RS64850B1 - Metodi za detektovanje neutrališućih antitela na leptin - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na metode za detektovanje neutrališućih antitela na leptin. Takvi metodi se mogu koristiti za detektovanje neutrališućih antitela na leptin u uzorku, ili za identifikovanje subjekata koji imaju neutrališuća antitela na leptin u krvi, serumu ili plazmi.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Metreleptin je analog leptina indikovan kao dodatak dijeti kao zamenska terapija za lečenje komplikacija leptinske deficijencije u subjektima sa urođenom ili stečenom generalizovanom lipodistrofijom. Urođena generalizovana lipodistrofija je retko stanje okarakterisano skoro potpunim nedostatkom adipoznog tkiva u telu i vrlo mišićavom pojavom. Adipozno tkivo se nalazi u mnogim delovima tela, uključujući ispod kože i u okružuenju unutrašnjih organa. Ono skladišti masnoću za energiju, a takođe pravi jastučiće i izoluje telo. Nedostatak adipoznog tkiva dovodi do skladištenja masnoće na drugim mestima u telu, na primer, u jetri i mišićima, što izaziva ozbiljne zdravstvene probleme. Stečena generalizovana lipodistrofija je retko stanje koje se javlja u detinjstvu ili adolescenciji, okarakterisano gubitkom masnoće što pogađa velike površine tela, naročito lice, ruke i noge.

[0003] Pored toga, metreleptin se izučava kao tretman za druge indikacije, uključujući parcijalnu lipodistrofiju, hipotalamičku amenoreju, nealkoholičarski steatohepatitis i razne druge hipoleptinemičke dismetaboličke poremećaje.

[0004] Metreleptin se generalno daje dnevno, subkutanim injekcijama. Zbog tog ponavljanog davanja, postoji rizik da subjekti razviju antitela na metreleptin. Ova antitela mogu da neutrališu metreleptin, čineći tretman neefektivnim. Štaviše, one mogu da neutrališu endogeni leptin, pogoršavajući bolest subjekata koji već pate od deficijencije leptina. Iz tog razloga, u struci postoji potreba za metodom pouzdanog detektovanja neutrališućih antitela u subjektima.

[0005] Dokumenti WO 2011/117084 A1 i FETISSOV SO et al., Autoantibodies against appetite-regulating peptide hormones i neuropeptides: Putative modulation by gut microflora (Autoantitela na peptidne hormone koji regulišu apetit i neuropeptide: Putativna modulacija crevnom mikroflorom). Nutrition 2008, vol. 24, str. 348-359 opisuju metode za detekciju antitela na leptin koje uključuju imobilisanje leptina na čvrstoj podlozi, dovođenje u kontakt imobilisanog leptina sa humanim uzorkom seruma da bi se uhvatila antitela na leptin prisutna u njemu, a zatim dovođenje u kontakt uhvaćenih antitela na leptin sa obeleženim antihumanim imunoglobulinskim antitelom kao sredstvom za detekciju uhvaćenih antitela na leptin.

[0006] Dokument CHAN JL et al., Immunogenicity associated with metreleptin tretman in patients with obesity ili lipodystrophy (Imunogenost vezana za tretman metreleptinom u pacijentima sa gojaznošću ili lipodistrofijom), Clinical Endocrinology 2016, vol. 85, str.137-149, opisuje metod za detekciju antitela na leptin koji uključuju mešanje dva različita tipa konjugata metreleptina, tj. jedan konjugovan sa biotinom, a drugi konjugovan sa detektabilnim obeleživačem, sa humanim uzorkom seruma, koji hvata antitela na metreleptin vezana za oba tipa konjugata metreleptina u čvrstoj fazi preko biotina iz jednog tipa konjugata metreleptina i detektuje uhvaćena antitela na metreleptin preko detektabilnog obeleživača iz drugog tipa konjugata metreleptina.

[0007] Dokument US 2005/209137 A1 opisuje metod za detekciju nivoa slobodnog leptina u uzorku iz osobe, koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka sa ptičjim domenom za vezivanje leptinskog receptora koji je vezan za čvrstu fazu, dovođenje u kontakt čvrste faze sa antitelom koje se specifično vezuje za leptin koje je kuplovano sa detektabilnim obeleživačem i detektovanje navedenog obeleživača koji je ostao u navedenoj čvrstoj fazi, čime se detektuje nivo slobodnog leptina u uzorku.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

[0008] Predmetni pronalazak se odnosi na detekciju neutrališućih antitela na leptin.

[0009] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na metod detektovanja neutrališućih antitela na leptin u uzorku, koji obuhvata: (a) inaktiviranje leptina prisutnog u uzorku; (b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u uzorak; (c) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin, gde navedeni supstrat sposoban da veže obeležen leptin sadrži obložen matriks i obeležen leptinski receptor vezan za obložen matriks; (d) pranje supstrata da bi se uklonio nevezan obeležen leptin i (e) merenje signala obeleživača koji je proizveo obeleženi leptin vezan za supstrat.

[0010] U jednom drugom aspektu, pronalazak se odnosi na metod identifikovanja subjekta koji ima neutrališuća antitela na leptin u krvi, serumu ili plazmi subjekta, koji obuhvata (a) inaktiviranje leptina i leptina prisutnog u uzorku subjektove krvi, seruma ili plazme; (b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u uzorak; (c) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin, gde navedeni supstrat sposoban da veže obeležen leptin sadrži obložen matriks i obeležen leptinski receptor vezan zavezan za obložen matriks; (d) pranje supstrata da bi se uklonio nevezan obeležen leptin; (e) merenje signala obeleživača koji je proizveo vezani obeleženi leptin; (f) merenje signala pozitivne kontrole, gde je navedeni signal pozitivne kontrole proizveden izvršavanjem koraka (a) - (e) i dalje obuhvata dodavanje poznate količine antitela na leptin u koraku (b) i (g) poređenje signala iz (e) sa signalom iz (f), gde, ako je nivo signala merenog u koraku (e) jednak ili manji od nivoa signala merenog u koraku (f), onda je subjekt pozitivan na testu za neutrališuća antitela na leptin.

[0011] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metod identifikovanja subjekata koji imaju neutrališuća antitela na leptin u krvi, serumu ili plazmi subjekta, koji obuhvata: (a) inaktiviranje leptina prisutnog u uzorku subjektove krvi, seruma ili plazme; (b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u uzorak; (c) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin, gde navedeni supstrat sposoban da veže obeležen leptin sadrži obložen matriks i obeležen leptinski receptor vezan zavezan za obložen matriks; (d) pranje supstrata da bi se uklonio nevezan obeleženi leptin; (e) merenje signala obeleživača koji je proizveo vezani obeleženi leptin; (f) merenje signala negativne kontrole, gde je navedeni signal negativne kontrole proizveden izvršavanjem koraka (a) - (e), gde uzorak krvi, seruma ili plazme ne sadrži neutrališuća antitela na leptin i (g) poređenje razlike u procentima u signalu iz (e) i signalu iz (f) sa graničnom vrednošću gde, ako je razlika u procentima između signala iz (e) i signala iz (f) veća od granične vrednosti, onda je subjekt pozitivan na testu za neutrališuća antitela na leptin. U nekim rešenjima, granična vrednost je između oko 5% i oko 40%, ili između oko 5% i oko 30%, ili između oko 5% i 15%.

[0012] U određenim rešenjima, leptin može biti obeležen peroksidazom rena ili rutenijum trisbipiridinom.

[0013] U nekim rešenjima, inaktivacija leptina se može postići zagrevanjem uzorka.

[0014] Obložen matriks može biti matriks obložen streptavidinom. Leptinski receptor može biti obeležen biotinom.

[0015] U nekim rešenjima, supstrat koji je sposoban da veže obeležen leptin može da sadrži (i) obložen matriks, (ii) antitelo vezano za matriks iz (i) i (iii) obeležen leptinski receptor vezan za antitelo iz (ii). Obložen matriks može biti matriks obložen streptavidinom. Leptinski receptor može biti obeležen obeleživačem pogodnim za afinitetno prečišćavanje; na primer, leptinski receptor može biti obeležen heksahistidinskim obeleživačem. Antitelo može imati pogodan afinitet za obeleživač leptiskog receptora; obeleživač, antitelo može biti antitelo na heksahistidin. Dalje, antitelo može biti obeleženo obeleživačem pogodnim za vezivanje za obložen matriks, kao što je biotin.

[0016] Metodi predmetnog pronalaska mogu još da obuhvataju korak snižavanja pH inaktiviranog uzorka (a) dodavanjem kiselog rastvora i da, gde obeleženi leptin dodat u (b) još obuhvata bazni rastvor dovoljan da neutrališe pH uzorka posle dodavanja. Kiseli rastvor može biti rastvor sirćetne kiseline, kao što je 0,8% sirćetna kiselina. Bazni rastvor može biti pufer, kao što je 0,125 M Tham pufer.

[0017] U nekim rešenjima, obeleženi leptin dodat u koraku (b) može biti rekombinantni humani leptin. U određenim rešenjima, obeleženi leptin dodat u koraku (b) može biti metreleptin.

[0018] U nekim rešenjima, detektabilni signal je generisan u koraku (e) kad je koncentracija obeleženog leptina, kao što je metreleptin, u uzorku u koraku (b) između oko 90 ng/mL i oko 120 ng/mL ili između oko 100 ng/mL i oko 110 ng/mL, kao što je oko 101 ng/mL, ili oko 109 ng/mL.

KRATAK OPIS SLIKA

[0019] Predmetni pronalazak će dalje biti objašnjen pozivajući se na pridružene crteže. Prikazani crteži nisu nužno u pravoj razmeri, nego su uopšteno dati sa naglaskom na ilustrovanje principa predmetne prijave i neke odlike mogu biti prenaglašene da bi prikazale detalje konkretnih komponenata. Pored toga, sve mere, specifikacije i slično, prikazane na slikama ili opisane niže, su planirane da budu ilustrativne, a ne restriktivne. Prema tome, specifične strukturne i funkcionalne detalje opisane ovde ne treba interpretirati kao ograničavajuće, nego samo kao reprezentativnu osnovu za instruiranje stručnjaka da primeni metode opisane ovde.

Sl. 1A-1B prikazuje primer testa receptorskog vezivanja za leptin i metreleptin koji uključuje supstrat sposoban da veže obeležen leptin, koji obuhvata (i) obložen matriks i (ii) obeležen leptinski receptor vezan za matriks iz (i), u skladu sa pronalaskom. Sl. 1A opisuje različite komponente korišćene u testu, a Sl.1B ilustruje primenu testa.

Sl. 2 predstavlja primer lista sa podacima za predstavljanje rezultata testa receptorskog vezivanja u skladu sa rešenjima pronalaska.

Sl. 3A-3B prikazuje primer testa receptorskog vezivanja za leptin i metreleptin koji uključuje supstrat sposoban da veže obeležen leptin, koji obuhvata (i) obložen matriks, (ii) antitelo vezano za matriks iz (i) i (iii) obeležen leptinski receptor vezan za antitelo iz (ii), u skladu sa rešenjima pronalaska. Sl. 3A opisuje različite komponente korišćene u testu, a Sl.3B ilustruje primenu testa.

Sl. 4 prikazuje primer testa receptorskog vezivanja za metreleptin koji uključuje pozitivnu i negativnu kontrolu, u skladu sa rešenjima pronalaska.

Sl. 5 prikazuje korak razdruživanja u kiselini za upotrebu u primeru testa receptorskog vezivanja za metreleptin, u skladu sa rešenjima pronalaska.

Sl. 6 je tabela koja prikazuje signal, inhibiciju u %, kao i kategorijske podatke iz analize uzoraka iz 17 subjekata, od kojih su neki zdravi, a neki bolesni i prethodno tretirani leptinom.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Metodi za detektovanje neutrališućih antitela na leptin

[0020] Ovde su opisani metodi za detektovanje neutrališućih antitela na leptin u uzorku, koji obuhvatju korake (a) inaktiviranja leptina prisutnog u uzorku; (b) dodavanja poznate količine obeleženog leptina u uzorak; (c) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin, gde navedeni supstrat sposoban da veže obeležen leptin sadrži obložen matriks i obeležen leptinski receptor vezan za obložen matriks; (d) pranje supstrata da bi se uklonio nevezan obeležen leptin i (e) merenje signala obeleživača koji je proizveo obeleženi leptin vezan za supstrat.

[0021] Termin "metod" i "test" se ovde koriste u istom značenju.

[0022] Namera je da metodi opisani ovde mogu da se koriste za detektovanje neutrališućih antitela na leptin iz bilo koje vrste, uključujući leptin koji se prirodno javlja u čoveku, mišu, pacovu i drugim heterolognim vrstama, kao i rekombinantno proizveden zreo leptin. Na primer, leptin je polipeptidni proizvod, na primer, ob gena kao što je opisano u International Publication No. WO 96/05309 i U.S. Patent No.6,309,853. Metodi iz pronalaska mogu da se koriste i za detektovanje neutrališućih antitela na biološki aktivne fragmente leptina, agoniste, analoge agonista, varijante, fuzione proteine, himerni leptin i njegove druge derivate, kao što su ona jedinjenja opisana u U.S. Patent No.5,521,283, U.S. Patent No.5,532,336, U.S. Patent No. 5,552,522, U.S. Patent No. 5,552,523, U.S. Patent No. 5,552,524, U.S. Patent No.

5,554,727, U.S. Patent No.5,559,208, U.S. Patent No. 5,580,954, U.S. Patent No.5,594,101, U.S. Patent No.5,691,309, U.S. Patent No.5,756,461, U.S. Patent No.5,851,995, U.S. Patent No. 5,935,810, U.S. Patent No. 6,001,968, U.S. Patent No. 6,309,853, U.S. Patent No.

6,309,853, U.S. Patent No.6,350,730, U.S. Patent No. 6,420,339, U.S. Patent No.6,429,290, U.S. Patent No.6,541,033, U.S. Patent No.6,936,439, U.S. Patent No.7,112,659, U.S. Patent No. 7,183,254, U.S. Patent No. 7,208,577, U.S. Patent No. 8,080,254, U.S. Patent No.

8,394,765, U.S. Publication No. 2016/0083446, PCT Publication No. WO 00/09165, PCT Publication No. WO 00/20872, PCT Publication No. WO 00/21574, PCT Publication No. WO 00/47741, PCT Publication No. WO 04/39832, PCT Publication No. WO 09/64298, PCT Publication No. WO 96/05309, PCT Publication No. WO 96/22308, PCT Publication No. WO 96/23517, PCT Publication No. WO 96/40912, PCT Publication No. WO 97/02004, PCT Publication No. WO 97/06816, PCT Publication No. WO 97/18833, PCT Publication No. WO 97/38014, PCT Publication No. WO 98/08512, PCT Publication No. WO 98/12224, PCT Publication No. WO 98/28427, PCT Publication No. WO 98/46257, PCT Publication No. WO 98/55139, PCT Publication No. WO 2012/050925, PCT Publication No. WO 2012/050930 i PCT Publication No. WO 2013/009539. U određenim rešenjima, metodi iz pronalaska mogu da se koriste za detektovanje neutrališućih antitela na metreleptin.

[0023] Metodi zamišljeni za inaktiviranje leptina uključuju inaktivaciju toplotom, kao i tretman hemijskim inhibitorima leptina, uključujući hemijske otrove za leptin, uz uslov da inhibitori ili otrovi mogu da se inactivated prior to the addition of obeležen leptin.

[0024] Namera je da obeležen leptin može da bude u bilo kom obliku leptina, analoga leptina, himere leptina ili fuzionog proteina, ili njegovog derivata, uključujući ona jedinjenja nabrojana gore. Namera je da obeležen leptin može biti obeležen bilo kojim obeleživačem koji je u stanju da proizvede pogodno kvantifikovan signal. Obeleživači mogu biti fluorescentni obeleživači, uključujući vremenski razložene fluorescentne obeleživače. Primeri uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i rutenijum tris-bipiridin, između ostalih obeleživača poznatih u struci. Stručnjak će razumeti da će metod detektovanja signala obeleživača koji je proizveo obeležen leptin vezan za supstrat zavisiti od prirode obeleživača.

[0025] Supstrat koji se koristi za dovođenje u kontakt uzoraka koji sadrži obeležen leptin obuhvata (i) obložen matriks i (ii) obeležen leptinski receptor vezan za matriks. U nekim rešenjima, obložen matriks je matriks obložen streptavidinom. U određenim rešenjima, leptinski receptor je obeležen biotinom. Na primer, leptinski receptor može biti vezan za matriks preko biotina. Podrazumeva se da obložen matriks može biti vezan više nego jednim obeleženim leptinskim receptorom. U određenim rešenjima, analog leptiskog receptora može biti vezan za matriks.

[0026] Alternativno, supstrat može da obuhvata: (i) obložen matriks; (ii) antitelo vezano za matriks i (iii) obeležen leptinski receptor vezan za antitelo. U nekim rešenjima, obložen matriks je matriks obložen streptavidinom. U određenim rešenjima, leptinski receptor može biti obeležen bilo kojim obeleživačem pogodnim za afinitetno prečišćavanje. Na primer, obeleživač može biti heksahistidinski obeleživač. U nekim rešenjima, antitelo, o kom se može govoriti kao o "antitelu za hvatanje leptinskog receptora" je bilo koje antitelo sa pogodnim afinitetom za obeleživač leptiskog receptora. Na primer, antitelo „hvatač“ leptinskog receptora može biti antitelo na heksahistidin, ako leptinski receptor ima heksahistidinski obeleživač. Antitelo za hvatanje leptinskog receptora može da bude obeleženo i obeleživačem pogodnim da ga veže za matriks, na primer, biotin. U određenim rešenjima, analog leptiskog receptora može biti vezan za matriks.

[0027] Matriks, kao što se ovde koristi, može biti čvrsta podloga za koju se obeležen leptinski receptor ili antitelo vezuje. Matriks može biti odgovarajući da meri signal koji je proizveo obeležen leptin. Primeri matriksa uključuju, ali nisu ograničeni na, udubljenja u ploči, kao što je mikrotitarska ploča i perle. U određenim rešenjima, matriks može biti Meso Scale Discovery (MSD) ploča sa više udubljenja.

[0028] U određenim rešenjima, uzorak korišćen u predmetnim metodima za detektovanje neutrališućih antitela na leptin može biti odabran od krvi, seruma ili plazme subjekta. Subjekt može biti sisar, kao što je čovek.

[0029] U jednom aspektu pronalaska, metodi zamišljeni ovde se mogu koristiti za identifikovanje subjekata koji imaju neutrališuća antitela u, na primer, krvi, serumu ili plazmi. Zamišljeno je da osobe koje imaju neutrališuća antitela za bilo koji leptin ili analog leptina možegu biti identifikovane. Osobe koje su pozitivne na neutrališuća antitela mogu se identifikovati poređenjem signala koji je proizveo obeleženi leptin sa pozitivnim i/ili negativnim kontrolnim podacima. Kad je kontrola pozitivna kontrola, zamišljeno je da, gde je signal manji ili jednak pozitivnom kontrolnom signalu, uzorak će se računati kao pozitivan na neutrališuća antitela. Gde je kontrola negativna kontrola, razlika u procentima između signala uzorka i kontrolnog signala će biti izračunata i razlika u procentima će biti upoređena sa graničnom vrednošću, i ako je veća od granične vrednosti, subjektu se dijagnostikuju neutrališuća antitela na testirani leptin.

[0030] Rešenja metoda koji uključuju negativnu kontrolu su ilustrovana na Slikama 1A-1B i 3A-3B. Ove slike prikazuju kako može doći do vezivanja između obeleženog leptina/metreleptina i leptinskih receptora i/ili između anti-leptin/anti-metreleptin neutrališućih antitela i leptinskih receptora, da daju razliku u procentima u signalu koji je manji od granične vrednosti, jednak njoj ili veći od granične vrednosti.

[0031] Granična vrednost može biti između oko 5% i oko 40%, ili između oko 10% i oko 30%, ili oko 20%. Na primer, granična vrednost može biti oko 5%, ili oko 6%, ili 7%, ili oko 8%, ili oko 9%, ili oko 10%, ili oko 11%, ili oko 12%, ili oko 13%, ili oko 14%, ili oko 15%, ili oko 16%, ili oko 17%, ili oko 18%, ili oko 19%, ili oko 20%, ili oko 21%, ili oko 22%, ili oko 23%, ili oko 24%, ili oko 25%, ili oko 26%, ili oko 27%, ili oko 28%, ili oko 29%, ili oko 30%, ili oko 31%, ili oko 32%, ili oko 33%, ili oko 34%, ili oko 35%, ili oko 36%, ili oko 37%, ili oko 38%, ili oko 39%, ili oko 40%.

[0032] U određenim rešenjima, granična vrednost može da se razlikuje ako subjekt ima normalan nivo leptina ili ako subjekt ima leptinsku deficijenciju. U određenim rešenjima, subjekt ima leptinsku deficijenciju ako ima koncentraciju u serumu koja je oko 16 ng/mL ili niža za žene i oko 7 ng/mL ili niža za muškarce; koncentraciju u serumu koja je oko 8 ng/mL ili niža za žene i oko 5 ng/mL ili niža za muškarce; ili oko 5 ng/mL ili niža za žene i oko 3 ng/mL ili niža za muškarce. Ili, subjekt ima leptinsku deficijenciju ako ima koncentraciju u serumu unutar 15-og percentila ili 10-og percentila ili 8-og percentila ili drugog percentila ili prvog percentila po NHANES III. Alternativno, subjekt ima leptinsku deficijenciju ako ima koncentraciju u serumu koja je unutar specifikovanog percentila popravljenog za BMI, pol i/ili druge faktore, kao što je koncentraciju u serumu unutar 10-og percentila ili 5-og percentila ili 3-eg percentila, ili 2-og percentila, po NHANES III, popravljenog za BMI.

[0033] U određenim rešenjima gde subjekt nema leptinsku deficijenciju, granična vrednost će biti između oko 5% i oko 40%, ili između oko 5% i oko 30%, ili, u nekim rešenjima, između oko 5% i oko 15%, kao što je oko 10,2% ako su neutrališuća antitela na leptin detektovana (npr., ako je subjekt bio tretiran leptinom), ili oko 7,89% ako su neutrališuća antitela na metreleptin detektovana (npr., ako je subjekt bio tretiran metreleptinom). U određenim rešenjima gde subjekt ima leptinsku deficijenciju, granična vrednost će biti između oko 5% i oko 40%, ili između oko 5% i oko 30% ili, u nekim rešenjima, između oko 5% i oko 15%, kao što je oko 10,2% ako su neutrališuća antitela na leptin detektovana (npr., ako je subjekt bio tretiran leptinom), ili oko 9,66% ako su neutrališuća antitela na metreleptin detektovana (npr., ako je subjekt bio tretiran metreleptinom).

[0034] Slika 2 predstavlja primer liste sa podacima za upotrebu sa metodima iz pronalaska.

[0035] U jednom drugom aspektu, metodi zamišljeni ovde se mogu koristiti za određivanje promena u subjektu tokom vremena u prisustvu neutrališućih antitela na leptin u krvi, serumu ili plazmi subjekta. Na primer, metodi se mogu koristiti u subjektu kome se radi leptinski tretman, za procenu promena u prisustvu neutrališućih neutrališuća antitela u subjektovoj krvi, serumu ili plazmi pre tretmana leptinom, a zatim tokom ili posle tretmana leptinom. Primeri tretmana leptinom su poznati u struci. Metod može da obuhvata: (1a) inaktiviranje leptina prisutnog u prvom uzorku subjektove krvi, seruma ili plazme; (1b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u prvi uzorak; (1c) dovođenje u kontakt prvog uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (1b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin; (1d) pranje supstrata da se ukloni nevezan obeležen leptin; (1e) merenje signala obeleživača, proizvedenog od strane vezanog obeleženog leptina; (2a) inaktiviranje leptina prisutnog u drugom uzorku subjektove krvi, seruma ili plazme; (2b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u drugi uzorak; (2c) dovođenje u kontakt drugog uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (2b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin; (2d) pranje supstrata da se ukloni nevezan obeležen leptin; (2e) merenje signala obeleživača, proizvedenog od strane vezanog obeleženog leptina; (3) poređenje signala obeleživača iz (2e) sa signalom obeleživača iz (1e). U nekim rešenjima, poređenje može biti određivanje razlike u procentima između signala obeleživača iz (2e) i signala obeleživača iz (1e). U određenim rešenjima, razlika u procentima se može uporediti sa graničnom vrednošću. Granična vrednost može biti između oko 55% i oko 95%, ili između oko 60% i oko 90%. Primeri ukjlučuju oko 60%, ili oko 61%, ili oko 62%, ili oko 63%, ili oko 64%, ili oko 65%, ili oko 66%, ili oko 67%, ili oko 68%, ili oko 69%, ili oko 70%, ili oko 71%, ili oko 72%, ili oko 73%, ili oko 74%, ili oko 75%, ili oko 76%, ili oko 77%, ili oko 78%, ili oko 79%, ili oko 80%, ili oko 81%, ili oko 82%, ili oko 83%, ili oko 84%, ili oko 85%, ili oko 86%, ili oko 87%, ili oko 88%, ili oko 89%, ili oko 90%. U određenim rešenjima, granična vrednost se može koristiti za određivanje da li bi subjekt trebalo da nastavi tretman ili, da li će subjekt biti responsivan na tretman. Na primer, ako je razlika u procentima jednaka ili manja od granične vrednosti, može se odrediti da bi subjekt trebalo da prekine tretman ili, da subjekt neće odgovoriti na tretman.

[0036] Zamišljeni metodi mogu još da obuhvataju korak razdruživanja, da bi se razdružila bilo koja neutrališuća antitela u uzorku od bilo kog leptina koji može biti prisutan u uzorku. Navedeni korak razdruživanja može se može postići snižavanjem pH uzorka posle neutralizacije leptina. Pogodni reagensi za zakišeljavanje uzorka će odmah biti jasni stručnjaku, na primer, može se koristiti sirćetna kiselina, kao što je rastvor od oko 0,5% do oko 1% sirćetne kiseline, ili oko 0,8% sirćetne kiseline. Drugi pogodni reagensi koji se mogu koristiti za zakišeljavanje uzorka su poznati stručnjaku uobičajenog nivoa. Posle zakišeljavanja uzorka, koje razdružuje bilo koja neutrališuća antitela od leptina koji mogu biti prisutni u uzorku, obeležen leptin se može dodati zajedno sa baznim rastvorom, dovoljnim da neutrališe pH uzorka. Zamišljeno je da rastvor koji sadrži obeležen leptin može biti pufer, takav da, kad se doda uzorku, pH uzorka se podigne do približno 7, kao što je 7,4, dozvoljavajući neutrališućim antitelima prisutnim u uzorku da se vežu za obeležen leptin. Odgovarajući puferi uključuju Tham pufer od oko 0,1 M do oko 0,15 M, ili oko 0,12 M do oko 0,14 M, ili oko 0,124 M ili 0,125 M. Drugi pogodni puferi koji mogu da vrate pH uzorka do oko neutralnosti su poznati stručnjaku uobičajenog nivoa.

[0037] Signali koje proizvode obeleživači se mogu meriti metodima poznatim u struci. Na primer, pogodni uređaji koji mogu da mere signale bi bili poznati stručnjaku uobičajenog nivoa.

[0038] Zamišljeno je da određivanje da li subjekt ima ili nema neutrališuća antitela na leptin može da se koristi da se predvidi da li će subjekt odgovoriti na tretman leptinom, na primer, očekivalo bi se da subjekt sa visokim nivoima neutrališućih antitela neće odgovoriti na leptinski tretman.

PRIMERI

[0039] Primeri koji slede nisu namenjeni da na bilo koji način ograniče opseg ovog pronalaska, nego su dati da ilustruju aspekte opisanih metoda. Mnoga druga rešenja ovog pronalaska će biti očigledna stručnjaku.

Primer 1

[0040] Uzorci subjekata se mogu testirati na sledeći način da bi se odredio nivo neutrališućih antitela koje oni sadrže (videti i Sliku 4):

1. Ploče obložene streptavidinom su blokirane primenom Superblock-a 1 sat.

2. Uzorci subjekata su inaktivirani toplotom.

3. Leptin ili metreleptin, obeležen rutenijumom (Ru) sulfo-, je dodat u svaki uzorak. Uzorci pozitivne kontrole su dobijeni dodavanjem leptina ili metreleptina obeleženog rutenijumom (Ru) sulfo- i antitela muLEP13-11.03 na leptin kao pozitivne kontrole. Uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 2 sata.

4. Ploče sa streptavidinom su oprane fosfatno puferisanim slanim rastvorom (PBS). Antitelo na heksahistidin obeleženo biotinom i razblaženo u PBS je dodato na ploče i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat.

5. Ploče su oprane PBS-om i dodat im je razblažen hepta-histidinski obeležen leptinski receptorski protein i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi jedan sat.

6. Ploče su oprane PBS-om i testirani i kontrolni uzorci (iz koraka 2 gore) su dodati na ploče i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 1 sat.

7. Ploče su oprane PBS-om i pročitane na MSD ESL čitaču.

[0041] Maksimalan signal za ležišta negativne kontrole koja sadrže leptin i metreleptin, ali ne i neutrališuće antitelo, je meren. Inhibicija u procentima je izračunata oduzimanjem merenog signala od maksimalnog signala za svaki uzorak i deljenjem tog broja maksimalnim signalom. Procentna inhibicija je zatim upoređena sa graničnom vrednošću, kao što je opisano u Primeru 3.

Primer 2

[0042] Opcioni korak kiselog razdruživanja može da se izvede modifikovanjem procedure opisane u Primeru 1 kao što sledi (videti i Sliku 5):

1. Posle inaktivacije toplotom, uzorci su inkubirani u 0,8% rastvoru sirćetne kiseline na sobnoj temperaturi jedan sat, da bi se razdružila sva vezana antitela u uzorku.

2. Sulfo-obeležen leptin ili metreleptin je razblažen u 0,124 M Tham pufernom rastvoru, koji neutrališe kiseli uzorak posle dodavanja, dozvoljavajući vezivanje antitela.

[0043] Određeno je da je osetljivost testa vezivanja receptora opisanog gore bila 109 ng/mL za antitela na metreleptin i 101 ng/mL za antitela na leptin. Granica detekcije za uporedljiv ćelijski test na neutrališuće antitelo je bio 251 ng/mL.

Primer 3

[0044] Granične vrednosti su izračunate na osnovu procentne inhibicije signala leptina i metreleptina u obolelim subjektima koji su prethodno imali tretman metreleptinom i tretmana normalnih neobolelih. Granična vrednost za inhibiciju vezivanja leptina u normalnim i prethodno tretiranim obolelim subjektima je 10,18%-na inhibicija. Granična vrednost za inhibiciju vezivanja metreleptina u prethodno tretiranim obolelim subjektima je 9,66%-na inhibicija, a u normalnim subjektima je bio 7,89%-na inhibicija. Sve granične vrednosti su nameštene da daju 1% lažno pozitivnih. Podaci sa graničnim vrednostima su predstavljeni na Sl. 6.

T l 1 R zim r ni nih r n i z l in i m r l in z n rm ln i z l l k

Primer 4

[0045] Uzorci iz 17 pacijenata su testirani na inhibiciju signala leptina i metreleptina u skladu sa metodima opisanim gore. Podaci su predstavljeni na Sl.6 i u Tabeli 2-4.

[0046] Dva kontrolna monoklonska neutrališuća antitela na leptin su korišćena u koncentracijama bilo 156 ng/ml (pozitivna kontrola (niska)), bilo 5000 ng/mL (pozitivna kontrola (visoka)). Kontrolni podaci su predstavljeni na Sl. 6 i u Tabeli 3. Inhibicija pomoću oba antitela je izuzetno konzistentna, pokazujući robustnost testa.

[0047] Uzorci sa inhibicijom većom od granične vrednosti su dodeljeni pozitivnoj kategoriji, dok su oni sa inhibicijom manjom od granične vrednosti dodeljeni negativnoj kategoriji. Videti Sl.6 i Tabelu 4.

1

Tabela 2. Podaci o signalima i procentnoj inhibiciji vezivanja leptina i metreleptina iz uzoraka iz 1 i n

Tabela 3. Podaci o signalima i procentna inhibicija vezivanja leptina i metreleptina visokim i niskim dozama monoklonskih neutrališućih antitela na le tin kao ozitivne kontrole

Tabela 4. Podaci o signalima i procentna inhibicija vezivanja leptina i metreleptina i dijagnostikovana kategorija (pozitivni ili negativni na neutrališuća antitela na leptin) za uzorke iz 17 pacijenata

[0048] Kroz celu ovu specifikaciju i zahteve koji slede, ako kontekst ne zahteva drukčije, reč "obuhvatati", i varijacije kao što su "obuhvata" i "obuhvataju", će se podrazumevati da označavaju uključivanje navedenog broja ili koraka ili grupe brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog broja ili koraka ili grupe brojeva ili koraka.

[0049] Kroz celu specifikaciju, gde su opisani sastavi koji uključuju komponente ili materijale, zamišljeno je da sastavi mogu suštinski da se sastoje od ili da se sastoje od bilo koje kombinacije nabrojanih komponenata ili materijala, osim ako nije opisano drukčije. Takođe, gde opisani metodi uključuju određene korake, zamišljeno je da metodi mogu

1

suštinski da se sastoje od ili da se sastoje od bilo koje kombinacije navedenih koraka, osim ako nije opisano drukčije. Pronalazak ilustrativno opisan ovde pogodno može da se praktikuje u odsustvu bilo kog elementa ili koraka koji ovde nije specifično opisan.

[0050] Praktikovanje ovde opisanih metoda i njihovih pojedinačnih koraka se može vršiti manuelno i/ili uz pomoć ili automatiku koju pruža elektronska oprema. Iako su postupci opisani pozivajući se na konkretna rešenja, stručnjak uobičajenog nivoa lako shvata da se mogu koristiti drugi načini izvođenja radnji vezanih za metode. Na primer, redosled koraka može da se promeni a da se ne odstupi od opsega metoda, osim ako nije opisano drukčije. Pored toga, neki od pojedinačnih koraka mogu da se kombinuju, preskoče ili da se dalje podele na dodatne korake.

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Metod za detektovanje neutrališućih antitela na leptin u uzorku, koji obuhvata korake:

(a) inaktiviranje leptina prisutnog u uzorku;

(b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u uzorak;

(c) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin, gde navedeni supstrat, sposoban da veže obeležen leptin, sadrži obložen matriks i obeležen leptinski receptor vezan za obložen matriks; (d) pranje supstrata da bi se uklonio nevezan obeležen leptin i

(e) merenje signala obeleživača koji je proizveo obeleženi leptin vezan za supstrat.

2. Metod za identifikovanje subjekata koji imaju neutrališuća antitela na leptin u krvi, serumu ili plazmi subjekta, koji obuhvata korake:

(a) inaktiviranje leptina i leptina prisutnog u uzorku subjektove krvi, seruma ili plazme;

(b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u uzorak;

(c) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin, gde navedeni supstrat, sposoban da veže obeležen leptin, sadrži obložen matriks i obeležen leptinski receptor vezan za obložen matriks; (d) pranje supstrata da bi se uklonio nevezan obeležen leptin;

(e) merenje signala obeleživača koji je proizveo obeleženi leptin;

(f) merenje signala pozitivne kontrole, gde je navedeni signal pozitivne kontrole proizveden uzvršavanjem koraka (a)-(e), i još obuhvata dodavanje poznate količine antitela na leptin u koraku (b) i

(g) poređenje signala iz (e) sa signalom iz (f), gde, ako je nivo signala merenog u koraku (e) jednak ili manji od nivoa signala merenog u koraku (f), onda je subjekt pozitivan na testu za neutrališuća antitela na leptin.

3. Metod za identifikovanje subjekata koji imaju neutrališuća antitela na leptin u krvi, serumu ili plazmi subjekta, koji obuhvata korake:

(a) inaktiviranje leptina prisutnog u uzorku krvi, seruma ili plazme;

(b) dodavanje poznate količine obeleženog leptina u uzorak;

(c) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži obeležen leptin iz (b) sa supstratom sposobnim da veže obeležen leptin, gde navedeni supstrat, sposoban da veže obeležen leptin, sadrži obložen matriks i obeležen leptinski receptor vezan za obložen matriks; (d) pranje supstrata da bi se uklonio nevezan obeležen leptin;

(e) merenje signala obeleživača koji je proizveo obeleženi leptin;

(f) merenje signala negativne kontrole, gde je navedeni signal negativne kontrole proizveden izvršavanjem koraka (a) - (e), gde uzorak krvi, seruma ili plazme ne sadrži neutrališuća antitela na leptin i

(g) poređenje razlike u procentima signala iz (e) i signala iz (f) sa graničnom vrednošću gde, ako je razlika u procentima između signala iz (e) i signala iz (f) veća od granične vrednosti, onda je subjekt pozitivan na testu za neutrališuća antitela na leptin.

4. Metod iz zahteva 3, gde je granična vrednost između oko 5% i oko 40%.

5. Metod iz bilo kog od prethodnih zahteva, gde je leptin obeležen peroksidazom rena ili rutenijum tris-bipiridinom.

6. Metod iz bilo kog od prethodnih zahteva, gde je korak inaktivacije (a) izvršen grejanjem uzorka.

7. Metod iz bilo kog od zahteva 1-6, gde je obloženi matriks matriks obložen streptavidinom.

8. Metod iz zahteva 7, gde je leptinski receptor obeležen biotinom.

9. Metod iz bilo kog od zahteva 1-6, gde navedeni supstrat, sposoban da veže obeležen leptin, sadrži:

(i) obložen matriks;

(ii) antitelo vezano za matriks iz (i) i

(iii) obeležen leptinski receptor vezan za antitelo iz (ii).

10. Metod iz zahteva 9, gde je leptinski receptor obeležen heksahistidinskim obeleživačem, a antitelo je antitelo na heksahistidin.

11. Metod iz bilo kog od zahteva 9 i 10, gde je antitelo obeleženo obeleživačem pogodnim da se veže za obložen matriks.

12. Metod iz bilo kog od prethodnih zahteva, je obeležen leptin dodat u koraku (b) obeleženi metreleptin.

1