RS64602B1 - Mutanti beta vulgaris tolerantni na herbicid als inhibitor - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na biljke Beta vulgaris tolerantne na herbicide ALS inhibitore i na njihove delove koji sadrže mutaciju na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 endogenog gena acetolaktat sintaze (ALS) prikazanoj u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO:1, pri čemu gen ALS kodira polipeptid ALS koji sadrži aminokiselinu leucin na poziciji 569 polipeptida ALS, pri čemu su pomenuta biljka Beta vulgaris i njeni delovi homozigotni za mutaciju gena ALS, pri čemu je pomenuta biljka Beta vulgaris netransgena u pogledu pomenutog endogenog gena ALS, pri čemu, kodon na pomenutoj poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 je TTG, i pri čemu je biljka Beta vulgaris najmanje 100 puta manje osetljiva na inhibitor ALS.

[0002] Uzgajani oblici Beta vulgaris (kao što je definisano u Ford-Lloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta. U: Biancardi E, Campbell LG, Skaracis GN, De Biaggi M (izd) Genetics and Breeding of Sugar Beet. Science Publishers, Enfield (NH), USA, str.25-33) predstavljaju važne poljoprivredne kulture u regionima sa umerenom i suptropskom klimom. Na primer, oko 20% svetske proizvodnje šećera se zasniva na šećernoj repi. Pošto su sadnice i mlade biljke repe tokom prvih 6-8 nedelja života podložne snažnoj konkurenciji od strane brzorastućih korova, koji su u toj borbi uspešniji od mladih useva, pouzdane mere za suzbijanje korova su od presudnog značaja na površinama na kojima se gaje ovi usevi.

[0003] Već više od 40 godina herbicidi su preferirani alat za suzbijanje korova u uzgoju repe. Proizvodi koji se koriste u tu svrhu, kao što je fenmedifam, desmedifan i metamitron, omogućavaju suzbijanje rasta korova na poljima repe bez oštećenja useva. Pa ipak, u nepovoljnim uslovima okruženja postoji prostor za poboljšanje efikasnosti ovih proizvoda, naročito ako štetni korovi kao što su Chenopodium album, Amaranthus retroflexus i/ili Tripleurospermum inodorata klijaju u dužem vremenskom periodu.

[0004] Inovativni herbicidni aktivni sastojci su veoma poželjni za poboljšanje mogućnosti suzbijanja korova kod repe. Takva jedinjenja treba da deluju na širok spektar korova, poželjno od klijanja korova sve do potpunog razvoja korovskih biljaka, i da ne utiču na useve repe bez obzira na njihovu fazu razvoja. Nijedan selektivni herbicidni aktivni sastojak koji zadovoljava sve te stroge zahteve na agronomski poboljšan način nije otkriven tokom proteklih decenija koristeći klasični pristup skrininga herbicida.

[0005] Neke hemikalije inhibiraju enzim „acetohidroksi kiselinsku sintazu“ (AHAS), poznat i kao „acetolaktat sintaza“ (ALS [EC 4.1.3.18]). ALS je mesto delovanja pet strukturno različitih porodica herbicida koje pripadaju klasi herbicida ALS inhibitora, kao što su (a) sulfonilurea herbicidi (Beyer E.M et al. (1988), Sulfonylureas in Herbicides: Chemistry, Degradation, and Mode of Action; Marcel Dekker, New York, 1988, 117-189), (b) sulfonilaminokarbonil triazolinonski herbicidi (Pontzen, R., Pflanz.-Nachrichten Bayer, 2002, 55, 37-52), (c) imidazolinonski herbicidi (Shaner, D.L., et al., Plant Physiol., 1984, 76, 545-546; Shaner, D.L., i O'Connor, S.L. (izd.) The Imidazolinone Herbicides, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991), (d) triazolopirimidinski herbicidi (Kleschick, W.A. et al., Agric. Food Chem., 1992, 40, 1083-1085), i (e) pirimidinil(tio)benzoatni herbicidi (Shimizu, T.J., Pestic. Sci.,1997, 22, 245-256; Shimizu, T. et al., Acetolactate Syntehase Inhibitors in Herbicide Classes in Development, Böger, P., Wakabayashi, K., Hirai, K., (izd.), Springer Verlag, Berlin, 2002, 1-41).

[0006] ALS učestvuje u konverziji dva molekula piruvata u molekul acetolaktata i ugljen dioksid. U ovoj reakciji, tiamin pirofosfat se koristi za vezivanje dva molekula piruvata. Acetolaktat, proizvod ove reakcije, na kraju postaje valin, leucin i izoleucin (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", u Plant Amino Acids, Singh, B.K., izd., Marcel Dekker Inc. New York, New York, str.227-247).

[0007] Inhibitori ALS ometaju biosintezu valina, leucina i izoleucina kod biljaka. Posledica je trenutno iscrpljivanje zaliha odgovarajućih aminokiselina, što uzrokuje prekid biosinteze proteina što dovodi do prestanka rasta biljke, i biljka na kraju umire, ili je barem oštećena.

[0008] Herbicidi ALS inhibitori se naširoko koriste u modernoj poljoprivredi zbog njihove efikasnosti pri umerenoj stopi primene i relativne netoksičnosti po životinje. Putem inhibicije aktivnosti ALS, ove porodice herbicida sprečavaju dalji rast i razvoj podložnih biljaka, uključujući mnoge vrste korova. Kako bi se biljkama obezbedila povećana tolerancija čak i na više koncentracije herbicida ALS inhibitora koje mogu biti neophodne za adekvatno suzbijanje korova, potrebne su dodatne uzgojne linije i sorte poljoprivrednih kultura otporne na herbicide koji inhibiraju ALS, kao i postupci i kompozicije za proizvodnju i upotrebu uzgojnih linija i sorti otpornih na herbicide koji inhibiraju ALS.

[0009] Širok dijapazon herbicida ALS inhibitora zemljoradnicima omogućava da suzbiju širok raspon korovskih vrsta, bez obzira na njihovu fazu razvoja, ali ovi veoma efikasni herbicidi ne mogu da se koriste kod repe jer su konvencionalne biljke repe/komercijalne sorte repe veoma podložne ovim herbicidima ALS inhibitorima. Pa ipak, ovi herbicidi ALS inhibitori pokazuju izuzetno herbicidno dejstvo protiv širokolisnih i uskolisnih vrsta korova. Prvi herbicidi koji deluju tako da inhibiraju ALS razvijeni su za upotrebu u poljoprivredi još pre 30 godina. Danas, aktivni sastojci ove klase herbicida pokazuju snažno suzbijanje korova i naširoko se koriste kod kukuruza i žitarica, kao i kod dikotiledonskih useva, osim repe.

[0010] Jedini herbicid ALS inhibitor za koji je danas poznato da se primenjuje u šemama primene nakon nicanja repe je Debut<®>. Repa razgrađuje ovaj herbicid (koji sadrži triflusulfuron-metil kao aktivni sastojak i specifična jedinjenja za formulaciju) pre nego što uspe da inhibira endogeni ALS enzim repe, ali on ima velike propuste u suzbijanju korova na površinama na kojima se gaji repa.

[0011] Otkako su herbicidi ALS inhibitori uvedeni u poljoprivredu, uočeno je da podložne biljne vrste, uključujući korove koji se javljaju u prirodi, povremenu spontano razviju otpornost na ovu klasu herbicida. Supstitucije pojedinačnog baznog para na specifičnim mestima u genu ALS obično dovode do varijanti ALS enzima koje su više ili manje rezistentne, i pokazuju različite nivoe inhibicije putem herbicida ALS inhibitora.

[0012] Biljke koje imaju mutantne ALS alele stoga pokazuju različite nivoe otpornosti na herbicide ALS inhibitore, u zavisnosti od hemijske strukture herbicida ALS inhibitora i mesta tačkaste mutacije u genu ALS.

[0013] Na primer, Hattori et al. (1995), Mol. Gen. Genet.246: 419-425, opisuju jednu mutaciju u Trp 557 kodonu u ćelijskoj liniji Brassica napus (u skladu sa numeracijom sekvence Arabidopsis thaliana koja se u literaturi koristi za poređenje svih ALS/AHAS mutanata ovo se odnosi na poziciju „574“), što odgovara poziciji 569 sekvence ALS repe. Ovi autori su uočili rezistenciju na nekoliko članova potklasa herbicida ALS inhibitora, kao što su sulfoniluree, imidazolinoni i triazolopirimidini.

[0014] Opisani su mutanti repe koji imaju tačkastu mutaciju u Ala 122 kodonu koja dovodi do određene otpornosti na potklasu imidazolinona herbicida ALS inhibitora (WO 98/02526), ali ona nije dovoljna za suzbijanje korova u šemama poljoprivredne primene. Nije opisana unakrsna otpornost na druge klase herbicida ALS inhibitora kada se koristi ovaj mutant.

Nadalje, biljke repe koje imaju drugu tačkastu mutaciju u Pro 197 kodonu pokazale su umerenu otpornost na herbicide ALS inhibitore koji su članovi potklase sulfonilurea herbicida. Opisani su i dvostruki mutanti ova dva (WO 98/02527). Međutim, nijedan od ovih mutanata nije korišćen za komercijalno uvođenje sorti repe jer nivo herbicidne tolerancije na herbicide ALS inhibitore kod ovih mutanata nije bio dovoljno veliki da se iskoristi u agronomiji.

[0015] Stougaard et al. (1990), J. Cell Biochem., Suppl. 14E, 310 opisuju izolaciju ALS mutanata u ćelijskoj kulturi tetraploidne šećerne repe. Izolovana su dva različita gena ALS (ALS I i ALS II) koja su se razlikovala samo na aminokiselinskoj poziciji 37. Mutant 1 je u svom genu ALS I sadržao 2 mutacije, dok je mutant 2 sadržao 3 mutacije u svom genu ALS II. Nakon što su mutacije razdvojene da bi se utvrdilo koja mutacija bi obezbedila rezistenciju na inhibitor ALS, otkriveno je da je ALS sintetisan od rekombinantne E. coli bio rezistentan na herbicid ako je sadržao tačkastu mutaciju u Trp 574 kodonu (u skladu sa numeracijom sekvence Arabidopsis thaliana koja se u literaturi koristi za poređenje svih ALS mutanata), što odgovara poziciji 569 ALS sekvence repe, koja dovodi do zamene aminokiseline „Trp“ aminokiselinom „Leu“. Stougaard et al kod šećerne repe nisu pokazali da je mutacija na poziciji 569 bilo kog gena ALS šećerne repe dovoljna da se ostvari prihvatljiv nivo tolerancije na herbicide ALS inhibitore. Štaviše, Stougaard et al nisu regenerisali niti koristili biljke šećerne repe koje sadrže mutaciju, uključujući mutaciju Trp -> Leu na poziciji 569 ALS šećerne repe.

[0016] Znajući to, Stougaard et al. su konstruisali vektore transformacije biljke koji su sadržali različite gene ALS za upotrebu u transformaciji biljke. Međutim, dalji podaci, posebno oni koji se odnose na efekte primene herbicida ALS inhibitora na biljke i/ili poljoprivredne površine koje sadrže ovu mutaciju u biljkama Beta vulgaris, do danas nisu otkriveni od strane ovih ili drugih autora, bilo kod genetski konstruisanih ili mutantnih biljaka, više od 20 godina nakon toga.

[0017] WO 99/57965 generalno opisuje biljke šećerne repe rezistentne na sulfonilureu i postupke za njihovo dobijanje putem EMS (etilmetansulfonat) mutageneze. Međutim, osim istraživanja koje je potrebno da se takvi mutanti dobiju, ova publikacija ne obezbeđuje takve biljke, niti opisuje bilo koju specifičnu lokaciju u genu ALS koja može biti relevantna za dobijanje mutanata tolerantnih na herbicide ALS inhibitore, niti otkriva bilo koju povezanu poljoprivrednu upotrebu za njih. Nadalje, postoji velika verovatnoća da, usled korišćenja tako jakog mutagenog jedinjenja kao što je EMS, brojne dalje mutacije mogu da se jave na drugim mestima u genomu, što može imati nepovoljna dejstva, uključujući čak i neplodnost i/ili usporen rast biljaka koje su tako dobijene. Štaviše, usled hemijske interakcije sa DNK, primena EMS može imati propuste u indukciji određenih mutacija, kao što je konverzija tripleta TGG u TTG, pošto EMS uvek konvertuje guanozin u adenozin.

[0018] Kod nekih vrsta korova kao što je Amaranthus, mutacija Trp 574 Leu može da se otkrije kod populacija biljaka koje su u više navrata izlagane herbicidima ALS inhibitorima. Ovi mutanti Trp 574 Leu pokazuju visok nivo tolerancije na nekoliko hemijskih klasa herbicida ALS inhibitora, kao što su oni izabrani iz grupe koja se sastoji od sulfonilurea i sulfonilaminokarbonil triazolinona.

[0019] WO 2008/124495 otkriva dvostruke i trostruke mutante ALS. U skladu sa WO 2009/046334, obezbeđene su specifične mutacije u genu ALS. Međutim, još nisu dobijeni mutanti Beta vulgaris tolerantni na herbicide koji sadrže takve mutacije prema WO 2009/046334 koji mogu da se iskoriste u poljoprivredi.

[0020] Štaviše, imajući u vidu činjenicu da, na primer, šećerna repa čini oko 20% svetske proizvodnje šećera, takođe bi bilo veoma poželjno da su dostupne biljke šećerne repe koje imaju prednost u rastu u odnosu na veoma potentne korove. Dakle, bilo bi veoma poželjno da postoje, u pogledu gena ALS, netransgene biljke Beta vulgaris, uključujući biljke šećerne repe, koje su tolerantne na herbicide ALS inhibitore. Stoga, postoji potreba za takvim netransgenim biljkama Beta vulgaris, naročito biljkama šećerne repe koje su tolerantne na herbicide ALS inhibitore pri nivou herbicida ALS inhibitora koji može da se koristi u poljoprivredi.

[0021] Dakle, tehnički problem je ispunjenje ove potrebe.

[0022] Predmetni pronalazak rešava ovu potrebu i kao rešenje tehničkog problema obezbeđuje biljku Beta vulgaris tolerantnu na herbicide ALS inhibitore i njene delove koji sadrže mutaciju na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 endogenog gena acetolaktat sintaze (ALS) prikazanoj u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO:1, pri čemu gen ALS kodira polipeptid ALS koji sadrži aminokiselinu leucin na poziciji 569 polipeptida ALS, pri čemu su pomenuta biljka Beta vulgaris i njeni delovi homozigotni za mutaciju gena ALS, pri čemu je pomenuta biljka Beta vulgaris netransgena u pogledu pomenutog endogenog gena ALS, pri čemu, kodon na pomenutoj poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 je TTG, i pri čemu je biljka Beta vulgaris najmanje 100 puta manje osetljiva na inhibitor ALS.

[0023] Seme prema predmetnom pronalasku je deponovano u NCIMB, Aberdeen, UK, pod brojem NCIMB 4170512. marta 2010. godine.

[0024] Primenom različitih postupaka uzgajanja, dalje mogu da se razviju komercijalne sorte sa visokim prinosom koje su veoma konkurentne na svim specifičnim tržištima uz dodatnu robusnu toleranciju na herbicide ALS inhibitore koristeći prvobitno dobijene mutantne biljke.

[0025] Treba napomenuti da, kao što se ovde koriste, oblici za jedninu uključuju upućivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na „reagens“ uključuje jedan ili više takvih različitih reagensa, a referenca na

„postupak“ uključuje referencu na ekvivalentne korake i postupke poznate osobama sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci koji mogu da se modifikuju ili da zamene postupke koji su ovde opisani.

[0026] Osim ako nije drugačije naznačeno, treba razumeti da se termin „najmanje“ koji prethodi nizu elemenata odnosi na svaki element u nizu.

[0027] U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, biće jasno da reč „uključivati“, i njene varijacije kao što je „uključuje“, „koji uključuje“, ukazuje na inkluziju navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i na isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Reč „uključivati“ i njene varijacije, s jedne strane, i „sadržati“ i tome analogne varijacije, s druge strane, mogu da se koriste naizmenično bez davanja prednosti bilo čemu od prethodnog.

[0028] Dobijene su biljke repe koje sadrže izmenjeni endogeni gen ALS (takođe se naziva gen „AHAS“), koje imaju tačkastu mutaciju u Trp 569 kodonu (u odnosu na referentnu aminokiselinsku sekvencu ALS Beta vulgaris koja je prikazana u SEQ ID NO: 2; to je jednako poziciji 574 navedene sekvence Arabidopsis thaliana koja je prikazana u SEQ ID NO: 6), i ta tačkasta mutacija je dobijena kroz nekoliko krugova selekcije za specifično izabrane herbicide ALS inhibitore.

[0029] Usled činjenice da su biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska dobijene izolovanjem spontano mutiranih biljnih ćelija, koje su direktno regenerisane u potpuno plodne biljke repe koje imaju tačkastu mutaciju kao što je ovde detaljnije opisano, ove biljke su netransgene u pogledu gena ALS.

[0030] Štaviše, same biljke iz predmetnog pronalaska su plodne, kao i njihovo potomstvo, te su tako korisne u svrhe razmnožavanja bez dalje obrade koja može izazvati dalje izmene genetske osnove uzrokovane stresom. Takve biljke dobijene u skladu sa procedurom selekcije koja je ovde primenjena mogu direktno da se koriste za dobijanje sorti i/ili hibrida repe koji imaju poljoprivredno korisne nivoe tolerancije na herbicide ALS inhibitore, čime se omogućavaju inovativne mere za suzbijanje korova na površinama na kojima se gaji repa.

[0031] Kada se ovde koristi, termin „transgeno“ znači da je gen, koji može biti gen iste ili različite vrste, uveden u biljku pomoću odgovarajućeg biološkog nosača, kao što je Agrobacterium tumefaciens, ili bilo kojim drugim fizičkim putem, kao što je transformacija protoplasta ili bombardovanje česticama, i taj gen može da se eksprimira u okruženju novog domaćina, naime genetski modifikovanom organizmu (GMO).

[0032] U skladu sa prethodnom definicijom, termin „netransgeno“ označava upravo suprotno, tj. da nije došlo do uvođenja odgovarajućeg gena putem odgovarajućeg biološkog nosača ili bilo kojim drugim fizičkim putem. Međutim, mutirani gen može da se prenese putem oprašivanja, prirodnim putem ili u procesu uzgajanja, kako bi se dobila druga netransgena biljka u pogledu ovog specifičnog gena.

[0033] „Endogeni“ gen znači gen biljke koji nije uveden u biljku tehnikama genetskog inženjeringa.

[0034] Kada se ovde koristi, termin „sekvenca“ se odnosi na sekvence nukleotida, polinukleotide, sekvence nukleinske kiseline, nukleinske kiseline, molekul nukleinske kiseline, peptide, polipeptide i proteine, u zavisnosti od konteksta u kome se koristi termin „sekvenca“.

[0035] Termini „sekvence nukleotida“, „polinukleotidi“, „sekvence nukleinskih kiselina“, „nukleinske kiseline“, „molekul nukleinske kiseline“ ovde se koriste naizmenično i odnose se na nukleotide, bilo da su to ribonukleotidi ili dezoksiribonukleotidi ili kombinacija oba, u polimernom nerazgranatom obliku bilo koje dužine. Sekvence nukleinske kiseline uključuju DNK, cDNK, genomsku DNK, RNK, sintetičke oblike i mešovite polimere, sens i antisens lance, ili mogu da sadrže neprirodne ili derivatizovane nukleotidne baze, kao što će biti jasno stručnjacima za ovu oblast.

[0036] Kada se ovde koristi, termin „polipeptid“ ili „protein“ (oba termina se ovde koriste naizmenično) znači peptid, protein ili polipeptid koji obuhvata aminokiselinske lance date dužine, pri čemu su aminokiselinski ostaci vezani pomoću kovalentnih peptidnih veza.

Međutim, takođe mogu da se koriste peptidomimetici takvih proteina/polipeptida u kojima su aminokiseline i/ili peptidne veze zamenjene funkcionalnim analozima, kao i aminokiseline koje ne spadaju u 20 aminokiselina kodiranih genom, kao što je selenocistein. Peptidi, oligopeptidi i proteini mogu da se nazivaju polipeptidi. Termin polipeptid se takođe odnosi na modifikacije polipeptida, npr. glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju i slično, i ne isključuje ih. Takve modifikacije su dobro opisane u osnovnim tekstovima i u detaljnijim monografijama, kao i u istraživačkoj literaturi. Polipeptid (ili protein) na koji se ovde poželjno misli je polipeptid ALS B. vulgaris (ili protein ALS) [SEQ ID NO: 2].

[0037] Aminokiselinske supstitucije obuhvataju aminokiselinske izmene u kojima se aminokiselina zamenjuje drugim aminokiselinskim ostatkom koji se javlja u prirodi. Takve supstitucije mogu da se klasifikuju kao „konzervativne“, kada se aminokiselinski ostatak koji je sadržan u proteinu ALS divljeg tipa zamenjuje drugom prirodnom aminokiselinom sličnog karaktera, na primer, Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln ili Phe↔Trp↔Tyr. Supstitucije takođe mogu biti „nekonzervativne“, kada se aminokiselinski ostatak koji je prisutan u proteinu ALS divljeg tipa supstituiše aminokiselinom sa različitim osobinama, kao što je prirodna aminokiselina iz druge grupe (npr. supstitucija naelektrisane ili hidrofobne aminokiseline alaninom. Termin „slične aminokiseline“, kao što se ovde koristi, odnosi se na aminokiseline koje imaju slične aminokiselinske bočne lance, tj. aminokiseline koje imaju polarne, nepolarne ili praktično neutralne bočne lance. „Aminokiseline koje nisu slične“, kao što se ovde koristi, odnosi se na aminokiseline koje imaju različite aminokiselinske bočne lance, na primer, aminokiselina sa polarnim bočnim lancem nije slična aminokiselini sa nepolarnim bočnim lancem. Polarni bočni lanci su obično prisutni na površini proteina, gde mogu da interaguju sa vodenim okruženjem koje se nalazi u ćelijama („hidrofilne“ aminokiseline). S druge strane, „nepolarne“ aminokiseline obično se nalaze u centru proteina, gde mogu da interaguju sa sličnim nepolarnim susedima

(„hidrofobne“ aminokiseline). Primeri za aminokiseline koje imaju polarne bočne lance su arginin, asparagin, aspartat, cistein, glutamin, glutamat, histidin, lizin, serin i treonin (sve hidrofilne, osim cisteina koji je hidrofoban). Primeri za aminokiseline koje imaju nepolarne bočne lance su alanin, glicin, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin i triptofan (sve hidrofobne, osim glicina koji je neutralan).

[0038] Generalno, usled njegovog opšteg znanja i konteksta u kome se koriste termini ALS, ALSL, AHAS ili AHASL, stručnjaku je jasno da li se misli na sekvencu nukleotida ili nukleinsku kiselinu, odnosno na aminokiselinsku sekvencu ili polipeptid.

[0039] Kada se ovde koristi, termin „gen“ se odnosi na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, ribonukleotida kao i dezoksiribonukleotida. Termin obuhvata dvolančanu i jednolančanu DNK i RNK. On takođe obuhvata poznate vrste modifikacija, na primer, metilovanje, „zatvaranje“, supstitucije jednog ili više prirodnih nukleotida analogom. Gen poželjno sadrži kodirajuću sekvencu koja kodira ovde definisani polipeptid. „Kodirajuća sekvenca“ je nukleotidna sekvenca koja se transkribuje u iRNK i/ili prevodi u polipeptid kada se ubacuje ili je pod kontrolom odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence su određene početnim kodonom translacije na 5'-terminusu i zaustavnim kodonom translacije na 3'-terminusu. Kodirajuća sekvenca može da uključuje, ali nije ograničena na, iRNK, cDNK, sekvence rekombinantne nukleinske kiseline ili genomsku DNK, dok introni takođe mogu biti prisutni u određenim okolnostima.

[0040] Kada se ovde koristi, termin „Beta vulgaris“ se skraćuje kao „B. vulgaris“.

[0041] Nadalje, ovde se koristi termin „repa“. Pomenuta tri termina se ovde koriste naizmenično i treba razumeti da u potpunosti obuhvataju uzgajane oblike Beta vulgaris kao što je definisano u Ford-Lloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta. U: Biancardi E, Campbell LG, Skaracis GN, De Biaggi M (izd) Genetics and Breeding of Sugar Beet. Science Publishers, Enfield (NH), USA, str.25-33. Slično tome, na primer, termin „Arabidopsis thaliana“ se skraćuje kao „A. thaliana“. Oba termina se ovde naizmenično koriste.

[0042] Kada se ovde koristi, termin „pozicija“ označava poziciju aminokiseline u ovde prikazanoj aminokiselinskoj sekvenci ili poziciju nukleotida u ovde prikazanoj nukleotidnoj sekvenci. Termin „odgovarajuća“, kao što se ovde koristi, takođe znači da pozicija nije određena samo brojem prethodnih nukleotida / aminokiselina.

[0043] Pozicija datog nukleotida, kao što se ovde koristi, koji može biti supstituisan može da se razlikuje usled delecija ili dodatnih nukleotida na drugom mestu u 5'-neprevedenom regionu (UTR) ALS, uključujući promoter i/ili bilo koje druge regulatorne sekvence ili gen (ne uključujući egzone i introne). Slično tome, pozicija date aminokiseline, kao što se ovde koristi, koja može biti supstituisana može da se razlikuje usled delecije ili adicije aminokiselina na drugom mestu u polipeptidu ALS.

[0044] Tako, pod „odgovarajućom pozicijom“, kao što se ovde koristi, podrazumeva se da nukleotidi/aminokiseline mogu da se razlikuju po naznačenom broju ali i dalje mogu imati slične susedne nukleotide / aminokiseline. Takvi nukleotidi / aminokiseline koji mogu biti zamenjeni, izbačeni ili dodati takođe su obuhvaćeni terminom „odgovarajuća pozicija“.

[0045] Kako bi se utvrdilo da li ostatak nukleotida ili aminokiselinski ostatak u datoj sekvenci nukleotida / aminokiselina ALS odgovara određenoj poziciji u nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2, stručnjak može da koristi sredstva i postupke koji su dobro poznati u struci, npr. poravnanje, ručno ili koristeći računarske programe kao što je BLAST (Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403-410), što označava Basic Local Alignment Search Tool (osnovni alat za traženje lokalnog poravnanja) ili ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680) ili bilo koji drugi odgovarajući program koji je pogodan za generisanje poravnanja sekvenci.

[0046] SEQ ID NO: 1 je nukleotidna sekvenca koja kodira ALS divljeg tipa Beta vulgaris. SEQ ID NO: 2 je aminokiselinska sekvenca Beta vulgaris dobijena od SEQ ID NO: 1.

Shodno tome, kodon na poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 kodira aminokiselinu na poziciji 569 (tj. aminokiselinu „Trp“ prema troslovnom kodu ili „W“ prema jednoslovnom kodu) SEQ ID NO: 2.

[0047] Kako bi se alternativno utvrdilo da li ostatak nukleotida ili aminokiselinski ostatak u datoj sekvenci nukleotida / aminokiselina ALS odgovara određenoj poziciji u nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1, nukleotidna sekvenca koja kodira ALS divljeg tipa A. thaliana prikazana u SEQ ID NO: 5 može da se koristi. SEQ ID NO: 6 je aminokiselinska sekvenca A. thaliana dobijena od SEQ ID NO: 5.

[0048] Shodno tome, kodon na poziciji 1720-1722 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 5 kodira aminokiselinu na poziciji 574 (tj. aminokiselinu „Trp“ prema troslovnom kodu ili „W“ prema jednoslovnom kodu) SEQ ID NO.6.

[0049] Ako se nukleotidna sekvenca ALS divljeg tipa A. thaliana prikazana u SEQ ID NO: 5 koristi kao referentna sekvenca (kao što se radi u većem delu relevantne literature, te se stoga koristi da se omogući lakše poređenje takvih poznatih sekvenci), kodon koji kodira aminokiselinu koja nije triptofan je na poziciji koja odgovara poziciji 1720-1722 nukleotidne sekvence ALS gena A. thaliana koja je prikazana u SEQ ID NO: 5.

[0050] Međutim, SEQ ID NO: 1 je referentna nukleotidna sekvenca, a SEQ ID NO: 2 je poželjna kao referentna aminokiselinska sekvenca u svim sledećim otkrićima.

[0051] Sledeća tabela daje pregled referentnih sekvenci koje se ovde koriste kada je utvrđena pozicija tačkaste mutacije u nukleotidnoj sekvenci ili supstitucije u aminokiselinskoj sekvenci:

[0052] Tako, ekvivalentna pozicija u svakom slučaju i dalje može da se utvrdi putem poravnanja sa referentnom sekvencom, kao što je SEQ ID NO: 1 ili 5 (nukleotidna sekvenca) ili SEQ ID NO: 2 ili 6 (aminokiselinska sekvenca).

[0053] Imajući u vidu razliku između gena ALS divljeg tipa B. vulgaris i gena ALS koji sadrži biljka B. vulgaris iz predmetnog pronalaska, gen ALS (ili polinukleotid ili nukleotidna sekvenca) koji sadrži biljka B. vulgaris iz predmetnog pronalaska takođe može da se smatra „mutantnim genom ALS“, „mutantnim alelom ALS“, „mutantnim polinukleotidom ALS“, i slično. Tako, u celoj ovoj specifikaciji, termini „mutantni alel“, „mutantni alel ALS“, „mutantni gen ALS“ ili „mutantni polinukleotid ALS“ koriste se naizmenično.

[0054] Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, ovi termini se odnose na nukleotidnu sekvencu koja sadrži kodon koji kodira leucin na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence gena ALS B. vulgaris koja je prikazana u SEQ ID NO: 1. Kada se posmatra u odnosu na referentnu sekvencu A. thaliana koja je prikazana u SEQ ID NO: 5, pozicija kodona je 1720-1722.

[0055] Slično tome, ovi termini se odnose na nukleotidnu sekvencu koja kodira protein ALS koji ima, na poziciji koja odgovara poziciji 569 aminokiselinske sekvence proteina ALS Beta vulgaris koja je prikazana u SEQ ID NO: 2, aminokiselinu leucin. Kada se posmatra u odnosu na referentnu sekvencu A. thaliana koja je prikazana u SEQ ID NO: 6, pozicija je 574.

[0056] Nasuprot tome, osim ako nije drugačije naznačeno, termini „alel divljeg tipa“, „ALS alel divljeg tipa“, „ALS gen divljeg tipa“ ili „ALS polinukleotid divljeg tipa“ odnose se na nukleotidnu sekvencu koja kodira protein ALS koji nema supstituciju W569 u odnosu na SEQ ID NO: 2 (ili W574 supstituciju u odnosu na SEQ ID NO: 6).

[0057] Takav „alel divljeg tipa“, „ALS alel divljeg tipa“, „ALS gen divljeg tipa“ ili „ALS polinukleotid divljeg tipa“ može, ali ne mora, da sadrži mutacije, pored mutacije koja dovodi do supstitucije W569.

[0058] U suštini, u pogledu gena ALS, jedina razlika između biljke B. vulgaris divljeg tipa i biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska je što na poziciji koja je ovde naznačena (tj. poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence gena ALS B. vulgaris koja je prikazana u SEQ ID NO: 1), biljka B. vulgaris iz predmetnog pronalaska sadrži kodon koji kodira leucin. Međutim, kao što je prethodno pomenuto, dalje razlike kao što su dodatne mutacije mogu biti prisutne između divljeg tipa i mutantnog ALS alela kao što je ovde navedeno. Ipak, ove dalje razlike nisu relevantne sve dok je prisutna prethodno objašnjena razlika.

[0059] Posledično, supstitucija W569 (ili supstitucija W574 kada se aminokiselinska sekvenca ALS A. thaliana SEQ ID NO: 6 koristi kao referenca) rezultat je izmene kodona na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 1 (odnosno na poziciji koja odgovara poziciji 1720-1722 nukleotidne sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 5).

[0060] Supstitucija na poziciji 569 je supstitucija W→L, gde je „L“ kodiran putem „TTG“.

[0061] Supstitucija na poziciji 569 je supstitucija W→L, zbog transverzije nukleotida „G“ na poziciji koja odgovara poziciji 1706 nukleotidne sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 1 (odnosno na poziciji koja odgovara poziciji 1721 nukleotidne sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 5) u nukleotid „T“. Shodno tome, kodon na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 1 (odnosno na poziciji koja odgovara poziciji 1720-1722 nukleotidne sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 5) promenjen je iz „TGG“ u „TTG“. Dok kodon „TGG“ kodira triptofan, kodon „TTG“ kodira leucin.

[0062] Dakle, predmetni pronalazak obezbeđuje biljku Beta vulgaris koja u nukleotidnoj sekvenci endogenog gena ALS sadrži kodon TTG (koji kodira leucin) na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence mutantnog gena ALS B. vulgaris koja je prikazana u SEQ ID NO: 1, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca sadrži (ili se manje poželjno sastoji od) SEQ ID NO: 3.

[0063] Biljke B. vulgaris koje kodiraju polipeptid ALS koji ima na poziciji koja odgovara poziciji 569 aminokiselinske sekvence proteina ALS Beta vulgaris prikazanoj u SEQ ID NO: 2 aminokiselinu leucin umesto triptofana, sadrže u nukleotidnoj sekvenci endogenog gena ALS TTG kodon koji kodira leucin na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence gena ALS B. vulgaris koja je prikazana u SEQ ID NO: 1.

[0064] Termin gen „ALS“ ili „AHAS“ B. vulgaris takođe obuhvata nukleotidne sekvence B. vulgaris koje su najmanje 90, 95, 97, 98 ili 99% identične nukleotidnoj sekvenci ALS B. vulgaris SEQ ID NO: 1 ili 3, pri čemu te 90, 95, 97, 98 ili 99% identične nukleotidne sekvence sadrže na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 kodon koji kodira leucin. Slično tome, ove najmanje 90, 95, 97, 98 ili 99% identične nukleotidne sekvence kodiraju polipeptid ALS koji sadrži na poziciji koja odgovara poziciji 569 SEQ ID NO: 2 leucin. Pomenute identične nukleotidne sekvence kodiraju protein ALS koji zadržava aktivnost kako što je ovde opisano, poželjnije, tako kodirani polipeptid ALS je tolerantan na jedan ili više herbicida ALS inhibitora kao što je ovde opisano. Pomenuti termin takođe obuhvata alelne varijante i homologe koji kodiraju polipeptid ALS koji je poželjno tolerantan na jedan ili više herbicida ALS inhibitora kao što je ovde opisano.

[0065] Kako bi se utvrdilo da li sekvenca nukleinske kiseline ima određeni stepen identičnosti sa nukleotidnim sekvencama koje su ovde opisane, stručnjak može da koristi sredstva i postupke koji su dobro poznati u struci, npr. poravnanje, ručno ili koristeći računarske programe kao što su oni pomenuti dalje u nastavku u vezi sa definicijom termina „hibridizacija“ i stepene homologije.

[0066] Na primer, BLAST, što označava Basic Local Alignment Search Tool (osnovni alat za traženje lokalnog poravnanja) (Altschul, Nucl. Acids Res.25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol.36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol.215 (1990), 403-410), može da se koristi za traženje lokalnih poravnanja sekvenci. BLAST proizvodi poravnanje nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci za utvrđivanje sličnosti sekvence. Usled lokalne prirode poravnanja, BLAST je naročito koristan za utvrđivanje identičnih poklapanja ili za identifikovanje sličnih sekvenci. Osnovna jedinica izlaza algoritma programa BLAST je visoko rangirani segmentni par (HSP). HSP se sastoji od fragmenata dve sekvence proizvoljne, ali jednake dužine, čije poravnanje je lokalno maksimalno i za koje ocena poravnanja zadovoljava ili premašuje granični ili eliminacioni rezultat koji je zadao korisnik. Pristup programa BLAST je da se traže HSP između ispitivane sekvence i sekvence iz baze podataka, da se proceni statistička značajnost bilo kojih otkrivenih poklapanja, i da se prijave samo ona poklapanja koja zadovoljavaju prag značajnosti koji je korisnik izabrao. Parametar E uspostavlja statistički značajnu granicu za prijavljivanje poklapanja sa sekvencom iz baze podataka. E se tumači kao gornja granica očekivane učestalosti slučajnog javljanja HSP (ili skupa HSP) u kontekstu pretrage cele baze podataka. Sve sekvence iz baze podataka čije poklapanje zadovoljava E prijavljuju se u programskom izlazu.

[0067] Analogne računarske tehnike koristeći BLAST (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), loc. cit.) koriste se za traženje identičnih ili srodnih molekula u bazama podataka nukleotida kao što je GenBank ili EMBL. Ova analiza je mnogo brža nego hibridizacija koja se zasniva na višestrukim membranama. Pored toga, osetljivost računarske pretrage može da se modifikuje da se utvrdi da li se bilo koje konkretno poklapanje klasifikuje kao identično ili slično. Osnova za pretragu je ocena proizvoda koja se definiše kao:

% identičnosti sekvence x % maksimalnog rezultata BLAST

i uzima u obzir stepen sličnosti između dve sekvence, kao i dužinu poklapanja sekvenci. Na primer, sa ocenom proizvoda 40, poklapanje će biti identično sa mogućom greškom 1-2%, a na 70, poklapanje će biti identično. Slični molekuli se obično identifikuju odabirom molekula koji imaju ocene proizvoda od 15 do 40, mada niže ocene mogu da se odnose na srodne molekule.

[0068] Termin polipeptid „ALS“ ili „AHAS“ B. vulgaris takođe obuhvata aminokiselinske sekvence koje su najmanje 90, 95, 97, 98 ili 99% identične aminokiselinskoj sekvenci ALS SEQ ID NO: 2 ili 4, pri čemu te najmanje 90, 95, 97, 98 ili 99% identične aminokiselinske sekvence sadrže na poziciji koja odgovara poziciji 569 SEQ ID NO: 2 aminokiselinu koja nije triptofan. Pomenute identične aminokiselinske sekvence zadržavaju aktivnost ALS kao što je ovde opisano, poželjnije, polipeptid ALS je tolerantan na herbicide ALS inhibitore kao što je ovde opisano.

[0069] Po potrebi, aktivnost ALS može da se izmeri u skladu sa testom koji je opisan u Singh (1991), Proc. Natl. Acad. Sci.88:4572-4576.

[0070] Međutim, nukleotidna sekvenca ALS koja je ovde navedena i koja kodira polipeptid ALS daje toleranciju na jedan ili više herbicida ALS inhibitora (ili, obrnuto, manju osetljivost na herbicid ALS inhibitor) kao što je ovde opisano. To je posledica tačkaste mutacije koja dovodi do aminokiselinske supstitucije kao što je ovde opisano. Shodno tome, tolerantnost na herbicid ALS inhibitor (ili, obrnuto, manja osetljivost na herbicid ALS inhibitor) može da se izmeri poređenjem aktivnosti ALS koja je dobijena iz ćelijskih ekstrakata od biljaka koje sadrže mutiranu sekvencu ALS i od biljaka koje nemaju mutiranu sekvencu ALS u prisustvu herbicida ALS inhibitora, kao što je opisano u Singh et al (1988) [J. Chromatogr., 444, 251-261].

[0071] Međutim, poželjniji test aktivnosti za polipeptid ALS kodiran nukleotidnom sekvencom koja sadrži TTG kodon koji kodira leucin na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence gena ALS B. vulgaris koja je prikazana u SEQ ID NO: 1 može da se obavi na sledeći način:

Kodirajuća sekvenca divljeg tipa Beta vulgaris i mutantne biljke B. vulgaris je klonirana, na primer, u vektore Novagen pET-32a(+) i vektori su transformisani, na primer, u AD494 liniju Ešerihije koli u skladu sa uputstvom proizvođača. Bakterije se poželjno uzgajaju na 37 °C u medijumu pod pritiskom za selekciju kao što je LB-medijum koji sadrži 100 mg/l karbenicilina i 25 mg/l kanamicina, indukuju se, na primer, 1 mM izopropil-β-D-tiogalaktopiranozidom sa OD600poželjno oko 0,6, kultivišu se tokom oko 16 sati poželjno na 18 °C i sakupljaju se centrifugiranjem. Bakterijski peleti se ponovo suspenduju u 100 mM natrijum fosfatnom puferu pH 7,0 koji sadrži 0,1 mM tiamin-pirofosfat, 1 mM MgCl2, i 1 µM FAD sa koncentracijom od 1 gram vlažne mase na 25 ml pufera i njihova struktura se uništava sonifikacijom. Sirovi proteinski ekstrakt koji je dobijen nakon centrifugiranja koristi se za merenje aktivnosti ALS.

[0072] Testovi ALS se zatim obavljaju, na primer, u mikrotitarskim pločama sa 96 bunarčića koristeći modifikaciju procedure koju je opisao Ray (1984), Plant Physiol., 75, 827-831. Reakciona smeša poželjno sadrži 20 mM kalijum fosfatni pufer pH 7,0, 20 mM natrijum piruvat, 0,45 mM tiamin pirofosfat, 0,45 mM MgCl2, 9 µM FAD, ALS enzim i različite koncentracije inhibitora ALS u finalnoj zapremini od oko 90 µl.

[0073] Testovi se započinju dodavanjem enzima i prekidaju se poželjno nakon 75 min inkubacije na 30 °C putem dodavanja 40 µl 0,5 M H2SO4. Nakon oko 60 min na sobnoj temperaturi, dodato je oko 80 µl rastvora 1,4% α-naftola i 0,14% kreatina u 0,7 M NaOH i nakon još oko 45 min inkubacije na sobnoj temperaturi određena je apsorbanca na 540 nm. Vrednosti p150 za inhibiciju ALS su određene kao što je opisao Ray (1984) ), Plant Physiol., 75, 827-831, koristeći program za postavljanje krive XLFit dodatak za Excel verzija 4.3.1 autora ID Business Solutions Limited, Guildford, UK.

[0074] Kada se koriste biljke, aktivnost ALS se poželjno utvrđuje u ćelijskim ekstraktima ili ekstraktima listova divljeg tipa i ćelijskim ekstraktima ili ekstraktima listova dobijenog mutanta B. vulgaris u prisustvu različitih koncentracija herbicida ALS inhibitora, poželjno sulfonilurea herbicida ili sulfonilamino karboniltriazolinonskih herbicida, poželjnije u prisustvu različitih formulacija herbicida ALS inhibitora „foramsulfurona“. ALS se tako poželjno ekstrahuje iz listova šećerne repe ili kultura tkiva šećerne repe kao što je opisao Ray (1984) u Plant Physiol 75:827-831.

[0075] Biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska su najmanje 100 puta manje osetljive na inhibitor ALS, poželjnije, 500 puta, još poželjnije 1000 puta, a najpoželjnije manje od 2000 puta. Kada se ovde koristi, manje osetljivo može i obrnuto da se posmatra kao „tolerantnije“ ili „rezistentnije“. Slično tome, „tolerantnije“ ili „rezistentnije“ može obrnuto da se tumači kao „manje osetljive“.

[0076] Na primer, biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska, a naročito biljka B. vulgaris koja je opisana u priloženim primerima, najmanje su 2000 puta manje osetljive na herbicid ALS inhibitor foramsulfuron (član potklase inhibitora ALS „sulfonilurea herbicida“) u poređenju sa enzimom divljeg tipa.

[0077] Biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska su manje osetljive na različite članove herbicida ALS inhibitora, kao što su sulfonilurea herbicidi, sulfonilamino karboniltriazolinonski herbicidi i imidazolinonski herbicidi. Poželjno su izabrani sulfonilurea herbicidi i sulfonilamino karboniltriazolinonski herbicidi na koje su pomenute biljke manje osetljive. U posebno poželjnom otelotvorenju, biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska su manje osetljive na herbicid ALS inhibitor formasulfuron (sulfonilurea herbicid) samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih herbicida ALS inhibitora iz potklase sulfonilurea herbicida ili bilo koje druge potklase herbicida ALS inhibitora.

[0078] Dakle, biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska koje su manje osetljive na herbicid ALS inhibitor isto tako mogu da se okarakterišu kao „tolerantnije“ na inhibitor ALS (tj. biljka tolerantna na inhibitor ALS).

[0079] Tako, biljka „tolerantna na inhibitor ALS“ odnosi se na biljku, posebno na biljku B. vulgaris, koja je tolerantnija najmanje na jedan herbicid ALS inhibitor pri nivou koji bi uobičajeno inhibirao rast normalne biljke ili biljke divljeg tipa, poželjno herbicid ALS inhibitor suzbija normalnu biljku ili biljku divljeg tipa. Pomenuta normalna biljka ili biljka divljeg tipa ne sadrži u nukleotidnoj sekvenci bilo kog alela endogenog ALS gena TTG kodon koji kodira leucin na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 nukleotidne sekvence gena ALS B. vulgaris prikazanoj u SEQ ID NO: 1.

[0080] Pomenuta nukleotidna sekvenca može uopšteno da se okarakteriše kao nukleotidna sekvenca koja je „tolerantna na herbicid ALS inhibitor“. Pod „nukleotidnom sekvencom tolerantnom na herbicid ALS inhibitor“ misli se na molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži barem mutaciju koja dovodi do TTG kodona koji kodira leucin u odnosu na protein ALS koji na poziciji koja odgovara poziciji 569 aminokiselinske sekvence proteina ALS B. vulgaris kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2 nema leucin, pri čemu pomenuta najmanje jedna mutacija dovodi do ekspresije proteina ALS koji je manje osetljiv na herbicid ALS inhibitor.

[0081] Pod „proteinom ALS tolerantnim na herbicide“ misli se na to da takav protein ALS pokazuje veću aktivnost ALS, u poređenju sa aktivnošću ALS proteina ALS divljeg tipa, u prisustvu najmanje jednog herbicida ALS inhibitora za koji je poznato da ometa aktivnost ALS i pri koncentraciji ili nivou pomenutog herbicida za koji je poznato da inhibira aktivnost ALS proteina ALS divljeg tipa.

[0082] Slično tome, termini „herbicidi ALS inhibitori“ ili jednostavno „inhibitori ALS“ koriste se naizmenično. Kao što se ovde koristi, „herbicid ALS inhibitor“ ili „inhibitor ALS“ ne treba da bude ograničen na jedan herbicid koji ometa aktivnost enzima ALS. Tako, osim ako nije drugačije navedeno ili jasno iz konteksta, „herbicid ALS inhibitor“ ili „inhibitor ALS“ može biti jedan herbicid ili smeša dva, tri, četiri, ili više herbicida koji su poznati u struci, poželjno kao što je ovde navedeno, od kojih svaki ometa aktivnost enzima ALS.

[0083] Neočekivano je otkriveno da čak i pojedinačna tačkasta mutacija koja je ovde opisana daje poljoprivredno korisne i stabilne nivoe otpornosti na herbicid ALS inhibitor kod biljaka B. vulgaris kao i kod njihovog potomstva, ako se uspostavi homozigotnost. U poređenju sa biljkama Beta vulgaris koje su tolerantne na herbicid i imaju isto genetsko poreklo u kojima je takva mutacija samo heterozigotno prisutna, biljke Beta vulgaris tolerantne na herbicid koje su homozigotne za mutaciju pokazuju bolji poljoprivredni nivo tolerancije na herbicid ALS inhibitor.

[0084] Stoga, predmetni pronalazak se odnosi na biljku Beta vulgaris tolerantnu na herbicid ALS inhibitor koja ima mutaciju endogenog gena acetolaktat sintaze (ALS), pri čemu gen ALS kodira polipeptid ALS koji sadrži leucin na poziciji 569 polipeptida ALS, pri čemu je data mutacija prisutna homozigotno, a najpoželjnije, data mutacija je prisutna homozigotno kao jedina mutacija endogenog gena ALS.

[0085] Takođe nije moglo da se očekuje da samo jedna mutacija gena ALS u Beta vulgaris bude dovoljna, pošto, na primer, WO 2010/037061 pokazuje da su dvostruki ili trostruki mutanti u genima ALS neophodni za postizanje poljoprivredno korisne otpornosti na herbicid ALS inhibitor.

[0086] Kada se ovde koristi, termin „heterozigotno“ znači da biljka ima različite alele na određenom lokusu, posebno na lokusu gena ALS.

[0087] „Homozigotno“ pokazuje da biljka iz predmetnog pronalaska ima dva primerka istog alela na različitim lancima DNK, naročito na lokusu gena ALS.

[0088] Kao što se ovde koristi, osim ako jasno nije drugačije naznačeno, termin „biljka“ treba da znači biljka u bilo kojoj fazi razvoja.

[0089] Poželjno je da biljka Beta vulgaris iz predmetnog pronalaska bude ortoploid ili anortoploid. Ortoploidna biljka može poželjno biti haploid, diploid, tetraploid, heksaploid, oktaploid, dekaploid ili dodekaploid, dok anortoploidna biljka može poželjno biti triploid ili pentaploid.

[0090] Delovi biljaka mogu biti povezani sa celom netaknutom biljkom ili odvojeni od nje. Takvi delovi biljke uključuju, ali nisu ograničeni na, organe, tkiva i ćelije biljke, a poželjno seme.

[0091] Biljka B. vulgaris iz predmetnog pronalaska je netransgena u pogledu endogenog gena ALS. Naravno, strani geni mogu biti prebačeni u biljku putem genetskog inženjeringa ili konvencionalnim postupcima kao što je ukrštanje. Pomenuti geni mogu biti geni koji daju tolerantnost na herbicide, poželjno daju tolerantnost na herbicide različitu od tolerantnosti na herbicide ALS inhibitore, geni koji povećavaju prinos, geni koji poboljšavaju rezistenciju na biološke organizme i/ili geni koji se bave modifikacijom sadržaja.

[0092] Postupak za proizvodnju biljke Beta vulgaris i njenih delova može da obuhvata sledeće korake:

(a) izlaganje kalusa, poželjno šećerne repe, oko 10<-7>M - 10<-9>M herbicidu ALS inhibitoru, poželjno formasulfuronu;

(b) odabir ćelijskih kolonija koje mogu da rastu u prisustvu do 3 × 10-<6>M herbicida ALS inhibitora, poželjno foramsulfurona [CAS RN 173159-57-4];

(c) regeneraciju izdanaka u prisustvu herbicida ALS inhibitora, poželjno foramsulfurona; (d) odabir regenerisanih sadnica sa herbicidom ALS inhibitorom, poželjno foramsulfuronom, jodsulfuron-metil natrijumom [CAS RN 144550-36-7] i/ili smešom oba, pri čemu je doza foramsulfurona poželjno jednaka 7-70 g a.i./ha, a doza jodsulfuron-metil natrijuma je poželjno jednaka 1-10 g a.i./ha.

[0093] Regenerisane sadnice dobijene u skladu sa prethodnim procesom (a) do (d) mogu da se koriste za dalju proizvodnju biljaka Beta vulgaris putem primene sledećih koraka (e) do (m):

(e) vegetativna mikropropagacija pojedinačnih sadnica iz koraka (d) za izolovanje različitih pozitivnih varijanti putem uspostavljanja ćelijske linije (klona) za svaku sadnicu tolerantnu na herbicid ALS inhibitor;

(f) dugoročno skladištenje svakog uspostavljenog klona u vegetativnom stanju;

(g) prebacivanje kloniranih biljaka svakog klona iz dugoročnog skladištenja u staklenu baštu;

(h) jarovizacija i adaptacija u komorama za jarovizaciju radi indukcije cvetanja;

(i) prebacivanje jarovizovanih biljaka u prostorije za rast (kontrolisana temperatura i svetlost);

(j) odabir biljaka koje najbolje proizvode polen od najbolje cvetajućih klonova za ukrštanje sa emaskuliranim biljkama elitne linije koja je osetljiva na herbicid ALS inhibitor da se prevaziđe negativni uticaj somaklonske varijacije na generativnu plodnost (muška i ženska) sadnica iz koraka (d);

(k) povratno ukrštanje sa elitnom linijom sve dok plodnost ne bude povraćena i samoheterozigotne biljke konačno dostignu homozigotno stanje;

(l) proizvodnja test ukrštanja sa partnerom osetljivim na herbicid ALS inhibitor i samoniklim semenom svake povratno ukrštene linije za procenu na terenu;

(m) primena poljoprivredno relevantnih doznih stopa različitih herbicida ALS inhibitora za odabir linije sa najboljim performansama, poželjno u homozigotnom stanju.

[0094] Linije koje su dobijene u skladu sa prethodnim koracima (a) do (m) čine osnovu za razvoj komercijalnih sorti nakon procedura poznatih u zajednici uzgajivača koje su podržane tehnikama molekulskog uzgoja (kao što je uzgoj potpomognut markerom ili odabir potpomognut markerom) za ubrzavanje procesa i osiguravanje pravilnog odabira biljaka da bi se dobila mutacija u homozigotnom obliku. (Za pregled, vidite Bertrand C.Y. et al. (2008), Phil. Trans. R. Soc, B., 363, 557-572)

[0095] Kalusi su dobijeni pomoću sredstava i postupaka koji su uobičajeno poznati u struci, na primer, kao što je opisano u priloženim primerima.

[0096] Seme koje je dobijeno u koraku (m), iznad, deponovano je u NCIMB, Aberdeen, UK, pod brojem NCIMB 41705.

[0097] Ćelijske kulture šećerne repe su započete od sadnica diploidne šećerne repe genotipa 7T9044 (kao što je, na primer, opisao Alexander Dovzhenko, doktorska disertacija, naslov: „Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.)“, Ludwig-Maximilians-Universität Munchen, Nemačka, 2001). Seme šećerne repe je tokom 60 sekundi potopljeno u 70% etanol, zatim je dva puta isprano u sterilnoj vodi sa 0,01% deterdženta i zatim inkubirano tokom 1-4 sata u 1% NaOCI izbeljivaču. Nakon toga, seme je 3 puta isprano sterilnom H2O i seme je skladišteno u sterilnoj vodi preko noći na 4 °C.

Embrioni su zatim izolovani koristeći forceps i skalpel.

[0098] Sveže pripremljeni embrioni su potopljeni u 0,5% NaOCI tokom 30 min, a zatim 3 puta isprani u sterilnoj vodi. Nakon poslednjeg koraka ispiranja, stavljeni su na MS agar medijum bez hormona (Murashige i Skoog (1962), Physiol. Plantarum, 15, 473-497).

Embrioni koji su se razvili u sterilne sadnice korišćeni su za započinjanje ćelijskih kultura šećerne repe koje mogu da se regenerišu.

[0099] Kotiledoni i hipokotili su isečeni na segmente dugačke 2-5 mm i zatim uzgajani na MS medijumu solidifikovanom agarom (0,8%) koji sadrži 1 mg/l benzilaminopurina (BAP) ili 0,25 mg/l tidiazurona (TDZ).4 nedelje kasnije, kulture izdanaka u razvoju su prebačene na sveži agar medijum istog sastava i zatim supkulturisane u mesečnim intervalima. Kulture su držane na 25 °C pod prigušenim svetlom sa ciklusom 12 h / 12 h svetla / mraka.

[0100] Nakon 7-10 supkultura, kulture izdanaka uzgajane na medijumu koji sadrži tidiazuron formirale su posebnu vrstu kalusa, koji je bio brzorastući, mek i krhak. Ova vrsta kalusa je bila žućkaste do svetlozelene boje. Neki od ovih krhkih kalusa konzistentno su proizvodili primordijalne izdanke koji sadrže hlorofil od struktura nalik embrionu. Ovi brzorastući kalusi koji mogu da se regenerišu korišćeni su za odabir mutanata šećerne repe koji su tolerantni na herbicid ALS inhibitor.

[0101] Kada je ova vrsta kalusa izložena 10<-9>M sulfonilurea foramsulfuronu (CAS RN 173159-57-4), ćelije su preživele, ali su proizvele manje od 50% biomase njihovih srodnika na medijumu na kome nema inhibitora. Na medijumu koji sadrži 3 × 10<-8>M foramsulfuron nije mogao da se uoči rast.10<-7>M foramsulfuron je izabran za eksperimente za odabir mutanata velikih razmera. Ćelijske kolonije koje preživljavaju i rastu su numerisane i prenete nakon 4-6 nedelja na svež medijum koji sadrži 3 x 10<-7>M inhibitor. Jedna od ovih ćelijskih kolonija je uspela da raste ne samo pri ovoj koncentraciji inhibitora već i u prisustvu 3 × 10<-6>M foramsulfurona. Od ovog klona (SB574TL), izdanci su regenerisani u prisustvu herbicida ALS inhibitora i izdanci su zatim prebačeni na MS medijum koji sadrži 0,05 mg/l naftalensirćetne kiseline (NAA).

[0102] U roku od 4-12 nedelja izdanci su formirali korenje i zatim su prebačeni u sterilne posude za biljke napunjene vlažnim, sterilizovanim perlitom, zalivane MS neorganskim sastojcima sa pola jačine. Alternativno, sadnice su prebačene neposredno iz medijuma koji je solidifikovan agarom u smešu zemljišta koje sadrži perlit u staklenoj bašti. Tokom prvih 10-15 dana nakon prebacivanja u zemljište koje sadrži supstrat, biljke su držane u okruženju sa visokom vlažnošću vazduha. Tokom navikavanja na uobičajeni režim vlažnosti vazduha u staklenoj bašti i nakon toga, biljke su držane u staklenoj bašti pod veštačkim osvetljenjem (12 h) na dnevnoj /noćnoj temperaturi od 20 -3 °C/ 15+-2 °C.

[0103] 3-5 nedelja kasnije, regenerisane biljke iz prethodno dobijene ćelijske kulture tolerantne na foramsulfuron (SB574TL) kao i od ćelijskih kultura divljeg tipa tretirane su foramsulfuronom, jodsulfuron-metil natrijumom (CAS RN 144550-3-7) i smešom oba aktivna sastojka. Doze herbicida koje su testirane bile su jednake 7-70 g a.i./ha za foramsulfuron i 1-10 g a.i./ha za jodsulfuron-metil natrijum. Regenerisane biljke iz ove tolerantne ćelijske linije podnosile su čak i najviše doze herbicida (foramsulfuron, jodsulfuron-metil natrijum i njihove smeše u odnosu 7:1 kada su čak i najniže doze ubile biljke divljeg tipa.

[0104] Potomstvo je testirano na sledeći način (bez ograničenja):

Zasnovano na SB574TL, F2 i F3 seme eksperimentalnih hibrida koji daju rezistentni alel u heterozigotnom stanju kao i F4-F6 seme koje daje mutantni alel u homozigotnom stanju zasejano je u polju i tretirano foramsulfuronom, jodsulfuron-metil natrijumom, kao i smešama oba herbicida ALS inhibitora kada je biljka razvila 3-5 listova u obliku rozete. Homozigotne sadnice su tolerisale smeše od 35 g foramsulfurona/ha 7 g jodsulfuron-metil natrijuma/ha bez usporavanja rasta ili bilo kojih znaka vidljive štete. U nekoliko slučajeva, heterozigotne linije su pokazale znake usporenog rasta i određenu hlorozu listova pri ovim stopama, ali su se oporavile u roku od 3-5 nedelja, dok su herbicidi ALS inhibitori ubili konvencionalne sadnice šećerne repe.

[0105] ALS mutanti su okarakterisani na sledeći način:

Ekstrakcija i analiza sekvence nukleinske kiseline dobijenog mutanta obavljena je od strane LGC Genomics GmbH, Berlin, Nemačka u skladu sa izmenjenim i dopunjenim standardnim protokolima.

[0106] Sekvenca nukleinske kiseline dobijena od SB574TL mutanta šećerne repe je prikazana u SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 4 predstavlja odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu, dok je SEQ ID NO: 1 dobijena nakon sekvenciranja biljke šećerne repe divljeg tipa koja je uzeta kao polazna supstanca. SEQ ID NO: 2 predstavlja odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu šećerne repe divljeg tipa.

[0107] Poređenje ovih sekvenci pokazuje da postoji samo mutacija na poziciji 574 ali da nije došlo ni do jedne druge promene u bilo kom drugom delu ovog endogenog gena ALS.

SEQ ID No1

ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTA ACCAAAACC

SEQ ID No 3

(1)

ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTA ACCAAAACC

SEQ ID No1

(61)

CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCA AAACCCCA

SEQ ID No 3

(61)

CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCA AAACCCCA

SEQ ID No1

(121)

ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAA TCATCCGCC

SEQ ID No 3

(121)

ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAA TCATCCGCC

SEQ ID No1

(181)

ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCT TTCGTTTCT

SEQ ID No 3

(181)

ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCT TTCGTTTCT

SEQ ID No1

(241)

CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGC TCTTGAGCGT

SEQ ID No 3

(241)

CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGC TCTTGAGCGT

SEQ ID No1

(301)

GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATC CACCAAGCT

SEQ ID No 3

GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATC CACCAAGCT

SEQ ID No1

(361)

CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGG CGGGGTTTTC

SEQ ID No 3

(361)

CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGG CGGGGTTTTC

SEQ ID No1

(421)

GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGC GACTTCTGGT

SEQ ID No 3

(421)

GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGC GACTTCTGGT

SEQ ID No1

(481)

CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCT GTCCCTCTT

SEQ ID No 3

(481)

CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCT GTCCCTCTT

SEQ ID No1

(541)

GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTT CAGGAGACT

SEQ ID No 3

(541)

GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTT CAGGAGACT

SEQ ID No1

(601)

CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTG GATGTAGAG

SEQ ID No 3

(601)

CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTG GATGTAGAG

SEQ ID No1

GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGG CCTGGACCT

SEQ ID No 3

(661)

GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGG CCTGGACCT

SEQ ID No1

(721)

GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGAT TGGGATAGG

SEQ ID No 3

(721)

GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGAT TGGGATAGG

SEQ ID No1

(781)

CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCG ACGAATGAG

SEQ ID No 3

(781)

CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCG ACGAATGAG

SEQ ID No1

(841)

GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCC TGTCTTGTAT

SEQ ID No 3

(841)

GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCC TGTCTTGTAT

SEQ ID No1

(901)

GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGA GTTGACAGGG

SEQ ID No 3

(901)

GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGA GTTGACAGGG

SEQ ID No1

(961)

ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGAT GAACTGTCT

SEQ ID No 3

ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGAT GAACTGTCT

SEQ ID No1

(1021)

CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGAT AAGGCGGAT

SEQ ID No 3

(1021)

CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGAT AAGGCGGAT

SEQ ID No1

(1081)

TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTC GAGGCGTTT

SEQ ID No 3

(1081)

TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTC GAGGCGTTT

SEQ ID No1

(1141)

GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGG AAGAACAAG

SEQ ID No 3

(1141)

GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGG AAGAACAAG

SEQ ID No1 (1201)

CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATG AATAAGATT

SEQ ID No 3 (1201)

CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATG AATAAGATT

SEQ ID No1

(1261)

CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGA AGAATTAGGT

SEQ ID No 3

(1261)

CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGA AGAATTAGGT

SEQ ID No1

(1321)

GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAAT TCCTCCACAA

SEQ ID No 3

(1321) GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAAT TCCTCCACAA

SEQ ID No1 (1381)

TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGT ACTGGTGTT

SEQ ID No 3 (1381)

TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGT ACTGGTGTT

SEQ ID No1

(1441) GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCG CCAATGGCTG

SEQ ID No 3

(1441) GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCG CCAATGGCTG

SEQ ID No1

(1501) ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGG AGCTGCAGTT

SEQ ID No 3

(1501) ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGG AGCTGCAGTT

SEQ ID No1

(1561) GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATT ATGAATGTT

SEQ ID No 3

(1561) GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATT ATGAATGTT

SEQ ID No1

(1621) CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCT GCTAAACAAT

SEQ ID No 3

(1621) CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCT GCTAAACAAT

SEQ ID No1

CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATGGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAA CCGGGCACAT

SEQ ID No 3

(1681)

CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATTGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAA CCGGGCACAT

SEQ ID No1

(1741)

ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTC AAATTCGCT

SEQ ID No 3

(1741)

ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTC AAATTCGCT

SEQ ID No1

(1801)

GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGG GCCGCCATT

SEQ ID No 3

(1801)

GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGG GCCGCCATT

SEQ ID No1

(1861) CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACC GCATCAAGAG

SEQ ID No 3

(1861) CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACC GCATCAAGAG

SEQ ID No1

(1921) CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACA GAGGGTGAT

SEQ ID No 3

(1921) CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACA GAGGGTGAT

SEQ ID No1

(1981) GGAAGAACCTCTTATTGA

SEQ ID No 3

(1981) GGAAGAACCTCTTATTGA

SEQ ID No.2

MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHK SSA

SEQ ID No.4

(1)

MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHK SSA

SEQ ID No.2

(61)

IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGAS MEIHQA

SEQ ID No.4

(61)

IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGAS MEIHQA

SEQ ID No.2

(121)

LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLAD ALLDSVPL

SEQ ID No.4

(121)

LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLAD ALLDSVPL

SEQ ID No.2

(181)

VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLAN SGRPGP

SEQ ID No.4

(181)

VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLAN SGRPGP

SEQ ID No.2

(241)

VLIDLPKDIQQQLVVPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSE SKKPVLY

SEQ ID No.4

(241)

VLIDLPKDIQQQLVVPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSE SKKPVLY

SEQ ID No.2

(301)

VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYA NYAVDKAD

SEQ ID No.4

VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYA NYAVDKAD

SEQ ID No.2

(361) LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLA LRGMNKI

SEQ ID No.4

(361) LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLA LRGMNKI

SEQ ID No.2

(421) LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGN AIISTGV

SEQ ID No.4

(421) LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGN AIISTGV

SEQ ID No.2

(481) GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAVVVD IDGDGSFIMNV

SEQ ID No.4

(481)

GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAVVVD IDGDGSFIMNV

SEQ ID No.2

(541)

QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPSKSAD IFPDMLKFA

SEQ ID No.4

(541)

QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMVVQLEDRFYKANRAHTYLGNPSKSADI FPDMLKFA

SEQ ID No.2

(601)

EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFK DTITEGD

SEQ ID No.4

(601)

EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFK DTITEGD

SEQ ID No.2

(661) GRTSY

SEQ ID No.4

(661) GRTSY-

[0108] Ipak, poželjno je da biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska i njihovi delovi mogu da se iskoriste u poljoprivredi. „Poljoprivredno iskoristive“ znači da su biljke B. vulgaris i njihovi delovi korisni za poljoprivredne svrhe. Na primer, biljke B. vulgaris treba da ispunjavaju svrhu da budu korisne u proizvodnji šećera, proizvodnji biogoriva (kao što je biogas, biobutanol), proizvodnji etanola, proizvodnji betaina i/ili uridina. Kada se ovde koristi, termin „poljoprivredno iskoristive“ takođe znači da su biljke B. vulgaris iz predmetnog pronalaska najmanje 100 puta manje osetljive na herbicid ALS inhibitor, poželjnije, 500 puta, još poželjnije 1000 puta, a najpoželjnije manje od 2000 puta. Herbicid ALS inhibitor je jedan ili više od ovde opisanih, poželjno je foramsulfuron, samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih herbicida ALS inhibitora iz potklase sulfonilurea herbicida ili iz bilo koje druge potklase herbicida ALS inhibitora, najpoželjnije je foramsulfuron u kombinaciji sa dodatnim sulfonilurea herbicidom i/ili inhibitorom ALS iz potklase sulfonilaminokarbonil triazolinonskih herbicida.

[0109] Poželjno, poljoprivredno iskoristive biljke B. vulgaris, najpoželjnije biljke šećerne repe, iz predmetnog pronalaska u potpunosti su plodne, poželjnije imaju plodnost divljeg tipa. Plodnost je od suštinskog značaja za biljku B. vulgaris iz predmetnog pronalaska kako bi ona mogla da se iskoristi u poljoprivredi.

[0110] Jedan primer za poljoprivredno iskoristivu biljku B. vulgaris je šećerna repa. Kada se gaji na površini od jednog hektara (oko 80.000 do 90.000 biljaka šećerne repe), biljka šećerne repe iz predmetnog pronalaska poželjno treba da služi za proizvodnju najmanje 4 tone šećera.

[0111] Alternativno, biljka šećerne repe iz predmetnog pronalaska poželjno treba da ima sadržaj šećera od 15-20%, poželjno najmanje 17% kako bi bila poljoprivredno iskoristiva. Tako, biljke šećerne repe koje imaju sadržaj šećera između 15-20%, poželjno najmanje 17%, predstavljaju poželjno otelotvorenje predmetnog pronalaska.

[0112] Biljke iz predmetnog pronalaska mogu da se identifikuju koristeći bilo koji postupak genotipske analize. Genotipsko ispitivanje biljaka uključuje tehnike kao što su elektroforeza izoenzima, polimorfizam dužine restrikcionih fragmenata (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP), nasumično amplifikovana polimorfna DNK (Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD), proizvoljno kondicionirana lančana reakcija polimerizacije (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction, AP-PCR), PCR specifična za alel (AS-PCR), amplifikacija DNK otiska (DNA Amplification Fingerprinting, DAF), regioni amplifikovani na osnovu poznate sekvence (Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR), polimorfizam dužine amplifikovanih fragmenata (Amplified Fragment Length Polymorphisms, AFLP), jednostavna ponavljanja sekvence (Simple Sequence Repeats, SSR) koja se takođe nazivaju „mikrosateliti“. Dodatne kompozicije i postupci za analizu genotipa biljaka koje su ovde date uključuju postupke koji su otkriveni u U.S. publikaciji br.

2004/0171027, U.S. publikaciji br.2005/02080506 i U.S. publikaciji br.2005/0283858.

[0113] Biljka Beta vulgaris koja je ovde opisana i/ili delovi biljke koji mogu da se sakupe ili materijal za propagaciju koji je ovde opisan mogu da se koriste za proizvodnju/gajenje biljaka Beta vulgaris. Postupci za proizvodnju/gajenje biljaka B. vulgaris su opisani na drugom mestu u ovom tekstu. Takvi postupci za proizvodnju/gajenje mogu da se koriste za dobijanje biljaka B. vulgaris iz predmetnog pronalaska koje dalje sadrže nove osobine biljke kao što je otpornost na stres, kao što je bez ograničenja stres usled suše, vreline, hladnoće ili soli, i slično.

[0114] Bolje razumevanje predmetnog pronalaska i njegovih brojnih prednosti će se steći pomoću sledećih primera.

Primer 1: Izolovanje mutanta

[0115] Ćelijske kulture šećerne repe su započete od sadnica diploidne šećerne repe genotipa 7T9044 (kao što je, na primer, opisao Alexander Dovzhenko, doktorska disertacija, naslov: „Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.)“, Ludwig-Maximilians-Universität Munchen, Nemačka, 2001).

[0116] Seme šećerne repe je tokom 60 sekundi potopljeno u 70% etanol, zatim je dva puta isprano u sterilnoj vodi sa 0,01% deterdženta i zatim inkubirano tokom 1-4 sata u 1% NaOCI izbeljivaču. Nakon toga, seme je 3 puta isprano sterilnom H2O i seme je skladišteno u sterilnoj H2O preko noći na 4 °C. Embrioni su zatim izolovani koristeći forceps i skalpel.

[0117] Sveže pripremljeni embrioni su potopljeni u 0,5% NaOCI tokom 30 min, a zatim 3 puta isprani u sterilnoj H2O. Nakon poslednjeg koraka ispiranja, stavljeni su na MS agar medijum bez hormona (Murashige i Skoog (1962), Physiol. Plantarum, 15, 473-497).

Embrioni koji su se razvili u sterilne sadnice korišćeni su za započinjanje ćelijskih kultura šećerne repe koje mogu da se regenerišu.

[0118] Kotiledoni i hipokotili su isečeni na segmente dugačke 2-5 mm i zatim uzgajani na MS medijumu koji je solidifikovan agarom (0,8%) koji sadrži 1 mg/l benzilaminopurina (BAP) ili 0,25 mg/l tidiazurona (TDZ).4 nedelje kasnije, kulture izdanaka u razvoju su prebačene na sveži MS agar medijum istog sastava i zatim supkulturisane u mesečnim intervalima. Kulture su držane na 25 °C pod prigušenim svetlom sa ciklusom 12 h / 12 h svetla / mraka.

[0119] Nakon 7-10 dana, supkulture kultura izdanaka uzgajane na medijumu koji sadrži tidiazuron formirale su posebnu vrstu kalusa, koji je bio brzorastući, mek i krhak. Ova vrsta kalusa je bila žućkaste do svetlozelene boje. Neki od ovih krhkih kalusa konzistentno su proizvodili primordijalne izdanke koji sadrže hlorofil od struktura nalik embrionu. Ovi brzorastući kalusi koji mogu da se regenerišu korišćeni su za odabir mutanata šećerne repe koji su tolerantni na herbicid ALS inhibitor.

[0120] Kada je ova vrsta kalusa izložena 10<-9>M herbicidu ALS inhibitoru foramsulfuronu (pripada potklasi sulfonilurea, videti iznad), ćelije su preživele, ali su proizvele manje od 50% biomase njihovih srodnika na medijumu na kome nema inhibitora. Na medijumu koji sadrži 3 × 10-8 M foramsulfuron nije mogao da se uoči rast.10<-7>M foramsulfuron je izabran za eksperimente za odabir mutanata u velikoj zapremini. Ćelijske kolonije koje preživljavaju i rastu su numerisane i prenete nakon 4-6 nedelja na svež medijum koji sadrži 3 × 10<-7>M inhibitor. Jedna od ovih ćelijskih kolonija je uspela da raste ne samo pri ovoj koncentraciji inhibitora već i u prisustvu 3 × 10<-6>M foramsulfurona.

[0121] Od ovog klona (SB574TL), izdanci su regenerisani u prisustvu herbicida ALS inhibitora i izdanci su zatim prebačeni na MS medijum koji sadrži 0,05 mg/l naftalen sirćetne kiseline (NAA).

[0122] U roku od 4-12 nedelja izdanci su formirali korenje i zatim su prebačeni u sterilne posude za biljke napunjene vlažnim, sterilizovanim perlitom, zalivane MS neorganskim sastojcima sa pola jačine. Alternativno, sadnice su prebačene neposredno iz medijuma koji je solidifikovan agarom u smešu zemljišta koje sadrži perlit u staklenoj bašti. Tokom prvih 10-15 dana nakon prebacivanja u zemljište koje sadrži supstrat, biljke su držane u okruženju sa visokom vlažnošću vazduha. Tokom navikavanja na uobičajeni režim vlažnosti vazduha u staklenoj bašti i nakon toga, biljke su držane u staklenoj bašti pod veštačkim osvetljenjem (12 h) na dnevnoj /noćnoj temperaturi od 20 -3 °C/ 15+-2 °C.

[0123] 3-5 nedelja kasnije, regenerisane biljke iz prethodno dobijene ćelijske kulture tolerantne na foramsulfuron (SB574TL) kao i od ćelijskih kultura divljeg tipa tretirane su foramsulfuronom, jodsulfuron-metil natrijumom (CAS RN 144550-3-7) i smešom oba aktivna sastojka. Doze herbicida koje su testirane bile su jednake 7-70 g a.i./ha za foramsulfuron i 1-10 g a.i./ha za jodsulfuron-metil natrijum. Regenerisane biljke iz ove tolerantne ćelijske linije podnosile su čak i najviše doze herbicida (foramsulfuron, jodsulfuron-metil natrijum i njihove smeše u odnosu 7:1 kada su čak i najniže doze ubile biljke divljeg tipa.

Primer 2: Testiranje potomstva

[0124] Zasnovano na SB574TL, F2 i F3 seme eksperimentalnih hibrida koji daju rezistentni alel u heterozigotnom stanju kao i F4-F6 seme koje daje mutantni alel u homozigotnom stanju zasejano je u polju i tretirano foramsulfuronom, jodsulfuron-metil natrijumom, kao i smešama oba herbicida ALS inhibitora kada je biljka razvila 3-5 listova u obliku rozete. Homozigotne sadnice su tolerisale smeše od 35 g foramsulfurona/ha 7 g jodsulfuron-metil natrijuma/ha bez usporavanja rasta ili bilo kojih znaka vidljive štete. Heterozigotne linije su pokazale znake usporenog rasta i određenu hlorozu listova pri ovim stopama, ali su se oporavile u roku od 3-5 nedelja, dok su herbicidi ALS inhibitori ubili konvencionalne sadnice šećerne repe.

Primer 3: Molekulska karakterizacija dobijenog mutanta šećerne repe (SB574TL) (samo kao referenca)

[0125] Ekstrakcija i analiza sekvence nukleinske kiseline dobijenog mutanta obavljena je od strane LGC Genomics GmbH, Berlin, Nemačka u skladu sa izmenjenim i dopunjenim standardnim protokolima.

[0126] Sekvenca nukleinske kiseline dobijena od SB574TL mutanta šećerne repe prikazana je ispod u SEQ ID NO: 3, gde SEQ ID NO: 4 predstavlja odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu, dok je SEQ ID NO: 1 dobijena nakon sekvenciranja biljke šećerne repe divljeg tipa koja je uzeta kao polazna supstanca. SEQ ID NO: 2 predstavlja odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu šećerne repe divljeg tipa.

[0127] Poređenje ovih sekvenci jasno pokazuje da postoji samo jedna mutacija na poziciji 569 ali da nije došlo ni do jedne druge promene u bilo kom drugom delu ovog endogenog gena ALS ovog biljnog materijala šećerne repe.

Primer 4: Merenje aktivnosti enzima (samo kao referenca)

[0128] Kodirajuća sekvenca divljeg tipa Beta vulgaris i gen ALS W574L mutanta (SB574TL) klonirani su u vektore Novagen pET-32a(+) i vektori su transformisani u AD494 liniju Ešerihije koli u skladu sa uputstvom proizvođača. Bakterije su uzgajane na 37 °C u LB medijumu (Luria-Broth medijum) koji sadrži 100 mg/l karbenicilina i 25 mg/l kanamicina, indukovane su sa 1 mM izopropil-b-D-tiogalaktopiranozidom sa OD600oko 0,6, kultivisane tokom 16 sati na 18 °C i sakupljene centrifugiranjem. Bakterijski peleti su ponovo suspendovani u 100 mM natrijum fosfatnom puferu pH 7,0 koji sadrži 0,1 mM tiamin pirofosfat, 1 mM MgCl2, i 1 µM FAD sa koncentracijom od 1 gram vlažne mase na 25 ml pufera, i ometani su sonifikacijom. Sirovi proteinski ekstrakt koji je dobijen nakon centrifugiranja korišćen je za merenje aktivnosti ALS.

[0129] Testovi ALS su obavljeni u mikrotitarskim pločama sa 96 bunarčića koristeći modifikaciju procedure koju je opisao Ray (1984). Reakciona smeša je sadržala 20 mM kalijum fosfatni pufer pH 7,0, 20 mM natrijum piruvat, 0,45 mM tiamin pirofosfat, 0,45 mM MgCl2, 9 µM FAD, ALS enzim i različite koncentracije inhibitora ALS u finalnoj zapremini od 90 µl. Testovi su započeti dodavanjem enzima i prekinuti nakon 75 min inkubacije na 30 °C putem dodavanja 40 µl 0,5 M H2SO4. Nakon 60 min na sobnoj temperaturi, dodato je 80 µl rastvora 1,4% a-naftola i 0,14% kreatina u 0,7 M NaOH i nakon još 45 min inkubacije na sobnoj temperaturi apsorbanca je određena na 540 nm. Vrednosti p150 za inhibiciju ALS su utvrđene kao što je opisao Ray (1984) koristeći program za postavljanje krive XLFit dodatak za Excel verzija 4.3.1 autora ID Business Solutions Limited.

[0130] Sveukupno, mutantni enzim je bio najmanje 2000 puta manje osetljiv na inhibitor ALS foramsulfuron nego enzim divljeg tipa.

Primer 5: Merenje aktivnosti enzima (iz biljaka) (samo kao referenca)

[0131] ALS je ekstrahovan iz listova šećerne repe ili kultura tkiva šećerne repe kao što je opisao Ray (1984), Plant Physiol 75:827-831.

[0132] Aktivnost ALS je utvrđena u ekstraktima listova divljeg tipa i šećernoj repi i ekstraktima listova dobijenog SB574TL u prisustvu različitih koncentracija foramsulfurona kao što je opisano u primeru 4.

[0133] Sveukupno, mutantni enzim je bio najmanje 2000 puta manje osetljiv na inhibitor ALS foramsulfuron nego enzim divljeg tipa.

Primer 6 Ispitivanje na terenu putem korišćenja homozigotnih biljaka šećerne repe tolerantnih na herbicid ALS inhibitor

[0134] Zasnovano na SB574TL, F4-F6 seme koje ima mutantni alel endogenog gena ALS u homozigotnom stanju korišćeno je za dalje testiranje. Seme biljke homozigotnih SB574TL mutantnih biljaka i seme uobičajene sorte KLARINA (uobičajeno dostupne referentne sorte šećerne repe osetljive na inhibitor ALS, koje nemaju odgovarajuću mutaciju na poziciji 569 u svom proteinu ALS) zasejano je u polju i raslo je do različitih faza rasta u skladu sa standardom BBCH (kao što je definisano u monografiji „Entwicklungsstadien mono- und dikotyler Pflanzen“, 2. izdanje, 2001, izd. Uwe Meier, Biologische Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft).

[0135] Nakon toga, biljke su tretirane odgovarajućim herbicidima ALS inhibitorima kao što je navedeno ispod u tabeli 1 i koji su identični onima koji su korišćeni tokom procedure odabira.

[0136] Količina vode koja se koristi u različitim primenama bila je 200 l/ha.

[0137] 8, 14 i 28 dana (kao što je naznačeno u tabeli 1) nakon primene (DAA) odgovarajućih herbicida ALS inhibitora, oštećenje (fitotoksičnost/fito) na različitim biljkama šećerne repe ocenjeno je na skali od 0% do 100%.

[0138] U ovom kontekstu, „0%“ znači „nema fitotoksičnosti/fito“, a „100%“ znači da su biljke u potpunosti ubijene.

Tabela 1

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Biljka Beta vulgaris tolerantna na herbicide ALS inhibitore i njeni delovi koji sadrže mutaciju na poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 endogenog gena acetolaktat sintaze (ALS) prikazanog u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO:1, pri čemu gen ALS kodira polipeptid ALS koji sadrži aminokiselinu leucin na poziciji 569 polipeptida ALS, pri čemu su pomenuta biljka Beta vulgaris i njeni delovi homozigotni za mutaciju gena ALS, pri čemu je pomenuta biljka Beta vulgaris netransgena u pogledu pomenutog endogenog gena ALS, pri čemu, kodon na pomenutoj poziciji koja odgovara poziciji 1705-1707 je TTG, i pri čemu je biljka Beta vulgaris najmanje 100 puta manje osetljiva na inhibitor ALS.

2. Biljka Beta vulgaris i njeni delovi prema zahtevu 1, pri čemu polipeptid ALS ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci ALS SEQ ID NO: 2.

3. Biljka Beta vulgaris i njeni delovi prema zahtevu 1, pri čemu gen ALS kodira polipeptid ALS koji sadrži leucin na poziciji 569 sekvence polipeptida ALS kao što je prikazano u SEQ ID NO: 2.

4. Biljka Beta vulgaris i njeni delovi prema zahtevu 1, pri čemu je endogeni gen ALS identičan nukleotidnoj sekvenci koja je definisana sa SEQ ID NO: 3.

5. Biljka Beta vulgaris i njeni delovi prema zahtevu 1, tolerantni na jedan ili više herbicida ALS inhibitora koji pripadaju grupi koja se sastoji od sulfonilurea herbicida, sulfonilaminokarbonil triazolinonskih herbicida, imidazolinonskih herbicida, triazolopirimidinskih herbicida i pirimidinil(tio)benzoatnih herbicida.

6. Biljka Beta vulgaris i njeni delovi prema zahtevu 1, pri čemu je mutacija homozigotno prisutna kao jedina mutacija endogenog gena acetolaktat sintaze (ALS).

7. Biljka Beta vulgaris i njeni delovi prema zahtevu 1, pri čemu je biljka Beta vulgaris najmanje 500 puta manje osetljiva na inhibitor ALS.

8. Delovi biljke Beta vulgaris prema zahtevu 1, pri čemu su delovi organi, tkiva i ćelije biljke, a poželjno seme.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd

50