RS64585B1 - Regulacija ekspresije gena putem aptamerima posredovane kontrole samodegradujućih ribozima - Google Patents

Regulacija ekspresije gena putem aptamerima posredovane kontrole samodegradujućih ribozima

Info

Publication number
RS64585B1
RS64585B1 RS20230822A RSP20230822A RS64585B1 RS 64585 B1 RS64585 B1 RS 64585B1 RS 20230822 A RS20230822 A RS 20230822A RS P20230822 A RSP20230822 A RS P20230822A RS 64585 B1 RS64585 B1 RS 64585B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
aptamer
target gene
ribozyme
twister
stem
Prior art date
Application number
RS20230822A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael J Volles
Olivier F Danos
Alex R Boyne
Veronique Zennou
Xuecui Guo
Original Assignee
Meiragtx Uk Ii Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiragtx Uk Ii Ltd filed Critical Meiragtx Uk Ii Ltd
Publication of RS64585B1 publication Critical patent/RS64585B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/52—Vector systems having a special element relevant for transcription encoding ribozyme for self-inactivation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Pronalazak obezbeđuje polinukleotidne konstrukte za regulaciju ekspresije gena modulacijom na bazi aptamera, samodegradujućih ribozima i postupke za upotrebu konstrukata za regulisanje ekspresije gena kao odgovor na prisustvo ili odsustvo liganda koji vezuje aptamer.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Mali endonukleolitički ribozimi sadrže RNK motive dužine od oko 50-150 nukleotida ("nt") koji imaju intrinzičku aktivnost degradacije RNK. Postoji nekoliko klasa malih endonukleolitičkih ribozima koji uključuju glavu čekića i ukosnicu. Nedavno su identifikovani novi samodegradujući ribozimi, uključujući tvister, tvister sister, pistol i hečet.
[0003] Felletti et al: ("Screening of Genetic Switches Based on the Twister Ribozyme Motif", Nucleic Add Aptamers: Selection, Characterization, and Application, Methods in Molecular Biology, in: Methods Mol Biol. 2016; 1380:225-39) prikazuje postupak za razvoj novih ligand-zavisnih riboprekidača koji sadrže tvister motiv, i u kome se katalitički motiv koristi kao platforma za ekspresiju u konjugaciji sa prirodnim ili in vitro selektovanim aptamernim domenima.
[0004] U.S. 2015/0056174 obezbeđuje modifikovane ribozime sa glavom čekića sa poboljšanom endonukleolitičkom aktivnošću (videti, e.g , sl.5A-F)
[0005] Berens et al. ("Riboswitch engineering - making the all-important second and third steps", Curr Opin Biotechnol 2015 Feb;31:10-5) odnosi se na izvesne detalje u vezi sa selekcijom i adekvatnošću aptamera.
[0006] Predmetni pronalazak koristi ribozime povezane sa aptamerima u cilju kreiranja polinukleotidnih kaseta za regulaciju ekspresije ciljnog gena kao odgovor na prisustvo ili odsustvo liganda koji vezuje aptamer.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0007] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotidnu kasetu za regulaciju ekspresije ciljnog gena koji sadrži riboprekidač koji sadrži tvister ribozim povezan drškom aptamera, gde se drška koja povezuje tvister ribozim sa aptamerom pričvršćuje za ribozim na lokaciji P3 drške tvister ribozima i gde je ciljni gen povezan sa P1 drškom tvister ribozima, pri čemu polinukleotidna kaseta, kada je ugrađena u ciljni gen, inhibira ekspresiju ciljnog gena u prisustvu liganda aptamera. U tom kontekstu, riboprekidač je "riboprekidač za isključivanje" jer vezivanje aptamera/liganda povećava ribonukleaznu funkciju tvister ribozima koja vodi do degradacije RNK ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu i time smanjuje ekspresiju ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, aptamer se vezuje za malomolekulski ligand.
[0008] U jednom primeru izvođenja, tvister ribozim je iz Nasonia vitripennis.U jednom primeru izvođenja, tvister ribozim sadrži sekvencu SEQ ID NO.:38. U jednom primeru izvođenja, tvister ribozim sadrži sekvencu SEQ ID NO.:39.
[0009] U jednom primeru izvođenja, P1 drška sadrži sekvencu koja produžava P1 dršku tvister ribozima za 1 do 3 bazna para. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 3 do 9 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 4 do 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 6 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 8 baznih parova.
[0010] U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom sadrzi sekvencu iz P3 drške ribozima i/ili sekvencu iz P1 drške aptamera. U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom ne sadrži sekvencu iz P3 drške ribozima i/ili sekvencu iz P1 drške aptamera U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka od oko 3 do oko 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka 3 do 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka 4 bazna para. U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka 3 bazna para.
[0011] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za moduliranje ekspresije ciljnog gena koji obuhvata:
(a) inseriranje polinukleotidne kasete, koja sadrži ovde opisani riboprekidač za isključivanje, u ciljni gen,
(b) uvođenje u ćeliju ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu, i
(c) izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za smanjenje ekspresije ciljnog gena
pri čemu navedeni postupak nije postupak za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom.
[0012] Slično tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotidnu kasetu koja sadrži ovde opisani riboprekidač za isključivanje, za upotrebu u postupku terapije moduliranjem ekspresije ciljnog gena koji obuhvata:
(a) inseriranja navedene polinukleotidne kasete u ciljni gen,
(b) uvođenje u ćeliju ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu, i
(c) izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za smanjenje ekspresije ciljnog gena.
[0013] U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta se inserira u 5' netranslatirani region ciljnog gena, 3' netranslatirani region ciljnog gena, i/ili nizvodno od start kodona za translaciju ciljnog gena.
[0014] U jednom primeru izvođenja, kada se polinukleotidna kaseta inserira nizvodno (tj., 3') od start kodona za translaciju ciljnog gena, riboprekidač se nalazi pored startnog kodona. Kod ostalih primera izvođenja, riboprekidač se nalazi oko 1 do oko 100, oko 1 do oko 50, ili oko 1 do oko 20 nukleotida od start kodona ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta sadrži 2A peptidnu sekvencu između 3' kraja riboprekidača i kodirajuće sekvence ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta sadrži linkersku sekvencu koja se nalazi pored 2A peptidne sekvence.
[0015] U jednom primeru izvođenja, dve ili više polinukleotidnih kaseta je inserirano u ciljni gen. U jednom primeru izvođenja, dve ili više polinukleotidne kasete sadrže različite aptamere koji se specifično vezuju za različite ligande malih molekula. U jednom primeru izvođenja, dve ili više polinukleotidnih kaseta sadrži isti aptamer.
[0016] U jednom primeru izvođenja, ciljni gen koji sadrži polinukleotidnu kasetu je ugrađen u vektor za ekspresiju ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, vektor je virusni vektor. U jednom primeru izvođenja, virusni vektor bira se iz grupe koja se sastoji od adenovirusnog vektora, vektora virusa povezanog sa adenovirusom i lentivirusnog vektora.
[0017] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotidnu kasetu za regulaciju ekspresije ciljnog gena koja sadrži riboprekidač koji sadrži tvister ribozim povezan sa aptamerom, gde P1 drška tvister ribozima i P1 drška aptamera sadrže alternativni zajednički krak drške, gde je aptamer povezan sa 3' ili 5' krajem P1 drške tvister ribozima, pri čemu, kada je aptamer povezan sa 3' krajem P1 drške tvister ribozima, deo 3' kraka P1 drške tvister ribozima je alternativno 5' krak P1 drške aptamera, a kada je aptamer povezan sa 5' krajem P1 drške tvister ribozima, deo 5' kraka P1 drške tvister ribozima je alternativno 3' krak P1 drške aptamera (videti, npr. sl. 6a-6b)., pri čemu polinukleotidna kaseta, kada se ugradi u ciljni gen, povećava ekspresiju ciljnog gena u prisustvu liganda aptamera. U ovom kontekstu, riboprekidač je "riboprekidač za uključivanje" jer vezivanje aptamer/ligand inhibira ribonukleaznu funkciju tvister ribozima smanjujući degradaciju RNK ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu i na taj način povećava ekspresiju ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, aptamer se vezuje za malomolekulski ligand.
[0018] U jednom primeru izvođenja, tvister ribozim je iz Nasonia vitripennis.U jednom primeru izvođenja, tvister ribozim sadrži SEQ ID NO.:38. U jednom primeru izvođenja, tvister ribozim sadrži sekvencu SEQ ID NO.:39.
[0019] U jednom primeru izvođenja, deo kraka P1 drške tvister ribozima koji je alternativno krak P1 drške aptamera dugačak je 4 do 8 nukleotida, 5 do 7 nukleotida, 6 nukleotida ili 7 nukleotida. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima je dugačka 4 do 9 baznih parova, 5 do 8 baznih parova, 6 baznih parova ili 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška aptamera je 6 do 11 baznih parova, 7 do 10 baznih parova, 8 baznih parova ili 9 baznih parova.
[0020] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za moduliranje ekspresije ciljnog gena koji obuhvata:
(a) inseriranje u ciljni gen polinukleotidne kasete koja sadrži riboprekidač za uključivanje, (b) uvođenje u ćeliju ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu, i
(c) izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za povećanje ekspresije ciljnog gena,
pri čemu navedeni postupak nije postupak za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom.
[0021] Slično tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotidnu kasetu koja sadrži ovde opisani riboprekidač za uključivanje, za upotrebu u postupku terapije moduliranjem ekspresije ciljnog gena koji obuhvata:
(a) inseriranje navedene polinukleotidne kasete u ciljni gen,
(b) uvođenje ciljnog gena koji se sastoji od polinukleotidne kasete u ćeliju, i
(c) izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za povećanje ekspresije ciljnog gena,
[0022] U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta se inserira u 5' netranslatirani region ciljnog gena, 3' netranslatirani region ciljnog gena, i/ili nizvodno od start kodona za translaciju.
[0023] U jednom primeru izvođenja, kada se polinukleotidna kaseta inserira nizvodno (tj., 3') od start kodona za translaciju ciljnog gena, riboprekidač za uključivanje se nalazi pored startnog kodona. Kod drugih primera izvođenja, riboprekidač se nalazi oko 1 do oko 100, oko 1 do oko 50, ili oko 1 do oko 20 nukleotida od startnog kodona ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta sadrži 2A peptidnu sekvencu između 3' kraja riboprekidača i kodirajuće sekvence ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta sadrži linkersku sekvencu pored 2A peptidne sekvence.
[0024] U jednom primeru izvođenja, dve ili više polinukleotidnih kaseta je inserirano u ciljni gen. U jednom primeru izvođenja, dve ili više polinukleotidnih kaseta sadrže različite aptamere koji se specifično vezuju za različite malomolekulske ligande. U jednom primeru izvođenja, dve ili više polinukleotidnih kaseta sadrže isti aptamer.
[0025] U jednom primeru izvođenja, ciljni gen koji sadrži polinukleotidnu kasetu je inkorporiran u vektor za ekspresiju ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, vektor je virusni vektor. U jednom primeru izvođenja, virusni vektor je odabran iz grupe koja se sastoji od adenovirusnog vektora, vektora virusa povezanog sa adenovirusom i lentivirusnog vektora.
[0026] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži ciljni gen koji sadrži polinukleotidnu kasetu prema predmetnom pronalasku. U jednom primeru izvođenja, vektor je virusni vektor. U jednom primeru izvođenja, virusni vektor bira se iz grupe koja se sastoji od adenovirusnog vektora, vektora virusa povezanog sa adenovirusom i lentivirusnog vektora.
KRATAK OPIS SLIKA
[0027]
Sl. 1a-1b. Tvister ribozimi se samodegraduju i suprimiraju ekspresiju gena u sisarskim ćelijama.
Sl. 1a. Sekvenca tvister ribozima iz N. vitripennis (tvister ose) ili iz sredinskog uzorka (estvister) klonirana je u 3' netranslatirani region ("UTR") u pEGFP-C1 vektoru. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima i izmeren je intenzitet fluorescencije GFP proteina. Tvister ose je doveo do smanjenja GFP ekspresije od približno 97% ili 36 puta, u poređenju sa pEGFP-C1 kontrolom. Es-tvister kada je kloniran u 3' UTR GFP značajno je smanjio ekspresiju ciljnog gena u HEK 293 ćelijama, ali ne u istoj meri kao tvister ose.
Sl. 1b. Mutantna tvister sekvenca je generisana mutiranjem A6 u G, kao što je naznačeno sekundarnom strukturom tvistera ose unutar grafikona. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima i izmeren je intenzitet fluorescencije GFP proteina. Tvister ose je ponovo smanjio ekspresiju GFP kada je kloniran u 3' UTR. Mutantni tvister ose, međutim, nije izazvao smanjenje GFP ekspresije.
Sl. 2a-2b. Modifikacija sekvence P1 drške poboljšava aktivnost degradacije tvister ribozima. Sl. 2a. Sekvenca produžetka od 3 bazna para (3HP) P1 drške tvistera ose.
Sl. 2b. Delecija SacII mesta iz početnog konstrukta GFP_wasp-twister i dodavanje drške od 3 bp u P1 dršku tvistera poboljšava degradaciju tvister ribozimom, što dovodi do daljeg smanjenja GFP ekspresije.
Sl. 2c. Prikazan je rezultat testa sa luciferazom. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima koji sadrže gen za luciferazu svica i tvister sa ili bez 3HP u 3' UTR.
Sl. 3a-3e. Generisanje tvister ribozima responsivnog na guanin.
Sl. 3a. Šematski prikaz povezivanja aptamerske sekvence sa tvister ribozimom i objašnjenje tvister ribozima responsivnog na ligand aptamera. Aptamer sekvenca je prikazana debljom linijom. U odsustvu liganda aptamera, aptamer bez liganda remeti degradaciju tvister ribozima, što dovodi do intaktne iRNK i posledične genske ekspresije. U prisustvu liganda aptamera, aptamer vezan sa ligandom olakšava formiranje P3 drške, čime se obnavlja aktivnost degradacije tvister ribozima, što dovodi do inhibicije genske ekspresije.
Sl. 3b. Rezultati testa sa luciferazom svica. Dvadeset konstrukata je napravljeno povezivanjem P1 drške guaninskog aptamera sa P3 drškom tvister ribozima, kao što je prikazano na sl. 3a, na donjem panelu. Dodatni 3HP je uračunat kao deo P1 drške tvistera. Drška koja povezuje petlju 2 i aptamer je sekvencijalno skraćena, denerišući različitu dužinu drška kao što je naznačeno u okruglim zagradama. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima, tretirane sa ili bez guanina. Stepen smanjenja za konstrukt LuciwaspGua16 je naznačen u grafikonu.
Sl. 3c. Validacija konstrukata sa luciferazom koji sadrže waspGua16 ili mutantni waspGua16. waspGua16 divljeg tipa je smanjio aktivnost luciferaze pri tretmanu sa 500 μM guanina, dok mutantni waspGua16 nije.
Prikazana sl. 3d. predstavlja rezultate testa sa luciferazom. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima, i tretirane sa ili bez 500 μM guanina ili sa 1mM guanozina.
[0040] Sl. 3e. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima, tretirane sa 500 μM guanozina. DMSO je korišćen kao kontrola za rastvarač. Supernatant je sakupljen 18 sati nakon tretmana guanozinom, Epo je izmeren pomoću ELISA kompleta. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ±SD (n=2). Prikazani su primeri dva nezavisna eksperimenta.
Sl. 4a-4b. Generisanje teofilin responsivnih tvister riboprekidačeva.
Sl. 4a. Šematski prikaz povezivanja teofilinskog aptamera sa sekvencom petlje 2 u tvister ribozimu. Prikazane su sekvence i dužina drške koja povezuje teofilinski aptamer i tvister petlju 2. Aptamer i ligand su označeni kao
Sl. 4b. Prikazani su rezultati testa sa luciferazom. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima, tretirane sa i bez 2 mM teofilina 4 sata nakon transfekcije.
Sl. 5a-5b. Prenosivost tvister riboprekidača u ćelijama sisara.
Sl. 5a. Šematski prikaz konstrukta sa tvisterGua16 riboprekidač i sekvencom linkera i 2A peptida (linker2A) inseriranim nizvodno od ATG i uzvodno od ostatka kodirajuće sekvence luciferaze (gornji panel), ili twisterGua16 i linker2A sekvence inserirane nizvodno od kodirajuće sekvence za prvih 10 aminokiselina u GFP (donji panel).
Sl. 5b. Prikazan je rezultat za test sa luciferazom. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima. Transfektovane ćelije su tretirane sa ili bez guanina 4 sata nakon transfekcije. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD (n=3).
Sl. 6a-6b. Generisanje tvister riboprekidača ZA UKLJUČIVANJE responsivnog na ligand aptamera.
Sl. 6a. Prikazuje šemu tvister guaninskog riboprekidača ZA UKLJUČIVANJE (gde je aptamer povezan sa 3' krajem tvister P1). Konfiguracija tvistera ose i aptamerske sekvence prikazana je kao primer, u kome je 3' kraj P1 drške (uključujući dršku od 3 bp) bio povezan sa aptamerskom sekvencom. U ovoj konfiguraciji, sekvenca drške je zajednička za P1 dršku tvistera i P1 dršku aptamera. Zajednička sekvenca drške je označena debljom linija. Pretpostavlja se da u odsustvu liganda aptamera (gornji panel), aptamer sekvenca povezana sa P1 drškom tvistera ne remeti strukturu tvistera i njenu aktivnost degradacije ribozima, zbog čega rezultira degradacijom iRNK i posledičnom inhibicijom genske ekspresije. U prisustvu liganda aptamera (donji panel), aptamer formira P1 dršku i čini zajedničku sekvencu drške (deblja linija) nedostupnom za formiranje P1 drške tvistera, čime remeti strukturu tvistera i njegovu ribozimsku aktivnost, što rezultira intaktnom iRNK i posledično genskom ekspresijom.
Sl. 6b. HEK 293 ćelije su transfektovane naznačenim konstruktima sa luciferazom. Transfektovane ćelije su tretirane sa ili bez 500 μM guanozina. DMSO je korišćen kao kontrola za rastvarač. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD (n=3). Veličina indukcije je označena u grafikonu za svaki konstrukt.
Slika 7a-7b. Ribozimska sekvenca glave čekića (7a) i ribozimska sekvenca ukosnice (7b) smeštene nizvodno od start kodona za translaciju. Gornji panel prikazuje nukleotidnu sekvencu, a donji panel prikazuje translatirane peptidne sekvence koje koriste različite okvire čitanje. Gornja linija u svakom slučaju je roditeljski ribozim, ne potpuno translatiran; tačke u nukleotidnoj sekvenci se koriste sa značenjem "isto kao gornja linija". 2A peptidna sekvenca iz virusa Thoseaasigna (T2A) označena je kao 2A. Mutacije su napravljene u cilju eliminacije potencijalnih stop kodona u sekvencama ribozima.
Slika 7c. Rezultati beta-galaktozidazne aktivnosti generisane iz HEK 293 ćelije transfektovane naznačenim konstruktima. Leva polovina grafikona prikazuje rezultate konstrukata sa ribozimskom sekvencom glave čekića, a desna polovina ukazuje na rezultate konstrukata sa ribozimskom sekvencom ukosnice. Mera smanjenja LacZ aktivnosti je izražena kao odnos vrednosti generisane od mutantnog konstrukta neaktivnog sa ribozimima i vrednosti generisane od mutantnog konstrukta aktivnog sa ribozimima Najviša mera je označena strelicom za svaki ribozim.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0028] Pronalazak obezbeđuje polinukleotidne konstrukte za regulaciju ekspresije gena modulacijom, na bazi aptamera, malih endonukleolitičkih ribozima i postupke za upotrebu konstrukata za regulisanje ekspresije gena kao odgovor na prisustvo ili odsustvo liganda koji se vezuje za aptamer. Polinukleotidni konstrukt sadrži najmanje jedan riboprekidač koji sadrži ribozim i aptamer. Način na koji je ribozim prikačen za aptamer obezbeđuje riboprekidače koji aktiviraju samodegradaciju ribozima u prisustvu liganda aptamera (riboprekidači za isključivanje) ili riboprekidače koji inhibiraju samodegraciju ribozima u prisustvu aptamera (riboprekidači za uključivanje).
[0029] Polinukleotidna kaseta za gensku regulaciju odnosi se na rekombinantni DNK konstrukt koji, kada se ugradi u DNK ciljnog gena, obezbeđuje mogućnost regulisanja ekspresije ciljnog gena putem aptamer/ligand posredovane regulacije samodegradacije ribozima. Kao što se ovde koristi, polinukleotidna kaseta ili konstrukt je nukleinska kiselina (npr. DNK ili RNK) koja se sastoji od elemenata izvedenih iz različitih izvora (npr. različitih organizama, različitih gena od istog organizma i slično). Polinukleotidna kaseta sadrži riboprekidač. Riboprekidač u kontekstu predmetnog pronalaska sadrži senzorski region (npr. aptamer) i ribozim koji su zajedno odgovorni za prepoznavanje prisustva liganda koji se vezuje za senzorski region i menja konformaciju mesta vezivanja ribozima. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima i P1 drška aptamera sarže alternativni zajednički krak drške. Ekspresija ciljnog gena se povećava kada je ligand aptamera prisutan i smanjuje se kada je ligand odsutan. U drugom primeru izvođenja, ekspresija ciljnog gena se smanjuje kada je ligand aptamera prisutan i povećava kada je ligand odsutan.
Ribozimi
[0030] Ribozim koji se koristi u predmetnom pronalasku je bilo koji mali endonukleolitički ribozim koji će se samo-degradovati u ciljnom tipu ćelija, tj., tvister ribozim. Videti, npr. Roth et al., Nat Chem Biol. 10(1):56-60; i Weinberg et al., Nat Chem Biol. 2015 Aug;11(8):606-10. U.S. 2015/0056174 obezbeđuje modifikovane ribozime glave čekića sa poboljšanom endonukleolitičkom aktivnošću (videti, npr., sl. 5A-F). U jednom primeru izvođenja, ribozim je tvister ribozim je iz Nasonia vitripenni
[0031] (SEQ. ID NO.:38). U jednom primeru izvođenja, ribozim sadrži SEQ. ID NO.:39, koja odgovara tvister ribozimu identifikovanom iz prirodnog uzorka.
1
Riboprekidač
[0032] Termin "riboprekidač" koji se ovde koristi odnosi se na regulatorni segment polinukleotida RNK. Riboprekidač u kontekstu predmetnog pronalaska sadrži senzorski region (npr. aptamer) i samodegradujuću ribonukleazu koji su zajedno odgovorni za prepoznavanje prisustva liganda (npr. mali molekul) i modulaciju konformacije samodegradujuće ribonukleaze i time njene aktivnosti. U jednom primeru izvođenja, riboprekidač je rekombinantan, i koristi polinukleotide iz dva ili više izvora. Termin "sintetički", kako se ovde koristi u kontekstu riboprekidača, odnosi se na riboprekidač koji se prirodno ne javlja. Senzor (npr. aptamer) i regioni ribonukleaze povezani su polinukleotidnim linkerom. Polinukleotidni linker formira RNK dršku (npr. region RNK polinukleotida koji je dvolančan).
Riboprekidači za isključivanje
[0033] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotidnu kasetu za regulaciju ekspresije ciljnog gena koji sadrži riboprekidač koji sadrži tvister ribozim povezan sa aptamerom pomoću drške, gde se drška koja povezuje tvister ribozim sa aptamerom pričvršćuje za ribozim na lokaciji P3 drške tvister ribozima i gde je ciljni gen povezan sa P1 drškom tvister ribozima (videti, npr., sl. 3a), pri čemu polinukleotidna kaseta, kada je ugrađena u ciljni gen, inhibira ekspresiju ciljnog gena u prisustvu liganda aptamera. U ovom kontekstu, riboprekidač je "riboprekidač za isključivanje" jer vezivanje aptamer/ligand povećava ribonukleaznu funkciju tvister ribozima koja dovodi do degradacije RNK ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu i time smanjuje ekspresiju ciljnog gena.
[0034] U ovoj konfiguraciji, gde su oba kraka drške aptamera povezana sa oba kraka P3 drške ribozima, ova drška može da sadrži dodatnu sekvencu koja može da formira dršku kada se aptamer veže za svoj ligand. Ova dodatna sekvenca drške može da sadrži sekvencu iz drške aptamera P1 i/ili dodatnu sekvencu koja se dodaje da bi se olakšalo formiranje drške kada je aptamer vezan njegovim ligandom. P3 drška može da sadrži jednu, dve, tri ili više promena u odnosu na P3 sekvencu divljeg tipa za ribozim. U nekim primerima izvođenja, drška koja povezuje aptamer sa ribozimom ne sadrži sekvencu ni iz P3 drške tvistera ni iz drške aptamera. Pored toga, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom (uključujući dršku P3) može da sadrži jedan ili više pogrešnih parova gde nukleotid nije komplementaran sa svojim parom na drugom kraku drške.
[0035] Drška koja povezuje aptamer sa ribozimom treba da bude dovoljne dužine (i GC sadržaja) da formira dršku po vezivanju liganda i time promoviše endonukleaznu aktivnost ribozima, dok takođe, kada ligand nije prisutan u dovoljnim količinama, uzima konformaciju koja inhibira endonukleaznu aktivnost ribozima.Dužina i sekvenca drške se mogu modifikovati pomoću poznatih tehnika kako bi se identifikovale drške koje omogućavaju prihvatljiv osnovni nivo ekspresije ciljnog gena kada je ligand prisutan i prihvatljive nivoe ekspresije ciljnog gena kada ligand nije prisutan. Ako je drška, na primer, predugačka, ona može da obezbedi aktivnu konformaciju ribozima u prisustvu ili odsustvu liganda. Ako je drška prekratka, možda neće obezbediti aktivni ribozim čak ni u prisustvu liganda. U nekim primerima izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka oko 3 do oko 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka 3 do 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka 4 bazna para. U jednom primeru izvođenja, drška koja povezuje ribozim sa aptamerom je dugačka 3 bazna para.
[0036] Treba razumeti da drška koja povezuje aptamer i ribozim nije uvek u dvolančanoj konfiguraciji drške. Kao što je prikazano na sl. 3a, kada aptamer nije vezan za ligand, struktura drške je poremećena, čime inhibira endonukleolitičku aktivnost ribozima. Kada se aptamer veže za svoj ligand drška se stabilizuje, čime se pospešuje endonukleolitička aktivnost ribozima.
[0037] U ovoj konfiguraciji riboprekidača za isključivanje, P1 drška ribozim je povezana sa nukleotidnom sekvencom ciljnog gena (videti, npr. sl. 3a). Ova P1 drška ribozima može da sadrži sve ili neke od P1 sekvenci ribozima koji se prirodno javljaju. Ova P1 drška može da sadrži dodatnu sekvencu drške iz drugog izvora. P1 drška može da sadrži jednu, dve, tri ili više promena u odnosu na P1 sekvencu divljeg tipa za ribozim. U nekim primerima izvođenja, P1 drška ribozima ne sadrži nikakakvu sekvencu iz sekvence P1 divljeg tipa za ribozim. Drška se i dalje označava kao P1 drška ribozima usled svoje lokacije. Dužina i sekvenca P1 drške mogu se modifikovati pomoću poznatih tehnika u cilju identifikacije drški koje omogućavaju, npr., prihvatljiv osnovni nivo ekspresije ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozim ima 3 do 9 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 4 do 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima ima 8 baznih parova.
[0038] Polinukleotidna kaseta koja se sastoji od riboprekidača može da bude postavljena na jednoj ili više lokacija u ciljnom genu, uključujući, ali ne ograničavajući se na 5' i 3' UTR i nizvodno od start kodona.
Riboprekidač za uključivanje
[0039] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotidnu kasetu za regulaciju ekspresije ciljnog gena koja sadrži riboprekidač koji sadrži tvister ribozim povezan sa aptamerom, gde P1 drška tvister ribozima i P1 drška aptamera sadrže alternativni zajednički krak drške, gde je aptamer povezan sa 3' ili 5' krajem P1 drške tvister ribozima, pri čemu, kada je aptamer povezan sa 3' krajem P1 drške tvister ribozima, deo 3' kraka P1 drške tvister ribozima je alternativno 5' krak P1 drške aptamera, a kada je aptamer povezan sa 5' krajem P1 drške tvister ribozima, deo 5' kraka P1 drške tvister ribozima je alternativno 3' krak P1 drške aptamera (videti, npr. sl. 6a-6b), pri čemu polinukleotidna kaseta, kada se ugradi u ciljni gen, povećava ekspresiju ciljnog gena u prisustvu liganda aptamera. U ovom kontekstu, riboprekidač je "riboprekidač za uključivanje" jer vezivanje aptamer/ligand inhibira ribonukleaznu funkciju tvister ribozima smanjujući degradaciju RNK ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu i na taj način povećava ekspresiju ciljnog gena u prisustvu liganda.
[0040] Kao i kod aptamera i drški ribozima koje su razmatrane u vezi sa riboprekidačem za isključivanje, P1 drška ribozima i P1 drška aptamera mogu da sadrže, ili da ne sadrže, sekvencu divljeg tipa. U tom smislu, imena drški se zasnivaju na njihovoj lokaciji na ribozimu ili aptameru i ne podrazumevaju da drške sadrže bilo koju konkretnu sekvencu. P1 drška ribozima i P1 drška aptamera, pored zajedničke sekvence drške, mogu i svaka za sebe nezavisno da sadrže sekvencu drške. Ova dodatna sekvenca drške može da uključuje sekvencu iz odgovarajuće P1 drške ribozima ili P1 drške aptamera i/ili dodatnu sekvencu koja se dodaje da bi se olakšalo formiranje drške. Pored toga, P1 drška ribozima i/ili P1 drška aptamera može da sadrži jedan ili više pogrešnih baznih parova gde nukleotid nije komplementaran sa svojim parom na drugom kraku drške.
1
[0041] P1 drška ribozima i P1 drška aptamera treba da budu dovoljne dužine (i GC sadržaja) tako da aptamer formira P1 dršku u prisustvu liganda aptamera i da ribozim formira P1 dršku kada ligand nije prisutan. Dužina i sekvenca drške mogu da se modifikuju pomoću poznatih tehnika kako bi se identifikovale drške koje omogućavaju prihvatljiv osnovni nivo ekspresije ciljnog gena kada ligand nije prisutan i prihvatljiv osnovni nivo ekspresije ciljnog gena kada je ligand prisutan. U jednom
[0042] primeru izvođenja, P1 drška tvister ribozima je dugačka 4 do 9 baznih parova, 5 do 8 baznih parova, 6 baznih parova ili 7 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, P1 drška aptamera je dugačka 6 do 11 baznih parova, 7 do 10 baznih parova, 8 baznih parova ili 9 baznih parova.
[0043] U ovoj konfiguraciji riboprekidača za uključivanje, aptamer se nalazi pored ribozima (bilo 5' ili 3'), dok i aptamer i ribozim sadrže alternativni zajednički krak drške. Kada je aptamer vezan za svoj ligand, to stabilizuje P1 dršku aptamera, što sprečava njegovu upotrebu kao dela strukture ribozima i inhibira endonukleaznu aktivnost ribozima. Kada ligand nije prisutan, zajednička drška je slobodna da formira deo P1 drške ribozima, čime se omogućava endonukleazna aktivnost ribozima i degradacija ciljne RNK što dovodi do smanjene ekspresije ciljnog gena. U primerima izvođenja, alternativno zajednički deo drške ribozima i aptamera je dugačak 4 do 8 nukleotida, 5 do 7 nukleotida, 6 nukleotida ili 7 nukleotida.
[0044] Polinukleotidna kaseta koja sadrži riboprekidač za uključivanje može da bude postavljena na jednoj ili više lokacija u ciljnom genu, uključujući, ali ne ograničavajući se na 5' i 3' UTR i nizvodno od startnog kodona.
Aptamer/Ligand
[0045] Prema pronalasku, senzorski region sadrži aptamer. Termin "aptamer" kako se ovde koristi, odnosi se na RNK polinukleotid koji se specifično vezuje za ligand. Termin "ligand" se odnosi na molekul koji je specifično vezan od strane aptamera. U jednom primeru izvođenja, ligand je molekul niske molekulske težina (manje od oko 1 000 daltona) molekul uključujući, na primer, lipidi, monosaharidi, sekundarni glasnici, ko-faktori, metalni joni, drugi prirodni proizvodi i metaboliti, nukleinske kiseline, kao i većina terapeutskih lekova. U jednom primeru izvođenja, ligand je polinukleotid sa dve ili više nukleotidnih baza.
[0046] U jednom primeru izvođenja, ligand je odabran iz grupe koja se sastoji od 8-azaguanina, adenozin 5'-monofosfat monohidrata, amfotericina B, avermektina B1, azatioprina, hlormadinon acetata, merkaptopurina, moricizin hidrohlorida, N6-metiladenozina, nadida, progesterona, promazin hidrohlorida, pirvinijum pamoata, sulfaguanidina, testosteron propionata, tioguanozina, tiloksapola i vorinostata.
[0047] Ligandi aptamera takođe mogu biti ćelijske endogene komponente koje se značajno povećavaju pod specifičnim fiziološkim/patološkim uslovima, kao što je onkogena transformacija - ovo može da uključuje molekule sekundarnih glasnika kao što su GTP ili GDP, kalcijum; masne kiseline, ili masne kiseline koje se nepravilno metabolišu, kao što je 13-HODE kod raka dojke (Flaherty, JT et al., Plos One, Vol. 8, e63076, 2013 ); amino kiseline ili metabolite amino kiselina; metabolite u putu glikolize koji obično imaju više nivoe u ćelijama raka ili u normalnim ćelijama kod metaboličkih bolesti; i molekule povezani sa rakom kao što su Ras ili mutantni Ras protein, mutantni EGFR kod raka pluća, indolamin-2,3-dioksigenazu (IDO) kod mnogih vrsta kancera. Endogeni ligandi uključuju metabolite progesterona kod raka dojke kao što je prikazano u JP Wiebe (Endocrine-Related Cancer (2006) 13:717-738). Endogeni ligandi takođe uključuju metabolite sa povećanim nivoima koji su rezultat mutacija u ključnim metaboličkim enzimima kod raka bubrega, kao što su laktat, glutation, kinurenin, kao što je prikazano u Minton, DR and Nanus, DM (Nature Reviews, Urology, Vol.12, 2005).
[0048] Aptameri imaju vezujuće regione koje su u stanju da formiraju komplekse sa predviđenim ciljnim molekulom (tj. ligandom). Specifičnost vezivanja se može definisati u smislu uporedivih konstanti disocijacije (Kd) aptamera za sopstveni ligand u poređenju sa konstantom disocijacije aptamera za nepovezane molekule. Dakle, ligand je molekul koji se vezuje za aptamer sa većim afinitetom nego za nepovezani materijal. Obično će Kd za aptamer u odnosu na sopstveni ligand biti najmanje oko 10 puta manji od Kd za aptamer sa nepovezanim molekulima. U drugim primerima izvođenja Kd će biti najmanje oko 20 puta manja, najmanje oko 50 puta manja, najmanje oko 100 puta manja, i najmanje oko 200 puta manja. Aptamer će tipično biti dužine između oko 15 i oko 200 nukleotida. Češće će aptamer biti dužine između 30 i oko 100 nukleotida.
[0049] Aptameri koji mogu da budu inkorporirani kao deo riboprekidača mogu da budu
1
prirodni aptamer, ili njegove modifikacije, ili aptameri koji su dizajnirani de novo i/ili podvrgnuti skriningu putem sistemske evolucije liganda eksponencijalnim obogaćivanjem (SELEX) ili drugim metodama skrininga. Primeri aptamera koji vezuju malomolekulske ligande uključuju, ali nisu ograničeni na teofilin, dopamin, sulforodamin B, celobiozu, kanamicin A, lividomicin, tobramicin, neomicin B, viomicin, hloramfenikol, streptomicin, citokine, molekule ćelijske površine, i metabolite. Za pregled aptamera koji prepoznaju male molekule, videti, npr., Famulok, Science 9:324-9 (1999) i McKeague, M. & DeRosa, M.C. J. Nuc. Aci.2012). U drugom primeru izvođenja, aptamer je komplementarni polinukleotid.
Metode za identifikaciju aptamera/liganda
[0050] U jednom primeru izvođenja, aptamer je dizajniran tako da vezuje određeni malomolekulski ligand. Metode za dizajniranje i izbor aptamera koji se vezuju za određene ligande prikazani su u 62/370.599. Druge metode za skrining aptamera uključuju, na primer, SELEX. Metode za dizajniranje putem SELEX metode aptamera koje selektivno vezuju mali molekul su prikazane u, npr. SAD patentima br. 5,475,096, 5,270,163, i Abdullah Ozer, et al. Nuc Aci. 2014 Modifikacije SELEX procesa su opisane u SAD patentima br. 5,580,737 i 5,567,588.
[0051] Tehnike selekcije za identifikaciju aptamera uglavnom podrazumevaju pripremu velikog pula DNK ili RNK molekula željene dužine koji sadrže region koji je randomizovan ili mutagenizovan. Na primer, pul oligonukleotida za selekciju aptamera može da sadrži region od 20-100 randomizovanih nukleotida okruženih regionima definisane sekvence koji su dugački oko 15-25 nukleotida i korisni za vezivanje PCR prajmera. Pul oligonukleotida se amplifikuje pomoću standardnih PCR tehnika, ili drugih sredstava koja omogućavaju amplifikaciju selektovanih sekvenci nukleinske kiseline. Pul DNK može da se transkribuje in vitro kako bi se proizveo pul RNK transkripata ukoliko je poželjan RNK aptamer. Pul RNK ili DNK oligonukleotidi se zatim podvrgnu selekciji na osnovu njihove sposobnosti da se posebno vežu za željeni ligand. Tehnike selekcije uključuju, na primer, afinitetnu hromatografiju, mada se može koristiti bilo koji protokol koji će omogućiti izbor nukleinskih kiselina na osnovu njihove sposobnosti da se posebno veže za drugi molekul. Tehnike selekcije za identifikaciju aptamera koji se vezuju za male molekule i funkcionišu unutar ćelije mogu da uključuju metode skrininga zasnovane na ćelijama. U slučaju afinitetne hromatografije, oligonukleotidi se kontaktiraju sa ciljnim ligandom koji je imobilisan na
1
supstratu u koloni ili na magnetnim zrncima. Oligonukleotid se poželjno selektuje prema vezivanju liganda u prisustvu koncentracija soli, temperatura i drugih uslova koja oponašaju normalne fiziološke uslove. Oligonukleotidi u pulu koji se vezuju za ligand zadržavaju se na koloni ili zrncima, a nevezujuće sekvence se ispiraju. Oligonukleotidi koji vezuju ligand se zatim amplifikuju (nakon reverzne transkripcije ako su RNK transkripti korišćeni) pomoću PCR tehnike (obično nakon elucije). Proces selekcije se ponavlja na selektovanim sekvencama za ukupno oko tri do deset iterativnih rundi procedure za selekciju. Dobijeni oligonukleotidi se zatim amplifikuju, kloniraju i sekvenciraju pomoću standardnih procedura za identifikovanje sekvenci oligonukleotida koji su sposobni da vežu ciljni ligand. Kada se identifikuje sekvenca aptamera, aptamer može dodatno da se optimizuje sprovođenjem dodatnih rundi selekcije polazeći od pula oligonukleotida koji sadrže mutagenizovanu sekvencu aptamera.
[0052] In vivo skrining aptamera može se koristiti nakon jedne ili više rundi in vitro selekcije (npr. SELEX). Na primer, Konig, J. et al. (RNK. 2007, 13(4):614-622, ) opisuju kombinovanje SELEX i tro-hibridnog sistema kvasca za vivo selekciju aptamera.
Ciljni geni
[0053] Kaseta za regulaciju gena prema predmetnom pronalasku je platforma koja može da se koristi za regulaciju ekspresije bilo kog ciljnog gena koji može da se eksprimira u ciljnoj ćeliji, tkivu ili organizmu. Termin "ciljni gen" se odnosi na polinukleotid koji se uvodi u ćeliju i sposoban je da bude transkribovan u RNK i preveden i/ili eksprimiran pod odgovarajućim uslovima. Alternativno, ciljni gen je endogen za ciljnu ćeliju i kaseta za regulaciju gena predmetnog pronalaska je pozicionirana u ciljni gen (na primer u 5' ili 3' UTR endogenog ciljnog gena). Primer ciljnog gena je polinukleotid koji kodira terapeutski polipeptid. U drugom primeru izvođenja, ciljni gen kodira RNK kao što su miRNK, rRNK, male ili duge nekodirajuće RNK, kratke RNK sa ukosnicom (shRNK) i bilo koje druge regulatorne RNK. U jednom primeru izvođenja, ciljni gen je egzogen za ćeliju u kojoj treba transkribovati rekombinantni DNK konstrukt. U jednom primeru izvođenja, ciljni gen je endogen za ćeliju u kojoj treba transkribovati rekombinantni DNK konstrukt.
[0054] Ciljni gen prema predmetnom pronalasku može da bude gen koji kodira protein, ili sekvenca koja kodira neproteinsku kodirajuću RNK. Ciljni gen može da bude, na primer, gen
1
koji kodira strukturni protein, enzim, protein za signalizaciju ćelija, mitohondrijski protein, protein cinka prsta, hormon, transportni protein, faktor rasta, citokin, intracelularni protein, ekstracelularni protein, transmembranski protein, citoplazmatski protein, nuklearni protein, receptorski molekul, RNK vezujući protein, DNK vezujući protein, transkripcioni faktor, translacionu mašineriju, protein kanala, motorni protein, molekul ćelijske adhezije, mitohondrijski protein, metabolički enzim, kinazu, fosfatazu, faktoru razmene, šaperonske proteine i modulatore bilo koje od ovih kategorija. Kod primera izvođenja, ciljni gen kodira eritropoietin (Epo), hormon rasta čoveka (hGH), transkripcioni aktivatorske efektorske nukleze (TALEN), humani insulin, CRISPR povezani protein 9 (cas9) ili imunoglobulin (ili njegov deoa), uključujući, npr. terapeutsko antitelo.
Ekspresioni konstrukti
[0055] predmetni pronalazak razmatra upotrebu rekombinantnog vektora za uvođenje u ciljne ćelije polinukleotida koji kodira ciljni gen i sadrži kasetu za regulisanje gena opisanu ovde. U mnogim primerima izvođenja, rekombinantni DNK konstrukt prema predmetnom pronalasku uključuje dodatne DNK elemente uključujući DNK segmente koji obezbeđuju replikaciju DNK u ćeliji domaćina i ekspresiju ciljnog gena u toj ćeliji na odgovarajućim nivoima. Stručnjak u oblasti zna da se kontrolne sekvence ekspresije (promotori, enhenseri i slično) biraju na osnovu njihove sposobnosti da pospešuju ekspresiju ciljnog gena u ciljnoj ćeliji. "Vektor" označava rekombinantni plazmid, veštački hromozom kvasca (YAC), mini hromozom, DNK mini krug ili virus (uključujući izvedene sekvence virusa) koji se sastoji od polinukleotida koji će biti isporučen u ćeliju domaćina, bilo in vitro ili in vivo. U jednom primeru izvođenja, rekombinantni vektor je virusni vektor ili kombinacija više virusnih vektora.
[0056] Virusni vektori za aptamerom posredovanu ekspresiju ciljnog gena u ciljnoj ćeliji, tkivu ili organizmu poznati su u oblasti i uključuju adenovirusne (AV) vektore, vektore virusa povezane sa adenovirusom (AAV), retrovirusne i lentivirusne vektore, i vektore Herpes simplex tipa 1 (HSV1).
[0057] Adenovirusni vektori uključuju, na primer, vektore na bazi humanog adenovirusa tipa 2 i humanog adenovirusa tipa 5 koji su napravljeni tako da budu replikativno defektni putem delecija u regionima E1 i E3. Transkripciona kaseta se može ubaciti u region E1, što daje
1
rekombinantni AV vektor sa deletiranim E1/E3. Adenovirusni vektori takođe uključuju adenovirusne vektore velikog kapaciteta, zavisne od pomagača (poznate i kao vektori velikog kapaciteta, "gutless" ili "gutted" vektori), koji ne sadrže virusne kodirajuće sekvence. Ovi vektori, sadrže cis delujuće elemente potrebne za replikaciju i pakovanje virusne DNK, uglavnom invertovane sekvence terminalnih ponovaka (ITR) i signale za pakovanje (Ψ). Ovi genomi AV vektora zavisni od pomagača imaju potencijal da nose od nekoliko stotina baznih parova do otprilike 36 kb strane DNK.
[0058] Rekombinantni virusni vektori povezani sa adenovirusom "rAAV", uključuju bilo koji vektor izveden iz adeno-asociranog virusnog serotipa, uključujući, bez ograničenja, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 i AAV-8, AAV-9, AAV-10, i slično. rAAV vektori mogu imati jedan ili više AAV gena divljeg tipa deletiranih u celini ili delimično, poželjno Rep/ili Cap gene, ali zadržavaju funkcionalne omeđujuće ITR sekvence. Funkcionalne ITR sekvence se zadržavaju za spasavanje, replikaciju, pakovanje i potencijalnu hromozomsku integraciju AAV genoma. ITR sekvence ne moraju biti nukleotidne sekvence divljeg tipa i mogu biti izmenjeni (npr. umetanjem, delecijama ili supstitucijom nukleotida) sve dok sekvence obezbeđuju funkcionalno spasavanje, replikaciju i pakovanje.
[0059] Alternativno, drugi sistemi kao što su lentivirusni vektori mogu se koristiti u primerima izvođenja pronalaska. Lentivirusni sistemi mogu da transdukuju ćelije koje se ne dele, kao i one koje se dele, što ih čini korisnim za primene koje ciljano deluju, na primer, na CNS ćelije koje se ne dele. Lentivirusni vektori potiču od virusa ljudske imunodeficijencije i, kao i taj virus, integrišu se u genom domaćina obezbeđujući potencijal za dugotrajnu ekspresiju gena.
[0060] Polinukleotidi, uključujući plazmide, YAC hromozome, minihromozome i mini krugove, koji nose ciljni gen koji sadrži kasetu za regulisanje gena takođe mogu da se uvedu u ćeliju ili organizam pomoću nevirusnih vektorskih sistema koristeći, na primer, katjonske lipide, polimere ili i jedne i druge, kao nosače. Konjugovani polimerni sistemi poli-L-lizin (PLL) polimera i polietilenimin (PEI) polimera takođe mogu da se koriste za isporučivanje vektora u ćelije. Druge metode za isporuku vektora ćelijama uključuju hidrodinamičko injeciranje i elektroporaciju i upotrebu ultrazvuka, kako za ćelijske kulture, tako i za organizme. Za pregled virusnih i nevirusnih sistema za isporučivanje gena, pogledati Nayerossadat, N. et al. (Adv Biomed Res.2012; 1:27).
1
Metode moduliranja ekspresije ciljnog gena
[0061] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metod moduliranja ekspresije ciljnog gena (npr. terapeutskog gena), tako što (a) ubacuje kasetu polinukleotida gena predmetnog pronalaska u ciljni gen; (b) uvođenje ciljnog gena koji se sastoji od kasete za regulaciju gena u ćeliju; i (c) izlaganje ćelije ligandu koji vezuje aptamer u efektivnoj količini za modulaciju ekspresije ciljnog gena, gde je rečeno da metoda nije metod za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom. U povezanom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kasetu polinukleotida za regulaciju gena predmetnog pronalaska za upotrebu u ametod terapiji moduliranjem ekspresije ciljnog gena (npr. terapeutskog gena), tako što (a) ubacivanjem navedene kasete za regulaciju gena polynucleotide u ciljni gen; (b) uvođenje ciljnog gena koji komprimuje kasetu za regulisanje gena u ćeliju; i (c) izlaganje ćelije ligandu koji vezuje aptamer u efektivnoj količini za modulaciju ekspresije ciljnog gena.
[0062] U jednom primeru izvođenja, jedna ili više kaseta za regulaciju gena se ubacuju u 3' UTR i/ili 5' UTR ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, jedna kaseta za regulisanje gena se ubacuje u 3' UTR ciljnog gena. U drugim primerima izvođenja 2, 3, 4 ili više kaseta za regulisanje gena se ubacuju u ciljni gen. U jednom primeru izvođenja, dve kasete za regulaciju gena se ubacuju u ciljni gen. Kada se veći broj kaseta za regulaciju gena ubaci u ciljni gen, svaka od njih može da sadrži isti aptamer tako da jedan ligand može da se koristi za modulaciju ribonukleazne degradacije većeg broja kaseta i time modulira ekspresija ciljnog gena. U drugim primerima izvođenja, veći broj kaseta za regulaciju gena se ubacuje u ciljni gen, svaka može da sadrži različit aptamer tako da izloženost većem broju različitih malomolekulskih liganada modulira ekspresiju ciljnog gena. U drugim primerima izvođenja, veći broj kaseta za regulaciju gena se ubacuje u ciljni gen, pri čemu svaka sadrži različite sekvence supstrata ribonukleaze. Ovo može da bude korisno za smanjenje rekombinacije i poboljšanje lakoće inkorporacije u virusne vektore.
[0063] U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta prema predmetnom pronalasku je efikasna u moduliranju ekspresije ciljnog gena kada se postavi nizvodno (tj. 3') od start kodona ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, kada se polinukleotidna kaseta inserira nizvodno od start kodona za translaciju ciljnog gena, riboprekidač za uključivanje se nalazi pored startnog kodona. Kod ostalih primera izvođenja, riboprekidač se nalazi oko 1 do oko
2
100, oko 1 do oko 50, ili oko 1 do oko 20 nukleotida od startnog kodona ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta sadrži 2A peptidnu sekvencu između 3' kraja riboprekidača i kodirajuće sekvence ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta sadrži 2A peptidnu sekvencu i linker ("2A linker") između 3' kraja riboprekidača i kodirajuće sekvence ciljnog gena. 2A sekvenca koja se koristi u primerima identifikovana je kod Thoseaasigna virusa, pa se ponekad označava kao "T2A". Umesto T2A, mogu se koristiti i druge sekvence koje razdvajaju vodeće poli peptida od ostatka genskog proizvoda. Drugi 2A peptidi uključuju peptide identifikovane u Picorna virusima: virusu bolesti stopala i usta (F2A, prvi otkriven), virus konjskog rinitisa A (E2A) i porcine teschovirus (P2A). Drugi 2A peptidi uključuju 2A peptid iz rotavirusa tipa C.
[0064] Polinukleotidna kaseta prema predmetnom pronalasku može se koristiti u kombinaciji sa drugim mehanizmima za regulaciju ekspresije ciljnog gena. U jednom primeru izvođenja, polinukleotidna kaseta prema predmetnom pronalasku koristi se u kombinaciji sa kasetom za regulaciju gena koja modulira ekspresiju ciljnog gena aptamerom posredovanom regulacijom alternativnog splajsovanja kao što je opisano u WO 2016/126747
Medicinska upotreba i farmaceutske kompozicije
[0065] Kao što je detaljno opisano prethodno u tekstu, jedan aspekt pronalaska obezbeđuje polinukleotidnu kasetu prema predmetnom pronalasku za upotrebu u postupku za terapiju regulisanjem nivoa terapeutskog proteina koji se isporučuje genskom terapijom. U ovom primeru izvođenja, "ciljni gen" može da kodira terapeutski protein. "Ciljni gen" može da kodira protein koji je endogen ili egzogen za ćeliju.
[0066] Sekvenca terapeutskog gena koja sadrži regulatornu kasetu sa riboprekidačem koga inicira aptamer isporučuje se ciljnim ćelijama in vitro ili ex vivo, npr. pomoću vektora. Ćelijska specifičnost "ciljnog gena" može da se kontroliše od strane promotora ili drugih elemenata unutar vektora. Isporuka vektorskog konstrukta koji sadrži ciljni gen i polinukleotidnu kasetu, kao i transfekcija ciljnih tkiva koja rezultira stabilnom transfekcijom regulisanog ciljnog gena, prvi je korak u proizvodnji terapeutskog proteina.
[0067] Međutim, zbog prisustva regulatorne kasete unutar sekvence ciljnog gena, ciljni gen nije eksprimiran u značajnim nivoima. U nekim primerima izvođenja, ciljni gen je u "isključenom stanju" u odsustvu specifičnog liganda koji se vezuje za aptamer koji se nalazi u regulatornoj kaseti riboprekidača. Tek kada se ligand specifičan za aptamer primeni (ili je na drugi način prisutan u dovoljnim količinama) aktivira se ekspresija ciljnog gena. U nekim primerima izvođenja, ciljni gen je u "isključenom stanju" u prisustvu specifičnog liganda koji se vezuje za aptamer koji se nalazi u regulatornoj kaseti riboprekidača. Kada se prestane sa primenom (ili je ligand na neki drugi način prisutan u dovoljno niskom nivou), doći će do ekspresije ciljnog gena.
[0068] Isporuka vektorskog konstrukta koji sadrži ciljni gen i isporuka aktivirajućeg liganda uglavnom su vremenski odvojene. Isporuka aktivirajućeg liganda će biti ograničavajući faktor kada se ciljni gen eksprimira, kao i nivo ekspresije proteina. Ligand može da bude isporučen brojnim rutama uključujući, ali ne i ograničena na, oralnu, intramuskularnu (IM), intravensku (IV), intraokularnu ili topikalnu.
[0069] Vreme isporuke liganda zavisiće od zahteva za aktiviranjem ciljnog gena. Na primer, ako je terapeutski protein kodiran ciljnim genom potreban konstantno, u slučaju riboprekidača "za uključivanje", oralni malomolekulski ligand može da se isporučuje svakodnevno, ili više puta dnevno, kako bi se obezbedilo stalno aktiviranje ciljnog gena, a samim tim i kontinuirana ekspresija terapeutskog proteina. Ako ciljni gen ima dugodelujući efekat, indukovani ligand se može ređe dozirati.
[0070] Ovaj pronalazak omogućava da se ekspresija terapeutskog transgena kontroliše privremeno, na način određen temporalnim doziranjem liganda specifičnog za aptamer unutar riboprekidača regulatorne polinukleotidne kasete. Povećana ekspresija terapeutskog transgena samo prilikom primene liganda (u slučaju riboprekidača za "uključivanje"), povećava bezbednost genske terapije tako što omogućava da se ciljni gen isključi u odsustvu liganda.
[0071] Različiti aptameri se mogu koristiti da bi se omogućilo različitim ligandima da aktiviraju ciljne gene ili suprimiraju ciljne gene. U nekim primerima izvođenja prema pronalasku, svaki terapeutski gen koji sadrži regulatornu kasetu imaće specifičan aptamer unutar kasete koji će biti aktiviran specifičnim malim molekulom. To znači da svaki terapeutski gen može da se aktivira samo ligandom specifičnim za aptamer koji je u njemu smešten. U ovim primerima izvođenja, svaki ligand će aktivirati samo jedan terapeutski gen. To dozvoljava mogućnost da se nekoliko različitih "ciljnih gena" isporuči jednom pojedincu i svaki će biti aktiviran pri isporuci specifičnog liganda za aptamer koji se nalazi u okviru regulatorne kasete smeštene u svakom ciljnom genu.
[0072] Ovaj pronalazak omogućava da svaki terapeutski protein čiji gen može da se isporuči telu (kao što je eritropoetin (EPO) ili terapeutsko antitelo) telo proizvede kada se isporuči aktivirajući ligand. Ova metoda terapijske isporuke proteina može zameniti proizvodnju takvih terapeutskih proteina izvan tela koji se zatim ubrizgavaju ili natalože, npr. antitela koja se koriste kod kancera ili za blokiranje inflamatorne ili autoimune bolesti. Telo koje sadrži regulisani ciljni gen postaje fabrika za proizvodnju bioloških sredstava, koja se uključuje kada se primeni ligand specifičan za gen.
[0073] Nivoi doziranja i vreme doziranja terapeutskog proteina mogu biti važni za terapeutsko dejstvo. Na primer, u isporuci antitela AVASTIN (anti-VEGF antitelo) za rak. Predmetni pronalazak povećava lakoću doziranja kao odgovor na praćenje nivoa i efekata terapeutskih proteina.
[0074] U jednom primeru izvođenja, ciljni gen može da kodira nukleazu koje može ciljano da deluje na i da edituje određenu DNK sekvencu. Takve nukleaze uključuju Cas9, nukleaze koje sadrže cinkane prstiće ili TALEN nukleaze. U slučaju ovih nukleaza, nukleazni protein može da bude potreban samo na kratak vremenski period koji je dovoljan da se ciljni endogeni geni edituju. Međutim, ako se neregulisani nukleazni gen isporuči u telo, ovaj protein može da bude prisutan do kraja života ćelije. U slučaju nukleaza, što je duže nukleaza prisutna, to je veći rizik od neciljanog editovanja. Regulacija ekspresije takvih proteina ima značajnu prednost jer je bezbedna. U ovom slučaju, vektor koji sadrži ciljni gen za nukleazu, koji sadrži regulatornu kasetu, može da bude isporučen odgovarajućim ćelijama u telu. Ciljni gen je u "isključenom" stanju u odsustvu liganda specifičnog za kasetu, tako da se nukleaza ne proizvodi. Tek kada se primeni aktivirajući ligand, nukleaza se proizvodi. Kada je protekao dovoljan broj vremena dozvoljavajući da dođe do dovoljne montaže, ligand će biti povučen i neće se ponovo administriranje. Tako je nukleazni gen nakon toga u "isključenom" stanju i nukleaza se više ne proizvodi i editovanje se zaustavlja. Ovaj pristup se može koristiti za ispravljanje genetskih stanja, uključujući niz naslednih retinopatija kao što je LCA10 izazvana mutacijama u CEP290 i Stargartova bolest izazvana mutacijama u ABCA4.
[0075] Primena regulisanog ciljnog gena koji kdira terapeutski protein koji se aktivira samo
2
pri primeni specifičnog liganda može se koristiti za regulisanje terapeutskih gena za lečenje brojnih različitih vrsta bolesti, npr. raka sa terapeutskim antitelima, imunoloških poremećaja sa imunomodulatornim proteinima ili antitelima, metaboličkih bolesti, retkih bolesti kao što je PNH sa anti-C5 antitelima ili fragmentima antitela kao regulatornim genima, ili okularne angiogeneze sa terapeutskim antitelima, i suvog AMD sa imunomodulatornim proteinima.
[0076] Veliki izbor specifičnih ciljnih gena, koji omogućavaju lečenje širokog spektra specifičnih bolesti i stanja, pogodan je za upotrebu u predmetnom pronalasku. Na primer, insulin ili insulin analogni (po mogućstvu ljudski insulin ili analogni ljudski insulin) mogu se koristiti kao ciljni gen za lečenje dijabetesa tipa I, dijabetesa tipa II ili metaboličkog sindroma; humani hormon rasta može da se koristi kao ciljni gen za lečenje dece sa poremećajima rasta ili odraslih kojima nedostaje hormon rasta; eritropoetin (poželjno humani eritropoetin) može se koristiti kao ciljni gen za lečenje anemije usled hronične bolesti bubrega, anemije usled mijelodisplazije ili anemije usled hemioterapije raka.
[0077] Predmetni pronalazak može da bude posebno pogodan za lečenje bolesti izazvanih defektima jednog gena kao što su cistična fibroza, hemofilija, mišićna distrofija, talasemija ili anemija srpastih ćelija. Tako se β-, γ-, δ-ili ζ-globin mogu koristiti kao ciljni gen za lečenje βtalasemije ili anemije srpastih ćelija; humani faktor VIII ili faktor IX mogu se koristiti kao ciljni gen za lečenje hemofilije A ili hemofilije B.
[0078] Ligandi koji se koriste u predmetnom pronalasku uglavnom se kombinuju sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača za formiranje farmaceutskih kompozicija pogodnih za primenu kod pacijenta. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju rastvarače, vezujuća sredstva, razblaživače, dezintegrante, maziva, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i sredstva za odlaganje apsorpcije, kao i slično, koji se u pricipu koriste u oblasti farmacije. Farmaceutske kompozicije mogu biti u obliku tableta, pilula, kapsula, dražeja i slično, i formulisani su tako da budu kompatibilni sa predviđenom rutom primene. Primeri za rute primene uključuju parenteralnu, npr. intravensku, intradermalnu, intranazalnu, subkutanu, oralnu, inhalacionu, transdermalnu (topikalnu), transmukoznu i rektalnu primenu.
[0079] Farmaceutske kompozicije koje sadrže ligande, primenjuju se kod pacijenata po rasporedu doziranja tako da se pacijentu isporučuje količina liganda dovoljna da na željeni način reguliše ciljni gen. Kada je ligand mali molekul, a oblik doza je tableta, kapsula ili slično, poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži od 0,1 mg do 10 g liganda; od 0,5 mg do 5 g liganda; od 1 mg do 1 g liganda; od 2 mg do 750 mg liganda; od 5 mg do 500 mg liganda; ili od 10 mg do 250 mg liganda.
[0080] Farmaceutska kompozicija se može dozirati jednom dnevno ili više puta dnevno (npr.
2, 3, 4, 5 ili više puta dnevno). Alternativno, farmaceutske kompozicije mogu biti dozirane ređe od jednom dnevno, npr. jednom u 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 dana, ili jednom mesečno ili jednom u nekoliko meseci. U nekim primerima izvođenja prema pronalasku, farmaceutske kompozicije se mogu primeniti kod pacijenta samo mali broj puta, npr.
[0081] Takođe opisan, ali ne i obuhvaćeni predmetom zaštite patentnih zahteva je postupak lečenja pacijenta kome je potrebno povećanje ekspresije terapeutskog proteina kodiranog ciljnim genom, pri čemu postupak obuhvata primenu kod pacijenta farmaceutske kompozicije koja sadrži ligand aptamera, gde je kod pacijenta prethodno primenjena rekombinantna DNK koja sadrži ciljni gen, gde ciljni gen sadrži kasetu za regulaciju gena prema predmetnom pronalasku koja obezbeđuje mogućnost regulisanja ekspresije ciljnog gena ligandom aptamera putem alternativnog splajsovanja pre-iRNK ciljnog gena, čime se povećava ekspresija terapeutskog proteina.
Proizvodni artikli i kompleti
[0082] Takođe opisani, ali ne i obuhvaćeni predmetom zaštite patentnih zahteva su kompleti ili proizvodni artikli za upotrebu u ovde opisanim postupcima. U aspektima, kompleti sadrže ovde opisane kompozicije (npr. za kompozicije za isporuku vektora koji sadrži ciljni gen koji sadrži kasetu za regulaciju gena) u odgovarajućoj ambalaži. Pogodna ambalaža za kompozicije (kao što su okularne kompozicije za ubrizgavanje) opisana ovde je poznata u oblasti, i uključuje, na primer, bočice (kao što su zapečaćene bočice), posude, ampule, flaše, tegle, fleksibilno pakovanje (npr. zapečaćene milar ili plastične kese) i slično. Ovi proizvodni artikli mogu biti dodatno sterilisani i/ili zapečaćeni.
[0083] Takođe opisani, ali ne i obuhvaćeni predmetom zaštite patentnih zahteva su kompleti koji se sastoje od ovde opisanih kompozicija i mogu dalje da sadrže instrukcije u vezi sa
2
postupcima korišćenja kompozicije, kao što su ovde opisane upotrebe. Kompleti opisani ovde mogu dalje uključivati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge bafere, razblažene, filtere, igle, špriceve i paketne umetke sa uputstvima za obavljanje administracije, uključujući npr. Na primer, komplet može da sadrži rAAV za ekspresiju ciljnog gena koji sadrži kasetu za regulaciju gena prema predmetnom pronalasku, farmaceutski prihvatljivi nosač pogodan za injekciju i jedno ili više od: pufera, razblaživača, filtera, igle, šprica i uputstva sa instrukcijama za izvođenje injeciranja. Komplet može da bude pogodan za intraokularnu injekciju, intramuskularnu injekciju, intravenoznu injekciju i slično.
[0084] "Homologija" i "homologne", kako se ovde koristi, odnosi se na procenat identičnosti između dve polinukleotidne sekvence ili između dve polipeptidne sekvence. Mera u kojoj jedna sekvenca odgovara drugoj može da se odredi tehnikama poznatim u oblasti. Na primer, homologija može da se odredi direktnim poređenjem dva molekula polipeptida poravnavanjem informacija o sekvenci i korišćenjem lako dostupnih kompjuterskih programa. Dve polinukleotidne ili dve polipeptidne sekvence su “značajno homologne” jedna u odnosu na drugu kada se, nakon optimalnog poravnanja sa odgovarajućim insercijama ili delecijama, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, i najmanje oko 95% nukleotida ili aminokiselina podudara u okviru definisane dužine molekula, kao što je utvrđeno korišćenjem prethodno navedenih metoda.
[0085] „Procenat identičnosti sekvence“ u odnosu na referentni polipeptid ili sekvencu nukleinske kiseline definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvenci kandidata koji su identični sa amino kiselinskim ostacima ili nukleotidima u referentnom polipeptidu ili nukleinskoj kiselini nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bis se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhu utvrđivanja procenta aminokiseline ili identiteta sekvence nukleinske kiseline može se postići na načine poznate prosečnom stručnjaku u oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnih kompjuterskih softverskih programa uključujući BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver.
[0086] Termin “polinukleotid“ ili “nukleinska kiselina”, kako se ovde koristi, odnosi se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo ribonukleotida ili dezoksiribonukleotida. Stoga, ovaj pojam uključuje, ali nije ograničen na, jednolančanu, dvolančanu ili višelančanu DNK ili RNK, genomsku DNK, cDNK, DNK-RNK hibride ili polimer koji se sastoji od baza
2
purina i pirimidina, ili drugih prirodnih, hemijski ili biohemijski modifikovanih, neprirodnih ili izvedenih nukleotidnih baza.
[0087] „Heterologno” ili “egzogeno” sredstvo izvedeno iz genotipski različitog entiteta od onog u ostatku entiteta sa kojim je upoređivan ili u koji je uveden ili inkorporiran. Na primer, polinukleotid koji se uvodi tehnikama genetskog inženjeringa u drugi tip ćelije je heterologni polinukleotid (i, kada je eksprimiran, može da kodira heterologne polipeptide). Slično tome, ćelijska sekvenca (npr. gen ili deo) koja je ugrađena u virusni vektor je heterologna nukleotidna sekvenca u odnosu na vektor.
[0088] Tabela koja sledi sadrži listu DNK sekvenci ovde opisanih konstrukata, kao i drugih sekvenci kao što je opisano. Sekvenca ribozima je podvučena, ispisana malim slovima u kurzivu; dodatna drška od 3 bazna para (3HP) je ispisana dvostruko podvučenim malim slovima; sekvence aptamera su ispisane talasasto podvučenim malim slovima; sekvence drške koje su zajedničke za dršku tvistera i dršku aptamera su date sivo osenčenim malim slovima; a linker2A sekvenca je ispisana debelo podvučenim malim slovima; kodirajuće sekvence su ispisane velikim slovima.
2
2
2
1
2
[0089] Treba razumeti i očekivati da stručnjak u oblasti može da napravi varijacije u principima pronalaska koji su ovde prikazani. Primeri koji slede dodatno ilustruju pronalazak,
PRIMER 1
Tvister ribozimi se samodegraduju i suprimiraju ekspresiju gena u sisarskim ćelijama
Eksperimentalne procedure:
[0090] Plazmidni konstrukti: Oligonukleotidi koji sadrđe sekvence divljeg tipa ili mutantne sekvence ribozims, ili iz Nasonia Vitripennis (osa) ili iz sredinskih uzoraka, omeđeni sa BsrGI i Mfel mestima su sintetisani (IDT). Sintetisani oligonukleotidi (“oligotidi”) digerirani su sa BsrGI i Mfel i klonirani u pEGFP-C1 (Clontech) digeriran sa kompatibilnim restrikcionim enzimima. Sekvence konstruisanih vektora verifikovane su DNK sekvenciranjem (Genewiz).
[0091] Transfekcija i merenje GFP fluorescencije: 3,5×10<4>HEK 293 ćelije su zasejane uploči sa 96 bunarčića sa ravnim dom, dan pre transfekcije. Plazmidna DNK (500 ng) je dodata u
4
epruvetu ili u ploču sa 96 bunarčića sa dnom u obliku slova U. Pored toga, TransIT-293 reagens (Mirus; 1,4 μl) je dodat u 50 μl Opti-mem I medijuma (Life Technologies), i ostavljen 5 minuta na sobnoj temperaturi ("RT"). Zatim je 50 μl ovog razblaženog reagensa za transfekciju dodato u DNK, promešano i inkubirano na RT 20 min. Konačno, 7 μl ovog rastvora je dodato u bunarčić sa ćelijama u ploči sa 96 bunarčića. LacZ konstrukt koja ne eksprimira GFP korišćena je kao negativna kontrola sa osnovnim nivoom. Intenzitet GFP fluorescencije izmeren je Tecan čitačem ploča, koristeći talasnu dužinu ekscitacije na 484 nm, talasnu dužinu emisije na 510 nm i propusni opseg ekscitacije od 5 nm. Intenzitet GFP fluorescencije izražen je kao vrednost koju generišu GFP konstrukti od koje je oduzeta vrednost koju generiše LacZ konstrukt.
Rezultati:
[0092] Tvister ribozimi postoje u brojnim vrstama bakterija i eukarija. Međutim, njihova aktivnost samodegradacije u ćelijama sisara još uvek nije utvrđena. Da bi se istražilo da li je tvister ribozim mogao da degraduje iRNK i suprimir ekspresiju gena u ćelijama sisara, tvister ribozim sekvenca iz N. Vitripennis (osa) i tvister ribozim sekvenca iz sredinskih uzoraka je inserirana u 3' UTR regione egFP gena u pEGFP-C1 vektoru. Kao što je prikazano na slici 1a, ubacivanje wasp-twister ribozim u 3' UTR rezultiralo je sa 97% i 36 puta inhibicijom GFP ekspresije prilikom poređenja sa pEGFP-C1 kontrolnim konstruktom. Sekvenca tvistera iz sredinskog uzorka (es-tvister) nije dovela do robustne supresije GFP ekspresije kao tvister ose, generišući oko 50% supresije GFP ekspresije kada se uporedi sa kontrolnim GFP vektorom. Da bi se dodatno utvrdilo da je do supresije GFP ekspresije došlo zbog degradacije tvister ribozima, generisan je mutantni konstrukt gde je A6 zamenjen sa G, što čini nemogućom degradaciju tvister ribozima. Ova mutacija A6G je potpuno ukinula supresiju GFP ekspresije, dok je tvister ribozim divljeg tipa izazvao smanjenje od 44 puta, kao što je prikazano na slici 1b. Ovi rezultati ukazuju na to da se u ćelijama sisara tvister ribozimi samodegraduju kada su prisutni u RNK ciljnog gena i time suprimiraju ekspresiju ciljnog gena.
PRIMER 2
Modifikacija sekvence P1 drške tvister ribozima poboljšava degradacionu aktivnost tvister ribozima
Eksperimentalne procedure:
[0093] Plazmidni konstrukti: Sledeći prajmeri su korišćeni za generisanje konstrukata GFP_wasp_No Sac 0HP ili GFP_wasp_No Sac 3HP: uzvodni prajmeri NoSac_Fwd (5' GCTGTACAAGTAAACTTGTAATGCGGCCGTGTAAATAATTTAC) i NoSac3HP_Fwd (5' AGCTGTACAAGTAAACGCCTTGTAATGCGGCCGTGTAAATAATTTAC) i reverzni prajmer Mfel Rev (5' ACAACAACAATTGCATTCATTTTATG). GFP_wasp-twister vektor je korišćen kao šablon i fragmenti DNK amplifikovani PCR tehnikom su digerirani sa BsrGI i Mfel i klonirani u pEGFP-C1 digeriran sa BsrGI i Mfel enzimima. EGFP gen u pEGFP-C1 zamenjen je genom luciferaze svica kako bi se generisao pFLuc vektor pomoću Gibsonove strategije kloniranja i kompleta za kloniranje (NEB). Ista strategija je korišćena za generisanje konstrukta Luc_wasp_No Sac 0HP i Luc_wasp_No Sac 3 HP zamenom egFP gena u konstruktima GFP_wasp_no Sac 0HP i GFP_wasp_no Sac 3HP sa genom luciferaze svica.
[0094] Merenje intenziteta GFP fluorescencije obavljeno je kao što je opisano u primeru 1.
[0095] Test sa luciferazom svica na gajenim ćelijama: 24 sata nakon zamene medijuma, ploče su uklonjene iz inkubatora, ekvilibrisane na RT tokom nekoliko minuta na laboratorijskom benču, i zatim aspirirane. Dodat je pufer Glo-lysis (Promega, 100 μL, RT) i ploče su ostavljene na RT najmanje 5 minuta. Sadržaj bunarčića je promešan trituracijom u 50 μL, i 20 μL svakog uzorka je pomešano sa 20 μL bright-glo reagensa (Promega) koji je bio razblažen na 10% u glo-lysis puferu. 96 bunarčića je bilo razmaknuto na neprozirnoj beloj ploči sa 384 bunarčića. Posle petominutne inkubacije na RT, luminescencija je izmerena pomoću Tecan instrumenta sa vremenom očitavanja od 500 mSec. Aktivnost luciferaze je izražena kao srednja relativna svetlosna jedinica (RLU)±S.D.
Rezultati:
[0096] Da bi se dodatno poboljšala aktivnost degradacije tvister ribozima u ćelijama sisara, i time povećao dinamički opseg suprimiranja ekspresije ciljnog gena od strane ribozima, sekvence pored P1 drške tvistera su modifikovane u GFP-tvister konstruktu. Prvo je deletirana SacII sekvenca koja se nalazi na 5' kraju tvister sekvence, čime je generisan GFP_wosp_no Sac 0HP. Da bi se utvrdilo da li bi duža P1 drška mogla da stabilizuje tvister ribozim i na taj način poboljša njegovu aktivnost degradacije, sekvenca SacII mesta zamenjena je sa CGC kako bi bila kreirana drška od 3 bazna para (3HP) u osnovi P1 drške tvister ribozima (sl. 2a), čime je generisan konstrukt GFP_wosp_no Sac 3HP. Zanimljivo, kao što je prikazano na sl.
2b, delecija SacII sekvence povećala je supresiju GFP, od 37 puta, pomoću konstrukta sa SacII sekvencom, do 68 puta, pomoću konstrukta GFP_wasp_no Sac 0HP bez SacII mesta, sugerišući da SacII sekvenca susedna 5' kraju P1 sekvence narušava aktivnost ribozima. Dodavanje drške od 3 bp u osnovi P1 drške dodatno je pojačalo aktivnost ribozima, generišući supresiju GFP ekspresije od 104 puta. Aktivnost ovog modifikovanog tvister konstrukta je takođe testirana pomoću gena za luciferazu svica kao reporter gena. Kao što je prikazano na sl. 2c, delecija SacII sekvence rezultirala je smanjenjem aktivnosti luciferaze od 101 put u poređenju sa pFLuc kontrolnim konstruktima. Dodavanje drške od 3bp na P1 dršku dodatno je povećalo smanjenje aktivnosti luciferaze na 254 puta u poređenju sa kontrolnim konstruktom.
PRIMER 3
Upotreba xpt-guaninskog aptamera za regulisanje ekspresije ciljnog gena putem modulacije tvister ribozima
Eksperimentalne procedure:
[0097] Oligotidi koji sadrže sekvencu tvister ribozima povezanu sa xpt-guaninskim aptamerom su sintetisani (IDT) i klonirani u pLuc vektor koristeći Gibsonovu strategiju kloniranja i komplet (NEB). Sekvence konstrukta su verifikovane DNK sekvenciranjem (Genewiz).
[0098] Transfekcija i tretman ligandom aptamera: HEK 293 ćelije su transfektovane kao što je opisano u primeru 1. Četiri sata posle transfekcije, medijumi su aspirirani, a dodati su novi medijumi sa ili bez 500 μM guanina ili 1 mM guanozina (Sigma). Test sa luciferazom je izveden 20 do 24 sata nakon tretmana guaninom ili guanozinom kao što je opisano u primeru 2. Smanjenje je izraženo kao količnik aktivnosti luciferaze dobijene u odsustvu liganda aptamera podeljeno sa vrednošću dobijenom u prisustvu liganda aptamera.
[0099] ELISA test za merenje mišjeg Epo u medijumima za gajenje: Supernatant je sakupljen18 sati nakon tretmana lekom i ELISA je izvedena pomoću ELISA kompleta (R&D) u skladu sa uputstvima proizvođača. Podaci su analizirani pomoću 4-parametarskog fitovanja krive.
Rezultati:
[0100] Kako bi se regulisala degradujuća aktivnost tvister ribozima, i time regulisala ekspresija ciljnog gena, aptamerska sekvenca je povezana sa P3 drškom tvister ribozima. Kada ligand aptamera nije prisutan, struktura ribozima je poremećena, sprečava degradaciju i omogućava ekspresiju ciljnog gena (sl. 3a, gornji panel). Dodavanje liganda aptamera dovodi do konformacione promene koja omogućava degradaciju tvister ribozima i smanjuje ekspresiju ciljnog gena (sl. 3a, donji panel). P1 drška xpt-guaninskog aptamera je presađena u P3 dršku tvister ribozim da bi se generisao tvister ribozim responsivan na guanin. U ovoj konfiguraciji (sl. 3a), u odsustvu liganda aptamera, insercija sekvence aptamera između dva kraka P3 drške tvostera remeti P3 dršku i strukturu tvister ribozima, tako što remeti aktivnost degradacije i omogućava da se ciljni gen eksprimira. U prisustvu liganda aptamera, aptamer/ligand vezivanje spaja krake drške, olakšavajući formiranje P3 drške i aktivnost degradacije tvistera, čime se suprimira ekspresija ciljnog gena.
[0101] Pored toga, pretpostavili smo da ako je drška koja povezuje aptamer i tvister predugačka, formiranje drške može da bude nezavisno od postojanja sekvence aptamera i dešava se u odsustvu liganda aptamera. Međutim, ako je drška prekratka, čak i u prisustvu liganda aptamera, stabilna struktura drške možda neće biti postignuta. Stoga, da bi se utvrdila optimalna dužina drške (da bi se postigla optimalna odziv na ligand aptamera), optimizovana je dužina drške koja povezuje aptamer i ribozim. Napravili smo serijska skraćenja drške, generišući ukupno 20 konstrukta sa dužinom drške koja se kreće od 17 do 1 bp. Kao što je prikazano na sl. 3b, od svih 20 konstrukta konstruisanih, Luci-waspGua16 koji ima 3 bp drške koja povezuje guanski aptamer direktno sa tvister petljom 2, pokazao je najveće smanjenje ekspresije gena za luciferazu (15 puta). Konstrukti sa dužinom drške kraćom od 3 bp ili duže od 7 bp nisu pokazale značajno smanjenje usled tretmana guaninom.
[0102] Konstrukt Luci-waspGua16 je potom validiran u posebnom eksperimentu, u koji je uključen kontrolni konstrukt koji sadrži mutant koji nije sposoban za degradaciju. Kao što je prikazano na sl. 3c, nakon tretmana guaninom, Luci-waspGua16 je generisao 92% (12 puta) smanjenje aktivnosti luciferaze u poređenju sa aktivnošću luciferaze kada nije dodat guanin.
Nasuprot tome, ni pLuc ni Luci-mutwaspGua16 konstrukti nisu pokazali bilo kakvo smanjenje aktivnosti luciferaze nakon tretmana guaninom. Ovi rezultati ukazuju na to da je nakon ligand aptamera tretmana obnovljena aktivnost tvister ribozima, što je dovelo do smanjene proizvodnje ekspresije ciljnog gena. Kada je guanozin korišćen na 1 mM kao ligand aptamera, konstrukt Luci-waspG16 je doveo do smanjenja ekspresije luciferaze od 25 puta (sl.3d).
[0103] Kada je waspGua16 inseriran u 3' UTR gena mišjeg eritropoetina (Epo) nakon tretmana guaninom, proizvodnja Epo je smanjena približno 30% u poređenju sa Epo proizvedenim iz kontrolnih ćelija tretiranih rastvaračima. Naši rezultati pokazuju da smo generisali guanin/guanozin responsivni tvister ribozim, sintetički tvister riboprekidač koji suprimira ekspresiju ciljnog gena kao odgovor na tretman ligandom aptamera.
PRIMER 4
Upotreba teofilinskog aptamera za regulisanje ekspresije ciljnog gena putem modulacije tvister ribozima
Eksperimentalna procedura:
[0104] Oligotidi koji sadrže sekvencu tvister ribozima povezanu za teofilinskim aptamerom sintetisani su (IDT) i klonirani u pLuc vektor koristeći Gibsonovu strategiju kloniranja i komplet (NEB). Sekvence konstrukta su verifikovane DNK sekvenciranjem (Genewiz).
[0105] Transfekcija i test sa luciferazom svica: HEK 293 ćelije su transfektovane kao što je opisano u primeru 1. Četiri sata posle transfekcije, medijumi su aspirirani i dodati su i novi medijumi sa ili bez 2 mM teofilina (Sigma). Test sa luciferazom je izveden 20 do 24 sata nakon tretmana teofilinom, kao što je opisano u primeru 2. Smanjenje je izraženo kao količnik aktivnosti luciferaze dobijene u odsustvu liganda aptamera podeljenog vrednošću dobijenom u prisustvu liganda aptamera.
Rezultati:
[0106] Testirali smo upotrebu dodatnog aptamera u moduliranju degradacije tvister ribozimom, čime se reguliše ekspresiju ciljnog gena. Na osnovu 20 Luci-waspGua konstrukta (1-20) kao što je opisano u primeru primeru 3, u povezivanju teofilinskog aptamera sa petljom 2 tvister ribozim je korišćena dodatna sekvenca drške od 3 ili 4 bp . Pored toga, sekvenca drški je varirala kao što je prikazano na sl. 4a. Kao što je prikazano na sl. 4b, tretman teofilinom je rezultirao smanjenjem aktivnosti luciferaze u svim konstruktima u poređenju sa uzorcima bez tretmana teofilinom. Konstrukt twister_theo_3 je imao smanjenje ekspresije gena za 62% nakon tretmana teofilinom. Ovi podaci pokazuju da smo generisali tvister ribozim responsivan na teofilin - sintetički tvister riboprekidač.
[0107] Kalemljenje teofilinskog aptamera i sekvenci drške na sekvencu petlje 2 u tvisteru izazvalo je drugačiji efekat na poremećaj aktivnosti tvister ribozima, kao što je demonstrirano na sl. 4b u odsustvu tretmana teofilinom. Konstrukt twister_theo_3 pokazao je najintenzivniji poremećaj aktivnosti ribozima, a otuda i najrobustniju aktivnost luciferaze, u odsustvu liganda aptamera. Razlika između twister_theo_2 i twister_theo_3 je dužina drške koja povezuje aptamer i tvister, što dovodi do razlike u poremećaju aktivnosti ribozima. Prilikom poređenja twister_theo_1, 3 i 4 koji svi imaju istu dužinu drške (3 bp), razlika počiva u sastavu drške. Ovi rezultati ukazuju na to da sastav sekvence drške takođe ima uticaja na aktivnost ribozima. Stoga ribozim responsivan na ligand aptamera može da se ostvari optimizacijom dužine i sastava sekvence efektorskog regiona drške koja povezuje aptamer i tvister ribozim.
PRIMER 5
Samodegradujući ribozimi suprimiraju ekspresiju ciljnog gena kada se postave nizvodno od translacionog start kodona.
Eksperimentalne procedure:
[0108] Plazmidni konstrukti: Sintetska dsDNA (IDT) i standardne tehnike restrikcionog kloniranja su korišćene kako bi se test sekvence uvele u prethodno kreirani vektor pHDM.2b-LacZ (raspored: CMV promotor - intron - LacZ - polyA). Svi konstrukti su verifikovani DNK sekvenciranjem.
[0109] Transfekcija: HEK293 ćelije (ATCC CRL-1573; uzgajane u DMEM-u, 10% FBS, 37°C, 10% CO2) su bile obložene u 96-dobro ravnim donjim pločama (100 μL) dan pre
4
transfektije, tako da je ušće bilo oko 70% u vreme transfektije. Plazmidna DNK (500 ng) je dodata u epruvetu ili u ploču sa 96 bunarčića sa dnom u obliku slova U. Nezavisno je TransIT-293 reagens (Mirus; 1,4 μl) je dodat u 50 μl Optimem I medijuma (Life Technologies) i ostavljen 5 minuta na sobnoj temperaturi ("RT"). Zatim je 50 μl ovog razblaženog reagensa za transfekciju dodato u DNK, pomešano i inkubirano na RT 20 min. Na kraju, 7 μl ovog rastvora je dodato u bunarčić sa ćelijama u ploči sa 96 bunarčića.
[0110] Beta-galaktozidazni (LacZ) test: 24 sata nakon transfekcije, ploče su uklonjene iz inkubatora, i ekvilibrisane na RT na nekoliko minuta na laboratorijskom benču, zatim aspirirane. Dodat je pufer Glo-lysis (Promega, 100 μL, RT) i ploče su ostavljene na RT najmanje 5 minuta. Zatim je sadržaj bunarčića promešan trituracijom u 50 μL. Uzorak od 2 μ L je uzet iz svakog bunarčića i razblažen u 200 μL glo-lysis pufera (razblaženo 101 put). Razblaženja su promešana trituracijom, a onda je 20 μ L svakog razblaženja pomešano sa 20 μL beta-glo reagensa (Promega) u čvrstoj beloj ploči sa 384 bunarčića. Trideset minuta kasnije, luminescencija je merena u relativnim svetlosnim jedinicama (RLU). Korišćeno je najviše 96 bunarčića od 384, po takvoj šemi da je svaki test bunar bio okružen ili praznim bunarčićima ili ivicom ploče, kako bi se smanjile unakrsne interakcije. Sva merenja spadaju u linearni opseg testa (određen upoređivanjem različitih nerazblaženih i razblaženih uzoraka; podaci nisu prikazani).
[0111] Rezultati: Napravljeni su konstrukti u kojima je jedini upotrebljivi ATG u okviru čitanja za lacZ reporter bio uzvodno ili od ribozima sa glavom čekića ili od ribozima sa ukosnicom (prikazano u U.S: 2015/0056174, videti npr sl. 1E) i za svaki smo napravili po tri varijante tako đto smo sekvencu ribozima stavili u svaki od mogužih okvira. U svim konstruktima, ribozim je pratio linker-2A-peptid-LacZ. Verzije sa mutantnim (neaktivnim) ribozimima takođe su napravljene kao kontrole. Mutacije su uvedene u svaki ribozim da bi se uklonili potencijalni stop kodoni. Nukleotidne i proteinske sekvence su obezbeđene na sl.7a i 7b. (gornja linija u svakom slučaju je matični ribozim, koji nije potpuno translatiran; tačkice u nukleotidnoj sekvenci se koriste u značenju "isto kao i gornja linija".)
[0112] Ovi konstrukti i njihove verzije sa inaktiviranim ribozimima su transfektovani u HEK293 ćelije, i nakon 24h je merena ekspresija LacZ, kao što je prikazano na sl. 7c. Rezultati ribozima sa glavom čekića (HH) prikazani su sa leve strane na sl. 7c. Postavljanje HH ribozima u 5' UTR dalo je smanjenje ekspresije od 162 puta u poređenju sa neaktivnim mutantnim ribozimom. Međutim, potpuna translacija (okvir 2, strelica) dala je mnogo bolje smanjenje ekspresije od 513 puta. Okvir 1 ne funkcioniše, što je očekivano zbog stop kodona u okviru u sekvenci ribozima koji nisu mogli da se uklone. Ribozimi sa ukosnicom (HP) su prikazani sa desne strane na sl.7c. Postavljanje HP ribozima u 5' UTR dalo je 133 puta, ali je prevod u okviru 1 rezultirao smanjenjem ekspresije od 502 puta (strelica). I drugi okviri su bili funkcionalni. Napravili smo nove ribozimske konstrukte koji pokazuju superiornu sposobnost kontrole gena u poređenju sa objavljenim radovima. Ovde su opisani konstrukti za ekspresiju gena kod kojih se ribozim nalazi, ne u UTR, nego posle start kodona. Kontrola ekspresije ciljnog gena može se značajno poboljšati postavljanjem ribozima 3' od translacionog start kodona u poređenju sa postavljanjem ribozima u 5' UTR. Kada se ribozim postavi nizvodno od starta translacije, samodegradacija uklanja start kodon od ostatka iRNK ciljnog gena, što rezultira smanjenim rezidualnim osnovnim nivoom ekspresije.
PRIMER 6
[0113] Guanin-responsivni tvister riboprekidač funkcioniše nizvodno od translacionog start kodona.
Eksperimentalne procedure:
[0114] Oligotidi koji sadrže ili start kodon ili kodirajuću sekvencu za prvih 10 aminokiselina GFP i waspGua16 praćeni linker2A sekvencom su sintetisani (IDT) i klonirani u pLuc vektor koristeći Gibsonovu strategiju kloniranja i kompleta za kloniranje (NEB). Transfekcija i test sa luciferazom na gajenim ćelijama izvedeni su kao što je opisano u primeru 3.
Rezultati:
[0115] Da bismo testirali prenosivost tvister ribozima responsivnog na ligand aptamera, postavili smo waspGua16 sekvencu nizvodno od bilo (i) translacionog start kodona gena za luciferazu ili (ii) kodirajuće sekvence za prvih 10 aa GFP proteina, kao što je ilustrovano na sl. 5a. Fuzionisanje sekvence tvister riboprekidača sa nizvodnim ciljnim genom kreira N-terminalni marker kada je proizvod ciljnog gena eksprimiran, što potencijalno može uticati na funkciju proteina. Da bi se uklonio ovaj N-terminalni marker, inserirana je linker2A sekvenca između tvister riboprekidača i nizvodne sekvence ciljnog gena. Kao što je prikazano na sl.5b, insercija polinukleotidne kasete tvister riboprekidača nije narušilo gensku ekspresiju luciferaze u odsustvu liganda aptamera, guanina, što ukazuje na poremećenu aktivnost ribozima. Međutim, u prisustvu guanina, genska ekspresija luciferaze je smanjena za 68% netretirane kontrole i za ATG_waspGua16 i za 10aa_waspGua16 konstrukte, dok kontrolni konstrukti koji sadrže mutiranu tvister sekvencu nisu pokazali smanjenje ekspresije luciferaze kao odgovor na tretman guaninom. Ovaj rezultat pokazuje da je smanjenje ekspresije ciljnog gena sa polinukleotidnom kasetom koja sadrži funkcionalne tvister riboprekidače posledica obnavljanja aktivnosti tvister ribozima zahvaljujući aptamer/ligand vezivanju. Naši rezultati ukazuju na to da tvister riboprekidač funkcioniše nizvodno od start kodona u kodirajućoj sekvenci, što pokazuje prenosivost polinukleotidne kasete koja sadrži sintetički tvister riboprekidač.
PRIMER 7
Upotreba guaninskog aptamera za generisanje guanin-responsivnog tvister riboprekidača za UKLJUČIVANJE
Eksperimentalne procedure:
[0116] Plazmidni konstrukti: Oligotidi koji sadrže linkerske sekvence aptamera sa P1 drškom tvister ribozima, sintetisani su (IDT) i klonirani u pLuc vektor koristeći strategiju i komplet za kloniranje (NEB) prema Gibsonu.
[0117] Transfekcija je obavljena kao što je opisano u primeru 1, a test sa luciferazom svica je izveden kao što je opisano u primeru 3.
Rezultati:
[0118] Tvister riboprekidači opisani u primerima 3 i 4 suprimiraju ekspresiju ciljnog gena kao odgovor na tretman ligandom aptamera, i predstavljaju, dakle, tvister riboprekidače ZA ISKLJUČIVANJE. Ovde je upotrebljena drugačija strategija za povezivanje sekvence aptamera sa tvister ribozimom, generisanjem tvister riboprekidača ZA UKLJUČIVANJE koji indukuje ekspresiju ciljnog gena prilikom tretmana ligandom aptamera. Kao što je prikazano na sl. 6a, 3' kraj P1 drške tvistera (uključujući dodatnu dršku od 3 bp) se nalazi pored
4
sekvence aptamera. U ovoj konfiguraciji, matična sekvenca je zajednička za P1 dršku tvistera i P1 dršku aptamera, tako da zajednička sekvenca može da formira ili P1 dršku tvistera ili P1 dršku aptamera. U odsustvu liganda aptamera (gornji panel), aptamer sekvenca pored tvister P1 drške ne remeti strukturu tvistera i njena aktivnost degradacije ribozima ostaje netaknuta, što dovodi do degradacije iRNK i inhibicije ekspresije ciljnog gena. U prisustvu liganda aptamera (donji panel), aptamer vezan za ligand formira P1 dršku aptamera sa zajedničkom sekvencom iz P1 drške tvistera koja time remeti formiranje P1 drške tvistera, i remeti njegovu ribozimsku aktivnost i povećava ekspresiju ciljnog gena. Kao što je opisano u primerima 3 i 4, dužina P1 drške aptamera je važna za njegovu regulatornu funkciju u kontekstu riboprekidača. Ako je drške previše dugačka, formiranje P1 aptamera postaje nezavisno od liganda aptamera, što dovodi do ekspresije ciljnog gena koja ne može da se reguliše. Pored toga, pretpostavili smo da će i dužina zajedničke sekvence biti takođe važna. Ako je sekvenca zajedničke drške prekratka, formiranje P1 drške aptamera možda neće uticati na tvister ribozim.
[0119] Kreirani su tvister riboprekidači ZA UKLJUČIVANJE kod kojih je bilo 6, bilo 7 nt sekvence P1 drške tvistera zajedničko sa P1 drškom aptamera. Sa zajedničkim sekvencama drške od 6 ili 7 nt, aptamer formira P1 dršku od 8 ili 9 bp. Xpt-guaninski aptamer je povezan sa 5' ili 3' krakom sekvence P1 drške tvistera, generišući GT8 ili TG8 i TG9 konstrukte. Povezivanje guaninskog aptamera sa 5' krakom P1 drške tvistera (konstrukt GT8) obezbedilo je indukciju aktivnosti luciferaze od 1,4 puta nakon tretmana guanozinom, kao što je prikazano na sl. 6b, na levom panelu. Međutim, kada je aptamer bio povezan sa 3' krajem P1 drške tvistera kao što je ilustrovano na sl. 6a, bazalni nivo aktivnosti luciferaze je smanjen na 0,7% kontrolnog vektora koji ne sadrži tvister/aptamer sekvence u 3' UTR. Nakon tretmana guanozinom, aktivnost luciferaze je izazvana generisanjem 8,6 puta i 9,2 puta indukcijom od konstrukta TG8 i TG9, odnosno, kao što je prikazano na sl. 6b (srednji i desni paneli). Nizak osnovni nivo ekspresije luciferaze iz konstrukta TG8 i TG9 ukazuje na to da povezivanje aptamera sa 3' krajem P1 drške nije poremetilo aktivnost ribozima, a nakon aptamer/ligand vezivanja, aktivnost tvister ribozima je oštećena, što je dovelo do povećanja ekspresije ciljnog gena. Ovi rezultati pokazuju da smo generisali nove riboprekidače ZA UKLJUČIVANJE koji indukuju ekspresiju ciljnog gena kao odgovor na tretman ligandom aptamera.

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Polinukleotidna kaseta za regulaciju ekspresije ciljnog gena, koja sadrži riboprekidač koji sadrži tvister ribozim povezan pomoću drške sa aptamerom, pri čemu se drška koja povezuje tvister ribozim sa aptamerom kači na ribozim na mestu P3 drške tvister ribozima i pri čemu je ciljni gen povezan sa P1 drškom tvister ribozima, gde polinukleotidna kaseta, kada je inkorporirana u ciljni gen, inhibira ekspresiju ciljnog gena u prisustvu liganda aptamera.
2. Polinukleotidna kaseta prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što se aptamer vezuje za malomolekulski ligand.
3. Polinukleotidna kaseta prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što tvister ribozim (a) je iz Nasonia vitripennis;
(b) sadrži SEQ ID NO.:38; ili
(c) sadrži SEQ ID NO.:39.
4. Polinukleotidna kaseta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koja sadrži sekvencu koja produžava P1 dršku tvister ribozima za 1 do 3 bazna para.
5. Polinukleotidna kaseta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što (a) P1 drška tvister ribozima ima 4 do 7 baznih parova;
(b) drška koja povezuje ribozim sa aptamerom sadrži sekvencu iz P3 drške ribozima i/ili sekvencu iz P1 drške aptamera; i/ili
(c) drška koja povezuje ribozim sa aptamerom ima 3 do 7 baznih parova.
6. Polinukleotidna kaseta za regulaciju ekspresije ciljnog gena koja sadrži riboprekidač koji sadrži tvister ribozim povezan sa aptamerom, gde P1 drška tvister ribozima i P1 drška aptamera sadrže alternativni zajednički krak drške, gde je aptamer povezan sa 3' ili 5' krajem P1 drške tvister ribozima, pri čemu, kada je aptamer povezan sa 3' krajem P1 drške tvister ribozima, deo 3' kraka P1 drške tvister ribozima je alternativno 5' krak P1 drške aptamera, a kada je aptamer povezan sa 5' krajem P1 drške tvister ribozima, deo 5' kraka P1 drške tvister ribozima je alternativno 3' krak P1 drške aptamera, pri čemu polinukleotidna kaseta, kada je inkorporirana u ciljni gen, povećava ekspresiju ciljnog gena u prisustvu liganda aptamera.
4
7. Polinukleotidna kaseta prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što se aptamer vezuje za malomolekulski ligand.
8. Polinukleotidna kaseta prema patentnom zahtevu 6 ili patentnom zahtevu 7, pri čemu, tvister ribozim
(a) je iz Nasonia vitripennis;
(b) sadrži SEQ ID NO.:38; ili
(c) sadrži SEQ ID NO.:39.
9. Polinukleotidna kaseta prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8, naznačena time što deo kraka P1 drške tvister ribozima koja je alternativno krak P1 drške aptamera ima 5 do 8 nukleotida.
10. Polinukleotidna kaseta prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 9, naznačena time što (a) P1 drška tvister ribozima ima 4 do 9 baznih parova;
(b) P1 drška aptamera ima 5 do 8 baznih parova.
11. Postupak za moduliranja ekspresije ciljnog gena koji obuhvata
(a) inserciju polinukleotidne kasete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 u ciljni gen; (b) uvođenje u ćeliju ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu; i
(c) izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za smanjenje ekspresije ciljnog gena; ili
(a') inserciju polinukleotidne kasete prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 10 u ciljni gen; (b') uvođenje u ćeliju ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu; i
(c') izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za povećanje ekspresije ciljnog gena
pri čemu navedeni postupak nije postupak za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom.
12. Polinukleotid za upotrebu u postupku za terapiju moduliranjem ekspresije ciljnog gena koji obuhvata
(a) inserciju polinukleotidne kasete prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 u ciljni gen; (b) uvođenje u ćeliju ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu; i
(c) izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za smanjenje ekspresije ciljnog gena
4
(a') inserciju polinukleotidne kasete prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 10 u ciljni gen; (b') uvođenje u ćeliju ciljnog gena koji sadrži polinukleotidnu kasetu; i
(c') izlaganje ćelije malomolekulskom ligandu koji se specifično vezuje za aptamer u količini koja je efikasna za povećanje ekspresije ciljnog gena
13. Postupak prema patentnom zahtevu 11 ili polinukleotidna kaseta za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što je polinukleotidna kaseta
(a) inserirana u 5' netranslatirani region ciljnog gena;
(b) inserirana u 3' netranslatirani region ciljnog gena; ili
(c) inserirana nizvodno od translacionog start kodona, opciono gde polinukleotidna kaseta sadrži 2A peptidnu sekvencu između 3' kraja riboprekidača i kodirajuće sekvence ciljnog gena.
14. Postupak prema patentnom zahtevu 11 ili 13 ili polinukleotidna kaseta za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili 13 gde su dve ili više polinukleotidnih kaseta inserirane u ciljni gen, opciono gde dve ili više polinukleotidnih kaseta sadrže (a) različite aptamere koji se specifično vezuju za različite malomolekulske ligande; ili (b) isti aptamer.
15. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 11 ili 13 do 14 ili polinukleotidna kaseta za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 14, pri čemu je ciljni gen koji sadrži polinukleotidne kasete inkorporiran u vektor za ekspresiju ciljnog gena.
16. Vektor koji sadrži ciljni gen koji sadrži polinukleotidnu kasetu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10.
17. Postupak ili polinukleotidna kaseta za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, ili vektor prema patentnom zahtevu 16, gde je vektor virusni vektor, opciono gde je virusni vektor odabran iz grupe koja se sastoji od adenovirusnog vektora, vektora virusa povezanog sa adenovirusom, i lentivirusnog vektora.
4
RS20230822A 2016-02-02 2017-02-02 Regulacija ekspresije gena putem aptamerima posredovane kontrole samodegradujućih ribozima RS64585B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662290209P 2016-02-02 2016-02-02
US201662290187P 2016-02-02 2016-02-02
PCT/US2017/016303 WO2017136608A2 (en) 2016-02-02 2017-02-02 Regulation of gene expression via aptamer-mediated control of self-cleaving ribozymes
EP17748194.2A EP3411506B1 (en) 2016-02-02 2017-02-02 Regulation of gene expression via aptamer-mediated control of self-cleaving ribozymes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64585B1 true RS64585B1 (sr) 2023-10-31

Family

ID=59500184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230822A RS64585B1 (sr) 2016-02-02 2017-02-02 Regulacija ekspresije gena putem aptamerima posredovane kontrole samodegradujućih ribozima

Country Status (24)

Country Link
US (2) US11512310B2 (sr)
EP (1) EP3411506B1 (sr)
JP (1) JP7222715B2 (sr)
KR (1) KR20180118650A (sr)
CN (1) CN109476697B (sr)
AU (1) AU2017213845B2 (sr)
CA (1) CA3048625A1 (sr)
DK (1) DK3411506T3 (sr)
ES (1) ES2954929T3 (sr)
FI (1) FI3411506T3 (sr)
HR (1) HRP20231119T1 (sr)
HU (1) HUE063465T2 (sr)
IL (1) IL260842B2 (sr)
LT (1) LT3411506T (sr)
MX (1) MX2018009369A (sr)
MY (1) MY198399A (sr)
PH (1) PH12018501651A1 (sr)
PL (1) PL3411506T3 (sr)
PT (1) PT3411506T (sr)
RS (1) RS64585B1 (sr)
SG (1) SG11201806589UA (sr)
SI (1) SI3411506T1 (sr)
SM (1) SMT202300302T1 (sr)
WO (1) WO2017136608A2 (sr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3589734A4 (en) * 2017-03-02 2020-12-23 Meiragtx UK II Limited REGULATION OF GENE EXPRESSION BY CLIVING BY RNASE P MODULATED BY APTAMER
KR102879552B1 (ko) 2020-03-24 2025-11-10 메이라지티엑스 진 레귤레이션 리미티드 티아민 유사체 및 유도체를 결합하는 압타머
EP4274802A4 (en) * 2021-01-05 2024-10-30 University of Washington MODULAR KINETICALLY CONTROLLED FUNCTIONAL RNA CONSTRUCTS AND RELATED COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS
EP4247946A4 (en) * 2021-01-11 2025-03-26 The Regents of The University of California Ribozyme-activated RNA constructs and uses thereof
CN118434758A (zh) 2021-12-15 2024-08-02 梅里特斯英国第二有限公司 肠肽的多顺反子表达
JP2024546954A (ja) * 2021-12-15 2024-12-26 メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド アプタマー及び小分子リガンド
CN114908095B (zh) * 2022-06-09 2025-01-14 南开大学 一种基于核酶的靶向抑制靶标rna的方法和应用
AU2024305450A1 (en) 2023-06-14 2026-01-22 MeiraGTx Gene Regulation Limited Small molecule ligands and aptamers

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050136035A1 (en) 2003-06-03 2005-06-23 Derek Ko Cell specific replication-competent viral vectors comprising a self processing peptide cleavage site
CA2545697C (en) * 2003-11-14 2016-12-20 Richard Mulligan Self-cleaving ribozymes and uses thereof
EP3260540A1 (en) * 2010-11-12 2017-12-27 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
US9222093B2 (en) 2011-06-30 2015-12-29 The University Of Hong Kong Two-way, portable riboswitch mediated gene expression control device

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017213845B2 (en) 2023-06-29
MX2018009369A (es) 2019-01-10
ES2954929T3 (es) 2023-11-27
LT3411506T (lt) 2023-09-11
US12359199B2 (en) 2025-07-15
IL260842B1 (en) 2023-03-01
PT3411506T (pt) 2023-09-12
BR112018015815A2 (pt) 2019-01-02
KR20180118650A (ko) 2018-10-31
EP3411506B1 (en) 2023-06-28
AU2017213845A1 (en) 2018-09-06
NZ745491A (en) 2025-09-26
CN109476697B (zh) 2022-08-23
PL3411506T3 (pl) 2023-11-27
CA3048625A1 (en) 2017-08-10
EP3411506A2 (en) 2018-12-12
HRP20231119T1 (hr) 2023-12-22
WO2017136608A4 (en) 2017-10-19
US20200032253A1 (en) 2020-01-30
EP3411506A4 (en) 2019-10-09
MY198399A (en) 2023-08-28
DK3411506T3 (da) 2023-09-25
IL260842B2 (en) 2023-07-01
IL260842A (sr) 2018-09-20
SG11201806589UA (en) 2018-09-27
SI3411506T1 (sl) 2023-11-30
US11512310B2 (en) 2022-11-29
PH12018501651A1 (en) 2019-06-03
US20230220382A1 (en) 2023-07-13
HUE063465T2 (hu) 2024-01-28
JP7222715B2 (ja) 2023-02-15
CN109476697A (zh) 2019-03-15
WO2017136608A2 (en) 2017-08-10
WO2017136608A3 (en) 2017-08-24
SMT202300302T1 (it) 2023-11-13
JP2019503205A (ja) 2019-02-07
FI3411506T3 (fi) 2023-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7623423B2 (ja) 選択的スプライシングのアプタマー媒介性調節による遺伝子発現の調節
US20230220382A1 (en) Regulation of gene expression via aptamer-mediated control of self-cleaving ribozymes
US20240093209A1 (en) Regulation of Gene Expression by Aptamer-Mediated Accessibility of Polyadenylation Signals
JP2019503204A (ja) アプタマーによるポリアデニル化の調節を通じての遺伝子発現制御
HK40001466B (en) Regulation of gene expression via aptamer-mediated control of self-cleaving ribozymes
HK40001466A (en) Regulation of gene expression via aptamer-mediated control of self-cleaving ribozymes
HK40059892A (en) Regulation of gene expression by aptamer-mediated modulation of alternative splicing
EA051948B1 (ru) Регуляция экспрессии генов посредством опосредованного аптамерами контроля саморасщепляющихся рибозимов
HK40020557A (en) Regulation of gene expression by aptamer-mediated accessibility of polyadenylation signals
HK40020557B (en) Regulation of gene expression by aptamer-mediated accessibility of polyadenylation signals
HK1248760B (en) Regulation of gene expression by aptamer-mediated modulation of alternative splicing