>, -C(S)R<b>, S(O)2R<c>, S(O)R<c>, -C(O)OR<d>, -C(S)OR<d>, -C(O)NR<e>R<f>, -C(S)NHR<e>, -NHC(O)R<d>, -NHC(S)R<d>, -OR<e>, -SR<e>, - O(C1-C4)alkilOR<e>, -NR<e>R<f>, 4- do 6-člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu pomenuti fenil za R<5>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, a pomenuti (C1-C4)alkil za R<5>je opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz OR<h>, -NR<j>R<k>, fenila, i 5- do 6-članog heteroarila, pri čemu su pomenuti 4- do 7-člani heterociklil i 4- do 6-člani heteroaril svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<m>, i pri čemu su pomenuti fenili i 5- do 6- 2 člani heteroaril opcionih supstituenata sa spiska za (C1-C4)alkil u R<5>svaki opciono i nezavisno supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>; R<g>, R<h>, R<j>, R<k>, i R<m>su svaki nezavisno vodonik, halo, (C1-C4)alkil, halo(Ci- C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, halo(C1-C4)alkoksi, fenil, -(C1-C4)alkilfenil, 3- do 4-člani cikloalkil, 4- do 6-člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, i pri čemu pomenuti 4- do 7-člani heterociklil za R<g>, R<h>, R<j>i R<k>jeste još opciono supstituisan sa =O, R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>i R<f>su svaki nezavisno vodonik, halo, (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, halo(C1-C4)alkoksi, fenil, 3- do 4-člani cikloalkil, 4-do 6-člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu i) pomenuti (C1-C4)alkil za R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>i R<f>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz fenila, -OR<h>, -NR<j>R<k>; ii) pri čemu su pomenuti fenil, 4- do 6-člani heteroaril, i ) 4- do 7-člani heterociklil za R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>, i R<f>svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, i iii) pomenuti 4- do 7-člani heterociklil za R<a>, R<b>, R<c>, R<d>, R<e>, i R<f>je dodatno opciono supstituisan sa =O.
2. 2. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1, pri čemu to jedinjenje jeste iz Formule II:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
3. 3. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili 2, i/ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu R<2>jeste (C1-C4) alkil.
4. 4. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu prsten A jeste fenil, piridil, pirazolil, ciklopropil, ciklobutil, azetidinil, ili piperidinil, od kojih je svaki opciono i nezavisno supstituisan sa jednom ili dve R<5>.
5. 5. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu prsten A jeste triazolil, pirolidinil, diazepanil, ili piperazinil, od koji je svaki opciono i nezavisno supstituisani sa jednom ili dve R<5>.
6. 6. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu R<5>jeste (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkoksi, halo, fenil, -NHC(O)OR<a>, - C(O)R<b>, S(O)2R<c>, S(O)R<c>, -C(O)OR<d>, -C(O)NR<e>R<f>, -NHC(O)R<d>, -OR<e>, -O(C1-C4)alkilOR<c>, - NR<e>R<f>, 4- do 6-člani heteroaril, ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu pomenuti fenil za R<5>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, a pomenuti (C1-C4)alkil za R<5>je opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz -OR<h>, -NR<j>R<k>, fenila, i 5- do 6-člani heteroaril, pri čemu su pomenuti 4- do 6-člani heteroaril i 4- do 7-člani heterociklil svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<m>, i pri čemu su pomenuti fenil i 5- do 6-člani heteroaril opcioni supstituenti na spisku za (C1-C4)alkil u R<5>svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>; R<a>je (C1-C4)alkil opciono supstituisan sa fenilom; R<b>je (C1-C4)alkil, fenil, 5- do 6-člani heteroaril ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu je pomenuti (C1-C4)alkil opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz fenila, -OR<h>, i -NR<j>R<k>, pri čemu su pomenuti fenil, 5- do 6-člani heteroaril, i 4- do 7-člani heterociklil svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>, i pri čemu je pomenuti 4- do 7-člani heterociklil dodatno opciono supstituisan i sa =O; svako R<c>je nezavisno fenil ili (C1-C4)alkil; svako R<d>je vodonik ili (C1-C4)alkil; svako R<e>je nezavisno vodonik ili (C1-C4)alkil opciono supstituisan sa OR<h>; svako R<f>je nezavisno vodonik, (C1-C4)alkil, fenil 3- do 4-člani cikloalkil, 4-do 6-člani heteroaril, ili 5- do 6-člani heterociklil, pri čemu su pomenuti fenil, 3- do 4-člani cikloalkil, 4- do 6-člani heteroaril, i 5- do 6-člani heterociklil svaki opciono i nezavisno supstituisani sa R<g>; a svako R<g>je nezavisno (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, halo(C1-C4)alkoksi, ili halo; svako R<h>je vodonik, (C1-C4)alkil, ili -( C1-C4)alkilfenil; svako R<j>je nezavisno vodonik ili (C1-C4)alkil; svako R<k>je nezavisno vodonik, (C1-C4)alkil, ili 3- do 4-člani cikloalkil; i svako R<m>je (C1-C4)alkil.
7. 7. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 6, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu R<5>jeste (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil, halo, fenil, - NHC(O)OR<a>, -C(O)R<b>, 4 S(O)2R<c>, - C(O)OR<d>, -C(O)NR<e>R<f>, -NHC(O)R<d>, -O(C1-C4)alkilOR<e>, -NR<e>R<f>, 4- do 6-člani heteroaril, ili 5- do 6-člani heterociklil, pri čemu je pomenuti (C1-C4)alkil za R<5>opciono supstituisan sa -OR<h>, fenilom, ili 5- do 6-članim heteroarilom, a pomenuti 4-do 6-člani heteroaril i 5- do 6-člani heterociklil su svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<m>, i pri čemu su pomenuti fenil i 5- do 6-člani heteroaril opcioni supstituenti na spisku za (C1-C4)alkil u R<5>svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz R<g>.
8. 8. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je svako R<f>nezavisno vodonik, (C1-C4)alkil, fenil pirazolil, piridinil, tetrahidropiranil, piperidinil, pri čemu pomenuti fenil pirazolil, piridinil, tetrahidropiranil, i piperidinil jesu svaki opciono i nezavisno supstituisani sa (C1-C4)alkilom; i svako R<g>je nezavisno (C1-C4)alkil, (C1-C4)alkoksi, ili halo.
9. 9. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 8, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<b>(C1-C4)alkil, fenil, 5- do 6-člani heteroaril ili 4- do 7-člani heterociklil, pri čemu su pomenuti fenil i 5- do 6-člani heteroaril za R<b>svaki opciono i nezavisno supstituisani sa 1 ili 2 grupe izabrane iz halo i (C1-C4)alkoksi, pri čemu pomenuti 4- do 7-člani heterociklil za R<b>jeste opciono supstituisan sa =O, i pri čemu pomenuti (C1-C4)alkil za R<b>jeste opciono supstituisan sa 1 ili 2 grupe izabrane iz fenila, -OR<h>, i -NR<j>R<k>.
10. 10. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 9, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je svako R<k>nezavisno vodonik ili (C1-C4) alkil.
11. 11.Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 do 10, i njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je X nesupstituisani (C1-C4) alkilen.
12. 12. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 11, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu R<4>jeste fenil ili -NHC(O)OR<a>.
13. 13. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 12, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je X veza ili CH2.
14. 14. Farmaceutska formulacija koja obuhvata jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 13, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i farmaceutskih prihvatljiv nosač.
15. 15. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 14, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu za lečenje kancera.