RS64343B9

RS64343B9 - Novi fuzioni protein specifičan za cd137 i pd-l1

Info

Publication number: RS64343B9
Application number: RS20230461A
Authority: RS
Inventors: Marina Pavlidou; Lucia Pattarini; Alix Scholer-Dahirel; Christine Rothe; Shane Olwill; Aiba Rachida Bel; Marlon Hinner; Janet Peper
Original assignee: Pieris Pharmaceuticals Gmbh; Servier Lab
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2023-11-30
Also published as: PL3830120T3; AU2019315703A1; HUE062320T2; SI3830120T1; MX2021000401A; JP2021533203A; BR112020025263A2; EP3830120B1; CL2021000207A1; IL279541A; KR20210040103A; MD3830120T3; CY1126148T1; US20210363257A1; HRP20230590T1; EP4249064A2; FI3830120T3; JP7482488B2; EP3830120A1; DK3830120T5

Description

Opis

I. POZADINA

[0001] Ligand programirane smrti 1, ili PD-L1 (takođe poznat kao klaster diferencijacije 274 ili CD274 i B7 homolog 1 ili B7-H1) je jednoprolazni membranski protein tipa I koji pripada grupi B7 porodice kostimulatornih/koinhibitornih molekula prezentacije gena.Ekstracelularni deo PD-L1 sadrži dva domena, N-terminalni domen IgV-tipa i domen IgC-tipa. PD-L1 ima kratak citoplazmatski domen bez bilo kojeg očiglednog motiva signalne transdukcije, koji je doveo do početnog uverenja da ne postoji unutrašnje signaliziranje od strane PD-L1 u obliku receptora. Noviji podaci, međutim, pokazuju da citoplazmatski domen PD-L1 sadrži neklasične zatvorene signalne transdukcione motive koji su sposobni da inhibiraju transdukciju interferona (IFN) i da zaštite ćelije kancera od IFN citotoksičnosti (Gato-Canas et al., Cell Rep, 2017).

[0002] PD-L1 igra krucijalnu ulogu u supresiji imunog sistema tokom trudnoće, hroničnih infekcija, alografta tkiva, autoimunih bolesti, i kancera. PD-L1 se eksprimira na raznim ćelijskim tipovima uključujući B ćelije, T ćelije, makrofagove, mijeloidne dendritske ćelije, mastocite, epitelijalne, i vaskularne endotelijalne ćelije. Takođe se eksprimira u nekoliko tipova kancera uključujući ali bez ograničenja na melanom, pluća, bešiku, debelo crevo, i kancer dojke. Nivoi visokog eksprimiranja PD-L1 su povezani sa povećanom agresivnošću posredovanjem iscrpljenosti i anaergije tumora koji infiltrira T ćelije, sekrecijom imunosupresivnih citokina, i zaštitom od lize citotoksičnih ćelija.

[0003] PD-L1 je ligand proteina programirane ćelijske smrti 1 (PD-1), ključnog inhibitornog receptora imunološke kontrolne tačke koji se prevashodno eksprimira na aktiviranim T ćelijama ali takođe na drugim ćelijama imunog sistema uključujući B ćelije i monocite. PD-1 je član porodice imunoglobulina koja sadrži ekstracelularni domen poput IgV, transmembranski domen i citoplazmatski rep sa ITIM (inhibitorni motiv imunoreceptora baziranog na tirozinu) i ITSM (motiv prebacivanja imunoreceptora baziran na tirozinu. Vezivanje PD-1 za PD-L1 dovodi do regrutiranja src homologije tirozin fosfataza koje sadrže dva domena 1 i 2 (SHP 1 i 2) do intracelularne motive prebacivanja PD-1 i eksprimiranja E3 ubikvitin ligaza CBL porodice. Ove ubikvitin ligaze se naknadno ubikvituju i onemogućavaju ključne posrednike transdukcije TCR signala što dovodi do uklanjanja TCR-ova iz ćelijske površine (Karwacz et al., EMBO Mol Med, 2011). SHP 1 i SHP 2 fosfataze inhibiraju TCR signaliziranje direktno završavanjem fosforilacije ZAP70 i PI3K. Pored toga, PD-L1 uključen u PD-1 može da uzrokuje inhibiciju puteva TCR signaliziranja uticanjem na ekspresiju i dejstvo CK2 i kinaza zavisnih od ciklina (CDK) (Arasanz et al., Oncotarget, 2017). Takođe je pokazano da uključivanje PD-1 dovodi do reprogramiranja metabolizma T ćelija iz povećane glikolize, koja je potrebna za proizvodnju energije za funkcije efektora, u β-oksidaciju masnih kiselina, što je povezano sa dugovečnim stanicama. Ovo takođe može da objasni preživljavanje I postojanost ćelija sa visokom ekspreijom PD-1 kod pacijenata sa hroničnim infekcijama i kancerom (Patsoukis et al., Nat Commun, 2015).

[0004] Blokiranje PD-1/PD-L1 interakcije ciljanim agensima protiv PD-1 ili anti-PD-L1 može da preokrene funkciju imunološke kontrolne tačke i popusti kočnicu na odgovorima T ćelija. Trenutno tri PD-L1 antitela, atezolizumab (TECENTRIQ, MPDL3280A, RG7466), avelumab (BAVENCIO, MSB0010718C), i durvalumab (IMFINZI, MEDI4736), su odobrena za lečenje kancera. Nekoliko uspešnih kliničkih ispitivanja sa ovim antitelima je pokazalo visoke stope objektivnog odgovora, trajnost odgovora, ili povišene stope preživljavanja kod kancera bešike, kancera kože i kancera pluća (Xu-Monette et al., Front Immunol, 2017).

[0005] Klaster diferencijacije 137 ili CD137 (takođe poznat kao 4-1 BB ili TNFRS9) je kostimulatorni imunološki receptor i član super porodice receptora faktora tumorske nekroze (TNFR). Prvenstveno se eksprimira na aktiviranim CD4+ i CD8+ T ćelijama, aktiviranim B ćelijama, i ćelijama prirodnih ubica (NK) ali takođe mogu da se nađu na monocitima u mirovanju i dendritskim ćelijama (Li and Liu, Clin Pharmacol, 2013), ili endotelijalnim ćelijama (Snell et al., Immunol Rev, 2011). CD137 igra važnu ulogu u regulaciji imunološkog odgovora i samim tim predstavlja cilj za imunoterapiju kancera. CD137 ligand (CD137L) predstavlja jedini poznati prirodni ligand CD137, i konstitutivno se eksprimira na nekoliko tipova antigena koji predstavljaju ćelije, kao što su aktivirane B ćelije, monocite, i dendritske ćelije slezine, i može da se uvede na T limfocitima.

[0006] CD137L predstavlja trimerni protein koji postoji kao oblik vezan za membranu i u obliku rastvorljive varijante. Mogućnost rastvorljivog CD137L da aktivira CD137, npr., na limfocitima koji eksprimiraju limfocite je ograničena, i potrebne su velike koncentracije za dobijanje efekta (Wyzgol et al., J Immunol, 2009). Prirodni put aktivacije CD137 je putem vezivanja CD137-pozitivnih ćelija sa CD137L-pozitivnim ćelijama. Za aktivaciju CD137 se zatim smatra da je izaziva grupisanje putem CD137L na suprotnim ćelijama, što dovodi do signaliziranja putem TRAF1, 2 i 3 (Yao et al., Nat Rev Drug Discov, 2013, Snell et al., Immunol Rev, 2011) i dalje istovremenih nishodnih efekata u CD137-pozitivnim T-ćelijama. U slučaju T-ćelija koje se aktiviraju prepoznavanjem njihovih odgovarajućih srodnih ciljeva, efekti dobijeni kostimulacijom CD137 su dodatna pojačana aktivacija, pojačano preživljavanje i proliferacija, proizvodnja proinflamatornog citokina i poboljšana sposobnost ubijanja.

[0007] Korist CD137 kostimulacije za eliminaciju kancerskih ćelija se pokazala u brojnim in

vivo modelima. Prinudna ekspresija CD137L na tumoru, na primer, dovodi do odbacivanja tumora (Melero et al., Eur J Immunol, 1998). Isto tome, prinudna ekspresija anti -CD137 scFv na tumoru dovodi do CD4<+>T-ćelija i eliminacije tumora zavisne od NK ćelija (Yang et al., KancerRes, 2007, Zhang et al., Mol Kancer Ther, 2006, Ye et al., Nat Med, 2002). Za sistemsku primenu anti-CD137 antitela je takođe pokazano da dovodi do retardacije rasta tumora (Martinet et al., Gene Ther, 2002).

[0008] Pokazano je da je CD137 odličan marker za reaktivne T ćelije koje se prirodno javljaju u humanim tumorima (Ye et al., Clin Cancer Res, 2014), i da anti-CD137 antitela mogu da se koriste za poboljšanje širenja i dejstva CD8<+>limfocita koji infiltriraju tumor melanoma za primenu u adoptivnoj terapiji T-ćelijama (Chacon et al., PLoS One, 2013).

[0009] Pretklinički prikaz potencijalne terapeutske koristi CD137 kostimulacije je podstakao razvoj terapeutskih antitela koja ciljaju CD137, uključujući BMS-663513 (opisan u U.S. Patent No.7,288,638) i PF-05082566 (Fisher et al., Kancer Immunol Immunother, 2012). WO 2017/123650 A2 se odnosi na molekule koji se specifično vezuju za 4-1 BB, člana superfamilije TNF receptora (TNFRSF). Konkretnije, ovaj pronalazak se odnosi na multivalentne i multispecifične molekule koji vezuju najmanje 4-1BB. WO 2017/215590 A1 se odnosi na anti-PD-L1 antitela ili njihove fragmente. Antitela ili njihovi fragmenti se specifično vezuju za C domen imunoglobulina PD-L1 proteina. Marlon J. Hinner et al: "Abstract B023: Costimulatory T-cell engagement via a novel bispecific anti-CD137 /anti-HER2 protein based on Anticalin technology", Cancer Immunology Research, vol.4, no.1, 1 January 2016 & Marlon J Hinner et al:

"Costimulatory T cell engagement via a novel bispecific antiCD137/anti-HER2 protein based on Anticalin technology" se odnose na kostimulatorno vezivanje T-ćelija preko bispecifičnog anti-CD137/anti-HER2 proteina bazirano na tehnologiji lipokalinskog muteina. WO 2018/087108 A1 se odnosi na humane lipokalinske muteine koji se vezuju za CD137 i mogu da se koriste u farmaceutskim primenama, na primer, u obliku anti-kancerskih agenasa i/ili imunoloških modulatora za lečenje ili sprečavanje humanih bolesti kao što su kancer, infektivne bolesti, i autoimune bolesti.

[0010] Ovo otkrivanje obezbeđuje, između ostalog, nove pristupe za simultano vezivanje CD137 i PD-L1 preko jednog ili više fuzionih proteina sa svojstvima specifičnosti vezivanja za CD137 i specifičnosti vezivanja za PD-L1.

II. DEFINICIJE

[0011] Sledeća lista definiše pojmove, fraze i skraćenice koje se koriste kroz ovu specifikaciju. Sve ovde navedene i definisane fraze su predviđene da obuhvataju sve gramatičke oblike.

[0012] Kako se ovde koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, "CD137" označava humani CD137 (huCD137). Humani CD137 označava protein pune dužine definisan sa UniProt Q07011, njegov fragment, ili njegova varijanta. CD137 je takođe poznat kao 4-1BB, član 9 superporodice receptor faktora tumorske nekroze (TNFRSF9), i indukuje ga aktivacija limfocita (ILA).

[0013] Kako se ovde koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, "ligand 1 programirane ćelijske smrti 1" ili "PD-L1" označava humani PD-L1 (huPD-L1). Humani PD-L1 označava protein pune dužine definisan sa UniProt Q9NZQ7, njegov fragment, ili njegovu varijantu. Humani PD-L1 je kodiran CD274 genom. PD-L1 je takođe poznat kao klaster diferencijacije 274 (CD274) ili B7 homolog 1 (B7-H1).

[0014] Kako se ovde koristi, "afinitet prema vezivanju" opisuje mogućnost biomolekula (npr., polipeptid ili protein) ovog otkrivanja (npr., lipokalinski mutein, antitelo, fuzioni protein, ili bilo koji drugi peptid ili protein) da se vezuje za izabrani cilj i da obrazuje kompleks. Afinitet prema vezivanju se meri brojem postupaka poznatih stručnjacima uključujući, ali bez ograničenja na, titraciju fluorescencije, ispitivanja zasnovan na imunoenzimskoj probi (ELISA), uključujući direktnu i kompetitivnu ELISA-u, kalorimetrijske postupke, kao što je kalorimetrija izotermalne titracije (ITC), i površinsku rezonancu plazmona (SPR). Ovi postupci su dobro utvrđeni u tehnici i neki primeri takvih postupaka su dodatno ovde opisani. Afinitet prema vezivanju je samim tim prijavljen kao vrednost konstante disocijacije (KD), polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50), ili polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) merena pomoću ovih postupaka. Niža KD, EC50, ili IC50vrednost znači bolju (veću) mogućnost vezivanja (afinitet). Shodno tome, afiniteti prema vezivanju dva biomolekula prema izabranom cilju mogu da se izmere i uporede. Prilikom poređenja afiniteta prema vezivanju dva biomolekula prema izabranom cilju, pojam "otprilike isti," "suštinski isti" ili "suštinski slični" označava da jedan biomolekul ima afinitet prema vezivanju prijavljen kao KD, EC50, ili IC50vrednost koja je identična ili slična sa drugim molekulom unutar eksperimentalne varijabilnosti afiniteta prema merenju vezivanja. Eksperimentalna varijabilnost afiniteta prema merenju vezivanju zavisi od konkretnog postupka koji se koristi i poznata je stručnjaku iz oblasti.

[0015] Kako se ovde koristi, pojam "suštinski" takođe može da se odnosi na kvalitativno stanje pokazivanja ukupnog ili približno ukupnog opsega ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa.

Stručnjak iz oblasti biologije će razumeti da hemijski fenomeni retko, ako ikada, idu do kraja i/ili nastavljaju sa završavanjem ili postižu ili izbegavaju apsolutni rezultat. Pojam "suštinski" se samim tim ovde koristi za hvatanje potencijalnog nedostatka potpunosti koja je svojstvena mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.

[0016] Kako se ovde koristi, pojam "detektovati," "detekcija," "koji može da se detektuje," ili "koji detektuje" se uzima u razmatranje i na kvantitativnom i kvalitativnom nivou, kao i njihova kombinacija. Samim tim uključuje kvantitativna, polukvantitativna, i kvalitativna merenja izvedena na biomolekulu ovog otkrivanja.

[0017] Kako se ovde koristi, "afinitet koji može da se detektuje" generalno označava da je mogućnost vezivanja između biomolekula i njegovog cilja, prijavljena kroz KD, EC50, ili IC50vrednost, najviše oko 10-

<5>M ili manje. Afinitet prema vezivanju, prijavljen kroz KD, EC50, ili IC50vrednost, veći od 10<-5>M generalno ne može više da se meri uobičajenim postupcima kao što su ELISA i SPR I samim tim su od sekundarnog značaja.

[0018] Napominje se da na obrazovanje kompleksa između biomolekula ovog otkrivanja i njegovog cilja utiču mnogi različiti faktori kao što su koncentracije odgovarajućeg cilja, prisustvo kompetitora, pH I jonska snaga sistema za puferisanje koji se koristi, eksperimentalni postupak koji se koristi za određivanje afiniteta prema vezivanju (npr., titracija fluorescencije, kompetitivna ELISA (koja se takođe naziva ELISA kompeticije), i površinska rezonanca plazmona), a čak i matematički algoritam koji se koristi za procenu eksperimentalnih podataka. Samim tim, stručnjaku je jasno da afinitet prema vezivanju prijavljen kroz KD, EC50, ili IC50vrednost može da varira unutar određenog eksperimentalnog opsega, u zavisnosti od postupka i postavke eksperimenta. Ovo znači da može postojati blago odstupanje u izmerenim KD, EC50, ili IC50vrednostima ili opsegu tolerancije u zavisnosti od, na primer, toga da li takve vrednosti određuje ELISA (uključujući direktnu ili ELISA-u kompeticije), SPR-om, ili drugim postupkom.

[0019] Kako se ovde koristi, "specifičan za," "specifično vezivanje," "specifično vezuje," ili "specifičnost vezivanja" se odnosi na mogućnost biomolekula da se pravi razlika između željenog cilja (na primer, CD137 i PD-L1) i jednog ili više referentnih ciljeva (na primer, celularni receptor za neutrofilni lipokalin povezan sa želatinazom). Smatra se da takva specifičnost nije apsolutno već relativno svojstvo i može biti određena, na primer, u skladu sa SPR-om, vestern blotovima, ELISA-om, fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (FACS), radioimunoispitivanje (RIA), elektrohemiluminiscencijom (ECL), imunoradiometrijskim ispitivanjem (IRMA), imunohistohemijom (IHC), i skenovima peptida.

[0020] Kada se ovde koristi u kontekstu fuzionog proteina ovog otkrivanja koji se vezuje za CD137 i PD-L1, pojam "specifičan za," "specifično vezivanje," "specifično vezuje," ili "specifičnost vezivanja" znači da se fuzioni protein vezuje za, reaguje sa, ili je usmeren na CD137 i PD-L1, kako je ovde opisano, ali se suštinski ne vezuje za drugi protein. Pojam "drugi protein" uključuje bilo koje druge proteine koji nisu CD137 ili PD-L1 ili proteini koji se blisko odnose ili koji su homologni sa CD137 ili PD-L1. Međutim, CD137 ili PD-L1 od vrsta, a da to nisu humani i fragmenti i/ili varijante CD137 ili PD-L1, ne isključuje pojam "drugi protein." Pojam "suštinski se ne vezuje" znači da fuzioni proteini ovog otkrivanja vezuju drugi protein manjim afinitetom prema vezivanju u odnosu na CD137 i/ili PD-L1, tj., pokazuju unakrsnu reaktivnost manju 30%, poželjno 20%, poželjnije 10%, naročito poželjno manje od 9, 8, 7, 6, ili 5%. Da li fuzioni protein specifično reaguje kako je ovde prethodno definisano može lako da se ispita, između ostalog, poređenjem reakcije fuzionog proteina ovog otkrivanja sa CD137 i/ili PD-L1 i reakcije pomenutog fuzionog proteina sa drugim protein(om)ima.

[0021] Kako se ovde koristi, pojam "lipokalin" se odnosi na monomerni protein od približno 18-20 kDa po masi, sa cilindričnim β- nabranim supersekundarnim strukturnim regionom koji obuhvata veći broj βlanaca (poželjno osam β-lanaca označenih sa od A do H) u paru povezanih sa većim brojem (poželjno četiri) petlje na jednom kraju da bi se time obuhvatio džep vezivanja liganda i definisao ulaz džepa vezivanja liganda. Dobro je utvrđeno da raznolikost pomenutih petlji u inače krutoj lipokalinikoj osnovi obezbeđuje razne različite režime vezivanja među članovima porodice lipokalina, pri čemu je svaki sposoban da se prilagodi ciljevima različitih veličina, oblika, i hemijskih karakteristika (pregledanih, npr. u Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996). Smatra se da se lipokalinika porodica proteina prirodno razvila da vezuje širok spektar liganda, pri čemu dele neobično niske nivoe celokupnog konzervisanja sekvence (čak sa identitetima sekvence manjim od 20%) a opet zadržavajući izuzetno sačuvan celokupni model savijanja. Podudarnost između položaja kod raznih lipokalina je dobro poznata stručnjaku iz oblasti (videti, npr., U.S. Patent br.

7,250,297). Proteini potpadaju pod definiciju "lipokalina" kako se ovde koristi uključujući, ali bez ograničenja na, humane lipokaline uključujući lipokalin iz suza (Tlc, Lcn1), Lipokalin-2 (Lcn2) ili neutrofilni lipokalin povezan sa želatinazom (NGAL), apolipoprotein D (ApoD), apolipoprotein M, α1-kiseli glikoprotein 1, α1-kiseli glikoprotein 2, α1-mikroglobulin, komplementnu komponentu 8γ, protein koji vezuje retinol (RBP), protein vezivanja epididimalne retionične kiseline, glikodelin, odorant-vezivanje protein Ila, protein koji vezuje miris lib, lipokalin-15 (Lcn15), i prostaglandin D sintazu.

[0022] Kako se ovde koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, "lipokalin iz suza" se odnosi na humani lipokalin iz suza (hTIc) i dalje se odnosi na zreli humani lipokalin iz suza. Pojam "zreli" kada se koristi da okarakteriše protein označava protein koji suštinski ne sadrži pojedinačni peptid. "Zreli hTlc" ovog otkrivanja se odnosi na zreli oblik humanog lipokalina iz suza, koji ne sadrži pojedinačni peptid. Zreli hTlc opisuju ostaci 19-176 sekvence deponovani u SWISS-PROT Data Bank pod pristupnim brojem P31025, i aminokiselina koja je naznačena u SEQ ID NO: 1.

[0023] Kako se ovde koristi, "Lipokalin-2" ili "neutrofilni lipokalin povezan sa želatinazom" se odnosi na human Lipokalin-2 (hLcn2) ili humani neutrofilni lipokalin povezan sa želatinazom (hNGAL) I dodatno se odnosi na zreli humani Lipokalin-2 ili zreli humani neutrofilni lipokalin povezan sa želatinazom. Pojam "zreli" kada se koristi da okarakteriše a protein označava a protein koji suštinski ne sadrži pojedinačni peptid. "Zreli hNGAL" ovog otkrivanja se odnosi na zreo oblik humanog neutrofilnog lipokalina povezanog sa želatinazom, koji ne sadrži pojedinačni peptid. Zreli hNGAL opisuju ostaci 21-198 sekvence deponovani u SWISS-PROT Data Bank pod pristupnim brojem P80188, i aminokiselina koja je naznačena u SEQ ID NO: 2.

[0024] Kako se ovde koristi, "nativna sekvenca" se odnosi na protein ili polipeptid sa sekvencom koja se javljaju u prirodi ili sa sekvencom divljeg tipa, bez obzira na njegov postupak pripreme. Takav protein nativne sekvence ili polipeptid mogu biti izolovani iz prirode ili mogu da se proizvode drugim sredstvima, kao što su rekombinantni ili sintetički postupci.

[0025] "Lipokalin nativne sekvence" se odnosi na lipokalin sa istom aminokiselinskom sekvencom kao odgovarajućim polipeptidom izvedenim iz prirode. Tako, lipokalin nativne sekvence može da ima aminokiselinsku sekvencu odgovarajućeg lipokalina koji se prirodno javlja (divljeg tipa) iz bilo kog organizma, određenije, sisara. Pojam "nativna sekvenca", kada se koristi u kontekstu lipokalina specifično obuhvata okrnjen ili izlučene oblike lipokalina koji se prirodno javljaju, oblici varijanti koji se prirodno javljaju kao alternativno splajsovani oblici i alelne varijante lipokalina koje se prirodno javljaju. Pojmovi "lipokalin nativne sekvence" i "lipokalin divljeg tipa" se ovde koriste naizmenično.

[0026] Kako se ovde koristi, "mutein," "mutirani" entitet (bilo protein ili nukleinska kiselina), ili "mutant" se odnosi na razmenu, deleciju, ili umetanje jedne ili više aminokiselina ili nukleotida, u poređenju sa proteinom ili nukleinskom kiselinom koji se prirodno javljaju (divljeg tipa). Pomenuti pojam takođe uključuje fragmente muteina kako je ovde opisano. Ovo otkrivanje otvoreno obuhvata lipokalinske muteine, kako je ovde opisano, sa cilindričnim β-nabranim supersekundarnim strukturnim regionom koji obuhvata osam β-lanaca povezanih u paru sa četiri petlje na jednom kraju čime se obuhvata džep vezivanja liganda i definiše ulaz džepa vezivanja liganda, pri čemu je najmanje jedna aminokiselina svake od najmanje tri pomenute četiri petlje mutirana u poređenju sa lipokalinom nativne sekvence.

[0027] Kako se ovde koristi, pojam "fragment," u vezi sa lipokalinskimim muteinima ovog otkrivanja, se odnosi na proteine ili polipeptide izvedene iz zrelih hTIc ili hNGAL ili lipokalinskih muteina pune dužine koji su okrnjeni na N-kraju i/ili C-kraju, tj., nedostaje im najmanje jedna od N-terminalnih i/ili C-terminalnih aminokiselina. Takvi fragmenti mogu da uključuju najmanje 10 ili više, kao što je 20 ili 30 ili više uzastopnih aminokiselina primarne sekvence zrelog hTIc ili hNGAL ili lipokalinski muteiniz kojeg je izveden i obično mogu da se detektuju imunološkim ispitivanjem zrelog hTIc ili hNGAL. Takvom fragmentu može da nedostaje do 2, do 3, do 4, do 5, do 10, do 15, do 20, do 25, ili do 30 (uključujući sve brojeve između) N-terminalnih i/ili C-terminalnih aminokiselina. Kao ilustrativni primer, takvom fragmentu mogu da nedostaju jedna, dve, tri, ili četiri N-terminalne (His-His-Leu-Leu) i/ili jedna ili dve C-terminalne aminokiseline (Ser-Asp) zrelog hTlc. Smatra se da je taj fragment poželjno funkcionalan fragment zrelog hTIc ili hNGAL ili lipokalinski mutein iz kojeg je izveden, što znači da poželjno zadržava specifičnost vezivanja, poželjno za CD137, zrelog hTlc/hNGAL ili lipokalinski mutein iz kojeg je izveden. Kao ilustrativni primer, takav funkcionalni fragment može da obuhvata najmanje aminokiseline na položajima 5-153, 5-150, 9-148, 12-140, 20-135, ili 26-133 koji odgovaraju linearnoj polipeptidnoj sekvenci zrelog hTlc. Kao drugi ilustrativni primer, takav funkcionalni fragment može da obuhvata najmanje aminokiseline na položajima 13-157, 15-150, 18-141, 20-134, 25-134, ili 28-134 koji odgovaraju linearnoj polipeptidnoj sekvenci zrelog hNGAL.

[0028] "Fragment" u odnosu na odgovarajući cilj CD137 ili PD-L1 fuzionog proteina ovog otkrivanja, se odnosi na N-terminalno i/ili C-terminalno okrnjen CD137 ili PD-L1 ili domene proteina CD137 ili PD-L1. Fragmenti CD137 ili fragmenti PD-L1 kako je ovde opisano zadržavaju sposobnost CD137 ili PD-L1 pune dužine da ih prepozna i/ili veže fuzioni protein ovog otkrivanja. Kao ilustrativni primer, fragment može biti ekstracelularni domen CD137 ili PD-L1. Kao ilustrativni primer, takav ekstracelularni domen može da obuhvata aminokiseline ekstracelularnih subdomena CD137, kao što su pojedinačne ili kombinovane aminokiselinske sekvence domena 1 (ostaci 24-45 UniProt Q07011), domena 2 (ostaci 46-86), domena 3 (87-118) i domena 4 (ostaci 119-159). Kao drugi ilustrativni primer, takav ekstracelularni domen može da obuhvata aminokiselinske ostatke 19-238 iz UniProt Q9NZQ7.

[0029] Kako se ovde koristi, pojam "varijanta" se odnosi na derivate proteina ili polipeptida koji uključuju mutacije, na primer supstitucijama, delecijama, umetanjima, i/ili hemijskim modifikacijama aminokiselinske sekvence ili nukleotidne sekvence. Takve supstitucije mogu biti konzervativne, tj., aminokiselinski ostatak se zameni hemijski sličan aminokiselinski ostatak. Primeri konzervativnih supstitucija su zamene među članovima sledećih grupa: 1) alanin, serin, treonin, i valin; 2) asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, glutamin, i asparagin, i histidin; 3) arginin, lizin, glutamin, asparagin, i histidin; 4) izoleucin, leukin, metionin, valin, alanin, fenilalanin, treonin, i prolin; i 5) izoleukin, leukin, metionin, fenilalanin, tirozin, i triptofan. Takve varijante uključuju proteine ili polipeptide, pri čemu je jedna ili više aminokiselina supstituisano njihovim odgovarajućim D-stereoizomerima ili aminokiselinama a koje ne spadaju u 20 aminokiselina koje se prirodno javljaju, kao što su, na primer, ornitin, hidroksiprolin, citrullin, homoserin, hidroksilizin, norvalin. Takve varijante takođe uključuju, na primer, proteine ili polipeptide u koje se dodaje jedan ili više amimokiselinskih ostataka ili se brišu na N- i/ili C-kraju. Generalno, varijanta je najmanje oko 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% ili najmanje oko 98% identična aminokiselinskoj sekvenci sa proteinom ili polipeptidom nativne sekvence. Varijanta poželjno zadržava biološko dejstvo, npr. vezivanje istog cilja, proteina ili polipeptida iz kojeg je izveden.

[0030] Pojam "varijanta", kako se ovde koristi u odnosu na odgovarajući ligand proteina CD137 ili PD-L1 fuzionog proteina ovog otkrivanja, se odnosi na CD137 ili PD-L1 ili njegov fragment, tim redom, koji ima jedan ili više kao što su 1, 2, 3, 4 ,5 ,6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili više aminokiselinskih supstitucija, brisanja i/ili umetanja u poređenju sa nativnom sekvencom iz CD137 ili PD-L1 (CD137 ili PD-L1 divljeg tipa), kao što je CD137 kako je deponovana kod UniProt Q07011 ili PD-L1 kako je deponovana kod UniProt Q9NZQ7 kako je ovde opisano. Varijanta CD137 ili varijanta PD-L1, tim redom, je poželjno najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ili 95% identična sa aminokiselinom CD137 ili PD-L1 divljeg tipa. Varijanta CD137 ili varijanta PD-L1 kako su ovde opisane zadržava mogućnost da vezuje fuzione proteine specifične za CD137 i PD-L1 kao što je definisano u priloženom setu patentnih zahteva.

[0031] Pojam "varijanta", kako se ovde koristi u odnosu na lipokalinski mutein, se odnosi na lipokalinski mutein ili njegov fragment ovog otkrivanja, pri čemu ta sekvenca ima mutacije, uključujući supstitucije, brisanja, i umetanja, i/ili hemijske modifikacije. Varijanta lipokalinskog muteina kako je ovde opisano zadržava biološko dejstvo, npr., vezivanje za CD137, lipokalinskog muteina iz kojeg je izveden.

Generalno, varijanta lipokalinskog muteina je najmanje oko 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% identična aminokiselinskoj sekvenci sa lipokalinskim muteinom iz kojeg je izveden.

[0032] Kako se ovde koristi, pojam "mutageneza" se odnosi na uvođenje mutacija u polinukleotid ili aminokiselinsku sekvencu. Mutacije su poželjno uvedene u eksperimentalnim uslovima tako da aminokiselina koja se prirodno javlja na datom položaju proteina ili polipeptidne sekvence može biti izmenjena, na primer supstituisana najmanje jednom aminokiselinom. Pojam "mutageneza" takođe uključuje (dodatnu) modifikaciju dužine segmenata sekvence brisanjem ili umetanjem jedne ili više aminokiselina. Samim tim, u opsegu ovog otkrivanja je da se, na primer, jedna aminokiselina na izabranom položaju sekvence se zameni nizom tri aminokiseline, što dovodi do dodavanje dva aminokiselinska ostatka u poređenju sa dužinom odgovarajućeg segmenta nativnog proteina ili aminokiselinske sekvence polipeptida. Takvo umetanje ili brisanje može da se uvede međusobno nezavisno u bilo koje segmente sekvence koji mogu da se podvrgnu mutagenezi u ovom otkrivanju.

[0033] Kako se ovde koristi, pojam "nasumična mutageneza" znači da predodređena mutacija (izmena aminokiseline) nije prisutna na određenom položaju sekvence već da najmanje dve aminokiseline mogu biti inkorporirane sa određenom verovatnoćom na prethodno definisanom položaju sekvence tokom mutageneze.

[0034] Kako se ovde koristi, pojam "identitet sekvence" ili "identitet" označava svojstvo sekvenci koje meri njihovu sličnost ili odnos. Pojam "identitet sekvence" ili "identitet" kako se koristi u ovom otkrivanju označava procenat uparenih identičnih ostataka – nakon čega sledi (homologno) poravnanje sekvence proteina ili polipeptida ovog otkrivanja sa sekvencom u pitanju - u odnosu na broj ostatak u dužoj od ove dve sekvence. Identitet sekvence je izmeren podelom broja identičnih aminokiselinskih ostataka ukupnim brojem ostataka i množenjem proizvoda sa 100.

[0035] Kako se ovde koristi, pojam "homologija sekvenci" ili "homologija" ima svoje uobičajeno značenje i homologna aminokiselina uključuje identične aminokiseline kao i aminokiseline za koje se smatra da spredstavljaju konzervativne supstitucije na ekvivalentnim položajima u linearnoj aminokiselinskoj sekvenca proteina ili polipeptida ovog otkrivanja (npr., bilo kog fuzionog proteina ili lipokalinskih muteina ovog otkrivanja).

[0036] Stručnjak će prepoznati dostupne kompjuterske programe, na primer BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2 (Altschul et al., J Mol Biol, 1990), i Smith-Waterman (Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981), za određivanje homologije sekvenci ili identiteta sekvenci pomoću standardnih parametara. Procenat homologije sekvenci ili identiteta sekvenci može, na primer, biti određen pomoću programa BLASTP, verzija 2.2.5 (Novembar 16, 2002; (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997). U ovom primeru, iako ne kao deo pronalaska koji se štiti, procenat homologije je zasnovana na poravnanju celog proteina ili polipeptidnih sekvenci (matrica: BLOSUM 62; troškovi praznine: 11.1; vrednost prekida podešena na 10<-3>) uključujući propeptidne sekvence, poželjno pomoću proteinskih osnova divljeg tipa kao referentnog u poređenju parova. Izračunato je kao procenat brojeva "pozitivnih" (homolognih aminokiselina) označenih kao rezultat u izlazu BLASTP programa podeljenih ukupnim brojem aminokiselina izabranih programom za poravnanje.

[0037] Specifično, da bi se odredilo da li je aminokiselinski ostatak aminokiselinske sekvence lipokalinskog muteina drugačiji od lipokalina divljeg tipa koji odgovara određenom položaju u aminokiselinskoj sekvenci lipokalina divljeg tipa, stručnjak može da koristi sredstva i postupke dobro poznate u tehnici, npr., poravnanja, ili ručno ili upotrebom kompjuterskih programa kao što su BLAST 2.0, što znači Alat za pretragu osnovnog lokalnog poravnanja, ili ClustalW, ili bilo koji drugi pogodan program koji je pogodan za generisanje poravnanja sekvenci. Shodno tome, sekvenca lipokalin divljeg tipa a može da služi kao "predmetna sekvenca" ili "referentna sekvenca," dok aminokiselinska sekvenca lipokalinskog muteina različita od lipokalin divljeg tipa opisanog ovde služi kao "upitna sekvenca." Pojmovi "sekvenca divljeg tipa," "referentna sekvenca," i "predmetna sekvenca" se ovde koriste naizmenično. Poželjna sekvenca lipokalin divljeg tipa a je sekvenca hTLc kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 ili hNGAL kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2.

[0038] "Praznine" su prostori u poravnanju koji su rezultat dodavanja ili brisanja aminokiselina. Samim tim, dve kopije tačno iste sekvence su 100% identične, ali sekvence koje su malo manje visoko konzervirane, i imaju brisanja, dodavanja, ili zamene, mogu da imaju niži stepen identiteta sekvence.

[0039] Kako se ovde koristi, pojam "položaj" označava položaj ili aminokiseline unutar aminokiselinske

1

sekvence ovde prikazane ili položaj nukleotida unutar ovde prikazane sekvence nukleinske kiseline. Trebalo bi da se ima u vidu da kada pojam "odgovara" ili "koji odgovara" kako se ovde koristi u kontekstu položaja aminokiselinskih sekvenci jednog ili više lipokalinskih muteina, odgovarajući položaj nije samo određen brojem nukleotida aminokiselina koje mu prethode. Shodno tome, apsolutni položaj date aminokiseline prema ovom otkrivanju može da varira od odgovarajućeg položaja usled brisanja ili dodavanja aminokiselina bilo gde u lipokalinu (mutantu ili divljeg tipa). Slično, apsolutni položaj datog nukleotida prema ovom otkrivanju može da varira od odgovarajućeg položaja usled brisanja ili dodavanja nukleotida bilo gde u muteinu ili 5'-netranslacionom regionu (UTR) lipokalina divljeg tipa uključujući promoter i/ili bilo koje druge regulatorne sekvence ili gen (uključujući eksone i introne).

[0040] "Odgovarajući položaj" prema ovom otkrivanju može biti položaj sekvence koji se ravna sa položajem sekvence kom odgovara u paru ili višestruko poravnanje sekvence prema ovom otkrivanju. Poželjno je imati u vidu da za "odgovarajući položaj" prema ovom otkrivanju, apsolutni položaji nukleotida ili aminokiselina mogu da se razlikuju od susednih nukleotida ili aminokiselina ali pomenuti susedni nukleotidi ili aminokiseline koji mogu biti zamenjeni, izbrisani, ili dodati mogu biti obuhvaćeni jednim ili više "odgovarajućih položaja".

[0041] Pored toga, za odgovarajući položaj u lipokalinskom muteinu baziran na referentnoj sekvenci prema ovom otkrivanju, poželjno je da se ima u vidu da položaji nukleotida ili aminokiselina strukturno mogu da odgovaraju položajima bilo gde u referentnom lipokalinu (lipokalinu divljeg tipa) ili drugom lipokalinskom muteinu, čak i ako mogu da se razlikuju u brojevima apsolutnog položaja, što će stručnjaci razumeti u smislu visoko očuvanog celokupnog uzorka savijanja među lipokalinima.

[0042] Kako se ovde naizmenično koriste, pojmovi "konjugat," "konjugacija," "spojiti," "fuzija," ili "povezan" se odnose na spajanje dva ili više podjedinica, kroz sve oblike kovalente ili nekovalentne veze, pomoću ali bez ograničenja na, genetsku fuziju, hemijsku konjugaciju, spajanje pomoću linkera ili agensa za unakrsno umrežavanje, i nekovalentnu asocijaciju.

[0043] Pojam "fuzioni polipeptid" ili "fuzioni protein" kako se ovde koristi se odnosi na polipeptid ili protein koji obuhvata dve ili više podjedinica. Fuzioni protein kao što je definisano u priloženom setu patentnih zahteva obuhvata dve ili više podjedinica, od kojih najmanje jedna od ovih podjedinica ima sposobnost specifičnog vezivanja za CD137, i dodatnu jedinicu koja je sposobna da se specifično vezuje za PD-L1. Unutar fuzionog proteina, ove podjedinice mogu biti povezane kovalentnom ili nekovalentnom vezom. Poželjno, fuzioni protein predstavlja translacionu fuziju između dve ili više podjedinica.

Translaciona fuzija može da nastane genetskim konstruisanjem kodirajuće sekvence za jednu podjedinicu u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom dodatne podjedinice. Obe podjedinice mogu biti ukrštene nukleotidnom sekvencom koja kodira linker. Međutim, podjedinice fuzionog proteina ovog otkrivanja takođe mogu biti povezane hemijskom konjugacijom. Podjedinice koje obrazuju fuzioni protein su obično međusobno povezane C-krajem jedne podjedinice sa N-krajem druge podjedinice, ili C-krajem jedne podjedinice sa C-krajem druge podjedinice, ili N-krajem jedne podjedinice sa N-krajem druge podjedinice, ili N-krajem jedne podjedinice sa C-krajem druge podjedinice. Podjedinice fuzionog proteina mogu biti povezane bilo kojim redom i mogu da uključuju više od jedne bilo kojih sastavnih podjedinica. Ako jedna ili više podjedinica predstavlja deo proteina (kompleks) koji se sastoji od više od jednog polipeptidnog lanca, pojam "fuzioni protein" takođe može da se odnosi na protein koji obuhvata spojene sekvence i sve druge polipeptidni lan(a)ce proteina (kompleksa). Kao ilustrativni primer, gde je imunoglobulin pune dužine spojen sa lipokalinskim muteinom teškim ili lakim lancem imunoglobulina, pojam "fuzioni protein" može da se odnosi na pojedinačni polipeptidni lanac koji i obuhvata lipokalinski mutein i teški ili laki lanac imunoglobulina. Pojam "fuzioni protein" takođe može da se odnosi na čitav imunoglobulin (i lake i teške lance) i lipokalinski mutein spojen sa jednim ili oba teška i/ili laka lanca.

[0044] Kako se ovde koristi, pojam "podjedinica" ovde otkrivenog fuzionog proteina se odnosi na pojedinačni protein ili odvojeni polipeptidni lanac, koji sam po sebi može da obrazuje stabilnu savijenu strukturu i definiše jedinstvenu funkciju obezbeđivanja motiva vezivanja prema cilju.

[0045] "Linker" koji može da obuhvata fuzioni protein ovog otkrivanja se spaja zajedno sa dve ili više podjedinica fuzionog proteina kako je ovde opisano. Veza može biti kovalentna ili nekovalentna.

Poželjna kovalentna veza je preko peptidne veze, kao što je peptidna veza između aminokiselina.

Poželjan linker je peptidni linker. Shodno tome, u poželjnom načinu ostvarivanja, pomenuti linker obuhvata jednu ili više aminokiselina, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više aminokiselina. Poželjni peptidni linkeri su ovde opisani, uključujući glicin-serinske (GS) linkere, glikosilisane GS linkere, i prolin-alanin-serin polimerne (PAS) linkere. U nekim poželjnim načinima ostvarivanja, GS linker je (G4S)3kako je opisan u SEQ ID NO: 13 se koristi da bi se zajedno spojile podjedinice fuzionog proteina. Drugi poželjni linkeri uključuju hemijske linkere.

[0046] Kako se ovde koristi, pojam "albumin" uključuje sve albumine sisara kao što su humani serumski albumin ili goveđi serum ili albumin iz seruma pacova.

[0047] Kako se ovde koristi, pojam "organski molekul" ili "mali organski molekul" označava organski molekul koji obuhvata najmanje dva atoma ugljenika, ali poželjno više od 7 ili 12 veza ugljenika koje mogu da se rotiraju, molekulske mase u opsegu između 100 i 2,000 daltona, poželjno između 100 i 1,000 daltona, i koji opciono uključuju jedan ili dva atoma metala.

[0048] "Uzorak" je definisan kao biološki uzorak uzet od bilo kog subjekta. Biološki uzorci uključuju, ali bez ograničenja na, krvni serum, urin, feces, semenu tečnost, ili tkivo, uključujući tumorsko tkivo.

[0049] "Subjekat" je kičmenjak, poželjno sisar, poželjnije čovek. Pojam "sisar" se ovde koristi za označavanje bilo koje životinje klasifikovane kao sisar, uključujući, bez ograničenja, ljude, domaće i životinje sa farme, i životinje iz zoološkog vrta, za sportove ili kućne ljubimce, kao što su, d neke, ovce, psi, konji, mačke, krave, pacovi, svinje, majmuni kao što su makaki rakojedi, kao neki od ilustrativnih primera. Poželjno, "sisar" koji se ovde koristi je čovek.

[0050] "Efektivna količina" je količina dovoljna da obezbedi korisne ili željene rezultate. Efektivna količina može da se da u jednoj ili više pojedinačnih primena ili doza.

[0051] Kako se ovde koristi, "antitelo" uključuje cela antitela ili bilo koji antigen-vezujući fragment (tj., "antigen-vezujući deo") ili njegov pojedinačni lanac. Celo antitelo se odnosi na glikoprotein koji obuhvata najmanje dva teška lanca (HC) i dva laka lanca (LC) međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (VHili HCVR) i konstantnog regiona lakog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog domena lakog lanca (VLili LCVR) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VHi VLregioni dodatno mogu da se podele u regione hipervarijabilnosti, označene sa regioni koji određuju komplementarnost (CDR), ukrštene sa regionima koji su više očuvani, označeni sa regioni okvira (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređena po sledećem redu od amino-kraja do karboksi-kraja: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom (na primer, PD-L1). Konstantni regioni antitela opciono mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiav domaćina ili faktore, uključujući razne ćelije imunog sistema (npr., ćelije efektora) i prvu komponentu (C1q) klasičnog komplementnog sistema.

[0052] Kako se ovde koristi, "antigen vezujući fragment" antitela se odnosi na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju mogućnost da se specifično vezuje za antigen (npr., PD-L1). Pokazalo se da antigen-vezujuću funkciju antitela mogu da izvedu fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih pojmom "antigen-vezujući fragment" antitela uključuju (i) Fab fragment koji se sastoji od VH, VL, CLi CH1domena; (ii) F(ab')2fragment koji obuhvata dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fab' fragment koji se sastoji od VH, VL, CLi CH1domena i region između CH1i CH2domena; (iv) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1domena; (v) jednolančani Fv fragment koji se sastoji od VHi VLdomena pojedinačnog kraka antitela, (vi) dAb fragmenta (Ward et al., Nature, 1989) koji se sastoji od VHdomena; i (vii) izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) ili kombinacija dva ili više izolovanih CDR koji opciono mogu biti združeni sintetičkim linkerom; (viii) "dijatelo" koje obuhvata VHi VLpovezane u istom polipeptidnom lancu kratkim linkerom (videti, npr., patentne dokumente EP 404,097; WO 93/11161; i Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993); (ix) "fragment antitela domena" koji sadrži samo VHili VL, pri čemu u nekim slučajevima dva ili više VHregiona su kovalentno združeni.

[0053] Antitela mogu biti poliklonalna ili monoklonalana; ksenogenska, alogenska, ili singenska; ili njihovi modifikovani oblici (npr., humanizovano, himerno, ili multispecifično). Antitela takođe mogu biti u potpunosti humana.

[0054] Kako se ovde koristi, "okvir" ili "FR" se odnosi na ostatke varijabilnog domena a da to nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (CDR).

[0055] "Fragmentni region koji može da se kristalizuje" ili "Fc region" se odnosi na C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca, uključujući FC regione nativne sekvence i Fc regione varijante. Iako granice Fc regiona imunoglobulinskog teškog lanca mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog

1

IgG se obično definiše tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226, ili od Pro230, do svog karboksilnog kraja pri čemu se numerišu prema EU indeksu Kabata (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). C-terminal lizin (ostatak 447 prema EU indeksu Kabata) Fc regiona može da se ukloni, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanje antitela, ili rekombinantim konstruisanjem nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Shodno tome, kompozicija intaktnog antitela može da obuhvata populacije antitela sa svih uklonjenih K447 ostatak, i populacije antitela sa mešavinom antitela sa i bez K447 ostatka.

[0056] "Fc receptor" ili "FcR" se odnosi na receptor koji se vezuje za Fc region antitela.

[0057] Kako se ovde koristi, "izolovano antitelo" se odnosi na antitelo koje suštinski ne sadrži prirodno okruženje. Na primer, izolovano antitelo suštinski ne sadrži celularni materijal i druge proteine iz ćelija ili tkiva iz kojih je izvedeno. "Izolovano antitelo" se dalje odnosi na antitelo koje suštinski ne sadrži druga antitela sa različitim antigenskim specifičnostima. U ovom slučaju, izolovano antitelo koje se vezuje specifično za PD-L1 suštinski ne sadrži antitela koja specifično vezuju antigene a da to nisu PD-L1.

Međutim, izolovano antitelo koje specifično vezuje PD-L1 može da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su PD-L1 molekuli od drugih vrsta.

[0058] Kako se ovde koristi, "monoklonalno antitelo" se odnosi na preparat molekula antitela pojedinačne molekuske kompozicije. Kompozicija monoklonalnog antitela prikazuje pojedinačnu specifičnost vezivanja u afinitet prema određenom epitopu.

[0059] Kako se ovde koristi, "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo koje se sastoji od CDR antitela dobijenih od sisara a da to nisu ljudi, i FR regiona i konstantnog regiona humanog antitela ili dobijenih od humanog antitela. Pojam "terapeutski agens" ili "terapeutski aktivan agens", kako se ovde koristi, se odnosi na agens koji je terapeutski koristan. Terapeutski agens može biti bilo koji agens za sprečavanje, poboljšanje, ili lečenje bolesti, fiziološkog stanja, simptoma, ili za procenu njene dijagnoze.

[0060] Kako se ovde koristi, "humano antitelo" uključuje antitela sa varijabilnim regionima u kojima su oba okvira i CDR regioni izvedeni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci humanih zametnih stanica. Dalje, ako antitelo sadrži konstantni region, taj konstantni region je takođe izveden iz humanih imunoglobulinskih sekvenci humanih zametnih stanica. Međutim, pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije predviđen da obuhvata antitela u kojima su sekvence CDR izvedene iz zametnih stanica drugih vrsta sisara, kao što su miš, nakalemljene na humane sekvence okvira.

III. OPIS CRTEŽA

[0061]

Fig.1: obezbeđuje prikaz modela reprezentativnih fuzionih proteina opisanih u ovoj prijavi koji su bispecifični za ciljeve CD137 i PD-L1. Reprezentativni fuzioni proteini su napravljeni na osnovu antitela specifičnog za PD-L1 (npr. antitelo pri čemu teške lance obezbeđuje SEQ ID NO: 86, ili obuhvata varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO: 77, ili obuhvata CDR sekvence iz GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), i VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), i lake lance koje obezbeđuje SEQ ID NO: 87, ili obuhvata varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO: 82, ili obuhvata CDR sekvence iz QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), i QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64)) i jedan ili više lipokalinskih muteina specifičnih za CD137 (npr., lipokalinski mutein iz SEQ ID NO: 42). Jedan ili više lipokalinskih muteina su genetički spojeni sa C- i/ili N-krajem ili teškog lanca ili lakog lanca antitela specifičnog za PD-L1 kao što je prikazano na Fig.1A-1I, što dovodi do fuzionih proteina, npr., SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91. Generisani fuzioni proteini bivalentni sa CD137 (npr., kao što je prikazano na Fig.1A-1D), ili četvorovalentni sa CD137 (npr., kao što je prikazano na Fig.1E-1H), ili mogu imati čak veću valentnost sa CD137 (npr., kao što je prikazano na Fig.1I). Dodatni monospecifični fuzioni proteini su nastali spajanjem jednog ili više lipokalinskih proteina specifičnih za CD137 (npr., kao što je prikazano na Fig.1J-1K) sa C-krajem Fc regionom antitela obezbeđenim kako je ovde opisano preko peptidnog linkera. Dobijeni monospecifični fuzioni proteini su obezbeđene u, npr., SEQ ID NO: 88 i SEQ ID NO: 89.

Fig.2: prikazuje rezultate ELISA eksperimenata u kojima je vezivanje za PD-L1 ili CD137 reprezentativnih fuzionih proteina određeno kao što je opisano u primeru 4. PD-L1 ili CD137 (sa C-terminalnim His ili Fc oznakom) je obložen na mikrotitarskoj ploči, i ispitani agensi su titrirani počevši od najviše koncentracije od 100 nM. Vrzani agensi tokom ispitivanja su detektovani putem anti-humanog IgG Fc-HRP ili anti-NGAL-HRP tim redom. Podaci su se uklapali sa 1:1 modelom vezivanja sa EC50vrednošću i maksimalnim signalom kao slobodnim parametrima, i nagibom koji je fiksiran za jednu. Dobijena EC50vrednosti su date u tabeli 4.

Fig.3: ilustruje rezultate ELISA eksperimenta u kojem je mogućnost reprezentativnih fuzionih proteina da simultano vezuje oba cilja, PD-L1 i CD137, određena kao što je opisano u primeru 5. Rekombinantni huPD-L1-His ili huCD137-His je obložen na mikrotitarskoj ploči, nakon čega je usledila titracija fuzionih proteina počevši od najviše koncentracije od 100 nM. Posle toga, konstantna koncentracija biotinilisanog huCD137-His ili biotinilisanog huPD-L1-His, tim redom, je dodata, što je detektovani preko ExtrAvidin-Peroxidase.

Fig.4: prikazuje rezultate ocene ciljanog vezivanja fuzionih proteina protočnom citometrijom pomoću humanog CD137 ili od makaki rakojeda (Fig.4A-4B) kao i humanog PD-L1 ili od makaki rakojeda (Fig.4C-4D) koji eksprimiraju Flp-In-CHO ćelije kao što je opisano u primeru 6. Nije primećeno vezivanje prilikom upotrebe lažno transfektovanih Flp-In-CHO ćelija (Fig.4E).

Geomterijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije je korišćena za izračunavanje

EC50vrednosti upotrebom nelinearne regresije (zajedničko dno, NAGIB =1). EC50vrednosti su date u tabeli 6.

1

Fig.5: prikazuje vezivanje fuzionih proteina za PD-L1-positivne tumorske ćelije procenjeno upotrebom protočne citometrije inkubiranjem RKO ćelija i fuziopnih proteina kao što je opisano u primeru 7.

Fig.6: obezbeđuje primere eksperimenta višestrukog vezivanja baziranog na SPR koji je napravljen da bi se istražilo da li interakcije fuzionog proteina sa CD137 ometa vezivanje CD137L za CD137, kao što je opisano u primeru 8. Ovo je ocenjeno stvaranjem kompleksa huCD137 (C-terminalna Fc fuzija) i huCD137L (sa C-terminalnom His oznakom) na SPR senzorskom čipu, i proverom da li fuzioni proteini još uvek mogu da vezuju kompleks huCD137 i CD137L. Kao referenca, huCD137 u odsustvu huCD137L se takođe inkubira sa ispitivanim fuzionim proteinima. SPR trag za vezivanje odgovarajućeg fuzionog proteina za sam huCD137 je obeleženo strelicom sa masnim vratom. SPR trag za vezivanje odgovarajućeg fuzionog proteina za huCD137 koji je zasićen sa huCD137L je obeležen strelicom sa isprekidanim vratom. Kao kontrole, slepe injekcije bez fuzionih proteina su korišćene. Eksperiment prikazuje da su svi ispitani fuzioni proteini bili u mogućnosti da se vezuje za CD137 u prisustvu CD137L.

Fig.7: prikazuje da fuzioni proteini ulaze u kompeticiju sa PD-L1 radi vezivanja za PD-1, prikazani u kompetitivnim ELISA ispitivanjima kao što je opisano u primeru 9. Konstantna koncentracija huPD-1-His je obložena na mikrotitarskoj ploči, nakon čega je usledilo dodavanje mešavine ispitivanih molekula u različitim koncentracijama i trag huPD-L1-Fc u fiksnoj koncentraciji. Vezani trag je detektovan upotrebom HRP-obeleženog anti-IgG Fc antitela. Primećena je inhibicija dozno zavisnog huPD-L1-Fc vezivanja za PD-1 CD137 i PD-L1 bispecifičnim fuzionim proteinima ili PD-L1 specifičnim antitelima.

Fig.8: Potencijal reprezentativnih fuzionih proteina da kostimulišu aktivaciju T-ćelija na način koji zavisi od PD-L1-cilja je ocenjen pomoću CD137 biološkog ispitivanja. NFκB-luc2/CD137 Jurkat ćelije su zajednički kultivisane sa PD-L1 koji eksprimira tumorsku ćelijsku liniju RKO u prisustvu raznih koncentracija fuzionih proteina ili kontrola. Posle 4h, reagens za ispitivanje luciferaze je dodat i izmereni su luminiscentni signali. Analiza logističke krive sa četiri parametra se izvodi sa GraphPad Prism<®>da bi se izračunale EC50vrednosti (videti tabela 9). Fuzioni proteini samo kostimulišu aktivaciju T-ćelija u prisustvu PD-L1 (Fig.8A i 8C) ali ne u odsustvu PD-L1 (Fig.8B i 8D). Nasuprot tome, referentno anti-CD137 mAb (SEQ ID NO: 28 i 29) prikazuje sličnu aktivaciju u prisustvu i odsustvu PD-L1 pozitivnih RKO ćelija.

Fig.9: prikazuje rezultate odgovarajućeg eksperimenta u kojem je istražena mogućnost izabranih fuzionih proteina da indukuju aktivaciju T-ćelija. PD-L1 antitela, uključujući gradivni blok odgovarajućeg PD-L1 antitela, CD137 vezujući lipokalinski muteini u obliku Fc fuzije, i antitelo sa oznakom anti-CD137 su ispitivane same i u kombinaciji u obliku anti-PD-L1/anti-CD137 koktela. U eksperimentu, humane mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) su inkubirane sa fuzionim proteinima, antitelima, Fc fuzijama lipokalinskog muteina, koktelima, ili kontrolom u prisustvu 1

1

ng/mL stafilokoknog enterotoksina B (SEB). Nivoi izlučenog interleukina 2 (IL-2), reflektivne aktivacije T-ćelija, su određene ispitivanjem baziranom na elektrohemoluminiscenciji kao što je opisano za aktivaciju T-ćelija i normalizovani do nivoa odgovarajuće IgG4 kontrole, kao što je opisano u primeru 11. Svi fuzioni proteini su sposobni za indukovanje aktivacije T-ćelija, i jače ili najmanje uporedivi sa pojedinačnim gradivnim blokovima ili koktelom sa oznakom anti-PD-L1/anti-CD137 antitela.

Fig.10: prikazuje mogućnost reprezentativnih fuzionih proteina da kostimulišu aktivaciju T-ćelija u na način koji je zavisan od PD-L1-cilja. PD-L1 antitela, uključujući odgovarajući gradivni blok PD-L1 antitela, CD137 vezujuće lipokalinske muteine u obliku Fc fuzija, i antitelo sa oznakom anti-CD137 su ispitivani sami i u kombinaciji kao anti-PD-L1/anti-CD137 koktel. Razne linije tumorskih ćelija koje eksprimiraju različite nivoe PD-L1 (visoki: RKO; umereni: HCC827; negativni: HepG) su posejane u ploče obložene anti-humanim CD3. Pan T ćelije i fuzioni proteini raznih koncentracija i pojedinačni gradivni blokovi su dodati i inkubirani tokom 3 dana. Nivoi izlučenih IL-2 su određeni ispitivanjem baziranim na elektrohemoluminiscenciji, kao što je opisano u primeru 12. Svi fuzioni proteini mogu da povećaju sekreciju IL-2 na način koji je zavisan od PD-L1.

Fig.11: ilustruje stabilnost čuvanja fuzionih proteina u PBS ili 25 mM histidinu, 60 mM NaCl, 200 mM argininu pH 6 posle 1-, 2-, 3-, ili 4-nedelje inkubacije na 37°C ili 40 °C u koncentraciji od 1mg/ml ili 20 mg/mL. Stabilnost je ocenjena opravkom monomera iz analitičkog isključivanja veličine ili oporavkom funkcionalnog proteina iz kvantitativne ELISA-e, kao što je opisano u primeru 13.

Fig.12: prikazuje mogućnost reprezentativnog fuzionog proteina (SEQ ID NO: 90 i 87) za stimulisanje sekrecija IL-2 u mešanoj limfocitnoj reakciji (MLR) sa CD4<+>T ćelijama. Fuzioni proteini, gradivni blok PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 86 i 87), CD137 vezujući lipokalinski mutein kao Fc fuzija (SEQ ID NO: 89), i antitelo sa oznakom anti-CD137 ili antitelo sa anti-PD-L1 oznakom samo ili u kombinaciji kao anti-PD-L1/anti-CD137 koktel, su ispitivani u ekvimolarnim koncentracijama, kao što je opisano u primeru 14. IL-2 sekrecija je izmerena u supernatantima posle 6 dana inkubacije ukupnim humanim CD4<+>T ćelijama i dendritskim ćelijama izvedenim iz monocita (moDC) od različitih zdravih davalaca. Fig.12A ilustruje da je fuzioni protein SEQ ID NO: 90 i 87 pokazao značajan porast sekrecije IL-2 u odnosu na sam gradivni blok (PD-L1 antitelo SEQ ID NO: 86 i 87 ili CD137 specifičan lipokalinski mutein SEQ ID NO: 89) i referentno anti-PD-L1 ilinti-CD137 antitelo (SEQ ID NO: 26 i 27 ili SEQ ID NO: 28 i 29, tim redom), u ekvimolarnim koncentracijama (ekvivalent sa 10 ili 0.1 µg/ml ispitanog fuzionog proteina). Podaci iz 8 nezavisnih eksperimenata su prikazani. Fig.12B prikazuje da fuzioni protein SEQ ID NO: 90 i 87 može da indukuje sekreciju IL-2 koja je zavisna od doze, u odnosu na koncentracije koje su u opsegu od 0.001 do 20 µg/mL. Nivoi IL-2 koje indukuje fuzioni protein su viši u odnosu na ekvimolarne koncentracije koktela referentnog anti-PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27) i referentnog anti-CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29). Prikazani su podaci reprezentativnih davalaca.

1

Fig.13: prikazuje mogućnost primernog fuzionog proteina (SEQ ID NO: 90 i 87) da indukuje sekreciju molekula efektora T-ćelija CD8<+>. Fuzioni protein je kultivisan sa moDCs i CD8<+>T ćelijama od neuparenih zdravih davalaca tokom 6 dana, posle čega je sekrecija IL-2 i molekula efektrora T-ćelija CD8<+>u supernatantima kvantifikovana Luminex ispitivanjem kao što je opisano u primeru 15. Fuzioni protein SEQ ID NO: 90 i 87 su pokazali porast sekrecije IL-2 i citotoksičnih faktora (perforin, granzim B, i granzm A) pri 10 µg/mL, u odnosu na referentno anti-PD-L1 antitelo (SEQ ID NO: 26 i 27) i referentno anti-CD137 antitelo (SEQ ID NO: 28 i 29) kada se upotrebljava samo ili u obliku koktela.

Fig.14: prikazuje da fuzioni proteini vezuju preklapajuće epitope sa klinički aktivnim CD137 antitelom (SEQ ID NO: 28 i 29), prikazanim u kompetitivnim ispitivanjima ELISA-e kao što je opisano u primeru 17. Konstantna koncentracija SEQ ID NO: 28 i 29 je obložena na mikrotitarskoj ploči, nakon čega je usledilo dodavanje mešavine molekula za ispitivanje u različitim koncentracijama i tragovima biotinilisanog huCD137-Fc u fiksnoj koncentraciji. Vezani trag je detektovan preko ExtrAvidin-Peroxidase. Fuzioni proteini ulaze u kompeticiju sa CD137 antitelom za CD137 vezivanje.

Fig.15: prikazuje potencijal reprezentativnih fuzionih proteina da blokiraju inhibitorni signal posredovan PD-1/PD-L1 interakcijom, procenjen biološkim ispitivanjem PD-1/PD-L1 blokade kao što je opisano u primeru 18. PD-1-NFAT-luc Jurkat T ćelije (Jurkat ćelijska linija koja ekpsrimira PD-1 i NFAT-posredovan gen luciferaze pod kontrolom NFAT promotera) su kokultivisane sa PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelijama u prisustvu raznih koncentracija molekula za ispitivanje. Posle 6 sati, reagens za ispitivanje luciferate je dodat i luminiscentni signali su izmereni. Pozadinski signal je PD-1-NFAT-luc Jurkat T ćelije kokultivisane sa samo PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelijama. Fuzioni protein SEQ ID NO: 90 i 87 blokiraju PD-1/PD-L1 put, uporedivo sa ispitivanim PD-L1 antitela, uključujući PD-L1 antitelo gradivnog bloka prikazano u SEQ ID NO: 86 i 87 i antitelo referentnog PD-L1 prikazano u SEQ ID NO: 26 i 27.

Fig.16: prikazuje mogućnost reprezentativnog fuzionog proteina da indukuje aktivaciju T-ćelije. Gradivni blok PD-L1 antitela i referentnog CD137 antitela, kada se koristi samo ili u kombinaciji sa PD-L1 antitelom, su dobro ispitani. U eksperimentu, humani PBMC su inkubirane sa fuzionim proteinom, antitelima, koktelima, ili kontrolom u prisustvu 0.1 ng/mL SEB. Nivoi izlučenog IL-2 su određeni ispitivanjem baziranim na elektrohemoluminiscencijom kao čitanje za aktivaciju T-ćelija, kao što je opisano u primeru 19 i prikazano na Fig.16A. Fig.16B prikazuje porast umnoška sekrecije nivoa IL-2 indukovanih molekulima za ispitivanje u poređenju sa nivoom pozadinske sekrecije IL-2 (PBMC stimulisane sa 0.1 ng/mL SEB i bez bilo kakvog molekula za ispitivanje). Fuzioni protein dovodi do dozno-zavisnog porasta sekrecije IL-2, koja je jača od samog PD-L1 antitela ili CD137 antitela ili u kombinaciji.

Fig.17: pokazuje mogućnost reprezentativnog fuzionog proteina da kostimuliše aktivaciju T-ćelija u prisustvu PD-L1. Gradivni blok PD-L1 antitela, referentno CD137 antitelo, i koktel CD137 antitela i

1

referentnog PD-L1 antitela su ispitivani paralelno. CHO ćelije ili transfektovane sa humanim PD-L1 (Fig.17A) ili lažno transfektovane (human PD-L1 negative, Fig.17B) su posejane u ploče koje su obložene anti-humanim anti-CD3. Pan T ćelije kao i razne koncentracije molekula za ispitivanje su dodate i inkubirane tokom 2 dana. Nivoi izlučenog IL-2 u supernatantu su određeni ispitivanjem baziranom na electrohemoluminiscenciji, kao što je opisano u primeru 20. Nivoi sekrecije IL-2 su normalizovani do pozadinskih nivoa (Pan T ćelije anti-CD3 CHO ćelije) kako bi se prikazao umnožak porasta sekrecije IL-2 u prisustvu humanog PD-L1 koji eksprimira CHO ćelije (Fig.17C) ili lažno transfektovane CHO ćelije (Fig.17D). Fuzioni protein indukuje jako dozno zavisno povećanje sekrecije IL-2 samo u prisustvu PD-L1, jače od samog referentnog CD137 antitela ili u kombinaciji sa referentnim PD-L1 antitelom.

Fig.18: obezbeđuje rezultat farmakokinetičkih analiza bispecifičnih fuzionih proteina i gradivnog bloka PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 86 i 87) kod miševa, kao što je opisano u primeru 21. Mužjacima CD-a miševa (3 miša po vremenskoj tački) su intravenski ubrizgavani fuzioni proteini u dozi od 10mg/kg. Nivoi leka su detektovani pomoću Sandwich ELISA koja detektuje pun molekul preko ciljeva PD-L1 i CD137. Nivoi anti-PD-L1 antitela u plazmi su određeni upotrebom Sandwich ELISA sa ciljevima PD-L1 i humanim Fc.

Fig.19: obezbeđuje rezultate farmakokinetičke analize za reprezentativni fuzioni protein (SEQ ID NO: 90 i 87) u poređenju sa dva prethodno opisana CD137- i PD-L1-vezujuća fuziona proteina (SEQ ID NO: 147 i SEQ ID NO: 148) kod miševa kao što je opisano u primeru 22. Mužjacima CD-a miševa (2 miša po vremenskoj tački) su ubrizgavani intravenski molekuli za ispitivanje u dozi od 2 mg/kg. Nivoi leka su detektovani pomoću ELISA u naznačenim vremenskim tačkama. Podaci su grafički prikazani na grafikonu vreme nasuprot koncentracije. Ovde opisani SEQ ID NO: 90 i 87, ali ne i SEQ ID NO: 147 ili SEQ ID NO: 148, prikazuje povoljan farmakokinetički profil i farmakokinetiku poput antitela.

IV. DETALJAN OPIS OVOG OTKRIVANJA

[0062] Kao što je ovde opisano, ovo otkrivanje obuhvata prepoznavanje da bivalentno CD137-sredstvo za vezivanje, kao što je antitelo, možda nije samo po sebi dovoljno da združi CD137 na T ćelijama ili NK ćelijama i dovede do efektne aktivacije, slične nedostatku dejstva trovalentnog rastvorljivog CD137L. U novijim objavama koje koriste pretkliničke mišje modele, in vivo dokazi su predstavljeni tako da način dejstva drugih anti-TNFR antitela zahteva interakciju antitela preko njihovog Fc-dela sa Fc-gama receptorima na Fc-gama-receptoru koji eksprimira ćelije (Bulliard et al., Immunol Cell Biol, 2014, Bulliard et al., J Exp Med, 2013). Načinom dejstva ovih anti-TNFR antitela samim tim može da dominira neciljno grupisanje preko Fc-gama receptora, u zavisnosti od prisustva Fc-gama receptora-koji eksprimira ćelije, koji se možda neće prekomerno eksprimirati u ciljanom tumorskom mikrookruženju u poređenju sa normalnim tkivima.

1

[0063] Stoga, postoji neispunjena potreba za stvaranjem terapeutika koji združuju i aktiviraju CD137 sa specifičnim načinom dejstva koji cilja tumor.

[0064] Da bi se ova potreba ispunila, ovo otkrivanje obezbeđuje, između ostalih stvari, nove pristupe za simultano uključivanje CD137 i PD-L1 preko jednog ili više fuzionih proteina sa specifičnošću vezivanja za CD137 i specifičnošću vezivanja za PD-L1. Pod uslovom da su fuzioni proteini napravljeni da promovišu CD137 grupisanje premošćavanjem CD137-pozitivnih T ćelija sa PD-L1 eksprimiranim u tumorskom mikrookruženju. Takvi bispecifični molekuli mogu da kombinuju aktivaciju T-ćelija indukovanu CD137 i širenje sa blokadom anti-PD-L1 posredovanom imunološkom kontrolnom tačkom i samim tim mogu da se prevaziđu određena ograničenja terapije pojedinačnim agensom i ponude koristi za, na primer, rezistentne ili pacijente koji ne daju odgovore. Fuzioni proteini su takođe napravljeni da obezbede potencijale kombinatorijalne terapije u jednom molekulu i da istovremeno omoguće lokalizovanu indukciju antigenski-specifičnih T-ćelija u tumorskom mikrookruženju, čime se potencijalno smanjuje periferna toksičnost.

[0065] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje fuzione proteine koji vezuju CD137 i PD-L1, kao i njihove postupke i korisne primene. Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje postupke pravljenja ovde opisanih CD137 i PD-L1 vezujućih fuzionih proteina kao i kompozicija koje obuhvataju takve proteine. CD137 i PD-L1 vezujući fuzioni proteini ovog otkrivanja kao i njihove kompozicije mogu da se koriste u postupcima detektovanja CD137 i/ili PD-L1 u uzorku, u postupcima vezivanja CD137 i/ili PD-L1 kod subjekta, ili u postupcima moduliranja imunoloških odgovora kod subjekta. Prethodno nisu opisani takvi fuzioni proteini sa takvim karakteristikama koji su koristi za upotrebe koje obezbeđuje ovo otkrivanje. Nasuprot ovde obezbeđenim fuzionim proteinim, prethodno poznati fuzioni proteini koji ciljaju i CD137 i PD-L1 su imali jednu ili više slabih farmakokinetika, neprihvatljiv stepen vezivanja van cilja, su smanjili ili na drugi način degradirali mogućnost vezivanja jednog ili oba cilja određenog fuzionog proteina (npr., PD-L1 i/ili CD137), i/ili neprihvatljiv stepen nespecifične (npr., nezavisan od PD-L1) aktivacije npr., imunog sistema.

A. Primeri fuzionih proteina specifičnih za CD137 i PD-L1 ovog otkrivanja.

[0066] Ovaj pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji je sposoban da vezuje i CD137 i PD-L1, pri čemu taj fuzioni protein obuhvata dve podjedinice, pri čemu ta prva podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine koji je specifičan za PD-L1, i pri čemu ta druga podjedinica obuhvata lipokalinski mutein koji je specifičan za CD137, pri čemu taj fuzioni protein obuhvata aminokiselinske sekvence koje su najmanje 90% identične sa sekvencom aminokiselinskih kiselina prikazanom u SEQ ID NO: 90 i 87, pri čemu teški lanac imunoglobulina obuhvata sledeći skup CDR sekvenci: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), a VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3, SEQ ID NO: 62) i laki lanac imunoglobulina obuhvataju sledeći skup CDR sekvenci: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), i QQSNSWPYT (LCDR3, SEQ ID NO: 64), i pri čemu aminokiselinska sekvenca lipokalinskog muteina

2

obuhvata sledeći skup mutiranih aminokiselinskih ostataka u odnosi na linearnu polipeptidnu sekvencu zrelog hNGAL (kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2): Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; i Lys 134 → Tyr. Obezbeđeni fuzioni protein kao što je definisano u priloženom setu patentnih zahteva sadrži najmanje dve podjedinice: (1) prvu podjedinicu koja obuhvata imunoglobulin pune dužine specifičan za PD-L1, i (2) drugu podjedinicu koja obuhvata lipokalinski mutein specifičan za CD137.

[0067] U nekim načinima ostvarivanja, najmanje jedna podjedinica može biti povezana sa drugom podjedinicom putem linkera. U nekim dodatnim načinima ostvarivanja, linker predstavlja peptidni linker, na primer, nestrukturni glicin-serinski (GS) linker, glikosilisani GS linker, ili prolin-alanin-serinski polimerni (PAS) linker. U nekim načinima ostvarivanja, GS linker predstavlja (Gly4Ser)3linker ((G4S)3) kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13. Drugi primerni linkeri su prikazani na SEQ ID NO: 14-23. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker može da ima od 1 do 50 aminokiselina, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1718, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina. Na primer, kada prva podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine, druga podjedinica može biti povezana peptidnim linkerom između N-kraja druge podjedinice i C-kraja konstantnog regiona teškog lanca (CH) pomenutog imunoglobulina.

[0068] Generalno, jedna podjedinica može biti spojena na svom N-kraju i/ili svom C-kraju sa drugom podjedinicom.

[0069] U nekim načinima ostvarivanja, u odnosu na fuzioni protein ovog otkrivanja, pri čemu najmanje jedna podjedinica može biti ili obuhvata imunoglobulin pune dužine, pri čemu se Fc funkcija Fc regiona pune dužine imunoglobulin sa Fc receptor-pozitivnom ćelijom može sačuvati u isto vreme dok se fuzioni protein simultano uključuje CD137 i PD-L1.

[0070] U nekim načinima ostvarivanja, pri čemu najmanje jedna podjedinica obezbeđenog fuzionog proteina može biti ili obuhvata imunoglobulin pune dužine, pri čemu Fc funkcija Fc regiona pune dužine imunoglobulina sa Fc receptor-pozitivnom ćelijom može biti smanjena ili u potpunosti suzbijena proteinom koji konstruiše dok taj fuzioni protein simultano uključuje CD137 i PD-L1. U nekim načinima ostvarivanja, ovo može da se postigne, na primer, prebacivanjem sa IgG1 srži na IgG4, jer je IgG4 poznato da pokazuje smanjene interakcije sa Fc-gama receptorom u poređenju sa IgG1. U nekim načinima ostvarivanja, da bi se dalje smanjilo rezidualno vezivanje za Fc-gama receptore, mutacije mogu biti uvedene u IgG4 srž kao što su F234A i L235A. U nekim načinima ostvarivanja, S228P mutacija takođe može biti uvedena u IgG4 srž kako bi se svela na minimum razmena IgG4 polu-antitela (Silva et al., J Biol Chem, 2015). U nekim načinima ostvarivanja, F234A i L235A mutacije mogu biti uvedene za smanjene ADCC i ADCP (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010) i/ili M428L i N434S mutacije ili M252Y, S254T, a T256E mutacije za produženo poluvreme eliminacije u serumu (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). U nekim načinima ostvarivanja, dodatna N297A mutacija može biti prisutna u imunoglobulinskom teškom lancu fuzionog proteina kako bi se uklonio motiv prirodne glikozilacije.

[0071] U nekim načinima ostvarivanja, Fc deo imunoglobulina uključuen u fuzioni protein ovog otkrivanja može da doprinese održavanju nivoa fuzionog proteina u serumu. Na primer, kada se Fc deo vezuje za Fc receptore na endotelijalnim ćelijama i fagocitima, fuzioni protein može da postane internalizovan i ponovo vraćen u krvotok, čime se pojačava njegovo poluvreme eliminacije unutar organizma.

[0072] U jednom aspektu, fuzioni proteini ovog otkrivanja vezuju CD137 sa velikim afinitetom. U drugom aspektu, obezbeđeni fuzioni proteini vezuju PD-L1 sa velikim afinitetom. U nekim poželjnim načinima ostvarivanja, obezbeđeni fuzioni proteini simultano vezuju CD137 i PD-L1. U nekim načinima ostvarivanja, simultano vezivanje za CD137 i PD-L1 omogućava obezbeđenim fuzionim proteinima da ispolje trajan anti-tumorski ili anti-infektivan odgovor.

[0073] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni fuzioni protein obuhvata aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 90 i 87.

[0074] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni fuzioni protein obuhvata aminokiselinske sekvence sa najmanje 92%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili čak veći identitet sekvence sa aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NO: 90 i 87.

B. Primerni imunoglobulini kako su uključeni u fuzione proteine.

[0075] Fuzioni protein kao što je definisan u priloženom setu patentnih zahteva obuhvata prvu podjedinicu koja obuhvata imunoglobulin pune dužine specifičan za PD-L1. U nekim načinima ostvarivanja, imunoglobulin, na primer, može biti IgG1, IgG2 ili IgG4. U nekim načinima ostvarivanja, imunoglobulin jeste ili obuhvata IgG4.

[0076] Ilustrativni primeri PD-L1-vezujućih antitela ovog otkrivanja mogu da obuhvataju antigen-vezujući region koji unakrsno blokira ili vezuje isti epitop kao PD-L1-vezujuće antitelo koje obuhvata regione varijabilnog domena teškog lanca (VH) i varijabilnog domena lakog lanca (VL) poznatog antitela kao što su atezolizumab (takođe poznat kao MPDL3280A ili RG7446, trgovinski naziv Tecentriq<®>), avelumab (takođe poznat kao MSB0010718C, trgovinski naziv Bavencio<®>), durvalumab (prethodno poznat kao MEDI4736, trgovinski naziv Imfinzi<®>), i BMS-936559 (takođe poznat kao MDX-1105), 5C10 (uključujući humanizovano 5C10), 5F10 (uključujući humanizovano 5F10), i 9F6 (uključujući humanizovano 9F6).

[0077] U nekim načinima ostvarivanja, par teškog lanca i lakog lanca obezbeđenog PD-L1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg domena je ili obuhvata HCVR i LCVR, tim redom, kao što sledi: SEQ ID NO: 77 i 82.

[0078] U nekim načinima ostvarivanja, par teškog lanca i lakog lanca obezbeđenog PD-L1 antitela je ili obuhvata aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86 i 87.

[0079] Varijabilni region teškog lanca obezbeđenog antitela PD-L1 ima tri CDR sa sledećim sekvencama: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62).

[0080] Varijabilni region lakog lanca obezbeđenog antitela PD-L1 ima tri CDR sa sledećim sekvencama: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64).

[0081] Obezbeđeno PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući domen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima tri CDR sa sledećim sekvencama: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), i varijabilni region lakog lanca koji ima tri CDR sa sledećim sekvencama: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64).

[0082] Ukoliko nije drugačije naznačeno, sve ovde otkrivene CDR sekvence su definisane prema IMGT postupku kako je opisan u Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999). CDR1 se sastoji od položaja 27 do 38, CDR2 se sastoji od položaja 56 do 65, CDR3 za V-gene nasledne linije se sastoji od položaja 105 do 116, CDR3 za preraspoređene V-J-gene ili V-D-J-gene se sastoji od položaja 105 do 117 (položaj koji prethodi J-PHE ili J-TRP 118) sa prazninama na gornjem delu petlje za preraspoređen CDR3-IMGT sa manje od 13 aminokiselina, ili sa dodatnim položajima 112.1, 111.1, 112.2, 111.2, itd. za preraspoređeni CDR3-IMGT sa više od 13 aminokiselina. Ti položaji dati u ovom paragrafu su prema IMGT nabrajanju opisani u Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999).

[0083] Antitela koja se specifično vezuju za PD-L1 kako su obuhvaćena fuzionim proteinima ovog otkrivanja mogu da obuhvataju Fc deo koji omogućava produženje poluvremena eliminacije in vivo bispecifičnog vezujućeg molekula ovog otkrivanja. U nekim načinima ostvarivanja, takav Fc deo je poželjno humanog porekla, poželjnije humani Fc deo IgG1 ili IgG4 antitela, čak poželjnije konstruisani humani Fc deo IgG1 ili IgG4 uz aktiviranje ili utišavanje funkcija efektora. U nekim načinima ostvarivanja, utišavanje funkcija efektora može biti poželjno u odnosu na aktiviranje funkcija efektora. U nekim načinima ostvarivanja, takav Fc deo je konstruisan da utiša funkcije efektora sa mutacijom(ama) na položajima 234 i/ili 235, nabrajanje prema EU indeksu Kabata (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). U nekim načinima ostvarivanja, mutacije u položajima F234 i L235 obezbeđenog anti-PD-L1 antitela mogu biti uvedene da se utišaju funkcije efektora. U drugim načinima ostvarivanja, mutacije u položajima D265 i P329 obezbeđenog anti-PD-L1 antitela mogu biti uvedene da se utiša funkcija efektora. Numerisanje oba skupa ovih potencijalnih mutacija je prema EU indeksu Kabata (Shields et al., J Biol Chem, 2001).

[0084] Razne tehnike za proizvodnju antitela i njihovih fragmenata su samim tim dobro poznate u tehnici i opisane, npr., u Altshuler et al. (2010). Stoga, na primer, poliklonalna antitela mogu da se dobiju iz krvi životinje nakon imunizacije antigenom u mešavini sa aditivima i adjuvansima, a monoklonalna antitela mogu biti proizvedena bilo kojom tehnikom koja obezbeđuje antitela proizvedena kulturama kontinuirane ćelijske linije. Primeri takvih tehnika su opisani, npr., Harlow and Lane (1999), (1988), i

2

uključuju tehniku hibridoma koju je originalno opisao Köhler and Milstein, 1975, tehniku trioma, tehniku hibridoma humane B ćelije (videti npr. Li et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006, Kozbilind Roder, Immunol Today, 1983) I tehniku EBV-hibridoma za proizvodnju monoklonalnih antitela ili može da se pripremi de novo pomoću raznih postupka za prikazivanje kao što su fag, ribozomalni, mRNK, ili ćelijski prikaz.

C. Primerni lipokalinski muteini ovog otkrivanja.

[0085] Lipokalini su proteinski vezujući molekuli koji su se prirodno razvili da vezuju ligande. Lipokalini se javljaju u mnogim organizmima, uključujući kičmenjake, insekte, biljke, i bakterije. Članovi lipokalinske proteinske porodice (Pervaiz and Brew, FASEB J, 1987) su obično mali, izlučeni proteini koji imaju pojedinačan polipeptidni lanac. Karakteriše ih opseg različitih svojstava molekulskog prepoznavanja: njihovo vezivanje za razne prevashodno hidrofobne male molekule (kao što su retinoidi, masne kiseline, holesteroli, prostaglandini, biliverdini, feromoni, tastanti, i davaoci mirisa), i njihovo vezivanje za specifične receptore ćelijske površine i njihovo formiranje makromolekulskih kompleksa. Iako su u prošlosti bili klasifikovani prevashodno kao prenosni proteini, sada je jasno da lipokalini ispunjavaju razne fiziološke funkcije. U njih spadaju uloge u prenosu retinola, mirisanju, signaliziranju feromona, i sintezi prostaglandina. Lipokalini su takođe naznačeni u regulaciji imunološkog odgovora i posredovanju homeostaze ćelija (pregledano, npr., u Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996).

[0086] Lipokalini dele neobično niske nivoe celokupne konzervacije sekvence, često sa identitetima sekvence manjim od 20%. Strogo nasuprot tome, njihov celokupni model savijanja je izuzetno konzervisan. Centralni deo lipokalinske strukture se sastoji od pojedinačnog osmolančanog antiparalelnog β-lista zatvorenog nazad na sebe kako bi se obrazovalo kontinuirano β-bure vezano vodonikom. Ovo β-bure obrazuje centralnu šupljinu. Jedan kraj bureta je sterikalno blokiran N-terminalnim peptidnim segmentom koji prolazi kroz dno kao i sa tri peptidne petlje koje povezuju βlance. Drugi kraj β-bureta je otvoren za rastvarač i obuhvata mesto za vezivanje cilja, koje obrazuju četiri fleksibilne peptidne petlje (AB, CD, EF, i GH). Raznolikost petlji u lipokalinskoj strukturi koja je inače kruta omogućavaju raznolikost različitih načina vezivanja pri čemu je svaka sposobna da prilagođava ciljeve različite veličine, oblika, i hemijskog karaktera (pregledano, npr., u Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996).

[0087] Lipokalinski mutein prema ovom otkrivanju može biti mutein bilo kog lipokalina. Primeri pogodnih lipokalina (takođe ponekad označeni sa "referentni lipokalin," "lipokalin divljeg tipa ," "strukture referentnog proteina," ili jednostavno "strukture") od kojih se može koristiti mutein uključuju, ali bez ograničenja na, lipokalin iz suza (lipokalin-1, Tlc, ili protein von Ebnerove žlezde, retinol vezujući protein, prostaglandinska D-sintaza neutrofila lipokainskog tipa, β-laktoglobulin, bilin-vezujući protein (BBP), apolipoprotein D (APOD), neutrofilni lipokalin povezan sa želatinazom (NGAL), protein koji se odnosi na α2-mikroglobulin (A2m), 24p3/uterokalin (24p3), protein von Ebnerove žlezde 1 (VEGP 1), protein von Ebnerove žlezde 2 (VEGP 2), i glavni alergen Can f 1 (ALL-1).

[0088] Aminokiselinska sekvenca lipokalinskog muteina prema ovom otkrivanju može imati sekvencu visokog identiteta u poređenju sa referentnim (ili divljeg tipa) lipokalinom iz kojeg je izveden, na primer, hTlc ili hNGAL, u odnosu na identitete sekvenci sa drugim lipokalinom (videti prethodno takođe). U ovom generalnom kontekstu aminokiselinska sekvenca lipokalinskog muteina prema ovom otkrivanju je najmanje suštinski slična aminokiselinskoj sekvenci odgovarajućeg referentnog (divljeg tipa) lipokalina, pod uslovom da mogu postojati praznine (kako je ovde definisano) u poravnanju koje su rezultat dodavanja ili brisanja aminokiselina.

[0089] Obično, lipokalinski mutein sadrži jedan ili više ostataka mutiranih aminokiselina – u odnosu na aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa ili referentnog lipokalina, na primer, hTlc i hNGAL – u četiri petlje na otvorenom kraju koje obuhvataju ligand-vezujući džep i definišu ulaz ligand-vezujućeg džepa (u poređenju sa prethodnim). Kako je prethodno objašnjeno, ovi regioni su suštinski u određivanju specifičnosti vezivanja lipokalinskog muteina za željeni cilj.

D. Primerni lipokalinski mutein specifičan za CD137 ovog otkrivanja.

[0090] Kako je prethodno navedeno, lipokalin je polipeptid kojeg definiše njegova supersekundarna struktura, naime region supersekundarne strukture cilindričnog β-nabranog lista povezan u paru sa četiri petlje na jednom kraju kako bi se samim tim definisao vezujući džep. Ovo otkrivanje nije ograničeno na konkretno ovde otkrivene lipokalinske muteine. U ovom smislu, ovo otkrivanje se odnosi na lipokalinski mutein sa regionom supersekundarne strukture cilindričnog β-nabranog lista koji obuhvata osam βlanaca u paru povezanih sa četiri petlje na jednom kraju kako bise time definisao vezujući džep, pri čemu je najmanje jedna aminokiselina svake od najmanje tri pomenute četiri petlje mutirana i pri čemu je pomenuti lipokalin efikasan u vezivanju CD137 sa afinitetom koji može da se detektuje.

[0091] U jednom aspektu, ovo otkrivanje uključuje bilo koji broj lipokalinskih muteina izvedenih iz referentnog (divljeg tipa) lipokalina, poželjno izvedenih iz zrelog hTIc ili zrelog hNGAL, koji vezuju CD137 sa afinitetom koji može da se detektuje. U povezanom aspektu, ovo otkrivanje uključuje razne lipokalinske muteine koji mogu da aktiviraju puteve nishodnog signaliziranja CD137 vezivanjem za CD137. U ovom smislu, CD137 se može smatrati neprirodnim ciljem referentnog (divljeg tipa) lipokalina, poželjno hTIc ili hNGAL, pri čemu se "neprirodni" odnosi na supstancu koja se ne vezuje za referentne (divljeg tipa) lipokaline u fiziološkim uslovima.

[0092] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje CD137-vezujuće hNGAL muteine. U ovom smislu, ovo otkrivanje obezbeđuje jedan ili više hNGAL muteina koji su sposobni za vezivanje CD137 sa afinitetom izmerenim sa KDod oko 800 nM, 700 nM, 200 nM, 140 nM, 100 nM ili manje, poželjno oko 70 nM, 50 nM, 30 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, ili čak manje.

[0093] CD137-vezujući hNGAL mutein koji je deo fuzionog proteina prema ovom pronalasku obuhvata sledeći skup mutiranih aminokiselinskih ostataka u odnosi na linearnu polipeptidnu sekvencu zrelog

2

hNGAL kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2: Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; i Lys 134 → Tyr. U nekim načinima ostvarivanja, hNGAL mutein koji obuhvata fuzioni protein prema ovom pronalasku obuhvata aminokiselinsku sekvencu kako je definisana u SEQ ID NO: 42.

[0094] U nekim načinima ostvarivanja, hNGAL mutein koji obuhvata fuzioni protein prema ovom pronalasku ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili više identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 42.

[0095] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni protein prema ovom pronalasku obuhvata lipokalinski mutein koji vezuje CD137 sa afinitetom mernim sa KDod oko 5 nM ili manje, pri čemu lipokalinski mutein ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili više identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 42.

[0096] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni protein prema ovom pronalasku obuhvata lipokalinski mutein koji može da obuhvata heterolognu aminokiselinsku sekvencu na svom N-ili C-kraju, poželjno C-kraju, kao što su Strep II oznaka (SEQ ID NO: 12) ili sekvenca mesta cepanja za određene restriktivne enzime, bez uticaja na biološko dejstvo (vezivanje za svoj cilj, npr., CD137) lipokalinskog muteina.

[0097] U nekim načinima ostvarivanja, dodatne modifikacije lipokalinskog muteina mogu biti uvedene kako bi se modulirale određene karakteristike muteina, kao što su poboljšanje stabilnosti uvijanja, stabilnost seruma , proteinska rezistentnost ili rastvorljivost u vodi kako bi se smanjila tendencija ka sakupljanju, ili kako bi se uvele nove karakteristike za mutein. U nekim načinima ostvarivanja, modifikacija(e) mogu da dovedu do dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10) karakteristika obezbeđenog muteima koji se modulira.

[0098] Na primer, moguće je mutirati jedan ili više položaja aminokiselinske sekvence lipokalinskog muteina da bi se uvele nove reaktivne grupe, na primer, za konjugaciju sa drugim jedinjenjima, kao što je polietilen glikol (PEG), hidroksietilni skrob (HES), biotin, peptidi ili proteini, ili za formiranje disulfidnih veza koje se ne javljaju prirodno. Konjugovano jedinjenje, na primer, PEG i HES, može u nekim slučajevima da poveća poluvreme eliminacije u serumu odgovarajućeg lipokalinskog muteina.

[0099] U nekim načinima ostvarivanja, reaktivna grupa lipokalinskog muteina može prirodno da se javi u svojoj aminokiselinskoj sekvenci, kao što su cisteinski ostaci koji se prirodno javljaju u pomenutoj aminokiselinskoj sekvenci. U nekim drugim načinima ostvarivanja, takva reaktivna grupa može biti uvedena mutagenezom. U slučaju da je reaktivna grupa uvedena mutagenezom, jedna mogućnost je mutacija aminokiseline na odgovarajućem položaju cisteinskim ostatkom. Primerne mogućnosti takve mutacije da se uvede cisteinski ostatak u aminokiselinsku sekvencu hTIc muteina uključuju supstitucije Thr 40→ Cys, Glu 73→ Cys, Arg 90→ Cys, Asp 95→ Cys, i Glu 131→ Cys sekvence divljeg tipa iz hTIc (SEQ ID NO: 1). Primerne mogućnosti takve mutacije za uvođenje cisteinskog ostataka u aminokiselinsku

2

sekvencu hNGAL muteina uključuju uvođenje cisteinskog ostatka na jednom ili više položaja sekvenci koji odgovaraju položajima sekvenci 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 ili 158 sekvence divljeg tipa iz hNGAL (SEQ ID NO: 2).Generisana tiolska grupa može da se koristi da PEGiliše ili HESiliše mutein, na primer, da bi se povećalo poluvreme eliminacije odgovarajućeg lipokalinskog muteina u serumu.

[0100] U nekim načinima ostvarivanja, da bi se obezbedili bočni lanci pogodne aminokiseline kao nove reaktivne grupe za konjugovanje jednog od gore navedenih jedinjenja na lipokalinskom muteinu, mogu da se uvedu veštačke aminokiseline u aminokiselinsku sekvencu lipokalinskog muteina. Generalno, takve veštačke aminokiseline su napravljene da bi bile reaktivnije i samim tim kako bi se olakšala konjugacija na željenom jedinjenju. Takve veštačke aminokiseline mogu biti uvedene mutagenezom, na primer, upotrebom veštačkog tRNK je para-acetil-fenilalanin.

E. Primerne upotrebe i primene fuzionih proteina specifičnih za CD137 i PD-L1

[0101] Pozivanja na postupke lečenja terapijom ili hirurški ili postupke in vivo dijagnostike ili upotrebe jedinjenja ili kompozicija za postupke lečenja terapijom ili hirurški ili postupcima in vivo dijagnostike u ovom poglavlju opisa bi trebalo da se tumače kao pozivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove prema ovom pronalasku za upotrebu u ovim postupcima.

[0102] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini ovog otkrivanja mogu da proizvedu sinergistički efekat putem dvostrukog ciljanja CD137 i PD-L1. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini ovog otkrivanja mogu da proizvedu sinergistički efekat putem CD137 kostimulacije i blokade PD-1/PD-L1 puta. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini ovog otkrivanja mogu da proizvedu lokalizovan antitumorski efekat dvostrukim ciljanjem CD137 i PD-L1. Zbog toga u medicini postoje brojne moguće primene za fuzione proteine ovog otkrivanja.

[0103] U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obuhvata upotrebu jednog ili više ovde otkrivenih fuzionih proteina ili jedne ili više kompozicija koje obuhvataju takve fuzione proteine za simultano vezivanje CD137 i PD-L1.

[0104] Ovo otkrivanje takođe uključuje upotrebu jednog ili više fuzionih proteina kako je opisano za formiranje kompleksa sa CD137 i/ili PD-L1.

[0105] Stoga u jednom aspektu ovog otkrivanja, obezbeđeni fuzioni proteini mogu da se koriste za detekciju CD137 i PD-L1. Takva upotreba može da uključuje faze stupanja u kontakt jednog ili više pomenutih fuzionih proteina, u pogodnim uslovima, sa uzorkom za koji se sumnja da sadrži CD137 i/ili PD-L1, čime se omogućava stvaranje kompleksa između fuzionih proteina i CD137 i/ili PD-L1, i detektovanje kompleksa pogodnim signalom. Signal koji može da se detektuje može biti uzrokovan etiketom, kako je prethodno objašnjeno, ili promenom fizičkih svojstava usled vezivanja, tj., pravljenja samog kompleksa. Jedan primer je površinska rezonanca plazmona, pri čemu se njena vrednost menja tokom vezivanja vezujućih partnera od kojih je jedan imobilisan na površini kao što je zlatna folija.

[0106] Fuzioni proteini ovog otkrivanja takođe mogu da se koriste za razdvajanje CD137 i/ili PD-L1.

2

Takva upotreba može da uključuje faze stupanja u kontakt jednog ili više pomenutih fuzionih proteina, u pogodnim uslovima, sa uzorkom za koji se pretpostavlja da sadrži CD137 i/ili PD-L1, čime se omogućava formiranje kompleksa između fuzionih proteina i CD137 i/ili PD-L1 i razdvajanje kompleksa iz uzorka.

[0107] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje dijagnostičke i/ili analitičke komplete koji obuhvataju jedan ili više fuzionih proteina prema ovom otkrivanju.

[0108] Pored njihove upotrebe u dijagnostici, opet u drugom aspektu, ovo otkrivanje uzima u razmatranje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju jedan ili više fuzionih proteina ovog otkrivanja i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0109] Dalje, u nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje fuzione proteine koji simultano vezuju CD137 i/ili PD-L1 za upotrebu kao što su anti-tumorski i/ili anti-infektivni agensi, i imunološke modulatore. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini ovog pronalaska su predviđeni za upotrebu u postupku prevencije, poboljšanja, ili lečenja humanih bolesti, kao što su razni kanceri, uključujući PD-L1-pozitivne kancere. Shodno tome, takođe su obezbeđeni postupci sprečavanja, poboljšanja, ili lečenja humanih bolesti kao što su razni kanceri, uključujući PD-L1-pozitivan kancer, kod subjekta kojem je to potrebno, koji obuhvata davanje pomenutom subjektu terapeutski efektivne količine jednog ili više fuzionih proteina ovog otkrivanja.

[0110] Primeri kancera koji mogu da se leče upotrebom fuzionih proteina ovog otkrivanja, uključuju kancer jetre, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer pluća, kutani ili intraokularni maligni melanom, renalni kancer, kancer materice, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer testisa, kancer materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grlića, karcinom vagine, karcinom vulve, n-Hodžkinov limfom, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarklom mekog tkiva, kancer mokraćnih kanala, kancer penisa, čvrsti tumori iz detinjstva, limfocitni limfom, kancer bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežne karlice, neoplazma centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS, tumilingiogeneza, tumor spinalne ose, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, Kapošijev sarkom, epidermoidni kancer, kancer pločastih ćelija, kanceriz izazvani usled spoljašnjih faktora uključujući one koje izaziva azbest, hematološki maligniteti uključujući, na primer, multipli mijelom, limfom B ćelija, Hodžkinov limfom/pimarni medijastinalni limfom B-ćelija, ne-Hodžkinovi limfomi, akutni mijeloidni limfom, hronična mijelogena leukemija, hronična limfoidna leukemija, folikularni limfom, difuzni limfom velikih B-ćelija, Burkitov limfom, imunoblastični limfom velikih ćelija, B-limfoblastični limofm prekursora, limfom ćelija omotača, akutna limfoblastična leukemija, mikozni fungoidi, limfom anaplastičnih velikih ćelija, limfom T ćelija, i T-limfoblastični limfom prekursora, i bilo koje kombinacije pomenutih kancera. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe može da se primeni na lečenja metastatskih kancera.

[0111] U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini prema ovom pronalasku mogu simultano da

2

ciljaju tumorske ćelije u kojima je PD-L1 eksprimiran i aktivira limfocite imunog sistema domaćina blizu takvih tumorskih ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini prema ovom pronalasku mogu da povećaju ciljane anti-tumorsko dejstvo T ćelija, pojačaju anti-tumorski imunitet i, i/ili imaju direktan efekat inhibiranja rasta tumora, čime se proizvode sinergistički anti-tumorski rezultati. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini prema ovom pronalasku mogu da aktiviraju odgovore u tumorskom mikrookruženju. U nekim načinima ostvarivanja, fuzioni proteini prema ovom pronalasku mogu da smanje neželjene efekte limfocita efektora prema zdravim ćelijama, tj. toksičnost van cilja, na primer, lokalnim inhibiranjem onkogenskog dejstva i izazivanjem aktivacije limfocita.

[0112] U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obuhvata upotreba fuzionog proteina prema ovom pronalasku, ili kompoziciju koja obuhvata obezbeđeni fuzioni protein, za uključivanje lokalizovanog limfocitnog odgovora u blizini PD-L1-pozitivnih tumorskih ćelija. Shodno tome, u nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke izazivanja lokalizovanog limfocitnog odgovora u blizini PD-L1-pozitivnih tumorskih ćelija, koji obuhvataju primenu jednog ili više fuzionih proteina prema ovom pronalasku ili jedne ili više kompozicija koje obuhvataju takva fuzione proteine. "Lokalizovan" znači da nakon simultanog vezivanja T-ćelije preko CD137 i uključivanja PD-L1-pozitivnih tumorskih ćelija, T-ćelije proizvode citokine, određenije IL-2 i/ili IFN gama u blizini PD-L1-pozitivnih ćelija. Takvi citokini odražavaju aktivaciju T-ćelija koja zatim može da ubija PD-L1-pozitivne ćelije, direktno ili indirektno privlačenjem drugih ćelija ubica, kao što su T-ćelije ili NK ćelije.

[0113] U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obuhvata upotrebu fuzionog proteina prema ovom pronalasku, ili kompozicije koji obuhvata takav fuzioni protein, za zajedničko stimulisanje T-ćelija, i/ili aktiviranje puteva nishodnog signaliziranja CD137. Poželjno, obezbeđeni fuzioni protein zajednički stimuliše T-ćelije i/ili aktiviranje puta nishodnog signaliziranja CD137 prilikom uključivanja tumorskih ćelija u kojima se eksprimira PD-L1. Shodno tome, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke izazivanja T limfocitne proliferacije i/ili aktiviranja puteva nishodnog signaliziranja CD137, poželjno prilikom uključivanja tumorskih ćelija u kojima se eksprimira PD-L1, koji obuhvata primenu jednog ili više fuzionih proteina ovog otkrivanja i/ili jedne ili više kompozicija koja obuhvata takve fuzione proteine.

[0114] U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obuhvata upotrebu fuzionog proteina prema ovom pronalasku ili kompozicije koje obuhvataju takav fuzioni protein, za indukovanje CD137 grupisanja i aktivacije na T-ćelijama i usmeravanje takvih T-ćelija na tumorske ćelije u kojima je eksprimiran PD-L1.

F. Proizvodnja primera radi obezbeđenih fuzionih proteina specifičnih za CD137 i PD-L1.

[0115] U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje molekule nukleinske kiseline (DNK i RNK) koji uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju fuzioni protein kao što je definisano u priloženom setu patentnih zahteva. U nekim načinima ostvarivanja, ovo otkrivanje obuhvata ćeliju domaćina koja sadrži obezbeđeni molekul nukleinske kiseline. Budući da degenerisanje genetskog koda dozvoljava supstitucije određenih kodona od strane drugih kodona koji označavaju istu aminokiselinu, ovo

2

otkrivanje nije ograničeno na konkretan molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein kako je ovde opisano, već obuhvata sve molekule nukleinske kiseline koji uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju funkcionalni fuzioni protein. U ovom smislu, ovo otkrivanje se takođe odnosi na nukleotidne sekvence koje kodiraju obezbeđene fuzione proteine.

[0116] Molekul nukleinske kiseline, kao što je DNK, je označen kao "sposoban da eksprimira molekul nukleinske kiseline" ili "može da omogući ekspresiju nukleotidne sekvence" ako uključuje elemente sekvence koji sadrže informacije koje se odnose na transkripcionu i/ili translacionu regulaciju, i takve sekvence su "operabilno povezane" sa nukleotidnom sekvencom koja kodira protein. Operabilna veza je veza u kojoj su elementi regulatorne sekvence i sekvenca koja se eksprimira spojeni tako da omogućavaju gensku ekspresiju. Precizna priroda regulatornih regiona neophodnih za gensku ekspresiju može da varira od vrste do vrste, ali generalno ovaj region uključuju promoter, koji, u prokariotama, sadrži i promoter per se, tj., elemente DNK koji usmeravaju početak transkripcije, kao i DNK elemente koji, kada se transkribuju u RNK, signaliziraju početak translacije. Takvi regioni promotera normalno uključuju 5' nekodirajućih sekvenci koje su uključene u početak transkripcije i translacije, kao što su the -35/-10 kutije i Shine-Dalgarno element u prokariotama ili TATA kutija, CAAT sekvence, i elementi 5'- za zatvaranje u eukariotama. Ovi regioni takođe mogu da uključuju pojačivač ili elemente represora kao I translacioni signal i vodeće sekvence za ciljanje nativnog proteina u specifičan odeljak ćelije domaćina.

[0117] Pored toga, 3' ne-kodirajuće sekvence mogu da sadrže regulatorne elemente uključene u transkripcionu terminaciju, polidadenilaciju ili tome slično. Ako, međutim, ove terminacione sekvence nisu zadovoljavajuće funkcionalne u određenoj ćeliji domaćina, mogu biti supstituisane signalima koji su funkcionalni u toj ćeliji.

[0118] Stoga molekul nukleinske kiseline ovog otkrivanja može biti "operabilno povezan" sa jednom ili više regulatornih sekvenci, kao što su sekvenca promotera, radi omogućavanja ekspresije ovog molekula nukleinske kiseline. U nekim načinima ostvarivanja, molekul nukleinske kiseline ovog otkrivanja uključuje sekvencu promotera i transkripcionu terminacionu sekvencu. Pogodni prokariotski promoteri su, na primer, tet promoter, lacUV5 promoter ili T7 promoter. Primeri promotera koji su korisni za ekspresiju u eukariotskim ćelijama su SV40 promoter ili CMV promoter.

[0119] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline takođe mogu biti deo vektora ili bilo koje druge vrste klonirajućeg vehikuluma, kao što su plazmid, fagmid, fag, bakulovirus, kozmid ili veštački hromozom.

[0120] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni molekul nukleinske kiseline može biti uključen u fagmid. Kako se koristi u ovom kontekstu, fagmidni vektor označava vektor koji kodira intergenski region umerenog faga, kao što je M13 ili f1, ili njegov funkcionalni deo spojen sa cDNK od značaja. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, nakon superinfekcije bakterijskih ćelija domaćina sa takvim obezbeđenim fagmidnim vektorom i odgovarajućim fagom pomoćnika (npr., M13K07, VCS-M13 ili R408) proizvode se intaktne čestice faga, čime se omogućava fizičko spajanje kodirane heterologne cDNK sa svojim odgovarajućim polipeptidom prikazanim na površini faga (Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi and Makowski, Curr Opin Biotechnol, 1999).

[0121] Prema raznim načinima ostvarivanja, klonirajući vehikulumi mogu da uključuju, pored prethodno opisanih regulatornih sekvenci i sekvence nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein kako je ovde opisano, replikacione i kontrolne sekvence izvedene iz vrste koja je kompatibilna sa ćelijom domaćina se koristi za ekspresiju kao i selekcione markere koji daju selektabilni feontip na transformisanim ili transfektovanim ćelijama. Veliki broj pogodnih klonirajućih vektora su poznati u tehnici i komercijalno su dostupni.

[0122] Ovo otkrivanje se takođe odnosi na, u nekim načinima ostvarivanja, postupke za proizvodnju fuzionih proteina ovog otkrivanja počevši od nukleinske kiseline koja kodira za fuzioni protein ili bilo koju podjedinicu pomoću postupaka genetskog inženjeringa kao što je definisano u priloženom setu patentnih zahteva. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni postupak može da se izvede in vivo, pri čemu obezbeđeni fuzioni protein može, na primer, da bude proizveden u bakterijskom ili eukariotskom organizmu domaćina, a zatim izolovan iz ovog organizma domaćina ili svoje kulture. Takođe je moguće da se proizvede fuzioni protein ovog otkrivanja in vitro, na primer, upotrebom in vitro translacionog sistema.

[0123] Prilikom proizvodnje fuzionog proteina in vivo, nukleinska kiselina koja kodira takav fuzioni protein može biti uvedena u pogodan bakterijski ili eukariotski organizam domaćina upotrebom rekombinantne DNK tehnologije koja je dobro poznata u tehnici. U nekim načinima ostvarivanja, molekul DNK koji kodira fuzioni protein prema ovom pronalasku, i određenije klonirajući vektor koji sadrži kodirajuću sekvencu takvog fuzionog proteina može biti transformisan u ćeliju domaćina koja može da eksprimira gen. Transformacija može da se izvede upotrebom standardnih tehnika. Stoga, ovo otkrivanje je takođe usmereno na ćelije domaćina koje sadrže molekul nukleinske kiseline kao što je ovde otkriveno.

[0124] U nekim načinima ostvarivanja, transformisane ćelije domaćina mogu biti kultivisane u uslovima pogodnim za ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira fuzioni protein prema ovom pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije domaćina mogu biti prokariotske, kao što su Escherichia coli (E. coli) ili Bacillus subtilis, ili eukaryotic, kao što su Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 ili ćelije insekta High5, besmrtne ćelijske linije sisara (npr., HeLa ćelije ili CHO ćelije) ili primarne ćelije sisara.

[0125] U nekim načinima ostvarivanja, gde lipokalinski mutein ovog otkrivanja obuhvaćen fuzionim proteinom kao što je definisano u priloženom setu patentnih zahteva, uključuje intramolelulske disulfidne veze, može biti poželjno da se usmeri protein u nastajanju na ćelijski odeljak sa oksidirajućim redoks miljeom pomoću odgovarajuće signalne sekvence. Takvo oksidirajuće okruženje može da obezbedi periplazma Gram-negativnih bakterija kao što su E. coli, u ekstracelularnom miljeu Grampozitivnih bakterija ili lumenu endoplazmatskog retikuluma eukariotskih ćelija i obično se prednost daje obrazovanju strukturnih disulfidnih veza.

1

[0126] U nekim načinima ostvarivanja, takođe je moguće da se proizvede fuzioni protein prema ovom pronalasku u cistoli ćelije domaćina, poželjno E. coli. U ovom slučaju, obezbeđeni fuzioni protein može direktno da se dovije u rastvorljivom i uvijenom stanju ili oporavljen u obliku inkluzionih tela, nakon čega sledi renaturacije in vitro. Dodatna opcija je upotreba specifičnih sojeva domaćina sa oksidirajućim intracelularnim miljeom, koji samim tim može da omogući stvaranje disulfidnih veza u cistoli (Venturi et al., J Mol Biol, 2002).

[0127] Stručnjak iz oblasti će razumeti postupke korisne za pripremu fuzionih proteina kojim se ovo otkrivanje bavi ali pri čemu taj protein ili sekvence nukleinske kiseline nisu direktno ovde otkriveni. Kao neki pregled, takve modifikacije aminokiselinske sekvence uključuju, npr., usmerenu mutagenezu pojedinačnih aminokiselinskih položaja kako bi se pojednostavilo podkloniranje proteinskog gena ili njegovih delova inkorporisanjem mesta cepanja za određene restrikcione enzime. Ove mutacije takođe mogu biti inkorporisane kako bi se dodatno poboljšao afinitet fuzionog proteina za njegove ciljeve (npr., CD137 i PD-L1). Dalje, mutacije mogu biti uvedene kako bi, ukoliko je potrebno, prilagodile jednu ili više karakteristika proteina kao što je poboljšanje stabilnost uvijanja, stabilnost seruma, otpornost proteina ili rastvorljivost vode ili kako bi se smanjila sklonost ga sakupljanju.

V. PRIMERI

Primer 1: Ekspresija i analiza reprezentativnih fuzionih proteina

[0128] U ovom primeru, reprezentativni fuzioni proteini lipokalina muteina antitela nastaju zajedničkim spajanjem PD-L1 specifičnog antitela sa teškim lancem koji obezbeđuje SEQ ID NO: 86, ili obuhvata varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO: 77, ili koji obuhvata CDR iz GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), i lake lance koji obezbeđuju SEQ ID NO: 87, ili obuhvataju varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO: 82, ili koji obuhvata CDR iz QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64), i lipokalinski mutein specifičan za CD137 iz SEQ ID NO: 42, putem linkera, kao što je nestrukturirani (G4S)3linker iz SEQ ID NO: 13, kako bi se PD-L1 i CD137 zahvatili u isto vreme. Različiti formati koji su nastali su prikazani na Fig.1. Na primer, takvi fuzioni proteini, npr., SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91, su nastali spajanjem jednog ili više lipokalinskih muteina iz SEQ ID NO: 42 ili sa jednim ili više od ta četiri kraja antitela koje obuhvata teški lanac koji obezbeđuje SEQ ID NO: 86, ili obuhvata varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO: 77, ili koji obuhvata CDR iz GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), i lake lance koji obezbeđuju SEQ ID NO: 87, ili obuhvataju varijabilni domen teškog lanca iz SEQ ID NO: 82, ili koji obuhvata CDR iz QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). Nastali fuzioni proteini mogu biti bivalentni sa CD137 (npr., kao što je prikazano na Fig.1A-1D) ili četvorovalentni sa CD137 (npr., kao što je prikazano na Fig. 1E-1H), ili mogu imati čak veću valentnost sa CD137 (npr., kao što je prikazano na Fig.1I).

2

[0129] Antitela specifična za PD-L1 kao i svi fuzioni proteini antitela lipokalinskog muteina opisani u ovom primeru su imala konstruisanu IgG4 srž, koja sadrži S228P mutaciju kako bi se na minimum svela razmena IgG4 polu-antitela in-vitro i in-vivo (Silva et al., J Biol Chem, 2015). Dodatne mutacije u IgG4 sržima takođe mogu da postoje u svim ovde opisanim antitelima i fuzionim proteinima, uključujući bilo koju ili više mutacija F234A, L235A, M428L, N434S, M252Y, S254T, i T256E. F234A i L235A mutacije mogu biti uvedene kako bi se smanjili ADCC i ADCP (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010). M428L i N434S mutacije ili M252Y, S254T, a T256E mutacije mogu biti uvedene radi produženog poluvremena eliminacije u serumu (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). Sva antitela su eksprimirana bez karboksiterminalnog lizina da bi se izbegla heterogenost.

[0130] Pored toga, Fc fuzije monospecifičnog lipokalinskog muteina su nastale spajanjem jednog ili više lipokalinskih muteina specifičnih za CD137 iz SEQ ID NO: 42, putem linkera, npr., nestrukturiranog (G4S)3 linkera iz SEQ ID NO: 13, sa C-krajem Fc regiona antitela obezbeđenog u SEQ ID NO: 30 kao što je prikazano na Fig.1J-1K. Dobijeni konstrukt je obezbeđen u SEQ ID NO: 88-89.

[0131] Konstrukti fuzionih proteina su nastali sintezom gena i klonirani su u ekspresioni vektor sisara. Zatim su prolazno eksprimirani u Expi293FTM ćelijama (Life Technologies). Koncentracija fuzionih proteina u ćelijskoj podlozi za kulture je izmerena HPLC-om (Agilent Technologies) koja koristi POROS<®>kolonu za proteine sa A afinitetom (Applied Biosystems). Titri fuzionih proteina su ukratko prikazani u tabeli 1.

[0132] Fuzioni proteini su prečišćeni Protein A hromatografijom nakon čega je usledila hromatografija isključenja veličine (SEC) u slanom rastvoru puferisanim fosfatom (PBS). Posle SEC prečišćavanja, frakcije koje sadrže monomerni protein su pulovane i ponovo su analizirane pomoću analitičke SEC.

Tabela 1: Prolazni ekspresioni titri

Primer 2: Ekspresija fuzionih proteina

[0133] Konstrukti primernih fuzionih proteina su nastali sintezom gena uključujući optimizaciju kodona i klonirani su u ekspresioni vektor sisara. Zatim su stabilno eksprimirani u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO). Koncentracija fuzionih proteina u podlozi za ćelijske kulture je izmerena pomoću Octet (ForteBio, Pall Corp.) sa senzorima proteina-A i kvantifikovana pomoću humanog IgG1 standarda. Titri fuzionih proteina su ukratko prikazani u tabeli 2. Podaci ukazuju da geometrija fuzionih proteina može da ima uticaja na prinos proizvoda i produktivnost ćelija.

Tabela 2: Stabilni ekspresioni titri

Primer 3: Vezivanje fuzionih proteina prema PD-L1 ili CD137 određeno rezonancom površinskog plazmona (SPR)

[0134] Kinetika vezivanja i afinitet primernih fuzionih proteina prema huPD-L1-His ili huCD137-His (humanom PD-L1 ili humanom CD137 sa C-terminalnom polihistidinskim oznakom, R&D Systems) su određeni rezonancom površinskog plazmona (SPR) pomoću Biacore 8K ili Biacore T200 (GE Healthcare).

[0135] Anti-humano IgG Fc antitelo (GE Healthcare) je imobilisano na CM5 senzorskom čipu pomoću standardne aminske hemije: karboksilne grupe na čipu su aktivirane pomoću 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid (EDC) i N-hidroksisukcinimid (NHS). Posle toga, rastvor anti-humanog IgG Fc antitela (GE Healthcare) u koncentraciji od 25 µg/mL u 10 mM natrijumacetata (pH 5.0) je primenjena pri brzini protoka od 5 µL/min do postizanja nivoa imobilizacije od 6000-10000 rezonantnih jedinica (RU). Rezidualni neizreagovani NHS-estri su blokirani prolaskom rastvora 1M etanolamina preko površine. Referentni kanal je analogno tretiran. Posle toga, fuzioni proteini za ispitivanje (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, SEQ ID NO: 90 i 91, SEQ ID NO: 88, i SEQ ID NO: 89) pri 0.25 µg/ml ili 0.5 µg/mL u HBS-EP+ pufer je uhvaćen od strane antihumanog IgG-Fc antitela na površini čipa tokom 180 s pri brzini protoka od 10 µL/min. Posle svake faze hvatanja, igla je oprana. Anti-PD-L1 antitela, uključujući referentno antitelo (SEQ ID NO: 26 i 27) i antitelo kako je uključeno u fuzione proteine (SEQ ID NO: 86 i 87), i referentno anti-CD137 antitelo (SEQ

4

ID NO: 28 i 29) su takođe ispitivana kao kontrole.

[0136] Za određivanje afiniteta, razblaženja huPD-L1-His (10 nM, 5 nM i 2.5 nM ili huCD137-His (900 nM, 300 nM, i 100 nM) su pripremljena u HBS-EP+ puferu i primenjena su na pripremljenu površinu čipa. Ispitivanje vezivanja je izvedeno sa kontaktnim vremenom od 180 s, vremenom disocijacije od 900 s i pri brzini protoka od 30 µL/min. Sva merenja su izvođena na 25°C. Regenerasinje površine čipa je postignuto sa tri injekcije od 3 M MgCl2tokom 120 s. pre merenja proteina, ciklusi početka su izvođeni u svrhu kondicioniranja. Podaci su procenjeni sa Biacore T200 Evaluation softverom (v2.0) ili sa Biacore 8K Evaluation softverom (V1.1.1). Dupla referenca je korišćena i 1:1 model vezivanja je korišćen za podešavanje sirovih podataka.

[0137] Vrednosti određene za kon, koff, i dobijena ravnotežna konstanta disocijacije (KD) za reprezentativne fuzione proteine je ukratko prikazana u tabeli 3. Svi bispecifični fuzioni proteini (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91) vezuju PD-L1 kao i CD137 sa subnanomolarnim do niskim nanomolarnim afinitetom.

Monospecifične CD137-specifične FC-fuzije lipokalinskog muteina (SEQ ID NO: 88 i SEQ ID NO: 89) se vezuju samo CD137 sa nisko nanomolarnim afinitetom.

Tabela 3: Kinetičke konstante i afiniteti fuzionih proteina određeni SPR-om

Primer 4. Vezivanje fuzionih proteina prema PD-L1 ili CD137 u imunoenzimskoj probi (ELISA)

[0138] Imunoenzimska proba (ELISA) je korišćena za određivanja potencije vezivanja primernih fuzionih proteina za humani PD-L1 i PD-L1 makaki rakojeda.

[0139] Rekombinantni huPD-L1-His ili cyPD-L1-His (humani ili PD-L1 makaki rakojeda sa C-terminalnom polihistidinskom oznakom, R&D Systems ili Sino Biologics) u koncentraciji od 1 µg/mL u PBS je oblagan tokom noći na mikrotitarskim pločama na 4°C. Posle pranja sa PBS-0.05%T (PBS dopunjen sa 0.05% (v/v) Tween 20), ploče su blokirane sa 2% BSA (w/v) u PBS-0.1%T (PBS dopunjen sa 0.1% (v/v) Tween 20) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Posle pranja sa 100 µL PBS-0.05%T pet puta, primerni fuzioni proteini (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, SEQ ID NO: 90 i 91), Fc fuzije lipokalinskog muteina specifičnog za CD137 (SEQ ID NO: 88 i SEQ ID NO: 89), i anti-PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27, SEQ ID NO: 86 i 87), u različitim koncentracijama su dodavani u bunarčiće i inkubirani tokom 1 h na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila faza pranja. Vezani molekuli u ispitivanju su detektovani inkubacijom sa 1:5000 razblaženim anti-humanim IgG Fc-HRP (Jackson Laboratory) u PBS-0.1%T-2%BSA. Posle dodatne faze pranja, fluorogenski HRP supstrat (QuantaBlu, Thermo) je dodat u svaki bunarčić i intenzitet fluorescencije je detektovan pomoću čitača fluorescentnom mikropločom.

[0140] Ista ELISA postavka je takođe korišćena za određivanje potencije vezivanja fuzionih proteina za CD137, pri čemu huCD137-His (humani CD137 sa C-terminalnom polihistidinskom oznakom, R&D Systems) ili cyCD137-Fc (CD137 makaki rakojeda C-terminalno spojen sa Fc) je umesto toga obložen na ploči mikrotitra. Agensi za ispitivanje su slično titrirani a vezani agensi su detektovani preko anti-NGAL-HRP.

[0141] Rezultati primernih eksperimenata su prikazani na Fig.2A-2D, zajedno sa krivama prilagođenosti koje su rezultat 1:1 sigmoidalnog uklapanja vezivanja, pri čemu su EC50vrednost i maksimalni signal bili slobodni parametri, a nagib je fiksiran za jedinicu. Dobijene EC50vrednosti su obezbeđene u tabeli 4.

[0142] Primećene EC50vrednosti prema dva humana cilja obezbeđenih fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, SEQ ID NO: 90 i 91, SEQ ID NO: 88, i SEQ ID NO: 89) su bili veoma slični ili su se mogli porediti sa ispitanim PD-L1 antitelima (referentno PD-L1 antitelo iz SEQ ID NO: 26 i 27 i PD-L1 antitelo iz SEQ ID NO: 86 i 87 kako su uključene u fuzione proteine), i/ili lipokalinski mutein specifičan za CD137 kako je uključen u fuzione proteine (SEQ ID NO: 42).

[0143] Svi ispitivani fuzioni proteini pokazuju unakrsnu reaktivnost sa PD-L1 makaki rakojeda, sa uporedivim EC50vrednostima sa referentnim PD-L1 antitelom (SEQ ID NO: 26 i 27) ili PD-L1 antitelom uključenim u fuzione proteine (SEQ ID NO: 86 i 87). Samo fuzioni proteini koji su četvorovalentni sa CD137 su pokazali (SEQ ID NO: 94 i 87, SEQ ID NO: 90 i 91, i SEQ ID NO: 88) unakrsnu reaktivnost sa CD137 makaki rakojeda na poredbenom nivou sa humanim CD137, tj., vezuju CD137 makaki rakojeda sa EC50vrednostima u istom opsegu kao odgovarajuća EC50s za humani CD137.

Tabela 4. Podaci ELISA za PD-L1 ili CD137 vezivanje

Primer 5. Simultano vezivanje fuzionih proteina sa PD-L1 i CD137 u ELISA

[0144] Kako bi se demonstriralo simultano vezivanje primernih fuzionih proteina sa PD-L1 i CD137, korišćen je ELISA format dvostrukog vezivanja.

[0145] Rekombinantni huPD-L1-His (R&D Systems) u PBS (1 µg/mL) je oblagan tokom noći na mikrotitarskim pločama na 4°C. Ploče su oprane pet puta nakon svake faze inkubacije sa 100 µL PBS-0.05%T. Ploče su blokirane sa 2% BSA (w/v) u PBS-0.1%T tokom 1 h na sobnoj temperaturi i posle su ponovo oprane. Različite koncentracije ispitivanih fuzionih proteina su dodavane u bunarčiće i inkubirane tokom 1 h na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila faza pranja. Posle toga, biotinilisani huCD137-His (huCD137-His-Bio, Sino Biological) je dodavan u konstantnoj koncentraciji od 1 µg/mL u PBS-0.1%T-2%BSA tokom 1 h. Posle pranja, 1:5000 razblaženje ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich) u PBS-0.1%T-2%BSA je dodavan u bunarčiće i inkubiran tokom 1 h. Posle dodatne faze pranja, fluorogenski HRP supstrat (QuantaBlu, Thermo) je dodavan u svaki bunarčić, a intenzitet fluorescencije je detektovan pomoću čitača fluorescentne mikroploče.

[0146] Dvostruko vezivanje primernih fuzionih proteina je takođe ispitano sa obrnutom postavkom gde je rekombinantni 1 µg/ml huCD137-His (R&D Systems) obložen na mikrotitarskim pločama a vezani fuzioni proteini su detektovani dodavanjem biotinilisanog huPD-L1-His (R&D Systems).

[0147] Podaci o dvostrukom vezivanju fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91) su prikazani u Fig.3A i 3B, zajedno sa krivama uklapanja koje su rezultat 1:1 sigmoidalnog uklapanja vezivanja, pri čemu su EC50vrednost i maksimalni signal bili slobodni parametri, a nagib je bio fiksiran za jedinicu.

EC50vrednosti je ukratko prikazana u tabeli 5. Svi bispecifični fuzioni proteini pokazuju jasne signale vezivanja, koji demonstriraju da fuzioni proteini mogu da istovremeno vezuju PD-L1 i CD137. Podaci dodatno ukazuju da spajanje lipokalinskog muteina specifičnog za CD137 sa C-krajevima antitela specifičnih za PD-L1 mogu biti poželjniji nego N-krajevi.

Tabela 5. Podaci iz ELISA-e za simultano vezivanje cilja I PD-L1 I CD37

Primer 6. Analiza protočne citometrije vezivanja fuzionih proteina za ćelije koje eksprimiraju humane i CD137 i PD-L1 makaki rakojeda

[0148] Ciljano specifično vezivanje fuzionih proteina za humane i ćelije makaki rakojeda koje eksprimiraju PD-L1i humane i ćelije makaki rakojeda koje eksprimiraju CD137 je ocenjeno protočnom citometrijom.

[0149] CHO ćelije su stabilno transfektovane sa humanim PD-L1, PD-L1 makaki rakojeda, humanim CD137, CD137 makaki rakojeda ili lažnom kontrolom pomoću Flp-In sistema (Life technologies) prema uputstvima proizvođača.

[0150] Transfektovane CHO ćelije su održavane u Hamovoj F12 podlozi (Life technologies) dopunjenoj sa 10% serumom fetusa teleta (Biochrom) i 500 µg/ml higromicina B (Roth). Ćelije su kultivisane u posudama sa ćelijskim kulturama prema uputstvu proizvođača (37°C, 5% CO2 atmosfera).

[0151] Za analizu protočne citometrije, odgovarajuće ćelijske linije su inkubirane sa fuzionim proteinima (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, SEQ ID NO: 90 i 91, SEQ ID NO: 88, i SEQ ID NO: 89) i detektovane pomoću fluorescentno obeleženog antihumanog IgG antitela u analizi FACS kao što je opisano u nastavku:

[0152] 5 × 10<4>ćelije po bunarčiću su inkubirane tokom 1 h u ledenom PBS koji sadrži 5% serum fetalnog teleta (PBS-FCS). Serija razblaženja fuzionih proteina i kontrolna antitela su dodata u te ćelije i inkubirana tokom 1 h na ledu. Ćelije su zatim oprane dva puta sa PBS a zatim inkubirane sa kozjim antihlgG Alexa647-obeleženim antitelom tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su posle toga oprane i analizirane pomoću iQue Flow citometra (Intellicyte Screener). Srednji geometrijski fluorescentni signali su grafički prikazani i uklopljeni sa Graphpad softverom pomoću nelinearne regresije (zajedničko dno, SLOPE =1).

[0153] Mogućnost fuzionih proteina da vezuju humani PD-L1 i CD137 makaki rakojeda je prikazana na Fig.4. Afiniteti prema vezivanju (EC50s) bispecifičnih fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91) za humani i cPD-L1 makaki rakojeda koji eksprimira ćelije su u jednocifrenom nanomolarnom opsegu koji pokazuje punu cino-unakrsnu reaktivnost (ukratko je prikazano u tabeli 6). Afiniteti prema vezivanju fuzionih proteina za humani CD137 koji eksprimira ćelije su u niskom nanomolarnom opsegu. Ispitivani fuzioni proteini su u potpunosti unakrsno reaktivni sa CD137 makaki rakojeda (SEQ ID NO: 94 i 87, SEQ ID NO: 90 i 91, i SEQ ID NO: 88), vezuju CD137 makaki rakojeda sa 6-13-struko smanjenim afinitetima u poređenju sa odgovarajućim afinitetima prema vezivanju za humani CD137 (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, i SEQ ID NO: 89), ili se ne vezuju sa CD137 makaki rakojeda (SEQ ID NO: 92 i 87 i 86 i 93). Nijedan od fuzionih proteina se vezuje za lažno transfektovane ćelije.

Tabela 6. Afiniteti prema vezivanju fuzionih proteina za ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1 ili CD137 i makaki rakojeda

Primer 7. Afiniteti prema vezivanju fuzionih proteina za PD-L1-pozitivne tumorske ćelije

[0154] Vezivanje fuzionih proteina za tumorske ćelije koje eksprimiraju PD-L1 je ocenjeno protočnom citometrijom.

[0155] PD-L1 koji eksprimira kolorektalnu ćelijsku liniju RKO je održavano u RPMI1640 (Life technologies) dopunjenim sa 10% FCS na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2.

4

[0156] Za analizu protočne citometrije, RKO ćelije su inkubirane sa fuzionim proteinima i detektovane upotrebom fluorescentno obeleženo anti-humano IgG antitelo kao što je opisano u primeru 6.

[0157] Mogućnost fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91) da vežu PD-L1-pozitivne tumorske ćelije je prikazana na Fig.5 i odgovarajući afiniteti prema vezivanju (EC50s) su ukratko prikazani u tabeli 7.

Afiniteti prema vezivanju fuzionih proteina za PD-L1-koji eksprimiraju RKO ćelije su bili u niskom nanomolarnom ili subnanomolarnom opsegu, uporedivom sa PD-L1 antitelom uključenim u fuzione proteine (SEQ ID NO: 86 i 87).

Tabela 7. Afiniteti prema vezivanju fuzionih proteina za PD-L1-pozitivne tumorske ćelije

Primer 8. Određivanje kompeticije između CD137L i fuzionih proteina kod vezivanja za CD137 sa SPR [0158] SPR ispitivanje je korišćeno za istraživanje kompeticije između humanog CD137L (huCD137L-His, R&D Systems) i primernih fuzionih proteina sa humanim CD137. Ispitivanje kompeticije se izvodi na 25°C na Biacore T200 instrumentu (GE Healthcare).

[0159] BiotinCAPture reagens (GE Healthcare) je imobilisan na CAP senzorskom čipu u koncentraciji od 50 µg/ml i brzini protoka od 2 µL/min tokom 300 s. Referentni kanal je analogno tretiran. Biotinilisan huCD137-Fc (R&D systems) je uhvaćen na površini čipa tokom 300 s u koncentraciji od 1 µg/mL i pri brzini protoka od 5 µL/min na drugom kanalu.

[0160] Da bi se analiziralo da li fuzioni proteini za ispitivanje (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 90 i 91, SEQ ID NO: 88, i SEQ ID NO: 89) ulaze u kompeticiju sa CD137L radi vezivanja CD137, primenjen je ili tekući pufer (HBS-EP+ pufer) ili 500 nM huCD137L-His na površinu čipa tokom 180 s uz brzinu protoka od 30 µL/min. Posle toga, fuzioni proteini za ispitivanje su primenjeni na pripremljenu površinu čipa u HBS-EP+ puferu u fiksnoj koncentraciji od 1 µM. Ispitivanje vezivanja je izvedeno tokom kontaktnog vremena od 180 s, vremenom disocijacije od 15 s i brzini protoka od 30 µL/min. Kao kontrola, injekcije pufera su uključene sa istim parametrima.

Regeneracija površine čipa je postignuta sa injekcijama od 6M Gua-HCl, 0,25M NaOH tokom 120 s pri brzini protoka od 10 µL/min, nakon čega je usledila dodatna faza pranja sa H2O (120 s, 10 µl/min).

[0161] Reprezentativni primeri za relevantni segment dobijenih senzograma su obezbeđeni u Fig.6 za fuzione proteine iz SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 90 i 91, SEQ ID NO: 88, i SEQ ID NO: 89. Trag SPR za vezivanje odgovarajućeg fuzionog proteina sa samim huCD137-Fc je obeleženo strelicom sa masnim korenom. Trag SPR za vezivanje fuzionog proteina sa huCD137-Fc koji je zasićen sa huCD137L-His je obeležen strelicom sa rastavljenim korenom. Ti podaci pokazuju da se svi fuzioni proteini vezuju za huCD137 u prisustvu huCD137L, ali sa blago smanjenim signalima u poređenju sa njihovim vezivanjem za CD137 u odsustvu CD137L. Ovo pokazuje da ispitivani fuzioni proteini mogu biti sterično zaustavljeni vezivanjem CD137L za CD137 u nekoj meri. Ovo vezujuće ponašanje fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 90 i 91, SEQ ID NO: 88, i SEQ ID NO: 89) je slično onom od anti-CD137 antitela SEQ ID NO: 28 i 29.

Primer 9. Kompeticija fuzionih proteina sa PD-L1 kod vezivanja za PD-1 određenog pomoću ELISA [0162] Kako bi se demonstrirala mogućnost fuzionih proteina da se inhibira interakcija između PD-1 i PD-L1, korišćen je kompetitivni ELISA format.

[0163] Rekombinantni huPD-1-His (Acrobiosystems) u PBS (1 µg/mL) je oblagan tokom noći na mikrotitarskim pločama na 4°C. Ploče su oprane pet puta nakon svake faze inkubacije sa 100 µL PBS-0.05%T (PBS dopunjen sa 0.05% (v/v) Tween 20). Ploče su blokirane sa 2% BSA (w/v) u PBS-0.1%T (PBS dopunjenom sa 0.1% (v/v) Tween 20) tokom 1 h na sobnoj temperaturi i posle su ponovo oprane.

Fuzioni proteini u različitim koncentracijama su pomešani sa 15 nM rekombinantnog huPD-L1-Fc (R&D systems) u obliku tragača i inkubirani tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Mešavine fuzionih proteina i tragač su dodati u ploče i inkubirani tokom 20 min na sobnoj temperaturi nakon čega je usledilo pet faza uzastopnog pranja sa 100 µL PBS-0.05%T. Posle toga, 1:5000 razblaženje kozjeg-anti humanog IgG-Fc HRP (Jackson) je dodato u bunarčiće i inkubirano tokom 1h. Posle dodatne faze pranja, fluorogenski HRP supstrat (QuantaBlu, Thermo) je dodat u svaki bunarčić, i intenzitet fluorescencije je detektovan pomoću čitač fluorescentne mikroploče.

[0164] Podaci o kompeticiji primernih fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, i SEQ ID NO: 90 i 91) su prikazani na Fig.7, zajedno sa krivama uklapanja koje su rezultat 1:1 sigmoidnog uklapanja vezivanja, pri čemu su IC50vrednost i maksimalni signal slobodni parametri, a nagib je fiksiran za jedinicu. IC50vrednosti su ukratko prikazani u tabli 9. Svi bispecifični fuzioni proteini su pokazali jasnu inhibiciju PD-1/PD-L1 interakcije sa IC50vrednostima koje su uporediva sa gradivnim blokom antitela (SEQ ID NO: 86 i 87) i referentnim PD-L1 antitelom (SEQ ID NO: 26 i 27).

Tabela 8 Kompeticija fuzionih proteina sa PD-L1 za vezivanje za PD-1

Primer 10. Kostimulacija T-ćelija zavisnih od PD-L1 pomoću biološkog ispitivanja CD137

[0165] Potencijal izabranih fuzionih proteina da indukuju aktivacije CD137 puta signaliziranja u prisustvu PD-L1 je ocenjen pomoću komercijalno dostupne dvostruke stabilne transfektovane Jurkatove ćelijske linije koja eksprimira CD137 i luc2 gena (humanizovana verzija luciferaze svica) dok luc2 ekspresijom upravlja element koji odgovara na NFκB. U ovom biološkom ispitivanju, angažovanje CD137 dovodi do CD137 intracelularnog signaliziranja, što dovodi do NFκB-posredovane luminiscencije.

[0166] PD-L1 koji eksprimira kolorektalnu ćelijsku liniju RKO je kultivisan kao što je opisano u primeru 7. Dan pre ispitivanja, RKO ćelije su postavljene na ploče 1.25 × 10<4>ćelija po bunarčiću i ostavljene su da prijanjaju tokom noći na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2.

[0167] Sledećeg dana, 3.75 × 10<4>NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat ćelije su dodate u svaki bunarčić, nakon čega je usledilo dodavanje razne koncentracije, koja je obično u opsegu od 0.001 nM do 5 nM, fuzionih proteina ili referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29). Ploče su prekrivene zatvaračem koji propušta gas i inkubirane na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2. Posle 4h, 30 µL Bio-Gio<™>reagens je dodat u svaki bunarčić i bioluminiscentni signal je kvantifikovan luminometrom (PHERAstar). Analiza logističke krive sa četiri parametra se izvodi sa GraphPad Prism<®>kako bi se izračunale EC50vrednosti (zajedničko dno, fiksirani nagib) koji je ukratko prikazan u tabeli 9. Kako bi se de pokazala zavisnost PD-L1 od angažovanja CD137 od strane fuzionih proteina, isti eksperiment se izvodi paralelno u odsustvu RKO ćelija. Ispitivanje se izvodi u triplikatima.

[0168] Rezultati odgovarajućeg eksperimenta su prikazani na Fig.8A-8D. Podaci pokazuju da su svi ispitani fuzioni proteini (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, i SEQ ID NO: 86 i 93) indukovali jaku kostimulaciju T-ćelija posredovanu CD137. Fig.8B i 8D pokazuju da aktivacijaCD137 od strane fuzionih proteina je zavisna od PD-L1, zato što nije detektovana aktivacija NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat ćelija u odsustvu PD-L1 koji eksprimira tumorske ćelije. Nasuprot tome, referentno anti-CD137

4

mAb (SEQ ID NO: 28 i 29) je pokazalo kostimulaciju T-ćelija posredovanu CD137 bez obzira na prisustvo ili odsustvo ciljanih ćelija.

Tabela 9. Ocena aktivacije T-ćelija pomoću CD137 biološkog ispitivanja

Primer 11. Ocena aktivacije T-ćelija pomoću humanih mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC)

[0169] Ispitivanje T ćelija je korišćeno za ocenu mogućnosti izabranih fuzionih proteina da kostimulišu odgovore T-ćelija kao i da spreče zajedničku inhibiciju posredovanu PD-L1 vezivanjem za PD-1. Za ovu svrhu, fuzioni proteini u različitim koncentracijama se dodaju u stafilokokalnim enterotoksinom B (SEB) stimulisane mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) i inkubiraju se tokom 4 dana na 37°C. Nivoi IL-2 sekrecije su izmereni u supernatantima.

[0170] PBMC zdravih dobrovoljnih davalaca su izolovane iz leukocitno trombocitnih međuslojeva centrifugacijom kroz polisaharozni gradijent za gustinu (Biocoll, 1.077 g/mL, Biochrom), u skladu sa Biohromovim protokolima. Prečišćeni PBMC su ponovo suspendovani u puferu koji se sastoji od 90% FCS i 10% DMSO, neposredno otopljeni i čuvani u tečnom azotu do dodatne upotrebe. Za ispitivanje, PBMC se otapaju i ostavljaju u mirovanju u podlogama za kulture (RPMI 1640, Life Technologies) sa dodatkom 10% FCS i 1% penicilin-streptomicina (Life Technologies) tokom 16 h na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2.

[0171] Sledeći postupak se izvodi upotrebom triplikata za svaki eksperimentalni uslov: 2.5×10<4>PBMC su inkubirani u svakom bunarčiću ploče od 384 bunarčića sa ravnim dnom za kulture tkiva u podlogama za kultivisanje. Serija razblaženja fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91), PD-L1 antitela gradivnog bloka (SEQ ID NO: 86 i 87), referentnog PD-L1 antitelo (SEQ ID NO: 26 i 27), referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29), koktela referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29) i PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 86 i 87 ili SEQ ID NO: 26 i 27), ili izotipne kontrole (SEQ ID NO: 24 i 25), koja je obično u opsegu od 10 do 0.002 nM, i SEB od 0.1 ng/ml su dodati u odgovarajuće bunarčiće. Ploče su prekrivene zatvaračem koji propušta gas (4titude) i inkubirane na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2tokom četiri dana. Posle toga, nivoi IL-2 u supernatantu su ocenjeni pomoću humanog IL-2 DuoSet kompleta (R&D Systems) kao što je opisano u postupcima u nastavku.

[0172] Ploče sa 384 bunarčića su oblagane tokom 2 h na sobnoj temperaturi sa 1 µg/mL "antitelom za hvatanje humanog IL-2" u PBS. Posle toga, bunarčići su oprani 5 puta sa 80 µl PBS dopunjenog sa 0.05 % Tween (PBS-T). Nakon 1 h blokiranja u PBS-0.05%T koji sadrži 1% kaseina (w/w), supernatanti za ispitivanje i serija koncentracija od IL-2 standarda razblaženog u podlozi za kulturu je prenesena u odgovarajuće bunarčiće i inkubirana tokom noći na 4°C. Sledećeg dana, mešavina od 100 ng/mL kozjeg anti-hlL-2-Bio antitela detekcije (R&D Systems) i 1µg/mL Sulfotag-obeleženog streptavidina (Mesoscale Discovery) u PBS-T koji sadrži 0.5% kaseina su dodati i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Posle pranja, 25 µL pufera za očitavanje (Mesoscale Discovery) je dodato u svaki bunarčić i dobijeni elektrohemiluminiscentni (ECL) signal je detektovan čitačem Mesoscale Discovery. Analiza i kvantifikacija su izvođene pomoću softvera Mesoscale Discovery.

[0173] Rezultat odgovarajućeg eksperimenta je prikazan na Fig.9. Bispecifični fuzioni proteini iz SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91 mogu da izazovu aktivaciju T-ćelija, koja se ispoljava kroz povišene nivoe sekrecije IL u odnosu na izotipnu kontrolu (hlgG4, Sigma). Najjače povećanje sekrecije IL-2 je primećeno od strane fuzionih proteina četvorovalentnih sa CD137 (SEQ ID NO: 94 i 87 i SEQ ID NO: 90 i 91), nakon čega je usledio fuzioni protein bivalentan sa CD137 sa lipokalinskim muteinom spojenim sa C-krajem antitela specifičnog za PD-L1 (SEQ ID NO: 90 i 87 i SEQ ID NO: 86 i 91). Najniže povećanje je primećeno sa fuzionim proteinima bivalentnim sa CD137 sa lipokalinskim muteinom spojenim sa N-krajem antitela specifičnog za PD-L1 (SEQ ID NO: 92 i 87 i SEQ ID NO: 86 i 93), međutim, i dalje uporedivo sa koktelom referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29) i referentnog PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27). Svi fuzioni proteini pokazuju više nivoe IL-2 sekrecije u odnosu na pojedinačne gradivne blokove, tj., lipokalinski mutein specifičan za CD137-Fc (SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 89) ili PD-L1 mAb gradivnog bloka (SEQ ID NO: 86 i 87).

Primer 12. Ocena aktivacije T-ćelija u prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju različit nivo PD-L1

[0174] Dodatno ispitivanje T ćelija je korišćeno za ocenu mogućnosti fuzionih proteina da kostimulišu aktivaciju T-ćelija u zavisnosti od PD-L1 cilja. Fuzioni proteini se primenjuju u različitim koncentracijama na anti-CD3 stimulisane T ćelije, u prisustvu tumorskih ćelijskih linija sa različitim nivoima ekspresije PD-L1. Ispitane tumorske ćelijske linije uključuju RKO (PD-L1 visok), HCC827 (PD-L1 umeren) i Hep-G2 (PD-L1 negativan). Nivoi sekrecije IL-2 su izmereni u supernatantima.

[0175] PBMC zdravih dobrovoljnih davalaca su izolovane from leukocitno trombocitnih međuslojeva kao što je opisano u primeru 11. T limfociti su dodatno prečišćeni iz PBMC magnetnim sortiranjem ćelija pomoću kompleta za prečišćavanje T ćelija Pan T cell purification Kit (Miltenyi Biotec GmbH) prema uputstvima proizvođača. Prečišćene Pan T ćelije su ponovo suspendovane u puferu koji se sastoji od 90% FCS i 10% DMSO, neposredno otopljene i čuvane u tečnom azotu do dalje upotrebe.

[0176] Za ispitivanje, T ćelije se otapaju i ostavljaju u mirovanju u podlogama za kulture (RPMI 1640, Life

4

Technologies) sa dodatkom 10% FCS i 1% penicilin-streptomicina (Life Technologies) tokom 16 h na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2.

[0177] Sledeći postupak se izvodi upotrebom triplikata za svaki eksperimentalni uslov: ploče sa ravnim dnom za kulture tkiva su prethodno obložene sa 0.25 µg/mL anti-CD3 antitelom tokom 1 h na 37°C, a zatim su oprane dva puta sa PBS. Tumorska ćelijska linija RKO, HCC827 ili Hep-G2 su tretirane 30 minuta sa 30 µg/ml mitomicina C (Sigma Aldrich) kako bi se blokirala proliferacija. Tumorske ćelije tretirane mitomicinom su zatim oprane dva puta sa PBS-om i postavljene u ploče sa 2.5 × 10<4>ćelija po bunarčiću u podlozi za kulturu kako bi se omogućilo prijanjanje tokom noći na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2. ciljane ćelije su prethodno gajene u standardnim uslovima, odvojene pomoću Accutase (PAA Laboratories), i ponovo suspendovane u podlogama za kulturu.

[0178] Sledećih dana, posle pranja ploča dva puta sa PBS, 1.25 × 10<4>T ćelija po bunarčiću su dodavane tumorskim ćelijama. Serija razblaženja fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, i SEQ ID NO: 86 i 93), referentnog PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27) i referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29) korišćena sama ili u kombinaciji, ili izotipna kontrola (SEQ ID NO: 24 i 25), koja je obično u opsegu od 0.005 nM do 10nM, su dodavani u odgovarajuće bunarčiće. Ploče su prekrivene zatvaračem koji propušta gas i inkubirane na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2tokom 3 dana.

[0179] Posle 3 dana zajedničkog kultivisanja, nivo IL-2 u supernatantu su ocenjeni kao što je opisano u primeru 11.

[0180] Podaci iz primera su prikazani u Fig.10. Zajedničko kultivisanje Pan T ćelija sa RKO ćelijama (PD-L1 visok) ili HCC827 (PD-L1 umereno) u prisustvu fuzionih proteina sa lipokalinskim muteinom spojenim sa C-krajem antitela specifičnog za PD-L1 (SEQ ID NO: 90 i 87 i SEQ ID NO: 86 i 91) dovodi do jasnog porasta sekrecije IL-2 u poređenju sa hIgG4 izotipnom kontrolom. Povećanje IL-2 sekrecije indukovane od strane fuzionih proteina sa lipokalinskim muteinom spojenim sa N-krajem antitela specifičnog za PD-L1 (SEQ ID NO: 92 i 87 i SEQ ID NO: 86 i 93) je bilo slabije ali i dalje veće od koktela referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29) i referentnog PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27). Nije primećen porast IL-2 sekrecije sa koktelom gradivnih blokova, lipokalinskog muteina specifičnog za CD137 (Fc spajanje, SEQ ID NO: 89) i PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 86 i 87). Pored toga, zajedničko kultivisanje sa Hep-G2 (PD-L1 negative) nije povećalo nivoe sekrecije IL-2 sa bilo kojim fuzionim proteinima, već sa koktelom referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29) i referentnog PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27).

[0181] Podaci ukazuju da funkcionalna aktivnost fuzionih proteina, merena njihovom mogućnošću da aktiviraju T ćelije ili povećaju sekreciju IL-2, je zavisna od PD-L1. Nasuprot tome, aktivacija T-ćelija ili sekrecija IL-2 indukovane referentnim CD137 antitelom (SEQ ID NO: 28 i 29), kada se koristi u kombinaciji sa referentnim PD-L1 antitelom (SEQ ID NO: 26 i 27), nije nužno zavisna od PD-L1 i nije je teško predvideti. Pored toga, podaci pokazuju da je bispecifičan format ciljanja PD-L1 i CD137 superiorniji od koktela dva odvojena molekula koja ciljaju CD137 i PD-L1 u prisustvu PD-L1 koji eksprimira ciljane ćelije.

4

Primer 13. Ocena stabilnosti čuvanja fuzionih proteina

[0182] Da bi se ocenila stabilnost čuvanja, primeri fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, SEQ ID NO: 88, i SEQ ID NO: 89) su inkubirane tokom 1 nedelje na 37°C u koncentraciji od 1 mg/ml u PBS. Monomerni fuzioni proteini su posle toga određeni pomoću analitičkog isključivanja prema veličini primenom 20 µg uzorka na kolonu Superdex 200, 3.2/300 Increase (GE Healthcare) pri brzini protoka od 0.15 ml/min i PBS kao tekućim puferom. Svi fuzioni peptidi za ispitivanje su bili stabilni posle inkubacije od 1 nedelje u PBS-u na 37 °C. Rezultati primera su prikazani na Fig.11A.

[0183] Ocene dodatne stabilnosti čuvanja su izvođene za izabrani fuzioni protein iz SEQ ID NO: 90 i 87. Fuzioni protein na 20 mg/ml je inkubiran tokom četiri nedelje na 40°C u 25 mM histidinu, 60 mM NaCl, 200 mM argininu pH 6. Funkcionalni sadržaj fuzionog proteina je izmeren u kvantitativnom ELISA okruženju, pomoću ispitivanja simultanog vezivanja kako je opisano u primeru 5. Rezultati primera su prikazani na Fig.11B.

Primer 14. Ocena reakcije mešanih limfocita (MLR) sa CD4<+>T ćelijama

[0184] Ispitivanje reakcije mešanih limfocita (MLR) je korišćeno za ocenu mogućnosti primernog fuzionog proteina da indukuje aktivaciju CD4<+>T-ćelija u prisustvu antigena koji predstavljaju ćelije. Fuzioni protein (SEQ ID NO: 90 i 87) u raznim koncentracijama je ispitivan u prisustvu dendritskih ćelija izvedenih iz monocita (moDCs) i CD4<+>T ćelija od nepodudarnih zdravih davalaca. Posle 6 dana kultivisanja u prisustvu ispitivanih molekula, sekrecija IL-2 i IFN-gama su kvantifikovane u supernatantima.

[0185] PBMC su prečišćeni iz pakovanja afereze trombocita pomoću Lymphoprep rastvora u skladu sa uputstvima proizvošača (StemCell). Ukupni CD4<+>T limfociti su prečišćeni iz PBMC upotrebom kompleta Miltenyi kit i zamrznuti u rastvoru od 90% FBS 10% DMSO. CD14<+>monociti su prečišćeni upotrebom kompleta sa perlama CD14<+>(Miltenyi) i korišćeni su sveži.

[0186] MoDC su dobijeni kultivisanjem CD14<+>monocita u RPMI1640 plus 10% FBS i Pen/Strep (LifeTech) u prisustvu 50 ng/mL od IL-4 i 100 ng/mL iz GMCSF (Miltenyi) tokom 6 dana na 2×10<6>ćelijama/mL.3. dana, 10 ml sveže podloge koja sadrži citokina je dodato. Fenotip (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) je ocenjen 7. dana od diferencijacije od strane FACS.

[0187] 10000 moDC su kultivisane u prisustvu 50000 CD4 T<+>ćelija u 96 bunarčića sa dnom u obliku slova U u potpunoj RPMI podlozi, u prisustvu ispitivanih molekula tokom 6 dana u RPMI u triplikatnim bunarčićima. Na kraju kulture, supernatanti su neposredno zamrznuti i čuvani za kvantifikaciju citokina.

[0188] IL-2 nivo je izmeren u supernatantima pomoću Luminex tehnologije i podaci iz primera su prikazani u Fig.12. Fig.12A prikazuje da je fuzioni protein (SEQ ID NO: 90 i 87) značajno bolji u indukciji IL-2 na 10 i 0.1 µg/mL u poređenju sa odgovarajućim gradivnim blokovima (SEQ ID NO: 89 i SEQ ID NO:

4

86 i 87) samim ili referentnim CD137 ili PD-L1 antitelom (SEQ ID NO: 28 i 29 ili SEQ ID NO: 26 i 27) u nekoliko skupova MLR eksperimenata (N=8). Fig.12B ukazuje da je fuzioni protein (SEQ ID NO: 90 i 87) indukovao dozno zavisnu sekreciju IL-2 u odnosu na kontrolu izotipnog antitel. IL-2 nivoi indukovani fuzionim proteinom SEQ ID NO: 90 i 87 su bili značajno viši u poređenju sa ekvimolarnim koncentracijama koktela referentnog PD-L1 antitelo (SEQ ID NO: 26 i 27) i referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29), tokom koncentracija koje su u opsegu od 0.001 do 20 µg/mL.

Primer 15. Ocena reakcije mešanih limfocita sa CD8<+>T ćelijama

[0189] Imajući u obzir izveštaje CD137 ekspresije i dejstvo kod humanih CD8<+>T ćelija, mogućnost primernog fuzionog proteina da indukuje CD8<+>aktivaciju T-ćelija u prisustvu antigena koji predstavlja ćelije je ocenjena u MLR ispitivanju. Fuzioni protein (SEQ ID NO: 90 i 87) je ispitan u prisustvu moDC i ukupnih CD8<+>T ćelija od nepodudarnih zdravih davalaca. Nakon 6 dana kultivisanja u prisustvu ispitanih molekula, sekrecija IL-2 i CD8 efektorskih molekula (perforin, granzim B, i granzim A) su bili kvantifikovani u supernatantima.

[0190] PBMC su prečišćeni iz pakovanja krvi aferezom trombocita upotrebom rastvora Lymphoprep prema uputstvima proizvođača (StemCell). Ukupni CD8<+>T limfociti su prečišćeni iz PBMC pomoću kompleta Miltenyi i korišćeni su sveži. CD14 pozitivni monociti su prečišćeni kompletom sa perlama CD14<+>(Miltenyi) i korišćeni su sveži.

[0191] MoDC su dobijeni kultivisanjem CD14<+>monocita u RPMI1640 plus 10% FBS i Pen/Strep (LifeTech) u prisustvu 50 ng/mL IL-4 i 100 ng/mL od GMCSF (Miltenyi) tokom 6 dana na 2×10<6>ćelija/mL.3. dana, 10 mL sveže podloge koja sadrži citokine je dodato. Fenotip (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) je ocenjen 7. dana diferencijacije putem FACS.

[0192] 10000 moDC su kultivisane sa 50000 CD8<+>T ćelijama, u prisustvu ispitivanih molekula u 96 (u trostrukim bunarčićima) sa dnom u obliku slova U u potpunom RPMI podlozi tokom 6 dana. Na kraju kulture, supernatanti su neposredno zaleđeni i čuvani za kvantifikaciju izlučenog faktora.

[0193] IL-2, perforin, granzim A, i granzim B su bili kvantifikovani u supernatantima pomoću Luminex tehnologije. Podaci iz primera su prikazani u Fig.13.

[0194] Fig.13 pokazuje da je fuzioni protein (SEQ ID NO: 90 i 87) pokazao povećanje sekrecije IL-2, perforina, granzima B, i granzima A u odnosu na ekvimolarnu koncentraciju referentnog PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27), referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29), ili koktela ta dva pri 10 µg/mL (N=4). Podaci dalje ukazuju da fuzioni protein (SEQ ID NO: 90 i 87) ima dejstvo na citotoksične CD8<+>T ćelije.

Primer 16. Ocena funkcionalnog in vivo dejstva kod modela mišjeg ksenografta nakalemljenog sa humanim PBMC

[0195] Da bi se istražilo in vivo dejstvo obezbeđenih fuzionih proteina, koristiće se ksenograft mišjeg

4

modela izveden iz ćelijske linije. Shodno tome, ćelijska linija humanog kancera će biti implantirana supkutano kod NOG imunodeficijentnih ženki miševa, isporučenih u uzrastu od 4-6 nedelja sa najmanje 1 nedeljom karantina. Nakon što su tumori dostigli zapremine od približno 80-100 mm<3>, miševi će biti supstituisani humanim PBMC. Ispitivana jedinjenjima će biti ubrizgavana najmanje tri puta i konstantno će se meriti rast i dejstvo tumora. Do kraja ispitivanja, miševi će biti žrtvovani, intratumorska infiltracija CD3-, CD4- i CD8-pozitivnih ćelija će biti ocenjene imunohistohemijom. IFN-gama RNK opseg će se izvesti kao dodatno očitavanje.

Primer 17. Analiza epitopa fuzionih proteina

[0196] Da bi se procenili epitopi fuzioni proteini prepoznaju, i da li su oni klinički relevantni, korišćen je kompetitivni ELISA format za određivanje kompeticije između fuzionih proteina i referentnog CD137 antitelo.

[0197] Mikrotitarske ploče su obložene referentnim CD137 antitelom SEQ ID NO: 28 i 29 u PBS (4 µg/mL) na 4°C tokom noći. Ploče su oprane pet puta nakon svake faze inkubacije sa 100 µL PBS-0.05%T (PBS dopunjenog sa 0.05% (v/v) Tween 20). Ploče su blokirane sa 2% BSA (w/v) u PBS-0.1%T (PBS dopunjen sa 0.1% (v/v) Tween 20) tokom 1 h na sobnoj temperaturi i posle su ponovo oprane. Fuzioni proteini (SEQ ID NO: 90 i 87 i SEQ ID NO: 86 i 91), lipokalinski mutein specifičan za CD137 (SEQ ID NO: 42), referentno CD137 antitelo (SEQ ID NO: 28 i 29), i kontrolno antitelo (SEQ ID NO: 86 i 87) u različitim koncentracijama su pomešani sa 1 nM biotinilisane humane CD137 Fc fuzije (huCD137-Fc-bio) u obliku tragača i inkubirani tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Mešavine molekula za ispitivanje i tragača su dodate u ploče i inkubirane tokom 20 min na sobnoj temperaturi nakon čega je usledilo pet faza uzastopnog pranja sa 100 µL PBS-0.05%T. Posle toga, 1:5000 razblaženje ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich) u PBS-0.1%T-2%BSA je dodato u bunarčiće i inkubirano tokom 1 h. Posle dodatne faze pranja, fluorogenski HRP supstrat(QuantaBlu, Thermo) je dodat u svaki bunarčić, i detektovan je intenzitet fluorescencije pomoću čitača fluorescentnih mikroploča.

[0198] Podaci o kompeticiji za primerni eksperiment su prikazani na Fig.14, gde x osa predstavlja koncentraciju molekula za ispitivanje a y osa predstavlja izmerenu koncentraciju molekula u tragovima. Podaci se uklapaju u 1:1 sigmoidnu krivu, pri čemu su IC50vrednost i maksimalni signal bili slobodni parametri, a nagib je fiksiran za jedinicu. Rezultati pokazuju da primerni fuzioni proteini (SEQ ID NO: 90 i 87 i SEQ ID NO: 86 i 91) ulaze u kompeticiju sa CD137 antitelom SEQ ID NO: 28 i 29 za vezivanje za CD137, što ukazuje da se fuzioni proteini vezuju za preklapajuće epitope sa antitelom.

Tabela 10. Kompeticija fuzionih proteina

4

Primer 18. Ocena aktivacije T ćelija pomoću biološkog ispitivanja blokade PD-1/PD-L1

[0199] Potencijal izabranih fuzionih proteina za blokiranje PD-1/PD-L1 posredovanog suzbijanja je ocenjen pomoću PD-1-NFAT-luc Jurkat T ćelija (Jurkat ćelijska linija konstruisana da eksprimira PD-1 i luc gen (gen ludiferaze svica) kojima upravlja element odgovora NFAT (NFAT-RE)), kokultivisan sa PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelijama (CHO-K1 ćelijama koje eksprimiraju humani PD-L1 i konstruisani protein ćelijske površine kreiran da aktivira kognatne TCR na antigenski zavisan način). U ovom biološkom ispitivanju, kada su PD-1-NFAT-luc Jurkat T ćelije i PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelije kokultivisane, PD-1/PD-L1 interakcija inhibira TCR signaliziranje i NFAT-RE-posredovanu luminiscenciju. Dodavanje PD-1/PD-L1 blokirajućeg agensa, kao što su fuzioni proteini specifični za CD137 i PD-L1 kako je ovde opisano, oslobađa inhibitorni signal i dovodi do TCR aktivacije i NFAT-RE-posredovane luminiscencije.

[0200] PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelije su gajene u Hamovoj F12 podlozi dopunjenoj sa 10% FCS i postavljene u ploče sa 8.00 × 10<3>ćelija po bunarčiću i ostavljane su da prijanjaju tokom noći na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2. Sledećeg dana, podloge sa kulturama su odbačene.1.00 × 10<4>PD-1-NFAT-luc Jurkat T ćelije su dodate u svaki bunarčić, nakon čega je usledilo dodavanje raznih koncentracija, koje su obično u opsegu od 0.005 nM do 50 nM. fuzionog proteina (SEQ ID NO: 90 i 87) ili PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 86 i 87 ili SEQ ID NO: 26 i 27). Ploče su prekrivene zatvaračem koji propušta gas i inkubirane na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2. Nakon 6h, 30 µL Bio-Glo<™>reagensa je dodato u svaki bunarčić i bioluminiscentni signal je kvantifikovan luminometrom. Analiza logističke krive sa četiri parametra se izvodi sa GraphPad Prism<®>da bi se izračunale EC50vrednosti koje su ukratko prikazani u tabeli

11. Ispitivanje se izvodi u triplikatima.

[0201] Rezultati odgovarajućeg eksperimenta su prikazani na Fig.15. Podaci pokazuju da ispitivani fuzioni protein inhibira PD-1/PD-L1 blokadu i aktivira T ćelije na dozno-zavisan način, pri čemu je EC50 vrednost uporediva sa vrednošću PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 86 i 87 ili SEQ ID NO: 26 i 27). Kao negativne kontrole, ni referentno CD137 antitelo (SEQ ID NO: 28 i 29) ni antitelo izotipne kontrole (SEQ ID NO: 24 i 25) dovodi do povećanja luminiscentnog signala.

Tabela 11. Ocena aktivacije T-ćelija korišćenjem biološkog ispitivanja PD-1/PD-L1 blokade

Primer 19. Ocena aktivacije T-ćelija pomoću humanih PBMC

[0202] Dodatno ispitivanje T ćelija je korišćeno kako bi se ocenila mogućnost izabranih fuzionih proteina za kostimulaciju odgovora T-ćelija, pri čemu se fuzioni proteini u različitim koncentracijama dodaju u SEB stimulisane humane PBMC i inkubiraju se 3 dana na 37°C. Nivoi sekrecije IL-2 su izmereni u supernatantima.

[0203] PBMC zdravih dobrovoljnih davalaca su izolovane i čuvane kao što je opisano u primeru 11. Za ispitivanje, PBMC se otapaju i ostavljaju u mirovanju u podlogama za kulture (RPMI 1640, Life Technologies) sa dodatkom 10% FCS i 1% penicilin-streptomicina (Life Technologies) tokom 24 h na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2.

[0204] Sledeći postupak se izvodi upotrebom triplikata za svaki eksperimentalni uslov: 2.5×10<4>PBMC je inkubirano u svakom bunarčiću ploče sa 384 bunarčića sa ravnim dnom za kulture tkiva u podlogama za kultivisanje. Serija razblaženja izabranog fuzionog proteina (SEQ ID NO: 90 i 87), antitela PD-L1gradivnog bloka (SEQ ID NO: 86 i 87), referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29) koje se koristi samo ili u kombinaciji sa referentnim PD-L1 antitelom (SEQ ID NO: 26 i 27), ili izotipnom kontrolom (SEQ ID NO: 24 i 25), koja je obično u opsegu od 0.0002 do 10 nM, i 0.1 ng/ml SEB su dodati u odgovarajuće bunarčiće. Ploče su prekrivene zatvaračem koji propušta gas (4titude) i inkubirane na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2tokom 3 dana. Posle toga, IL-2 u supernatantu su ocenjeni kao što je opisano u primeru 11.

[0205] Rezultati odgovarajućeg eksperimenta su prikazani na Fig.16. EC50vrednosti molekula za ispitivanje za indukovanje sekrecije IL-2 su ukratko prikazani u tabeli 12. Bispecifičan fuzioni protein SEQ ID NO: 90 i 87 indukuje jako dozno zavisno povećanje sekrecije IL-2, do viših nivoa u poređenju sa PD-L1 antitelom gradivnog bloka, referentnim CD137 antitelom i koktelom referentnog PD-L1 i CD137 antitelom, kao i smanjenja efektivne EC50vrednosti u odnosu na PD-L1 i CD137 antitela koja se koriste sama ili u kombinaciji.

Tabela 12. Ocena aktivacije T-ćelija pomoću humanih PBMC

Primer 20. Ocena PD-L1 zavisne aktivacije T-ćelija indukovana fuzionim proteinima

[0206] Kostimulacija T-ćelija zavisna o PD-L1 cilju fuzionim proteinima je dodatno analizirana pomoću

1

ispitivanja aktivacije T-ćelija. Fuzioni proteini se primenjuju u različitim koncentracijama na anti-CD3 stimulisane T ćelije, kokultivisane sa humanim PD-L1 transfektovanim ili lažno transfektovanim Flp-In-CHOćelijama. Nivoi IL-2 sekrecije su mereni u supernatantima.

[0207] PBMC zdravih dobrovoljnih davalaca su izolovane iz leukocitno trombocitnih međuslojeva kao što je opisano u primeru 11. T limfociti su dodatno prečišćeni i čuvani kao što je opisano u primeru 12.

[0208] Za ispitivanje, T ćelije se otapaju i ostavljaju u mirovanju u podlogama za kulture (RPMI 1640, Life Technologies) sa dodatkom 10% FCS i 1% penicilin-streptomicina (Life Technologies) tokom noći na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2.

[0209] Sledeći postupak se izvodi upotrebom triplikata za svaki eksperimentalni uslov: ploče sa ravnim dnom za kulture tkiva su prethodno obložene sa 0.25 µg/mL anti-CD3 antitelom tokom 2 h na 37°C a zatim su oprane dva puta sa PBS. CHO ćelije, transfektovane sa humanim PD-L1 ili lažno transfektovane, su tretirane 30 minuta sa 30 µg/ml mitomicina C (Sigma Aldrich) kako bi se blokirala proliferacija. Ćelije tretirane mitomicinom su zatim oprane dva puta sa PBS-om i postavljene u ploče sa 1.0 × 10<7>ćelija po bunarčiću u podlozi za kulturu kako bi se omogućilo prijanjanje tokom noći na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2. CHO ćelije su prethodno gajene u standardnim uslovima, odvojene pomoću Accutase (PAA Laboratories), i ponovo suspendovane u podlogama za kulturu.

[0210] Sledećih dana, 8.33 × 10<3>T ćelija po bunarčiću je dodatu u CHO ćelije. Serija razblaženja primernog fuzionog proteina SEQ ID NO: 90 i 87, PD-L1 antitelo gradivnog bloka (SEQ ID NO: 86 i 87), referentno CD137 antitelo (SEQ ID NO: 28 i 29), i koktel referentnog PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 26 i 27) I referentno CD137 antitelo (SEQ ID NO: 28 i 29), ili izotipna kontrola (SEQ ID NO: 24 i 25), koja je obično u opsegu od 0.003 nM do 50nM, su dodavani u odgovarajuće bunarčiće. Ploče su prekrivene zatvaračem koji propušta gas i inkubirane na 37°C u atmosferi vlažnog 5% CO2tokom 2 dana.

[0211] Posle 2 dana zajedničkog kultivisanja, IL-2 nivoi u supernatantu su ocenjeni kao što je opisano u primeru 11.

[0212] Podaci iz primera su prikazani na Fig.17. Zajedničko kultivisanje Pan T ćelija sa CHO ćelijama transfektovanim sa humanim PD-L1 u prisustvu fuzionog proteina (SEQ ID NO: 90 i 87 i SEQ ID NO: 86 i 91) su doveli do jake dozno-zavisnog IL-2 izlučivanja u odnosu na hIgG4 izotipnu kontrolu i mnogo je jače od referentnih antitela gde je samo blagi porast IL-2 sekrecije primećen za referentno CD137 antitelo ili koktel referentnog CD137 antitela i referentnog PD-L1 antitela. Prilikom zajedničkog kultivisanja sa lažno-transfektovanim CHO ćelijama (PD-L1 negativan), samo referentno CD137 antitelo i koktel referentnog CD137 antitela i referentnog PD-L1 antitela su pokazali blago dozno-zavisan porast kof IL-2 sekrecije. Rezultati ilustruju da je aktivacija T ćelija od strane fuzionih proteina PD-L1 zavisna, nasuprot referentnog CD137 antitela (SEQ ID NO: 28 i 29) pokazala CD137 kostimulaciju posredovanu T-ćelijama bez obzira na prisustvo ili odsustvo ciljanih ćelija.

2

Primer 21. Farmakokinetika fuzionih proteina kod miševa

[0213] Analize farmakokinetike reprezentativnih fuzionih proteina (SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91) su izvođene kod miševa. Mužjacima CD-a miševa približne starosti od 5 nedelja (3 miša po vremenskoj tački; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) je u repnu venu ubrizgavan fuzioni protein u dozi od 10 mg/kg. Ispitivanim člancima se davao bolus zapremine od 5 mL/kg. Uzorci plazme miševa su dobijeni u vremenskim tačkama od 5 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 4 d, 8 d, 14 d, 21 d, i 28 d. Dovoljna cela krv – uzeta u izofulranskoj anesteziji – je sakupljena da bise dobilo najmanje 100 µL Li-Heparin plazme po životinji i vremenu. Nivoi leka su detektovani pomoću Sandwich ELISA koja detektuje puni bispecifični konstrukt putem ciljeva PD-L1 i CD137. Podaci su uklopljeni pomoću modela sa dva odeljka korišćenjem softvera Prism GraphPad 5.

[0214] Fig.18 predstavlja grafičke prikaze koncentracija u plazmi tokom vremena za fuzione proteine SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 86 i 91, SEQ ID NO: 92 i 87, SEQ ID NO: 86 i 93, SEQ ID NO: 94 i 87, i SEQ ID NO: 90 i 91, grafički prikazane zajedno sa vrednostima dobijenim za građenje bloka PD-L1 antitela (SEQ ID NO: 86 i 87) kao referentnog. Farmakokinetika je izgledala slično u svim slučajevima. Počevši od koncentracija u plazmi od oko 200 µg/mL, nivoi u plazmi su pali do nivoa od oko 50 µg/mL tokom 48 sati, a zatim su padali dosta sporije do nivoa od oko 10 µg/mL na kraju eksperimenta nakon 28 dana. Analiza bez odeljaka se primenjuje na ove podatke. Terminalno poluvreme eliminacije je ukratko prikazano u tabeli 13.

[0215] Podaci pokazuju da fuzioni proteini imaju dug, terminalno poluvreme eliminacije kod miševa poput antitela. Budući da ispitivanje koje se koristi za određivanje koncentracija fuzionih proteina u plazmi zahteva zadržano dejstvo i prema PD-L1 i CD137, rezultat takođe pokazuje da bispecifični molekuli ostaju intaktni tokom vremenskog toka od 28 dana.

Tabela 13 Terminalna poluvremena eliminacije kod miševa određeni analizom bez odeljaka

Primer 22. Farmakokinetika fuzionih proteina kod miševa

[0216] Analiza farmakokinetike reprezentativnog fuzionog proteina SEQ ID NO: 90 i 87 je izvedena kod miševa i upoređena je sa dve prethodno opisana CD137- i PD-L1-vezujuća fuziona proteina (SEQ ID NO: 147 i SEQ ID NO: 148). Mužjacima CD-a miševa približne starosti od 5 nedelja (2 miša po vremenskoj tački; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) je u repnu venu ubrizgavan odgovarajući molekul u dozi od 2 mg/kg. Uzorci plazme miševa su dobijeni u vremenskim tačkama od 5 min, 24 h, 168 h, i 336 h. Dovoljna cela krv - uzeta u izofluranskoj anesteziji – je sakupljena kako bi se dobilo najmanje 30-50 µL Li-Heparin plazme po životinji i vremenu.

[0217] Nivoi leka u plazmi su analizirani ELISA-om. HuCD137-His (humani CD137 sa C-terminalnim polihistidinskim tagom) je rastvoren u PBS (1 µg/mL) i obložen preko noći na mikrotitarskim pločama na 4°C. Ploča se zatim pere posle svake faze inkubacije sa oprana posle sa 80 µL PBS-a dopunjenog sa 0.05% (v/v) Tween 20 pet puta. Ploče su blokirane sa PBS/BSA/Tween (PBS koji sadrže 2% BSA (w/v) i 0.1% (v/v) Tween 20) tokom 1 h na sobnoj temperaturi i posle su oprane. Uzorci plazme su razblaženi u PBS/BSA/Tween do 20% koncentracije u plazmi, dodati u bunarčiće, i inkubirani tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon toga sledi druga faza pranja. Vezani agensi tokom ispitivanja su detektovani posle 1 h inkubacije sa mešavinom biotinilisanog humanog PD-L1 i streptavidina SULFOTAG (Mesoscale Discovery) na 1 µg/mL pri čemu je svaki razblažen u PBS koji sadrži 2% BSA (w/v) i 0.1% (v/v) Tween 20. Posle dodatne faze pranja, 35 µL pufera za očitavanje je dodato u svaki bunarčić i očitan je elektrohemiluminiscentni (ECL) signal svakog bunarčića upotrebom Mesoscale Discovery čitača. Podaci su preneseni u eksel kako bi se analizirali i kvantifikovali. Pripremljena je kalibraciona kriva sa standardnim proteinskim razblaživanjima.

[0218] Fig.19 predstavlja grafički prikaz koncentracija u plazmi tokom vremena za SEQ ID NO: 90 i 87, SEQ ID NO: 147, i SEQ ID NO: 148. SEQ ID NO: 90 i 87 prikazuje povoljan farmakokinetički profil ili farmakokinetiku poput antitela, dok SEQ ID NO: 147 i SEQ ID NO: 148 ne prikazuju. Kako je ovde opisano, povoljan farmakokinetički profil ili farmakokinetika poput antitela se može smatrati da su postignuti ako je % cmaxiznad 10 % posle 336 h.

VI. NEPATENTNE REFERENCE

[0219]

1. GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., ARASANZ, H., IBANEZ-VEA, M., LORENZO, L., FERNANDEZ-HINOJAL,

G., VERA, R., SMERDOU, C., MARTISOVA, E., AROZARENA, I., WELLBROCK, C., LLOPIZ, D., RUIZ, M.,

SAROBE, P., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D.2017. PDL1 Signals through Conserved Sequence Motifs to Overcome Interferon-Mediated Cytotoxicity. Cell Rep, 20, 1818-1829.

2. KARWACZ, K., BRICOGNE, C., MACDONALD, D., ARCE, F., BENNETT, C. L., COLLINS, M. & ESCORS, D.

2011. PD-L1 co-stimulation contributes to ligand-induced T cell receptor down-modulation on CD8+ T cells. EMBO Mol Med, 3, 581-92.

3. ARASANZ, H., GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., IBANEZ-VEA, M., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. &

ESCORS, D.2017. PD1 signal transduction pathways in T cells. Oncotarget, 8, 51936-51945.

4

4. PATSOUKIS, N., BARDHAN, K., CHATTERJEE, P., SARI, D., LlU, B., BELL, L. N., KAROLY, E. D., FREEMAN, G. J., PETKOVA, V., SETH, P., LI, L. & BOUSSIOTIS, V. A.2015. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Not Commun, 6, 6692.

5. XU-MONETTE, Z. Y., ZHANG, M., LI, J. & YOUNG, K. H.2017. PD-1/PD-L1 Blockade: Have We Found the Key to Unleash the Antitumor Immune Response? Front Immunol, 8, 1597.

6. LI, S. Y. & LlU, Y.2013. Immunotherapy of melanoma with the immune costimulatory monoclonal antibodies targeting CD137. Clin Pharmacol, 5, 47-53.

7. SNELL, L. M., LIN, G. H., MCPHERSON, A. J., MORAES, T. J. & WATTS, T. H.2011. T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev, 244, 197-217.

8. WYZGOL, A., MULLER, N., FICK, A., MUNKEL, S., GRIGOLEIT, G. U., PFIZENMAIER, K. & WAJANT, H.

2009. Trimer stabilization, oligomerization, and antibody-mediated cell surface immobilization improve the activity of soluble trimers of CD27L, CD40L, 41BBL, and glucocorticoid-induced TNF receptor ligand. J Immunol, 183, 1851-61.

9. YAO, S., ZHU, Y. & CHEN, L.2013. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation. Not Rev Drug Discov, 12, 130-46.

10. MELERO, I., BACH, N., HELLSTROM, K. E., ARUFFO, A., MITTLER, R. S. & CHEN, L.1998.

Amplification of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory 4-1BB ligand: synergy with the CD28 co-stimulatory pathway. Eur J Immunol, 28, 1116-21.

11. YANG, Y., YANG, S., YE, Z., JAFFAR, J., ZHOU, Y., CUTTER, E., LIEBER, A., HELLSTROM, I. & HELLSTROM, K. E.2007. Tumor cells expressing anti-CD137 scfv induce a tumor-destructive environment. Cancer Res, 67, 2339-44.

12. ZHANG, H., KNUTSON, K. L., HELLSTROM, K. E., DISIS, M. L. & HELLSTROM, I.2006. Antitumor efficacy of CD137 ligation is maximized by the use of a CD137 single-chain Fv-expressing whole-cell tumor vaccine compared with CD137-specific monoclonal antibody infusion. Mol Cancer Ther, 5, 149-55.

13. YE, Z., HELLSTROM, I., HAYDEN-LEDBETTER, M., DAHLIN, A., LEDBETTER, J. A. & HELLSTROM, K. E.

2002. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Not Med, 8, 343-8.

14. MARTINET, O., DIVINO, C. M., ZANG, Y., GAN, Y., MANDELI, J., THUNG, S., PAN, P. Y. & CHEN, S. H.

2002. T cell activation with systemic agonistic antibody versus local 4-1BB ligand gene delivery combined with interleukin-12 eradicate liver metastases of breast cancer. Gene Ther, 9, 786-92. 15. YE, Q., SONG, D. G., POUSSIN, M., YAMAMOTO, T., BEST, A., LI, C., COUKOS, G. & POWELL, D. J., JR.2014. CD137 accurately identifies and enriches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor. Clin Cancer Res, 20, 44-55.

16. CHACON, J. A., WU, R. C., SUKHUMALCHANDRA, P., MOLLDREM, J. J., SARNAIK, A., PILON-THOMAS, S., WEBER, J., HWU, P. & RADVANYI, L.2013. Co-stimulation through 4-1BB/CD137 improves the expansion and function of CD8(+) melanoma tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive T-cell therapy. PLoS One, 8, e60031.

17. FISHER, T. S., KAMPERSCHROER, C., OLIPHANT, T., LOVE, V. A., LIRA, P. D., DOYONNAS, R., BERGQVIST, S., BAXI, S. M., ROHNER, A., SHEN, A. C., HUANG, C., SOKOLOWSKI, S. A. & SHARP, L. L.

2012. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunol Immunother, 61, 1721-33.

18. SKERRA, A.2000. Lipocalins as a scaffold. Biochim Biophys Acta, 1482, 337-50.

19. FLOWER, D. R., NORTH, A. C. & SANSOM, C. E.2000. The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim Biophys Acta, 1482, 9-24.

20. FLOWER, D. R.1996. The lipocalin protein family: structure and function. Biochem J, 318 ( Pt 1), 1-14.

21. ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAFFER, A. A., ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. & LIPMAN, D. J.1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.

Nucleic Acids Res, 25, 3389-402.

22. ALTSCHUL, S. F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E. W. & LIPMAN, D. J.1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215, 403-10.

23. SMITH, T. F. & WATERMAN, M. S.1981. Identification of common molecular subsequences. J Mol Biol, 147, 195-7.

24. WARD, E. S., GUSSOW, D., GRIFFITHS, A. D., JONES, P. T. & WINTER, G.1989. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature, 341, 544-6.

25. HOLLIGER, P., PROSPERO, T. & WINTER, G.1993. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 6444-8.

26. JOHNSON, G. & WU, T. T.2000. Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res, 28, 214-8.

27. EHRENMANN, F., KAAS, Q. & LEFRANC, M. P.2010. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. Nucleic Acids Res, 38, D301-7.

28. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., ZHANG, J., DRANOFF, G., WILSON, N. S. & BROGDON, J. L.2014. OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcgammaRs, leading to antitumor efficacy. Immunol Cell Biol, 92, 475-80.

29. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., WINDMAN, M., RUE, S. M., ETTENBERG, S., KNEE, D. A., WILSON, N. S., DRANOFF, G. & BROGDON, J. L.2013. Activating Fc gamma receptors contribute to the antitumor activities of immunoregulatory receptor-targeting antibodies. J Exp Med, 210, 1685-93.

30. SILVA, J. P., VETTERLEIN, O., JOSE, J., PETERS, S. & KIRBY, H.2015. The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation. J Biol Chem, 290, 5462-9.

31. GLAESNER, W., VICK, A. M., MILLICAN, R., ELLIS, B., TSCHANG, S. H., TIAN, Y., BOKVIST, K., BRENNER, M., KOESTER, A., PORKSEN, N., ETGEN, G. & BUMOL, T.2010. Engineering and characterization of the long-acting glucagon-like peptide-1 analogue LY2189265, an Fc fusion protein. Diabetes Metab Res Rev, 26, 287-96.

32. DALL'ACQUA, W. F., KIENER, P. A. & WU, H.2006. Properties of human IgGls engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FeRn). J Biol Chem, 281, 23514-24.

33. ZALEVSKY, J., CHAMBERLAIN, A. K., HORTON, H. M., KARKI, S., LEUNG, I. W., SPROULE, T. J., LAZAR, G. A., ROOPENIAN, D. C. & DESJARLAIS, J. R.2010. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Not Biotechnol, 28, 157-9.

34. SHIELDS, R. L., NAMENUK, A. K., HONG, K., MENG, Y. G., RAE, J., BRIGGS, J., XIE, D., LAI, J., STADLEN, A., LI, B., FOX, J. A. & PRESTA, L. G.2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem, 276, 6591-604.

35. ALTSHULER, E. P., SEREBRYANAYA, D. V. & KATRUKHA, A. G.2010. Generation of recombinant antibodies and means for increasing their affinity. Biochemistry (Mosc), 75, 1584-605.

36. HARLOW, E. & LANE, D.1999. Using antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

37. HARLOW, E. & LANE, D.1988. Antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory.

38. LI, J., SAI, T., BERGER, M., CHAO, Q., DAVIDSON, D., DESHMUKH, G., DROZDOWSKI, B., EBEL, W., HARLEY, S., HENRY, M., JACOB, S., KLINE, B., LAZO, E., ROTELLA, F., ROUTHIER, E., RUDOLPH, K., SAGE, J., SIMON, P., YAO, J., ZHOU, Y., KAVURU, M., BONFIELD, T., THOMASSEN, M. J., SASS, P. M., NICOLAIDES, N. C. & GRASSO, L.2006. Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology. Proc Natl Acad Sci USA, 103, 3557-62.

39. KOZBOR, D. & RODER, J. C.1983. The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes. Immunol Today, 4, 72-9.

40. COLE, S. P., CAMPLING, B. G., LOUWMAN, I. H., KOZBOR, D. & RODER, J. C.1984. A strategy for the production of human monoclonal antibodies reactive with lung tumor cell lines. Cancer Res, 44, 2750-3.

41. HOLLIGER, P. & HUDSON, P. J.2005. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Not Biotechnol, 23, 1126-36.

42. PERVAIZ, S. & BREW, K.1987. Homology and structure-function correlations between alpha 1-acid glycoprotein and serum retinol-binding protein and its relatives. FASEB J, 1, 209-14.

43. SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W.2001. Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

44. FLOWER, D. R.2000. Beyond the superfamily: the lipocalin receptors. Biochim Biophys Acta, 1482, 327-36.

45. BREUSTEDT, D. A., KORNDORFER, I. P., REDL, B. & SKERRA, A.2005. The 1.8-A crystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity with capacity for multiple ligands. J Biol Chem, 280, 484-93.

46. SCHMIDT, T. G., KOEPKE, J., FRANK, R. & SKERRA, A.1996. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. J Mol Biol, 255, 753-66.

47. VAJO, Z. & DUCKWORTH, W. C.2000. Genetically engineered insulin analogs: diabetes in the new millenium. Pharmacol Rev, 52, 1-9.

48. FUERTGES, F. & ABUCHOWSKI, A.1990. The clinical efficacy of poly(ethylene glycol)-modified proteins. Journal of Controlled Release, 11, 139-148.

49. DENNIS, M. S., ZHANG, M., MENG, Y. G., KADKHODAYAN, M., KIRCHHOFER, D., COMBS, D. & DAMICO, L. A.2002. Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem, 277, 35035-43.

50. KONIG, T. & SKERRA, A.1998. Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J Immunol Methods, 218, 73-83.

51. OSBORN, B. L., OLSEN, H. S., NARDELLI, B., MURRAY, J. H., ZHOU, J. X., GARCIA, A., MOODY, G., ZARITSKAYA, L. S. & SUNG, C.2002. Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys. J Pharmacol Exp Ther, 303, 540-8.

52. LOWMAN, H. B.1997. Bacteriophage display and discovery of peptide leads for drug development. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 26, 401-24.

53. RODI, D. J. & MAKOWSKI, L.1999. Phage-display technology--finding a needle in a vast molecular haystack. Curr Opin Biotechnol, 10, 87-93.

54. VENTURI, M., SEIFERT, C. & HUNTE, C.2002. High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm. J Mol Biol, 315, 1-8.

55. BRUCKDORFER, T., MARDER, O. & ALBERICIO, F.2004. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol, 5, 29-43.

Claims

Patentni zahtevi

1. Fuzioni protein koji je sposoban da vezuje i CD137 i PD-L1, pri čemu taj fuzioni protein obuhvata dve podjedinice, pri čemu prva podjedinica obuhvata imunoglobulin pune dužine koji je specifičan za PD-L1, i pri čemu druga podjedinica obuhvata lipokalinski mutein koji je specifičan za CD137,

pri čemu taj fuzioni protein obuhvata aminokiselinske sekvence koje su najmanje 90% identične aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NO: 90 i 87,

pri čemu teški lanac imunoglobulina obuhvata sledeći skup CDR sekvenci: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), i VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3, SEQ ID NO: 62), a laki lanac imunoglobulina obuhvata sledeći skup CDR sekvenci: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), i QQSNSWPYT (LCDR3, SEQ ID NO: 64), i pri čemu aminokiselinska sekvenca lipokalinskog muteina obuhvata sledeći skup mutiranih aminokiselinskih ostataka u odnosu na linearnu polipeptidnu sekvencu zrelog hNGAL kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2: Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; i Lys 134 → Tyr.

2. Fuzioni protein prema zahtevu 1, pri čemu je aminokiselinska sekvenca lipokalinskog muteina najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 42.

3. Fuzioni protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu aminokiselinska sekvenca lipokalinskog muteina obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 42.

4. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je druga podjedinica povezana na N-kraju linkerom sa C-krajem svakog konstantnog regiona teškog lanca (CH) prve podjedinice, pri čemu je taj linker poželjno linker iz SEQ ID NO: 13.

5. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu imunoglobulin obuhvata varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji obuhvataju aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 77 i 82.

6. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu imunoglobulin obuhvata teški lanac i laki lanac koji obuhvataju aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86 i 87.

7. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu imunoglobulin ima IgG4 srž, pri čemu ta IgG4 srž poželjno ima jednu ili više sledećih mutacija: S228P, N297A, F234A, L235A, M428L, N434S, M252Y, S254T, i T256E, prema EU indeksu Kabata.

8. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-5 ili 7 pri čemu taj fuzioni protein obuhvata aminokiselinske sekvence koje su najmanje 92%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili više identične aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NO: 90 i 87.

9. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu taj fuzioni protein obuhvata aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 90 i 87.

10. Molekul nukleinske kiseline koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu poželjno

(i) molekul nukleinske kiseline je operabilno povezan sa regulatornom sekvencom kako bi se omogućila ekspresija pomenutog molekula nukleinske kiseline; ili

(ii) molekul nukleinske kiseline je sadržan u vektoru ili fagmidnom vektoru.

11. Ćelija domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 10.

12. Postupak proizvodnje fuzionog proteina prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu se taj fuzioni protein proizvodi počevši od nukleinske kiseline koja kodira za fuzioni protein, pri čemu se taj fuzioni protein poželjno proizvodi u bakterijskom ili eukariotskom organizmu domaćina i izoluje se iz ovog organizma domaćina ili njegove kulture.

13. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-9.

14. Fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-9 za upotrebu u terapiji.

15. Fuzioni protein za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu je ta upotreba u lečenju kancera.