RS64503B1 - Lactobacillus reuteri mm4-1a za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja autističnog spektra - Google Patents

Lactobacillus reuteri mm4-1a za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja autističnog spektra

Info

Publication number
RS64503B1
RS64503B1 RS20230719A RSP20230719A RS64503B1 RS 64503 B1 RS64503 B1 RS 64503B1 RS 20230719 A RS20230719 A RS 20230719A RS P20230719 A RSP20230719 A RS P20230719A RS 64503 B1 RS64503 B1 RS 64503B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mhfd
social
reuteri
formulation
offspring
Prior art date
Application number
RS20230719A
Other languages
English (en)
Inventor
Mauro Costa-Mattioli
Shelly Alexandra Buffington
Original Assignee
Baylor College Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baylor College Medicine filed Critical Baylor College Medicine
Publication of RS64503B1 publication Critical patent/RS64503B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/02—Suppositories; Bougies; Bases therefor; Ovules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/173—Reuteri
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Otkriće se odnosi najmanje na oblasti ćelijske biologije, molekularne biologije, biohemije, neurologije, ponašanja, gastroenterologije i medicine.
STANJE TEHNIKE
[0002] Nedavni dokazi ukazuju na to da izloženost gojaznosti majke in utero negativno utiče na organizaciju i sazrevanje neuronskih kola koja su neophodna za razvoj mentalnog zdravlja deteta. Zaista, gojaznost majke i/ili nezdrava ishrana majke značajno povećava rizik od neurorazvojnih poremećaja, uključujući poremećaj autističnog spektra (ASD) kod dece (Bolton and Bilbo, 2014; Connolly et al., 2016; Krakowiak et al., 2012; Sullivan et al., 2014). S obzirom na istovremeni porast prevalencije kako gojaznosti (Skinner and Skelton, 2014) tako i ASD (Zablotsky et al., 2015), korisno je razumeti odnos između ta dva.
[0003] Količina i vrsta prehrambenih makronutrijenata snažno utiču na crevnu mikrobiotu (Tremaroli and Backhed, 2012), koja se sastoji od ogromne bakterijske zajednice koja boravi u donjem delu creva i živi u simbiotskom odnosu sa domaćinom. Prema tome, gojaznost majke je povezana sa promenama u crevnom mikrobiomu kod potomaka kako kod humanih tako i kod nehumanih primata (Galley et al., 2014; Ma et al., 2014). Pored toga, osobe sa ASD često imaju istovremeno poremećaje ponašanja, gastrointestinalne probleme i disbiozu crevne mikrobiote (Kohane et al., 2012; Mayer et al., 2014; Parracho et al., 2005). S obzirom na veliku količinu pretkliničke literature koja podržava ideju da dvosmerni komunikacioni sistem između creva i mozga, poznat kao osovina creva i mozga, povezuje aktivnosti creva i mozga (Cryan and Dinan, 2012; Mayer et al., 2015), spekuliše se da promene u mikrobiomu creva mogu dovesti do ASD i srodnih neurobihejvioralnih poremećaja (Mayer et al., 2014). Međutim, ostaje nepoznato kako promene u bakterijama koje nastanjuju naše crevo mogu uticati na razvoj i funkciju mozga kod ASD.
[0004] Ovo otkriće zadovoljava davnu potrebu u tehnici za lečenje neuroloških i neurobihejvioralnih poremećaja.
[0005] US 2014/363410 odnosi se na upotrebu Lactobacillus reuteri DSM 17938 za stimulisanje uspostavljanja zdrave i normalne kognitivne funkcije kod mladih sisara.
KRATAK REZIME
[0006] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Naročito, pronalazak obezbeđuje formulaciju koja sadrži Lactobacillus reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475) i/ili njegov bioaktivni ekstrakt ili frakciju za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije jednog ili više deficita socijalnog ponašanja kod individue sa poremećajem autističnog spektra, koji sadrži korake obezbeđivanja individui i/ili majci tokom gestacije individue terapeutski efikasne količine formulacije.
[0007] Ovde su otkriveni postupci i kompozicije za lečenje i/ili prevenciju medicinskog stanja kod koga najmanje jedan simptom je deficit socijalnog ponašanja ili pri čemu stanje je neurorazvojni, psihijatrijski i neurodegenerativni poremećaj. Iako je svako zdravstveno stanje koje ima deficit socijalnog ponašanja obuhvaćeno za ovo otkriće, u specifičnim aspektima medicinsko stanje je razvojni poremećaj, uključujući neurorazvojni poremećaj.
[0008] Individua može imati narušeno socijalno ponašanje bilo koje vrste. U pronalasku, neurorazvojni poremećaj je poremećaj autističnog spektra (ASD) koji je uzrokovan sredinom (ishrana, infekcija patogenom, izloženost toksinima, pesticidima, itd.) ili genetskim faktorima (mutacije u genima povezanim sa ASD i drugim neurološkim poremećajima), starošću oca/majke i prevremenim rođenjem, ili bilo koja kombinacija ovih faktora. U specifičnim primerima izvođenja, individua je rođena od majke koja je gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili je na ishrani sa visokim sadržajem masti, podvrgnuta je imunološkoj aktivaciji tokom trudnoće, iako je u nekim slučajevima individua rođena od majke koja nije bila gojazna, nema prekomernu težinu i/ili nije na ishrani sa visokim sadržajem masti. U drugim slučajevima, individua (majka ili roditelj) nosi mutacije povezane sa neurorazvojnim poremećajima. U drugim slučajevima, majka ili individua pokazuju izmenjenu mikrobiotu creva ili pokazuju promenu nivoa oksitocina.
[0009] U određenim aspektima, individui kojoj je potrebno lečenje i/ili prevencija deficita socijalnog ponašanja, neurorazvojnih, psihijatrijskih i neurodegenerativnih poremećaja bilo kog uzroka, obezbeđena je efikasna količina jedne ili više vrsta bakterija za lečenje i/ili prevenciju jednog ili više deficita socijalnog ponašanja. U nekim aspektima tretman dovodi do poboljšanja deficita socijalnog ponašanja, i u specifičnim aspektima rezultuje poboljšanjem deficita socijalnog ponašanja do unutar normalnog spektra.
[0010] Određeni aspekti otkrića predviđaju modifikovanje crevnog mikrobioma individue da bi se poboljšao jedan ili više deficita socijalnog ponašanja, neurorazvojnih i/ili psihijatrijskih poremećaja kod individue. Ostali aspekti otkrića predviđaju modifikovanje crevnog mikrobioma individue da bi se poboljšao neurorazvojni poremećaj kod individue. U specifičnim slučajevima, nivo najmanje jednog mikroba u crevnom mikrobiomu je promenjen da bi se poboljšao jedan ili više deficita socijalnog ponašanja. U nekim slučajevima, individua može ili ne mora biti rođena od majke koja je bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili koja je bila na ishrani sa visokim sadržajem masti. U specifičnim aspektima, bakterija je iz roda Lactobacillus. U drugim aspektima, individua nosi mutaciju(e) povezane sa neurorazvojnim poremećajima. U posebnim aspektima, vrsta Lactobacillus je L. reuteri, i L. reuteri može biti isporučena kao jedna vrsta ili kao jedna od više vrsta nepatogenih bakterija. U pronalasku, vrsta Lactobacillus je L. reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475). Individua čija su majka ili otac gojazni, sa prekomernom telesnom težinom i/ili koji su bili na ishrani sa visokim sadržajem masti ili individua koja nosi mutacije povezane sa neurorazvojnim poremećajima, može dobiti efikasnu količinu L. reuteri pre i/ili posle rođenja. U nekim slučajevima, trudnica može dobiti efikasnu količinu L. reuteri, naime L. reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475), i u takvim slučajevima njenom potomstvu se može obezbediti efikasna količina L. reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475) pre i/ili posle rođenja. Fetus može imati poboljšanje crevnog mikrobioma nakon što majka primi jednu ili više bakterija, na primer kroz placentu i/ili cirkulaciju krvi.
[0011] Primeri izvođenja otkrića obezbeđuju da rekonstitucija specifičnog mikrobioma preokreće sinaptičke deficite izazvane ishranom majke kao dodatak ili alternativa deficitima socijalnog ponašanja kod potomaka. Potomstvo može da se odnosi na rođenje jednog potomka ili rođenje višestrukih potomaka iz višestruke trudnoće. Osoba može biti bilo koje rase ili pola, a majka može biti bilo kog uzrasta, rase ili pola.
[0012] U jednom primeru izvođenja obezbeđena je formulacija koja sadrži Lactobacillus reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475) za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije jednog ili više deficita socijalnog ponašanja kod individue sa poremećajem spektra autizma, koji sadrži korake obezbeđivanja individui i/ili majci tokom gestacije individue terapeutski efikasne količine formulacije. U specifičnom primeru izvođenja, kada je formulacija obezbeđivana individui, majka individue je bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili na ishrani sa visokim sadržajem masti tokom gestacije sa individuom. U nekim primerima izvođenja, formulacija se obezbeđuje majci tokom gestacije individue. U specifičnim primerima izvođenja, deficit socijalnog ponašanja sadrži smanjenu društvenost, preferenciju za socijalnu novinu, poteškoće u društvenoj upotrebi verbalne i neverbalne komunikacije, ili njihovu kombinaciju. Individua ima poremećaj autističnog spektra. U nekim primerima izvođenja pronalaska, postupak dalje sadrži korak identifikacije da majka jeste ili je bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom, i/ili na ishrani sa visokim sadržajem masti tokom gestacije sa individuom i pri čemu se formulacija obezbeđuje individui ili majci sa namerom za lečenje ili prevenciju deficita socijalnog ponašanja kod individue. U specifičnim slučajevima, individua koja je rođena ili koju je nosila majka koja jeste ili je bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili na ishrani sa visokim sadržajem masti može se posebno prepoznati da joj je potrebno lečenje sa Lactobacillus, kao što je L. reuteri. U određenim aspektima, na majku i/ili dete se primenjuje Lactobacillus za lečenje, ali Lactobacillus nije L. acidophilus u obliku jogurta.
[0013] Bilo koja formulacija za upotrebu u pronalasku može da sadrži dodatne vrste bakterija ili kvasac.
[0014] Ovde je takođe opisan tretman ili prevencija jednog ili više poremećaja u kojima je oksitocinergički sistem disfunkcionalan. Ovde je takođe opisana prevencija ili lečenje jednog ili više stanja u kojima su dopaminergički sistem i sistem nagrađivanja uzurpirani ili disfunkcionalni.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0015]
Sl. 1A-1J: Socijalni deficiti i disbioza crevne mikrobiote kod MHFD potomaka. Sl. 1A, Šema režima ishrane majke i ploda. Sl.1B, Šema zadatka recipročne socijalne interakcije. Sl.
1C-1D, MHFD potomci su pokazali smanjenu recipročnu interakciju (1C, P<0.0001, t=7.90; D, P<0.001, t=5.89). Sl.1E, Šema zadatka socijalne interakcije u tri komore. Sl.1F-1G, U testu društvenosti, MRD potomci su proveli više vremena u interakciji sa mišem nego sa praznim žičanim kavezom (Sl. 1F, P<0.0001, t= 8.817), dok MHFD potomci nisu pokazali sklonost prema mišu (Sl. 1F, P=0.48, t=1.19; Efekat ishrane majke F1,52=6.08, P<0.05). U testu socijalne novine, za razliku od MRD (Sl. 1G, P<0.0001, t=6.68), MHFD potomci nisu imali preferenciju za interakciju sa novim u odnosu na poznatog miša (Sl. 1G, P=0.086, t=2.08; Efekat ishrane majke F1,52=34.96, P<0.0001). Sl. 1H-1I, Reprezentativna istraživačka delatnost MRD (Sl. 1H) i MHFD (Sl. 1I) potomstva u trokomornom testu. Sl. 1J, Analiza glavnih koordinata (PCoA) neponderisanih UniFrac udaljenosti od prosečnog skupa podataka gena 16S rRNK (n=1000 razređivanja; 7.617 očitavanja/uzorku) pokazalo je da su MRD uzorci grupisani odvojeno od MHFD uzoraka (P<0.001, R2=0.37). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM. Videti takođe Sl.8A-8G - 11A-11B.
Sl. 2A-2G: Zajednički smeštaj MHFD sa MRD potomtsvom spašava kako socijalnu disfunkciju tako i filogenetski profil mikrobiote MHFD miševa. Sl.2A, Šema eksperimenta sa zajedničkim smeštajem. Sl.2B, MRD i MHFD potomci su razdvojeni od majke u jednu od tri kompozicije kaveza. Sl.2C-2G, Vreme socijalne interakcije (Sl.2C, MRD naspram MHFD P<0.001, t=9.30; MRD naspram zajedno smeštenih MHFD P>0.99, t=0.31; MHFD naspram zajedno smeštenih MHFD P<0.001, t=7.99; P<0.0001, F3,8=30.51) i trajanje kontakta (Sl.2D, MRD naspram MHFD P<0.05, t=4.13; MRD naspram zajedno smeštenih MHFD P>0.99, t=0.46; MHFD naspram zajedno smeštenih MHFD P<0.05, t=4.59; P<0.001, F3,8=9.01) u testu recipročne interakcije; vremena socijalne interakcije u društvenosti (Sl. 2E, MRD P<0.001, t=4.36; MHFD P>0.99, t=0.078; Zajedno smešteni MRD P<0.0001, t=6.33; Zajedno smešteni MHFD P<0.001, t=4.78; Ishrana majke/Stanište/Efekat interakcije F3,32=6.13, P<0.01) i testovi socijalne novine (Sl. 2F, MRD P<0.0001, t=5.12; MHFD P>0.99, t=0.60; Zajedno smešteni MRD P<0.001, t=4.20; Zajedno smešteni MHFD P<0.001, t=4.76; Ishrana majke/Stanište/Efekat interakcije F3,32=4.37, P<0.01), kao i filogenetsko grupisanje zasnovano na UniFrac (Sl. 2G, P<0.001, R2=0.552; n=1000 razređivanja; 3390 očitavanja/uzorku), svi su obnovljeni u MHFD potomcima koji su smešteni zajedno sa MRD miševima. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM. Videti takođe Sl.12A-12D i Sl.13A-13G.
Sl. 3A-3L: Fekalna mikrobiota iz MRD, ali ne i MHFD, potomstva poboljšava socijalno ponašanje primaoca bez mikroba (GF). Sl.3A-3D, GF miševi pokazuju smanjenu recipročnu socijalnu interakciju (Sl. 3A, P<0.0001, t=22.73; Sl. 3B, P<0.001, t=11.31) i deficite u društvenosti (Sl. 3C, Kontrola P<0.0001, t=5.30, GF P>0.99, t=0.39; Efekat glavne grupe F1,24=21.98, P<0.0001) i preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 3D, Kontrola P<0.01, t=3.64, GF P=0.39, t=1.33; Efekat glavne grupe F1,24=5.29, P<0.05). Šema transplantacije fekalne mikrobiote (FMT) na četiri (Sl.3E) i osam nedelja starosti (Sl.3F). Sl.3G-3H, FMT iz MRD, ali ne i MHFD, potomci prilikom razdvajanja od majke povratili su kako GF društvenost (Sl.
3G, GFMRDkol P<0.0001, t=6.66; GFMHFDkol P=0.35, t=1.40; Donorski efekat F1,28=32.44, P<0.0001) tako i preferenciju za socijalnu novinu (Sl.3H, GFMRDkol P<0.01, t=3.60; GFMHFDkol P=0.81, t=0.84; Donorski efekat F1,28=9.86, P<0.01). Sl.3I-3J, U osam nedelja, FMT od MRD ili MHFD donatora nije uspeo da poboljša društvenost (Sl. 3I, GFMRDkol P=0.51, t=1.20; GFMHFDkol P=0.28, t=1.58; Donorski efekat F1,12=0.07, P=0.79) ili preferenciju za socijalnu novinu kod GF miševa (Sl.3J, GFMRDkol P=0.48, t=1.23; GFMHFDkol P>0.99, t=0.043; Donorski efekat F1,12=0.71, P=0.42). Sl. 3K-3L, PCoA neponderisanih UniFrac udaljenosti zasnovanih na skupu podataka sekvenciranja gena 16S rRNK od GF primalaca stolice od MRD ili MHFD donatora u četiri (3K, P=0.001, R2=0.83; n=1000 razređivanja; 4628 očitavanja/uzorku) ili osam (3L, P<0.001, R2=0.77; n=1000 razređivanja; 4805 očitavanja/uzorku) nedelja starosti. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM. Videti takođe Sl.14A-14H i 15A-15F.
Sl. 4A-4P: Selektivni tretman sa Lactobacillus (L.) reuteri vraća socijalne deficite i nivoe oksitocina kod MHFD potomaka. Sl. 4A, Šema L. reuteri-tretmana. Sl.4B,4C, Za razliku od medijuma za resuspendovanje (Sl.4B, P>0.99, t=1.03; c, P>0.99, t=0.40) ili toplotom ubijenog L. reuteri (Sl.4B, P>0.99, t=1.35; c, P>0.99, t=0.21), primena živih L. reuteri u vodi za piće vratila je društvenost (Sl. 4B, P<0.0001, t=5.98) i preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 4C, P<0.001, t=5.01) kod MHFD potomaka (Sl. 4B, Efekat tretmana F1,86=87.53, P<0.0001; Sl.
4C, Efekat tretmana F1,86=30.24, P<0.0001). Sl.4D-4E, Reprezentativne trake koje prikazuju istraživačku aktivnost. Sl.4F, Reprezentativne slike kontrolne imunoreaktivnosti oksitocina na različitim anteroposteriornim nivoima u PVN. Sl. 4G-4J, Imunoreaktivnost oksitocina kod PVN MRD (Sl. 4G), MHFD (Sl. 4H), MHFD potomaka tretiranih L. reuteri koji je ubijen toplotom (Sl.4I), i MHFD potomaka tretiranih živim L. reuteri (Sl.4J). Sl.4K-4N, Broj ćelija imunoreaktivnih na oksitocin (Sl. 4K, P<0.01, t=4.76) i intenzitet imunofluorescencije oksitocina (Sl.4L, P<0.01, t=3.80) su smanjeni u PVN MHFD u odnosu na MHFD miševe. U PVN potomaka MRD i MHFD, imunoreaktivnost NeuN broja ćelija (Sl. 4M, P=0.34, t=1.09) i intenzitet imunofluorescencije (Sl.4N, P=0.79, t=0.28) bili su slični. Sl.4O-4P, U odnosu na tretman toplotom ubijenim L. reuteri, tretman živim L. reuteri značajno je povećao broj ćelija pozitivnih na oksitocin (Sl.4O, P<0.05, t=2.93) i intenzitet imunofluorescencije oksitocina (Sl.
4P, P<0.05, t=3.09) u PVN potomaka MHFD. AU: proizvoljne jedinice. Grafikoni prikazuju srednju vrednost ± SEM. Videti takođe Sl.16A-16C Sl.19A-19F.
Sl. 5A-5L: Recipročna socijalna interakcija i LTP izazvan socijalnom interakcijom u VTA DA neuronima MHFD potomaka obnovljeni su pomoću L. reuteri. Sl. 5A, Šema eksperimentalnog dizajna. Sl. 5B-5E, Samo interakcija sa nepoznatim mišem indukovala je LTP u MRD VTA DA neuronima, što je određeno povećanim odnosom AMPAR/NMDAR (Sl.
5B, 5D, Početna linija naspram poznatog P>0.99, t=0.12, početna linija naspram nepoznatog P<0.01, t=3.79; poznati nasparam nepoznatog P<0.05, t=3.03; 5F=8.03, P<0.01). Kod MHFD potomaka, ni nepoznata ni poznata recipročna interakcija nije izazvala LTP u VTA DA neuronima (Sl. 5C,5E, Početna linija naspram poznatog P>0.99, t=0.035, Početna linija naspram nepoznatog P=0.64, t=1.30; poznati naspram nepoznatog P=0.50, t=1.45; F2,15=1.47, P=0.26). Sl. 5F-5G, Dok su MRD miševi provodili više vremena u interakciji sa nepoznatim nego sa poznatim mišem (poznati naspram nepoznatog; Sl. 5F, P<0.001, t=4.88; Sl. 5G, P<0.0001, t=5.87), MHFD miševi nisu (poznati naspram nepoznatog; Sl.5F, P=0.47, t=1.87;
Sl. 5G, P=0.40, t=1.96) (Sl.5F, F3,19=13.8, P<0.0001; Sl. 5G, F3,19=18.54, P<0.0001). Sl.
5H-5K, živi (Sl.5H,5J, P<0.01, t=4.95), ali ne toplotom-ubijeni L. reuteri (Sl.5I,5K, P=0.84, t=0.20), obnovio je LTP izazvan interakcijom sa nepoznatim u VTA potomaka MHFD. Sl.5L, Za razliku od toplotom ubijenog L. reuteri (MHFD naspram MHFD+Hk-Lr P>0.99, t=0.099), živi L. reuteri obnovio je recipročnu socijalnu interakciju (MHFD naspram MHFD+Lr P<0.05, t=3.24; F2,9=6.45, P<0.05). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM. Videti takođe Sl.
20A-20C - Sl.22A-22D.
Sl. 6A-6F: Oksitocin vraća VTA plastičnost izazvanu socijalnom interakcijom i deficite socijalnog ponašanja kod potomaka MHFD. Sl. 6A-6B, Intranazalna primena oksitocina je spasila LTP u VTA potomaka MHFD (Sl. 6B, MHFD+OKST sam naspram MHFD+OKST nepoznati P<0.01, t=3.66; MHFD+vehikulum nepoznati naspram MHFD+OKST nepoznati P<0.05, t=2.86; F2,15=7.97, P<0.01). Sl. 6C-6F, Oksitocin je takođe obnovio recipročnu socijalnu interakciju (Sl. 6C, MHFD naspram MHFD+vehikulum P=0.55, t=1.46; MHFD naspram MHFD+OKST P<0.05, t=3.62; MHFD+vehikulum naspram MHFD+OKST P<0.01, t=4.81; F2,8=12.82, P<0.01; Sl. 6D, MHFD naspram MHFD+vehikulum P>0.99, t=0.16; MHFD naspram MHFD+OKST P<0.05, t=4.075; MHFD+vehikulum naspram MHFD+OKST P<0.05, t=3.94; F2,8=10.97, P<0.01), društvenost (Sl.6E, MHFD+vehikulum P>0.99, t=0.44; MHFD+oksitocin P=0.24, t=1.74; Efekat tretmana F1,8=2.37, P=0.16) i preferenciju za socijalnu novinu kod potomaka MHFD (Sl. 6F, MHFD+vehikulum P=0.65, t=1.05; MHFD+oksitocin P<0.05, t=3.54; Efekat tretmana F1,8=10.54, P<0.05). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM. Takođe videti slike 22A-22D.
Sl. 7: Vrste čija je brojnost smanjena u crevnoj mikrobioti MHFD potomaka.
Sl. 8A-8G: Ishrana sa visokim sadržajem masti povećava težinu majki, ali ne i potomaka, u vezi sa Sl.1A-1J. Sl. 8A-8B, Ženke miševa hranjene ishranom sa visokim sadržajem masti (HFD) pokazale su povećanje težine >25% u poređenju sa ženkama koje su hranjene redovnom ishranom (RD) nakon 8 nedelja na ishrani (Sl.8A, P<0.05, t=2.42; Sl.8B, P<0.01, t=3.90). Sl.
8C, Ženke hranjene HFD pokazale su povećanu masu masti u odnosu na RD ženke (Sl. 8C, P<0.0001, t=5.80). Sl. 8D-8E, U poređenju sa RD, veličina legla ženki hranjenih HFD je smanjena (Sl.8D, P<0.01, t=3.18) i povećano je vreme do prvog legla (Sl.8E, P<0.05, t=2.26).
Sl. 8F-8G, Težina potomstva se nije razlikovala između majčinih kohorti ishrane na bilo sedam do osam (Sl. 8F, P=0.12, t=1.63) ili starosti od jedanaest-dvanaest nedelja (Sl. 8G, P=0.10, t=1.80), raspona godina tokom kojeg su vršeni testovi ponašanja. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 9A-9D: Oštećena socijalna ponašanja kod MHFD potomaka, u vezi sa Slikama 1A-1J. Sl. 9A-9B, MHFD potomci su pokazali smanjen broj (Sl. 9A, P<0.001, t=5.10) i učestalost kontakata (Sl.9B, P<0.01, t=4.73) u testu recipročne socijalne interakcije. Sl. 9C-9D, U testu sa tri komore, MHFD miševi pokazuju smanjenu društvenost (Sl. 9C, MRD P<0.01, t=3.67, MHFD P=0.15, t=1.81; Efekat ishrane majke F1,52=15.00, P<0.001) i preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 9D, MRD P<0.001, t=4.28, MHFD P=0.053, t=2.29; Efekat ishrane majke F1,52=21.53, P<0.0001). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 10A-10F: Mikrobiom creva MHFD potomaka ne pokazuje taksonomske promene visokog nivoa, ali je bakterijski diverzitet smanjen, u vezi sa Sl. 1A-1J. Sl. 10A-10D, Relativna brojnost prvih 10 najzastupljenijih filuma, kako je identifikovana analizom gena 16S rRNK, nije se značajno razlikovala između kohorti ishrane majki (Sl.10A,10B, Bacteroidetes P=0.50; Firmicutes P=0.94; Proteobacteria P=0.64; Deferribacteres P=0.91; Actinobacteria P=0.20; Tenericutes P=0.83; Candidate division TM7 P=0.73; Cyanobacteria P=0.97; Verrucomicrobia P=0.38; Fusobacteria P=0.37) i redova (Sl.10C,10D, Bacteroidales P=0.67, Erysipelotrichales P=0.32, Clostridiales P=0.32; Deferribacterales P=1; Campylobacterales P=1; Lactobacillales P=0.68; Bifidobacteriales P=0.78; Coriobacteriales P=0.23; Desulfovibrionales P=0.49; RF9 P=0.56). Sl.10E, PCoA ponderisanih UniFrac udaljenosti od prosečnog, zaokruženog razređenog MRD i MHFD 16S rRNK skupa podataka (n=1000 razređivanja; 7617 očitavanja/uzorku). Ponderisana procena strukture zajednice pokazala je preklapanje između dve kohorte ishrane majki (Sl. 10E, P=0.18, R2=0.063). Sl. 10F, Identifikovano je znatno manje operativnih taksonomskih jedinica (OTU) među uzorcima potomaka MHFD u odnosu na MRD, što ukazuje na smanjenu mikrobnu raznolikost kod potomaka MHFD (P<0.01, t=3.41). Grafikon prikazuje srednju vrednost ± SEM.
Sl. 11A-11B: HFD menja mikrobiom majke, u vezi sa Slikama 1A-1J. Sl. 11A, PCoA neponderisanih UniFrac udaljenosti generisanih iz prosečnog, zaokruženog skupa podataka gena 16S rRNK (n=1000 razređivanja; 2397 očitavanja/uzorku). Mikrobni sastav majčinih fekalnih uzoraka grupisan je neposredno pre primene ishrane, ali u roku od četiri nedelje na ishrani, uzorci fekalija majke hranjene HFD grupisani su odvojeno od kontrola. Ova promena u mikrobiološkom sastavu je održana nakon osam nedelja na ishrani, kada je počeo uzgoj (P<0.001, R2=0.79). Sl.11B, Dok se raznolikost bakterija nije razlikovala pre početka ishrane (P=0.61, t=1.30), značajno je smanjena kod ženki hranjenih HFD nakon četiri (P<0.05, t=2.82) i osam nedelja na ishrani (P<0.0001, t=5.78). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM. Sl. 12A-12D: Zajednički smeštaj jednog MHFD sa tri MRD potomka preokrenulo je socijalne deficite MHFD potomaka, u vezi sa Slikama 2A-2G. Sl. 12A-12B, Zajednički smeštaj sa MRD potomcima poboljšalo je broj kontakta za recipročnu socijalnu interakciju MHFD potomaka (Sl. 12A, MRD naspram MHFD P<0.01, t=5.92; MRD naspram zajedno smeštenih MHFD P=0.32, t=2.27; MHFD naspram zajedno smeštenih MHFD P<0.05, t=3.65; F3,8=12.10, P<0.01) i učestalosti interakcije (Sl.12B, MRD naspram MHFD P<0.01, t=5.89; MRD naspram zajedno smeštenih MHFD P=0.32, t=2.26; MHFD naspram zajedno smeštenih MHFD P<0.05, t=3.63; F3,8=11.99, P<0.01). Sl. 12C-12D, Zajednički smeštaj sa MRD poboljšao je društvenost potomaka MHFD (Sl.12C, MRD P<0.01, t=3.97; Zajednički smeštaj MRD P<0.01, t=3.53; MHFD P=0.79, t=1.31; Zajednički smeštaj MHFD P=0.086, t=2.42; Ishrana majke/efekat smeštaja F1,32=13.42, P<0.001) i preferenciju za socijalnu novinu (Sl.
12D, MRD P<0.01, t=3.66; Zajednički smeštaj MRD P<0.05, t=2.91; MHFD P=0.67, t=1.41; Zajednički smeštaj MHFD P<0.01, t=3.83; Ishrana majke/efekat smeštaja F1,32=47.73, P<0.0001). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 13A-13G: Zajednički smeštaj tri MHFD sa jednim MRD potomkom spašava socijalne deficite i filogenetski profil MHFD miševa, u vezi sa Slikama 2A-2G. Sl. 13A, Šema eksperimenta zajedničkog smeštaja. Sl.13B, MRD i MHFD potomci su razdvojeni od majke u jednu od tri kompozicije kaveza, kao što je prikazano. Sl.13C-13G, Vreme socijalne interakcije (Sl. 13C, MRD naspram MHFD P<0.0001, t=10.21; MRD naspram zajedno smeštenih MHFD P>0.99, t=1.41; MHFD naspram zajedno smeštenih MHFD P<0.0001, t=8.53; P<0.0001, F3,8=38.88) i trajanje kontakta (Sl. 13D, MRD naspram MHFD P<0.0001, t=7.18; MRD naspram zajedno smeštenih MHFD P>0.99, t=0.59; MHFD naspram zajedno smeštenih MHFD P<0.001, t=6.29; P=0.0001, F3,8=19.14) u testu recipročne interakcije; društvenost (Sl. 13E, MRD P<0.0001, t=7.37; MHFD P=0.802, t=1.31; Zajedno smešteni MRD P<0.0001, t=6.02; Zajedno smešteni MHFD P<0.0001, t=9.46; Ishrana majke/smeštaj/Efekat interakcije F3,32=18.62, P<0.0001) i preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 13F, MRD P<0.05, t=2.82; MHFD P=0.723, t=1.37; Zajedno smešteni MRD P<0.05, t=2.72; Zajedno smešteni MHFD P<0.01, t=3.34; Ishrana majke/Stanište/Efekat interakcije F3,32=4.55, P<0.01) kao i UniFrac filogenetsko grupisanje (Sl. 13G, P<0.001, R2=0.681; n=1000 razređivanja; 12600 očitavanja/uzorku), svi su obnovljeni u MHFD potomcima koji su smešteni zajedno sa MRD miševima u konfiguraciji 3 MHFD:1MRD. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 14A-14G: Socijalni deficiti miševa bez mikroba(GF) spašeni su transplantacijom fekalne mikrobiote od MRD, ali ne i MHFD, Donori u dobi od 4 nedelje, u vezi sa Sl.3A-3L. Sl. 14A-14B, Tokom testa recipročne socijalne interakcije, broj kontakata (Sl. 14A, P<0.001, t=10.10) i učestalost interakcije (Sl. 14B, P<0.001, t=10.19) su smanjeni kod GF potomaka. Sl. 14C-14D, U trokomornom testu, GF miševi su pokazali smanjenu društvenost (Sl. 14C, Kontrola P<0.01, t=3.87; GF P=0.95, t=0.73; Grupni efekat F1,24=10.58, P<0.01) i preferenciju za socijalnu novinu (Sl.14D, Kontrola P<0.05, t=2.54; GF P>0.99, t=0.30; Grupni efekat F1,24=2.51, P=0.13). Sl. 14E-14F, Rezultati trokomornog testa pokazuju da je transplantacija fekalne mikrobiote iz MRD, ali ne i potomstva MHFD prilikom razdvajanja od majke (četiri nedelje), vratila kako GF društvenost (Sl. 14E, MRD-kolonizovani GF P<0.01, t=3.39; MHFD-kolonizovani GF P>0.99, t=0.67; Efekat opcije donator/interakcija F1,28=8.25, P<0.01) tako i preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 14F, MRD-kolonizovani GF P<0.05, t=2.89; MHFD-kolonizovani GF P=0.69, t=0.96; Donorski efekat F1,28=7.42, P<0.05). Sl.
14G-14H, U osam nedelja, ni MRD- ni MHFD- transplantacija fekalne mikrobiote nije poboljšala socijalne deficite kod GF miševa (Sl.14G, MRD-kolonizovani GF P=0.55, t=1.15; MHFD-kolonizovani GF P=0.41, t=1.35; Donorski efekat F1,12=0.020, P=0.89; Sl. 14H, MRD-kolonizovani GF P=0.18, t=1.85; MHFD-kolonizovani GF P>0.99, t=0.53; Donorski efekat F1,12=2.85, P=0.12). FMT= transplantacija fekalne mikrobiote. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 15A-15F: Diverzitet bakterijske zajednice se razlikuje između GF miševa koji primaju MRD naspram MHFD fekalne mikrobiote, u vezi sa Slikama 3A-3L. Sl. 15A-15E, Diverzitet bakterija kod GF MRD i MHFD primalaca tokom vremena prikazana kao lokalna regresija sa intervalom poverenja od 95% (Sl. 15A). U poređenju sa GF miševima transplantiranim fekalnom materijom MRD, broj OTU uočenih kod GF miševa transplantiranih fekalnom materijom MHFD bio je sličan 24 sata nakon transplantacije (Sl.15A, 15B, P=0.57, t=0.61), ali je smanjen u nedelji jedan (Sl. 15A, 15C, P<0.05, t=3.27), dva (Sl. 15A, 15D, P<0.05, t=3.12) i osam (Sl.15A, 15E, P<0.05, t=0.298). Sl.15F, Broj uočenih OTU je smanjen kod GF miševa koji su primili fekalnu mikrobiotu od MHFD u odnosu na MRD potomke (Sl.
15F, P<0.05, t=2.98). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 16A-16C: Tretman sa L. reuteri poništava socijalne deficite MHFD, u vezi sa Sl.4A-4P i tabelom 1. Sve grupe potomaka MRD preferirale su komoru u kojoj se nalazi miš u testu društvenosti (Sl. 16A, MRD+medijumi P<0.05, t=2.84; MRD+ L. reuteri koji je ubijen toplotom, P<0.001, t=4.12; MRD+živi L. reuteri P<0.0001, t=5.71) i komoru koja sadrži miša 2 u testu socijalne novine (Sl.16B, MRD+medijumi P<0.01, t=3.90; MRD+ L. reuteri koji je ubijen toplotom, P<0.001, t=4.44; MRD+živi L. reuteri P<0.01, t=3.57). Za razliku od samih medijuma (Sl. 16A, MHFD+medijumi P>0.99, t=0.56; Sl. 16B, MHFD+medijumi P>0.99, t=0.64) ili L. reuteri koji je ubijen toplotom (Sl.16A, MHFD+ L. reuteri koji je ubijen toplotom P=0.085, t=2.50; Sl.16B, MHFD+ L. reuteri koji je ubijen toplotom P>0.99, t=0.053), primena živih L. reuteri u vodi za piće poboljšala je društvenost potomaka MHFD i preferenciju za socijalnu novinu (Sl.16A, MHFD+L. reuteri P<0.0001, t=5.06; Efekat tretmana F1,86=55.61, P<0.0001; Sl. 16B, MHFD+L. reuteri P<0.001, t=4.55; Efekat tretmana F1,86=37.12, P<0.0001). Sl.16C, Polaganje pre i posle tretmana otkrilo je da je većina L. reuteri preživela tokom perioda tretmana od 24 sata, ali nijedan nije nakon postupka ubijanja toplotom. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 17A-17G: Tretman sa drugim Lactobacillus, (L.) johnsonii, nije uspeo da preokrene socijalne deficite kod potomaka MHFD, u vezi sa Slikama 4A-4P i slikom 7. Sl.17A, Šema tretmana sa L. johnsonii. Sl. 17B,17C, Ni medijum za resuspendovanje (Sl. 17B, P=0.38, t=1.72; Sl. 17C, P>0.99, t=0,40) niti primena L. johnsonii u vodi za piće (Sl. 17B, P>0.99, t=0.78; Sl. 17C, P>0.99, t=0.21) nisu poboljšali društvenost (Sl. 17B) ili preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 17C) kod MHFD potomaka (Sl. 17B, Efekat tretmana F3,32=23.94, P<0.0001; Sl. 17C, Efekat tretmana F3,32=6.13, P<0.001). Sl. 17D-17G, Reprezentativni prikazi praćenja miševa tokom svake faze zadatka sa 3 komore, kohorte kao što su navedene. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 18A-18B: Preterano ponavljajuće ponašanje kod MHFD i miševa bez mikroba (GF) nije posredovano promenama u mikrobiomu, u vezi sa Slikama 4A-4P. Sl. 18A, Šema zadatka zakopavanja klikera, mera ponavljajućeg ponašanja kod miševa. Sl. 18B, MHFD potomci su zakopali više klikera nego MRD potomci (P<0.05, t=3.64). GF miševi su zakopali više klikera u poređenju sa konvencionalno kolonizovanim MRD potomcima (P<0.0001, t=5.20). Zajednički smeštaj nije uspeo da preokrene povećano ponašanje zakopavanja klikera kod potomaka MHFD (zajedno smešteni MHFD naspram MRD, P<0.01, t=4.32; Zajedno smešteni MHFD naspram MHFD, P>0.99, t=1.51) i kolonizacija GF miševa sa MRD mikrobiotom u dobi od 4 nedelje nije preokrenula preterano ponavljajuće ponašanje (MRD kolonizovani GF naspram MRD, P=0.25, t=2.60; MRD-kolonizovani naspram GF, P>0.99, t=1.38). Grafikon prikazuje srednju vrednost ± SEM.
Sl. 19A-19F: Tretman sa L. reuteri nije uspeo da preokrene ponašanje MHFD potomaka vezano za anksioznost, povezano sa Slikama 4A-4P. Sl. 19A, Šema testa na otvorenom terenu. Sl. 19B, U poređenju sa MRD, potomci MHFD proveli su manje vremena istražujući centar arene na otvorenom (P<0.05, t=3.61) i tretman sa L. reuteri nije značajno uticao na ovo ponašanje (MHFD naspram MHFD+L.reuteri, P>0.99, t=0.13; MRD naspram MHFD+L. reuteri, P<0.05, t=2.79; F2,49=7.82, P<0.01). Sl. 19C, Reprezentativni grafikoni istraživačke delatnosti. Sl. 19D-19F, Mere lokomotorne aktivnosti tokom istraživanja arene nisu se razlikovale između grupa ishrane majke ili grupa tretmana (Sl.19D, F2,49=0.26, P=0.77; 19E, F2,49=0.25, P=0.78; 19F, F2,49=1.30, P=0.28). Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 20A-20C: Identifikacija DA neurona u lateralnom VTA u isečcima srednjeg mozga kod miševa, u vezi sa Sl. 5A-5L i 6A-6F. Sl. 20A, Reprezentativni snimak neurona u lateralnom VTA koji pokazuje stabilan rad pejsmejkera na 1-5 Hz u režimu vezanom za ćeliju.
Sl. 20B, Širina spajkova je merena od početka unutrašnjeg otklona do spoljnog pika pri potencijalu zadržavanja od -55 mV. Neuroni koji pokazuju širinu spajkova > 1.0 ms uzeti su kao dopaminergični. Sl. 20C, Samo ventrolateralni VTA neuroni su proučavani sa strujom aktiviranom velikom (> 150 pA) hiperpolarizacijom (Ih) i velikom (> 150 pA) strujom curenja.
Sl. 21A-21D: Bazalna sinaptička transmisija je nepromenjena u VTA isečcima od MHFD miševa, u vezi sa Sl.5A-5L i 6A-6F. Ekscitatorne postsinaptičke struje (EPCS) su snimljene kako je opisao Zhu et al. (2011). Sl. 21A, Izazvana EPSC (eEPSC) amplituda kao funkcija intenziteta stimulacije prikazana je kao ulazno/izlazne krive (snimljene u naponskoj stezi na -70 mV sa pipetama koje sadrže cezijum i u prisustvu 100 µM pikrotoksina) bila je slična u VTA isečcima iz MRD i MHFD potomaka (t=0.16, p=0.88, n=5). Sl. 21B, Upareni EPSC su zabeleženi u intervalima od 50, 100, 200 i 400 ms između stimulusa i odnosi uparenih impulsa EPSC2/EPSC1 ne pokazuju razliku između MRD i MHFD potomaka (t=0.2, p=0.84, n=5). Sl.
21C-21E, Tragovi uzoraka (gore) minijaturnih spontanih EPSC i zbirni podaci (dole) pokazuju sličnu učestalost (Sl. 21D, t=0.24, p=0.81, n=6) i amplitudu (Sl. 21E, t=0.07, p=0.94, n=6) u VTA isečcima iz MRD i MHFD potomaka. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM. Sl. 22A-22D: Primena oksitocina poboljšava socijalno ponašanje potomaka MHFD, povezano sa Sl. 6A-6F. Sl. 22A-22B, U testu recipročne socijalne interakcije, intranazalna primena oksitocina je poboljšala trajanje kontakta sa potomcima MHFD (Sl. 22A, P=0.052, t=2.99; Efekat tretmana F2,8=5.87, P<0.05) i učestalost interakcije (Sl. 22B, P<0.05, t=3.43; Efekat tretmana F2,8=14.58, P<0.01), dok sama intranazalna primena nosača nije imala efekta (Sl. 22A, P>0.99, Z=0.11; 22B, P=0.20, t=2.11). Sl. 22C-22D, U zadatku sa tri komore, intranazalni oksitocin je poboljšao društvenost (Sl. 22C, MHFD+vehikulum P>0.99, t=0.29; MHFD+oksitocin P<0.01, t=3.50; Efekat tretmana F1,12=5.16, P<0.05) i preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 22D, MHFD+vehikulum P=0.50, t=1.25; MHFD+oksitocin P=0.096, t=2.34; Efekat tretmana F(1,8)=6.41, P<0.05) kod MHFD potomaka. Grafikoni pokazuju srednju vrednost ± SEM.
Sl. 23A i 23B: Tretman sa L. reuteri spašava deficite socijalnog ponašanja kod GF miševa.
Dodavanje L reuteri u vodu za piće preokreće deficijentnu društvenost (Sl. 23A) i socijalnu novinu (Sl.23B) GF miševa.
Sl. 24A-24D: Tretman sa L. reuteri spašava socijalno ponašanje miševa sa deficijencijom Cntnap2. (Sl. 24A-24B) Miševi kojima nedostaje Cntnap2 pokazali su smanjenu društvenost i socijalnu novinu. (Sl. 24C-24D) Dodavanje L reuteri u vodu za piće preokreće nedostatak društvenosti (Sl. 24C) i socijalne novine (Sl.24D) kod miševa kojima nedostaje Cntnap2.
DETALJAN OPIS
[0016] Kako se ovde koristi u specifikaciji, reči u jednini mogu značiti jedan ili više. Kako se ovde koristi u patentnom(im) zahtevu(ima), kada se koristi u vezi sa reči "sadrži", reči na egleskom jeziku ispred kojih se nalazi predlog "a" ili "an" mogu značiti jedno ili više od jednog. Kako se ovde koristi, "drugi/sledeći" može značiti najmanje drugi ili više. U specifičnim primerima izvođenja, aspekti pronalaska mogu da se "sastoje u suštini od" ili "sastoje od" jednog ili više elemenata pronalaska, na primer. Neki primeri izvođenja pronalaska mogu se sastojati od ili se u suštini sastojati od jednog ili više elemenata, koraka postupka i/ili postupaka pronalaska. Smatra se da se bilo koji postupak ili kompozicija opisana ovde može primeniti u odnosu na bilo koji drugi postupak ili kompoziciju opisanu ovde. Primeri izvođenja o kojima se raspravlja u kontekstu postupaka i/ili kompozicija pronalaska mogu se koristiti u odnosu na bilo koji drugi postupak ili kompoziciju opisanu ovde. Na taj način, primer izvođenja koji se odnosi na jedan postupak ili kompoziciju može se primeniti i na druge postupke i kompozicije pronalaska.
[0017] Ovde su opisani postupci i kompozicije za lečenje ili prevenciju deficita socijalnog ponašanja ili medicinskih stanja gde su jedan ili više deficita socijalnog ponašanja najmanje jedan simptom. U nekim aspektima, individua ima neurorazvojni poremećaj. U posebnim aspektima, individui kojoj je to potrebno obezbeđuje se efikasna količina jedne ili više određenih bakterija u terapeutske ili preventivne svrhe. U pronalasku, individua ima poremećaj autističnog spektra (ASD).
I. Probiotici i formulacije
[0018] Ovde je opisano lečenje ili prevencija medicinskog stanja u kome je najmanje jedan simptom deficit socijalnog ponašanja, uključujući u nekim slučajevima neurorazvojni poremećaj. U posebnim aspektima, individui koja ima deficit socijalnog ponašanja ili koja je u riziku da ima deficit socijalnog ponašanja, ili individui koja je trudna sa individuom koja je u riziku da ima deficit socijalnog ponašanja, obezbeđuje se efikasna količina formulacije koja sadrži efikasnu količinu Lactobacillus, kao što je L. reuteri. Bilo koji soj L. reuteri može se koristiti. Primeri sojeva L. reuteri obuhvataju najmanje ATCC PTA 6475, DSM17938, ATCC PTA4659, ATCC PTA 5289, ATCC 55730, CRL1324, DSM20016, CF4-6G, ATCC55730, CF48-3A1, M27U15, i druge sojeve navedene u Frese et al., 2011; Spinler et al., 2014; Oh et al., 2010, i njihove kombinacije. L. reuteri može se dobiti iz bilo kog pogodnog izvora, uključujući komercijalne, iz istraživačke laboratorije, kao poklon ili izolovan iz prirode. Postupci izolacije za L. reuteri su poznati u tehnici, uključujući najmanje one opisane u U.S. patentu br. 5,439,678 i U.S. patentu br. 5,849,289, na primer. U pronalasku, L. reuteri soj je Lactobacillus reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475).
[0019] Kompozicije koje sadrže bakterije selektovane upotrebom postupaka opisanih u prethodnom tekstu su opisane ovde. Kompozicije mogu uključiti farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i/ili ekscipijens. Kompozicija u nekim slučajevima može uključivati više od jednog bakterijskog izolata. Kompozicije se mogu formulisati za isporuku u hrani, vodi, preko oralne gavaže, preko aerosola ili proizvoda za raspršivanje, kapi, praha osušenog zamrzavanjem, ekstrakta, pilule i/ili preko supozitorije, u specifičnim slučajevima.
[0020] Sojevi ili kompozicije opisani ovde mogu se primenjivati na različite načine poznate ili dostupne stručnjacima. Sojevi ili kompozicije se mogu primeniti u obliku farmaceutskog, nutricionističkog sredstva, dodati hrani i/ili vodi, i/ili obezbediti u obliku aerosola ili spreja za primenu inhalacijom. Pored toga, sojevi i kompozicije opisane ovde mogu da budu obezbeđene kao tečne suspenzije, liofilizovani ili praškovi osušeni zamrzavanjem ili zamrznuti koncentrati za dodavanje ciljnim regionima koji nisu subjekat, kao primeri.
[0021] U specifičnim aspektima, kompozicija L. reuteri i srodni postupci opisani ovde koriste posebne postupke formulacije. U nekim primerima, nosač može dalje da sadrži sredstvo za raspadanje, klizajuće sredstvo i/ili lubrikant, kao što je opisano u U.S. patentu 9,084,434, na primer, da bi se olakšao duži rok trajanja i/ili polu-život formulacije. Sredstvo za raspadanje može biti bilo koje pogodno sredstvo za raspadanje kao što je, na primer, sredstvo za raspadanje izabrano iz grupe koja se sastoji od natrijum kroskarmeloze, krospovidona, gelan gume, hidroksipropil celuloze, skroba i natrijum skrob glikolata. Klizajuće sredstvo može biti bilo koje pogodno klizajuće sredstvo kao što je, na primer, klizajuće sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od silicijum dioksida, koloidnog silicijum dioksida i talka. Lubrikant može biti bilo koji pogodni lubrikant kao što je, na primer, lubrikant izabran iz grupe koja se sastoji od kalcijum stearata, magnezijum stearata, stearinske kiseline, natrijum stearil fumerata i masne kiseline na biljnoj bazi. U kompoziciji i postupku, nosač je prisutan u kompoziciji u opsegu od približno 30% tež./tež. do približno 98% tež./tež.; ovaj težinski procenat je kumulativni težinski procenat uzimajući u obzir sve sastojke prisutne u nosaču. Kompozicija za upotrebu u ovom pronalasku može biti oralni dozni oblik, prah koji se meša u tečnost ili žvakaća guma. Kada je kompozicija oralni dozni oblik, oralni dozni oblik se može izabrati iz grupe koja se sastoji od tableta, skrobnih kapsula i kapsule, pri čemu tablete i kapsule mogu biti čvrste ili za žvakanje. Kada je kompozicija prah, može se mešati u tečnost koja se bira iz grupe koja se sastoji od vode, mleka, soka i jogurta. Tamo gde je kompozicija žvakaća guma, guma može biti u obliku tableta meke ili tvrde žvakaće gume. Kombinovanjem probiotičkih vrsta sa šećernim alkoholima, kao što su manitol, sorbitol, sami ili zajedno sa dodatnim šećernim alkoholom laktitolom i/ili fitonutrijentom, kao što su oligomerni proantocijanidini (OPC), povećava se stabilnost probiotičkih formulacija u različitim uslovima skladištenja.
[0022] U posebnim aspektima, probiotičke kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti pripremljene kao prah koji je namenjen da se rastvori u tečnosti, kao što je voda, mleko, sok i jogurt. Podrazumeva se da se pojedinačne tečnosti mogu mešati zajedno gde je to potrebno. Na primer, probiotička formulacija može da se kombinuje sa voćnim sokom i jogurtom ili mlekom i jogurtom da se napravi probiotički jogurt. Probiotička formulacija se takođe može kombinovati sa mlekom i sladoledom za pripremu probiotičkih mlečnih šejkova. Arome za probiotičke tečne formulacije koje se razmatraju u pronalasku su poznate prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.
[0023] U posebnim slučajevima, formulacija L. reuteri za upotrebu u pronalasku (kao primer za Lactobacillus) sadrži jedan ili više ekscipijenasa. Primeri ekscipijenasa koji se mogu koristiti za formulisanje odgovarajućih doznih oblika obuhvataju vezujuća sredstva, sredstva za raspadanje, lubrikante, obloge, plastifikatore, sredstva za kompresiju, sredstva za vlažnu granulaciju i zaslađivače, od kojih su svi poznati stručnjacima iz oblasti tehnike na koju se pronalazak odnosi. Svi sledeći primeri dati su kao ilustracija, a ne kao ograničenje. Vezujuća sredstva se koriste tamo gde je prikladno da pomognu da sastojci u obliku doze ostanu zajedno. Primeri vezujućih sredstava uključuju karbopol, povidon i ksantan gumu. Lubrikanti se uglavnom uvek koriste u proizvodnji doznih oblika direktnom kompresijom kako bi se sprečilo da se zbijena praškasta masa zalepi za opremu tokom postupka tabletiranja ili inkapsulacije. Primeri lubrikanata uključuju kalcijum stearat, magnezijum stearat, stearinsku kiselinu, natrijum stearil fumerat i masne kiseline na biljnoj bazi. Sredstva za raspadanje pomažu u razbijanju zbijene mase kada se stave u tečno okruženje. Primeri sredstava za raspadanje uključuju natrijum kroskarmelozu, krospovidon, gelan gumu, hidroksipropil celulozu, skrob i natrijum skrob glikolat. Obloge se koriste za kontrolu rastvorljivosti leka. Primeri obloga uključuju karagenan, celuloza acetat ftalat, etilcelulozu, gelan gumu, matodekstrin, metakrilate, metilcelulozu, mikrokristalnu celulozu i šelak. Plastifikatori se koriste za kontrolu brzine oslobađanja leka iz doznog oblika. Primeri plastifikatora uključuju citratne estre, dibutil sebakat, dietil ftalat, polivinilacetat ftalat i triacetin. Sredstva za kompresiju uključuju kalcijum karbonat, dekstrozu, fruktozu, guar gumu, med, laktozu, maltodekstrin, maltozu, manitol, mikrokristalnu celulozu, melasu, sorbitol, skrob i saharozu. Sredstva za vlažnu granulaciju uključuju kalcijum karbonat, laktozu, maltodekstrin, manitol, mikrokristalnu celulozu, povidon i skrob. Zaslađivači uključuju aspartam, dekstrozu, fruktozu, med, laktozu, maltodekstrin, maltozu, manitol, melasu, monoamonijum glicirizinat, sorbitol, sukralozu i saharozu. Ekscipijensi koji se generalno koriste u proizvodnji tableta za žvakanje uključuju, radi ilustracije, a ne ograničenja, dekstrozu, fruktozu, guar gumu, laktozu, maltodekstrin, maltozu, manitol, mikrokristalnu celulozu i sorbitol. Kao što je očigledno iz prethodne liste, mnogi od istih sastojaka mogu se koristiti za različite svrhe u različitim oblicima doziranja.
[0024] Kompozicija L. reuteri za upotrebu u pronalasku može biti obezbeđena kao formulacija za individuu u bilo kom pogodnom obliku, i u određenim primerima izvođenja oni su živi iako su u određenim primerima izvođenja oni mrtvi. U posebnim primerima izvođenja, formulacija L. reuteri za upotrebu u pronalasku je formulisana da ciljno deluje na region u gastrointestinalnom traktu, uključujući bilo koji deo gastrointestinalnog trakta. Formulacija L. reuteri je formulisana tako da se isporučuje u bilo koji deo gastrointestinalnog trakta.
[0025] Formulacija se može obezbediti u hrani i/ili piću, u specifičnim primerima izvođenja. Posebni primeri uključuju mlečne proizvode i/ili hranu obogaćenu probioticima. Međutim, dostupne su i tablete, kapsule, gume ili prahovi koji sadrže bakterije u obliku osušenom zamrzavanjem. U specifičnim primerima izvođenja, formulacija L. reuteri za upotrebu u pronalasku je obezbeđena u piluli ili u jogurtu, na primer. Formulacija se može obezbediti u formuli za odojčad i/ili žitaricama (za bebe ili na drugi način), u nekim slučajevima.
[0026] Svaka doza kompozicije L. reuteri za upotrebu u pronalasku može da sadrži određeni opseg bakterijskih ćelija. U specifičnim slučajevima, kompozicija L. reuteri za upotrebu u pronalasku sadrži opseg od oko 10<3>ćelija do oko 10<13>ćelija. U određenim slučajevima, svaka doza je u rasponu od oko 10<5>ćelija do oko 10<11>ćelije, oko 10<5>do oko 10<10>ćelija, oko 10<7>ćelija do oko 10<10>ćelija, i tako dalje. U drugim slučajevima, svaka doza je u opsegu od oko 10 ćelija do oko 10<1>ćelija.
[0027] U nekim slučajevima, poželjno je da se probiotički mikroorganizmi ne suše zamrzavanjem ili raspršivanjem u proizvodu koji je spreman za upotrebu, jer je poželjno da mikroorganizmi budu što robusniji kada uđu u creva kako bi se uspešno takmičili sa proinflamatornim delom mikroflore koja je već prisutna u crevima. Međutim, neki sojevi mogu biti dovoljno robusni i/ili neki protokoli dovoljno nežni da omoguće probiotičke mikroorganizme sušene raspršivanjem ili zamrzavanjem u proizvodu spremnom za upotrebu.
[0028] Ovde su opisane formulacije za upotrebu u pronalasku koje sadrže soj L. reuteri pogodan za isporuku osobi kojoj je to potrebno. Formulacija može dalje da sadrži prebiotički materijal, koji je sastojak hrane koji podstiče rast L. reuteri, kao što su prosti šećeri, složeni ugljeni hidrati, vlakna, masti, proteini ili prirodni proizvodi, kao što su vitamini, minerali i polifinoli koji stimulišu preživljavanje, rast ili aktivnost L. reuteri ili stimulišu njegovu postojanost u gastrointestinalnom traktu. Formulacija može da sadrži nosač koji se može progutati, koji može biti farmaceutski prihvatljiv nosač kao što je kapsula, tableta ili prah. U specifičnim primerima izvođenja, progutani nosač je prehrambeni proizvod kao što je kiselo mleko, jogurt (zamrznuti ili nezamrznuti), mleko u prahu, mlečni koncentrat, sirni namazi, prelivi i/ili pića. Formulacija može dalje da sadrži protein i/ili peptid, posebno proteine i/ili peptide koji su bogati glutaminom/glutamatom, lipidima, ugljenim hidratima, vitaminima, mineralima i/ili mikroelementima, na primer. Formulacija može dalje da sadrži pomoćno sredstvo, lek, biološko jedinjenje ili njihovu smešu. U određenim primerima izvođenja formulacija može biti hrana ili lek.
[0029] Efikasna količina L. reuteri može se obezbediti individui kojoj je to potrebno i može ili ne mora biti obezbeđena sa jednim ili više dodatnih probiotika, kao što je jedna ili više dodatnih probiotičkih bakterija i/ili kvasac. Dodatne probiotičke bakterije i/ili kvasac mogu biti u istoj kompoziciji kao i L. reuteri, ili dodatne probiotičke bakterije i/ili kvasac mogu biti u različitoj kompoziciji od L. reuteri. Dodatne probiotičke bakterije i/ili kvasac mogu, ali ne moraju da se daju individui u isto vreme kada i L. reuteri. Dodatne probiotičke bakterije i/ili kvasac mogu pomoći u lečenju i/ili prevenciji najmanje jednog deficita socijalnog ponašanja i/ili dodatne probiotičke bakterije mogu biti korisne za lečenje i/ili prevenciju najmanje jednog simptoma drugog medicinskog stanja. Druga medicinska stanja koja se mogu lečiti i/ili sprečiti u isto vreme sa drugim probioticima uključuju najmanje anksioznost, kogniciju, šizofreniju, bipolarni poremećaj, poremećaj raspoloženja, sezonski afektivni poremećaj, sindrom iritabilnog creva, inflamatornu bolest creva (IBD), infektivnu dijareju (uzrokovanu virusima, bakterijama ili parazitima), dijareju uzrokovanu antibioticima, stanja kože (kao što je ekcem), zdravlje urinarnog sistema i vagine, sprečavanje alergija i prehlade i oralno zdravlje.
[0030] Dodatne probiotičke bakterije i/ili kvasac mogu biti bilo koje vrste, sve dok nisu patogeni u količini koja se daje individui. U specifičnim primerima izvođenja, dodatne probiotičke bakterije i/ili kvasac mogu biti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. fermentum, L. paracasei, L. plantarum, L. rhamnosus, L. salivarius, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. animalis subsp. lactis, B. longum, Streptococcus thermophilis, Enterococcus faecalis, E. faecium, Bifidobacterium, Saccharomyces boulardii, i Lactobacillus bifidus, Parabacteroides distasonis, Helicobacter hepaticus, Bacteroides uniformis, neklasifikovana Olsenella, neklasifikovana Collinsella, Bifidobacterium pseudolongum, Lactobacillus johnsonii, ili njihova kombinacija. U slučajevima kada se jedna ili više drugih bakterija i/ili kvasac daju individui, oni se mogu obezbediti u određenom odnosu. U slučajevima kada postoji još jedna bakterija u formulaciji, takav odnos može biti 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 i tako dalje. U slučajevima kada postoji više od jedne druge bakterije u formulaciji, određeni odnos može biti 1:1:1; 1:2:1; 1:10:1; 1:2:2; 1:10:10; 1:100:1; 1:100:100, i tako dalje.
[0031] Individua takođe može unositi vitamine i/ili riblje ulje, na primer.
II. Primeri izvođenja tretmana i isporuke
[0032] U određenim primerima izvođenja, individua koja je subjekat za postupke i kompozicije opisane ovde ima medicinsko stanje kod koga najmanje jedan simptom je deficit socijalnog ponašanja. U specifičnim aspektima, individua ima neurorazvojni poremećaj, i takav poremećaj može imati bilo koji uzrok, uključujući deprivaciju, genetske i metaboličke bolesti, imunološke poremećaje, zarazne bolesti, faktore ishrane, fizičke traume i toksične faktore i faktore sredine, na primer; poremećaj može imati dva ili više uzroka. U pronalasku, režim lečenja je za pojedinca sa ASD. U svakom slučaju, individua može biti rođena od majke na ishrani sa visokim sadržajem masti, od majke koja je bila gojazna ili od majke koja je imala prekomernu telesnu težinu, ili individua može biti trudna.
[0033] Individui koji ima deficit socijalnog ponašanja obezbeđuje se efikasna količina formulacije koja sadrži najmanje efikasnu količinu L. reuteri. U nekim slučajevima, može postojati režim koji ima prvu fazu za početni tretman, koji može trajati danima, nedeljama, mesecima ili godinama, a zatim drugu fazu održavanja, koja može trajati nedeljama, mesecima ili godinama. U posebnom obliku pronalaska, početni režim lečenja može da sadrži najmanje oko 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, ili 10<10>ćelija po dozi. Takav tretman se može primeniti jednom ili više puta dnevno, uključujući oko 1, 2, 3 ili više puta dnevno, tokom perioda koji je dovoljan da se stabilizuje crevna flora. U drugim slučajevima, u fazi održavanja, individui se obezbeđuje manja količina bakterija i/ili ređe primene nego u početnoj fazi lečenja.
[0034] Trajanje režima lečenja može zavisiti od svakog pojedinačnog pacijenta i stadijuma medicinskog stanja. U nekim slučajevima, kontinuirano lečenje tokom određenog vremenskog perioda se dešava sve do uočljivog poboljšanja deficita socijalnog ponašanja. U nekim slučajevima, poboljšani deficit socijalnog ponašanja održava se dodatnim tretmanom, iako dodatni tretman može biti smanjen u učestalosti i/ili zapremini.
[0035] Iako u nekim slučajevima, formulacija L. reuteri se obezbeđuje bebi ili detetu sa deficitom socijalnog ponašanja, u nekim slučajevima se bebi ili detetu daje formulacija L. reuteri kada ne postoji otkriveni deficit socijalnog ponašanja, ali je beba ili dete imalo biološku majku koja je bila gojazna ili je imala prekomernu telesnu težinu i/ili je imala ishranu sa visokim sadržajem masti. U nekim slučajevima biološkoj majci koja je gojazna ili sa prekomernom telesnom težinom ili koja je na ishrani sa visokim sadržajem masti daje se formulacija pre rođenja deteta. U određenim slučajevima individua koji je adolescent ili odrasla osoba dobija odgovarajuće doze L. reuteri da bi se poboljšao deficit socijalnog ponašanja i individua je možda imala ili nije imala majku koja je bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom ili je bila na ishrani sa visokim sadržajem masti. U drugim slučajevima, formulacija L. reuteri se obezbeđuje bebama, deci, adolescentima, odraslima i/ili starijim osobama.
[0036] U slučajevima kada je majka individue sa deficitom socijalnog ponašanja gojazna, majka i/ili dete se mogu lečiti (majka pre porođaja). Majka se smatra gojaznom ako ima indeks telesne mase (BMI) od 30 ili više. Majka se smatra gojaznom ako ima BMI od 25 do 29.9.
[0037] Stručnjak u ovoj oblasti može da izmeri jedan ili više deficita socijalnog ponašanja kod ljudi na različite načine. U specifičnim primerima izvođenja, kvalifikovani stručnjak bi koristio standarde postavljene u Dijagnostičkom i statističkom priručniku za mentalne poremećaje, peto izdanje (DSM-5):
A. Stalne poteškoće u društvenoj upotrebi verbalne i neverbalne komunikacije koje se manifestuju u svemu od sledećih:
1. Deficiti u upotrebi komunikacije u društvene svrhe, kao što su pozdravljanje i deljenje informacija, na način koji odgovara društvenom kontekstu.
2. Pogoršanje sposobnosti promene komunikacije tako da bude u skladu sa kontekstom ili potrebama slušaoca, kao što je drugačiji govor u učionici nego na igralištu, drugačiji razgovor sa detetom nego sa odraslom osobom i izbegavanje upotrebe previše formalnog jezika.
3. Poteškoće u poštovanju pravila za razgovor i pripovedanje, kao što su smenjivanje u razgovoru, preformulisanje kada se pogrešno razume i znanje kako da se koriste verbalni i neverbalni signali za regulisanje interakcije.
4. Poteškoće u razumevanju onoga što nije eksplicitno navedeno (npr. donošenje zaključaka) i nebukvalnih ili dvosmislenih značenja jezika (npr. idiomi, humor, metafore, višestruka značenja koja zavise od konteksta za tumačenje).
B. Deficiti rezultiraju funkcionalnim ograničenjima u efikasnoj komunikaciji, društvenom učešću, društvenim odnosima, akademskom postignuću ili profesionalnom učinku, pojedinačno ili u kombinaciji.
C. Početak simptoma je u ranom razvojnom periodu (ali deficiti se možda neće u potpunosti manifestovati sve dok zahtevi društvene komunikacije ne pređu ograničene kapacitete).
D. Simptomi se ne mogu pripisati drugom medicinskom ili neurološkom stanju ili niskim sposobnostima u domenima ili strukturi reči i gramatici, i nisu bolje objašnjeni poremećajem spektra autizma, intelektualnim invaliditetom (poremećaj intelektualnog razvoja), globalnim razvojnim kašnjenjem ili drugim mentalnim poremećajem.
E. Stalni deficiti u socijalnoj komunikaciji i socijalnoj interakciji u više konteksta, kao što se manifestuje sledećim, trenutno ili istorijski (primeri su ilustrativni, nisu iscrpni, pogledajte tekst):
1. Deficiti socijalno-emocionalnog reciprociteta, koji se kreću, na primer, od abnormalnog društvenog pristupa i neuspeha normalnog razgovora naprednazad; do smanjenog deljenja interesa, emocija ili afekta; do neuspeha da se započne ili odgovori na društvene interakcije.
2. Deficiti u neverbalnom komunikativnom ponašanju koji se koriste za socijalnu interakciju, u rasponu, na primer, od loše integrisane verbalne i neverbalne komunikacije; do abnormalnosti u kontaktu očima i govoru tela ili nedostatke u razumevanju i upotrebi gestova; do potpunog nedostatka izraza lica i neverbalne komunikacije.
3. Deficiti u razvoju, održavanju i razumevanju odnosa, u rasponu, na primer, od poteškoća u prilagođavanju ponašanja različitim društvenim kontekstima; do poteškoća u deljenju maštovite igre ili u sklapanju prijateljstva; do odsustva interesovanja za vršnjake.
4. Simptomi izazivaju klinički značajna oštećenja u društvenim, profesionalnim ili drugim važnim oblastima trenutnog funkcionisanja.
[0038] U posebnim primerima izvođenja, individui kojoj je to potrebno je obezbeđena efikasna količina L. reuteri prema pronalasku u svrhu poboljšanja deficita socijalnog ponašanja. U nekim slučajevima, individui se sa namerom obezbeđuje efikasna količina L. reuteri prema pronalasku u svrhu poboljšanja najmanje jednog deficita socijalnog ponašanja. Trudnoj majci se može obezbediti efikasna količina L. reuteri u svrhu prevencije ili poboljšanja najmanje jednog socijalnog ponašanja kod njenog potomstva, i u nekim slučajevima ta majka je gojazna, sa prekomernom telesnom težinom ili ima ishranu sa visokim sadržajem masti. U nekim postupcima, trudnica je identifikovana kao da joj je potrebna efikasna količina L. reuteri jer je gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili na ishrani sa visokim sadržajem masti, iako u nekim slučajevima nije. Individua može biti izložena riziku da ima najmanje jedan deficit socijalnog ponašanja jer je njegova biološka majka bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili na ishrani sa visokim sadržajem masti, i identifikacija takvog rizika je deo nekih postupaka. U drugim primerima izvođenja, L. reuteri prema pronalasku se može primeniti za povećanje društvene povezanosti, poboljšanje raspoloženja, smanjenje depresije i poboljšanje blagostanja kod individue, uključujući prijatelje, članove porodice, kolege i partnere.
[0039] U određenim aspektima otkrića, najmanje jedan simptom najmanje jednog neurorazvojnog poremećaja se leči efikasnom količinom L. reuteri. Individua se može lečiti od socijalnih deficita i promena u mikrobiomu creva tako što će se trudnoj majci ili potomstvu obezbediti efikasna količinu formulacije L. reuteri. Efikasna količina formulacije L. reuteri može indirektno ili direktno da poboljša socijalnu interakciju jer indirektno ili direktno indukuje sinaptičku potencijaciju (LTP) u ventralnoj tegmentalnoj oblasti (VTA) individue. Efikasna količina formulacije L. reuteri može indirektno ili direktno povećati broj oksitocinskih imunoreaktivnih neurona u hipotalamusu. Aspekti otkrića utiču na posledice ishrane majke, disbiozu crevne mikrobiote, plastičnost VTA i abnormalno socijalno ponašanje obezbeđivanjem efikasne probiotičke terapije L. reuteri za individuu.
[0040] U specifičnim primerima izvođenja, individui je obezbeđena terapija ili preventiva za jedan ili više deficita socijalnog ponašanja pored kompozicija za upotrebu u pronalasku. Na primer, može im biti obezbeđeno sledeće kao dodatak L. reuteri: a) druge vrste bakterija, b) prebiotičke i druge hranljive materije (npr., vitamini, lipidi, proteini, itd.) sa L. reuteri i c) bihejvioralna terapija u kombinaciji sa L. reuteri.
[0041] L. reuteri ne može biti isporučen kao živi mikroorganizam, ali umesto toga specifični ekstrakt ili frakcija proizvedena iz živog mikroorganizma može biti podjednako bioaktivna. Ovo je pokazano, na primer, u slučaju zarastanja rana kod životinja, u kojima konzumirane ultrazvukom obrađene smeše ili lizati pripremljeni od živih ili mrtvih L reuteri su biološki aktivni u modelu zarastanja rana (Poutahidis et al., 2013; Varian et al., 2016). Smeše, lizati ili ekstrakti se mogu isporučiti u obliku pilule ili bilo kog drugog standardnog načina isporuke (hrana ili tečni napici, jogurt, suvi prah pomešan u vodi ili piću u kome se takve smeše mogu efikasno dozirati i konzumirati u biološki aktivnom formatu.
III. Kompleti prema otkriću
[0042] Kompleti su takođe opisani ovde. Kompleti za implementaciju postupaka opisanih ovde su posebno razmatrani. U nekim aspektima, postoje kompleti za lečenje deficita socijalnog ponašanja kod individue i/ili sprečavanje pojave najmanje jednog simptoma deficita socijalnog ponašanja kod individue. Komplet se može obezbediti za lečenje i/ili prevenciju deficita socijalnog ponašanja kod pojedinca, i u nekim slučajevima u kojima je majka individue gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili na dijeti sa visokim sadržajem masti. U nekim aspektima, komplet je za trudnu majku koja je gojazna, sa prekomernom telesnom težinom i/ili na ishrani sa visokim sadržajem masti, iako je u drugim slučajevima komplet za svaku trudnu majku ili bilo koje novorođenče, dete, adolescenta ili odraslu osobu.
[0043] Kontejneri kompleta će generalno uključivati najmanje jednu bočicu, test epruvetu, bocu, flašu, špric ili drugi kontejner, u koji komponenta Lactobacillis (uključujući L. reuteri) može biti postavljena, i poželjno, u odgovarajućoj alikvoti. Kada u kompletu postoji više od jedne komponente osim komponente Lactobacillis (uključujući L. reuteri), komplet će takođe generalno sadržati drugi, treći ili drugi dodatni kontejner u koji dodatne komponente (kao što je druga bakterija) mogu biti odvojeno postavljene. Međutim, različite kombinacije komponenti mogu biti sadržane u bočici. Kompleti ovog otkrića takođe će tipično uključivati sredstva za držanje kompozicija i bilo koje druge kontejnere reagensa postavljene blisko i zatvorene za komercijalnu prodaju. Takvi kontejneri mogu uključivati plastične kontejnere za injekcije ili livene duvanjem u koje se zadržavaju željene bočice.
[0044] Kada su komponente kompleta obezbeđene u jednom i/ili više tečnih rastvora, tečni rastvor je vodeni rastvor, pri čemu je posebno poželjan sterilni vodeni rastvor. Međutim, komponente kompleta mogu biti obezbeđene kao „stab“ ili kao sušeni prah(ovi). Kada su reagensi i/ili komponente obezbeđeni kao suvi prah, prah se može rekonstituisati dodatkom odgovarajućeg rastvarača. Predviđeno je da se rastvarač takođe može obezbediti u drugom kontejneru. Komponente kompleta mogu biti upakovane ili u vodenom medijumu ili u liofilizovanom obliku.
[0045] Komplet će takođe sadržati uputstva za upotrebu komponenti kompleta, kao i upotrebu bilo kog drugog reagensa koji nije uključen u komplet. Uputstva mogu uključivati varijacije koje se mogu implementirati.
[0046] U nekim aspektima otkrića, drugi tretmani za deficite socijalnog ponašanja su uključeni u komplet. Drugi tretmani mogu uključivati bihejvioralne tretmane, lekove ili oba. Kada individua ima neki od nekih neurorazvojnih poremećaja, individua može imati dodatna medicinska stanja kao što su poremećaj sna, napadi i/ili gastrointestinalni (GI) distres i kompleti mogu takođe imati ove terapeutske kompozicije.
PRIMERI
[0047] Sledeći primeri su uključeni da pokažu neke primere izvođenja pronalaska. Stručnjaci bi trebalo da razumeju da tehnike otkrivene u primerima koji slede predstavljaju tehnike koje je pronalazač otkrio da dobro funkcionišu u primeni pronalaska, i stoga se mogu smatrati da predstavljaju neke načine za njegovo izvođenje.
[0048] U posebnim primerima izvođenja, nalazi otkrića povezuju disfunkciju creva i mozga. Ovde je opisano da ishrana sa visokim sadržajem masti kod majke (MHFD) izaziva promenu u mikrobnoj ekologiji koja ima direktan negativan uticaj na socijalno ponašanje. Naročito je otkriveno da promene izazvane MHFD u mikrobiomu creva potomaka blokiraju dugotrajnu neuralnu adaptaciju u mezolimbičkom dopaminskom sistemu nagrađivanja (ventralna tegmentalna oblast, VTA). Od još šireg interesa i značajnog uticaja je identifikacija probiotičkog kandidata (jedna vrsta bakterije, barem u nekim slučajevima) koji preokreće sinaptičku funkciju u VTA, socijalno ponašanje, kao i nivoe oksitocina, „društvenog hormona“ (Donaldson and Young, 2008; Insel, 2010), u mozgu MHFD potomaka.
PRIMER 1
[0049] Socijalna ponašanja su pogoršana kod MHFD potomaka. Da bi se istražilo kako gojaznost majke izazvana ishranom utiče na neurorazvoj potomstva, ženke miševa su hranjene redovnom ishranom (RD) ili ishranom sa visokim sadržajem masti (HFD) tokom 8 nedelja, što je standardni period potreban da se postigne stanje gojaznosti izazvane ishranom kod miševa (Aye et al., 2015). Ženke su zatim parene sa mužjacima da bi se dobilo potomstvo koje je dobilo redovnu ishranu nakon razdvajanja od majke (Sl.1A). Kao što se očekivalo, MHFD je značajno povećao težinu majke (Sl. 8A-8C). U skladu sa izveštajima o češćim spontanim pobačajima kod gojaznih majki (King, 2006), veličina legla je smanjena (Sl.8D) i povećana je latencija do prvog legla kod ženki miševa hranjenih HFD (Sl. 8E). Važno je napomenuti da nije bilo značajne razlike u težini potomstva između kohorti ishrane majki u dobi od 7-12 nedelja (Sl.
8F i 8G), u vreme kada su sprovedeni bihejvioralni i elektrofiziološki eksperimenti.
[0050] S obzirom da je gojaznost majke povezana sa ASD (Bilder et al., 2013; Dodds et al., 2011; Krakowiak et al., 2012; Moss and Chugani, 2014) i deficijentne socijalne interakcije su istaknuta karakteristika osoba sa ASD (Mefford et al., 2012), ispitivano je socijalno ponašanje kod potomaka MRD i MHFD. Prvo, recipročne socijalne interakcije su procenjene beleženjem količine vremena koje je par miševa proveo u interakciji u neutralnoj areni (Sl. 1B). U poređenju sa MRD potomcima, MHFD potomci su imali manje recipročnih interakcija (Sl.1C, 1D, 9A i 9B). Zatim, test sa tri komore (Silverman et al., 2010) korišćen je za procenu a) društvenosti upoređivanjem vremena koje su miševi proveli u interakciji sa praznim žičanim kavezom naspram onog koji sadrži miša i b) preferenciju za socijalnu novinu merenjem vremena koje su miševi proveli u interakciji sa poznatim mišem naspram nepoznatog (Sl.1E). U skladu sa rezultatima iz recipročnih socijalnih interakcija, MHFD potomci su imali smanjenu društvenost i nisu pokazivali preferenciju za socijalnu novinu (Sl. 1F-1I, 9C i 9D). Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da potomci MHFD pokazuju socijalne deficite.
[0051] Disbioza crevne mikrobiote kod MHFD potomaka. Različiti faktori mogu doprineti etiologiji socijalnih abnormalnosti ponašanja izazvanih MHFD. Međutim, pokazalo se da gojaznost majke menja mikrobiom creva potomaka (Galley et al., 2014; Ma et al., 2014) i individue sa dijagnozom ASD često istovremeno imaju disbiozu crevne mikrobiote (Kohane et al., 2012; Mayer et al., 2014; Parracho et al., 2005). Da bi se ispitalo da li MHFD izaziva promene u mikrobioti creva potomaka, bakterijski sastav i struktura zajednice u fecesu MRD i MHFD potomaka analizirani su sekvenciranjem gena 16S ribozomalne RNK (rRNK). Mikrobne zajednice kod MRD i kod MHFD potomaka sastojale su se od tipične mikrobiote creva miša, kojom su dominirali Bacteroidetes i Firmicutes (Sl.10A-10D). Dok se raznolikost bakterija izračunata na osnovu ponderisanih UniFrac udaljenosti [procena strukture zajednice uzimajući u obzir abundancu operativnih taksonomskih jedinica (OTU)] nije značajno razlikovala potomstvo iz bilo koje grupe ishrane (Sl. 10E), neponderisane analize UniFrac udaljenosti (procena struktura zajednice uzimajući u obzir samo OUT prisustvo/odsustvo) otkrila je značajnu razliku između struktura bakterijskih zajednica (Sl. 1J). Pored toga, raznovrsnost mikrobiote kod MHFD potomaka je smanjena u poređenju sa MRD mikrobiotom (Sl. 10F). U skladu sa prethodnim izveštajima (Turnbaugh et al., 2006), režim HFD kod majki indukovao je značajnu promenu u sastavu i raznolikosti mikrobioma majke (Sl. 11A i 11B), koja je bila slična onoj uočenoj kod njihovih potomaka (Sl.1J i 10F).
[0052] Mikrobiota creva posreduje u socijalnim deficitima indukovanim MHFD. Dok se mikrobne zajednice razlikuju među individuama (Yatsunenko et al., 2012), poznato je da članovi porodice koji žive zajedno dele svoju mikrobiotu (Song et al., 2013). Pošto su miševi koprofagi i prenose crevnu mikrobiotu jedan između drugog fekalno-oralnim putem (Ridaura et al., 2013), ispitano je da li zajednički smeštaj MHFD sa MRD miševima sprečava socijalne deficite kod MHFD potomaka. U tom cilju, prilikom razdvajanja od majke (3 nedelje) MHFD miš je smešten zajedno sa tri MRD miša (Sl. 2A i 2B). Kontrolne grupe su se sastojale od pojedinačnih kaveza koji su sadržali ili četiri MHFD miša ili četiri MRD miša (Sl. 2B). Sakupljeni su fekalni uzorci i procenjeno je socijalno ponašanje kod MRD i MHFD potomaka kada su miševi bili stari 7-8 nedelja. Zapanjujuće, MHFD miševi koji su smešteni zajedno sa MRD miševima pokazali su normalne recipročne društvene interakcije (Sl.2C, 2D, 12A i 12B), kao i normalnu društvenost i preferenciju za socijalnu novinu, kao što je utvrđeno testom sa 3 komore (Sl. 2E, 2F, 12C i 12D). Dakle, zajednički smeštaj sa kontrolnim miševima ispravlja socijalne deficite kod MHFD potomaka.
[0053] Zatim je ispitano da li je zajednički smeštaj takođe korigovao promene u mikrobioti MHFD potomaka. Zaista, zajednički smeštaj je izazvao promenu u bakterijskom filogenetskom profilu MHFD miševa tako da liči na onu kod MRD miševa ili zajedno smeštenih MRD miševa (Sl. 2G), čime se ispravljaju promene izazvane MHFD u komensalnoj mikrobioti. U skladu sa idejom da fekalnoj mikrobioti MHFD potomaka nedostaje jedna ili više korisnih bakterijskih vrsta potrebnih za normalno društveno ponašanje, zajednički smeštaj jednog MRD sa tri MHFD potomka bio je dovoljan da se spasu i socijalno ponašanje i filogenetski profil mikrobiote potomaka MHFD (Sl.13A-13G).
[0054] Kolonizacija miševa bez mikroba (GF) mikrobiotom iz MRD, ali ne i MHFD miševa, preokreće njihovo deficijentno socijalno ponašanje. Studije na GF miševima su pokazale da crevna mikrobiota može uticati na razvoj i funkciju mozga (Cryan i Dinan, 2012). Smatralo se da, ako je nedostatak jedne ili više vrsta bakterija u mikrobioti MHFD potomaka odgovoran za njihovo defektno socijalno ponašanje, GF miševi bi takođe trebalo biti socijalno deficijentni. Potvrđujući ovo razmatranje, socijalno ponašanje je narušeno kod GF miševa (Sl.
3A-3D i 14A-14D).
[0055] Da bi se identifikovale funkcionalne razlike između zajednica crevnih mikroba i utvrdilo da li je njihova uloga uzročna, (gavažirana) fekalna mikrobiota je presađena iz odraslih MRD i MHFD potomaka u GF miševe starosti 4 nedelje (Sl.3E) i 8 nedelja (Sl.3F). Zanimljivo je da GF miševi koji su primili fekalnu mikrobiotu od MRD potomaka prilikom razdvajanja od majke (4 nedelje; Sl. 3G, 3H, 14E i 14F), ali ne u 8 nedelja (Sl. 3I, 3J, 14G i 14H), pokazali su normalno socijalno ponašanje. Nasuprot tome, GF miševi koji su primili fekalnu mikrobiotu od MHFD potomaka ostali su socijalno oštećeni, bez obzira na starost u kojoj je izvršen fekalni transfer (Sl. 3G-3I i 14E-14H). Štaviše, kao u slučaju filogenetskog odvajanja MRD i MHFD mikrobiote (Sl. 1J), bakterijske zajednice kod GF miševa koji su primali feces od potomaka MHFD donora grupisane su odvojeno od onih GF miševa koji su primali feces od potomaka MRD donora, bez obzira na to da li je fekalna transplantacija izvršena u 4 ili 8 nedelja (Sl.3K, 3L i 15A-15F). Ovi podaci otkrivaju neurorazvojni prozor tokom kojeg mikrobna rekonstitucija efikasno poboljšava socijalno ponašanje.
[0056] MHFD negativno utiče na podskup bakterija u crevima i selektivno ponovno uvođenje Lactobacillus (L.) reuteri vraća socijalne deficite kod MHFD potomaka. Da bi se istražilo koje bakterijske vrste su odsutne u zajednici mikrobiota MHFD potomaka, izvršeno je metagenomsko „šotgan“ sekvenciranje fekalnih uzoraka iz MHFD i MRD potomaka. Analiza je identifikovala nekoliko vrsta čija je relativna brojnost dramatično smanjena u mikrobioti potomaka MHFD (Sl. 7). Među njima, L. reuteri bio je najdrastičnije smanjen (> 9 puta) u populaciji mikrobiote MHFD, u poređenju sa mikrobiotom MRD (Sl.7).
[0057] Pokazano je da L. reuteri stimuliše nivo oksitocina (Poutahidis et al., 2013), hormona koji igra ključnu ulogu u socijalnom ponašanju (Donaldson and Young, 2008). Smatralo se da je selektivno smanjenje u L. reuteri u mikrobioti MHFD potomaka bilo uzročno povezano sa njihovim socijalnim deficitima. Da bismo ovo okarakterisali, L. reuteri su uvedeni u vodu za piće MHFD potomaka prilikom razdvajanja od majke, tokom 4 nedelje, nakon čega je testirano ponašanje (Sl. 4A). Izvanredno, tretman sa L. reuteri značajno je poboljšao društvenost i preferenciju za socijalnu novinu kod MHFD potomaka (Sl.4B, 4C, 4E, 16A i 16B). Rezultati nekoliko kontrolnih eksperimenata naglašavaju specifičnost L. reuteri-posredovanog spašavanja socijalnih ponašanja kod MHFD potomaka. Prvo, voda za piće tretirana resuspendovanim medijumom ili toplotom ubijenim L. reuteri (80°C tokom 20 min) nisu uspeli da povrate socijalno ponašanje kod MHFD potomaka (Sl.4B-4D, 16A i 16B). Drugo, voda za piće sa živom L. reuteri nije promenila socijalno ponašanje MRD potomaka (Sl.4B, 4C, 16A i 16B), verovatno zato što njihova crevna mikrobiota već sadrži dovoljno L. reuteri. Na kraju, dodavanje L. reuteri u vodu za piće nije imalo veći uticaj na vitalnost bakterija i postupak ubijanja toplotom je potpuno ukinuo jedinice koje formiraju kolonije (Sl.16C). Važno je da je poboljšanje socijalnog ponašanja specifično za L. reuteri jer sličan tretman sa drugom vrstom Lactobacillus, L. johnsonii, čija je brojnost takođe smanjena u crevnoj mikrobioti MHFD potomaka (Sl.7), nije uspeo da spase socijalno ponašanje kod MHFD potomaka (Sl.17A-17G).
[0058] MHFD potomci pokazuju druge osobine ponašanja koje su povezane sa ASD, kao što su ponavljajuće ponašanje i anksioznost (Sl. 18A-18B - 19A-19F). Zanimljivo je da, iako zajednički smeštaj WMHFD sa MRD potomcima vraća društveno ponašanje (Sl.4B i 4C), nije uspeo da spase zakopavanje klikera (Sl.18B), zadatak ponašanja koji odražava ponavljajuće i perseverativno ponašanje (Thomas et al., 2009). Shodno tome, miševi bez mikroba su takođe pokazali povećano zakopavanje klikera, i fekalne mikrobne transplantacije od MRD (ili MHFD) potomaka u GF miševe nisu uspele da spasu ponavljajuće ponašanje (Sl.18B). Dakle, ponavljajuća ponašanja kod MHFD potomaka ne zavise od promena u mikrobiomu creva. Dodatno, L. reuteri tretman nije uspeo da spase promene u anksioznosti kod MHFD potomaka (Sl. 19B-19C). Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da rekonstitucija L. reuteri posebno spašava socijalne, ali ne i druge bihejvioralne endofenotipove povezane sa ASD.
[0059] Nivoi oksitocina su smanjeni u hipotalamusu MHFD potomaka. Sve je više dokaza da neuropeptid oksitocin modulira brojne aspekte socijalnog ponašanja (Donaldson and Young, 2008; Insel, 2010) i da je uključen u ASD (Lerer et al., 2008; Wu et al., 2005). L. reuteri, koji je spasio socijalno ponašanje kod MHFD miševa (Sl.4B, 4C i 4E), prijavljeno je da povećava nivoe oksitocina (Poutahidis et al., 2013). Pošto se oksitocin primarno sintetiše u paraventrikularnim jezgrima (PVN) hipotalamusa, razmatrano je da se upoređuje broj ćelija koje eksprimiraju oksitocin u PVN potomaka MRD i MHFD. Zanimljivo, MHFD potomci su imali značajno manje oksitocin imunoreaktivnih neurona u poređenju sa MRD potomcima (Sl.
4F-4H, 4K i 4L). Smanjenje imunoreaktivnosti oksitocina nije bilo posledica ukupnog smanjenja PVN neurona, jer je ukupan broj neurona bio nepromenjen (kako je mereno NeuN bojenjem; Sl. 4G, 4H, 4M i 4N). Posebno, kod L. reuteri-tretiranim MHFD potomcima, broj ćelija koje eksprimiraju oksitocin bio je veći nego kod potomaka MHFD tretiranih kontrolnom (Sl. 4I, 4J, 4O i 4P). Dakle, broj imunoreaktivnih neurona na oksitocin u PVN je smanjen kod MHFD potomaka, ali se može obnoviti tretmanom L. reuteri.
[0060] Funkcija mezolimbičkog dopaminskog sistema nagrađivanja je oštećena kod MHFD potomaka. Regioni mozga koji reaguju na stimuluse koji prirodno nagrađuju, uključujući ventralnu tegmentalnu oblast (VTA) i nucleus accumbens (NAc), krucijalno su uključeni u socijalno ponašanje (Dolen et al., 2013; Gunaydin et al., 2014; Huang and Hessler, 2008). Pored toga, neuroni koji eksprimiraju oksitocin u PVN projektuju se na VTA (Melis et al., 2007). Oksitocin aktivira VTA neurone i kod miševa i kod ljudi, čime utiče na obradu socijalno relevantnih znakova (Gregory et al., 2015; Groppe et al., 2013; Tang et al., 2014) i blokada receptora oksitocina u VTA sprečava socijalnu vezu kod glodara (Pedersen et al., 1994). S obzirom na to da socijalna stimulacija može biti posebno korisna i da pokreće sinaptičku potencijaciju u VTA DA neuronima ptica (Huang and Hessler, 2008), razmatrano je da li direktna socijalna interakcija izaziva dugoročnu potencijaciju (LTP) sinaptičkih inputa u VTA DA neurone (Sl. 20A-20C). U tom cilju, zabeleženi su AMPAR/NMDAR odnosi glutamatergičnih ekscitatornih postsinaptičkih struja (EPSC) kod MRD i MHFD potomaka 24 sata nakon 10-minutne recipročne interakcije sa nepoznatim ili sa poznatim mišem (Sl. 5A). Kod kontrolnih MRD miševa, socijalna interakcija sa nepoznatim, ali ne i sa poznatim mišem, pokrenula je LTP u VTA DA neuronima, što je određeno povećanjem AMPAR/NMDAR odnosa (Sl. 5B i 5D). Nasuprot tome, kod MHFD potomaka, društvena interakcija sa nepoznatim nije uspela da izazove LTP u njihovim VTA DA neuronima (Sl.5C i 5E). Ulaznoizlazne krive, odnosi uparenih impulsa i frekvencija i amplituda minijaturnih EPSC (mEPSC) pokazuju da se oštećenje LTP izazvano socijalnom interakcijom kod MHFD potomaka ne može pripisati promenama u bazalnom sinaptičkom prenosu (Sl.21A-21E).
[0061] Preslikavajući elektrofiziološke rezultate, MRD potomci su proveli znatno više vremena u interakciji sa nepoznatim nego sa poznatim mišem, ali MHFD potomci nisu (Sl. 5F i 5G). Dakle, socijalna interakcija izaziva dugotrajno povećanje aktivnosti dopaminergičkog sistema nagrađivanja MRD, ali ne i kod MHFD, potomaka. Tretman sa L. reuteri ili oksitocinom preokreće kako LTP u VTA DA neuronima tako i socijalno ponašanje kod MHFD potomaka. Zatim se razmatralo da li bi L. reuteri tretman, koji vraća društvenost i preferenciju za socijalnu novinu kod MHFD potomaka (Sl.4B, 4C i 4E), takođe spasio recipročnu socijalnu interakciju i povezane promene u sinaptičkoj snazi u VTA. Živi (Sl.5H i 5J), ali ne ubijen toplotom (Sl.5I i 5K), L. reuteri spasio je LTP izazvan interakcijom sa nepoznatim u VTA, kao i recipročne socijalne interakcije kod MHFD potomaka (Sl. 5L). Tako, L. reuteri obnavlja LTP izazvan socijalnom interakcijom u VTA potomaka MHFD.
[0062] Ovi nalazi, zajedno sa činjenicom da je L. reuteri tretman povećao imunoreaktivnost oksitocina u PVN potomaka MHFD (Sl.4I, 4J 4O i 4P), doveo je do ispitivanja da li direktna primena oksitocina takođe može da preokrene bihejvioralne i elektrofiziološke deficite karakteristične za MHFD potomke. Da bi se ovo okarakterisalo, oksitocin je davan intranazalno - poželjan postupak davanja neuropeptida u mozak zaobilazeći invazivnije postupke (Penagarikano et al., 2015) - na MHFD potomcima i recipročne socijalne interakcije merene su 30 minuta kasnije. Iako ni sam oksitocin ni samo socijalna interakcija nisu uspeli da spasu LTP izazvan socijalnom interakcijom u VTA, kombinacija socijalne interakcije i tretmana oksitocinom je obnovila LTP u VTA potomaka MHFD (Sl.6A i 6B), podržavajući prethodni rad koji implicira sinergistički efekat oksitocina i dopamina u obradi socijalno relevantnih znakova (Modi and Young, 2012). Shodno tome, tretman oksitocinom je poboljšao recipročnu socijalnu interakciju (Sl. 6C, 6D, 22A i 22B), kao i društvenost i preferenciju za socijalnu novinu (Sl.6E, 6F, 22C i 22D). Dakle, primena oksitocina spašava socijalno ponašanje i srodne neuronske adaptacije u VTA potomaka MHFD.
[0063] Zajedno, podaci pokazuju da MHFD narušava sinaptičke adaptacije posredovane oksitocinom u VTA koje su u osnovi socijalnog ponašanja.
Značaj određenih primera izvođenja
[0064] Precizna rekonstitucija mikrobioma ima terapeutski potencijal za individue sa ASD i drugim neurorazvojnim poremećajima. Nedavno istraživanje Centra za kontrolu i prevenciju bolesti procenjuje da je oko jedno od 45 dece pogođeno ASD (Zablotsky et al., 2015). Uprkos značajnom povećanju njegove incidence, trenutno ne postoje lekovi koji mogu da izleče ASD ili da leče osnovne simptome. Stoga je razvoj novih strategija lečenja od ključnog značaja. Iako se sumnja da genetika i životna sredina i njihove interakcije izazivaju ASD, faktori životne sredine mogu činiti veliki deo slučajeva ASD (Hallmayer et al., 2011). Zapanjujuće je da se sve veća prevalencija ASD ogleda u porastu gojaznosti odraslih. Ovo predstavlja veliki zdravstveni problem jer se više od polovine novorođenčadi u SAD rađa od majki koje su ili gojazne ili izložene ishrani sa visokim sadržajem masti (HFD) tokom trudnoće (Ogden et al., 2014) i postoji sve veći broj dokaza da gojaznost majke povećava rizik od neuropsihijatrijskih poremećaja kod potomaka, uključujući ASD (Krakowiak et al., 2012; Sullivan et al., 2014). Zaista, nedavna studija je otkrila da je 1.5 puta veća verovatnoća da će majke sa gojaznošću imati dete sa ASD i povećani rizik od dece sa ASD je bio dvostruko veći kod trudnica sa gojaznošću i gestacijskim dijabetesom (Connolly et al., 2016). Dok je većina fokusa na terenu bila na inflamaciji (Bolton and Bilbo, 2014) ili epigenetskim promenama (Mathers and McKay, 2009), biološki mehanizam kojim gojaznost majke utiče na neurorazvoj potomstva ostaje nejasan. Ovde je pokazano da je disfunkcija ponašanja povezana sa gojaznošću izazvanom MHFD izazvana promenama u mikrobioti creva potomaka. Nekoliko linija dokaza podržava ovu ideju. Prvo, osobe sa dijagnozom ASD često istovremeno imaju disbiozu crevne mikrobiote (Kohane et al., 2012; Mayer et al., 2014; Parracho et al., 2005). Drugo, gojaznost majke dovodi do promena u mikrobiomu creva potomaka kod ljudi i nehumanih primata (Galley et al., 2014; Ma et al., 2014). Treće, kod miševa, mikrobiota creva MHFD potomaka je izmenjena (Sl. 1A-1J) smanjenjem specifičnih vrsta bakterija (Sl. 7). Četvrto, manipulacija zajednicom mikrobioma zajedničkim smeštajem MHFD sa MRD potomcima spašava socijalne deficite izazvane MHFD i koriguje njihov mikrobni filogenetski profil (Sl. 2A-2G). Peto, GF miševi su socijalno oštećeni i fekalna mikrobiota presađena iz MRD (ali ne i MHFD) potomaka spašava socijalno ponašanje GF (Sl. 3A-3L). Konačno, tretman jednom bakterijskom vrstom, L. reuteri, koja je dramatično smanjena kod MHFD potomaka (Sl.7), obnavlja socijalno ponašanje kod MHFD miševa (Sl.4A-4P).
[0065] U specifičnim primerima izvođenja, postoji model u kome L. reuteri poboljšava socijalno ponašanje stimulisanjem funkcija posredovanih oksitocinom. U skladu sa ovim modelom, L. reuteri-tretman povećava nivoe oksitocina u PVN miševa MHFD (Sl. 4I i 4J) i direktni tretman oksitocinom normalizuje društveno ponašanje MHFD (Sl. 6A-6F). U specifičnim primerima izvođenja, L. reuteri stimuliše oksitocin u mozgu jer vagusni nerv (Davari et al., 2013; Foster and McVey Neufeld, 2013) je glavni put komunikacije između creva/L. reuteri i promena oksitocina u PVN. Poznato je da se vlakna vagusnog nerva projektuju na PVN (Sabatier et al., 2013; Uvnas-Moberg et al., 2014). Pored toga, aktivnost neurona u PVN izazvana kolonizacijom bakterija je blokirana subdijafragmatičnom vagotomijom (Wang et al., 2002). Posebno su relevantni izveštaji da L. reuteri-posredovano povećanje oksitocina zavisi od vagusnog nerva (Poutahidis et al., 2013) i da je druga vrsta Lactobacillus, L. ramnosus, smanjila anksioznost izazvanu stresom na način zavisan od vagusa (Bravo et al., 2011).
[0066] Rezultati pružaju novi uvid u mehanizam kojim MHFD uzrokuje ASD i kako značajan pomak u mikrobnoj ekologiji, zbog MHFD, može negativno uticati na socijalno ponašanje i povezane neuronske promene kod potomstva. Ove neuronske adaptacije, koje leže u osnovi socijalnog ponašanja tako što povećavaju istaknutost i vrednost nagrađivanja od socijalnih stimulusa, iznenađujuće su narušene promenama u crevnom mikrobiomu izazvanim ishranom majke (Sl.5A-5L). Zanimljivo je da, prema nedavnom radu, obnavljanje propustljivosti creva zasnovano na probioticima u mišjem modelu ASD može poboljšati neka ponašanja slična ASD, ali ne i socijalno ponašanje (Hsiao et al., 2013). S obzirom da su pronalazači identifikovali drugog kandidata za probiotike, L. reuteri, koji spašava socijalno ponašanje (Sl. 4A-4P i 5A-5L), ali ne i druga ponašanja poput ASD (Sl. 18A-18B i 19A-19F) kod MHFD miševa, u specifičnim primerima izvođenja pažljivo izabrana kombinacija probiotika je korisna kao neinvazivni tretman za milione pacijenata koji pate od ASD.
PRIMER 2
PRIMERI MATERIJALA I METODA
[0067] Ishrana za miševe i majke. C57Bl6/J miševi su dobijeni od Jackson Laboratories (#000-664) i držani su u ciklusu svetlo/mrak od 12 sati i imali su pristup hrani i vodi ad libitum. Ženke su bile na redovnoj ishrani (RD) koja se sastojala od 13.4% kcal od masti, 30% kcal od proteina i 57% kcal od ugljenih hidrata (Lab Diets, #5001) ili ishrani sa visokim sadržajem masti (HFD) koja se sastojala od 60% kcal od masti, 20% kcal od proteina i 40% kcal od ugljenih hidrata (Research Diets, #D12492). Težina majke je merena nedeljno. Ukupna masa i masa masti majke su merene korišćenjem mq7.5 Minispec NMR analizatora telesne kompozicije. Nakon osam nedelja na ishrani, ženke su uparene sa odraslim mužjacima C57Bl6/J da bi se dobilo potomstvo. Dobijeni potomci su razdvojeni od majke u dobi od tri nedelje i svi su stavljeni na RD, bez obzira na ishranu majke (MRD ili MHFD). Miševi bez mikroba (C57Bl6/J) su održavani u fleksibilnom izolatoru napajanim HEPA filtriranim vazduhom i sa ozračenom hranom i vodom. Potomstvo bez mikroba je razdvojeno od majke sa četiri nedelje starosti. Svi testovi ponašanja su obavljeni na mužjacima miševima starim 7-12 nedelja.
[0068] Brigu o životinjama i eksperimentalne postupke odobrio je institucionalni komitet za negu i upotrebu životinja Medicinskog koledža Bejlor u skladu sa svim smernicama koje su postavili Nacionalni instituti za zdravlje SAD. Recipročna socijalna interakcija. Miševi su smešteni u arenu od pleksiglasa veličine 25x25x25 cm, na koju prethodno nisu bili naviknuti, bilo sa poznatom (jedinka u istom kavezu) ili sa nepoznatom konspecifičnom jedinkom koja odgovara po starosti i polu. U svim eksperimentima, upareni miševi su upareni za ishranu majke, izvor kolonizacije i/ili tretman. Snimili smo vreme kada je par miševa bio uključen u socijalnu interakciju (blisko praćenje, dodirivanje, njuškanje od nosa do nosa, njuškanje od nosa do anusa i/ili puzanje jedan ispod drugog). Ljudski posmatrač je bio slep za majčinu ishranu i/ili grupu za lečenje. Socijalno ponašanje je analizirano pomoću automatizovanog softvera AnyMaze.
[0069] Trokomorni socijalni test. Crawley-ev trokomorni test društvenosti i preferencije za socijalnu novinu izveden je kako je opisano (Silverman et al., 2010). Ukratko, miš je prvo doživeo 10-minutni period navikavanja tokom kojeg mu je bilo dozvoljeno da slobodno istražuje arenu od pleksiglasa 60x40x23cm podeljenu u tri međusobno povezane komore jednake veličine (leva, centralna, desna). Društvenost je merena tokom drugog desetominutnog perioda u kome je subjekat mogao da stupi u interakciju ili sa praznom žičanom posudom (Prazna) ili žičanom posudom koja sadrži konspecifičnu nepoznatu jedniku koja odgovara po starosti i polu (Miš 1). Vreme provedeno u interakciji (njuškanje, puzanje) bilo sa praznom posudom ili sa nepoznatim mišem koji se nalazi u drugoj posudi, kao i vreme provedeno u svakoj komori, zabeleženo je korišćenjem softvera AnyMaze, od strane nezavisnih posmatrača. Postavljanje prazne posude u levu ili desnu komoru tokom perioda društvenosti bilo je protivteža između ispitivanja. Konačno, sklonost socjalnoj novini ispitana je uvođenjem drugog nepoznatog miša (Miš 2) u prethodno praznu žičanu posudu. Vreme provedeno u svakoj komori, kao i vreme provedeno u interakciji sa mišem 1 ili mišem 2, zabeleženo je korišćenjem automatizovanog softvera AnyMaze od strane nezavisnih posmatrača.
[0070] Zakopavanje klikera. Zakopavanje klikera je izvedeno kao što je prethodno opisano (Thomas et al., 2009). Ukratko, miševi su smešteni u kavez standardne veličine koji je sadržao 20 pravilno raspoređenih crnih klikera koji su postavljeni na prostirci za spavanje od fine drvene iverice 5 cm dubine. Nakon 20 minuta, miš je uklonjen i klikeri sa najmanje dve trećine dubine zaklonjeni drvenom ivercom računali su se kao zakopani.
[0071] Otvoreno polje. Miševi su stavljeni u otvorenu arenu (40x40x20 cm) i ostavljeni da slobodno istražuju 10 minuta dok je njihova pozicija kontinuirano praćena korišćenjem softvera za praćenje (ANY-Maze). Praćenje je omogućilo merenje pređene udaljenosti, brzine i položaja u areni tokom čitavog zadatka. Zabeleženo je vreme provedeno u centru arene, definisano kao unutrašnjost 20x20 cm.
[0072] Sekvenciranje gena 16s rRNK. Postupci su prilagođeni postupcima razvijenim za projekat NIH-Human Microbiome Project (Human Microbiome Project, 2012a, b). Ukratko, bakterijska genomska DNK je ekstrahovana korišćenjem MO BIO PowerSoil DNA kompleta za izolaciju (MO BIO Laboratories). 16S rDNK V4 region je amplifikovan pomoću PCR-a i sekvencioniran na MiSeq platformi (Illumina) upotrebom 2x250 bp protokola za upareni kraj koji daje očitavanja na kraju para koja se skoro potpuno preklapaju. Prajmeri koji se koriste za amplifikaciju sadrže adaptere za MiSeq sekvenciranje i jednostrane barkodove koji omogućavaju udruživanje i direktno sekvenciranje PCR proizvoda (Caporaso et al., 2012). Očitani parovi gena 16S rRNK su demultipleksirani na osnovu jedinstvenih molekularnih bar kodova, a očitavanja su spojena korišćenjem USEARCH v7.0.1090 (Edgar, 2010), dozvoljavajući nula neusklađenosti i minimalno preklapanje od 50 baza. Spojena očitavanja su skraćena na prvoj bazi sa Q5. Filter kvaliteta je primenjen na dobijena spojena očitavanja. Očitavanja koja sadrže više od 0.05 očekivanih grešaka su odbačena. Sekvence gena 16S rRNK su grupisane u operativne taksonomske jedinice (OTU) sa graničnom vrednošću sličnosti od 97% korišćenjem UPARSE algoritma (Edgar, 2013). OTU su mapirane na optimizovanu verziju SILVA baze podataka (Quast et al., 2013) koja sadrži samo region 16S v4 za određivanje taksonomija. Abundance su dobijene mapiranjem demultipleksiranih očitavanja u UPARSE OTU. Prilagođeni skript je konstruisao razređenu OTU tabelu od izlaznih datoteka generisanih u prethodna dva koraka za nishodne analize alfa-diverziteta, beta-diverziteta (Lozupone and Knight, 2005) i filogenetskih trendova.
[0073] „Šotgan“ sekvenciranje celog genoma. Pojedinačne biblioteke konstruisane od svakog uzorka su učitane na HiSeq platformu (Illumina) i sekvencionirane upotrebom protokola za očitavanje krajnjeg-para 2x100 bp. Illumina uparene biblioteke su konstruisane od ukupne genomske DNK izolovane iz svakog uzorka. DNK je podeljena u fragmente od približno 400-600 bp, nakon čega je usledila ligacija Illumina adaptera koji sadrže molekularne barkodove za nishodno demultipleksiranje. Ovi proizvodi su zatim umnoženi PCR-om posredovanom ligacijom (LM-PCR) korišćenjem KAPA HiFi DNK polimeraze (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, SAD). Nakon prečišćavanja kuglica pomoću Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, SAD), izvršeno je kvantitativno određivanje i određena je distribucija veličine LM-PCR proizvoda korišćenjem LabChip GX sistema za elektroforezu (PerkinElmer, Akron, OH, SAD). Biblioteke su objedinjene u ekvimolarnim količinama po 6 uzoraka po grupi i pripremljene za sekvencioniranje pomoću TruSeq PE Cluster Generation Kit (Illumina). Svaki skup biblioteka je učitan u jednu traku HiSeq 2000 protočne ćelije sa dodatkom 1% PhiX kontrolne biblioteke. Datoteke sekvenciranja su demultipleksirane sa CASAVA verzijom 1.8.3 (Illumina).
[0074] Kvalitetno filtriranje, skraćivanje i demultipleksiranje je sprovedeno pomoću prilagođenog cevovoda koji sadrži Trim Galore (Krueger, 2014) i cutadapt (Martin, 2011) za adapter i kvalitetno skraćivanje i PRINSEQ (Schmieder i Edwards, 2011) za filtriranje niske složenosti i deduplikaciju sekvence. Pored toga, Bowtie2 v2.2.1 (Langmead and Salzberg, 2012) je korišćen za mapiranje očitavanja na MetaPhlAn markere za klasifikaciju bakterijskih vrsta (Segata et al., 2012).
[0075] Kolonizacija miševa bez mikroba transplantacijom fekalne mikrobiote. Sveži fekalni uzorci su sakupljeni od donorskih miševa/kohorte mikrobioma i homogenizovani na ledu u sterilnom PBS pod sterilnim uslovima. Dobijena suspenzija je centrifugirana na 1000 g tri minuta na 4oC. Supernatanti su izolovani i razblaženi do 5×10<9>CFU/ml sa sterilnim PBS. Četiri ili osam nedelja stari miševi bez mikroba (GF) C57Bl6/J su zatim odmah kolonizovani jednom sondom sa 0.2 mL rastvora. Fekalni uzorci su sakupljeni od kolonizovanih GF miševa 24h, 7d, 14d, 28d i 56d nakon kolonizacije. Fekalni uzorci su brzo zamrznuti i čuvani na -80°C dok nisu pripremljeni za sekvenciranje. Eksperimenti u ponašanju su započeti tri nedelje nakon transplantacije.
[0076] Kultura i tretman sa L. reuteri i L. johnsonii. Lactobacillus reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475) i Lactobacillus johnsonii (ATCC 33200) kultivisani su anaerobno u MRS bujonu u 90% N2, 5% CO2, 5% H2sredini. L. reuteri je ubijen toplotom držanjem bakterija na 80°C tokom 20 minuta (Wang et al., 2010). Vijabilnost bakterija je procenjena nanošenjem na ploče, a efikasnost postupka ubijanja toplotom je potvrđena odsustvom rasta kolonija nakon postavljanja. Kulture su centrifugirane, isprane i resuspendovane u anaerobnom rastvoru (PBS) i zamrznute na -80°C do upotrebe. PBS, živi ili termički ubijeni L. reuteri su dodavani u vodu za piće, koja je svakodnevno menjana da bi se minimizovala varijabilnost doze. Dok je eksperimentalna grupa primila žive bakterije, jedna kontrolna grupa je dobila identično pripremljene kulture bakterija ubijenih toplotom. Druga grupa kontrolnih miševa je primila vodu tretiranu samo sa PBS. Živi i ubijani toplotom L. reuteri isporučuju se u dozi od 1×10<8>organizmu/mišu/dan neprekidno u vodi za piće. Miševi su konzumirali tretiranu vodu ad libitum tokom perioda tretmana. Tretirana voda za piće za svaku grupu je menjana dnevno dva sata pre početka mračnog ciklusa da bi se minimizirale varijacije u izloženosti mikrobima. Analize ponašanja su započete nakon 4 nedelje tretmana L. reuteri ili kontrolnog tretmana. Protokol pripreme i primene L. johnsonii je odgovarao protokolu L. reuteri. Na kraju tretmana prikupljeni su fekalni uzorci za sekvenciranje i tkiva korišćena u studijama imunofluorescencije.
[0077] Imunofluorescencija. Miševi su duboko anestezirani inhalacijom izoflurana i perfuzirani transkardijalno sa 10 ml 0.9% fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom, a zatim sa 30 ml 4% paraformaldehida u 0.1 M fosfatnom puferu (PFA). Mozgovi su naknadno fiksirani u 4% PFA na 4°C preko noći, a zatim krioprotektovani u 30% saharoze 0.1 M PB tokom tri dana. Koronalni isečci (30 µm) debljine su dobijeni iz zamrznutog tkiva korišćenjem mikrotoma sa kliznim sečivom, a zatim su prebačeni u ledeno hladan PBS. Isečci su blokirani sa 5% normalnog kozjeg seruma, 0.3% Triton X-1000.1M PB (PBTgs) tokom 1 h ljuljanja na sobnoj temperaturi i zatim inkubirani u primarnim antitelima (zečji anti-oksitocin, ImmunoStar #20068, 1:2000; mišji anti-NeuN, Millipore, #MAB377, 1:2000) razblaženim u PBTgs ljuljajući se na 4°C tokom 24 sata. Isečci su zatim isprani tri puta sa 0.3% Triton X-1000.1 M PB. Primarna antitela su vizuelizovana korišćenjem sekundarnog kozjeg anti-zečjeg Alexa Fluor<®>488 (ThermoFisher Scientific, #A-11034) i kozjeg anti-mišjeg Alexa Fluor<®>594 (ThermoFisher Scientific, #A-11032) antitela (razblaživanje 1:1000). Isečci su inkubirani u sekundarnim antitelima ljuljajući se u mraku 1 sat na sobnoj temperaturi. Petominutno finalno ispiranje sa svakim od PBTgs, 0.1 M PB i 0.05 M PB prethodilo je postavljanju na 2% želatinom (Sigma-Aldrich, # G9391) obložena pokrovna stakla. Jedra su vizuelizovana korišćenjem Vectashield H-1200 sa DAPI (Vector Labs, #H-1200). Fluorescentno snimanje i akvizicija podataka obavljeni su na Zeiss AxioImager.Z2 mikroskopu (Car Zeiss MicroImaging) montiranom sa AxioCam digitalnom kamerom (Carl Zeiss MicroImaging). Slike su snimljene korišćenjem softvera za akviziciju AxioVision (Carl Zeiss Microimaging). Sve slike u okviru datog skupa podataka su dobijene u identičnim vremenima ekspozicije, unutar datog kanala, kako bi se omogućilo poređenje intenziteta signala. Na nekim slikama, kontrast i osvetljenost su linearno podešeni pomoću softvera Photoshop (Adobe). Obrada slika je primenjena ujednačeno na sve slike u okviru datog skupa podataka. Intenzitet fluorescencije je meren u Imaged (NIH) izborom regiona od interesa (ćelijska tela hipotalamusa pozitivna na oksitocin i NeuN). Populacija neurona koji eksprimiraju oksitocin hipotalamusa i broj NeuN+ ćelija su procenjeni u Imaged upotrebom sledećeg operativnog niza: (1) otvoriti datoteku slike, (2) oduzeti pozadinu, (3) podesiti prag, (4) pretvoriti u masku, (5) podeliti, (6) analizirati čestice. Automatska identifikacija granica ćelija je potvrđena u odnosu na izvornu sliku od strane eksperimentatora slepog za dodelu grupa.
[0078] Primena okitocina. Oksitocin je dobijen od Tocris Bioscience (proizvod 1910) i rastvoren u 10% dimetil sulfoksidu (DMSO) u PBS. 10% DMSO u PBS je korišćen kao kontrola u obliku nosača. Miševi su primili oksitocin intranazalno (približno 200 µg/kg) trideset minuta pre ponašanja. 1.25 µl rastvora oksitocina ili nosača je ubrizgano u svaku nozdrvu iz pipete P10. Doza oksitocina je odabrana prema dozama za koje je prijavljeno da spašavaju socijalno ponašanje u genetskim modelima koji fenotipski eksprimiraju ponašanja slična ASD (Penagarikano et al., 2015).
[0079] Elektrofiziologija. Snimanja su izvedena kao što je prethodno opisano (Ungless et al., 2001; Zhu et al., 2011) i istraživači su održavani slepim na uslove lečenja. Ukratko, miševi su anestezirani mešavinom ketamina (100 mg/kg), ksilazina (10 mg/kg) i acepromazina (3 mg/kg). Horizontalni isečci (debljine 225 - 300 µm) koji sadrže VTA isečeni su iz mozga C57BL/6J miševa. Miševi su transkardijalno perfuzirani sa ledeno hladnim, oksigenisanim rastvorom koji sadrži (u mM) NaCl, 87; NaHCO3, 25; KCl, 2.5; NaH2PO4, 1.25; MgCl2, 7; CaCl2, 0.5; dekstrozu, 25; saharozu, 75. Horizontalni isečci su isečeni vibrirajućim mikrotomom tkiva (VF-100 Compresstome, Precisionary Instruments, San Jose, CA, ili Leica VT 1000S, Leica Mycrosistems, Buffalo Grove, IL), inkubirani na 34°C tokom 40 minuta, držani na sobnoj temperaturi najmanje 30 minuta pre njihovog transfera u komoru za snimanje koja je kontinuirano perfundirana veštačkom cerebrospinalnom tečnošću (ACSF) na 32°C i brzinom protoka od 2-3 ml/min. Snimak ACSF sadržao je u mM: 120 NaCl, 3.3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 10 dekstroza, 1 MgCl2i 2 CaCl2. Pipete za snimanje su napravljene od tankozidnog borosilikatnog stakla (TW150F-4, WPI, Sarasota, FL). Nakon punjenja intracelularnim rastvorom (u mM): 117 CsMeSO3; 0.4 EGTA; 20 HEPES; 2.8 NaCl, 2.5 ATP-Mg 2.0; 0.25 GTP-Na; 5 TEA-Cl, podešen na pH 7.3 sa CsOH i 290 mosmol/l, imali su otpornost od 3-5 MS2. Podaci su dobijeni sa MultiClamp 700B amplifikatorom, digitalizovani na 20 kHz sa Digidata 1440A, snimljeni Clampex 10 i analizirani pomoću Clampfit 10 softvera (Molecular Devices). Snimci su filtrirani onlajn na 3 kHz sa Bessel-ovim niskopropusnim filterom. Hiperpolarizujući puls od 2 mV primenjen je pre svakog EPSC da bi se procenio ulazni i pristupni otpor (Ra). Podaci su odbačeni kada je Ra bio nestabilan ili veći od 25MS2, struja održavanja je bila > 200 pA, ulazni otpor je pao > 20% tokom snimanja ili je početna linija EPSC promenjena za > 10%. Nakon uspostavljanja gigaomske zaptivke (> 2GS2) i beleženja stabilnog spontanog paljenja u ćelijski-vezanom, režimu naponske stezaljke (-70 mV potencijal održavanja), fenotip ćelije je određen merenjem širine akcionog potencijala i prisustva struje Ih. Odnosi AMPAR/NMDAR su izračunati kao što je prethodno opisano (Ungless et al., 2001). Ukratko, neuroni su bili stegnuti naponom na 40 mV dok se struja održavanja nije stabilizovala (na < 200 pA). Monosinaptički EPSC su izazvani na 0.05 Hz sa bipolarnom stimulirajućom elektrodom postavljenom 50-150 µm rostralno u odnosu na lateralnu VTA. Pikrotoksin (100 µM) je dodat u ACSF za snimanje da bi se blokirali IPSC posredovani GABARA. Nakon snimanja dvokomponentnog EPSC, DL-AP5 (100 µM) je primenjen u kupatilu 10 minuta da bi se uklonila NMDAR komponenta, koja je zatim dobijena vanmrežnim oduzimanjem preostale AMPAR komponente od originalnog EPSC. Maksimalne amplitude izolovanih komponenti su korišćene za izračunavanje odnosa AMPAR/NMDAR. Pikrotoksin i DL-AP5 su kupljeni od Tocris Bioscience, a svi ostali reagensi su nabavljeni od Sigma-Aldrich.
[0080] Statistička analiza. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM. Za eksperimente ponašanja, statistika je zasnovana na dvostranim neuparenim Studentovim ttestovima, jednosmernoj ili dvosmernoj ANOVA sa Bonferroni post-hok analizom da bi se ispravila višestruka poređenja, osim ako nije drugačije naznačeno. Vrednosti P, t i F su predstavljene na legendama slika, n vrednosti su date na slikama. P<0.05 se smatralo značajnim. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. GraphPad-ov Prism 6 (La Jolla, CA) softver je korišćen za obavljanje statističkih analiza i za generisanje grafičkih prikaza podataka. Za sekvenciranje gena 16S rRNK, analiza i vizualizacija zajednica mikrobioma sprovedena je u RStudio 0.99.292 [http://www.R-project.org/ (2014)], koristeći philoseq paket (McMurdie and Holmes, 2013) za uvoz podataka za uzorak i izračunavanje alfa i beta metrike raznovrsnosti.
Podaci o sekvenciranju gena 16S rRNK analizirani su korišćenjem Silva 115 i 123 (Quast et al., 2013). Analize su obavljene na skupovima podataka koji su razređeni 1000x, zatim je izračunata srednja vrednost i zaokružena. Sekvence amplikona su deponovane u NCBI arhivu očitavanja sekvenci pod pristupnim brojem TBD. Modelovanje Dirichlet-ove multinomske smeše je izvedeno u majci (Schloss et al., 2009). Značajnost kategoričkih promenljivih određivana je korišćenjem neparametarskog Mann-Whitney testa za dve kategorije poređenja ili Kruskal-Wallis testa kada se upoređuju tri ili više kategorija. Jednosmerna ANOVA praćena Dunett-ovim testom višestrukih poređenja je izvedena korišćenjem GraphPad-ove Prism 6. Korelacija između dve kontinuirane promenljive je određena linearnim regresijama, gde P-vrednosti ukazuju na verovatnoću da je nagib linije regresije nula. Glavni koordinatni dijagrami su koristili Monte-Carlo permutacioni test za procenu P-vrednosti. Sve P-vrednosti su prilagođene za višestruka poređenja sa FDR algoritmom (Benjamini et al., 2001). Veličina uzorka je zasnovana na objavljenoj literaturi (Argilli et al., 2008; Caporaso et al., 2012; Chung et al., 2015; Gkogkas et al., 2013). Nijedna životinja ili podaci nisu isključeni iz analiza.
PRIMER 3
L. REUTERI TRETMAN VRAĆA SOCIJALNA PONAŠANJA U GENETSKIM I SREDINSKIM MODELIMA ASD
[0081]
A. Tretman sa L. reuteri spašava socijalno ponašanje kod miševa bez mikroba. Ranije smo pokazali da tretman sa L. reuteri preokreće deficite socijalnog ponašanja kod MHFD miševa. Međutim, da li jedna vrsta (L. reuteri) je sama direktno odgovorna za obnavljanje fenotipa socijalnog ponašanja kod MHFD potomaka ili da li je efekat L. reuteri indirektan menjanjem ili promenom aktivnosti i/ili bakterijskog ekosistema koji su odgovorni za rezultujuću biološku promenu u ponašanju trenutno je nepoznato. Da bismo razlikovali ove dve mogućnosti, lečili smo miševe bez mikroba (GF) sa L. reuteri, kao što smo gore opisali. U skladu sa našim prethodnim rezultatima, u poređenju sa konvencionalno kolonizovanim miševima, GF miševi pokazuju narušeno društveno ponašanje (Sl.23A). Zanimljivo, tretman sa L. reuteri bio je dovoljan da obnovi deficite socijalnog ponašanja kod GF miševa (Sl. 23A-23B). Pošto su GF miševi po definiciji lišeni bilo kakvih bakterija ili mikroba, naši podaci sugerišu da efekat od L. reuteri na socijalno ponašanje je direktan (nije posredovano drugom bakterijom ili mikrobom).
Dakle, tretman sa L. reuteri obnavlja socijalno ponašanje i kod MHFD potomaka i kod GF miševa.
B. Tretman sa L. reuteri spašava socijalno ponašanje u genetskom mišjem modelu ASD. Da bi se ispitalo da li bi lečenje sa L. reuteri moglo da povrati ponašanje slično ASD u genetskim modelima ASD, proučavali smo miševe kojima nedostaje kontaktin povezan sa proteinom 2 (CNTNAP2). Mutacije u CNTNAP2 su povezane sa sindromskim oblicima ASD (Nascimento, et al., 2016; Yoo, et al., 2017; Zare, et al., 2017; el-Sobky, et al., 2004; Alarcon, et al.., 2008; Sampath, et al., 2013; Chiocchetti, et al., 2015), čime služe kao genetski model autizma kod miševa. Drugo, miševi kojima nedostaje Cntnap2 pokazuju ponašanja slična ASD (Penagarikano, et al.). Treće, oksitocin spašava društvene abnormalnosti u ponašanju kod miševa kojima nedostaje Cntnap2 (Penagarikano, et al., 2015; Penagarikano, et al., 2011). Kao što je prethodno opisano (Penagarikano, et al., 2015; Penagarikano, et al., 2011), takođe smo otkrili da miševi kojima nedostaje CNTNAP2 pokazuju deficit socijalnog ponašanja, što je pokazano smanjenom društvenošću i socijalnoj novini (Sl.24A-24B). Izvanredno, otkrili smo da tretman sa L. reuteri preokreće abnormalnosti socijalnog ponašanja kod miševa sa deficijencijom Cntnap2 (Sl.24C-24D).
[0082] Ukratko, pokazali smo da a) oksitocin obnavlja socijalno ponašanje kod miševa sa deficijencijom Cntnap2 i b) L. reuteri stimuliše proizvodnju oksitocina u PVN i spašava socijalno ponašanje kod MHFD potomaka, i c) L. reuteri preokreće socijalno ponašanje u genetskom mišjem modelu ASD. Uzeti zajedno, naši podaci podržavaju ideju da tretman sa L. reuteri spašava socijalno ponašanje u sredinskim (MHFD potomci i GF miševi) i genetskim (miševi sa deficijencijom Cntnap2) modelima ASD, i uzeti zajedno sa našim prethodnim opisima odnosa između socijalne disfunkcije, nivoa oksitocina i mnogih drugih neuroloških stanja, upotreba L. reuteri terapije se može smatrati opštijim terapijskim pristupom ako se dozira i isporučuje (žive bakterije ili posebno pripremljeni ekstrakti ili lizati) na efikasan način.
PRIMER 4
LEČENJE ILI PREVENCIJA NEURORAZVOJNIH, NEURODEGENERATIVNIH I PSIHIJATRIJSKIH POREMEĆAJA
[0083] U posebnim primerima izvođenja, ovo otkriće se odnosi na neurorazvojne i psihijatrijske poremećaje: Pored neurorazvojnih poremećaja, ovo otkriće uključuje medicinska stanja u kojima je oksitocinergički sistem nefunkcionalan, uključujući Williams-ov sindrom, Prader-Willi sindrom i sindrom fragilnog X, na primer (Francis, et al., 2014). Pored toga, u posebnim primerima izvođenja koji ciljno deluju na sistem oksitocina preko primene L. reuteri je koristan za lečenje ponašanja zavisnosti, uključujući poremećaje u ishrani/hranjenju, zavisnost od droga, bipolarni poremećaj i šizofreniju, na primer (Cochran, et al., 2013; MacDonald, et al., 2014; McQuaid, et al., 2014; Sarnyai, et al., 2014; Kirsch, et al., 2015; Perez-Rodriguez, et al., 2015; Rice, et al., 2015; Romano, et al., 2015; Zik, et al., 2015; Brambilla, et al., 2016; Bukovskaya, et al., 2016; Lee, et al., 2016; Quintana, et al., 2017).
[0084] U specifičnim primerima izvođenja, efikasna količina L. reuteri se obezbeđuje individui sa ili u riziku od depresije. Depresija je jedan od najčešćih psihijatrijskih poremećaja. Izaziva teške simptome koji utiču na to kako se neko oseća, razmišlja i nosi sa svakodnevnim aktivnostima, kao što su spavanje, ishrana ili rad. Zanimljivo je da smanjeni nivoi oksitocina mogu povećati rizik od depresije, posebno postporođajne depresije (McQuaid, et al., 2014; Arletti, et al., 1987; Papp, et al., 2000; Matsushita, et al., 2010; Loyens, et al., 2013; Moura, et al., 2016; Amini-Khoei, et al., 2017). S obzirom da L. reuteri podstiče proizvodnju oksitocina, L. reuteri u određenim primerima izvođenja je koristan u lečenju velikih depresivnih poremećaja.
[0085] U određenim primerima izvođenja, zavisnost od droga, Parkinson-ova bolest i kompulzivni poremećaji sa izmenama u sistemu nagrađivanja-dopamina. Pronalazači su pokazali da L. reuteri stimuliše aktivnost dopaminergičkih neurona u ključnoj oblasti nagrade. Kod zavisnosti, gde postoji kompulzivno ponašanje koje pojačava (nagrađuje) i postoji gubitak kontrole u ograničavanju unosa, dopaminergički putevi nagrađivanja se menjaju. U specifičnim primerima izvođenja, L. reuteri je koristan za lečenje stanja u kojima su uzurpirani dopaminergički sistem i sistem nagrađivanja, uključujući zavisnost od droga (Hyman, et al., 2006), gojaznost i unos hrane (Kenny, et al., 2011; Blum, et al., 2014 ), Parkinson-ovu bolest i druga ponašanja zavisnosti, kao što je kockanje (Fenu, et al., 2009; Matsumoto, et al., 2015), na primer.
[0086] U određenim primerima izvođenja, ovo otkriće poboljšava socijalnu kognitivnu funkciju, kao što su neurodegenerativni poremećaji. Socijalno kognitivno oštećenje, koje može dovesti do lošeg kvaliteta života, problema sa mentalnim zdravljem i usamljenosti (Kennedy, et al., 2012), može biti izraženo nakon akutnog oštećenja mozga (na primer), kao što je traumatska povreda mozga ili moždani udar, i u specifičnim primerima izvođenja predstavlja ključnu karakteristiku ranih faza nekih hroničnih neuroloških poremećaja, kao što su frontotemporalna demencija, Alzheimer-ova bolest i Parkinson-ova bolest (Beer, et al., 2006; Henry, et al., 2016). Pored toga, oksitocin i dopamin su ključni za formiranje socijalne memorije (Ferguson, et al., 2000; Gonzalez-Burgos, et al., 2008; Shamay-Tsoory, et al., 2016). Kako su pronalazači utvrdili da L reuteri stimuliše proizvodnju oksitocina i sinaptičku plastičnost posredovanu dopaminom, dva sistema koji su pogođeni kod poremećaja koji pokazuju probleme socijalne kognicije (Rudelli, et al., 1984; Gibb, et al., 1989; Braak, et al., 1990; Selden, et al., 1994; Burns, et al., 2005; Ross, et al., 2009; Borroni, et al., 2010; Finger, et al., 2011; Tampi, et al., 2017), ova vrsta bakterija je korisna za lečenje socijalne memorije i kognitivne funkcije kod neuroloških i neurodegenerativnih poremećaja.
[0087] Tretman sa L. reuteri spašava socijalno ponašanje kod miševa bez mikroba. Pronalazači su ranije pokazali da tretman sa L. reuteri preokreće deficite socijalnog ponašanja kod MHFD miševa. Međutim, da li je jedna vrsta (L. reuteri) sama direktno odgovorna za obnavljanje fenotipa društvenog ponašanja kod MHFD potomaka ili da li je efekat L. reuteri indirektan menjanjem ili promenom aktivnosti i/ili bakterijskog ekosistema koji su odgovorni za rezultujuću biološku promenu u ponašanju trenutno je nepoznato. Da bi napravili razliku između ove dve mogućnosti, pronalazači su tretirali miševe bez mikroba (GF) sa L. reuteri, kao što smo gore opisali. U skladu sa našim prethodnim rezultatima, u poređenju sa konvencionalno kolonizovanim miševima, GF miševi pokazuju narušeno socijano ponašanje (Sl. 23A-23B). Zanimljivo, tretman sa L. reuteri je bio dovoljan da povrati deficite socijalnog ponašanja kod GF miševa (Sl. 23A-23B). Pošto su GF miševi po definiciji lišeni bilo kakvih bakterija ili mikroba, naši podaci sugerišu da je efekat L. reuteri na socijalno ponašanje direktan (nije posredovan drugom bakterijom ili mikrobom). Dakle, tretman sa L. reuteri obnavlja socijalno ponašanje i kod MHFD potomaka i kod GF miševa.
[0088] Tretman sa L. reuteri spašava socijalno ponašanje u genetskom mišjem modelu ASD. Da bi se ispitalo da li bi tretman sa L. reuteri mogao da povrati ponašanja slična ASD u genetskim modelima ASD, pronalazači su proučavali miševe kojima nedostaje kontaktin povezan sa proteinom 2 (CNTNAP2). Mutacije u CNTNAP2 su povezane sa sindromskim oblicima ASD (Nascimento et al., 2016; Yoo et al., 2017; Zare et al., 2017; el-Sobky et al., 2004; Alarcon et al., 2008; Sampath et al., 2013; Chiocchetti et al., 2015), čime služe kao genetski model autizma kod miševa. Drugo, miševi sa deficijencijom Cntnap2 pokazuju ponašanja slična ASD (Penagarikano et al., 2015). Treće, oksitocin spašava socijalne abnormalnosti u ponašanju kod miševa sa nedostatkom Cntnap2 (Penagarikano et al., 2015; Penagarikano et al., 2011). Kao što je prethodno opisano (Penagarikano et al., 2015; Penagarikano et al., 2011), miševi kojima nedostaje CNTNAP2 pokazuju deficit socijalnog ponašanja, što je pokazano smanjenom društvenošću i socijalnom novinom (Sl. 24A-24B). Izvanredno, tretman sa L. reuteri preokreće abnormalnosti socijalnog ponašanja kod miševa sa deficijencijom Cntnap2 (Sl.24C-24D).
[0089] Ukratko, pokazali smo da a) oksitocin obnavlja socijalno ponašanje kod miševa sa deficijencijom Cntnap2 i b) L. reuteri stimuliše proizvodnju oksitocina u PVN i spašava socijalno ponašanje kod MHFD potomaka, i c) L. reuteri preokreće socijalno ponašanje u genetskom mišjem modelu ASD. Uzeti zajedno, naši podaci podržavaju ideju da tretman sa L. reuteri spašava socijalno ponašanje u sredinskim (MHFD potomci i GF miševi) i genetskim (miševi sa deficijencijom Cntnap2) modelima ASD, i uzeti zajedno sa našim prethodnim opisima odnosa između socijalne disfunkcije, nivoa oksitocina i mnogih drugih neuroloških stanja, upotreba L. reuteri terapija se može smatrati opštijim terapijskim pristupom ako se dozira i isporučuje (žive bakterije ili posebno pripremljeni ekstrakti ili lizati) na efikasan način.
REFERENCE
[0090] Alarcon, M., et al., Linkage, association, and gene-expression analyses identify CNTNAP2 as an autism-susceptibility gene. Am J Hum Genet, 2008.82(1): p.150-9.
[0091] Amini-Khoei, H., et al., Oxytocin mitigated the depressive-like behaviors of maternal separation stress through modulating mitochondrial function and neuroinflammation. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2017.76: p.169-178.
[0092] Argilli, E., Sibley, D.R., Malenka, R.C., England, P.M., and Bonci, A. (2008). Mechanism and time course of cocaine-induced long-term potentiation in the ventral tegmental area. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 28, 9092-9100.
[0093] Arletti, R. and A. Bertolini, Oxytocin acts as an antidepressant in two animal models of depression. Life Sci, 1987.41(14): p.1725-30.
[0094] Aye, I.L., Rosario, F.J., Powell, T.L., and Jansson, T. (2015). Adiponectin supplementation in pregnant mice prevents the adverse effects of maternal obesity on placental function and fetal growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 12858-12863.
[0095] Beer, J.S. and K.N. Ochsner, Social cognition: a multi level analysis. Brain Res, 2006.
1079(1): p.98-105.
[0096] Benjamini, Y., Drai, D., Elmer, G., Kafkafi, N., and Golani, I. (2001). Controlling the false discovery rate in behavior genetics research. Behavioural brain research 125, 279-284.
[0097] Bilder, D.A., Bakian, A.V., Viskochil, J., Clark, E.A., Botts, E.L., Smith, K.R., Pimentel, R., McMahon, W.M., and Coon, H. (2013). Maternal prenatal weight gain and autism spectrum disorders. Pediatrics 132, e1276-1283.
[0098] Blum, K., P.K. Thanos, and M.S. Gold, Dopamine and glucose, obesity, and reward deficiency syndrome. Front Psychol, 2014.5: p.919.
[0099] Bolton, J.L., and Bilbo, S.D. (2014). Developmental programming of brain and behavior by perinatal diet: focus on inflammatory mechanisms. Dialogues in clinical neuroscience 16, 307-320.
[0100] Borroni, B., C. Costanzi, and A. Padovani, Genetic susceptibility to behavioural and psychological symptoms in Alzheimer disease. Curr Alzheimer Res, 2010.7(2): p.158-64.
[0101] Braak, H. and E. Braak, Alzheimer's disease: striatal amyloid deposits and neurofibrillary changes. J Neuropathol Exp Neurol, 1990.49(3): p.215-24.
[0102] Brambilla, M., et al., Effects of Intranasal Oxytocin on Long-Term Memory in Healthy Humans: A Systematic Review. Drug Dev Res, 2016.77(8): p.479-488.
[0103] Bravo, J.A., Forsythe, P., Chew, M.V., Escaravage, E., Savignac, H.M., Dinan, T.G., Bienenstock, J., and Cryan, J.F. (2011). Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 16050-16055.
[0104] Bukovskaya, O. and A. Shmukler, Oxytocin and Social Cognitions in Schizophrenia: A Systematic Review. Psychiatr Q, 2016.87(3): p.521-43.
[0105] Burns, J.M., et al., White matter lesions are prevalent but differentially related with cognition in aging and early Alzheimer disease. Arch Neurol, 2005.62(12): p.1870-6.
[0106] Caporaso, J.G., Lauber, C.L., Walters, W.A., Berg-Lyons, D., Huntley, J., Fierer, N., Owens, S.M., Betley, J., Fraser, L., Bauer, M., et al. (2012). Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal 6, 1621-1624.
[0107] Chiocchetti, A.G., et al., Variants of the CNTNAP25' promoter as risk factors for autism spectrum disorders: a genetic and functional approach. Mol Psychiatry, 2015.20(7): p.839-49.
[0108] Chung, W., Choi, S.Y., Lee, E., Park, H., Kang, J., Park, H., Choi, Y., Lee, D., Park, S.G., Kim, R., et al. (2015). Social deficits in IRSp53 mutant mice improved by NMDAR and mGluR5 suppression. Nature neuroscience 18, 435-443.
[0109] Cochran, D.M., et al., The role of oxytocin in psychiatric disorders: a review of biological and therapeutic research findings. Harv Rev Psychiatry, 2013.21(5): p.219-47.
[0110] Connolly, N., Anixt, J., Manning, P., Ping, I.L.D., Marsolo, K.A., and Bowers, K. (2016). Maternal metabolic risk factors for autism spectrum disorder-An analysis of electronic medical records and linked birth data. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research.
[0111] Cryan, J.F., and Dinan, T.G. (2012). Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature reviews Neuroscience 13, 701-712.
[0112] Davari, S., Talaei, S.A., Alaei, H., and Salami, M. (2013). Probiotics treatment improves diabetes-induced impairment of synaptic activity and cognitive function: behavioral and electrophysiological proofs for microbiome-gut-brain axis. Neuroscience 240, 287-296.
[0113] Dodds, L., Fell, D.B., Shea, S., Armson, B.A., Allen, A.C., and Bryson, S. (2011). The role of prenatal, obstetric and neonatal factors in the development of autism. Journal of autism and developmental disorders 41, 891-902.
[0114] Dolen, G., Darvishzadeh, A., Huang, K.W., and Malenka, R.C. (2013). Social reward requires coordinated activity of nucleus accumbens oxytocin and serotonin. Nature 501, 179-184.
[0115] Donaldson, Z.R., and Young, L.J. (2008). Oxytocin, vasopressin, and the neurogenetics of sociality. Science 322, 900-904.
[0116] Edgar, R.C. (2010). Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26, 2460-2461.
[0117] Edgar, R.C. (2013). UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature methods 10, 996-998.
[0118] el-Sobky, E., et al., Molecular cytogentic profiles of hepatitis C infection in patients at Sharkia Governorate, Egypt. J Egypt Soc Parasitol, 2004.34(1 Suppl): p.401-15.
[0119] Fenu, S., J. Wardas, and M. Morelli, Impulse control disorders and dopamine dysregulation syndrome associated with dopamine agonist therapy in Parkinson's disease. Behav Pharmacol, 2009.20(5-6): p.363-79.
[0120] Ferguson, J.N., et al., Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet, 2000. 25(3): p.284-8.
[0121] Finger, E.C., New potential therapeutic approaches in frontotemporal dementia: oxytocin, vasopressin, and social cognition. J Mol Neurosci, 2011.45(3): p.696-701.
[0122] Foster, J.A., and McVey Neufeld, K.A. (2013). Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression. Trends in neurosciences 36, 305-312.
[0123] Francis, S.M., et al., Oxytocin and vasopressin systems in genetic syndromes and neurodevelopmental disorders. Brain Res, 2014.1580: p.199-218.
[0124] Frese, S.A, et al., The evolution of host specialization in the vertebrate gut symbiont Lactobacillus reuteri. PLoS Genet. 2011 Feb;7(2):e1001314. doi: 10.1371/journal.pgen.1001314.
[0125] Galley, J.D., Bailey, M., Kamp Dush, C., Schoppe-Sullivan, S., and Christian, L.M. (2014). Maternal obesity is associated with alterations in the gut microbiome in toddlers. PloS one 9, e113026.
[0126] Gibb, W.R., et al., The substantia nigra and ventral tegmental area in Alzheimer's disease and Down's syndrome. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1989.52(2): p.193-200.
[0127] Gkogkas, C.G., Khoutorsky, A., Ran, I., Rampakakis, E., Nevarko, T., Weatherill, D.B., Vasuta, C., Yee, S., Truitt, M., Dallaire, P., et al. (2013). Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature 493, 371-377.
[0128] Gonzalez-Burgos, I. and A. Feria-Velasco, Serotonin/dopamine interaction in memory formation. Prog Brain Res, 2008.172: p.603-23.
[0129] Gregory, R., Cheng, H., Rupp, H.A., Sengelaub, D.R., and Heiman, J.R. (2015). Oxytocin increases VTA activation to infant and sexual stimuli in nulliparous and postpartum women. Hormones and behavior 69, 82-88.
[0130] Groppe, S.E., Gossen, A., Rademacher, L., Hahn, A., Westphal, L., Grunder, G., and Spreckelmeyer, K.N. (2013). Oxytocin influences processing of socially relevant cues in the ventral tegmental area of the human brain. Biological psychiatry 74, 172-179.
[0131] Gunaydin, L.A., Grosenick, L., Finkelstein, J.C., Kauvar, I.V., Fenno, L.E., Adhikari, A., Lammel, S., Mirzabekov, J.J., Airan, R.D., Zalocusky, K.A., et al. (2014). Natural neural projection dynamics underlying social behavior. Cell 157, 1535-1551.
[0132] Hallmayer, J., Cleveland, S., Torres, A., Phillips, J., Cohen, B., Torigoe, T., Miller, J., Fedele, A., Collins, J., Smith, K., et al. (2011). Genetic heritability and shared environmental factors among twin pairs with autism. Archives of general psychiatry 68, 1095-1102.
[0133] Henry, J.D., et al., Clinical assessment of social cognitive function in neurological disorders. Nat Rev Neurol, 2016.12(1): p.28-39.
[0134] Hsiao, E.Y., McBride, S.W., Hsien, S., Sharon, G., Hyde, E.R., McCue, T., Codelli, J.A., Chow, J., Reisman, S.E., Petrosino, J.F., et al. (2013). Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 155, 1451-1463.
[0135] Huang, Y.C., and Hessler, N.A. (2008). Social modulation during songbird courtship potentiates midbrain dopaminergic neurons. PloS one 3, e3281.
[0136] Human Microbiome Project, C. (2012a). A framework for human microbiome research. Nature 486, 215-221.
[0137] Human Microbiome Project, C. (2012b). Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486, 207-214.
[0138] Hyman, S.E., R.C. Malenka, and E.J. Nestler, Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu Rev Neurosci, 2006.29: p.565-98.
[0139] Insel, T.R. (2010). The challenge of translation in social neuroscience: a review of oxytocin, vasopressin, and affiliative behavior. Neuron 65, 768-779.
[0140] Kennedy, D.P. and R. Adolphs, The social brain in psychiatric and neurological disorders. Trends Cogn Sci, 2012.16(11): p.559-72.
[0141] Kenny, P.J., Common cellular and molecular mechanisms in obesity and drug addiction. Nat Rev Neurosci, 2011. 12(11): p.638-51.
[0142] King, J.C. (2006). Maternal obesity, metabolism, and pregnancy outcomes. Annual review of nutrition 26, 271-291.
[0143] Kirsch, P., Oxytocin in the socioemotional brain: implications for psychiatric disorders. Dialogues Clin Neurosci, 2015.17(4): p.463-76.
[0144] Kohane, I.S., McMurry, A., Weber, G., MacFadden, D., Rappaport, L., Kunkel, L., Bickel, J., Wattanasin, N., Spence, S., Murphy, S., et al. (2012). The co-morbidity burden of children and young adults with autism spectrum disorders. PloS one 7, e33224.
[0145] Krakowiak, P., Walker, C.K., Bremer, A.A., Baker, A.S., Ozonoff, S., Hansen, R.L., and Hertz-Picciotto, I. (2012). Maternal metabolic conditions and risk for autism and other neurodevelopmental disorders. Pediatrics 129, e1121-1128.
[0146] Krueger, F. (2014). Trim Galore. v.0.3.7. http://wwwbioinformaticsbabrahamacuk/projects/trim_galore/.
[0147] Langmead, B., and Salzberg, S.L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature methods 9, 357-359.
[0148] Lee, M.R., et al., Targeting the Oxytocin System to Treat Addictive Disorders: Rationale and Progress to Date. CNS Drugs, 2016.30(2): p.109-23.
[0149] Lerer, E., Levi, S., Salomon, S., Darvasi, A., Yirmiya, N., and Ebstein, R.P. (2008). Association between the oxytocin receptor (OXTR) gene and autism: relationship to Vineland Adaptive Behavior Scales and cognition. Molecular psychiatry 13, 980-988.
[0150] Loyens, E., et al., Antidepressant-like effects of oxytocin in mice are dependent on the presence of insulin-regulated aminopeptidase. Int J Neuropsychopharmacol, 2013. 16(5): p.
1153-63.
[0151] Lozupone, C., and Knight, R. (2005). UniFrac: a new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and environmental microbiology 71, 8228-8235.
[0152] Ma, J., Prince, A.L., Bader, D., Hu, M., Ganu, R., Baquero, K., Blundell, P., Alan Harris, R., Frias, A.E., Grove, K.L., et al. (2014). High-fat maternal diet during pregnancy persistently alters the offspring microbiome in a primate model. Nature communications 5, 3889.
[0153] MacDonald, K. and D. Feifel, Oxytocin's role in anxiety: a critical appraisal. Brain Res, 2014. 1580: p.22-56.
[0154] Martin, M. (2011). Cutadapt removes adaptor sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnetjournal 17, 10-12.
[0155] Mathers, J.C., and McKay, J.A. (2009). Epigenetics - potential contribution to fetal programming. Advances in experimental medicine and biology 646, 119-123.
[0156] Matsumoto, M., Dopamine signals and physiological origin of cognitive dysfunction in Parkinson's disease. Mov Disord, 2015.30(4): p.472-83.
[0157] Matsushita, H., et al., Oxytocin mediates the antidepressant effects of mating behavior in male mice. Neurosci Res, 2010.68(2): p.151-3.
[0158] Matsuzaki, M., et al., Oxytocin: a therapeutic target for mental disorders. J Physiol Sci, 2012. 62(6): p.441-4.
[0159] Mayer, E.A., Padua, D., and Tillisch, K. (2014). Altered brain-gut axis in autism: comorbidity or causative mechanisms? BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology 36, 933-939.
[0160] Mayer, E.A., Tillisch, K., and Gupta, A. (2015). Gut/brain axis and the microbiota. The Journal of clinical investigation 125, 926-938.
[0161] McMurdie, P.J., and Holmes, S. (2013). phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PloS one 8, e61217.
[0162] McQuaid, R.J., et al., Making room for oxytocin in understanding depression. Neurosci Biobehav Rev, 2014.45: p. 305-22.
[0163] Mefford, H.C., Batshaw, M.L., and Hoffman, E.P. (2012). Genomics, intellectual disability, and autism. N Engl J Med 366, 733-743.
[0164] Melis, M.R., Melis, T., Cocco, C., Succu, S., Sanna, F., Pillolla, G., Boi, A., Ferri, G.L., and Argiolas, A. (2007). Oxytocin injected into the ventral tegmental area induces penile erection and increases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and paraventricular nucleus of the hypothalamus of male rats. The European journal ofneuroscience 26, 1026-1035.
[0165] Modi, M.E., and Young, L.J. (2012). The oxytocin system in drug discovery for autism: animal models and novel therapeutic strategies. Hormones and behavior 61, 340-350.
[0166] Moss, B.G., and Chugani, D.C. (2014). Increased risk of very low birth weight, rapid postnatal growth, and autism in underweight and obese mothers. American journal of health promotion : AJHP 28, 181-188.
[0167] Moura, D., M.C. Canavarro, and M. Figueiredo-Braga, Oxytocin and depression in the perinatal period-a systematic review. Arch Womens Ment Health, 2016.19(4): p.561-70.
[0168] Nascimento, P.P., et al., Single nucleotide polymorphisms in the CNTNAP2 gene in Brazilian patients with autistic spectrum disorder. Genet Mol Res, 2016.15(1).
[0169] Ogden, C.L., Carroll, M.D., Kit, B.K., and Flegal, K.M. (2014). Prevalence of childhood and adult obesity in the United States, 2011-2012. JAMA : the journal of the American Medical Association 311, 806-814.
[0170] Oh P.L et al., Diversification of the gut symbiont Lactobacillus reuteri as a result of host-driven evolution. ISME J.2010 Mar;4(3):377-87.
[0171] Papp, M. and J. Wieronska, Antidepressant-like activity of amisulpride in two animal models of depression. J Psychopharmacol, 2000.14(1): p.46-52.
[0172] Parracho, H.M., Bingham, M.O., Gibson, G.R., and McCartney, A.L. (2005). Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children. Journal of medical microbiology 54, 987-991.
[0173] Pedersen, C.A., Caldwell, J.D., Walker, C., Ayers, G., and Mason, G.A. (1994). Oxytocin activates the postpartum onset of rat maternal behavior in the ventral tegmental and medial preoptic areas. Behavioral neuroscience 108, 1163-1171.
[0174] Penagarikano, O., et al., Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell, 2011.147(1): p.235-46.
[0175] Penagarikano, O., et al., Exogenous and evoked oxytocin restores social behavior in the Cntnap2 mouse model of autism. Sci Transl Med, 2015.7(271): p.271ra8.
[0176] Perez-Rodriguez, M., et al., Oxytocin and social cognition in affective and psychotic disorders. Eur Neuropsychopharmacol, 2015.25(2): p.265-82.
[0177] Poutahidis, T., Kearney, S.M., Levkovich, T., Qi, P., Varian, B.J., Lakritz, J.R., Ibrahim, Y.M., Chatzigiagkos, A., Alm, E.J., and Erdman, S.E. (2013). Microbial symbionts accelerate wound healing via the neuropeptide hormone oxytocin. PloS one 8, e78898.
[0178] Quast, C., Pruesse, E., Yilmaz, P., Gerken, J., Schweer, T., Yarza, P., Peplies, J., and Glockner, F.O. (2013). The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic acids research 41, D590-596.
[0179] Quintana, D.S., et al., Oxytocin system dysfunction as a common mechanism underlying metabolic syndrome and psychiatric symptoms in schizophrenia and bipolar disorders. Front Neuroendocrinol, 2017.
[0180] Rice, L.J. and S.L. Einfeld, Cognitive and behavioural aspects of Prader-Willi syndrome. Curr Opin Psychiatry, 2015.28(2): p.102-6.
[0181] Ridaura, V.K., Faith, J.J., Rey, F.E., Cheng, J., Duncan, A.E., Kau, A.L., Griffin, N.W., Lombard, V., Henrissat, B., Bain, J.R., et al. (2013). Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 341, 1241214.
[0182] Romano, A., et al., From Autism to Eating Disorders and More: The Role of Oxytocin in Neuropsychiatric Disorders. Front Neurosci, 2015.9: p.497.
[0183] Ross, H.E. and L.J. Young, Oxytocin and the neural mechanisms regulating social cognition and affiliative behavior. Front Neuroendocrinol, 2009.30(4): p.534-47.
[0184] Rudelli, R.D., M.W. Ambler, and H.M. Wisniewski, Morphology and distribution of Alzheimer neuritic (senile) and amyloid plaques in striatum and diencephalon. Acta Neuropathol, 1984.64(4): p.273-81.
[0185] Sabatier, N., Leng, G., and Menzies, J. (2013). Oxytocin, feeding, and satiety. Frontiers in endocrinology 4, 35.
[0186] Sampath, S., et al., Defining the contribution of CNTNAP2 to autism susceptibility. PLoS One, 2013.8(10): p. e77906.
[0187] Sarnyai, Z. and G.L. Kovacs, Oxytocin in learning and addiction: From early discoveries to the present. Pharmacol Biochem Behav, 2014.119: p. 3-9.
[0188] Schloss, P.D., Westcott, S.L., Ryabin, T., Hall, J.R., Hartmann, M., Hollister, E.B., Lesniewski, R.A., Oakley, B.B., Parks, D.H., Robinson, C.J., et al. (2009). Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and environmental microbiology 75, 7537-7541.
[0189] Schmieder, R., and Edwards, R. (2011). Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics 27, 863-864.
[0190] Segata, N., Waldron, L., Ballarini, A., Narasimhan, V., Jousson, O., and Huttenhower, C. (2012). Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature methods 9, 811-814.
[0191] Selden, N., M.M. Mesulam, and C. Geula, Human striatum: the distribution of neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease. Brain Res, 1994.648(2): p.327-31.
[0192] Shamay-Tsoory, S.G. and A. Abu-Akel, The Social Salience Hypothesis of Oxytocin. Biol Psychiatry, 2016.79(3): p.194-202.
[0193] Silverman, J.L., Yang, M., Lord, C., and Crawley, J.N. (2010). Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature reviews Neuroscience 11, 490-502.
[0194] Skinner, A.C., and Skelton, J.A. (2014). Prevalence and trends in obesity and severe obesity among children in the United States, 1999-2012. JAMA pediatrics 168, 561-566.
[0195] Song, S.J., Lauber, C., Costello, E.K., Lozupone, C.A., Humphrey, G., Berg-Lyons, D., Caporaso, J.G., Knights, D., Clemente, J.C., Nakielny, S., et al. (2013). Cohabiting family members share microbiota with one another and with their dogs. eLife 2, e00458.
[0196] Spinler ,J.K., et al. From prediction to function using evolutionary genomics: humanspecific ecotypes of Lactobacillus reuteri have diverse probiotic functions. Genome Biol Evol.
2014 Jun 19;6(7):1772-89. doi: 10.1093/gbe/evu137.
[0197] Sullivan, E.L., Nousen, E.K., and Chamlou, K.A. (2014). Maternal high fat diet consumption during the perinatal period programs offspring behavior. Physiology & behavior 123, 236-242.
[0198] Tampi, R.R., et al., Oxytocin for frontotemporal dementia: a systematic review. Ther Adv Psychopharmacol, 2017.7(1): p.48-53.
[0199] Tang, Y., Chen, Z., Tao, H., Li, C., Zhang, X., Tang, A., and Liu, Y. (2014). Oxytocin activation of neurons in ventral tegmental area and interfascicular nucleus of mouse midbrain. Neuropharmacology 77, 277-284.
[0200] Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L.A., and Paylor, R. (2009). Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than noveltyinduced anxiety. Psychopharmacology 204, 361-373.
[0201] Tremaroli, V., and Backhed, F. (2012). Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature 489, 242-249.
[0202] Turnbaugh, P.J., Ley, R.E., Mahowald, M.A., Magrini, V., Mardis, E.R., and Gordon, J.I. (2006). An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 444, 1027-1031.
[0203] Ungless, M.A., Whistler, J.L., Malenka, R.C., and Bonci, A. (2001). Single cocaine exposure in vivo induces long-term potentiation in dopamine neurons. Nature 411, 583-587.
[0204] Uvnas-Moberg, K., Handlin, L., and Petersson, M. (2014). Self-soothing behaviors with particular reference to oxytocin release induced by non-noxious sensory stimulation. Frontiers in psychology 5, 1529.
[0205] Varian, B.J. et al., Microbial lysate upregulates host oxytocin. Brain Behavior Immun., 2017. 61(0): p.36-49.
[0206] Wang, B., Mao, Y.K., Diorio, C., Pasyk, M., Wu, R.Y., Bienenstock, J., and Kunze, W.A. (2010). Luminal administration ex vivo of a live Lactobacillus species moderates mouse jejunal motility within minutes. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 24, 4078-4088.
[0207] Wang, X., Wang, B.R., Zhang, X.J., Xu, Z., Ding, Y.Q., and Ju, G. (2002). Evidences for vagus nerve in maintenance of immune balance and transmission of immune information from gut to brain in STM-infected rats. World journal of gastroenterology 8, 540-545.
[0208] Wu, S., Jia, M., Ruan, Y., Liu, J., Guo, Y., Shuang, M., Gong, X., Zhang, Y., Yang, X., and Zhang, D. (2005). Positive association of the oxytocin receptor gene (OXTR) with autism in the Chinese Han population. Biological psychiatry 58, 74-77.
[0209] Yatsunenko, T., Rey, F.E., Manary, M.J., Trehan, I., Dominguez-Bello, M.G., Contreras, M., Magris, M., Hidalgo, G., Baldassano, R.N., Anokhin, A.P., et al. (2012). Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 486, 222-227.
[0210] Yoo, H.J., et al., Family-based genetic association study of CNTNAP2 polymorphisms and sociality endophenotypes in Korean patients with autism spectrum disorders. Psychiatr Genet, 2017.27(1): p.38-39.
[0211] Zablotsky, B., Black, L.I., Maenner, M.J., Schieve, L.A., and Blumberg, S.J. (2015). Estimated Prevalence of Autism and Other Developmental Disabilities Following Questionnaire Changes in the 2014 National Health Interview Survey. National Health Statistics Reports 1-20.
[0212] Zare, S., F. Mashayekhi, and E. Bidabadi, The association of CNTNAP2 rs7794745 gene polymorphism and autism in Iranian population. J Clin Neurosci, 2017.39: p.189-192.
[0213] Zhu, P.J., Huang, W., Kalikulov, D., Yoo, J.W., Placzek, A.N., Stoica, L., Zhou, H., Bell, J.C., Friedlander, M.J., Krnjevic, K., et al. (2011). Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell 147, 1384-1396.
[0214] Zik, J.B. and D.L. Roberts, The many faces of oxytocin: implications for psychiatry. Psychiatry Res, 2015.226(1): p.31-7.

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Formulacija koja sadrži Lactobacillus reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475) i/ili njegov bioaktivni ekstrakt ili frakciju za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije jednog ili više deficita socijalnog ponašanja kod individue sa poremećajem autističnog spektra, koji sadrži korake obezbeđivanja individui i/ili majci tokom gestacije individue terapeutski efikasne količine formulacije.
2. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je prilikom obezbeđivanja formulacije individui, majka individue bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom ili je bila na ishrani sa visokim sadržajem masti tokom trudnoće sa individuom ili je majka imala izmenjen mikrobiom creva.
3. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što postupak sadrži obezbeđivanje formulacije majci tokom gestacije individue.
4. Formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačena time što deficit socijalnog ponašanja sadrži smanjenu društvenost, preferenciju za socijalnu novinu, poteškoće u socijalnoj upotrebi verbalne i neverbalne komunikacije, ili njihovu kombinaciju.
5. Formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačena time što postupak dalje sadrži korak identifikacije da je majka gojazna ili je bila gojazna, sa prekomernom telesnom težinom ili na ishrani sa visokim sadržajem masti tokom trudnoće sa individuom i pri čemu je formulacija obezbeđena za individuu ili majku sa namerom za lečenje ili prevenciju deficita socijalnog ponašanja kod individue.
6. Formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačena time što formulacija sadrži dodatne vrste bakterija ili hranljivu materiju (hranljive materije).
7. Formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačena time što se formulacija isporučuje preko pilule ili supozitorije.
8. Formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačena time što formulacija je hrana, piće, jogurt, suvi prah ili suvi prah pomešan u vodi ili napitku.
9. Formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačena time što je individui data efikasna količina jedne ili više vrsta bakterija različitih od L. reuteri, jedan ili više prebiotika ili drugih hranljivih materija i/ili bihejvioralna terapija.
10. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačena time što hranljiva materija je jedan ili više od vitamina, lipida ili proteina.
11. Formulacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačena time što individua ima ili je u riziku da ima jedno ili više od socijalnog kognitivnog oštećenja, Williamovog sindroma, Prader-Willi sindroma, sindroma fragilnog X, jednog ili više adiktivnih ponašanja, bipolarnog poremećaja, šizofrenije, depresije, postpartalne depresije, anksioznosti, Parkinson-ove bolesti i/ili Alzheimer-ove bolesti.
12. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što adiktivno ponašanje se odnosi na jednu ili više vrsta hrane, alkohola, droga, kockanje, inhalante i duvan.
13. Formulacija za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-12, u kojoj L. reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475) ili biološki aktivni ekstrakt, lizat, poluprečišćeni ili prečišćeni aktivni molekul(i) iz L. reuteri MM4-1A (ATCC-PTA-6475) se uzimaju kao profilaktička terapija za unapređenje opšteg blagostanja, zdravstvenog stanja mozga, raspoloženja i/ili socijalnih ponašanja i socijalne memorije.
RS20230719A 2016-04-15 2017-04-15 Lactobacillus reuteri mm4-1a za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja autističnog spektra RS64503B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662322946P 2016-04-15 2016-04-15
PCT/US2017/027827 WO2017181158A1 (en) 2016-04-15 2017-04-15 Probiotic therapies for developmental disorders and other neurological disorders
EP17783343.1A EP3442547B1 (en) 2016-04-15 2017-04-15 Lactobacillus reuteri mm4-1a for use in the treatment or prevention of autism spectrum disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64503B1 true RS64503B1 (sr) 2023-09-29

Family

ID=60042831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230719A RS64503B1 (sr) 2016-04-15 2017-04-15 Lactobacillus reuteri mm4-1a za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja autističnog spektra

Country Status (14)

Country Link
US (2) US11135252B2 (sr)
EP (2) EP4238573A1 (sr)
DK (1) DK3442547T3 (sr)
ES (1) ES2954147T3 (sr)
FI (1) FI3442547T3 (sr)
HR (1) HRP20231030T1 (sr)
HU (1) HUE062788T2 (sr)
LT (1) LT3442547T (sr)
PL (1) PL3442547T3 (sr)
PT (1) PT3442547T (sr)
RS (1) RS64503B1 (sr)
SI (1) SI3442547T1 (sr)
SM (1) SMT202300283T1 (sr)
WO (1) WO2017181158A1 (sr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20231030T1 (hr) * 2016-04-15 2023-12-22 Baylor College Of Medicine Lactobacillus reuteri mm4-1a za upotrebu u liječenju ili prevenciji poremećaja autističnog spektra
KR102463809B1 (ko) * 2019-05-24 2022-11-04 한국식품연구원 클로스트리디오이데스 디피실레에 항균 활성을 갖는 락토바실러스 파라카세이 WiKim0110 균주 및 이를 포함하는 조성물
CN115279194A (zh) * 2020-01-13 2022-11-01 赛欧托生物科技股份有限公司 治疗或改善自闭症和相关病症的方法
CA3205469A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 The General Hospital Corporation Probiotics compositions and method of using the same to enhance growth and social function in children
CN117320566A (zh) * 2020-12-30 2023-12-29 通用医疗公司 用于治疗自闭症谱系障碍的方法和组合物
CN113180109B (zh) * 2021-04-16 2022-02-18 段云峰 罗伊氏乳杆菌在制备预防或治疗发育障碍类疾病产品中的应用
CN113073066B (zh) 2021-04-16 2022-01-04 段云峰 罗伊氏乳杆菌及其应用、组合物、药物和食品
US12005044B1 (en) 2022-11-29 2024-06-11 Autism Therapeutics Inc. Treatment of autism spectrum disorders with ergothioneine, selenoneine, or combinations thereof
US20240252558A1 (en) * 2023-01-29 2024-08-01 The University Of Chicago Probiotics to rescue maternal immune activation-induced neurodevelopment deficits
JPWO2024242147A1 (sr) * 2023-05-22 2024-11-28

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5413960A (en) 1987-05-01 1995-05-09 Biogaia Ab Antibiotic reuterin
ES2353690T3 (es) 2002-10-03 2011-03-04 Neuropharmacology Services, Llc Oxitocina para su uso en el tratamiento del autismo y del trastorno de asperger.
US7344867B2 (en) 2005-04-15 2008-03-18 Eamonn Connolly Selection and use of lactic acid bacteria for reducing inflammation in mammals
US9084434B2 (en) 2006-09-27 2015-07-21 Little Calumet Holdings Llc Probiotic oral dosage forms
US20100063002A1 (en) 2007-03-13 2010-03-11 Bernd Stahl Method of improving skills with a composition comprising non-digestible saccharide
CN102202527B (zh) * 2008-11-03 2014-12-31 雀巢产品技术援助有限公司 包含益生菌并改善睡眠模式的营养组合物
JP2013507394A (ja) 2009-10-09 2013-03-04 プロセラ インコーポレイテッド 自閉症スペクトル障害と診断されたヒトにおいて自閉症スペクトル障害に関連する少なくとも一つの症状を低減するための、ペディオコッカス属を含む組成物及び方法
MY191538A (en) * 2010-12-31 2022-06-30 Abbott Lab Human milk oligosaccharides to promote growth of beneficial bacteria
EP2609814A1 (en) 2011-12-30 2013-07-03 Nestec S.A. Lactobacillus reuteri DSM 17938 for the development of cognitive function
EP2609813A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-03 Nestec S.A. Lactobacillus reuteri DSM 17938 for the development of the enteric nervous system
CA2964480A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to microbial treatment and diagnosis of disorders
HRP20231030T1 (hr) * 2016-04-15 2023-12-22 Baylor College Of Medicine Lactobacillus reuteri mm4-1a za upotrebu u liječenju ili prevenciji poremećaja autističnog spektra

Also Published As

Publication number Publication date
SMT202300283T1 (it) 2023-11-13
EP3442547A4 (en) 2019-11-27
EP3442547A1 (en) 2019-02-20
FI3442547T3 (fi) 2023-09-05
EP3442547B1 (en) 2023-06-07
US20210379123A1 (en) 2021-12-09
SI3442547T1 (sl) 2023-11-30
HUE062788T2 (hu) 2023-12-28
DK3442547T3 (da) 2023-09-04
LT3442547T (lt) 2023-09-25
ES2954147T3 (es) 2023-11-20
HRP20231030T1 (hr) 2023-12-22
PT3442547T (pt) 2023-09-04
WO2017181158A1 (en) 2017-10-19
US11135252B2 (en) 2021-10-05
US20190070226A1 (en) 2019-03-07
EP4238573A1 (en) 2023-09-06
PL3442547T3 (pl) 2023-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210379123A1 (en) Probiotic therapies for developmental disorders and other neurological disorders
CA2966360C (en) Compositions and methods comprising bacteria for improving behavior in neurodevelopmental disorders
US20230048705A1 (en) Use of probiotics in the treatment and/or prevention of atopic dermatitis
Gawlik-Kotelnicka et al. Can microbiology affect psychiatry? A link between gut microbiota and psychiatric disorders
RS57006B1 (sr) Probiotičke terapije za autizam
US20220331378A1 (en) Compositions and methods for treating autism spectrum disorder
Abdrabou et al. Comparative therapeutic efficacy study of Lactobacilli probiotics and citalopram in treatment of acute stress-induced depression in lab murine models
TW201907927A (zh) 包含細菌菌株之組合物
Laureano-Melo et al. Maternal supplementation with Lactobacillus paracasei DTA 83 alters emotional behavior in Swiss mice offspring
WO2022192854A1 (en) Methods to induce biopterin and related metabolites
HK40100503A (en) Lactobacillus reuteri mm4-1a for use in the treatment or prevention of autism spectrum disorders
Missal et al. Gut-Brain Axis: A Medium for Immune Interaction
HK40004596B (en) Lactobacillus reuteri mm4-1a for use in the treatment or prevention of autism spectrum disorders
HK40004596A (en) Lactobacillus reuteri mm4-1a for use in the treatment or prevention of autism spectrum disorders
Byrne Gnotobiotic Mouse Models for Characterizing the Role of the Microbiota on Undernutrition and Early Postnatal Brain Development
Trinh The interaction between the gut microbiome and the brain in anorexia nervosa: inflammation and brain function in a translational rat model
EA040422B1 (ru) Применение пробиотиков в лечении и/или профилактике атопического дерматита
OA19179A (en) Use of probiotics in the treatment and/or prevention of atopic dermatitis.
HK40009064B (en) Use of probiotics in the treatment and/or prevention of atopic dermatitis
HK40009064A (en) Use of probiotics in the treatment and/or prevention of atopic dermatitis
BR112019001116B1 (pt) Composição probiótica usada no tratamento e/ou prevenção da dermatite atópica