RS64754B1 - Fasl-izrađeni biomaterijali sa imunomodularnom funkcijom - Google Patents

Fasl-izrađeni biomaterijali sa imunomodularnom funkcijom

Info

Publication number
RS64754B1
RS64754B1 RS20230876A RSP20230876A RS64754B1 RS 64754 B1 RS64754 B1 RS 64754B1 RS 20230876 A RS20230876 A RS 20230876A RS P20230876 A RSP20230876 A RS P20230876A RS 64754 B1 RS64754 B1 RS 64754B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fasl
biomaterial
cells
patient
cell
Prior art date
Application number
RS20230876A
Other languages
English (en)
Inventor
Haval Shirwan
Andres J Garcia
Esma S Yolcu
Hong Zhao
Devon Headen
Original Assignee
University Of Louisville Research Foundation Inc
Georgia Tech Res Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Louisville Research Foundation Inc, Georgia Tech Res Inst filed Critical University Of Louisville Research Foundation Inc
Publication of RS64754B1 publication Critical patent/RS64754B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/178—Lectin superfamily, e.g. selectins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/02—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with means providing suspensions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Description

Opis
OBLAST
[0001] Ovde su opisani FasL-izrađeni biomaterijali i biomaterijali za upotrebu, kao što je za imunomodulaciju, kao što je za tretman autoimunih bolesti uključujući dijabetes tipa 1 i sprečavanje ili smanjenje rizika od odbacivanja transplantata.
STANJE TEHNIKE
[0002] Transplantacija stranih ćelija (kao što su koštana srž i matične ćelije), tkiva (kao što su ostrvca pankreasa) i organa (kao što su bubrezi, srce, jetra) postala je važna i efikasna terapijska alternativa za pacijente sa određenim bolestima. Međutim, transplantacija stranih transplantata između genetski različitih pacijenata (alotransplantati između pripadnika iste vrste ili ksenotransplantati između pripadnika različitih vrsta) ograničena je mogućnošću kontrole imunološkog prepoznavanja i odbacivanja transplantata od strane primaoca. Čak i za autotransplantate (gde su ćelije transplantata izvedene iz sopstvenog tkiva pacijenta, na primer, indukovanom pluripotencijom), efikasnost transplantacije će zavisiti od kontrole autoimunog odgovora na transplantate.
[0003] Na primer, transplantacija koštane srži (BM) se smatra izuzetno obećavajućim tretmanom za hematopoetske i autoimune poremećaje i za određene vrste raka. Jedna od prepreka transplantaciji koštane srži je mogućnost odbacivanja transplantiranog tkiva, posredovana T ćelijama i NK ćelijama domaćina. Bolest transplantat-protiv-domaćina (GvHD) je još jedna moguća štetna posledica transplantacije koštane srži. donorske T ćelije u transplantiranom tkivu mogu pokrenuti imuni odgovor protiv vitalnih organa domaćina, što često dovodi do smrti domaćina. Reakcije domaćina protiv transplantata i GvHD stoga ograničavaju kliničku upotrebu transplantacije koštane srži, koja bi inače mogla da se široko koristi za tretman različitih bolesti i za sprečavanje odbacivanja stranog transplantata.
[0004] Dijabetes tipa 1 (T1D) je autoimuna bolest koju karakteriše gubitak mase β-ćelija koje proizvode insulin, i time i kontrole glikemije, usled koordinisanog imunološkog odgovora protiv β-ćelija specifičnih antigena koji zahtevaju CD4+ T ćelije. Obnavljanje mase β-ćelije putem alogene transplantacije ostrvaca je trenutno poželjna klinička intervencija za poboljšanje kontrole glikemije kod pacijenata sa teškom glikemijskom nestabilnošću. Čak i sa autolognim proizvodima beta ćelija, kontrola imunog odgovora na autologne ćelije će ostati važna za terapijsku efikasnost. Dugovečnost alogenih transplantata je ograničena ne samo imunološkim odgovorima domaćina, već i sekundarnim neuspehom transplantata zbog toksičnih efekata hronične imunosupresije potrebne za kontrolu odbacivanja.
[0005] Imunosupresivni farmakološki agensi su glavni oslonac režima za kontrolu odbacivanja alotransplantata. Iako su takvi lekovi efikasni u smanjenju ozbiljnosti epizoda odbacivanja, oni su nespecifični i ne stvaraju stanje trajne tolerancije specifične za transplantat. Kontinuirano izlaganje primaoca ovim imunosupresivnim agensima je stoga povezano sa značajno povećanim rizikom od oportunističkih infekcija i maligniteta. Pored toga, ovi nespecifični imunosupresivni agensi mogu izazvati ozbiljne i neželjene efekte kod domaćina. Ovi neželjeni efekti često nadmašuju koristi za pacijente sa bolestima u kojima telo identifikuje određene delove sebe kao „strane“ i pokreće adaptivni imunološki napad koji dovodi do autoimunosti, kao što je primećeno kod dijabetesa tipa 1, artritisa, lupusa i višestrukih skleroza.
[0006] Trenutna klinička praksa je primena imunosupresiva koji sprečavaju aktivnost T-ćelija. Takvi imunosupresivi se primenjuju tokom dužeg perioda u tretmanu autoimunih bolesti, a često i tokom života pacijenta koji je primio strane transplantate. Potreba za dugotrajnom upotrebom imunosupresiva čini uspešan tretman zavisnim od čestog medicinskog nadzora i izlaže pacijenta ozbiljnim neželjenim efektima lekova.
[0007] Headen, DM: „Microfluidics-based Microgel Synthesis for Immunoisolation and Immunomodulation in Pancreatic Islet Transplantation“, (XP055542432, maj 2017.), ukazuje da su dizajnirani mikrogelovi PEG-4MAL koji mogu zarobiti i ispoljavati himerni SA-FasL protein u njegovom bioaktivnom obliku, ali ne obelodanjuje kako je to postignuto.
[0008] Prema tome, postoji potreba za sastavima i postupcima korisnim za efekat imunomodulacije, kao što je sprečavanje ili smanjenje rizika od odbacivanja ćelijskih ili tkivnih transplantata i/ili tretman dijabetesa tipa I. Takođe postoji potreba za sastavima i postupcima korisnim za izazivanje imunološke tolerancije. SAŽETAK PRONALASKA
[0009] Pronalazak je FasL-izrađen biomaterijal kako je definisano u patentnom zahtevu 1, kao i biomaterijal kako je definisano u patentnom zahtevu 10 za upotrebu u izazivanju imunološke tolerancije, i postupak za pravljenje takvih FasL-izrađenih biomaterijala kako je definisano u patentnom zahtevu 21.
[0010] U skladu sa pronalaskom, pružen je biomaterijal izrađen za ispoljavanje FasL proteina, gde je hidrogel izrađen da ispoljava FasL proteine, i gde hidrogel sadrži himerni FasL protein koji sadrži FasL deo i streptavidinski ili avidinski deo konjugovan preko biotina za hidrogel. U skladu sa nekim otelotvorenjima, hidrogel je polietilen glikol (PEG) mikrogel izrađen da prikaže deo biotina. U skladu sa nekim otelotvorenjima, pruženi su polietilen glikol (PEG) hidrogelovi koji pokazuju FasL protein. U specifičnim otelotvorenjima, hidrogelovi mogu da sadrže delove biotina konjugovane sa SA-FasL delovima.
[0011] U skladu sa bilo kojim otelotvorenjem, FasL deo može biti FasL protein otporan na matričnu metaloproteinazu.
[0012] U skladu sa bilo kojim otelotvorenjem, biomaterijal može da sadrži imunosupresivni lek, kao što je rapamicin. FasL-izrađeni hidrogelovi mogu dalje da sadrže imunosupresivni lek, kao što je rapamicin. FasL-izrađeni biomaterijali ili hidrogelovi koji dalje sadrže imunosupresivni lek mogu pružiti kontrolisano oslobađanje leka.
[0013] U skladu sa bilo kojim otelotvorenjem, biomaterijal može sadržati ćeliju transplantata, kao što su PBMC, ćelije koštane srži, hematopoetske matične ćelije, matične ćelije, mezenhimalne matične ćelije, dendritske ćelije, dendritske ćelije pulsirane autoantigenima, proizvode ljudskih beta ćelija i splenocite. Ćelija transplantata može biti inkapsulirana u biomaterijalu.
[0014] U skladu sa pronalaskom, pružen je biomaterijal prema pronalasku za upotrebu u izazivanju imunološke tolerancije kod pacijenta koji ima potrebu za tim. U skladu sa nekim otelotvorenjima, primena je transplantacijom.
[0015] U skladu sa bilo kojim otelotvorenjem, pacijent može biti čovek, primat koji nije čovek, svinja, pas, mačka, krava, ovca, konj, zec, miš ili pacov.
[0016] U nekim otelotvorenjima, pacijentu je potrebna imunološka tolerancija na ćeliju transplantata, kao što su PBMC, ćelije koštane srži, hematopoetske matične ćelije, matične ćelije, mezenhimalne matične ćelije, dendritske ćelije, dendritske ćelije pulsirane autoantigenima, proizvodi ljudskih beta ćelija, i splenociti. Biomaterijal može da se koristi za prevenciju ili smanjenje rizika od odbacivanja ćelijskih ili tkivnih transplantata i/ili za tretman dijabetesa tipa 1.
[0017] U skladu sa bilo kojim otelotvorenjem, biomaterijal je za upotrebu kod pacijenta, gde je pacijentu potrebna imunološka tolerancija na ćeliju transplantata, kao što su PBMC, ćelije koštane srži, hematopoetske matične ćelije, matične ćelije, mezenhimalne matične ćelije, dendritske ćelije, dendritske ćelije pulsirane sa autoantigenima, proizvodima ljudskih beta ćelija i splenocitima. U nekim otelotvorenjima, biomaterijal sadrži ćeliju transplantata. U nekim otelotvorenjima, ćelija transplantata je inkapsulirana u biomaterijalu.
[0018] U nekim otelotvorenjima, pacijentu je potreban tretman za dijabetes tipa 1, i biomaterijal može biti za upotrebu pri primeni ćelija ostrvaca pankreasa pacijentu. U nekim otelotvorenjima, pacijentu su potrebni tretman ili prevencija odbacivanja alotransplantata, i biomaterijal može biti za upotrebu pri primeni ćelijama pacijenta od donora alotransplantata. U nekim otelotvorenjima, pacijentu su potrebni tretman ili prevencija odbacivanja ksenotransplantata, i biomaterijal može biti za upotrebu pri primeni ćelijama pacijenta od donora ksenotransplantata. U nekim otelotvorenjima, donor ksenotransplantata je čovek, primat koji nije čovek, svinja, pas, mačka, krava, ovca, konj, zec, miš ili pacov. U nekim otelotvorenjima, pacijentu su potrebni tretman ili prevencija odbacivanja autotransplantata, i opciono pacijentu se primenjuju autologne ćelije transplantata. U nekim otelotvorenjima, autologne ćelije transplantata se mogu dobiti indukovanom pluripotencijom. U nekim otelotvorenjima, pacijentu su potrebni tretman ili prevencija autoimunosti, i opciono pacijentu se primenjuje autoantigen ispoljen na ćeliji odabranoj od (i) ćelije koja eksprimira autoantigen (ii) ćelije dekorisane autoantigenom i (iii) dendritske ćelije pulsirane autoantigenom.
[0019] U skladu sa nekim otelotvorenjima, pružen je postupak pravljenja biomaterijala prema pronalasku kako je definisano u patentnom zahtevu 21.
KRATAK OPIS SLIKA
[0020]
SLIKA 1 prikazuje grafički prikaz proizvodnje mikrogelova kako je ovde opisano koji pružaju kontrolisano ispoljavanje imunomodulatornih proteina. SLIKA 1A prikazuje grafički kako su mikrofluidi koji fokusiraju protok korišćeni za generisanje biotinilovanih mikrogelova iz PEG-4MAL makromera funkcionalizovanih biotinom. SA-FasL je imobilisan na biotinilovanim mikrogelovima, i rezultujući imunomodulatorni SA-FasL mikrogelovi su ko-transplantirani sa ostrvcima ispod kapsule bubrega dijabetičkih miševa, izazivajući prihvatanje transplantata. SLIKA 1B pokazuje da mikrogelovi sa vezanim biotinom (gornji levi panel, sivi) mogu da zahvate streptavidin (svetlo sivi, donji levi panel), i da mikrogelovi bez biotina nisu zarobili streptavidin (desni paneli). (skala stubića 200 µm). SLIKA 1C pokazuje biotinilovane mikrogelove koji hvataju i ispoljavaju streptavidin (SA) na dozno-zavisni način sve dok se ne postigne zasićenje na 150 µg/mL. SLIKA 1D pokazuje da SA-FasL ispoljen na mikrogelovima održava bioaktivnost i indukuje dozno-zavisnu apoptozu u FasL-osetljivim ćelijama.
SLIKA 2 prikazuje slike koje prikazuju da FasL-izrađeni mikrogelovi produžavaju zadržavanje SA-FasL in vivo. SA-FasL je označen skoro IR bojom i implantiran ispod kapsule bubrega miševa i snimljen in vivo. SLIKA 2A prikazuje reprezentativne slike lokalizacije SA-FasL na mestu transplantata kada se ispoljava na mikrogelovima, za razliku od difuznog signala merenog kod životinja koje su primale bez SA-FasL. Toplotne mape su konzistentne kod životinja u istoj grupi tretmana. Slike nisu prikazane za dane 18 i 21 jer je signal bio zanemarljiv. SLIKA 2B prikazuje grafikon koji prikazuje kvantifikaciju in vivo uklapanja krive fluorescencije i eksponencijalnog raspada, što pokazuje da mikrogelovi koji pokazuju SA-FasL produžavaju zadržavanje proteina u poređenju bez SA-FasL (p < 0,0001; n=8).]
SLIKA 3 pokazuje preživljavanje alogenih ostrvaca transplantata koji su ko-transplantirani sa SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima. SLIKA 3A prikazuje grafik koji prikazuje preživljavanje transplantat ostrvaca. Biotinilovani mikrogelovi su izrađeni sa SA-FasL (1 µg proteina/1000 mikrogelova) i ko-transplantirani sa nemodifikovanim BALB/c ostrvcima (500/transplantat) ispod kapsule bubrega hemijski dijabetičkih C57BL/6 primalaca. Rapamicin je korišćen u dozi od 0,2 mg/kg dnevno i.p. injekcija za 15 doza počevši od dana transplantacije u naznačenim grupama. Životinje su praćene za nivoe glukoze u krvi i dva uzastopna dnevna očitavanja > 250 mg/dL smatrana su dijabetičkim (odbacivanje) (p < 0,0001, **p < 0,01, ***p < 0,001). SLIKA 3B pokazuje imunobojenje dugotrajnog funkcionalnog transplantata (> 200 dana) i odbačenog transplantata od primalaca koji primaju SA-FasL-ispoljavajuće mikrogelove. Samo funkcionalni transplantati (gornji panel) pokazali su insulin pozitivne strukture (svetlo siva oblast) i DNK (tamno siva). Odbačeni transplantati (donji panel) nisu pokazali bojenje insulinom. Beli vrhovi strelica ukazuju na mikrogelove. Tkivo je obojeno za DNK (tamno sivo). (skala stubića 100 µm). SLIKA 3C prikazuje grafikon koji prikazuje da miševi sa transplantiranim transplantat ostrvcima koji su ko-transplantirani sa SA-FasL mikrogelom i rapamicinom pokazuju isti odgovor glukoze kao miševi sa naivnim ostrvcima na dan 200 dana nakon transplantacije.
SLIKA 4 prikazuje grafikone koji prikazuju praćenje imunog sistema i ulogu CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>Treg ćelije u prihvatanju transplantat ostrvaca. SLIKA 4A prikazuje grafikone koji prikazuju sistemski odgovor dugotrajnih preživelih sa transplantatima na donorske antigene. Splenociti iz navedenih grupa su označeni karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE) i korišćeni su kao responderi na ozračeni BALB/c donor i C3H stimulatore treće strane u ex vivo mešovitom testu reakcije limfocita. Razblaživanje CFSE boje u CD4<+>i CD8<+>T ćelijama je procenjeno korišćenjem antitela na CD4 i CD8 molekule u protočnoj citometriji i prikazano je kao procenat deobe za svaku ćelijsku populaciju. SLIKA 4B prikazuje analizu vremenskog toka tipova imunih ćelija. Pojedinačne ćelije pripremljene iz limfnih čvorova slezine, bubrega i bubrežnih limfnih čvorova naznačenih grupa na dane 3 i 7 nakon transplantacije ostrvaca obojene su fluorescentno označenim antitelima na molekule ćelijske površine koji definišu CD4<+>Teff (CD4<+>CD44<hi>CD62L<lo>), CD8<+>Teff (CD8<+>CD44<hl>CD62L<lo>), i Treg (CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>) populacije i analizirane su pomoću protočne citometrije. Prikazani su odnosi Treg prema CD4<+>Teff i CD8<+>Teff (srednja vrednost ± SEM,<∗>p < 0,05,<∗∗>p < 0,005). SLIKA 4C prikazuje grafikone koji prikazuju da iscrpljivanje Treg ćelija dovodi do akutnog odbacivanja uspostavljenih transplantat ostrvaca. CS7BL/6.FoxP3<EGFP/DTR>miševi (n=5) su transplantirani sa BALB/c transplantat ostrvcima i SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima pod prolaznim pokrivačem rapamicina (primenjen i.p. dnevno u dozi od 0,2 mg/kg za 15 doza). Ovi miševi su zatim injektirani i.p. sa 50 µg/kg toksina difterije na dan 50 nakon transplantacije (strelica) kako bi se iscrpele Treg ćelije.
SLIKA 5 prikazuje grafikon koji prikazuje da su Treg ćelije potrebne za prihvatanje transplantat ostrvaca. Smanjenje Treg ćelija dovodi do akutnog odbacivanja uspostavljenih transplantat ostrvaca. CS7BL/6.FoxP3<EGFP/DTR>miševi su transplantirani sa BALB/c transplantat ostrvcima i SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima pod prolaznim pokrivačem rapamicina (primenjen ip dnevno u dozi od 0,2 mg/kg za 15 doza). Kohorta miševa je injektirana i.p. sa 50 µg/kg toksina difterije na dan 50 nakon transplantacije (strelica) kako bi se iscrpele Treg ćelije, dok je druga grupa ostavljena netretirana.
SLIKA 6 pokazuje imunološko prihvatanje alogenih transplantat ostrvaca koja su ko-transplantirani sa SA-FasL mikrogelovima u epididimalnom masnom jastučiću. SLIKA 6A prikazuje grafik koji prikazuje preživljavanje transplantiranih ostrvaca. Biotinilovani mikrogelovi su izrađeni sa SA-FasL (1 µg proteina/1000 mikrogelova) i ko-transplantirani sa nemodifikovanim BALB/c ostrvcima (600/masni jastučić, 1200 ukupno/primalac) u epididimalnu masnu podlogu kod pacijenata sa hemijskim dijabetesom C57BL/6. Rapamicin je korišćen u dozi od 0,2 mg/kg dnevno i.p. injekcija za 15 doza počevši od dana transplantacije. Životinje su praćene u pogledu nivoa glukoze u krvi i dva uzastopna dnevna očitavanja od ≥ 250 mg/dL smatrana su dijabetičkim (odbacivanje) (p < 0,0008).
SLIKA 6B prikazuje slike imunološkog bojenja dugotrajnog funkcionalnog transplantata (> 60 dana) od miševa koji su primali SA-FasL mikrogelove rapamicin koji pokazuju glukagon i insulin pozitivne strukture. DNK-obojen DAPI označava ćelije i pozitivne i negativne na glukagon ili insulin. (skala stubića 50 µm). SLIKA 6C prikazuje grafikon koji ne prikazuje nikakve razlike između SA-FasL mikrogela i kontrolnih grupa u nivoima jetrenih enzima u serumu (isprekidana linija označava normalne gornje nivoe enzima), i paneli ispod grafikona prikazuju slike histoloških preseka koji ne otkrivaju razlike u nivoima jetrenih enzima između SA-FasL mikrogela i kontrolne grupe.
SLIKA 7 prikazuje grafikon koji prikazuje da je SA-FasL vezan za biotinilovane mikrogelove na dozno-zavisni način. SA-FasL je označen AlexaFluor488 NHS esterom (Thermo Fisher), i slobodna boja je uklonjena odsoljavanjem u Zeba koloni (7k MWCO, Thermo Fisher) tri puta. Biotinilovani mikrogelovi (10<4>) su suspendovani u 500 µL SA-FasL ili samo SA rastvora u navedenim koncentracijama tokom 1 sata. Mikrogelovi su zatim isprani centrifugiranjem 10 puta u 1% goveđem serumskom albuminu u PBS kako bi se uklonio nevezani protein. Funkcionalizovani mikrogelovi su stavljeni u ploču sa 96 komorica i očitani na Biotek HT340 čitaču ploča, i pozadinski signal (prazna komorica) je oduzet od svih vrednosti (n = 2 (SA) ili 3 (SA-FasL), srednja vrednost ± SEM).
Vrednosti fluorescencije su konvertovane u apsolutne koncentracije korišćenjem standardne krive.
SLIKA 8 prikazuje grafikon koji prikazuje da direktno vezivanje SA-FasL za PEG-4MAL makromer smanjuje bioaktivnost. Različite doze SA-FasL reagovane su sa 10 µL 10% PEG-4MAL makromera u rastvoru tokom 1 sata. Bilo netretirani rastvorljivi SA-FasL ili PEGilovani SA-FasL inkubirani su sa A20 ćelijama preko noći, i broj apoptotičkih ćelija je određen protočnom citometrijom nakon bojenja aneksinom V-APC i propidijum jodidom (n=2, srednja vrednost ± SEM).
SLIKA 9 prikazuje grafik koji prikazuje trajnu toleranciju na glukozu kod hemijski dijabetičkih C57BL/6 miševa transplantiranih sa mikrogelovima koji ispoljavaju SA-FasL (1 µg proteina/1000 mikrogelova); dok naivna BALB/c transplantat ostrvca (500) pokazuju toleranciju na glukozu samo pod kratkim pokrivačem rapamicina (primenjen i.p. dnevno po 0,2 mg/kg za 15 doza). Kontrole su uključivale miševe podvrgnute istom režimu, osim što su primali mikrogelove bez SA-FasL.
SLIKA 10 pokazuje da SA-FasL mikrogelovi ne utiču na zdravlje ili funkciju ostrvaca. Ostrvca pacova su kultivisana sa SA-FasL mikrogelovima (1:2 odnos ostrvca:mikrogel) tokom 24 sata.
SLIKA 10A prikazuje grafikon koji prikazuje metaboličku aktivnost u ostrvcima bez ili ostrvcima kotransplantiranim sa SA-FasL mikrogelovima. SLIKA 10B prikazuje grafik koji ne prikazuje nikakvu razliku u glukozom stimulisanoj sekreciji insulina između ostrvaca bez ili ostrvaca ko-transplantiranih sa SA-FasL mikrogelovima. SLIKA 10C pokazuje grafički prikaz koji otkriva da ostrvca kotransplantirana sa SA-FasL mikrogelovima (SA-FasL-M) pokazuju smanjenje sekrecije proinflamatornih citokina MIP-1 i IL6, ali ne i MCP-1 u poređenju sa ostrvcima bez (*p < 0,05,<∗∗>p < 0,01). SLIKA 10D prikazuje sliku živo-mrtvo bojenja, ne otkrivajući razliku u odnosu živih i mrtvih ćelija između ostrvaca bez ili ostrvaca ko-transplantiranih sa SA-FasL mikrogelovima. SLIKA 10E prikazuje slike imunog bojenja za insulin i glukagon i zajedničko bojenje za DNK sa DAP I, ne otkrivajući razliku između ostrvaca bez ili ostrvaca ko-transplantiranih sa SA-FasL mikrogelovima u pogledu eksprimiranja insulina i glukagona. (skala stubića 50 µm).
SLIKA 11 prikazuje slike preseka transplantata obojenog hemotoksilinom i eozinom u kapsuli bubrega na dan 21 nakon transplantacije kako bi se potvrdilo da su FasL mikrogelovi još uvek prisutni na mestu transplantata. Bele strelice pokazuju položaj mikrogelova.
SLIKA 12 prikazuje grafikon koji prikazuje da nefrektomija vraća pacijente transplantirane sa ostrvcima i SA-FasL mikrogelovima rapamicin u hiperglikemijsko stanje. Bubrezi su secirani na dan 200 nakon transplantacije (strelica).
SLIKA 13 prikazuje grafikon koji prikazuje preživljavanje transplantat ostrvaca nakon transplantacije SA-FasL mikrogelova koji su ko-transplantirani sa ostrvcima. Biotinilovani mikrogelovi su izrađeni sa SA-FasL (1 µg proteina/1000 mikrogelova, osim ako nije drugačije naznačeno) i ko-transplantirani sa nemodifikovanim ili SA-FasL izrađenim BALB/c ostrvcima (500/transplantat) ispod kapsule bubrega hemijski/dijabetičara C57BL 6 primalaca. Rapamicin je korišćen u dozi od 0,2 mg/kg dnevno i.p. injekcija za 15 doza počevši od dana transplantacije u naznačenim grupama. Životinje su praćene u pogledu nivoa glukoze u krvi i dva uzastopna dnevna očitavanja od ≥ 250 mg/dL smatrana su dijabetičkim (odbacivanje) (<∗>p < 0,05,<∗∗>p < 0,01).
SLIKA 14 prikazuje dijagrame protočne citometrije koji prikazuju proliferaciju imunih ćelija na osnovu CFSE testa. Splenociti sakupljeni od odabrane grupe primalaca transplantacije su označeni sa CFSE i korišćeni kao odgovor na ozračene (2000 cGi) splenocite od donora ili C3H miševa treće strane u standardnom in vitro testu proliferacije. Posle 4 dana u kulturi, ćelije su obojene sa 7AAD i fluorescentno konjugovanim Abs protiv CD4 i CD8, i analizirane na CFSE razblaživanje pomoću gejtinga na živim ćelijama korišćenjem BD LSR II. Podaci su analizirani korišćenjem Diva softvera.
SLIKA 15 prikazuje dijagrame protočne citometrije imunog profila slezine, bubrega i limfnih čvorova koji dreniraju bubrege odbacujućih i dugoročnih miševa (> 200 dana). Pojedinačne ćelije su pripremljene iz slezine i limfnih čvorova nežnim mehaničkim raspršivanjem i iz bubrega sa ostrvcima varenjem kolagenazom. Ćelije su obojene upotrebom antitela na markere ćelijske površine ili intracelularni FoxP3. Podaci su prikupljeni korišćenjem BD LSR II i analizirani korišćenjem Diva softvera.
SLIKA 16 prikazuje protočnu citometrijsku analizu Teff i Treg ćelija u različitim tkivima primalaca transplantat ostrvaca u ranoj fazi nakon transplantacije. Pojedinačne ćelije pripremljene iz limfnih čvorova slezine, bubrega i limfnih čvorova koji dreniraju bubrege naznačenih grupa na dane 3 i 7 nakon transplantacije ostrvaca obojene su fluorescentno označenim antitelima na molekule ćelijske površine za CD4<+>Teff (CD4<+>CD44<hi>CD62L<lo>), CD8<+>Teff (CD8<+>CD44<hi>CD62L<lo>), i Treg (CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>) ćelije i analizirane pomoću protočne citometrije. Prikazani su apsolutni brojevi ćelija u naznačenim tkivima (srednja vrednost ± SEM,<∗>p < 0,05,<∗∗>p < 0,01,<∗∗∗>p < 0,005).
SLIKA 17 prikazuje grafikone koji prikazuju da DT primena FoxP3/DTR miševima iscrpljuje Treg ćelije. Miševi su injektirani i.p. sa toksinom difterije (50 µg/kg telesne težine). SLIKA 17A prikazuje grafik koji prikazuje da je iscrpljivanje Treg ćelija prolazno kao što je određeno protočnom citometrijom. SLIKA 17B prikazuje grafikon koji prikazuje nivoe glukoze u krvi nakon DT primene FoxP3/DTR miševima.
SLIKA 18 prikazuje grafikon koji prikazuje nivoe glukoze u krvi za transplantaciju epididimalnih masnih jastučića. Očitavanja su obavljena na hemijski dijabetičkim C57BL/6 miševima transplantiranim sa SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima (1 µg protein/1000 mikrogelova) i naivnim BALB/c transplantat ostrvcima (500) pod kratkim poklopcem rapamicina (primenjivan i.p. dnevno u dozi od 0,2 mg/kg za 15 doza).
DETALJAN OPIS
[0021] Posebni detalji različitih otelotvorenja pronalaska su navedeni u nastavku kako bi se ilustrovao pronalazak. U diskusiji koja sledi, opisana su specifična otelotvorenja različitih aspekata pronalaska. Trebalo bi razumeti da se bilo koja specifična otelotvorenja jednog aspekta može koristiti zajedno sa bilo kojim specifičnim otelotvorenjem drugog aspekta, čak i ako svaka moguća permutacija i kombinacija specifičnih otelotvorenja nije izričito izložena.
[0022] FasL-izrađeni biomaterijali, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, korisni su, na primer, za izazivanje imunološke tolerancije ili imunosupresije, što može biti poželjno u kontekstu tretiranja autoimunih bolesti ili tretiranja ili prevencije odbacivanja transplantata.
[0023] Nakon prepoznavanja i aktivacije antigena, T efektorske ćelije regulišu Fas receptor na svojoj površini i postaju osetljive na FasL-posredovanu apoptozu. Važno je da je FasL-posredovana apoptoza kritična za indukciju samotolerancije i održavanje, jer je Fas ili FasL nedostatak povezan sa masivnom autoimunošću i kod ljudi i kod glodara. Ovo sugeriše da ne postoje kompenzacioni mehanizmi za ovaj put, dodatno naglašavajući njegov značaj kao mete za imunomodulaciju.
[0024] FasL-izrađeni biomaterijali, kako je definisano u patentnom zahtevu 1, pružaju kontrolisano opterećenje, ispoljavanje i zadržavanje FasL proteina na ciljanim mestima in vivo, i efikasni su za imunomodulaciju. FasL-izrađeni biomaterijali mogu se primenjivati zajedno sa transplantatom (npr., sa ćelijama transplantata ili tkivom transplantata) i izazivaju imunološku toleranciju na transplantat.
Biomaterijali pronalaska mogu postići dugotrajnu, specifičnu imunosupresiju na mestu transplantata, izbegavajući toksičnost povezanu sa nespecifičnim, sistemskim farmakološkim imunosupresivima. Ovo je jedinstvena prednost u odnosu na gensku terapiju, jer nekontrolisano, kontinuirano eksprimiranje FasL, koji poseduje pleiotropne funkcije i različite načine eksprimiranja koji mogu biti različito regulisani od strane ciljanih tkiva (vezana za membranu ili rastvorljiva), može imati neželjene posledice. Zaista, ektopično eksprimiranje FasL korišćenjem genske terapije za imunomodulaciju u postavkama transplantacije rezultovalo je mešovitim i suprotnim ishodima sa nekim studijama koje pokazuju štetan uticaj eksprimiranja FasL na preživljavanje transplantata. Lokalizovana i trajna ispoljavanje FasL, kako je ovde opisana, prevazilazi komplikacije povezane sa ektopičnim eksprimiranjem FasL divljeg tipa u ciljanim tkivima korišćenjem genske terapije. Ovaj koncept lokalizovane imunomodulacije takođe ograničava potencijalne toksičnosti povezane sa agonističkim antitelima protiv Fas za imunomodulaciju.
[0025] FasL-izrađeni biomaterijali pronalaska pružaju fleksibilnost proizvoda koji se već prodaju za širu kliničku primenu, pošto se ovi imunomodulatorni materijali mogu pripremiti u vreme transplantacije i jednostavno pomešati sa ćelijama transplantata (kao što su ostrvca) za isporuka bez potrebe za inkapsulacijom ćelija transplantata ili manipulacijom ćelijama transplantata kako bi se predstavili proteini.
[0026] CD8<+>i CD4<+>T efektorske ćelije, posebno CD4<+>T ćelije, igraju ključnu ulogu u započinjanju i održavanju različitih autoimunih bolesti, uključujući dijabetes tipa 1, reumatoidni artritis, lupus, multiplu sklerozu, i u odbacivanju stranog transplantata, uključujući odbacivanje alogenih i ksenogenih transplantata. T efektorske ćelije, stoga, predstavljaju važnu metu za imunološku modulaciju za prevenciju i tretman ovih bolesti. U normalnim fiziološkim uslovima, T efektorske (Teff) ćelije su pod kontrolom druge klase T ćelija, označenih kao T regulatorne (Treg) ćelije. Treg ćelije, slične Teff ćelijama, prate inflamatorne znakove i infiltriraju se u odbacivanje transplantata. Sve više naučnih dokaza pokazuju da je poremećaj fiziološke ravnoteže između T efektorskih i T regulatornih ćelija u korist T efektorskih ćelija osnovni uzrok mnogih autoimunih bolesti i odbacivanja stranog transplantata. Pristupi koji ciljaju i T efektorske ćelije i T regulatorne ćelije imaju značajan terapeutski potencijal za ponovno uspostavljanje fiziološke ravnoteže u autoimunosti, i za naginjanje ravnoteže u korist T regulatornih ćelija u slučaju odbacivanja transplantata. Definicije
[0027] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj predmetno obelodanjena tema pripada.
[0028] Za potrebe predmetne prijave, naredni izrazi imaju ove definicije:
Kako se ovde koriste, oblici jednine označavaju jedan ili više, osim ako nije posebno naznačeno da znači samo jedan.
[0029] Kako se ovde koristi, izraz „primena“ uključuje direktnu primenu drugome, samoprimenu i prepisivanje ili usmeravanje primene agensa kako je ovde obelodanjeno. Kako se ovde koristi, izraz „primena“ obuhvata sve pogodne načine primene supstance pacijentu. Uobičajeni putevi uključuju oralni, sublingvalni, transmukozni, transdermalni, rektalni, vaginalni, subkutani, intramuskularni, intravenski, intraarterijski, intratekalni, putem katetera, preko implantata itd.
[0030] „Pacijent“ ili „subjekat“ kako se ovde koristi uključuje bilo kog sisara. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek.
[0031] Kako se ovde koristi, izrazi „efikasna količina“ i „terapeutski efikasna količina“ označavaju dozu ili koncentraciju u plazmi pacijenta, respektivno, koje pružaju specifičan farmakološki efekat za koji se aktivni agens primenjuje kod pacijenta kom je takav tretman potreban. Naglašeno je da efikasna količina aktivnog agensa neće uvek biti efikasna u tretmanu stanja/bolesti opisanih ovde, iako se takva doza smatra efikasnom količinom od strane stručnjaka.
[0032] Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutski sastav“ se odnosi na jedan ili više aktivnih agenasa formulisanih sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijensom ili razblaživačem.
[0033] Izraz „farmaceutski prihvatljiv“ se ovde koristi da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, sastave i/ili dozne oblike koji su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu in vivo bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika.
FasL-izrađeni biomaterijali
[0034] FasL-izrađeni biomaterijali pronalaska su biomaterijali izrađeni da ispoljavaju FasL protein. Kako se ovde koristi, „FasL“ se odnosi na Fas ligand. Kako se ovde koristi, „FasL deo“ označava barem deo FasL koji indukuje apoptozu. U nekim otelotvorenjima, FasL deo obuhvata ili se sastoji od ekstracelularnog domena FasL. U nekim otelotvorenjima, FasL deo sadrži ili se sastoji od FasL proteina otpornog na matričnu metaloproteinazu (MMP). Kako se ovde koristi, FasL protein otporan na matričnu metaloproteinazu (MMP) je oblik FasL u kom ekstracelularnom domenu FasL nedostaju mesta osetljiva na MMP. Pogledati Yolcu i dr., Immunity 17: 795-808 (2002).
[0035] Biomaterijali su izrađeni da pokažu FasL putem konjugacije preko biotina u hidrogel kako je definisano u patentnom zahtevu 1, i mogu se koristiti tehnologije kontrolisanog oslobađanja.
[0036] FasL protein se ispoljava na biomaterijalu putem biotin/avidin ili biotin/streptavidin (SA) vezivanja. Prema pronalasku, hidrogel je biotinilovan i vezan za FasL-streptavidin konjugat (ili himerni protein koji sadrži FasL protein i streptavidin ili avidinski deo) putem streptavidin-biotin vezivanja. SA-FasL vezan za biotinilovane hidrogelove zadržava moćnu apoptotičku aktivnost. Količina bioaktivnog SA-FasL koji se isporučuje pacijentu može se lako kontrolisati korišćenjem ovde opisanih FasL biomaterijala.
[0037] Ranije smo izvestili o konstrukciji himernog oblika FasL sa streptavidinom (SA), SA-FasL, u kom je ekstracelularni domen od FasL, bez MMP osetljivih mesta, kloniran C-terminalno u SA, što je korisno kao efikasan imunomodulator agent. Pogledati Yolcu i dr., Immunity 17, 795-808 (2002). Ovi proteini postoje kao tetrameri i oligomeri sa snažnom apoptotičkom aktivnošću na ćelijama koje eksprimiraju Fas. Važno je da su ostrvca pankreasa, modifikovana biotinom vezanim za površinu ćelije, praćena izradom sa SA-FasL, stekla status privilegovanog imuniteta i preživela neograničeno u odsustvu hronične imunosupresije u alogenom mišjem modelu za transplantaciju. Pogledati Yolcu i dr., J Immunol 187, 5901-5909 (2011).
[0038] Interakcija između biotina i avidina ili streptavidina („SA“) nudi nekoliko prednosti u predmetnom kontekstu. Na primer, biotin ima izuzetno visok afinitet i za SA (1013 M-1) i za avidin (1015 M-1). Pored toga, i SA i avidin su tetramerni polipeptidi od kojih svaki vezuje četiri molekula biotina. Konjugati koji sadrže SA ili avidin stoga imaju tendenciju da formiraju tetramere i više strukture i mogu da formiraju komplekse sa više delova koji sadrže biotin.
[0039] Kako se ovde koristi, „biotin“ uključuje delove koji sadrže biotin koji su u stanju da se vežu za površine, kao što su ćelijske površine, kao što su NHS-biotin i EZ-Link<™>Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce). Biotin i proteinski reaktivni oblici biotina su dostupni komercijalno.
[0040] SA ili avidinski fragmenti koji zadržavaju značajnu vezujuću aktivnost za biotin, kao što je najmanje 50% ili više afiniteta vezivanja prirodnog SA ili avidina, takođe se mogu koristiti. Takvi fragmenti uključuju „jezgarni streptavidin“ („CSA“), skraćenu verziju polipeptida streptavidina pune dužine koji može uključivati ostatke streptavidina 13-138, 14-138, 13-139 or 14-139. Pogledati, npr. Pahler i dr., J. Biol. Chem., 262: 13933-37 (1987). Mogu se koristiti i drugi skraćeni oblici streptavidina i avidina koji zadržavaju snažno vezivanje za biotin. Pogledati, npr. Sano i dr., J Biol Chem.270(47): 28204-09 (1995) (opisuje varijante streptavidina 16-133 i 14-138) (SAD patent br.6,022,951). Takođe se mogu koristiti mutanti streptavidina i jezgarni oblici strepavidina koji zadržavaju značajnu aktivnost vezivanja za biotin ili povećanu aktivnost vezivanja biotina. Pogledati, npr. Chilcoti i dr., Proc Natl Acad Sci, 92(5): 1754-58 (1995), Reznik i dr., Nat Biotechnol, 14(8): 1007-11(1996). Na primer, mogu se koristiti mutanti sa smanjenom imunogenošću, kao što su mutanti mutirani mutagenezom usmerenom na mesto za uklanjanje potencijalnih epitopa T ćelija ili epitopa limfocita. Pogledati Meyer i dr., Protein Sci., 10: 491-503 (2001). Slično, mutanti avidina i oblici jezgra avidina koji zadržavaju značajnu aktivnost vezivanja biotina ili povećanu aktivnost vezivanja biotina takođe se mogu koristiti. Pogledati Hiller i dr., J Biochem, 278: 573-85 (1991); i Livnah i dr., Proc Natl Acad Sci USA 90: 5076-80 (1993). Radi pogodnosti, u razmatranjima ovde, izrazi „avidin“ i „streptavidin“ (ili „SA“) obuhvataju fragmente, mutante i osnovne oblike ovih molekula.
[0041] Avidin i streptavidin su dostupni od komercijalnih dobavljača. Štaviše, poznate su sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju streptavidin i avidin i sekvence aminokiselina streptavidina i avidina. Pogledati, npr. GenBank pristupni brojevi Ks65082; Ks03591; NM_205320; Ks05343; Z21611; i Z21554.
[0042] Biomaterijal je hidrogel. Kako se ovde koristi, „hidrogel“ se odnosi na polimerni materijal koji nabrekne u vodi, npr., polimerne mreže koje nabreknu u vodi, sa dimenzijama mnogo većim od ćelije (kao što je > 500 µm). Kako se ovde koristi, „mikrogel“ se odnosi na hidrogel sa manjim dimenzijama (kao što je reda veličine 10s ili 100s od µm). Hidrogel može biti bilo koji farmaceutski prihvatljiv hidrogel koji je pogodan za primenu ciljanom pacijentu. Hidrogel se obično formira kada je organski polimer (prirodni ili sintetički) umrežen preko kovalentnih, jonskih ili vodoničnih veza kako bi se stvorila trodimenzionalna struktura otvorene rešetke koja zarobljava molekule vode kako bi se formirao gel. Primeri materijala koji se mogu koristiti za formiranje hidrogela uključuju materijale na bazi makromera (uključujući PEG makromere) sastavljene korišćenjem različitih postupaka unakrsnog povezivanja (kao što je adicija tipa Majkl, tiol-en, klik reakcije, itd.), polisaharide (kao što je alginat), polifosfazine i poliakrilate, ili blok kopolimere kao što su Pluronics™ ili Tetronics™, polietilen oksid-polipropilen glikol blok kopolimere koji su umreženi temperaturom, polimerizacijom slobodnih radikala, klik reakcijama ili pH, respektivno.
[0043] U specifičnim otelotvorenjima, biomaterijal je polietilen glikol (PEG) hidrogel ili mikrogel. Hidrogel se može sintetisati od makromera poli(etilen) glikola (PEG-4MAL) sa 4 kraka sa krajnjim maleimidima, kao što je mikrofluidna polimerizacija. Pogledati Headen i dr., Advanced Materials, 26:3003-3008 (2014). PEG-4MAL platforma omogućava stehiometrijsku, kovalentnu inkorporaciju molekula koji sadrže tiol, i pruža poboljšanu efikasnost umrežavanja za formiranje strukturno definisanih hidrogelova. Pogledati Phelps i dr., Advanced Materials, 24: 64-70, 62 (2012). PEG-4MAL ispoljava minimalnu toksičnost in vivo, i brzo se izlučuje urinom, što je važno za kliničku primenu.
[0044] Biotinilovani hidrogelovi ili mikrogelovi se mogu proizvesti reagovanjem biotin-PEG-tiola sa PEG-4MAL makromerom i generisanjem mikrogelova prečnika 150 µm umreženih sa ditiotreitolom (DTT) putem mikrofluidine polimerizacije. Pogledati, npr. SLIKA 1A. Dobijeni mikrogelovi pokazuju kovalentno vezan biotin sposoban da zarobi SA sa visokim afinitetom. Pogledati, npr. SLIKU 1B.
[0045] Biomaterijal može da sadrži ili da bude formulisan sa (npr., pomešan sa ili spojen sa) dodatnim terapeutskim agensom, kao što je imunosupresiv. Primeri odgovarajućih imunosupresivnih lekova uključuju rapamicin, ciklofosamid busulfan, fludarabin, metotreksat, sulfasalazin, hidroksihlorokin, azatioprin, tocilizumab, etanercept, adalimumab, anakinra, abatacept, rituksimabumab, degololizumab, metilprednizolon, predinizon, takrolimus i triamcinolon. U nekim otelotvorenjima, imunosupresivni lek je rapamicin.
Postupci izazivanja imunološke tolerancije
[0046] Biomaterijal pronalaska se može primeniti u postupcima za sprovođenje imunomodulacije koji se sastoje od primene pacijentu koji ima potrebu za tim FasL-izrađenog biomaterijala kao što je ovde opisano. Postupak može biti za sprečavanje ili smanjenje rizika od odbacivanja ćelijskih ili tkivnih transplantata i/ili za tretman dijabetesa tipa I.
[0047] Kao što je navedeno iznad, ovde opisani FasL biomaterijali korisni su za izazivanje imunosupresije. Prema tome, biomaterijali se mogu koristiti u postupcima izazivanja imunosupresije kod pacijenta koji ima potrebu za tim, koji se sastoje od primene pacijentu FasL biomaterijala u količini efikasnoj da izazove imunološku toleranciju.
[0048] Kao što je navedeno iznad, ovde opisani FasL biomaterijali su takođe korisni za izazivanje specifične imunološke tolerancije. Na primer, primena FasL biomaterijala zajedno sa transplantatom (npr., ćelija transplantata) može izazvati specifičnu imunološku toleranciju na ćeliju transplantata. Prema tome, u skladu sa nekim otelotvorenjima, pruženi su biomaterijali za upotrebu u izazivanju imunološke tolerancije kod pacijenta koji ima potrebu za tim, gde se pacijentu primenjuje FasL biomaterijal ćelije transplantata u količini koja je efikasna da indukuje imunološku toleranciju na ćeliju transplantata.
[0049] Kako se ovde koristi, „ćelija transplantata“ se odnosi na ćeliju donora (ili tkivo ili organ koji sadrži ćeliju), koja se primenjuje pacijentu koji ima potrebu za tim. Tipovi ćelija transplantata uključuju ćelije ostrvaca (npr., ćelije ostrvaca pankreasa), splenociti, PBMC, ćelije koštane srži, mezenhimalne matične ćelije, hematopoetske matične ćelije, matične ćelije, indukovane pluripotentne matične ćelije, proizvode ljudskih beta ćelija, hepatocite, dendritske ćelije, makrofage, endotelne ćelije, srčane ćelije i vaskularne ćelije i imune ćelije, uključujući T ćelije, itd., u zavisnosti od stanja koje se tretira. U skladu sa ovim postupcima, FasL hidrogel indukuje specifičnu imunološku toleranciju na ćelije transplantata.
[0050] Za ilustraciju, pacijentu se mogu primenjivati ćelije ostrvaca pankreasa za tretman dijabetesa.
Pacijentu se mogu primenjivati ćelije ostrvaca pankreasa i hidrogel koji je izrađen da prikaže FasL („FasL hidrogel“) kako bi se specifično indukovala imunološka tolerancija na ćelije ostrvaca pankreasa. U drugom primeru, pacijentu se mogu primenjivati hepatociti za tretman akutne insuficijencije jetre ili metaboličkih poremećaja zasnovanih na jetri. Pacijentu se mogu primenjivati hepatociti i FasL hidrogel kako bi se indukovala imunološka tolerancija na hepatocite.
[0051] Ćelija transplantata se može primeniti kao preparat izolovanih ćelija ili kao deo tkiva ili organa.
[0052] Ćelija transplantata može biti alogena. Ćelija transplantata može biti ksenogena. Ćelija transplantata može biti od čoveka, primata koji nije čovek, psa, mačke, krave, ovce, konja, zeca, miša ili pacova.
[0053] Ćelija transplantata može biti autologna ili autogena (od pacijenta koji se tretira). Na primer, autologna ćelija transplantata može biti izvedena iz autolognog tkiva indukovanom pluripotentnošću i diferencijacijom indukovanih pluripotentnih ćelija do željene autologne ćelije transplantata. Ćelije pacijenta se mogu koristiti za izazivanje imunološke tolerancije na sebe koja je prekinuta kod autoimune bolesti.
Primeri ćelija pogodnih za upotrebu u ovim otelotvorenjima uključuju mobilisane hematopoetske matične ćelije, PBMC, dendritske ćelije i slično. Ćelije se mogu izabrati između onih koje prirodno eksprimiraju sopstvene antigene koji su ciljani u autoimunoj bolesti. Na primer, dijabetes tipa I je autoimuna bolest u kojoj telo reaguje i odbacuje ćelije ostrvaca pankreasa (β). U ranim stadijumima dijabetesa, pre nego što se sve ćelije ostrvaca odbace, moguće je izazvati toleranciju na ćelije ostrvaca i na taj način sprečiti napredovanje dijabetesa.
[0054] Prema tome, pacijentu može biti potrebna imunološka tolerancija na ćeliju transplantata, i imunološka tolerancija može biti izazvana primenom FasL hidrogela kao što je ovde opisano i ćelije transplantata, i ćelija transplantata se bira na osnovu stanja koje se tretira. Na primer, kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija dijabetesa tipa 1, ćelija transplantata može biti ćelija ostrvaca pankreasa. Kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija odbacivanja alotransplantata, ćelija transplantata može biti ćelija donora alotransplantata, kao što su ćelije koštane srži alotransplantata, srčani miociti alotransplantata i vaskularne ćelije alotransplantata, ili druge ćelije donora alotransplantata kako je razmatrano iznad. Kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija odbacivanja ksenotransplantata, ćelija transplantata može biti ćelija donora ksenotransplantata, kao što su ćelije koštane srži ksenotransplantata, srčani miociti ksenotransplantata i vaskularne ćelije ksenotransplantata, ili druge ćelije donora ksenotransplantata kako je razmatrano iznad. Kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija autolognog odbacivanja, ćelija transplantata može biti autologna ćelija, kao što su ćelije izvedene iz autolognog tkiva indukovanom pluripotentnošću i diferencijacijom indukovanih pluripotentnih ćelija.
[0055] Stoga, pacijentu može biti potrebna imunološka tolerancija na ćeliju transplantata. Ćelija transplantata može biti izabrana između PBMC, ćelija koštane srži, hematopoetskih matičnih ćelija, matičnih ćelija, mezenhimalnih matičnih ćelija, dendritskih ćelija, dendritskih ćelija pulsiranih autoantigenima, proizvoda ljudskih beta ćelija i splenocita. Na primer, kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija dijabetesa tipa 1, ćelija transplantata može biti ćelija ostrvaca pankreasa, ili kao dodatak ili alternativno druge ćelije kao što je razmatrano iznad. Kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija odbacivanja alotransplantata, ćelije transplantata mogu biti ćelije donora alotransplantata, kao što su ćelije izabrane iz grupe koju čine ćelije koštane srži alotransplantata, srčani miociti alotransplantata i vaskularne ćelije alotransplantata ili druge ćelije od donora alotransplantata kao što je razmatrano iznad. Kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija odbacivanja ksenotransplantata, ćelije transplantata mogu biti ćelije donora ksenotransplantata, kao što su ćelije izabrane iz grupe koju čine ćelije koštane srži ksenotransplantata, srčani miociti ksenotransplantata i vaskularne ćelije ksenotransplantata ili druge ćelije od donora ksenotransplantata kao što je razmatrano iznad. Kada su pacijentu potrebni tretman ili prevencija autoimunosti, ćelije transplantata mogu biti (i) ćelija koja eksprimira autoantigen (ii) ćelija obogaćene autoantigenom i (iii) dendritska ćelija pulsirana sa autoantigenom.
[0056] Za upotrebu u ovim postupcima, FasL biomaterijal (kao što je FasL hidrogel) i ćelija transplantata mogu se primenjivati u istom sastavu, ili se mogu primenjivati odvojeno. Ćelija transplantata može biti inkapsulirana FasL biomaterijalom. Na primer, ćelija transplantata može biti zarobljena u biomaterijalu hidrogela ili mikrogela. FasL biomaterijal (kao što je FasL hidrogel) i ćelija transplantata mogu se primeniti na isto mesto kod pacijenta, kao što je lokalna injekcija na približno isto mesto. FasL biomaterijal (kao što je FasL hidrogel) i ćelija transplantata mogu se transplantirati na isto mesto kod pacijenta (npr., kotransplantacija). Postupci mogu postići dugotrajnu, specifičnu imunosupresiju na mestu transplantata.
[0057] Prema tome, u skladu sa nekim otelotvorenjima, primena je transplantacijom. Alogeno prihvatanje ostrvaca transplantata može se postići jednostavnom ko-transplantacijom nemodifikovanih ostrvaca i biomaterijala koji ispoljavaju FasL bez dugotrajne imunosupresije.
[0058] U nekim otelotvorenjima, FasL biomaterijal (kao što je FasL hidrogel) se primenjuje sa imunosupresivnim lekom, kao što su rapamicin ili bilo koji od gore navedenih. U takvim otelotvorenjima, FasL biomaterijal (kao što je FasL hidrogel) i imunosupresivni lek mogu biti formulisani zajedno (npr. hidrogel može da sadrži imunosupresivni lek), ili se mogu primeniti u odvojenim sastavima, istovremeno ili uzastopno, bilo kojim redosledom. Može biti potreban kraći kurs imunosupresivnog leka nego kada se ne primenjuje FasL biomaterijal.
[0059] FasL biomaterijali (kao što su FasL hidrogelovi) koji sadrže imunosupresivni lek mogu pružiti kontrolisano oslobađanje leka. FasL biomaterijali (kao što su FasL hidrogelovi) koji sadrže imunosupresivni lek mogu da pruže kontrolisano oslobađanje leka u mikrookruženju transplantata ili da sadrže transplantat u obliku kapsule izrađene sa ovim imunomodulatornim molekulima (FasL).
[0060] Primena FasL biomaterijala (kao što je FasL hidrogel) kako je ovde opisano sa imunosupresivnim lekom može postići sinergetski imunosupresivni efekat. Na primer, imunosupresivni lek (kao što je rapamicin) može da radi u sinergiji sa FasL da specifično eliminiše patogene T efektorske ćelije dok proširuje T regulatorne ćelije, čime se ravnoteža imunog odgovora prebacuje ka zaštiti. Bez vezivanja teorijom, ovaj sinergetski efekat se može postići tako što FasL deo aktivira ekstrinzičnu apoptozu posredovanu receptorom smrti u Tefektorskim ćelijama, dok imunosupresivni lek (kao što je rapamicin) aktivira intrinzičnu apoptozu posredovanu mitohondrijama. Pogledati, npr. Ju i dr., Nature 373(6513): 444-448 (1995); and Yellen i dr., Cell Cycle, 10(22): 3948-3956 (2011).
[0061] Primena FasL biomaterijala (kao što je FasL hidrogel) kao što je ovde opisano sa imunosupresivnim lekom možda neće narušiti sistemski imuni odgovor i može povećati odnos T regulatornih ćelija u odnosu na T pomoćne ćelije. T regulatorne ćelije igraju važnu ulogu u modulaciji imunoloških odgovora i one su inflamatorni znaci i infiltriraju se u odbacivanje transplantata.
[0062] Kao što je navedeno iznad, FasL biomaterijal (kao što je FasL hidrogel) se može primeniti u količini koja je efektivna da izazove imunosupresiju ili indukuje specifičnu imunološku toleranciju. Efikasne količine FasL će varirati u zavisnosti od pacijenta koji se tretira, načina primene i prirode i težine stanja koje se tretira. Količine FasL korišćene u primerima ispod su ilustrativne i mogu se pretvoriti u doze za drugog pacijenta na osnovu naredne tabele:
[0063] Samo kao ilustracija, efikasna doza FasL može biti od manje od oko 0,2 µg/kg/dan do najmanje oko 10 µg/kg/dan, ili više, na osnovu FasL dela. Na primer, ovde opisani postupci mogu se sprovoditi korišćenjem dnevnih FasL doza u količinama manjim od oko 0,2 µg/kg/dan, oko 0,2 µg/kg/dan, oko 0,5 µg/kg/dan, oko 1 µg/kg/ dan, oko 1,5 µg/kg/dan, oko 2 µg/kg/dan, oko 2,5 µg/kg/dan, oko 3 µg/kg/dan, oko 3,5 µg/kg/dan, oko 4 µg/kg/dan, oko 4,5 µg/kg/dan, oko 5 µg/kg/dan, ili više.
Dijabetes tipa 1
[0064] Dijabetes tipa 1 (T1D) je autoimuna bolest koju karakteriše gubitak mase β-ćelija koje proizvode insulin, a time i kontrole glikemije, usled koordinisanog imunološkog odgovora protiv β-ćelija specifičnih antigena koji zahtevaju CD4<+>T ćelije. Obnavljanje mase β-ćelije putem alogene transplantacije ostrvaca je trenutno poželjna klinička intervencija za poboljšanje kontrole glikemije kod pacijenata sa teškom glikemijskom nestabilnošću. Međutim, dugovečnost alogenih transplantata je ograničena ne samo imunološkim odgovorima domaćina, već i sekundarnim neuspehom transplantata zbog toksičnih efekata hronične imunosupresije potrebne za kontrolu odbacivanja. Patogene T efektorske (Teff) ćelije su glavni krivac uništenja ostrvaca alotransplantata. Stoga, obećavajuća strategija za povećanje funkcionalne dugovečnosti ostrvaca alotransplantata bez potrebe za dugotrajnom imunosupresijom obuhvata nove terapije koje ciljaju Teff ćelije za eliminaciju, ublažavajući njihovu patogenu funkciju.
[0065] Nakon aktivacije, T ćelije pojačavaju regulaciju Fas i postaju osetljive na FasL-posredovanu apoptozu, proces koji igra ključnu ulogu u aktivacijom izazvanoj ćelijskoj smrti (AICD) i toleranciji na sopstvene antigene. Nedostatak Fas ili FasL dovodi do masovne limfoproliferacije i autoimunih patologija kod glodara i ljudi, pokazujući nedostatak kompenzacionih mehanizama i važnost ovog puta za regulaciju imuniteta. Prepoznajući imunomodulatorni potencijal ovog puta, nekoliko grupa je uspešno koristilo FasL gensku terapiju za ublažavanje alogenih imunih odgovora za prihvatanje transplantata u eksperimentalnim životinjskim modelima. Iako ove intervencije pokazuju efikasnost, nepoznati sigurnosni profil trajnog ektopičkog eksprimiranja FasL u ciljanim tkivima, kao i tehnički i regulatorni izazovi genske terapije, ograničavaju njihov klinički potencijal. Pored toga, FasL doprinosi AICD samo u njegovom oligomernom obliku vezanom za membranu. Matrične metaloproteinaze (MMP) mogu da cepaju FasL u ekstracelularni rastvorljiv oblik koji inhibira apoptozu i deluje kao hemoatraktant za neutrofile, ubrzavajući uništavanje alotransplantata.
[0066] Transplantacija ostrvaca je obećavajuća terapija za dijabetes tipa 1. Međutim, hronična imunosupresija za kontrolu odbacivanja alogenih ostrvaca indukuje morbiditete i narušava funkciju ostrvaca.
[0067] T-efektorske ćelije su odgovorne za odbacivanje ostrvaca alotransplantata i eksprimiraju Fas receptor smrti nakon aktivacije, postajući osetljive na Fas-posredovanu apoptozu. Međutim, lokalizovana imunomodulacija korišćenjem mikrogelova koji ispoljavaju apoptotski oblik Fas liganda (SA-FasL) kao što je ovde opisano dovodi do produženog preživljavanja alogenih transplantat ostrvaca, kao što je prikazano kod dijabetičkih miševa. Dalje, kratak kurs tretiranja rapamicinom može povećati imunomodulatornu efikasnost SA-FasL-mikrogelova, što dovodi do prihvatanja i funkcije svih alotransplantata tokom dužeg vremenskog perioda, kao što je 200 dana u eksperimentu koji je prikazan u nastavku. Štaviše, tretirani pacijenti mogu pokazati normalne sistemske odgovore na donorske antigene, što implicira imunološku privilegiju transplantata i povećan broj CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>T-regulatornih ćelija u transplantatu i drenažnim limfnim čvorovima. U eksperimentu koji je prikazan u nastavku, brisanje T-regulatornih ćelija je dovelo do akutnog odbacivanja uspostavljenih ostrvaca alotransplantata.
[0068] Ovi rezultati su u skladu sa utvrđenom ulogom FasL u fiziološkoj imunološkoj privilegiji za odabrana tkiva, kao što su prednja očna komora i testisi. Zeiser i dr., Blood 111(1): 453-462 (2008); Battaglia i dr., Blood, 105(12): 4743-4748 (2005); Basu i dr., J Immunol 180(9): 5794-5798 (2008). Uočena zaštita od odbacivanja zahtevala je Treg ćelije i bila je lokalizovana na transplantatu, pošto su dugoročni primaoci generisali normalan sistemski odgovor na antigene donora, što implicira privilegiju imuniteta. Ovo je u skladu sa studijom koja pokazuje da primarni mioblasti transfektovani da eksprimiraju FasL daju imunološku privilegiju ko-transplantiranim alogenim ostrvcima. Ju i dr. Nature 373(6513): 444-448 (1995). Štaviše, ranije smo pokazali da su alogena ostrvca izrađena da ispoljavaju SA-FasL protein na svojoj površini pod kratkim pokrivačem rapamicina prevazišla odbacivanje izazivanjem tolerancije lokalizovane na transplantatu i imunološke privilegije, koje održavaju Treg ćelije. Dakle, ovde opisani lokalizovani imunomodulatorni pristup biomaterijalu može da pruži alternativu hroničnoj imunosupresiji za kliničku transplantaciju ostrvaca.
[0069] Dakle, ovde su opisani FasL-izrađeni biomaterijali gde je FasL konjugovan sa streptavidinom (SA-FasL) ispoljen na biokompatibilnom materijalu, koji je hidrogel, kao što je polietilen glikol (PEG) hidrogel. SA-FasL-izrađeni biomaterijali su korisni, na primer, za imunomodulaciju, kao što je sprečavanje ili smanjenje rizika od odbacivanja ćelijskih ili tkivnih transplantata, kao što je sprečavanje ili smanjenje rizika od odbacivanja stranog transplantata, za sprečavanje ili smanjenje rizik od odbacivanja transplantacije ostrvaca pankreasa, i/ili za prevenciju ili smanjenje rizika od odbacivanja matičnih ćelija, proizvoda ljudskih beta ćelija pankreasa (kao što se mogu koristiti za tretman dijabetesa tipa 1), i u kombinaciji sa drugim tretmanima i/ili tretman drugih poremećaja koji mogu imati koristi od ćelijskih ili tkivnih transplantata. Tako, na primer, ovde opisani SA-FasL-izrađeni biomaterijali korisni su u tretmanu autoimunih bolesti, kao što je dijabetes tipa I, prevencija odbacivanja ćelijskih i tkivnih transplantata, kao što su matične ćelije, ostrvca pankreasa, hematopoetske matične ćelije, hepatociti, mezenhimske matične ćelije, indukovane pluripotentne matične ćelije, embrionalne matične ćelije, proizvodi ljudskih beta ćelija izvedeni iz matičnih ćelija, i u vezi sa tretmanm različitih hematopoetskih poremećaja i poremećaja imunodeficijencije korišćenjem matičnih ćelija.
[0070] Opisani su streptavidin-konjugovani FasL konstrukt (SA-FasL) koji se koristi u specifičnim otelotvorenjima koja su ovde opisana per se, i pokazalo se da sprečava odbacivanje alogenih ostrvaca pankreasa pod kratkim tokom tretiranja rapamicinom. U kontekstu specifičnih otelotvorenja predmetnog pronalaska, PEG hidrogelovi izrađeni da ispoljavaju SA-FasL protein na svojoj površini pokazali su se efikasnim u sprečavanju odbacivanja ko-transplantiranih ostrvaca pankreasa kada se koriste u kombinaciji sa kratkim kursom imunosupresivnog leka rapamicina kod miševa sa hemijskim dijabetesom. Uzeto zajedno, ove studije pokazuju korisnost upotrebe SA-FasL-izrađenih biomaterijala za tretman odbacivanja stranog transplantata i autoimunosti.
[0071] U kontekstu predmetnog pronalaska, SA-FasL ima jedinstvene mehanizme delovanja koji se mogu maksimalno iskoristiti korišćenjem hidrogelova kao nosača. S obzirom na kritičnu ulogu FasL u samotoleranciji i da nema kompenzacionih mehanizama kada je deficitaran, ovaj molekul ima prednosti u odnosu na druge biološke i imunosupresivne lekove koji se koriste za tretman autoimunosti i odbacivanja transplantata. Na primer, autoreaktivne i aloreaktivne T ćelije, kada se aktiviraju, povećavaju Fas receptor, i kao takve postaju direktna meta SA-FasL. Stoga, SA-FasL ima potencijal da specifično eliminiše auto i aloreaktivne T ćelije, bez znanja o repertoaru T ćelija za specifičnost antigena. Ovaj put nije ciljan u terapeutske svrhe i kao takav je jedinstven. Štaviše, ovaj koncept ima efikasnost i specifičnost u odnosu na sadašnje tehnologije koje industrija koristi za tretman autoimunosti i odbacivanja transplantata, i koje ne samo da su neefikasne već imaju i razne nuspojave, na primer one povezane sa standardnom imunosupresijom koja se koristi za autoimunost i odbacivanje transplantata.
[0072] Odbacivanje stranog transplantata i razne autoimune bolesti, kao što je dijabetes tipa I (TID), krajnji su rezultat neravnoteže između patogenih T efektorskih (Teff) i zaštitnih T regulatornih (Treg) ćelija. Stoga, pristupi koji efikasno pomeraju patogenu TeftTreg ravnotežu u korist Treg ćelija imaju potencijal da spreče i preokrenu autoimunost, kao i da spreče odbacivanje stranog transplantata. Patogene T ćelije koje prepoznaju auto ili transplantacione antigene se aktiviraju i regulišu Fas receptor na svojoj površini. Ove ćelije su otporne na apoptozu Fas ligandom (FasL) zbog eksprimiranja različitih anti-apoptotičkih gena.
PRIMERI
Primer 1: Proizvodnja biotinilovanih mikrogelova koji mogu da zarobe Streptavidin-FasL
[0073] Biotinilovani mikrogelovi se mogu proizvesti reakcijom biotin-(poli-etilen-glikol (PEG))-tiola sa makromerom polietilen glikola sa 4 kraka (PEG-4MAL) sa krajnjim maleimidima i stvaranjem mikrogelova prečnika 150 µm umreženih sa ditiotretom (DTT) putem mikrofluidne polimerizacije (Slika 1A). Dobijeni mikrogelovi pokazuju kovalentno vezan biotin sposoban da zarobi streptavidin (SA) sa visokim afinitetom (Slika 1B). Biotin-specifično zarobljavanje SA na mikrogelovima variralo je linearno sa koncentracijom SA u rastvoru za vezivanje do koncentracije zasićenja od 150 µg/mL (SLIKA 1C), demonstrirajući doznozavisnu kontrolu ispoljavanja SA na površini mikrogela. Kao što se očekivalo, zarobljavanje SA-FasL na biotinilovanim mikrogelovima pratilo je sličan dozno-zavisni odnos (SLIKA 7). Važno je da je ispoljavanje SA-FasL na mikrogelovima indukovao dozno-zavisnu apoptozu u A20 ćelijama (SLIKA 1D), koje su osetljivi na FasL-posredovanu apoptozu. Nasuprot tome, direktno kovalentno spajanje SA-FasL sa PEG-4MAL makromerom eliminiše SA-FasL apoptotičku aktivnost (SLIKA 8), demonstrirajući značaj imobilizacije biotina za ispoljavanje bioaktivnog SA-FasL. Ovi rezultati pokazuju da SA-FasL vezan za biotinilovane mikrogelove zadržava moćnu apoptotičku aktivnost i da se količina isporučenog bioaktivnog SA-FasL može lako kontrolisati korišćenjem ovog pristupa.
[0074] Kako bi se ispitalo da li funkcionalizovani materijal utiče na normalno zdravlje i funkciju ostrvaca, ostrvca pacova su kultivisana sa SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima (1:2 ostrvca mikrogel odnos) tokom 24 sata. Nije bilo razlika između ostrvaca kultivisanih sa SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima i ostrvaca bez (kontrola) u metaboličkoj aktivnosti (SLIKA 10A), lučenju insulina stimulisanom glukozom (SLIKA 10B), živo-mrtvom bojenju (SLIKA 10D), ili obrascima eksprimiranja insulina i glukagona (SLIKA 10E). Zanimljivo je da su ostrvca koja su zajedno kultivisana sa SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima imala smanjeno lučenje proinflamatornih citokina MIP1a i IL-6, ali ne i MCP-1, u poređenju sa ostrvcima bez kao kontrolom (SLIKA 10C). Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da mikrogelovi koji ispoljavaju SA-FasL ne utiču negativno na zdravlje ili funkciju ostrvaca.
Primer 2: Ispoljavanje SA-FasL na mikrogelovima produžava lokalnu isporuku SA-FasL na mestima transplantata.
[0075] Takođe smo istražili zadržavanje SA-FasL ispoljenog na mikrogelovima in vivo. SA-FasL, označen skoro infracrvenom fluorescentnom bojom, imobilisan je na biotinilovanim mikrogelovima, koji su implantirani ispod kapsule bubrega miševa. Uzdužno praćenje označenog SA-FasL izvršeno je na in vivo sistemu za snimanje tokom 21 dana. Slike za fluorescentni signal pokazuju koncentrisani signal lokalizovan na području oko bubrega kod miševa koji primaju označene SA-FasL-ispoljavajuće mikrogelove, dok je fluorescentni signal difuzan za miševe koji primaju označen bez SA-FasL bez nosača mikrogela. (SLIKA 2A). Kod miševa koji su primali samo označeni SA-FasL, bez nosača za isporuku mikrogela, protein je brzo očišćen sa mesta transplantacije, sa 60% smanjenjem signala do dana 1 nakon implantacije i zanemarljivog signala do dana 7 nakon implantacije. (SLIKA 2B). Nasuprot tome, miševi koji su primali SA-FasL-ispoljavajuće mikrogelove pokazali su značajno više nivoe SA-FasL tokom vremena sa povišenim nivoima uporedivim sa signalom na dan 0 na mestu implantacije tokom 7 dana nakon transplantacije. Analiza profila zadržavanja korišćenjem pojedinačnih uklapanja krive eksponencijalnog raspada pokazala je značajno duže vreme zadržavanja za SA-FasL-ispoljavajuće mikrogelove u poređenju sa bez SA-FasL (poluživot 3,0 ± 0,8 dana naspram 0,70 ± 0,40 dana, p < 0,0001). Štaviše, proračuni površine ispod krive pokazali su povećano zadržavanje SA-FasL za vezan mikrogel u odnosu na slobodan protein (5,25 ± 0,87 prema 1,98 ± 0,14, p < 0,007). SLIKA 11 pokazuje da se mikrogelovi na mestu implantacije mogu jasno uočiti na dan 21, što je utvrđeno histološkim pregledom. Ovaj rezultat podržava zaključak da gubitak fluorescentnog signala za SA-FasL-mikrogelove proizilazi iz odvezivanja SA-FasL iz biotinilovanog mikrogela, a ne degradacije mikrogelova. Stoga, ova strategija biomaterijala za produženu, lokalnu isporuku SA-FasL u mesta transplantata značajno pojačava lokalne efekte dok minimizuje rizike sistemskih efekata ovog snažnog imunomodulatornog proteina. Očekujemo da ova strategija biomaterijala za produženu, lokalnu isporuku SA-FasL u mestima transplantata značajno pojačava lokalne efekte dok minimizuje rizik od sistemskih efekata ovog snažnog imunomodulatornog proteina.
Primer 3: Ko-transplantacija alogenih ostrvaca i SA-FasL- izrađenih mikrogelova obnavlja dugoročnu kontrolu glikemije bez upotrebe hronične imunosupresije ili modifikacije ostrvaca.
[0076] Imunomodulatorna efikasnost SA-FasL-ispoljavajućih mikrogelova testirana je u okruženju za transplantaciju alogenih ostrvaca. Nemodifikovana alogena (Balb/c) ostrvca su pomešana sa mikrogelovima, i dobijena smeša je transplantirana ispod kapsule bubrega streptozotocin-dijabetičkih C57BL/6 miševa. Miševi koji su primali nemodifikovana ostrvca i kontrolne biotinilovane mikrogelove akutno su odbacili sve transplantate (srednje vreme preživljavanja (MST) = 15 dana; SLIKA 3A), dok su ostrvca ko-transplantirana sa SA-FasL-izrađenim mikrogelovima imala značajno produženo preživljavanje (MST = 31 dan) sa približno 25% subjekata koji su preživeli više od 200 dana pre žrtvovanja (SLIKA 3A). Značajno je da je >90% (12/13) transplantata funkcionisalo i preživelo tokom čitavog perioda posmatranja od 200 dana kod miševa koji su zajedno transplantirani sa nemodifikovanim ostrvcima i SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima kada su pacijenti tretirani kratkim kursom rapamicina (0,2 mg/kg dnevno započeto na dan 0 nakon transplantacije za 15 doza; SLIKA 3A). Imunološko bojenje mesta implantacije kod primalaca sa funkcionalnim transplantatom nakon 200 dana otkrilo je insulin pozitivne strukture koje podsećaju na ostrvca u bliskoj vezi sa mikrogelovima, dok insulin pozitivne strukture nisu primećene kod primalaca sa odbačenim transplantatom. (SLIKA 3B). Intraperitonealni testovi tolerancije glukoze pokazali su ekvivalentnu funkciju ovih dugotrajnih transplantata u poređenju sa naivnim miševima (SLIKA 3C); analize površine ispod krive nisu pokazale razlike između naivnih i dugotrajnih transplantata (P = 0,20). U značajnoj suprotnosti, isti protokol sa injekcijama rapamicina, ali bez mikrogelova dizajniranih sa SA-FasL, rezultovao je akutnim odbacivanjem (MST = 36 dana) sa sličnim performansama kao grupa mikrogelova koja ispoljava SA-FasL (SLIKA 3A).
[0077] Kako bi se dalje utvrdilo da su ko-transplantacija ostrvaca i SA-FasL izrađenih doveli do preokreta dijabetesa, nivoi glukoze u krvi su mereni tokom vremena kod primalaca transplantata. Reprezentativni nivoi glukoze u krvi tokom vremena za primaoce transplantata sa SA-FasL-ispoljavajućim mikrogelovima rapamicin ili kontrolnim mikrogelovima rapamicin su prikazani na SLICI 9. Nefrektomija kod dijabetičkih miševa koji su primali ostrvca i SA-FasL-ispoljavajuće mikrogelove rapamicin na dan 200 nakon transplantacije brzo je obnovila hiperglikemiju (SLIKA 12), pokazujući da je preokret dijabetesa kod ovih pacijenta bio posledica transplantacije. Desetostruko povećanje površinske gustine SA-FasL na mikrogelovima nije imalo značajno poboljšanje preživljavanja transplantata (SLIKA 13). Takođe smo uporedili funkcionalne performanse SA-FasL-ispoljavajućih mikrogelova sa ostrvcima koji ispoljavaju SAFasL, jer smo ranije pokazali da je ova strategija bila efikasna u promovisanju prihvatanja transplantata. Yolcu i dr., J Immunol 187(11): 5901-5909 (2011). Nismo primetili nikakve razlike u efektima SA-FasL, sa ili bez primene rapamicina, između SA-FasL ispoljenih na površini ostrvaca ili mikrogelova (SLIKA 14). Međutim, glavna i značajna prednost SA-FasL ispoljavanja zasnovanog na mikrogelu je izbegavanje hemijske modifikacije ostrvaca, koja može prevazići potencijalni negativan uticaj na održivost i funkciju ostrvaca, i takođe pružiti bolju strategiju kao komercijalni proizvod. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da jednostavna ko-transplantacija alogenih ostrvaca i SA-FasL-izrađenih mikrogelova obnavlja dugoročnu kontrolu glikemije bez upotrebe hronične imunosupresije ili modifikacije ostrvaca.
Primer 4: Primaoci SA-FasL-izrađenih mikrogelova održavaju sistemsku imunološku kompetenciju.
[0078] Zbog lokalizovane prirode imunomodulacije, procenili smo sistemski odgovor primalaca transplantata na donorske antigene u in vitro testu proliferacije. I CD4+ i CD8+ T ćelije iz dugotrajnih (> 200 dana) primalaca transplantata ostrvaca tretiranih mikrogelovima napravljenim od SA-FasL, pokazale su proliferativne odgovore na donore kao i na antigene treće strane (SLIKA 4A i SLIKA 14). Uočeni odgovori su bili sličnih veličina kao oni dobijeni korišćenjem T ćelija od odbacujućih miševa koji su primali nemodifikovane mikrogelove plus rapamicin. Ovaj rezultat ukazuje da miševi koji primaju SA-FasL-izrađene mikrogelove održavaju sistemsku imunološku kompetenciju, i da zaštita koju pružaju SA-FasL-izrađeni mikrogelovi ostaje lokalizovana na transplantatu.
[0079] Kako bi se dalje razjasnio mehanizam prihvatanja transplantata, populacije imunih ćelija sakupljene iz slezine, limfnih čvorova koji dreniraju transplantat (LN) i transplantata su analizirani korišćenjem protočne citometrije u studiji vremenskog toka, sa posebnim fokusom na Teff i T-regulatore (Treg) ćelije kao mete FasL-posredovane imunomodulacije kao što je prikazano na SLICI 15. Primetili smo opšti trend smanjenja broja i CD4<+>i CD8<+>Teff ćelija u tkivima miševa koji su primali SA-FasL-izrađene mikrogelove rapamicin u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala nemodifikovane mikrogelove same ili u kombinaciji sa rapamicinom kao što je prikazano na SLICI 16. Grupa nemodifikovanih mikrogelova plus rapamicin je pokazala trend povećanja broja Treg ćelija koje su dostigle značaj u limfocitima koji se infiltriraju transplantatom na dan 7 nakon transplantacije. Miševi koji su primali SA-FasL-izrađene mikrogelove i rapamicin imali su povećan odnos Treg prema CD4<+>i CD8<+>Teff ćelijama u transplantatu (p < 0,05 za Treg:CD8<+>Teff) i LN za dreniranje transplantatom (p < 0,05 za obe Treg:Teff populacije) u poređenju sa kontrolnim miševima koji su primali nemodifikovane mikrogelove sami ili u kombinaciji sa rapamicinom (SLIKA 4B).
[0080] Takođe, imajući u vidu trend povećanja odnosa Treg i Teff ćelija, sproveli smo studiju iscrpljivanja kako bismo direktno procenili ulogu Treg ćelija u posmatranom prihvatanju transplantata u našem modelu. Za ove studije, BALB/c alogena ostrvca su transplantirana u transgene miševe C57BL/6 koji eksprimiraju receptor ljudskog toksina difterije (DT) pod FoxP3 kontrolom. Kod ovih FoxP3/DTR miševa, primena DT privremeno iscrpljuje Treg ćelije nekoliko dana pre nego što se vrati na normalne nivoe (SLIKA 17A). Važno je da primena DT nema efekta na nivo glukoze u krvi FoxP3/DTR miševa (SLIKA 17B). Hemijski dijabetički transgeni miševi transplantirani sa alogenim ostrvcima i SA-FasL-izrađenim mikrogelovima ispod prolaznog pokrivača rapamicina uspostavili su prihvatanje transplantata, kao što je ranije primećeno kod C57BL/6 primaoca, gde su miševi održavali funkciju transplantata na dan 50 nakon transplantacije (SLIKA 4C). Iscrpljivanje Treg ćelija primenom DT na dan 50 dovelo je do odbacivanja svih transplantata do dana 82 (SLIKA 4C, MST = 72 dana). U značajnom kontrastu, kontrolni miševi bez DT tretmana su zadržali funkciju transplantata za 200-dnevnu eksperimentalnu krajnju tačku. Ovi rezultati pokazuju dominantnu ulogu Treg ćelija u prihvatanju transplantata kod miševa koji primaju SA-FasL-ispoljavajuće mikrogelove.
Primer 5: Strategija SA-FasL-mikrogela poboljšava funkciju transplantiranog ostrvca bez hronične imunosupresije na klinički relevantnom mestu transplantacije.
[0081] Kapsula bubrega je eksperimentalno pogodno mesto za transplantaciju za proučavanje isporuke ćelija, ali ima ograničenja za kliničko usvajanje. Stoga smo ispitali transplantaciju alogenih ostrvaca u masni jastučić epididima miša. Epididimalni masni jastučić kod miševa je analogan omentumu kod ljudi. Važno je da omentum predstavlja klinički relevantno mesto za transplantaciju ostrvaca. Pogledati Baidal i dr., N Engl J Med 376(19): 1887-1889 (2017); and Berman i dr., Diabetes, 65(5): 1350-1361 (2016). Kako bi se ostrvca zadržala na ovom mestu, transplantati su isporučeni unutar PEG hidrogela koji se razgradi proteazom sa kontrolisanim oslobađanjem VEGF koji poboljšava usađivanje ostrvaca. Pogledati Weaver i dr., Sci Adv, 3(6): e1700184 (2017). U skladu sa našim rezultatima za mesto bubrežne kapsule, alogena ostrvca kotransplantirana sa SA-FasL-mikrogelovima pod kratkim pokrivanjem tretmana rapamicinom pokazala su značajno poboljšano preživljavanje kod dijabetičkih miševa u poređenju sa kontrolama (p < 0,0008, SLIKA 6A). Transplantati ostrvaca u ovom modelu su takođe normalizovali nivoe glukoze u krvi, pokazujući funkciju (SLIKA 18). Imunološko bojenje mesta transplantacije kod miševa sa funkcionalnim transplantacijama ostrvaca u grupi mikrogelova sa SA-FasL rapamicin otkrilo je mnoge strukture koje su pozitivno obojene na insulin i glukagon (SLIKA 6B), dok takve strukture pozitivne na insulin i glukagon nisu pronađene kod miševa koji su primali ostrvce sa kontrolnim mikrogelovima. Konačno, kao početna procena potencijalne toksičnosti tretmana SA-FasL-mikrogelom, izmerili smo nivoe enzima jetre u serumu i uradili histologiju jetre i bubrega kod dugoročnih primaoca (> 60 dana) (SLIKA 6C). Nivoi enzima jetre bili su u granicama normale i nije bilo razlika između SA-FasL-ispoljavajućih mikrogelova i kontrola. Slično, nije bilo razlika u bruto strukturi tkiva jetre ili bubrega. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da SA-FasL-mikrogel strategija poboljšava funkciju transplantiranog ostrvca bez hronične imunosupresije na klinički relevantnom mestu transplantacije sa prihvatljivim sigurnosnim profilom.
Materijali i postupci
[0082] Sinteza i karakterizacija mikrogela. Rastvor prekursora mikrogela koji sadrži 5% tež./zap. PEG-4MAL (20 kDa, Laysan Bio) i 1,0 mM biotin-PEG-tiol (1 kDa, Nanocs) reagovana je tokom 15 minuta u PBS. Ovaj prekursor je dispergovan u kapljice i zatim je umrežen u mineralnom ulju (Sigma) koje sadrži 2% SPAN80 (Sigma) i 1:15 emulziju od 30 mg/mL ditiotreitola (Sigma) na mikrofluidnom čipu, kao što je prethodno opisano. Pogledati Headen i dr., Advanced Materials, 26: 3003-3008 (2014). Kontrolni mikrogelovi koji nisu sadržali biotin-PEG-tiol takođe su sintetisani korišćenjem ovog protokola. Nakon pranja mikrogelova 5 puta centrifugiranjem u 1% goveđem serumskom albuminu (Sigma) u PBS, 10<4>mikrogelova su inkubirani sa različitim koncentracijama streptavidin-AlexaFluor488 konjugata tokom 30 minuta u 500 µL PBS, i isprani su 5 puta centrifugiranjem kako bi se uklonio nevezani SA. Mikrogelovi iz svakog uzorka su stavljeni u ploču sa 96 komorica i fluorescencija je merena na čitaču ploča (Perkin Elmer HTS 7000). Biotin i kontrolni mikrogelovi su takođe sintetisani sa kovalentno vezanim peptidom (GRGDSPC)-AlexaFluor594 konjugatom za vizuelizaciju kapsule, i fluorescentno su snimljeni kako bi se potvrdila SA imobilizacija specifična za biotin.
[0083] In vitro SA-FasL bioaktivnost.10<4>mikrogelova, sa ili bez biotina, ko-inkubirani su tokom 30 minuta u 500 µL PBS sa 1% goveđeg serumskog albumina koji sadrži različite SA-FasL koncentracije. Mikrogelovi su isprani 8 puta centrifugiranjem kako bi se uklonio nevezani SA-FasL i inkubirani sa 10<6>A20 ćelija u medijumu od 1,0 mL. Posle 18 sati, ćelije su obojene markerima rane i kasne apoptoze (aneksin V-APC i propidijum jodid, BD Biosciences). Uzorci su analizirani protočnom citometrijom (Accuri C6 protočni citometar) i ćelije koje su obojene pozitivno na bilo koji marker smatrane su apoptotičnim. Izvedene su tri nezavisne replike ovog eksperimenta.
[0084] In vitro citokompatibilnost SA-Fas-L konjugovanih mikrogelova. Ostrvca pankreasa pacova su izolovana od Lewis muških donora i kultivisana preko noći pre sprovođenja eksperimenta. Posle 24 sata, 500 IEQ u 300 µL kompletnog CMRL je zajedno kultivisano sa 1000 SA-FasL konjugovanim mikrogelovima tokom dodatna 24 sata. Ostrvca su zatim analizirana na metaboličku aktivnost preko MTT (Promega);
Živi/mrtvi uzorci su vizuelizovani korišćenjem Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) i Zeiss LSM 710 invertovanog konfokalnog mikroskopa. Statički test oslobađanja insulina stimulisanog glukozom (GSIR) je korišćen za procenu sekrecije insulina ostrvaca nakon ko-kulture, stimulisanje sa niskim (3 mM) i visokim Krebsovim puferom (11 mM) u trajanju od 1 sata. Drugo izlaganje bazalnim uslovima izvršeno je tokom dodatnog 1 sata. Za kvantifikaciju uzoraka GSIR korišćen je ELISA test insulina pacova (Mercodia, Inc., Winston Salem, NC). Inflamatorni citokini iz supernatanta ko-kulture analizirani su pomoću multipleksnog kompleta za detektovanje antitela zasnovanog na magnetnim perlama (Milliplex Rat Cytokine Panel with IFNg, IL-1b, IL-6, IL-17A, MCP-1, MIP-1a) prema uputstvima proizvođača. Pedeset mikrolitara supernatanta iz tri nezavisne komorice je analizirano korišćenjem Magpix sa Analyst softverom za analizu (Milliplex@ 5,1, Merck, SAD). Standardne krive za svaki analit su generisane korišćenjem standarda koje je pružio proizvođač. Imunološka analiza insulina i glukagona obavljena je nakon ko-kulture fiksiranjem uzoraka ostrvaca u 10% formalinu tokom 1 sata. Celi uzorci su obojeni u suspenziji za insulin (Dako A0564, 1:100), glukagon (Abcam ab10988, 1:50) i DAPI (Invitrogen, 1:500). Celokupni uzorci su snimljeni za insulin (žuto), glukagon (magenta) i DAPI (plavo).
[0085] In vivo SA-FasL praćenje. SA-FasL je označen sa AlexaFluor750 NHS estrom (Thermo Fisher), i slobodna boja je uklonjena desalinizacijom u Zeba koloni (7k MWCO, Thermo Fisher) tri puta.3,0 µg označenog SA-FasL je imobilisano na 2000 biotinskih mikrogelova inkubacijom od 30 minuta, nakon čega je usledilo 5 koraka ispiranja. Mikrogelovi koji ispoljavaju SA-FasL ili su bez SA-FasL su implantirani ispod kapsule bubrega C57Bl/6 primaoca (n=8 miševa/grupi), i intenzitet i distribucija signala su praćeni uzdužno korišćenjem IVIS SpectrumCT sistema za snimanje. Merenja intenziteta su normalizovana na vrednostima dana 0. Uklapanja nelinearne krive su izvedena u GraphPad Prism i vreme zadržavanja je upoređeno korišćenjem t-testa. Pored toga, za svaku grupu je izračunata površina ispod krive, i za poređenje grupa korišćen je Velčov t-test.
[0086] Transplantacija ostrvaca. BALB/c ostrvca pankreasa su izolovana korišćenjem Liberase TL kao digestivnog enzima (Roche Life Science) i prečišćena Ficoll gradijentom gustine kao što je ranije objavljeno. Pogledati Yolcu i dr., Immunity 17: 795-808 (2002). Kako bi se biotinilovala ostrvca, kultivisana ostrvca preko noći su inkubirana u 5 µM EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Scientific) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, opsežno isprana PBS kako bi se uklonio nevezani rastvor biotina. Biotinilovana ostrvca i mikrogelovi su izrađeni sa SA-FasL (~150 ng/500 ostrvaca i 1-10 µg/1000 mikrogelova). Približno, 500 ostrvaca ko-transplantirano je sa 1000 mikrogela u streptozotocin dijabetičke (200 mg/kg i.p., dijabetes (> 250 mg/dL) potvrđen dva uzastopna dana) C57BL/6 ili B6.129(Cg)-Foxp3<tm3(DTR/GFP)Ayr>/J (C57BL/6.FoxP3<EGFP/DTR>) primaoce, gde je naznačeno. Za smanjenje Treg, primaoci transplantata ostrvaca injektirani su i.p. sa toksinom difterije (50 µg/kg telesne težine) i iscrpljivanje je potvrđeno 3 dana kasnije u limfocitima periferne krvi korišćenjem protočne citometrije. Odabrane grupe su takođe tretirane i.p. sa rapamicinom u dozi od 0,2 mg/kg dnevno tokom 15 doza počevši od dana transplantacije. Nemodifikovana BALB/c ostrvca ko-transplantirana sa nemodifikovanim PEG gelovima korišćena su kao kontrole. Životinje su praćene na nivo glukoze u krvi, i nivoi glukoze u krvi ≥ 250 mg/dL za dva uzastopna dnevna merenja su se smatrali odbijenim. IPGTT je izveden na dan 200 nakon transplantacije nakon 6 sati gladovanja uz upotrebu 2 g/kg rastvora glukoze (25%). Nivo glukoze u krvi je procenjen ubodom repa pre injekcije i 10, 20, 30, 60, 90, 120 minuta nakon injekcije. Podaci su grafički prikazani pomoću GraphPad Prism i korišćen je test log ranga kako bi se odredila značajnost između grupa, p < 0,05 se smatra značajnim
[0087] Praćenje imuniteta. Slezina, bubrezi i limfni čvorovi koji dreniraju bubrege sakupljeni su od odbacujućih miševa i dugoročnih miševa (> 200 dana). Pojedinačne ćelije su pripremljene iz slezine i limfnih čvorova nežnim mehaničkim raspršivanjem i iz bubrega sa ostrvcima varenjem kolagenazom. Ćelije su obojene upotrebom antitela na markere ćelijske površine (Alexa 700-CD4 Ab, APC-Cy7-CD8 Ab, PE-Cy7-CD25 Ab od Pharmingen, BD, i eFlour 450-CD44 Ab i PerCP-Ci5,5-CD62L Ab od eBioscience).
Intracelularno FoxP3 bojenje je sprovedeno na fiksiranim/permeabliziranim ćelijama korišćenjem seta pufera za bojenje FoxP3 transkripcionog faktora (eBioscience). Podaci su prikupljeni korišćenjem BD LSR II i analizirani korišćenjem Diva softvera. Podaci su grafički prikazani korišćenjem GraphPad Prism, i Velčov ttest je korišćen za određivanje značaja između grupa, p < 0,05 se smatra značajnim
[0088] Test proliferacije. Splenociti sakupljeni iz odabrane grupe primalaca transplantacije su označeni sa CFSE i korišćeni kao odgovor na ozračene (2000 cGi) splenocite od donora ili treće strane C3H miševa u standardu in vitro test proliferacije. PogledatiE. S. Yolcu i dr., J Immunol, 187: 5901-5909 (2011). Posle 4 dana u kulturi, ćelije su obojene sa 7AAD i fluorescentno konjugovanim Abs protiv CD4 i CD8, i analizirane na CFSE razblaživanje pomoću gejtinga na živim ćelijama korišćenjem BD LSR II. Podaci su analizirani korišćenjem Diva softvera. Podaci su grafički prikazani korišćenjem GraphPad Prism i Velčov t-test je korišćen za određivanje značajnosti između grupa, p < 0,05 se smatra značajnim.
[0089] Konfokalna mikroskopija. Nakon perioda posmatranja od 200 dana, dugoročni bubrezi koji nose ostrvca su brzo zamrznuti u OCT jedinjenju (Sakura Tissue-Tek) potapanjem u metil butan (Sigma) na suvom ledu. Tkiva su isečena na kriške debljine 10 µm korišćenjem Bright OTF5000 kriomikrotoma (Rose Scientific) i stavljena na matirane pločice za bojenje. Pločice su fiksirane u 4% paraformaldehida, inkubirane u 0,5% Triton X-100 i blokirane u 0,1% goveđem serumskom albuminu, 5% kozjeg seruma i pacovskog anti-mišjeg CD16/CD32 (BD Pharmingen). Bojenje je izvedeno korišćenjem zečjeg anti-glukagonskog mAb (ćelijsko signaliziranje) i poliklonskog anti-insulinskog antitela zamorca (Dako) kao primarnih antitela, nakon čega je usledilo ispiranje i bojenje kozjim anti-zečjim antitelom sa AlexaFluor-647 (Life AlexaFluor)-555-konjugovano antitelo zamorca (Invitrogen). Hoechst 33342 (Molecular Probes) je korišćen za bojenje DNK. Fluorescentne slike su dobijene korišćenjem Leica TCS SP5 konfokalne mikroskopije pod uvećanjem od 10X.

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Biomaterijal izrađen da prikaže FasL protein, gde je biomaterijal hidrogel, gde hidrogel sadrži himerni FasL protein koji sadrži FasL deo i streptavidin ili avidinski deo konjugovan preko biotina sa hidrogelom.
2. Biomaterijal prema patentnom zahtevu 1, gde hidrogel jeste mikrogel.
3. Biomaterijal prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde hidrogel jeste mikrogel od polietilen glikola (PEG) izrađen da ispoljava biotinski deo.
4. Biomaterijal prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3, gde FasL deo jeste FasL protein otporan na matričnu metaloproteinazu.
5. Biomaterijal prema patentnom zahtevu 1, gde biomaterijal dalje sadrži imunosupresivni lek.
6. Biomaterijal prema patentnom zahtevu 5, gde imunosupresivni lek jeste rapamicin.
7. Biomaterijal prema patentnom zahtevu 1, gde biomaterijal dalje sadrži ćeliju transplantata.
8. Biomaterijal prema patentnom zahtevu 7, gde ćelija transplantata jeste inkapsulirana biomaterijalom.
9. Biomaterijal prema patentnom zahtevu 7, gde ćelija transplantata nije inkapsulirana biomaterijalom.
10. Biomaterijal izrađen da prikaže FasL protein prema bilo kom patentnom zahtevu od 1-9 za upotrebu u izazivanju imunološke tolerancije kod pacijenta koji ima potrebu za tim.
11. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde se hidrogel transplantira u pacijenta.
12. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 u kombinaciji sa imunosupresivnim lekom, opciono gde imunosupresivni lek jeste rapamicin.
13. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde je pacijent čovek, primat koji nije čovek, svinja, pas, mačka, krava, ovca, konj, zec, miš ili pacov.
14. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde je pacijentu potrebna imunološka tolerancija na ćeliju transplantata, opciono gde pacijentu se primenjuje ćelija transplantata, opciono gde biomaterijal dalje sadrži ćeliju transplantata, opciono gde je ćelija transplantata inkapsulirana biomaterijalom, opciono gde je ćelija transplantata odabrana između PBMC, ćelija koštane srži, hematopoetskih matičnih ćelija, matičnih ćelija, mezenhimalnih matičnih ćelija, dendritskih ćelija, dendritskih ćelija pulsiranih sa autoantigenima, proizvoda ljudskih beta ćelija i splenocita.
15. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde je pacijentu potrebna imunološka tolerancija na ćeliju transplantata, opciono gde se pacijentu primenjuje ćelija transplantata gde ćelija transplantata nije inkapsulirana biomaterijalom, opciono gde je ćelija transplantata izabrana od PBMC, ćelija koštane srži, hematopoetskih matičnih ćelija, matičnih ćelija, mezenhimalnih matičnih ćelija, dendritskih ćelija, dendritskih ćelija pulsiranih autoantigenima, proizvoda ljudskih beta ćelija i splenocita.
16. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde je pacijentu potreban tretman za dijabetes tipa 1, opciono gde se pacijentu primenjuju ćelije ostrvaca pankreasa.
17. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde su pacijentu potrebni tretman ili prevencija odbacivanja alotransplantata, opciono gde se pacijentu primenjuju ćelije od donora alotransplantata.
18. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde su pacijentu potrebni tretman ili prevencija odbacivanja ksenotransplantata, opciono gde se pacijentu primenjuju ćelije od donora ksenotransplantata, opciono gde je donor ksenotransplantata čovek, primat koji nije čovek, svinja, pas, mačka, krava, ovca, konj, zec, miš ili pacov.
19. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde su pacijentu potrebni tretman ili prevencija odbacivanja autotransplantata, opciono, gde se pacijentu primenjuju autologne ćelije transplantata, opciono gde se autologne ćelije transplantata dobijaju indukovanom pluripotencijom.
20. Biomaterijal za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde su pacijentu potrebni tretman ili prevencija auto imunosti, opciono gde se pacijentu primenjuje autoantigen ispoljen na ćeliji odabranoj od (i) ćelije koja eksprimira autoantigen (ii) ćelije obogaćene sa autoantigenom i (iii) dendritske ćelije pulsirane sa autoantigenom.
21. Postupak za pravljenje biomaterijala prema bilo kom patentnom zahtevu od 1-9, koji obuhvata dovođenje u dodir biotinilovanog biomaterijala sa himernim FasL proteinom koji sadrži FasL deo i streptavidinski ili avidinski deo.
RS20230876A 2017-03-10 2018-03-09 Fasl-izrađeni biomaterijali sa imunomodularnom funkcijom RS64754B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762469802P 2017-03-10 2017-03-10
EP18764623.7A EP3592392B1 (en) 2017-03-10 2018-03-09 Fasl-engineered biomaterials with immunomodulatory function
PCT/US2018/021742 WO2018165547A1 (en) 2017-03-10 2018-03-09 Fasl-engineered biomaterials with immunomodulatory function

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64754B1 true RS64754B1 (sr) 2023-11-30

Family

ID=63448048

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230876A RS64754B1 (sr) 2017-03-10 2018-03-09 Fasl-izrađeni biomaterijali sa imunomodularnom funkcijom

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11602547B2 (sr)
EP (2) EP3592392B1 (sr)
JP (1) JP7335821B2 (sr)
CN (2) CN110582560B (sr)
AU (1) AU2018230474B2 (sr)
CA (1) CA3055908A1 (sr)
DK (1) DK3592392T3 (sr)
ES (2) ES3038100T3 (sr)
FI (1) FI3592392T3 (sr)
HR (1) HRP20231297T1 (sr)
HU (1) HUE064306T2 (sr)
LT (1) LT3592392T (sr)
PL (1) PL3592392T3 (sr)
PT (1) PT3592392T (sr)
RS (1) RS64754B1 (sr)
SI (1) SI3592392T1 (sr)
SM (1) SMT202300437T1 (sr)
WO (1) WO2018165547A1 (sr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3886759A1 (en) * 2018-11-26 2021-10-06 Massachusetts Institute of Technology Compositions and methods for immune tolerance
EP4178623A4 (en) 2020-07-08 2025-04-16 Georgia Tech Research Corporation Crosslinked hydrogel for immune checkpoint blockade delivery
EP4452351A4 (en) * 2021-12-20 2026-03-18 Univ Florida MICROGELS, MICROGELS MANUFACTURING PROCESSES AND MICROGELS USAGE PROCESSES
AU2023268552A1 (en) * 2022-05-12 2024-11-21 Itolerance, Inc. Transient sirolimus with fasl microgels
WO2024182722A1 (en) * 2023-03-01 2024-09-06 Georgia Tech Research Corporation Therapeutic nanoparticles for solid organ immune acceptance
WO2024249293A1 (en) * 2023-05-26 2024-12-05 The Curators Of The University Of Missouri Controlled release of therapeutic proteins for immunomodulation
WO2025255498A1 (en) * 2024-06-06 2025-12-11 The General Hospital Corporation Biocompatible polymer compositions and methods of use

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5917796A (en) 1995-04-11 1997-04-09 Trustees Of Boston University Streptavidin mutants
JP3925663B2 (ja) * 1995-06-30 2007-06-06 持田製薬株式会社 抗Ｆａｓリガンド抗体および該抗体を用いた測定法
GB9523469D0 (en) * 1995-11-16 1996-01-17 Sandoz Ltd Organic compounds
US7927602B2 (en) * 2002-07-23 2011-04-19 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Fas ligand-avidin/streptavidin fusion proteins
AU1676302A (en) 2000-06-30 2002-01-14 Univ Louisville Res Found Alteration of cell membrane for new functions
WO2004049907A2 (en) 2002-11-27 2004-06-17 University Of Louisville Research Foundation Compositions and methods for treating transplants
CA2619048A1 (en) * 2005-08-15 2007-02-22 The Regents Of The University Of California Vegf-activated fas ligands
WO2011041240A1 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tissue transplant compositions and methods for use
RU2554854C9 (ru) 2009-07-31 2017-02-03 Асцендис Фарма Ас Биоразлагаемые нерастворимые в воде гидрогели на основе полиэтиленгликоля
WO2011055944A2 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 Sk Holdings Co., Ltd. Methods for treating fibromyalgia syndrome
AU2013328785B2 (en) 2012-10-11 2016-07-21 Ascendis Pharma A/S Hydrogel prodrugs
US20160194625A1 (en) * 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US9381217B2 (en) 2013-09-09 2016-07-05 Georgia Tech Research Corporation Microgels for encapsulation of cells and other biologic agents
US12023367B2 (en) * 2015-06-19 2024-07-02 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Immunomodulation for the long term prevention and treatment of autoimmune diseases and foreign tissue rejection

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20231297T1 (hr) 2024-02-02
JP7335821B2 (ja) 2023-08-30
EP3592392A4 (en) 2020-12-16
ES3038100T3 (en) 2025-10-09
AU2018230474A1 (en) 2019-10-31
US11602547B2 (en) 2023-03-14
HUE064306T2 (hu) 2024-02-28
WO2018165547A1 (en) 2018-09-13
CN110582560B (zh) 2024-06-14
EP4299749C0 (en) 2025-07-16
US20200046780A1 (en) 2020-02-13
DK3592392T3 (da) 2023-10-23
EP3592392B1 (en) 2023-09-13
PL3592392T3 (pl) 2024-03-18
EP3592392A1 (en) 2020-01-15
JP2020511531A (ja) 2020-04-16
SI3592392T1 (sl) 2024-02-29
EP4299749B1 (en) 2025-07-16
ES2963331T3 (es) 2024-03-26
US20230310510A1 (en) 2023-10-05
AU2018230474B2 (en) 2023-08-03
CN110582560A (zh) 2019-12-17
EP4299749A2 (en) 2024-01-03
CN118697854A (zh) 2024-09-27
EP4299749A3 (en) 2024-03-27
LT3592392T (lt) 2024-01-25
SMT202300437T1 (it) 2024-01-10
CA3055908A1 (en) 2018-09-13
FI3592392T3 (fi) 2023-11-09
PT3592392T (pt) 2023-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230310510A1 (en) Fasl-engineered biomaterials with immunomodulatory function
Headen et al. Local immunomodulation with Fas ligand-engineered biomaterials achieves allogeneic islet graft acceptance
JP6505063B2 (ja) インビボで結合組織を生成、修復、および／または維持するための方法
Scalea et al. Transplantation tolerance induction: cell therapies and their mechanisms
Zakrzewski et al. Overcoming immunological barriers in regenerative medicine
Kim et al. Interleukin (IL)-10 induced by CD11b+ cells and IL-10-activated regulatory T cells play a role in immune modulation of mesenchymal stem cells in rat islet allografts
Davis et al. Harnessing the immunomodulatory and tissue repair properties of mesenchymal stem cells to restore β cell function
Liu et al. Methoxy polyethylene glycol modification promotes adipogenesis by inducing the production of regulatory T cells in xenogeneic acellular adipose matrix
Pathak et al. Tregs and mixed chimerism as approaches for tolerance induction in islet transplantation
Oli et al. Classic and current opinions in human organ and tissue transplantation
Shi et al. Endogenous expansion of regulatory T cells leads to long-term islet graft survival in diabetic NOD mice
US12594346B2 (en) Crosslinked hydrogel for immune checkpoint blockade delivery
HK40105464A (en) Fasl-engineered biomaterials with immunomodulatory function
Kochat et al. Donor antigen-primed regulatory T cells permit liver regeneration and phenotype correction in hemophilia A mouse by allogeneic bone marrow stem cells
EP3212222A2 (en) Compositions and methods for antigen-specific tolerance
Wong Exploring New Avenues in Islet Transplantation: Localized Immune Modulations with Rapamycin-Eluting Microparticles
Weiss et al. The indirect alloresponse impairs the induction but not maintenance of tolerance to MHC class I-disparate allografts
JP2025516714A (ja) Ｆａｓｌミクロゲルを用いた一過性シロリムス
WO2026064310A1 (en) Anti-cd3 granular hydrogel for immune protection of cell therapies
Model LOCAL IMMUNOSUPPRESSION FOR LONG-TERM MAINTENANCE OF VASCULARIZED COMPOSITE ALLOTRANSPLANTATION
Woodward Targeting Fas pathway as an effective means of inducing tolerance to pancreatic islets.
Liu Development of Biomaterial Scaffolds to Modulate the Local Immune Microenvironment and Support Allogeneic Islet Transplantation
Dhadda Using mesenchymal stromal cells to improve islet transplantation outcome
Selig Immunomodulatory Function of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Experimental Autoimmune Type 1 Diabetes
Bayrack Evaluation of the Protection Induced by a Monotherapy of Anti-LFA-1 Monoclonal Antibody and Co-transplantation of Neonatal Porcine Islets with Sertoli Cells