RS64372B1 - Genska terapija za poboljšanje vida - Google Patents

Genska terapija za poboljšanje vida

Info

Publication number
RS64372B1
RS64372B1 RS20230560A RSP20230560A RS64372B1 RS 64372 B1 RS64372 B1 RS 64372B1 RS 20230560 A RS20230560 A RS 20230560A RS P20230560 A RSP20230560 A RS P20230560A RS 64372 B1 RS64372 B1 RS 64372B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
aav
rod
light
vector
mice
Prior art date
Application number
RS20230560A
Other languages
English (en)
Inventor
Matteo Rizzi
Robin Ali
Alexander Smith
Koji Nishiguchi
Original Assignee
Ucl Business Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ucl Business Ltd filed Critical Ucl Business Ltd
Publication of RS64372B1 publication Critical patent/RS64372B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu vektora genske terapije za poboljšanje vida kod pacijenta.
STANJE TEHNIKE
[0002] Kod mnogih vrsta sisara, uključujući miševe i ljude, broj štapića (štapićastih fotoreceptorskih ćelija) koji posreduju u vidu pri slabom svetlu znatno je veći od broja čepića (kupastih fotoreceptorskih ćelija) (Curcio et al, 2000). Međutim, u industrijalizovanom svetu u kome osvetljenje omogućava da čepići funkcionišu tokom dana, od manje je važnosti vid koji je posredovan štapićima. Mnogi pacijenti sa odsutnom funkcijom štapića od rođenja se identifikuju samo slučajno i, u stvari, ne mogu prepoznati sopstveni abnormalni vid (Dryja, 2000). Naprotiv, kada je prisutna disfunkcija čepića, pacijenti su uvek simptomatični i često pate od oštećenja vida u zavisnosti od stepena disfunkcije njihovih čepića. U nekim uslovima, međutim, samo (ili uglavnom) čepići su izgubljeni ili nefunkcionalni, a štapići ostaju relativno očuvani. Na primer, ahromatopsija je teška nasledna distrofija mrežnjače sa potpunim odsustvom funkcije čepića od rođenja, ali, verovatno, sa normalnom funkcijom štapića (Hess et al, 1986; Nishiguchi et al, 2005). Mutacije u više gena uključujući CNGA3 (Kohl et al 1998); i PDE6C (Chang et al, 2009; Thiadens et al, 2009) su povezane sa bolešću. Svaki od gena koji izazivaju bolest kodira esencijalnu komponentu fototransdukcione kaskade čepića koja prevodi svetlost u električni signal izazivajući hiperpolarizaciju fotoreceptorske ćelije. Kod makularne degeneracije koja je povezana sa uzrastom (AMD), oštećenje vida je prvenstveno uzrokovano degeneracijom fovee bogate čepićima u centralnoj makuli. Tako pacijenti gube centralni vid i oštrinu, ali često imaju relativno dobro očuvanu perifernu makulu i stoga imaju određeni korisni rezidualni vid koji je ograničen nedostatkom čepića izvan fovee.
[0003] Štapići su visoko osetljivi na svetlost, što im omogućava da u prigušenim uslovima percipiraju malu količinu svetlosti. Čepići, naprotiv, su manje osetljivi, ali su sposobni da obrađuju velike količine svetlosti i kontinuirano prenose vizuelne signale u dnevnoj svetlosti. Ova funkcionalna razlika je, delom, zbog efikasnosti deaktivacije mašinerije fotosignalizacije, kompleksa GTPaze koji se sastoji iz RGS9, R9AP (takođe poznat kao RGS9BP), i Gβ5. RGS9 je katalitička komponenta koja hidrolizuje GTP kuplovan sa G-proteinom, pri čemu su R9AP i Gβ5 esencijalne konstitutivne podjedinice (Burns et al, 2009; Burns et al, 2010). Važno, R9AP usidruje kompleks za disk membranu na spoljnom segmentu fotoreceptora gde se takođe odvija fototransdukciona signalizacija (Baseler et al, 2002). Ekspresija R9AP određuje nivo kompleksa GTPaze tako da bilo koji RGS9 koji je proizveden u višku R9AP se verovatno brzo degraduje (Martyemyanov et al, 2009). Prekomerna ekspresija R9AP u mišjim štapićima je dovoljna da bi se povećala GTPazna akivnost i da bi se suštinski ubrzale njihove kinetike deaktivacije o čemu svedoče snimci pojedinačnih ćelija (Krispel et al, 2006). U čepićima, procenjeno je da je ekspresija RGS9 je ~10-puta veća u odnosu na štapiće (Cowan et al, 1998; Zhang et al, 2003). Ovo obezbeđuje osnovu za sposobnost čepića da se brzo oporave od svetlosnog izlaganja i stoga održe funkcionalnim prema kontinuiranom svetlosnom stimulusu. Takođe dozvoljava čepićima da odgovore na bržu stimulaciju. Zaista, klinički, pacijenti sa odloženom deaktivacijom fototransdukcione kaskade uzrokovane genskim defektima u RGS9 ili R9AP, ili bradiopsijom, imaju duboko oštećenje vida posredovano čepićima uključujući dnevno slepilo i smanjenu sposobnost da vide pokretne objekte Nishiguchi et al, 2004; Michaelides et al, 2010). U međuvremenu, vid koji je posredovan štapićima je manje pogođen istom mutacijom.
[0004] Neki uslovi makularne degeneracije, kao što je makularna degeneracija povezana sa uzrastom (AMD) i uslovi nasleđene makularne degeneracije takođe ispoljavaju disfunkciju čepića ali normalnu ili manje oštećenu funkciju štapića. Makularna degeneracija je vodeći uzročnik slepila u razvijenom svetu i kako se njena rasprostranjenost učetvorostručava u svakoj životnoj dekadi očekuje se da će instanca AMD biti u porastu u predstojećim godinama kako se životni vek bude produžavao. Lekovi za lečenje AMD već čine preko 1% ukupnog budžeta za lekove Nacionalne zdravstvene službe Velike Britanije. Dok se pacijenti sa uznapredovalom AMD mogu osposobiti za fiksaciju ekstra-fovealno, niska stopa osvežavanja i nizak prag izbeljivanja ćelija štapića ograničava kvalitet dobijenog vida.
[0005] WO2009127705 opisuje nove terapijske alate i postupke za lečenje slepila.
[0006] WO2013124477 opisuje postupke i kompozicije za lečenje bolesti degeneracije mrežnjače.
[0007] WO2012167109 opisuje RPGRIP1 gensku terapiju za Leberovu kongenitalnu amaurozu.
[0008] Lhériteau et al. (Molecular Therapy.2013; 22(2) stranice 265 -277) opisuje gensku terapiju kod psa deficijentnog za RPGRIP1.
[0009] Nishiguchi et al. (Nature Communications. 2015; 6(6006) stranice 1-10) opisuje kako genska terapija obnavlja vid kod rd1 miševa nakon uklanjanja pomešane mutacije u Gpr179.
[0010] Han et al. (Frontiers in Systems Neuroscience.2011;5(18) stranice 1-8) opisuje optogenetičku kontrolu korteksa kod nehumanog primata.
[0011] Burns et al. (Physiology.2010; 25(2), stranice 72-84) opisuje G-proteinsku signalizaciju u živim ćelijama.
[0012] Pearring et al., (Mol Biol Cell. 2014;25(17):2644-2649) opisuje kako je ciljanje R9AP na spoljašnje segmente štapića nezavisno od rodopsina i usmereneno je SNARE homolognim domenom.
[0013] Sandoval et al., (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2006;47(13):853) prekomernu ekspresiju R9AP i RGS9-1 usmerenu AAV u mrežnjači pacova.
SUŠTINA PRONALASKA
[0014] Koristeći miševe sa odsutnom funkcijom čepića, pokazali smo da prekomerna ekspresija Rgs9-usidrenog proteina (R9AP), kritične komponente kompleksa GTPaze koja posreduje u deaktivaciji fototransdukcione kaskade, posredstvom AAV-a, rezultira desenzibilizacijom i "fotopskim pomeranjem" elektroretinograma štapića. Tretman omogućava štapićima da reaguju na jaču tj. svetliju svetlost (do ~2,0 log) od neobrađenih ćelija na račun skotopske (niži svetlosni nivo) funkcije. Merenja višeelektrodnih nizova pomoću tretiranih mrežnjača su pokazala su da ganglijske ćelije mrežnjače takođe odražavaju "fotopski pomak" štapića, pokazujući stepenovane odgovore na nivoima fotopskog svetla. Funkcija kontrastne osetljivosti merena kvantifikovanjem pokreta praćenja glave kao odgovor na rotirajuće sinusoidne rešetke pokazala je poboljšanje osetljivosti do 25 puta u uslovima sobne svetlosti i brži odgovor na ponovljene stimuluse. Osim toga, biohemijsko merenje nivoa rodopsina koji se može izbeljivati kod ovih miševa je pokazalo da vizuelni ciklus ne ograničava funkciju štapića.
[0015] Takođe je eksprimirana brza svetlosnu protonsku pumpu, ArchT (Han et al, 2011) u fotoreceptorskim ćelijama štapićima. AAV8 čestice koje nose ArchT-EGFP pod kontrolom promotora rodopsina (Rho) su ubrizgane subretinalno odraslim miševima. Ekspresija Rho-ArchT-EGFP bila je ograničena na membranu fotoreceptorske ćelije štapića. Ekspresija ArchT je omogućila izuzetno brze svetlosne reakcije, dok je unutrašnji odgovor štapića bio očuvan i bio je uporediv sa onim uočenim u netransdukovanim fotoreceptorskim ćelijama štapića. Sve u svemu, ekspresija ArchT nije promenila sposobnost fotoreceptorskih ćelija štapića da reaguju na skotopske stimuluse, ali je dala dodatnu sposobnost reagovanja brzim odgovorima bez beljenja na više nivoe osvetljenja. Takođe smo otkrili da su transdukovani štapići mogli pouzdano da izdrže ovu brzu transmisiju slično 'čepićima', jer su štapići koji eksprimiraju ArchT pokretali trajne ganglijske ćelije mrežnjače (RGC) koje su se povećavale pri visokim intenzitetima svetlosti i na frekvencijama koje su se približavale onima kod fotoreceptorskih ćelija čepića. Ekspresija Rho-ArchT-EGFP u CNGA3-/- i PDE6C-/-miševima kojima nedostaje vid posredovan čepićima takođe je proširio osetljivost ovih miševa na stimuluse jakog svetla i omogućio brz vid ovim miševima. Maksimalna frekvencija stimulusa koju su miševi koji eksprimiraju ArchT mogli da prate bila je slična onoj kod fotoreceptorskih ćelija čepića.
[0016] Zajedno, ovi rezultati pokazuju da, nakon transdukcije zdravih fotoreceptora štapića genima koji kodiraju proteine osetljive na svetlost koji u karakteristični za čepiće ili gene koji kodiraju molekule koji povećavaju brzinu mehanizma endogene signalizacije kod štapića, štapići se ponašaju više slično čepićima i stoga mogu nadoknaditi disfunkciju čepića. Navedeno sadrži implikacije za lečenje brojnih poremećaja vida u kojima je smanjena funkcija čepića, ali ostaju bar neki zdravi štapići. Ovo je u suprotnosti sa prethodnim slučajevima (Busskamp et al, 2010; US Patent Publication No.2012258530) u kojima je cilj bio vraćanje izgubljene funkcije u čepićima. Izmena funkcije u štapićima na način iz ovog pronalaska je povoljna u tim uslovima u kojima su čepići disfunkcionalni ali se mogu popraviti (na primer u ranim stadijumima degeneracije mrežnjače kada je funkcija fotoreceptora izgubljena ali fotoreceptor-u-bipolarnoj sinapsi može biti intaktan) su retki, pri čemu su uslovi u kojima je funkcija čepića ozbiljnija ili uznapredovala i ne može se popraviti ili gde su čepići u potpunosti izgubljeni, ali ipak ostaju neki zdravi fotoreceptori štapića, uobičajeno (videti gore). Osim toga, ovaj pronalazak omogućava nastanak ‘pseudo-fovee’, malog dela štapića sličnih čepićima koji će poboljšati vid u uslovima u uslovima u kojima su fovealni čepići izgubljeni ili su disfunkcionalni.
[0017] Pronalazak prema tome obezbeđuje adeno-povezani virusni (AAV) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira genski proizvod koji je osetljiv na svetlost i/ili koji modulira endogenu signalizaciju oseljivu na svetlost u fotoreceptorskoj ćeliji, za upotrebu u postupku poboljšanja vida kod pacijenta in sa disfunkcijom fotoreceptora čepića i/ili degeneracijom uvođenjem pomenute nukleinske kiseline u fotoreceptore zdravih štapića u mrežnjači pacijenta i ekspresiji pomenutog genskog proizvoda, tako da je opseg svetlostnih intenziteta na koje reaguje štapićasta fotoreceptorska ćelija je proširen i/ili brzina pri kojoj štapićasta fotoreceptorska ćelija reaguje na svetlost je povećana, pri čemu:
genski proizvod je ArchT, Jaws (cruxhalorodopsin), iC1C2, ili R9AP;
kapsid vektora AAV vektora je kapsid AAV8; i
nukleinska kiselina je eksprimirana pod kontrolom promotora specifičnog za štapiće.
KRATAK OPIS NACRTA
[0018]
Slika 1: Ekspresija ArchT u štapićastim fotoreceptorskim ćelijama dovodi do brzih struja koje pokreće svetlost
(a), gornji paneli: AAV8-posredovana transdukcija ArchT-EGFP (zeleno, videti leve panele) pod kontrolom promotora rodopsina. Nije uočeno preklapanje sa čepićima (ljubičato: Arestin kupastih ćelija, videti srednje panele, belo: DAPI, videti desne panele). Donji paneli: specificičnost ekpresije može se takođe uočiti sinaptičkom nivou. (b) ArchT-EGFP je lokalizovan na membrani fotoreceptora štapića, uključujući unutrašnje i spoljne segmente. (c) Kvantifikovanje fluorescencije u krajevima štapića koji eskprimira ArchT-EGFP (zeleno, levi pik) i krajevima čepića koji su pozitivni za arestin čepića ćelija (ljubičasto, desni pik) pokazuje dve različite trake koje odgovaraju pod-sloju u kome redom lokalizuju sinapse štapića i čepića (n=22). (d) Snimci pojedinačnih ćelija iz ćelijskih tela fotoreceptora štapića koji eksprimiraju ArchT. Struje posredovane intrinzičnom fototransdukcijom štapića (gornji trag) u odgovoru na 10 ms 530-nm svetlosne pulseve (zeleno, videti vertikalne stubiće) su sačuvane. Struje generisane ArchT bile su brže (donji trag). Skala stubića:
(a) gornji paneli: 50 µm; (a) donji paneli i (b): 10 um.
Slika 2: Ekspresija ArchT-pokreće odgovore visoke frekvencije u štapićastim ćelijama i brzu transmisiju na ganglijske ćelije u mežnjači.
(a) Intrinzične struje štapića koje su svetlosno izazvane u neubrizganim mrežnjačama C57BL6. (b) ArchT-posredovane struje su sposobne da prate znatno veće frekvencije stimulacije.
(c) Odgovori su vremenski zaključani na prezentaciju stimulusa (zeleni vertikalni stubići). (d) Štapići koje eksprimiraju ArchT reaguju na stimulaciju frekvencijom od 80 Hz bez kolebanja, pri čemu intrinzični odgovori štapića padaju na ~20 Hz. (e) Pregled podataka koji pokazuju ekspresiju ArchT ne menjaju intrizične odgovore štapićastih fotoreceptorskih ćelija, dok odgovor ArchT počinje na svetlijim svetlosnim nivoima. (f) Snimci čipa sa više elektroda mrežnjače koje eksprimiraju PDE6C-/-ArchT. Intrinzični odgovori štapića nisu uspeli da izazovu pouzdane skokove ganglijskih ćelija mrežnjače iznad 20 Hz. Naprotiv, aktivacija štapića posredovana ArchT-om dovela je do brzog porasta ganglijskih ćelija mrežnjače do nivoa koji se može uporediti sa fotoreceptorskim ćelijama čepića.
Slika 3: ArchT posredovana aktivacija štapićastih ćelija pokreće bihejvioralni odgovor za brze stimuluse visokog svetlosnog intenziteta.
(a) Gornji paneli: šematski prikaz ponašanja uslovljavanja straha. Ukratko, vizuelni stimulus je bio uparen sa šokom. 24 sata kasnije ponašanje ukočenosti je testirano u novom kontekstu. Donji paneli: neinjektirani CNGA3<-/->i PDE6C<-/->miševi nisu uspeli da nauče zadatak (levi setovi traka na svakom grafikonu). Međutim, ArchT ekspresija je uspešno dovela do ponašanja ukočenosti kod miševa (desni skupovi traka na svakom grafikonu). (b) Optomotorno testiranje. Miševi koji eksprimiraju ArchT su u stanju da prate stimuluse na frekvencijama uporedivim sa onima koje pouzdano prate čepići.
Slika 4: Prekomerna ekspresija R9AP posredovana AAV-om u štapićima i ubrzana deaktivacija atalasa kod Cnga3-/-miševa.
A. Povećana ekspresija RGS9 u Cnga3-/-oku tretiranom sa rRAAV2/8.Rho.mR9ap. Prekomerna ekspresija R9AP dovodi do povećane imunoreaktivnosti prema RGS9 (crveno) kroz sloj fotoreceptora u tretiranom oku (levo) u poređenju sa netretiranim (desno). Western blot pokazuje povećanu ekspresiju RGS9 kako u mrežnjači tako i u pigmentnom epitelu mrežnjače (RPE) u oku sa prekomernom ekspresijom R9AP (dole). Mala količina RGS9 proteina je takođe otkrivena u RPE tretiranog oka. Ovo može odražavati "prelivanje" prekomernog proteina sadržanog u fagocitoziranoj membrani diska. Linija skale označava 25 mm.
B. Povećana brzina oporavka amplitude a-talasa u Cnga3-/-oku tretiranom sa rAAV2/8.Rho.mR9ap i rAAV2/8.CMV.mR9ap. Reprezentativni ERG tragovi za bljesak sonde (crni tragovi, pogledajte tragove sa vrhuncem u sredini vremenskog toka) i za 2. blic (crveni tragovi) predstavljeni u intervalu između stimulusa (ISI) od 2 sekunde od tretiranog (gore) a neobrađene (donje) oči iste životinje. Primetno je da drugi blic daje mali a-talas (strelica) koji je jasno vidljiv u tretiranom oku, dok a-talas nije vidljiv (strelica) u netretiranom drugom oku. Prikaz oporavka atalasa kod različitih ISI u tretiranim i netretiranim očima. Oči kojima je ubrizgan rAAV2/8.CMV.mR9ap (n = 5) ili rAAV2/8.Rho.mR9ap (n = 7) imaju bržu kinetiku oporavka od netretiranog oka (n = 5) koje je najvidljivije sa kraćim ISI. Podaci su predstavljeni kao prosečna ± standardna greška srednje vrednosti. OE: prekomerna ekspresija.
Slika 5: Pojačanje fotopičke funkcije štapića preko prekomerne ekspresije R9AP u Cnga3-/-miševima.
A. Podizanje praga odgovora i fotopičnog pomeranja 6Hz ERG-ova preko prekomerne ekspresije R9AP u štapićima Cnga3-/-miševa. Reprezentativni ERG tragovi od 6Hz iz Cnga3-/-miša kod kojih je jedno oko tretirano sa rAAV2/8.CMVmR9ap, a drugo oko nije tretirano (gornji panel). ERG tragovi su poređani od odgovora prema najtamnijem blicu (-6,0 log cd.s/m<2>) do najsjajnijeg blica (2,0 log cd.s/m<2>; odozdo) od vrha ka dnu na 0,5 log.cd.s /m<2>koraku. Primetno je da je donji prag intenziteta blica pri kojem se javljaju reakcije povećan, što je u kombinaciji sa povišenim pragom odziva na svetlije bljeskove. Ovo rezultira "fotopskim pomeranjem" funkcije mrežnjače u oku tretiranom sa rAAV2/8.CMV.mR9ap. Rezime rezultata 6Hz ERG koji pokazuju fotopski pomak funkcije mrežnjače nakon tretmana sa rAAV2/8.CMV.mR9ap ili rAAV2/8.Rho.mR9ap (donji panel). ERG odgovori od Gnat1-/-miševa sa nedostatkom funkcije fotoreceptora štapića predstavljaju funkciju posredovanu čepićem. U međuvremenu, odgovori C57BL6 miševa potiču iz štapića i čepića. Podaci su predstavljeni kao % amplitude u odnosu na maksimalni odgovor i predstavljeni su kao prosečnih ± standardnih grešaka srednje vrednosti. ERG-ovi su zabeleženi iz Cnga3-/-miševa tretiranih sa rAAV2/8.CMV.mR9ap (Cnga3-/-CMVR9ap; N = 8), Cnga3-/-miševi tretirani sa rAAV2/8.Rho.mR9ap (Cnga3-/-Rho.R9ap; N = 6), Cnga3-/-miševi netretirani (Cnga3-/-Netretirani; N = 8), Gnat1-/-miševi netretirani (Gnat1-/-netretirani; N = 6) i miševi C57BL6 netretirani (C57BL6 netretirani; N = 6).
B. Povećani odgovori mrežnjače na duge bljeskove u Cnga3-/-oku tretiranom sa rAAV2/8.CMV.mR9ap. Otvoreni pravougaonik označava trajanje blica. Primetno je da se u oku tretiranom sa rAAV2/8.CMVmR9ap, odgovori mogu detektovati sa produženim trajanjem svetlosnog stimulusa. Suprotno tome, netretirano kontralateralno oko pokazuje malo ili nimalo odgovora kada se snima istovremeno u identičnim uslovima.
C. Dobijanje funkcije mrežnjače pod fotopičnim uslovima u Cnga3-/-očima tretiranim sa rAAV2/8.CMV.mR9ap. Primetno je da tretirano oko pokazuje odgovore u uslovima fotopičnog snimanja (bela pozadinska svetlost od 20 cd/m<2>), dok netretirano kontralateralno oko istovremeno snimano nije reagovalo.
Slika 6: Efikasan prenos signala (transmisija) izmenjenog fotoreceptora do bipolarnih ćelija u očima koje prekomerno eksprimiraju R9AP
A. Reprezentativni ERG tragovi. ERG-ovi su snimljeni nakon injekcije rAAV2/8.CMV.mR9ap (crveni trag, donji trag) u Cnga3-/-mišu korišćenjem zasićenog blica (1,9 log cd.s/m2). Kontralateralno oko je služilo kao netretirana kontrola (crni trag, gornji trag).
B. Odložena aktivacija bipolarnih ćelija usled blica. Implicitna vremena A-talasa i B-talasa merena su iz ERG odgovora na zasićenje blicem (1,9 log cd.s/m<2>) u tretiranim i netretiranim očima.
C. Kriva odgovora intenziteta za amplitude a-talasa i b-talasa snimljene kod Cnga3-/-miševa (N=5) sa jednim okom tretiranim sa rAAV2/8.CMV.mR9ap (crvene krive) i drugim okom koje nije tretirano (crne krive). Svi podaci su predstavljeni kao prosečna ± standardna greška srednje vrednosti. OE: prekomerna ekspresija
Slika 7: Dobijanje održive vizuelne percepcije nakon prekomerne ekspresije R9AP kod Cnga3-/-miševa
A. Poboljšana funkcija kontrastne osetljivosti merena optokinetičkim odgovorima. Kod Cnga3-/-miševa tretiranih sa rAAV2/8.Rho.mR9ap u levom oku, funkcija kontrastne osetljivosti (CSF) je različito merena u smeru kazaljke na satu (predstavlja tretirano levo oko) i u smeru suprotnom od kazaljke na satu (predstavlja netretiranu desno oko) kretanje glave prema sinusoidnim rešetkama. CSF za tretirane oči (crvena kriva) bila je bolja od one za netretirane oči (plava kriva), koja je bila slična onoj za netaknute Cnga3-/- miševe (crna kriva; prosek oba oka). Imajte na umu da je CSF za tretirano oko bio ekvivalentan, ako ne i malo bolji, onom za netaknute kontrole divljeg tipa (zeleno; prosek oba oka). N= 5 za sve grupe. Svi podaci su predstavljeni kao prosečna ± standardna greška srednje vrednosti. OE: prekomerna ekspresija.
B. Stalni nivoi rodopsina nakon produženog izlaganja optometrijskom testu. Reprezentativno snimanje optičke apsorpcije očnog uzorka korišćenjem spektrofotometra za skeniranje (levi panel unutar zelene isprekidane kutije). Oduzimanje apsorpcije očnih uzoraka izmerenih nakon (plavi trag, gornji trag između 300 i 400 nm) od prethodnog (crveni trag) potpunog fotoizbeljivanja pokazalo je lmin vrhunac na ~380 nm što odgovara oslobođenim fotoproizvodima u kombinaciji sa lmax maksimalnim na ~500 nm predstavlja količinu rodopsina koji se može izbeljivati u uzorku (desni panel unutar zelene isprekidane kutije). Brzina izbeljivanja rodopsina je procenjena merenjem spektra razlike (lmax) u potpuno proširenim očima tretiranim ili netretiranim sa rAAV2/8.Rho.mR9ap kod Cnga3-/- miševa nakon 5 minuta izlaganja beloj svetlosti od 7,0 mV (dole levo ; prosečna ± standardna greška srednje vrednosti). Nivoi rodopsina su takođe mereni nakon izlaganja Cnga3-/-miševa optomotrijskom testu do 120 minuta (desno dole; N=3 za svaku vremensku tačku) nakon jednostrane injekcije rAAV2/8.Rho.mR9ap. Siva oblast označava nivoe rodopsina (srednja standardna devijacija ±) zabeležena kod netaknutih Cnga3-/-miševa (N=8) nakon adaptacije preko noći na tamu. Isprekidana linija označava prosek. Treba imati u vidu da nivo rodopsina ostaje stabilan najmanje 2 sata u oba oka tretiranim sa rAAV2/8.Rho.mR9ap i netretiranim očima Cnga3-/- miševa. Podaci sa trakama greške su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardne greške srednje vrednosti.
Slika 8: Prekomerna ekspresija R9AP povećava brzinu oporavka fotoodgovora štapića kod Pde6c-/-miševa.
Vremenska konstanta (σ) za 50% oporavak amplitude a-talasa smanjena je za ~50% u Pde6c-/-očima ubrizganim rAAV2/8.CMV.mR9ap (σ = ∼ 5,75 sek) u poređenju sa netretiranim kontralateralnim očima (σ = ∼ 11,46 sek) u skladu sa ubrzanom deaktivacijom fototransdukcije nakon tretmana. N = 6. Podaci sa subićima greške su prikazani kao srednja vrednost ± standardne greške srednje vrednosti.
Slika 9: Prekomerna ekspresija R9AP dovodi do "fotopskog pomeranja" krive intenzitet-odgovor kod Pde6c-/-miševa.
Oči koje su ubrizgane sa rAAV2/8.CMV.mR9ap pokazale su fotopski pomak ERG odgovora od 6 Hz na inkrementalne intenzitete blica u poređenju sa netretiranim kontralateralnim očima kod Pde6c-/- miševa (N = 6). Podaci su predstavljeni kao % amplitude u odnosu na maksimalan odgovor i prikazani su kao prosečna ± standardna greška srednje vrednosti.
Slika 10: Trajni efekat prekomerne ekspresije R9AP bez jasnih dokaza o degeneraciji mrežnjače 5 meseci nakon injekcije rAAV2/8.CMV.mR9ap kod Cnga3-/- miševa.
Profil odgovora normalizovan u odnosu na maksimalnu amplitudu potvrdio je prisustvo "fotopskog pomeranja" krive intenzitet-odgovor na bliceve od 6 Hz (gore). Isti podaci bez normalizacije nisu pokazali nikakve dokaze smanjenja amplituda u tretiranom oku (dole). N = 5. Podaci su predstavljeni kao prosečna ± standardna greška srednje vrednosti.
Slika 11: Tretman miševa divljeg tipa sa rAAV2/8.Rho.mR9ap nije pokazao očigledan efekat na 6 Hz ERG krivu intenzitet-odgovor.
Oči tretirane sa rAAV2/8.Rho.mR9ap nisu pokazale pomeranje krive intenzitet-odgovor od 6 Hz ERG u poređenju sa onim za netretirane kontralateralne oči kod C57BL6 miševa (N = 5). Podaci su predstavljeni kao prosečna ± standardna greška srednje vrednosti.
Slika 12: Nema povećanja vizuelne percepcije nakon prekomerne ekspresije R9AP kod C57BL6 miševa.
Kod miševa C57BL6 tretiranih sa rAAV2/8.Rho.mR9ap samo u levom oku, funkcija kontrastne osetljivosti (CSF) je različito merena za glavu u smeru kazaljke na satu (što predstavlja tretirano levo oko) i suprotno od kazaljke na satu (predstavlja netretirano desno oko) glavu praćenje kretanja do rotirajućih sinusoidnih rešetki. CSF za tretirane oči (ružičasta kriva) i netretirane oči (svetloplava kriva) pokazao je slične rezultate, koji su bili slični onima za netaknute C57BL6 miševe (zelena kriva; prosek oba oka). N= 5 za sve grupe. Svi podaci su predstavljeni kao prosečna ± standardna greška srednje vrednosti. OE: prekomerna ekspresija.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0019] Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu čija ekspresija da proizvede genski proizvod, uobičajeno protein, koji je uticati na lečenje očnog stanja kao što je ovde opisano, operativno je povezana sa promotorom da bi se obrazovala ekspresiona kaseta, je opisana.
Nukleinske kiseline i genski proizvodi
[0020] Vektor za upotrebu u pronalasku sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira genski proizvod koji je osetljiv na svetlost i/ili koji modulira endogenu signalizaciju koja je osetljiva na svetlost u fotoreceptorskoj ćeliji i čini štapić transdukovanom sa nukleinskom kiselinom da se ponaša više nalik kupastoj ćeliji proširenjem opsega svetlosnih intenziteta na koje fotoreceptor štapićaste ćelije reaguje je i/ili povećava brzinu na kojoj fotoreceptor štapićaste ćelije reaguje na svetlost. Prema tome, protein može sam po sebi biti direktno osetljiv na svetlost, npr. može izmeniti provodljivost membrane u štapićima na način koji dovodi do hiperpolarizacije (spoljni protok struje) na stimulaciju svetlosti. Takvi proteini će na primer biti osetljivi na svetlost ili “light gated” G-kuplovani membranski proteini, jonski kanali, jonske pumpe ili jonski transporteri. Proteini osetljivi na svetlost su odabrani od ArchT, Jaws (cruxhalorhodopsin) (Chuong et al, 2014), iC1C2, i R9AP (takođe poznat pod imenom RGS9BP). Genski proizvodi za upotrebu u pronalasku su ArchT, Jaws (cruxhalorhodopsin), iC1C2, i R9AP. Ovde takođe prikazana, nukleinska kiselina može kodirati bilo koji drugi genski proizvod koji povećava brzinu endogenog mehanizma signalizacije štapića. U svakom od ovih slučajeva, sekvenca može kodirati protein divljeg tipa ili mutant ili varijantu ili skraćenu verziju koja zadržava aktivnost proteina divljeg tipa. Nukleinska kiselina može takođe biti optimizovana kodonom za ekspresiju u ciljnom ćelijskom tipu. Vektor za upotrebu u pronalasku je adeno-povezani virusni (AAV) vektor, pri čemu je kapsid AAV vektora AAV8 kapsid. Nukleinska kiselina za upotrebu u pronalasku je eksprimirana pod kontrolom promotora specifičnog za štapiće.
[0021] Nakon ekspresije genskog proizvoda, štapići će ispoljiti snažniju i/ili bržu modulaciju na svetlosne stimuluse u odnosu na netransdukovane štapiće, i više od uobičajenih intenziteta. Primeri uključuju unapređenu jačinu modulacije i/ili brže kinetike aktivacije/inaktivacije. Štapići koji su transdukovani u skladu sa pronalaskom će prema tome reagovati snažnije i/ili brzo do osvetljenja u mezopskom i/ili fotopskom opsegu u odnosu netransdukovane šapićaste ćelije. Poželjno, odgovor štapića na uslove skotopskog osvetljavanja nije pogođen ili nije suštinski pogođen, tj. štapići dobijaju sposobnost da odgovore snažno i/ili brzo do jačeg svetla bez gubljenja sposobnosti da odgovore na prigušenu svetlost.
Promotori i drugi regulatorni elementi
[0022] U konstruktu za ekspresiju, nukleinska kiselina koja kodira genski proizvod je obično operativno povezana sa promotorom. Promotor može biti konstitutivni ali je poželjno specifičan za fotoreceptor ili je poželjan promotor fotoreceptora, poželjnije specifičan za štapić ili promotor koji je poželjan za štapić kao što je rodopsin (Rho), Neuron specifični za mrežnjaču leucinski zatvarač protein (NRL) ili promotor fosfodiesteraza 6B (PDE6B). Promotorski region uključen u ekspresionu kasetu može biti bilo koje dužine sve dok je efikasan da pokreće ekspresiju genskog proizvoda, poželjno specifičnu za fotoreceptor ili ekspresiju poželjnu za fotoreceptor ili specifičnu za štapić ili ekspresiju poželjnu za štapić.
[0023] Pod promotorom koji je specifičan za fotoreceptor, je označen promotor koji samo pokreće ekpresiju ili u suštini samo u fotoreceptorima, npr. onu koja pokreće ekspresiju bar sto puta snažnije u fotoreceptorima u odnosu na bilo koji drugi ćelijski tip. Pod promotor koji je specifičan za štapiće, označen je promotor koji pokreće samo ekspresiju ili u suštini samo u fotoreceptorima, npr. onu koja pokreće ekspresiju bar sto puta snažnije u fotoreceptorima u odnosu na bilo koji drugi ćelijski tip, uključujući čepiće. Pod promotor koji je poželjan za fotoreceptor, je označen promotor koji je eksprimiran preferencijalno u fotoreceptorima ali može takođe pokrenuti ekspresiju u određenom obimu u drugim tkivima, npr. onaj koji pokreće ekspresiju najmanje dva puta, najmanje pet puta, najmanje deset puta, najmanje 20-puta, ili najmanje 50-puta snažnije u fotoreceptorima nego u bilo kom drugom ćelijskom tipu. Pod promotorom koji je poželjan kod štapića, je označen promotor koji pokreće ekspresiju preferencijalno u fotoreceptorima ali takođe može pokrenuti ekspresiju u određenom obimu u drugim tkivima, npr. onaj koji pokreće ekspresiju najmanje dva puta, najmanje pet puta, najmanje deset puta, najmanje 20-puta, ili najmanje 50-puta snažnije u fotoreceptorima u odnosu na bilo koji drugi ćelijski tip, uključujući čepiće.
[0024] Jedan ili više drugih regulatornih elemenata, kao što su pojačivači, mogu takođe biti prisutni kao i promotor.
Vektori
[0025] Vektor iz ovog izlaganja može biti bilo kojeg tipa, na primer može biti plazmidni vektor ili minicirkularna DNK.
[0026] Takođe su izloženi virusni vektori. Virusni vektor se može na primer zasnivati na herpes simpleks virusu, adenovirusu ili lentivirusu. Virusni vektor može biti adeno povezani virusni (AAV) vektor ili njegov derivat. Derivat virusnog vektora može biti himeri, izmešani ili kapsidom modifikovani derivat.
[0027] Virusni vektor može sadržati genom AAV iz prirodno dobijenog serotipa, izaolata ili klade AAV. Serotip može, na primer biti AAV2, AAV5 ili AAV8.
[0028] Efikasnost genske terapije je, generalno, zavisna od odgovarajuće i efikasne isporuke donirane DNK. Ovaj proces je obično posredovan virusnim vektorima. Adeno-povezani virusi (AAV), član familije parvovirusa, su obično korišćeni u genskoj terapiji. Divlji tip AAV, koji sadrži virusne gene, ubacuje njihov genomski materijal u hromozom 19 ćelije domaćina. Jedolančani DNK genom AAV sadrži dva invertovana terminalna ponovka (ITRs) i dva otvorena okvira čitanja, koji sadrže strukturalne (cap) i gene (rep) za pakovanje.
[0029] Za terapeutske svrhe, samo sekvence koje su potrebne in cis, pored terapijskog gena, su ITRs. Virus AAV je prema tome modifikovan: virusni geni su uklonjeni iz genoma, za proizvodnju rekombinantnih AAV (rAAV). Ovo sadrži samo terapijski gen, dva ITRs. Uklanjanje virusnih gena čini rAAV nesposobnim za aktivnu inserciju njegovog genoma u DNK ćelije domaćina. Umesto toga, rAAV genomi spajaju se preko ITRs, pri čemu se obrazuju cirkularne, epizomalne strukture, ili insert u prethodno postojeće hromozomske prekide. Za virusnu proizvodnju, strukturalni i geni za pakovanje su, sada uklonjeni iz rAAV, dopunjeni su u in trans, u obliku pomoćničkog plazmida. AAV je posebno atraktivni vektor s obzirom da je generalno nepatogeni; većina ljudi je bila inficirana sa ovim virusom tokom života bez štetnih efekata.
[0030] Imunoprivilegovano očno tkivo, rezultat anatomskih barijera i imunomodulatornih faktora, čini oko u velikoj meri izuzetim od neželjenih imunskih odgovora koji mogu biti izazvani u drugim tkivima od strane AAV (Taylor 2009).
[0031] AAV vektori su ograničeni sa relativno malim kapacitetom pakovanja oko 4.8kb i sporim početkom ekspresije nakon transdukcije. Pored ovih manjih nedostataka, AAV je postao najčešće korišćeni virusni vektor za gensku terapiju mrežnjače.
[0032] Većina vektorskih konstrukata su zasnovani na AAV serotipu 2 (AAV2). AAV2 se veže za ciljne ćelije preko proteoglikanskog receptora heparin sulfata. Genom AAV2, kao i svi AAV serotipovi, mogu biti zatvoreni u brojne različite kapsidne proteine. AAV2 može biti upakovan u svoj prirodni AAV2 kapsid (AAV2/2) ili može biti pseudotipizovan sa drugim kapsidom (npr. AAV2 genom u AAV1 kapsidu; AAV2/1, AAV2 genom u AAV5 kapsidu; AAV2/5 i AAV2 genom u AAV8 kapsidu; AAV2/8).
[0033] rAAV transdukuje ćelije putem endocitoze posredovane receptorom specifične za serotip. Glavni faktor koji ima uticaja na kinetike ekspresije rAAV transgena je brzina uklanjanja omotača virusnih čestica unutar endozoma. Ovo, zauzvrat, zavisi od vrste kapsida koji obuhvata genetički materijal (Ibid.). Nakon uklanjanja omotača linearni jednolančani rAAV genom je stabilizovan obrazovanjem dvolančanog molekula pomoću de novo sinteze komplementarnog lanca. Upotreba
1
sopstvene komplementarne DNK može zaobići ovu fazu proizvodnjom dvolančane DNK transgena. Natkunarajah et al (2008) su pronašli da samo-komplementarna ekpresija AAV2/8 gena je bila bržeg početka i veće amplitude, u poređenju sa jednolančanom AAV2/8. Prema tome, zaobilazeći vremensko kašnjenje povezano sa sintezom drugog lanca, nivoi genske ekspresije su povećani, kada se uporede sa ekspresijom transgena iz standardnih jednolančanih konstrukata. Naknadne studije kojima se ispituje efekat samo-komplementarne DNK u drugim AAV pseudotipovima (npr. AAV2/5) proizveli su slične rezultate. Jedno upozorenje za ovu tehniku je da, kako AAV ima kapacitet pakovanja od približno 4.8kb, samokomplementarni rekombinantni genom mora biti odgovarajuće veličine (tj.
2.3kb ili manje).
[0034] Pored modifikovanog kapaciteta pakovanja, pseudotipizacija genoma AAV2 sa drugim kapsidima AAV može izmeniti ćelijsku specifičnost i kinetike ekspresije transgena.
[0035] Prijavljeno je da AAV2/8 efikasnije transdukuje fotoreceptore u odnosu na ili AAV2/2 ili AAV2/5 (Natkunarajah et al.2008).
[0036] Vektor za upotrebu u pronalasku sadrži genom adeno-povezanog virusa (AAV) ili njegov derivat. Vektor za upotrebu u pronalasku je vektor adeno-povezanog virusa (AAV) koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira genski proizvod koji je osetljiv na svetlost i/ili koji modulira endogenu signalizaciju osetljivu na svetlost u fotoreceptorskoj ćeliji, za upotrebu u metodi poboljšanja vida kod pacijenta sa disfunkcijom fotoreceptora čepića i/ili degeneracijom uvođenjem navedene nukleinske kiseline u zdrave fotoreceptore štapića u mrežnjači pacijenta i ekspresijom pomenutog genskog proizvoda u njima, tako da opseg intenziteta svetlosti do kojeg fotoreceptor štapićaste ćelije može reaguje se produžava i/ili se povećava brzina kojom fotoreceptor štapića reaguje na svetlost, pri čemu:
genski proizvod je ArchT, Jaws (cruxhalorodopsin), iC1C2 ili R9AP; kapsid AAV vektora je kapsid AAV8; a nukleinska kiselina se eksprimira pod kontrolom promotora specifičnog za štapić.
[0037] AAV genom je polinukleotidna sekvenca koja kodira funkcije potrebne za proizvodnju AAV virusne čestice. Ove funkcije uključuju one koje rade u ciklusu replikacije i pakovanja za AAV u ćeliji domaćinu, uključujući inkapsulaciju AAV genoma u AAV virusnu česticu. Prirodni AAV virusi su deficijentni za replikaciju i oslanjaju se na obezbeđivanje pomoćnih funkcija in trans za završetak ciklusa replikacije i pakovanja. Shodno tome i sa dodatnim uklanjanjem AAV rep i cap gena, AAV genom vektora za upotrebu u pronalasku je deficijentan za replikaciju.
[0038] AAV genom može biti u jednolančanom obliku, bilo pozitivnom ili negativnom smislu, ili alternativno u dvolančanom obliku. Upotreba dvolančanog oblika omogućava zaobilaženje koraka replikacije DNK u ciljnoj ćeliji i tako može ubrzati ekspresiju transgena.
[0039] AAV genom može biti iz bilo kog prirodno dobijenog serotipa ili izolata ili klade AAV. Kao što je stručnjaku poznato, AAV virusi koji se javljaju u prirodi mogu se klasifikovati prema različitim biološkim sistemima.
[0040] Uobičajeno, AAV virusi se nazivaju u smislu njihovog serotipa. Serotip odgovara varijantama podvrsta AAV koji zbog svog profila ekspresije kapsidnih površinskih antigena ima distinktivnu reaktivnost čime se može razlikovati od drugih varijantnih podvrsta. Obično, virus koji ima određeni serotip AAV ne reaguje efikasno unakrsno sa neutralizujućim antitelima koja su specifična za bilo koji drugi serotip AAV. Serotipovi AAV uključuju AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 i AAV11, takođe rekombinantne serotipove, kao što su Rec2 i Rec3, nedavno identifikovani iz mozga primata. Genom vektora za upotrebu u pronalasku može se dobiti iz bilo kojeg serotipa AAV. Kapsid vektora za upotrebu u pronalasku je serotipa AAV8. Genom i kapsid se mogu dobiti iz istog serotipa ili iz različitih serotipova.
[0041] Poželjno je da genom vektora za upotrebu u pronalasku je dobijen iz AAV serotipa 2 (AAV2), AAV serotipa 4 (AAV4), AAV serotipa 5 (AAV5) ili AAV serotipa 8 (AAV8). Najpoželjnije je da je genom dobijen iz AAV2 ali drugi serotipovi određenog interesa uključuju AAV4, AAV5 i AAV8, koji efikasno transdukuju tkivo u oku, kao što je pigmentni epitel mrežnjače. Opisani su kapsidi koji su dobijeni iz AAV5 ili AAV8, naročito AAV8. Kapsid vektora za upotrebu u pronalasku je serotipa AAV8.
[0042] Pregledi AAV serotipova mogu se naći u Choi et al (Curr Gene Ther.2005; 5(3); 299-310) i Wu et al (Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327). Sekvence genoma AAV ili elementi AAV genoma uključujući sekvence ITR, rep ili cap geni mogu se dobiti iz sledećih pristupnih brojeva sekvenci punog genoma AAV: Adeno-povezani virus 1 NC_002077, AF063497; Adeno-povezani virus 2 NC_001401; Adeno-povezani virus 3 NC_001729; Adeno-povezani virus 3B NC_001863; Adeno-povezani virus 4 NC_001829; Adeno-povezani virus 5 Y18065, AF085716; Adeno-povezani virus 6 NC_001862; Ptičji AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; Ptičji AAV soj DA-1 NC_006263, AY629583; Goveđi AAV NC_005889, AY388617.
[0043] AAV virusi se takođe mogu nazivati kladama ili klonovima. Ovo se odnosi na filogenetski odnos prirodno dobijenih virusa AAV, i uobičajno na filigenetisku grupu AAV virusa koja se može pratiti nazad do zajedničkog pretka, i uključuje sve njegove potomke. Dodatno, AAV virusi se mogu nazivati specifičnim izolatom, tj. genetički izolat specifičnog AAV virusa koji se nalazi u prirodi. Izraz genetički izolat opisuje populaciju virusa AAV koji je prošao ograničeno gensko mešanje sa drugim prirodnim AAV virusima, čime je definisana prepoznatljiva različita populacija na genetičkom nivou.
[0044] Primeri klada i izolata AAV uključuju:
Klada A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu.48 AY530611, Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609
Klada B: Hu.19 AY530584, Hu.20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24 AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377,
Klada C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623
Klada D: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013
Klada E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556
Klada F: Hu14 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, Klonalni Izolat AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003/
[0045] Stručnjak iz oblasti tehnike može odabrati odgovarajući serotip, kladu, klon ili izolat AAV na osnovu njihovog zajedničkog opšteg znanja. Treba razumeti međutim, da pronalazak takođe obuhvata upotrebu genoma AAV drugih serotipova koji još uvek nisu identifikovani ili karakterisani. AAV serotip određuje specifičnost tkiva za infekciju (ili tropizam) AAV virusa. Prema tome, poželjni AAV serotipovi za upotrebu u AAV virusima koji su davani pacijentima u skladu sa ovim pronalaskom su oni koji imaju prirodni tropizam za ili visoku efikasnost transfekcije fotoreceptora štapića. Vekor za upotrebu u pronalasku je AAV vektor pri čemu je kapsid AAV vektora kapsid AAV8.
[0046] Uobičajeno, genom AAV prirodno dobijenog serotipa ili izolata ili klade AAV sadrži bar jednu sekvencu terminalnog invertovanog ponovka (ITR). Vektori za upotrebu u pronalasku obično sadrže dve ITR, poželjno jednu na svakom kraju genoma. ITR sekvenca deluje cis da se obezbedi funkcionalni početak replikacije, i omogućava integraciju i isecanje vektora iz genoma ćelije. Poželjne sekvence ITR su one od AAV2 i njihove varijante. Genom AAV obično sadrži gene za pakovanje, kao što su rep i/ili cap geni koji kodiraju funkcije pakovanja za AAV virusnu česticu. Gen rep kodira jedan ili više od proteina Rep78, Rep68, Rep52 i Rep40 ili njihove varijante. Gen cap kodira jedan ili više kapsidnih proteina kao što su VP1, VP2 i VP3 ili njihove varijante. Ovi proteini čine kaspid AAV virusne čestice. Varijante kapsida su razmatrane u tekstu ispod.
[0047] Poželjno genom AAV će biti derivatizovan za svrhu davanja pacijentima. Takva derivatizacija je standard u oblasti tehnike i predmetni pronalazak podrazumeva upotrebu bilo kojeg poznatog derivata genoma AAV, i derivata koji se mogu generisati primenjivanjem postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Derivatizacija genoma AAV i kapsida AAV su date u pregledu u, na primer, Choi et al i Wu et al, kao što je gore navedeno.
[0048] Derivati genoma AAV uključuju bilo koje prekinute ili modifikovane oblike genoma AAV koji dozvoljava ekspresiju Rep-1 transgena sa vektora in vivo. Uobičajeno, moguće je značajno skratiti AAV genom da bi se uključila minimalna virusna sekvenca, a da bi se zadržala gore navedena funkcija. Ovo je poželjno iz bezbednosnih razloga da bi se smanjio rizik od rekombinacije vektora sa virusom divljeg tipa, kao i da bi se izbeglo pokretanje ćelijskog imunog odgovora prisustvom proteina virusnog gena u ciljnoj ćeliji.
[0049] Uobičajeno, derivat će uključivati najmanje jednu invertovanu terminalnu ponavljajuću sekvencu (ITR), poželjno više od jednog ITR-ova, kao što su dva ITR ili više. Jedan ili više ITR može biti izvedeno iz AAV genoma koji imaju različite serotipove, ili mogu biti himerni ili mutantni ITR. Poželjni mutantni ITR je onaj koji ima deleciju trs (eng. terminal resolution site). Ova delecija omogućava kontinuiranu replikaciju genoma da bi se stvorio jednolančani genom koji sadrži i kodirajuće i komplementarne sekvence, tj. samokomplementarni genom AAV. Ovo omogućava zaobilaženje replikacije DNK u ciljnoj ćeliji i tako omogućava ubrzanu ekspresiju transgena.
[0050] U vektorima za upotrebu u pronalasku, jedan ili više ITR-ova će poželjno biti bočno sa ekspresione konstruktne kasete koja sadrži promotor i transgen. Uključivanje jednog ili više ITR-ova je poželjno da bi se pomoglo pakovanje vektora pronalaska u virusne čestice. U poželjnim izvođenjima, ITR elementi će biti jedine sekvence zadržane iz nativnog AAV genoma u derivatu. Prema tome, derivat poželjno neće uključivati rep i/ili cap gene prirodnog genoma i bilo koje druge sekvence prirodnog
1
genoma. Ovo je poželjno iz gore opisanih razloga, kao i da bi se smanjila mogućnost integracije vektora u genom ćelije domaćina. Pored toga, smanjenje veličine AAV genoma omogućava povećanu fleksibilnost u inkorporiranju drugih elemenata sekvence (kao što su regulatorni elementi) unutar vektora pored transgena.
[0051] Što se tiče genoma AAV2, sledeći delovi bi se stoga mogli ukloniti u derivatu: jedna sekvenca invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR), geni za replikaciju (rep) i kapsid (cap). Međutim, u nekim izvođenjima, uključujući in vitro izvođenja, derivati mogu dodatno uključiti jedan ili više rep i/ili cap gena ili druge virusne sekvence AAV genoma.
[0052] Derivat može biti himerni, pomešani ili derivat sa modifikovanim kapsidom jednog ili više virusa AAV koji se pojavljuju u prirodi. Ovde su prikazane proteinske sekvence kapsida iz različitih serotipova, klada, klonova, ili izolata AAV unutar istog vektora. Opisano je pakovanje genoma jednog serotipa u kapsid drugog serotipa tj., pseudotipizacija. Pronalazak obuhvata pakovanje genoma jednog serotipa u kapsid serotipa AAV8.
[0053] Himerni, pomešani ili derivati sa modifikovanim kapsidom biće obično selektovani da obezbede jednu ili više željenih funkcionalnosti za virusni vektor. Stoga, ovi derivati mogu pokazati povećanu efikasnost isporuke gena, smanjenu imunogenost (humoralnu ili ćelijsku), izmenjeni raspon tropizma i/ili poboljšano ciljanje određenog tipa ćelije u poređenju sa AAV virusnim vektorom koji sadrži prirodni AAV genom, kao što je AAV2. Na povećanu efikasnost isporuke gena može uticati poboljšano vezivanje receptora ili ko-receptora na površini ćelije, poboljšana internalizacija, poboljšani promet unutar ćelije i u jezgro, poboljšano uklanjanje omotača virusne čestice i poboljšana konverzija jednolančanog genoma u dvolančani oblik. Povećana efikasnost se takođe može odnositi na izmenjeni opseg tropizma ili ciljanje specifične ćelijske populacije, tako da se vektorska doza ne razblaži davanjem u tkiva gde nije potrebna.
[0054] Himerni kapsidni proteini obuhvataju one koji su generisani rekombinacijom između dve ili više sekvenci koje kodiraju kapsid AAV serotipova koji se nalaze u prirodi. Ovo se može izvesti, na primer, pristupom spasavanja markera u kome se neinfektivne kapsidne sekvence jednog serotipa kotransfektuju sa kapsidnim sekvencama drugog serotipa, a usmerena selekcija se koristi za selekciju kapsidnih sekvenci koje imaju željena svojstva. Kapsidne sekvence različitih serotipova mogu se promeniti homolognom rekombinacijom unutar ćelije da bi se proizveli novi himerni kapsidni proteini. Himerni kapsidni proteini takođe uključuju one generisane inženjeringom sekvenci kapsidnih proteina za prenos specifičnih kapsidnih proteinskih domena, površinskih petlji ili specifičnih aminokiselinskih ostataka između dva ili više kapsidnih proteina, na primer između dva ili više kapsidnih proteina različitih serotipova.
[0055] Promešani ili himerni kapsidni proteini se takođe mogu generisati mešanjem DNK ili PCR-om sklonim greškama. Hibridni AAV kapsidni geni se mogu stvoriti nasumično fragmentacijom sekvenci srodnih AAV gena, npr. oni koji kodiraju kapsidne proteine više različitih serotipova i zatim ponovo sastavljaju fragmente u “self-priming” reakciji polimeraze, što takođe može izazvati ukrštanja u regionima homologije sekvence. Biblioteka hibridnih AAV gena stvorena na ovaj način mešanjem kapsidnih gena nekoliko serotipova može se pregledati da bi se identifikovali virusni klonovi koji imaju željenu funkcionalnost. Slično, PCR sklon greškama se može koristiti za nasumično mutiranje AAV kapsidnih gena da bi se stvorila raznovrsna biblioteka varijanti koje se zatim mogu odabrati za željeno svojstvo.
[0056] Sekvence kapsidnih gena takođe mogu biti genetički modifikovane da uvedu specifične delecije, supstitucije ili insercije u odnosu na nativnu sekvencu divljeg tipa. Konkretno, kapsidni geni mogu biti modifikovani insercijom sekvence nepovezanog proteina ili peptida unutar otvorenog okvira čitanja sekvence koja kodira kapsid, ili na N-i/ili C-terminusu sekvence koja kodira kapsid.
[0057] Nepovezani protein ili peptid može povoljno biti onaj koji deluje kao ligand za određeni tip ćelije, čime se postiže poboljšano vezivanje za ciljnu ćeliju ili poboljšava specifičnost ciljanja vektora na određenu ćelijsku populaciju.
[0058] Nesrodni protein može takođe biti onaj koji pomaže prečišćavanju virusne čestice kao deo proizvodnog procesa, tj. epitopa ili afinitetne oznake. Mesto insercije će obično biti odabrano tako da ne ometa druge funkcije virusne čestice, npr. internalizaciju, trafiking virusnim česticama. Stručnjak iz oblasti tehnike može identifikovati pogodna mesta za inserciju na osnovu svog opšteg poznatog znanja. Određena mesta su otkrivena u Choi et al, kao što je gore navedeno.
[0059] Pronalazak dodatno obuhvata obezbeđivanje sekvenci AAV genoma u različitom redosledu i konfiguraciji u odnosu na nativni AAV genom. Pronalazak takođe obuhvata zamenu jedne ili više AAV sekvenci ili gena sa sekvencama drugog virusa ili sa himernim genima sastavljenim od sekvenci iz više od jednog virusa. Takvi himerni geni mogu biti sastavljeni od sekvenci iz dva ili više srodnih virusnih proteina različitih virusnih vrsta.
[0060] Vektor za upotrebu u pronalasku je vektor adeno-povezanog virusa (AAV) koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira genski proizvod koji je osetljiv na svetlost i/ili koji modulira endogenu signalizaciju osetljivu na svetlost u fotoreceptorskoj ćeliji, za upotrebu u postupku poboljšanja vida kod pacijenta sa disfunkcijom fotoreceptora čepića i/ili degeneracijom uvođenjem navedene nukleinske kiseline u zdrave fotoreceptore štapiće u mrežnjači pacijenta i ekspresijom pomenutog genskog proizvoda u njima, tako da opseg intenziteta svetlosti do kojeg fotoreceptor štapića može reaguje se produžava i/ili se povećava brzina kojom fotoreceptor štapića reaguje na svetlost, pri čemu:
genski proizvod je ArchT, Jaws (cruxhalorodopsin), iC1C2 ili R9AP; kapsid AAV vektora je kapsid AAV8;
a nukleinska kiselina se eksprimira pod kontrolom promotora specifičnog za štapić
[0061] Takođe je izložena AAV virusna čestica koja sadrži ovde opisani vektor. Čestice AAV uključuju transkapsidovane oblike u kojima genom AAV ili derivart ima ITR jednog serotipa je upakovan u različit serotip. Čestice AAV takođe uključuju mozaične oblike pri čemu je smeša nemodifikovanih kapsidnih proteina iz dva ili više različitih serotipa čini virusni omotač. Čestica AAV takođe uključuje hemijski modifikovane oblike koji nose ligande apsorbovane na površini kapsida. Na primer, takvi ligandi mogu uključiti antitela za ciljanje određenog receptora ćelijske površine.
[0062] Takođe je prikazana ćelija domaćina koja obuhvata prikazani vektor ili AAV virusnu česticu.
[0063] Vektori za upotrebu u pronalasku mogu se dobiti korišćenjem standardnih načina koji su poznati u oblasti tehnike za obezbeđivanje vektora za gensku terapiju. Prema tome, dobro upostavljena transfekcija javnog domena, pakovanje i postupci za prečišćavanje mogu se koristiti za dobijanje odgovarajućeg vektorskog preparata.
[0064] Kao što je gore razmatrano, vektor za upotrebu u pronalasku može sadržati pun genom AAV virusa koji se nalazi u prirodi pored pomotera ili njegove varijante, kao što je ovde prikazano. Međutim, obično će se koristiti derivatizovani genom, na primer derivat koji ima najmanje jednu invertovanu terminalnu ponavljajuću sekvencu (ITR), ali kome mogu nedostajati bilo koji AAV geni kao što su rep ili cap.
1
[0065] U takvim izvođenjima, da bi se omogućilo sklapanje derivatizovanog genoma u AAV virusnu česticu, dodatni genetički konstukti koji obezbeđuju AAV i/ili funkcije pomoćničkog virusa će biti obezbeđene u ćeliji domaćina u kombinaciji sa derivatizovanim genomom. Ovi dodatni konstrukti će obično sadržati gene koji kodiraju strukturalne AAV kapsidne proteine tj. cap, VP1, VP2, VP3, i gene koji kodiraju druge funkcije koje su potrebne za životni ciklus AAV, kao što je rep. Odabir strukturalnih kapsidnih proteina koji su obezbeđeni na dodatnom konstruktu će odrediti serotip upakovanog virusnog vektora.
[0066] Posebno poželjni upakovani virusni vektor za upotrebu u pronalasku sadrži derivatizovani genom AAV2 u kombinaciji sa AAV8 kapsidnim proteinima.
[0067] Kao što je gore pomenuto, AAV virusi su inkompetentni za replikaciju i tako funkcioniše pomoćni virus, poželjno pomoćne funkcije adenovirusa će obično biti obezbeđene na jednom ili više dodatni konstrukata da se omogući replikacija AAV.
[0068] Svaki od gore navedenih dodatnih konstrukata može biti obezbeđen kao plazmidi ili drugi epizomalni elementi u ćeliji domaćina, ili alternativno jedan ili više konstrukata može biti integrisan u genom ćelije domaćina.
Farmaceutske kompozicije, doze i tretmani
[0069] Vektor za upotrebu u pronalasku može biti formulisan u farmaceutske kompozicije. Ove kompozicije mogu da sadrže, pored vektora, farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale dobro poznate stručnjacima. Takvi materijali treba da budu netoksični i ne bi trebalo da ometaju efikasnost aktivnog sastojka. Precizna priroda nosača ili drugog materijala može odrediti stručnjak u skladu sa načinom primene, tj. ovde direktnom retinalnom, subretinalnom ili intravitrealnom injekcijom.
[0070] Farmaceutski sastav je tipično u tečnom obliku. Tečne farmaceutske kompozicije generalno uključuju tečni nosač kao što je voda, nafta, životinjska ili biljna ulja, mineralno ulje ili sintetičko ulje. Može se uključiti fiziološki rastvor soli, magnezijum hlorid, dekstroza ili drugi rastvor saharida ili glikoli kao što su etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol. U nekim slučajevima može se koristiti surfaktant, kao što je pluronska kiselina (PF68) 0,001%.
[0071] Za injekciju na mestu bolesti, aktivni sastojak će biti u obliku vodenog rastvora koji je bez pirogena i ima odgovarajući pH, izotoničnost i stabilnost. Oni sa relevantnim veštinama u ovoj oblasti su u stanju da pripreme pogodna rastvora koristeći, na primer, izotonična sredstva kao što su injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, laktatna Ringerova injekcija, Hartmanov rastvor. Po potrebi mogu biti uključeni konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidansi i/ili drugi aditivi.
[0072] Za odloženo oslobađanje, vektor može biti uključen u farmaceutsku kompoziciju koja je formulisana za sporo oslobađanje, kao što je u mikrokapsulama formiranim od biokompatibilnih polimera ili u lipozomalnim sistemima nosača prema metodama poznatim u tehnici. Vektori za upotrebu u pronalasku mogu biti upakovani u komplet.
[0073] Generalno, poželjna je direktna retinalna, subretinalna ili intravitrealna isporuka prikazanih vektora, obično injekcijom. Stoga je poželjna isporuka u retinalni, subretinalni ili intravitrealni prostor. Vektori se takođe mogu uvesti u štapićaste fotoreceptorske ćelije in vitro nakon čega sledi transplantacija ćelija u mrežnjaču
[0074] Vektori za upotrebu u pronalasku takođe mogu da se koriste u kombinaciji sa bilo kojom drugom terapijom za lečenje ili prevenciju poremećaja vida. Na primer, oni se mogu koristiti u
1
kombinaciji sa poznatim tretmanima koji koriste VEGF antagoniste, npr. anti-VEGF antitela kao što su Bevacizumab ili Ranibizumab ili rastvorljivi antagonisti receptora kao što je Aflibercept, za lečenje AMD-a ili drugih očnih poremećaja kako je ovde diskutovano.
[0075] Doze i dozni režimi mogu se odrediti u okviru normalne prakse lekara koji je odgovoran za primenu kompozicije. Doza vektora za upotrebu u pronalasku može se odrediti prema različitim parametrima, naročito prema starosti, težini i stanju pacijenta kome je lečenje namenjeno; načina primene; i željenog režima. Ponovo, lekar će biti sposoban da odredi željeni način davanja i dozu za bilo kojeg određenog pacijenta.
[0076] Uobičajena pojedinačna doza je 10<10>i 10<12>čestica genoma, u zavisnosti od količine tkiva mrežnjače koje zahteva transdukciju. Čestica genoma je ovde definisana kao AAV kapsid koji sadrži jednolanačani molekul DNK koji se može kvantifikovati sa postupkom koji je specifičan za sekvencu (kao što je PCR u realnom vremenu). Takva doza može biti obezbeđena kao pojedinačna doza, ali može biti ponovljena za drugo oko ili u slučajevima u kojima vektor nije ciljao određeni region mrežnjače iz bilo kojeg razloga (kao što su hirurške komplikacije). Tretman je poželjno jedan trajni tretman za svako oko, ali ponovljene injekcije, na primer u budućim godinama i/ili sa različiti serotipovi AAV se mogu uzeti u razmatranje.
Tretmani
[0077] Vektori za upotrebu u pronalasku mogu se koristiti za lečenje bilo kojeg očnog stanja u kojem postoji disfunkcija, degeneracija ili odsustvo čepića, ali ostaju barem neki zdravi štapići. Funkcija čepića može u potpunosti ili delimično da nedostaje, npr. najmanje 10%, najmanje 25%, najmanje, najmanje 50%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 90% ili više nedostaje. Zdravi štapići su štapići koji su sposobni da obavljaju normalne ili delimične, npr. najmanje 10%, najmanje 25%, najmanje, najmanje 50%, najmanje 75% ili najmanje 90% normalne funkcije štapićaste ćelije u smislu percepcije svetlosti na skotopskim nivoima.
[0078] Vektori za upotrebu pronalaska mogu se koristiti u postupku za lečenje stanja uključujući makularnu degeneraciju, ahromatopsiju i Leberovu kongenitalnu amaurozu. Makularna degeneracija može biti degeneracija makule povezana sa uzrastom (AMD), na primer vlažna ili neovaskularna AMD ili geografska atrofija, nasledno stanje makularne degeneracije ili nasledna distrofija čepića. U nekim izvođenjima, pronalazak će rezultirati stvaranjem 'pseudo-fovee', malog dela štapića sličnih čepićima koji poboljšavaju vid u uslovima u kojima su fovealne kupaste ćelije izgubljene ili su disfunkcionalne.
[0079] Uopšteno, pacijenti koji će se tretirati sa vektorima će biti humani pacijenti. Mogu biti muškarci ili žene bilo kog starosnog doba.
[0080] Primeri koji slede ilustruju pronalazak.
PRIMERI
Primer 1 – Postupci za ArchT eksperimente.
Životinje
[0081] Miševi divljeg tipa (C57BL/6J) su kupljeni od Harlan Laboratories (Blackthorn, UK). CNGA3-/-i PDE6C-/-miševi su uzgajani interno. Svi miševi su održavani u cikličnim svetlosnim uslovima (12 h svetlo-mrak); osvetljavanje kaveza je bilo intenziteta 7 foot-candles tokom svetlosnog ciklusa. Svi eksperimenti su odobreni od strane lokalnih institucionalnih odbora za negu i upotrebu životinja (UCL, London, UK) i u skladu sa smernicama o nezi i upotrebi životinja koje su usvojene od strane Društva za neuronauku i Udruženja za istraživanje vida i Oftamologije (Rockville, MD).
1
Plazmidni konstruktu, proizvodnja virusa i postupak ubrizgavanja
[0082] Transgeni konstrukt (ArchT-EGFP) je ljubazno obezbeđen od strane Prof Ed Boyden (MIT, USA) i sadrži sekvencu cDNK gena koji kodira ArchT spojenu sa fluorescentnim proteinom EGFP. Plazmidi su pakovani u AAV8 da bi se dobili rekombinantni AAV virusni vektori, AAV8.hRho.ArchT-EGFP. Rekombinantni AAV8 vektor je proizveden upotrebom postupka trostruke prolazne transfekcije kao što je opisano prethodno. Plazmidni konstrukt, AAV plazmid za pakovanje specifičan za serotip i pomoćni plazmid su pomešani sa polietileniminom (Polysciences Inc.) da se obrazuju kompleksi za transfekciju, koji su nakon toga dodati na 293T ćelije i ostavljeni su u trajanju od 72h. Ćelije su sakupljene, koncentrovane i lizirane da bi se oslobodio vektor. AAV8 je prečišćen upotrebom AVB Sepharose kolona (GE Healthcare). Oba su isprana u 1X PBS i koncentrovana su do zapremine od 100-150 µL. Titri virusnih čestica su određeni komparativnim dot-blot DNK koji je pripremljen iz prečišćenih virusnih štokova i definisanih plazmidnih kontrola. Koncentracije prečišćenog vektora koje su korišćenje za sve eksperimente su bile 5 X 10<12>virusnih čestica/ml. Subretinalne injekcije su izvedene kao što je prethodno opisano od strane naše grupe i sastoje se iz duplih injekcija svaka od 2ul.
Imunohistohemija
[0083] Životinje su eutanazirane, očne jabučice su enukleisane i rožnjača, sočiva iris uklonjeni. Za preseke mrežnjače, očne čašice su fiksirane u 4% paraformaldehidu (PFA) u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi, pre nego što se ugrade u medijum sa optimalnom temeraturom sečenja (OCT). Kriopreseci debiljne 30µm su isečeni u sagitalnoj orijentaciji, isprani sa PBS i blokirani u 10% normalnom kozjem serumu (NGS), 3% albumin seruma govečeta (BSA) i 0.1% Triton-X100. Dobijeni uzorci su inkubirani sa primarnim antitelima u rastvoru za blokiranje na 4°C preko noći upotrebom zečjeg anti-čepić arestina (razblaženje 1:500). Nakon ispiranja sa PBS, odgovarajuća kombinacija sekundarnih antitela (svako u razblaženju 1:500, life technologies) uključujući kozje anti zečje Alexa Fluor 546 (#A11035), kozje anti mišje Alexa Fluor 633 (#A21052) i streptavidin, Alexa Fluor 633 konjugat (#S21375) su korišćeni za obeležavanje uzoraka pre nego što su bili suprotno obojeni sa DAPI i montirani sa DAKO fluorescentnim medijumom za montiranje (DAKO, S3023, Denmark). Slike su dobijene konfokalnom mikroskopijom (Leica DM5500Q).
Snimci usisavanja pojedinačnog fotoreceptora
[0084] Životinje su bile prilagođene na tamu u trajanju od 12h pre početka eksperimenata. Miševima je davana prekomerna doza smeše ketamin-dormitor anestetika u intraperitonealnu šupljinu, da bi se izazvala terminalna hirurška anestezija. Miševi su nakon toga žrtvovani cervikalnom dislokacijom i enukleisani. Oči su secirane pod prigušenom, daleko crvenom osvetljenju. Izolovane mrežnjače su bile ugrađene u 1% rastvor agaroze sa niskom tačkom topljenja i nakon toga su isečene korišćenjem vibrotoma (leica) u prednje preseke debljine 230um. Preseci su montirani u komoru za snimanje i perfuzionisani su karbogenom (95% O25% CO2) zasićenim Ames medijumom koji sadrži 100µm 9-cis retinala (Sigma) i 0.2% BSA (Sigma). Temperatura rastvora za perfuziju je održavana na 37°C korišćenjem linijskog grejnog elementa pod kontrolom povratne sprege (Scientifica). “Patch” pipete sa veoma niskim otporom (1-2MΩ ) su napravljene od kapilara filamentisanog borosilikatnog stakla (Harvard Apparatus Ltd) upotrebom Narishige PC-10 vertikalnog izvlakača. Pipete su napunjene sa eksternim rastvorom, montirane na “headstage” i primenjen je mali pritisak kroz vrh (~30mbar). Korišćenjem infracrvenog osvetljenja i mikroskopa da bi se pomogla vizuelizacija pipeta je postavljena na površinu mrežnjače, i zatim je spuštena ~50um u preseku, sve dok se segmenti fotoreceptora nisu pojavili inaktni i uredno složeni. Blagi negativni pritisak je primenjen kroz vrh pipete kako je polako napredovalo kroz tkivo mrežnjače, upotrebom 100ms, 10mV test pulsa da bi se pratio otpor kroz vrh pipete. Kada se otpor povećao na ~20-30MΩ odgovori pobuđeni svetlosno su ispitivani. Svetlosni
1
stimulus iz LED svetlosnog izvora (maksimum talasne dužine 530nm) spojen sa tečnim svetlosnim vodičem, su isporučeni kroz objektiv mikroskopa (Olympus). Neutralni filteri gustine su korišćeni da bi se precizno kontrolisao intenzitet svetlosnog stimulusa. Svetlosni stimulus koji se sastoje iz kvadratnih talasnih pulseva programiranih korišćenjem P-Clamp softvera (Molecular Devices), i isporučenih pomoću a DAC table (Axon Instruments) u konjukciji sa LED upravljačem (Thorlabs). Elektrofiziološka snimanja su izvedena upotrebom Multiclamp 700B amplifikatora (Molecular Devices). Podaci su digitalizovani na 20kHz.
Snimci MEA
[0085] Životinje su bile prilagođene na tamu u trajanju od 12h pre početka eksperimenata. Miševima je davana prekomerna doza smeše ketamin-dormitor anestetika u intraperitonealnu šupljinu, da bi se izazvala terminalna hirurška anestezija. Miševi su nakon toga žrtvovani cervikalnom dislokacijom i enukleisani. Oči su disecirane u karbogenu (95% kiseonik, 5% ugljen dioksid) zasićenom Ames medijumu (Sigma), pod prigušenim crvenim svetlom. Rožnjača i sočiva su uklonjeni, sa pažnjom da se ukloni što više staklastog tela sa površine mrežnjače u meri što je više moguće. RPE je odvojen od mrežnjače i ravna latica u preseku od 1-3 mm isečena je sa ’čaše’ mrežnjače. Navedena latica mrežnjače je postavljena ganglion-ćelijskom stranom nadole na površinu multielektodnog čipa, kružno oštećenje je napravljeno iz nereaktivne žice od platine (Sigma) i najlon je korišćen za držanje lattice u položaju. Kroz snimanja, tkivo je perfuzionisano sa karbogen zasićenim Ames medijumom (Sigma), održavanim na temperaturi od 36.5 stepeni celzijusa. Za snimke koji obuhvataju skotopske ili mezotopske uslove, napravljen je perfuzioni medijum da uključi 9-cis retinal (Sigma), u koncentraciji od 100µM, u 0.2% BSA (Sigma). Perforisani čip za snimanje od 60-elektoda, koji se sastoji iz volframovih elektroda u razmaku od 100 µm (Multi Channel Systems) je korišćen za snimanje vanćelijskih potencijala ćelije ganglioca. Promene u voltaži su umnožene i digitlizovane na 50kHz sa MC Card sistemom, upotrebom MC Rack softvera (MultiChannel Systems).
Analiza elektrofizioloških podataka
[0086] Elektrofiziološki podaci su analizirani korišćenjem prilagođenih makroa u IgorPro 6. Sinaptičke struje i potencijali su detektovani upotrebom algoritma amplitudnog praga u kome je prag za detekciju događaja podešen na 2 puta standardne devijacije od pozadinske buke (obično oko 10pA). Detetovane struje i potencijali su verifikovani manuelno pažljivom inspekcijom svih elektrofizoloških podataka.
Uslovljavanje straha
[0087] Miševi su trenirani i ispitivani upotrebom komercijalno dostupnog sistema za uslovljavanje straha (Med Associates). Da bi se osigurali slepi uslovi, eksperimentator koji sprovodi trening i ispitivanje je uvek bio slep u odnosu na miša i uslove tretmana Ukratko, postavka koja se sastoji iz komore za uslovljavanje (20x30 cm) sa rešetkastim podom od nerđajućeg čelika koja je postavljena unutar kabine za prigušivanje zvuka. Ponašanje miša je praćeno u kontinuitetu tokom treniranja i ispitivanje pomoću ugraćene infracrvene digitalne kamere (30 okvira/s brzina sticanja) i infracrveno osvetljenje. Softver za zamrzavanje videa (Med Associates) je korišćen za kontrolu isporuke svetlosnog stimulusa i šoka. Svetlosni stimulus se sastoji iz pojedinačne LED (530 nm, Thorlabs) 5 Hz 50ms fulltreperenje pune svetlosti koje je generisano pomoću Arduino interfejsa (Arduino Software) pozicioniranog na bočnom panelu komore za uslovljavanje. Da bi se osiguralo da se kontekst u kome se izvode treniranje i ispitivanje razlikuje, pod i zaobljeni paneli zida su insertovani u komoru za sesiju ispitivanja. Pozadinska bela svetlost je korišćena za smanjenje šansi aktivacije štapića i zenice su proširene sa Tropikamid kapima da bi se povećala količina svetlosti koja dopire do mrežnjače miša.
1
[0088] Miševi su postavljeni unutar komore i prošli su kroz jednu seriju kondicioniranja, koja se sastoji iz 6 uparivanja od 5 s, svetlosnog stimulusa koji je zajednički završen sa 2 s, 0.65 mA šokom na stopalu. Interval između ispitivanja je pseudo randomizovan (srednja vrednost intervala 90 s). Nakon sesije treninga miševi su vraćeni u kućni kavez.24 h nakon treninga, miševi su ispitani za vizuelno naglašeno pamćenje. Miševi su postavljeni u komoru za ispitivanje i praćeni su ukupno 360 s. Svetlosni stimulus uslovljavanja je prikazan kontinuirano u poslednjih 120 s sesije ispitivanja. Svi podaci su dobijeni i bodovani automatski od strane VideoFreeze softvera (Med Associates). Ukratko, softver je kalibrisan pre postavljanja životinje u komoru. Softver zatim meri promene piksela koje se dešavaju između svakog video kadra. Prag kretanja je postavljen da bude što je moguće niži (20 jedinica indeksa pokreta), a kontinuirani broj zamrzavanja je podešen na brzinu kadrova da bi se obezbedilo najosetljivije očitavanje pokreta. Da bi se procenilo podsećanje na pamćenje svetlosnih znakova, procentualno vreme ponašanja zamrzavanja je usrednjeno za dva minuta neposredno pre i posle početka svetlosnog stimulusa. Statistička značajnost je procenjena jednosmernom ANOVA-om. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± S.E.M.
Optometrija
[0089] Oštrina vida je merena posmatranjem optomotornih odgovora miševa na rotirajuće sinusoidne rešetke (OptoMotry, Cerebral Mechanics). Korišćeni protokol daje nezavisne mere oštrine desnog i levog oka na osnovu nejednake osetljivosti dva oka na rotaciju šablona, jer samo kretanje u smeru temporalno-nazalno izaziva odgovor praćenja. Kao rezultat toga, desno i levo oko su najosetljivije na rotacije u smeru suprotnom od kazaljke na satu (CCV) i u smeru kazaljke na satu (CV), redom. Podražaji različite vremenske frekvencije su korišćeni da bi se odredio prag na kome je bio prisutan odgovor. Korišćena je dvostruko slepa procedura prinudnog izbora sa dve alternative, u kojoj je posmatrač bio 'slep' na smer rotacije šablona, da li se radi o ArchT-tretiranom ili netretiranom CNGA3-/-ili PDE6C-/-mišu ili starosti-podudarna kontrolna životinja divljeg tipa (C57BL6). Vizuelna oštrina je izmerena u oba oka ispitivanih života i usrednjena ili odvojeno analizirana za svako oko nakon 4 ispitivanja koja su sprovedena u 4 odvojena dana. Merenje je izvedeno na miševima koji su primili injekciju 3-10 nedelja nakon tretmana zajedno sa izogenim kontrolama prilagođenom uzrastu.
Primer 2 - ekspresija ArchT u fotoreceptorima štapićastih ćelija daje sposobnost da se reaguje brzim odgovorima bez beljenja
[0090] Vid koji je posredovan ćelijom štapića je optimizovan za niske nivoe osvetljenja, uključujući detekciju jednog fotona. Međutim, štapići ne mogu da se uporede sa brzim nastankom i oporavkom reakcija čepića na svetlost (Fu et al., 2007, Pugh et al., 1999). Ova funkcionalna razlika, korisna za obezbeđivanje pouzdanog vida u različitim okruženjima, postaje iscrpljujuća kada se vid posredovan čepićem izgubi u uslovima kao što je degeneracija makule povezane sa uzrastom, kada se gusto zbijene čepiće u fovei degenerišu (de Jong 2006). Ispitivano je da li bi štapići mogli da reaguju i brže se oporave na stimulanse, to bi pomoglo u ublažavanju funkcionalnog oštećenja uzrokovanog gubitkom čepića.
[0091] Brza protonska pumpa vođena svetlom (ArchT) (Han et al., 2011) izražena je u fotoreceptorima štapića. AAV8 čestice koje nose ArchT-EGFP pod kontrolom promotora rodopsina (Rho) su ubrizgane subretinalno kod odraslih miševa. Ekspresija Rho-ArchT-EGFP bila je ograničena na membranu fotoreceptora štapića (slike 1a-b). Sinaptički terminali štapića koji eksprimiraju Rho-ArchT-EGFP i kupastih ćelija mogu se lako razlikovati nakon imunohistohemije (Slika 1c). Kvantitativni PCR na sortiranoj populaciji kupastih ćelija potvrdio je da je ekspresija Rho-ArchT-EGFP specifična za populaciju štapića i da nije primećen očigledan znak toksičnosti do 6 meseci nakon injekcije AAV8. Ekspresija ArchT je omogućila izuzetno brze svetlosne odgovore, dok je unutrašnji odgovor štapića bio očuvan i uporediv sa onim uočenim u netransdukovanim fotoreceptorima štapića (slika 1d). Struje
2
izazvane svetlošću snimljene sa štapića koji eksprimiraju ArchT su pokazali znatno bržu kinetiku od intrinzičnih struja štapića u svim testiranim modelima miša (Slika 2a-b). Ova kinetika je omogućila da se struje izazvane svetlošću modulišu do 80 Hz, daleko iznad granica oba štapića, koji su kolebali na ~20 Hz (slika 2a-c), i čepića (Fu et al., 2007).
[0092] Iznenađujuće, ArchT ekspresija nije izmenila svojstva fotoreceptora štapića dok je dobijena sposobnost da se odgovori brzim odgovorima bez izbeljivanja (Slika 2e).
Primer 3 – štapići koji eksprimuju ArchT- pokreću održani nagli rast RGC pri visokim svetlosnim intenzitetima i učestalostima koje se približavaju onima kod fotoreceptora čepića
[0093] Sledeće je ispitivano da li kola koja su pokrenuta od strane čepića će biti sposobna da prate vid vođen štapićima koji je brži od normalnog. Putevi štapića i čepića predstavljaju neke sličnosti i neke iznenađujuće razlike i prema tome nije jasno da li kolo štapića može može pouzdano da održi brzu ’štapiću sličnu’ transmisiju (Wässle et al., 2004). Pokazano je da štapići kontaktiraju direktno OFF ’čepiće’ bipolarne ćelije (Soucy et al., 1998 and Hack et al., 1999) i uparena pulsna stimulacija ukazuje na to da ovaj alternativni put može biti brz kao čepići-do-OFF-bipolarne (Li et al., 2010). Međutim, nije jasno kako održavanje ovog odgovora može biti i da li štapić (ON) bipolarnih ćeljia može takođe održati brzu transmisiju. Osim toga, sinaptički terminusi štapića imaju različitu veličinu i ultrastrukturalnu organizaciju u poređenju sa kupastim ćelijama i štapićima bipolarnim ćelijama koje ne kontaktiraju ganglijske ćelije mrežnjače (RGCs) direktno ali samo kro put koji uključuje All amakrine ćelije (Wässle et al., 2004). Da bi se ispitala maksimalna brzina koju put štapića može da dostigne, multi-elektrodna snimanja iz RGC-a u mišjim modelima kojima nedostaje funkcija čepića su izvedena, da bi se izolovao RGC ishod posredstvom štapića. Odgovori u RGC koji su vođeni štapićima u netransdukovanim mrežnjačama su izbeljeni na visokim svetlosnim nivoima i nisu mogli da prate frekvencije stimulacije veće od ~20 Hz (Slika 2f).
[0094] Suprotno, štapići koji eksprimuju ArchT dovele su do trajnih skokova RGC-a pri visokim intenzitetima svetlosti i na frekvencijama koje su se približavale frekvencijama fotoreceptora kupastih ćelija (Slika 2f).
Primer 4 - ekspresija Rho-ArchT-EGFP proširila je osetljivost miševa kojima nedostaje vid posredovan čepićima na jake svetlosne stimuluse
[0095] Da bi ovaj vid štapića brži od normalnog bio koristan, smatralo se da bi miševi trebali biti u stanju da koriste struje posredovane ArchT kako bi pouzdano odgovorili na svetle i brze stimuluse. CNGA3<-/->i PDE6C<-/->miševi kojima nedostaje vid posredovan čepićima (Biel et al., 1999. i Change et al., 2009.) nisu uspeli da nauče paradigmu uslovljavanja straha gde su jaki svetlosni stimulusi upareni i istovremeno prekinuti sa blagim šokom stopala (slika 3a). Međutim, ekspresija Rho-ArchT-EGFP proširila je osetljivost ovih miševa na jake svetlosne stimuluse, omogućavajući učenje o povezanosti između vizuelnog stimulusa i šoka (slika 3a). Konačno, ispitano je da li ekspresija ArchT daje brzi vid miševima CNGA3<-/->i PDE6C<-/->. Procena brzine vida pomoću optomotornog testiranja (Umino et al., 2008) pokazala je da su miševi koji eksprimiraju ArchT bili u stanju da prate stimuluse brže od miševa koji nisu bili podvrgnuti subretinalnim virusnim injekcijama i miševa koji su primili samo vektor GFP (slika 3b). Maksimalna frekvencija stimulusa koju su miševi koji eksprimiraju ArchT mogli da prate bila je slična onoj kod fotoreceptora čepića (slika 3b).
[0096] Zajedno, ovi rezultati pokazuju da se štapići mogu pokretati brže nego svojom intrinzičnom foto-transdukcijskom kaskadom i da kola na štapićima mogu da izdrže bržu signalizaciju. Važno je da sinaptičko oslobađanje iz štapića ne zahteva velike fluktuacije napona, ali male struje umesto toga mogu izazvati dovoljne varijacije napona da značajno izmene njihov sinaptički prenos (Cangiano et al., 2012). Ovo proširuje upotrebu pronalaska na nivoe svetlosti nekoliko puta niže od prosečnih nivoa svetlosti potrebnih za optogenetsku manipulaciju aktivnosti većine drugih neurona (Han et al., 2011).
Primer 5 -Postupci za RPAP eksperimente
Životinje
[0097] C57BL6 (Harlan, UK), Cnga3-/-(J.R. Heckenlively, Univerzitet Mičigen), Pde6c/-(J.R. Heckenlively, Univerzitet Mičigen, MI) (Chang et al., 2009), i Gnat1-/-(J. Lem, Medicinski fakultet Univerziteta Tufts, MA) (Calvert et al., 2000) miševi su održavani u objektu za životinje na Univerzitetskom koledžu u Londonu. Odrasle muške i ženske životinje bile su stare 6-12 nedelja u vreme virusne injekcije i korišćene su za eksperimente najmanje 2 nedelje nakon injekcije da bi se omogućila dovoljna ekspresija R9AP. Svi korišćeni miševi bili su starosti od 2 do 6 meseci i bili su podudarni po godinama između grupa datog eksperimenta. Svi eksperimenti su sprovedeni u skladu sa Smernicama o korišćenju životinja i ljudi u neuronaučnim istraživanjima i sa ARVO izjavom o upotrebi životinja u oftalmološkim i vidnim istraživanjima. Životinje su držane na standardnom ciklusu od 12/12 sati svetlo-mrak
Konstrukcije plazmida i proizvodnja rekombinantnog AAV8
[0098] Mišja R9ap cDNK je PCR amplifikovana iz cDNK mrežnjače miša korišćenjem prajmera koji su dizajnirani da obuhvate ceo kodirajući region. R9ap cDNK je klonirana između promotora (CMV promotor ili goveđi promotor rodopsina) i SV40 mesta poliadenilacije. Ovi plazmidi su korišćeni za generisanje dva pseudotipovana AAV2/8 virusna vektora, rAAV2/8.CMV.mR9ap i rAAV2/8.Rho.mR9ap, kao što je opisano u nastavku u tekstu ispod.
[0099] Rekombinantni AAV2/8 vektor je proizveden postupkom trostruke prolazne transfekcije kao što je prethodno opisano (Gao et al., 2002). Konstrukt plazmida, plazmid za pakovanje specifičan za AAV serotip i pomoćni plazmid su pomešani sa polietileniminom da bi se formirali transfekcioni kompleksi koji su zatim dodavani u 293T ćelije i ostavljeni tokom 72 h. Ćelije su sakupljene, koncentrovane i lizirane da bi se oslobodio vektor. AAV2/8 je prečišćen afinitetnom hromatografijom i koncentrovan korišćenjem ultrafiltracionih kolona (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany), ispran u PBS-u i koncentrovan do zapremine od 100-150 µl. Titri virusnih čestica su određeni dot-blotom ili PCR-om u realnom vremenu. Korišćene koncentracije prečišćenog vektora bile su 1-2 x 10<12>virusnih čestica/ml.
Elektroretinogram (ERG)
[0100] ERG-ovi su zabeleženi iz oba oka nakon što su miševi adaptirani na tamu preko noći korišćenjem komercijalno dostupnog sistema (Espion E2, Diagnosys LLC, Lowell, MA). Životinje su anestezirane intraperitonealnom injekcijom 0,007 ml/g mešavine medetomidin hidrohlorida (1 mg/ml), ketamina (100 mg/ml) i vode u odnosu 5:3:42 pre snimanja. Zenice su u potpunosti proširene upotrebom 2,5% fenilefrina i 1,0% tropikamida. Prvo su postavljene srednje subdermalne referentne elektrode za tlo i usta, a zatim pozitivne srebrne elektrode kojima je dozvoljeno da lagano dodiruju centar rožnjače pod slabim crvenim osvetljenjem. Kap Viscotears 0,2% tečnog gela (Dr. Robert Winzer Pharma/OPD Laboratories, Watford, UK) stavljena je na vrh pozitivnih elektroda da bi rožnjače održale vlažne tokom snimanja i mišu je ostavljeno da se dodatno prilagodi tami 5 minuta. Granične frekvencije filtera opsega bile su 0,312 Hz i 1000 Hz. Brzina oporavka fotoodgovora je merena korišćenjem paradigme uparenih blica gde su parovi blica sa identičnim intenzitetom zasićenja (1,8 log.cd.s/m<2>) razdvojeni različitim intervalima između stimulusa (ISI; 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 sek). U ovoj paradigmi, 1. blic bi potpuno potisnuo električne odgovore mehanizama štapićaste ćelije koji omogućavaju posmatranje brzine funkcionalnog oporavka funkcije štapića predstavljanjem 2. blica sa različitim ISI. Obezbeđeno je dovoljno vremena (150 sekundi) između parova blica da bi se omogućio potpuni oporavak prvog bljeska. Tada bi posmatrani oporavak amplitude a-talasa trebalo da odražava brzinu deaktivacije štapića kod životinja koje nemaju funkciju čepića, pošto blic treba da izbeli samo deo (0,02%) rodopsina (Lyubarski et al., 2004 i Weymouth, A.E. & Vingrys 2008). Serije intenziteta skotopskog treperenja od 6 Hz izvedene su kao što je prethodno objavljeno sa nekoliko modifikacija (Seeliger et al., 2001). Korišćeno je 17 koraka intenziteta blica u rasponu od -6 do 2 log.cd.s/m<2>, svaki odvojen od 0,5 log jedinice. Za svaki korak, nakon 10 sekundi adaptacije, preleti od 600 ms su uprosečeni 20 puta koristeći isto stanje blica. Serija odgovora prilagođenih tami je takođe dobijena korišćenjem dužih bljeskova sa trajanjem od 20, 100 i 200 ms sve pri 83,3 cd/m<2>. Standardni jednokratni skotopski snimci dobijeni su od životinja prilagođenih tami sa sledećim povećanjem intenziteta svetlosti: -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1.0, 1.5 i 1.9 log.cd.s/m<2>. Snimanje fotopičnog blica obavljeno je nakon 5-minutnih intervala prilagođavanja svetlosti na intenzitetu pozadinskog svetla od 20 cd/m2, koji je takođe korišćen kao pozadinsko svetlo za vreme snimanja. Korišćeni intenziteti fotopičnog svetla bili su -2, -1, 0, 1, 1,5 i 1,9 log.cd.s/m<2>.
Histologija
[0101] Šest nedelja nakon unilateralne subretinalne injekcije rAAV2/8.Rho.mR9ap, oba oka iz Cnga3-/-miša su brzo uklonjena i i trenutno zamrznuti u tečnom azotu. Nakon kriougradnje oka u OCT (RA Lamb, East-borne, UK), oči su isečene kao poprečne preseke debljine 15 µm i sušene na vazduhu 15 -30 min. Za imunohistohemiju, preseci su prethodno blokirani u PBS-u koji sadrži normalan magareći serum (2%), goveđi serumski albumin (2%) 1 h pre inkubacije sa anti-RGS9 antitelom (1:500; Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja 2 x 15 minuta sa PBS-om, preseci su inkubirani sa odgovarajućim Alexa 546-obeleženim sekundarnim antitelom (Invitrogen, Carlsbad, CA) tokom 2 h na sobnoj temperaturi (ST), isprani i obojeni Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK). Retinalni preseci su pregledani na konfokalnom mikroskopu (Leica TCS SP2, Leica Microsystems; Wetzlar, Nemačka).
Western blot
[0102] Oči iz Cnga3-/-miša 4 nedelja posle unilateralne subretinalne injekcije rAAV2/8.Rho.mR9ap su sakupljene. Nakon odvajanja neuralne mrežnjače od kompleksa RPE/horoid/sklera, tkiva su homogenizovana u RIPA puferu i ostavljena na ledu 20 minuta. Uzorci su centrifugirani na 16, 000 g tokom 30 minuta na 4 °C i čuvani na -20 °C do upotrebe. Western blot je sproveden korišćenjem poznatih protokola.
Optomotorni odgovori i funkcija kontrastne osetljivosti
[0103] Osetljivosti na kontrast i oštrine vida tretiranih i netretiranih očiju mereni su posmatranjem optomotornih odgovora miševa na rotirajuće sinusoidne rešetke (OptoMotry<™>, Cerebral Mechanics, Lethbridge, AB Canada). Korišćeni protokol daje nezavisna merenja oštrine desnog i levog oka na osnovu nejednake osetljivosti dva oka na rotaciju šablona: desno i levo oko se pokreću prvenstveno rotacijom u smeru suprotnom od kazaljke na satu, odnosno u smeru kazaljke na satu (Douglas et al., 2005). Miš je postavljen na malo ostrvo izolovano od poda u zatvorenom prostoru okruženom sa 4 monitora sa rotirajućom sinusoidnom rešetkom sa srednjom osvetljenošću od 62 cd/m<2>. Korišćena je dvostruko slepa procedura prinudnog izbora sa dve alternative, u kojoj je posmatrač bio 'slep' na smer rotacije šablona, bilo da li se radi o tretiranoj ili netretiranoj Cnga3-/-mišu ili kontrolnoj životinji divljeg tipa odgovarajućeg uzrasta. (C57BL6). Kontrastna osetljivost izmerena na 0.128, 0.256, 0.383, 0.511 ciklusa/stepen predstavljena na 6 Hz definisana je kao 100 podeljeno sa najnižim procentom kontrasta
2
koji daje prag odgovora. Oba oka svakog miša su testirana četiri puta u nezavisnim danima. Podaci su projektovani na Campbell-Robsonovu kontrastnu tabelu osetljivosti sa sinusoidnim rešetkama koje predstavljaju relativne prostorne frekvencije.
Merenja rodopsina
[0104] Nakon potpunog prilagođavanja na tamu preko noći, miševi su anestezirani, a zenice su potpuno proširene da bi se procenila brzina izbeljivanja vizuelnog pigmenta. Zatim su miševi stavljeni u svetlosnu kutiju sa izvorom svetlosti (7,0 mV) koji je direktno osvetljavao oko 5 minuta pre nego što su oči sakupljene. U drugom eksperimentu, miševi su bili izloženi identičnim uslovima kao i za merenje kontrastne osetljivosti za različita trajanja (0, 30 60, 120 minuta). Oči miša su uklonjene u svakoj vremenskoj tački i stavljene u 250 µl fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom i brzo zamrznute u tečnom azotu u lagano nepropusnoj cevi i držane na -20 °C do upotrebe. Neke oči su sakupljene u mraku pod crvenim osvetljenjem nakon noćne adaptacije miševa na tamu. Spektrofotometrijska merenja rodopsina su obavljena kao što je prethodno navedeno sa manjim modifikacijama (Douglas et al., 1995). Ukratko, uzorci su odmrznuti na sobnoj temperaturi i homogenizovani. Ova i sve naredne operacije izvedene su pri slabom crvenom osvetljenju koje minimalno izbeljuje vizuelne pigmente. Svakom uzorku je dodato 50 mikrolitara n-dodecil β-D-maltozida (200 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i dobijena smeša je rotirana 2 h na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledilo centrifugiranje od 10 minuta ( 23.000 g) na 4°C. Supernatant je uklonjen i stavljen u kvarcnu kivetu u Shimadzu UV-2101PC spektrofotometar (Shimadzu, Kyoto, Japan). Nakon početnog skeniranja neizbeljenog ekstrakta od 300 nm do 700 nm, uzorak je izložen monohromatskoj svetlosti (502 nm) u trajanju od 3 minuta, što se pokazalo kao dovoljno da potpuno izbeli rodopsin (Longbottom et al., 2009), i ponovo skenirano. Svi spektri apsorpcije su na nuli na 700 nm. Diferencijalni spektri su konstruisani korišćenjem krivih pre i posle izbeljivanja i određene maksimalne optičke gustine na ~ 500 nm, koje predstavljaju količinu ekstrahovanog vizuelnog pigmenta.
Primer 6 - Prekomerna ekspresija R9AP u štapićima i povećana brzina deaktivacije fotoreceptora
[0105] RGS9, Gb5 i R9AP su obavezni članovi regulatornog kompleksa GTPaze. Da bi se proučavao efekat prekomerne ekspresije R9AP posredovane AAV-om na kompleks GTPaze u štapićima, ispitan je nivo i distribucija RGS9 nakon subretinalne injekcije rAAV2/8.Rho.mR9ap kod Cnga3<-/->miševa. Ovi miševi imaju normalnu funkciju štapića, ali odsustvo funkcije čepića i služe kao model ahromatopsije. Četiri nedelje kasnije, tretirana mrežnjača je pokazala povećanu imunoreaktivnost protiv RGS9 u celom sloju fotoreceptora u tretiranoj u poređenju sa netretiranom mrežnjačem (Slika 4A). Western blot analiza je dalje potvrdila povećanu ekspresiju proteina RGS9 u tretiranoj mrežnjači (Slika 4B). Ovi rezultati su pokazali da prekomerna ekspresija R9AP korišćenjem AAV2/8 efektivno povećava nivo katalitičke komponente RGS9 i kompleksa GTPaze.
[0106] Zatim je proučavan funkcionalni efekat prekomerne ekspresije R9AP posredovane AAV2/8 na fototransdukciju štapića primenom ERG uparenog blica (Lyubarsky and Pugh 1996). U ovoj paradigmi, isporučuje se par identičnog intenziteta blica sa promenljivim intervalom između stimulusa i meri se oporavak drugog odgovora u odnosu na prvi. Na putu fotoreceptora štapića, brzina oporavka a-talasa (koji potiče od fotoreceptora) zavisi od brzine deaktivacije. Utvrđeno je da je vremenska konstanta (s) za 50% oporavak amplitude a-talasa smanjena za -60% u Cnga3-/-očima ubrizganim rAAV2/8.CMV.mR9ap (σ = ~ 2,99 sek) u poređenju sa netretirane oči (σ = ~ 7,38 sek; slika 4C). Slično tome, povećana brzina oporavka amplitude a-talasa primećena je korišćenjem promotora rodopsina (rAAV2/8.Rho.mR9ap σ = ∼ 2,74 sek; slika 4C) u istoj liniji miša (Cnga3-/-) ili istog virusa (rAAV2 /8.CMV.mR9ap) u drugoj liniji miša sa defektom čepića (Pde6c-/-; Slika 8).
[0107] Ova zapažanja su pokazala da subretinalna injekcija rRAAV2/8.CMV.mR9ap ili rAAV2/8.Rho.mR9ap može značajno povećati brzinu deaktivacije fototransdukcije štapića kroz povećanje nivoa RGS9 i kompleksa GTPaze.
Primer 7 - "Fotopsko pomeranje" funkcije štapića prekomernom ekspresijom R9AP
[0108] Da bi se istražilo da li povećana brzina deaktivacije postignuta prekomernom ekspresijom kompleksa R9AP i GTPaze u štapićima može da promeni radni opseg funkcije fotoreceptora, ERG-ovi treperenja prilagođeni tami od 6 Hz su snimljeni korišćenjem inkrementalnih intenziteta blica. Oči tretirane sa rAAV2/8.CMV.mR9ap ili rAAV2/8.Rho.mR9ap pokazale su povećan odgovor na svetlije bljeskove u poređenju sa netretiranim očima. Ovo je rezultiralo povećanjem gornjeg praga odgovora za do ~2 log jedinice (Slika SA), sa malim uticajem na maksimalni fotoodgovor (151 ± 17 µV u tretiranim nasuprot 162 ± 29 µV u netretiranim očima; prosečna ± standardna greška srednje vrednosti). Kao što se očekivalo, ovo "fotopsko pomeranje" u radnom opsegu štapićastih ćelija je praćeno recipročnim podizanjem donjeg praga odgovora za do ~ 1,5 log jedinica. U međuvremenu, gornji prag ERG odgovora očiju divljeg tipa i Gnat1-/- oči, oba sa funkcionalnim kupastim ćelijama, bio je povišen za ~4,0 log jedinice u poređenju sa netretiranim Cnga3-/- očima. Slični rezultati su dobijeni kada je rAAV2/8.Rho.mR9ap ubrizgan u Pde6c-/- miševe (Slika 9). Kao posledica toga, tretman je omogućio štapićima da reaguju na bljeskove dužeg trajanja (Slika 5B) i na bljeskove pod pozadinskim osvetljenjem koje izoluje čepiće (Slika 5C). Ovo uključuje stanja u kojima netretirani štapići praktično nisu ispoljili nikakav odgovor.
[0109] Uzeti zajedno, ovi rezultati su utvrdili da prekomerna ekspresija R9AP u štapićastim ćelijama dovodi do njihove desenzibilizacije i omogućava ćelijama da steknu fotopičnu funkciju u zamenu za skotopičnu funkciju. Ova terapeutska indukcija funkcije štapića „fotopskog pomeranja“ trajala je najmanje 5 meseci bez vidljivih dokaza degeneracije mrežnjače (Slika 10). U međuvremenu, tretman miševa divljeg tipa korišćenjem istih virusnih vektora nije pokazao merljivu promenu u funkciji mrežnjače (Slika 11).
Primer 8 - Bipolarni put štapića omogućava prenos izmenjene funkcije štapića
[0110] Ovaj rad je utvrdio da prekomerna ekspresija R9AP u štapićima rezultira bržom kinetikom deaktivacije fotoreceptora i omogućava neuronu da odgovori na veću količinu fotona. U međuvremenu, ubrzana deaktivacija bi takođe trebalo da rezultira kraćim trajanjem oslobađanja neurotransmitera na sinaptičkom terminalu fotoreceptora. Stoga je procenjeno da li tretman utiče na nizvodnu bipolarnu signalizaciju štapića. Prvo je proučavana brzina i obim prenosa signala od fotoreceptora do bipolarnih ćelija do kratkog pojedinačnog bljeska merenjem implicitnog vremena i amplituda a-talasa (koji potiče od fotoreceptora) i b-talasa (koji potiče od bipolarne ćelije) koristeći ERG (slika 6a). Sve u svemu, uočena je nešto manja, ali skoro identična kriva intenzitet-odgovor za tretirane i netretirane oči i za a-talas i za b-talas. Mala uočena razlika može odražavati ili stvarnu posledicu ubrzane deaktivacije fotoreceptora ili samo neuralno oštećenje izazvano subretinalnom injekcijom. Implicitno vreme a-talasa označava tačku u kojoj bipolarni ćelijski b-talas postaje detektljiv. Takođe smo primetili mala kašnjenja u implicitnom vremenu a-talasa i b-talasa, što ukazuje da postoji skromno kašnjenje u prenosu neuronskih signala od fotoreceptora do bipolarnih ćelija. Ipak, relativno velika varijacija ERG odgovora između pojedinaca ukazuje na malo kašnjenje ili smanjenje odgovora štapića ne mora nužno da se prevede u vizuelnu disfunkciju (Birch i Anderson 1992).
[0111] Stoga, ovi rezultati ukazuju da, u principu, bipolarne ćelije skoro u potpunosti prihvataju promenu funkcije fotoreceptora i, što je još važnije, pokazuju odgovarajući odnos doza-odgovor.
Primer 9 - Prekomerna ekspresija R9ap dovodi do poboljšane funkcije osetljivosti na kontrast
2
[0112] Zatim je postavljeno pitanje da li je „fotopsko pomeranje“ funkcije štapića usled prekomerne ekspresije R9AP prevedeno u poboljšane vizuelne performanse pod svetlošću merenjem optokinetičkog odgovora na rotirajuće sinusoidne rešetke pod najsvetlijim mogućim uslovima snimanja sa standardnim kompjuterskim monitorom (62 cd/m<2>) (Carvalho et al., 2011). Jedinstvena prednost ovog testa ponašanja je u tome što se vizuelna funkcija svakog oka može proučavati posebno; funkcija desnog oka se može ispitati odgovorima na rešetke u smeru suprotnom od kazaljke na satu (CCV), a levog oka pomoću stimulusa u smeru kazaljke na satu (Douglas et al., 2005). Funkcija prostorne kontrastne osetljivosti (CSF) proučavana je sa fiksnom vremenskom frekvencijom od 6,0 Hz i ustanovljeno je da Cnga3-/-miševi imaju smanjen CSF u poređenju sa miševima divljeg tipa (Slika 7). CSF, funkcija kontrastne osetljivosti i oštrine vida, prikazala je opseg procene vizuelne percepcije (životinje bi verovatno mogle da percipiraju rešetke ispod krive, ali ne iznad; slika 7A). Zanimljivo, 8,0 puta (P = 0,005) i 5,4 puta (P = 0,011) povećanje osetljivosti korišćenjem rešetki od 0,128 i 0,256 ciklusa/stepen (c/d), redom, primećeno je kada je kontrastna osetljivost tretiranog a netretirane oči su upoređene (slika 7A levi panel). Nije primećena jasna promena kontrastne osetljivosti za rešetke od 0,383 (P = 0,056) i 0,511 (P = 0,111) c/d. Zanimljivo je da je prosečna osetljivost tretiranog oka kod Cnga3-/- miševa premašila onu kod kontrola divljeg tipa sa normalnom funkcijom čepića. Međutim, kada su miševi divljeg tipa tretirani istim virusnim konstruktom, CSF se nisu razlikovali između tretiranih i netretiranih očiju (Slika 12).
[0113] Nakon što je utvrđeno da prekomerna ekspresija R9AP dovodi do povećanja vizuelnih performansi kada se gledaju maksimalno svetla podešavanja monitora, nastojalo se da se utvrdi da li je ovo povećanje vida održivo. Ovo je opravdano zabrinjavajuće s obzirom da je poznato da je regeneracija vizuelnog pigmenta u štapićima znatno sporija od regeneracije čepića (Wang i Kefalov 2011). Prvo je procenjeno da li tretman dovodi do promene brzine izbeljivanja vizuelnog pigmenta. Utvrđeno je da izlaganje tretiranih i netretiranih očiju jakom svetlu tokom 5 minuta nije dalo nikakvu razliku u nivoima zaostalog vizuelnog pigmenta koji se može izbeljivati (Slika 7B donji levi panel). Drugo, količina rodopsina koji se može izbeljivati u oku je proučavana nakon izlaganja Cnga3-/-miševa tokom promenljivog vremena istim eksperimentalnim uslovima sprovedenim za merenje CSF. Rezultati su pokazali da je nivo vizuelnog pigmenta ostao stabilan bez dokaza o smanjenju tokom 2 sata izlaganja vizuelnim stimulansima, slično za tretirane i netretirane oči (slika 7B donji desni panel). Ovi rezultati su pokazali da je povećanje vizuelne percepcije kod tretiranih Cnga3-/- miševa podržano dovoljnim snabdevanjem molekula rodopsina i da je održivo.
REFERENCE
[0114]
Curcio, C.A., et al. The Journal of comparative neurology 292, 497-523 (1990). Dryja, T.P. American journal of ophthalmology 130, 547-563 (2000).
Hess, R.F. & Nordby, K. The Journal of physiology 371, 365-385 (1986). Nishiguchi, K.M., et al. Human mutation 25, 248-258 (2005).
Kohl, S., et al. Nature genetics 19, 257-259 (1998).
Chang, B. et al. P.N.A.S 106, 19581-19586 (2009). Thiadens, A.A., et al. American journal of human genetics 85, 240-247 (2009).
Burns, M.E. & Pugh, E.N. Biophys J 97, 1538-1547 (2009). Burns, M.E. & Pugh, E.N. Physiology 25, 72-84 (2010).
Baseler, H.A., et al. Nature neuroscience 5, 364-370 (2002). Martemyanov, K.A. & Arshavsky, V.Y. Prog MolBiol Transl 86, 205-227 (2009).
Krispel, C.M., et al. Neuron 51, 409-416 (2006).
Cowan, C.W., et al. P.N.A.S.95, 5351-5356 (1998).
2
Zhang, X., Wensel, T.G. & Kraft, T.W. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 23, 1287-1297 (2003).
Nishiguchi, K.M., et al. Nature 427, 75-78 (2004).
Michaelides, M., et al. Ophthalmology 117, 120-127 e121 (2010).
Han, X. et al. Front Syst Neurosci.5, 18 (2011). Busskamp, V., et al. Science 329, 413-417 (2010).
Fu, Y., Yau, K.W. Pflugers Arch.454, 805-819 (2007).
Pugh, E.N. Jr et al. Curr Opin Neurobiol.9, 410-418 (1999).
de Jong, P.V.T.M. N EnglJMed 355, 1474-1485 (2006).
Wässle, H. NatRev Neurosci.5, 747-757 (2004).
Soucy, E. et al. Neuron 21, 481-493 (1998).
Hack, I. et al. P.N.A.S.96, 14130-14135 (1999).
Li, W. et al. Nat Neurosci 13, 414-416 (2010).
Biel, M. et al. P.N.A.S.96, 7553-7557 (1999).
Umino, Y. et al. JNeurosci 28, 189-198 (2008).
Cangiano, L. et al. J Physiol.590, 3841-3855 (2012).
Bemdt, A. et al. Science 344, 420-424 (2014).
Wietek, J. et al. Science 344, 409-412 (2014).
Calvert, P.D. et al. P.N.A.S 97, 13913-13918 (2000).
Gao, G.P. et al. P.N.A.S 99, 11854-11859 (2002).
Lyubarsky, A.L., et al.Vision research 44, 3235-3251 (2004).
Weymouth, A.E. & Vingrys, A.J. Progress in retinal and eye research 27, 1-44 (2008).
Seeliger, M.W., et al. Nature genetics 29, 70-74 (2001).
Douglas, R.M., et al. Visual neuroscience 22, 677-684 (2005).
Douglas, R.H., et al. Journal of Comparative Physiology a-Sensory Neural and Behavioral Physiology 177, 111-122 (1995).
Longbottom, R., et al. P.N.A.S.106, 18728-18733 (2009).
Lyubarsky, A.L. & Pugh, E.N., Jr. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 16, 563-571 (1996).
Birch, D.G. & Anderson, J.L. Archives of ophthalmology 110, 1571-1576 (1992).
Carvalho, L.S., et al. Human molecular genetics 20, 3161-3175 (2011).
Wang, J.S. & Kefalov, V.J. Progress in retinal and eye research 30, 115-128 (2011).
Taylor, A. W., Ocular immune privilege, Eye, 23, 1885-1889 (2009).
Natkunarajah, M. et al., Assessment of ocular transduction using single-stranded and selfcomplementary recombinant adeno-associated virus serotype 2/8, Gene Ther.15, 463-467 (2008). Choi, V. W. et al., AAV hybrid serotypes: improved vectors for gene delivery, Curr. Gene Ther., 5, 299-310 (2005).
Wu, Z. et al., Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy, Mol. Ther., 14, 316-327 (2006).
Chuong, A.S. et al., Non-invasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin, Nat Neurosci., 17, 1123-1129 (2014).
2

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Adeno-povezani virusni (AAV) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira genski proizvod koji je osetljiv na svetlost i/ili koji modulira endogenu signalizaciju koja je osetljiva na svetlost u fotoreceptorskoj ćeliji, za upotrebu u postupku poboljšanja vida kod pacijenta disfunkcijom i/ili degeneracijom fotoreceptora čepića uvođenjem pomenute nukleinske kiseline u zdrave fotoreceptore štapiće u mrežnjači pacijenta i ekspresiji u njoj pomenutog genskog proizvoda, tako da je opseg svetlosnih intenziteta na koji fotoreceptorska ćelija štapića reaguje proširen i/ili brzina na kojoj fotoreceptorska ćelija ćelija reaguje na svetlost je povećana, pri čemu:
genski proizvod je ArchT, Jaws (cruxhalorodopsin), iC1C2, ili R9AP;
kapsid vektora AAV je kapsid AAV8, i nukleinska kiselina koja je eksprimirana pod kontrolom promotora specifičnog za štapić.
2. Vektor AAV za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je genom vektora AAV izveden iz AAV2.
3. Vektor AAV za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde pacijent boluje od makularne degeneracije, ahromatopsije ili Leberove kongenitalne amauroze.
4. Vektor AAV za upotrebu prema zahtevu 3, gde je makularna degeneracija makularna degeneracija povezana sa uzrastom (AMD), nasledno stanje makularne degeneracije ili nasledna distrofija čepića.
5. Vektor za upotrebu prema zahtevu 4, gde je makularna degeneracija povezana sa uzrastom (AMD) vlažna ili neovaskularna AMD ili geografska atrofija.
6. Vektor AAV za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je signalizacija fotoreceptora štapića proširena u mezopski i/ili fotopski opseg osvetljenja.
7. Vektor AAV za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde fotoreceptori štapići ispoljavaju poboljšanu jačinu modulacije i/ili kinetike brže aktivacije/inaktivacije.
8. Vektor AAV za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je poboljšan mezopski i/ili fotopski vid pacijenta.
9. Vektor AAV za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je promoter specifičan za štapić Rodopsin (Rho), protein leucinski zatvarač specifičan za neuralnu mrežnjaču (NRL) ili promoter fosfodiesteraze 6B (PDE6B).
10. Vektor AAV za upotrebu prema bilo kom zahteva 1 do 9 u kome je upotreba u kombinaciji sa drugom terapijom za lečenje ili prevenciju poremećaja vida.
11. Vektor AAV za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je genski proizvod ArchT ili R9AP.
2
RS20230560A 2015-02-23 2016-02-19 Genska terapija za poboljšanje vida RS64372B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201503008A GB201503008D0 (en) 2015-02-23 2015-02-23 Treatment
PCT/GB2016/050419 WO2016135457A1 (en) 2015-02-23 2016-02-19 Gene therapy to improve vision
EP16706413.8A EP3261679B1 (en) 2015-02-23 2016-02-19 Gene therapy to improve vision

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64372B1 true RS64372B1 (sr) 2023-08-31

Family

ID=52822045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230560A RS64372B1 (sr) 2015-02-23 2016-02-19 Genska terapija za poboljšanje vida

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20180030477A1 (sr)
EP (1) EP3261679B1 (sr)
JP (1) JP6771474B2 (sr)
KR (1) KR102272466B1 (sr)
CN (1) CN107530449A (sr)
AU (2) AU2016225277B2 (sr)
CA (1) CA2977464C (sr)
CY (1) CY1126098T1 (sr)
DK (1) DK3261679T3 (sr)
EA (1) EA201791900A1 (sr)
ES (1) ES2947308T3 (sr)
FI (1) FI3261679T3 (sr)
GB (1) GB201503008D0 (sr)
HK (1) HK1248594A1 (sr)
HR (1) HRP20230775T1 (sr)
HU (1) HUE062319T2 (sr)
IL (1) IL254066B (sr)
LT (1) LT3261679T (sr)
MX (1) MX2017010772A (sr)
MY (1) MY186444A (sr)
PH (1) PH12017501525B1 (sr)
PL (1) PL3261679T3 (sr)
PT (1) PT3261679T (sr)
RS (1) RS64372B1 (sr)
SG (2) SG10202005923WA (sr)
SI (1) SI3261679T1 (sr)
SM (1) SMT202300200T1 (sr)
WO (1) WO2016135457A1 (sr)
ZA (1) ZA201706440B (sr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7048585B2 (ja) * 2016-09-22 2022-04-05 ソルボンヌ・ユニヴェルシテ 網膜変性疾患の処置に使用するための光遺伝学的に形質転換した光受容体前駆細胞
EP4367250A1 (en) * 2021-07-06 2024-05-15 Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel Promoter for specific expression of genes in rod photoreceptors

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002082904A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of treating or retarding the development of blindness
JP2009536219A (ja) * 2006-05-04 2009-10-08 ウェイン・ステート・ユニバーシティー ロドプシン拡散のインビボ送達による視覚応答の回復
CA2721635A1 (en) * 2008-04-18 2009-10-22 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Compositions comprising halorhodopsin
GB2498325B (en) * 2010-10-15 2018-05-02 Eos Neuroscience Inc Engineered human GRM6 enhancer sequence for use in eye therapies
US8957028B2 (en) * 2010-11-13 2015-02-17 Massachusetts Institute Of Technology Red-shifted opsin molecules and uses thereof
WO2012167109A2 (en) * 2011-06-03 2012-12-06 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Rpgrip1 gene therapy for leber congenital amaurosis
US20150038557A1 (en) * 2012-02-24 2015-02-05 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treatment of retinal degenerative diseases
CA2956707A1 (en) 2014-07-29 2016-02-04 Circuit Therapeutics, Inc. System and method for optogenetic therapy

Also Published As

Publication number Publication date
US20180030477A1 (en) 2018-02-01
KR20180012737A (ko) 2018-02-06
HK1248594A1 (zh) 2018-10-19
MX2017010772A (es) 2018-03-01
US20200377907A1 (en) 2020-12-03
DK3261679T3 (da) 2023-06-26
BR112017018062A2 (pt) 2018-04-10
US20250290096A1 (en) 2025-09-18
HUE062319T2 (hu) 2023-10-28
MY186444A (en) 2021-07-22
HK1248595A1 (en) 2018-10-19
SG10202005923WA (en) 2020-07-29
PT3261679T (pt) 2023-07-04
CY1126098T1 (el) 2023-11-15
ZA201706440B (en) 2021-06-30
AU2022201553B2 (en) 2024-08-15
NZ735735A (en) 2021-09-24
CN107530449A (zh) 2018-01-02
LT3261679T (lt) 2023-07-10
HRP20230775T1 (hr) 2023-10-27
KR102272466B1 (ko) 2021-07-02
JP6771474B2 (ja) 2020-10-21
PL3261679T3 (pl) 2023-09-04
CA2977464C (en) 2022-04-05
FI3261679T3 (fi) 2023-06-28
PH12017501525B1 (en) 2023-08-30
SG11201706822XA (en) 2017-09-28
AU2016225277A1 (en) 2017-10-12
EP3261679A1 (en) 2018-01-03
IL254066B (en) 2021-10-31
SMT202300200T1 (it) 2023-09-06
WO2016135457A1 (en) 2016-09-01
GB201503008D0 (en) 2015-04-08
AU2022201553A1 (en) 2022-03-31
JP2018506982A (ja) 2018-03-15
ES2947308T3 (es) 2023-08-04
IL254066A0 (en) 2017-10-31
PH12017501525A1 (en) 2018-02-05
CA2977464A1 (en) 2016-09-01
EA201791900A1 (ru) 2018-02-28
EP3261679B1 (en) 2023-05-03
SI3261679T1 (sl) 2023-09-29
AU2016225277B2 (en) 2021-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8470790B2 (en) Restoration of visual responses by in vivo delivery of rhodopsin nucleic acids
KR102763312B1 (ko) 치료적으로 유효한 양의 재조합 aav9- 유도 벡터의 망막하 전달을 포함하는 대상체의 원추 광수용체 내 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법
CN107429252B (zh) 优化的rpe65启动子和编码序列
US20250290096A1 (en) Gene therapy to improve vision
WO2016198627A1 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of alzheimer&#39;s disease
JP2020059719A (ja) 網膜色素変性症の治療
HK1248595B (en) Gene therapy to improve vision
VISION Gene Therapy To Improve Vision
NZ735735B2 (en) Gene therapy to improve vision
EA042590B1 (ru) Генная терапия для улучшения зрения
BR112017018062B1 (pt) Terapia genética para melhorar a visão
KR20250051697A (ko) 인간 원추형 광수용체 광유전학 작제물
Khabou Development of safe and efficient aav vectors for retinal gene therapy
Kolstad Development and assessment of gene therapies for inherited blinding diseases
HK40004342A (en) Restoration of visual responses by in vivo delivery of rhodopsin nucleic acids
Boye et al. Highly Efficient Delivery of AAV vectors to the Primate Retina
JP2017025008A (ja) 網膜色素変性症の治療