RS64461B1 - Farmaceutske formulacije pegilovanih lipozoma i faktora koagulacije krvi - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije faktora krvi za subkutanu primenu.

[0002] Tipično, faktori krvi su pripremljeni kao farmaceutske kompozicije za intravensku primenu. Kompozicije su zasnovane na aktivnom proteinu, često konjugovanom sa polimerom kao što je polietilen glikol (PEG) da bi se poboljšao poluživot u cirkulaciji. Stoga je intravenska primena PEGiliranih faktora krvi kao terapeutskih sredstava dobro shvaćena i široko prihvaćena. Poznate su i lipozomske formulacije golih (tj. nekonjugovanih i bez modifikacija) faktora krvi kao što su supstance faktora VIII i faktora IX, videti npr. WO 95/04524.

[0003] Farmaceutske kompozicije koje sadrže faktor VIII i lipozome modifikovane prisustvom polietilen glikola su opisane u WO 99/55306 kod kojih krvni faktor nije inkapsuliran u lipozomu. Međutim, formulacije su pripremljene za intravensku primenu. Dodatne formulacije drugih proteina su opisane u WO 2004/091723 gde proteini uključuju faktore zgrušavanja krvi. Za proteine se kaže da se vezuju za lipozome na nekovalentan način kroz interakciju sa polietilen glikolom prisutnim na površini lipozoma. Međutim, formulacije faktora zgrušavanja krvi pripremljene prema primerima ovog dokumenta su takođe za intravensku primenu.

[0004] Drugi primeri formulacija faktora krvi, faktora VIII i faktora VIIa, prisutnih kao konjugat sa PEG, prikazani su u WO 2011/135307 i WO 2011/135308 odnosno gde su stvarne pripremljene formulacije bile za intravensku primenu. WO 2013/156488 takođe opisuje dozni oblik modifikovanih terapeutskih sredstava, uključujući faktore krvi kao što su faktor VIII (FVIII) i faktor VIIa (FVIIa), za subkutanu primenu.

[0005] Takođe je utvrđeno da je faktor VIII sposoban da se poveže sa PEGiliranim lipozomima, tj. krvni faktor nije inkapsuliran unutar lipozoma (Baru et al Thromb. Haemost., 93, pages 1061-1068, (2005)). Međutim, kompozicije FVIII su pripremljene samo kao formulacije za intravensku primenu.

[0006] Dodatne studije od Peng et al u The AAPS Journal, 14(1), strane 25-42 (2011) otkrivaju alternativni pristup zasnovan na FVIII inkapsuliranom u lipozomima koji su naknadno PEGilirani pasivnim dodavanjem PEG lipozomima nakon pripreme. U jednom eksperimentu u Peng et al lipozomalna formulacija se primenjuje subkutano (SC) da bi se ispitala imunogenost, ali nema sugestije o terapeutskoj svrsi ove primene. U Peng et al postoji i konkretna referenca na rad Baru et al (2005) i izjava da je pristup Baru et al "izložiti FVIII komponentama plazme kao što su proteaze i IgG". Lipozomi pripremljeni po metodi Baru et al (2005) koji sadrže rekombinantni faktor VIII su primenjivani intravenski na subjekte (Spira et al Blood, 108 (12), strane 3668-3673 (2012)).

[0007] Trenutne metodologije za formulisanje faktora krvi za primenu oslanjaju se na intravenske načine primene. Ovo je problematično pošto pacijent neizbežno prima veliku bolusnu injekciju aktivnog sredstva u nekoliko vremenskih tačaka što dovodi do neujednačenog terapeutskog nivoa sredstva u krvi pacijenta.

[0008] Stoga postoji potreba za farmaceutskom kompozicijom krvnog faktora koji može da obezbedi bezbednu i efikasnu dozu.

[0009] U skladu sa ovim pronalaskom, obezbeđena je farmaceutska kompozicija za subkutanu primenu koja sadrži faktor krvi VIII i koloidnu česticu koja sadrži približno 0.5 do 20 molnih procenata amfipatskog lipida derivatizovanog sa biokompatibilnim hidrofilnim polimerom, pri čemu krvni faktor nije inkapsuliran u pomenutu koloidnu česticu. Kompozicija se primenjuje subkutano sa ponovljenom subkutanom primenom farmaceutske kompozicije pre nego što se koncentracija farmaceutske kompozicije u krvi smanji na subterapeutske nivoe.

[0010] Koloidne čestice mogu biti suštinski neutralne i polimer može da nosi u suštini nikakvo neto naelektrisanje. Koloidne čestice mogu imati srednji prečnik čestica između oko 0.03 do oko 0.4 mikrona (µm), na primer imaju srednji prečnik čestica od približno 0.1 mikrona (µm). Srednji prečnik čestica u ovom opsegu može povećati vreme cirkulacije čestica in vivo i sprečavaju njihovu adsorpciju od strane retikuloendotelnog sistema (RES).

[0011] Krvni faktor se može koristiti u liofilizovanom obliku prilikom pripreme farmaceutske kompozicije.

[0012] Kada kompozicija sadrži fragment krvnog faktora, faktor može prikladno biti njegov aktivni fragment u kome fragment zadržava biološku aktivnost, ili suštinski istu biološku aktivnost kao prirodni faktor krvi. Na primer, jedan takav aktivni fragment je skraćena sekvenca faktora VIII B-domena prikazana na slici 1.

[0013] Dalje je moguće da kompozicija može da sadrži i prirodni faktor krvi i njegov fragment.

[0014] Farmaceutska kompozicija pronalaska može takođe dodatno da sadrži drugo terapeutski aktivno jedinjenje ili molekul, npr. antiinflamatorni lek, analgetik ili antibiotik, ili drugo farmaceutski aktivno sredstvo koje može da stimuliše ili pojača aktivnost faktora VIIa,

[0015] Faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor Xa, faktor XI, faktor V, faktor XIII, von Willebrand-ov faktor (vWF), protrombin ili protein C, ili njihov fragment, kao što je na primer drugi faktor koagulacije krvi.

[0016] Termini Faktor VIIa (FVIIa) i Faktor VII (FVII) se takođe koriste naizmenično osim ako kontekst ne navodi drugačije. FVIII se koristi kao skraćenica za faktor VIII, FIX se koristi kao skraćenica za faktor IX, i tako dalje za sve faktore krvi opisane ovde mutatis mutandis.

[0017] Faktor koagulacije (zgrušavanja) krvi može biti iz bilo kog pogodnog izvora i može biti rekombinantni protein proizveden tehnologijom rekombinantne DNK korišćenjem molekularno bioloških tehnika ili sintetisan hemijski ili proizveden transgenski u mleku sisara, ili faktor može biti izolovan iz prirodnih izvora (npr. prečišćen iz krvne plazme). Pogodan faktor je faktor zgrušavanja krvi sisara, kao što je faktor zgrušavanja krvi čoveka. Reference na faktor zgrušavanja krvi uključuju faktor koagulacije krvi.

[0018] Kao što je gore pomenuto, svi faktori krvi su okarakterisani između ostalog svojstvom površinske adhezije. Ovo je neophodna karakteristika kaskade koagulacije koja zahteva da se enzimi i kofaktori prilepe na druge učesnike u kaskadi, na površinu trombocita i na tkivo na mestu povrede. Zaista, posebno je važno da krvni ugrušak ostane na mestu povrede i da se ne povlači da izazove opasnu trombozu. Ovo svojstvo predstavlja izazov u formulisanju lekova, jer će se krvni faktori kao što su VIIa, VIII i IX preterano lepiti na bilo koje staklene i plastične površine. U praksi, ovo je ublaženo širokom upotrebom polisorbata (npr. Tween<®>80).

[0019] Koloidne čestice pronalaska su tipično u obliku lipidnih vezikula ili lipozoma kao što je dobro poznato u tehnici. Reference na koloidne čestice u ovoj specifikaciji uključuju lipozome i lipidne vezikule osim ako kontekst ne navodi drugačije.

[0020] U koloidnim česticama, amfipatski lipid može biti fosfolipid iz prirodnih ili sintetičkih izvora. Amfipatski lipid može da sadrži približno 0.5 do oko 20 molnih procenata (%) čestica, na primer približno oko 1 do 20%, ili oko 1 do 6%, ili oko 3%.

[0021] Pogodni primeri takvih amfipatskih lipida uključuju fosfatidiletanolamin (PE), karbamat-vezani nenaelektrisani lipopolimer ili aminopropandiol distearoil (DS), ili njihove smeše. Pogodan primer fosfatidil etanolamina (PE) može biti 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin (DSPE). Svrha biokompatibilnog hidrofilnog polimera je da sterički stabilizuje SUV, čime se sprečava spajanje vezikula in vitro, i omogućavanje da vezikule izbegnu adsorpciju od strane RES in vivo.

[0022] Koloidne čestice mogu dalje da sadrže drugi amfipatski lipid dobijen bilo iz prirodnih ili sintetičkih izvora. Drugi amfipatski lipid može biti fosfatidilholin (PC). Pogodan primer fosfatidil holina (PC) može biti palmitoil-oleoil fosfatidil holin (POPC).

[0023] U takvom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija može biti sastavljena od koloidnih čestica koje sadrže palmitoil-oleoil fosfatidil holin (POPC) i 1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanol-amin (DSPE) u odnosu DSPE (DSPOPC) ) od 85 do 99:15 do 1. U nekim slučajevima, odnos POPC:DSPE može biti od 90 do 99:10 prema 1. U jednom primeru izvođenja, odnos POPC:DSPE može biti 97:3.

[0024] U alternativnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može biti dopunjena holesterolom.

[0025] Biokompatibilni polimer može imati molekulsku težinu između oko 500 do oko 5000 Daltona, na primer približno 2000 Daltona.

[0026] Biokompatibilni hidrofilni polimer koji se koristi prema pronalasku može biti izabran iz grupe koja se sastoji od polialkiletara, polimlečnih kiselina i poliglikolnih kiselina. Biokompatibilni hidrofilni polimer može biti polietilen glikol (PEG). Polietilen glikol kako se koristi u kompozicijama pronalaska može imati molekulsku težinu između oko 500 do oko 5000 daltona, na primer može imati molekulsku težinu od približno 1000, 2000 ili 3000 daltona. U jednom primeru izvođenja, molekulska težina PEG-a može biti 2000 daltona. Polietilen glikol može biti razgranat ili nerazgranat.

[0027] Primer pogodnog derivatizovanog amfipatskog lipida može biti 1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanol-amin-N-[poli-(etilenglikol)]. Ako PEG ima molekulsku težinu od 2000 Daltona, derivatizovani amfipatski lipid se može opisati kao 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin-N-[poli-(etilenglikol)-2000] (DSPE-PEG 2000).

[0028] Farmaceutska kompozicija može da sadrži bilo koji pogodan ekscipijens, pufer i/ili adjuvans. Primeri takvog ekscipijensa, pufera i/ili adjuvansa uključuju fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS), kalijum fosfat, natrijum fosfat i/ili natrijum citrat. Ostali biološki puferi mogu uključivati PIPES, MOPS itd.

[0029] Pogodne pH vrednosti za farmaceutsku kompoziciju uključuju sve opšte prihvatljive pH vrednosti za primenu in vivo, kao što je na primer pH 5.0 do pH 9.0, pogodno od pH 6.8 do pH 7.2, ili pH 7.0.

[0030] Predmetni pronalazači su iznenađujuće otkrili da se formulacije faktora krvi u vezi sa koloidnim česticama (lipozomima) derivatizovanim biokompatibilnim polimerom mogu uspešno primeniti subkutano i postići terapeutski efikasnu dozu krvnog faktora na subjekta koji pati od hemofilije. Pogodno, biokompatibilni polimer je polietilen glikol.

[0031] U primerima ovog pronalaska, PEG je ugrađen u lipozom tokom formiranja vezikula, pre povezivanja sa faktorom krvi. Veruje se da se specifične sekvence aminokiselina na faktoru krvi mogu nekovalentno vezati za karbamatne funkcije PEG molekula na spoljašnjoj strani lipozoma.

[0032] Iako postoji referenca u Peng et al (2011) na primenu lipozomskog FVIII na miševe subkutano (SK) sasvim je jasno da je ovo urađeno samo da bi se sagledala relativna imunogenost i da se nije smatralo održivom opcijom lečenja. Da bi ovo istakli, autori jasno navode na vrhu strane 41 da je „FVIII-PI/PEG dat intravenski, klinički put primene za FVIII“. Drugim rečima, Peng et al ne otkriva niti čak predlaže subkutanu primenu kao održivu opciju lečenja. Dalje, autori u Peng et al (2011) takođe navode na strani 40 da je njihov pristup „izrazito drugačiji“ od Baru et al (2005). Najnovije publikacije u ovoj oblasti stoga predstavljaju međusobno isključive i različite alternative ovom pronalasku.

[0033] Kao što je gore objašnjeno, lipozom ne inkapsulira faktor(e) krvi tako da se po želji mogu koristiti lipozomi manje veličine koji imaju duži poluživot in vivo, pošto ih ne uklanja retikuloendotelni sistem (RES). Aktivnost formulisanih faktora krvi nije narušena kao što je prikazano u Primerima sa utvrđenom punom aktivnošću in vitro i odmah nakon injekcije in vivo.

[0034] Faktori krvi su u nekovalentnoj interakciji sa polimernim lancima na spoljnoj površini lipozoma i ne sprovodi se nikakva hemijska reakcija da bi se aktivirali polimerni lanci, za razliku od kompozicije otkrivene u EP-A-0689428. Priroda interakcije između faktora krvi i lipozoma derivatizovanog biokompatibilnim hidrofilnim polimerom može biti bilo kojim nekovalentnim mehanizmom, kao što su jonske interakcije, hidrofobne interakcije, vodonične veze i Van der Waals-ova privlačenja (Arakawa, T. and Timasheff, S. N., Biochemistry 24: 6756- 6762 (1985); Lee, J. C. and Lee, L. L. Y., J. Biol. Chem. 226: 625-631 (1981)). Primer takvog polimera je polietilen glikol (PEG).

[0035] Za pripremu lipida koji formiraju vezikule, derivatizovanih hidrofilnim polimerima, mogu se koristiti različite poznate reakcije kuplovanja. Na primer, polimer (kao što je PEG) može da se derivatizuje u lipid kao što je fosfatidiletanolamin (PE) preko grupe cijanuričnog hlorida. Alternativno, zatvoren PEG može biti aktiviran sa karbonil diimidazol reagensom za kuplovanje, da bi se formiralo aktivirano jedinjenje imidazola. Jedinjenje vezano za karbamat se može dobiti reakcijom terminalnog hidroksila MPEG (metoksiPEG) sa p-nitrofenil hloroformatom da bi se dobio p-nitrofenil karbonat. Ovaj proizvod je zatim reagovao sa 1-amino-2,3-propandiolom da bi se dobio intermedijer karbamat. Hidroksilne grupe diola su acilirane da bi se dobio konačni proizvod. Slična sinteza, korišćenjem glicerola umesto 1-amino-2,3-propandiola, može se koristiti za proizvodnju proizvoda vezanog za karbonat, kao što je opisano u WO 01/05873. Druge reakcije su dobro poznate i opisane su, npr. u US 5,013,556.

[0036] Koloidne čestice (lipozomi) se mogu klasifikovati prema različitim parametrima. Na primer, kada se veličina i broj lamela (strukturni parametri) koriste kao parametri, onda se mogu opisati tri glavna tipa lipozoma: Multilamelarni vezikuli (MLV), mali jednoslojni vezikuli (SUV) i veliki unilamelarni vezikuli (LW).

[0037] MLV su vrste koje se spontano formiraju hidratacijom osušenih fosfolipida iznad njihovog gela u temperaturu prelaza faze tečne kristalne faze (Tm). Veličina MLV je heterogena i njihova struktura podseća na ljusku luka sa naizmeničnim, koncentričnim vodenim i lipidnim slojevima.

[0038] SUV se formiraju od MLV ultrazvukom ili drugim postupcima kao što su ekstruzija, homogenizacija pod visokim pritiskom ili mešanje sa visokim smicanjem i jednoslojni su. One su najmanje vrste sa visokim odnosom površine i zapremine i stoga imaju najmanju zapreminu hvatanja vodenog prostora prema težini lipida.

[0039] Treći tip lipozoma LUV ima veliki vodeni odeljak i jedan (jednolamelarni) ili samo nekoliko (oligolamelarnih) lipidnih slojeva. Dodatni detalji su otkriveni u D. Lichtenberg and Y. Barenholz, in "Liposomes: Preparation, Characterization, and Preservation, in Methods of Biochemical Analysis", Vol.33, pp.337 - 462 (1988).

[0040] Kako se ovde koristi, termin "punjenje" označava bilo koju vrstu interakcije biopolimernih supstanci koje se stavljaju, na primer, interakciju kao što je inkapsulacija, adhezija (na unutrašnji ili spoljašnji zid vezikule) ili ugradnja u zid sa ili bez ekstruzije biopolimernih supstanci.

[0041] Kako je ovde korišćen i naznačen gore, termin "lipozom" se odnosi na koloidne čestice i ima za cilj da uključi sve sfere ili vezikule bilo kog amfipatskog jedinjenja koja mogu spontano ili ne-spontano vezikulirati, na primer fosfolipide gde je najmanje jedna acil grupa zamenjena složenim estrom fosforne kiseline. Lipozomi mogu biti prisutni u bilo kom fizičkom stanju od staklastog do tečnog kristala. Većina triacilglicerida je pogodna, a najčešći fosfolipidi pogodni za upotrebu u ovom pronalasku su lecitini (takođe nazvani fosfatidilholini (PC)), koji su mešavine diglicerida stearinske, palmitinske i oleinske kiseline povezane sa holin estrom fosforne kiseline. Lecitin se nalazi u svim životinjama i biljkama kao što su jaja, soja i životinjska tkiva (mozak, srce i slično), a mogu se proizvoditi i sintetički. Izvor fosfolipida ili njegov postupak sinteze nisu kritični, može se koristiti bilo koji prirodni ili sintetički fosfatid.

[0042] Primeri specifičnih fosfatida su L-a-(distearoil) lecitin, L-a-(dipalmitoil) lecitin, L-afosfatidna kiselina, L-a-(dilauroil)-fosfatidna kiselina, L-a(dimiristoil) fosfatidna kiselina, L-a(diofatidiil)fosfatidna kiselina, DL-a (di-palmitoil) fosfatidna kiselina, L-a(distearoil) fosfatidna kiselina i različite vrste L-a-fosfatidilholina pripremljenih od mozga, jetre, žumanca, srca, soje i slično, ili sintetički, i njihove soli. Druge pogodne modifikacije obuhvataju kontrolisanu peroksidaciju unakrsnih linkera masnih acilnih ostataka u fosfatidilholinima (PC) i cviterjonskim amfipatatima koji formiraju micele sami ili kada se pomešaju sa PC kao što su alkil analozi PC.

[0043] Fosfolipidi mogu varirati u čistoći i takođe mogu biti hidrogenizovani u potpunosti ili delimično. Hidrogenacija smanjuje nivo neželjene peroksidacije i modifikuje i kontroliše temperaturu prelaza gela u tečnost/kristalnu fazu (Tm) što utiče na pakovanje i curenje.

[0044] Lipozomi se mogu "skrojiti" prema zahtevima bilo kog specifičnog rezervoara uključujući različite biološke tečnosti, održavaju svoju stabilnost bez agregacije ili hromatografskog odvajanja, i ostaju dobro dispergovani i suspendovani u ubrizganoj tečnosti. Fluidnost in situ promene zbog sastava, temperature, saliniteta, dvovalentnih jona i prisustva proteina. Lipozom se može koristiti sa ili bez bilo kojeg drugog rastvarača ili surfaktanta.

[0045] Generalno pogodni lipidi mogu imati sastav acilnog lanca koji je karakterističan, barem u pogledu prelazne temperature (Tm) komponenti acilnog lanca u PC jajetu ili sojinom zrnu, tj. jedan lanac je zasićen i jedan nezasićen ili su oba nezasićena. Međutim, nije isključena mogućnost korišćenja dva zasićena lanca.

[0046] Lipozomi mogu da sadrže druge lipidne komponente, sve dok one ne izazivaju nestabilnost i/ili agregaciju i/ili hromatografsko razdvajanje. Ovo se može utvrditi rutinskim eksperimentisanjem.

[0047] Biokompatibilni hidrofilni polimer može biti fizički pričvršćen za površinu lipozoma, ili umetnut u membranu lipozoma. Polimer stoga može biti kovalentno vezan za lipozom.

[0048] Poznati su i dostupni različiti postupci za proizvodnju modifikovanih lipozoma koji su unilamelarni ili multilamelarni (videti Lichtenberg i Barenholz, (1988)):

1. Tanak film fosfolipida se hidrira vodenim medijumom nakon čega sledi mehaničko mućkanje i/ili ultrazvučno zračenje i/ili ekstruzija kroz odgovarajući filter;

2. Rastvaranje fosfolipida u pogodnom organskom rastvaraču, mešanje sa vodenim medijumom praćeno uklanjanjem rastvarača;

3. Upotreba gasa iznad kritične tačke (tj. freona i drugih gasova kao što je CO2ili smeše CO2i drugi gasoviti ugljovodonici) ili

4. Priprema mešanih micela lipidnog deterdženta, a zatim snižavanje koncentracije deterdženata na nivo ispod njegove kritične koncentracije pri kojoj se formiraju lipozomi.

[0049] Generalno, takvi postupci proizvode lipozome sa heterogenim veličinama od oko 0.02 do 10 µm ili više. Pošto su za upotrebu u ovom pronalasku poželjni lipozomi koji su relativno mali i dobro definisane veličine, drugi korak obrade definisan kao "smanjenje veličine lipozoma" može se koristiti za smanjenje veličine i heterogenosti veličine suspenzija lipozoma.

[0050] Suspenzija lipozoma može biti dimenzionisana tako da se postigne selektivna distribucija veličine vezikula u opsegu veličine manjem od oko 5 µm, na primer < 0.4 µm. U jednom primeru izvođenja pronalaska, koloidne čestice imaju prosečni prečnik veličine čestica od oko 0.03 do 0.4 mikrona (µm), pogodno oko 0.1 mikrona (µm).

[0051] Lipozomi u ovom opsegu mogu se lako sterilisati filtracijom kroz odgovarajući filter. Manje vezikule takođe pokazuju manju tendenciju agregacije pri skladištenju, čime se smanjuju potencijalno ozbiljni problemi sa blokadom ili začepljenjem kada se lipozom ubrizgava intravenski ili subkutano. Konačno, lipozomi koji su smanjeni do submikronskog opsega pokazuju ravnomerniju distribuciju.

[0052] Nekoliko tehnika je dostupno za smanjenje veličine i heterogenosti veličine lipozoma, na način pogodan za ovaj pronalazak. Ultrazvučno zračenje suspenzije lipozoma, bilo standardnim kupatilima ili ultrazvukom sondom, dovodi do progresivnog smanjenja veličine do malih unilamelnih vezikula (SUV) veličine između 0.02 i 0.08 µm.

[0053] Homogenizacija je još jedan postupak koji se oslanja na smicanje energije za fragmentaciju velikih lipozoma u manje. U tipičnom postupku homogenizacije, suspenzija lipozoma se recirkuliše kroz standardni homogenizator za emulziju dok se ne uoče izabrane veličine lipozoma, tipično između oko 0.1 i 0.5 µm. U oba postupka, distribucija veličine čestica se može pratiti konvencionalnim određivanjem veličine čestica laserskim snopom.

[0054] Ekstruzija lipozoma kroz polikarbonatni filter sa malim porama ili ekvivalentnu membranu je takođe efikasan postupak za smanjenje veličine lipozoma na relativno dobro definisanu distribuciju veličine čiji je prosek u opsegu između oko 0.02 i 5 µm, u zavisnosti od veličine pora membrane.

[0055] Tipično, suspenzija se provlači kroz jednu ili dve naslagane membrane nekoliko puta dok se ne postigne željena distribucija veličine lipozoma. Lipozom se može ekstrudirati kroz sukcesivno manje membrane pora da bi se postiglo postepeno smanjenje veličine lipozoma.

[0056] Centrifugiranje i hromatografija na molekularnom situ su drugi postupci koji su dostupni za proizvodnju suspenzije lipozoma sa veličinom čestica ispod odabranog praga manjeg od 1 µm. Ova dva odgovarajuća postupka uključuju preferencijalno uklanjanje velikih lipozoma, umesto pretvaranja velikih čestica u manje. Prinosi lipozoma su shodno tome smanjeni.

[0057] Suspenzija lipozoma obrađena po veličini može se lako sterilisati prolaskom kroz membranu za sterilizaciju koja ima veličinu diskriminacije čestica od oko 0.4 µm, kao što je konvencionalni membranski filter dubine 0.45 µm. Lipozomi su stabilni u liofilizovanoj formi i mogu se rekonstituisati neposredno pre upotrebe apsorbovanjem u vodi.

[0058] Pogodni lipidi za formiranje lipozoma su opisani gore. Pogodni primeri uključuju, ali nisu ograničeni na fosfolipide kao što su dimiristoilfosfatidilholin (DMPC) i/ili dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), fosfolipide dobijene iz jaja i soje dobijene nakon delimičnog ili potpunog prečišćavanja, direktno ili praćeno delimičnim prečišćavanjem vodonikom.

[0059] Sledeća četiri postupka su opisana u WO 95/04524 i generalno su pogodna za dobijanje koloidnih čestica (lipozoma) koji se koriste u skladu sa ovim pronalaskom.

Postupak A

[0060]

- a) mešanje amfipatskih supstanci, kao što su lipidi pogodni za formiranje vezikula u organskim rastvaračima koji se ne mešaju sa vodom

- b) uklanjanje rastvarača u prisustvu čvrstog nosača, alternativno, osušene amfipatske supstance ili njihove smeše se mogu direktno koristiti u bilo kom obliku (prah, granulat itd.), - c) prenošenje proizvoda iz koraka b) u rastvor biopolimernih supstanci u fiziološki kompatibilnom rastvoru

- d) dodavanje organskog rastvarača koji ima svojstva rastvaranja ili dispergovanja, kao i - e) sušenje frakcije dobijene u koraku d) pod uslovima koji zadržavaju funkciju biopolimernih supstanci.

[0061] Prema koraku a) Postupka A amfipatske supstance pogodne za formiranje vezikula kao što su gore navedene se mešaju u organskom rastvaraču koji se ne meša sa vodom. Organski rastvarač koji se ne meša sa vodom može biti polarno-protični rastvarač kao što su fluorovani ugljovodonici, hlorovani ugljovodonici i slično.

[0062] U koraku b) postupka prema pronalasku rastvarač se uklanja u prisustvu čvrstog nosača. Čvrsti nosač može biti inertan organski ili neorganski materijal koji ima strukturu nalik na perle. Materijal neorganskog potpornog materijala može biti staklo, a organski materijal može biti teflon<™>ili drugi slični polimeri.

[0063] Korak c) Postupka A pronalaska je za uzimanje proizvoda iz koraka b) u rastvor supstanci koje se inkapsuliraju u fiziološki kompatibilan rastvor.

[0064] Fiziološki kompatibilni rastvor može biti ekvivalentan rastvoru natrijum hlorida do oko 1.5 težinskih. Takođe je moguće koristiti druge soli sve dok su fiziološki kompatibilne, npr. kao krioprotektant, npr. šećeri i/ili aminokiseline. Na primer, laktoza, saharoza ili trehaloza se mogu koristiti kao krioprotektant.

1

[0065] Izborno, između koraka a) i b) može se obezbediti korak inaktivacije virusa, sterilizacija, depirogenizacija, filtriranje frakcije ili slično iz koraka a). Ovo bi moglo biti korisno da bi se u ranoj fazi pripreme imao farmaceutski prihvatljivi rastvor.

[0066] Korak d) Postupka A je dodavanje organskog rastvarača koji ima svojstva solubilizacije ili dispergovanja.

[0067] Organski rastvarač može biti organski polarno-protični rastvarač koji se meša sa vodom. Takođe se mogu koristiti niži alifatični alkoholi koji imaju 1 do 5 atoma ugljenika u alkil lancu, kao što je tercijarni butanol (terc-butanol). Količina organskog polarno-protičnog rastvarača koji se meša sa vodom u velikoj meri zavisi od njegovog mešanja sa supstancom koja se stavlja u lipozome. Na primer, ako treba da se unese protein, gornja granica je određena količinom rastvarača koji utiče na aktivnost proteina. Ovo može jako da varira u zavisnosti od prirode supstance koja se puni. Na primer, ako faktor zgrušavanja krvi sadrži faktor IX, tada je količina od oko 30% terc-butanola, dok je za faktor VIII pogodna količina manja od 10% terc-butanola (faktor VIII je mnogo osetljiviji na uticaj terc-butanola). Procenat terc-butanola u ovim primerima je zasnovan na zapreminskom procentu izračunatom za konačnu koncentraciju.

[0068] Izborno, posle koraka d), može se izvršiti sterilizacija inaktivacije virusa i/ili porcionisanje frakcije dobijene posle koraka d).

[0069] Korak e) ovog pronalaska je sušenje frakcije dobijene u koraku d) pod uslovima koji zadržavaju funkciju supstance koja se puni. Jedan postupak za sušenje smeše je liofilizacija. Liofilizacija se može izvesti u prisustvu krioprotektanta, na primer, laktoze ili drugih saharida ili aminokiselina. Alternativno, može se koristiti isparavanje ili sušenje raspršivanjem.

[0070] Osušeni ostatak se zatim može uzeti u vodeni medijum pre upotrebe. Nakon preuzimanja čvrste supstance, ona formira disperziju odgovarajućih lipozoma. Vodeni medijum može da sadrži fiziološki rastvor i formirana disperzija može izborno biti propuštena kroz odgovarajući filter da bi se smanjila veličina lipozoma ako je potrebno. Pogodno, lipozomi mogu imati veličinu od 0.02 do 5 µm, na primer u opsegu od < 0.4 µm.

[0071] Lipozomi koji se mogu dobiti postupkom A pokazuju visoko opterećenje faktora krvi.

[0072] Farmaceutske kompozicije pronalaska takođe mogu biti intermedijerni proizvod koji se može dobiti izolacijom bilo koje frakcije iz koraka c) ili d) postupka A. Shodno tome, formulacija pronalaska takođe sadrži vodenu disperziju koja se može dobiti nakon uzimanja proizvoda iz koraka e) postupka A u vodi u obliku disperzije (lipozomi u vodenoj sredini).

[0073] Alternativno, farmaceutske kompozicije pronalaska se takođe mogu dobiti sledećim postupcima koji se označavaju kao Postupci B, C, D i E.

Postupak B

[0074] Ovaj postupak takođe sadrži korake a), b) i c) Postupka A. Međutim, korak d) i e) Postupka A su izostavljeni.

Postupak C

[0075] U postupku C korak d) postupka A je zamenjen ciklusom zamrzavanja i odmrzavanja koji se mora ponoviti najmanje dva puta. Ovaj korak je dobro poznat u stanju tehnike za proizvodnju lipozoma.

Postupak D

[0076] Postupak D isključuje upotrebu bilo koje osmotske komponente. U postupku D uključeni su koraci pripreme vezikula, mešanja i značajno oslobađanje od soli rastvora supstanci koji se sipa i zajedničko sušenje tako dobijenih frakcija.

Postupak E

[0077] Postupak E je jednostavniji od postupaka A - D opisanih gore. Zahteva rastvaranje jedinjenja koja se koriste za pripremu lipozoma (lipidni antioksidansi, itd.) u polarno-protičnom rastvaraču koji se meša sa vodom kao što je terc-butanol. Ovaj rastvor se zatim meša sa vodenim rastvorom ili disperzijom koja sadrži faktor krvi. Mešanje se vrši u optimalnom zapreminskom odnosu potrebnom za održavanje biološke i farmakološke aktivnosti sredstva.

[0078] Smeša se zatim liofilizuje u prisustvu ili odsustvu krioprotektanta. Pre upotrebe lipozomalne formulacije potrebna je rehidratacija. Ovi lipozomi su multilamelarni, njihovo smanjenje se može postići jednim od postupaka opisanih u WO 95/04524.

[0079] Pronalazak takođe uključuje postupke lečenja hemofilije A kod subjekta koji sadrže subkutanu primenu farmaceutske kompozicije ili doze kao što je ovde definisana na subjekta kome je to potrebno. Takvi postupci mogu uključiti, postupak lečenja hemofilije A kod subjekta gde je pacijent razvio antitela (tj. inhibitore) na faktor krvi.

[0080] Bolesti ili poremećaji zgrušavanja krvi mogu se okarakterisati gubitkom funkcije faktora zgrušavanja krvi ili stvaranjem auto-antitela. Primeri bolesti zgrušavanja krvi uključuju hemofiliju, kao što su hemofilija A i hemofilija B.

[0081] Ovaj pronalazak se stoga proširuje na farmaceutsku kompoziciju kao što je gore definisana za upotrebu u lečenju hemofilije A. Takve farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju hemofilije A mogu se koristiti tamo gde je pacijent razvio antitela na navedeni faktor krvi. Upotreba pronalaska u skladu sa ovim aspektom takođe uključuje upotrebu krvnog faktora u proizvodnji leka kao što je gore definisano za upotrebu u lečenju hemofilije A.

[0082] Faktor VIIa se može koristiti u lečenju epizoda krvarenja kod hemofilije A ili B, ili u lečenju pacijenata koji su razvili inhibitorna antitela protiv FVIII ili IX, respektivno. Faktor VIII se može koristiti u lečenju epizoda krvarenja kod pacijenata sa hemofilijom A, a faktor IX se može koristiti u lečenju pacijenata sa hemofilijom B.

[0083] Kako se ovde koristi, termin "tretman/lečenje" uključuje bilo koji režim koji može biti od koristi za čoveka ili sisara koji nije čovek. Tretman „sisara koji nisu ljudi“ proširuje se na tretman domaćih sisara, uključujući konje i kućne ljubimce (npr. mačke i pse) i životinja sa farmi/poljoprivrednih životinja uključujući članove porodica ovaca, koza, svinja, goveda i kopitara. Tretman može biti u vezi sa bilo kojim postojećim stanjem ili poremećajem, ili može biti profilaktički (preventivni tretman). Lečenje može biti nasledne ili stečene bolesti. Lečenje može biti akutnog ili hroničnog stanja.

[0084] Nivoi aktivnosti u kaskadi koagulacije krvi mogu se meriti bilo kojim odgovarajućim testom, na primer testom vremena zgrušavanja cele krvi (WBCT) ili aktivnim parcijalnim tromboplastinskim vremenom (APTT).

[0085] Test vremena zgrušavanja cele krvi (WBCT) meri vreme potrebno da puna krv formira ugrušak u spoljašnjem okruženju, obično staklenoj cevi ili posudi.

[0086] Test aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (APTT) meri parametar dela puta zgrušavanja krvi. Nenormalno je povišen kod hemofilije i intravenske terapije heparinom. Za APTT je potrebno nekoliko mililitara krvi iz vene. APTT vreme je mera jednog dela sistema zgrušavanja poznatog kao „intrinzični put“. APTT vrednost je vreme u sekundama da se desi određeni proces zgrušavanja u laboratorijskom testu. Ovaj rezultat se uvek upoređuje sa "kontrolnim" uzorkom normalne krvi. Ako testni uzorak traje duže od kontrolnog uzorka, to ukazuje na smanjenu funkciju zgrušavanja u unutrašnjem putu. Opšta medicinska terapija obično ima za cilj opseg APTT reda od 45 do 70 sekundi, ali vrednost se takođe može izraziti kao odnos testa i normale, na primer 1.5 puta normalan. Visok APTT u odsustvu lečenja heparinom može biti posledica hemofilije, što može zahtevati dalje testiranje.

[0087] Pronalazak takođe obezbeđuje komplet delova koji sadrži farmaceutsku kompoziciju pronalaska i vehikulum za davanje uključujući injekcioni rastvor za subkutanu primenu, pri čemu navedeni komplet prikladno sadrži uputstva za njegovu upotrebu.

1

[0088] Pronalazak stoga može takođe pogodno obezbediti dozni oblik farmaceutske kompozicije pronalaska. Takvi dozni oblici mogu biti obezbeđeni kao pogodni kontejneri ili bočice koje sadrže odgovarajuću dozu za pacijenta.

[0089] Farmaceutske kompozicije za subkutanu primenu ili dozni oblici prema pronalasku mogu se primenjivati sami ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima, kao što su terapeutska jedinjenja ili molekuli, npr. antiinflamatorni lekovi, analgetici ili antibiotici ili druga farmaceutski aktivna sredstva koja mogu da stimulišu ili pojačaju aktivnost faktora VIIa, faktora VII, faktora VIII, faktora IX, faktora X, faktora Xa, faktora XI, faktora V, faktora XIII, von Wilebrand-ovog faktora (vWF), protrombina ili proteina C, ili njihovog fragmenta, kao što je na primer drugi faktor koagulacije krvi. Takva primena sa drugim jedinjenjima može biti simultana, odvojena ili uzastopna. Komponente se mogu pripremiti u obliku kompleta koji može sadržati uputstva prema potrebi.

[0090] Farmaceutske kompozicije pronalaska omogućavaju poboljšano lečenje bolesti gde se krvni faktor primenjuje za lečenje pacijenta koji pati od hemofilije A.

[0091] U jednom primeru izvođenja pronalaska obezbeđena je farmaceutska kompozicija za subkutanu primenu koja sadrži faktor krvi i koloidnu česticu koja sadrži približno 1-20 molnih procenata amfipatskog lipida derivatizovanog biokompatibilnim hidrofilnim polimerom, farmaceutski prihvatljiv pufer, podešen na fiziološki pH pogodan za subkutanu primenu, pri čemu krvni faktor nije inkapsuliran u pomenutoj koloidnoj čestici.

[0092] Stručnjak razume da doza leka pronalaska zavisi od koncentracije efikasnih biopolimernih supstanci kao i njihove efikasnosti.

[0093] Doza do 2.000 mg/lipozomima lipida po kg telesne težine može se primeniti na pacijente kod kojih su aktivni faktori u lipozomima opterećeni efikasnošću većom od 50% na osnovu ukupne aktivnosti koja se koristi za pripremu napunjenih lipozoma.

[0094] Shodno tome, u sledećem aspektu ovog pronalaska, zapremina formulacije za isporuku pacijentu ne može biti veća od 2 ml. Pogodno, zapremina isporuke može biti 5 µl, 10 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 250 µl, 500 µl, 750 µl ili 1 ml. U alternativnim primerima izvođenja zapremina formulacije za isporuku ne može biti veća od 1.5 ml, 2 ml, 2.5 ml, 3.0 ml ili 3.5 ml.

[0095] Važno je napomenuti da ovaj pronalazak omogućava da se veća koncentracija aktivnog sredstva isporuči u jednoj potkožnoj injekciji bezbednije nego intravenskom injekcijom, pošto se ne isporučuje direktno u krvotok pacijenta. Ovo je posebno važno kada se radi o faktorima zgrušavanja krvi, jer visoka koncentracija faktora zgrušavanja krvi primenjenih intravenski može dovesti do neželjenih i opasnih krvnih ugrušaka kod pacijenta.

[0096] Subkutana isporuka omogućava stabilnu infuziju aktivnog sredstva u krvotok preko limfnog sistema, čime se izbegava efekat opasnih nivoa aktivnog sredstva koji se isporučuje direktno u krvni sistem. Zbog toga, pošto je koncentracija unošenja sredstva u krvotok regulisana limfnim sistemom pacijenta, veća koncentracija se može isporučiti u dozi za subkutanu primenu, što omogućava da se koriste manje količine nego što se tradicionalno koriste sa intravenskom primenom.

[0097] Formulacije pronalaska mogu biti za primenu najmanje jednom dnevno, najmanje dva puta dnevno, oko jednom nedeljno, oko dva puta nedeljno, oko jednom u dve nedelje ili oko jednom mesečno.

[0098] Za određene terapeutske supstance, režim doziranja od jednom dnevno će biti dovoljan, ali za druge može biti prikladniji ili poželjniji češći režim doziranja, gde količina koja se isporučuje u svakoj dozi koja se primenjuje subkutano može biti smanjena u odnosu na standardnu intravensku dozu. Tako, na primer, formulacija pronalaska može da se primenjuje jednom dnevno, dva puta dnevno (ili više ako je potrebno).

[0099] Ovaj pronalazak omogućava prevenciju brzog porasta i naknadnog pada (tj. "zub testere") koncentracije terapeutskog sredstva u krvi. Ovaj pronalazak obezbeđuje konzistentniju, predvidljivu koncentraciju sredstva u krvi pacijenta tokom dužeg vremenskog perioda nego što se to tradicionalno vidi kod standardnih farmaceutskih formulacija istog sredstva kada se više puta daje intravenski.

[0100] Dodatna prednost ovog pronalaska je da omogućava da se veća doza sredstva primeni subkutano nego što se može bezbedno primeniti intravenski. Ovo rezultira pružanjem dužeg trajanja terapeutske koristi nego što bi se obično i bezbedno moglo postići većim dozama ili češćim doziranjem intravenskom isporukom. Na primer, u slučaju krvnih faktora, pošto se proizvodi isporučuju preko torakalnog kanala u subklavijsku venu, postupak omogućava da se u jednoj vremenskoj tački primeni veća količina proizvoda u vidu pojedinačne doze subkutano nego što bi se mogla primeniti u jednoj vremenskoj tački intravenoski u venu. Unošenje velike doze bolusa u venu može izazvati neželjeni trombotički događaj.

[0101] Dodatna prednost ovog pronalaska je ta što omogućava da se terapeutsko sredstvo ponovo dozira u intervalima kako bi se omogućilo da se koncentracija sredstva u krvi održi na konzistentnom nivou, obezbeđujući trajni konstantan i predvidljiv terapeutski efekat bez potrebe da se čeka ponovo dozirati sve dok koncentracija sredstva u krvi ne padne na terapijski irelevantne nivoe. U tradicionalnoj praksi, intravensko ponovno doziranje faktora zgrušavanja krvi, sa svojim neposrednim Cmaxi početak dejstva, odlaže se dok se ne proceni da je nivo terapeutika pao na nivo na kome je dodavanje Cmaxod nove injekcije neće dostići potencijalno trombogeni nivo (tj. smanjenje rizika od neželjenog događaja), ali to znači da je pacijent

1

dostigao „nezdrav” opseg nivoa sredstva u svom krvotoku. Drugim rečima, naknadne doze sredstva se normalno ne daju pacijentu dok su "zdravi nivoi", ili terapeutski efikasni nivoi, sredstva i dalje prisutni u krvotoku. Međutim, ovaj pronalazak omogućava ponovno doziranje sredstva dok su nivoi sredstva u krvi i dalje u terapeutski efikasnom opsegu. Stoga pronalazak obezbeđuje konzistentniji terapeutski nivo proteina u krvotoku koji je idealniji za profilaksu. Zbog doslednog unošenja sredstva u krvotok preko torakalnog kanala, izbegava se problem povećanja sredstva u krvotoku do nepoželjno visokih nivoa.

[0102] Pronalazak obezbeđuje formulaciju za subkutanu primenu na subjekta koja omogućava subjektu da primi dozni oblik faktora zgrušavanja krvi dovoljan da održi vreme zgrušavanja cele krvi kod navedenog subjekta od najviše 20 minuta, drugim rečima za primenu ne više od jednom mesečno. Takođe je obezbeđena formulacija faktora koagulacije krvi za subkutanu primenu ne više od jednom mesečno pri čemu dozni oblik ima Cmaxod najmanje 10% i ne više od 90% u poređenju sa ekvivalentnim referentnim doznim oblikom kada se primenjuje intravenski, za upotrebu u lečenju poremećaja zgrušavanja krvi. Prikladno, Cmaxje od 20% do 80%, ili od 30% do 70%, ili od 40% do 60%.

[0103] Pod "ne više od" podrazumeva se da se dozni oblik može primenjivati češće od navedenog vremenskog perioda, ali to nije neophodno; efekat subkutane primene takvog doznog oblika znači da se efekti vide tokom vremenskog perioda. Međutim, zbog nižeg i doslednog Cmax, češće doziranje se može javiti bez neželjenih efekata na pacijenta.

[0104] Pogodno, dozni oblik faktora zgrušavanja krvi može biti dovoljan da održi vreme zgrušavanja cele krvi kod navedenog subjekta manje od 15 minuta, ili prikladno, manje od 12 minuta. U jednom primeru izvođenja, dozni oblik faktora zgrušavanja krvi je dozni oblik najmanje jednom nedeljno, ili najmanje jednom mesečno, najmanje jednom u dve nedelje, najmanje jednom u pola nedelje.

[0105] Takođe je obezbeđena dozna formulacija prema pronalasku, u kojoj je doza faktora zgrušavanja krvi od 1 do 1000 IU/kg, ili od 5 do 500 IU/kg, ili od 100 do 250 IU/kg, ili od 25 do 50 IU/kg, ili od 5 do 50 IU/kg.

[0106] Dozni oblik ovog pronalaska koji sadrži faktor zgrušavanja krvi omogućava ređe doziranje doznog oblika, koji je i dalje dovoljan da održi vreme zgrušavanja cele krvi kod subjekta ne više od 20 minuta, ili ne više od 15 minuta, ili ne više od 10 minuta. U jednom aspektu, dozni oblik je dovoljan da održi vreme zgrušavanja cele krvi manje od 12 minuta. Dozni oblik može da obezbedi ne više od jednom u dve nedelje, ne više od jednom nedeljno, ne više od dva puta nedeljno, ne više od jednom u tri dana, ne više od jednom u 2 dana, ne više od jednom dnevno ili više ili manje čest oblik doze.

1

[0107] Važno je napomenuti da je jedna od prednosti ovog pronalaska to što dozni oblik kada je sredstvo faktor zgrušavanja krvi, ne mora da se primenuje na pacijenta češće od ovih intervala da bi se nastavilo da se održava vreme zgrušavanja cele krvi u zdravom opsegu, ali se može primenjivati češće kako bi se obezbedilo "stabilno stanje" slično onom kod formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem. "Normalno" vreme zgrušavanja pune krvi se generalno smatra od 10 do 12 minuta od 10 do 12 minuta, a sve manje od 15 minuta se smatra zdravim kod ljudi koji nisu hemofilični. Kada vreme zgrušavanja cele krvi prelazi 20 minuta, smatra se da je u nezdravom opsegu. Između 15 i 20 minuta se smatra da ukazuje na to da iako je krvarenje pod kontrolom, ono nije normalno.

[0108] U sledećem primeru izvođenja, dozni oblik se primenjuje ređe nego što bi bilo predviđeno poluživotom u plazmi bolusne intravenske injekcije. Na primer, bolusna injekcija modifikovanog Faktora IX može biti potrebna jednom nedeljno, dok isto sredstvo koje se isporučuje subkutano u skladu sa pronalaskom može biti potrebno samo jednom u deset dana ili manje.

[0109] Prema dodatnom aspektu pronalaska, obezbeđen je dozni oblik farmaceutske kompozicije od 25 do 50 IU/kg faktora koagulacije krvi za subkutanu primenu na istoj ili sa manjom učestalošću od faktora koagulacije krvi koji se primenjuje intravenski.

[0110] Formulacije ovog pronalaska su stoga u stanju da održavaju normalnu vrednost za hemostazu do sedam dana u kojoj je normalna vrednost definisana kao vreme zgrušavanja cele krvi (WBCT) manje od 15 minuta, prikladno, oko 12 minuta ili manje.

[0111] Formulacije specifičnih primera izvođenja pronalaska u kojima formulacija sadrži faktor krvi mogu da sadrže dozu od 25 do 50 IU/kg. U nekim primerima izvođenja doza može biti 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 IU/kg. Doziranje može biti od 25 IU/kg do 30 IU/kg, 35 IU/kg do 40 IU/kg ili 40 IU/kg do 50 IU/kg.

[0112] Formulacije specifičnih primera izvođenja pronalaska u kojima formulacija sadrži faktor krvi mogu alternativno da sadrže dozu od 5 do 50 IU/kg. U nekim primerima izvođenja doza može biti 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 IU/kg. Doziranje može biti od 5 IU/kg do 10 IU/kg, 25 IU/kg do 30 IU/kg, 35 IU/kg do 40 IU/kg ili 40 IU/kg do 50 IU/kg.

[0113] U jednom primeru izvođenja, kada se dozni oblik priprema kao doza od 150 IU/kg, formulacija može biti pogodna za primenu jednom u dve nedelje na subjekta kome je to potrebno. Pogodno, formulacija može biti za primenu ne više od jednom u dve nedelje. Alternativno, doza se može pripremiti kao doza od 100 IU/kg

[0114] Prema primeru izvođenja pronalaska, formulacija pronalaska koja sadrži faktor zgrušavanja krvi može dovesti do održavanja normalne hemostaze najmanje jednu polovinu

1

nedelje.

[0115] Dozni oblici u skladu sa pronalaskom, kada se daju subkutano, rezultiraju manjim količinama modifikovanog faktora koagulacije (zgrušavanja) krvi koje su potrebne da bi se postigao isti terapeutski krajnji cilj, čime se obezbeđuju bezbedniji proizvodi za subjekte kojima je potrebno lečenje. U jednom primeru izvođenja polovina prilagođene doze modifikovanog faktora zgrušavanja krvi primenjenog intravenski je dovoljna da se postigne normalna hemostaza tokom najmanje jedne nedelje kod subjekata, posebno kod kojih je faktor koagulacije krvi faktor VIII. Pogodna vrednost za normalnu hemostazu je vreme zgrušavanja cele krvi (WBCT) od oko 12 minuta, kao što je gore opisano.

[0116] Formulacije pronalaska mogu prikladno da sadrže manje od polovine terapeutski efikasne količine prilagođene dozi referentne formulacije formulisane za intravensku primenu koja sadrži isti modifikovani faktor koagulacije krvi da bi se postigao isti terapeutski efekat.

[0117] Pronalazak stoga takođe obezbeđuje dozni oblik modifikovanog faktora koagulacije krvi za subkutanu primenu u kome dozni oblik sadrži 50% doze prilagođene količine potrebne za intravensku primenu da bi se postiglo isto trajanje efikasnog delovanja.

[0118] Formulacija pogodna za subkutanu primenu može se prikladno pripremiti kao vodena ili uglavnom vodena formulacija. Formulacija može da sadrži takve dodatne soli, konzervanse i stabilizatore i/ili ekscipijense ili adjuvanse po potrebi. Dozni oblici pronalaska mogu biti obezbeđeni kao anhidrovani praškovi spremni za ekstemporanu formulaciju u pogodnom vodenom medijumu.

[0119] Pogodno, takvi dozni oblici mogu biti formulisani kao puferovane vodene formulacije. Pogodni puferski rastvori mogu uključivati, ali nisu ograničeni na aminokiseline (na primer histidin), soli neorganskih kiselina i alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala, (na primer soli natrijuma, soli magnezijuma, soli kalijuma, soli litijuma ili soli kalcijuma - primeri kao natrijum hlorid, natrijum fosfat ili natrijum citrat). Druge komponente kao što su deterdženti ili emulgatori (na primer, Tween 80<®>ili bilo koji drugi oblik Tween<®>) mogu biti prisutni i stabilizatori (na primer benzamidin ili derivat benzamidina). Ekscipijensi kao što su šećeri (na primer saharoza) takođe mogu biti prisutni. Pogodne vrednosti za pH su fiziološki pH, npr. pH 6.8 do 7.4 ili pH 7.0. Tečni dozni oblici mogu biti pripremljeni spremni za upotrebu u takvim vehikulumima za primenu.

[0120] U jednom posebnom primeru izvođenja pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija za subkutanu primenu kao što sledi:

- 50 mM natrijum citrata

1

- pH 7.0

- 100 mM fosfolipidi - molarni odnos 97:3 palmitoil-oleoil fosfatidil holina (POPC) i 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin-N-[poli-(etilenglikol)-20-P000]-2000).

- Liofilizovani rFVIII (Helikate NexGen)

[0121] Pronalazak će sada biti dalje opisan putem pozivanja na sledeće primere koji su prisutni samo u svrhu ilustracije i ne smatraju se ograničenjima pronalaska.

Primer 1: Sinteza lipozoma

[0122] Mešani lipidi su pripremljeni od palmitoil-oleoil fosfatidil holina (POPC) i 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin-N-[poli-(etilenglikol)-2000] derivatizovanog sa PEG-2000 molekulom (PEG-2000 sa molekulskom težinom 2000 daltona) (DSPE-PEG 2000), kao što sledi:

Molekulska težina POPC: 760.08 g/mol

Molekulska težina DSPE-2kPEG: 2789.5 g/mol

[0123] Konačni preparat je imao koncentraciju od 100 mM fosfolipida. Smeša lipida od 15% tež./v je napravljena sa molarnim odnosom POPC:DSPE-2kPEG od 97:3. Sledeće su izmerene i pomešane:

2.04g POPC

0.232g DSPE-2kPEG

14.9 mL terc-butanola (otopljenog u vodenom kupatilu na 35°C), sve stavljeno u Schott bocu od 100 mL.

[0124] Smeša je održavana na 35°C u vodenom kupatilu i mešana povremeno dok se sve čvrste materije ne rastvore/disperguju. Konačni materijal je bila bistra bezbojna smeša. Smeša je zamrznuta na -80°C preko noći.

[0125] Operacija je održavana u haubi da bi se omogućilo zadržavanje tokom čišćenja nakon upotrebe osušenog/kondenzovanog rastvarača. Christ Alpha 1-2 LD sušač zamrzavanjem i vakuumska pumpa su zagrejani 20 minuta, a smrznuta smeša lipida/rastvarača je uklonjena iz skladištenja na -80°C i osušena preko noći.

1

[0126] Osušeni lipidi su izvučeni iz sušare sledećeg jutra. Pojavili su se kao suvi kristalni kolač. Za dalju obradu bio je potreban rastvor lipida od 100 mM. Količine prisutnih lipida izračunavaju se kao oko 82 µmola DSPE-2kPEG i 2.69 mmol POPC; dakle oko 2.77 mmol lipida. Stoga je bilo potrebno 27.7 mL razblaživača. 27.7 mL 50 mM natrijum citratnog pufera je dodato osušenim lipidima, a rezultujuća smeša je mešana i zagrejana do oko 35°C. Posle oko 120 minuta, nastala je bela emulzija bez očiglednih velikih čvrstih materija. Ovo je podvrgnuto ekstruziji kao u nastavku.

[0127] Sartorius kućište za filtriranje pod pritiskom od nerđajućeg čelika od 47 mm je sastavljeno i umotano u vodeni omotač (umotane cevi koje se napajaju preko termocirkulatora) održavane na 35°C. Kućište je opremljeno polikarbonatnom membranom urezanom u traci (detalji ispod), prekrivenom predfilterom od staklenih vlakana (Whatman GF/D). Emulzija je sipana u kućište i ekstrudirana pod gasom azota od 4 bara, a filtrat je sakupljen u epruvete od 50 mL. Trajanje svake ekstruzije je vremenski određeno i zabeleženo.

[0128] Redosled filtracije je bio: 0.8 µm, 0.4 µm, 0.2 µm, 0.2 µm, 0.1 µm i 0.1 µm (tj. jedan prolaz kroz veće filtere i dva prolaza kroz manje filtere od 0.2 i 0.1 µm), pri čemu je filtrat ponovo zagrejan do 35°C između prolaza. Lipozomi su ekstrudirani, a tabelarni podaci su ispod:

Tabela 1

[0129] Dobijeni ekstrudirani lipidi su čuvani na 5°C. 15 mL 'ekstrudiranih lipozoma' je uklonjeno iz ohlađenih zaliha i raspoređeno u sterilnu epruvetu od 50 mL unutar mikrobiološkog sigurnosnog kabineta. Veličina ekstrudiranih liposoma je analizirana korišćenjem fotonskog korelacionog spektrometra ALV5000. Prosečan radijus je određen na 75.40 ± 0.86 nm, a prosečna širina pika 22.21 ± 3.86 nm, dajući prosečni prečnik od 150.80 nm i indeks polidisperznosti od 0.087.

2

Primer 2: Farmakokinetika/farmakodinamika rekombinantnog humanog FVIII rekonstituisanog sa PEGiliranim lipozomima kod pasa sa hemofilijom A nakon subkutane primene

[0130] Pas sa hemofilijom A (identifikovan kao pas broj "1") primio je subkutane doze PEGiliranih lipozoma povezanih sa faktorom VIII (PEGLip FVIII SQ), kako sledi:

Ciljevi ove studije su bili da se odrede PK i PD kod psa sa hemofilijom rFVIII pune dužine rekonstituisanog u PEGiliranim lipozomima koji su primenjeni subkutano (SQ).

rFVIII pune dužine

[0131] Liofilizovani rFVlll pune dužine (Helixate NexGen, serija 270LR8VB) je korišćen kao test artikal.

Formulacija PEGiliranih lipozoma

[0132] PEGilovani lipozomi u citratnom puferu su proizvedeni u skladu sa Primerom 1 iznad prema metodi Baru et al. (2005). Formulacija lipozoma je imala sledeći sastav; 50 mM natrijum citrata pH 7.0 koji sadrži 100 mM fosfolipida; koji sadrži smešu sa molarnim odnosom 97:3 palmitoil-oleoilfosfatidilholina (POPC) i 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin-N-[poli-(etilenglikol)-2000] (DSPE-PEG).

[0133] Eksperimentalni testirani subjekat pas bio je iz kolonije hemofilije A smeštene na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Alabami. Svi psi imaju urođenu tešku hemofiliju A. Ispitanik je bio težak 16.4 kg i nije bio naivan na ljudske proteine.

[0134] Pre doziranja, pas je testiran da bi se potvrdilo normalno zdravstveno stanje, uključujući kompletnu hemiju krvi, hemijski profil seruma fibrinogen, peptide izvedene iz fibrinogena (FDP), trombinsko vreme i analizu urina.

[0135] Dizajn ove studije bio je ispitivanje izvodljivosti jedne SQ doze na jednoj osobi.

[0136] Rekombinantni humani FVIII pune dužine (Helixate NexGen, 2,000 IU) je rekonstituisan sa 13.3 ml PEGiliranog lipozomalnog razblaživača. Rekonstituisani rFVIII je lagano mešan na sobnoj temperaturi 5-10 min da bi se omogućilo da se protein adsorbuje na lipozome pre upotrebe. Jednom rekonstituisana, suspenzija je imala aktivnost FVIII od 150 IU/ml.

[0137] Ispitaniku je dozirana SQ od 100 IU/kg. Izračunavanje zapremine leka za primenu obavljeno je prema sledećoj jednačini:

Zapremina doze (ml) = (a x b)/c

Gde:

a je ciljna doza (100 IU/kg)

b je težina psa (kg)

c je aktivnost rFVIII (150 IU/ml)

[0138] Nakon doziranja, ispitivana životinja je posmatrana zbog kliničkih znakova. Neočekivana toksičnost je proverena izvođenjem CBC i hemijskih testova seruma 48 sati i 5 dana nakon doze. Fibrinogen, FDP i trombinsko vreme (TT) su procenjeni da bi se testirao povećan rizik od tromboze.

[0139] Uzorci krvi (5 ml) uzeti su od psa koji je dozirao SQ u sledećim vremenskim tačkama nakon primene:

Primena pre leka i 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 i 120 sati nakon doze.

[0140] Puna krv (ne-citrirana; 1 ml) je korišćena za test zgrušavanja cele krvi i test aktiviranog vremena zgrušavanja. Preostali uzorci krvi od 4 ml su prebačeni u epruvete koje sadrže 0.109 M tri-natrijum citrat antikoagulans (9:1 v/v) na ledu.

[0141] Testovi aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT), aktiviranog vremena zgrušavanja (ACT) i tromboelastograma (TEG) su sprovedeni na citratoj punoj krvi.

[0142] Plazma je pripremljena centrifugiranjem preostale citrirane krvi i dobijeni uzorci plazme su čuvani u alikvotima od približno 100 µl na -80°C.

Testovi

(i) Necitrirana puna krv: test zgrušavanja pune krvi

[0143] Uzorci krvi su podeljeni između 2 vakuumske epruvete (2 X 0.5 ml) i pažljivo posmatrani uz periodično i razumno nivelisanje epruvete sve dok se ugrušak nije utvrdio prekidom protoka u potpuno horizontalnom položaju. Kvalitet ugruška je posmatran držanjem epruvete u potpuno obrnutom položaju. Vreme zgrušavanja cele krvi je zabeleženo kao srednja vrednost ukupnog vremena od ekstrakcije uzorka do vizuelnog posmatranja krvnog ugruška za oba uzorka i zabeležen je kvalitet ugruška u obrnutom položaju.

(ii) Citrirana puna krv: tromboelastogramski (TEG) test

[0144] TEG je izveden sa ponovo kalcifikovanom citranom punom krvlju korišćenjem tromboelastografa Hemostasis Analyzer Model 5000 (Haemoscope Corporation) prema preporukama proizvođača. Ukratko, 1 ml citrirane pune krvi stavljen je u komercijalno dostupnu (Teg<®>Hemostasis System Kaolin, Haemonetics) bočicu koja sadrži kaolin. Mešanje je obezbeđeno blagim okretanjem bočica koje sadrže kaolin 5 puta. Igle i čaše su stavljene u TEG analizator u skladu sa standardnim postupkom koji je preporučio proizvođač. Svaka standardna TEG šolja je stavljena u prethodno zagrejan držač za instrumente na 37°C i napunjena sa 20 µl kalcijum hlorida (0.2 M). Zatim je dodato 340 µl citrirane pune krvi aktivirane kaolinom za ukupnu zapreminu od 360 µl.

(iii) Aktivirano vreme zgrušavanja (ACT) i aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (aPTT)

[0145] ACT i aPTT testovi su sprovedeni korišćenjem Haemachron Jr koagulacionog analizatora (International Technidyne Corps.) prema uputstvima proizvođača.

(iv) Plazma: analiza aktivnosti FVIII (hromogena)

[0146] Aktivnost plazme FVIII je određena korišćenjem Coatest testa (Dia Pharma, West Chester, OH). Uzorci plazme su razblaženi 1:20 do 1:80 sa razblaživačem za analizu i analizirani prema uputstvima proizvođača. Standardne krive su uspostavljene korišćenjem referentne plazme normalne hemostaze (american diagnostica inc, Stamford, CT) i prečišćenog PEG-FVIII proteina.

(v) Plazma: ELISA FVIII

[0147] Koncentracija FVIII antigena u uzorcima plazme biće određena pomoću ELISA korišćenjem kompleta antigena Visulize FVIII od Affinity Biologicals (Ancaster, Ontario, Kanada) prema uputstvima proizvođača.

2

(vi) Plazma: Imunogenost

[0148] Bethesda testovi su sprovedeni na 1:4, 1:10 i 1:20 razblaženjima test plazme u humanoj plazmi sa nedostatkom FVIII. Jednake zapremine razblažene test plazme i normalne ljudske referentne plazme su inkubirane na 37°C tokom 2 sata i Bethesda titar je određen korišćenjem aPTT testa i standardne krive ljudske plazme kao što je gore opisano.

Tabela 2

[0149] Rezultati studije su prikazani u tabeli 3.

3 ela ab T

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju pacijenata koji boluje od hemofilije A koja sadrži faktor krvi VIII i koloidnu česticu, pri čemu koloidna čestica sadrži oko 0.5 do 20 molnih procenata amfipatskog lipida derivatizovanog sa biokompatibilnim hidrofilnim polimerom, pri čemu koloidna čestica je suštinski neutralna i polimer u suštini ne nosi neto naelektrisanje, pri čemu krvni faktor nije inkapsuliran u navedenoj koloidnoj čestici, pri čemu se kompozicija primenjuje subkutano i pri čemu se ponovljena subkutana primena farmaceutske kompozicije izvodi pre nego što se koncentracija farmaceutske kompozicije u krvi smanjuje do subterapeutskih nivoa.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što koloidna čestica ima srednji prečnik čestice između oko 0.03 do oko 0.4 mikrona (µm); izborno pri čemu koloidna čestica ima srednji prečnik čestice od približno 0.1 mikrona (µm).

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačena time što navedeni amfipatski lipid je fosfolipid iz prirodnih ili sintetičkih izvora; izborno pri čemu navedeni amfipatski lipid je fosfatidiletanolamin (PE).

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačena time što navedeni amfipatski lipid je nenaelektrisani lipopolimer povezan sa karbamatom; izborno pri čemu navedeni amfipatski lipid je aminopropandiol distearoil (DS).

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što navedene koloidne čestice dalje sadrže drugi amfipatski lipid dobijen bilo iz prirodnih ili sintetičkih izvora; izborno pri čemu navedeni drugi amfipatski lipid je fosfatidilholin.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 5, naznačena time što koloidna čestica sadrži palmitoil-oleoil fosfatidil holin (POPC) i 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin (DSPE) u odnosu (POPC:DSPE) od 85 do 99:15 do 1; izborno pri čemu odnos POPC:DSPE je od 90 do 99:10 do 1; izborno pri čemu odnos POPC:DSPE je 97:3.

7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 5, naznačena time što je holesterol dodat kompoziciji.

2

8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, naznačena time što je navedeni biokompatibilni hidrofilni polimer izabran iz grupe koja se sastoji od polialkiletara, polimlečnih kiselina i poliglikolnih kiselina; izborno pri čemu navedeni biokompatibilni hidrofilni polimer je polietilen glikol.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, naznačena time što polietilen glikol ima molekulsku težinu između oko 500 do oko 5000 daltona; izborno pri čemu polietilen glikol ima molekulsku težinu od približno 2000 daltona.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8 ili zahtevu 9, naznačena time što derivatizovani amfipatski lipid je 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin-N-[poli-(etilenglikol)]; izborno pri čemu derivatizovani amfipatski lipid je 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amin-N-[poli-(etilenglikol)-2000] (DSPE-PEG 2000).

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10, naznačena time što kompozicija dodatno sadrži još jedno terapeutski aktivno jedinjenje.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 11, naznačena time što je navedeni pacijent razvio antitela na faktor krvi.