RS64553B1 - Vektori za lečenje fridrajhove ataksije - Google Patents

Vektori za lečenje fridrajhove ataksije

Info

Publication number
RS64553B1
RS64553B1 RS20230662A RSP20230662A RS64553B1 RS 64553 B1 RS64553 B1 RS 64553B1 RS 20230662 A RS20230662 A RS 20230662A RS P20230662 A RSP20230662 A RS P20230662A RS 64553 B1 RS64553 B1 RS 64553B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
vector
fxn
nucleic acid
frataxin
Prior art date
Application number
RS20230662A
Other languages
English (en)
Inventor
Dueñas Antoni Matilla
Díaz Ivelisse Sánchez
Cabasés Eudald Balagué
Original Assignee
Gentec S A
Fundacio Inst Dinvestigacio En Ciencies De La Salut Germans Trias I Pujol
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gentec S A, Fundacio Inst Dinvestigacio En Ciencies De La Salut Germans Trias I Pujol filed Critical Gentec S A
Publication of RS64553B1 publication Critical patent/RS64553B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Frying-Pans Or Fryers (AREA)
  • Paper (AREA)

Description

OPIS
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se može uključiti u oblast novih terapeutika za lečenje Fridrajhove ataksije. Specifično, predmetna prijava se odnosi na nove proizvode za gensku terapiju. Proizvodi su sposobni za lečenje Fridrajhove ataksije.
Stanje tehnike
[0002] Fridrajhova ataksija (FRDA; OMIM #229300) je retka nasledna neurodegenerativna bolest koja uzrokuje progresivno oštećenje nervnog sistema rezultujući u simptomima u opsegu od smetnji u hodu i problema sa jezikom do bolesti srca ili kardiomiopatije. Bolest je nazvana prema lekaru Nikolausu Fridrajhu, koji ju je prvi opisao 1860-tih. Ataksija, koja se odnosi na probleme motoričke koordinacije kao što su nezgrapni pokreti i nestabilnost, javlja se kod Fridrajhove ataksije degeneracijom nervnog tkiva kičmene moždine i nerava koji kontrolišu mišićno kretanje ruku i nogu. Kičmena moždina se skuplja sa nervnim ćelijama koje gube deo svoje mijelinske ovojnice. Fridrajhova ataksija, iako neuobičajena, je najčešća nasledna ataksija, u opsegu od 1 na 30.000-50.000 živorođenih, sa prevalencijom od 2-4 na 100.000. Podjednako su pogođena oba pola. Simptomi obično počinju između 5 i 15 godina starosti, ali se u retkim slučajevima mogu pojaviti već sa 18 meseci ili čak 50 godina. Prvi simptom koji se pojavljuje je obično otežano hodanje ili ataksija hoda. Ataksija se postepeno pogoršava i polako se širi na ruke i zatim na trup. Kao rani znaci mogu se pojaviti deformiteti stopala kao što su pes cavus, nevoljno savijanje prstiju na stopalima ili čekić prsti na stopalima. Vremenom mišići počinju da slabe i da se troše, posebno u stopalima, nogama i rukama i razvijaju se deformiteti. Ostali simptomi uključuju gubitak refleksa tetiva, posebno u kolenima i gležnjevima. Često dolazi do postepenog gubitka osećaja u ekstremitetima, koji se može proširiti na druge delove tela. Dizartrija se razvija i pacijent se lako umara. Brzi, ritmični i nevoljni pokreti očiju koji se nazivaju nistagmus su česti. Većina ljudi sa Fridrajhovom ataksijom razvija skoliozu, koja, ako je teška, može uticati na disanje.
[0003] Drugi simptomi koji se mogu javiti su bol u grudima, kratak dah i palpitacije. Ovi simptomi su rezultat različitih oblika srčanih bolesti koje često prate Fridrajhovu ataksiju, kao što su hipertrofična kardiomiopatija, miokardijalna fibroza ili srčana insuficijencija. Abnormalnosti pulsa kao što su tahikardija i srčani blok su takođe česte. Oko 20% ljudi sa Fridrajhovom ataksijom razvija netoleranciju na ugljene hidrate i 30% pokazuje dijabetes melitus. Neki pogođeni ljudi gube sluh ili vid. Brzina napredovanja bolesti varira od osobe do osobe. Generalno, između 10 i 20 godina nakon pojave prvih simptoma, osoba je vezana za invalidska kolica i u kasnijim stadijumima bolesti individue postaju potpuno onesposobljene.
Može uticati na očekivani životni vek. Mnogi ljudi sa Fridrajhovom ataksijom umiru u odraslom dobu zbog udružene bolesti srca, najčešćeg uzroka smrti. Međutim, neki ljudi sa manje teškim simptomima Fridrajhove ataksije ponekad žive do 60 ili 70 godina.
[0004] Neuroimidžing kao što je MRI pokazuje normalan izgled u ranim stadijumima bolesti, iako progresivno otkriva varijabilnu atrofiju vratne kičmene moždine i malog mozga. Ovo često pokazuje atrofiju gornjeg pedunkula. Elektrofiziološke studije pokazuju brzine provodljivosti veće od 40 m/s uz odsustvo ili smanjenje senzornih akcionih potencijala i odsustvo refleksa H. Na neuropatološkom nivou, zabaleženi su izražena atrofija kičmene moždine, zadnjih korena, povremeno malog mozga i srčana hipertrofija. Neurodegeneracija se identifikuje u perifernim senzornim nervima sa progresivnim gubitkom senzornih neurona velikih ganglija dorzalnog korena, degeneracijom dorzalnog stuba, transinaptičkom degeneracijom neurona u Clarkeovoj kičmi i spinocerebelarnim vlaknima, piramidalnim traktovima i atrofijom gracilnog i klinastog jedra. Sekundarne lezije mogu uključivati atrofiju zupčastog jedra u malom mozgu koja utiče na velike glutamatergične neurone i atrofiju Betz-ovih ćelija i kortikospinalnih traktova.
[0005] Godine 1996., uzrok Fridrajhove ataksije je identifikovan kao molekularni defekt u FXN genu koji se nalazi na hromozomu 9 (9q21 traka). Mutacija se sastoji od abnormalne homozigotne ekspanzije GAA tripleta koji se nalazi unutar ALU sekvence u prvom intronu FXN gena. Oko 98% pacijenata sa FRDA ima 2 hromozoma sa brojem između 201 i 1.700 GAA ponovaka (češće između 600 i 900) u svakom od njih. Međutim, 2-5% pacijenata sa FRDA ima ekspanziju GAA i tačkastu mutaciju u FXN genu u kompozitnoj heterozigozi (Tabela 1). Do danas je opisano više od 17 različitih mutacija u FXN genu koje mogu da izazovu FRDA. Ekspanzija GAA u FRDA je veoma nestabilna tokom mejoze i ometa transkripciju FXN gena uzrokujući abnormalno niske nivoe iRNK frataksina. Ekspanzija GAA bi utišala transkripciju FXN gena i tako ukinula ekspresiju frataksina formiranjem trostrukih DNK struktura ili DNK-RNK hibrida, ili oba. Nedavno je predloženo da bi ekspanzija GAA blokirala prelazak sa inicijacije na elongaciju transkripcije zbog formiranja struktura sličnih heterohromatinu u blizini hiperekspanzije GAA. Takođe je predloženo da bi ekspanzija GAA dovela do epigenetske metilacije CpG mesta lociranih u 5' ushodnom regionu FXN gena, uzrokujući njihovo utišavanje. Dakle, kao posledica GAA mutacije u FXN genu, kod FRDA se javlja nedostatak proteina frataksina.
Tabela 1. Najzastupljenije alelske varijante identifikovane u genu FXN koje uzrokuju Fridrajhovu ataksiju.
[0006] FXN gen kodira mali konzervirani mitohondrijalni protein koji sadrži 210 aminokiselina (aa) u svom prekursorskom obliku, sa molekulskom težinom od 23.135 Da nazvan frataksin (Q16595). Ovaj oblik prekursorskog proteina sadrži N-terminalnu sekvencu tranzita koja ga usmerava ka mitohondrijalnom matriksu gde ga mitohondrijalna peptidaza pretvara u različite manje izoforme (FXN42-210, FXN56-210, FXN81-210, FXN78-210) zrelog proteina frataksina koji je FXN81-210 od 130 aa i 14.2 kDa koji je najzastupljeniji. Kod ljudi, frataksin se detektuje u mitohondrijalnom matriksu zajedno sa njegovom unutrašnjom membranom u velikom broju tkiva i najzastupljeniji nivoi su identifikovani u srčanom tkivu, kičmenoj moždini i limfoblastima koji se dele, a izuzetno najniži nivoi u malom mozgu. Frataksin do danas nije otkriven u cerebralnom korteksu. Pošto je gen odgovoran za bolest identifikovan i sa generisanjem nekoliko životinjskih modela, različite funkcije su postulirane za frataksin kao što su homeostaza mitohondrijalnog gvožđa, skladištenje gvožđa, odgovor na oksidativni stres, biogeneza Fe-S klastera, modulacija aktivnosti mitohondrijalne akonitaze i regulacija oksidativne fosforilacije. U FRDA, nedostatak frataksina uzrokovan homozigotnom ekspanzijom GAA ekspanzije u FXN genu dovodi do nedovoljne biosinteze klastera gvožđesumpor neophodnih za transport elektrona u mitohondrijama i sklopu akonitaze, što dovodi do disregulacije mitohondrijalne funkcije i akumulacije gvožđa u mitohondrijama promenom njegove homeostaze. Frataksin takođe modulira kapacitet vezivanja DNK proteina akonitaze 1 (ACO1), koji pored učešća u ciklusu limunske kiseline u mitohondrijalnom matriksu, reguliše unos i korišćenje ćelijskog gvožđa.
[0007] Genetskom manipulacijom generisano je nekoliko životinjskih i ćelijskih modela za Fridrajhovu ataksiju. Generisanje AF modela kod miša koji oponaša što je moguće bliže ljudsku bolest bio je težak zadatak, a trenutno postoji 8 različitih mišjih modela FRDA. Nažalost, nijedan od njih nije prisutan sa kombinacijom svih fenotipskih simptoma FA kod iste životinje, kao što su lezije u ganglijama dorzalnog korena (DRG) i cerebelarnim zupčastim jedrima, iako su korisni za proučavanje izolovanih aspekata molekularnog neurodegenerativnog procesa u FRDA i za procenu različitih tretmana kod specifičnih simptoma. Najviše korišćeni u pretkliničkim tretmanima su Prp-CreERT i YG8R miševi. Prp-CreERT miševi posebno razvijaju cerebelarnu i progresivnu senzornu ataksiju, najistaknutije neurološke funkcije Fridrajhove ataksije. Histološke studije kod ovih životinja pokazuju abnormalnosti kičmene moždine i ganglija dorzalnog korena sa odsustvom motoričke neuropatije, što je obeležje humane bolesti, kao i defekte arborizacije u Purkinjeovim ćelijama malog mozga. Nasuprot tome, YG8R transgeni miševi u odsustvu endogenog mišjeg frataksin proteina pokazuju sporo progresivnu FRDA patologiju. Za razliku od ljudi, ovi miševi ne pokazuju srčane deficite.
[0008] Među virusnim i nevirusnim vektorima koji se koriste u genskoj terapiji humanih patologija, vektori izvedeni iz adeno-asociranog virusa (AAV) pokazali su značajne kliničke prednosti i produženu ekspresiju u životinjskim modelima Gošeove bolesti, Fabrijeve bolesti, Pompeove bolesti, metahromatske leukodistrofije, Niemann-Pick A bolesti i mukopolisaharidoze I, II, III A, III B, IV i VII između ostalih. Intravenska primena AAV vektora u životinjskim modelima lizozomalnih bolesti skladištenja dovela je do povećanja aktivnosti enzima do 16 puta od normalnih vrednosti u krvi, jetri, slezini, bubrezima i mišićima, što ih čini veoma korisnim za lečenje ove vrste patologija. Tokom proteklih 10 godina, AAV su bili vektori izbora u većini kliničkih ispitivanja sprovedenih za lečenje patologija centralnog i perifernog nervnog sistema (http://www.abedia.com/wiley/index.html). Važno je da do danas nisu primećeni neželjeni efekti kod ovih vektora i rezultati su veoma obećavajući. Dakle, nekoliko faktora je učinilo da AAV postanu idealno sredstvo za isporuku gena za centralni nervni sistem (CNS). AVektori virusa povezani sa adeno koji sadrže sekvencu frataksina korišćeni su za lečenje FRDA kod miševa (Gérard et al., 2014. Mol Ther Methods Clin Dev. 1: 14044; Chapdelaine et al., 2016. Gene Ther.23(7): 606-614; Tremblay et al., 2015. Mol Ther.
23(Suppl.1): pS153; WO 2016/150964). Ali, AAV vektori otkriveni u prethodnom stanju tehnike ili prekomerno ili premalo eksprimiraju frataksin i ne dostižu do svih ciljnih ćelija i neurona zahvaćenih u FRDA, što ih čini nepogodnim za efikasan tretman FRDA i posebno njegovih neuroloških znakova. Dakle, potreban je AAV vektor koji eksprimira protein frataksin u terapeutski efikasnoj količini.
[0009] Trenutno ne postoji efikasna terapija za lečenje FRDA i stoga postoji potreba za novim terapeutskim sredstvima za lečenje FRDA. Cilj ovog pronalaska je da obezbedi odgovarajuću terapiju za lečenje FRDA.
Slike
[0010]
Slika 1. Procena SYN (sinapsina) i FXN (frataksina; 1255 bp) humanih promotora na ekspresiju proteina frataksina (FXN). Da bi se testirali nivoi ekspresije proteina humanog frataksina (FXN) pod regulacijom fragmenta endogenog promotora (phFXN) i sinapsin neuronskog promotora (phSIN), u poređenju sa ekspresijom pod visoko eksprimirajućim konstitutivnim promotorom CMV, ćelije humanog neuroblastoma SHSY5Y su transfektovane praznim vektorom (traka 1) ili konstrukcijama koje kodiraju humani sinapsin (phSYN) (traka 3), ili fragmentom promotora frataksina (phFXN) od 1255 bp (traka 4). Konstrukti 1.2 i 1.3 koji koriste phSYN ili phFXN (1255 bp) za ekspresiju humane sekvence kodiranja FXN (hFXN CDS) nisu rezultirali ekspresijom rekombinantnog proteina frataksina (rFXN). HA, oznaka hemaglutinina.
Slika 2. Procena humanih promotora SYN (sinapsin), NSE (neuron-specifična enolaza), i FXN (frataksin; 1255 bp) zajedno sa WPRE sekvencom na ekspresiju proteina frataksina (FXN). Procenjen je efekat 320 bp fragmenta sa 5' kraja iz FXN i WPRE sekvenci na ekspresiju FXN iz phSYN promotora prethodno prikazanog na Sl.1 (traka 3, 4 naspram 8) i phNSE (traka 6). Različiti konstrukti su transfektovani u HEK ćelije i lizati su analizirani 48 sati nakon transfekcije. Efikasnost WPRE sekvenci u stabilizaciji RNK se vidi u konstruktu koji eksprimira FXN iz CMV promotora (traka 2). Međutim, dodavanje i kombinacija regulatornih elemenata prikazanih iznad nije rezultiralo ekspresijom FXN iz phSYN, hpFXN ili phNSE. HA, oznaka hemaglutinina; iFXN, intermedijerni oblik FXN; mFXN, zreli oblik FXN; WPRE, posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota.
Slika 3. Procena humanih promotora SYN (sinapsina), NSE (neuron-specifične enolaze) i FXN (frataksina; 1255 bp) zajedno sa CMV pojačivačem i WPRE sekvencama na ekspresiju proteina frataksina (FXN).. HEK i ćelije mišjeg neuroblastoma N2a su transfektovane konstruktima koji sadrže CMV pojačivač zajedno sa promotorima SYN, NSE ili FXN (1255 bp). Kombinacija regulatornih elemenata prikazanih iznad nije rezultirala ekspresijom FXN iz phSYN, phFXN ili phNSE promotora. HA, oznaka hemaglutinina; iFXN, intermedijerni oblik FXN; mFXN, zreli oblik FXN; WPRE, posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota.
Slika 4. Procena efekta humanih promotora SYN (sinapsina), NSE (neuron-specifične enolaze) i FXN (frataksina; 1255 bp) uz dodatak KOZAK (5') i WPRE (3') sekvenci na ekspresiju proteina frataksina (FXN). Različiti konstrukti su transfektovani u HEK ćelije i lizati su analizirani 48 sati nakon transfekcije. Efikasnost WPRE sekvenci u stabilizaciji RNK se vidi u konstruktu koji eksprimira FXN iz CMV promotora (traka 1 naspram 2). Dalje pojačanje ekspresije FXN dodavanjem kozak sekvence i 105 nt sekvenci između promotora i FXN kodirajuće sekvence se vidi na trakama 2 naspram 3. Međutim, dodavanje i kombinacija regulatornih elemenata prikazanih iznad nije rezultiralo u ekspresiji FXN iz phSYN, phFXN ili phNSE. HA, hemaglutininska oznaka; iFXN, intermedijerni oblik FXN; mFXN, zreli oblik; pFXN, prekursorski oblik; WPRE, posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota.
Slika 5. Procena kombinacije definisanog linkera između humanih promotora PGK1 (fosfoglicerat kinaze 1), NSE (neuron-specifične enolaze), SYN (sinapsina) ili FXN (frataksina; 1255 bp) i kodirajućeg regiona (CDS) FXN pored KOZAK (5') i WPRE (3') sekvenci na ekspresiju proteina frataksina (FXN). Prikazani različiti konstrukti su transfektovani u N2a (A, B i E) ili HEK (C i D) ćelije i lizati su analizirani 48 sati nakon transfekcije. Ekspresija FXN je konzistentno detektovana iz phPGK, ali ne i iz phNSE ili phFXN (1255 bp) promotora kada se koristi 105 bp linker između promotora i kodirajućeg regiona (A, C i D: traka 4; B: traka 5 i E: traka 8). HA, hemaglutininska oznaka; iFXN, intermedijerni oblik FXN; mFXN, zreli oblik; pFXN, prekursorski oblik; WPRE, posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota.
Slika 6. Ekspresija luciferaze (LUC) pod humanim promotorm PGK1 (fosfoglicerat kinaze 1) nakon intratekalne injekcije vektora rAAV9 (4.6 × 10<12>vg/Kg) u YG8R Tg/- i WT miševe. Ekspresija luciferaze je otkrivena nakon intraperitonealne injekcije 150 µl D-luciferina pri 150 mg/kg težine miša 3.5 meseca nakon intratekalne injekcije vektora (A). Organi su disekovani i supstrat luciferaze je dodat svež pre snimanja slike (relativne razmere su prikazane posle levog i desnog panela (B))
Slika 7. In vivo ekspresija iRNK frataksina u miševima starosti 7 meseci na koje je intratekalno primenjen rAAV9-PGK1-FXN. Nivoi iRNK frataksina su određeni kvantitativno pomoću qRT-PCR u tkivima jetre, srca, lumbalne ganglije dorzalnog korena (DRG-L), lumbalne kičmene moždine (SC-L), grudne kičmene moždine (SC-T), vratne kičmene moždine (SC-C), malog mozga (Cb) i mozga (frontalni region C1) od YG8R hemizigotnih transgenih (Tg/-) ili homozigotnih (Tg/Tg) miševa starosti 7 meseci. Na YG8R hemizigotne transgene miševe (Tg/-) primenjivani su rAAV-Null (prikazano crnom bojom) ili rAAV9-PGK1-FXN (prikazano svetlo sivom) i u FRDA homozigotne transgene miševe (Tg/Tg) (prikazano tamno sivom) nisu injektirani. Za razliku od YG8R hemizigotnih miševa (Tg/-) koji nose dve tandemske kopije humanog FXN gena sa ~82 i ~190 GAA trinukleotidnih ponovaka sekvenci u jednom od hromozoma, homozigotni YG8R miševi sadrže dve tandem kopije u svakom od hromozoma. Ni homozigotni ni hemizigotni YG8R miševi za humani FXN ne eksprimiraju endogeni Fxn pošto imaju genetsku osnovu Fxn „knockout“ miša. Homozigotni YG8R miševi su služili kao kontrola više ekspresije za iRNK humanog FXN jer sadrži više kopija humanog transgena, ali ispoljava normalne funkcije. Miševi starosti 2.5 meseci su injektirani intratekalno i humani prajmeri specifični za FXN su korišćeni za kvantitativno određivanje iRNK FXN u različitim tkivima. Nivoi ukupne iRNK FXN su normalizovani do nivoa onih detektovanih u YG8R hemizigotnim miševima (Tg/-) tretiranim sa rAAV9-Null za svako od analiziranih tkiva. Pet meseci nakon intratekalne injekcije vektora rAAV9-PGK1-FXN, nivoi iRNK FXN su bili viši (oko 1.3 i 3.2 puta) kod hemizigotnih YG8R miševa (Tg/-) kojima je injektiran rAAV9-PGK1-FXN sa testiranim dozama, ali ne viši od nivoa kod homozigotnih YG8R miševa (Tg/Tg) koji su u svim tkivima, u poređenju sa nivoima kod Tg/- miševa tretiranih AAV-Null. A) Relativni nivoi iRNK humanog FXN i kod ženki i kod mužjaka miševa n= 6 (3 ženke i 3 mužjaka). Višestruke razlike između modela YG8R miševa sa Fridrajhovom ataksijom kojima je injektiran kontrolni AAV-null u poređenju sa YG8R miševima kojima je injektiran rAAV9-PGK1-FXN statistički su značajne u jetri, ganglijama dorzalnog korena i kičmenoj moždini (p=0.019, p=0.004 i p = 0.024; označeno zvezdicama *) sa trendovima rasta u svim ostalim prikazanim tkivima. Uočena je veća varijabilnost kod mužjaka u poređenju sa ženkama miševa sa korišćenom dozom. B) Relativni nivoi iRNK hFXN kod ženki YG8R miševa. Statistički značajne višestruke razlike u nivoima frataksina detektovane su u svim proučavanim tkivima označenim zvezdicama i navedenim u tabeli ispod. Višestruka povećanja kod miševa kojima je injektiran rAAV9-PGK1-FXN nikada nisu bila veća od nivoa detektovanih kod Tg/Tg YG8R miševa. Statistička značajnost, p<0.05*, p<0.005**
Slika 8. In vivo ekspresija rekombinantnog proteina frataksina iz rAAV9-hPGK1-FXN vektora posle intratekalne injekcije. Lizati iz kultivisanih ćelija N2a transfektovanih praznim vektorom ili vektorom koji eksprimira frataksin koji je korišćen kao pozitivna kontrola (Sl.8A i 8B: trake 1 i 2). Endogeni FXN protein u N2a ćelijama i WT miševima je detektovan anti-FXN antitelom (A i B). Humani FXN protein iz transgena kod YG8R miševa, kao i humani rekombinantni FXN protein kod injektiranih miševa, detektovani su i u jetri i u mozgu miševa (A i B). Inkubacija blotova sa anti-FXN antitelom tokom jednog sata počinje da otkriva humani FXN protein, dok inkubacija preko noći (o/n) otkriva i FXN miša kod WT miševa i humani FXN kod hemizigota (Tg/-) i homozigotnih miševa (Tg/Tg). Nivoi ekspresije rekombinantnog humanog FXN proteina eksprimiranog iz injektiranog rAAV9-FXN su slični nivoima endogenog FXN proteina miša kod WT miševa. HA, oznaka hemaglutinina; iFXN, intermedijerni oblik FXN; mFXN, zreli oblik FXN; WPRE, posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota.
Slika 9. Obnavljanje refleksa hvatanja kod YG8R miševa tokom vremena nakon injekcije vektora rAAV9-FXN. Hvatanje zadnjih udova je ocenjeno od 0 do 3 (videti Metode), što označava manje ili veće oštećenje, kod hemizigotnih (Tg/-) miševa i WT injektiranih sa vektorima rAAV9-FXN ili rAAV9-null. Rezultati za ženke i mužjake zajedno (n=10, 5 mužjaka i 5 ženki za svaku grupu). Promene u refleksu hvatanja otkrivene su već u dobi od 4 meseca kod hemizigotnih YG8R miševa. Nakon intratekalne injekcije vektora rAAV9-FXN, čini se da se refleks hvatanja normalizuje, što ukazuje na obnavljanje tokom vremena ovog neurološkog patološkog fenotipa.
Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između vrednosti za WT i Tg/- miševe kojima je injektiran rAAV9-null i znaci tarabe (#) označavaju značajne razlike između vrednosti dobijenih za Tg/- miševe kojima je injektiran rAAV9-null i Tg/- miševe kojima je injektiran rAAV9-FXN. *, # : P<0.05
Slika 10. In vivo ekspresija rekombinantnog proteina frataksina u miševima kojima je injektiran rAAV9-hPGK1-FXN obnavlja elektrofiziološka svojstva na različitim udaljenostima od stimulusa (D1-D4) kaudalnog nerva. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između WT i Tg/- YG8R FRDA miševa tretiranih sa rAAV9-null, dok znak tarabe (#) označava značajne razlike između rAAV9-null i YG8R miševa tretiranih sa rAAV9-FXN. Intratekalna injekcija miševa u dobi od 2.5 meseca sa vektorom rAAV9-FXN sprečava ili usporava defekte u nervnoj provodljivosti u FRDA mišjem modelu za FRDA (YG8R). WT, zeleni (n = 10); Tg/- YG8R FRDA miševi tretirani rAAV9-null vektorom, sivi (n= 10); Tg/-YG8R FRDA miševi tretirani vektorom rAAV9-FXN, plavi (n = 10). Merenja su dobijena na 1 cm, 2 cm, 3 cm i 4 cm od vrha repa označenih kao vrednosti za mesta D1, D2, D3 i D4, respektivno*, #: P<0.05.
Slika 11. Očuvanje ganglija dorzalnog korena kod miševa YG8R modela miševa FRDA tretiranih sa rAAV9-FXN. Činilo se da je kalibar lumbalnog ganglija dorzalnog korena očuvan, kao i morfologija mitohondrija u modelu FRDA miša koji je tretiran sa rAAV9-FXN u poređenju sa istim miševima tretiranim rAAV9-null virusom.
Kratak opis pronalaska
[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje vektor adeno-asociranog virusa (AAV) koji sadrži nukleinsku kiselinu, pri čemu nukleinska kiselina sadrži:
(i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira frataksin;
(ii) promotor fosfo-glicerat-kinaze (PGK) koji se sastoji od SEQ ID NO: 1; i
(iii) posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (WPRE);
pri čemu (ii) i (iii) su operativno vezani za i regulišu ekspresiju (i), pri čemu postoji operativno funkcionalni linker između (i) i (ii), pri čemu se navedeni linker sastoji od SEQ ID NO: 6, i pri čemu AAV vektor je vektor AAV serotipa 9.
[0012] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vektor za prenos koji sadrži nukleinsku kiselinu i dodatne elemente nukleinske kiseline za stimulisanje integracije ili transpozicije vektora za prenos u vektor AAV serotipa 9. Ovde je dalje opisana upotreba vektora za prenos za proizvodnju AAV vektora ovog pronalaska. Takođe, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju i AAV vektor pronalaska za upotrebu kao lek, posebno za upotrebu u lečenju FRDA.
Detaljan opis pronalaska
Definicije
[0013] Termini "tretman/lečenje" i "terapija", kao što su korišćeni u ovoj prijavi, označavaju grupu higijenskih, farmakoloških, hirurških i/ili fizičkih sredstava korišćenih sa namerom da se izleči i/ili ublaži bolest i/ili simptomi sa ciljem saniranja zdravstvenog problema. Termini "tretman/lečenje" i "terapija" uključuju preventivne i lekovite postupke, s obzirom da su oba usmereni na održavanje i/ili ponovno uspostavljanje zdravlja individue ili životinje. Bez obzira na poreklo simptoma, bolesti i invaliditeta, primena odgovarajućeg leka za ublažavanje i/ili izlečenje zdravstvenog problema treba tumačiti kao oblik lečenja ili terapije u kontekstu ove prijave.
[0014] Termin "terapeutski efikasna količina" označava količinu materije koja ima terapeutski efekat i koja je sposobna da leči FRDA.
[0015] Termini "individua", "pacijent" ili "subjekat" su korišćeni naizmenično u ovoj prijavi i nije bila namera da budu ograničavajući ni na koji način . "Individua", "pacijent" ili "subjekat" mogu biti bilo koje starosti , pola i fizičkog stanja.
[0016] Kao što je ovde korišćen, "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "farmaceutski prihvatljiv razblaživač" označava bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, omotače, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, kompatibilna sa farmaceutskom primenom. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i, bez ograničavanja obima ovog pronalaska, uključuju: dodatna puferska sredstva, konzervanse, korastvarače, antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin, helatiajuća sredstva kao što je EDTA; komplekse metala (npr. komplekse Zn-proteina); biorazgradive polimere, kao što su poliestri; protivjone koji stvaraju soli, kao što su natrijum, polihidrične šećerne alkohole; aminokiseline, kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina i treonin; organske šećere ili šećerne alkohole, kao što su laktitol, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli npr., inozitol), polietilen glikol; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol i natrijum tio sulfat; proteine male molekularne težine, kao što su albumin u humanom serumu, albumin goveđeg seruma, želatin ili drugi imunoglobulini; i hidrofilni polimeri, kao što je polivinilpirolidon.
[0017] Termin "frataksin" označava protein koji je kodiran od strane FXN gena i koji se obično nalazi u mitohondriji. Detalji o proteinu se mogu naći u UniProtKB bazi podataka pod pristupnim brojem Q16595.
[0018] Termin "promotor" označava DNK sekvencu za koju se može vezati RNK polimeraza u cilju započinjanja transkripcije. Sekvenca može dalje da sadrži mesta vezivanja za različite proteine koji regulišu transkripciju, kao što su transkripcioni faktori. Promotorska sekvenca
1
može biti sastavljena od različitih fragmenata promotora (bilo različiti ili isti fragmenti) koji se nalaze blizu u DNK sekvenci i mogu biti razdvojeni linkerima ili spejserima. Takvi promotori se nazivaju himerni promotori. U poželjnom primeru izvođenja, termin "promotor" označava fosfoglicerat-kinazni (PGK) promotor.
[0019] Termin "posttranskripcioni regulatorni element" označava DNK sekvencu koja kada je transkribovana stvara tercijarnu strukturu koja pojačava ili inhibira ekspresiju proteina.
[0020] Termin "operativno vezane" označava dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje su vezane na način koji omogućava da jedna sekvenca nukleinske kiseline utiče na drugu. Na primer, PGK promotor i WPRE su operativno vezani sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira frataksin tako da nivoi ekspresije frataksina regulišu PGK promotor i WPRE.
[0021] Termin "funkcionalna varijanta" označava nukleinske kiseline ili aminokiseline čija se nukleinska ili aminokiselinska sekvenca razlikuje na jednoj ili više pozicija od roditeljske nukleinske ili aminokiselinske sekvence, pri čemu razlike mogu biti adicije, delecije i/ili supstitucije nukleinskih kiselina ili aminokiselinskih ostataka, i koje su i dalje funkcionalne i stoga pogodne za lečenje FRDA. Stručna osoba može odrediti funkcionalne varijante traženjem homologa BLAST pretragom ili proučavanjem varijabilnosti proteina ili gena u populaciji.
[0022] Termin "Adeno-povezani virus" označava mali virus koji inficira ljude i neke druge vrste primata. "Vektor" je bilo koji vehikulum koji se može koristiti za veštački prenos stranog genetskog materijala u ćeliju. Dakle, "AAV vektor" označava rekombinantni AAV koji nosi nukleinsku kiselinu u ćeliju.
AAV vektor
[0023] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor adeno-vezanog virusa (AAV) koji sadrži nukleinsku kiselinu, pri čemu nukleinska kiselina sadrži:
(i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira frataksin;
(ii) promotor fosfo-glicerat-kinaze (PGK) koji se sastoji od SEQ ID NO: 1; i
(iii) posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (WPRE);
pri čemu (ii) i (iii) su operativno vezani za i regulišu ekspresiju (i), pri čemu postoji operativno funkcionalni linker između (i) i (ii), pri čemu se navedeni linker sastoji od SEQ ID NO: 6, i pri čemu AAV vektor je vektor AAV serotipa 9.
[0024] SEQ ID NO: 1 označava sledeću sekvencu:
[0025] PGK promotor je SEQ ID NO: 1.
[0026] Identičnost sekvenci između dve sekvence može se odrediti konvencionalnim postupcima. Na primer, korišćenjem standardnih logaritama poravnanja poznatih u stanju tehnike kao što je BLAST (Altschul et al., 1990. J Mol Biol. 215(3): 403-10). U poželjnom primeru izvođenja, identičnost sekvenci između dve sekvence se određuje korišćenjem BLAST-a.
[0027] SEQ ID NO: 2 označava sledeću sekvencu:
[0028] U poželjnom primeru izvođenja, WPRE sadrži SEQ ID NO: 2 ili sekvenca koja je najmanje 75% identična sa SEQ ID NO: 2. Poželjno WPRE sadrži SEQ ID NO: 2 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 2. Poželjnije, WPRE je SEQ ID NO: 2 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 2.
[0029] SEQ ID NO: 3 označava sledeću sekvencu:
[0030] U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sadrži SEQ ID NO: 3 ili sekvencu koja je najmanje 75% identična sa SEQ ID NO: 3 i funkcionalna je varijanta frataksina. Poželjno, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sadrži SEQ ID NO: 3 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 3. Poželjnije, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin je SEQ ID NO: 3 ili sekvenca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 3.
[0031] Nukleinska kiselina sadrži: linker između promotora i sekvence nukleinske kiseline koja kodira frataksin, pri čemu se linker sastoji od SEQ ID NO: 6.
[0032] SEQ ID NO: 6 označava sledeću sekvencu:
[0033] U poželjnom primeru izvođenja, nukleinska kiselina dalje sadrži Kozak sekvencu i Kozak sekvenca je takođe operativno vezana za i reguliše ekspresiju sekvence nukleinske kiseline koja kodira frataksin. Kozak sekvenca je sekvenca koja se javlja u eukariotskoj iRNK i ima konsenzus sekvencu gccRccAUGG, pri čemu R je purin, mala slova označavaju najčešću bazu na poziciji gde baza ipak može da varira i velika slova su visoko konzervativne.
[0034] SEQ ID NO: 4 označava sledeću sekvencu:
1
[0035] U poželjnom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži (i), (ii) i (iii) je SEQ ID NO: 4 ili sekvenca koja je najmanje 75% identična SEQ ID NO: 4. Poželjno, nukleinska kiselina koja sadrži (i), (ii) i (iii) je SEQ ID NO: 4 ili sekvenca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 4.
[0036] U poželjnom primeru izvođenja, nukleinska kiselina dalje sadrži PolyA signal. Poželjno, PolyA signal je dužine najmanje 50, 100, 150 ili 228 bp. Poželjnije PolyA signal je dužine najmanje 228 bp. Najpoželjnije, PolyA signal je dužine 228 bp.
[0037] U poželjnom primeru izvođenja, nukleinska kiselina dalje sadrži jednu ili više invertovanih terminalnih ponavljajućih (ITR) sekvenci. Poželjno, nukleinska kiselina sadrži dve ITR sekvence. Poželjnije, ITR sekvence okružuju ostale komponente nukleinske kiseline.
[0038] SEQ ID NO: 5 označava sledeću sekvencu:
1
�
[0039] U poželjnom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je SEQ ID NO: 5 ili sekvenca koja je najmanje 75% identična SEQ ID NO: 5. Poželjno, nukleinska kiselina SEQ ID NO: 5 ili sekvenca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 5.
[0040] U poželjnom primeru izvođenja, vektor omogućava ekspresiju terapeutski efikasne količine frataksina kod pacijenta koji pati od Fridrajhove ataksije. Dakle, vektor isporučuje nukleinsku kiselinu u ćelije pacijenta gde nukleinska kiselina zatim eksprimira frataksin u terapeutski efikasnoj količini.
[0041] AAV vektor je vektor AAV serotipa 9, tj. AAV-9 vektor.
Nukleinska kiselina
[0042] U drugom aspektu, ova specifikacija otkriva nukleinsku kiselinu koja sadrži: (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira frataksin; (ii) PGK promotor; i (iii) WPRE; pri čemu (ii) i (iii) su operativno vezani za i regulišu ekspresiju (i).
[0043] U poželjnom otkriću, PGK promotor sadrži SEQ ID NO: 1 ili sekvenca koja je najmanje 75% identična sa SEQ ID NO: 1. Poželjno PGK promotor sadrži SEQ ID NO: 1 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1. Poželjnije, PGK promotor je SEQ ID NO: 1 ili sekvenca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 1.
[0044] U poželjnom otkriću, WPRE sadrži SEQ ID NO: 2 ili sekvencu koja je najmanje 75% identična sa SEQ ID NO: 2. Poželjno WPRE sadrži SEQ ID NO: 2 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 2. Poželjnije, WPRE je SEQ ID NO: 2 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 2.
[0045] U poželjnom otkriću, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sadrži SEQ ID NO: 3 ili sekvencu koja je najmanje 75% identična sa SEQ ID NO: 3 i je funkcionalna varijanta frataksina. Poželjno, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sadrži SEQ ID NO: 3 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 3. Poželjnije, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin je SEQ ID NO: 3 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 3.
[0046] U poželjnom otkriću, nukleinska kiselina dalje sadrži: linker između promotora i sekvence nukleinske kiseline koja kodira frataksin, pri čemu se linker sastoji od ili sadrži SEQ ID NO: 6 ili sekvencu koja je najmanje 75% identična sa SEQ ID NO: 6. Poželjno, linker se sastoji od ili sadrži SEQ ID NO: 6 ili sekvencu koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 6.
1
[0047] U poželjnom otkriću, nukleinska kiselina dalje sadrži Kozak sekvencu i Kozak sekvenca je takođe operativno vezana za i reguliše ekspresiju sekvence nukleinske kiseline koja kodira frataksin.
[0048] U poželjnom otkriću, sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži (i), (ii) i (iii) je SEQ ID NO: 4 ili sekvenca koja je najmanje 75 % identična sa SEQ ID NO: 4. Poželjno, nukleinska kiselina koja sadrži (i), (ii) i (iii) je SEQ ID NO: 4 ili sekvenca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 4.
[0049] U poželjnom otkriću, nukleinska kiselina dalje sadrži PolyA signal. Poželjno, PolyA signal je dužine najmanje 50, 100, 150 ili 228 bp. poželjnije PolyA signal je dužine najmanje 228 bp. Najpoželjnije, PolyA signal je dužine 228 bp.
[0050] U poželjnom otkriću, nukleinska kiselina dalje sadrži jednu ili više invertovanih terminalnih ponavljajućih (ITR) sekvenci. Poželjno, nukleinska kiselina sadrži dve ITR sekvence. Poželjnije, ITR sekvence okružuju ostale komponente nukleinske kiseline.
[0051] U poželjnom otkriću, nukleinska kiselina je SEQ ID NO: 5 ili sekvenca koja je najmanje 75% identična SEQ ID NO: 5. Poželjno, nukleinska kiselina je SEQ ID NO: 5 ili sekvenca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 5.
Klonirajući vektor
[0052] U trećem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje vektor za kloniranje koji sadrži nukleinsku kiselinu prema bilo kom od prethodno opisanih primera izvođenja i dodatne elemente nukleinske kiseline za stimulaciju replikacije vektora za kloniranje u bakterijskoj ćeliji.
[0053] označava bilo koji "klonirajući vektor" koji je pogodan za kloniranje, što generalno uključuje prisustvo restrikcionih mesta, oridžina replikacije za razmnožavanje bakterija i selektabilni marker.
[0054] Vektor za kloniranje prema pronalasku sadrži nukleinsku kiselinu koja je ovde opisana i poželjno se može koristiti za proizvodnju vektora za prenos ili AAV vektora prema pronalasku. Vektor prenosa
[0055] U četvrtom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje vektor za prenos koji sadrži nukleinsku kiselinu prema bilo kom od prethodno opisanih primera izvođenja ili otkrića i dodatne elemente nukleinske kiseline za stimulaciju integracije ili transpozicije vektora za prenos u AAV vektor, poželjno AAV-9 vektor.
[0056] Termin "vektor za prenos" označava vektor koji je pogodan za integraciju ili transpoziciju u AAV vektor. Vektor za prenos stoga generalno dozvoljava inserciju genetičke informacije u AAV vektor.
[0057] Vektor za prenos prema pronalasku sadrži nukleinsku kiselinu kao što je opisana u patentnom zahtevu 9 i može poželjno da se koristi za proizvodnju AAV vektora prema pronalasku.
1
Upotreba vektora za prenos
[0058] U petom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu vektora za prenos ovog pronalaska za proizvodnju AAV vektora prema bilo kom od prethodno opisanih primera izvođenja.
Farmaceutska kompozicija
[0059] U šestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži AAV vektor ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Farmaceutska kompozicija kako je ovde opisana može takođe da sadrži druge supstance. Ove supstance uključuju, ali nisu ograničene na, krioprotektante, lioprotektante, surfaktante, sredstva za povećanje zapremine, antioksidante i stabilizatore. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može biti liofilizovana.
[0060] Termin "krioprotektant" kako se ovde koristi, uključuje sredstva koja obezbeđuju stabilnost AAV vektoru protiv naprezanja izazvanog smrzavanjem, tako što su prvenstveno isključeni sa površine AAV vektora. Krioprotektanti mogu takođe da ponude zaštitu tokom primarnog i sekundarnog sušenja i dugotrajnog skladištenja proizvoda. Neograničavajuće primeri krioprotektanata uključuju šećere, kao što su saharoza, glukoza, trehaloza, manitol, manoza i laktoza, polimere, kao što su dekstran, hidroksietil skrob i polietilen glikol, surfaktante, kao što su polisorbati (npr., PS-20 ili PS-80); i aminokiseline, kao što su glicin, arginin, leucin i serin. Uglavnom se koristi krioprotektant koji pokazuje nisku toksičnost u biološkim sistemima.
[0061] U jednom primeru izvođenja, lioprotektant se dodaje ovde opisanoj farmaceutskoj kompoziciji. Termin "lioprotektant" kako se ovde koristi, uključuje sredstva koja obezbeđuju stabilnost AAV vektora tokom postupka sušenja zamrzavanjem ili dehidratacije (primarni i sekundarni ciklusi sušenja zamrzavanjem), obezbeđivanjem amorfne staklaste matrice i vezivanjem sa površinom AAV vektora putem vodonične veze, zamena molekula vode koji se uklanjaju tokom postupka sušenja. Ovo pomaže da se minimizira degradacija proizvoda tokom ciklusa liofilizacije i poboljša dugoročna stabilnost proizvoda. Neograničavajući primeri lioprotektanata uključuju šećere, kao što su saharoza ili trehaloza; aminokiseline, kao što je mononatrijum glutamat, nekristalni glicin ili histidin; metilamin, kao što je betain; liotropnu so, kao što je magnezijum sulfat; poliol, kao što su trihidrični ili viši šećerni alkoholi, na primer, glicerin, eritritol, glicerol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol; propilen glikol; polietilen glikol; pluroniks; i njihove kombinacije. Količina lioprotektanta koja se dodaje u farmaceutsku kompoziciju je generalno količina koja ne dovodi do neprihvatljive količine degradacije soja kada je farmaceutski kompozicija liofilizovana.
[0062] U nekim primerima izvođenja, sredstvo za povećanje zapremine je uključeno u farmaceutsku kompoziciju. Termin "sredstvo za povećanje zapremine" kako se ovde koristi, uključuje sredstva koja obezbeđuju strukturu liofilizovanog proizvoda bez direktne interakcije sa farmaceutskim proizvodom. Pored obezbeđivanja farmaceutski elegantnog kolača,
1
sredstva za povećanje zapremine mogu takođe da daju korisne osobine u pogledu modifikacije temperature kolapsa, obezbeđivanja zaštite od smrzavanja i odmrzavanja i poboljšanja stabilnosti soja tokom dugotrajnog skladištenja. Neograničavajući primeri sredstava za povećanje zapremine uključuju manitol, glicin, laktozu i saharozu. Sredstva za povećanje zapremine mogu biti kristalna (kao što su glicin, manitol ili natrijum hlorid) ili amorfna (kao što je dekstran, hidroksietil skrob) i generalno se koriste u formulacijama u količini od 0.5% do 10%.
[0063] Drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori, kao što su oni opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) takođe mogu biti uključeni u ovde opisanu farmaceutsku kompoziciju, pod uslovom da ne utiču negativno na željene karakteristike farmaceutske kompozicije. Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, omotače, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u tehnici. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste i uključuju: dodatna puferska sredstva; konzervanse; ko-rastvarače; antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; helatirajuća sredstva kao što je EDTA; komplekse metala (npr. kompleksi Znproteina); biorazgradive polimere, kao što su poliestri; protivjoni koji stvaraju soli, kao što su natrijum, polihidrični šećerni alkoholi; aminokiseline, kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin i treonin; organske šećere ili šećerne alkohole, kao što su laktitol, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr., inozitol), polietilen glikol; redukciona sredstva koji sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol i natrijum tio sulfat; proteini male molekularne težine, kao što su albumin humanog seruma, albumin goveđeg seruma, želatin ili drugi imunoglobulini; i hidrofilni polimeri, kao što je polivinilpirolidon.
[0064] Farmaceutska kompozicija se može pripremiti za oralnu, sublingvalnu, bukalnu, intravensku, intramuskularnu, subkutanu, intraperitonealnu, konjuktivalnu, rektalnu, transdermalnu, intratekalnu, topikalnu i/ili primenu posredovanu inhalacijom. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija može biti rastvor koji je pogodan za intravensku, intramuskularnu, konjuktivalnu, transdermalnu, intraperitonealnu i/ili subkutanu primenu. U sledećem primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija može biti rastvor koji je pogodan za sublingvalne, bukalne i/ili puteve primene posredovane inhalacijom. U alternativnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija može biti gel ili rastvor koji je pogodan za intratekalnu primenu. U alternativnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija može biti aerosol koji
2
je pogodan za primenu posredovanu inhalacijom. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija se može pripremiti za intratekalnu primenu.
[0065] Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži uobičajene ekscipijense i nosače koji su poznati u stanju tehnike. Za čvrste farmaceutske kompozicije, mogu se koristiti konvencionalni netoksični čvrsti nosači koji uključuju, na primer, farmaceutske vrste manitola, laktoze, skroba, magnezijum stearata, natrijum saharina, talka, celuloze, glukoze, saharoze, magnezijum karbonata i slično. Za rastvor za injekcije, farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži krioprotektante, lioprotektante, surfaktante, sredstva za povećanje zapremine, antioksidante, sredstva za stabilizaciju i farmaceutski prihvatljive nosače. Za primenu aerosola, farmaceutske kompozicije se generalno isporučuju u fino podeljenom obliku zajedno sa surfaktantom i propelantom. Surfaktant mora, naravno, biti netoksičan i generalno je rastvorljiv u propelentu. Predstavnici takvih sredstava su estri ili parcijalni estri masnih kiselina koji sadrže od 6 do 22 atoma ugljenika, kao što su kapronska, oktanska, laurinska, palmitinska, stearinska, linolna, linolenska, olesterinska i oleinska kiselina sa alifatičnim polihidričnim alkoholom ili njegovim cikličnim anhidridom. Mogu se koristiti mešani estri, kao što su mešani ili prirodni gliceridi. Nosač takođe može biti uključen, po želji, kao što je, na primer, lecitin za intranazalnu isporuku. Za supozitorije, tradicionalna vezujuća sredstva i nosači mogu uključivati, na primer, polialkalen glikole ili trigliceride.
Medicinske upotrebe
[0066] U sedmom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje AAV vektor ovog pronalaska, ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu kao lek. U osmom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje AAV vektor ovog pronalaska, ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u lečenju Fridrajhove ataksije.
[0067] U poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor iz ovog pronalaska, t ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska se primenjuje intratekalno, intramuskularno, intracerebralno ili intracerebroventrikularno, poželjno intratekalno ili intramuskularno.
[0068] U poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor ovog pronalaska, ili farmaceutska kompozicija ovog pronalaska se primenjuje u dozi od najmanje 1 × 10<9>vektorskih genoma/kg telesne težine, poželjno 1 × 10<10>, 1 × 10<11>ili 1 × 10<12>vektorskih genoma/kg telesne težine. Poželjnije, primenjuje se najmanje ili oko 4.6 × 10<12>vektorskih genoma/kg telesne težine. Primeri
Primer 1: Konstrukcija plazmida
[0069] Kodirajuća sekvenca izoforme 1 humanog frataksina (hFXN) je fuzionisana sa hemaglutininskom oznakom (HA) i klonirana u vektor ekspresije pcDNA3.1 upotrebom sa In-Fusion<®>HD Cloning Kit (Clontech). Fuzioni sistem je korišćen za sve korake kloniranja. Nekoliko konstrukata je generisano fuzionisanjem CMV ili humanih (h) promotora (p) sinapsina (phSYN), neuron specifične enolaze (phNSE), 1255 bp FXN promotora (phFXN1255) ili izoforme 1 humane fosfoglicerat kinaze (phPGK1) sa kodirajućim regionom FXN gena. Dodatni regulatorni elementi, kao što su CMV pojačivač i Kozak sekvence, dodati su na 5 prim kraju pored sekvence elementa koji reaguje na virus hepatitisa mrmota (WPRE) na 3 prim kraju. Svi ovi konstrukti generisani ekspresionim vektorima su navedeni u tabeli 2.
[0070] Plazmidi koji sadrže istu kombinaciju regulatornih elemenata takođe su generisani da podstaknu ekspresiju luciferaze zamenom kodirajuće sekvence FXN za sekvencu kodiranja luciferaze svica (LUC) koja je amplifikovana iz pGL3-LUC vektora (Promega) takođe koristeći In-Fusion<®>HD Cloning Kit (Clontech). Ovi plazmidi su navedeni u tabeli 3.
Primer 2: Konstrukcija i proizvodnja rekombinantnog adeno-povezanog virusnog vektora.
[0071] Ekspresione kasete iz pcDNA3.1-phPGK-kFXN-HA-WPRE i pcDNA3.1-phPGK-kLUC-HA-WPRE plazmida su klonirane u SnaBI-Mfel mesta rekombinantnog AAV9 vektora (rAAV9-phPGK1-FXN-HA-WPRE vektora i rAAV9-phPGK-LUC-WPRE vektora). Pored toga, generisan je kontrolni nulti vektor kome nedostaje sekvenca kodiranja FXN (AAV2/9-null). Sva tri konstrukta i virusne čestice su generisane pomoću Jedinica za proizvodnju vektora u Centru za biotehnologiju životinja i gensku terapiju (Universitat Autònoma de Barcelona). Konačni dobijeni titri bili su 1.4 × 10<13>vg/ml za AAV9-phPGK-FXN-HA-WPRE, 9.8 × 10<12>vg/ml za AAV9-phPGK-LUC-WPRE i 6 × 10<12>vg/ml za AAV2/9-null.
Primer 3: Optimizacija ekspresije frataksina
1. Ćelijska kultura, in vitro ekspresija i test reportera luciferaze
[0072] Ćelije neuroblastoma miša (N2a), ćelije humanog neuroblastoma (SH-SY5Y) i ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK 293) uzgajane su u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (Sigma), 2 mM glutamina, 50 µg /ml penicilina/streptomicina (Life technologies) pri 70% konfluencije u posudama za kulturu od 10 cm. Transfekcije su sprovedene korišćenjem lipofektamina 2000 (Life technologies) za ćelije N2a i SH-SY5Y i kalcijum fosfata za HEK 293 korišćenjem samo 4 µg plazmidne DNK pored 0.25 µg EGFP. Nakon transfekcije, medijum je zamenjen svežim medijumom za kulturu DMEM za HEK ćelije i sa Neurobasal, B27 suplementom, 10 µM retinoične kiseline, 2 mM glutamina, 50 µg/ml penicilina/streptomicina za ćelije N2a i SH-SY5Y. Četrdeset osam sati nakon promene medijuma ćelijske kulture, ćelije transfektovane ekspresionim plazmidima navedenim u Tabeli 2 su sakupljene i čuvane na -80°C do dalje upotrebe. Za test reportera luciferaze, plazmidi navedeni u Tabeli 3 su transfektovani kao što je gore pomenuto i ćelije su ponovo postavljene u ploče sa 384 bunarčića i aktivnost luciferaze je određena korišćenjem dualnog kompleta za test reportera luciferaze prema uputstvima proizvođača (Promega).
2. SDS-PAGE i imunobloting
[0073] Proteini su ekstrahovani iz kultivisanih ćelija homogenizacijom u RIPA puferu za lizu: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl, 0.1% natrijum deoksiholat, 1% Triton X-100, 1% SDS, 2 mM etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTTA), 25 mM natrijum fluorida (NaF), 2.5 mM NaVO3 i koktel inhibitora proteina (Roche). Koncentracija proteina je određena korišćenjem DC-BioRad proteinskog testa (BioRad). Ukupni proteinski ekstrakt je pomešan sa 4X puferom za punjenje uzorka proteina (Li-Cor Biosciences) koji sadrži 1 mM DTT i razdvojen je elektroforezom na 15% akrilamidnom gelu pri konstantnoj 20 mA pre transfera do PVDF membrane. Primarna korišćena antitela su bila anti-FXN PAC 2518 (velikodušan poklon dr Grazia Isaya, Mayo Clinic, Rochester MN), anti-FXN (1G2, Merck Millipore), anti-HA oznaka (klon 16B12, MMS-101P, Covance) i anti-beta aktin (AC15, Sigma). Sekundarna antitela konjugovana infracrvenom bojom bila su anti-mišja IRDye-800CW i anti-zečja IRDye 700CW (Li-Cor Biosciences) i imunoreaktivnost je detektovana upotrebom softvera za analizator Odyssey v2.1 (Li-Cor Biosciences).
3. Rezultati
[0074] Kao što se može videti na slikama 1-5 i tabelama 2-3, obezbeđenje konstrukta koji sadrži promotor hPGK1, linkerske sekvence (dužina i sadržaj) i WPRE omogućava ekspresiju frataksina u ćelijama. Humani PGK1 promotor je metabolički regulisan promotor eksprimiran u fiziološki relevantnim tkivima, što ga čini dobrim kandidatom za promotor za frataksin. Međutim, regulatorni elementi ili sekvence/dužina linkera koje treba koristiti da bi se mogle eksprimirati sekvence koje kodiraju frataksin nisu bile jasne. Pokušavajući različite kombinacije elemenata i sekvenci, naši rezultati pokazuju da ekspresija proteina iz humanih sekvenci koje kodiraju frataksin zahteva uključivanje operativno funkcionalnog linkera između hPGK1 promotora i sekvenci koje kodiraju FXN pošto konstrukti koji sadrže dužinu od oko 105 nt dozvoljavaju ekspresiju FXN, dok dužine linkera oko 35 nt ne dozvoljavaju, čak i sa dodatkom sekvence stabilizatora WPRE RNK. Zanimljivo je da je ovaj zahtev linkera primećen samo kada se koristi promotor hPGK1, ali ne i kod drugih testiranih promotora (tj. hSYN). Dalje, nivoi proteina frataksina iz ovog vektora su mnogo niži od onih dobijenih od vektora vođenih CMV ili CAG promotorom čak i u odsustvu WPRE sekvenci, čime su sličniji sa endogenim nivoima. Jedno od ograničenja prethodnih pristupa je da su u mogućnosti da se dobije ekspresija frataksina, korišćeni promotori visokog pokretanja, kao što su CAG ili CMV promotori, što dovodi do veoma visokog nivoa ekspresije proteina koji može izazvati ćelijski stres i prevazići neke od zaštitnih efekata. Vektor predstavljen ovde je u sposoban da pokrene ekspresiju proteina frataksina u relevantnom nervnom sistemu i perifernim tkivima u količinama unutar fiziološki funkcionalnog opsega.
2
Tabela 2: Rezime rezultata. Relativni nivoi FXN posle transfekcije sa različitim konstruktima
Ekspresioni plazmidi frataksina Ćelijski tip Antitelo Imunoreaktivnost N2A / HEK293 / Anti-HA oznaka Covance) / Anti-FXN 1.1 cDNA3.1- CMV-FXN-HA +
Ekspresioni plazmidi frataksina Ćelijski tip Antitelo Imunoreaktivnost
Tabela 3: Reporter test frataksina i konstrukata PGK1 promotora
Ekspresioni plazmidi luciferaze Ćelijski tip Ekspresija
Primer 4: In vivo podaci
1. Životinje
[0075] Mišji model YG8R Fridrajhove ataksije razvijen od strane Pook i kolege (Pook et al.
2001. Neurogenetics.3(4):185-93; Virmouni et al., 2014. PLoS ONE.9(9):e107416) korišćen u ovoj studiji je dobijen iz Jackson Laboratories Repository (br. skladišta 012253). Ovaj humani FXN transgeni mišji model je „knockaut“ za endogeni mišji frataksin gen (Fxn -/-) i sadrži humani FXN YAC transgen iz osnivača YG8 (koji nosi dve tandemske kopije humanog FXN gena sa približno 82 i sa 190 ponovaka GAA trinukleotidne sekvence). Miševi su smešteni u uslovima sličnim SPF u NexGen Mouse IVC kavezima (Allentown, NJ) sa ciklusom od 12 sati svetla-mraka i kontrolisanim negativnim pritiskom, temperaturom i vlažnošću, i slobodnim pristupom vodi i ozračenoj hrani za glodare Teklad global 18% protein (Envigo). Kolonija miša YG8R stvorena je na Institutu za zdravstvena istraživanja Germans Trias i Pujol (IGTP). U svim eksperimentima korišćeni su ženke i mužjaci hemizigotnih YG8R (Tg/-) i WT C57BI/6 miševa.
[0076] Miševi hemizigoti za mutantni humani FXN gen (YG8R) su genotipizirani kao što je prethodno objavljeno (29,36). Ukratko, genomska DNK je ekstrahovana iz YG8R mišjeg repa
2
pomoću Maxwell<®>16 Mouse Tail DNA Purification Kit (Promega). Broj kopija transgena određen je za svakog miša upotrebom kvantitativne PCR u realnom vremenu (qPCR) u LightCycler<®>480 Instrument (Roche) upotrebom SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNase H Plus) (Takara) i sledećih prajmera za transgen humanog frataksina: hFXN_Tg_FW: 5'-GAAC-TTCAAATTAGTTCCCCTTTCTTC-3' (SEQ ID NO: 7), hFXN_Tg_RV: 5'-CACAGCCAT-TCTTTGGGTTTC-3' (SEQ ID NO: 8); i interna kontrola Apolipoprotein B-100 izoforma X1: IC_FW: 5'-CACGTGGGCTCCAGCATT-3' (SEQ ID NO: 9), IC_RV: TCACCAGTCATTTCTGCCTTTG (SEQ ID NO: 10). Test je izveden u uslovima termičkog ciklusa: 95°C tokom 5 minuta, i 40 ciklusa od 95°C tokom 20 sekundi i 60°C tokom 30 sekundi, 72°C tokom 30 sekundi i konačno 1 ciklus na 72°C 2 min. Uzorci su analizirani u tri ponavljanja za svaki gen od interesa i nivoi transgena su određeni pomoću Ct (ΔΔCt) postupka. Broj kopija transgena je procenjen u odnosu na Ct podatke iz kontrolnog uzorka sa poznatim brojem kopija. Dužina ponavljanja GAA je određena pomoću GAA PCR amplifikacije PCR upotrebom LA taq (Invitrogen) i sledećih prajmera: GAA-F: 5'-GGGATTGGTT-GCCAGTGCTT-AAAAGTTAG-3' (SEQ ID NO: 11) i GAA-R: 5'-GATCTAAGGACCATCATGG-CCACACTTGCC-3' (SEQ ID NO: 12). PCR proizvodi su razdvojeni u 1.5% agaroznim gelovima elektroforezom na 100 V tokom 3 sata i analizirane su veličine traka. Broj GAA ponavljanja je zatim određen oduzimanjem 451 bp (bočne neponovljive DNK) od veličine PCR proizvoda i deljenjem preostale veličine ponavljanja baznog para sa 3.
[0077] Svi postupci na životinjama sprovedeni su u skladu sa EU i lokalnim propisima i odobreni od strane odgovarajućih lokalnih etičkih komiteta.
2. Primena AAV
[0078] YG8R hemizigotni i WT miševi starosti 10 nedelja su anestezirani intraperitonealnom injekcijom ketamina (10 mg/kg telesne težine; Imalgene 500; Rhône-Merieux, Lyon, France) i ksilazina (1 mg/kg telesne težine; Rompun; Bayer). Intratekalna primena AAV9-phPGK-FXN-HA-WPRE, AAV9-phPGK-LUC-WPRE ili AAV2/9-null izvršena je u lumbalnoj regiji. Nakon bočne izloženosti kičme, disekcijom paravertebralnih mišića, virusni vektori su polako ubrizgani u CSF kroz iglu od 33 kalibra i Hamilton špric između lumbalnih pršljenova L3 i L4. Odgovarajući pristup intratekalnom prostoru potvrđen je pokretom repa životinje. Nakon toga su mišić i koža zašiveni. Količina primenjena za svakog miša različitih virusnih vektora bila je 4.6 × 10e-12 vg/Kg telesne težine miša.
3. Vektorska bio-distribucija upotrebom imadžinga luciferaze
[0079] Za in vivo procenu biodistribucije vektora AAV9-phPGK-LUC-WPRE, na miševe je intratekalno primenjen vektorom u dobi od 10 nedelja (2.5 meseca) i 3.5 meseca kasnije dobili su jednu intraperitonealnu injekciju rastvora supstrata D-luciferina na 150 mg/kg težine miša. Miševi su anestezirani 15 minuta nakon primene supstrata inhalacionom anestezijom (izofluran 4% za indukciju i 2% za održavanje). Anestezirani miševi su držani u tamnoj komori
2
Perkin Elmer Ivis Lumina II (Caliper Life Sciences, Nemačka) da bi se snimile emisije fotona. Slike su analizirane pomoću softvera Living imaging (Xenogen Corporation, CA, EUA) sa 1 min vremenom integracije, vidno polje od 12.5 cm. Za ex-vivo procenu, tkiva i organi miševa su ekstrahovani nakon 15 minuta primene supstrata. Tkiva i organi su stavljeni u prozirne posude, a slike su snimljene korišćenjem softvera Living imaging (Xenogen Corporation, CA, EUA) kao što je gore navedeno. Rezultati se mogu videti na slici 6.
4. qRT-PCR
[0080] RNK je ekstrahovana iz 30 mg sveže zamrznutog tkiva miša upotrebom RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNK RIN i kvantifikacija su dobijeni sa Agilent 2200 TapeStation (Agilent). RNK je retrotranskribovana na cDNK (25 ng/ul) upotrebom PrimeScriptTM RT kompleta reagensa (Takara) sa termičkim uslovima: 37°C tokom 15 minuta, 85°C tokom 5 sekundi. qRT-PCR je izveden sa cDNK iz tkiva miša da bi se testirali nivoi ekspresije frataksina u formatu ploče sa više bunarčića korišćenjem instrumenta LightCycler480 (Roche Diagnostics). Reakcione smeše su sadržale ukupnu zapreminu od 10 µl koja se sastojala od 0.1 mM svakog prajmera, 10 ng cDNK i 5 µl TaqMan Universal Master Mix II, bez UNG (Thermofisher Scientific). Prajmer-probu za detekciju humanog frataksina je unapred dizajnirao Bio-rad (dHsaCPE5031641, Bio-rad), prajmere za beta-2 mikroglobulina (B2m) domaćinski gen za uzorke miševa je unapred dizajnirao IDT (Mm.PT.39a.22214835; IDT). Test je izveden u uslovima termičkog ciklusa: 50°C tokom 2 minuta, 95°C tokom 10 minuta i 40 ciklusa od 95°C tokom 15 sekundi i 60°C tokom 1 minute. Uzorci su analizirani u tri ponavljanja za svaki gen od interesa i novoi su određivani pomoću Ct (ΔΔCt) postupka. Rezultati se mogu videti na slici 7.
5. SDS-PAGE i imunobloting
[0081] Proteini su ekstrahovani iz mišjeg tkiva homogenizacijom u RIPA puferu za lizu: 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl, 0.1% natrijum deoksiholat, 1% Triton X-100, 1% SDS, 2 mM etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTTA), 25 mM natrijum fluorida (NaF), 2.5 mM NaVO3 i koktel inhibitora proteina (Roche). Koncentracija proteina je određena korišćenjem DC-BioRad proteinskog testa (BioRad). Ukupni proteinski ekstrakt je pomešan sa 4X puferom za punjenje uzorka proteina (Li-Cor Biosciences) koji sadrži 1 mM DTT i razdvojen je elektroforezom na 15% akrilamidnom gelu pri konstantnoj 20 mA pre transfera do PVDF membrane. Primarna korišćena antitela su bila anti-FXN PAC 2518 (velikodušan poklon dr Grazia Isaya, Mayo Clinic, Rochester MN), anti-FXN (1G2, Merck Millipore), anti-HA oznaka (klon 16B12, MMS-101P, Covance) i anti-beta aktin (AC15, Sigma). Sekundarna antitela konjugovana infracrvenom bojom bila su anti-mišja IRDye-800CW i anti-zečja IRDye 700CW (Li-Cor Biosciences) i imunoreaktivnost je detektovana upotrebom softvera za analizator Odyssey v2.1 (Li-Cor Biosciences). Rezultati se mogu videti na slici 8.
2
. Hvatanje
[0082] Pokazalo se da je hvatanje zadnjeg ekstremiteta marker progresije bolesti kod brojnih mišjih modela neurodegeneracije. Svaki miš je podignut za rep dalje od okolnih objekata. Položaj zadnjeg ekstremiteta je posmatran 10 sekundi i ocenjen na sledeći način: Ako su zadnji udovi bili dosledno rašireni prema van, dalje od stomaka, dodeljuje mu se ocena 0. Ako je jedan zadnji ud uvučen prema stomaku više od 50% vremena kada je obešen, dobija ocenu 1. Ako su oba zadnja uda bila delimično uvučena prema stomaku više od 50% vremena kada su bili obešeni, dobija ocenu 2. Ako su mu zadnji udovi bili potpuno uvučeni i dodiruju stomak više od 50% od vremena kada su bili obešeni, dobija ocenu 3. Refleks hvatanja je procenjivan svaka 2 meseca kod miševa od 4 meseca starosti. Rezultati se mogu videti na slici 9.
7. Elektrofiziologija
[0083] Amplituda (µV) i brzina nervne provodljivosti (m/s) merene su u kaudalnom nervu mišjeg repa. Kod životinja pod inhalacionom anestezijom (izofluran 2%), igla stimulacione elektrode je bila smeštena subkutano na 4 različite tačke stimulacije (1 cm, 2 cm, 3 cm, 4 cm od vrha repa) dok je tačka registracione igle bila fiksirana na 6 cm od vrha repa. Vrednosti su zabeležene pomoću EMG/PE N-EP sa 2 kanala iz Medelec Synergy aparata (Viasys, EUA). Tokom elektrofizioloških ispitivanja, temperatura kože životinja je održavana iznad 32°C. Miševi su procenjivani svaka 2 meseca od 4 meseca starosti. Rezultati se mogu videti na slici 10.
8. Rezultati
[0084] Predlažemo da bi predstavljeni AAV tretman bio efikasan kao tretman za FRDA jer se može eksprimirati u fiziološki relevantnim tkivima, nivoima, pokazuje sličnu obradu kao endogeni protein i može značajno poboljšati elektrofiziološka svojstva pogođenih neurona i neurološke simptome u mišjem modelu FRDA (YG8R). Slika 6 prikazuje da je gen luciferaze u vektoru AAV9 pod istim regulatornim elementima kao i FXN u vektoru AAV9-hPGK1-FXN kada se intratekalno injektira, eksprimiran kroz kičmenu moždinu, mozak kao i u perifernim tkivima. Takođe, ekspresija luciferaze pod istim vektorom i regulatorni elementi ostaju konzistentni oko najmanje 7 meseci nakon injekcije (podaci nisu prikazani). Budući da smanjeni nivoi frataksina leže u osnovi većine, ako ne i svih simptoma kod FRDA i individue koji su nosioci mutacije koja eksprimira ≥25% nivoa frataksina nemaju simptome FRDA, mali porast ekspresije FXN bi trebalo da bude u stanju da spreči ili značajno ublaži simptome kod pacijenata sa FRDA. Međutim, veoma visoki nivoi ekspresije FXN ili bilo kog drugog proteina mogu indukovati ćeliju i na kraju umanjiti zaštitne efekte ili čak pogoršati simptome. Stoga je od interesa da se razvije vektor koji eksprimira FXN koji rezultira nivoima što sličnijim onima endogenog FXN proteina. Stoga smo razvili vektor (AAV9-hPGK1-FXN) vektor koji omogućava ekspresiju FXN pod metabolički regulisanim stimulisanim u fiziološki relevantnim nivoima i isporučili ga intratekalno u 10-nedeljne YG8R hemizigotne miševe (Tg/-). Viši nivoi iRNK FXN su otkriveni kod YG8R hemizigotnih miševa (Tg/-) 3.5 meseca nakon intratekalne
2
injekcije vektora AAV9-PGK1-FXN u poređenju sa neinjektiranim miševima i u jetri i u torakalnom delu kičmene moždine (0.5 i 2 puta, respektivno; Slika 7). Oni su bili jednaki ili niži nego kod homozigotnih YG8R miševa koji su pokazali 0.5 odnosno 3 puta veći nivoi u kičmenoj moždini, u poređenju sa hemizigotnim YG8R miševima. Ovo ukazuje da je ovaj vektor za kodiranje FXN ubrizgan u L3-L4 intratekalni region uzet i eksprimiran u neuronima torakalne kičmene moždine bilo retrogradnim transportom ili difundiranjem kroz kičmenu tečnost. Takođe smo primetili da vektor AAV9 koji se intratekalno primenjuje takođe može da prođe krvno-moždanu barijeru i dostigne periferna tkiva kao što su jetra, srce, itd. (Slika 6) i da može da eksprimira iRNK hFXN iz injektiranog vektora (Slika 7).
[0085] Takođe su analizirani nivoi ekspresije FXN proteina iz razvijenog rekombinantnog vektora. Iako korišćeno antitelo pokazuje veći afinitet za humani FXN protein kao što se vidi iz uzorka proteina dobijenog posle 1 sata u odnosu na inkubaciju blota preko noći sa primarnim anti-FXN antitelom, Slika 8 prikazuje da nivoi FXN proteina eksprimirani iz vektora rAAV9-PGK1-FXN izgledaju slični nivoima FXN miša kod WT miševa (Slika 8A, trake 3 naspram 4 i Slika 8B drugi panel, trake 3 naspram 4 i 5 naspram 6 i 7). Izvanredno, uspeli smo da detektujemo rekombinantni FXN protein u regionu motornog korteksa (C1) mozga miša (slika 8B, traka 7). Ovo ukazuje na to da isporuka našeg vektora intratekalnom injekcijom u lumbalni region kičmene moždine rezultira distribucijom vektora u motoričkim regionima CNS-a. Pored toga, čini se da se rekombinantni protein obrađuje na sličan način kao i FXN protein divljeg tipa, pri čemu su intermedijerni i zreli oblik najistaknutiji obrađeni oblik.
[0086] Dalje smo analizirali fenotip YG8R hemizigotnih miševa (Tg/-) tretiranih sa rAAV9-PGK1-FXN u poređenju sa rAAV9-null vektorom za neurološki refleks hvatanja i elektrofiziološka svojstva kaudalnog nerva. Pokazalo se da je refleks hvatanja uključen u nekoliko neurodegenerativnih poremećaja. Čini se da ovaj refleks uključuje senzorne i kičmene motoričke puteve koji regulišu pokrete prednjih i zadnjih udova. Posebno se pokazalo da su uključeni cerebelo-kortiko-retikularni putevi. Stoga, da bismo odredili efekat tretmana vektora rAAV9-hPGK1-FXN na ove puteve kod YG8R miševa, kvantitativno smo odredili refleks hvatanja u različito vreme nakon intratekalne injekcije vektora (pogledati metode). Slika 9 pokazuje da YG8R miševi tretirani AAV9-null i AAV9-FXN vektorima pokazuju defekte spajanja već u dobi od četiri meseca (1.5 meseca nakon intratekalne injekcije). Međutim, tokom vremena refleks hvatanja se normalizuje kod miševa tretiranih AAV-FXN da bi više ličio na one kod WT miševa, čak i više u dobi od 10 meseci (6.5 meseci nakon injekcije). Ovo sugeriše da postoje rane anomalije u senzornom i cerebelo-kortiko-retikularnom sistemu u FRDA modelu miša koje su značajno poboljšane ili poništene tretmanom sa AAV-FXN vektorom.
[0087] Da bismo preciznije odredili efekte tretmana na senzorne neurone, odredili smo elektrofiziološka svojstva (amplitudu i brzinu) kaudalnog nerva YG8R miševa tretiranih AAV-FXN vektorom u poređenju sa onima koji su tretirani AAV9-null kontrolnim vektorom. Slika 10
2
prikazuje da na svim udaljenostima od vrha repa (1-4 cm) nisu zabeležene značajne razlike između WT tretiranih nultim vektorom ili hemizigotnih miševa YG8R tretiranih nultim vektorom ili hemizigotnih miševa tretiranih sa "null" i AAV-FXN u starosti od četiri meseca (1.5 meseci nakon tretmana). Međutim, od 6 meseci starosti, dok su YG8R (Tg/-) miševi tretirani AAV9-null pokazali značajan pad amplitude, miševi tretirani AAV9-FXN su više ličili na WT miševe čak i do 13 meseci starosti (9.5 meseci nakon tretmana). Nisu zabeležene promene u brzini (podaci nisu prikazani). Ovi podaci ukazuju da je tretman sa AAV-hPGK1-FXN vektorom bio u stanju da očuva funkciju kaudalnog nerva kod YG8R miševa, verovatno sprečavanjem gubitka aksona iz pogođenih neurona.

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Adeno-asocirani virusni (AAV) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu, naznačen time što nukleinska kiselina sadrži:
(i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira frataksin;
(ii) promotor fosfo-glicerat-kinaze (PGK) koji se sastoji od SEQ ID NO: 1; i
(iii) posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (WPRE);
pri čemu (ii) i (iii) su operativno vezani za i regulišu ekspresiju (i), pri čemu postoji operativno funkcionalni linker između (i) i (ii), pri čemu se navedeni linker sastoji od SEQ ID NO: 6, i pri čemu AAV vektor je vektor AAV serotipa 9.
2. Vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sadrži SEQ ID NO: 3, ili sekvencu koja je najmanje 90% identična SEQ ID NO: 3 i funkcionalna je varijanta frataksina.
3. Vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sastoji od SEQ ID NO: 3, ili sekvence koja je najmanje 98% identična sa SEQ ID NO: 3 i funkcionalna je varijanta frataksina.
4. Vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što se WPRE sastoji od SEQ ID NO: 2 ili sekvence koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 2.
5. Vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što se WPRE sastoji od SEQ ID NO: 2 ili sekvence koja je najmanje 99% identična sa SEQ ID NO: 2.
6. Vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sastoji od SEQ ID NO: 3, i WPRE se sastoji od SEQ ID NO: 2 ili sekvence koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 2.
7. Vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira frataksin sastoji od SEQ ID NO: 3, i WPRE se sastoji od SEQ ID NO: 2 ili sekvence koja je najmanje 99% identična sa SEQ ID NO: 2.
8. Vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži (i), (ii), (iii) i linker, sastoji od SEQ ID NO: 4.
9. Vektor za prenos koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži:
(i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira frataksin;
(ii) PGK promotor koji se sastoji od SEQ ID NO: 1; i
(iii) WPRE;
pri čemu (ii) i (iii) su operativno vezani za i regulišu ekspresiju (i), pri čemu postoji operativno funkcionalni linker između (i) i (ii), i pri čemu se navedeni linker sastoji od SEQ ID NO: 6, i pri čemu vektor za prenos dalje sadrži dodatne elemente nukleinske kiseline za stimulaciju integracije ili transpozicije vektora za prenos u vektor AAV serotipa 9.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži AAV vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
11. AAV vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, za upotrebu kao lek.
12. AAV vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, za upotrebu u lečenju Fridrajhove ataksije.
RS20230662A 2017-10-17 2018-10-17 Vektori za lečenje fridrajhove ataksije RS64553B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17382691 2017-10-17
EP18786778.3A EP3697914B9 (en) 2017-10-17 2018-10-17 Vectors for the treatment of friedreich's ataxia
PCT/EP2018/078384 WO2019076973A1 (en) 2017-10-17 2018-10-17 VECTORS FOR THE TREATMENT OF FRIEDREICH ATAXIA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64553B1 true RS64553B1 (sr) 2023-10-31

Family

ID=60262871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230662A RS64553B1 (sr) 2017-10-17 2018-10-17 Vektori za lečenje fridrajhove ataksije

Country Status (11)

Country Link
US (3) US12084673B2 (sr)
EP (2) EP4089173A1 (sr)
JP (2) JP7128491B2 (sr)
CN (1) CN111542612B (sr)
AU (1) AU2018350774B2 (sr)
CA (1) CA3079107A1 (sr)
ES (1) ES2951945T3 (sr)
HU (1) HUE062806T2 (sr)
PL (1) PL3697914T3 (sr)
RS (1) RS64553B1 (sr)
WO (1) WO2019076973A1 (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3697914T3 (pl) 2017-10-17 2023-10-16 Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol Wektory do leczenia ataksji friedreicha
US12281321B2 (en) 2018-09-28 2025-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
EP3928098B1 (en) 2019-02-20 2025-01-08 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol In vitro method for predicting mortality risk in patients suffering from cardiogenic shock
JP2022548270A (ja) * 2019-09-13 2022-11-17 ラセルタ セラピューティクス， インコーポレイテッド フリードライヒ運動失調症の治療のための組成物及び方法
MX2024003241A (es) * 2021-09-17 2024-05-15 Astellas Gene Therapies Inc Terapia genica con frataxina.

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0673431A1 (en) * 1992-12-03 1995-09-27 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
ES2582200T3 (es) * 2007-09-12 2016-09-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Utilización de vectores víricos portadores del gen CYP46A1 para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer
AU2010316982B2 (en) 2009-11-09 2013-09-12 Genepod Therapeutics Ab Novel viral vector construct for neuron specific continuous DOPA synthesis in vivo
WO2012170771A1 (en) * 2011-06-09 2012-12-13 Curna, Inc. Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn
US9066966B2 (en) * 2013-02-01 2015-06-30 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cardiomyopathy due to friedreich ataxia
EP2960336A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Genethon Efficient systemic treatment of dystrophic muscle pathologies
EP3632923A1 (en) 2015-01-16 2020-04-08 Voyager Therapeutics, Inc. Central nervous system targeting polynucleotides
WO2016150964A1 (en) * 2015-03-23 2016-09-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment and the prevention of neurological phenotype associated with friedreich ataxia
SG10201912763QA (en) * 2015-11-05 2020-02-27 Bamboo Therapeutics Inc Modified friedreich ataxia genes and vectors for gene therapy
EP3363356A1 (en) 2017-02-17 2018-08-22 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Prognosis of endovascular treatment in acute ischemic stroke patients
PL3697914T3 (pl) 2017-10-17 2023-10-16 Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol Wektory do leczenia ataksji friedreicha
EP3476863A1 (en) 2017-10-30 2019-05-01 Fundació Institut d'Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol Anti-cd5l antibody and uses thereof
US20210278405A1 (en) 2018-06-18 2021-09-09 Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red, M.P. Identification of metabolomic signatures in urine samples for tuberculosis diagnosis
ES3040135T3 (en) 2018-07-19 2025-10-28 Fundacio Inst Dinvestigacio En Ciencies De La Salut Germans Trias I Pujol In vitro method for the diagnosis of synucleinopathies

Also Published As

Publication number Publication date
PL3697914T3 (pl) 2023-10-16
AU2018350774B2 (en) 2025-03-13
EP3697914B1 (en) 2023-06-07
AU2018350774A1 (en) 2020-04-30
US20260022400A1 (en) 2026-01-22
CN111542612B (zh) 2024-03-19
US20210189423A1 (en) 2021-06-24
JP7466855B2 (ja) 2024-04-15
ES2951945T3 (es) 2023-10-25
JP7128491B2 (ja) 2022-08-31
EP3697914B9 (en) 2023-10-04
HUE062806T2 (hu) 2023-12-28
WO2019076973A1 (en) 2019-04-25
EP3697914A1 (en) 2020-08-26
JP2021501573A (ja) 2021-01-21
RU2020115898A3 (sr) 2021-11-18
US20220340928A1 (en) 2022-10-27
CA3079107A1 (en) 2019-04-25
CN111542612A (zh) 2020-08-14
RU2020115898A (ru) 2021-11-18
ES2951945T9 (es) 2023-12-28
EP4089173A1 (en) 2022-11-16
US12084673B2 (en) 2024-09-10
US12371711B2 (en) 2025-07-29
EP3697914C0 (en) 2023-06-07
JP2022166146A (ja) 2022-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12371711B2 (en) Vectors for the treatment of Friedreich&#39;s ataxia
JP6199965B2 (ja) Ｒｐｇｒｘ連鎖性網膜変性のａａｖ媒介型遺伝子治療
US11040113B2 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment and the prevention of neurological phenotype associated with Friedreich ataxia
Korecki et al. Human MiniPromoters for ocular-rAAV expression in ON bipolar, cone, corneal, endothelial, Müller glial, and PAX6 cells
JP2019536782A (ja) ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介性遺伝子編集による筋ジストロフィーの予防
CA3099306A1 (en) Compositions and methods for the treatment of parkinson&#39;s disease
Peng et al. Delivery of Oct4 and SirT1 with cationic polyurethanes-short branch PEI to aged retinal pigment epithelium
WO2016185242A1 (en) Synergistic combination of neuronal viability factors and uses thereof
JPH10505485A (ja) スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子を含むアデノウイルス
JP2025529884A (ja) ファブリー病の治療に使用するための組成物
Stieger et al. Adeno-associated virus mediated gene therapy for retinal degenerative diseases
KR20210055626A (ko) Tmem176b, 이의 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물
CN117122688B (zh) 作用于前脑兴奋性神经元的prrt2及其上调剂的应用
HK40084196A (en) Vectors for the treatment of friedreich&#39;s ataxia
US20220290157A1 (en) Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
RU2774892C2 (ru) Векторы для лечения атаксии фридрейха
CA3199230A1 (en) Elovl2 constructs for human gene therapy
US20250361527A1 (en) Vector-based gene therapy for elongator acetyltransferase complex subunit 1 (elp1)
Simonato et al. Gene Therapy for Neurological Diseases
Johnson et al. AAV9 gene therapy restores lifespan and treats pathological and behavioral abnormalities in a mouse model of CLN8-Batten disease
WO2025175135A1 (en) Modifying neurons to treat or prevent parkinson&#39;s disease
WO2024008709A1 (en) Intravenous administration of neuroglobin for treating neurological disorders
WO2025264696A2 (en) Restorative cell therapy for eye diseases and vision loss
JP2008050263A (ja) Ｒｅｔｔ症候群を治療する医薬
CN120769917A (zh) 嵌合aav及其用途