RS64573B1 - Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom - Google Patents

Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom

Info

Publication number
RS64573B1
RS64573B1 RS20230816A RSP20230816A RS64573B1 RS 64573 B1 RS64573 B1 RS 64573B1 RS 20230816 A RS20230816 A RS 20230816A RS P20230816 A RSP20230816 A RS P20230816A RS 64573 B1 RS64573 B1 RS 64573B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sirpα
human
rodent
gene
humanized
Prior art date
Application number
RS20230816A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew J Murphy
Gavin Thurston
Bindu Varghese
Cagen Gurer
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS64573B1 publication Critical patent/RS64573B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C12N2015/8572—Animal models for proliferative diseases, e.g. comprising an oncogene
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Description

UNAKRSNA REFERENCA NA POVEZANU PRIJAVU
[001] Ova prijava polaže pravo prvenstva od privremene patentne prijave br.
61/881,261 podnete u SAD 23. septembra 2013.
STANJE TEHNIKE
[002] Imuni sistem se sastoji od nekoliko različitih tipova ćelija koje su uključene u višestruke visoko regulisane procese i koje zajedno stvaraju imune odgovore koji su efikasni u eliminaciji stranih proteina. Dalje, otkriveno je da ove iste imune ćelije poseduju svojstvo samosvesti zahvaljujući, između ostalog, regulatornim membranskim proteinima koji regulišu interakcije između ćelija. Takva komunikacija je kritična za opstanak takvih organizama, jer se sugeriše da su ti isti proteini važna determinanta presađivanja transplantata. Međutim, ne postoji in vivo sistem za određivanje molekularnih aspekata interakcija humanih imunih ćelija i njihove regulacije. Takav sistem obezbeđuje izvor za analize hematopoetskih funkcija i funkcija imunog sistema ljudi in vivo, identifikacije novih terapija i vakcina.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[003] Predmetni pronalazak se takođe zasniva na spoznaji da je poželјno inženjerstvo ne-humanih životinja da bi se omogućilo pobolјšano usađivanje humanih hematopoetskih matičnih ćelija. Predmetni pronalazak je, takođe, zasnovan na prepoznavanju da su ne-humane životinje koje imaju humanizovani SIRPα gen i/ili na drugi način eksprimuju, sadrže ili proizvode humani ili humanizovani SIRPα protein poželjne, na primer, za upotrebu u usađivanju humanih hematopoetskih matičnih ćelija.
[004] Pronalazak obezbeđuje glodara čiji genom sadrži humanizovani SIRPa gen, pri čemu je humanizovani SIRPα gen operativno vezan za SIRPα promotor glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara i eksprimuje humanizovani SIRPα protein kod glodara, i pri čemu humanizovani SIRPα obuhvata (i) vanćelijski deo koji je najmanje 95% identičan ostacima amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina SEQ. ID 4 i (ii) unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara.
[005] Pronalazak dalje obezbeđuje izolovanu ćeliju ili tkivo glodara čiji genom sadrži humanizovani SIRPα gen, pri čemu je humanizovani SIRPα gen operativno vezan za SIRPα promotor glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara, i kodira humanizovani SIRPα protein, pri čemu humanizovani SIRPα protein obuhvata (i) vanćelijski deo koji je najmanje 95% identičan ostacima amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina SEQ. ID 4 i (ii) unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara.
[006] Pronalazak dodatno obezbeđuje postupak za pravljenje glodara, koji obuhvata: (a) umetanje sekvence humane SIRPα nukleinske kiseline u endogeni SIRPα lokus glodara u embrionalnu matičnu (ES) ćeliju glodara da bi se formirao humanizovani SIRPα gen, pri čemu je humanizovani SIRPα gen operativno vezan za SIRPα promotor glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara, i kodira humanizovani SIRPα protein, pri čemu humanizovani SIRPα protein obuhvata (i) vanćelijski deo koji je najmanje 95% identičan ostacima amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina SEQ. ID 4 i (ii) unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara, čime se dobija modifikovana ES ćelija glodara koja sadrži humanizovani SIRPα gen; i (b) pravljenje glodara korišćenjem modifikovane ES ćelije dobijene u (a).
[007] Pronalazak dalјe obezbeđuje postupak za procenu terapijske efikasnosti leka koji cilјa humane ćelije, koji obuhvata: (a) davanje glodaru pronalaska u koji je transplantirana jedna ili više humanih ćelija; (b) davanje kandidata za lek glodaru; i (c) praćenje humanih ćelija glodara kako bi se utvrdila terapeutska efikasnost kandidata za lek.
[008] Pronalazak dalje obezbeđuje vektor za ciljanje nukleinske kiseline, koji sadrži: fragment humane genomske DNK koji sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena, okružen 5’ homolognim krakom koji sadrži fragment genomske DNK glodara uzvodno od egzona 2 SIRPα gena glodara, i 3’ homologni krak koji sadrži fragment genomske DNK glodara nizvodno od egzona 4 SIRPα gena glodara; pri čemu integracija fragmenta humane genomske DNK u genom ćelije glodara na osnovu homologne rekombinacije dovodi do zamene egzona 2, 3 i 4 SIRPα gena glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara sa egzonima 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena da bi se formirao humanizovani SIRPα gen, pri čemu je dati humanizovani SIRPα gen operativno vezan za SIRPα promotor glodara na datom endogenom SIRPα lokusu glodara i kodira humanizovani SIRPα protein koji obuhvata vanćelijski deo humanog SIRPα proteina koji je kodiran datim humanim SIRPα genom i unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara, koji je kodiran datim SIRPα genom glodara, a pri čemu je glodar izabran iz miša ili pacova.
[009] Ovde je opisana ne-humana životinja koja eksprimuje SIRPα polipeptid koji sadrži vanćelijski deo humanog SIRPα proteina i unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina.
[0010] Vanćelijski deo humanog SIRPα proteina može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 28-362 humanog SIRPα proteina koji se pojavljuje u SEQ ID NO: 4.
[0011] Vanćelijski deo humanog SIRPα proteina može imati procentualni identitet od najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% sa odgovarajućim vanćelijskim delom humanog SIRPα proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3. Vanćelijski deo humanog SIRPα proteina može da deli 100% identiteta (ili je identičan) sa odgovarajućim vanćelijskim delom humanog SIRPα proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0012] Ovde je, takođe, opisana ne-humana životinja koja takođe ne eksprimuje endogeni nehumani SIRPα protein. Ne-humana životinja može biti glodar koji, takođe, ne eksprimuje endogeni SIRPα protein glodara. Ne-humana životinja može biti miš koji, takođe, ne eksprimuje endogeni mišji SIRPα protein koji ima sekvencu koja se pojavljuje u Tabeli 3.
[0013] Ovde je dalje opisana ne-humana životinja koja sadrži SIRPα gen koji sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena koji je operativno vezan za ne-humani SIRPα promotor.
[0014] A SIRPα gen ne-humane životinje ovde opisan može da sadrži egzone 1, 5, 6, 7 i 8 endogenog ne-humanog SIRPα gena.
[0015] Ne-humana životinja koja je ovde opisana može da bude glodar. Glodar može biti izabran između miša ili pacova.
[0016] Ovde je, takođe, opisan SIRPα polipeptid kodiran genom ne-humane životinje kako je ovde opisano.
[0017] Ovde je, takođe, opisana izolovana ćelija ili tkivo ne-humane životinje, kao što je ovde opisano. Ćelija se može izabrati između limfocita (npr. B ili T ćelije), mijeloidne ćelije (npr. makrofaga, neutrofila, granulocita, mijeloidne dendritske ćelije i mastocita) i neurona. Tkivo se može izabrati između masnog tkiva, bešike, mozga, dojke, koštane srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, želuca, timusa, testisa, jajnika i/ili njihove kombinacije.
[0018] Ovde je dodatno opisana izolovana ćelija ili tkivo miša čiji genom uključuje SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα proteina vezanog za unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina. SIRPα gen koji je ovde opisan može biti operativno vezan za mišji SIRPα promotor. Ovde opisani SIRPα gen može da sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena.
[0019] Ovde je, takođe, opisana embrionalna matična ćelija (ES) koja nije humana, čiji genom sadrži SIRPα gen kako je ovde opisan. ES ćelija može da sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena koji je operativno povezan sa ne-humanim SIRPα promotorom. ES ćelija može biti ES ćelija glodara. Ovde opisana ne-humana embrionalna matična ćelija može biti embrionalna matična ćelija miša ili pacova.
[0020] Ovde je, takođe, opisan ne-humani embrion koji sadrži, načinjen je, dobijen ili generisan iz embrionalne matične ćelije koja nije humana a koji sadrži SIRPα gen kako je ovde opisano. Ne-humani embrion može biti embrion glodara. Embrion glodara kako je ovde opisan može biti embrion miša ili pacova.
[0021] Ovde je dalje opisan postupak pravljenja ne-humane životinje koja eksprimuje SIRPα protein iz endogenog SIRPα lokusa, pri čemu SIRPα protein sadrži humanu sekvencu, a postupak obuhvata ciljanje endogenog SIRPα lokusa u ne-humanoj ES ćeliji genomskim fragmentom koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira humani SIRPα protein u celini ili delimično; dobijanje modifikovane ne-humane ES ćelije koja sadrži endogeni SIRPα lokus koji sadrži datu humanu sekvencu; i stvaranje ne-humane životinje, korišćenjem date modifikovane ES ćelije.
[0022] Kao što je ovde opisano, data nukleotidna sekvenca može da sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena. Data nukleotidna sekvenca može da sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena koji ima sekvencu od najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identiteta sa humanim SIRPα genom koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0023] Data nukleotidna sekvenca može da kodira ostatke amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina. Data nukleotidna sekvenca može da kodira ostatke amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina koji ima sekvencu od najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta sa humanim SIRPα proteinom koji se pojavljuje u Tabeli 3.
[0024] Ovde je dodatno opisan postupak obezbeđivanja miša čiji genom uključuje SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα proteina vezanog za unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina, a postupak obuhvata modifikaciju genoma miša tako da sadrži SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα proteina vezanog za unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina, čime se obezbeđuje dati miš. SIRPα gen može biti SIRPα gen kao što je ovde opisano. SIRPα gen može da sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena.
[0025] Ovde je, takođe, opisan postupak usađivanja humanih ćelija u miša, a postupak se sastoji od koraka obezbeđivanja miša čiji genom sadrži SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα proteina vezanog za unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina, i transplantaciju jedne ili više humanih ćelija u miša. Postupak može dalјe da obuhvata korak ispitivanja usađivanja jedne ili više humanih ćelija u miša. Korak analize može da obuhvata upoređivanje usađivanja jedne ili više humanih ćelija sa usađivanjem kod jednog ili više miševa divljeg tipa. Korak analize može da obuhvata upoređivanje usađivanja jedne ili više humanih ćelija sa usađivanjem kod jednog ili više miševa čiji genom ne sadrži SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα proteina vezanog za unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina.
[0026] Humane ćelije mogu biti hematopoetske matične ćelije. Humane ćelije se mogu transplantirati intravenozno. Humane ćelije se mogu transplantirati intraperitonealno. Humane ćelije se mogu transplantirati potkožno.
[0027] Takođe je ovde opisan postupak koji obuhvata korake obezbeđivanje jedne ili više ćelija čiji genom uklјučuje SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα proteina vezanog za unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina; inkubacija jedne ili više ćelija sa obeleženim supstratom; i merenje fagocitoze obeleženog supstrata po jednoj ili više ćelija. Ćelije mogu biti mišje ćelije.
[0028] Supstrat može biti fluorescentno obeležen. Supstrat može biti obeležen antitelom. Supstrat može biti jedno ili više crvenih krvnih zrnaca. Supstrat može biti jedna ili više bakterijskih ćelija.
[0029] Ovde je dodatno opisan postupak koji se sastoji od koraka obezbeđivanja miša čiji genom uključuje SIRPα gen koji kodira vanćelijski deo humanog SIRPα proteina vezanog za unutarćelijski deo mišjeg SIRPα proteina, čime se miš izlaže antigenu, i merenje fagocitoze antigena od strane jedne ili više ćelija miša. Korak izlaganja može obuhvatati izlaganje miša antigenu koji je fluorescentno obeležen. Korak izlaganja može obuhvatati izlaganje miša jednoj ili više ćelija koje sadrže antigen. Korak izlaganja može obuhvatati izlaganje miša jednoj ili više ćelija koje sadrže antigen. Korak izlaganja može obuhvatati izlaganje miša jednoj ili više bakterijskih ćelija koje sadrže antigen.
[0030] Ovde opisani SIRPα gen može da sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena. Vanćelijski deo humanog SIRPα proteina opisanog ovde može da sadrži amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 28-362 humanog SIRPα proteina koji se pojavljuje u Tabeli 3. SIRPα gen koji je ovde opisan može biti operativno vezan za mišji SIRPα promotor.
[0031] Ovde je, takođe, opisana ne-humana životinja koja se može dobiti postupcima opisanim ovde. Ne-humane životinje koje su ovde opisan, ne mogu da detektabilno eksprimuju vanćelijski deo endogenog SIRPα proteina.
[0032] Ovde su dalje opisani postupci za identifikaciju ili validaciju leka ili vakcine, postupak obuhvata korake isporuke leka ili vakcine ne-humanoj životinji kako je ovde opisana, i monitoring jednog ili više imunoloških odgovora na lek ili vakcinu, bezbednosnog profila leka ili vakcine, ili efekta na bolest, poremećaj ili stanje. Monitoring sigurnosnog profila može da uključi utvrđivanje da li ne-humana životinja pokazuje neželjena dejstva ili neželjene reakcije kao rezultat davanja leka ili vakcine. Neželjeno dejstvo ili neželjena reakcija može da se bira između morbiditeta, smrtnosti, promene telesne težine, promene nivoa jednog ili više enzima (npr. jetre), promene težine jednog ili više organa, gubitka funkcije (npr. senzorna, motorička, organska, itd.), povećana osetljivost na jednu ili više bolesti, promene genoma ne-humane životinje, povećanje ili smanjenje potrošnje hrane i komplikacije jedne ili više bolesti.
[0033] Ovde je, dodatno, opisana upotreba ne-humane životinje, kako je ovde opisana, u razvoju leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba kao lek.
[0034] Ovde je, takođe, opisana upotreba ne-humane životinje, kako je ovde opisana, za procenu efikasnosti terapijskog leka koji cilјa humane ćelije. U ne-humanu životinju opisanu ovde transplantiraju se humane ćelije, a kandidat za lek koji cilja takve humane ćelije se daje takvoj životinji. Efikasnost leka se određuje nadgledanjem humanih ćelija kod ne-humane životinje nakon primene leka.
[0035] Ovde opisane ne-humane životinje mogu biti glodari, poželjno miš ili pacov.
[0036] Kako su upotrebljeni u ovoj prijavi, izrazi „oko“ i „približno“ se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji broj koji se koristi u ovoj prijavi sa ili bez oko/približno ima za cilj da pokriva sve normalne fluktuacije koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće tehnike.
[0037] Ostale karakteristike, predmeti i prednosti ovog pronalaska su očigledni u detalјnom opisu koji sledi. Treba, međutim, shvatiti, da je detaljni opis, koji ukazuje na određene realizacije predmetnog pronalaska, dat samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje. Različite promene i modifikacije unutar obima pronalaska će postati jasne stručnjacima u tehnici iz detaljnog opisa.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0038] Ovde priloženi crtež je samo radi ilustracije, a ne kao ograničenje.
[0039] Slika 1 prikazuje dijagram, ne u razmeri, endogenog mišjeg SIRPα gena (gore) sa svakim egzonom numerisanim. Humanizovani endogeni SIRPα gen (dole) je prikazan da sadrži egzone 2-4 humanog SIRPα gena i neomicinsku selekcionu kasetu (Ub-Neo) okruženu mestima za prepoznavanje rekombinacije specifične za mesto (npr. loxP). Ciljano umetanje egzona 2-4 humanog SIRPα gena rezultira endogenim genom koji eksprimuje humanizovani SIRPα gen koji ima vanćelijski region koji odgovara humanom SIRPα proteinu.
[0040] Slika 2 prikazuje preklapanje ekspresije SIRPα divljeg tipa i mišjeg heterozigota za humanizovani SIRPα gen.
[0041] Slika 3 pokazuje procenat CD45<+>ćelija u različitim sojevima miševa sa usađenim humanim CD34+ ćelijama.
[0042] Slika 4 pokazuje procenat CD45<+>CD3<+>ćelija u različitim sojevima miševa sa usađenim humanim CD34<+>ćelijama.
[0043] Slika 5 pokazuje procenat CD45<+>CD19<+>ćelija u različitim sojevima miševa sa usađenim humanim CD34<+>ćelijama.
[0044] Slika 6 pokazuje da je Ab 1 potisnuo rast Raji tumora na način zavisan od doze kod SIRPα BRG miševa kojima su usađene hCD34+. Zapremina Raji tumora je merena 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 i 34 dana nakon implantacije tumora. Prikazani su podaci za pojedinačne životinje (Paneli A-D) . SIRPα BRG miševima sa usađenim hCD34+ su date 2x10<6>Raji tumorske ćelije supkutano 0. dana. Kontrolne grupe nisu primile antitela (kontrola vehikulumom) (Panel A). Za eksperimentalne grupe, na dan 0. miševi su tretirani IP dozom ne-vezujuće kontrole Ab (Kontrolni AB 5) na 0,4 mg/kg (Panel B), ili Ab 1 na 0,4 mg/kg (Panel C) ili 0,04 mg/kg (Panel D), nakon čega slede doze puta nedeljno tokom trajanja studije. Kompozitni podaci za sve pojedinačne test grupe prikazani su na slici 7.
[0045] Slika 7 pokazuje da je Ab 1 značajno potisnuo rast Raji tumora u poređenju sa kontrolama kod SIRPα BRG miševa sa usađenim hCD34+. Podaci predstavljaju kompozitne podatke od n=4-5 miševa po grupi kao što je prikazano na slici 6. Podaci su izraženi kao srednja vrednost (SEM) i analizirani su korišćenjem analize varijanse (ANOVA) i post hoc testova da bi se ispitali značajni efekti (Tukijev test za dvosmernu ANOVA). Jedan miš u kontrolnoj grupi vehikuluma, kontrolnoj grupi Ab 5 i grupi Ab 1 od 0,4mg/kg isključen je iz ovog kompozitnog grafikona zbog rane smrti da bi se analizirali podaci dvosmernom ANOVA-om.
[0046] Slika 8 pokazuje da Ab 1 nije uticao na telesnu težinu kod SIRPα BRG miševa sa usađenim hCD34+. Telesna težina je merena 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 i 34 dana nakon implantacije tumora. Mereni su podaci za pojedinačne životinje (Paneli A-D) . SIRPα BRG miševima sa usađenim hCD34+.su date 2x10<6>Raji tumorske ćelije supkutano 0. dana. Kontrolne grupe nisu primile antitela (kontrola vehikulumom) (panel A). Za eksperimentalne grupe, 0. dana miševi su tretirani IP dozom IgG1 nevezujućeg kontrolnog Ab 5 od 0,4 mg/kg (Panel B) ili Ab 1 od 0,4 mg/kg (Panel C) ili 0,04 mg/kg (Panel D), nakon čega slede doze dva puta nedeljno tokom trajanja studije.
DEFINICIJE
[0047] Ovaj pronalazak nije ograničen na ovde opisane posebne postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe, treba razumeti da je ovde upotrebljena terminologija samo u svrhu opisivanja određenih realizacija i da nije namenjena ograničavanju, pošto je obim predmetnog pronalaska definisan u patentnim zahtevima.
[0048] Ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni izrazi i značenja uključuju značenja koja izrazi i fraze imaju u tehnici, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kojem se koristi izraz ili fraza. Iako se bilo koji postupak i materijal sličan ili ekvivalentan ovde opisanima mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada će biti opisani određeni postupci i materijali.
[0049] Izraz „približno“ kako je ovde upotrebljen za jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim aspektima, izraz „približno“ ili „oko” odnosi se na raspon vrednosti koje spadaju u 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u bilo kojem smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti, osim ako je drugačije navedeno ili je drugačije vidljivo iz konteksta (osim u slučaju kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
[0050] Izraz „biološki aktivan", kako se ovde koristi, upućuje na odliku bilo kog sredstva koje ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr. u organizmu). Na primer, sredstvo koje, kada je prisutno u organizmu, ima biološko dejstvo u tom organizmu, smatra se da je biološki aktivno. U posebnim aspektima, gde je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli barem jednu biološku aktivnost proteina ili polipeptida obično se naziva „biološki aktivnim” delom.
[0051] Izraz "uporediv", kao što se ovde koristi, upućuje na dva ili više sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd. koji možda nisu identični jedni drugima, ali koji su dovoljno slični da omogućuju poređenje među sobom tako da se zaključci mogu razumno izvući na osnovu uočenih razlika ili sličnosti. Stručnjaci sa uobičajenim veštinama razumeće, u kontekstu, koji stepen identiteta je potreban u datim okolnostima da bi se dva ili više takvih sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd., smatrala uporedivim.
[0052] Izraz "konzervativni" kao što se ovde koristi da opiše konzervativnu supstituciju amino-kiselina, upućuje na supstituciju amino-kiselinskog ostatka sa drugim amino-kiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Uopšteno, konzervativna supstitucija amino-kiselina neće bitno promeniti funkcionalna svojstva od interesa za protein, na primer, sposobnost receptora da se veže za ligand. Primeri grupa amino-kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju alifatske bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatskohidroksilne bočne lance, kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amide kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; bazne bočne lance kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance kao što su aspartanska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor, poput cisteina i metionina. Konzervativne supstitucione grupe amino-kiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim aspektima, konzervativna supstitucija amino-kiselina može biti supstitucija bilo kog nativnog ostatka u proteinu alaninom, kao što je korišćeno u, na primer, alanin skenirajućoj mutagenezi. U nekim aspektima, napravljena je konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 opisanoj u Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. U nekim aspektima, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima nenegativnu vrednost u matrici logverovatnoće PAM250.
[0053] Izraz „disrupcija“ kako se ovde koristi odnosi se na rezultat događaja homologne rekombinacije sa molekulom DNK (npr. sa endogenom homolognom sekvencom kao što je gen ili genski lokus). U nekim aspektima, disrupcija može postići ili predstavljati umetanje, deleciju, supstituciju, zamenu, misense mutaciju ili pomeranje okvira DNK sekvence ili bilo koju njihovu kombinaciju. Insercije mogu da obuhvataju umetanje celih gena ili fragmenata gena, npr. egzona, koji mogu biti drugog porekla, a ne endogene sekvence. U nekim aspektima, disrupcija može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr. gena ili genskog proizvoda (npr. proteina koga kodira gen). U nekim aspektima, disrupcija može da smanji ekspresiju gena, proteina može da umanji ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim aspektima, disrupcija može da promeni sekvencu gena ili kodiranog genskog proizvoda (npr. kodirani protein). U nekim aspektima, disrupcija može da skrati ili fragmentira gen ili kodirani genski proizvod (npr. kodirani protein). U nekim aspektima, disrupcija može proširiti gen ili kodirani genski proizvod; u nekim takvim aspektima može doći do poremećaja sklapanja fuzionisanog proteina. U nekim aspektima, disrupcija može uticati na nivo, ali ne i aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim aspektima, disrupcija može uticati na aktivnost, ali ne i na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim aspektima, disrupcija možda neće imati značajan uticaj na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim aspektima, disrupcija možda neće imati značajan uticaj na aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim aspektima, disrupcija možda neće imati značajan uticaj bilo na nivo ili aktivnost gena ili genskog proizvoda.
[0054] Izraz „endogeni lokus“ ili „endogeni gen“, kako se ovde koristi, uklјučuje genetski lokus pronađen u roditelјskom ili referentnom organizmu pre uvođenja poremećaja, delecije, zamene, alternacije ili modifikacije kako je ovde opisano. U nekim aspektima, endogeni lokus ima sekvencu koja se nalazi u prirodi. U nekim aspektima, endogeni lokus je divljeg tipa. U nekim aspektima, referentni organizam je organizam divljeg tipa. U nekim aspektima, referentni organizam je stvoreni organizam. U nekim aspektima, referentni organizam je laboratorijski uzgojen organizam (bilo da je divlji ili stvoreni).
[0055] Izraz "endogeni promotor" odnosi se na promotor koji je prirodno povezan, na primer, u organizmu divljeg tipa, sa endogenim genom.
[0056] Izraz "heterologni", kao što se ovde koristi, odnosi se na sredstvo ili entitet iz drugog izvora. Na primer, kada se koristi u vezi sa polipeptidom, genom ili genskim proizvodom ili je prisutan u određenoj ćeliji ili organizmu, izraz pojašnjava da je relevantni polipeptid, gen ili genski proizvod 1) napravio čovek; 2) je unesen u ćeliju ili organizam (ili njihov prekursor) od strane čoveka (npr., genetskim inženjeringom); i/ili 3) nije prirodno proizveden ili prisutan u
1
odgovarajućoj ćeliji ili organizmu (npr. relevantni tip ćelije ili tip organizma).
[0057] Izraz "ćelija domaćin", kao što se ovde koristi, uključuje ćeliju u koju je uvedena heterologna (npr. egzogena) nukleinska kiselina ili protein. Stručnjaci u tehnici posle čitanja ove objave razumeće da se takvi pojmovi ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju, već se koriste i da se odnose na potomstvo takve ćelije. Budući da se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije ili zbog mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uključeno u opseg izraza „ćelija domaćin“ kao što se ovde koristi. U nekim aspektima, ćelija domaćin jeste ili sadrži prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. Generalno, ćelija domaćin je svaka ćelija koja je pogodna za prijem i/ili proizvodnju heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira na biološko carstvo za koje je ćelija označena. Primerne ćelije uključuju one prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr. sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. itd.), Ćelije mikobakterija, gljivične ćelije, ćelije kvasca ( npr. S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), životinjske ćelije koje nisu humane, humane ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim aspektima, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova ili miša. U nekim aspektima, ćelija je eukariotska i bira se iz sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), ćelija mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, VI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60 (npr. BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalni), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, ćelija Sertoli, BRL 3A ćelija, ćelija HT1080, ćelija mijeloma, tumorska ćelija i ćelijska linija izvedena iz gore pomenute ćelije. U nekim aspektima, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćeliju retine koja eksprimuje virusni gen (npr. ćeliju PER.C6™). U nekim aspektima, ćelija domaćin jeste ili sadrži izolovanu ćeliju. U nekim aspektima, ćelija domaćin je deo tkiva. U nekim aspektima, ćelija domaćin je deo organizma.
[0058] Izraz „humanizovani”, kao što se ovde koristi u skladu sa značenjem razumljivim od strane stručnjaka upućuje na nukleinske kiseline ili proteine čija struktura (tj. nukleotidne ili amino-kiselinske sekvence) obuhvata delove koji u osnovi ili identično odgovaraju strukturama određenog gena ili proteina koji se nalaze u prirodi kod ne-humane životinje, a takođe uključuju delove koji se razlikuju od onih koji se nalaze u odgovarajućem određenom genu ili proteinu koji nije humani, i umesto toga, oni bliže odgovaraju uporedivim strukturama koje su pronađene u odgovarajućem humanom genu ili proteinu. „Humanizovani” gen može biti onaj koji kodira polipeptid koji u osnovi ima sekvencu amino-kiseline kao humani polipeptid (npr. humani protein ili njegov deo - npr. njegov karakteristični deo) . Daćemo samo jedan primer, u slučaju membranskog receptora, "humanizovani" gen može kodirati polipeptid koji ima vanćelijski deo, u celini ili delom, koji ima sekvencu amino-kiseline kao humani vanćelijski deo i preostalu sekvencu kao onu kod polipeptida koji nije humani (npr. mišjeg). Humanizovani gen može da sadrži najmanje deo sekvence DNK humanog gena. Humanizovani gen može da sadrži čitavu sekvencu DNK humanog gena. Humanizovani protein može da sadrži sekvencu koja ima deo koji se pojavljuje u humanom proteinu. Humanizovani protein može da sadrži čitavu sekvencu humanog proteina i eksprimuje se iz endogenog lokusa ne-humane životinje, a koji odgovara homologu ili ortologu humanog gena.
[0059] Izraz „identičnost“ kao što se ovde koristi, u vezi sa upoređivanjem sekvenci, upućuje na identitet određen utvrđenim brojem različitih algoritama poznatih u tehnici, koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotida i/ili sekvenci amino-kiselina. U nekim aspektima, identičnosti, kao što su ovde opisane, određuju se pomoću ClustalW v.1.83 (sporog) poravnanja korišćenjem vrednosti otvorene praznine od 10.0, vrednosti za produženi razmak od 0.1 i korišćenjem Gonetove matrice sličnosti (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
[0060] Izraz „izolovan“, kao što se ovde koristi, upućuje na supstancu i/ili entitet koji je (1) odvojen od barem nekih komponenti sa kojima je povezan kada je inicijalno proizveden (bilo u prirodi i/ili u eksperimentalnom okruženju) i/ili (2) dizajniran, proizveden, pripremljen i/ili proizveden od strane čoveka. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se odvojiti od oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% ostalih komponenti sa kojima su bili u početku povezani. U nekim aspektima, izolovana sredstva su oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98% , oko 99%, ili više od oko 99% čista. Kako se ovde koristi, supstanca je „čista” ako je u osnovi bez drugih komponenti. U nekim aspektima, kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, supstanca se još može smatrati „izolovanom” ili čak „čistom”, nakon što je kombinovana sa određenim drugim komponentama kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenasa (npr. pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim aspektima, izračunava se procenat izolacije ili čistoće materije, bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenasa. Dajući samo jedan primer, u nekim aspektima, biološki polimer, poput polipeptida ili polinukleotida koji se javlja u prirodi, smatra se „izolovanim” kada, a) na osnovu svog porekla ili izvora dobijanja nije povezan sa nekim ili svim komponentama koje ga prate u svom izvornom stanju u prirodi; b) u osnovi ne sadrži druge polipeptide ili nukleinske kiseline iste vrste od vrsta koje ih proizvode u prirodi; c) je eksprimovan ili je na neki drugi način povezan sa komponentama ćelije ili drugog sistema ekspresije koji nije od vrste koja ga proizvodi u prirodi. Tako se, na primer, u nekim aspektima polipeptid koji je hemijski sintetizovan ili se sintetiše u ćelijskom sistemu različitom od onoga koji ga proizvodi u prirodi, smatra „izolovanim” polipeptidom. Alternativno ili dodatno, u nekim aspektima, polipeptid koji je podvrgnut jednoj ili više tehnika prečišćavanja može se smatrati „izolovanim” polipeptidom u meri u kojoj je odvojen od drugih komponenti a ) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojim je povezan kada je prvobitno proizveden.
[0061] Izraz „ne-humana životinja“ kao što se ovde koristi, upućuje na bilo koji organizam kičmenjaka koji nije čovek. U nekim aspektima, ne-humana životinja je ciklostom, košljoriba, rušljoriba (npr. ajkula ili raža), vodozemac, gmizavac, sisar i ptica. U nekim aspektima, ne-humani sisar je primat, koza, ovca, svinja, pas, krava ili glodar. U nekim aspektima, ne-humana životinja je glodar, poput pacova ili miša.
[0062] Izraz „nukleinska kiselina“, kao što se ovde koristi, u svom najširem smislu, upućuje na bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja jeste ili se može ugraditi u lanac oligonukleotida. U nekim aspektima, nukleinska kiselina je jedinjenje i/ili supstanca koja jeste ili se može ugraditi u lanac oligonukleotida putem fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, u nekim aspektima, „nukleinska kiselina” se odnosi na pojedinačne ostatke nukleinske kiseline (npr. nukleotide i/ili nukleozide); u nekim aspektima, „nukleinska kiselina” se odnosi na oligonukleotidni lanac koji sadrži pojedinačne ostatke nukleinske kiseline. U nekim aspektima, „nukleinska kiselina” jeste ili sadrži RNK; u nekim aspektima, „nukleinska kiselina” jeste ili sadrži DNK. U nekim aspektima, nukleinska kiselina jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više ostataka prirodne nukleinske kiseline. U nekim aspektima, nukleinska kiselina jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više analoga nukleinske kiseline. U nekim aspektima, analog nukleinske kiseline razlikuje se od nukleinske kiseline po tome što ne koristi fosfodiestarsku kičmu. Na primer, u nekim realizacijama, nukleinska kiselina jeste, sadrži ili se sastoji od jednu ili više „peptidnih nukleinskih kiselina“, koje su poznate u tehnici i imaju peptidne veze umesto fosfodiestarskih veza u kičmi, razmatrane su u okviru obima predmetnog pronalaska.
Alternativno ili dodatno, u nekim aspektima, nukleinska kiselina ima jednu ili više fosforotioatnih i/ili 5’-N-fosforamiditnih veza umesto fosfodiestarskih veza. U nekim aspektima, nukleinska kiselina jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više prirodnih nukleozida (npr. adenozina, timidina, guanozina, citidina, uridina, deoksiadenozina, deoksitimidina, deoksiguanozian i deoksi citidina). U nekim realizacijama, nukleinska kiselina jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više nukleozidnih analoga (npr.2-aminoadenozina, 2-tiotimidina, inozina, pirolo-pirimidina, 3-metil adenozina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenozina, C5-bromouridina, C5-fiuorouridina, C5-jodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenozina, 7-deazaadenozina, 7-deazaguanozina, 8-oksoadenozina, 8-oksoguanozina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, metilovane baze, interkalirane baze i njihove kombinacije). U nekim aspektima, nukleinska kiselina sadrži jedan ili više modifikovanih šećera
1
(npr. 2'-fluororiboza, riboza, 2'-deoksiriboza, arabinoza i heksoza) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. U nekim aspektima, nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalni genski proizvod kao što je RNK ili protein. U nekim aspektima, nukleinska kiselina uključuje jedan ili više introna. U nekim aspektima, nukleinska kiselina se priprema jednom ili više izolacija iz prirodnog izvora, enzimskom sintezom polimerizacijom na osnovu komplementarnog uzorka (in vivo ili in vitro), reprodukcijom u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu i hemijskom sintezom. U nekim aspektima, nukleinska kiselina je najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ili više ostataka dugačka. U nekim aspektima, nukleinska kiselina je jednolančana; u nekim aspektima, nukleinska kiselina je dvolančana. U nekim aspektima, nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jedan element koji kodira, ili je komplement sekvence koja kodira, polipeptid. U nekim aspektima, nukleinska kiselina ima enzimsku aktivnost.
[0063] Izraz „operativno povezan“, kao što se ovde koristi, odnosi se na jukstapoziciju pri čemu su opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolna sekvenca „operativno povezana” na kodirajuću sekvencu se liguje na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. „Operativno povezane” sekvence obuhvataju i kontrolne sekvence ekspresije koje su bliske genu koji nas zanima i kontrolnim sekvencama ekspresije koje transregulišu ili su na daljini radi kontrole gena od interesa. Izraz "kontrolna sekvenca ekspresije", kao što se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidne sekvence, koje su neophodne da bi se izvršila ekspresija i obrada kodirajućih sekvenci za koje su vezani. Kontrolne sekvence ekspresije, uključuju odgovarajuće inicijacije transkripcije, terminacije, promotorne i pojačivačke sekvence; efikasni RNK signali za obradu kao što su splajsujući i poliadenilacioni signali; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku mRNA; sekvence koje povećavaju efikasnost translacije (tj., Kozak konsenzusna sekvenca); sekvence koje povećavaju stabilnost proteina; i po želji, sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina. Na primer, u prokariotima, takve kontrolne sekvence obično uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za završavanje transkripcije, dok u eukariotima obično takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za završavanje transkripcije. Izraz „kontrolne sekvence” treba da obuhvati komponente čiji je prisustvo neophodno za ekspresiju i obradu, a može uključivati i dodatne komponente čija je prisutnost korisna, na primer, vodećih sekvenci i fuzionih partnerskih sekvenci.
[0064] Izraz „polipeptid“, kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koji polimerni lanac amino-kiselina. U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja se javlja u prirodi. U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja se ne pojavljuje u prirodi. U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja je napravljena tako da je dizajnirana i/ili proizvedena dejstvom ruku čoveka.
[0065] Izraz „rekombinantni“, kao što se ovde koristi, je namenjen da uputi na polipeptide (npr. signalno-regulatorne proteine kao što je ovde opisano) koji su dizajnirani, kreirani, pripremljeni, izraženi, stvoreni ili izolovani rekombinantnim sredstvima, kao što su polipeptidi eksprimovani korišćenjem rekombinantnog vektora ekspresije transfektovanog u ćeliju domaćina, polipeptide izolovane iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanog polipeptida (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech.15:62-70; Azzazy H., i Highsmith W. E., (2002), Clin. Biochem.35:425-445; Gavilondo J. V., i Larrick J. W., (2002) BioTechniques 29:128-145); Hoogenboom H., i Chames P. (2000), Immunology Today 21:371-378), antitela koja su izolovana iz životinje (npr. miša) koji je transgen za humane imunoglobulinske gene (videti npr., Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295; Kellermann S-A. and Green L. L. (2002), Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370) ili polipeptide koji su pripremljeni, eksprimovani, stvoreni ili izolovani na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje odabranih elemenata sekvence jedan za drugi. U nekim aspektima jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence nalaze se u prirodi. U nekim aspektima jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence je dizajnirano in silico. U nekim aspektima jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence rezultat je mutageneze (npr. in vivo ili in vitro) poznatog elementa sekvence, npr. iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Na primer, u nekim aspektima, rekombinantni polipeptid sadrži sekvence koje se nalaze u genomu organizma izvora koji nas zanima (npr. čoveka, miša itd.). U nekim aspektima rekombinantni polipeptid ima sekvencu amino-kiseline koja je rezultat mutageneze (npr. in vitro ili in vivo, na primer kod ne-humane životinje), tako da su sekvence amino-kiselina rekombinantnih polipeptida sekvence koje, iako potiču iz i povezane su sa sekvencama polipeptida, ne mogu prirodno postojati unutar genoma ne-humane životinjein vivo.
[0066] Izraz „zamenska” se ovde koristi da uputi na postupak kroz koji je „zamenjena” sekvenca nukleinske kiseline (npr. gen) koja se nalazi u lokusu domaćina (npr. u genomu) uklonjena iz tog lokusa i na svoje mesto je postavljena je drugačija „zamenska” nukleinska kiselina. U nekim aspektima, zamenjene sekvence nukleinskih kiselina i zamenske sekvence nukleinske kiseline su uporedive jedna sa drugom, na primer, one su homologne jedna drugoj i/ili sadrže odgovarajuće elemente (npr. elemente koji kodiraju proteine, regulatorne elemente, itd.). U nekim aspektima, zamenjena sekvenca nukleinskih kiselina uključuje jedan ili više promotora, pojačivača, splajsujuće mesto za donora, mesta prijemna splajsa, intron, ekson, neprevedene
1
regije (UTR); u nekim aspektima, zamenska sekvenca nukleinskih kiselina uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. U nekim aspektima, zamenska sekvenca nukleinske kiseline je homolog zamenjene sekvence nukleinske kiseline. U nekim aspektima, zamenska nukleinska kiselina je ortolog zamenjene sekvence. U nekim aspektima, zamenska nukleinska kiselina jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline. U nekim aspektima, uključujući gde zamenska sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu glodara (npr. sekvencu miša). Tako postavljena nukleinska kiselina može da sadrži jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne sekvence nukleinske kiseline koja se koristi za dobijanje tako postavljene sekvence (npr., promotora, pojačivača, 5’- ili 3’- neprevedene regije, itd.). Na primer, u raznim aspektima, zamena je supstitucija endogene sekvence heterolognom sekvencom koja rezultira proizvodnjom genskog proizvoda iz tako postavljene sekvence nukleinske kiseline (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne i ekspresijom endogene sekvence; zamena je od endogene genomske sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira SIRPα protein, a DNK fragment kodira jedan ili više humanih SIRPα proteina). U različitim aspektima, endogeni gen ili njegov fragment je zamenjen odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom.
Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog ili je u osnovi sličan ili isti u strukturi i/ili funkciji, endogenom genu ili njegovom fragmentu koji je zamenjen.
[0067] Izraz „signalni regulatorni protein“ ili „SIRP“ kako se ovde koristi odnosi se na receptor signalnog regulatornog proteina, npr. SIRPα receptor. SIRP geni uključuju receptor plazma membrane koji se eksprimuje na površini ćelije i služi kao regulatorni protein uključen u interakcije između proteina na površini membrane na leukocitima. Unutar SIRP gena, polimorfne varijante su opisane kod ljudskih subjekata. Kao ilustracija, nukleotidne i amino-kiselinske sekvence humanih i mišjih SIRP gena, prikazane su na tabeli 1. Stručnjaci u tehnici nakon čitanja ove prijave prepoznaće da jedan ili više endogenih receptora SIRP gena u genomu (ili svi) mogu biti zamenjeni jednim ili više heterolognih SIRP gena (npr. polimorfnim varijantama, podtipovima ili mutantima, genima druge vrste, humanizovanim oblicima, itd.).
[0068] „Ćelija koja eksprimuje SIRP“ kako se ovde koristi odnosi se na ćeliju koja eksprimuje receptor signalnog regulatornog proteina. U nekim aspektima, ćelija koja eksprimuje SIRP eksprimuje receptor signalnog regulatornog proteina na svojoj površini. U nekim aspektima SIRP protein može se eksprimovati na površini ćelije u količini koja je dovolјna da posreduje interakcije ćelija-ćelija putem SIRP proteina eksprimovanog na površini ćelije. Primeri ćelija koje eksprimuju SIRP uključuju neurone, limfocite, mijeloidne ćelije, makrofage, neutrofile i ćelije
1
prirodne ubice (NK). Ćelije koje eksprimuju SIRP regulišu interakciju imunih ćelija kako bi regulisale imuni odgovor na različite strane antigene ili patogene. Ne-humane životinje opisane ovde mogu da pokažu regulaciju imunih ćelija preko humanizovanih SIRP receptora eksprimovanim na površini još jedne ćelije ne-humane životinje.
[0069] Izraz „suštinski” kao što se ovde koristi, upućuje na kvalitativni uslov ispoljavanja ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Stručnjak u biološkoj tehnici razumeće da biološke i hemijske pojave retko, ako ikad, završe i/ili pristupe dovršenosti ili postignu ili izbegnu apsolutni rezultat. Izraz „suštinski” se ovde stoga koristi za hvatanje potencijalnog nedostatka potpunosti koji je svojstven mnogim biološkim i hemijskim pojavama.
[0070] Izraz „suštinska homologija” kao što se ovde koristi, odnosi se na poređenje između sekvenci amino-kiselina ili sekvenci nukleinskih kiselina. Kao što će se razumeti od strane stručnjaka u tehnici, dve sekvence se obično smatraju „suštinski homolognim”, ako sadrže homologne ostatke na odgovarajućim pozicijama. Homologni ostaci mogu biti identični ostaci. Alternativno, homologni ostaci mogu biti neidentični ostaci koji će imati odgovarajuće slične strukturne i/ili funkcionalne karakteristike. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima iz tehnike, određene amino-kiseline su po pravilu klasifikovane kao „hidrofobne" ili „hidrofilne" amino-kiseline i/ili kao da imaju „polarni" ili „nepolarni" bočni lanac. Supstitucija jedne aminokiseline drugom istog tipa često se može smatrati "homolognom" supstitucijom. Uobičajene kategorizacije amino-kiselina sumirane su u tabelama 1 i 2.
TABELA 1
Alanin Ala A nepolarna neutralna 1.8 Arginin Arg R polarna pozitivna -4.5 Asparagin Asn N polarna neutralna -3.5 Asparaginska Asp D polarna negativna -3.5 Cistein Cys C nepolarna neutralna 2.5 Glutaminska Glu E polarna negativna -3.5 Glutamin Gln Q polarna neutralna -3.5 Glicin Gly G nepolarna neutralna -0.4 Histidin His H polarna pozitivna -3.2 Izoleucin Ile I nepolarna neutralna 4.5 Leucin Leu L nepolarna neutralna 3.8
Lizin Lys K polarna pozitivna -3.9 Metionin Met M nepolarna neutralna 1.9 Fenilalanin Phe F nepolarna neutralna 2.8 Prolin Pro P nepolarna neutralna -1.6 Serin Ser S polarna neutralna -0.8 Treonin Thr T polarna neutralna -0.7 Triptofan Trp W nepolarna neutralna -0.9
1
Tirozin Tyr Y polarna neutralna -1.3 Valin Val V nepolarna neutralna 4.2
TABELA 2
Dvoznačne amino-kiseline 3-slova 1-slovo Asparaginska kiselina ili aspartična
kiselina Asx B
Glutamin ili Glutaminska kiselina Glx Z
Leucin ili Izoleucin Xle J Nespecifikovane ili nepoznate amino- Xaa X
kiseline
[0071] Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se porediti koristeći bilo koji od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim računarskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa razmacima i PSI-BLAST za sekvence amino-kiselina. Primeri takvih programa opisani su u Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; 1990; Altschul, et al. Methods in Enzymology, Altschul, et al., “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res.
25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1999. Pored identifikacije homolognih sekvenci, gore navedeni programi obično daju i stepen homologije. U nekim aspektima, dve sekvence smatraju se suštinski homolognim ako je barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka homologno u odnosu na odgovarajući deo ostataka. U nekim aspektima, relevantni deo je potpuna sekvenca. U nekim aspektima, relevantni deo je najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili više ostataka. U nekim aspektima, relevantni deo uključuje susedne ostatke duž kompletne sekvence. U nekim aspektima, odgovarajući deo uključuje diskontinuirane ostatke duž kompletne sekvence. U nekim aspektima, relevantni deo je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.
[0072] Izraz „ suštinski identičan" kao što se ovde koristi, odnosi se na poređenje između amino-kiselina ili sekvenci nukleinskih kiselina. Kao što je ponato stručnjacima u tehnici, dve sekvence se obično smatraju „u osnovi identičnim” ako sadrže identične ostatke na odgovarajućim pozicijama. Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se porediti koristeći bilo koji od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim računarskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne
1
sekvence i BLASTP, BLAST sa razmacima i PSI-BLAST za sekvence amino-kiselina. Primeri takvih programa opisani su u Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol.
Biol.,215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology, Altschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1999. Pored identifikovanja identičnih sekvenci, gore navedeni programi obično daju i stepen identiteta. U nekim aspektima, dve sekvence se smatraju u osnovi identičnim ako je barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više odgovarajućih ostataka identično u relevantnom delu ostataka. U nekim aspektima, relevantni deo je potpuna sekvenca. U nekim aspektima, relevantni deo je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.
[0073] Izraz „ciljajući vektor“ ili „ciljajući konstrukt“ kao što se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidni molekul koji sadrži ciljajući region. Ciljajući region sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična sekvenci u ciljnoj ćeliji, tkivu ili životinji i omogućava integraciju ciljajućeg konstrukta u položaj unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje putem homologne rekombinacije. Ciljajući regioni koji koriste lokacije za prepoznavanje rekombinacija specifičnih za lokaciju (npr. loxP ili Frt mesta) su takođe uključeni. U nekim aspektima, ovde opisani ciljajući konstrukt dalje sadrži sekvencu nukleinskih kiselina ili gen od posebnog interesa, selekcioni marker, kontrolne i/ili regulatorne sekvence i druge sekvence nukleinske kiseline koje omogućavaju rekombinaciju posredovanu egzogenim dodavanjem proteina koji pomažu u ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. U nekim aspektima, ciljajući konstrukt ovde opisan dalje sadrži gen od interesa u celosti ili delimično, pri čemu je gen od interesa heterologni gen koji kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom.
[0074] Izraz „varijanta“, kao što se ovde koristi, odnosi se na entitet koji pokazuje značajan strukturni identitet sa referentnim entitetom, ali se strukturno razlikuje od referentnog entiteta u prisustvu ili nivou jedne ili više hemijskih grupa u poređenju sa referentnim entitetom. U mnogim aspektima, „varijanta” se, takođe, funkcionalno razlikuje od svog referentnog entiteta. Uopšteno, da li se određeni entitet ispravno smatra „varijantom“ referentnog entiteta, zasniva se na njegovom stepenu strukturnog identiteta sa referentnim entitetom. Kao je poznato stručnjacima u tehnici, bilo koji biološki ili hemijski referentni entitet ima određene karakteristične strukturne elemente. Varijanta, po definiciji, je različiti hemijski entitet koji deli jedan ili više takvih karakterističnih strukturnih elemenata. Da bismo ipak dali nekoliko primera, mali molekul može imati karakteristični strukturni element jezgra (npr. jezgro makrocikla) i/ili
1
jedan ili više karakterističnih visećih grupa, tako da je varijanta malog molekula ona koja deli strukturni element jezgra i karakteristične viseće grupe, ali se razlikuje kod ostalih visećih grupa i/ili u vrstama veza (jednostruke nasuprot dvostrukoj, E protiv Z, itd.) unutar jezgra, polipeptid može imati karakteristični element sekvence koji se sastoji od većeg broja amino-kiselina koje imaju označene pozicije jedna u odnosu na drugu u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru i/ili doprinose određenoj biološkoj funkciji, nukleinska kiselina može imati karakteristični element sekvence koji se sastoji od većeg broja nukleotidnih ostataka koji imaju određene položaje jedan u odnosu na drugi u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru. Na primer varijanta polipeptida može se razlikovati od referentnog polipeptida kao rezultat jedne ili više razlika u sekvenci amino-kiselina i/ili jedne ili više razlika u hemijskim delovima (npr. ugljeni hidrati, lipidi, itd.) kovalentno vezanim za polipeptidnu kičmu. U nekim aspektima, varijanta polipeptida pokazuje ukupni identitet sekvence sa referentnim polipeptidom koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ili 99%. Alternativno ili dodatno, u nekim aspektima, varijanta polipeptida ne deli barem jedan karakteristični element sekvence sa referentnim polipeptidom. U nekim aspektima, referentni polipeptid ima jednu ili više bioloških aktivnosti. U nekim aspektima, varijanta polipeptida deli jednu ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. U nekim aspektima, varijanti polipeptida nedostaje jedna ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. U nekim aspektima, varijanta polipeptida pokazuje smanjeni nivo jedne ili više bioloških aktivnosti u poređenju sa referentnim polipeptidom. U mnogim aspektima, polipeptidom od interesa se smatra „varijanta“ roditelja ili referentnog polipeptida ako polipeptid od interesa ima sekvencu amino-kiselina koja je identična onoj roditeljskoj (matičnoj) ali sa malim brojem izmena sekvenci na određenim pozicijama.
Uobičajeno je manje od 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ostataka u varijanti supstituisano u poređenju sa matičnim. U nekim aspektima, varijanta ima 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstituisanih ostataka u poređenju sa matičnim. Često, varijanta ima veoma mali broj (npr. manji od 5, 4, 3, 2 ili 1) supstituisanih funkcionalnih ostataka (tj. ostataka koji učestvuju u određenoj biološkoj aktivnosti ). Dalje, varijanta obično nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 dodataka ili delecija i često nema dodataka ili delecija, u poređenju sa matičnim. Štaviše, bilo kakvi dodaci ili delecije su obično manji od oko 25, oko 20, oko 19, oko 18, oko 17, oko 16, oko 15, oko 14, oko 13, oko 10, oko 9, oko 8, oko 7, oko 6, i obično su manje od oko 5, oko 4, oko 3 ili oko 2 ostatka. U nekim aspektima, roditeljski (matični) ili referentni polipeptid je onaj koji se nalazi u prirodi. Kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, u prirodi se može naći veći broj varijanti određenog polipeptida od interesa, posebno kada je polipeptid od interesa polipeptid sa infektivnim agensom.
[0075] Izraz „vektor“, kao što se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline
2
koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. U nekim aspektima vektori su sposobni za ekstrahromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina na koje su povezani u ćeliji domaćinu, kao što je eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori koji mogu usmeravati ekspresiju operativno povezanih gena ovde se zovu „ekspresioni vektori."
[0076] Izraz „divljeg tipa”, kao što se ovde koristi, ima značenje razumljivo u struci koje upućuje na entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kakvu nalazimo u prirodi u „normalnoj" (nasuprot mutantnom, bolesnom, izmenjenom, itd.) stanju ili kontekstu. Stručnjaci u tehnici će ceniti da geni i polipeptidi divljeg tipa često postoje u više različitih oblika (npr. aleli).
DETALJAN OPIS
[0077] Ovde su opisane, između ostalog, poboljšane i/ili konstruisane ne-humane životinje koje imaju humanizovani genetski materijal koji kodira signalni regulatorni protein (npr. SIRP) za testove ugradnje transplantata, aktivaciju fagocitoze i transdukciju signala. Takođe se smatra da takve ne-humane životinje pružaju pobolјšanje transplantacijskog usađivanja humanih ćelija. Prema tome, ovaj pronalazak je posebno koristan za održavanje humanih hematopoetskih ćelija kod ne-humanih životinja. Naročito, predmetna prijava obuhvata humanizaciju glodarskog SIRPα gena što rezultira eksprimovanjem humanizovanog proteina na površini ćelijske membrane ne-humane životinje. Takvi humanizovani proteini imaju sposobnost da prepoznaju usađene humane ćelije angažovanjem humanizovanog SIRPα proteina na površini ćelija i liganda prisutnih na površini usađenih humanih ćelija. Ovde su opisane ne-humane životinje koje su sposobne da prime transplantirane humane hematopoetske ćelije; takvi ne-humani sisari mogu razviti i/ili imati imuni sistem koji sadrži humane ćelije. Humanizovani SIRPα proteini mogu da imaju sekvencu koja odgovara ostacima amino-kiselina 28 – 362 humanog SIRPα proteina. Nehumane životinje opisane ovde mogu da sadrže endogeni SIRPα gen koji sadrži genetski materijal od ne-humane životinje i heterologne vrste (npr. čoveka). Ovde opisane ne-humane životinje mogu da sadrže humanizovani SIRPα gen, pri čemu humanizovani SIRPα gen sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena.
[0078] Različiti aspekti pronalaska detaljno su opisani u sledećim odeljcima. Upotreba odeljaka nije namenjena da ograniči pronalazak. Svaki odeljak može da se odnosi na bilo koji aspekt ovog pronalaska. U ovoj prijavi, upotreba „ili“ znači „i/ili“ osim ako nije drugačije navedeno.
Porodica gena signalnih regulatornih proteina (SIRP)
[0079] Signalni regulatorni proteini (SIRP) čine familiju glikoproteina na ćelijskoj površini koji se eksprimuju na limfocitima, mijeloidnim ćelijama (uključujući makrofage, neutrofile, granulocite, mijeloidne dendritične ćelije i mastocite) i neuronima (npr. vidi: Barclay and Brown, 2006, Nat Rev Immunol 6, 457-464). Postoji nekoliko zabeleženih SIRP gena i oni se mogu kategorisati prema njihovim odgovarajućim ligandima i vrstama signalizacije u koje su uključeni. SIRPα (takođe poznat kao CD172A, SHPS1, P84, MYD-1, BIT i PTPNS1) se eksprimuje na imunim ćelijama mijeloidne loze i funkcioniše kao inhibitorni receptor preko imunoreceptorskog tirozin-baziranog inhibitornog motiva (ITIM). Ekspresija SIRPa je, takođe, primećena na neuronima. Zabeleženi ligandi za SIRPα uključuju, pre svega, CD47, ali takođe uključuju surfaktantne proteine A i D. SIRPβ (takođe nazvan CD172b) se eksprimuje na makrofagima i neutrofilima, međutim, nisu prijavljeni nikakvi poznati ligandi. SIRPβ sadrži kratak citoplazmatski region u poređenju sa SIRPα i poznato je da se povezuje sa signalnom komponentom poznatom kao DNAX aktivacioni protein 12 (DAP12). Stoga se smatra da je SIRPβ aktivirajući receptor. SIRPγ (koji se takođe naziva CD 172g i SIRPβ2) se eksprimuje na limfocitima i ćelijama prirodnim ubicama i takođe se vezuje za CD47, međutim, nije prijavljena nikakva signalna funkcija jer citoplazmatski rep sadrži samo četiri amino-kiseline i nedostaje sekvenca koja bi olakšala povezivanje sa DAP12. Još jedan član, SIRPδ, je opisan i postoji kao rastvorljivi receptor.
[0080] Uloga SIRPα, posebno, je ispitivana u pogledu njegove inhibitorne uloge u fagocitozi ćelija domaćina od strane makrofaga. Na primer, vezivanje CD47 za SIRPα na makrofagima, pokreće inhibitorne signale koji negativno regulišu fagocitozu. Alternativno, prijavljeni su pozitivni efekti signalizacije posredovani vezivanjem SIRPα (Shultz et al., 1995, J Immunol 154, 180-91).
SIRPα Sekvence
[0081] Primeri SIRPα sekvenci za miša i čoveka navedeni su u Tabeli 3. Za cDNK sekvence, uzastopni egzoni su razdvojeni naizmeničnim podvučenim tekstom. Za proteinske sekvence, signalni peptidi su podvučeni, a transmembranske i citoplazmatske sekvence su ispisane kurzivom.
[0082]
TABELA 3
2
2
�
Humanizovane SIRPα ne-humane životinje
[0083] Obezbedjene su ne-humane životinje koje eksprimuju humanizovane SIRPα proteine na površini imuno ćelija (npr. mijeloidnih ćelija) ne-humanih životinja a koje su rezultat genetske modifikacije endogenog lokusa ne-humane životinje a koja kodira SIRPα protein. Pogodni primeri opisani ovde uključuju glodare, posebno miševe.
2
[0084] Humanizovani SIRPα gen, ovde opisan, može da sadrži genetski materijal od heterologne vrste (npr. ljudi), pri čemu humanizovani SIRPα gen kodira SIRPα protein koji sadrži kodirani deo genetskog materijala heterologne vrste. Ovde opisani humanizovani SIRPα gen može da sadrži genomsku DNK heterologne vrste koja odgovara vanćelijskom delu SIRPα proteina koji se eksprimuje na plazma membrani ćelije. Ne-humane životinje, embrioni, ćelije i ciljajući konstrukti za pravljenje ne-humanih životinja, embrioni koji nisu humani i ćelije koje sadrže navedeni humanizovani SIRPα gen takođe su opisani.
[0085] Endogeni SIRPα gen može biti izbrisan. Endogeni SIRPα gen može da bude izmenjen, pri čemu je deo endogenog SIRPα gena zamenjen heterolognom sekvencom (npr., humanom SIRPα sekvencom, u celini ili delimično). Ceo ili suštinski ceo endogeni SIRPα gen može da bude zamenjen heterolognim genom (npr., humanim SIRPα genom). Deo heterolognog SIRPα gena može da bude ubačen u endogeni SIRPα gen koji nije humani na endogenom SIRPα lokusu. Heterologni gen može biti humani gen. Modifikacija ili humanizacija može da se vrši na jednoj od dve kopije endogenog SIRPα gena, što stvara ne-humanu životinju a koja je heterozigotna u odnosu na humanizovani gen SIRPα. Opisana je ne-humana životinja koja je homozigotna za humanizovani SIRPα gen.
[0086] Ovde opisana ne-humana životinja sadrži humani SIRPα gen, u celini ili delimično, na endogenom ne-humanom SIRPα lokusu. Takve ne-humane životinje mogu se opisati kao da imaju heterologni SIRPα gen. Zamenjeni, insertovani, modifikovani ili izmenjeni SIRPα gen na endogenom SIRPα lokusu ili protein eksprimovan iz takvog gena može se otkriti korišćenjem različitih metoda, uključujući, na primer, PCR, Western blot, Southern blot, test polimorfizma dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) ili test na dobitak ili gubitak alela. Nehumana životinja može da bude heterozigotna u odnosu na humanizovani SIRPα gen.
[0087] Ovde opisani humanizovani SIRPα gen može da uklјuči SIRPα gen koji ima drugi, treći, četvrti, peti, šesti i sedmi ekson, a svaki može imati sekvencu najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu drugom, trećem i četvrtom eksonu koji se pojavlјuju u humanom genu SIRPα iz Tabele 3.
[0088] Humanizovani SIRPα gen, koji je ovde opisan, može da uključi SIRPα gen koji ima nukleotidnu kodirajuću sekvencu (npr. cDNK sekvencu) najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu nukleotidima 352 – 1114 koji se pojavljuju u humanizovanoj SIRPα Cdna sekvenci iz tabele 3.
[0089] Humanizovani SIRPα protein proizveden od strane ne-humane životinje koja je ovde opisana, može da ima vanćelijski deo koji ima sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%,
2
55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična vanćelijskom delu humanog SIRPα proteina koji se pojavljuje na tabeli 3.
[0090] Humanizovani SIRPα protein proizveden od strane ne-humane životinje a koja je ovde opisana može da ima vanćelijski deo koji ima sekvencu koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična ostacima amino-kiselina 28 - 362 koji se pojavljuju u humanom SIRPα proteinu sa tabele 3.
[0091] Humanizovani SIRPα protein proizveden od strane ne-humane životinje a koja je ovde opisana može da ima sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična sekvenci amino-kiselina humanizovanog SIRPα proteina koji se pojavljuje na tabeli 3.
[0092] Opisane su kompozicije i postupci za pravljenje ne-humanih životinja, a koje eksprimuju humanizovani SIRPα protein, uključujući specifične polimorfne oblike, alelne varijante (npr. pojedinačne razlike u amino-kiselinama) uključujući kompozicije i postupke za pravljenje ne-humanih životinja koje eksprimuju takve proteine iz humanog promotora i humane regulatorne sekvence. Takođe su opisane kompozicije i postupci za pravljenje ne-humanih životinja koje eksprimuju takve proteine iz endogenog promotora i endogene regulatorne sekvence. Postupci uključuju ubacivanje genetskog materijala koji kodira humani SIRPα protein u celini ili delimično na preciznu lokaciju u genom ne-humane životinje a koji odgovara endogenom SIRPα genu, stvarajući na taj način humanizovani SIRPα gen koji eksprimuje SIRPα protein koji je humani u celini ili delimično. Postupci mogu da uključe ubacivanje genomske DNK koja odgovara eksonima 2 - 4 humanog SIRPα gena u endogeni SIRPα gen ne-humane životinje, stvarajući tako humanizovani gen koji kodira SIRPα protein koji sadrži humani deo koji sadrži amino-kiseline koje su kodirane insertovanim eksonima.
[0093] Pristup humanizovanog SIRPα gena koristi relativno minimalnu modifikaciju endogenog gena i rezultira prirodnom transdukcijom signala posredovanog prirodnim SIRPα kod ne-humane životinje, jer su genomski redosledi SIRPα sekvenci modifikovani u jednom fragmentu i stoga zadržavaju normalnu funkcionalnost uključivanjem potrebnih regulatornih sekvenci. Dakle, modifikacija SIRPα gena možda neće uticati na druge okolne gene ili druge endogene SIRP gene. Dalje, modifikacija možda neće uticati na sastavljanje funkcionalnog receptora na plazmi i održava normalne efektorske funkcije vezanjem i naknadnom transdukcijom signala kroz citoplazmatski deo receptora, na koji modifikacija ne utiče.
[0094] Shematska ilustracija (ne u razmeri) endogenog mišjeg SIRPα gena i humanizovanog SIRPα gena data je prikazana na slici 1. Kao što je ilustrovani, genomski DNK koji sadrži eksone 2 - 4 humanog SIRPα gena je ubačen u endogeni mišji SIRPα gen pomoću
2
ciljajućeg konstrukta. Genomska DNK uključuje deo gena koji kodira vanćelijski deo (npr. ostatke amino-kiselina 28 - 362) humanog SIRPα proteina odgovornog za vezivanje liganda.
[0095] Ne-humana životinja (npr. miš) koja ima humanizovani SIRPα gen na endogenom SIRPα lokusu može se napraviti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, može se napraviti ciljajući vektor koji uvodi humani SIRPα gen u celini ili delimično sa selektivnim marker genima. Slika 1 ilustruje mišji genom koji sadrži inserciju eksona 2 - 4 humanog SIRPα. Kao što je prikazano, ciljajući konstrukt sadrži 5’ homologni krak koji sadrži sekvencu ushodno od eksona 2 endogenog mišjeg SIRPα gena, praćen genomskim DNK fragmentom koji sadrži eksone 2 - 4 humanog SIRPα gena, ketridža za izbor leka (npr. gen za otpornost na neomicin sa obe strane okružen loxP sekvencama) i 3’ homologni krak koji sadrži sekvencu nishodno od eksona 4 endogenog mišjeg SIRPα gena. Nakon homologne rekombinacije, eksoni 2 - 4 endogenog mišjeg SIRPα gena su zamenjeni sekvencom sadržanom u ciljajućem vektoru.
Humanizovani SIRPα gen se dobija i rezultuje u ćeliji ili ne-humanoj životinji a koja eksprimuje humanizovani SIRPα protein koji sadrži amino-kiseline kodirane eksonima 2- 4 humanog SIRPα gena. Kaseta za izbor leka može opciono da se ukloni naknadnim dodavanjem rekombinaze (npr. tretmanom Cre).
[0096] Pored miševa koji imaju humanizovane SIRPα gene kao što je ovde opisano, ovde su takođe opisane i druge genetski modifikovane ne-humane životinje koje sadrže humanizovane SIRPα gene. Takve ne-humane životinje sadrže humanizovani SIRPα gen koji je operativno povezan sa endogenim SIRPα promotorem. Takve ne-humane životinje mogu da eksprimuju humanizovani SIRPα protein iz endogenog lokusa, pri čemu humanizovani SIRPα protein sadrži ostatke amino-kiselina 28 – 362 humanog SIRPα proteina.
[0097] Takve ne-humane životinje mogu biti odabrane iz grupe koju čine miš, pacov, zec, svinja, goveče (npr. krava, bik, bivo), jelen, ovca, koza, kokoška, mačka, pas, feretka, primat (npr., marmozet, rezus makaki majmuni). Za ne-humane životinje za koje pogodne genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, primenjuju se drugi postupci da se napravi nehumana životinja koja sadrži genetske modifikacije, kao ovde opisane. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikaciju ne-ES ćelijskog genoma (npr. fibroblast ili indukovanu pluripotentnu ćeliju) i korišćenje nuklearnog prenosa za prenos modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr. oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (npr. modifikovanog oocita) kod ne-humane životinje, pod pogodnim uslovima da formira embrion.
[0098] Ovde opisana životinja može biti sisar koja nije čovek. Ne-humana životinja ovde opisana može da bude mali sisar, na primer, iz natporodice Dipodoidea ili Muroidea. Ovde opisana genetski modifikovana životinja može da bude glodar. Ovde opisan glodar može da bude izabran između miša, pacova i hrčka. Glodar može da bude izabran iz natporodice Muroidea.
Ovde opisana genetski modifikovana životinja može da bude iz porodice izabrane iz Calomyscidae (npr. hrčaka sličnih miševima), Cricetidae (npr. hrčaka, pacova i miševa iz Novog sveta, voluharica), Muridae (pravi miševi i pacovi, gerbili, ježoliki miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi penjači, kameni miševi, belorepi pacovi, Hypogeomys antimena), Platacanthomyidae (npr. Platacanthomys lasiurus), i Spalacidae (npr., krtice, Rhizomys sinensis i zokori). Ovde opisani genetski modifikovani glodari mogu da se biraju između pravog miša ili pacova (porodice Muridae), gerbila (pustinjskog pacova), ježolikog miša i grivastog pacova. Genetski modifikovani miš koji je ovde opisan može da potiče od člana porodice Muridae. Nehumana životinja ovde opisana može da bude glodar. Ovde opisani glodar može biti izabran od miša i pacova. U nekim aspektima, ne-humana životinja koja je ovde opisana može da bude miš.
[0099] U nekim aspektima, ne-humana životinja koja je ovde opisana je glodar koji je miš C57BL soja odabranog između C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, and C57BL/Ola. Miš može da bude soj 129 izabran iz grupe koja se sastoji od soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr.129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (vidi npr.
Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). U nekim određenim aspektima, ovde opisani genetski modifikovani miš je kombinacija gore pomenutog soja 129 i pomenutog soja C57BL/6. U nekim određenim aspektima, ovde opisani miš je kombinacija gore pomenutih sojeva 129 ili kombinacija gore pomenutih sojeva BL/6. U nekim određenim aspektima, soj 129 kombinacije kako je ovde opisano je soj 129S6 (129/SvEvTac). Ovde opisani miš može da bude soj BALB, npr. soj BALB/c. Ovde opisani miš može da bude kombinacija soja BALB i drugog napred pomenutog soja.
[00100] Ovde opisana ne-humana životinja može biti pacov. Ovde opisani pacov može biti odabran od Wistar pacova, soja LEA, soja Sprague Dawley, soja Fischer, F344, F6 i Dark Agouti. U nekim određenim aspektima, soj pacova ovde opisan je kombinacija dva ili više sojeva odabranih iz grupe koja se sastoji od Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.
1
Postupci Primene Ne-humanih Životinja Koje Imaju Humanizovane SIRPα gene [00101] SIRPα mutantne i transgene ne-humane životinje (npr. miševi) su zabeleženi (Inagaki et al., 2000, EMBO Journal 19(24):6721-6731; Strowig et al., 2011, Proc. Nat. Acad. Sci. 108(32): 13218-13223). Takve životinje su korišćene u različitim testovima da bi se utvrdili, na primer, molekularni aspekti ekspresije, funkcije i regulacije SIRPα. Međutim, nisu bez ograničenja. Na primer, upotreba SIRPα mutantnih miševa je ograničena zbog štetnih zdravstvenih stanja koja su rezultat nesposobnosti ćelija koje sadrže mutantni oblik SIRPα da signaliziraju. Dalje, pošto CD47, ligand za SIRPα, može biti prisutan na istoj ćeliji kao mutantni oblik SIRPα i oba proteina su sposobna da obezbede unutarćelijske signale, nije moguće razlikovati da li su takvi rezultati posledica nedostatka SIRPα signalizacije ili nedostatka vezivanja CD47. U slučaju transgenih miševa sa humanim SIRPα, mišji SIRPα je netaknut i funkcionalan. Dakle, funkcije zavisne od SIRPα u različitim biološkim procesima (npr. usađivanje) ne mogu se jasno pripisati samo funkciji humanog SIRPα ili funkciji samo mišjeg SIRPα kod ovih miševa, jer su i humani i mišji SIRPα receptori prisutni i funkcionalni.
[00102] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede poboljšani in vivo sistem i izvor bioloških materijala (npr. ćelija) koji eksprimuju humani SIRPα koji su korisni za razne testove. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za razvoj terapeutskih sredstava koja cilјaju SIRPα i/ili moduliraju SIRPα-CD47 signalizaciju. Miševi predmetnog pronalaska mogu se koristiti za skrining i razvoj kandidata za terapiju (npr. antitela) koja se vezuju za humani SIRPα. Ovde opisane životinje koje nisu čovek mogu se koristiti za određivanje profila vezivanja antagonista i/ili agonista humanizovanog SIRPα na površini ćelije životinje koja nije čovek kako je ovde opisano.
[00103] Ne-humane životinje ovde opisane, mogu da se koriste za merenje terapeutskog efekta blokiranja ili modulacije signalizacije SIRPα (npr. fosforilacije) i efekta na ekspresiju gena kao rezultata ćelijskih promena. Ovde opisana ne-humana životinja ili ćelije izolovane od nje može biti izložena kandidatu za terapiju koji se vezuje za humani SIRPα na površini ćelije nehumane životinje i, nakon naknadnog vremenskog perioda, mogu se analizirati efekti na procese zavisne od SIRPα, na primer, proliferaciju B i/ili T ćelija, klirens trombocita i indukciju ekspresije citokina.
[00104] Ne-humane životinje,ovde opisane, mogu da eksprimuju humanizovani SIRPα protein, pa ćelije, ćelijske linije i ćelijske kulture mogu biti generisane da služe kao izvor humanizovanog SIRPα za upotrebu u vezujućim i funkcionalnim testovima, npr. za ispitivanje vezivanja ili funkcija SIRPα antagonista ili agonista, posebno gde je antagonist ili agonist specifičan za humanu SIRPα sekvencu ili epitop. Humanizovani SIRPα protein eksprimovan nehumanom životinjom, kao što je ovde opisano, može da sadrži varijantu sekvence amino-kiselina.
2
Zabeležene su varijante humanih SIRPα proteina koji imaju varijacije povezane sa ostacima vezivanja liganda. Ne-humane životinje koje su ovde opisane eksprimuju humanizovanu varijantu proteina SIRPα. Varijanta može biti polimorfna na poziciji amino-kiseline povezane sa vezanjem liganda. Ne-humane životinje ovde opisane, koriste se za određivanje efekta vezivanja liganda putem interakcije sa polimorfnom varijantom humanog SIRPα.
[00105] Ovde opisane ćelije ne-humanih životinja mogu se izolovati i koristiti ad hoc, ili se mogu održavati u kulturi tokom mnogih generacija. Ćelije ne-humane životinje ovde opisane mogu biti učinjene besmrtnim i održavane u kulturi neograničeno (npr.u serijskim kulturama).
[00106] Ćelije ne-humanih životinja ovde opisanih mogu da se koriste u ispitivanju ćelijske transmigracije za testiranje i razvoj kandidata za terapeutike koji moduliraju humani SIRPα.
Takvi procesi su neophodni za mnoge ćelijske procese, uklјučujući zarastanje rana, diferencijaciju, proliferaciju i preživlјavanje.
[00107] Ćelije ne-humanih životinja ovde opisane mogu se koristiti u klonalnim testovima za ćelije koje formiraju megakariocitne kolonije za testiranje farmako-toksikoloških aspekata kandidata za terapiju koji ciljaju humani SIRPα.
[00108] Ovde opisane ćelije ne-humanih životinja mogu se koristiti u testovima fagocitoze za određivanje terapeutskog potencijala jedinjenja ili bioloških sredstava za modulaciju regulacije fagocitoze zavisne od SIRPα.
[00109] Ovde opisane ne-humane životinje mogu da obezbede in vivo sistem za analizu i testiranje leka ili vakcine. Kandidatski lek ili vakcina mogu se isporučiti jednoj ili više nehumanih životinja ovde opisanih, praćeno monitoringom ne-humanih životinja radi utvrđivanja jednog ili više imunoloških odgovora na lek ili vakcinu, sigurnosnog profila leka ili vakcine, ili efekta na bolest ili stanje. Takvi lekovi ili vakcine mogu se poboljšati i/ili razviti kod takvih nehumanih životinja.
[00110] Ovde opisane ne-humane životinje mogu pružiti pobolјšani in vivo sistem koji razjašnjavaju mehanizme interakcije ćelija-ćelija kod humanih ćelija putem usvojenog prenosa. Ovde opisanim ne-humanim životinjama može se implantirati ksenograft tumora, nakon čega sledi druga implantacija limfocita koji infiltriraju tumor koji se mogu usaditi adoptivnim transferom da bi se utvrdila efikasnost u iskorenjivanju solidnih tumora ili drugih malignih tumora. Takvi eksperimenti se mogu izvoditi sa humanim ćelijama zbog ekskluzivnog prisustva humanog SIRPα bez nadmetanja sa endogenim SIRPα ne-humane životinje. Dalјe, terapije i farmaceutski proizvodi za upotrebu u ksenotransplantaciji mogu se pobolјšati i/ili razviti kod takvih životinja koje nisu čovek.
[00111] Ovde opisane ne-humane životinje mogu obezbediti pobolјšani in vivo sistem za održavanje i razvoj humanih hematopoetskih matičnih ćelija kroz ugrađivanje. Ovde opisane nehumane životinje mogu pružiti pobolјšani razvoj i održavanje humanih matičnih ćelija unutar nehumanih životinja. Povećane populacije diferenciranih humanih B i T ćelija mogu se posmatrati u krvi, koštanoj srži, slezini i timusu životinje koje nisu čovek. Ne-humane životinje ovde opisane mogu da obezbede povećanje nivoa usađivanja humanih ćelija u poređenju sa ne-humanim životinjama koje eksprimuju i mišji i humani SIRPα.
[00112] Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za procenu efikasnosti terapijskog leka koji cilja humane ćelije. U ne-humanu životinju opisanu ovde transplantiraju se humane ćelije, a kandidat za lek koji cilja takve humane ćelije se daje takvoj životinji.
Terapeutska efikasnost leka se zatim određuje nadgledanjem humanih ćelija kod ne-humane životinje nakon primene leka. Lekovi koji se mogu testirati na ne-humanim životinjama uključuju kako jedinjenja malih molekula, tj. jedinjenja molekulske težine manjih od 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD ili 800 daltona, tako i velika molekularna jedinjenja (kao što su proteini, npr. antitela), koja imaju namenjene terapeutske efekte za lečenje ljudskih bolesti i stanja targetiranjem (npr. vezivanjem i/ili dejstvom na) humane ćelije.
[00113] Lek može biti lek protiv raka, a humane ćelije su ćelije raka, koje mogu biti ćelije primarnog raka ili ćelije ćelijskih linija uspostavljenih iz primarnog raka. U ovim aspektima, nehumanoj životinji ovde opisanoj može biti transplantirana ćelija raka čoveka, a lek protiv raka dat je ne-humanoj životinji. Efikasnost leka može se utvrditi procenom da li je rast ili metastaza ćelija raka čoveka kod ne-humane životinje inhibiran kao posledica primene leka.
[00114] Lek protiv raka može biti molekul antitela, koji vezuje antigen na humanim ćelijama raka. Lek protiv raka može biti bispecifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka i za antigen na drugim humanim ćelijama, na primer, ćelijama humanog imuno sistema (ili „ljudske imune ćelije“) kao što su B ćelije i T ćelije.
[00115] Ovde opisanoj ne-humanoj životinji mogu se ugraditi humane imune ćelije ili ćelije koje se diferenciraju u humane imune ćelije. U takvu ne-humanu životinju sa ugrađenim humanim imunološkim ćelijama transplantiraju se humane ćelije raka i daje joj se lek protiv raka, kao što je bispecifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka i za antigen na humanim imuno ćelijama (npr. T ćelijama). Terapijska efikasnost bispecifičnog antitela može se proceniti na osnovu njegove sposobnosti da inhibira rast ili metastaze humanih ćelija raka kod ne-humane životinje. U ovde opisanu ne-humanu životinju može se ugraditi humani CD34+ hematopoetske progenitorne ćelije koje stvaraju koje stvaraju imune ćelije (uklјučujući T ćelije, B ćelije, NK ćelije, između ostalih). Ćelije limfoma humane B ćelije (npr. Radži ćelije) transplantiraju se u takvu ne-humanu životinju sa ugrađenim humanim imunološkim ćelijama, kojoj se zatim daje bispecifično antitelo koje se vezuje za CD20 (antigen na normalnim B
4
ćelijama i određenih malignih tumora B ćelija) i CD3 podjedinice receptora T ćelije, da se testira sposobnost bispecifičnog antitela da inhibira rast tumora kod ne-humane životinje.
PRIMERI
[00116] Sledeći primeri su dati kako bi se opisalo onima koji su prosečni stručnjaci u tehnici kako da naprave i koriste ovde opisane postupke i kompozicije pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što su pronalazači smatrali za svoj pronalazak. Ako nije drugačije naznačeno, temperatura je prikazana u Celzijusu, a pritisak jeste ili je blizu atmosferskog.
Primer 1. Humanizacija endogenog gena signalnog regulatornog proteina (SIRP).
[00117] Ovaj primer ilustruje ogledne postupke humanizacije endogenog gena koji kodira signalni regulatorni protein alpha (SIRPα) kod ne-humanog sisara, poput glodara (npr. miša). Poznato je da humani SIRPα postoji u najmanje 10 alelnih oblika. Postupci opisani u ovom primeru mogu se koristiti za humanizaciju endogenog SIRPα gena ne-humane životinje korišćenjem bilo kojeg humanog alela, ili kombinacije humanih alela (ili fragmenata alela) po želji. U ovom primeru, varijanta 1 humanog SIRPα je primenjena za humanizaciju endogenog SIRPα gena miša.
[00118] Ciljajući vektor za humanizaciju vanćelijskog regiona SIRP (npr. SIRPα) konstruisan je pomoću tehnologije VELOCIGENE® (vidi, npr. U.S. Patent No.6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with highresolution expression analysis, Nature Biotech.21(6):652-659).
[00119] Ukratko, klon mišjeg bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) bMQ-261H14 je modifikovan da se izbriše sekvenca koja sadrži egzone 2 do 4 endogenog SIRPα gena i ubace egzoni 2 do 4 humanog SIRPα gena korišćenjem humanog BAC klona CTD-3035H21.
Genomska DNK koja odgovara egzonima 2 do 4 endogenog SIRPα gena (~8555 bp) zamenjena je u BAC klonu bMQ-261H14 sa ~8581 bp DNK fragmentom koji sadrži egzone 2 do 4 humanog SIRPα gena iz BAC klona CTD-3035H21. Analiza sekvence humanog SIRPα alela sadržanog u BAC klonu CTD-3035H21 otkrila je da alel odgovara humanoj varijanti 1. Kaseta neomicina okružena loxP mestima je dodata na kraj ~8581 bp humanog DNK fragmenta koji sadrži egzone 2 do 4 humanog SIRPα gena (Slika 1).
[00120] Homologni krakovi uzvodno i nizvodno su dobijeni iz mišje BAC DNK na pozicijama 5’ i 3’ egzona 2 i 4, tim redosledom, i dodati ~8581 bp humanom fragmentu-neomicin kaseti da bi se stvorio konačni ciljajući vektor za humanizaciju endogenog SIRPα gena, koji sadrži homologni krak 3’ do 5’, a 5’ homologni krak sadrži 19 kb mišje DNK, 5’ egzona 2 endogenog SIRPα gena, ~8581 bp DNK fragment koji sadrži egzone 2 do 4 humanog SIRPα gena, neomicinsku kasetu okruženu loxP lokacijama i 3’ homologni krak koji sadrži 21 kb mišje DNK 3’ egzona 4 endogenog SIRPα gena. Ciljana insercija ciljajućeg vektora pozicionirala je kasetu neomicina u peti intron mišjeg SIRPα gena između egzona 4 i 5. Ciljajući vektor je linearizovan digestijom sa SwaI, a zatim korišćen u homolognoj rekombinaciji u bakterijskim ćelijama da bi se postigla ciljana zamena egzona 2 do 4 u mišjem SIRPα genu sa egzonima 2 do 4 humanog SIRPα gena (Slika 1).
[00121] Ciljana BAC DNK (opisana gore) je korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija da bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže zamenu egzona 2 do 4 u endogenom mišjem SIRPα genu sa genomskim fragmentom koji sadrži egzone 2 do 4 humanog SIRPα gena.
Pozitivne ES ćelije koje sadrže genomski fragment koji sadrži egzone 2 do 4 humanog SIRPα gena su identifikovane kvantitativnim PCR korišćenjem TAQMAN™ sondi (Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). Nukleotidna sekvenca preko ushodne tačke insercije uključivala je sledeće, što ukazuje na endogenu sekvencu miša ushodno od tačke insercije (koja se nalazi u zagradama u daljem tekstu) vezanu kontinuirano za humanu SIRPα sekvencu kasete prisutnu na mestu umetanja: (AGCTCTCCTA CCACTAGACT GCTGAGACCC GCTGCTCTGC TCAGGACTCG ATTTCCAGTA CACAATCTCC CTCTTTGAAA AGTACCACAC ATCCTGGGGT) GCTCTTGCAT TTGTGTGACA CTTTGCTAGC CAGGCTCAGT CCTGGGTTCC AGGTGGGGAC TCAAACACAC TGGCACGAGT CTACATTGGA TATTCTTGGT (SEQ ID NO: 6). Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke insercije na 5’ kraju kasete neomicina uključivala je sledeće, što ukazuje na humanu SIRPα genomsku sekvencu koja je u blizini sekvence kasete nizvodno od tačke insercije (nalazi se u zagradama ispod sa loxP sekvencom u kurzivu): GCTCCCCATT CCTCACTGGC CCAGCCCCTC TTCCCTACTC TTTCTAGCCC CTGCCTCATC TCCCTGGCTG CCATTGGGAG CCTGCCCCAC TGGAAGCCAG (TCGAG ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA) (SEQ ID NO: 7).
Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke insercije na 3’ kraju neomicinske kasete uključivala je sledeće, što ukazuje na sekvencu kasete koja je u blizini genomske sekvence miša 3’ egzona 4 endogenog gena i endogenog SIRPα gena (nalazi se u zagradama ispod): CATTCTCAGT ATTGTTTTGC CAAGTTCTAA TTCCATCAGA CCTCGACCTG CAGCCCCTAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGC (TGTCTCATAG AGGCTGGCGA TCTGGCTCAG GGACAGCCAG TACTGCAAAG AGTATCCTTG TTCATACCTT CTCCTAGTGG CCATCTCCCT GGGACAGTCA) (SEQ ID NO: 8).. Pozitivni ES ćelijski klonovi su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa korišćenjem VELOCIMOUSE® metode (videti, npr., US Pat. No.7,294,754 i Poueymirou et al.2007, F0 generacija miševa koji su u potpunosti izvedeni iz donorskih genski ciljanih ES ćelija što dozvoljava neposrednu fenotipsku analizu Nature Biotech.25(1):91-99) da bi se stvorilo leglo mladunaca koje sadrži inserciju egzona 2 do 4 humanog SIRPα gena u endogeni SIRPα gen miša.
[00122] Ciljane ES ćelije opisane iznad su korišćene kao donorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miša VELOCIMOUSE® metodom (supra). Miševi koji nose humanizaciju eksona 2 do 4 endogenog SIRPα gena ponovo su potvrđeni i identifikovani genotipizacijom korišćenjem test modifikacije alela (Valenzuela et al., supra) koji je otkrio prisustvo humanih SIRPα genskih sekvenci.
[00123] Miševi koji nose humanizovani SIRPα genski konstrukt (tj. koji sadrže humane SIRPα egzone 2 do 4 u mišjem SIRPα genu) mogu da se uzgajaju do Cre deletor soja miša (videti, npr. Međunarodnu patentnu prijavu WO 2009/114400) kako bi se uklonila bilo koja loksirana neomicin kaseta uvedena ciljajućim vektorom koji nije uklonjen, na primer, u fazi ES ćelije ili u embrionu. Opciono, neomicinska kaseta se zadržava u mišu.
[00124] Mladunci su genotipizirani, a heterozigotni mladunac za humanizovani konstrukt SIRPα gena odabran je za karakterizaciju.
Primer 2. Ekspresija humanizovanog SIRPα u ne-humanim životinjama.
[00125] Ovaj primer prikazuje karakterističnu ekspresiju SIRPα proteina na površini ćelija ne-humanih životinja koje su konstruisane da sadrže humanizovani SIRPα genski konstrukt kao što je opisano u Primeru 1 na endogenom SIRPα lokusu.
[00126] Ukratko, slezine su izolovane od divljeg tipa (WT) i mišjih heterozigota za humanizovani SIRPα gen. Slezine su zatim perfuzirane sa kolagenazom D (Roche Bioscience), a eritrociti su lizirani ACK puferom za lizu u skladu sa specifikacijama proizvođača. Ekspresija na ćelijskoj površini mišjeg i humanog SIRPα je analizirana pomoću FACS-a korišćenjem anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), anti-CD11b (M1/70), anti-humanog SIRPα (SE5A5) i anti-mišjeg SIRPα (P84) konjugovanog sa fluorohromom. Protočna citometrija je izvedena korišćenjem BD LSRFORTESSA™. Primer ekspresije humanog i mišjeg SIRPα detektovane na površini CD11b+ monocita je prikazan na slici 2.
[00127] Kao što je prikazano na Slici 2, ekspresija i mišjeg i humanizovanog SIRPα se jasno može detektovati na površini CD11b<+>monocita heterozigotnih miševa.
Primer 3. Usađivanje humanih ćelija u humanizovane SIRP ne-humane životinje.
[00128] Ovaj primer prikazuje poboljšano usađivanje humanih hematopoetskih matičnih ćelija kod ne-humanih životinja koje imaju humanizovani SIRPα gen.
[00129] Ukratko, Rag2 KO IL2Rγ<null>] miševi sa ili bez humanizovanog SIRPα gena su uzgajani u uslovima bez patogena. Novorođeni miševi (stari od 2 do 5 dana) su ozračeni sa 240 cGy i intrahepatično ubrizgani sa 1x10<5>CD34<+>humanim hematopoetskim matičnim ćelijama. Miševima je uzeta krv 10 do 12 nedelja nakon presađivanja, a krv je analizirana pomoću FACS-a korišćenjem fluorohrom konjugovanog anti-humanog CD45 (HI30), anti-humanog CD3 (SK7), anti-humanog CD19 (HIB19) i anti-mišjeg CD45 (30-F11) da bi se proverila rekonstitucija humanog imunog sistema. Genetska pozadina miševa je BALB/cTa x 129/SvJae.
[00130] Primerni procenti humanih CD34<+>ćelija kod divljeg tipa, mišjih heterozigota za humanizovani SIRPα, mišjih homozigota za humanizovani SIRPα i BALB-Rag2<-/->IL2Rγc<-/->(DKO) miševa su prikazani u na Slikama 3 – 5.
[00131] Kao što je prikazano u ovom primeru, mišji homozigoti za humanizovani SIRPα gen pokazuju poboljšano usađivanje humanih CD34<+>ćelija obezbeđujući najveći procenat humanih CD34+ ćelija na periferiji (npr. krvi) u poređenju sa drugim testiranim sojevima.
[00132] Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da je humanizovani SIRPα funkcionalan kod miševa kako je ovde opisano kroz ekspresiju na površini ćelija kod miša i sposoban je da podrži usađivanje humanih CD34<+>hematopoetskih matičnih ćelija.
Primer 4. Procena efikasnosti Ab 1 na rast Raji tumora limfoma kod BRG miševa.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[00133] Ab 1 je bispecifično antitelo (bsAb) koje se vezuje za CD3, T ćelijski antigen povezan sa kompleksom T ćelijskih receptora (TCR) i CD20, površinski antigen B ćelija prisutan na normalnim B ćelijama i nekoliko maligniteta loze B ćelija. Ab 1 je dizajniran da premosti ćelije koje eksprimiraju CD20 sa citotoksičnim T ćelijama vezivanjem za CD3 podjedinicu TCR-a, što rezultira CD20-usmerenim poliklonskim ubijanjem T ćelija. CD20 je klinički potvrđena meta za imunoterapiju; himerno antitelo rituksimab je odobreno za lečenje nehočkinovih limfoma (NHL) i hronične limfocitne leukemije (CLL). Iako pacijenti mogu postati refraktorni na rituksimab, gubitak ekspresije CD20 se obično ne primećuje. Prema tome, bispecifično antitelo koje premošćuje CD20-pozitivne tumorske ćelije sa citotoksičnim T ćelijama predstavlja potencijalnu strategiju protiv tumora.
[00134] U ovoj studiji, efekat tretmana sa CD20xCD3 bsAb Ab 1 na rast tumora humanog B ćelijskog limfoma (Raji) je ispitivan na modelu tumora kod miša. Model je koristio BALB/c-Rag2null IL2rγnull (BRG) miševe sa usađenim hCD34+ koji su humanizovani za SIRPα. Ovi miševi, sa humanim T, B i NK ćelijama, kao i granulocitima, monocitima i dendritskim ćelijama (DC), tretirani su sa Ab 1 dva puta nedeljno, što je rezultiralo značajnom supresijom rasta Raji tumora u poređenju sa kontrolnim vehikulumom i nevezujućim kontrolnim mAb, kontrolnim Ab 5. Tretman Ab 1 je potisnuo rast tumora i pri 0,4 mg/kg i 0,04 mg/kg sa većim značajem od kontrolne grupe sa vehikulumom tokom perioda lečenja (p<0,0001). Nijedan značajan gubitak težine nije primećen ni u jednoj grupi za tretiranje. Ovi rezultati prikazuju da Ab 1 cilja Raji tumore kod miševa sa humanim imunim ćelijama, što rezultira značajnom supresijom tumora.
MATERIJALI I POSTUPCI
Materijali
Testno jedinjenje i kontrolno antitelo
[00135] Testno jedinjenje: Ab 1.
[00136] Kontrolno antitelo: Kontrolni Ab 5.
Reagensi
Tabela 4: Lista reagenasa
Testni sistemi
[00137] Studije tumora predstavljene u ovom izveštaju su koristile 24-32 nedelje stare mužjake i ženke BALB/c-Rag2null IL2rγnull (BRG) imunodeficijentnih miševa humanizovanih za signalni regulatorni protein alfa (SIRPα) gen. Oni su generisani u Regeneranu ciljanjem embrionalnih matičnih ćelija (ES) (Strowig et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108(32): 13218-13223 (2011)). Nakon prepoznavanja CD47, SIRPα inhibira klirens CD47 pozitivnih ćelija od strane makrofaga. Prethodne studije su pokazale da BRG miševi koji eksprimuju humani SIRPα transgen imaju pojačano usađivanje humanog HSC (Strowig et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108(32): 13218-13223 (2011)).
[00138] Novorođeni SIRPα BRG mladunci su ozračeni i usađeni sa hCD34+ hematopoetskim progenitorskim ćelijama izvedenim iz fetalne jetre (Traggiai, et al., Science, 304(5667): 104-107 (2004)). Ovi humani HSC stvaraju humane T, B i NK ćelije, kao i granulocite, monocite i dendritske ćelije (DC). Zbog niskog nivoa cirkulišućih humanih B ćelija, postoji nizak nivo cirkulišućih humanih IgG. Štaviše, ovi miševi ne razvijaju zametne centre, nemaju limfne čvorove i imaju ograničeno nadopunjavanje T i B ćelija ako su ove ćelije iscrpljene. Mišji monociti, DC i granulociti, takođe, ostaju prisutni. Kompozicija imunih ćelija je potvrđena protočnom citometrijom krvi, a miševi su randomizirani prema % humanog CD45 usađivanja pre upotrebe u studijama tumora. Miševima su implantirane ćelije Raji tumora na dan 0, a testirana je sposobnost Ab 1 da blokira rast tumora tokom 4 nedelje. Telesna težina i zapremine tumora zabeleženi su 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30. i 34. dana nakon implantacije.
Eksperimentalni dizajn
Rekonstitucija humanog imunog sistema kod SIRPα BRG miševa
[00139] Imunodeficijentni BALB/c Rag2 /-γc-/- (BRG) humani SIRP alpha (SIRPα BRG) miševi su uzgajani u izolatorima bez klica u objektu za životinje Regenerona. Novorođeni miševi su zračeni jednom dozom od 300cGrey, 8-24 h pre injekcije humanih CD34+ hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) izolovanih iz jetre humanog fetusa. Presađivanju je ostavljeno da se razvije tokom 12-16 nedelja i broj presađenih ćelija je periodično procenjivan protočnom citometrijom. Tokom čitavog trajanja eksperimenta, životinje su bile smeštene u Regeneron objektu za životinje pod standardnim uslovima u 12-časovnom ritmu dan/noć sa pristupom hrani i vodi ad libitum.
4
Broj životinja po kavezu bio je ograničen na najviše 5 miševa.
[00140] Krv miša je analizirana da bi se odredili procenti nivoa presađivanja pre početka studije. Cela krv je sakupljena u dve kapilarne epruvete koje sadrže 150 µL 2% EDTA (etilendiamintetrasirćetne kiseline; 15 mg/mL). Crvena krvna zrnca su lizirana korišćenjem ACK pufera za lizu 3 minuta i pufer je neutralizovan sa PBS (bez kalcijuma ili magnezijuma). Ćelije su blokirane sa Fc Block-om tokom 5 minuta na 4°C i zatim obojene humanim CD45, NKp46, CD19, CD3 i CD14 tokom 30 minuta na 4°C. Uzorci su analizirani pomoću 5-laserske protočne citometrije (BD Fortessa). Procenat usađivanja je određen kao % humanih CD45+ ćelija od ukupnih ćelija.
Procedura studije Raji tumora kod SIRPα BRG miševa
[00141] Dana 0, grupama od 5 SIRPα BRG miševa je dato 2x10<6>Raji tumorskih ćelija supkutano. Istog dana, miševi su tretirani intraperitonealnom (IP) dozom bilo Ab 1 (0,4 ili 0,04 mg/kg), nevezujućeg kontrolnog mAb Kontrolnog Ab 5 (koji vezuje mačji antigen bez unakrsne reaktivnosti na humani CD20 ili CD3) u dozi od 0,4 mg/kg ili samo vehikulum. Miševi su nakon toga primali dve doze antitela nedeljno tokom 4 nedelje. Rast tumora je meren meračem 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30. i 34. dana. Studijske grupe su sumirane u Tabeli 5.
Tabela 5: Sažetak tretmanskih grupa za SIRPα BRG miševe
Specifične procedure
Priprema reagenasa
[00142] Ab 1 i Kontrolni Ab 5 su razblaženi do željene koncentracije u vehiklumu (10 mM histidina, 5% saharoze, pH 5.8). Raji ćelije su dobijene iz Regeneron osnovnog postrojenja (prolaz 4) i održavane u medijumu za kulturu: RPMI 1640 10% FBS Pen Strep-L-Glu Merkaptoetanol. Raji ćelije su razblažene do željene koncentracije u medijumu.
Statističke analize
[00143] Statističke analize su obavljene korišćenjem GraphPad softvera Prism 5.0 (verzija za Mekintoš). Statistička značajnost je određena dvosmernom ANOVA-om sa Tukijevim višestrukim poređenjima nakon testa. Podaci iz svakog od očitavanja su upoređeni po tretmanskim grupama. Prag od p<0.05 smatran je statistički značajnim, na šta ukazuje *. Miševi koji su umrli pre kraja studije su uklonjeni iz kombinovane krive rasta tumora (ali ne i individualne krive rasta kod miša) kao što je naznačeno i statističke analize da bi se analizirala dvosmerna ANOVA.
REZULTATI
Ab 1 potiskuje rast Raji tumorskih ćelija kod SIRPα BRG miševa sa usađenim hCD34+ [00144] Ab 1 je potisnuo rast Raji tumora u poređenju sa kontrolom vehikulumom i nevezujućom kontrolom kod SIRPα BRG miševa sa usađenim hCD34+ (Slika 6). Novorođeni SIRPα BRG mladunci su ozračeni i presađene su im hCD34+ ćelije fetalne jetre kao hematopoetske progenitorske ćelije (Traggiai, et al., Science, 304(5667): 104-107 (2004)), što je dovelo do rasta humanih T, B, i NK ćelija, kao i granulocita, monocita i DC. Dana 0, SIRPα BRG miševima sa usađenim hCD34+ je supkutano ubrizigano 2x10<6>Raji tumorskih ćelija. Istog dana, miševi su tretirani intraperitonealnom (IP) dozom ili Ab 1 (0,4 ili 0,04 mg/kg) ili nevezujućim kontrolnim mAb kontrolnim Ab 5, ili kontrolnim vehikulumom, nakon čega su usledile doze dva puta nedeljno tokom studije.
[00145] U poređenju sa kontrolnim grupama sa vehikulumom i nevezujućim kontrolnim grupama, Ab 1 je značajno potisnuo rast Raji tumora primenjenog u dozama od 0,04 mg/kg (p<0,0001) ili 0,4 mg/kg (p<0,0001) na 34. dan implantacije tumora (slika 7). Štaviše, efekti tretmana Ab 1 bili su zavisni od doze, sa 0,4 mg/kg Ab 1 koji je potpuno potisnuo rast tokom studije, u poređenju sa 0,04 mg/kg Ab 1, koji je potpuno potisnuo rast tumora do 30. dana. Ni Ab 1 ni nevezujući kontrolni mAb nisu imali značajan uticaj na telesnu težinu miša tokom studije (Slika 8).
ZAKLJUČAK
[00146] Uticaj tretmana sa Abi, CD20xCD3 bsAb, na rast Raji tumora je ispitivan na modelu miša. Ab 1 je bio efikasan u supresiji rasta tumora kod SIRPα BRG miševa sa usađenim hCD34+ sa humanim T, B i NK ćelijama, kao i granulocitima, monocitima i DC. Tretman dvaput nedeljno sa Ab 1 je rezultirao značajnom i dozno-zavisnom supresijom rasta Raji tumora limfoma humanih B ćelija u poređenju sa kontrolnim vehikulumom i nevezujućom kontrolom. Nijedan značajan gubitak težine nije primećen ni u jednoj grupi za tretiranje. Ovi rezultati pokazuju da Ab 1 cilja na Raji tumore kod miševa sa humanim imunim ćelijama, što rezultira značajnom supresijom rasta tumora.
Ekvivalenti
[00147] Opisavši tako nekoliko aspekata najmanje jedne realizacije ovog pronalaska, stručnjaci u tehnici će ceniti da će stručnjaci u ovoj oblasti lako doći do različitih promena, modifikacija i pobolјšanja. Takve izmene, modifikacije i pobolјšanja treba da budu deo ovog pronalaska. Shodno tome, prethodni opis i crtež su dati samo kao primer.
[00148] Upotreba rednih izraza kao što su „prvi“, „drugi“, „treći“, itd. u zahtevima za modifikovanje elementa zahteva sama po sebi ne označava nikakav prioritet, presedan ili redosled jednog elementa zahteva nad drugim ili vremenski redosled kojim se izvode postupci neke metode, ali se koriste samo kao oznake za razlikovanje jednog elementa zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa istog imena (ali za upotrebu rednog izraza) za razlikovanje elemenata zahteva.
[00149] Članovi „a“ i „an“ (u engleskom jeziku), kako su ovde upotreblјeni u specifikaciji i u zahtevima, ukoliko nije jasno naznačeno suprotno, trebalo bi razumeti da uklјučuju množinske reference. Tvrdnje ili opisi koji uklјučuju „ili“ između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovolјenim ako je jedan, više njih, ili su svi članovi grupe prisutni, uključeni ili su na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak, osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način evidentno iz konteksta. Pronalazak uklјučuje aspekte u kojima je tačno jedan član grupe prisutan, uključen ili je na neki drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak, takođe, uklјučuje aspekte u kojima je više od jednog ili su svi članovi grupe prisutni, uključeni ili su na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak. Dalјe, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd., iz jednog ili više navedenih zahteva, uvodi u drugi zahtev zavistan od istog osnovnog zahteva (ili, prema potrebi, bilo koji drugi zahtev), ukoliko nije drugačije naznačeno ili ukoliko stručnjaku u ovoj oblasti ne bi bilo očigledno da bi moglo doći do kontradikcije ili nedoslednosti. Tamo gde su elementi predstavlјeni kao liste (npr. u Markush grupi ili sličnom formatu), podrazumeva se da je obelodanjena i svaka podgrupa elemenata i bilo koji element(i) mogu biti uklonjeni iz grupe. Treba razumeti da se, generalno, tamo gde se pronalazak ili aspekti pronalaska odnose na određene elemente, karakteristike itd., određene realizacije pronalaska ili aspekti pronalaska sastoje se, ili se u osnovi sastoje od, takvih elemenata, karakteristika, itd. Radi jednostavnosti, ove realizacije nisu u svakom slučaju posebno navedene u toliko reči ovde. Takođe, treba razumeti da se bilo koja realizacija ili aspekt pronalaska može izričito izuzeti iz zahteva, bez obzira na to da li je određeno izuzeće navedeno u specifikaciji.
[00150] Stručnjaci u tehnici će ceniti uobičajene standarde odstupanja ili greške koji se pripisuju vrednostima dobijenim u testovima ili drugim ovde opisanim postupcima.
4
[00151] Publikacije, veb stranice i drugi referentni materijali koji se ovde navode opisuju stanje tehnike pronalaska i pružaju dodatne detalјe u vezi sa njegovom praksom.

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI:
1. Glodar čiji genom obuhvata
humanizovani SIRPα gen,
naznačen time što je humanizovani SIRPα gen operativno vezan za SIRPα promotor glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara i eksprimuje humanizovani SIRPα protein kod glodara, i
naznačen time što humanizovani SIRPα protein sadrži
(i) vanćelijski deo koji je najmanje 95% identičan amino -kiselinskim ostacima 28-362 humanog SIRPα proteina SEQ. ID 4, i
(ii) unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara.
2. Glodar prema zahtevu 1, naznačen time što vanćelijski deo humanizovanog SIRPα proteina sadrži ostatke amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina.
3. Glodar prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što humanizovani SIRPα protein sadrži sekvencu amino-kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5.
4. Glodar prema bilo kom od zahteva 1-3, naznačen time što glodar ne eksprimuje SIRPα protein glodara.
5. Glodar prema bilo kom od zahteva 1-4, naznačen time što je glodar pacov.
6. Izolovana ćelija ili tkivo glodara čiji genom sadrži
humanizovani SIRPα gen,
naznačena time što je humanizovani SIRPα gen operativno vezan za SIRPα promotor glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara i kodira humanizovani SIRPα protein, i naznačena time što humanizovani SIRPα protein sadrži
(i) vanćelijski deo koji je najmanje 95% identičan ostacima amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina SEQ. ID 4, i
(ii) unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara.
7. Izolovana ćelija ili tkivo glodara prema zahtevu 6, naznačena time što vanćelijski deo humanizovanog SIRPα proteina sadrži ostatke amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina.
8. Izolovana ćelija ili tkivo glodara prema bilo kom od zahteva 6-7, naznačena time što je izolovana ćelija ili tkivo glodara izolovana ćelija ili tkivo pacova.
9. Postupak stvaranja glodara, koji uključuje:
(a) umetanje sekvence humane SIRPα nukleinske kiseline u endogeni SIRPα lokus glodara u embrionalnoj matičnoj (ES) ćeliji glodara da bi se formirao humanizovani SIRPα gen, naznačen time što je humanizovani SIRPα gen operativno vezan za SIRPα promotor glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara i kodira humanizovani SIRPα protein, i naznačen time što humanizovani SIRPα protein sadrži
(i) vanćelijski deo koji je najmanje 95% identičan ostacima amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina SEQ. ID 4, i
(ii) unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara,
čime se dobija modifikovana ES ćelija glodara koja sadrži humanizovani SIRPα gen; i (b) pravljenje glodara korišćenjem modifikovane ES ćelije dobijene u (a).
10. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što vanćelijski deo humanizovanog SIRPα proteina sadrži ostatke amino-kiselina 28-362 humanog SIRPα proteina.
11. Postupak prema zahtevima 9 ili 10, naznačen time što je glodar pacov.
12. Postupak za procenu terapijske efikasnosti leka usmerenog na humane ćelije, koji obuhvata:
(a) obezbeđivanje glodara prema bilo kojemm od zahteva 1-5, u koga je transplantirana jedna ili više humanih ćelija;
(b) davanja kandidata za lek glodaru; i
(c) praćenje humanih ćelija kod glodara kako bi se utvrdila terapeutska efikasnost kandidata za lek.
13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što je glodar pacov.
14. Vektor za ciljanje nukleinske kiseline, koji sadrži:
fragment humane genomske DNK koji sadrži egzone 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena, okružen
5’ homolognim krakom koji sadrži fragment genomske DNK glodara uzvodno od egzona 2 SIRPα gena glodara, i
3’ homolognim krakom koji sadrži fragment genomske DNK glodara nizvodno od egzona 4 SIRPα gena glodara;
naznačen time što integracija fragmenta humane genomske DNK u genom ćelije glodara na osnovu homologne rekombinacije dovodi do zamene egzona 2, 3 i 4 SIRPα gena glodara na endogenom SIRPα lokusu glodara sa egzonima 2, 3 i 4 humanog SIRPα gena, da bi se formirao humanizovani SIRPα gen,
naznačen time što dati humanizovani SIRPα gen je operativno vezan za SIRPα promotor glodara na datom endogenom SIRPα lokusu glodara, i kodira humanizovani SIRPα protein koji sadrži vanćelijski deo humanog SIRPα proteina kodiranog datim humanim SIRPα genom i unutarćelijski deo SIRPα proteina glodara koji je kodiran od strane SIRPα gena glodara, i
naznačen time što je glodar izabran iz miša ili pacova.
1
15. Vektor za ciljanje nukleinske kiseline prema zahtevu 14, naznačen time što dati humanizovani SIRPα gen sadrži egsone 1, 5, 6, 7 i 8 datog SIRPα gena glodara.
2
RS20230816A 2013-09-23 2014-09-23 Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom RS64573B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361881261P 2013-09-23 2013-09-23
EP18192264.2A EP3434101B1 (en) 2013-09-23 2014-09-23 Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64573B1 true RS64573B1 (sr) 2023-10-31

Family

ID=51663510

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250788A RS67091B1 (sr) 2013-09-23 2014-09-23 Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom
RS20230816A RS64573B1 (sr) 2013-09-23 2014-09-23 Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom
RS20190162A RS58365B1 (sr) 2013-09-23 2014-09-23 Ne-humane životinje koje imaju humanizovan signal-regulatorni proteinski gen

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250788A RS67091B1 (sr) 2013-09-23 2014-09-23 Ne-humana životinja sa humanizovanim signalno-regulatornim proteinskim genom

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190162A RS58365B1 (sr) 2013-09-23 2014-09-23 Ne-humane životinje koje imaju humanizovan signal-regulatorni proteinski gen

Country Status (28)

Country Link
US (9) US9193977B2 (sr)
EP (5) EP4635977A3 (sr)
JP (4) JP6453893B2 (sr)
KR (2) KR102370419B1 (sr)
CN (2) CN108441497B (sr)
AU (3) AU2014321187B2 (sr)
CA (1) CA2925564C (sr)
CY (1) CY1121410T1 (sr)
DK (4) DK3434101T5 (sr)
ES (4) ES2624614T3 (sr)
FI (2) FI3434101T3 (sr)
HR (3) HRP20251062T1 (sr)
HU (3) HUE072332T2 (sr)
IL (4) IL297607B2 (sr)
LT (3) LT3175706T (sr)
MX (1) MX368931B (sr)
NZ (1) NZ717817A (sr)
PH (1) PH12016500342A1 (sr)
PL (3) PL3434101T3 (sr)
PT (4) PT3175706T (sr)
RS (3) RS67091B1 (sr)
RU (2) RU2018136614A (sr)
SG (3) SG10201902547SA (sr)
SI (3) SI3434101T1 (sr)
SM (3) SMT202500280T1 (sr)
TR (1) TR201901782T4 (sr)
WO (1) WO2015042557A1 (sr)
ZA (1) ZA201601138B (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4502152A3 (en) 2009-10-06 2025-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
SG10202008003VA (en) 2011-02-15 2020-10-29 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice
FI2892330T3 (fi) 2012-09-07 2023-03-25 Univ Yale Geneettisesti muokattuja hiiriä ja menetelmiä niiden käyttämiseksi
MX377561B (es) 2012-11-05 2025-03-10 Regeneron Pharma Animales no humanos genéticamente modificados y métodos de uso de los mismos.
TR201901782T4 (tr) * 2013-09-23 2019-03-21 Regeneron Pharma İnsanlaştirilmiş bi̇r si̇nyal düzenleyi̇ci̇ protei̇n geni̇ne sahi̇p olan i̇nsan dişi hayvanlar.
ES2613379T3 (es) 2013-10-15 2017-05-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animales con IL-15 humanizada
CA2929846C (en) 2013-11-19 2020-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
CN111690052B (zh) 2014-04-08 2024-06-04 瑞泽恩制药公司 具有人源化FC-γ受体的非人动物
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
MX2016014995A (es) 2014-05-19 2017-03-31 Regeneron Pharma Animales no humanos geneticamente modificados que expresan eritropoyetina de humano.
IL287519B2 (en) 2014-06-19 2024-01-01 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized programmed cell death 1 gene
RU2726446C2 (ru) 2014-11-24 2020-07-14 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3
HUE064960T2 (hu) 2014-12-05 2024-04-28 Regeneron Pharma Differenciációs 47 gén humanizált klasztert tartalmazó nem-humán állatok
CN113412818B (zh) 2014-12-09 2022-11-04 瑞泽恩制药公司 具有人源化分化簇274基因的非人动物
ES2950399T3 (es) * 2015-04-13 2023-10-09 Regeneron Pharma Ratones humanizados Sirpa-IL15 insertados y métodos de uso de los mismos
CN104904661B (zh) * 2015-06-05 2018-07-24 杭州正因生物技术有限公司 一种人源化小鼠
AU2016304794B2 (en) 2015-08-07 2021-07-15 ALX Oncology Inc. Constructs having a SIRP-alpha domain or variant thereof
WO2017087780A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
SG11201806176PA (en) 2016-02-04 2018-08-30 Regeneron Pharma Non-human animals having an engineered angptl8 gene
DK3422845T3 (da) 2016-02-29 2021-08-30 Regeneron Pharma Gnavere med et humaniseret tmprss-gen
CN108467873B (zh) 2017-03-17 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
CN108588126B (zh) 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
WO2018177441A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
CN109136261B (zh) 2017-06-19 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化cd28基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018233608A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-27 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd28
KR20200033259A (ko) 2017-07-31 2020-03-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 생체내에서 CRISPR/Cas-매개된 파괴 또는 삭제 및 외인성 도너 핵산과의 CRISPR/Cas-유도된 재조합을 평가하기 위한 방법 및 조성물
CN110891420B (zh) 2017-07-31 2022-06-03 瑞泽恩制药公司 Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用
US20190098879A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
EP3592140A1 (en) 2018-03-19 2020-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
IL314733A (en) 2018-03-26 2024-10-01 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
SG11202012338QA (en) 2018-07-10 2021-01-28 Univ Kobe Nat Univ Corp ANTI-SIRPa ANTIBODY
HRP20240999T1 (hr) 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
WO2020160285A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University SIRPα EXPRESSION ON T CELLS IS A BIOMARKER FOR FUNCTIONAL T CELLS DURING EXHAUSTION
KR102661779B1 (ko) 2019-04-04 2024-04-30 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 응고 인자 12 좌위를 포함하는 비-인간 동물
CN114126648A (zh) 2019-05-31 2022-03-01 Alx肿瘤生物技术公司 用SIRPα Fc融合体组合免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
CN121243368A (zh) 2019-11-27 2026-01-02 Alx肿瘤生物技术公司 用于治疗癌症的组合疗法
US20230058049A1 (en) * 2019-12-31 2023-02-23 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED IMMUNODEFICIENT NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPa/CD47
WO2021154791A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
JP7765403B2 (ja) 2020-04-21 2025-11-06 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃｘｃｌ１３遺伝子を有する非ヒト動物
JP2024500153A (ja) * 2020-12-21 2024-01-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｓｌｐ遺伝子、ヒト化ｔｓｌｐ受容体遺伝子、及び／又はヒト化ｉｌ７ｒａ遺伝子を有する非ヒト動物
JP2024520902A (ja) 2021-05-13 2024-05-27 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド がんを治療するための併用療法
KR20240117571A (ko) 2021-12-08 2024-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도
WO2023143341A1 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric nkp46
IL318159A (en) 2022-07-19 2025-03-01 Regeneron Pharma Genetically modified animal model and its use to model the human immune system
EP4593590A1 (en) 2022-09-29 2025-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
KR20260025082A (ko) 2023-06-16 2026-02-23 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 벡터, 유전자 변형 세포, 및 그것을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물
US20250255282A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same
WO2025212991A1 (en) 2024-04-05 2025-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent models of disease
WO2025250495A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Acceleration of human hepatocyte engraftment in humanized liver animals by supplementing paracrine ligands or agonists that activate human liver regeneration signals

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149635A (en) * 1986-09-12 1992-09-22 Abbott Biotech, Inc. Messenger RNA stabilization in animal cells
CZ294615B6 (cs) * 1997-09-12 2005-02-16 Apotech R & D Sa Léčivo obsahující protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRIL pro léčení rakoviny
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2587344T3 (es) * 2003-12-24 2016-10-24 Novo Nordisk A/S Ratón transgénico que comprende un polinucleótido que codifica C5aR humano o humanizado
ES2463476T3 (es) 2004-10-19 2014-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética
EP1907566A4 (en) * 2005-05-27 2008-12-10 Memory Pharm Corp VECTORS FOR TRANSGENIC MORBUS ALZHEIMER MOUSE MODEL AND USES THEREOF
US20070028316A1 (en) * 2005-06-02 2007-02-01 Xiaoxia Li Transgenic non-human Act1-deficient mammals and uses thereof
EP2573112A1 (en) * 2007-10-11 2013-03-27 The Hospital For Sick Children Modulation of sirpa - cd47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
TWI476280B (zh) 2008-03-07 2015-03-11 Regeneron Pharma 來自二倍體宿主胚胎注射之ｅｓ－細胞衍生的老鼠
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
EP4502152A3 (en) 2009-10-06 2025-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
EP2618656B1 (en) * 2010-09-20 2018-06-20 Yale University, Inc. HUMAN SIRPalpha TRANSGENIC ANIMALS AND THEIR METHODS OF USE
ES2680636T3 (es) * 2011-02-14 2018-09-10 Revivicor Inc. Cerdos genéticamente modificados para xenotrasplante de xenoinjertos vascularizados y derivados de los mismos
SG10202008003VA (en) * 2011-02-15 2020-10-29 Regeneron Pharma Humanized m-csf mice
SMT202200205T1 (it) 2011-10-28 2022-07-21 Regeneron Pharma Topi geneticamente modificati che esprimono molecole chimeriche del complesso maggiore di istocompatibilità (mhc) ii
CN108866101A (zh) * 2011-10-28 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 人源化il-6和il-6受体
SMT201900478T1 (it) 2011-10-28 2019-09-09 Regeneron Pharma Topi con complesso maggiore di istocompatibilita' geneticamente modificati
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
FI2892330T3 (fi) 2012-09-07 2023-03-25 Univ Yale Geneettisesti muokattuja hiiriä ja menetelmiä niiden käyttämiseksi
MX377561B (es) 2012-11-05 2025-03-10 Regeneron Pharma Animales no humanos genéticamente modificados y métodos de uso de los mismos.
CN111484999B (zh) 2013-02-20 2024-10-25 瑞泽恩制药公司 人源化的t细胞共受体的小鼠
EP3699190B9 (en) 2013-02-22 2023-10-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Murine cell expressing humanized major histocompatibility complex
TR201901782T4 (tr) * 2013-09-23 2019-03-21 Regeneron Pharma İnsanlaştirilmiş bi̇r si̇nyal düzenleyi̇ci̇ protei̇n geni̇ne sahi̇p olan i̇nsan dişi hayvanlar.
CA2984413A1 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 Institute Of Immunology Co., Ltd. Transgenic non-human animal expressing human specific molecule and human fc.gamma. receptor family

Also Published As

Publication number Publication date
DK2922394T3 (en) 2017-05-15
JP6453893B2 (ja) 2019-01-16
PT4269430T (pt) 2025-08-06
ZA201601138B (en) 2020-06-24
US9193977B2 (en) 2015-11-24
US20160374321A1 (en) 2016-12-29
JP2020114209A (ja) 2020-07-30
US9127292B2 (en) 2015-09-08
WO2015042557A4 (en) 2015-06-18
RU2016110462A3 (sr) 2018-03-30
DK3434101T5 (da) 2024-09-16
IL244187A0 (en) 2016-04-21
US20160050896A1 (en) 2016-02-25
EP4635977A3 (en) 2026-01-21
EP2922394A1 (en) 2015-09-30
IL244187B (en) 2018-11-29
US20150089678A1 (en) 2015-03-26
JP7149370B2 (ja) 2022-10-06
US9462794B2 (en) 2016-10-11
CN108441497B (zh) 2021-10-29
TR201901782T4 (tr) 2019-03-21
US20150089679A1 (en) 2015-03-26
CN105592695B (zh) 2018-04-10
RU2018136614A (ru) 2018-11-27
AU2024216527A1 (en) 2024-09-19
AU2020286187A1 (en) 2021-01-07
EP3434101A1 (en) 2019-01-30
FI4269430T3 (fi) 2025-08-08
DK3434101T3 (da) 2023-10-02
HRP20190227T1 (hr) 2019-06-14
JP2021104064A (ja) 2021-07-26
IL297607B1 (en) 2023-09-01
RS67091B1 (sr) 2025-09-30
EP4635977A2 (en) 2025-10-22
SI4269430T1 (sl) 2025-09-30
CA2925564A1 (en) 2015-03-26
KR20160056900A (ko) 2016-05-20
US12161097B2 (en) 2024-12-10
US20180139941A1 (en) 2018-05-24
EP3175706B1 (en) 2018-11-07
ES2959333T3 (es) 2024-02-23
ES2624614T3 (es) 2017-07-17
EP3434101B1 (en) 2023-08-16
ES3037239T3 (en) 2025-09-30
EP4269430A2 (en) 2023-11-01
PL3434101T3 (pl) 2024-02-19
SMT201900067T1 (it) 2019-02-28
US10206379B2 (en) 2019-02-19
LT3434101T (lt) 2023-09-25
SMT202500280T1 (it) 2025-09-12
SG10201801326PA (en) 2018-03-28
IL278679B2 (en) 2023-04-01
HUE042412T2 (hu) 2019-06-28
CY1121410T1 (el) 2020-05-29
MX2016003636A (es) 2016-07-21
SG11201601184UA (en) 2016-03-30
CN108441497A (zh) 2018-08-24
US20200187468A1 (en) 2020-06-18
CA2925564C (en) 2023-03-21
HRP20251062T1 (hr) 2025-11-07
PL4269430T3 (pl) 2025-10-13
IL297607B2 (en) 2024-01-01
SI3434101T1 (sl) 2023-11-30
AU2020286187B2 (en) 2024-06-13
IL297607A (en) 2022-12-01
ES2710282T3 (es) 2019-04-24
US20170265442A1 (en) 2017-09-21
EP3175706A1 (en) 2017-06-07
JP2019047818A (ja) 2019-03-28
HRP20231121T1 (hr) 2023-12-22
US20190124895A1 (en) 2019-05-02
FI3434101T3 (fi) 2023-10-02
JP6875573B2 (ja) 2021-05-26
EP4269430B1 (en) 2025-06-18
HUE072332T2 (hu) 2025-11-28
PT2922394T (pt) 2017-05-22
DK4269430T3 (da) 2025-08-18
KR102407354B1 (ko) 2022-06-10
NZ717817A (en) 2022-07-01
IL278679A (en) 2022-12-01
HK1209275A1 (en) 2016-04-01
WO2015042557A1 (en) 2015-03-26
US20210251201A1 (en) 2021-08-19
PL3175706T3 (pl) 2019-05-31
US11019810B2 (en) 2021-06-01
SI3175706T1 (sl) 2019-03-29
SMT202300287T1 (it) 2023-11-13
EP2922394B1 (en) 2017-02-22
US9700027B2 (en) 2017-07-11
AU2014321187B2 (en) 2020-09-17
LT3175706T (lt) 2019-02-25
KR20220032125A (ko) 2022-03-15
CN105592695A (zh) 2016-05-18
JP6665269B2 (ja) 2020-03-13
RU2016110462A (ru) 2017-10-30
PH12016500342A1 (en) 2016-05-02
US10426146B2 (en) 2019-10-01
IL262958A (en) 2018-12-31
RU2671166C2 (ru) 2018-10-29
US9901083B2 (en) 2018-02-27
JP2016537015A (ja) 2016-12-01
SG10201902547SA (en) 2019-04-29
LT4269430T (lt) 2025-08-25
PT3434101T (pt) 2023-09-19
HUE063376T2 (hu) 2024-01-28
DK3175706T3 (en) 2019-03-04
PT3175706T (pt) 2019-02-11
MX368931B (es) 2019-10-22
RS58365B1 (sr) 2019-03-29
KR102370419B1 (ko) 2022-03-04
EP4269430A3 (en) 2024-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12161097B2 (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
AU2014321187A1 (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK40093188A (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK40093188B (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK40126416A (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK1259923B (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK1234601A1 (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK1234601A (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK1259923A1 (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK1234601B (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
HK1209275B (en) Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene