RS64870B1

RS64870B1 - Imunomodulatorni proteini varijante pd-l1 i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS64870B1
Application number: RS20231112A
Authority: RS
Inventors: Ryan Swanson; Michael Kornacker; Mark F Maurer; Dan Ardourel; Daniel William Demonte; Joseph L Kuijper
Original assignee: Alpine Immune Sciences Inc
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2023-12-29
Also published as: IL268780A; JP7701395B2; CN110831963A; KR20240039221A; PL3596116T3; JP7664022B2; IL268780B2; EP3596116A1; KR20240123406A; HUE064136T2; DK3596116T5; IL268780B1; PT3596116T; US20260062456A1; KR20190140923A; WO2018170021A1; FI3596116T3; JP2023057022A; HRP20231382T1; JP2025138715A

Description

Opis

Unakrsne reference na povezane prijave

[0001] Ova prijava ima prvenstvo u odnosu na U.S. privremenu prijavu br.62/472,554 podnetu 16. marta 2017. godine, pod nazivom „PD-L1 Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof“, U.S. privremenu prijavu br.62/475,076 podnetu 22. marta 2017. godine, pod nazivom „PD-L1 Ligand Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof“, U.S. privremenu prijavu br.62/537,923 podnetu 27. jula 2017. godine, pod nazivom „PD-L1 Ligand Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof“, i U.S. privremenu prijavu br. 62/582,249 podnetu 6. novembra 2017. godine, pod nazivom „PD-L1 Ligand Variant Immunomodulatory Proteins and Uses Thereof“.

Oblast pronalaska

[0002] Predmetno otkriće se odnosi na terapeutske kompozicije za modulaciju imunskog odgovora u lečenju kancera i imunoloških bolesti. Predmetno otkriće se odnosi na određene varijante PD-L1 koje pokazuju poboljšano vezivanje, kao što je poboljšani afinitet ili selektivnost vezivanja, za PD-1.

Osnova pronalaska

[0003] Postoji sve veći medicinski interes za modulaciju imunskog odgovora putem intervencije u procesima koji se odvijaju u imunološkoj sinapsi (immunological synapse, IS) nastaloj od strane i između antigen prezentujućih ćelija (antigen-presenting cell, APC) ili ciljnih ćelija i limfocita. Mehanički, proteini ćelijske površine u IS mogu da obuhvataju koordiniranu i često istovremenu interakciju više proteinskih ciljeva sa jednim proteinom za koji se vezuju. IS interakcija se odvija u neposrednoj vezi sa spojem dve ćelije, i jedan protein u ovoj strukturi može da interaguje sa proteinom na istoj ćeliji (cis), kao i sa proteinom na povezanoj ćeliji (trans), verovatno istovremeno. Iako su poznata terapeutska sredstva koja mogu da moduliraju IS, potrebna su poboljšana terapeutska sredstva.

Obezbeđeni su imunomodulatorni proteini, uključujući rastvorljive proteine ili transmembranske imunomodulatorne proteine koji mogu da se eksprimiraju na ćelijama, koji ispunjavaju te zahteve.

[0004] WO 2017/029389 otkriva nekoliko varijanti mišjeg i humanog PD-L1 koji sadrži domen IgV i/ili IgC i njegove fragmente. Wang et al (J. Exp. Med. (2003) 197, str.1083-1091) takođe otkriva varijante mišjeg PD-L1. Kerstin et al (Nature (2011) 478, str.476 - 482) i Wade et al (Science (2009) 326, str.865-867) otkrivaju sekvencu zečjih i konjskih ortologa PD-L1, koji imaju supstituciju N45Q, odnosno N45K. Terawaki et al (Immunology (2007) 19, str.881 - 890) razmatraju specifično i visoko afinitetno vezivanje ekstracelularnog domena PD-L1 za ćelije koje eksprimiraju PD-1. Srinivasan et al (Current protein and peptide science (2005) 6, str.1 - 12) otkrivaju da je Ig domen veoma očuvan u ćelijskim površinskim proteinima usled sposobnosti da se opire proteolizi. Omid et al (Methods (2014) 65, str.114 -126) opisuju da konstruisana Fc varijanta Ig eliminiše sve efektorske funkcije putem strukturnih odstupanja. Maya et al (MABS (2013) 5, str.896-903 proučavaju dejstvo izmenjenog vezivanja FcyR na farmakokinetiku antitela kod majmuna cinomolgusa. Danny et al (Nature Rev. Clin. Onc. (2016) 13, str.273-290) ispitivali su budućnost lečenja kancera putem imunomodulacije, CAR i kombinovane terapije. WO 2016/168771 opisuje imunomodulatorne proteine koji sadrže najmanje jedan IgSF domen bez modifikovanog afiniteta prema imunoglobulinu koji ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u domenu IgSF divljeg tipa. WO 2018/022945 i WO 2018/022946 otkrivaju varijante polipeptida PD-L1 koje uključuju supstitucije D43G, I20L, I36T, N45D i Fc fuzije.

Sažetak

[0005] Ovde je obezbeđena varijanta polipeptida PD-L1, u skladu sa zahtevom 1.

[0006] Nemodifikovani PD-L1 je humani PD-L1 ili njegov specifični vezujući fragment. U nekim takvim otelotvorenjima, nemodifikovani PD-L1 sadrži (i) sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO:30 ili 1728, (ii) sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:30 ili 1728; ili (iii) njen deo koji sadrži domen IgV ili domen IgC ili specifične vezujuće fragmente jednog ili oba od njih.

[0007] U nekim takvim otelotvorenjima, specifični vezujući fragment domena IgV ili domena IgC ima dužinu najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ili više aminokiselina; ili specifični vezujući fragment domena IgV ima dužinu koja je najmanje 80% dužine domena IgV datog kao aminokiseline 24-130 SEQ ID NO:3 i/ili specifični vezujući fragment domena IgC ima dužinu koja je najmanje 80% dužine domena IgC datog kao aminokiseline 133-225 SEQ ID NO:3. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 sadrži do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselinskih modifikacija, opciono aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:30, 1728, ili njenim specifičnim vezujućim fragmentom.

[0008] U skladu sa pronalaskom, varijanta polipeptida PD-L1 pokazuje povećan vezujući afinitet prema ektodomenu PD-1 u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog PD-L1 za ektodomen PD-1. U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 polipeptida pokazuje izmenjeno vezivanje za ektodomen CD80 u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog PD-L1 za ektodomen CD80. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1a pokazuje izmenjeno vezivanje za ektodomen PD-1 u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1. U nekim otelotvorenjima, izmenjeno vezivanje je izmenjeni afinitet vezivanja i/ili izmenjena selektivnost vezivanja.

[0009] U nekim takvim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je izabrana od I20L/N45D, I36T/N45D, D43G/N45D, N45D/V58A, N45D/S75P, N45D/N78I, I20L/I36T/N45D, D43G/N45D/V58A, I20L/E27G/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/A33D/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/D43G/N45D/N78I, V11A/I20L/E27G/D43G/N45D/HS1Y/S99G, I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R, I20L/I36T/N45D, A33D/D43G/N45D/V58A/S75P, K23R/D43G/N45D, D43G/N45D/L56Q/V58A/G101G-ins (G101GG), I20L/K23E/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/K23E/D43G/N45D/VSOA/N78I, I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R/G101G-ins (G101GG), N45D, N45D/K144E, N45D/P198S, N45D/P198T, N45D/R195G, N45D/R195S, N45D/S131F, N45D/V58D, N45D/I148V/R195G, N45D/K111T/R195G, N45D/N113Y/R195S, N45D/N165Y/E170G, N45D/Q89R/I98V, N45D/S131F/P198S, N45D/S75P/P198S, N45D/V50A/R195T, E27D/N45D/T183A/I188V, K23N/N45D/S75P/N120S, N45D/I148V/R195G/N201D, N45D/K111T/T183A/I188V, N45D/Q89R/F189S/P198S, N45D/T163I/K167R/R195G, N45D/V50A/I119T/K144E, T19A/N45D/K144E/R195G, V11E/N45D/T130A/P198T, V26A/N45D/T163I/T185A, K23NIN45D/L 124S/K 167T/R195G, K23N/N45D/Q73R/T163I, K28R/N45D/K57E/I98V/R195S, K28R/N45D/V129D/T163N/R195T, M41K/D43G/N45D/R64S/R195G, M41K/D43G/N45D/R64S/S99G, N45D/R68L/F173L/D197G/P198S, N45D/V50A/I148V/R195G/N201D, M41K/D43G/K44E/N45D/R195G/N201D, N45D/VSOA/L124S/K144E/L179P/R195G.

[0010] U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži varijantu PD-L1 polipeptida koji sadrži ili se sastoji od ekstracelularnog domena (ECD) PD-L1; i/ili varijanta PD-L1 polipeptida sadrži ili se sastoji od domena IgV ili domena IgC. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 uključuje sekvencu aminokiselina datu u bilo kom od SEQ ID NOS: 66, 82, 101-104, 107, 109-110, 112-113, 115-117, 131, 147, 166-169, 172, 174-175, 177-178, 180-182, 254, 270, 289-292, 295, 297-298, 300-301, 303-305, 1725-1727, 1774-1780, 1785-1793, 1795, 1798-1800, 1802, 1804-1809, 1811-1818, 1863-1869, 1874-1882, 1884, 1887-1889, 1891, 1893-1898, 1900-1907, 1920-1922, 1935-1937, 1953, 1969, 1988-1991, 1994, 1996-1997, 1999-2000, 2002-2004, 2008ili njen specifični vezujući fragment, ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 95% identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 66, 82, 101-104, 107, 109-110, 112-113, 115-117, 131, 147, 166-169, 172, 174-175, 177-178, 180-182, 254, 270, 289-292, 295, 297-298, 300-301, 303-305, 1725-1727, 1774-1780, 1785-1793, 1795, 1798-1800, 1802, 1804-1809, 1811-1818, 1863-1869, 1874-1882, 1884, 1887-1889, 1891, 1893-1898, 1900-1907, 1920-1922, 1935-1937, 1953, 1969, 1988-1991, 1994, 1996-1997, 1999-2000, 2002-2004, 2008 ili njen specifični vezujući fragment, i koja ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija.

[0011] U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV. U nekim takvim otelotvorenjima, domen IgV ili njegov specifični vezujući fragment je jedini deo PD-L1 varijante polipeptida PD-L1. U nekim takvim otelotvorenjima, IgC domen je jedini deo PD-L1 varijante polipeptida PD-L1.

[0012] U skladu sa pronalaskom, varijanta polipeptida PD-L1 specifično se vezuje za ektodomen PD-1 sa povećanim afinitetom u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog PD-L1 za isti ektodomen PD-1. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 specifično se vezuje za ektodomen PD-1 i ektodomen CD80, oba sa povećanim afinitetom u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog PD-L1 za iste ektodomene. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 specifično se vezuje za ektodomen PD-1 sa povećanim afinitetom i specifično se vezuje za ektodomen CD80 sa smanjenim afinitetom u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog PD-L1 za iste ektodomene.

[0013] U nekim takvim otelotvorenjima, povećani afinitet prema ektodomenu PD-1 je povećan više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta ili 60 puta u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1. U nekim aspektima, povećani afinitet prema ektodomenu CD80 je povećan više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta ili 60 puta u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1. U nekim slučajevima, smanjeni afinitet prema ektodomenu CD80 je smanjen više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta ili 60 puta u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1.

[0014] U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida se specifično vezuje za ektodomen PD-1 sa povećanom selektivnošću u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1. U nekim slučajevima, povećana selektivnost obuhvata veći odnos vezivanja varijante polipeptida za PD-1 u odnosu na CD80 u poređenju sa odnosom vezivanja nemodifikovanog polipeptida PD-L1 za iste ektodomene PD-1 u odnosu na CD80. U nekim primerima, odnos je veći za najmanje ili najmanje oko 1,5 puta, 2,0 puta, 3,0 puta, 4,0 puta, 5 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta ili više.

[0015] U nekim takvim otelotvorenjima, CD80 je humani CD80.

[0016] U nekim takvim otelotvorenjima, vezujuća aktivnost je izmenjena (povećana ili smanjena) više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1.

[0017] U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je rastvorljivi protein. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 nema transmembranski domen PD-L1 i domen intracelularne signalizacije; i/ili varijanta polipeptida PD-L1 ne može da se eksprimira na ćelijskoj površini. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 povezana je sa domenom multimerizacije. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta PDL1 polipeptida je multimerni polipeptid, opciono dimerni polipeptid, koji sadrži prvu varijantu polipeptida PD-L1 povezanu sa domenom multimerizacije i drugu varijantu polipeptida PD-L1 povezanu sa domenom multimerizacije. U nekim otelotvorenjima, prva varijanta polipeptida PD-L1 i druga varijanta polipeptida PD-L1 su iste ili različite.

[0018] U nekim takvim otelotvorenjima, domen multimerizacije je Fc domen ili njegova varijanta sa smanjenom efektorskom funkcijom. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je povezana sa ostatkom koji povećava biološki poluživot polipeptida. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je povezana sa Fc domenom ili njegovom varijantom sa smanjenom efektorskom funkcijom.

[0019] U nekim takvim otelotvorenjima, Fc domen je domen sisara, opciono čoveka; ili varijanta Fc domena sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u poređenju sa nemodifikovanim Fc domenom sisara, opciono čoveka. U nekim takvim otelotvorenjima, Fc domen ili njegova varijanta sadrži sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 187 ili SEQ ID NO: 188 ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 187 ili SEQ ID NO: 188. U nekim otelotvorenjima, Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija izabranih od E233P, L234A, L234V, L235A, L235E, G236del, G237A, S267K, N297G, R292C, V302C i K447del, svaka na osnovu EU numeracije. U nekim otelotvorenjima, Fc domen sadrži aminokiselinsku modifikaciju C220S na osnovu EU numeracije. U nekim takvim otelotvorenjima, Fc domen sadrži sekvencu aminokiselina datu u bilo kom od SEQ ID NO: 1155, 1157, 1158, 1159, 1715, 1938, 1939 i 1940 ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85% identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO:1155, 1157, 1158, 1159, 1715, 1938, 1939 i 1940 i pokazuje smanjenu efektorsku funkciju.

[0020] U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je vezana posredno preko linkera, opciono G4S linkera. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je transmembranski imunomodulatorni protein koji dalje sadrži transmembranski domen povezan sa ektracelularnim domenom (ECD), ili njegovim specifičnim vezujućim fragmentom, varijante polipeptida PD-L1.

[0021] U nekim takvim otelotvorenjima, transmembranski domen sadrži sekvencu aminokiselina koja je data kao ostaci 239-259 SEQ ID NO:3 ili njenu funkcionalnu varijantu koja pokazuje najmanje 85% identičnosti sekvence sa ostacima 239-259 SEQ ID NO:3. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži citoplazmatski signalni domen povezan sa transmembranskim domenom. U nekim slučajevima, citoplazmatski signalni domen sadrži sekvencu aminokiselina koja je data kao ostaci 260-290 SEQ ID NO:3 ili njenu funkcionalnu varijantu koja pokazuje najmanje 85% identičnosti sekvence sa ostacima 260-290 SEQ ID NO:3.

[0022] U nekim od ovde obezbeđenih otelotvorenja, varijanta PD-L1 polipeptida modulira odgovor imunske ćelije, kao što je T ćelija. U nekim otelotvorenjima, odgovor, npr. T ćelijski odgovor, povećan je ili smanjen. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 povećava ekspresiju IFN-gama (interferon-gama) u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1 u in vitro T-ćelijskom testu. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 smanjuje ekspresiju IFN-gama (interferon-gama) u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1 u in vitro T-ćelijskom testu.

[0023] U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 polipeptida je deglikozilovana.

[0024] U nekim otelotvorenjima bilo koje varijante polipeptida PD-L1 koja je ovde opisana, varijanta polipeptida PD-L1 povećava T-ćelijsku signalizaciju u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1, kao što je utvrđeno koristeći reporterski test koji uključuje T-ćeliju (npr. Jurkatovu) konstruisanu sa reporterom (npr. luciferaza) koji je operativno povezan sa promoterom IL-2. U nekim otelotvorenjima bilo koje varijante polipeptida PD-L1 koja je ovde opisana, varijanta polipeptida PD-L1 smanjuje T-ćelijsku signalizaciju u poređenju sa nemodifikovanim PD-L1, kao što je utvrđeno koristeći reporterski test koji uključuje T-ćeliju (npr. Jurkatovu) konstruisanu sa reporterom (npr. luciferaza) koji je operativno povezan sa promoterom IL-2. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je obezbeđena u bilo kom od brojnih formata, kao što je rastvorljiv ili imobilisan (npr. vezan za ploču).

[0025] Takođe je obezbeđen imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 u skladu sa bilo kojim od obezbeđenih otelotvorenja, neposredno ili posredno vezan preko linkera sa drugim polipeptidom koji sadrži domen superfamilije imunoglobulina (IgSF). U nekim slučajevima, afinitet domena IgSF je modifikovan i pokazuje izmenjeno vezivanje za jedan ili više njegovih srodnih vezujućih partnera u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom domena IgSF za isti pojedinačni ili za više srodnih vezujućih partnera. U nekim otelotvorenjima, afinitetno modifikovani domen IgSF sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u poređenju sa nemodifikovanim ili domenom IgSF divljeg tipa člana familije IgSF. U nekim slučajevima, domen IgSF pokazuje povećano vezivanje za jedan ili više srodnih vezujućih partnera u poređenju sa nemodifikovanim ili domenom IgSF divljeg tipa člana familije IgSF za isti pojedinačni ili za više srodnih vezujućih partnera. U nekim primerima, afinitet domena IgSF je modifikovan i pokazuje izmenjeno vezivanje za jedan ili više srodnih vezujućih partnera u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog ili domena IgSF divljeg tipa člana familije IgSF za isti pojedinačni ili više srodnih vezujućih partnera. U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 je prva varijanta PD-L1 i domen IgSF drugog polipeptida je domen IgSF iz druge varijante PD-L1, pri čemu su prva i druga varijanta PD-L1 iste ili različite.

[0026] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 može specifično da se vezuje za PD-1 i domen IgSF drugog polipeptida može da se vezuje za srodnog vezujućeg partnera koji nije onaj koji varijanta polipeptida PD-L1 specifično vezuje. U nekim otelotvorenjima, domen IgSF je član familije B7. U nekim slučajevima, domen IgSF je ostatak koji lokalizuje tumor koji se vezuje za ligand eksprimiran na tumoru ili inflamatorno lokalizujući ostatak koji se vezuje za ćeliju ili tkivo povezano sa inflamatornim okruženjem. U nekim otelotvorenjima, domen IgSF je ostatak koji lokalizuje tumor koji se vezuje za ligand eksprimiran na tumoru. U nekim slučajevima, ligand je B7H6. U nekim otelotvorenjima, domen IgSF je iz NKp30.

[0027] U nekim otelotvorenjima, domen IgSF ili njegov afinitetno modifikovani domen IgSF, opciono iz drugog ili trećeg polipeptida, predstavlja ili sadrži domen IgV. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je domen IgV, ili ga sadrži. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži domen multimerizacije vezan sa jednom ili obe varijante polipeptida PD-L1 domena IgSF. U nekim slučajevima, domen multimerizacije je Fc domen ili njegova varijanta sa smanjenom efektorskom funkcijom. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein je dimeran. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein je homodimeran. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein je heterodimeran.

[0028] U nekim takvim otelotvorenjima, domen IgSF drugog polipeptida je domen IgSF liganda koje se vezuje za inhibitorni receptor, ili je njegov afinitetno modifikovan domen IgSF. U nekim slučajevima, afinitetno modifikovan domen IgSF pokazuje povećan afinitet vezivanja i/ili selektivnost vezivanja za inhibitorni receptor u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog domena IgSF za isti inhibitorni receptor. U nekim otelotvorenjima, inhibitorni receptor je TIGIT, PD-1 ili CTLA-4; ili je ligand inhibitornog receptora PD-L2, CD155, CD112 ili CD80.

[0029] U nekim takvim otelotvorenjima, domen IgSF drugog polipeptida je afinitetno modifikovan domen IgSF koji sadrži: (i) divlji tip CD155 koji sadrži IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 47, 310, ili 353, ili varijanta polipeptida CD155 koja sadrži domen IgSF iz bilo kog od SEQ ID NO datih u tabeli 5, opciono bilo kog od SEQ ID NO: 311-352, 354-665, 1505-1576, 1551-1714; (ii) divlji tip CD112 koji sadrži domen IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 48, 666, ili 761, ili varijanta polipeptida CD112 koja sadrži domen IgSF iz bilo kog od SEQ ID NO datih u tabeli 4, opciono bilo kog od SEQ ID NO: 667-760, 762-931, 1433-1504; (iii) divlji tip CD80 koji sadrži domen IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 28, 1005, ili 2030, ili varijanta polipeptida CD80 koja sadrži IgSF iz bilo kog od SEQ ID NO datih u tabeli 3, opciono bilo kog od SEQ ID NO: 932-964, 966-1038, 1040-1078, 1080-1112, 1114-1152; (iv) divlji tip PD-L2 koji sadrži domen IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 31, 1203, ili 1263, ili varijanta polipeptida PD-L2 koja sadrži domen IgSF iz bilo kog od SEQ ID NO datih u tabeli 3, opciono bilo kog od SEQ ID NO: 1204-1254, 1256-1331, 1333-1407, 1409-1432; (v) sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 95% identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO u (i)-(iv) i koja sadrži aminokiselinsku supstituciju; ili (vi) specifični vezujući fragment bilo čega od (i)-(v).

[0030] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein dalje sadrži treći polipeptid koji sadrži domen IgSF člana familije IgSF ili njegov afinitetno modifikovani domen IgSF, pri čemu pomenuti afinitetno modifikovani domen IgSF sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u poređenju sa nemodifikovanim ili domenom IgSF divljeg tipa člana familije IgSF. U nekim slučajevima, treći polipeptid je isti kao prvi i/ili drugi polieptid, ili se treći polipeptid razlikuje od prvog i/ili drugog polipeptida. U nekim primerima, treći polipeptid je izabran od (i) CD155 divljeg tipa koji sadrži IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 47, 310, ili 353, ili varijante polipeptida CD155 koja sadrži domen IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO:311-352, 354-665, 1505-1576, 1551-1714; (ii) CD112 divljeg tipa koji sadrži domen IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 48, 666, ili 761, ili varijante polipeptida CD112 koja sadrži IgSF domen dat u bilo kom od SEQ ID NO: 667-760, 762-931, 1433-1504; (iii) divlji

1

tip CD80 koji sadrži domen IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 28, 1005, ili 2030, ili varijante polipeptida CD80 koja sadrži IgSF domen dat u bilo kom od SEQ ID NO: 932-964, 966-1038, 1040-1078, 1080-1112, 1114-1152; (iv) divlji tip PD-L2 koji sadrži domen IgSF dat u bilo kom od SEQ ID NO: 31, 1203, ili 1263, ili varijante polipeptida PD-L2 koja sadrži IgSF domen dat u bilo kom od SEQ ID NO: 1204-1254, 1256-1331, 1333-1407, 1409-1432; (v) sekvence aminokiselina koja pokazuje najmanje 95% identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO u (i)-(iv) i koja sadrži aminokiselinsku supstituciju; ili (vi) specifični vezujući fragment bilo čega od (i)-(v). U nekim slučajevima, domen IgSF ili njegov afinitetno modifikovani domen IgSF, opciono iz drugog ili trećeg polipeptida, predstavlja ili sadrži domen IgV. U nekim slučajevima, IgSF domen ili njegov afinitetno modifikovani IgSF domen, opciono iz drugog ili trećeg polipeptida, varijanta je PD-L2 polipeptida koja je IgV domen ili ga sadrži.

[0031] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein dalje sadrži najmanje jedan dodatni polipeptid koji sadrži domen IgSF člana familije IgSF ili njegov afinitetno modifikovani domen IgSF, pri čemu pomenuti afinitetno modifikovani domen IgSF sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom domena IgSF člana familije IgSF. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein dalje sadrži domen multimerizacije vezan za najmanje jednu varijantu polipeptida PD-L1, ili drugi polipeptid. U nekim aspektima, imunomodulatorni protein dalje sadrži domen multimerizacije vezan sa najmanje jednom varijantom polipeptida PD-L1, drugi polipeptid i/ili treći polipeptid. U nekim slučajevima, domen multimerizacije je Fc domen ili njegova varijanta sa smanjenom efektorskom funkcijom. U nekim otelotvorenjima, domen multimerizacije promoviše nastanak heterodimera.

[0032] Obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži prvu varijantu polipeptida PD-L1 u kojoj je domen multimerizacije prvi domen multimerizacije i drugu varijantu polipeptida PD-L1 u kojoj je domen multimerizacije drugi domen multimerizacije, pri čemu prvi i drugi domen multimerizacije interaguju da grade multimer koji sadrži prvu i drugu varijantu polipeptida PD-L1, opciono pri čemu su prva i druga varijanta polipeptida PD-L1 iste. U nekim slučajevima, domen multimerizacije je prvi domen multimerizacije i interaguje sa drugim domenom multimerizacije da gradi multimer koji sadrži imunomodulatorni protein. U nekim primerima, imunomodulatorni protein je prvi imunomodulatorni protein i drugi imunomodulatorni protein je vezan neposredno ili posredno preko linkera za drugi domen multimerizacije, pri čemu multimer sadrži prvi i drugi imunomodulatorni protein. U nekim otelotvorenjima, drugi imunomodulatorni protein je bilo koji od opisanih imunomodulatornih proteina, i domen multimerizacije je drugi domen multimerizacije. U nekim slučajevima, multimer je dimer. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid je varijanta polipeptida CD155 i prvi i/ili drugi imunomodulatorni protein sadrži sekvencu datu u bilo kom od SEQ ID NO: 1716-1721, ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1716-1721; ili je drugi polipeptid CD112 ili CD155, i treći polipeptid je preostalo od CD112 ili CD155 i prvi i/ili drugi imunomodulatorni protein sadrže sekvencu datu u bilo kom od SEQ ID NO: 1722-1724, ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1716-1721.

[0033] U nekim slučajevima, imunomodulatorni protein je homodimer. U nekim aspektima, imunomodulatorni protein je heterodimer, opciono pri čemu su prvi i drugi domen multimerizacije različiti i/ili mogu da interaguju da posreduju u nastanku heterodimera.

U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi domen multimerizacije je Fc domen ili njegova varijanta sa smanjenom efektorskom funkcijom, opciono pri čemu, Fc domen je protein imunoglobulina koji je humani i/ili je Fc region humani, opciono pri čemu Fc region pripada imunoglobulinu G1 (IgG1) ili imunoglobulinu G2 (IgG2), opciono dat u SEQ ID NO: 187 ili SEQ ID NO: 188, opciono pri čemu Fc region pokazuje jednu ili više efektorskih funkcija; ili varijanta Fc domena sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu divljeg tipa, opciono pri čemu, smanjena efektorska funkcija je smanjena u odnosu na Fc region divljeg tipa, opciono pri čemu je humani Fc divljeg tipa iz humanog IgG1. U nekim slučajevima, prvi i drugi domen multimerizacije su isti ili različiti.

[0034] U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona sadrži aminokiselinske supstitucije E233P, L234A, L234V, L235A, L235E, G236del, G237A, S267K, ili N297G, uz numeraciju ostataka u skladu sa Kabatovim EU indeksom; ili aminokiselinske supstitucije R292C/N297G/V302C ili L234A/L235E/G237A, uz numeraciju ostataka u skladu sa Kabatovim EU indeksom. U nekim primerima, Fc region ili varijanta Fc regiona sadrži aminokiselinsku supstituciju C220S, uz numeraciju ostataka u skladu sa Kabatovim EU indeksom. U nekim slučajevima, Fc region ili varijanta Fc regiona sadrži K447del, uz numeraciju ostataka u skladu sa Kabatovim EU indeksom.

[0035] Takođe je obezbeđen konjugat koji sadrži varijantu PD-L1 u skladu sa bilo kojim od obezbeđenih otelotvorenja, ili imunomodulatorni protein u skladu sa bilo kojim od obezbeđenih otelotvorenja vezan za ostatak. U nekim slučajevima, ostatak je ciljajući ostatak koji se specifično vezuje za molekul na površini ćelije. U nekim aspektima, ciljajući ostatak se specifično vezuje za molekul na površini imunske ćelije.

[0036] U nekim otelotvorenjima, imunska ćelija je antigen prezentujuća ćelija ili limfocit. U nekim slučajevima, ciljajući ostatak je ostatak koji lokalizuje tumor koji se vezuje za molekul na površini tumora. U nekim primerima, ostatak je protein, peptid, nukleinska kiselina, mali molekul ili nanočestica. U nekim otelotvorenjima, ostatak je antitelo ili antigen vezujući fragment. U nekim takvim otelotvorenjima, konjugat je dvovalentan, četvorovalentan, šestovalentan ili osmovalentan. U nekim aspektima, konjugat je fuzioni protein

[0037] Takođe je obezbeđen molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptida PD-L1 u skladu sa bilo kojim od obezbeđenih otelotvorenja, ili imunomodulatorni polipeptid ili konjugat koji je fuzioni protein u skladu sa bilo kojim od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline je sintetička nukleinska kiselina. U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline je kDNK.

[0038] Takođe je obezbeđen vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim slučajevima, vektor je ekspresioni vektor. U nekim aspektima, vektor je ekspresioni vektor sisara ili virusni vektor.

[0039] Takođe je obezbeđena ćelija koja sadrži vektor prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim slučajevima, ćelija je ćelija sisara. U nekim aspektima, ćelija je humana ćelija.

[0040] Takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina, koji obuhvata uvođenje molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja ili vektor prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja u ćeliju domaćina u uslovima za ekspresiju proteina u ćeliji. U nekim

1

slučajevima, postupak dalje obuhvata izolovanje ili prečišćavanje varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina iz ćelije. Takođe je obezbeđen postupak za konstruisanje ćelije koja eksprimira varijantu polipeptida PD-L1 koji obuhvata uvođenje molekula nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptida PD-L1 prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja u ćeliju domaćina u uslovima u kojima se polipeptid eksprimira u ćeliji.

[0041] Takođe je obezbeđena konstruisana ćelija koja eksprimira varijantu polipeptida PD-L1 prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, imunomodulatorni protein prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, konjugat koji je fuzioni protein prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja ili vektor prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim slučajevima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni protein sadrži signalni peptid. U nekim slučajevima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni protein kodiran je nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu nukleotida koja kodira signalni peptid. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni protein ne sadrži transmembranski domen i/ili se ne eksprimira na površini ćelije.

[0042] U nekim otelotvorenjima konstruisane ćelije, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni protein izlučuju se ili mogu da se izlučuju iz konstruisane ćelije. U nekim otelotvorenjima, konstruisana ćelija sadrži varijantu polipeptida PD-L1 koja sadrži transmembranski domen i/ili je transmembranski imunomodulatorni protein prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 eksprimirana je na površini ćelije.

[0043] U nekim otelotvorenjima konstruisane ćelije, ćelija je imunska ćelija. U nekim slučajevima, imunska ćelija je antigen prezentujuća ćelija (APC) ili limfocit. U nekim otelotvorenjima, ćelija je primarna ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija je ćelija sisara. U nekim otelotvorenjima, ćelija je humana ćelija. U nekim otelotvorenjima, limfocit je T ćelija. U nekim otelotvorenjima, APC je veštačka APC. U nekim primerima, ćelija je limfocit, a limfocit je T ćelija. U nekim aspektima, ćelija je APC, a APC je veštačka APC. U nekim takvim otelotvorenjima, konstruisana ćelija dalje sadrži himerni antigenski receptor (CAR) ili konstruisani T-ćelijski receptor.

[0044] Takođe je obezbeđen infektivni agens, koji sadrži molekul nukleinske kiseline koja kodira varijantu polipeptida PD-L1 prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, konjugat koji je fuzioni protein iz bilo kog od obezbeđenih otelotvorenja ili imunomodulatorni polipeptid prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim slučajevima, kodirana varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni polipeptid ne sadrži transmembranski domen i/ili se ne eksprimira na površini ćelije u kojoj se eksprimira. U nekim otelotvorenjima, kodirana varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni polipeptid izlučuje se ili može da se izlučuje iz ćelije u kojoj se eksprimira. U nekim slučajevima, kodirana varijanta polipeptida PD-L1 sadrži transmembranski domen. U nekim otelotvorenjima, kodirana varijanta polipeptida PD-L1 je eksprimirana na površini ćelije u kojoj se eksprimira.

[0045] U nekim takvim otelotvorenjima, infektivni agens je bakterija ili virus. U nekim otelotvorenjima, virus je lentivirusni ili retrovirusni konstrukt ili njihov hibrid. U nekim aspektima, virus je onkolitički virus. U nekim primerima, onkolitički virus je adenovirus, adenoasocirani virus, virus herpesa, virus herpes simpleksa, virus vezikularnog stomatitisa, reovirus, virus Njukasl bolesti, parvovirus, virus malih boginja, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), Koksaki virus ili vakcinija virus. U nekim slučajevima, virus specifično cilja dendritske ćelije (DC) i/ili je selektivan za dendritske ćelije. U nekim primerima, virus je lentivirusni vektor koji je pseudotipovan sa modifikovanim proizvodom omotača Sindbis virusa. U nekim takvim otelotvorenjima, infektivni agens dalje sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira dalji genski proizvod koji dovodi do smrti ciljne ćelije ili koji može da osnaži ili pojača imunološki odgovor. U nekim primerima, dalji genski proizvod je izabran od antikancerskog agensa, antimetastatskog agensa, antiangiogenog agensa, imunomodulatornog molekula, inhibitora imunske kontrolne tačke, antitela, citokina, faktora rasta, antigena, citotoksičnog genskog proizvoda, proapoptotskog genskog proizvoda, antiapoptotskog genskog proizvoda, gena za razgradnju ćelijske matrice, gena za regeneraciju tkiva ili reprogramiranje humane somatske ćelije na pluripotentnost.

[0046] Takođe je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži varijantu polipeptida PD-L1 prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, imunomodulatorni protein prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, konjugat prema bilo kom od otelotvorenja, konstruisanu ćeliju prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja ili infektivni agens prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija sadrži

1

farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je sterilna.

[0047] Takođe je obezbeđen proizvod koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja u bočici. U nekim slučajevima, bočica je zaptivena.

[0048] Takođe je obezbeđen komplet koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja i uputstvo za upotrebu. Takođe je obezbeđen komplet koji sadrži proizvod prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja i uputstvo za upotrebu.

[0049] Takođe je obezbeđena farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku za modulaciju imunskog odgovora kod ispitanika, kao što je povećanje ili smanjenje imunskog odgovora, koji obuhvata primenu farmaceutske kompozicije prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja na ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, postupak za modulaciju imunskog odgovora kod ispitanika obuhvata primenu konstruisanih ćelija prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja na ispitaniku. U nekim slučajevima, konstruisane ćelije su autologne za ispitanika. U nekim slučajevima, konstruisane ćelije su alogene za ispitanika. U nekim otelotvorenjima, postupak koji modulira imunski odgovor leči bolest ili stanje kod ispitanika. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu na ispitaniku rastvorljive varijante polipeptida PD-L1 prema bilo kom od ovde opisanih otelotvorenja, imunomodulatornog proteina prema bilo kom od ovde opisanih otelotvorenja ili konjugata prema bilo kom od ovde opisanih otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata primenu na ispitaniku infektivnog agensa koji kodira varijantu polipeptida PD-L1 prema bilo kom od ovde opisanih otelotvorenja.

[0050] U nekim takvim otelotvorenjima, imunski odgovor je povećan. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni protein koji je rastvorljiv. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni protein je Fc fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni protein koji je rastvorljiv, opciono koji nema transmembranski domen i domen intracelularne signalizacije PD-L1. U nekim slučajevima, rastvorljivi imunomodulatorni protein je imunomodulatorni Fc fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje varijanta polipeptida PD-L1 prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, imunomodulatorni protein prema bilo

1

kom od obezbeđenih otelotvorenja, ili konjugat prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje konstruisana ćelija koja sadrži varijantu polipeptida PD-L1 koja može da se izlučuje. U nekim takvim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje konstruisana ćelija prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim aspektima, na ispitaniku se primenjuje infektivni agens koji kodira varijantu polipeptida PD-L1 koji je sekretabilni imunomodulatorni protein, opciono u uslovima u kojima infektivni agens inficira tumorsku ćeliju ili imunsku ćeliju i sekretabilni imunomodulatorni protein se izlučuje iz inficirane ćelije.

[0051] U nekom otelotvorenju, bolest ili stanje je tumor ili kancer. U nekim primerima, bolest ili stanje je izabrano od melanoma, kancera pluća, kancera mokraćne bešike, hematološkog maligniteta, kancera jetre, kancera mozga, renalnog kancera, kancera dojke, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera slezine, kancera prostate, kancera testisa, kancera jajnika, kancera materice, karcinoma želuca, muskuloskeletnog kancera, kancera glave i vrata, gastrointestinalnog kancera, kancera germinativnih ćelija ili endokrinog i neuroendokrinog kancera.

[0052] U nekim takvim otelotvorenjima, imunski odgovor je smanjen. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje imunomodulatorni protein ili konjugat koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 povezanu sa domenom IgSF ili ostatkom koji se lokalizuje na ćeliju ili tkivo inflamatornog okruženja. U nekim slučajevima, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ili sadrži IgSF domen divljeg tipa ili njegovu varijantu. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje imunomodulatorni protein prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja, ili konjugat prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja.

[0053] U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje varijanta polipeptida PD-L1 koja je transmembranski imunomodulatorni protein. U nekim otelotvorenjima, na ispitaniku se primenjuje konstruisana ćelija koja sadrži varijantu polipeptida PD-L1 koji je transmembranski imunomodulatorni protein prema bilo kom od obezbeđenih otelotvorenja. U nekim slučajevima, na ispitaniku se primenjuje infektivni agens koji kodira varijantu polipeptida PD-L1 koji je transmembranski imunomodulatorni protein, opciono u uslovima u kojima infektivni agens inficira tumorsku ćeliju ili imunsku ćeliju i transmembranski imunomodulatorni protein se eksprimira na površini inficirane ćelije.

1

U nekim otelotvorenjima, bolest ili stanje je inflamatorna ili autoimuna bolest ili stanje. U nekim takvim otelotvorenjima, bolest ili stanje je vaskulitis povezan sa antitelima na antigene citoplazme neutrofilnih leukocita (ANCA), vaskulitis, autoimuna bolest kože, transplantacija, reumatska bolest, inflamartorna gastrointestinalna bolest, inflamatorna bolest oka, inflamatorna neurološka bolest, inflamatorna bolest pluća, inflamatorna endokrina bolest, ili autoimuna hematološka bolest. U nekim primerima, bolest ili stanje je izabrano od inflamatorne bolesti creva, transplantata, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, multiple skleroze, astme, reumatoidnog artritisa ili psorijaze. U nekim takvim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 se primenjuje u obliku koji smanjuje imunski odgovor kod ispitanika.

Kratak opis slika (otelotvorenja koja ne spadaju u navedeni opseg priloženih zahteva data su kao opšte reference)

[0054]

SL. 1A-1C prikazuje različite oblike obezbeđenih varijanti molekula domena IgSF. SL.1A prikazuje rastvorljive molekule, uključujući: (1) varijantu domena IgSF (vIgD) fuzionisanu sa Fc lancem; (2) naslagani molekul koji sadrži prvu varijantu domena IgSF (prvi vIgD) i drugi domen IgSF kao što je druga varijanta domena IgSF (drugi vIgD); (3) molekul IgSF koji cilja tumor koji sadrži prvu varijantu domena IgSF (vIgD) i domen IgSF koji cilja antigen tumora, kao što je NKp30 domen IgSF; i (4) varijantu domena IgSF (vIgD) povezanu sa antitelom (V-mAb). SL. 1B prikazuje transmembranski imunomodulatorni protein (TIP) koji sadrži varijantu domena IgSF (vIgD) eksprimiranu na površini ćelije. U jednom primeru otelotvorenja, srodni vezujući partner transmembranski vezanog vIgD je inhibitorni receptor (npr. PD-L1), iTIP koji sadrži vIgD (npr. PD-L1 vIgD) antagonizuje ili blokira negativnu signalizaciju inhibitornog receptora, što daje aktiviranu T-ćeliju ili efektorsku T-ćeliju. U nekim slučajevima, ako je grupisanje inhibitornog receptora (PD-1) blizu aktivacionog receptora (npr. CD28), može se ostvariti agonizujuća aktivnost putem TIP. SL.1C prikazuje izlučeni imunomodulatorni protein (SIP) u kome se varijanta domena IgSF (vIgD) izlučuje iz ćelije, kao što je prva T-ćelija (npr. CAR T-ćelija). U jednom primeru otelotvorenja, srodni vezujući partner izlučenog vIgD je inhibitorni receptor (npr. PD-1), koji može da se eksprimira putem prve ćelije (npr. T-ćelija, kao što je CAR T-ćelija) i/ili na drugoj ćeliji (npr. T-ćelija, endogena ili konstruisana, kao

1

što je CAR T-ćelija). Nakon vezivanja SIP sa srodnim vezujućim partnerom, SIP antagonizuje ili blokira negativnu signalizaciju putem inhibitornog receptora, što daje aktiviranu T-ćeliju ili efektorsku T-ćeliju. U svim slučajevima, vIgD može biti samo V-domen (IgV), kombinacija V-domena (IgV) i C-domena (IgC), uključujući ceo ekstracelularni domen (ECD), ili bilo koja kombinacija domena Ig člana familije IgSF.

SL. 2 prikazuje šematski primer aktivnosti varijante IgSF domena (vIgD) fuzionisanog sa Fc (vIgD-Fc) gde je vIgD varijanta domena IgSF PD-L1. Kao što je prikazano, rastvorljivi vIgD PD-L1 interaguje sa srodnim vezujućim partnerima da blokira interakcije PD-L1 ili PD-L2 sa PD-1, što blokira PD-1 inhibitorni receptor, i, u nekim slučajevima, omogućava T-ćeliji da se diferencira u efektorski fenotip.

SL. 3 prikazuje šematski primer naslaganog molekula koji je antagonist kontrolne tačke za višestruke ciljeve koji sadrži prvu varijantu domena IgSF (prvi vIgD) koji je vIgD PD-L1 ili PD-L2 i drugi domen IgSF (npr. drugi vIgD) koji se vezuje za drugi inhibitorni receptor. U šematskom primeru, drugi domen IgSF (npr. drugi vIgD) je CD112 ili CD155 vIgD. Kao što je prikazano, prvi vIgD i drugi vIgD interaguju sa srodnim vezujućim partnerima da blokiraju interakcije PD-L1 ili PD-L2 sa PD-1 i blokiraju interakcije CD155 ili CD112 sa TIGIT i/ili CD112R, čime se blokira više inhibitornih receptora.

SL. 4 prikazuje šematski primer naslaganog molekula za lokalizaciju varijante IgSF (vIgD) na tumorsku ćeliju. U ovom formatu, naslagani molekul sadrži prvu varijantu domena IgSF (prvi vIgD) i drugi domen IgSF (npr. drugi vIgD) gde je drugi domen IgSF (npr. drugi vIgD) domen IgSF usmeren na tumor koji se vezuje za tumorski antigen. Primer domena IgSF usmerenog na tumor je domen IgSF NKp30, koji se vezuje za tumorski antigen B7-H6. U ovom prikazu, varijanta domena IgSF (vIgD) je varijanta domena IgSF PD-L1. Kao što je prikazano, vezivanje domena IgSF usmerenog na tumor za površinu tumorske ćelije lokalizuje prvu varijantu domena IgSF na površini tumorske ćelije gde može da interaguje sa jednim ili više srodnih vezujućih partnera eksprimiranih na površini susedne imunske ćelije (npr. T-ćelija) za antagonizaciju inhibitorne aktivnosti PD-1 i olakšavanje aktivacije T-ćelija.

1

SL. 5A prikazuje različite reprezentativne konfiguracije naslaganog molekula koji sadrži prvu varijantu domena IgSF (prvi vIgD) i drugi domen IgSF, kao što je druga varijanta domena IgSF (drugi vIgD). Kao što je prikazano, prvi vIgD i drugi IgSF domen su nezavisno vezani, neposredno ili posredno, sa N- ili C-terminusom Fc regiona. Za dobijanje homodimernog Fc molekula, Fc region je onaj koji može da gradi homodimer sa uparenim Fc regionom putem zajedničke ekspresije pojedinačnog Fc regiona u ćeliji. Za dobijanje heterodimernog Fc molekula, pojedinačni Fc region sadrži mutacije (npr. mutacije „dugme u rupici“ u domenu CH3), tako da nastanak heterodimera ima prednost u odnosu na homodimere kada se pojedinačni Fc region zajednički eksprimira u ćeliji.

SL. 5B prikazuje različite reprezentativne konfiguracije naslaganog molekula koji sadrži prvu varijantu domena IgSF (prvi vIgD), drugi domen IgSF, kao što je druga varijanta domena IgSF (drugi vIgD), i treći domen IgSF, kao što je treća varijanta domena IgSF (treći vIgD). Kao što je prikazano, prvi vIgD, drugi IgSF i treći IgSF domen su nezavisno vezani, neposredno ili posredno, sa N- ili C-terminusom Fc regiona. Za dobijanje homodimernog Fc molekula, Fc region je onaj koji može da gradi homodimer sa uparenim Fc regionom putem zajedničke ekspresije pojedinačnog Fc regiona u ćeliji.

SL. 6 prikazuje šematski primer aktivnosti varijante domena IgSF (vIgD) konjugovanog sa antitelom (V-mAb) gde se antitelo (npr. anti-HER2 antitelo) vezuje za antigen na površini tumorske ćelije da bi se vIgD lokalizovao na ćeliji. Kao što je prikazano, vezivanje antitela za površinu tumorske ćelije lokalizuje vIgD na površini tumorske ćelije gde može da interaguje sa jednim ili više srodnih vezujućih partnera eksprimiranih na površini susedne imunske ćelije (npr. T-ćelija) za agonizaciju ili antagonizaciju signalizacije receptora. Kao što je prikazano u jednom reprezentativnom otelotvorenju, varijanta domena IgSF (vIgD) je varijanta domena IgSF PD-L1 koja vezuje inhibitorni receptor PD-1, recimo ima povećan afinitet prema njemu. Vezivanje vIgD PD-L1 za inhibitorni receptor PD-1 antagonizuje ili blokira negativnu signalizaciju inhibitornog receptora, što dovodi do aktivirane T-ćelije ili efektorske T-ćelije. U nekim slučajevima, ako je grupisanje inhibitornog receptora (PD-1) blizu aktivacionog receptora (npr. CD28), može se ostvariti agonizacija aktivnosti inhibitornog receptora putem TIP.

2

SL. 7A-7C prikazuje različite reprezentativne konfiguracije konjugata varijanta IgSF-antitelo (V-Mab). FIG. 7A pokazuje različite konfiguracije u kojima je varijanta domena IgSF vezana, neposredno ili posredno, za N- i/ili C-terminus lakog lanca antitela. FIG. 7B pokazuje različite konfiguracije u kojima je varijanta domena IgSF vezana, neposredno ili posredno, za N- i/ili C-terminus teškog lanca antitela. SL. 7C prikazuje rezultate konfiguracija V-Mab kada se laki lanac sa SL.7A i teški lanac sa SL.7B zajedno eksprimiraju u ćeliji.

SL. 8 i SL. 9 prikazuju rezultate biološke aktivnosti rastvorljive varijante PD-L1 IgV-Fc testirane u humanoj reakciji pomešanih limfocita (MLR). Približno 10.000 sazrelih DC i 100.000 prečišćenih alogenih CD3+ T-ćelija uzgajano je zajedno sa različitim rastućim koncentracijama varijanti PD-L1 IgV-Fc fuzionih proteina. Nebitni humani IgG ili samo medijum (označeni sa „bez dodatka“) korišćeni su kao negativna kontrola. Ispitani su kontrolni proteini, PDL1-Fc (kompletan ekstracelularni domen PD-L1 divljeg tipa), PD-L1 IgV-Fc divljeg tipa i anti-PD-1 monoklonsko antitelo (nivolumab) za pozitivnu kontrolu. SL.8 i SL. 9 prikazuju izračunate nivoe IFN-gama u supernatantima za uzgajanje (pg/ml) pri naznačenim koncentracijama varijante fuzionog molekula IgV-Fc.

SL. 10 prikazuje studije proliferacije za T-ćelije transdukovane reprezentativnom testiranom varijantom PD-L1 SIP.

SL. 11 prikazuje dozni odgovor za vezivanje naznačenih varijanti fuzionih molekula IgV-Fc, PD-L1/CD155 naslaganog Fc fuzionog molekula ili PD-L1/CD155/CD112 naslaganog Fc fuzionog molekula za iscrpljene T-ćelije.

SL. 12 prikazuju izračunate nivoe IFN-gama u supernatantima kulture (pg/ml) iscrpljenih T-ćelija pri naznačenoj koncentraciji varijante fuzionog molekula IgV-Fc, PD-L1/CD155 naslaganog Fc fuzionog molekula ili kontrolnih antitela.

Detaljan opis

[0055] Ovde su obezbeđeni imunomodulatorni proteini koji predstavljaju ili sadrže varijante ili mutante liganda 1 programirane ćelijske smrti 1 ili PD-L1 (poznat i kao klaster diferencijacije 274, CD274. B7 homolog 1 ili B7H1) ili njegove specifične vezujuće fragmente koji pokazuju aktivnost vezivanja za najmanje jednog srodnog vezujućeg partnera ciljnog liganda (takođe se naziva kontrastrukturni protein). Varijante polipeptida PD-L1 sadrže barem aminokiselinsku supstituciju N45D, uzimajući u obzir numeraciju iz SEQ ID NO:30, u poređenju sa nemodifikovanim humanim polipeptidom PD-L1. -Varijanta polipeptida PD-L1 i imunomodulatorni proteini pokazuju povećan afinitet vezivanja prema PD-1. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni proteini su rastvorljivi. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni proteini su transmembranski imunomodulatorni proteini koji mogu da se eksprimiraju na površini ćelija. U nekim otelotvorenjima, ovde je takođe obezbeđen jedan ili više drugih imunomodulatornih proteina koji su konjugati ili fuzije koje sadrže ovde obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i jedan ili više drugih ostataka ili polipeptida.

[0056] U nekim otelotvorenjima, varijante polipeptida PD-L1 i imunomodulatorni proteini modulišu imunološki imunski odgovor, kao što je povećanje ili smanjenje imunskog odgovora. U nekim otelotvorenjima, ovde obezbeđene varijante polipeptida PD-L1 i imunomodulatorni proteini mogu da se koriste za lečenje bolesti ili stanja povezanih sa disregulacijom imunskog odgovora.

[0057] U nekim otelotvorenjima, obezbeđene varijante polipeptida PD-L1 modulišu aktivaciju T-ćelija putem interakcija sa kostimulatornim i/ili koinhibitornim signalnim molekulima. Uopšteno, za antigen specifičnu aktivaciju T-ćelija neophodna su dva različita signala. Prvi signal se dobija interakcijom T-ćelijskog receptora (TCR) sa antigenima povezanim sa glavnim histokompatibilnim kompleksom (MHC) koji su prisutni na antigen prezentujućim ćelijama (APC). Drugi signal je kostimulatoran za angažovanje TCR i neophodan je za proliferaciju, diferencijaciju i/ili preživljavanje T-ćelija, uključujući, u nekim slučajevima, izbegavanje apoptoze ili anergije T-ćelija.

[0058] U nekim otelotvorenjima, u normalnim fiziološkim uslovima, imunski odgovor posredovan T-ćelijama inicira se prepoznavanjem antigena od strane T-ćelijskog receptora (TCR) i regulisan je ravnotežom kostimulatornih i inhibitornih signala (npr. proteini imunske kontrolne tačke). Imunski sistem se oslanja na imunske kontrolne tačke da se spreči autoimunost (tj. samotolerancija) i da se tkiva zaštite od prekomernog oštećenja prilikom imunskog odgovora, na primer prilikom napada na patogenu infekciju. Međutim, u nekim slučajevima, ovi imunomodulatorni proteini mogu biti disregulisani kod bolesti i stanja, uključujući tumore, kao mehanizam za izbegavanje imunskog sistema.

[0059] U nekim otelotvorenjima, u poznate T-ćelijske kostimulatorne receptore spada protein programirane ćelijske smrti 1 ili PD-1, koji je T-ćelijski kostimulatorni receptor za ligande PD-L1 (poznat i kao klaster diferencijacije 274, CD274. B7 homolog 1 ili B7-H1) i ligand 1 programirane ćelijske smrti 2 ili PD-L2 (poznat i kao PDCD1L2, PDCD1LG2, klaster diferencijacije 273, CD273. ili B7-DC). PD-L1 i PD-L2 se uobičajeno eksprimiraju na površini T-ćelija, B-ćelija i mijeloidnih ćelija. PD-L1 i PD-L2 su negativni regulatori imunske aktivacije i mogu da smanje imunski odgovor putem interakcija sa receptorom programirane smrti 1 (PD-1). U nekim aspektima, PD-1 se eksprimira na NK ćelijama i T-ćelijama, uključujući CD4+ i CD8+ ćelije, pri čemu angažovanje PD-1 može da inhibira aktivaciju, proliferaciju i/ili ekspanziju ćelija.

[0060] Međutim, ligandi PD-L1 takođe mogu da se vezuju za klaster diferencijacije 80 (poznat i kao CD80 ili B7-1). Vezivanje PD-L1 za CD80 može da blokira interakciju između PD-L1 i PD-1, čime se potencira ili pojačava imunski odgovor. Tako, u nekim slučajevima, interakcija PD-L1 sa CD80 i PD-L1 sa PD-1 dovodi do suprotnog dejstva u modulaciji imunskih odgovora. Tako, PD-1 i CD80 mogu imati suprotne uloge u imunskim odgovorima za modulaciju proinflamatornog ili antiinflamatornog odgovora, koji su, u nekim slučajevima, povezani sa brojnim bolestima i stanjima.

[0061] U nekim otelotvorenjima, PD-1 i CD80 mogu imati komplementarne uloge u oblikovanju imunskog odgovora. U nekim otelotvorenjima, pojačavanje ili supresija aktivnosti receptora PD-1 ima klinički značaj za lečenje inflamatornih i autoimunih poremećaja, kancera i virusnih infekcija. Međutim, u nekim slučajevima, terapije za intervenciju i izmenu imunomodulatornih dejstava takvih receptora ograničene su zahtevima prostorne orijentacije kao i ograničenjem dimenzija koje nameću granice imunološke sinapse. U nekim aspektima, postojeći terapeutski lekovi, uključujući antitela-lekove, nisu nužno sposobni da istovremeno interaguju sa više ciljnih proteina koji učestvuju u modulaciji ovih interakcija. Pored toga, u nekim slučajevima, postojeći terapeutski lekovi mogu imati samo sposobnost antagonizacije, ali ne i agonizacije imunskog odgovora. Pored toga,

2

farmakokinetičke razlike između lekova koji nezavisno ciljaju jedan od ovih receptora mogu da dovedu do teškoća u održavanju željene koncentracije takvih kombinacija lekova u krvi tokom lečenja.

[0062] U nekim otelotvorenjima, obezbeđene varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatorni proteini modulišu (npr. povećavaju ili smanjuju) imunološku aktivnost povezanu sa PD-1. Tako, obezbeđeni polipeptidi prevazilaze ova ograničenja tako što obezbeđuju varijantu PD-L1 sa povećanim afinitetom vezivanja za PD-1, čime se agonizuje ili antagonizuje dejstvo receptora. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni polipeptidi prevazilaze ova ograničenja tako što obezbeđuju varijantu PD-L1 sa izmenjenim (npr. povećanim ili smanjenim) afinitetom vezivanja za CD80, čime se modulira dejstvo interakcije između PD-1 i PD-L1. Takođe su obezbeđeni postupci za proizvodnju i korišćenje ovih varijanti PD-L1.

[0063] Ako je definicija koja je ovde data kontradiktorna ili na drugi način nedosledna definiciji datoj u patentima, prijavama, objavljenim prijavama i drugim publikacijama koje su ovde obuhvaćene referencom, definicija koja je ovde data ima prednost u odnosu na definiciju iz referenci.

[0064] Naslovi odeljaka koji se ovde koriste imaju samo organizacionu svrhu i ne treba ih tumačiti kao ograničenje opisane materije.

I. DEFINICIJE

[0065] Osim ako nije drugačije definisano, svi termini iz struke, simboli i drugi tehnički i naučni termini ili terminologija koji se ovde koriste treba da imaju isto značenje koje je poznato osobi sa uobičajenim znanjem i veštinama u oblasti na koju se odnosi materija iz patentnog zahteva. U nekim slučajevima, termini sa uobičajeno poznatim značenjem su ovde definisani radi razjašnjenja i/ili brze reference, i ne treba nužno tumačiti uključivanje takvih definicija ovde kao značajnu razliku u odnosu na ono što je uobičajeno poznato u struci.

[0066] Termini koji se koriste u ovoj specifikaciji definisani su na sledeći način, osim ako nisu drugačije ograničeni u konkretnim slučajevima. Oblici za jedninu koji se koriste u specifikaciji i priloženim zahtevima uključuju i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi, akronimi i skraćenice koje se ovde koriste imaju isto značenje koje je poznato osobi sa uobičajenim znanjem i veštinama u oblasti kojoj pronalazak pripada. Osim ako nije drugačije naznačeno, skraćenice i simboli za hemijske i biohemijske nazive su u skladu sa IUPAC-IUB nomenklaturom. Osim ako nije drugačije naznačeno, svi numerički rasponi obuhvataju vrednosti koje definišu raspon kao i sve cele brojeve između njih.

[0067] Termin „afinitetno modifikovan“, kao što se koristi u kontekstu domena superfamilije imunoglobulina, označava domen superfamilije imunoglobulina (IgSF) sisara koji ima izmenjenu sekvencu aminokiselina (u odnosu na odgovarajući matični domen divljeg tipa ili nemodifikovani domen IgSF) tako da ima povećan ili smanjen afinitet vezivanja ili avidnost prema najmanje jednom od srodnih vezujućih partnera (alternativno „kontrastrukture“) u poređenju sa matičnim kontrolnim domenom IgSF divljeg tipa ili nemodifikovanim (tj. neafinitetno modifikovanim). Ovim kontekstom je obuhvaćen afinitetno modifikovani domen IgSF PD-L1. U nekim otelotvorenjima, afinitetno modifikovani domen IgSF može da ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više aminokiselinskih razlika, kao što su aminokiselinske supstitucije, u domenu IgSF divljeg tipa ili nemodifikovanom. Povećanje ili smanjenje afiniteta vezivanja ili avidnosti može da se odredi koristeći dobro poznate testove vezivanja, kao što je protočna citometrija. Larsen et al., American Journal of Transplantation, sveska 5: 443-453 (2005). Takođe, vidite Linsley et al., Immunity, sveska 1(9): 793-801 (1994). Afinitet vezivanja ili avidnosti proteina prema srodnom vezujućem partneru povećava se do vrednosti koja je najmanje 10% veća nego kod kontrolnog domena IgSF divljeg tipa, a u nekim otelotvorenjima najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 5000%, ili 10.000% veća od vrednosti kontrolnog domena IgSF divljeg tipa. Afinitet vezivanja ili avidnosti proteina prema najmanje jednom srodnom vezujućem partneru smanjuje se do vrednosti koja nije veća od 90% ali nije manja od 10% vrednosti kontrolnog domena IgSF divljeg tipa, a u nekim otelotvorenjima nije veća od 80%, 70% 60%, 50%, 40%, 30%, ili 20% ali nije manja od 10% vrednost kontrolnog domena IgSF divljeg tipa. Afinitetno modifikovani protein je izmenjen u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci putem supstitucije, adicije ili delecije aminokiselinskih ostataka. Termin „afinitetno modifikovani domen IgSF“ ne treba tumačiti kao postavljanje bilo kog uslova za bilo koju konkretnu početnu kompoziciju ili postupak kojim je kreiran afinitetno modifikovani domen IgSF. Tako, afinitetno modifikovani domeni IgSF iz predmetnog pronalaska nisu ograničeni na domene

2

IgSF divljeg tipa koji su zatim transformisani u afinitetno modifikovan domen IgSF bilo kojim konkretnim procesom ili afinitetnom modifikacijom. Afinitetno modifikovani polipeptid domena IgSF može, na primer, biti dobijen polazeći od informacije o sekvenci domena IgSF divljeg tipa sisara, zatim modelovan kompjuterskom simulacijom za vezivanje za srodnog vezujućeg partnera, i konačno rekombinantnim ili hemijskim putem sintetisan dajući kompoziciju afinitetno modifikovanog domena IgSF. U samo jednom alternativnom primeru, afinitetno modifikovani domen IgSF može da se kreira mutagenezom divljeg tipa domena IgSF usmerenom na mesto. Tako, afinitetno modifikovani domen IgSF označava proizvod i nije nužno proizvod dobijen bilo kojim datim procesom. Mogu da se koriste brojne tehnike, uključujući rekombinantne metode, hemijsku sintezu ili njihove kombinacije.

[0068] Termin „alogeno“, kao što se ovde koristi, označava ćeliju ili tkivo koje je uklonjeno iz jednog organizma, a zatim infuzijom ili adoptivno prebačeno u genetski nesličan organizam iste vrste. U nekim otelotvorenjima pronalaska, vrsta je miš ili čovek.

[0069] Termin „autologno“, kao što se ovde koristi, označava ćeliju ili tkivo koje je uklonjeno iz istog organizma u koji je kasnije prebačeno infuzijom ili adoptivno. Autologna ćelija ili tkivo može da se izmeni, na primer, metodom rekombinacije DNK, tako da više ne bude genetski identična nativnoj ćeliji ili nativnom tkivu uklonjenom iz organizma. Na primer, nativna autologna T-ćelija može biti genetski konstruisana tehnikama rekombinacije DNK da postane autologno konstruisana ćelija koja eksprimira transmembranski imunomodulatorni protein i/ili himerni antigenski receptor (CAR), što u nekim slučajevima uključuje konstruisanje T-ćelije ili TIL (limfocit koji infiltrira tumor). Konstruisane ćelije su zatim infuzijom ubačene u pacijenta iz kog je izolovana nativna T-ćelija. U nekim otelotvorenjima, organizam je čovek ili miš.

[0070] Termini „afinitet vezivanja“ i „avidnost vezivanja“, kao što se ovde koriste, označavaju specifični afinitet vezivanja, odnosno specifičnu avidnost vezivanja, proteina prema njegovoj kontrastrukturi u specifičnim uslovima vezivanja. U biohemijskoj kinetici, avidnost se odnosi na akumuliranu jačinu više afiniteta pojedinačnih nekovalentnih vezujućih interakcija, recimo između PD-L1 i njegovih kontrastruktura PD-1 i/ili CD80. Tako, avidnost se razlikuje od afiniteta, koji opisuje jačinu jedne interakcije. Povećanje ili slabljenje afiniteta vezivanja varijante PD-L1 koja sadrži afinitetno modifikovan domen IgSF PD-L1 prema njegovoj kontrastrukturi određuje se u odnosu na afinitet vezivanja nemodifikovanog PD-L1,

2

kao što je nemodifikovani PD-L1 koji sadrži nativni ili divlji tip domena IgSF, kao što je domen IgV. Postupci za određivanje afiniteta ili avidnosti vezivanja su poznati u struci.

Vidite, na primer, Larsen et al., American Journal of Transplantation, sveska 5: 443-453 (2005). U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 iz pronalaska (tj. protein PD-L1 koji sadrži afinitetno modifikovani domen IgSF) specifično se vezuje za PD-1 i/ili CD80, na osnovu merenja protočnom citometrijom, sa afinitetom vezivanja koji daje vrednost prosečnog intenziteta fluorescencije (MFI) najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% veću nego kontrolni PD-L1 divljeg tipa u testu vezivanja.

[0071] Termin „biološki poluživot“ odnosi se na vreme koje je potrebno da supstanca, kao što je imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 iz predmetnog pronalaska, izgubi polovinu svoje farmakološke ili fiziološke aktivnosti ili koncentracije. Na biološki poluživot može da utiče eliminacija, izlučivanje, razgradnja (npr. enzimska) supstance, ili apsorpcija i koncentracija u određenim organima ili tkivima u telu. U nekim otelotvorenjima, biološki poluživot može da se proceni utvrđivanjem vremena koje je potrebno da koncentracija supstance u krvnoj plazmi dostigne polovinu stabilnog nivoa („poluživot u plazmi“). Konjugati koji mogu da se koriste za derivatizaciju i povećanje biološkog poluživota polipeptida iz pronalaska poznati su u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), XTEN (produženi rekombinantni peptidi; vidite, WO2013130683), albumin humanog seruma (HSA), albumin goveđeg seruma (BSA), lipide (acilovanje), i poly-Pro-Ala-Ser (PAS), poliglutaminsku kiselinu (glutamilacija).

[0072] Termin „himerni antigenski receptor“ ili „CAR“, kao što se ovde koristi, označava veštački transmembranski protein (tj. ljudsku tvorevinu) eksprimiran na ćeliji sisara koji sadrži najmanje ektodomen, transmembranu i endodomen. Opciono, CAR protein sadrži „spejser“ koji kovalentno vezuje ektodomen sa transmembranskim domenom. Spejser je često polipeptid koji vezuje ektodomen sa transmembranskim domenom preko peptidnih veza. CAR se tipično eksprimira na limfocitu sisara. U nekim otelotvorenjima, CAR se eksprimira na ćeliji sisara kao što je T-ćelija ili limfocit koji infiltrira tumor (TIL). CAR eksprimiran na T-ćeliji se ovde naziva „CAR T-ćelija“ ili „CAR-T“. U nekim otelotvorenjima, CAR-T je T pomoćna ćelija, citotoksična T-ćelija, T-ćelija prirodni ubica, memorijska T-ćelija, regulatorna T-ćelija ili gama delta T-ćelija. Kada se klinički koristi, npr. u adoptivnom transferu ćelija, CAR-T sa antigen vezujućom specifičnošću prema pacijentovom tumoru je tipično konstruisan za ekspresiju na T-ćeliji dobijenoj od pacijenta.

2

Konstruisana T-ćelija koja eksprimira CAR je zatim infuzijom vraćena u pacijenta. CAR-T je tako često autologni CAR-T, iako su alogeni CAR-T obuhvaćeni opsegom ovog pronalaska. Ektodomen CAR sadrži antigen vezujući region, kao što je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment (npr. scFv), koji se u fiziološkim uslovima specifično vezuje za ciljni antigen, kao što je specifični antigen tumora. Nakon specifičnog vezivanja, biohemijski sled događaja (tj. transdukcija signala) dovodi do modulacije imunološke aktivnosti CAR-T. Tako, na primer, nakon specifičnog vezivanja antigen vezujućeg regiona CAR-T za ciljni antigen može doći do promena imunološke aktivnosti T-ćelijske aktivnosti, što se vidi u promenama citotoksičnosti, proliferacije ili proizvodnje citokina. Transdukcija signala nakon aktivacije CAR-T se u nekim otelotvorenjima postiže putem CD3-zeta lanca („CD3-z“) koji je uključen u transdukciju signala kod nativnih T-ćelija sisara. CAR-T mogu dalje da sadrže višestruke signalne domene kao što je CD28, 41BB ili OX40, kako bi dalje modulisali imunomodulatorni odgovor T-ćelije. CD3-z sadrži očuvani motiv poznat kao motiv aktivacije imunoreceptora na bazi tirozina (ITAM) koji je uključen u transdukciji signala T-ćelijskog receptora.

[0073] Termin „zbirno“ ili „zbir“, kada se koristi u vezi sa proizvodnjom citokina koja je indukovana prisustvom dve ili više varijanti PD-L1 iz pronalaska u in vitro testu, označava ukupni nivo ekspresije citokina bez obzira na proizvodnju citokina koja je indukovana pojedinačnom varijantom PD-L1. U nekim otelotvorenjima, citokin koji se testira je IFN-gama, kao u in vitro testu primarnih T-ćelija.

[0074] Termin „srodni vezujući partner“ (koristi se naizmenično sa terminom „kontrastruktura“) kada se koristi da se označi polipeptid, recimo da se označi domen IgSF varijante PD-L1, odnosi se najmanje na jedan molekul (tipično nativni protein sisara) za koji se naznačeni polipeptid specifično vezuje u specifičnim uslovima vezivanja. U nekim aspektima, varijanta PD-L1 koja sadrži afinitetno modifikovani domen IgSF specifično se vezuje za kontrastrukturu odgovarajućeg nativnog PD-L1 ili PD-L1 divljeg tipa, ali sa povećanim ili oslabljenim afinitetom. Vrsta liganda koja je prepoznata i specifično se vezuje za srodni receptor u specifičnim uslovima vezivanja predstavlja primer kontrastrukture ili srodnog vezujućeg partnera tog receptora. „Srodni vezujući partner na ćelijskoj površini“ je srodni vezujući partner eksprimiran na površini ćelije sisara. „Molekulske vrste ćelijske površine“ predstavljaju srodnog vezujućeg partnera liganda imunološke sinapse (IS),

2

eksprimirane na ćelijama i od strane ćelija, kao što su ćelije sisara, koje grade imunološku sinapsu.

[0075] Kao što se ovde koristi, „konjugat“, „konjugacija“ ili gramatičke varijacije prethodnog, odnose se na međusobno spajanje ili vezivanje dva ili više jedinjenja koje dovodi do nastanka drugog jedinjenja, putem bilo kojih postupaka spajanja ili vezivanja koji su poznati u struci. Ovaj termin takođe može da se odnosi na jedinjenje koje je dobijeno međusobnim spajanjem ili vezivanjem dva ili više jedinjenja. Na primer, varijanta polipeptida PD-L1 vezana neposredno ili posredno sa jednim ili više hemijskih ostataka ili polipeptidom predstavlja primer konjugata. Takvi konjugati uključuju fuzione proteine, kako one koji su proizvedeni putem hemijskih konjugata, tako i one proizvedene bilo kojim drugim postupcima.

[0076] Termin „kompetitivno vezivanje“, kao što se ovde koristi, znači da protein može specifično da se vezuje za najmanje dva srodna vezujuća partnera, ali da specifično vezivanje jednog srodnog vezujućeg partnera inhibira, recimo sprečava ili isključuje, istovremeno vezivanje drugog srodnog vezujućeg partnera. Tako, u nekim slučajevima, nije moguće da protein veže dva srodna vezujuća partnera u isto vreme. Uopšteno, kompetitivni vezivači sadrže isto ili preklapajuće mesto vezivanja za specifično vezivanje, ali to nije neophodan uslov. U nekim otelotvorenjima, kompetitivno vezivanje dovodi do merljive inhibicije (delimične ili potpune) specifičnog vezivanja proteina za jedan od srodnih vezujućih partnera usled specifičnog vezivanja drugog srodnog vezujućeg partnera. Poznati su različiti postupci za kvantifikaciju kompetitivnog vezivanja, kao što je ELISA test (test sa imunosorbentom vezanim za enzim).

[0077] Termin „konzervativna aminokiselinska supstitucija“, kao što se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinsku supstituciju u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Primeri za grupe aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatične-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenil alanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Grupe

2

konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin, fenil alanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin.

[0078] Termin „odgovara“ kada se koristi da označi pozicije proteina, kao što je navod da nukleotidi ili aminokiselinske pozicije „odgovaraju“ nukleotidima ili aminokiselinskim pozicijama u otkrivenoj sekvenci, kao što je dato u spisku sekvenci, odnosi se na nukleotide ili aminokiselinske pozicije identifikovane prilikom poravnavanja sa otkrivenom sekvencom na osnovu strukturnog poravnavanja sekvence koristeći standardni algoritam za poravnavanje, kao što je GAP algoritam. Na primer, odgovarajući ostaci mogu da se utvrde poravnavanjem referentne sekvence sa sekvencom PD-L1 divljeg tipa datom u SEQ ID NO:30 ili 1728 (domen ECD) ili datom u SEQ ID NO: 55 ili 309 (domen IgV) pomoću postupaka strukturnog poravnavanja koji su ovde opisani. Putem poravnavanja sekvenci, stručnjak za ovu oblast može da identifikuje odgovarajuće ostatke, na primer, koristeći očuvane i identične aminokiselinske ostatke kao smernice.

[0079] Termini „smanjiti“ ili „oslabiti“ ili „prigušiti“, kao što se ovde koriste, označavaju smanjenja za statistički značajan iznos. Smanjenje može biti najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100%.

[0080] Termini „derivati“ ili „derivatizovano“ odnose se na modifikaciju proteina njegovim kovalentnim vezivanjem, neposredno ili posredno, sa kompozicijom tako da se izmene karakteristike kao što je biološki poluživot, bioraspoloživost, imunogenost, rastvorljivost, toksičnost ili delotvornost, uz zadržavanje ili povećavanje njegove terapeutske korisnosti. Derivati imunomodulatornih polipeptida iz pronalaska su obuhvaćeni opsegom pronalaska i mogu da se proizvedu, na primer, glikozilacijom, pegilovanjem, lipidacijom ili Fc-fuzijom.

[0081] Kao što se ovde koristi, „domen“ (obično sekvenca od tri ili više, obično 5 ili 7 ili više aminokiselina, recimo od 10 do 200 aminokiselinskih ostataka) odnosi se na deo molekula, kao što je protein ili kodirajuća nukleinska kiselina, koji je strukturno i/ili funkcionalno drugačiji od drugih delova molekula i može da se identifikuje. Na primer, domeni uključuju one delove polipeptidnog lanca koji mogu da grade nezavisno savijenu strukturu u proteinu načinjenu od jednog ili više strukturnih motiva i/ili koja se prepoznaje na osnovu funkcionalne aktivnosti, kao što je vezujuća aktivnost. Protein može imati jedan ili više od jednog različitih domena. Na primer, domen može da se identifikuje, definiše ili razlikuje na osnovu homologije primarne sekvence ili strukture za srodne članove familije, kao što je homologija za motive. U drugom primeru, domen može da se razlikuje na osnovu funkcije, kao što je sposobnost da interaguje sa biomolekulom, kao što je srodni vezujući partner. Domen nezavisno može da pokazuje biološku funkciju ili aktivnost tako da domen nezavisno ili fuzionisan sa drugim molekulom može da vrši aktivnost, kao što je, na primer, vezivanje. Domen može biti linearna sekvenca aminokiselina ili nelinearna sekvenca aminokiselina. Brojni polipeptidi sadrže više domena. Takvi domeni su poznati i mogu da ih identifikuju stručnjaci za ovu oblast. Kao primer ovoga, date su definicije, ali je jasno da stručnjaci umeju da prepoznaju konkretne domene po nazivu. Po potrebi, odgovarajući softver može da se koristi za identifikaciju domena.

[0082] Termin „ektodomen“, kao što se ovde koristi, odnosi se na region membranskog proteina, kao što je transmembranski protein, koji se nalazi izvan vezikularne membrane. Ektodomeni često sadrže vezujuće domene koji se specifično vezuju za ligande ili receptore na ćelijskoj površini, recimo preko vezujućeg domena koji se specifično vezuje za ligand ili receptor na ćelijskoj površini. Ektodomen ćelijskog transmembranskog proteina se alternativno naziva ekstracelularni domen.

[0083] Termini „delotvorna količina“ ili „terapeutski delotvorna količina“ odnose se na količinu i/ili koncentraciju terapeutske kompozicije iz pronalaska, uključujući proteinsku kompoziciju ili ćelijsku kompoziciju, koja, kada se primeni ex vivo (dovođenjem u kontakt sa ćelijom pacijenta) ili in vivo (primenom na pacijentu), samostalno (tj. kao monoterapija) ili u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensima, daje statistički značajno smanjenje progresije bolesti, na primer, putem poboljšavanja ili eliminacije simptoma i/ili uzroka bolesti. Delotvorna količina može biti količina koja olakšava, smanjuje ili ublažava najmanje jedan simptom ili biološki odgovor ili efekat povezan sa bolešću ili poremećajem, sprečava progresiju bolesti ili poremećaja, ili poboljšava fizičko funkcionisanje pacijenta. U slučaju ćelijske terapije, delotvorna količina je delotvorna doza ili broj ćelija primenjenih na pacijentu putem adoptivne ćelijske terapije. U nekim otelotvorenjima, pacijent je sisar, kao što je nehumani primat ili ljudski pacijent.

[0084] Termin „endodomen“, kao što se ovde koristi, odnosi se na region koji se može naći u nekim mebranskim proteinima, kao što su transmembranski proteini, koji se proteže u unutrašnji prostor definisan membranom ćelijske površine. U ćelijama sisara, endodomen je

1

citoplazmatski region membranskog proteina. U ćelijama, endodomen interaguje sa intracelularnim gradivnim elementima i može da igra ulogu u transdukciji signala, te tako, u nekim slučajevima, može biti intracelularni signalni domen. Endodomen ćelijskog membranskog proteina se alternativno naziva citoplazmatski domen, koji, u nekim slučajevima, može biti domen citoplazmatske signalizacije.

[0085] Termini „pojačana“ ili „povećana“, kao što se ovde koriste u kontekstu povećanja imunološke aktivnosti limfocita sisara, označavaju povećanje jedne ili više aktivnosti limfocita. Povećana aktivnost može biti jedno ili više od povećanog ćelijskog preživljavanja, ćelijske proliferacije, proizvodnje citokina, ili T-ćelijske citotoksičnosti, na primer za statistički značajan iznos. U nekim otelotvorenjima, referenca na povećanu imunološku aktivnost znači povećanje proizvodnje interferona gama (IFN-gama), na primer za statistički značajan iznos. U nekim otelotvorenjima, imunološka aktivnost može da se proceni testom reakcije pomešanih limfocita (mixed lymphocyte reaction, MLR). Postupci za obavljanje MLR testova su poznati u struci. Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56. Drugi postupci za procenu aktivnosti limfocita su poznati u struci, uključujući bilo koji test koji je ovde opisan. U nekim otelotvorenjima, pojačavanje može biti povećanje najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, ili 500% veće od kontrolne vrednosti koja nije nula.

[0086] Termin „konstruisana ćelija“, kao što se ovde koristi, odnosi se na ćeliju sisara koja je genetski modifikovana ljudskom intervencijom, na primer postupcima rekombinacije DNK ili virusne transdukcije. U nekim otelotvorenjima, ćelija je imunska ćelija, kao što je limfocit (npr. T-ćelija, B-ćelija, NK ćelija) ili antigen prezentujuća ćelija (npr. dendritska ćelija). Ćelija može biti primarna ćelija pacijenta ili može biti ćelijska linija. U nekim otelotvorenjima, konstruisana ćelija iz pronalaska sadrži varijantu PD-L1 iz pronalaska konstruisanu da modulira imunološku aktivnost T-ćelije koja eksprimira PD-1 i opciono CD80 za koju se varijanta PD-L1 specifično vezuje. U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 je transmembranski imunomodulatorni protein (u nastavku se naziva „TIP“) koji sadrži ekstracelularni domen ili njegov deo koji sadrži IgV ili ECD domen vezan za transmembranski domen (npr. transmembranski domen PD-L1) i, opciono, intracelularni signalni domen. U nekim slučajevima, TIP je u obliku himernog receptora koji sadrži heterologni citoplazmatski signalni domen ili endodomen. U nekim otelotvorenjima, konstruisana ćelija može da eksprimira i izlučuje imunomodulatorni protein, kao što je ovde

2

opisano. U obezbeđene konstruisane ćelije spadaju ćelije koje dalje sadrže konstruisani T-ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigenski receptor (CAR).

[0087] Termin „konstruisana T-ćelija“, kao što se ovde koristi, odnosi se na T-ćeliju, kao što je T pomoćna ćelija, citotoksična T ćelija (alternativno, citotoksični T limfocit ili CTL), T-ćelija prirodni ubica, regulatorna T-ćelija, memorijska T-ćelija, ili gama delta T-ćelija, koja je genetski modifikovana ljudskom intervencijom, kao što su postupci rekombinacije DNK ili postupci virusne transdukcije. Konstruisana T-ćelija sadrži varijantu transmembranskog imunomodulatornog proteina (TIP) PD-L1 ili izlučenog imunomodulatornog proteina (SIP) iz predmetnog pronalaska koja je eksprimirana na T-ćeliji i konstruisana je da modulira imunološku aktivnost same konstruisane T-ćelije, ili ćelije sisara za koju se varijanta PD-L1 eksprimirana na T-ćeliji specifično vezuje.

[0088] Termin „konstruisani T-ćelijski receptor“ ili „konstruisani TCR“ se odnosi na T-ćelijski receptor (TCR) konstruisan da se specifično vezuje sa željenim afinitetom za glavni histokompatibilni kompleks (MHC)/ciljni antigen peptida koji je izabran, kloniran i/ili nakon toga uveden u populaciju T-ćelija, koji se često koristi za adoptivnu imunoterapiju. Nasuprot konstruisanim TCR, CAR su konstruisani da se vezuju za ciljne antigene nezavisno od MHC.

[0089] Termin „eksprimiran na“, kao što se ovde koristi, koristi se za protein koji se eksprimira na površini ćelije, kao što je ćelija sisara. Tako, protein se eksprimira kao membranski protein. U nekim otelotvorenjima, eksprimirani protein je transmembranski protein. U nekim otelotvorenjima, protein je konjugovan sa ostatkom malog molekula kao što je lek ili detektabilna oznaka. Proteini eksprimirani na površini ćelije mogu da uključuju proteine ćelijske površine, kao što su ćelijski površinski receptori koji su eksprimirani na ćelijama sisara.

[0090] Termin „ostatak koji produžava poluživot“ odnosi se na ostatak polipeptidne fuzije ili hemijskog konjugata koji produžava poluživot proteina u cirkulaciji krvnog seruma sisara u poređenju sa poluživotom proteina koji nije tako konjugovan sa ostatkom. U nekim otelotvorenjima, poluživot je produžen za više od ili više od oko 1,2 puta, 1,5 puta, 2,0 puta, 3,0 puta, 4,0 puta, 5,0 puta ili 6,0 puta. U nekim otelotvorenjima, poluživot je produžen za više od 6 sati, više od 12 sati, više od 24 sata, više od 48 sati, više od 72 sata, više od 96 sati, više od 1 nedelje nakon in vivo primene u poređenju sa proteinom bez ostatka koji produžava poluživot. Poluživot se odnosi na vreme koje je potrebno da protein izgubi polovinu svoje koncentracije, količine ili aktivnosti. Poluživot može da se utvrdi, na primer, koristeći ELISA test ili test aktivnosti. Primeri za ostatke koji produžavaju poluživot uključuju Fc domen, domen multimerizacije, polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), XTEN (produženi rekombinantni peptidi; vidite, WO2013130683), albumin humanog seruma (HSA), albumin goveđeg seruma (BSA), lipide (acilovanje), i poly-Pro-Ala-Ser (PAS), poliglutaminsku kiselinu (glutamilacija).

[0091] Termin „imunološka sinapsa“ ili „imunska sinapsa“, kao što se ovde koristi, označava međupovršinu između ćelije sisara koja eksprimira MHC I (glavni histokompatibilni kompleks) ili MHC II, kao što je antigen prezentujuća ili tumorska ćelija, i limfocita sisara kao što je efektorska T-ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK).

[0092] Fc (fragment koji se može kristalisati) region ili domen molekula imunoglobulina (takođe se naziva Fc polipeptid) u velikoj meri odgovara konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina, i odgovoran je za različite funkcije, uključujući efektorske funkcije antitela. Fc domen sadrži deo domena šarke molekula imunoglobulina ili ceo domen, plus CH2 i CH3 domen. Fc domen može da gradi dimer dva polipeptidna lanca spojena preko jedne ili više disulfidnih veza. U nekim otelotvorenjima, Fc je varijanta Fc koja pokazuje smanjenu (npr. smanjenu za više od 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više) aktivnost za olakšavanje efektorske funkcije. U nekim otelotvorenjima, referenca na aminokiselinske supstitucije u Fc regionu je na osnovu EU sistema numeracije, osim ako nije opisana u vezi sa specifičnim SEQ ID NO. EU numeracija je poznata i u skladu sa najskorije ažuriranom IMGT naučnom tabelom (IMGT<®>, the international ImMunoGeneTics information system<®>,

[0093] http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (kreirano: 17. maja 2001. godine, poslednji put ažurirano: 10. januara 2013. godine) i EU indeksom koji je objavljen u Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5. izd. US Department of Health and Human Services, NIH publikacija br.91-3242 (1991).

[0094] Imunoglobulinska Fc fuzija („Fc-fuzija“), kao što je imunomodulatorni Fc fuzioni protein, predstavlja molekul koji sadrži jedan ili više polipeptida (ili jedan ili više malih molekula) operativno vezanih za Fc region imunoglobulina. Fc-fuzija može, na primer, da sadrži Fc region antitela (koji olakšava efektorske funkcije i farmakokinetiku) i varijantu PD-

4

L1. Fc region imunoglobulina može biti vezan neposredno ili posredno za jednu ili više varijanti PD-L1 ili malih molekula (fuzioni partneri). Različiti linkeri su poznati u struci i opciono mogu da se koriste za vezivanje Fc sa fuzionim partnerom dajući Fc-fuziju. Fc-fuzije istih vrsta mogu da se dimerizuju tako da grade Fc-fuzione homodimere, ili se koriste vrste koje nisu identične da se dobiju Fc-fuzioni heterodimeri. U nekim otelotvorenjima, Fc je Fc sisara, kao što je mišji ili humani Fc.

[0095] Termin „ćelija domaćin“ odnosi se na ćeliju koja može da se koristi za ekspresiju proteina kodiranog rekombinantnim ekspresionim vektorom. Ćelija domaćin može biti prokariota, na primer, E. coli, ili može biti eukariota, na primer, jednoćelijska eukariota (npr. kvasac ili druga gljivica), biljna ćelija (npr. ćelija biljke duvana ili paradajza), životinjska ćelija (npr. humana ćelija, ćelija majmuna, ćelija hrčka, ćelija pacova, ćelija miša ili ćelija insekta) ili hibridom. Primeri za ćelije domaćine uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njihove derivate kao što su Veggie CHO i srodne ćelijske linije koje rastu u medijumu bez seruma ili CHO soj DX-B11, koji nema DHFR. Još jedan primer su ćelije epitela ljudskih bubrega 293 ili njihovi derivati. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija sisara (npr. ćelija čoveka, ćelija majmuna, ćelija hrčka, ćelija pacova, ćelija miša ili ćelija insekta).

[0096] Termin „imunoglobulin“ (skraćeno kao što se ovde koristi, odnosi se na protein imunoglobulina sisara, uključujući bilo koju od pet humanih klasa antitela: IgA (uključuje potklase IgA1 i IgA2), IgD, IgE, IgG (uključuje potklase IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) i IgM. Termin takođe obuhvata imunoglobuline koji imaju dužinu manju od kompletne, bilo da su u potpunosti ili delimično sintetički (npr. rekombinantna ili hemijska sinteza) ili prirodno proizvedeni, kao što je antigen vezujući fragment (Fab), varijabilni fragment (Fv) koji sadrži VHi VL, jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji sadrži VHi VLmeđusobno vezane u jednom lancu, kao i druge fragmente V regiona antitela, kao što su Fab', F(ab)2, F(ab')2, dsFv diajatelo, Fc i Fd polipeptidni fragmenti. Ovim terminom su obuhvaćena bispecifična antitela, homobispecifična i heterobispecifična.

[0097] Termin „superfamilija imunoglobulina“ ili „IgSF“, kao što se ovde koristi, označava grupu proteina ćelijske površine i rastvorljivih proteina koji učestvuju u procesima prepoznavanja, vezivanja ili adhezije ćelija. Molekuli se kategorizuju kao članovi ove superfamilije na osnovu zajedničkih strukturnih karakteristika sa imunoglobulinima (tj.

antitelima). Svi imaju domen poznat kao domen imunoglobulina ili presavijanje. Članovi IgSF uključuju antigenske receptore ćelijske površine, koreceptore i kostimulatorne molekule imunskog sistema, molekule koji učestvuju u prezentovanju antigena limfocitima, molekule ćelijske adhezije, određene citokinske receptore i intracelularne mišićne proteine. Oni su obično povezani sa ulogama u imunskom sistemu. Proteini u imunološkoj sinapsi su često članovi IgSF. IgSF takođe mogu da se klasifikuju u „potfamilije“ na osnovu zajedničkih osobina kao što je funkcija. Takve potfamilije se obično sastoje od 4 do 30 članova IgSF.

[0098] Termini „domen IgSF“ ili „domen imunoglobulina“ ili „domen Ig“, kao što se ovde koriste, odnose se na strukturni domen proteina IgSF. Domeni Ig su dobili naziv po molekulima imunoglobulina. Oni sadrže oko 70-110 aminokiselina i kategorisani su prema veličini i funkciji. Domeni Ig imaju karakteristično presavijanje Ig, koje ima strukturu nalik sendviču koju grade dve ravni antiparalelnih beta lanaca. Interakcije između hidrofobnih aminokiselina sa unutrašnje strane sendviča i veoma očuvanih disulfidnih veza koje nastaju između ostataka cisteina u B i F lancima stabilizuju presavijanje Ig. Jedan kraj domena Ig ima odeljak koji se zove region za određivanje komplementarnosti, koji je važan za specifičnost antitela prema ligandima. Domeni nalik Ig mogu da se klasifikuju (u klase) kao: IgV, IgC (koji može biti IgC1 ili IgC2) ili IgI. Većina domena Ig je varijabilna (IgV) ili konstantna (IgC). Domeni IgV sa 9 beta lanaca su generalno duži nego domeni IgC sa 7 beta lanaca. Domeni Ig nekih članova IgSF podsećaju na domene IgV u aminokiselinskoj sekvenci, ali su po veličini slični domenima IgC. Oni se nazivaju domeni IgC2, dok se standardni domeni Ig Cnazivaju domeni IgC1. Lanci T-ćelijskog receptora (TCR) sadrže dva domena Ig u ekstracelularnom delu, jedan domen IgV na N-terminusu i jedan domen IgC1 pored ćelijske membrane. PD-L1 sadrži dva domena Ig, jedan domen IgV i jedan IgC.

[0099] Termin „vrste IgSF“, kao što se ovde koristi, odnosi se na skup proteina članova IgSF sa identičnom ili suštinski identičnom primarnom aminokiselinskom sekvencom. Svaki član superfamilije imunoglobulina (IgSF) sisara definiše jedinstven identitet svih vrsta IgSF koje pripadaju tom članu IgSF. Tako, svaki član familije IgSF je jedinstven u odnosu na druge članove familije IgSF i, shodno tome, svaka vrsta konkretnog člana familije IgSF je jedinstvena u odnosu na vrste drugog člana familije IgSF. Ipak, može doći do varijacija između molekula koji pripadaju istim vrstama IgSF usled razlika u posttranslacionoj modifikaciji, kao što je glikozilacija, fosforilacija, ubikvitinacija, nitrozilacija, metilovanje, acetilovanje i lipidacija. Pored toga, manje razlike sekvence u okviru jedne vrste IgSF usled polimorfizma gena predstavljaju još jedan oblik varijacije u okviru jedne grupe IgSF kao i skraćeni oblici IgSF vrste divljeg tipa, na primer, usled proteolitičkog cepanja. „Vrsta IgSF na ćelijskoj površini“ je vrsta IgSF koja se eksprimira na površini ćelije, generalno ćelije sisara.

[0100] Termin „imunološka aktivnost“, kao što se ovde koristi u kontekstu limfocita sisara kao što su T-ćelije, odnosi se na jednu ili više od aktivnosti preživljavanja ćelija, ćelijske proliferacije, proizvodnje citokina (npr. interferon-gama) ili T-ćelijske citotoksičnosti. U nekim slučajevima, imunološka aktivnost može da označava ćelijsku ekspresiju citokina, kao što su hemokini i interleukini. Testovi za određivanje povećanja ili potiskivanja imunološke aktivnosti uključuju testove MLR (reakcija pomešanih limfocita) koji mere nivoe citokina interferona-gama u supernatantima za uzgajanje (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56), SEB (stafilokokni enterotoksin B) test stimulacije T-ćelija (Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56), i test anti-CD3 stimulacije T-ćelija (Li i Kurlander, J Transl Med.2010: 8: 104). Pošto je aktivacija T-ćelija povezana sa izlučivanjem citokina IFN-gama, detekcija nivoa IFN-gama u supernatantima za uzgajanje u in vitro testovima humanih T-ćelija može da se izvrši koristeći komercijalne ELISA komplete (Wu et al, Immunol Lett 2008 Apr 15; 117(1): 57-62). Indukcija imunskog odgovora dovodi do povećanja imunološke aktivnosti u odnosu na limfocite u stanju mirovanja.

Imunomodulatorni protein, kao što je varijanta polipeptida PD-L1 koji sadrži afinitetno modifikovani domen IgSF, kao što je ovde obezbeđeno, u nekim otelotvorenjima može da poveća ili, u alternativnim otelotvorenjima, da smanji ekspresiju IFN-gama (interferon-gama) u testu primarnih T-ćelija u poređenju sa članom IgSF divljeg tipa ili kontrolnim domenom IgSF. Stručnjacima će biti jasno da format testa primarnih T-ćelija koji se koristi za određivanje povećanja ekspresije IFN-gama može da se razlikuje od onog koji se koristi da se testira smanjenje ekspresije IFN-gama. Za testiranje sposobnosti imunomodulatornog proteina ili afinitetno modifikovanog domena IgSF iz pronalaska da izmeni ekspresiju IFN-gama u testu primarnih T-ćelija, može da se koristi test reakcije pomešanih limfocita (MLR). U nekim slučajevima, rastvorljivi oblik afinitetno modifikovanog domena IgSF iz pronalaska pogodno može da se koristi za određivanje njegove sposobnosti da poveća ili smanji ekspresiju IFN-gama u MLR. Alternativno može da se koristi test koimobilizacije. U testu koimobilizacije, signal T-ćelijskog receptora, koji u nekim otelotvorenjima obezbeđuje anti-CD3 antitelo, koristi se zajedno sa koimobilisanim afinitetno modifikovanim domenom IgSF, kao što je varijanta PD-L1, da se odredi sposobnost da se poveća ili smanji ekspresija IFNgama u poređenju sa kontrolnim domenom IgSF divljeg tipa. Postupci za testiranje imunološke aktivnosti konstruisanih ćelija, uključujući i procenu aktivnosti varijante transmembranskog imunomodulatornog proteina PD-L1, poznati su u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, sposobnost ekspanzije T-ćelija nakon antigenske stimulacije, održavanje ekspanzije T-ćelija u odsustvu ponovne stimulacije i antikancerske aktivnosti na odgovarajućim životinjskim modelima. Testovi takođe uključuju testove za procenu citotoksičnosti, uključujući standardni test oslobađanja<51>Cr (vidite, npr. Milone et al., (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464) ili testove citotoksičnosti na bazi protoka, ili test citotoksičnosti na bazi impedanse (Peper et al. (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198).

[0101] „Imunomodulatorni polipeptid“ ili „imunomodulatorni protein“ je molekul polipeptida ili proteina koji modulira imunološku aktivnost. Pod „modulacijom“ ili „moduliranjem“ imunskog odgovora misli se na to da je imunološka aktivnost povećana ili smanjena. Imunomodulatorni protein može biti jedan polipeptidni lanac ili multimer (dimeri ili viši multimeri) najmanje dva polipeptidna lanca međusobno kovalentno vezana, na primer, pomoću međulančanih disulfidnih veza. Tako, monomerni, dimerni i viši multimerni polipeptidi su obuhvaćeni definisanim terminom. Multimerni polipeptidi mogu biti homomultimerni (od identičnih polipeptidnih lanaca) ili heteromultimerni (od neidentičnih polipeptidnih lanaca). Imunomodulatorni protein iz pronalaska sadrži varijantu PD-L1.

[0102] Termin „povećanje“, kao što se ovde koristi, označava povećanje za statistički značajan iznos. Povećanje može biti najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, ili veće od kontrolne vrednosti koja nije nula.

[0103] „Izooblik“ PD-L1 je jedan od više prirodnih polipeptida PD-L1 koji se razlikuju po aminokiselinskoj sekvenci. Izooblici mogu biti proizvod spojenih varijanti transkripta RNK koje eksprimira jedan gen, ili proizvod ekspresije veoma sličnih ali ipak različitih gena koja daje funkcionalno sličan protein, što može da se desi usled duplikacije gena. Kao što se ovde koristi, termin „izooblik“ PD-L1 takođe se odnosi na proizvod različitih alela gena PD-L1.

[0104] Termin „limfocit“, kao što se ovde koristi, označava bilo koji od tri podvrste belih krvnih zrnaca u imunskom sistemu sisara. To uključuje ćelije prirodne ubice (NK ćelije) (koje funkcionišu u ćelijski posredovanom, citotoksičnom urođenom imunitetu), T ćelije (za ćelijski posredovan, citotoksični adaptivni imunitet) i B- ćelije (za humoralni, adaptivni imunitet kontrolisan antitelom). T-ćelije uključuju: T pomoćne ćelije, citotoksične T ćelije, T-ćelije prirodne ubice, memorijske T-ćelije, regulatorne T-ćelije ili gama delta T-ćelije.

Urođene limfoidne ćelije (ILC) takođe su obuhvaćene definicijom limfocita.

[0105] Termini „sisar“ ili „pacijent“ specifično obuhvataju upućivanje najmanje na jedno od: čoveka, šimpanze, rezus majmuna, cinomolgus majmuna, psa, mačke, miša ili pacova.

[0106] Termin „membranski protein“, kao što se ovde koristi, označava protein koji se, u fiziološkim uslovima, vezuje neposredno ili posredno za lipidni dvosloj. Lipidni dvosloj koji gradi membranu može biti biološka membrana kao što je eukariotska (npr. sisarska) ćelijska membrana ili veštačka (tj. ljudska tvorevina) membrana kao što je ona koja se može naći na lipozomu. Vezivanje membranskog proteina za lipidni dvosloj može biti putem kovalentnog vezivanja, ili putem nekovalentnih interakcija, kao što su hidrofobne ili elektrostatičke interakcije. Membranski protein može biti integralni membranski protein ili periferni membranski protein. Membranski proteini koji su periferni membranski proteini su nekovalentno vezani za lipidni dvosloj ili nekovalentno vezani za integralni membranski protein. Periferni membranski protein gradi privremenu vezu sa lipidnim dvoslojem tako da, u rasponu uslova koji su fiziološki kod sisara, periferni membranski protein može da se asocira i/ili disocira od lipidnog dvosloja. Za razliku od perifernih membranskih proteina, integralni membranski proteini grade suštinski trajnu vezu sa lipidnim dvoslojem membrane tako da, u rasponu uslova koji su fiziološki kod sisara, integralni membranski proteini se ne disociraju od lipidnog dvosloja. Membranski protein može da gradi vezu sa membranom preko jednog sloja lipidnog dvosloja (monotopski) ili je vezan preko oba sloja membrane (politopski). Integralni membranski protein koji interaguje sa samo jednim lipidnim dvoslojem je „integralni monotopski protein“. Integralni membranski protein koji interaguje sa oba lipidna dvosloja je „integralni politopski protein“ koji se ovde alternativno naziva „transmembranski protein“.

[0107] Termini „modulacija“ ili „modulira“ kao što se ovde koriste u kontekstu imunskog odgovora, kao što je imunski odgovor sisara, odnose se na bilo koju izmenu, kao što je povećanje ili smanjenje, postojećih ili potencijalnih imunskih odgovora koji se javljaju kao rezultat primene imunomodulatornog polipeptida koji sadrži varijantu PD-L1 iz predmetnog pronalaska ili kao rezultat primene konstruisanih ćelija koje eksprimiraju imunomodulatorni protein, kao što je varijanta transmembranskog proteina PD-L1 iz predmetnog pronalaska. Tako, termin se odnosi na izmenu, kao što je povećanje ili smanjenje, imunskog odgovora u poređenju sa imunskim odgovorom koji se javlja ili je prisutan u odsustvu primene imunomodulatornog proteina koji sadrži varijantu PD-L1 ili ćelija koje eksprimiraju takav imunomodulatorni polipeptid. Takva modulacija obuhvata bilo kakvu indukciju, aktivaciju, potiskivanje ili izmenu do određenog stepena ili nivoa imunološke aktivnosti imunske ćelije. Imunske ćelije uključuju B ćelije, T ćelije, NK ćelije (prirodne ubice), NK T ćelije, profesionalne antigen prezentujuće ćelije (APC) i neprofesionalne antigen prezentujuće ćelije, i inflamatorne ćelije (neutrofile, makrofage, monocite, eozinofile i bazofile).

Modulacija obuhvata sve promene postojećeg imunskog odgovora, nastanak imunskog odgovora, potencijalni imunski odgovor, ili sposobnost indukcije, regulacije, uticaja ili odgovora na imunski odgovor. Modulacija uključuje svaku izmenu ekspresije i/ili funkcije gena, proteina i/ili drugih molekula u imunskim ćelijama u okviru imunskog odgovora.

Modulacija imunskog odgovora ili modulacija imunološke aktivnosti uključuje, na primer, sledeće: eliminaciju, deleciju ili sekvestraciju imunskih ćelija; indukciju ili stvaranje imunskih ćelija koje mogu da modulišu funkcionalni kapacitet drugih ćelija kao što su autoreaktivni limfociti, antigen prezentujuće ćelije, ili inflamatorne ćelije; indukciju neresponsivnog stanja kod imunskih ćelija (tj. anergije); povećanje ili potiskivanje aktivnosti ili funkcije imunskih ćelija, uključujući, bez ograničenja, izmenu obrasca proteina koje ove ćelije eksprimiraju. Primeri uključuju izmenjenu proizvodnju i/ili izlučivanje određenih klasa molekula, kao što su citokini, hemokini, faktori rasta, faktori transkripcije, kinaze, kostimulatorni molekuli ili drugi receptori ćelijske površine ili bilo koja kombinacija ovih modulatornih događaja. Modulacija može da se proceni, na primer, izmenom ekspresije IFN-gama (interferon gama) u poređenju sa kontrolom PD-L1 divljeg tipa u testu primarnih T-ćelija (vidite, Zhao i Ji, Exp Cell Res. 2016 Jan1; 340(1): 132-138). Modulacija može da se proceni, na primer, izmenom imunološke aktivnosti konstruisanih ćelija, kao što je izmena citotoksične aktivnosti konstruisanih ćelija ili izmena izlučivanja citokina konstruisanih ćelija u odnosu na ćelije konstruisane sa transmembranskim proteinom PD-L1 divljeg tipa

[0108] Termin „molekulske vrste“, kao što se ovde koristi, odnosi se na skup proteina sa identičnom ili suštinski identičnom primarnom aminokiselinskom sekvencom. Svaki član superfamilije imunoglobulina (IgSF) sisara definiše skup identičnih ili suštinski identičnih molekulskih vrsta. Tako, na primer, humani PD-L1 je član IgSF i svaki humani molekul PD-L1 je molekulska vrsta PD-L1. Može doći do varijacija između molekula koji pripadaju istoj

4

molekulskoj vrsti usled razlika u posttranslacionoj modifikaciji, kao što je glikozilacija, fosforilacija, ubikvitinacija, nitrozilacija, metilovanje, acetilovanje i lipidacija. Pored toga, manje razlike sekvence u okviru jedne vrste molekula usled polimorfizma gena predstavljaju još jedan oblik varijacije u okviru jedne molekulske vrste, kao i skraćeni oblici jedne molekulske vrste divljeg tipa, na primer, usled proteolitičkog cepanja. „Molekulska vrsta na ćelijskoj površini“ je molekulska vrsta koja se eksprimira na površini ćelije sisara. Kaže se da su dve ili više različitih vrsta proteina u „cis“ ili „cis konfiguraciji“ jedna prema drugoj kada je svaka prisutna isključivo na jednoj ili isključivo na drugoj ćeliji sisara koje grade IS (ali ne na obe). Kaže se da su dve različite vrste proteina u „trans“ ili „trans konfiguraciji“ kada je prva prisutna isključivo na jednoj od dve ćelije sisara koje grade IS, a druga je prisutna isključivo na drugoj od dve ćelije sisara koje grade IS. Dve različite vrste proteina, pri čemu je svaka prisutna na obe ćelije sisara koje grade IS, nalaze se u cis i trans konfiguraciji na ovim ćelijama.

[0109] Termin „domen multimerizacije“ označava sekvencu aminokiselina koja promoviše stabilnu interakciju molekula polipeptida sa jednim ili više dodatnih molekula polipeptida, pri čemu svaki sadrži komplementarni domen multimerizacije (npr. prvi domen multimerizacije i drugi domen multimerizacije), koji može biti isti ili različit domen multimerizacije.

Interakcija između komplementarnih domena multimerizacije, npr. interakcija između prvog domena multimerizacije i drugog domena multimerizacije, gradi stabilnu interakciju proteinprotein dajući multimer molekula polipeptida sa dodatnim molekulom polipeptida. U nekim slučajevima, domen multimerizacije je isti i interaguje sa samim sobom dajući stabilnu interakciju protein-protein između dva polipeptidna lanca. Generalno, polipeptid je vezan neposredno ili posredno sa domenom multimerizacije. Primeri za domene multimerizacije uključuju sekvence imunoglobulina ili njihove delove, leucinske zatvarače, hidrofobne regione, hidrofilne regione i domene kompatibilne interakcije protein-protein. Domen multimerizacije, na primer, može biti konstantni region ili domen imunoglobulina, kao što je, na primer, Fc domen ili njegovi delovi iz IgG, uključujući podvrste IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4, IgA, IgE, IgD i IgM i njihove modifikovane oblike.

[0110] Termini „nukleinska kiselina“ i „polinukleotid“ koriste se naizmenično da se označi polimer ostataka nukleinske kiseline (npr. dezoksiribonukleotidi ili ribonukleotidi) u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Osim ako nije specifično naglašeno, termini obuhvataju nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida i koje imaju njima slične osobine vezivanja i metabolišu se slično prirodnim nukleotidima. Osim ako nije drugačije naznačeno, konkretna sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante (npr. supstitucije degenerativnih kodona) i komplementarne nukleotidne sekvence, kao i sekvencu koja je izričito naznačena („referentna sekvenca“). Konkretno, supstitucije degenerativnih kodona mogu da se postignu stvaranjem sekvenci u kojima je treća pozicija jednog ili više (ili svih) izabranih kodona supstituisana ostacima mešovite baze i/ili dezoksi inozina. Termin nukleinska kiselina ili polinukleotid obuhvata kDNK ili iRNK kodiranu genom.

[0111] Termin „nekompetitivno vezivanje“, kao što se ovde koristi, označava sposobnost proteina da se istovremeno specifično vezuje za najmanje dva srodna vezujuća partnera. Tako, protein može da se vezuje za najmanje dva različita srodna vezujuća partnera u isto vreme, iako interakcija vezivanja ne mora biti u istom trajanju tako da je, u nekim slučajevima, protein specifično vezan samo sa jednim od srodnih vezujućih partnera. U nekim otelotvorenjima, vezivanje se odvija u specifičnim uslovima vezivanja. U nekim otelotvorenjima, istovremeno vezivanje je takvo da vezivanje jednog srodnog partnera značajno ne inhibira istovremeno vezivanje za drugog srodnog vezujućeg partnera. U nekim otelotvorenjima, nekompetitivno vezivanje znači da se vezivanjem drugog srodnog vezujućeg partnera za mesto vezivanja na proteinu ne premešta vezivanje prvog srodnog vezujućeg partnera za mesto na proteinu. Postupci za procenu nekompetitivnog vezivanja su dobro poznati u struci, kao što je postupak opisan u Perez de La Lastra et al., Immunology, 1999 Apr: 96(4): 663-670. U nekim slučajevima, u nekompetitivnim interakcijama, prvi srodni vezujući partner specifično se vezuje na mestu interakcije koje se ne preklapa sa mestom interakcije drugog srodnog vezujućeg partnera, tako da vezivanje drugog srodnog vezujućeg partnera ne ometa direktno vezivanje prvog srodnog vezujućeg partnera. Tako, bilo koji uticaj vezivanja srodnog vezujućeg partnera usled vezivanja drugog srodnog vezujućeg partnera je preko mehanizma koji nije direktno ometanje vezivanja prvog srodnog vezujućeg partnera. Na primer, u kontekstu interakcija enzima i supstrata, nekompetitivni inhibitor se vezuje za mesto koje nije aktivno mesto enzima. Nekompetitivno vezivanje uključuje interakcije nekompetitivnog vezivanja u kojima se drugi srodni vezujući partner specifično vezuje na mestu interakcije koje se ne preklapa sa vezivanjem prvog srodnog vezujućeg partnera ali se vezuje na drugom mestu interakcije samo kada je prvo mesto interakcije zauzeto od strane prvog srodnog vezujućeg partnera.

[0112] Termin „farmaceutska kompozicija“ odnosi se na kompoziciju koja je pogodna za farmaceutsku upotrebu kod ispitanika sisara, često čoveka. Farmaceutska kompozicija tipično sadrži delotvornu količinu aktivnog agensa (npr. imunomodulaturni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 ili konstruisane ćelije koje eksprimiraju varijantu PD-L1 transmembranskog imunomodulatornog proteina) i nosač, ekscipijens ili razblaživač. Nosač, ekscipijens ili razblaživač je obično farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens, odnosno razblaživač.

[0113] Termini „polipeptid“ i „protein“ ovde se koriste naizmenično i označavaju lanac molekula od dve ili više aminokiselina povezanih preko peptidnih veza. Termini se ne odnose na određenu dužinu proizvoda. Tako, definicijom polipeptida su obuhvaćeni „peptidi“ i „oligopeptidi“. Termini uključuju posttranslacione modifikacije polipeptida, na primer, glikozilacije, acetilovanja, fosforilacije, i slično. Termini takođe uključuju molekule u kojima se može nalaziti jedan ili više analoga aminokiselina ili nekanonskih ili neprirodnih aminokiselina koji mogu da se sintetišu ili rekombinantno eksprimiraju koristeći poznate tehnike za konstrukciju proteina. Pored toga, proteini mogu biti derivatizovani.

[0114] Termin „test primarnih T-ćelija“, kao što se ovde koristi, označava in vitro test za merenje ekspresije interferona-gama („IFN-gama“). Brojni takvi testovi za primarne T-ćelije su poznati u struci. U poželjnom otelotvorenju, test koji se koristi je test anti-CD3 koimobilizacije. U ovom testu, primarne T-ćelije se stimulišu pomoću anti-CD3 koji je imobilisan sa dodatnim rekombinantnim proteinima ili bez njih. Supernatanti kulture se sakupljaju u određenim terminima, obično 24-72 sata. U drugom otelotvorenju, test koji se koristi je MLR. U ovom testu, primarne T-ćelije se stimulišu alogenim APC. Supernatanti kulture se sakupljaju u određenim terminima, obično 24-72 sata. Nivoi humanog IFN-gama se mere u supernatantu kulture koristeći standardne ELISA tehnike. Komercijalni kompleti su dostupni od dobavljača, i test se obavlja u skladu sa preporukama proizvođača.

[0115] Termin „prečišćen“ koji se koristi za nukleinske kiseline, kao što su one koje kodiraju imunomodulatorne proteine iz pronalaska, generalno označava nukleinsku kiselinu ili polipeptid koji suštinski nema druge komponente, kao što je utvrđeno analitičkim tehnikama koje su dobro poznate u struci (npr. prečišćeni polipeptid ili polinukleotid formira odvojenu traku u gelu za elektroforezu, hromatografskom eluatu i/ili medijumima podvrgnutim gradijentnom centrifugiranju). Na primer, nukleinska kiselina ili polipeptid koji daju suštinski jednu traku u gelu za elektroforezu su „prečišćeni“. Prečišćena nukleinska kiselina ili protein

4

iz pronalaska su najmanje oko 50% čisti, obično najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 99% ili više čisti (npr. procenat na bazi mase ili mola).

[0116] Termin „rekombinantno“ pokazuje da je supstanca (npr. nukleinska kiselina ili polipeptid) veštački (tj. neprirodno) izmenjena ljudskom intervencijom. Izmena može da se obavi na supstanci u njenom prirodnom okruženju ili stanju, ili izvan njih. Na primer, „rekombinantna nukleinska kiselina“ je nukleinska kiselina napravljena rekombinacijom nukleinskih kiselina, npr. tokom kloniranja, afinitetne modifikacije, mešanja DNK, ili drugim dobro poznatim procedurama molekularne biologije. „Molekul rekombinantne

DNK“ sačinjen je od segmenata DNK koji su međusobno vezani pomoću takvih tehnika molekularne biologije. Termin „rekombinantni protein“ ili „rekombinantni polipeptid“, kao što se ovde koristi, označava molekul proteina koji se eksprimira koristeći molekul rekombinantne DNK. „Rekombinantna ćelija domaćin“ je ćelija koja sadrži i/ili eksprimira rekombinantnu nukleinsku kiselinu ili koja je na drugi način izmenjena genetskim inženjeringom, kao što je uvođenje u ćeliju molekula nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni protein, kao što je transmembranski imunomodulatorni protein koji je ovde obezbeđen. Signali za kontrolu transkripcije kod eukariota sadrže elemente nazvane „promoter“ i „pojačivač“. Promoteri i pojačivači se sastoje od kratkih nizova sekvenci DNK koje specifično interaguju sa ćelijskim proteinima koji učestvuju u transkripciji. Elementi promoteri i pojačivači su izolovani iz različitih eukariotskih izvora, uključujući gene u ćelijama kvasaca, insekata i sisara i viruse (analogni kontrolni elementi, tj. promoteri, takođe su otkriveni kod prokariota). Odabir konkretnog promotera i pojačivača zavisi od vrste ćelije koja će se koristiti za ekspresiju proteina od interesa. Termini „u operativnoj kombinaciji“, „po operativnom redosledu“ i „operativno vezano“, kao što se ovde koriste, označavaju vezu sekvenci nukleinskih kiselina na takav način ili sa takvom orijentacijom da se proizvede molekul nukleinske kiseline koji može da usmerava transkripciju datog gena i/ili sintezu molekula željenog proteina.

[0117] Termini „rekombinantni ekspresioni vektor“, kao što se ovde koristi, označava molekul DNK koji sadrži željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u konkretnoj ćeliji domaćinu. Sekvence nukleinske kiseline neophodne za ekspresiju kod prokariota uključuju promoter, opciono sekvencu operatora, mesto vezivanja ribozoma, a moguće i druge sekvence. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotere, pojačivače i signale za terminaciju i poliadenilaciju. Sekretorna signalna peptidna sekvenca može takođe, opciono, biti kodirana putem rekombinantnog ekspresionog vektora, operativno vezanog sa kodirajućom sekvencom za rekombinantni protein, kao što je rekombinantni fuzioni protein, tako da eksprimirani fuzioni protein može da se izluči iz rekombinantne ćelije domaćina, radi lakšeg izolovanja fuzionog proteina iz ćelije, ako se to želi. Ovaj termin uključuje vektor kao samoreplikujuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor koji je inkorporisan u genom ćelije domaćina u koju je uveden. U vektore spadaju virusni vektori, kao što su lentivirusni vektori.

[0118] Termin „selektivnost“ odnosi se na preferencu predmetnog proteina, ili polipeptida, za specifično vezivanje jednog supstrata, kao što je jedan srodan vezujući partner, u poređenju sa specifičnim vezivanjem za drugi supstrat, kao što je drugi srodni vezujući partner predmetnog proteina. Selektivnost može da se vidi kao odnos aktivnosti vezivanja (npr. afinitet vezivanja) predmetnog proteina i prvog supstrata, kao što je prvi srodni vezujući partner (npr. Kd1) i aktivnosti vezivanja (npr. afinitet vezivanja) istog predmetnog proteina sa drugim srodnim vezujućim partnerom (npr. Kd2).

[0119] Termin „identičnost sekvence“, kao što se ovde koristi, označava identičnost sekvence između gena ili proteina na nivou nukleotida, odnosno aminokiselina. „Identičnost sekvence“ je mera identičnosti između proteina na nivou aminokiselina i mera identičnosti između nukleinskih kiselina na nivou nukleotida. Identičnost sekvence proteina može da se utvrdi poređenjem aminokiselinske sekvence na datoj poziciji svake sekvence kada su sekvence poravnate. Slično tome, identičnost sekvence nukleinskih kiselina može da se utvrdi poređenjem nukleotidne sekvence na datoj poziciji svake sekvence kada su sekvence poravnate. Postupci za poravnavanje sekvenci za poređenje su dobro poznati u struci, i takvi postupci uključuju GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA i TFASTA. Algoritam BLAST izračunava procenat identičnosti sekvence i vrši statističku analizu sličnosti između dve sekvence. Softver za sprovođenje BLAST analize je javno dostupan preko veb stranice Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI).

[0120] Termin „rastvorljiv“, kao što se ovde koristi u vezi sa proteinima, znači da protein nije membranski protein. Uopšteno, rastvorljivi protein sadrži samo ekstracelularni domen receptora člana familije IgSF, ili njegov deo koji sadrži domen ili domene IgSF ili njihove specifične vezujuće fragmente, ali ne sadrži transmembranski domen. U nekim slučajevima,

4

rastvorljivost proteina može da se poboljša vezivanjem, neposredno ili posredno preko linkera, za Fc domen, koji, u nekim slučajevima, takođe može da poboljša stabilnost i/ili poluživot proteina. U nekim aspektima, rastvorljivi protein je Fc fuzioni protein.

[0121] Termin „vrste“, kao što se ovde koristi u vezi sa polipeptidima ili nukleinskim kiselinama, označava skup molekula sa identičnim ili suštinski identičnim sekvencama. Može doći do varijacija između polipeptida koji pripadaju istim vrstama usled razlika u posttranslacionoj modifikaciji, kao što je glikozilacija, fosforilacija, ubikvitinacija, nitrozilacija, metilovanje, acetilovanje i lipidacija. Malo skraćene sekvence polipeptida koje se razlikuju (ili imaju drugačije kodiranje) od vrsta kompletne dužine na amino terminusu ili karboksi terminusu za najviše 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostataka smatraju se istom vrstom. Takve mikroheterogenosti su uobičajena karakteristika proizvedenih proteina.

[0122] Termin „specifično vezuje“, kao što se ovde koristi, označava sposobnost proteina da se, u specifičnim uslovima vezivanja, vezuje za ciljni protein tako da je njegov afinitet ili avidnost najmanje 5 puta veći, ali opciono najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 ili 500 puta veći, ili čak najmanje 1000 puta veći u odnosu na prosečni afinitet ili avidnost istog proteina prema skupu nasumičnih peptida ili polipeptida koji ima dovoljnu statističku veličinu.

Specifično vezujući protein ne mora da se vezuje isključivo za jedan ciljni molekul, ali može specifično da se vezuje za neciljni molekul usled sličnosti strukturne konformacije između cilja i necilja (npr. paralozi ili ortolozi). Stručnjacima će biti jasno da je specifično vezivanje za molekul koji ima istu funkciju kod različite životinjske vrste (tj. ortolog) ili neciljni molekul koji ima suštinski sličan epitop kao ciljni molekul (npr. paralog) moguće i da ono ne umanjuje specifičnost vezivanja koja je utvrđena u odnosu na statistički validan skup jedinstvenih neciljeva (npr. nasumični polipeptidi). Tako, polipeptid iz pronalaska može specifično da se vezuje za više od jedne različite vrste ciljnih molekula usled unakrsne reaktivnosti. ELISA imunološki testovi u čvrstoj fazi, ForteBio Octet ili Biacore merenja mogu da se koriste za utvrđivanje specifičnog vezivanja između dva proteina. Uopšteno, interakcije između dva vezujuća proteina imaju konstantu disocijacije (Kd) manju od 1×10<-5>M, a često čak i samo 1 × 10<-12>M. U određenim otelotvorenjima predmetnog otkrića, interakcije između dva vezujuća proteina imaju konstantu disocijacije manju od ili manju od oko 1×10<-6>M, 1×10<-7>M, 1×10<-8>M, 1×10<-9>M, 1×10<-10>M ili 1×10<-11>M ili manje.

4

[0123] Termini „površinski eksprimira“ ili „površinska ekspresija“ u vezi sa ćelijom sisara koja eksprimira polipeptid znače da se polipeptid eksprimira kao membranski protein. U nekim otelotvorenjima, membranski protein je transmembranski protein.

[0124] Kao što se ovde koristi, „sintetički“, koji označava, na primer, molekul sintetičke nukleinske kiseline ili sintetički gen ili sintetički peptid odnosi se na molekul nukleinske kiseline ili molekul polipeptida koji je proizveden rekombinantnim postupcima i/ili postupcima hemijske sinteze.

[0125] Termin „ciljajući ostatak“, kao što se ovde koristi, označava kompoziciju koja je kovalentno ili nekovalentno vezana sa polipeptidom koji sadrži varijantu PD-L1 iz predmetnog pronalaska, ili ga fizički enkapsulira. Ciljajući ostatak ima specifičan afinitet vezivanja prema željenoj kontrastrukturi kao što je receptor ćelijske površine (npr. PD-1) ili tumorski antigen, kao što je specifični antigen tumora (TSA) ili antigen povezan sa tumorom (TAA), kao što je B7-H6. Željena kontrastruktura je tipično locirana na specifičnom tkivu ili vrsti ćelija. Ciljajući ostaci uključuju: antitela, antigen vezujuće fragmente (Fab), varijabilni fragment (Fv) koji sadrži VHi VL, jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji sadrži VHi VLmeđusobno vezane u jednom lancu, kao i druge fragmente V regiona antitela, kao što su Fab', F(ab)2, F(ab')2, dsFv dijatelo, nanotela, rastvorljivi receptori, receptorski ligandi, afinitetno sazreli receptori ili ligandi, kao i kompozicije malih molekula (<500 daltona) (npr. kompozicije specifičnih vezujućih receptora). Ciljajući ostaci takođe mogu biti kovalentno ili nekovalentno vezani sa lipidnom membranom lipozoma koji enkapsuliraju polipeptid iz predmetnog pronalaska.

[0126] Termin „transmembranski protein“, kao što se ovde koristi, označava membranski protein koji suštinski ili u potpunosti obuhvata lipidni dvosloj, kao što su lipidni dvoslojevi koji se mogu naći u biološkoj membrani kao što je ćelija sisara, ili je veštački konstrukt kao što je lipozom. Transmembranski protein sadrži transmembranski domen („transmembranski domen“) preko koga je integrisan u lipidni dvosloj i zahvaljujući kome je ta integracija termodinamički stabilna u fiziološkim uslovima. Transmembranski domeni generalno mogu da se predvide na osnovu njihove aminokiselinske sekvence pomoću brojnih komercijalno dostupnih bioinformatičkih softverskih aplikacija na osnovu njihove povećane hidrofobnosti u odnosu na regione proteina koji interaguju sa vodenim okruženjem (npr. citosol, ekstracelularna tečnost). Transmembranski domen je često hidrofobni alfa heliks koji se

4

proteže duž membrane. Transmembranski protein može da prođe kroz oba sloja lipidnog dvosloja jednom ili više puta. Transmembranski protein uključuje obezbeđene transmembranske imunomodulatorne proteine koji su ovde opisani. Pored transmembranskog domena, transmembranski imunomodulatorni protein iz pronalaska dalje sadrži ektodomen i, u nekim otelotvorenjima, endodomen.

[0127] Termini „lečenje“, „tretman“ ili „terapija“ bolesti ili poremećaja, kao što se ovde koriste, znače usporavanje, zaustavljanje ili preokretanje progresije bolesti ili stanja, što se može videti na osnovu smanjenja, prekida ili eliminacije kliničkih ili dijagnostičkih simptoma, putem primene terapeutske kompozicije (npr. koja sadrži imunomodulatorni protein ili konstruisane ćelije) iz pronalaska, samostalno ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjem, kao što je ovde opisano. „Lečenje“, „tretman“ ili „terapija“ takođe znači smanjenje težine simptoma kod akutne ili hronične bolesti ili poremećaja ili smanjenje brzine relapsa, na primer, u slučaju toka relapsne ili remitentne autoimunske bolesti, ili smanjenje inflamacije u slučaju inflamatornog aspekta autoimune bolesti. Kao što se ovde koriste u kontekstu kancera, termini „lečenje“ ili „inhibicija“ ili „inhibiranje“ kancera označavaju najmanje jedno od: statistički značajnog smanjenja brzine rasta tumora, prekida rasta tumora, smanjenja veličine, mase, metaboličke aktivnosti ili zapremine tumora, što se meri pomoću standardnih kriterijuma kao što su, bez ograničenja, kriterijumi za procenu odgovora solidnih tumora (RECIST), ili statistički značajno povećanje preživljavanja bez progresije (PFS) ili ukupnog preživljavanja (OS). „Sprečavanje“, „profilaksa“ ili „prevencija“ bolesti ili poremećaja, kao što se koristi u kontekstu ovog pronalaska, označava primenu imunomodulatornog polipeptida ili konstruisanih ćelija iz pronalaska, samostalno ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjem, za prevenciju javljanja ili nastanka bolesti ili poremećaja, ili nekih ili svih simptoma bolesti ili poremećaja, ili za smanjenje verovatnoće nastanka bolesti ili poremećaja.

[0128] Termin „specifični antigen tumora“ ili „TSA“, kao što se ovde koristi, označava kontrastrukturu koja je prisutna prvenstveno na ćelijama tumora ispitanika sisara, ali se obično ne može naći na normalnim ćelijama ispitanika sisara. Specifični antigen tumora ne mora da bude ekskluzivan za ćelije tumora, ali je procenat ćelija konkretnog sisara koje imaju specifični antigen tumora dovoljno veliki ili su nivoi specifičnog antigena tumora na površini tumora dovoljno visoki da on može da bude cilj antitumorskih lekova, kao što su imunomodulatorni polipeptidi iz pronalaska, i obezbeđuje prevenciju ili lečenje sisara od

4

dejstva tumora. U nekim otelotvorenjima, u nasumičnom statističkom uzorku ćelija sisara sa tumorom najmanje 50% ćelija koje prikazuju TSA su ćelije kancera. U drugim otelotvorenjima, najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% ćelija koje prikazuju TSA su ćelije kancera.

[0129] Termin „varijanta“ (takođe „modifikovano“ ili „mutant“), kao što se koristi za varijantu PD-L1, označava PD-L1, kao što je PD-L1 sisara (npr. čoveka ili miša), kreiran ljudskom intervencijom. Varijanta PD-L1 je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku supstituciju N45D, uzimajući u obzir numeraciju iz SEQ ID NO:30, u poređenju sa nemodifikovanim humanim PD-L1. Varijanta PD-L1 je polipeptid koji se razlikuje od nemodifikovane sekvence izooblika PD-L1 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, adicija ili njihovih kombinacija. Za svrhe ovog pronalaska, varijanta PD-L1 sadrži najmanje jedan afinitetno modifikovani domen, pri čemu se jedna ili više aminokiselinskih razlika javlja u domenu IgSF (npr. domen IgV ili ECD). Varijanta PD-L1 može da ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više aminokiselinskih razlika, kao što su aminokiselinske supstitucije. Varijanta polipeptida PD-L1 generalno pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa odgovarajućim divljim tipom ili nemodifikovanim PD-L1, recimo sa sekvencom SEQ ID NO:3, njegovom zrelom sekvencom (nema signalnu sekvencu) ili njenim delom koji sadrži ekstracelularni domen ili njen domen IgSF. U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 polipeptida pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa odgovarajućim divljim tipom ili nemodifikovanim PD-L1 koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO:30 ili 1728 ili SEQ ID NO: 55 ili 309.

Neprirodne aminokiseline i prirodne aminokiseline su obuhvaćene opsegom dozvoljenih supstitucija ili adicija. Varijanta PD-L1 nije ograničena ni na jedan konkretan postupak proizvodnje i uključuje, na primer, de novo hemijsku sintezu, de novo tehnike rekombinacije DNK, ili njihove kombinacije. Varijanta PD-L1 iz pronalaska se specifično vezuje za najmanje jedan PD-1 neke vrste sisara. U nekim otelotvorenjima, izmenjena aminokiselinska sekvenca dovodi do izmenjenog (tj. povećanog ili smanjenog) afiniteta ili avidnosti vezivanja prema PD-1 i/ili CD80 u poređenju sa divljim tipom ili nemodifikovanim proteinom PD-L1. Povećanje ili smanjenje afiniteta vezivanja ili avidnosti može da se odredi koristeći dobro poznate testove vezivanja, kao što je protočna citometrija. Larsen et al., American Journal of Transplantation, sveska 5: 443-453 (2005). Takođe, vidite Linsley et al., Immunity, sveska

4

1(9): 793-801 (1994). Povećanje afiniteta ili avidnosti vezivanja varijante PD-L1 prema PD-1 i/ili CD80 je do vrednosti koja je najmanje 5% veća nego kod divljeg tipa ili nemodifikovanog PD-L1, a, u nekim otelotvorenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% veća od vrednosti divljeg tipa ili nemodifikovane kontrole PD-L1. Smanjenje afiniteta ili avidnosti vezivanja PD-L1 prema PD-1 i/ili CD80 ide do vrednosti koja je najviše 95% vrednosti divljeg tipa ili nemodifikovane kontrole, a, u nekim otelotvorenjima, najviše 80%, 70% 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ili nema detektabilnog afiniteta ili aviditeta vezivanja u odnosu na vrednosti divljeg tipa ili nemodifikovane kontrole. Varijanta PD-L1 je izmenjena u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci putem supstitucije, adicije ili delecije aminokiselinskih ostataka. Termin „varijanta“ u kontekstu varijante PD-L1 ne treba tumačiti kao postavljanje bilo kog uslova za bilo koju konkretnu početnu kompoziciju ili postupak kojim se varijanta PD-L1 kreira. Varijanta PD-L1 može, na primer, biti dobijena polazeći od informacije o sekvenci divljeg tipa PD-L1 sisara, zatim modelovana kompjuterskom simulacijom za PD-1 i/ili CD80, i konačno rekombinantnim ili hemijskim putem sintetisana dajući varijantu PD-L1 iz predmetnog pronalaska. U samo jednom alternativnom primeru, varijanta PD-L1 može da se kreira mutagenezom usmerenom na mesto divljeg tipa PD-L1. Tako, varijanta PD-L1 označava kompoziciju i nije nužno proizvod dobijen bilo kojim datim procesom. Mogu da se koriste brojne tehnike, uključujući rekombinantne metode, hemijsku sintezu ili njihove kombinacije.

[0130] Termin „divlji tip“ ili „prirodni“ ili „nativni“, kao što se ovde koristi u vezi sa biološkim supstancama kao što su molekuli nukleinske kiseline, proteini (npr. PD-L1), članovi IgSF, ćelije domaćini i slično, označava one koje se mogu naći u prirodi i nisu modifikovane ljudskom intervencijom.

II. VARIJANTE POLIPEPTIDA PD-L1

[0131] Pored vezivanja PD-1, ovde su obezbeđene varijante polipeptida PD-L1 koje pokazuju povećani afinitet vezivanja prema jednom ili više daljih srodnih vezujućih partnera PD-L1. U nekim otelotvorenjima, srodni vezujući partner PD-L1 je CD80. Varijanta polipeptida PD-L1 sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, kao što je jedna ili više supstitucija (alternativno „mutacije“ ili „zamene“), delecija ili adicija, u domenu (IgD) superfamilije imunoglobulina (IgSF) u odnosu na divlji tip ili nemodifikovani polipeptid PD-L1 ili deo divljeg tipa ili nemodifikovanog PD-L1 koji sadrži IgD ili njegov specifični vezujući fragment. Tako, obezbeđena varijanta polipeptida PD-L1 predstavlja ili sadrži varijantu IgD (u nastavku se naziva „vIgD“), pri čemu jedna ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija) postoji u IgD.

[0132] U nekim otelotvorenjima, IgD sadrži domen IgV ili domen IgV i domen IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, IgD može biti samo IgV, kombinacija IgV i IgC, uključujući ceo ekstracelularni domen (ECD), ili bilo koja kombinacija Ig domena PD-L1. Tabela 2 daje primere za ostatke koji odgovaraju regionima IgV ili IgC PD-L1. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV ili domen IgV i domen IgC, pri čemu se najmanje jedna aminokiselinska modifikacija (npr. supstitucija) nalazi u domenu IgV. U nekim otelotvorenjima, usled izmenjenosti aktivnosti ili afiniteta vezivanja, izmenjeni domen IgV ili domen IgC (npr. IgC2) je afinitetno modifikovani domen IgSF.

[0133] U nekim otelotvorenjima, varijanta je modifikovana u još jednom domenu IgSF u odnosu na sekvencu nemodifikovanog PD-L1. U nekim otelotvorenjima, nemodifikovana sekvenca PD-L1 je PD-L1 divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, nemodifikovani ili divlji tip PD-L1 ima sekvencu nativnog PD-L1 ili njegovog ortologa. U nekim otelotvorenjima, nemodifikovani PD-L1 predstavlja ili sadrži ekstracelularni domen (ECD) PD-L1 ili njegov deo koji sadrži jedan ili više domena IgSF (vidite tabelu 2). U nekim otelotvorenjima, ekstracelularni domen nemodifikovanog ili divljeg tipa polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV i domen ili domene IgC (npr. IgC2). Međutim, varijanta polipeptida PD-L1 ne mora da sadrži i domen IgV i domen ili domene IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV ili se suštinski sastoji od njega. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži jedan ili oba domena IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV i prvi i drugi domen IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 je rastvorljiva i nema transmembranski domen. U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 dalje sadrži transmembranski domen i, u nekim slučajevima, takođe i citoplazmatski domen.

[0134] U nekim otelotvorenjima, nemodifikovana sekvenca PD-L1 ima (i) sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO:3 ili njen zreli oblik koji nema signalnu sekvencu, (ii) sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa SEQ ID NO:3

1

ili njenim zrelim oblikom, ili (iii) predstavlja deo (i) ili (ii) koji sadrži domen IgV i opciono domen IgC (npr. IgC2).

[0135] U nekim otelotvorenjima, divlji tip ili nemodifikovana sekvenca PD-L1 predstavlja ili sadrži ekstracelularni domen PD-L1 ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, nemodifikovani polipeptid ili polipeptid PD-L1 divljeg tipa sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 30 ili 1728, ili njen ortolog. U nekim slučajevima, nemodifikovani polipeptid ili polipeptid PD-L1 divljeg tipa može da sadrži (i) sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 30 ili 1728, (ii) sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 30 ili 1728, ili (iii) predstavlja specifični vezujući fragment sekvence iz (i) ili (ii) koji sadrži domen IgV ili domen IgC (npr. IgC2).

[0136] U nekim otelotvorenjima, polipeptid divljeg tipa ili nemodifikovani polipeptid PD-L1 sadrži domen IgV ili domen ili domene IgC (npr. IgC2), ili njihov specifični vezujući fragment. U nekim otelotvorenjima, IgV domen divljeg tipa ili nemodifikovanog PD-L1 polipeptida sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 55 ili 309 (odgovara aminokiselinskim ostacima 24-103 SEQ ID NO: 3), ili njen ortolog. Na primer, domen IgV nemodifikovanog polipeptida ili polipeptida PD-L1 divljeg tipa može da sadrži (i) sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 55 ili 309, (ii) sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 55 ili 309, ili (iii) specifični vezujući fragment sekvence iz (i) ili (ii). U nekim otelotvorenjem, divlji tip ili nemodifikovani domen IgV može da vezuje jedan ili više srodnih vezujućih proteina PD-L1, kao što je jedan ili više od PD-1 ili CD80.

[0137] U nekim otelotvorenjima, prvi domen IgC2 divljeg tipa ili nemodifikovanog polipeptida PD-L1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je data kao ostaci 133-225 SEQ ID NO: 3, ili njen ortolog. Na primer, domen IgC2 nemodifikovanog polipeptida ili polipeptida PD-L1 divljeg tipa može da sadrži (i) sekvencu aminokiselina koja je data kao ostaci 133-225 SEQ ID NO: 3, (ii) sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sekvence sa ostacima 133-225 SEQ ID NO: 3, ili (iii) specifični vezujući fragment iz (i) ili (ii). U nekim

2

otelotvorenjima, divlji tip ili nemodifikovani domen IgC može da vezuje jedan ili više srodnih vezujućih proteina PD-L1 pored PD-1.

[0138] U nekim otelotvorenjima, divlji tip ili nemodifikovani polipeptid PD-L1 sadrži specifični vezujući fragment PD-L1, kao što je specifični vezujući fragment domena IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, specifični vezujući fragment može da vezuje PD-1 i/ili CD80. Specifični vezujući fragment može biti dugačak najmanje 50 aminokiselina, recimo najmanje 60, 70, 80, 90, 100 ili 110 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, specifični vezujući fragment domena IgC (npr. IgC2) sadrži sekvencu aminokiselina koja je najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% dužine domena IgC datog kao aminokiseline 133-225 SEQ ID NO: 3.

[0139] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen ECD ili njegov deo koji sadrži jedan ili više afinitetno modifikovanih domena IgSF. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 može da sadrži domen IgV i opciono domen ili domene IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 može da sadrži domen IgV i domen ili domene IgC (npr. IgC2). Varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV kompletne dužine. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen ili domene IgC (npr. IgC2) kompletne dužine. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži specifičan vezujući fragment jednog ili više domena IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV kompletne dužine i domen ili domene IgC (npr. IgC2) kompletne dužine. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV kompletne dužine i specifičan vezujući fragment jednog ili više domena IgC (npr. IgC2).

[0140] U svim takvim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija) varijante polipeptida PD-L1 može da se nalazi u bilo kom pojedinačnom ili u više domena IgSF polipeptida PD-L1. Na primer, u nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija) nalazi se u ekstracelularnom domenu varijante polipeptida PD-L1. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija) nalazi se u domenu IgV. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija) nalazi se u domenu IgC (npr. IgC2) ili specifičnom vezujućem fragmentu domena IgC (npr. IgC2).

[0141] Generalno, sve različite osobine polipeptida su pojedinačno razmotrene u nastavku (npr. rastvorljivi i membranski vezani polipeptidi, afinitet PD-L1 prema PD-1 i CD80, broj varijacija po polipeptidnom lancu, broj vezanih polipeptidnih lanaca, broj i priroda aminokiselinskih izmena po varijanti PD-L1, itd.). Međutim, kao što će stručnjaku biti jasno, bilo koji konkretni polipeptid može da sadrži kombinaciju ovih nezavisnih osobina. Jasno je da je referenca na aminokiseline, uključujući određenu sekvencu datu kao SEQ ID NO, koja se koristi za opisivanje organizacije domena za domen IgSF, data samo u ilustrativne svrhe, i ne treba da ograničava opseg obezbeđenih otelotvorenja. Jasno je da su polipeptidi i opisi njihovih domena teorijski dobijeni na osnovu analize homologije i poravnavanja sa sličnim molekulima. Tako, tačan lokus može da se razlikuje, i nije nužno isti za svaki protein. Stoga, specifični domen IgSF, kao što je specifični domen IgV ili domen IgC, može biti duži ili kraći za nekoliko aminokiselina (na primer, jednu, dve, tri ili četiri).

[0142] Nadalje, različita otelotvorenja pronalaska koja su razmotrena u nastavku često su data u okviru značenja definisanih termina koje je prethodno dato. Tako, naslovi, redosled prezentovanja i različiti aspekti i otelotvorenja, kao i zasebno otkrivanje svake pojedinačne osobine, ne treba da predstavljaju ograničenje opsega predmetnog otkrića.

A. Reprezentativne modifikacije

[0143] Ovde su obezbeđene varijante polipeptida PD-L1 koje sadrže najmanje jedan afinitetno modifikovan domen IgV u odnosu na domen IgV koji je sadržan u nemodifikovanom polipeptidu PD-L1 tako da varijanta PD-L1 pokazuje povećani afinitet vezivanja prema PD-1 u poređenju sa nemodifikovanim humanim polipeptidom PD-L1. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima afinitet vezivanja prema PD-1 ili PD-1 i CD80 koji se razlikuje od kontrolne sekvence nemodifikovanog polipeptida PD-L1, kako je utvrđeno, na primer, ELISA imunološkim testovima čvrste faze, protočnom citometrijom, pomoću ForteBio Octet ili Biacore testova. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima povećani afinitet vezivanja prema PD-1 i CD80. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima smanjeni afinitet vezivanja prema CD80, u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1.

[0144] Afiniteti vezivanja za svakog od srodnih vezujućih partnera su nezavisni, to jest, u nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima povećani afinitet vezivanja prema

4

PD-1 i CD80, ili smanjeni afinitet vezivanja prema CD80, u odnosu na nemodifikovani polipeptid PD-L1.

[0145] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima povećani afinitet vezivanja prema CD80, u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima smanjeni afinitet vezivanja prema CD80, u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1.

[0146] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima povećani afinitet vezivanja prema PD-1 i CD80, u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima povećani afinitet vezivanja prema PD-1 i smanjeni afinitet vezivanja prema CD80, u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1.

[0147] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sa povećanim ili većim afinitetom vezivanja prema PD-1 i opciono CD80 imaće povećan afinitet vezivanja u odnosu na kontrolni nemodifikovani polipeptid PD-L1 od najmanje oko 5%, recimo najmanje oko 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, ili 50% za PD-1 i/ili CD80. U nekim otelotvorenjima, povećanje afiniteta vezivanja u odnosu na divlji tip ili nemodifikovani polipeptid PD-L1 je veće od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta. U takvim primerima, nemodifikovani polipeptid PD-L1 ima istu sekvencu kao varijanta polipeptida PD-L1, osim što ne sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija).

[0148] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sa redukovanim ili smanjenim afinitetom vezivanja prema CD80 imaće smanjen afinitet vezivanja u odnosu na kontrolni nemodifikovani polipeptid PD-L1 od najmanje 5%, recimo najmanje oko 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više za CD80. U nekim otelotvorenjima, smanjenje afiniteta vezivanja u odnosu na nemodifikovani PD-L1 polipeptid veće je od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta. U takvim primerima, nemodifikovani polipeptid PD-L1 ima istu sekvencu kao varijanta polipeptida PD-L1, osim što ne sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija).

[0149] U nekim otelotvorenjima, ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) bilo kog od prethodnih otelotvorenja za PD-1 i/ili CD80 može biti manja od 1×10<-5>M, 1×10<-6>M, 1×10<-7>M, 1×10<-8>M, 1×10<-9>M, 1×10<-10>M ili 1×10<-11>M, ili 1×10<-12>M ili manja.

[0150] Nemodifikovana sekvenca PD-L1 ne mora nužno da se koristi kao polazna kompozicija za dobijanje varijanti polipeptida PD-L1 koje su ovde opisane. Stoga, korišćenje termina „modifikacija“, kao što je „supstitucija“, ne ukazuje na to da su predmetna otelotvorenja ograničena na određeni postupak za proizvodnju varijanti polipeptida PD-L1. Varijante polipeptida PD-L1 mogu da se proizvedu, na primer, de novo sintezom peptida i tako ne zahtevaju nužno modifikaciju, kao što je „supstitucija“, za izmenu kodona da kodira modifikaciju, npr. supstituciju. Ovaj princip takođe važi za termine „adicija“ ili „delecija“ aminokiselinskog ostatka, koji takođe ne ukazuju na određeni postupak proizvodnje. Način na koji se varijante polipeptida PD-L1 konstruišu ili proizvode nije ograničen ni na jedan određeni postupak. Međutim, u nekim otelotvorenjima, divlji tip ili nemodifikovani PD-L1 koji kodira nukleinsku kiselinu mutagenizuje se od genetskog materijala divljeg tipa ili nemodifikovanog PD-L1 i ispituje se na željeni specifični afinitet vezivanja i/ili indukciju ekspresije IFN-gama ili drugu funkcionalnu aktivnost. U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 polipeptida se sintetiše de novo koristeći protein ili sekvence nukleinskih kiselina dostupne u brojnim javno dostupnim bazama podataka, i nakon toga se ispituje. Nacionalni centar za biotehnološke informacije pruža takve informacije, i njegova veb stranica je javno dostupna putem interneta, kao što je slučaj i sa bazom podataka UniProtKB koja je prethodno razmotrena.

[0151] Osim ako nije drugačije navedeno, kao što je naznačeno u predmetnom otkriću, aminokiselinske modifikacije su naznačene brojem pozicije aminokiseline koji odgovara numeraciji pozicija nemodifikovane sekvence ECD koja je data u SEQ ID NO:30 ili 1728 ili, takođe, gde je to primenljivo, nemodifikovane sekvence IgV koja je data u SEQ ID NO: 309 (sadrži ostatke 1-114 SEQ ID NO:30) na sledeći način:

[0152] Modifikacije koje su ovde obezbeđene mogu biti u nemodifikovanom polipeptidu PD-L1 datom u SEQ ID NO:30, 309 ili 1728. U nekim slučajevima, modifikacije takođe mogu biti u nemodifikovanom IgV datom u SEQ ID NO:55. U skladu sa ovim pronalaskom, nemodifikovani polipeptid PD-L1 ima 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnost sekvence sa SEQ ID NO: 30, 55, 309 ili 1728.

[0153] Stručnjak će umeti da identifikuje odgovarajuću poziciju modifikacije, npr. aminokiselinske supstitucije, u polipeptidu PD-L1, uključujući njegov deo koji sadrži njegov domen IgSF (npr. ECD ili IgV), recimo putem poravnavanja referentne sekvence sa SEQ ID NO:30 ili SEQ ID NO:309. Prilikom navođenja modifikacija u ovom otkriću, aminokiselinska pozicija se navodi u sredini, pri čemu je odgovarajuća nemodifikovana aminokiselina (npr. divljeg tipa) navedena pre broja, a identifikovana varijanta aminokiselinske supstitucije je navedena nakon broja. Ako modifikacija predstavlja deleciju pozicije, stavlja se oznaka „del“, a ako je modifikacija insercija na poziciji stavlja se oznaka „ins“. U nekim slučajevima, insercija se navodi sa aminokiselinskom pozicijom naznačenom u sredini, pri čemu je odgovarajuća nemodifikovana aminokiselina (npr. divljeg tipa) navedena pre i posle broja, a identifikovana varijanta aminokiselinske insercije je navedena nakon nemodifikovane aminokiseline (npr. divljeg tipa).

[0154] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, u sekvenci nemodifikovanog PD-L1. Jedna ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, može se nalaziti u ektodomenu (ekstracelularni domen) sekvence nemodifikovanog PD-L1. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, nalazi se u domenu IgV ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, nalazi se u domenu ECD ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, nalazi se u domenu IgC (npr. IgC2) ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim otelotvorenjima varijante polipeptida PD-L1, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, nalazi se u domenu IgV, i jedna ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, nalazi se u domenu ili domenima IgC (npr. IgC2) ili njihovom specifičnom vezujućem fragmentu.

[0155] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija. Modifikacije (npr. supstitucije) mogu biti u domenu IgV i opciono domenu ili domenima IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, u domenu IgV. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, u domenu ili domenima IgC (npr. IgC2) ili njihovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ima najmanje oko 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1 ili njegovim specifičnim vezujućim fragmentom, kao što je sekvenca aminokiselina SEQ ID NO: 30, 1728, 55 ili 309.

[0156] U nekim otelotvorenjima, pored mutacije N45D, varijanta polipeptida PD-L1 ima jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu, koje odgovaraju pozicijama 6, 10, 11, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 26, 27, 28, 33, 35, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 64, 65, 68, 71, 72, 73, 74, 75, 78, 79, 83, 89, 90, 93, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 104, 106, 110, 111, 112, 113, 117, 119, 120, 121, 124, 129, 130, 131, 134, 137, 138, 144, 148, 149, 150, 155, 158, 160, 163, 165, 167, 170, 171, 173, 175, 176, 177, 179, 180, 183, 185, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 206, 207, 213, ili 221, u odnosu na pozicije date u SEQ ID NO: 30 ili 1728. U nekim otelotvorenjima, takve varijante polipeptida PD-L1 pokazuju povećani afinitet vezivanja prema PD-1 i opciono CD80 u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1. Na primer, u nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 pokazuje povećani afinitet vezivanja prema PD-1 i CD80, u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1.

[0157] U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske modifikacije, npr. aminokiselinske supstitucije, uključuju I20L/N45D, I36T/N45D, D43G/N45D, N45D/V58A, N45D/S75P, N45D/N78I, I20L/I36T/N45D, D43G/N45D/V58A, I20L/E27G/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/A33D/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/D43G/N45D/N78I, V11A/I20L/E27G/D43G/N45D/H51Y/S99G I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R, I20L/I36T/N45D, A33D/D43G/N45D/V58A/S75P, K23R/D43G/N45D, D43G/N45D/L56Q/V58A/G101G-ins (G101GG), I20L/K23E/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/K23E/D43G/N45D/V50A/N78L I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R/G101G-ins (G101GG), N45D, N45D/K144E, N45D/P198S, N45D/P198T, N45D/R195G, N45D/R195S, N45D/S131F, N45D/V58D, N45D/I148V/R195G, N45D/K111T/R195G, N45D/N113Y/R195S, N45D/N165Y/E170G, N45D/Q89R/I98V, N45D/S131F/P198S, N45D/S75P/P198S, N45D/V50A/R195T, E27D/N45D/T183A/I188V, K23N/N45D/S75P/N120S, N45D/I148V/R195G/N201D, N45D/K111T/T183A/I188V, N45D/Q89R/F189S/P198S, N45D/T163I/K167R/R195G, N45D/V50A/I119T/K144E, T19A/N45D/K144E/R195G, V11E/N45D/T130A/P198T, V26A/N45D/T163I/T185A, K23N/N45D/L124S/K167T/R195G, K23N/N45D/Q73R/T163I, K28R/N45D/K57E/I98V/R195S, K28R/N45D/V129D/T163N/R195T, M41K/D43G/N45D/R64S/R195G, M41K/D43G/N45D/R64S/S99G, N45D/R68L/F 173L/D 1 97G/P 1985, N45D/V50A/I148V/R195G/N201D, M41K/D43G/K44E/N45D/R195G/N201D, N45D/V50A/L124S/K144E/L179P/R195G.

[0158] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 20, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija I20L. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 27, 33, 36, 43, 50, 58, 75, 78, 99, 195 ili 198. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija E27G, A33D, I36T, D43G, V50A, V58A, S75P, N78I, S99G, R195G, P198S ili P198T. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije I20L/N45D.

[0159] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 27, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija E27G. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 33, 36, 43, 50, 58, 75, 78, 99, 195 ili 198.

[0160] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 33, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija A33D. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 36, 43, 50, 58, 75, 78, 99, 195 ili 198.

[0161] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 36, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija I36T. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 43, 50, 58, 75, 78, 99, 195 ili 198. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija I20L, E27G, A33D, D43G, N45D, N45T, V50A, V58A, S75P, N78I, M97L, S99G, R195G, P198S ili P198T, ili konzervativna aminokiselinska supstitucija prethodnog. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije I36T/N45D.

[0162] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 43, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija D43G. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 50, 58, 75, 78, 99, 195 ili 198. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije D43G/N45D. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije D43G/N45D/V58A.

[0163] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije I20L/N45D, I36T/N45D, D43G/N45D, N45D/V58A, N45D/S75P, N45D/R195G, ili N45D/P198S.

[0164] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 50, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija V50A. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 43, 58, 75, 78, 99, 195 ili 198.

[0165] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 58, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija V58A. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 43, 50, 75, 78, 99, 195 ili 198. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije N45D/V58D.

[0166] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na

1

poziciji koja odgovara poziciji 75, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija S75P. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 43, 50, 58, 78, 99, 195 ili 198.

[0167] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 78, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija N78I. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 43, 50, 58, 75, 99, 195 ili 198. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije N45D/N78I.

[0168] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 99, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija S99G. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 43, 50, 58, 75, 78, 195 ili 198.

[0169] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na poziciji koja odgovara poziciji 195, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija R195G. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 43, 50, 58, 75, 78, 99 ili 198. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije N45D/R195G.

[0170] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije u nemodifikovanom PD-L1 ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu na

2

poziciji koja odgovara poziciji 198, imajući u vidu numeraciju pozicija datu u SEQ ID NO:30. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska modifikacija je aminokiselinska supstitucija P198S ili P198T. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 dalje sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, na jednoj ili više pozicija 20, 27, 33, 36, 43, 50, 58, 75, 78, 99 ili 195. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinske modifikacije N45D/P198S ili N45D/P198T.

[0171] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 sadrži bilo koju od supstitucija (mutacija) navedenih u tabeli 1, koje sadrže N45D. Tabela 1 takođe daje reprezentativne sekvence u odnosu na SEQ ID NO za ekstracelularni domen (ECD) ili IgV domen PD-L1 divljeg tipa ili reprezentativne varijante polipeptida PD-L1. Kao što je naznačeno, tačan lokus ili ostaci koji odgovaraju datom domenu mogu da se razlikuju, recimo u zavisnosti od postupaka koji se koriste za identifikovanje ili klasifikaciju domena. Takođe, u nekim slučajevima, susedne N- i/ili C-terminalne aminokiseline datog domena (npr. ECD ili IgV) takođe mogu biti uključene u sekvencu varijante polipeptida IgSF, tako da se obezbedi pravilno presavijanje domena kada se eksprimira. Tako, jasno je da primere SEQ ID NO iz tabele 1 ne treba tumačiti kao ograničenje. Na primer, određeni domen, kao što je domen ECD ili IgV, varijante polipeptida PD-L1 može biti za nekoliko aminokiselina duži ili kraći, recimo 1-10, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 aminokiselina duži ili kraći, nego sekvenca aminokiselina data u odgovarajućem SEQ ID NO.

4

TABELA 1: Reprezentativne varijante polipeptida PD-L1

Mutacija(e) ECD SEQ ID IgV SEQ ID NO NO

TABELA 1: Reprezentativne varijante polipeptida PD-L1

Mutacija(e) ECD SEQ ID IgV SEQ ID NO NO

TABELA 1: Reprezentativne varijante polipeptida PD-L1

Mutacija(e) ECD SEQ ID IgV SEQ ID NO NO

TABELA 1: Reprezentativne varijante polipeptida PD-L1

Mutacija(e) ECD SEQ ID IgV SEQ ID NO NO

[0172] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 pokazuje povećani afinitet prema ektodomenu PD-1 u poređenju sa divljim tipom ili nemodifikovanim polipeptidom PD-L1, koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 30, 1728, 55 ili 309. U nekim otelotvorenjima, polipeptid PD-L1 pokazuje povećani afinitet prema ektodomenu CD80 u poređenju sa divljim tipom ili nemodifikovanim PD-L1, koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 30, 1728, 55 ili 309. U nekim otelotvorenjima, polipeptid PD-L1 pokazuje povećani afinitet prema ektodomenu PD-1 i ektodomenu CD80 u poređenju sa divljim tipom ili nemodifikovanim polipeptidom PD-L1, koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 30, 1728, 55 ili 309.

[0173] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 pokazuje povećani afinitet prema ektodomenu PD-1 i smanjeni afinitet prema ektodomenu CD80 u poređenju sa nemodifikovanim polipeptidom PD-L1, koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 30, 1728, 55 ili 309.

[0174] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 pokazuje povećanu selektivnost za PD-1 u odnosu na CD80 u poređenju sa odnosom vezivanja nemodifikovanog polipeptida PD-L1 (npr. dat u SEQ ID NO: 30, 55 ili 309) za vezivanje PD-1 u odnosu na CD80, kao što je naznačeno odnosom vezivanja PD-1 prema vezivanju CD80 (odnos vezivanja PD-ECD80) koji je veći od 1. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PDL1 pokazuje odnos vezivanja PD-1 u odnosu na CD80 koji je veći od ili veći od oko 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, ili veći.

III. FORMATI VARIJANTI POLIPEPTIDA

[0175] Imunomodulatorni polipeptid koji sadrži ovde obezbeđenu varijantu PD-L1 u kojoj je sadržan vIgD može biti formatiran na brojne načine, na primer kao rastvorljivi protein, membranski vezani protein ili izlučeni protein. U nekim otelotvorenjima, za željenu terapeutsku primenu može da se izabere konkretni format. U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 obezbeđen je u formatu za antagonizaciju ili blokiranje aktivnosti njegovog srodnog vezujućeg partnera, npr. PD-1. U nekim otelotvorenjima, antagonizam PD-1 može biti koristan za promociju imuniteta u onkologiji. U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 obezbeđen je u formatu za agonizaciju ili stimulaciju aktivnosti njegovog srodnog vezujućeg partnera, npr. PD-1. U nekim otelotvorenjima, agonizam PD-1 može biti koristan za lečenje inflamacije ili autoimunosti. Stručnjak lako može da odredi aktivnost konkretnog formata, kao što je antagonizacija ili agonizacija jednog ili više specifičnih srodnih vezujućih partnera. Ovde su dati reprezentativni postupci za procenu takvih aktivnosti, uključujući one u primerima.

[0176] U nekim aspektima, obezbeđeni su imunomodulatorni proteini koji sadrže vIgD PD-L1 pri čemu su takvi proteini rastvorljivi, npr. fuzionisani sa Fc lancem. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih domena IgSF, kao što je jedan ili više dodatnih vIgD, može biti vezano sa vIgD PD-L1 kao što je ovde obezbeđeno (u nastavku se naziva

„naslagani“ imunomodulatorni protein). U nekim otelotvorenjima, modularni format obezbeđenih imunomodulatornih proteina daje fleksibilnost za konstruisanje ili generisanje imunomodulatornih proteina za modulaciju aktivnosti više kontrastruktura (više srodnih vezujućih partnera). U nekim otelotvorenjima, takvi „naslagani“ molekuli mogu biti obezbeđeni u rastvorljivom formatu ili, u nekim slučajevima, mogu biti kao membranski vezani ili izlučeni proteini. U nekim otelotvorenjima, varijanta imunomodulatornog proteina PD-L1 obezbeđena je kao konjugat u kome je sadržan vIgD PD-L1 vezan, neposredno ili posredno, sa ciljajućim agensom ili ostatkom, npr. sa antitelom ili drugim vezujućim molekulima koji se specifično vezuju za ligand, npr. antigen, na primer, za ciljanje ili

1

lokalizaciju vIgD na specifičnom okruženju ili ćeliji, recimo kada se primenjuje na ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, ciljajući agens, npr. antitelo ili drugi vezujući molekul, vezuje se za tumorski antigen, čime se varijanta PD-L1 koja sadrži vIgD lokalizuje u mikrookruženju tumora, na primer, radi modulacije aktivnosti limfocita koji infiltriraju tumor (TIL) specifičnih za mikrookruženje tumora. U nekim otelotvorenjima, ciljajući agens, npr. antitelo ili drugi vezujući molekul, vezuje se za antigen eksprimiran na antigen prezentujućim ćelijama ili normalnim tkivima u inflamatornom okruženju, čime se varijanta PD-L1 koja sadrži vIgD lokalizuje na područja neželjene autoimunske inflamacije, na primer, radi modulacije aktivnosti T-ćelija koje ciljaju sopstveni antigen.

[0177] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni proteini su eksprimirani u ćelijama i obezbeđeni u okviru terapije konstruisanim ćelijama (ECT). U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je eksprimirana u ćeliji, kao što je imunska ćelija (npr. T ćelija ili antigen prezentujuća ćelija), u obliku vezanom za membranu, čime se obezbeđuje transmembranski imunomodulatorni protein (u nastavku se takođe naziva „TIP“). U nekim otelotvorenjima, u zavisnosti od srodnog vezujućeg partnera koji prepoznaje TIP, konstruisane ćelije koje eksprimiraju TIP mogu da agonizuju srodnog vezujućeg partnera tako što obezbeđuju kostimulatorni signal, pozitivan ili negativan, za druge konstruisane ćelije i/ili endogene T ćelije. U nekim aspektima, varijanta polipeptida PD-L1 je eksprimirana u ćeliji, kao što je imunska ćelija (npr. T ćelija ili antigen prezentujuća ćelija) u obliku koji može da se izluči, što daje izlučeni ili rastvorljivi oblik varijante polipeptida PD-L1 (u nastavku se takođe naziva „SIP“), recimo kada se ćelije primene na ispitaniku. U nekim aspektima, SIP može da antagonizuje srodnog vezujućeg partnera u okruženju (npr. mikrookruženju tumora) u koje se luči. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je eksprimirana u infektivnom agensu (npr. virusni ili bakterijski agens) koji, nakon primene na ispitaniku, može in vivo da inficira ćeliju, kao što je imunska ćelija (npr. T ćelija ili antigen prezentujuća ćelija), radi isporučivanja ili ekspresije varijante polipeptida u obliku TIP ili SIP u ćeliji.

[0178] U nekim otelotvorenjima, rastvorljivi imunomodulatorni polipeptid, kao što je varijanta PD-L1 koja sadrži vIgD, može biti enkapsuliran u lipozomu koji i sam može biti konjugovan sa bilo kojim pojedinačnim obezbeđenim konjugatom ili bilo kojom kombinacijom konjugata (npr. ciljajući ostatak). U nekim otelotvorenjima, rastvorljivi ili membranski vezani imunomodulatorni polipeptidi iz pronalaska su deglikozilovani. U

2

specifičnijim otelotvorenjima, varijanta sekvence PD-L1 je deglikozilovana. U još specifičnijim otelotvorenjima, domen ili domeni varijante PD-L1 IgV i/ili IgC (npr. IgC2) su deglikozilovani.

[0179] Neograničavajući primeri za obezbeđene formate su opisani na SL.1A-1C i dodatno opisani ispod.

A. Rastvorljivi protein

[0180] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 je rastvorljivi protein. Stručnjacima će biti jasno da proteini ćelijske površine tipično imaju intracelularni, transmembranski i ekstracelularni domen (ECD) i da rastvorljivi oblik takvih proteina može da se napravi koristeći ekstracelularni domen ili njegovu imunološki aktivnu podsekvencu. Tako, u nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 nema transmembranski domen ili deo transmembranskog domena. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu PD-L1 nema intracelularni (citoplazmatski) domen ili deo intracelularnog domena. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 sadrži samo deo vIgD koji sadrži ECD domen ili njegov deo koji sadrži domen IgV i opciono domen ili domene IgC (npr. IgC2) koji sadrže aminokiselinske modifikacije.

[0181] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein predstavlja ili sadrži varijantu polipeptida PD-L1 u obliku monomera i/ili koja pokazuje jednovalentno vezivanje za vezujućeg partnera. U nekim aspektima, opisana varijanta polipeptida PD-L1, kao što je varijanta PD-L1 koja je rastvorljiva i/ili koja nema transmembranski domen i domen intracelularne signalizacije, vezana je, neposredno ili posredno, sa daljim ostatkom. U nekim otelotvorenjima, dalji ostatak je protein, peptid, mali molekul ili nukleinska kiselina. U nekim otelotvorenjima, jednovalentni imunomodulatorni protein je fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, ostatak je molekul koji produžava poluživot. Primeri za takve molekule koji produžavaju poluživot uključuju, ali nisu ograničeni na, albumin, polipeptid koji vezuje albumin, Pro/Ala/Ser (PAS), C-terminalni peptid (CTP) beta podjedinice humanog horionskog gonadotropina, polietilen glikol (PEG), dugačke nestrukturisane hidrofilne sekvence aminokiselina (XTEN), hidroksietil skrob (HES), mali molekul koji vezuje albumin, ili kombinacije prethodnog.

[0182] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 može biti vezan za ostatak koji uključuje konformaciono neuređene polipeptidne sekvence sačinjene od aminokiselina Pro, Ala i Ser (vidite, npr. WO2008/155134, SEQ ID NO: 2025). U nekim slučajevima, aminokiselinsko ponavljanje je najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više aminokiselinskih ostataka, pri čemu svako ponavljanje sadrži ostatak (ostatke) Ala, Ser i Pro. Tako, ovde je obezbeđen imunomodulatorni protein koji je PASilovan protein, pri čemu je varijanta polipeptida PD-L1 vezana, neposredno ili posredno preko linkera, za Pro/Ala/Ser (PAS). U nekim otelotvorenjima, može da se koristi jedna ili više dodatnih struktura linkera.

[0183] U nekim otelotvorenjima, ostatak olakšava detekciju ili prečišćavanje varijante polipeptida PD-L1. U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid sadrži oznaku ili fuzioni domen, npr. afinitetnu oznaku ili oznaku za prečišćavanje, vezane, neposredno ili posredno, za N- i/ili C-terminus polipeptida PD-L1. Poznate su različite odgovarajuće polipeptidne oznake i/ili fuzioni domeni, i uključuju, bez ograničenja, polihistidinsku (His) oznaku, FLAG-oznaku (SEQ ID NO: 2010), Myc-oznaku i fluorescentne proteinske oznake (npr. EGFP, dat u SEQ ID NO: 2027-2029). U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 sadrži najmanje šest histidinskih ostataka (dato u SEQ ID NO: 2011). U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 dalje sadrži različite kombinacije ostataka. Na primer, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 dalje sadrži jednu ili više polihistidinskih oznaka i FLAG oznaka.

[0184] U nekim otelotvorenjima, polipeptid PD-L1 je vezan sa modifikovanim konstantnim regionom (Fc) teškog lanca imunoglobulina koji ostaje u jednovalentnom obliku kao što je dato u SEQ ID NO: 1187.

[0185] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži varijantu polipeptida PD-L1 koja je, neposredno ili posredno, preko linkera, vezana sa domenom multimerizacije. U nekim aspektima, domen multimerizacije produžava poluživot molekula. Interakcija dve ili više varijanti polipeptida PD-L1 može da se olakša njihovim vezivanjem, neposredno ili posredno, sa bilo kojim ostatkom ili drugim polipeptidom koji i sami mogu da interaguju da grade stabilnu strukturu. Na primer, zasebno kodirani polipeptidni lanci varijante PD-L1 mogu da se spoje multimerizacijom, pri čemu je multimerizacija polipeptida posredovana

4

domenom multimerizacije. Domen multimerizacije tipično omogućava nastanak stabilne interakcije protein-protein između prve varijante polipeptida PD-L1 i druge varijante polipeptida PD-L1.

[0186] Homo- ili heteromultimerni polipeptidi mogu da se dobiju zajedničkom ekspresijom zasebnih varijanti polipeptida PD-L1. Prva i druga varijanta polipeptida PD-L1 mogu biti iste ili različite. U konkretnim otelotvorenjima, prva i druga varijanta polipeptida PD-L1 u homodimeru, su iste, i obe su vezane za domen multimerizacije koji je isti. U drugim otelotvorenjima, heterodimeri mogu da se dobiju vezivanjem prve i druge varijante polipeptida PD-L1 koje su različite. U takvim otelotvorenjima, u nekim aspektima, prva i druga varijanta polipeptida PD-L1 su vezane za različite domene multimerizacije koji mogu da promovišu nastanak heterodimera.

[0187] U nekim otelotvorenjima, domen multimerizacije uključuje svaki onaj koji je sposoban da gradi stabilnu interakciju protein-protein. Domeni multimerizacije mogu da interaguju preko sekvence imunoglobulina (npr. Fc domen; vidite, npr. Međunarodne patentne publikacije br. WO 93/10151 i WO 2005/063816 US; U.S. pub. br.

2006/0024298; U.S. pat. br.5,457,035); leucinskog zatvarača (npr. od proteina fos i jun koji transformišu jezgro ili proto-onkogena c-myc ili od generalne kontrole azota (GCN4)) (vidite, npr. Busch i Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6:36-40; Gentz et al., (1989) Science, 243:1695-1699); hidrofobnog regiona; hidrofilnog regiona; ili slobodnog tiola koji gradi intermolekulsku disulfidnu vezu između himernih molekula homo- ili heteromultimera. Pored toga, domen multimerizacije može da sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži izbočinu komplementarnu sekvenci aminokiselina koja sadrži rupicu, kao što je opisano, na primer, u U.S. pat. br.5,731,168; Međunarodnim patentnim pub. br. WO 98/50431 i WO 2005/063816; Ridgway et al. (1996) Protein Engineering, 9:617-621. Takav region multimerizacije može da se konstruiše tako da sterne interakcije promovišu stabilnu interakciju, i dalje promovišu nastanak prvenstveno heterodimera umesto homodimera, iz smeše himernih monomera. Generalno, izbočine nastaju kada se mali bočni lanci aminokiselina sa međupovršine prvog polipeptida zamene većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzatorne šupljine koje su iste ili slične veličine kao izbočine opciono nastaju na međupovršini drugog polipeptida zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim lancima (npr. alanin ili treonin). Primeri domena za multimerizaciju opisani su u nastavku.

[0188] Varijanta polipeptida PD-L1 može biti vezana bilo gde, ali je to obično preko njenog N- ili C-terminusa, sa N- ili C-terminusom domena multimerizacije kako bi se napravio himerni polipeptid. Veza može biti neposredna ili posredna preko linkera. Himerni polipeptid može biti fuzioni protein ili može biti izgrađen putem hemijskog vezivanja, recimo putem kovalentnih ili nekovalentnih interakcija. Na primer, kada se priprema himerni polipeptid koji sadrži domen multimerizacije, nukleinska kiselina koja kodira celinu ili deo varijante polipeptida PD-L1 može biti operativno vezana sa nukleinskom kiselinom koja kodira sekvencu domena multimerizacije, neposredno ili posredno ili opciono preko domena linkera. U nekim slučajevima, konstrukt kodira himerni protein kada je C-terminus varijante polipeptida PD-L1 vezan sa N-terminusom domena multimerizacije. U nekim slučajevima, konstrukt može da kodira himerni protein u kome je N-terminus varijante polipeptida PD-L1 vezan sa C-terminusom domena multimerizacije.

[0189] Polipeptidni multimer sadrži više, recimo dva, himerna proteina nastala vezivanjem, neposredno ili posredno, dve iste ili različite varijante polipeptida PD-L1 neposredno ili posredno sa domenom multimerizacije. U nekim primerima, kada domen multimerizacije predstavlja polipeptid, genska fuzija koja kodira varijantu polipeptida PD-L1 i domen multimerizacije ubačena je u odgovarajući ekspresioni vektor. Dobijeni himerni ili fuzioni protein može da se eksprimira u ćelijama domaćinima koje su transformisane rekombinantnim ekspresionim vektorom, i dozvoljeno je da se sakupe u multimere, pri čemu domeni multimerizacije interaguju dajući jednovalentne polipeptide. Hemijsko vezivanje domena multimerizacije sa varijantama polipeptida PD-L1 može da se izvrši koristeći heterobifunkcionalne linkere.

[0190] Dobijeni himerni polipeptidi, kao što su fuzioni proteini, i multimeri nastali od njih, mogu da se prečiste bilo kojim odgovarajućim postupkom kao što je, na primer, afinitetna hromatografija preko kolone proteina A ili proteina G. Kada se dva molekula nukleinske kiseline koji kodiraju različite polipeptide transformišu u ćelije, doći će do nastanka homo- ili heterodimera. Uslovi za ekspresiju mogu da se podese tako da se prednost daje nastanku heterodimera u odnosu na nastanak homodimera.

[0191] U nekim otelotvorenjima, domen multimerizacije je Fc domen ili njegovi delovi iz imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži varijantu polipeptida PD-L1 vezanu za Fc imunoglobulina (dajući „imunomodulatornu Fc fuziju“, kao što je „fuzija varijante PD-L1-Fc“, naziva se i fuzija PD-L1 vIgD-Fc). U nekim otelotvorenjima, vezivanje varijante polipeptida PD-L1 je na N-terminusu Fc. U nekim otelotvorenjima, vezivanje varijante polipeptida PD-L1 je na C-terminusu Fc. U nekim otelotvorenjima, dve ili više varijanti polipeptida PD-L1 (iste ili različite) nezavisno su vezane za N-terminus i C-terminus.

[0192] U nekim otelotvorenjima, Fc je mišji ili humani Fc. U nekim otelotvorenjima, Fc je Fc region IgGl, lgG2, lgG3 ili lgG4 sisara ili čoveka. U nekim otelotvorenjima, Fc je dobijen od IgG1, kao što je humani IgG1. U nekim otelotvorenjima, Fc sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 187 ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 187.

[0193] U nekim otelotvorenjima, Fc region sadrži jednu ili više modifikacija za izmenu (npr. smanjenje) jedne ili više njegovih normalnih funkcija. Uopšteno, Fc region je zadužen za efektorske funkcije, kao što je citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), pored kapaciteta vezivanja antigena, što je glavna funkcija imunoglobulina. U nekim slučajevima, efektorske funkcije Fc regiona mogu da uključuju programiranu ćelijsku smrt i ćelijsku fagocitozu. Pored toga, sekvenca FcRn prisutna u Fc regionu igra ulogu u regulaciji nivoa IgG u serumu putem povećanja in vivo poluživota putem konjugacije sa in vivo receptorom FcRn. U nekim otelotvorenjima, takve funkcije u Fc mogu da se smanje ili izmene za korišćenje sa obezbeđenim Fc fuzionim proteinima.

[0194] U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija može da se uvede u Fc region fuzije varijante PD-L1-Fc koja je ovde obezbeđena, čime se dobija varijanta Fc regiona. U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona ima smanjenu efektorsku funkciju. Postoje brojni primeri promena ili mutacija Fc sekvenci koje mogu da izmene efektorsku funkciju. Na primer, WO

00/42072, WO2006019447, WO2012125850, WO2015/107026, US2016/0017041 i Shields et al. J Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001) opisuju reprezentativne varijante Fc sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR.

[0195] U nekim otelotvorenjima, obezbeđene fuzije varijante PD-L1-Fc sadrže Fc region koji pokazuje smanjene efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za primenu u kojoj je poluživot fuzije varijante PD-L1-Fc in vivo bitan, ali su neke efektorske funkcije (poput CDC i ADCC) nepotrebne ili štetne. Mogu da se obave in vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti da bi se potvrdilo smanjenje/iscrpljivanje aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu da se obave kako bi se potvrdilo da fuzija varijante PD-L1-Fc nema vezivanje FcyR (te stoga verovatno nema aktivnost ADCC), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcyRIII, dok monociti eksprimiraju FcyRI, FcyRII i FcyRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama rezimirana je u tabeli 2 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri za in vitro testove za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa opisani su u U.S. pat. br.

5,500,362 (vidite, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); U.S. pat. br.

5,821,337 (vidite Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu da se koriste postupci neradioaktivnih testova (vidite, na primer, ACTI<™>neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; i CytoTox 96<™>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, Wis.). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može da se proceni in vivo, npr. na životinjskom modelu kao što je model otkriven u Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q takođe mogu da se obave kako bi se potvrdilo da fuzija varijante PD-L1-Fc ne može da se vezuje za C1q i stoga nema aktivnost CDC. Vidite, npr. ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu aktivacije komplementa može da se obavi test CDC (vidite, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163

(1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M. S. i M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Određivanje vezivanja FcRn i in vivo klirensa/poluživota može takođe da se obavi koristeći postupke koji su poznati u struci (vidite, npr. Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

[0196] Fuzije varijante PD-L1-Fc sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 prema EU numeraciji (U.S. pat. br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više aminokiselinskih pozicija 265, 269, 270, 297 i 327 prema EU numeraciji, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (U.S. pat. br.7,332,581).

[0197] U nekim otelotvorenjima, Fc region fuzije varijante PD-L1-Fc ima Fc region u kome je bilo koja pojedinačna ili više aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 i 329 (označene prema EU numeraciji) supstituisana različitim aminokiselinama u poređenju sa nativnim Fc regionom. Takve izmene Fc regiona nisu ograničene na prethodno opisane izmene i uključuju, na primer, izmene kao što su deglikozilovani lanci (N297A i N297Q), IgG1-N297G, IgG1-L234A/L235A, IgG1-L234A/L235E/G237A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/ S267K, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, i IgG4-L236E opisane u Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; izmene kao što su G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R i N325LL328R opisane u WO 2008/092117; aminokiselinske insercije na pozicijama 233, 234, 235 i 237 (označene prema EU numeraciji); i izmene na mestima koja su opisana u WO 2000/042072.

[0198] Opisane su određene varijante Fc sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Vidite, npr. U.S. pat. br.6,737,056; WO 2004/056312, WO2006019447 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

[0199] U nekim otelotvorenjima, obezbeđena je fuzija varijante PD-L1-Fc koja sadrži varijantu Fc regiona koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje produžavaju poluživot i/ili poboljšavaju vezivanje za neonatalni Fc receptor (FcRn). Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za FcRn opisana su

u US2005/0014934A1 (Hinton et al.) ili WO2015107026. Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve varijante Fc uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434 prema EU numeraciji, npr. supstituciju ostatka Fc regiona 434 (U.S. pat. br.7,371,826).

[0200] U nekim otelotvorenjima, Fc region fuzije varijante PD-L1-Fc sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija E356D i M358L prema EU numeraciji. U nekim otelotvorenjima, Fc region fuzije varijante PD-L1-Fc sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija C220S, C226S i/ili C229S prema EU numeraciji. U nekim otelotvorenjima, Fc region fuzije varijante PD-L1 sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija R292C i V302C. Vidite takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. pat. br.

5,648,260; U.S. pat. br.5,624,821; i WO 94/29351 gde su dati drugi primeri varijanti Fc regiona.

[0201] U nekim otelotvorenjima, u Fc regionu su načinjene izmene koje dovode do smanjenog vezivanja C1q i/ili citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), npr. kao što je opisano u U.S. pat. br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[0202] U nekim otelotvorenjima, obezbeđena je fuzija varijante PD-L1-Fc koja sadrži varijantu Fc regiona koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, pri čemu je varijanta Fc regiona dobijena od IgG1, kao što je humani IgG1. U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona dobijena je od sekvence aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 187. U nekim otelotvorenjima, Fc sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju koja je N82G na osnovu numeracije SEQ ID NO: 187 (odgovara N297G prema EU numeraciji). U nekim otelotvorenjima, Fc dalje sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju koja je R77C ili V87C na osnovu numeracije SEQ ID NO: 187 (odgovara R292C ili V302C prema EU numeraciji). U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju C5S prema numeraciji SEQ ID NO: 187 (odgovara C220S prema EU numeraciji). Na primer, u nekim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona sadrži sledeće aminokiselinske modifikacije: V297G i jednu ili više od sledećih aminokiselinskih modifikacija C220S, R292C ili V302C prema EU numeraciji (odgovara N82G i jednoj ili više od sledećih aminokiselinskih modifikacija C5S, R77C ili V87C na osnovu SEQ ID NO:187), npr. Fc region sadrži sekvencu koja je data u SEQ ID NO:1157. U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija C220S, L234A, L235E ili G237A, npr. Fc region sadrži sekvencu koja je data u SEQ ID NO:1158. U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija C220S, L235P, L234V, L235A, G236del ili S267K, npr. Fc region sadrži sekvencu koja je data u SEQ ID NO:1159. U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija C220S, L234A, L235E, G237A, E356D ili M358L, npr. Fc region sadrži sekvencu koja je data u SEQ ID NO:1155.

[0203] U nekim otelotvorenjima, Fc region nema C-terminalni lizin koji odgovara poziciji 232 divljeg tipa ili nemodifikovanog Fc koji je dat u SEQ ID NO: 187 (odgovara K447del prema EU numeraciji). U nekim aspektima, takav Fc region može dodatno da uključuje jednu ili više dodatnih modifikacija, npr. aminokiselinskih supstitucija, kao što je bilo koja ovde opisana. Primer za takav Fc region je dat u SEQ ID NO: 1938, 1939, 1940, ili 1715.

[0204] U nekim otelotvorenjima, obezbeđena je fuzija varijante PD-L1-Fc koja sadrži varijantu Fc regiona, pri čemu varijanta Fc sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u bilo kom od SEQ ID NO:1155, 1157, 1158, 1159, 1715, 1938, 1939, ili 1940 ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1155, 1157, 1158, 1159, 1715, 1938, 1939, ili 1940.

[0205] U nekim otelotvorenjima, Fc je dobijen od IgG2, kao što je humani IgG2. U nekim otelotvorenjima, Fc sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 188 ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 188.

[0206] U nekim otelotvorenjima, Fc sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 1200 ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1200. U nekim otelotvorenjima, Fc IgG4 je stabilizovani Fc u kome je CH3 domen humanog IgG4 supstituisan CH3 domenom humanog IgG1 i koji pokazuje inhibiranu formaciju agregata, antitelo u kome su domeni CH3 i CH2 humanog IgG4 supstituisani CH3, odnosno CH2 domenom humanog IgG1, ili antitelo u kome je arginin na poziciji 409 humanog IgG4, označenoj u skladu sa EU indeksom čiji su autori Kabat et al., supstituisan lizinom, i koje pokazuje inhibiranu formaciju agregata (vidite, npr. U.S. patent br.8,911,726. U nekim otelotvorenjima, Fc je IgG4 koji sadrži mutaciju S228P, za koji se ispostavilo da sprečava rekombinaciju između terapeutskog antitela i endogenog IgG4 putem razmene Fabkraka (vidite, npr. Labrijin et al. (2009) Nat. Biotechnol., 27(8): 767-71.) U nekim otelotvorenjima, Fc sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 1201 ili

1

sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1201.

[0207] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je neposredno vezana sa sekvencom Fc. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 je posredno vezana sa sekvencom Fc, recimo preko linkera. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više „peptidnih linkera“ vezuje varijantu polipeptida PD-L1 i Fc domen. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker može biti dugačak jedan aminokiselinski ostatak ili više. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker ima najmanje jedan aminokiselinski ostatak ali nije duži od 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, linker se sastoji od tri alanina (AAA). U nekim otelotvorenjima, linker je fleksibilni linker. U nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina): GGGGS („4GS“ ili „G4S"; SEQ ID NO: 1942) ili multimeri 4GS linkera, kao što su ponavljanja 2, 3, 4 ili 54GS linkera, kao što je dato u SEQ ID NO: 240 (2xGGGGS) ili SEQ ID NO:239 (3xGGGGS). U nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina) GSGGGGS (SEQ ID NO:1941). U nekim otelotvorenjima, linker takođe može da sadrži niz ostataka alanina, samostalno ili kao dodatak drugom peptidnom linkeru (kao što je 4GS linker ili njegov multimer). U nekim otelotvorenjima, broj ostataka alanina u svakom nizu je: 2, 3, 4, 5, ili 6 alanina. U nekim otelotvorenjima, linker je čvrsti linker. Na primer, linker je α-heliksni linker. U nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina): EAAAK ili multimeri EAAAK linkera, kao što su ponavljanja 2, 3, 4, ili 5 EAAAK linkera, kao što je dato u SEQ ID NO: 2022 (1xEAAAK), SEQ ID NO: 2023 (3xEAAAK) ili SEQ ID NO: 2024 (5xEAAAK). U nekim otelotvorenjima, linker dalje može da sadrži aminokiseline uvedene kloniranjem i/ili sa mesta restrikcije, na primer, linker može da sadrži aminokiseline GS (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina) uvedene korišćenjem mesta restrikcije BAMHI. Na primer, u nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina) GSGGGGS (SEQ ID NO:1941), GS(G4S)3(SEQ ID NO: 2031), ili GS(G4S)5(SEQ ID NO: 2032). U nekim primerima, linker je 2xGGGGS nakon koga slede tri alanina (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 241). U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 sadrži različite kombinacije peptidnih linkera.

[0208] U nekim otelotvorenjima, varijanta PD-L1-Fc fuzionog proteina je dimer koji grade dve varijante PD-L1 Fc polipeptida vezane sa Fc domenom. U nekim otelotvorenjima, dimer

2

je homodimer u kome su dve varijante PD-L1 Fc polipeptida iste. U nekim otelotvorenjima, dimer je heterodimer u kome su dve varijante PD-L1 Fc polipeptida različite.

[0209] Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijantu PD-L1-Fc fuzionog proteina. U nekim otelotvorenjima, za proizvodnju Fc fuzionog proteina, molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu PD-L1-Fc fuzionog proteina se insertuje u odgovarajući ekspresioni vektor. Dobijena varijanta PD-L1-Fc fuzionog proteina može da se eksprimira u ćelijama domaćinima koje su transformisane ekspresijom kada se sastavljanje Fc domena odvija preko interlančanih disulfidnih veza koje nastaju između ostataka Fc, što daje dimerne, recimo dvovalentne, varijante PD-L1-Fc fuzionih proteina.

[0210] Dobijeni Fc fuzioni proteini lako mogu da se prečiste afinitetnom hromatografijom na koloni sa proteinom A ili proteinom G. Za dobijanje heterodimera mogu biti neophodni dodatni koraci prečišćavanja. Na primer, kada se dve nukleinske kiseline koje kodiraju različite varijante polipeptida PD-L1 transformišu u ćelije, nastanak heterodimera mora da se ostvari biohemijskim putem, pošto će molekuli varijante PD-L1 koji nose Fc domen takođe biti eksprimirani kao disulfidno vezani homodimeri. Tako, homodimeri mogu da se redukuju u uslovima koji pogoduju ometanju međulančanih disulfida, ali nemaju dejstvo na unutarlančane disulfide. U nekim slučajevima, različite varijante PD-L1 Fc monomera su pomešane u ekvimolarnim količinama i oksidisane da grade smešu homo- ili heterodimera. Komponente ove smeše razdvajaju se tehnikama hromatografije. Alternativno, nastanak ove vrste heterodimera može da se podstakne genetskim konstruisanjem i ekspresijom Fc fuzionih molekula koji sadrže varijantu polipeptida PD-L1, koristeći postupke „dugme u rupici“ koji su opisani u nastavku.

B. Naslagani molekuli sa dodatnim domenima IgSF

[0211] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni proteini mogu da sadrže bilo koju od ovde obezbeđenih varijanti polipeptida PD-L1 vezanu, neposredno ili posredno, sa jednim ili više domena superfamilije imunoglobulina (IgSF) („naslagani“ konstrukt imunomodulatornog proteina, takođe se naziva imunomodulatorni protein „tipa II“). U nekim aspektima, to može dati jedinstvene multidomenske imunomodulatorne proteine koji vezuju dva ili više, recimo tri ili više, srodnih vezujućih partnera, čime se obezbeđuje modulacija imunske sinapse sa više ciljeva.

[0212] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži kombinaciju („kombinacija koja nije divljeg tipa“) i/ili raspored („raspored koji nije divljeg tipa“ ili „permutacija koja nije divljeg tipa“) varijante domena PD-L1 sa jednom ili više afinitetno modifikovanih i/ili neafinitetno modifikovanih sekvenci domena IgSF drugog člana familije IgSF (npr. član familije IgSF sisara) koje se ne mogu naći kod članova familije IgSF divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži 2, 3, 4, 5 ili 6 domena superfamilije imunoglobulina (IgSF), gde je najmanje jedan od domena IgSF domen IgSF varijante PD-L1 (vIgD PD-L1) u skladu sa datim opisom.

[0213] U nekim otelotvorenjima, sekvence dodatnih domena IgSF mogu biti modifikovani domen IgSF koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, u poređenju sa divljim tipom ili nemodifikovanim domenom IgSF. U nekim otelotvorenjima, domen IgSF može biti neafinitetno modifikovan (npr. divljeg tipa) ili je afinitetno modifikovan. U nekim otelotvorenjima, nemodifikovani ili divlji tip domena IgSF može biti poreklom od miša, pacova, majmuna cinomolgusa ili čoveka, ili kombinacija prethodnog. U nekim otelotvorenjima, dodatni domeni IgSF mogu biti domen IgSF člana familije IgSF datog u tabeli 2. U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF može biti afinitetno modifikovani domen IgSF koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija, npr. supstitucija, u poređenju sa domenom IgSF koji je sadržan u članu familije IgSF koji je dat u tabeli 2.

[0214] U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF je afinitetno ili neafinitetno modifikovani domen IgSF sadržan u članu familije IgSF familije izabrane od familije signalnih regulatornih proteina (SIRP), familije nalik aktivirajućim receptorima eksprimiranim na mijeloidnim ćelijama (TREML), familije adhezionog molekula ćelije povezane sa karcinoembrionskim antigenom (CECAM), familije lektina nalik na Ig koji vezuje sijalinsku kiselinu (SIGLEC), familije butirofilina, familije B7, familije CD28, familije koja sadrži V skup i domen imunoglobulina (VSIG), familije transmembranskog domena V skupa (VSTM), familije glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC), familije molekula signalne limfocitne aktivacije (SLAM), receptora nalik imunoglobulinu leukocita (LIR), familije nektina (Nec), familije nalik nektinu (NECL), familije srodne receptoru poliovirusa (PVR), familije prirodnog receptora za aktivaciju citotoksičnosti (NCR), familije T-ćelijskog imunoglobulina i mucina i familije receptora nalik imunoglobulinu ćelija ubica

4

(KIR). U nekim otelotvorenjima, dodatni domeni IgSF su nezavisno dobijeni od proteina IgSF izabranog iz grupe koja se sastoji od CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD274 (PD-L1, B7-H1), PDCD1LG2(PD-L2, CD273), ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2), CD276(B7-H3), VTCN1(B7-H4), CD28, CTLA4, PDCD1(PD-1), ICOS, BTLA(CD272), CD4, CD8A(CD8-alpha), CD8B(CD8-beta), LAG3, HAVCR2(TIM-3), CEACAM1, TIGIT, PVR(CD155), PVRL2(CD112), CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R1(CD200R), NCR3 (NKp30) i VSIG8.

[0215] Prva kolona u tabeli 2 daje naziv i, opciono, naziv potencijalnih sinonima tog konkretnog člana IgSF. Druga kolona daje identifikator proteina iz baze podataka UniProtKB, javno dostupne baze podataka kojoj se može pristupiti putem interneta na uniprot.org ili, u nekim slučajevima, GenBank broj. Univerzalni proteinski resurs (UniProt) predstavlja sveobuhvatni resurs za proteinske sekvence i podatke o napomenama. Baze podataka UniProt uključuju UniProt bazu znanja (UniProtKB). UniProt je nastao u saradnji Evropskog instituta za bioinformatiku (EMBL-EBI), SIB švajcarskog instituta za bioinformatiku i Resursa informacija o proteinima (PIR) i izdržava se prvenstveno pomoću subvencija Nacionalnih instituta za zdravlje (NIH) SAD-a. GenBank je baza podataka genskih sekvenci NIH, skup svih javno dostupnih sekvenci DNK sa napomenama (Nucleic Acids Research, 2013 Jan;41(D1):D36-42). Treća kolona prikazuje region u kome se nalazi naznačeni domen IgSF. Region je naveden kao region u kome domen obuhvata ostatke koji određuju raspon. Kolona 3 takođe naznačava klasu domena IgSF za navedeni region IgSF. Kolona 4 prikazuje region u kome se nalaze naznačeni dodatni domeni (signalni peptid, S; ekstracelularni domen, E; transmembranski domen, T; citoplazmatski domen, C). Jasno je da opis domena može da se razlikuje u zavisnosti od postupaka koji se koriste za identifikaciju ili klasifikaciju domena, i oni mogu različito da se identifikuju iz različitih izvora. Opis ostataka koji odgovaraju domenu u tabeli 2 treba shvatiti samo kao primer, i on može biti duži ili kraći za nekoliko aminokiselina (na primer, jednu, dve, tri ili četiri). Kolona 5 za neke od navedenih članova IgSF navodi neke od njihovih srodnih ćelijskih vezujućih partnera.

TABELA 2. Članovi IgSF u skladu sa predmetnim otkrićem.

Član IgSF NCBI Klasa Drugi Srodni Sekvenca aminokiselina (sinonimi) pristupni regiona i domeni vezujući člana IgSF (SEQ ID broj domena partneri NO)

TABELA 2. Članovi IgSF u skladu sa predmetnim otkrićem.

1

TABELA 2. Članovi IgSF u skladu sa predmetnim otkrićem.

2

TABELA 2. Članovi IgSF u skladu sa predmetnim otkrićem.

4 TABELA 2. Članovi IgSF u skladu sa predmetnim otkrićem.

Član IgSF NCBI Klasa Drugi Srodni Sekvenca aminokiselina (sinonimi) pristupni regiona i domeni vezujući člana IgSF (SEQ ID

[0216] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni proteini, pored toga što sadrže varijantu polipeptida PD-L1, takođe sadrže najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 dodatnih domena superfamilije imunoglobulina (IgSF), kao što je domen IgD člana familije IgSF dat u tabeli 2. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje jedan dodatni domen IgSF (npr. drugi domen IgSF). U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje dva dodatna domena IgSF (npr. drugi i treći domen IgSF). U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje tri dodatna domena IgSF (npr. drugi, treći i četvrti). U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje četiri dodatna domena IgSF (npr. drugi, treći, četvrti i peti). U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje pet dodatnih domena IgSF (npr. drugi, treći, četvrti, peti i šesti). U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje šest dodatnih domena IgSF (npr. drugi, treći, četvrti, peti, šesti i sedmi). U nekim otelotvorenjima, svaki od domena IgSF u imunomodulatornom proteinu je drugačiji. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan od dodatnih domena IgSF je isti kao najmanje jedan drugi domen IgSF u imunomodulatornom proteinu. U nekim otelotvorenjima, svaki od domena IgSF potiče ili je izveden od drugog člana familije IgSF. U nekim otelotvorenjima, najmanje dva domena IgSF potiču ili su izvedeni od istog člana familije IgSF.

[0217] U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF sadrži domen IgV ili domen ili domene IgC (npr. IgC2), ili specifični vezujući fragment domena IgV ili specifični vezujući fragment jednog ili više domena IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF predstavlja ili sadrži domen IgV kompletne dužine. U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF predstavlja ili sadrži domen ili domene IgC) kompletne dužine (npr. IgC2. U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF predstavlja ili sadrži specifični vezujući fragment domena IgV. U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF predstavlja ili sadrži specifični vezujući fragment jednog ili više domena IgC (npr. IgC2). U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži najmanje dva dodatna domena IgSF jednog (istog) člana IgSF. Na primer, u nekim aspektima, imunomodulatorni protein sadrži ECD ili njegov deo člana IgSF koji sadrži domen IgV kompletne dužine i domen ili domene IgC (npr. IgC2) kompletne dužine ili njihov specifični vezujući fragment.

[0218] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni proteini sadrže najmanje jedan dodatni domen IgSF (npr. drugi ili, u nekim slučajevima, i treći domen IgSF, i tako dalje) gde je najmanje jedan dodatni, npr. drugi ili treći domen IgSF, domen IgSF dat u divljem tipu ili nemodifikovanom domenu IgSF ili njegov specifični vezujući fragment sadržan u sekvenci aminokiselina koja je data u bilo kom od SEQ ID NO: 1-27 i 216. U nekim otelotvorenjima, divlji tip ili nemodifikovani domen IgSF je domen IgV ili domen IgC, kao što je domen IgC1 ili IgC2.

[0219] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni proteini, pored toga što sadrže varijantu polipeptida PD-L1, takođe sadrže najmanje jedan dodatni afinitetno modifikovani domen IgSF (npr. drugi ili, u nekim slučajevima, i treći afinitetno modifikovani domen IgSF, i tako dalje) gde najmanje jedan dodatni domen IgSF jeste vIgD koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili mutacija) u poređenju sa domenom IgSF kod divljeg tipa ili nemodifikovanog domena IgSF, kao što je domen IgSF člana familije IgSF koji je dat u tabeli 2. U nekim otelotvorenjima, dodatni, npr. drugi ili treći, afinitetno modifikovani domen IgSF ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa divljim tipom ili nemodifikovanim domenom IgSF ili njegovim specifičnim vezujućim fragmentom koji je sadržan u sekvenci aminokiselina koja je data u bilo kom od SEQ ID NO: 1-27 i 216. U nekim otelotvorenjima, divlji tip ili nemodifikovani domen IgSF je domen IgV ili domen IgC, kao što je domen IgC1 ili IgC2. U nekim otelotvorenjima, dodatni, npr. drugi ili treći, domen IgSF je afinitetno modifikovani domen IgV i/ili domen IgC. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih domena IgSF je afinitetno modifikovani domen IgSF koji sadrži domen IgV i/ili domen ili domene IgC (npr. IgC2), ili specifični vezujući fragment domena IgV i/ili specifični vezujući fragment jednog ili više domena IgC (npr. IgC2), gde domen IgV i/ili IgC sadrži aminokiselinske modifikacije (npr. supstitucije). U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih afinitetno modifikovanih domena IgSF sadrži domen IgV koji sadrži aminokiselinske modifikacije (npr. supstitucije). U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih afinitetno modifikovanih domena IgSF sadrži domen IgSF prisutan u ECD ili delu ECD odgovarajućeg nemodifikovanog člana familije IgSF, kao što je domen IgV kompletne dužine i domen ili domeni IgC (npr. IgC2) kompletne dužine, ili njihovi specifični vezujući fragmenti, gde jedan ili oba od IgV i IgC sadrže aminokiselinske modifikacije (supstitucije).

[0220] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 može da sadrži jedan ili više vIgD PD-L1 koji su ovde dati. U nekim otelotvorenjima, varijanta imunomodulatornog proteina PD-L1 koja je ovde obezbeđena sadrži tačno 1, 2, 3, 4, 5 ili više sekvenci varijante PD-L1. U nekim otelotvorenjima, najmanje dve sekvence varijante PD-L1 su identične varijante domena IgSF.

[0221] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni polipeptid sadrži dve ili više sekvenci vIgD PD-L1. Više varijanti PD-L1 u polipeptidnom lancu mogu biti međusobno identične (tj. iste vrste) ili neidentične (tj. različite vrste) sekvence varijanti PD-L1. Pored otelotvorenja sa pojedinačnim polipeptidnim lancem, u nekim otelotvorenjima, dva, tri, četiri ili više polipeptida iz pronalaska mogu biti međusobno vezani kovalentno ili nekovalentno. Tako, ovde su obezbeđeni monomerni, dimerni i multimerni proteini višeg reda (npr.3, 4, 5 ili više). Na primer, u nekim otelotvorenjima, tačno dva polipeptida iz pronalaska mogu biti međusobno kovalentno ili nekovalentno vezana tako da grade dimer. U nekim otelotvorenjima, vezivanje se vrši preko međulančanih cisteinskih disulfidnih veza.

Kompozicije koje sadrže dva ili više polipeptida iz pronalaska mogu biti identične vrste ili suštinski identične vrste polipeptida (npr. homodimer) ili neidentične vrste polipeptida (npr. heterodimer). Kompozicija koja ima više vezanih polipeptida iz pronalaska može, kao što je gore navedeno, imati jednu ili više identičnih ili neidentičnih varijanti PD-L1 iz pronalaska u svakom polipeptidnom lancu. U nekim specifičnim otelotvorenjima, identične ili suštinski identične vrste (dozvoljeno je 3 ili manje razlika sekvence aminokiselina N-terminusa ili C-terminusa) varijante PD-L1-Fc fuzionih polipeptida biće dimerizovane dajući homodimer. Alternativno, različite vrste varijante PD-L1-Fc fuzionih polipeptida mogu da se dimerizuju dajući heterodimer.

[0222] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje jedan dodatni domen IgSF (npr. drugi ili, u nekim slučajevima, i treći domen IgSF i tako dalje) koji je vIgD koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa domenom IgSF (npr. IgV) divljeg tipa ili nemodifikovanog domena IgSF koji nije PD-L1.

[0223] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih domena IgSF (npr. drugi ili treći IgSF) je domen IgSF (npr. ECD ili IgV) drugog člana familije IgSF koji se i sam vezuje za inhibitorni receptor. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih domena IgSF (npr. drugi ili treći IgSF) je afinitetno modifikovani domen IgSF koji je varijanta domena IgSF (vIgD) člana familije IgSF koji se vezuje za inhibitorni receptor i koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u domenu IgSF (npr. ECD ili IgV), gde, u nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija dovodi do povećanog vezivanja za inhibitorni receptor. U nekim otelotvorenjima, vIgD sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija) u divljem tipu ili nemodifikovanom domenu IgSF (npr. ECD ili IgV) člana familije IgSF koji se vezuje za inhibitorni receptor. Pored PD-1, primeri za takve inhibitorne receptore su CTLA-4, LAG3, TIGIT, TIM-3, ili BTLA. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih domena IgSF je poreklom od člana familije IgSF koji je izabran od CD155, CD112, PD-L2, CD80 ili CEACAM1. Tako, u nekim aspektima su obezbeđeni antagonisti kontrolne tačke sa više ciljeva koji ciljaju ili blokiraju aktivnost više od jednog inhibitornog receptora.

[0224] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein ima antagonist kontrolne tačke sa više ciljeva koji cilja ili blokira aktivnost najmanje dva, tri, četiri ili više inhibitornih receptora. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju varijantu polipeptida PD-L1 i jedan ili više domena IgSF inhibitornog receptora, kao što je divlji tip ili nemodifikovani inhibitorni receptor. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju varijantu polipeptida PD-L1 i jedan ili više domena IgSF CD80, npr. divlji tip ili nemodifikovani CD80, kao što je domen IgV dat u SEQ ID NO:1005, 1079 ili 2030 ili ECD ili njegov deo (koji sadrži domen IgV i IgC ili njihove specifične vezujuće fragmente) dat u SEQ ID NO:28 ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju varijantu polipeptida PD-L1 i jedan ili više domena IgSF CD112, npr. divlji tip ili nemodifikovani CD112, kao što je domen IgV dat u SEQ ID NO:666 ili 761 ili ECD ili njegov deo (koji sadrži domen IgV i IgC ili njihove specifične vezujuće fragmente) dat u SEQ ID NO:48 ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju varijantu polipeptida PD-L1 i jedan ili više domena IgSF PD-L2, npr. divlji tip ili nemodifikovani PD-L2, kao što je domen IgV dat u SEQ ID NO:1203 ili 1263 ili ECD ili njegov deo (koji sadrži domen IgV i IgC ili njihove specifične vezujuće fragmente) dat u SEQ ID NO:31 ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju varijantu polipeptida PD-L1 i jedan ili više domena IgSF CD155, npr. divlji tip ili nemodifikovani CD155, kao što je domen IgV dat u SEQ ID NO: 310 ili 353 ili ECD ili njegov deo (koji sadrži domen IgV i IgC ili njihove specifične vezujuće fragmente) dat u SEQ ID NO:47 ili njegov deo.

[0225] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži jedan ili više dodatnih domena IgSF (npr. drugi ili treći IgSF) koji je vIgD člana familije IgSF koji se vezuje za inhibitorni receptor u kome jedna ili više aminokiselinskih modifikacija u domenu IgSF (npr. IgV) dovodi do povećanog afiniteta vezivanja vIgD, ili fuzionog ili imunomodulatornog proteina koji sadrži vIgD, prema srodnom vezujućem partneru inhibitornog receptora u poređenju sa nemodifikovanim domenom IgSF, kao što je afinitet vezivanja koji je povećan više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija u domenu IgSF (npr. IgV) dovodi do povećane selektivnosti vIgD, ili fuzionog ili imunomodulatornog proteina koji sadrži vIgD, za njegov inhibitorni receptor u poređenju sa nemodifikovanim domenom IgSF. U nekim otelotvorenjima, povećana selektivnost je veći odnos vezivanja vIgD za inhibitorni receptor u odnosu na drugog srodnog vezujućeg partnera, kao što je srodni vezujući partner koji nije inhibitorni receptor, u poređenju sa odnosom vezivanja nemodifikovanog IgSF za inhibitorni receptor u odnosu na drugog srodnog vezujućeg partnera. U nekim otelotvorenjima, odnos je veći za najmanje ili najmanje oko 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta.

[0226] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni (npr. drugi ili treći) vIgD je domen IgSF (npr. IgV) varijante polipeptida CD80 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija) u domenu IgSF (npr. IgV) CD155 ili CD112, koji su članovi familije IgSF koji se vezuju za inhibitorni receptor TIGIT. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni (npr. drugi) vIgD sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija) u domenu IgSF (npr. IgV) CD80, koji je član familije IgSF koji se vezuje za inhibitorni receptor CTLA-4. Primeri za aminokiselinske modifikacije, kao što su supstitucije, delecije ili adicije, u domenu IgSF (npr. ECD ili IgV koji sadrži IgV i IgC) varijante polipeptida CD80 dati su u tabeli 3. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida CD80 koja sadrži domen IgV koji sadrži bilo koju aminokiselinsku modifikaciju datu u tabeli 3, kao što je domen IgV dat u bilo kom SEQ ID NO:1006-1078, 1080-1112, 1114-1152 ili domen IgV koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1006-1078, 1080-1112, 1114-1152 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida CD80 koja sadrži ECD ili njegov deo koji sadrži domene IgV i/ili IgC, u kome je sadržana bilo koja aminokiselinska modifikacija data u tabeli 3, kao što je ECD dat u bilo kom od SEQ ID NO: 932-964, 966-1004 ili ECD koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 932-964, 966-1004 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija.

[0227] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni (npr. drugi ili treći) vIgD je domen IgSF (npr. IgV) varijante CD155 polipeptida koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija) u domenu IgSF (npr. IgV) u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom CD155, što, u nekim aspektima, dovodi do povećanog vezivanja za inhibitorni receptor TIGIT. Primeri za aminokiselinske modifikacije, kao što su supstitucije, delecije ili adicije, u domenu IgSF (npr. IgV ili ECD koji sadrži IgV i IgC) varijante CD155 polipeptida dati su u tabeli 5. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu PD-L1 polipeptida i varijantu CD155 polipeptida koja sadrži domen IgV koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih modifikacija datih u tabeli 5, kao što je domen IgV koji je dat u bilo kom od SEQ ID NO:

1

332-352, 354-374, 472-665, 1505-1550, 1570-1714, ili domen IgV koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 332-352, 354-374, 472-665, 1505-1550, 1570-1714 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida CD155 koja sadrži ECD ili njegov deo koji sadrži domene IgV i/ili IgC, u kome je sadržana bilo koja aminokiselinska modifikacija data u tabeli 5, kao što je ECD dat u bilo kom od SEQ ID NO: 311-331, 375-471, 1551-1622 ili ECD koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 311-331, 375-471, 1551-1622 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija.

[0228] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni (npr. drugi ili treći) vIgD je domen IgSF (npr. IgV) varijante CD112 polipeptida koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija) u domenu IgSF (npr. IgV) u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom CD112, što, u nekim aspektima, dovodi do povećanog vezivanja za inhibitorni receptor TIGIT. Primeri za aminokiselinske modifikacije, kao što su supstitucije, delecije ili adicije, u domenu IgSF (npr. IgV ili ECD koji sadrži IgV i IgC) varijante CD112 polipeptida dati su u tabeli 4. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu PD-L1 polipeptida i varijantu CD112 polipeptida koja sadrži domen IgV koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih modifikacija datih u tabeli 4, kao što je domen IgV koji je dat u bilo kom od SEQ ID NO: 714-760, 762-808, 850-931, ili domen IgV koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 714-760, 762-808, 850-931 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida CD112 koja sadrži ECD ili njegov deo koji sadrži domene IgV i/ili IgC, u kome je sadržana bilo koja aminokiselinska modifikacija data u tabeli 4, kao što je ECD dat u bilo kom od SEQ ID NO: 667-713, 809-849, 1433-1456 ili ECD koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 667-713, 809-849, 1433-1456 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija.

1 1

[0229] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni (npr. drugi ili treći) vIgD je domen IgSF (npr. IgV) varijante polipeptida PD-L2 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija) u domenu IgSF (npr. ECD ili IgV) u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom PD-L2, što, u nekim aspektima, dovodi do povećanog vezivanja za inhibitorni receptor PD-1. Primeri za aminokiselinske modifikacije, kao što su supstitucije, delecije ili adicije, u domenu IgSF (npr. IgV ili ECD koji sadrži IgV i IgC) varijante PD-L2 polipeptida dati su u tabeli 8. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu PD-L1 polipeptida i varijantu PD-L2 polipeptida koja sadrži domen IgV koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih modifikacija datih u tabeli 8, kao što je domen IgV koji je dat u bilo kom od SEQ ID NO: 1281-1331, 1333-1407, 1409-1432 ili domen IgV koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 1281-1331, 1333-1407, 1409-1432 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida PD-L2 koja sadrži ECD ili njegov deo koji sadrži domene IgV i/ili IcD, u kome je sadržana bilo koja aminokiselinska modifikacija data u tabeli 8, kao što je ECD dat u bilo kom od SEQ ID NO:1204-1254, 1256-1280 ili ECD koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 1204-1254, 1256-1280 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija.

[0230] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više dodatnih domena IgSF (npr. drugi IgSF) je domen IgSF (npr. IgV) drugog člana familije IgSF koji vezuje ili prepoznaje tumorski antigen. U takvim otelotvorenjima, član familije IgSF ima funkciju ostatka koji locira tumor, čime se vIgD PD-L1 dovodi u neposrednu blizinu imunskih ćelija u mikrookruženju tumora. U nekim otelotvorenjima, dodatni domen IgSF (npr. drugi IgSF) jeste domen IgSF NKp30, koji vezuje ili prepoznaje B7-H6 eksprimiran na tumorskoj ćeliji. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni (npr. drugi) domen IgSF, npr. NKp30, jeste afinitetno modifikovani domen IgSF ili vIgD koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija). U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija povećava afinitet vezivanja i/ili selektivnost za B7-H6 u poređenju sa nemodifikovanim domenom IgSF, npr. NKp30, recimo za najmanje ili najmanje oko 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta. Primeri za aminokiselinske modifikacije, kao što su supstitucije,

1 2

delecije ili adicije, u domenu IgSF (npr. domenu nalik IgC ili kompletnom ECD) varijante NKp30 polipeptida dati su u tabeli 6. U reprezentativne polipeptide spada varijanta NKp30 koja sadrži mutacije L30V/A60V/S64P/S86G u odnosu na pozicije ekstracelularnog domena NKp30 koje odgovaraju pozicijama datim u SEQ ID NO: 54. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida NKp30 koja sadrži domen nalik IgC koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih modifikacija datih u tabeli 6, kao što je domen nalik IgC koji je dat u bilo kom od SEQ ID NO: 1184-1188 ili domen nalik IgC koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 1184-1188 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida NKp30 koja sadrži ECD ili njegov deo koji sadrži domen ili domene IgSF, u kome je sadržana bilo koja aminokiselinska modifikacija data u tabeli 6, kao što je ECD dat u bilo kom od SEQ ID NO: 1178-1182 ili ECD koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 1178-1182 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija.

[0231] U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni (npr. drugi ili treći) vIgD je domen IgSF (npr. IgV) varijante polipeptida CD86 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr. supstitucija, delecija ili adicija) u domenu IgSF (npr. IgV) u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom CD86, što, u nekim aspektima, dovodi do povećanog vezivanja njegovog srodnog vezujućeg partnera. Primeri za aminokiselinske modifikacije, kao što su supstitucije, delecije ili adicije, u domenu IgSF (npr. IgV ili ECD koji sadrži IgV i IgC) varijante polipeptida CD86 dati su u tabeli 7. U reprezentativne polipeptide spada varijanta CD86 koja sadrži mutacije Q35H/H90L/Q102H u odnosu na pozicije ekstracelularnog domena CD86 koje odgovaraju pozicijama datim u SEQ ID NO: 29. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu varijantu PD-L1 polipeptida i varijantu CD86 polipeptida koja sadrži domen IgV koji sadrži bilo koju od aminokiselinskih modifikacija datih u tabeli 7, kao što je domen IgV koji je dat u bilo kom od SEQ ID NO: 1196-1199 ili domen IgV koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO: 1196-1199 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju obezbeđenu

1

varijantu polipeptida PD-L1 i varijantu polipeptida CD86 koja sadrži ECD ili njegov deo koji sadrži domene IgV i/ili IgC, u kome je sadržana bilo koja aminokiselinska modifikacija data u tabeli 7, kao što je ECD dat u bilo kom od SEQ ID NO: 1191-1194 ili ECD koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičan bilo kom od SEQ ID NO:1191-1194 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija.

[0232] Tabele 3-8 daju primere za polipeptide koji sadrže jedan ili više afinitetno modifikovanih domena IgSF koji mogu da se koriste u naslaganim konstruktima koji su ovde obezbeđeni.

1 4

1

1 TABELA 3: Reprezentativne varijante polipeptida CD80

1

11 TABELA 3: Reprezentativne varijante polipeptida CD80

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

11

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

11

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

11

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

11

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO P18F, T26M, L44V, Q62K, L79P, E82D, F91S, 1562 1516, 1539 L104M, G111D

11

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO P18F, H40Q, T61K, Q62K, L79P, F91S, 1579 1625, 1671 L104M, T107V

P18S, Q32R, Q62K, R78G, L79P, F91S, 1580 1626, 1672 T107A, R113W

Q12H, P18T, L21S, G22S, V57A, Q62R, 1581 1627, 1673 L79P, F91S, T107M

V9I, P18S, S24P, H49Q, F58Y, Q60R, Q62K, 1582 1628, 1674 L79P, F91S, T107M

P18T, W46C, H49R, S65A, S67V, A76T, 1583 1629, 1675 L79P, S87T, L104M

P18S, S42T, E51G, L79P, F91S, G92W, 1584 1630, 1676 T107M

V10F, T15S, P18L, R48Q, L79P, F91S, 1585 1631, 1677 T107M, V115M

P18S, L21M, Y30F, N35D, R84W, F91S, 1586 1632, 1678 T107M, D116G

P18F, E51V, S54G, Q60R, L79Q, E82G, S87T, 1587 1633, 1679 M90I, F91S, G92R, T107M

Q16H, P18F, F91S, T107M 1588 1634, 1680 P18T, D23G, Q60R, S67L, L79P, F91S, 1589 1635, 1681 T107M, V115A

D8G, V9I, V11A, P18T, T26M, S52P, L79P, 1590 1636, 1682 F91S, G92A, T107L, V115A

V9I, P18F, A47E, G50S, E68G, L79P, F91S, 1591 1637, 1683 T107M

P18S, M55I, Q62K, S69P, L79P, F91S, T107M 1592 1638, 1684 P18T, T39S, S52P, S54R, L79P, F91S, T107M 1593 1639, 1685

11

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO P18S, D23N, L79P, F91S, T107M, S114N 1594 1640, 1686 P18S, P34S, E51V, L79P, F91S, G111R 1595 1641, 1687 P18S, H59N, V75A, L79P, A81T, F91S, 1596 1642, 1688 L104M, T107M

P18S, W46R, E68D, L79P, F91S, T107M, 1597 1643, 1689 R113G

V9L, P18F, T45A, S65A, S67V, R78K, L79V, 1598 1644, 1690 F91S, T107M, S114T

P18T, M55L, T61R, L79P, F91S, V106I, 1599 1645, 1691 T107M

T15I, P18S, V33M, N35F, T39S, M55L, R78S, 1600 1646, 1692 L79P, F91S, T107M

P18S, Q62K, K70E, L79P, F91S, G92E, 1601 1647, 1693 R113W

P18F, F20I, T26M, A47V, E51K, L79P, F91S 1602 1648, 1694 P18T, D23A, Q60H, L79P, M90V, F91S, 1603 1649, 1695 T107M

P18S, D23G, C29R, N35D, E37G, M55I, 1604 1650, 1696 Q62K, S65A, S67G, R78G, L79P, F91S,

L104M, T107M, Q110R

A13E, P18S, M36R, Q62K, S67T, L79P, 1605 1651, 1697 N85D, F91S, T107M

V9I, P18T, H49R, L79P, N85D, F91S, L104T, 1606 1652, 1698 T107M

V9A, P18F, T61S, Q62L, L79P, F91S, G111R 1607 1653, 1699 D8E, P18T, T61A, L79P, F91S, T107M 1608 1654, 1700

12

TABELA 5: Reprezentativne varijante polipeptida CD155

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO P18S, V41A, H49R, S54C, L79S, N85Y, L88P, 1609 1655, 1701 F91S, L104M, T107M

V11E, P18H, F20Y, V25E, N35S, H49R, 1610 1656, 1702 L79P, F91S, T107M, G111R

V11A, P18F, D23A, L79P, G80D, V95A, 1611 1657, 1703 T107M

P18S, K70R, L79P, F91S, G111R 1612 1658, 1704 V9L, V11M, P18S, N35S, S54G, Q62K, L79P, 1613 1659, 1705 L104M, T107M, V115M

V9L, P18Y, V25A, V38G, M55V, A77T, 1614 1660, 1706 L79P, M90I, F91S, L104M

V10G, P18T, L72Q, L79P, F91S, T107M 1615 1661, 1707 P18S, H59R, A76G, R78S, L79P 1616 1662, 1708 V9A, P18S, M36T, S65G, L79P, F91S, L104T, 1617 1663, 1709 G111R, S112I

P18T, S52A, V57A, Q60R, Q62K, S65C, 1618 1664, 1710 L79P, F91T, N100Y, T107M

V11A, P18F, N35D, A47E, Q62K, L79P, 1619 1665, 1711 F91S, G99D, T107M, S114N

V11A, P18T, N35S, L79P, S87T, F91S 1620 1666, 1712 V9D, V11M, Q12L, P18S, E37V, M55I, Q60R, 1621 1667, 1713 K70Q, L79P, F91S, L104M, T 107M

T15S, P18S, Y30H, Q32L, Q62R, L79P, F91S, 1622 1668, 1714 T107M

TABELA 6: Reprezentativne varijante polipeptida NKp30

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO Domen nalik IgC SEQ ID NO Divlji tip 54 1183

TABELA 7: Reprezentativne varijante polipeptida CD86

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

12

TABELA 7: Reprezentativne varijante polipeptida CD86

Mutacija(e) ECD SEQ ID NO IgV SEQ ID NO

[0233] Broj takvih neafinitetno modifikovanih ili afinitetno modifikovanih domena IgSF koji su prisutni u „naslaganom“ konstruktu imunomodulatornog proteina (bilo da se radi o kombinacijama koje nisu divljeg tipa ili rasporedima koji nisu divljeg tipa) najmanje je 2, 3, 4 ili 5, a u nekim otelotvorenjima tačno 2, 3, 4 ili 5, domena IgSF (pri čemu utvrđivanje afinitetno modifikovanih domena IgSF ne uzima u obzir bilo koje njihove nespecifične vezujuće frakcione sekvence i/ili njihove suštinski imunološki neaktivne frakcione sekvence).

[0234] U nekim otelotvorenjima naslaganog imunomodulatornog proteina koji je ovde obezbeđen, broj domena IgSF je najmanje 2, pri čemu je broj afinitetno modifikovanih i broj neafinitetno modifikovanih domena IgSF nezavisno najmanje: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Tako, broj

12

afinitetno modifikovanih domena IgSF, odnosno broj neafinitetno modifikovanih domena IgSF (afinitetno modifikovani domen IgSF:neafinitetno modifikovani domen IgSF) može biti tačno ili najmanje: 2:0 (afinitetno modifikovan: divlji tip), 0:2, 2:1, 1:2, 2:2, 2:3, 3:2, 2:4, 4:2, 1:1, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5 ili 5:1.

[0235] U nekim otelotvorenjima naslaganog imunomodulatornog proteina, najmanje dva neafinitetno modifikovana i/ili afinitetno modifikovana domena IgSF su identični domeni IgSF.

[0236] U nekim otelotvorenjima, naslagani imunomodulatorni protein koji je ovde obezbeđen sadrži najmanje dva afinitetno modifikovana i/ili neafinitetno modifikovana domena IgSF jednog člana IgSF, ali sa rasporedom koje nije divljeg tipa (alternativno, „permutacija“). Jedan ilustrativni primer za raspored ili permutaciju koji nisu divljeg tipa je imunomodulatorni protein koji sadrži redosled sekvenci afinitetno modifikovanih i/ili neafinitetno modifikovanih domena IgSF koji nije divljeg tipa u odnosu na one koje se nalaze kod divljeg tipa PD-L1 čije sekvence domena IgSF su bile izvor varijanti domena IgSF kao što je ovde dato. Tako, u jednom primeru, imunomodulatorni protein može da sadrži IgV proksimalan i IgC distalan transmembranskom domenu, mada u neafinitetno modifikovanom i/ili modifikovanom obliku. Prisustvo, u imunomodulatornom proteinu koji je ovde obezbeđen, kombinacija koje nisu divljeg tipa i rasporeda koji nisu divljeg tipa neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF takođe je obuhvaćeno predmetnom materijom.

[0237] U nekim otelotvorenjima naslaganog imunomodulatornog proteina, neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domeni IgSF su neidentični (tj. različiti) domeni IgSF. Neidentični afinitetno modifikovani domeni IgSF specifično vezuju, u specifičnim uslovima vezivanja, različite srodne vezujuće partnere i oni su „neidentični“ bez obzira na to da li su domeni IgSF divljeg tipa ili nemodifikovani domeni IgSF od kojih su konstruisani bili isti. Tako, na primer, kombinacija najmanje dva neidentična domena IgSF u imunomodulatornom proteinu koja nije divljeg tipa može da sadrži najmanje jednu sekvencu domena IgSF čije poreklo potiče i jedinstveno je za jedan PD-L1, i najmanje jednu sekvencu drugog domena IgSF čije poreklo potiče i jedinstveno je za drugog člana familije IgSF koji nije PD-L1, pri čemu su domeni IgSF imunomodulatornog proteina u neafinitetno modifikovanom i/ili afinitetno modifikovanom obliku. Međutim, u alternativnim

12

otelotvorenjima, dva neidentična domena IgSF poreklom su od iste sekvence domena IgSF, ali je najmanje jedan afinitetno modifikovan tako da se specifično vezuje za različite srodne vezujuće partnere.

[0238] Više neafinitetno modifikovanih i/ili afinitetno modifikovanih domena IgSF u polipeptidnom lancu naslaganog imunomodulatornog proteina ne mora biti međusobno neposredno kovalentno vezano. U nekim otelotvorenjima, interventni niz sačinjen od jednog ili više aminokiselinskih ostataka posredno međusobno kovalentno vezuje neafinitetno modifikovane i/ili afinitetno modifikovane domene IgSF. Veza može biti preko N-terminalnih sa C-terminalnim ostacima.

[0239] U nekim otelotvorenjima, dva ili više domena IgSF, uključujući vIgD PD-L1 i jedan ili više dodatnih domena IgSF (npr. drugu ili treću varijantu domena IgSF) drugog člana familije IgSF, vezani su kovalentno ili nekovalentno. U nekim otelotvorenjima, dva ili više domena IgSF su međusobno posredno povezani, na primer preko linkera. U nekim otelotvorenjima, interventni niz sačinjen od jednog ili više aminokiselinskih ostataka posredno međusobno kovalentno vezuje domene IgSF. Veza može biti preko N-terminalnih sa C-terminalnim ostacima. U nekim otelotvorenjima, veza može da se napravi preko bočnih lanaca aminokiselinskih ostataka koji se ne nalaze na N-terminusu ili C-terminusu domena IgSF. Tako, veze mogu da se naprave preko terminalnih ili internih aminokiselinskih ostataka ili njihovih kombinacija.

[0240] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži najmanje dva domena IgSF, oba vezana neposredno ili posredno preko linkera. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein sadrži najmanje tri imunomodulatorna proteina, svaki vezan neposredno ili posredno preko linkera. Različite konfiguracije su prikazane na SL.5A i 5B.

[0241] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više „peptidnih linkera“ vezuje vIgD PD-L1 i jedan ili više dodatnih domena IgSF (npr. drugu ili treću varijantu domena IgSF). U nekim otelotvorenjima, peptidni linker može biti dugačak jedan aminokiselinski ostatak ili više. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker ima najmanje jedan aminokiselinski ostatak ali nije duži od 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, linker je fleksibilni linker. U nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina): GGGGS („4GS“; SEQ ID NO:

12

1942) ili multimeri linkera 4GS, kao što su ponavljanja 2, 3, 4 ili 5 linkera 4GS. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker je (GGGGS)2(SEQ ID NO: 240) ili (GGGGS)3(SEQ ID NO: 239). U nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina) GSGGGGS (SEQ ID NO:1941). U nekim otelotvorenjima, linker takođe može da sadrži niz ostataka alanina, samostalno ili kao dodatak drugom peptidnom linkeru (kao što je 4GS linker ili njegov multimer). U nekim otelotvorenjima, broj ostataka alanina u svakom nizu je: 2, 3, 4, 5, ili 6 alanina. U nekim otelotvorenjima, linker takođe može da sadrži niz ostataka alanina, samostalno ili kao dodatak drugom peptidnom linkeru (kao što je 4GS linker ili njegov multimer). U nekim otelotvorenjima, broj ostataka alanina u svakom nizu je: 2, 3, 4, 5, ili 6 alanina. U nekim otelotvorenjima, linker je čvrsti linker. Na primer, linker je α-heliksni linker. U nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina): EAAAK ili multimeri EAAAK linkera, kao što su ponavljanja 2, 3, 4, ili 5 EAAAK linkera, kao što je dato u SEQ ID NO: 2022 (1xEAAAK), SEQ ID NO: 2023 (3xEAAAK) ili SEQ ID NO: 2024 (5xEAAAK). U nekim otelotvorenjima, linker dalje može da sadrži aminokiseline uvedene kloniranjem i/ili sa mesta restrikcije, na primer, linker može da sadrži aminokiseline GS (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina) uvedene korišćenjem mesta restrikcije BAMHI. Na primer, u nekim otelotvorenjima, linker je (u skladu sa jednoslovnom šifrom aminokiselina) GSGGGGS (SEQ ID NO:1941), GS(G4S)3(SEQ ID NO: 2031), ili GS(G4S)5(SEQ ID NO: 2032). U nekim primerima, linker je 2xGGGGS nakon koga slede tri alanina (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 241). U nekim slučajevima, različite kombinacije peptida se koriste kao linkeri.

[0242] U nekim otelotvorenjima, neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domeni IgSF su vezani preko „peptidnih linkera divljeg tipa“ koji su ubačeni na N-terminusu i/ili C-terminusu neafinitetno modifikovanih i/ili afinitetno modifikovanih domena IgSF. Ovi linkeri se takođe nazivaju vodeće sekvence (N-terminalne za neafinitetno modifkovan ili afinitetno modifikovan domen IgSF) ili prateće sekvence (C-terminalne za neafinitetno modifikovani ili afinitetno modifikovani domen IgSF), i sekvence koje postoje u proteinu divljeg tipa koje se protežu neposredno izvan strukturnog predviđanja Ig presavijanja IgSF. U nekim otelotvorenjima, „linker divljeg tipa“ je aminokiselinska sekvenca koja se nalazi nakon signalne sekvence, ali pre domena IgSF, kao što je definisani domen IgV, u aminokiselinskoj sekvenci proteina divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, linker „divljeg tipa“ je aminokiselinska sekvenca koja se nalazi neposredno nakon domena IgSF, recimo neposredno nakon definisanog domena IgV ali pre domena IgC, u aminokiselinskoj sekvenci proteina

12

divljeg tipa. Ove linkerske sekvence mogu da doprinesu ispravnom presavijanju i funkcionisanju susednih domena IgSF. U nekim otelotvorenjima, prisutan je vodeći peptidni linker ubačen na N-terminusu prvog domena IgSF i/ili prateća sekvenca ubačena na C-terminusu prvog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF. U nekim otelotvorenjima, prisutan je drugi vodeći peptidni linker ubačen na N-terminusu drugog domena IgSF i/ili druga prateća sekvenca ubačena na C-terminusu drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF. Kada su prvi i drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domeni IgSF dobijeni od istog matičnog proteina i povezani su sa istom orijentacijom, peptidni linkeri divljeg tipa između prvog i drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF se ne dupliraju. Na primer, kada su prvi prateći peptidni linker divljeg tipa i drugi vodeći peptidni linker divljeg tipa isti, imunomodulatorni protein tipa II ne sadrži prvi prateći peptidni linker divljeg tipa ili drugi vodeći peptidni linker divljeg tipa.

[0243] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein tipa II sadrži prvi vodeći peptidni linker divljeg tipa ubačen na N-terminusu prvog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF, pri čemu prvi vodeći peptidni linker divljeg tipa sadrži najmanje 5 (recimo najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili više) uzastopnih aminokiselina iz međusekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je prvi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji mu neposredno prethodi (kao što je signalni peptid ili domen IgSF). U nekim otelotvorenjima, prvi vodeći peptidni linker divljeg tipa sadrži celu interventnu sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je prvi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji mu neposredno prethodi (kao što je signalni peptid ili domen IgSF).

[0244] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein tipa II dalje sadrži prvi prateći peptidni linker divljeg tipa ubačen na C-terminusu prvog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF, pri čemu prvi prateći peptidni linker divljeg tipa sadrži najmanje 5 (recimo najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili više) uzastopnih aminokiselina iz interventne sekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je prvi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji neposredno sledi (kao što je domen IgSF ili transmembranski domen). U nekim otelotvorenjima, prvi prateći peptidni linker divljeg tipa sadrži celu interventnu

12

sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je prvi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji neposredno sledi (kao što je domen IgSF ili transmembranski domen).

[0245] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein tipa II dalje sadrži drugi vodeći peptidni linker divljeg tipa ubačen na N-terminusu drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF, pri čemu drugi vodeći peptidni linker divljeg tipa sadrži najmanje 5 (recimo najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili više) uzastopnih aminokiselina iz interventne sekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji mu neposredno prethodi (kao što je signalni peptid ili domen IgSF). U nekim otelotvorenjima, drugi vodeći peptidni linker divljeg tipa sadrži celu interventnu sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji mu neposredno prethodi (kao što je signalni peptid ili domen IgSF).

[0246] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein tipa II dalje sadrži drugi prateći peptidni linker divljeg tipa ubačen na C-terminusu drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog domena IgSF, pri čemu drugi prateći peptidni linker divljeg tipa sadrži najmanje 5 (recimo najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili više) uzastopnih aminokiselina iz interventne sekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji neposredno sledi (kao što je domen IgSF ili transmembranski domen). U nekim otelotvorenjima, drugi prateći peptidni linker divljeg tipa sadrži celu interventnu sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani domen IgSF dobijen između matičnog domena IgSF i domena koji neposredno sledi (kao što je domen IgSF ili transmembranski domen).

[0247] U nekim otelotvorenjima, dva ili više domena IgSF, uključujući vIgD PD-L1 i jedan ili više dodatnih domena IgSF (npr. druga i/ili treća varijanta domena IgSF) drugog člana familije IgSF, vezani su sa domenom multimerizacije ili zakačeni za njega, recimo sa Fc za dobijanje Fc fuzije, što, nakon ekspresije u ćeliji, u nekim aspektima može da proizvede dimerni multidomenski naslagani imunomodulatorni protein. Dakle, takođe su obezbeđeni dimerni multidomenski imunomodulatorni proteini.

1

[0248] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 i jedan ili više dodatnih domena IgSF su nezavisno vezani, neposredno ili posredno, sa N- ili C-terminusom domena multimerizacije, kao što je Fc region. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 i najmanje jedan od jednog ili više dodatnih domena IgSF su vezani, neposredno ili posredno, i jedna od varijanti PD-L1 i jedan od jednog ili više dodatnih domena IgSF su takođe vezani, neposredno ili posredno, sa N- ili C-terminusom domena multimerizacije, kao što je region Fc. U nekim otelotvorenjima, N- ili C-terminus domena multimerizacije, kao što je region Fc, vezan je sa varijantom PD-L1 polipeptida, ili je jedan ili više dodatnih domena IgSF i preostali od N- ili C-terminusa regiona Fc vezan sa drugom varijantom PD-L1 ili drugim od jednog ili više dodatnih domena IgSF. U nekim otelotvorenjima, veza sa domenom multimerizacije, recimo sa Fc je preko peptidnog linkera, npr. peptidnog linkera kao što je prethodno opisan. U nekim otelotvorenjima, veza između varijante PD-L1 i jednog ili više dodatnih domena IgSF je preko peptidnog linkera, npr. peptidnog linkera kao što je prethodno opisan. U nekim otelotvorenjima, vIgD PD-L1, jedan ili više dodatnih domena IgSF i domen multimerizacije, kao što je domen Fc, mogu biti međusobno vezani u bilo kojoj od brojnih konfiguracija, kao što je prikazano na SL.5A i 5B. Reprezentativne konfiguracije su opisane u primerima.

[0249] U nekim otelotvorenjima, naslagani imunomodulatorni protein je dimer koji grade dva imunomodulatorna Fc fuziona polipeptida. Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koji od naslaganih imunomodulatornih proteina. U nekim otelotvorenjima, dimerni multidomenski naslagani imunomodulatorni protein takođe može da se proizvede u ćelijama putem ekspresije, ili u nekim slučajevima zajedničke ekspresije, naslaganih imunomodulatornih Fc fuzionih polipeptida, kao što je prethodno opisano u skladu sa dobijanjem dimernih Fc fuzionih proteina.

[0250] U nekim otelotvorenjima, dimerni multidomenski naslagani imunomodulatorni protein je dvovalentan za svaki region Fc, jednovalentan za svaku podjedinicu, ili dvovalentan za jednu podjedinicu i četvorovalentan za drugu.

[0251] U nekim otelotvorenjima, dimerni multidomenski naslagani imunomodulatorni protein je homodimerni multidomenski naslagani Fc protein. U nekim otelotvorenjima, dimerni multidomenski naslagani imunomodulatorni protein sadrži prvi naslagani

1 1

imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid i drugi naslagani imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid gde su prvi i drugi polipeptid isti. U nekim otelotvorenjima, multidomenski naslagani molekul sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 i drugi domen IgSF i drugi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 i drugi domen IgSF. U nekim otelotvorenjima, multidomenski naslagani molekul sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1, drugi domen IgSF i treći domen IgSF i drugi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1, drugi domen IgSF i treći domen IgSF. U nekim otelotvorenjima, Fc deo prvog i/ili drugog fuzionog polipeptida može biti bilo koji Fc kao što je prethodno opisano. U nekim otelotvorenjima, Fc deo ili region prvog i drugog fuzionog polipeptida je isti.

[0252] U nekim otelotvorenjima, multidomenski naslagani molekul je heterodimeran, sadrži dva različita Fc fuziona polipeptida, npr. prvi i drugi Fc fuzioni polipeptid, pri čemu je najmanje jedan Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 i/ili najmanje jedan drugi domen IgSF (npr. druga varijanta domena IgSF). U nekim otelotvorenjima, prvi ili drugi Fc fuzioni polipeptid dalje sadrži treći domen IgSF (npr. treću varijantu domena IgSF).

[0253] U nekim otelotvorenjima, multidomenski naslagani molekul sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 i drugi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži drugi domen IgSF, pri čemu, u nekim slučajevima, prvi ili drugi Fc fuzioni polipeptid dodatno sadrži treći domen IgSF. U nekim otelotvorenjima, multidomenski naslagani molekul sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1, drugi domen IgSF i, u nekim slučajevima, treći domen IgSF i drugi Fc fuzioni polipeptid koji nije vezan ni sa jednom varijantom polipeptida PD-L1 ili dodatnim domenom IgSF. U nekim otelotvorenjima, Fc deo ili region prvog i drugog fuzionog polipeptida je isti. U nekim otelotvorenjima, Fc deo ili region prvog i drugog fuzionog polipeptida se razlikuje.

[0254] U nekim otelotvorenjima, multidomenski naslagani molekul sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži 1, 2, 3, 4 ili više varijanti polipeptida PD-L1 i 1, 2, 3, 4 ili više dodatnih domena IgSF, pri čemu je ukupni broj domena IgSF u prvom naslaganom Fc fuzionom polipeptidu veći od 2, 3, 4, 5, 6 ili više. U jednom primeru takvog otelotvorenja, drugi naslagani Fc fuzioni polipeptid sadrži 1, 2, 3, 4 ili više varijanti polipeptida PD-L1 i 1, 2, 3, 4 ili više dodatnih domena IgSF, pri čemu je ukupni broj domena IgSF u drugom naslaganom

1 2

Fc fuzionom polipeptidu veći od 2, 3, 4, 5, 6 ili više. U još jednom primeru takvog otelotvorenja, drugi Fc fuzioni polipeptid nije vezan ni sa jednom varijantom polipeptida PD-L1 ili dodatnim domenom IgSF.

[0255] U nekim otelotvorenjima, heterodimerni naslagani molekul sadrži prvi naslagani imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid i drugi naslagani imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid gde su prvi i drugi polipeptid različiti. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni naslagani molekul sadrži prvu fuziju Fc polipeptida koja sadrži region Fc i prvu varijantu polipeptida PD-L1 i/ili drugi domen IgSF (npr. drugu varijantu domena IgSF) i drugu fuziju polipeptida koja sadrži region Fc i preostalo od prve varijante polipeptida PD-L1 ili drugog domena IgSF. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni naslagani molekul sadrži prvu fuziju Fc polipeptida koja sadrži region Fc i prvu varijantu polipeptida PD-L1 i/ili drugi domen IgSF (npr. druga varijanta domena IgSF) i drugu fuziju Fc polipeptida koja sadrži region Fc i prvu varijantu polipeptida PD-L1 i drugi domen IgSF (npr. druga varijanta domena IgSF), ali sa drugom orijentacijom ili konfiguracijom u odnosu na prvi region Fc. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi Fc fuzioni polipeptid takođe sadrži treći domen IgSF (npr. treću varijantu domena IgSF).

[0256] U nekim otelotvorenjima, domen Fc jednog ili oba od prvog i drugog naslaganog imunomodulatornog Fc fuzionog polipeptida sadrži modifikaciju (npr. supstituciju) tako da je međupovršina molekula Fc modifikovana da olakšava i/ili pospešuje heterodimerizaciju. U nekim otelotvorenjima, modifikacije uključuju uvođenje izbočine (dugmeta) u prvi Fc polipeptid i šupljine (rupice) u drugi Fc polipeptid tako da izbočina može da se pozicionira u šupljinu za pospešivanje stvaranja kompleksa prvog i drugog polipeptida koji sadrži Fc. Aminokiseline ciljane za zamenu i/ili modifikaciju radi stvaranja izbočina ili šupljina u polipeptidu obično su aminokiseline međupovršine koje interaguju ili su u kontaktu sa jednom ili više aminokiselina međupovršine drugog polipeptida.

[0257] U nekim otelotvorenjima, sekvenca aminokiselina se dodaje pre sekvence Fc za konstrukte u kojima sekvenca Fc predstavlja N-terminalni deo sekvence. U nekim slučajevima, sekvenca aminokiselina HMSSVSAQ (SEQ ID NO:1156) dodaje se neposredno pre sekvence Fc za konstrukte u kojima sekvenca Fc predstavlja N-terminalni deo sekvence. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni naslagani molekul sadrži prvu fuziju Fc polipeptida koja sadrži region Fc (dugme) i prvu varijantu polipeptida i/ili drugi domen IgSF (npr. drugu

1

varijantu domena IgSF) i drugu fuziju Fc polipeptida koja sadrži region Fc (rupica) koji sadrži umetnutu sekvencu HMSSVSAQ (SEQ ID NO:1156) koja neposredno prethodi regionima Fc prve i druge Fc polipeptidne fuzije.

[0258] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid koji je modifikovan da sadrži aminokiseline izbočine (dugme) uključuje zamenu nativne ili originalne aminokiseline aminokiselinom koja ima najmanje jedan bočni lanac koji štrči sa međupovršine prvog polipeptida, te stoga može da se pozicionira u odgovarajuću šupljinu (rupica) na susednoj međupovršini drugog polipeptida. Zamenska aminokiselina je najčešće ona koja ima veći volumen bočnog lanca nego prvobitni aminokiselinski ostatak. Stručnjak za ovu oblast ume da utvrdi i/ili proceni osobine aminokiselinskih ostataka, kako bi identifikovao one koji su idealne zamenske aminokiseline za stvaranje izbočine. U nekim otelotvorenjima, zamenski ostaci za nastanak izbočine su prirodni aminokiselinski ostaci i uključuju, na primer, arginin (R), fenilalanin (F), tirozin (Y) ili triptofan (W). U nekim primerima, originalni ostatak koji je identifikovan za zamenu je aminokiselinski ostatak koji ima mali bočni lanac, kao što je, na primer, alanin, asparagin, asparaginska kiselina, glicin, serin, treonin ili valin.

[0259] U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid koji je modifikovan da sadrži šupljinu (rupicu) uključuje zamenu nativne ili originalne aminokiseline aminokiselinom koja ima najmanje jedan bočni lanac koji je uvučen od međupovršine drugog polipeptida, te stoga može da primi odgovarajuću izbočinu sa međupovršine prvog polipeptida. Zamenska aminokiselina je najčešće ona koja ima manji volumen bočnog lanca nego prvobitni aminokiselinski ostatak. Stručnjak za ovu oblast ume da utvrdi i/ili proceni osobine aminokiselinskih ostataka, kako bi identifikovao one koji su idealni zamenski ostaci za stvaranje šupljine. Generalno, zamenski ostaci za stvaranje šupljine su prirodne aminokiseline i uključuju, na primer, alanin (A), serin (S), treonin (T) i valin (V). U nekim primerima, originalna aminokiselina koja je identifikovana za zamenu je aminokiselina koja ima veliki bočni lanac, kao što je, na primer, tirozin, arginin, fenilalanin ili triptofan.

[0260] CH3 međupovršina humanog IgG1, na primer, uključuje šesnaest ostataka na svakom domenu lociranom na četiri antiparalelna β-lanca koji se protežu 1090 Å2 od svake površine (vidite, npr. Deisenhofer et al. (1981) Biochemistry, 20:2361-2370; Miller et al., (1990) J Mol. Biol., 216, 965-973; Ridgway et al., (1996) Prot. Engin., 9: 617-621; U.S. pat. br.

5,731,168). Modifikacije domena CH3 za stvaranje izbočina ili šupljina opisane su, na

1 4

primer, u U.S. pat. br.5,731,168; Međunarodnim patentnim prijavama WO98/50431 i WO 2005/063816; i Ridgway et al., (1996) Prot. Engin., 9: 617-621. U nekim primerima, modifikacije domena CH3 za stvaranje izbočina ili šupljina tipično su usmerene na ostatke koji se nalaze na dva centralna antiparalelna β-lanca. Cilj je da se smanji rizik da izbočine koje su kreirane mogu da se uklope tako što će štrčati u okolni rastvarač, umesto da budu smeštene u kompenzujuću šupljinu u partnerskom domenu CH3.

[0261] U nekim otelotvorenjima, heterodimerni molekul sadrži mutaciju T366W u domenu CH3 „lanca s dugmetom“ i mutacije T366S, L368A, Y407V u domenu CH3 „lanca s rupicom“. U nekim slučajevima, takođe može da se koristi dodatni međulančani disulfidni most između domena CH3 (Merchant, A. M., et al., Nature Biotech.16 (1998) 677-681), npr. putem uvođenja mutacije Y349C u domen CH3 lanca s „dugmetom“ ili „rupicom“ i mutacije E356C ili mutacije S354C u domen CH3 drugog lanca. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni molekul sadrži mutacije S354C, T366W u jednom od dva domena CH3 i mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva domena CH3. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni molekul sadrži mutacije E356C, T366W u jednom od dva domena CH3 i mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva domena CH3. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni molekul sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva domena CH3 i mutacije E356C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva domena CH3. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni molekul sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva domena CH3 i mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva domena CH3. Primeri drugih tehnologija „dugme u rupici“ su poznati u struci, npr. kao što je opisano u EP 1870 459 A1.

[0262] U nekim otelotvorenjima, region Fc heterodimernog molekula dodatno može da sadrži jednu ili više drugih mutacija Fc, kao što je bilo koja od prethodno opisanih. U nekim otelotvorenjima, heterodimerni molekul sadrži region Fc sa mutacijom koja smanjuje efektorsku funkciju.

[0263] U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc koja sadrži modifikacije izbočine (dugme) ili šupljine (rupica) CH3 može biti spojena sa naslaganim imunomodulatornim polipeptidom na bilo kom mestu, ali tipično preko N- ili C-terminusa, sa N- ili C-terminusom prvog i/ili drugog naslaganog imunomodulatornog polipeptida, tako da gradi fuzioni polipeptid. Veza može biti neposredna ili posredna preko linkera. Tipično, molekul sa dugmetom i rupicom se

1

stvara zajedničkom ekspresijom prvog naslaganog imunomodulatornog polipeptida koji je vezan sa varijantom Fc koja sadrži modifikaciju(e) izbočine CH3 sa drugim naslaganim imunomodulatornim polipeptidom koji je vezan sa varijantom Fc koja sadrži modifikaciju(e) šupljine CH3.

[0264] Ovde je obezbeđen homodimerni multidomenski naslagani molekul proizveden od naslaganog imunomodulatornog Fc fuzionog polipeptida koji sadrži domen IgSF, npr. domen IgV, varijante polipeptida PD-L1 i drugi domen IgSF, npr. IgV, varijante polipeptida CD155. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid multidomenskog naslaganog molekula ima sekvencu koja je data u bilo kom od SEQ ID NO: 1716, 1717, 1718, 1719, 1720 ili 1721 ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1716, 1717, 1718, 1719, 1720 ili 1721 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u domenu IgSF varijante PD-L1 i/ili CD155. U nekim otelotvorenjima, nastali multidomenski naslagani molekuli se vezuju za TIGIT kao i za PD-1. U nekim aspektima, vezivanje za TIGIT je istog ili sličnog stepena ili, u nekim slučajevima, povećano, u poređenju sa vezivanjem za TIGIT odgovarajućeg domena IgSF nemodifikovanog ili divljeg tipa PD-L1 ili CD155. U nekim aspektima, vezivanje za PD-1 je istog ili sličnog stepena ili, u nekim slučajevima, povećano, u poređenju sa vezivanjem za PD-1 odgovarajućeg domena IgSF nemodifikovanog ili divljeg tipa PD-L1. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za TIGIT ili PD-1 je najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više od vezivanja za TIGIT ili PD-1 nenaslaganog oblika IgSF-Fc varijante PD-L1. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za TIGIT je najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više od vezivanja za TIGIT nenaslaganog oblika IgSF-Fc varijante CD155. U nekim otelotvorenjima, dobijeni multidomenski naslagani molekul povećava T-ćelijske imunske odgovore u poređenju sa IgSF-Fc nenaslaganom varijantom PD-L1 i/ili varijantom CD155-IgSF-Fc, kao što je utvrđeno u reporterskom testu. U nekim otelotvorenjima, povećanje je veće od 1,2 puta, 1,3 puta, 1,4 puta, 1,5 puta, 2,0 puta, 3,0 puta, 4,0 puta, 5,0 puta ili više.

[0265] Ovde je obezbeđen homodimerni multidomenski naslagani molekul proizveden od naslaganog imunomodulatornog Fc fuzionog polipeptida koji sadrži domen IgSF, npr. domen IgV, varijante polipeptida PD-L1 i drugi domen IgSF, npr. IgV, varijante polipeptida CD155 i treći domen IgSF, npr. IgV, varijante polipeptida CD112. U nekim otelotvorenjima, prvi i

1

drugi imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid multidomenskog naslaganog molekula ima sekvencu koja je data u bilo kom od SEQ ID NO: 1722, 1723 i 1724 ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću identičnost sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1722, 1723 i 1724 i sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u domenu IgSF varijante CD112, CD155 i/ili PD-L1. U nekim otelotvorenjima, nastali multidomenski naslagani molekuli vezuju se za TIGIT, CD112R kao i za PD-1. U nekim aspektima, vezivanje za TIGIT je istog ili sličnog stepena ili, u nekim slučajevima, povećano, u poređenju sa vezivanjem za TIGIT odgovarajućeg domena IgSF nemodifikovanog ili divljeg tipa CD112 ili CD155. U nekim aspektima, vezivanje za CD112R je istog ili sličnog stepena ili, u nekim slučajevima, povećano, u poređenju sa vezivanjem za CD112R odgovarajućeg domena IgSF nemodifikovanog ili divljeg tipa CD112. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za TIGIT ili CD112R je najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više od vezivanja za TIGIT ili CD112R nenaslaganog oblika IgSF-Fc varijante CD112. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za TIGIT je najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više od vezivanja za TIGIT nenaslaganog oblika IgSF-Fc varijante CD155. U nekim otelotvorenjima, dobijeni multidomenski naslagani molekul povećava T-ćelijske imunske odgovore u poređenju sa nenaslaganom IgSF-Fc varijantom CD112, varijantom CD155-IgSF-Fc i/ili varijantom PD-L1-IgSF-Fc, kao što je utvrđeno u reporterskom testu. U nekim otelotvorenjima, povećanje je veće od 1,2 puta, 1,3 puta, 1,4 puta, 1,5 puta, 2,0 puta, 3,0 puta, 4,0 puta, 5,0 puta ili više.

C. Konjugati i fuzije varijanti polipeptida i imunomodulatornih proteina

[0266] U nekim otelotvorenjima, varijante polipeptida koje su ovde obezbeđene, koje su imunomodulatorni proteini koji sadrže varijante domena Ig iz familije IgSF (vIgD), mogu biti konjugovane ili fuzionisane sa ostatkom, kao što je efektorski ostatak, kao što je drugi protein, neposredno ili posredno, tako da grade konjugat („konjugat IgSF“). U nekim otelotvorenjima, vezivanje može biti kovalentno ili nekovalentno, npr. preko nekovalentne reakcije biotin-streptavidin. U nekim otelotvorenjima, ostatak može biti ciljajući ostatak, lek malog molekula (nepolipeptidni lek koji ima molarnu masu manju od 500 daltona), toksin, citostatički agens, citotoksični agens, imunosupresivni agens, radioaktivni agens koji je pogodan za dijagnostičke svrhe, jon radioaktivnog metala za terapeutske svrhe, enzim koji aktivira prolek, agens koji produžava biološki poluživot, ili dijagnostički ili detektabilni agens.

1

[0267] U nekim otelotvorenjima, efektorski ostatak je terapeutski agens, kao što je agens za lečenje kancera, koji je citotoksičan, citostatičan ili na drugi način pruža neku terapeutsku korist. U nekim otelotvorenjima, efektorski ostatak je ciljajući ostatak ili agens, kao što je agens koji cilja ćelijski površinski antigen, npr. antigen na površini ćelije tumora. U nekim otelotvorenjima, efektorski ostatak je oznaka koja može da stvori detektabilni signal, neposredno ili posredno. U nekim otelotvorenjima, efektorski ostatak je toksin. U nekim otelotvorenjima, efektorski ostatak je protein, peptid, nukleinska kiselina, mali molekul ili nanočestica.

[0268] U nekim otelotvorenjima, 1, 2, 3, 4, 5 ili više efektorskih ostataka, koji mogu biti isti ili različiti, konjugovano je, vezano ili fuzionisano sa varijantom polipeptida ili proteina, što daje konjugat IgSF. U nekim otelotvorenjima, takvi efektorski ostaci mogu biti vezani za varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina koristeći različite postupke molekularne biološke ili hemijske konjugacije i vezivanja koji su poznati u struci i opisani u nastavku. U nekim otelotvorenjima, linkeri, kao što su peptidni linkeri, raskidivi linkeri, neraskidivi linkeri ili linkeri koji pomažu u reakciji konjugacije, mogu da se koriste za vezivanje ili konjugaciju efektorskih ostataka sa varijantom polipeptida ili imunomodulatornog proteina.

[0269] U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF sadrži sledeće komponente: (protein ili polipeptid), (L)qi (efektorski ostatak)m, pri čemu je protein ili polipeptid bilo koji od opisanih varijanti polipeptida ili imunomodulatornih proteina koje mogu da vezuju jedan ili više liganda srodnih kontrastruktura kao što je opisano; L je linker za vezivanje proteina ili polipeptida sa ostatkom; m je najmanje 1; q je 0 ili više; a dobijeni konjugat IgSF se vezuje za ligande jedne ili više kontrastruktura. U konkretnim otelotvorenjima, m je 1 do 4, a q je 0 do 8.

[0270] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je konjugat IgSF koji sadrži varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina koja je ovde obezbeđena konjugovanu sa ciljajućim agensom koji se vezuje za ćelijski površinski molekul, na primer, za ciljanu isporuku varijante polipeptida ili imunomodulatornog proteina u specifičnu ćeliju. U nekim otelotvorenjima, ciljajući agens je molekul koji ima sposobnost da lokalizuje i vezuje molekul prisutan na normalnim ćelijama/tkivu i/ili tumorskim ćelijama/tumoru kod ispitanika. Drugim rečima, konjugati IgSF koji sadrže ciljajući agens mogu da se vezuju za

1

ligand (neposredno ili posredno) koji je prisutan na ćeliji, kao što je tumorska ćelija. Ciljajući agensi iz pronalaska koji su razmatrani za upotrebu uključuju antitela, polipeptide, peptide, aptamere, druge ligande ili bilo koju njihovu kombinaciju, koji mogu da vezuju komponentu ciljne ćelije ili molekula.

[0271] U nekim otelotvorenjima, ciljajući agens vezuje ćeliju(e) tumora ili može da se vezuje u blizini ćelije(a) tumora (npr. vaskulatura tumora ili mikrookruženje tumora) nakon primene na ispitaniku. Ciljajući agens može da se vezuje za receptor ili ligand na površini ćelije kancera. U još jednom aspektu pronalaska, izabran je ciljajući agens koji je specifičan za nekancerozne ćelije ili tkivo. Na primer, ciljajući agens može biti specifičan za molekul koji je u normalnim uslovima prisutan na određenoj ćeliji ili tkivu. Nadalje, u nekim otelotvorenjima, isti molekul može biti prisutan na normalnim ćelijama i ćelijama kancera. Poznate su različite ćelijske komponente i molekuli. Na primer, ako je cilajući agens specifičan za EGFR, dobijeni konjugat IgSF može da cilja ćelije kancera koje eksprimiraju EgFR kao i normalne epidermalne ćelije kože koje eksprimiraju EGFR. Stoga, u nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF iz pronalaska može da funkcioniše putem dva zasebna mehanizma (ciljanje ćelija kancera i nekancerskih ćelija).

[0272] U različitim aspektima pronalaska, ovde otkriveni konjugat IgSF iz pronalaska sadrži ciljajući agens koji može da vezuje/cilja ćelijsku komponentu, kao što je tumorski antigen, bakterijski antigen, virusni antigen, antigen mikoplazme, gljivični antigen, antigen priona, antigen parazita. U nekim aspektima, ćelijska komponenta, antigen ili molekul može da se koristi da označi željeni cilj za ciljajući agens. Na primer, u različitim otelotvorenjima, ciljajući agens je specifičan za komponentu ili se vezuje za nju, što uključuje, bez ograničenja, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR, ErbB-1, HER1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3/HER3, ErbB-4/HER4, familiju liganda EGFR; familiju receptora rasta nalik insulinu (IGFR), IGF vezujuće proteine (IGFBP), familiju liganda IGFR; familiju receptora faktora rasta izvedenog iz trombocita (PDGFR), familiju liganda PDGFR; familiju receptora faktora rasta fibroblasta (FGFR), familiju liganda FGFR, familiju receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR), familiju VEGF; familiju receptora HGF; familiju receptora TRK; familiju efrinskog receptora (EPH); familiju receptora AXL; familiju receptora leukocitne tirozin kinaze (LTK); familiju receptora TIE, angiopoetin 1,2; familiju receptora nalik tirozin kinazi receptora siročeta (ROR), npr. ROR1; CD171 (L1CAM); B7-H6 (NCR3LG1); PD-L1, antigen glikozilacije tumora, npr. sTn ili Tn, kao što je sTn Ag

1

MUC1; LHR (LHCGR); fosfatidil serin, familiju receptora diskoidinskog domena (DDR); familiju receptora RET; familiju receptora KLG; familiju receptora RYK; familiju receptora MuSK; receptore transformišućeg faktora rasta-α (TGF-α), TGF-β; receptore citokina, receptore klase I (familija hematopoetina) i klase II (familija interferona/IL-10), superfamiliju receptora faktora nekroze tumora (TNF) (TNFRSF), familiju receptora smrti; antigene kancera testisa (CT), antigene specifične za liniju, antigene diferencijacije, alfa-aktinin-4, ARTCl, fuzione proizvode regiona klastera tačke pucanja-Abelson (Bcr-abl), B-RAF, kaspazu-5 (CASP-5), kaspazu-8 (CASP-8), β-katenin (CTNNB1), ciklus ćelijske deobe 27 (CDC27), ciklin zavisnu kinazu 4 (CDK4), CDKN2A, COA-I, dek-can fuzioni protein, EFTUD-2, faktor elongacije 2 (ELF2), fuzioni protein Ets varijante gena 6/gena akutne mijeloidne leukemije 1 ETS (ETC6-AML1), fibronektin (FN), npr. ekstradomen A (EDA) fibronektina, GPNMB, fuzioni protein receptor lipida male gustine/GDP-L fukoza: β-D-galaktoza 2-α-L-fukoziltransferaza (LDLR/FUT), HLA-A2. promenu arginina u izoleucin na ostatku 170 α-heliksa α2-domena u genu HLA-A2 (HLA-A*201-R170I), HLA-Al 1, mutirani protein toplotnog šoka 70-2 (HSP70-2M), K1AA0205, MART2, sveprisutno mutirani melanom 1, 2, 3 (MUM-I, 2, 3), prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP), neo-PAP, miozin klase I, NFYC, OGT, OS-9, fuzioni protein pml-RARα, PRDX5, PTPRK, K-ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, RBAF600, SIRT2, SNRPDl, fuzioni protein SYT-SSXl ili -SSX2, trioza fosfat izomerazu, BAGE, BAGK- 1, BAGE-2,3,4,5, GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8, GnT-V (aberantna N-acetil glukozaminil transferaza V, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-I, LAGE, LAGE-I, CTL prepoznati antigen na melanomu (CAMEL), MAGE-Al (MAGE-I), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-AlO, MAGE-AI l, MAGE-A12, MAGE-3, MAGE-Bl, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE- Cl, MAGE-C2, mucin 1 (MUCl), MART-1/Melan-A (MLANA), gplOO, gplOO/ Pmell7 (SILV), tirozinazu (TYR), TRP-I, HAGE, NA-88, NY-ESO-I, NY-ESO-l/LAGE-2, SAGE, Spl7, SSX-1,2,3,4, TRP2-INT2, karcinoembrionski antigen (CEA), kalikrein 4, mamaglobin-A, OAl, antigen specifičan za prostatu (PSA), TRP- 1/ gp75, TRP-2, adipofilin, protein inducibilan interferonom odsutan kod melanoma 2 (AIM-2), BING-4, CPSF, ciklin Dl, adhezioni molekul epitelnih ćelija (Ep-CAM), EphA3, faktor rasta fibroblasta-5 (FGF-5), glikoprotein 250 (gp250), EGFR (ERBB1), HER-2/neu (ERBB2), α2 lanac receptora interleukina 13 (IL13Rα2), receptor IL-6, intestinalnu karboksil esterazu (iCE), alfa-feto protein (AFP), M-CSF, mdm-2, MUCl, p53 (TP53), PBF, PRAME, PSMA, RAGE-I, RNF43, RU2AS, SOXlO, STEAPl, survivin (BIRC5), reversnu transkriptazu humane telomeraze (hTERT), telomerazu, gen Vilmsovog tumora (WTl), SYCPl, BRDT,

14

SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE-5, LIP1, CTAGE-I, CSAGE, MMAl, CAGE, BORIS, HOM-TES-85, AF15ql4, HCA661, LDHC, MORC, SGY-1, SPOl 1, TPXl, NY-SAR-35, FTHL17, NXF2, TDRDl, TEX15, FATE, TPTE, imunoglobulinske idiotipove, Bens Džonsov protein, estrogene receptore (ER), androgene receptore (AR), CD40, CD30, CD20, CD 19, CD33, kancerski antigen 72-4 (CA 72-4), kancerski antigen 15-3 (CA 15-3), kancerski antigen 27- 29 (CA 27-29), kancerski antigen 125 (CA 125), kancerski antigen 19-9 (CA 19-9), β-humani horionski gonadotropin, β-2 mikroglobulin, antigen karcinoma skvamoznih ćelija, enolazu specifičnu za neurone, protein toplotnog šoka gp96, GM2, sargramostim, CTLA-4, 707 alanin prolin (707-AP), antigen adenokarcinoma prepoznat od strane T-ćelija 4 (ART- 4), karcinoembriogeni antigen peptid-1 (CAP-I), hloridni kanal 2 aktiviran kalcijumom (CLCA2), ciklofilin B (Cyp-B), humani tumor pečatnog prstena-2 (HST-2), proteine humanog papiloma virusa (HPV) (HPV-E6, HPV-E7, antigeni velikog ili malog kapsida, drugi), proteine Epštajn-Barovog virusa (EBV) (EBV latentni membranski proteini - LMPl, LMP2; drugi), proteine virusa hepatitisa B ili C, i proteine HIV.

[0273] U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF, preko ciljajućeg agensa, vezivaće ćelijsku komponentu tumorske ćelije, vaskulature tumora ili mikrookruženja tumora, čime se pospešuje ubijanje ciljnih ćelija putem modulacije imunskog odgovora (npr. putem aktivacije kostimulatornih molekula ili inhibicije negativnih regulatornih molekula aktivacije imunske ćelije), inhibicije signala za preživljavanje (npr. antagonisti faktora rasta ili citokina ili hormonskog receptora), aktivacije signala smrti, i/ili imunski posredovane citotoksičnosti, recimo putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela. Takvi konjugati mogu da funkcionišu putem nekoliko mehanizama za prevenciju, smanjenje ili eliminaciju ćelija tumora, kao što je olakšavanje isporučivanja konjugovanih efektorskih ostataka u tumorski cilj, recimo putem receptorski posredovane endocitoze konjugata IgSF, ili takvi konjugati mogu da regrutuju, vezuju i/ili aktiviraju imunske ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije, T ćelije, B ćelije). Štaviše, u nekim slučajevima, jedan ili više prethodnih puteva može da funkcioniše nakon primene jednog ili više konjugata IgSF iz pronalaska.

[0274] U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF, preko ciljajućeg agensa, biće lokalizovan, recimo vezan, za ćelijsku komponentu ćelije tumora, vaskulature tumora ili mikrookruženja tumora, čime se moduliraju ćelije imunskog odgovora u blizini tumora. U nekim otelotvorenjima, ciljajući agens olakšava isporučivanje konjugovanog IgSF (npr. vIgD) u tumorski cilj, recimo putem interakcije sa srodnim vezujućim partnerom radi izmene signalizacije imunskih ćelija (npr. NK ćelija, monocita/makrofaga, dendritiskih ćelija, T ćelija, B ćelija) koje nose srodnog vezujućeg partnera. U nekim otelotvorenjima, lokalizovana isporuka posreduje antagonizujuću ili blokirajuću aktivnost inhibitornog receptora PD-1. U nekim otelotvorenjima, lokalizovana isporuka agonizuje inhibitorni receptor PD-1, koji, u nekim slučajevima, može da se javi kada postoji proksimalno grupisanje aktivirajućeg receptora.

[0275] U nekim otelotvorenjima, ciljajući agens je imunoglobulin. Kao što se ovde koristi, termin „imunoglobulin“ obuhvata prirodna ili veštačka jedno- ili viševalentna antitela, uključujući, bez ograničenja, poliklonska, monoklonska, multispecifična, humana, humanizovana ili himerna antitela, jednolančana antitela, fragmente Fab, fragmente F(ab'), fragmente proizvedene putem ekspresione biblioteke Fab, jednolančani Fv (scFv); antiidiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr. anti-Id antitela za antitela iz pronalaska), i fragmente koji vezuju epitop bilo čega od prethodnog. Termin „antitelo“, kao što se ovde koristi, označava molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, npr. molekule koji sadrže antigen vezujuće mesto koje imunospecifično vezuje antigen. Molekuli imunoglobulina iz pronalaska mogu biti bilo koje vrste (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl i IgA2) ili potklase molekula imunoglobulina.

[0276] U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF, preko ostatka koji cilja antitelo, vezivaće ćelijsku komponentu tumorske ćelije, vaskulature tumora ili mikrookruženja tumora, čime se pospešuje apoptoza ciljnih ćelija putem modulacije imunskog odgovora (npr. putem aktivacije kostimulatornih molekula ili inhibicije negativnih regulatornih molekula aktivacije imunske ćelije), inhibicije signala za preživljavanje (npr. antagonisti faktora rasta ili citokina ili hormonskog receptora), aktivacije signala smrti, i/ili imunski posredovane citotoksičnosti, recimo putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela. Takvi konjugati mogu da funkcionišu putem nekoliko mehanizama za prevenciju, smanjenje ili eliminaciju ćelija tumora, kao što je olakšavanje isporučivanja konjugovanih efektorskih ostataka u tumorski cilj, recimo putem receptorski posredovane endocitoze konjugata IgSF, ili takvi konjugati mogu da regrutuju, vezuju i/ili aktiviraju imunske ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije, T ćelije, B ćelije).

[0277] U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF, preko ostatka koji cilja antitelo, vezivaće ćelijsku komponentu tumorske ćelije, vaskulature tumora ili mikrookruženja tumora, čime se modulira imunski odgovor (npr. putem aktivacije kostimulatornih molekula ili inhibicije negativnih regulatornih molekula aktivacije imunskih ćelija). U nekim otelotvorenjima, takvi konjugati mogu da prepoznaju, vezuju i/ili moduliraju (npr. inhibiraju ili aktiviraju) imunske ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije, T ćelije, B ćelije).

[0278] Ostaci koji ciljaju antitelo iz pronalaska uključuju fragmente antitela koji uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, jednolančane Fv (scFv), jednolančana antitela, disulfidno vezane Fv (sdFv) i fragmente koji sadrže VL ili VH domen. Antigen vezujući fragmenti antitela, uključujući jednolančana antitela, mogu da sadrže varijabilni region (regione), samostalno ili u kombinaciji sa celinom ili delom sledećeg: regiona šarke, domena CH1, CH2 i CH3. U pronalazak su takođe uključeni antigen vezujući fragmenti koji takođe sadrže bilo koju kombinaciju varijabilnih regiona sa regionom šarke, domenima CH1, CH2 i CH3. U pronalazak su takođe uključeni fragmenti Fc, antigen-Fc fuzioni proteini, i konjugati Fc-ciljajućeg ostatka ili fuzioni proizvodi (Fc-peptid, Fc-aptamer). Ostaci koji ciljaju antitelo iz pronalaska mogu biti poreklom iz bilo koje životinje, uključujući ptice i sisare. U jednom aspektu, ostaci koji ciljaju antitelo su humani, mišji (npr. miša ili pacova), magareći, ovčji, zečji, kozji, zamorca, kamilji, konjski ili kokošji. Nadalje, takva antitela mogu biti humanizovane verzije životinjskih antitela. Ostaci koji ciljaju antitelo iz pronalaska mogu biti monospecifični, bispecifični, trispecifični, ili mogu imati još veću multispecifičnost.

[0279] U različitim otelotvorenjima, antitelo/ciljajući ostatak regrutuje, vezuje i/ili aktivira imunske ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije) putem interakcija između Fc (u antitelima) i Fc receptora (na imunskim ćelijama) i preko konjugovanih varijanti polipeptida ili imunomodulatornih proteina koji su ovde obezbeđeni. U nekim otelotvorenjima, antitelo/ciljajući ostatak prepoznaje ili vezuje tumorski agens i lokalizuje konjugovane varijante polipeptida ili imunomodulatorne proteine koji su ovde obezbeđeni na tumorsku ćeliju da bi se olakšala modulacija imunskih ćelija u blizini tumora.

[0280] Primeri za antitela koja mogu biti inkorporisana u konjugate IgSF uključuju, ali nisu ograničeni na antitela kao što je cetuksimab (IMC-C225; Erbitux<®>), trastuzumab (Herceptin<®>), rituksimab (Rituxan<®>; MabThera<®>), bevacizumab (Avastin<®>), alemtuzumab (Campath<®>; Campath-1H<®>; Mabcampath<®>), panitumumab (ABX-EGF; Vectibix<®>),

14

ranibizumab (Lucentis<®>), ibritumomab, ibritumomab tiuksetan, (Zevalin<®>), tozitumomab, jod I 131 tozitumomab (BEXXAR<®>), katumaksomab (Removab<®>), gemtuzumab, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg<®>), abatacept (CTLA4-Ig; Orencia<®>), belatacept (L104EA29YIg;

LEA29Y; LEA), ipilimumab (MDX-010; MDX-101), tremelimumab (ticilimumab; CP-675,206), PRS-010, PRS-050, aflibercept (VEGF Trap, AVE005), volociksimab (M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), ciksutumumab (IMC-A12), matuzumab (EMD72000), nimotuzumab (h-R3), zalutumumab (HuMax-EGFR), necitumumab IMC-11F8, mAb806 / ch806, Sym004, mAb-425, panoreks @ (17-1A) (mišje monoklonsko antitelo); panoreks @ (17-1A) (himerno mišje monoklonsko antitelo); IDEC- Y2B8 (mišje, anti- CD2O MAb); BEC2 (antiidiotipsko MAb, oponaša epitop GD) (sa BCG); onkolim (Lym-1 monoklonsko antitelo); SMART MI95 Ab, humanizovan 13' ILYM-I (onkolim), ovareks (B43.13, antiidiotipsko mišje MAb); MDX-210 (humanizovano anti-HER-2 bispecifično antitelo); 3622W94 MAb koje se vezuje za EGP40 (17-1A) antigen pankarcinoma na adenokarcinomima; Anti-VEGF, zenapaks (SMART Anti-Tac (IL-2 receptor); SMART MI95 Ab, humanizovano Ab, humanizovano); MDX-210 (humanizovano anti- HER-2 bispecifično antitelo); MDX-447 (humanizovani bispecifično antitelo na receptor EGF); NovoMAb-G2 (Ab specifično za pankarcinom); TNT (himerno MAb za histonske antigene); TNT (himerno MAb za histonske antigene); gliomab-H (monoklon s -humanizovana Ab); GNI-250 Mab; EMD-72000 (himerni-EGF antagonist); LymphoCide (humanizovano LL2 antitelo); i MDX-260 bispecifično, cilja GD-2, ANA Ab, SMART IDlO Ab, SMART ABL 364 Ab ili ImmuRAIT-CEA. Kao što se može videti na osnovu prethodnog spiska, antitela se uobičajeno prave za konkretni ciljni epitop.

[0281] U nekim otelotvorenjima, ostatak koji cilja antitelo je antitelo kompletne dužine, ili njegov antigen vezujući fragment, koji sadrži domen Fc. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida ili imunomodulatornog proteina je konjugovana sa delom Fc ostatka koji cilja antitelo, recimo konjugacijom sa N-terminusom dela Fc antitela.

[0282] U nekim otelotvorenjima, vIgD je vezan, neposredno ili posredno, sa N- ili C-terminusom lakog i/ili teškog lanca antitela. U nekim otelotvorenjima, veza može biti preko peptidnog linkera, kao što je prethodno opisano. Mogu da se naprave različite konfiguracije. SL. 7A-7C prikazuje primere konfiguracija. U nekim otelotvorenjima, konjugat antitela može da se proizvede zajedničkom ekspresijom teškog i lakog lanca antitela u ćeliji.

[0283] U jednom aspektu pronalaska, ciljajući agens je molekul aptamera. Na primer, u nekim otelotvorenjima, aptamer je sačinjen od nukleinskih kiselina koje funkcionišu kao ciljajući agens. U različitim otelotvorenjima, konjugat IgSF iz pronalaska sadrži aptamer koji je specifičan za molekul na ćeliji tumora, vaskulaturu tumora i/ili mikrookruženje tumora. U nekim otelotvorenjima, sam aptamer može da sadrži biološki aktivnu sekvencu, pored (sekvence) ciljajućeg modula, pri čemu biološki aktivna sekvenca može da indukuje imunski odgovor na ciljnu ćeliju. Drugim rečima, takav molekul aptamera je agens sa dvostrukom primenom. U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF iz pronalaska sadrži konjugaciju aptamera sa antitelom, pri čemu su aptamer i antitelo specifični za vezivanje za različite molekule na ćeliji tumora, vaskulaturi tumora, mikrookruženju tumora i/ili imunskim ćelijama.

[0284] Termin „aptamer“ uključuje DNK, RNK ili peptide koji su izabrani na osnovu specifičnih osobina vezivanja za određeni molekul. Na primer, aptamer može da se izabere za vezivanje konkretnog gena ili genskog proizvoda u ćeliji tumora, vaskulaturi tumora, mikrookruženju tumora i/ili imunskoj ćeliji, kao što je ovde otkriveno, pri čemu se odabir vrši postupcima koji su poznati u struci i bliski stručnjaku.

[0285] U nekim aspektima pronalaska, ciljajući agens je peptid. Na primer, varijante polipeptida ili imunomodilatornih proteina koje su ovde obezbeđene mogu biti konjugovane sa peptidom koji može da vezuje komponentu kancera ili ćelije tumora. Stoga, takvi konjugati IgSF iz pronalaska sadrže peptidne ciljajuće agense koji se vezuju za ćelijsku komponentu ćelije tumora, vaskulature tumora i/ili komponente mikrookruženja tumora. U nekim otelotvorenjima, peptidi ciljajući agensi mogu biti antagonisti ili agonisti integrina. Integrini, koji sadrže alfa i beta podjedinicu, uključuju brojne vrste dobro poznate stručnjaku.

[0286] U jednom otelotvorenju, ciljajući agens je Vvβ3. Integrin Vvβ3 se eksprimira na različitim ćelijama i pokazalo se da posreduje u nekoliko biološki relevantnih procesa, uključujući adheziju osteoklasta za koštanu matricu, migraciju vaskularnih ćelija glatkih mišića i angiogenezu. Pogodni ciljajući molekuli za integrine uključuju RGD peptide ili peptidomimetike, kao i peptide ili peptidomimetike koji nisu RGD (vidite, npr. U.S. pat. br.

5,767,071 i 5,780,426) za druge integrine kao što je V4.βi (VLA-4), V4-P7 (vidite, npr. U.S. pat. br.6,365,619; Chang et al, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:159-163 (2002); Lin et al., Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:133-136 (2002)), i slično.

14

[0287] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je konjugat IgSF koji sadrži ovde obezbeđenu varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina konjugovanu sa terapeutskim agensom. U nekim otelotvorenjima, terapeutski agens uključuje, na primer, daunomicin, doksorubicin, metotreksat i vindezin (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187, 1986). U nekim otelotvorenjima, terapeutski agens ima intracelularnu aktivnost. U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF je internalizovan i terapeutski agens je citotoksin koji blokira sintezu proteina ćelije, što dovodi do smrti ćelije. U nekim otelotvorenjima, terapeutski agens je citotoksin koji sadrži polipeptid koji ima aktivnost inaktivacije ribozoma, uključujući, na primer, gelonin, buganin, saporin, ricin, lanac A ricina, briodin, toksin difterije, restriktocin, egzotoksin A pseudomonasa i njihove varijante. U nekim otelotvorenjima, kada je terapeutski agens citotoksin koji sadrži polipeptid koji ima aktivnost inaktivacije ribozoma, konjugat IgSF mora biti internalizovan prilikom vezivanja za ciljnu ćeliju kako bi protein biti citotoksičan po ćelije.

[0288] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je konjugat IgSF koji sadrži ovde obezbeđenu varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina konjugovanu sa toksinom. U nekim otelotvorenjima, toksin uključuje, na primer, bakterijske toksine kao što je toksin difterije, biljne toksine kao što je ricin, toksine malog molekula kao što je geldanamicin (Mandler et al., J.Nat. Cancer Inst.92(19):1573-1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem.13:786-791 (2002)), majtanzinoid (EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)), i kaliheamicin (Lode et al., Cancer Res.58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res.53:3336-3342 (1993)). Toksini mogu da vrše citotoksično i citostatično dejstvo putem mehanizama koji uključuju vezivanje tubulina, vezivanje DNK ili inhibiciju topoizomeraze.

[0289] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je konjugat IgSF koji sadrži ovde obezbeđenu varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina konjugovanu sa oznakom koja može da generiše detektabilni signal, neposredno ili posredno. Ovi konjugati IgSF mogu da se koriste za istraživačke ili dijagnostičke primene, kao što je in vivo detekcija kancera. Oznaka poželjno može da proizvede, neposredno ili posredno, detektabilni signal. Na primer, oznaka može biti radiološki neprozirna ili radioizotop, kao što je 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; fluorescentno (fluorofor) ili hemiluminescentno (hromofor) jedinjenje, kao što je fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin; enzim, kao što je alkalna fosfataza, β-

14

galaktozidaza ili peroksidaza rena; agens za snimanje; ili jon metala. U nekim otelotvorenjima, oznaka je radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer 99Tc ili 123I, ili spin oznaka za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (poznato i kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je cirkonijum-89, jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.

Cirkonijum-89 može da gradi komplekse sa različitim helatorima metala i da se konjuguje sa antitelima, npr. za PET snimanje (WO 2011/056983). U nekim otelotvorenjima, konjugat IgSF može da se detektuje posrednim putem. Na primer, sekundarno antitelo koje je specifično za konjugat IgSF i sadrži detektabilnu oznaku može da se koristi za detekciju konjugata IgSF.

[0290] Konjugati IgSF mogu da se pripreme koristeći bilo koje postupke koji su poznati u struci. Vidite, npr. WO 2009/067800, WO 2011/133886, i U.S. publikaciju patentne prijave br. 2014322129.

[0291] Varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina iz konjugata IgSF mogu biti „vezane za“ efektorski ostatak na bilo koji način na koji varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina mogu da se dovedu u vezu ili vežu sa efektorskim ostatkom. Na primer, varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina iz konjugata IgSF mogu biti vezane za efektorski ostatak hemijskim ili rekombinantnim putem. Hemijska sredstva za pripremu fuzija ili konjugata poznata su u struci i mogu da se koriste za pripremu konjugata IgSF. Postupci koji se koriste za konjugaciju varijanti polipeptida ili imunomodulatornih proteina i efektorskog ostatka moraju da omoguće vezivanje varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina sa efektorskim ostatkom bez ometanja sposobnosti varijanti polipeptida ili imunomodulatornih proteina da se vezuju za ligande jedne ili više kontrastruktura.

[0292] Varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina iz konjugata IgSF mogu biti posredno vezane za efektorski ostatak. Na primer, varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina iz konjugata IgSF mogu biti neposredno vezane za lipozom koji sadrži efektorski ostatak jedne ili više vrsta. Efektorski ostaci i/ili varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina takođe mogu biti vezani za čvrstu površinu.

14

[0293] U nekim otelotvorenjima, varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina konjugata IgSF i efektorski ostatak su proteini i mogu biti konjugovani koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Dostupno je nekoliko stotina kroslinkera koji mogu da konjuguju dva proteina. (Vidite, na primer, „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking,“ 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). Kroslinker se generalno bira na osnovu reaktivnih funkcionalnih grupa koje su dostupne ili insertovane na varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina i/ili efektorski ostatak. Pored toga, ako nema reaktivnih grupa, može da se koristi fotoaktivabilni kroslinker. U određenim slučajevima, može biti poželjno da se između varijanti polipeptida ili imunomodulatornih proteina i efektorskog ostatka uključi spejser. Agensi za umrežavanje koji su poznati u struci uključuju homobifunkcionalne agense: glutaraldehid, dimetiladipimidat i bis(diazobenzidin) i heterobifunkcionalne agense: m maleimidobenzoil-N-hidroksi sukcinimid i sulfo-m maleimidobenzoil-N-hidroksi sukcinimid.

[0294] U nekim otelotvorenjima, varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina konjugata IgSF mogu biti konstruisane sa specifičnim ostacima za hemijsko vezivanje efektorskog ostatka. Specifični ostaci koji se koriste za hemijsko vezivanje molekula koji su poznati u struci uključuju lizin i cistein. Kroslinker se bira na osnovu reaktivnih funkcionalnih grupa koje su insertovane u varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina, i dostupne na efektorskom ostatku.

[0295] Konjugat IgSF takođe može da se pripremi koristeći tehnike rekombinacije DNK. U takvom slučaju, sekvenca DNK koja kodira varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina je fuzionisana sa sekvencom DNK koja kodira efektorski ostatak, što daje molekul himerne DNK. Sekvenca himerne DNK se transficira u ćeliju domaćina koja eksprimira fuzioni protein. Fuzioni protein može da se izoluje iz ćelijske kulture i prečisti koristeći tehnike koje su poznate u struci.

[0296] Primeri za vezivanje efektorskog ostatka, koji je oznaka, sa varijantama polipeptida ili imunomodulatornih proteina, uključuju postupke koji su opisani u Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth.

40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem.30:407 (1982); Wensel i Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983); i Colcher et al.,

14

„Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice“, Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986).

[0297] Radiološke ili druge oznake mogu biti inkorporisane u konjugat na poznate načine. Na primer, peptid može biti biosintetisan ili može biti sintetisan putem hemijske sinteze aminokiselina koristeći odgovarajuće aminokiselinske prekursore koji sadrže, npr. fluor-19 umesto vodonika. Oznake poput 99Tc ili 123I, 186Re, 188Re i 111In mogu da se vežu preko cisteinskog ostatka u peptidu. Itrijum-90 može da se veže preko ostatka lizina. IODOGEN postupak (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978)) može da se koristi za inkorporaciju joda-123. „Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy“ (Chatal, CRC Press 1989) detaljno opisuje druge postupke.

[0298] Konjugati varijanti polipeptida ili imunomodulatornih proteina i citotoksičnog agensa mogu da se naprave koristeći različite bifunkcionalne agense za kuplovanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1 -karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCI), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)- etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1 ,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricin može da se pripremi kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).1-p-izotiocijanatobenzil-3-metil dietilentriamin pentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 predstavlja primer helatora za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Vidite, npr. WO94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može da se koristi kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetilni linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); U.S. patent br.

5,208,020).

[0299] Konjugati IgSF iz pronalaska izričito razmatraju, bez ograničenja, konjugate leka pripremljene sa reagensima za umrežavanje: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SlAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. od kompanije Pierce Biotechnology,

14

Inc., Rockford, IL, U.S.A). Vidite strane 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

D. Transmembranski i sektretabilni imunomodulatorni proteini i konstruisane ćelije

[0300] Ovde su obezbeđene konstruisane ćelije koje eksprimiraju imunomodulatornu varijantu polipeptida PD-L1 (alternativno, „konstruisane ćelije“). U nekim otelotvorenjima, eksprimirana imunomodulatorna varijanta polipeptida PD-L1 je transmembranski protein i eksprimira se na površini. U nekim otelotvorenjima, eksprimirana imunomodulatorna varijanta polipeptida PD-L1 se eksprimira i izlučuje iz ćelije.

1. Transmembranski imunomodulatorni proteini

[0301] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 može biti protein vezan za membranu. Kao što je u nastavku detaljnije opisano, imunomodulatorni polipeptid može biti transmembranski imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu PD-L1 u kojoj se nalazi: ektodomen koji sadrži najmanje jedan afinitetno modifikovani domen IgSF (IgV i opciono IgC), transmembranski domen i, opciono, citoplazmatski domen. U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein može biti eksprimiran na površini imunske ćelije, kao što je ćelija sisara, uključujući i površinu limfocita (npr. T ćelija ili NK ćelija) ili antigen prezentujuće ćelije. U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein se eksprimira na površini T-ćelije sisara, uključujući T-ćelije kao što su: T pomoćna ćelija, citotoksična T-ćelija (alternativno, citotoksični T limfocit ili CTL), T-ćelija prirodni ubica, regulatorna T-ćelija, memorijska T-ćelija ili gama delta T-ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija sisara je antigen prezentujuća ćelija (APC). Uobičajeno, ali ne i uvek, ektodomen (alternativno „ekstracelularni domen“) sadrži jednu ili više aminokiselinskih varijacija (npr. aminokiselinskih supstitucija) varijante PD-L1 iz pronalaska. Tako, na primer, u nekim otelotvorenjima, transmembranski protein će sadržati ektodomen koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija varijante PD-L1 iz pronalaska.

[0302] U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije eksprimiraju varijantu polipeptida PD-L1 koji su transmembranski imunomodulatorni polipeptidi (TIP) koji mogu biti membranski protein, kao što je transmembranski protein. U tipičnim otelotvorenjima, ektodomen

1

membranskog proteina sadrži ekstracelularni domen ili njegov domen IgSF varijante PD-L1 koja je ovde obezbeđena, u kome se nalazi jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u najmanje jednom domenu IgSF, kao što je opisano. Transmembranski imunomodulatorni proteini koji su ovde obezbeđeni dalje sadrže transmembranski domen vezan za ektodomen. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen daje kodirani protein za površinsku ćelijsku ekspresiju na ćeliji. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen je neposredno vezan za ektodomen. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen je posredno vezan za ektodomen preko jednog ili više linkera ili spejsera. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen sadrži pretežno hidrofobne aminokiselinske ostatke, kao što su leucin i valin.

[0303] U nekim otelotvorenjima, transmembranski anker domen kompletne dužine može da se koristi da se osigura da će TIP biti eksprimirani na površini konstruisane ćelije, kao što je konstruisana T-ćelija. On bi pogodno mogao biti poreklom iz određenog nativnog proteina koji se afinitetno modifikuje (npr. PD-L1 ili drugi nativni protein IgSF), i jednostavno se fuzioniše sa sekvencom prvog domena proksimalnog membrani na sličan način kao nativni protein IgSF (npr. PD-L1). U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein sadrži transmembranski domen odgovarajućeg divljeg tipa ili nemodifikovanog člana IgSF, kao što je transmembranski domen sadržan u sekvenci aminokiselina koja je data u SEQ ID NO:3 (tabela 2). U nekim otelotvorenjima, oblik vezan za membranu sadrži transmembranski domen odgovarajućeg divljeg tipa ili nemodifikovanog polipeptida, kao što je onaj koji odgovara ostacima 239-259 SEQ ID NO:3.

[0304] U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen je nenativni transmembranski domen koji nije transmembranski domen nativnog PD-L1. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen je dobijen od transmembranskog domena drugog člana familije polipeptida PD-L1 koji je membranski vezan ili transmembranski protein. U nekim otelotvorenjima, može da se koristi transmembranski anker domen drugog proteina na T-ćelijama. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen je izveden iz CD8. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen može dalje da sadrži ekstracelularni deo CD8 koji ima ulogu spejser domena. Primer za transmembranski domen izveden iz CD8 dat je u SEQ ID NO: 242 ili 1164 ili njegovom delu koji sadrži transmembranski domen CD8. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen je sintetički transmembranski domen.

1 1

[0305] U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein dalje sadrži endodomen, kao što je citoplazmatski signalni domen, vezan za transmembranski domen. U nekim otelotvorenjima, citoplazmatski signalni domen indukuje ćelijsku signalizaciju. U nekim otelotvorenjima, endodomen transmembranskog imunomodulatornog proteina sadrži citoplazmatski domen odgovarajućeg divljeg tipa ili nemodifikovanog polipeptida, kao što je citoplazmatski domen sadržan u sekvenci aminokiselina koja je data u SEQ ID NO:3 (vidite tabelu 2).

[0306] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni transmembranski imunomodulatorni protein koji predstavlja ili sadrži varijantu PD-L1 sadrži sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 191 i sadrži ektodomen koji sadrži najmanje jedan afinitetno modifikovani domen IgSF PD-L1, kao što je opisano, i transmembranski domen. U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein sadrži bilo koju pojedinačnu ili više aminokiselinskih supstitucija u domenu IgSF (npr. domenu IgV), kao što je opisano, uključujući bilo koju datu u tabeli 1. U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein može dalje da sadrži citoplazmatski domen, kao što je opisano. U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein može dalje da sadrži signalni peptid. U nekim otelotvorenjima, signalni peptid je nativni signalni peptid člana IgSF divljeg tipa, kao što je signalni peptid sadržan u sekvenci aminokiselina koja je data u SEQ ID NO:3 (vidite, npr. tabelu 2).

[0307] Takođe je obezbeđen molekul aminokiseline koji kodira takve transmembranske imunomodulatorne proteine. U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira transmembranski imunomodulatorni protein sadrži sekvencu nukleotida koja kodira sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 191 i sadrži ektodomen koji sadrži najmanje jedan afinitetno modifikovani domen IgSF, kao što je opisano, transmembranski domen i, opciono, citoplazmatski domen. U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline može dalje da sadrži sekvencu nukleotida koja kodira signalni peptid. U nekim otelotvorenjima, signalni peptid je nativni signalni peptid odgovarajućeg člana IgSF divljeg tipa (vidite, npr. tabelu 2).

1 2

[0308] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni su CAR-povezani transmembranski imunomodulatorni proteini u kojima endodomen transmembranskog imunomodulatornog proteina sadrži domen citoplazmatske signalizacije koji sadrži najmanje jedan signalni domen koji sadrži ITAM (motiv aktivacije imunoreceptora na bazi tirozina). ITAM je očuvani motiv koji se nalazi kod brojnih signalnih domena proteina uključenih u transdukciju signala imunskih ćelija, uključujući CD3-zeta lanac („CD3-z“) koji učestvuje u transdukciji signala T-ćelijskog receptora. U nekim otelotvorenjima, endodomen sadrži domen signalizacije CD3-zeta. U nekim otelotvorenjima, domen signalizacije CD3-zeta sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 243, ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO:243 i zadržava aktivnost T-ćelijske signalizacije. U nekim otelotvorenjima, endodomen CAR-povezanog transmembranskog imunomodulatornog proteina može dalje da sadrži kostimulatorni domen signalizacije za dalju modulaciju imunomodulatornih odgovora T-ćelija. U nekim otelotvorenjima, kostimulatorni domen signalizacije je CD28, ICOS, 41BB ili OX40. U nekim otelotvorenjima, kostimulatorni domen signalizacije je izveden iz CD28 ili 4-1BB i sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u bilo kom od SEQ ID NO: 1165-1168 ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO:1165-1168 i zadržava aktivnost T-ćelijske kostimulatorne signalizacije. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni CAR-povezani transmembranski imunomodulatorni proteini imaju osobine CAR da stimulišu T-ćelijsku signalizaciju prilikom vezivanja afinitetno modifikovanog domena IgSF za srodnog vezujućeg partnera ili kontrastrukturu. U nekim otelotvorenjima, specifično vezivanje afinitetno modifikovanog domena IgSF za njegovu kontrastrukturu može dovesti do promena imunološke aktivnosti T-ćelijske aktivnosti, što se može videti na osnovu promena citotoksičnosti, proliferacije ili proizvodnje citokina.

[0309] U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein ne sadrži endodomen koji može da posreduje citoplazmatsku signalizaciju. U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein nema mehanizam za transdukciju signala divljeg tipa ili nemodifikovanog polipeptida, te stoga ne indukuje ćelijsku signalizaciju. U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein nema intracelularni (citoplazmatski ) domen ili deo intracelularnog domena odgovarajućeg divljeg tipa ili nemodifikovanog polipeptida, kao što je domen citoplazmatske signalizacije sadržan u

1

sekvenci aminokiselina koja je data u SEQ ID NO:3 (vidite tabelu 2). U nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein ne sadrži ITIM (motiv inhibicije imunoreceptora na bazi tirozina), koji je sadržan u određenim inhibitornim receptorima, uključujući inhibitorne receptore familije IgSF (npr. PD-1 ili TIGIT). Tako, u nekim otelotvorenjima, transmembranski imunomodulatorni protein sadrži samo ektodomen i transmembranski domen, kao što je bilo koji opisan.

2. Izlučeni imunomodulatorni proteini i konstruisane ćelije

[0310] U nekim otelotvorenjima, varijanta imunomodulatornog polipeptida PD-L1 koja sadrži bilo koju pojedinačnu ili više aminokiselinskih mutacija, kao što je ovde opisano, može da se izlučuje, na primer kada se eksprimira iz ćelije. Takva varijanta imunomodulatornog proteina PD-L1 ne sadrži transmembranski domen. U nekim otelotvorenjima, varijanta imunomodulatornog proteina PD-L1 nije konjugovana sa ostatkom koji produžava poluživot (kao što je domen Fc ili domen multimerizacije). U nekim otelotvorenjima, varijanta imunomodulatornog proteina PD-L1 sadrži signalni peptid, npr. signalni peptid antitela ili drugu efikasnu signalnu sekvencu za sprovođenje domena izvan ćelije. U situaciji kada imunomodulatorni protein sadrži signalni peptid i eksprimira ga konstruisana ćelije, signalni peptid dovodi do izlučivanja imunomodulatornog proteina iz konstruisane ćelije. Uopšteno govoreći, signalni peptid, ili deo signalnog peptida, cepa se sa imunomodulatornog proteina prilikom izlučivanja. Imunomodulatorni protein može biti kodiran nukleinskom kiselinom (koja može biti deo ekspresionog vektora). U nekim otelotvorenjima, ćelija (kao što je imunska ćelija, na primer primarna imunska ćelija) eksprimira i luči imunomodulatorni protein.

[0311] Tako, u nekim otelotvorenjima, obezbeđene su varijante imunomodulatornih proteina PD-L1 koje dalje sadrže signalni peptid. U nekim otelotvorenjima, ovde je obezbeđen molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu imunomodulatornog proteina PD-L1 operativno povezanu sa sekvencom sekrecije koja kodira signalni peptid.

[0312] Signalni peptid je sekvenca na N-terminusu imunomodulatornog proteina koja daje signal za izlučivanje imunomodulatornog proteina iz ćelije. U nekim otelotvorenjima, signalni peptid je dugačak oko 5 do oko 40 aminokiselina (na primer, dugačak oko 5 do oko

1 4

7, oko 7 do oko 10, oko 10 do oko 15, oko 15 do oko 20, oko 20 do oko 25, ili oko 25 do oko 30, oko 30 do oko 35, ili oko 35 do oko 40 aminokiselina).

[0313] U nekim otelotvorenjima, signalni peptid je nativni signalni peptid odgovarajućeg PD-L1 divljeg tipa (vidite tabelu 2). U nekim otelotvorenjima, signalni peptid je nenativni signalni peptid. Na primer, u nekim otelotvorenjima, nenativni signalni peptid je mutantni nativni signalni peptid odgovarajućeg PD-L1 divljeg tipa, i može da uključuje jednu ili više (recimo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više) supstitucija, insercija ili delecija. U nekim otelotvorenjima, nenativni signalni peptid je signalni peptid ili mutant signalnog peptida člana familije iz iste familije IgSF kao što je slučaj sa članom familije IgSF divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, nenativni signalni peptid je signalni peptid ili mutant signalnog peptida člana familije iz različite familije IgSF u odnosu na člana familije IgSF divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, signalni peptid je signalni peptid ili mutant signalnog peptida familije proteina koja nije IgSF, kao što je signalni peptid imunoglobulina (kao što je teški lanac IgG ili kapa laki lanac IgG), citokin (kao što je interleukin-2 (IL-2) ili CD33), protein serumskog albumina (npr. HSA ili albumin), preproteinska signalna sekvenca humanog azurocidina, luciferaza, tripsinogen (npr. himotripsinogen ili tripsinogen) ili drugi signalni peptid koji efikasno može da izlučuje protein iz ćelije. Primeri za signalne peptide uključuju sve opisane u tabeli 9.

1

MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA

1

[0314] U nekim otelotvorenjima sekretabilne varijante imunomodulatornog proteina PD-L1, imunomodulatorni protein sadrži signalni peptid kada se eksprimira, i signalni peptid (ili njegov deo) raskida se sa imunomodulatornog proteina prilikom izlučivanja.

[0315] U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije eksprimiraju varijante polipeptida PD-L1 koje se izlučuju iz ćelije. U nekim otelotvorenjima, takva varijanta polipeptida PD-L1 je kodirana molekulom nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorni protein pod operativnom kontrolom signalne sekvence za izlučivanje. U nekim otelotvorenjima, kodirani imunomodulatorni protein se izlučuje kada se eksprimira iz ćelije. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline ne sadrži transmembranski domen. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline ne sadrži ostatak koji produžava poluživot (kao što je domen Fc ili domen multimerizacije). U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline sadrži signalni peptid. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina iz pronalaska dalje sadrži sekvencu nukleotida koja kodira sekretorni ili signalni peptid operativno vezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira imunomodulatorni protein, što omogućava izlučivanje imunomodulatornog proteina

3. Ćelije i konstruisane ćelije

[0316] Ovde su obezbeđene konstruisane ćelije koje eksprimiraju bilo koji od obezbeđenih imunomodulatornih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije na svojoj

1

površini eksprimiraju bilo koji od obezbeđenih transmembranskih imunomodulatornih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije eksprimiraju imunomodulatorni protein iz ćelija i sposobne su ili su u stanju da ga izlučuju u uslovima koji su odgovarajući za izlučivanje proteina. U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein se eksprimira na limfocitu, kao što je limfocit koji infiltrira tumor (TIL), T-ćelija ili NK ćelija, ili na mijeloidnoj ćeliji. U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije su antigen prezentujuće ćelije (APC). U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije su konstruisane T-ćelije sisara ili konstruisane antigen prezentujuće ćelije sisara (APC). U nekim otelotvorenjima, konstruisane T-ćelije ili APC su ljudske ili mišje ćelije.

[0317] U nekim otelotvorenjima, konstruisane T-ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, T pomoćnu ćeliju, citotoksičnu T-ćeliju (alternativno, citotoksični T limfocit ili CTL), T-ćeliju prirodnog ubicu, regulatornu T-ćeliju, memorijsku T-ćeliju ili gama delta T-ćeliju. U nekim otelotvorenjima, konstruisane T-ćelije su CD4+ ili CD8+.

[0318] U nekim otelotvorenjima, konstruisane APC uključuju, na primer, APC koje eksprimiraju MHC II kao što su makrofagi, B-ćelije i dendritske ćelije, kao i veštačke APC (aAPC) koje uključuju ćelijske i acelularne (npr. biorazgradive polimerne mikročestice) aAPC. Veštačke APC (aAPC) su sintetičke verzije APC koje mogu da deluju na sličan način kao APC, tako što prezentuju antigene T-ćelijama i aktiviraju ih. Prezentovanje antigena vrši MHC (klasa I ili klasa II). U nekim otelotvorenjima, u konstruisanim APC kao što su aAPC, antigen koji se nanosi na MHC je, u nekim otelotvorenjima, antigen specifičan za tumor ili antigen povezan sa tumorom. Antigen koji se nanosi na MHC je prepoznat od strane T-ćelijskog receptora (TCR) T-ćelije, koji, u nekim slučajevima, može da eksprimira PD-1 i, opciono, CD80, ili drugi molekul koji prepoznaje varijanta polipeptida PD-L1 koji su ovde obezbeđeni. Supstance koje mogu da se koriste za konstruisanje aAPC uključuju poli (glikolnu kiselinu), poli(mlečnu-koglikolnu kiselinu), gvožđe oksid, lipozome, lipidne dvoslojeve, sefarozu i polistiren.

[0319] U nekim otelotvorenjima, ćelijska aAPC može da se konstruiše da sadrži agonist TIP i TCR koji se koristi u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. U nekim otelotvorenjima, ćelijska aAPC može da se konstruiše da sadrži agonist TIP i TCR koji se koristi u ex vivo ekspanziji humanih T-ćelija, recimo pre primene, npr. za ponovno uvođenje u pacijenta. U nekim aspektima, aAPC može da uključuje ekspresiju najmanje jednog klona anti-CD3 antitela, kao

1

što je, npr. OKT3 i/ili UCHT1. U nekim aspektima, aAPC mogu biti inaktivirane (npr. ozračene). U jednom otelotvorenju, TIP može da uključuje bilo koju varijantu domena IgSF koja pokazuje afinitet vezivanja prema srodnom vezujućem partneru na T-ćeliji.

[0320] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni protein koji je ovde obezbeđen, kao što je transmembranski imunomodulatorni protein ili sekretabilni imunomodulatorni protein, zajedno je eksprimiran ili konstruisan u ćeliji koja eksprimira antigen vezujući receptor, kao što je rekombinantni receptor, kao što je himerni antigenski receptor (CAR) ili T-ćelijski receptor (TCR). U nekim otelotvorenjima, konstruisana ćelija, kao što je konstruisana T-ćelija, prepoznaje željeni antigen povezan sa kancerom, inflamatornim i autoimunim poremećajima ili virusnom infekcijom. U specifičnim otelotvorenjima, antigen vezujući receptor sadrži antigen vezujući ostatak koji specifično vezuje antigen specifičan za tumor ili antigen povezan sa tumorom. U nekim otelotvorenjima, konstruisana T-ćelija je CAR (himerni antigenski receptor) T-ćelija koja sadrži antigen vezujući domen (npr. scFv) koji se specifično vezuje za antigen, kao što je antigen specifičan za tumor ili antigen povezan sa tumorom. U nekim otelotvorenjima, TIP protein se eksprimira u konstruisanoj ćeliji T-ćelijskog receptora ili konstruisanoj ćeliji himernog antigenskog receptora. U takvim otelotvorenjima, konstruisana ćelija koeksprimira TIP i CAR ili TCR. U nekim otelotvorenjima, SIP protein se eksprimira u konstruisanoj ćeliji T-ćelijskog receptora ili konstruisanoj ćeliji himernog antigenskog receptora. U takvim otelotvorenjima, konstruisana ćelija zajedno eksprimira SIP i CAR ili TCR.

[0321] Himerni antigenski receptori (CAR) su rekombinantni receptori koji uključuju antigen vezujući domen (ektodomen), transmembranski domen i intracelularni signalni region (endodomen) koji može da indukuje ili posreduje aktivacioni signal za T-ćeliju nakon vezivanja antigena. U jednom primeru, ćelije koje eksprimiraju CAR su konstruisane da eksprimiraju ekstracelularni jednolančani varijabilni fragment (scFv) sa specifičnošću za određeni tumorski antigen vezan za intracelularni signalni deo koji sadrži aktivirajući domen i, u nekim slučajevima, kostimulatorni domen. Kostimulatorni domen može da se dobije, npr. od CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, inducibilnog T-ćelijskog kostimulatora (ICOS).

Aktivirajući domen može da se dobije, npr. od CD3, kao što je CD3 zeta, epsilon, delta, gama, i slično. U određenim otelotvorenjima, CAR je konstruisan da ima dva, tri, četiri ili više kostimulatornih domena. scFv CAR može da se konstuiše da cilja antigen koji se eksprimira na ćeliji povezan sa bolešću ili stanjem, npr. tumorski antigen, kao što je, na

1

primer, CD19, koji je transmembranski protein koji eksprimiraju ćelije B-ćelijske linije, uključujući sve normalne B-ćelije i B-ćelijske malignitete, uključujući, bez ograničenja, NHL, CLL i ALL koji nije T-ćelijski. Primeri za CAR+ T-ćelijske terapije i konstrukte opisani su u U.S. patentnim publikacijama br.2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309, i 2014/0050708.

[0322] U nekim aspektima, antigen vezujući domen je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, kao što je jednolančani fragment (scFv). U nekim otelotvorenjima, antigen se eksprimira na ćeliji tumora ili kancera. Primer za antigen je CD19. Primer za CAR je anti-CD19 CAR, kao što je CAR koji sadrži anti-CD19 scFv dat u SEQ ID NO:1163 ili SEQ ID NO:1174. U nekim otelotvorenjima, CAR dalje sadrži spejser, transmembranski domen i intracelularni signalni domen ili region koji sadrži ITAM signalni domen, kao što je signalni domen CD3zeta. U nekim otelotvorenjima, CAR dalje uključuje kostimulatorni signalni domen.

[0323] U nekim otelotvorenjima, spejser i transmembranski domen su šarka i transmembranski domen dobijeni od CD8, na primer, koji imaju reprezentativnu sekvencu datu u SEQ ID NO: 242, 1164, 2014 ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 242, 1164, ili 2014. U nekim otelotvorenjima, endodomen sadrži domen signalizacije CD3-zeta. U nekim otelotvorenjima, domen signalizacije CD3-zeta sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 243, ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:243 i zadržava aktivnost T-ćelijske signalizacije. U nekim otelotvorenjima, endodomen CAR može dalje da sadrži kostimulatorni region signalizacije za dalju modulaciju imunomodulatornih odgovora T-ćelija. U nekim otelotvorenjima, kostimulatorni domen signalizacije predstavlja ili sadrži kostimulatorni region, ili je dobijen od kostimulatornog regiona, iz CD28, ICOS, 41BB ili OX40. U nekim otelotvorenjima, kostimulatorni domen signalizacije je izveden iz CD28 ili 4-1BB i sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u bilo kom od SEQ ID NO: 1165-1168 ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1165-1168 i zadržava aktivnost kostimulatorne T-ćelijske signalizacije.

1 1

[0324] U nekim otelotvorenjima, konstrukt koji kodira CAR dalje kodira drugi protein, kao što je marker, npr. detektabilni protein, odvojen od CAR putem samoraskidive peptidne sekvence. U nekim otelotvorenjima, samoraskidiva peptidna sekvenca je samoraskidivi peptid F2A, T2A, E2A ili P2A. Primeri za sekvence samoraskidivog peptida T2A dati su u bilo kom od SEQ ID NO: 1167, 1177 ili 2021 ili sekvenci aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili veću identičnost sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1167, 1177 ili 2021. U nekim otelotvorenjima, T2A je kodiran sekvencom nukleotida koja je data u SEQ ID NO: 1176 ili je sekvenca koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili više identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1176. Primer za sekvencu samoraskidivog peptida P2A dat je u SEQ ID NO: 2026 ili sekvenci aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 2026. U nekim slučajevima konstrukta nukleinske kiseline koji kodira više od jednog samoraskidivog peptida P2A (kao što je P2A1 i P2A2), pri čemu sekvenca nukleotida P2A1 i P2A2 kodira P2A dat u SEQ ID NO:2026, sekvenca nukleotida može biti različita da bi se izbegla rekombinacija između sekvenci.

[0325] U nekim otelotvorenjima, marker je detektabilni protein, kao što je fluorescentni protein, npr. zeleni fluorescentni protein (GFP) ili plavi fluorescentni protein (BFP). Primeri za sekvence fluorescentnih proteinskih markera dati su u SEQ ID NO: 1170, 2020, 2027-2029 ili sekvenci aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili više identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1170 ili 2020.

[0326] U nekim otelotvorenjima, CAR ima sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO: 1160, 1171, 1172, 1173, 2015, 2016, 2018 ili 2019 ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili veću identičnost sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1160, 1171, 1172, 1173, 2015, 2016, 2018 ili 2019. U nekim otelotvorenjima, CAR je kodiran sekvencom nukleotida koja je data u SEQ ID NO: 1175 ili 2017 ili sekvencom aminokiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ili više identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1175 ili 2017.

1 2

[0327] U drugom otelotvorenju, konstruisana T-ćelija ima TCR, uključujući rekombinantni ili konstruisani TCR. U nekim otelotvorenjima, TCR može biti nativni TCR. Stručnjaci za ovu oblast će prepoznati da generalno nativni T-ćelijski receptori sisara sadrže alfa i beta lanac (ili gama i delta lanac) koji učestvuju u antigen specifičnom prepoznavanju i vezivanju. U nekim otelotvorenjima, TCR je konstruisana TCR koja je modifikovana. U nekim otelotvorenjima, TCR konstruisane T-ćelije specifično se vezuju za antigen povezan sa tumorom ili antigen specifičan za tumor koji prezentuje APC.

[0328] U nekim otelotvorenjima, imunomodulatorni polipeptidi, kao što su transmembranski imunomodulatorni polipeptidi ili sekretabilni imunomodulatorni polipeptidi, mogu da se ugrade u konstruisane ćelije, kao što su konstruisane T-ćelije ili konstruisane APC, putem različitih strategija, kao što su one koje se koriste za rekombinantne ćelije domaćine. U struci su poznati različiti postupci za uvođenje konstrukta DNK u primarne T-ćelije. U nekim otelotvorenjima, koristi se virusna transdukcija ili elektroporacija plazmida. U tipičnim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorni protein, ili ekspresioni vektor, sadrži signalni peptid koji lokalizuje eksprimirane transmembranske imunomodulatorne proteine na ćelijsku membranu ili za izlučivanje. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira transmembranske imunomodulatorne proteine iz pronalaska je potklonirana u virusni vektor, kao što je retrovirusni vektor, što omogućava ekspresiju u ćelijama domaćina sisara. Ekspresioni vektor može da se uvede u ćeliju domaćina, i imunomodulatorni protein se eksprimira na površini ili se izlučuje u uslovima za uzgajanje ćelije domaćina.

[0329] U reprezentativnom primeru, primarne T-ćelije mogu da se prečiste ex vivo (CD4 ćelije ili CD8 ćelije, ili i jedne i druge) i stimulišu protokolom za aktivaciju koji se sastoji od različitih agonista TCR/CD28, kao što su perlice obložene sa anti-CD3/anti-CD28. Nakon 2 ili 3 dana procesa aktivacije, rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži imunomodulatorni polipeptid može stabilno da se uvede u primarne T-ćelije standardnim protokolima za transdukciju lentivirusa ili retrovirusa ili strategijama za elektroporaciju plazmida. Ćelije mogu da se prate na ekspresiju imunomodulatornih polipeptida, na primer, putem protočne citometrije koristeći anti-epitopsku oznaku ili antitela koja unakrsno reaguju sa nativnim matičnim molekulom i polipeptide koji sadrže varijantu PD-L1. T-ćelije koje eksprimiraju

1

imunomodulatorni polipeptid mogu da se obogate putem sortiranja sa antitelima na antiepitopsku oznaku ili da se obogate za visoku ili nisku ekspresiju, u zavisnosti od primene.

[0330] Nakon ekspresije imunomodulatornog polipeptida, konstruisane T-ćelije mogu različitim sredstvima da se testiraju na odgovarajuću funkciju. Zajednička ekspresija konstruisanih CAR ili TCR može da se potvrdi da bi se pokazalo da ekspresija imunomodulatornog proteina nije značajno uticala na ovaj deo konstruisane T-ćelije. Nakon potvrđivanja, standardni in vitro testovi citotoksičnosti, proliferacije ili citokina (npr. ekspresija IFN-gama) mogu da se koriste za procenu funkcija konstruisanih T-ćelija.

Reprezentativne standardne krajnje tačke su procenat lize tumorske linije, proliferacija konstruisane T-ćelije ili ekspresija proteina IFN-gama u supernatantima kulture. Može da se izabere konstruisani konstrukt koji dovodi do statistički značajnog povećanja lize tumorske linije, povećane proliferacije konstruisane T-ćelije ili povećane ekspresije IFN-gama u poređenju sa kontrolnim konstruktom. Pored toga, nekonstruisane, na primer nativne primarne ili endogene T-ćelije takođe mogu da se inkorporiraju u isti in vitro test za merenje sposobnosti konstrukta imunomodulatornog polipeptida koji je eksprimiran na konstruisanim ćelijama, kao što su konstruisane T-ćelije, da se modulira aktivnost, pa tako, u nekim slučajevima, da se aktivira i stvara efektorska funkcija kod nativnih T-ćelija posmatrača. Povećana ekspresija markera aktivacije kao što su CD69, CD44 ili CD62L može da se prati na endogenim T-ćelijama, a povećana proliferacija i/ili proizvodnja citokina može da ukazuje na željenu aktivnost imunomodulatornog proteina koji se eksprimira na konstruisanim T-ćelijama.

[0331] U nekim otelotvorenjima, slični testovi mogu da se koriste za poređenje funkcije konstruisanih T-ćelija koje sadrže samo CAR ili TCR sa onima koje sadrže konstrukt CAR ili TCR i TIP. Ovi in vitro testovi se obično vrše zasejavanjem različitih odnosa konstruisane T-ćelije i ćelijske linije „tumora“ koja sadrži srodni CAR ili TCR antigen zajedno u kulturi. Standardne krajnje tačke su procenat lize tumorske linije, proliferacija konstruisane T-ćelije ili proizvodnja IFN-gama u supernatantima kulture. Može da se izabere konstruisani imunomodulatorni protein koji dovodi do statistički značajnog povećanja lize tumorske linije, povećane proliferacije konstruisane T-ćelije ili povećane proizvodnje IFN-gama u poređenju sa istim konstruktom samo TCR ili CAR. Konstruisane humane T-ćelije mogu da se analiziraju kod imunokompromitovanih miševa, kao što je soj NSG, kojem nedostaju mišje T, NK i B-ćelije. Konstruisane humane T-ćelije u kojima CAR ili TCR vezuje ciljnu

1 4

kontrastrukturu na ksenograftu i zajedno se eksprimira sa TIP afinitetno modifikovanim domenom IgSF mogu adoptivno da se prenesu in vivo sa drugačijim brojem i odnosom ćelija u poređenju sa ksenograftom. Na primer, graftovanje CD19+ tumorskih linija leukemije koje sadrže luciferazu/GFP vektor može da se prati pomoću bioluminescencije ili ex vivo pomoću protočne citometrije. U jednom uobičajenom otelotvorenju, ksenograft se uvodi u mišji model, nakon čega, nekoliko dana kasnije, slede konstruisane T-ćelije. Konstruisane T-ćelije koje sadrže imunomodulatorni protein mogu da se testiraju na povećano preživljavanje, klirens tumora ili povećan broj konstruisanih T-ćelija u odnosu na konstruisane T-ćelije koje sadrže samo CAR ili TCR. Kao i u in vitro testu, endogene, nativne (tj. nekonstruisane) humane T-ćelije mogu koadoptivno da se prenesu da bi se istražilo uspešno širenje epitopa u toj populaciji, što dovodi do boljeg preživljavanja ili klirensa tumora.

E. Infektivni agensi koji eksprimiraju varijante polipeptida i imunomodulatornih proteina

[0332] Takođe su obezbeđeni infektivni agensi koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od varijanti polipeptida, kao što su polipeptidi vIgD PD-L1, uključujući sekretabilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine koji su ovde opisani. U nekim otelotvorenjima, takvi infektivni agensi mogu da isporuče nukleinske kiseline koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida koje su ovde opisane, kao što su polipeptidi vIgD PD-L1, u ciljnu ćeliju kod ispitanika, npr. imunsku ćeliju i/ili antigen prezentujuću ćeliju (APC) ili tumorsku ćeliju kod ispitanika. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje su sadržane u takvim infektivnim agensima, i/ili nukleinske kiseline za stvaranje ili modifikaciju takvih infektivnih agenasa, kao što su vektori i/ili plazmidi, i kompozicije koje sadrže takve infektivne agense.

[0333] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je mikroorganizam ili mikrob. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je virus ili bakterija. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je virus. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je bakterija. U nekim otelotvorenjima, takvi infektivni agensi mogu da isporuče sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koju od varijanti polipeptida, kao što su polipeptidi vIgD PD-L1, uključujući sekretabilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine koji su ovde opisani. Tako, u nekim otelotvorenjima, ćelija ispitanika koja je inficirana putem infektivnih agensa ili je došla u kontakt sa njima može da se navede da na ćelijskoj površini eksprimira ili da izlučuje

1

varijante imunomodulatornih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens takođe može da isporuči jedan ili više lekova ili nukleinskih kiselina koje kodiraju druge lekove u ćeliju i/ili u okruženje u ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, drugi lekovi koji mogu da se isporuče putem infektivnih agensa uključuju citokine ili druge imunomodulatorne molekule.

[0334] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens, npr. virus ili bakterija, sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koju od varijanti polipeptida, kao što su polipeptidi vIgD PD-L1, uključujući sekretabilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine koji su ovde opisani, i putem dolaska u kontakt i/ili inficiranja ćelije ispitanika, ćelija eksprimira varijante polipeptida, kao što su polipeptidi vIgD PD-L1, uključujući sekretabilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine, koje kodiraju sekvence nukleinske kiseline sadržane u infektivnom agensu. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens može da se primenjuje na ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens može da se dovede u kontakt sa ćelijama ispitanika ex vivo.

[0335] U nekim otelotvorenjima, varijante polipeptida, kao što su polipeptidi vIgD PD-L1, uključujući transmembranske imunomodulatorne proteine, koje su eksprimirane od strane ćelija inficiranih infektivnim agensom predstavljaju transmembranski protein i eksprimiraju se na površini. U nekim otelotvorenjima, varijante polipeptida, kao što su polipeptidi vIgD PD-L1, uključujući sekretabilne imunomodulatorne proteine, koje su eksprimirane od strane ćelija inficiranih infektivnim agensom, eksprimiraju se i izlučuju iz ćelije. Transmembranski imunomodulatorni protein ili izlučeni imunomodulatorni protein može biti bilo koji od ovde opisanih.

[0336] U nekim otelotvorenjima, ćelije ispitanika na koje je usmeren infektivni agens uključuju tumorsku ćeliju, imunsku ćeliju i/ili antigen prezentujuću ćeliju (APC). U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je usmeren na ćeliju u mikrookruženju tumora (TME). U nekim otelotvorenjima, infektivni agens isporučuje nukleinske kiseline koje kodiraju varijante polipeptida, kao što su polipeptidi vUgD PD-L1, uključujući sekretabilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine, u odgovarajuću ćeliju (na primer, APC, kao što je ćelija koja na ćelijskoj površini prikazuje peptid/MHC kompleks, kao što je dendritska ćelija) ili tkivo (npr. limfoidno tkivo) koje će indukovati i/ili pojačati željeno dejstvo, npr. imunomodulaciju i/ili specifični ćelijski posredovan imunski odgovor, npr. odgovor CD4 i/ili CD8 T-ćelija, gde odgovor CD8 T-ćelija može da uključuje odgovor citotoksičnih T-ćelija

1

(CTL). U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je usmeren na APC, kao što je dendritska ćelija (DC). U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline koji isporučuju infektivni agensi koji su ovde opisani uključuje odgovarajuće sekvence aminokiselina koje su neophodne za ekspresiju operativno povezanih kodirajućih sekvenci koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida, u određenoj ciljnoj ćeliji, npr. regulatorne elemente kao što su promoteri.

[0337] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju imunomodulatorne polipeptide takođe može da sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju jedan ili više dodatnih genskih proizvoda, npr. citokine, enzime za konverziju proleka, citotoksine i/ili detektabilne genske proizvode. Na primer, u nekim otelotvorenjima, infektivni agens je onkolitički virus i virus može da sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju dodatne terapeutske genske proizvode (vidite, npr. Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411; vidite U.S. pat. br.7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 i 7,754,221 i U.S. pat. publ. br.

2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 i 2011/006465 0. U nekim otelotvorenjima, dodatni genski proizvod može biti terapeutski genski proizvod koji može dovesti do smrti ciljne ćelije (npr. tumorske ćelije) ili genski proizvod koji može povećati ili pojačati ili regulisati imunski odgovor (npr. citokin). Primeri za genske proizvode između ostalog takođe uključuju antikancerski agens, antimetastatski agens, antiangiogeni agens, imunomodulatorni molekul, inhibitor imunske kontrolne tačke, antitelo, citokin, faktor rasta, antigen, citotoksični genski proizvod, proapoptotski genski proizvod, antiapoptotski genski proizvod, gen za razgradnju ćelijske matrice, gen za regeneraciju tkiva ili reprogramiranje humane somatske ćelije na pluripotentnost, i druge gene koji su ovde opisani ili poznati stručnjaku za ovu oblast. U nekim otelotvorenjima, dodatni genski proizvod je faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga (GM-CSF).

1. Virusi

[0338] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je virus. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je onkolitički virus, ili virus koji cilja određene ćelije, npr. imunske ćelije. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens cilja tumorsku ćeliju i/ili ćeliju kancera kod

1

ispitanika. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens cilja imunsku ćeliju ili antigen prezentujuću ćeliju (APC).

[0339] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je onkolitički virus. Onkolitički virusi su virusi koji se akumuliraju i repliciraju u tumorskim ćelijama. Zahvaljujući replikaciji u ćelijama, i opcionom isporučivanju nukleinskih kiselina koje kodiraju varijantu polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida koji su ovde opisani, dolazi do lize tumorskih ćelija, i tumor se smanjuje i može biti eliminisan. Onkolitički virusi takođe mogu imati širok raspon domaćina i vrsta ćelija. Na primer, onkolitički virusi mogu da se akumuliraju u imunoprivilegovanim ćelijama ili imunoprivilegovanim tkivima, što uključuje tumore i/ili metastaze, i takođe uključuje povređena tkiva i ćelije, što omogućava isporučivanje i ekspresiju nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida koji su ovde opisani u širokom rasponu vrsta ćelija. Onkolitički virusi takođe mogu da se repliciraju na način specifičan za tumorsku ćeliju, što dovodi do lize tumorskih ćelija i efikasne regresije tumora.

[0340] Primeri za onkolitičke viruse uključuju adenoviruse, adenoasocirane viruse, viruse herpesa, virus herpes simpleksa, virus vezikularnog stomatitisa, reovirus, virus Njukasl bolesti, parvovirus, virus malih boginja, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), Koksaki virus i vakcinija virus. U nekim otelotvorenjima, onkolitički virusi mogu specifično da kolonizuju čvrste tumore, a da pri tome ne inficiraju druge organe, i mogu da se koriste kao infektivni agens za isporučivanje nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida koje su ovde opisane u takve čvrste tumore.

[0341] Onkolitički virusi za upotrebu u isporučivanju nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida koji su ovde opisani mogu biti bilo koji onkolitički virusi poznati stručnjaku za ovu oblast i uključuju, na primer, virus vezikularnog stomatitisa, vidite, npr. U.S. pat. br.7,731,974, 7,153,510, 6,653,103 i U.S. pat. pub. br.

2010/0178684, 2010/0172877, 2010/0113567, 2007/0098743, 20050260601, 20050220818 i EP pat. br.1385466, 1606411 i 1520175; virus herpes simpleksa, vidite, npr U.S. pat. br. 7,897,146, 7,731,952, 7,550,296, 7,537,924, 6,723,316, 6,428,968 i U.S. pat. pub. br., 2014/0154216, 2011/0177032, 2011/0158948, 2010/0092515, 2009/0274728, 2009/0285860, 2009/0215147, 2009/0010889, 2007/0110720, 2006/0039894, 2004/0009604, 2004/0063094

1

, Međunarodne patentne pub. br., WO 2007/052029, WO 1999/038955; retroviruse, vidite, npr. U.S. pat. br.6,689,871, 6,635,472, 5,851,529, 5,716,826, 5,716,613 i U.S. pat. pub. br.

20110212530; viruse vakcinije, vidite, npr.2016/0339066, i adenoasocirane viruse, vidite, npr. U.S. pat. br.

8,007,780, 7,968,340, 7,943,374, 7,906,111, 7,927,585, 7,811,814, 7,662,627, 7,241,447, 7,2 38,526, 7,172,893, 7,033,826, 7,001,765, 6,897,045, i 6,632,670.

[0342] Onkolitički virusi takođe uključuju viruse koji su genetski izmenjeni da bi se ublažila njihova virulencija, poboljšao njihov bezbednosni profil, povećala njihova specifičnost za tumor, i takođe su opremljeni dodatnim genima, na primer, citotoksinima, citokinima, enzimima za konverziju proleka, da bi se poboljšala sveukupna delotvornost virusa (vidite, npr. Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411; vidite U.S. pat. br.7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 i 7,754,221 i U.S. pat. publ. br.

2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 i 2011/006465 0). U nekim otelotvorenjima, onkolitički virusi mogu biti oni koji su modifikovani tako da se selektivno repliciraju u ćelijama kancera, te su tako onkolitički. Na primer, onkolitički virus je adenovirus koji je konstruisan da ima modifikovani tropizam za tumorsku terapiju i takođe kao vektori za gensku terapiju. Primer za to su ONYX-015, H101 i Ad5ΔCR (Hallden i Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16:945-58) i TNFerade (McLoughlin et al. (2005) Ann. Surg. Oncol., 12:825-30), ili adenovirus Oncorine<®>koji se replicira u odgovarajućim uslovima.

[0343] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je modifikovani virus herpes simpleksa. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je modifikovana verzija talimogen laherparepveka (poznat i kao T-Vec, Imlygic ili OncoVex GM-CSF), koji je modifikovan da sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od ovde opisanih varijanti imunomodulatornih polipeptida, kao što je ovde opisana varijanta polipeptida PD-L1. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je modifikovani virus herpes simpleksa koji je opisan, npr. u WO 2007/052029, WO 1999/038955, US 2004/0063094, US 2014/0154216, ili njegove varijante.

[0344] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je virus koji cilja određenu vrstu ćelija kod ispitanika na kome se primenjuje virus, npr. virus koji cilja imunske ćelije ili antigen

1

prezentujuće ćelije (APC). Dendritske ćelije (DC) su ključne APC za inicijaciju i kontrolu imunskih odgovora. DC mogu da hvataju i obrađuju antigene, migriraju sa periferije u limfoidni organ, i prezentuju antigene T-ćelijama u mirovanju na način koji je ograničen glavnim histokompatibilnim kompleksom (MHC). U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je virus koji specifično može da cilja DC za isporučivanje nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida za ekspresiju u DC. U nekim otelotvorenjima, virus je lentivirus ili njegova varijanta ili derivat, kao što je lentivirusni vektor kome nedostaje integracija. U nekim otelotvorenjima, virus je lentivirus koji je pseudotipovan da efikasno vezuje i produktivno inficira ćelije koje eksprimiraju ćelijski površinski marker neintegrin koji hvata intracelularni adhezioni molekul-3 specifičan za dendritske ćelije (DC-SIGN), kao što su DC. U nekim otelotvorenjima, virus je lentivirus pseudotipovan sa glikoproteinom Sindbis virusa E2 ili njegov modifikovani oblik, kao što su oni opisani u WO 2013/149167. U nekim otelotvorenjima, virus omogućava isporučivanje i ekspresiju sekvence od interesa (npr. nukleinska kiselina koja kodira bilo koju ovde opisanu varijantu polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida) u DC. U nekim otelotvorenjima, virus uključuje one opisane u WO 2008/011636 ili US

2011/0064763, Tareen et al. (2014) Mol. Ther., 22:575-587, ili njihove varijante. Primeri za vektorsku platformu tropičnu za dendritske ćelije je ZVex<™>.

2. Bakterije

[0345] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je bakterija. Na primer, u nekim otelotvorenjima, bakterije mogu da isporuče nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju ovde opisanu varijantu imunomodulatornih polipeptida u ciljnu ćeliju kod ispitanika, kao što je tumorska ćelija, imunska ćelija, antigen prezentujuća ćelija i/ili fagocitna ćelija. U nekim otelotvorenjima, bakterija može biti poželjno usmerena na specifično okruženje u ispitaniku, kao što je mikrookruženje tumora (TME), radi ekspresije i/ili izlučivanja varijante imunomodulatornih polipeptida i/ili za ciljanje specifičnih ćelija u okruženju radi ekspresije varijante imunomodulatornih polipeptida.

[0346] U nekim otelotvorenjima, bakterija isporučuje nukleinske kiseline u ćelije putem bakterijski posredovanog transfera plazmidne DNK u ćelije sisara (takođe se naziva „baktofekcija“). Na primer, u nekim otelotvorenjima, isporučivanje genetskog materijala se ostvaruje putem ulaza cele bakterije u ciljne ćelije. U nekim otelotvorenjima, spontana ili

1

indukovana bakterijska liza može da dovede do oslobađanja plazmida za dalju ekspresiju eukariotske ćelije. U nekim otelotvorenjima, bakterija može da isporuči nukleinske kiseline u nefagocitne ćelije sisara (npr. tumorske ćelije) i/ili fagocitne ćelije, npr. neke imunske ćelije i/ili APC. U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline koje bakterija isporučuje mogu da se prenesu u jedro ćelije ispitanika za ekspresiju. U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline takođe uključuju odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina za ekspresiju operativno vezanih sekvenci koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida u određenoj ćeliji domaćinu, npr. regulatorne elemente kao što su promoteri ili pojačivači. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens koji je bakterija može da isporuči nukleinske kiseline koje kodiraju imunomodulatorne proteine u obliku RNK, kao što je prethodno napravljena translaciono sposobna RNK koja se isporučuje u citoplazmu ciljne ćelije gde će je prevesti organele ciljne ćelije.

[0347] U nekim otelotvorenjima, bakterija može da se replikuje i da lizira ciljne ćelije, npr. tumorske ćelije. U nekim otelotvorenjima, bakterija može da sadrži i/ili oslobađa sekvence nukleinske kiseline i/ili genske proizvode u citoplazmu ciljnih ćelija, što dovodi do ubijanja ciljne ćelije, npr. tumorske ćelije. U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je bakterija koja može specifično da se replikuje u određenom okruženju kod ispitanika, npr. mikrookruženju tumora (TME). Na primer, u nekim otelotvorenjima, bakterija može da se replikuje specifično u anaerobnom ili hipoksičnom mikrookruženju. U nekim otelotvorenjima, uslovi ili faktori koji su prisutni u određenim okruženjima, npr. aspartat, serin, citrat, riboza ili galaktoza koju proizvode ćelije u TME, mogu da deluju kao hemoatraktansi za privlačenje bakterije u okruženje. U nekim otelotvorenjima, bakterija može da eksprimira i/ili izlučuje u okruženje imunomodulatorne proteine koji su ovde opisani, npr. TME.

[0348] U nekim otelotvorenjima, infektivni agens je bakterija koja je Listeria sp., Bifidobacterium sp., Escherichia sp., Clostridium sp., Salmonella sp., Shigella sp., Vibrio sp. ili Yersinia sp. U nekim otelotvorenjima, bakterija je izabrana od jednog ili više od Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Vibrio cholera, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, Clostridium novyi, Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum i Bifidobacterium adolescentis. U nekim otelotvorenjima, bakterija je konstruisana bakterija. U nekim otelotvorenjima, bakterija je konstruisana bakterija kao što su one opisane, npr. u Seow i Wood (2009) Molecular Therapy 17(5):767-777; Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs

1 1

1:6, 385-394; Patyar et al. (2010) J Biomed Sci 17:21; Tangney et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:4, 284-287; van Pijkeren et al. (2010) Hum Gene Ther. 21(4):405-416; WO 2012/149364; WO 2014/198002; US 9103831; US 9453227; US 2014/0186401; US 2004/0146488; US 2011/0293705; US 2015/0359909 i EP 3020816. Bakterija može da se modifikuje da isporučuje sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koju od varijanti imunomodulatornih polipeptida, konjugata i/ili fuzija koje su ovde date, i/ili da eksprimiraju takve varijante imunomodulatornih polipeptida u ispitaniku.

F. Nukleinske kiseline, vektori i postupci za proizvodnju polipeptida ili ćelija

[0349] Ovde su obezbeđene izolovane ili rekombinantne nukleinske kiseline koje se zbirno nazivaju „nukleinske kiseline“ koje kodiraju bilo koje od različitih obezbeđenih otelotvorenja ovde obezbeđene varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene, uključujući sve koje su opisane ispod, korisne su za rekombinantnu proizvodnju (npr. ekspresiju) ovde obezbeđenih varijanti polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene, uključujući sve koje su opisane ispod, korisne su za ekspresiju ovde obezbeđenih varijanti polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida u ćelijama, na primer u konstruisanim ćelijama, npr. imunskim ćelijama, ili ćelijama infektivnog agensa. Nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK, i uključuju iRNK, kRNK, rekombinantnu i sintetičku RNK i DNK i kDNK. Nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene su tipično molekuli DNK, a najčešće molekuli dvolančane DNK. Međutim, takođe je obezbeđena jednolančana DNK, jednolančana RNK, dvolančana RNK i hibridne nukleinske kiseline DNK/RNK ili njihove kombinacije koje sadrže bilo koju od sekvenci nukleotida iz pronalaska.

[0350] Ovde su takođe obezbeđeni rekombinantni ekspresioni vektori i rekombinantne ćelije domaćini korisni za proizvodnju ovde obezbeđenih varijanti polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida.

[0351] Ovde su takođe obezbeđene konstruisane ćelije, kao što su konstruisane imunske ćelije, koje sadrže bilo koju od obezbeđenih nukleinskih kiselina ili kodiranih varijanti polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida, kao što je bilo koji od

1 2

transmembranskih imunomodulatornih polipeptida ili sekretabilnih imunomodulatornih polipeptida.

[0352] Ovde su takođe obezbeđeni infektivni agensi, kao što su bakterijske i virusne ćelije, koje sadrže bilo koju od obezbeđenih nukleinskih kiselina ili kodiranih varijanti polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornih polipeptida, kao što je bilo koji od transmembranskih imunomodulatornih polipeptida ili sekretabilnih imunomodulatornih polipeptida.

[0353] U bilo kom od prethodno obezbeđenih otelotvorenja, nukleinske kiseline koje kodiraju imunomodulatorne polipeptide koji su ovde obezbeđeni mogu biti uvedene u ćelije koristeći tehnike rekombinantne DNK i kloniranja. U tu svrhu, pripremljen je molekul rekombinantne DNK koja kodira imunomodulatorni polipeptid. Postupci za pripremu takvih molekula DNK su dobro poznati u struci. Na primer, sekvence koje kodiraju peptide mogu da se izoluju iz DNK koristeći odgovarajuće restrikcione enzime. Alternativno, molekul DNK može da se sintetiše koristeći tehnike hemijske sinteze, kao što je postupak fosforamidita. Takođe može da se koristi kombinacija ovih tehnika. U nekim slučajevima, rekombinantna ili sintetička nukleinska kiselina može da se dobije putem lančane reakcije polimeraze (PCR). U nekim otelotvorenjima, može da se kreira insert DNK koji kodira jednu ili više varijanti polipeptida PD-L1 koje sadrže najmanje jedan afinitetno modifikovani domen IgSF i, u nekim otelotvorenjima, signalni peptid, transmembranski domen i/ili endodomen u skladu sa obezbeđenim opisom. Ovaj insert DNK može da se klonira u odgovarajući vektor za transdukciju/transfekciju, kao što je poznato stručnjacima za ovu oblast. Takođe su obezbeđeni ekspresioni vektori koji sadrže molekule nukleinske kiseline.

[0354] U nekim otelotvorenjima, ekspresioni vektori mogu da eksprimiraju imunomodulatorne proteine u odgovarajućoj ćeliji u uslovima koji su pogodni za ekspresiju proteina. U nekim aspektima, molekul nukleinske kiseline ili ekspresioni vektor sadrži molekul DNK koji kodira imunomodulatorni protein operativno vezan sa odgovarajućim sekvencama za kontrolu ekspresije. Dobro su poznati postupci za postizanje ovog operativnog vezivanja, kako pre, tako i nakon što je molekul DNK ubačen u vektor. Sekvence za kontrolu ekspresije uključuju promotere, aktivatore, pojačivače, operatore, mesta vezivanja ribozoma, početne signale, zaustavne signale, signale za zatvaranje, poliadenilacione signale i druge signale koji učestvuju u kontroli transkripcije ili translacije.

1

[0355] U nekim otelotvorenjima, ekspresija imunomodulatornog proteina je kontrolisana promoterom ili pojačivačem za kontrolu ili regulaciju ekspresije. Promoter je operativno vezan sa delom molekula nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina. U nekim otelotvorenjima, promoter je konstitutivno aktivni promoter (kao što je konstitutivno aktivni promoter specifičan za tkivo ili drugi konstitutivni promoter). U nekim otelotvorenjima, promoter je inducibilni promoter, koji može imati odgovor na indukujući agens (kao što je T-ćelijski aktivacioni signal).

[0356] U nekim otelotvorenjima, konstitutivni promoter je operativno vezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina. Primeri za konstitutivne promotere uključuju promoter vakuolirajućeg virusa majmuna 40 (SV40), promoter citomegalovirusa (CMV), promoter ubikvitina C (UbC) i promoter EF-1 alfa (EF1a). U nekim otelotvorenjima, konstitutivni promoter je specifičan za tkivo. Na primer, u nekim otelotvorenjima, promoter omogućava konstitutivnu ekspresiju imunomodulatornog proteina u specifičnim tkivima, kao što su imunske ćelije, limfociti ili T-ćelije. Primeri za promotere specifične za tkivo su opisani u U.S. patentu br.5,998,205, uključujući, na primer, promotere fetoproteina, DF3, tirozinaze, CEA, surfaktantskog proteina i ErbB2.

[0357] U nekim otelotvorenjima, inducibilni promoter je operativno vezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina tako da ekspresija nukleinske kiseline može da se kontroliše putem kontrole prisustva ili odsustva odgovarajućeg induktora transkripcije. Na primer, promoter može biti regulisani ekspresioni sistem promotera i faktora transkripcije, kao što su objavljeni sistemi regulisani tetraciklinom ili drugi sistemi koji mogu da se regulišu (vidite, npr. objavljenu Međunarodnu PCT prijavu br. WO 01/30843), za omogućavanje regulisane ekspresije kodiranog polipeptida. Primer za regulisani promoterski sistem je Tet-On (i Tet-Off) sistem koji je dostupan, na primer, od kompanije Clontech (Palo Alto, CA). Ovaj promoterski sistem omogućava regulisanu ekspresiju transgena pod kontrolom tetraciklina ili derivata tetraciklina, kao što je doksiciklin. Poznati su i drugi promoterski sistemi koji mogu da se regulišu (vidite, npr. objavljenu U.S. prijavu br.2002-0168714, pod nazivom „Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches“, koja opisuje zamene gena koje sadrže domene vezivanja liganda i domene regulacije transkripcije, kao što su oni dobijeni od hormonskih receptora).

1 4

[0358] U nekim otelotvorenjima, promoter daje odgovor na element koji je responsivan na T-ćelijsku aktivacionu signalizaciju. Isključivo kao primer, u nekim otelotvorenjima, konstruisana T-ćelija sadrži ekspresioni vektor koji kodira imunomodulatorni protein i promoter operativno vezan za kontrolu ekspresije imunomodulatornog proteina. Konstruisana T-ćelija može da se aktivira, na primer, signalizacijom preko konstuisanog T-ćelijskog receptora (TCR) ili himernog antigenskog receptora (CAR), i tim putem se aktivira ekspresija i izlučivanje imunomodulatornog proteina preko responsivnog promotora.

[0359] U nekim otelotvorenjima, inducibilni promoter je operativno vezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorni protein tako da se imunomodulatorni protein eksprimira kao odgovor na nuklearni faktor aktiviranih T-ćelija (NFAT) ili nuklearni faktor pojačivača kapa lakog lanca aktiviranih B-ćelija (NF-κB). Na primer, u nekim otelotvorenjima, inducibilni promoter sadrži mesto vezivanja za NFAT ili NF-κB. Na primer, u nekim otelotvorenjima, promoter je promoter NFAT ili NF-κB ili njegova funkcionalna varijanta. Tako, u nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina omogućava kontrolu ekspresije imunomodulatornog proteina uz istovremeno smanjenje ili eliminaciju toksičnosti imunomodulatornog proteina. Konkretno, konstruisane imunske ćelije koje sadrže nukleinske kiseline iz pronalaska eksprimiraju i izlučuju imunomodulatorni protein samo kada se ćelija (npr. T-ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigenski receptor (CAR) koji ćelija eksprimira) specifično stimuliše putem antigena i/ili se ćelija (npr. put kalcijumske signalizacije ćelije) nespecifično stimuliše putem, npr. forbol miristat acetata (PMA)/jonomicina. U skladu sa time, ekspresija i, u nekim slučajevima, izlučivanje imunomodulatornog proteina može da se kontroliše tako da se javlja samo kada je to potrebno (npr. u prisustvu infektivnog agensa koji izaziva bolest, kancera, ili na mestu tumora), što pomaže da se smanje ili izbegnu neželjene interakcije imunomodulatornog proteina.

[0360] U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira imunomodulatorni protein koji je ovde opisan sadrži odgovarajuću sekvencu nukleotida koja kodira promoter NFAT, promoter NF-κB, ili njihovu funkcionalnu varijantu. „Promoter NFAT“, kao što se ovde koristi, označava jedan ili više elemenata responsivnih na NFAT vezanih za minimalni promoter. „Promoter NF-κB“ odnosi se na jedan ili više elemenata responsivnih na NF-κB vezanih za minimalni promoter. U nekim otelotvorenjima, minimalni promoter gena je minimalni humani promoter IL-2 ili promoter CMV. Elementi koji su responsivni na NFAT mogu da sadrže, npr. elemente koji su responsivni na NFAT1, NFAT2, NFAT3, i/ili NFAT4.

1

Promoter NFAT, promoter NF-κB, ili njihova funkcionalna varijanta mogu da sadrže bilo koji broj vezujućih motiva, npr. najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje deset, najmanje jedanaest, ili do dvanaest vezujućih motiva.

[0361] Nastali rekombinantni ekspresioni vektor koji na sebi ima molekul DNK koristi se za transformaciju odgovarajućeg domaćina. Ova transformacija može da se vrši koristeći postupke koji su dobro poznati u struci. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja je ovde obezbeđena dalje sadrži sekvencu nukleotida koja kodira sekretorni ili signalni peptid operativno vezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira imunomodulatorni polipeptid tako da se dobijeni rastvorljivi imunomodulatorni polipeptid izoluje iz medijuma za uzgajanje, ćelije domaćina ili periplazme ćelije domaćina. U drugim otelotvorenjima, biraju se odgovarajući signali za kontrolu ekspresije da se omogući membranska ekspresija imunomodulatornog polipeptida. Nadalje, komercijalno dostupni kompleti kao i podugovaračke kompanije za proizvodnju mogu da se koriste za dobijanje konstruisanih ćelija ili rekombinantnih ćelija domaćina koje su ovde obezbeđene.

[0362] U nekim otelotvorenjima, nastali ekspresioni vektor koji na sebi ima molekul DNK koristi se za transformaciju, recimo transdukciju, odgovarajuće ćelije. Uvođenje može da se vrši koristeći postupke koji su dobro poznati u struci. Primeri postupaka uključuju postupke za transfer nukleinskih kiselina koje kodiraju receptore, uključujući transfer putem virusne, npr. retrovirusne ili lentivirusne, transdukcije, transpozona i elektroporacije. U nekim otelotvorenjima, ekspresioni vektor je virusni vektor. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina se prebacuje u ćelije postupcima lentivirusne ili retrovirusne transdukcije.

[0363] Bilo koja od brojnih i javno dostupnih i dobro poznatih ćelija domaćina sisara, uključujući T-ćelije ili APC sisara, može da se koristi u pripremi polipeptida ili konstruisanih ćelija. Odabir ćelije zavisi od više faktora koji su poznati u struci. Oni uključuju, na primer, kompatibilnost sa izabranim ekspresionim vektorom, toksičnost peptida koje kodira molekul DNK, brzinu transformacije, lakoću izolovanja peptida, osobine ekspresije, biološku bezbednost i troškove. Mora se naći ravnoteža ovih faktora, pri čemu treba razumeti da neće sve ćelije biti podjednako delotvorne za ekspresiju konkretne sekvence DNK.

1

[0364] U nekim otelotvorenjima, ćelije domaćini mogu biti različite eukariotske ćelije, kao što su ćelije kvasca, ili ćelije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije HEK293. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija iz suspenzije i polipeptid je konstruisan ili proizveden u uzgajanoj suspenziji, kao što je uzgajana suspenzija CHO ćelija, npr. ćelija CHO-S. U nekim primerima, ćelijska linija je ćelijska linija CHO kojoj nedostaje DHFR (DHFR-), kao što je DG44 i DUXB11. U nekim otelotvorenjima, ćeliji nedostaje glutamin sintaza (GS), npr. ćelije CHO-S, ćelije CHOK1 SV i ćelije CHOZN((R)) GS-/-. U nekim otelotvorenjima, CHO ćelije, kao što su ćelije CHO iz suspenzije, mogu biti ćelije CHO-S-2H2, ćelije CHO-S-klona 14 ili ćelije ExpiCHO-S.

[0365] U nekim otelotvorenjima, ćelije domaćini takođe mogu biti prokariotske ćelije, kao što je slučaj sa E. coli. Transformisani rekombinantni domaćin se uzgaja u uslovima ekspresije polipeptida, a zatim se prečišćava za dobijanje rastvorljivog proteina.

Rekombinantne ćelije domaćini mogu da se uzgajaju u uslovima konvencionalne fermentacije tako da dođe do ekspresije željenih polipeptida. Takvi uslovi fermentacije su dobro poznati u struci. Konačno, polipeptidi koji su ovde obezbeđeni mogu da se izoluju i prečiste iz kultura rekombinantnih ćelija bilo kojim postupcima koji su dobro poznati u struci, kao što je taloženje amonijum sulfatom ili etanolom, kiselo ekstrahovanje, anjon ili katjon izmenjivačka hromatografija, hromatografija sa fosfocelulozom, hromatografija hidrofobne interakcije i afinitetna hromatografija. Koraci ponovnog presavijanja proteina mogu po želji da se koriste za finalizaciju konfiguracije zrelog proteina. Konačno, tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) može da se koristi u finalnim koracima prečišćavanja.

[0366] U nekim otelotvorenjima, ćelija je imunska ćelija, kao što je bilo koja prethodno opisana u vezi sa pripremom konstruisanih ćelija. U nekim otelotvorenjima, takve konstruisane ćelije su primarne ćelije. U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije su autologne za ispitanika. U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije su alogene za ispitanika. U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije su dobijene od ispitanika, na primer leukaferezom, i transformisane ex vivo za ekspresiju imunomodulatornog polipeptida, npr. transmembranskog imunomodulatornog polipeptida ili sekretabilnog imunomodulatornog polipeptida.

[0367] Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od varijanti imunomodulatornih polipeptida sadržanih u infektivnim agensima koji su ovde opisani. U

1

nekim otelotvorenjima, infektivni agensi isporučuju nukleinske kiseline u ćeliju ispitanika, i/ili omogućavaju ekspresiju kodiranih varijanti polipeptida u ćeliji. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje se koriste za dobijanje, proizvodnju ili modifikaciju takvih infektivnih agensa. Na primer, u nekim otelotvorenjima, obezbeđeni su vektori i/ili plazmidi koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida, za stvaranje infektivnih agensa, isporučivanje u ćelije ispitanika i/ili ekspresiju varijanti imunomodulatornih polipeptida u ćelijama ispitanika.

[0368] U nekim otelotvorenjima, obezbeđene nukleinske kiseline su rekombinantni virusni ili bakterijski vektori koji sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektori mogu da se koriste za proizvodnju infektivnog agensa koji sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida i/ili se isporučuju u ciljnu ćeliju u ispitaniku radi ekspresije u ciljnoj ćeliji. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor je ekspresioni vektor. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor uključuje odgovarajuće sekvence koje su neophodne za dobijanje i/ili proizvodnju infektivnog agensa i ekspresiju u ciljnoj ćeliji.

[0369] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor je plazmid ili kozmid. Plazmid ili kozmid koji sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida, kao što je ovde opisano, može da se konstruiše koristeći standardne tehnike poznate u struci. Za dobijanje infektivnog agensa, vektor ili genom može da se konstruiše u obliku plazmida, a zatim može da se transficira u pakovanje ili proizvodnu ćelijsku liniju ili bakteriju domaćina. Rekombinantni vektori mogu da se dobiju koristeći bilo koju od rekombinantnih tehnika koje su poznate u struci. U nekim otelotvorenjima, vektori mogu da uključuju prokariotsko poreklo replikacije i/ili gen čija ekspresija daje detektabilni ili selektabilni marker, kao što je otpornost leka na propagaciju i/ili selekciju u prokariotskim sistemima.

[0370] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor je virusni vektor. Primeri za rekombinantne virusne vektor uključuju genom lentivirusnog vektora, genom vektora poks virusa, genom vektora vakcinija virusa, genom vektora adenovirusa, genom vektora adenoasociranog virusa, genom vektora virusa herpesa i genom vektora alfa virusa. Virusni vektori mogu biti živi, oslabljeni, sa uslovnom replikacijom ili sa nedostatkom replikacije,

1

nepatogeni (defektni), virusni vektor kompetentan za replikaciju i/ili je modifikovan da eksprimira heterologni genski proizvod, npr. varijante imunomodulatornih polipeptida koje su ovde obezbeđene. Vektori za dobijanje virusa takođe mogu biti modifikovani za izmenu oslabljivanja virusa, što uključuje bilo koji postupak za povećanje ili smanjenje transkripcionog ili translacionog opterećenja.

[0371] Primeri za virusne vektore koji mogu da se koriste uključuju vektore modifikovanog vakcinija virusa (vidite, npr. Guerra et al., J. Virol.80:985-98 (2006); Tartaglia et al., AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445-47 (1992); Gheradi et al., J. Gen. Virol.86:2925-36 (2005); Mayr et al., Infection 3:6-14 (1975); Hu et al., J. Virol.75: 10300-308 (2001); U.S. patente br.5,698,530, 6,998,252, 5,443,964, 7,247,615 i 7,368,116); vektore adenovirusa ili vektore adenoasociranog virusa (vidite, npr. Molin et al., J. Virol.72:8358-61 (1998); Narumi et al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol.19:936-41 (1998); Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188-93 (2004); U.S. patente br.

6,143,290; 6,596,535; 6,855,317; 6,936,257; 7,125,717; 7,378,087; 7,550,296); retrovirusne vektore uključujući one koji su bazirani na mišjem virusu leukemije (MuLV), virusu leukemije majmuna gibona (GaLV), ekotropnim retrovirusima, virusu imunodeficijencije majmuna (SIV), virusu humane imunodeficijencije (HIV) i kombinacijama (vidite, npr. Buchscher et al., J. Virol.66:2731-39 (1992); Johann et al., J. Virol.66: 1635-40 (1992); Sommerfelt et al., Virology 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol.63:2374-78 (1989); Miller et al., J. Virol.65:2220-24 (1991); Miller et al., Mol. Cell Biol.10:4239 (1990); Kolberg, NIH Res.4:43 1992; Cornetta et al., Hum. Gene Ther.2:215 (1991)); lentivirusne vektore uključujući one koji su bazirani na virusu humane imunodeficijencije (HIV-1), HIV-2, virusu imunodeficijencije mačaka (FIV), virusu infektivne anemije konja, virusu imunodeficijencije majmuna (SIV), i maedi/visna virusu (vidite, npr. Pfeifer et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.2: 177-211 (2001); Zufferey et al., J. Virol.72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J. Virol.72:8150, 1998; Philpott i Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al., J. Virol.69: 2729, 1995; Nightingale et al., Mol. Therapy, 13: 1121, 2006; Brown et al., J. Virol.73:9011 (1999); WO 2009/076524; WO 2012/141984; WO 2016/011083; McWilliams et al., J. Virol.77: 11150, 2003; Powell et al., J. Virol.70:5288, 1996) ili bilo koje njihove varijante i/ili vektore koji mogu da se koriste za dobijanje bilo kog od prethodno opisanih virusa. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor može da uključuje regulatorne sekvence, kao što su sekvence promotera ili pojačivača,

1

koje mogu da regulišu ekspresiju virusnog genoma, kao što je slučaj sa RNK virusima, u ćelijskim linijama za pakovanje (vidite, npr. U.S. patente br.5,385,839 i 5,168,062).

[0372] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor je ekspresioni vektor, npr. ekspresioni vektor koji omogućava ekspresiju kodiranog genskog proizvoda kada se isporuči u ciljnu ćeliju, npr. ćeliju ispitanika, npr. ćeliju tumora i/ili APC. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni ekspresioni vektori koji su sadržani u infektivnim agensima mogu da eksprimiraju imunomodulatorne proteine u ciljnoj ćeliji ispitanika, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju proteina.

[0373] U nekim aspektima, nukleinske kiseline ili ekspresioni vektor sadrže sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira imunomodulatorni protein operativno vezan za odgovarajuće sekvence za kontrolu ekspresije. Dobro su poznati postupci za postizanje ovog operativnog vezivanja, kako pre, tako i nakon što je sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira imunomodulatorni protein ubačena u vektor. Sekvence za kontrolu ekspresije uključuju promotere, aktivatore, pojačivače, operatore, mesta vezivanja ribozoma, početne signale, zaustavne signale, signale za zatvaranje, poliadenilacione signale i druge signale koji učestvuju u kontroli transkripcije ili translacije. Promoter može biti operativno vezan sa delom sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunomodulatorni protein. U nekim otelotvorenjima, promoter je konstitutivno aktivni promoter u ciljnoj ćeliji (kao što je konstitutivno aktivni promoter specifičan za tkivo ili drugi konstitutivni promoter). Na primer, rekombinantni ekspresioni vektor takođe može da uključuje transkripcione regulatorne elemente (TRE) specifične za tkivo, kao što je B limfocit, T limfocit ili TRE specifične za dendritske ćelije. TRE specifični za limfoidno tkivo su poznati u struci (vidite, npr. Thompson et al., Mol. Cell. Biol.12:1043-53 (1992); Todd et al., J. Exp. Med.

177:1663-74 (1993); Penix et al., J. Exp. Med.178:1483-96 (1993)). U nekim otelotvorenjima, promoter je inducibilni promoter, koji može imati odgovor na indukujući agens (kao što je T-ćelijski aktivacioni signal). U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline koje su isporučene u ciljnu ćeliju ispitanika, npr. tumorsku ćeliju, imunsku ćeliju i/ili APC, mogu biti operativno vezane za bilo koji od prethodno opisanih regulatornih elemenata.

[0374] U nekim otelotvorenjima, vektor je bakterijski vektor, npr. bakterijski plazmid ili kozmid. U nekim otelotvorenjima, bakterijski vektor se isporučuje u ciljnu ćeliju, npr. tumorske ćelije, imunske ćelije i/ili APC, putem bakterijski posredovanog transfera

1

plazmidne DNK u ćelije sisara (takođe se naziva „baktofekcija“). U nekim otelotvorenjima, isporučeni bakterijski vektor takođe sadrži odgovarajuće sekvence za kontrolu ekspresije u ciljnim ćelijama, kao što je sekvenca promotera i/ili sekvenca pojačivača, ili bilo koje regulatorne ili kontrolne sekvence koje su prethodno opisane. U nekim otelotvorenjima, bakterijski vektor sadrži odgovarajuće sekvence za kontrolu ekspresije za ekspresiju i/ili izlučivanje kodiranih varijanti polipeptida u infektivnom agensu, npr. bakteriji.

[0375] U nekim otelotvorenjima, polipeptidi koji su ovde obezbeđeni takođe mogu da se naprave sintetičkim postupcima. Sinteza čvrste faze je poželjna tehnika za proizvodnju pojedinačnih peptida, pošto ona predstavlja najisplativiji postupak za pravljenje malih peptida. Na primer, dobro poznate tehnike sinteze čvrste faze uključuju upotrebu zaštitnih grupa, linkera i podloga u čvrstoj fazi, kao i specifične reakcione uslove za protekciju i deprotekciju, uslove za raskidanje linkera, upotrebu čistača i druge aspekte sinteze peptida u čvrstoj fazi. Peptidi zatim mogu da se sklope u polipeptide kao što je ovde dato.

IV. POSTUPCI ZA PROCENU AKTIVNOSTI IMUNSKE MODULACIJE VARIJANTI POLIPEPTIDA PD-L1 I IMUNOMODULATORNIH PROTEINA

[0376] U nekim otelotvorenjima, varijante polipeptida PD-L1 koje su ovde obezbeđene (npr. kompletne dužine i/ili specifični vezujući fragmenti ili konjugati, naslagani konstrukti ili njihove fuzije, konstruisane ćelije ili infektivni agensi) pokazuju imunomodulatornu aktivnost da moduliraju aktivaciju T-ćelija. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi PD-L1 moduliraju ekspresiju IFN-gama u T-ćelijskom testu u poređenju sa divljim tipom ili nemodifikovanim kontrolnim PD-L1. U nekim slučajevima, modulacija ekspresije IFN-gama može da poveća ili da smanji ekspresiju IFN-gama u poređenju sa kontrolom. Testovi za određivanje specifičnog vezivanja i ekspresije IFN-gama su dobro poznati u struci i uključuju testove MLR (reakcija pomešanih limfocita) koji mere nivoe citokina interferona gama u supernatantima za uzgajanje (Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56), SEB (stafilokokni enterotoksin B) test stimulacije T-ćelija (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56), i test anti-CD3 stimulacije T-ćelija (Li i Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104).

[0377] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 u nekim otelotvorenjima može da poveća, ili, u alternativnim otelotvorenjima, da smanji ekspresiju IFN-gama (interferon-

1 1

gama) u testu primarnih T-ćelija u poređenju sa PD-L1 kontrolom divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, takva aktivnost može da zavisi od toga da li je varijanta polipeptida PD-L1 obezbeđena u obliku za antagonističku aktivnost ili u obliku za agonističku aktivnost. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina je antagonist inhibitornog receptora, na primer blokira inhibitorni signal u ćeliji koji se može javiti da smanji odgovor na aktivirajuće stimulanse, npr. CD3 i/ili CD28 kostimulatorni signal ili mitogeni signal. Stručnjacima je jasno da postoje različiti formati testova primarnih T-ćelija koji se koriste za određivanje povećanja ili smanjenja ekspresije IFN-gama.

[0378] Za testiranje sposobnosti varijante PD-L1 da poveća ili smanji ekspresiju IFN-gama u testu primarnih T-ćelija može da se koristi test reakcije pomešanih limfocita (MLR). U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina obezbeđena u antagonističkom obliku, kao što je rastvorljivi oblik, npr. varijanta PD-L1-Fc ili sekretabilnog imunomodulatornog proteina, blokira aktivnost inhibitornog receptora PD-1 i tako povećava aktivnost MLR u testu, što se može uočiti na osnovu povećane proizvodnje IFN-gama u testu. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina koja je obezbeđena u agonističkom obliku, kao što je lokalizujući naslagani vIgD ili konjugat koji sadrži ostatak za lokalizaciju tumora ili konstruisana ćelija koja eksprimira transmembranski imunomodulatorni protein kao što je obezbeđeno, može da stimuliše aktivnost inhibitornog receptora PD-1 i tako smanji aktivnost MLR, što se može videti na osnovu smanjene proizvodnje IFN-gama. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina koja je obezbeđena u agonističkom obliku, kao što je lokalizujući naslagani vIgD ili konjugat koji sadrži ostatak za lokalizaciju tumora ili konstruisana ćelija koja eksprimira transmembranski imunomodulatorni protein kao što je obezbeđeno, može da blokira aktivnost inhibitornog receptora PD-1 i tako poveća aktivnost MLR, na primer da poveća proizvodnju IFN-gama.

[0379] Alternativno, za testiranje sposobnosti varijante PD-L1 da modulira povećanje ili smanjenje ekspresije IFN-gama u testu primarnih T-ćelija može da se koristi test koimobilizacije. U testu koimobilizacije, signal TCR, koji u nekim otelotvorenjima obezbeđuje anti-CD3 antitelo, koristi se zajedno sa koimobilisanom varijantom PD-L1 da se odredi sposobnost da se poveća ili smanji ekspresija IFN-gama u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom kontrole PD-L1. U nekim otelotvorenjima, varijanta

1 2

polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina, npr. koimobilisana varijanta PD-L1 (npr. PD-L1-Fc), smanjuje proizvodnju IFN-gama u testu koimobilizacije.

[0380] U nekim otelotvorenjima, za testiranje sposobnosti varijante PD-L1 da modulira povećanje ili smanjenje ekspresije IFN-gama može da se koristi reporterski test T-ćelija. U nekim otelotvorenjima, T-ćelija je Jurkatova T-ćelijska linija ili je dobijena od Jurkatovih T-ćelijskih linija. U reporterskim testovima, takođe se generišu reporterske ćelijske linije (npr. Jurkatova reporterska ćelija) za prekomernu ekspresiju inhibitornog receptora koji je srodni vezujući partner varijante polipeptida domena IgSF. Na primer, u slučaju varijante PD-L1, generisana je reporterska ćelijska linija (npr. Jurkatova reporterska ćelija) za prekomernu ekspresiju PD-1. U nekim otelotvorenjima, reporterske T-ćelije takođe sadrže reporterski konstrukt koji sadrži inducibilni promoter responsivan na aktivaciju T-ćelije operativno vezan za reporter. U nekim otelotvorenjima, reporter je fluorescentni ili luminescentni reporter. U nekim otelotvorenjima, reporter je luciferaza. U nekim otelotvorenjima, reporter je responsivan na signalizaciju CD3. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter NFAT. U nekim otelotvorenjima, promoter je responsivan na kostimulatornu signalizaciju, npr. kostimulatornu signalizaciju CD28. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter IL-2.

[0381] U nekim aspektima reporterskog testa, reporterska ćelijska linija je stimulisana, na primer putem zajedničke inkubacije sa antigen prezentujućim ćelijama (APC) koje eksprimiraju ligand divljeg tipa inhibitornog receptora, npr. PD-L1. U nekim otelotvorenjima, APC su veštačke APC. Veštačke APC su dobro poznate stručnjaku za ovu oblast. U nekim otelotvorenjima, veštačke APC su dobijene od jedne ili više ćelijskih linija sisara, kao što su ćelije K562, CHO ili 293.

[0382] U nekim otelotvorenjima, Jurkatove reporterske ćelije su inkubirane zajedno sa veštačkim APC koje prekomerno eksprimiraju inhibitorni ligand u prisustvu varijante molekula domena IgSF ili imunomodulatornog proteina, npr. varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina. U nekim otelotvorenjima, ekspresija reportera se prati, na primer na osnovu određivanja luminescencije ili fluorescencije ćelija. U nekim otelotvorenjima, normalne interakcije između inhibitornog receptora i liganda dovode do suzbijanja ili smanjenja signala reportera, na primer u poređenju sa kontrolom, npr. ekspresije reportera putem zajedničke inkubacije kontrolnih T-ćelija i APC kada nije prisutna interakcija inhibitornog receptora i liganda, npr. APC koje prekomerno ne eksprimiraju PD-

1

L1. U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina koja je ovde obezbeđena antagonizuje interakciju, npr. kada se obezbedi u rastvorljivom obliku kao varijanta PD-L1-Fc ili kada se eksprimira iz APC kao sekretabilni imunomodulatorni protein, što dovodi do povećanja signala reportera u poređenju sa odsustvom varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina. U nekim slučajevima, određeni formati varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina koji su ovde obezbeđeni mogu da obezbede agonističku aktivnost, što dovodi do smanjenja ekspresije reportera u poređenju sa odsustvom varijante polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina.

[0383] Upotreba odgovarajućih kontrola je poznata stručnjacima za ovu oblast. Međutim, u prethodnim otelotvorenjima, kontrola obično uključuje korišćenje nemodifikovanog PD-L1, kao što je divlji tip nativnog izooblika PD-L1 iste vrste sisara od koje je varijanta PD-L1 izvedena ili razvijena. U nekim otelotvorenjima, divlji tip ili nativni PD-L1 ima isti oblik kao varijanta ili njoj odgovarajući oblik. Na primer, ako je varijanta PD-L1 rastvorljivi oblik koji sadrži varijantu ECD fuzionisanu sa proteinom Fc, onda je kontrola rastvorljivi oblik koji sadrži divlji tip ili nativni ECD iz PD-L1 fuzionisan sa proteinom Fc. U zavisnosti od toga da li je afinitet vezivanja i/ili selektivnost za jedno ili više od PD-1 i CD80 povećan ili smanjen, varijanta PD-L1 u nekim otelotvorenjima će povećati ekspresiju IFN-gama, a, u alternativnim otelotvorenjima, smanjiće ekspresiju INF-gama, u testu T-ćelija u poređenju sa kontrolom PD-L1 divljeg tipa.

[0384] U nekim otelotvorenjima, varijanta polipeptida PD-L1 ili imunomodulatornog proteina povećava ekspresiju IFN-gama (tj. ekspresiju proteina) u odnosu na divlji tip ili nemodifikovanu kontrolu PD-L1 najmanje za: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više. U drugim otelotvorenjima, varijanta PD-L1 ili imunomodulatornog proteina smanjuje ekspresiju IFN-gama (tj. ekspresiju proteina) u odnosu na divlji tip ili nemodifikovanu kontrolu PD-L1 najmanje za: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više. U nekim otelotvorenjima, kontrola PD-L1 divljeg tipa je mišji PD-L1, kao što bi se uobičajeno koristilo za varijantu PD-L1 čija sekvenca je izmenjena u odnosu na mišju sekvencu PD-L1 divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, kontrola PD-L1 divljeg tipa je humani PD-L1, kao što bi se uobičajeno koristio za varijantu PD-L1 čija sekvenca je izmenjena u odnosu na humanu sekvencu PD-L1 divljeg tipa, kao što je sekvenca PD-L1 koja sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 30 ili 1728, ili SEQ ID NO: 55 ili 309.

1 4

V. FARMACEUTSKE FORMULACIJE

[0385] Ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže bilo koju od ovde opisanih varijanti polipeptida PD-L1, imunomodulatornih proteina, konjugata, konstruisanih ćelija ili infektivnih agensa. Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Na primer, farmaceutska kompozicija može da sadrži jedan ili više ekscipijenasa za modifikaciju, održavanje ili očuvanje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine disolucije ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije. U nekim aspektima, stručnjaku je jasno da farmaceutska kompozicija koja sadrži ćelije može da se razlikuje od farmaceutske kompozicije koja sadrži protein.

[0386] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je čvrsta supstanca, kao što je prašak, kapsula ili tableta. Na primer, komponente farmaceutske kompozicije mogu biti liofilizovane. U nekim otelotvorenjima, čvrsta farmaceutska kompozicija je rekonstituisana ili rastvorena u tečnosti pre primene.

[0387] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je tečnost, na primer, varijanta polipeptida PD-L1 rastvorena u vodenom rastvoru (kao što je fiziološki rastvor ili Ringerov rastvor). U nekim otelotvorenjima, pH vrednost farmaceutske kompozicije je od oko 4,0 od oko 8,5 (recimo od oko 4,0 do oko 5,0, od oko 4,5 do oko 5,5, od oko 5,0 do oko 6,0, od oko 5,5 do oko 6,5, od oko 6,0 i oko 7,0, od oko 6,5 do oko 7,5, od oko 7,0 do oko 8,0 ili od oko 7,5 do oko 8,5).

[0388] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, na primer, punilac, vezivač, oblogu, konzervans, lubrikans, aromu, zaslađivač, boju, rastvarač, puferujući agens, helator ili stabilizator. Primeri za farmaceutski prihvatljive punioce uključuju celulozu, dvobazni kalcijum fosfat, kalcijum karbonat, mikrokristalnu celulozu, saharozu, laktozu, glukozu, manitol, sorbitol, maltol, preželatinizovani skrob, kukuruzni skrob ili krompirov skrob. Primeri za farmaceutski prihvatljive vezivače uključuju polivinil pirolidon, skrob, laktozu, ksilitol, sorbitol, maltitol, želatin, saharozu, polietilen glikol, metil celulozu ili celulozu. Primeri za farmaceutski prihvatljive obloge uključuju hidroksipropil metilcelulozu (HPMC), šelak, protein kukuruza zein ili želatin. Primeri za

1

farmaceutski prihvatljive dezintegranse uključuju polivinil pirolidon, karboksimetil celulozu ili natrijum skrob glikolat. Primeri za farmaceutski prihvatljive lubrikanse uključuju polietilen glikol, magnezijum stearat ili stearinsku kiselinu. Primeri za farmaceutski prihvatljive konzervanse uključuju metil parabene, etil parabene, propil paraben, benzojevu kiselinu ili sorbinsku kiselinu. Primeri za farmaceutski prihvatljive zaslađivače uključuju saharozu, saharin, aspartam ili sorbitol. Primeri za farmaceutski prihvatljive puferujuće agense uključuju karbonate, citrate, glukonate, acetate, fosfate ili tartarate.

[0389] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija dalje sadrži agens za kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda, kao što su injektabilne mikrosfere, bioerodibilne čestice, polimerna jedinjenja (polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi.

[0390] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je sterilna. Sterilizacija može da se postigne filtracijom kroz membrane za sterilnu filtraciju ili zračenjem. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija koristeći ovaj postupak može da se obavi pre liofilizacije i rekonstitucije ili nakon toga. Kompozicija za parenteralnu primenu može da se skladišti u liofilozovanom obliku ili u rastvoru. Pored toga, parenteralne kompozicije se obično ubacuju u ambalažu koja ima sterilni priključak, na primer, kesa za intravenski rastvor ili bočica koji ima zatvarač koji može da se probuši hipodermičnom iglom za injekciju.

[0391] U nekim otelotvorenjima, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže transmembranske imunomodulatorne proteine, uključujući konstruisane ćelije koje eksprimiraju takve transmembranske imunomodulatorne proteine. U nekim otelotvorenjima, farmaceutske kompozicije i formulacije sadrže jedan ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa. Takve kompozicije mogu da sadrže pufere kao što je neutralni puferovani fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferovan fosfatom i slično; ugljovodonike kao što je glukoza, manoza, saharoza ili dekstran, manitol; proteine; polipeptide ili aminokiseline kao što je glicin; antioksidanse; helatore kao što je EDTA ili glutation; adjuvanse (npr. aluminijum hidroksid); i konzervanse. Kompozicije iz predmetnog pronalaska su poželjno formulisane za intravensku primenu.

[0392] Takva formulacija, na primer, može biti u obliku koji je pogodan za intravensku infuziju. Farmaceutski prihvatljiv nosač može biti farmaceutski prihvatljiva supstanca,

1

kompozicija ili vehikulum koji učestvuje u prenosu ili transportu ćelija od interesa iz jednog tkiva, organa ili dela tela u drugo tkivo, drugi organ ili deo tela. Na primer, nosač može biti tečni ili čvrsti punilac, razblaživač, ekscipijens, rastvarač ili supstanca za enkapsulaciju, ili neka njihova kombinacija. Svaka komponenta nosača mora biti „farmaceutski prihvatljiva“, što znači da mora biti kompatibilna sa ostalim sastojcima formulacije. Takođe mora biti pogodna za kontakt sa bilo kojim tkivom, organom ili delom tela sa kojim se može susresti, što znači da ne sme postojati rizik od toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, imunogenosti, ili bilo koje druge komplikacije koji značajno premašuje terapeutsku korist.

VI. PROIZVODI I KOMPLETI

[0393] Ovde su takođe obezbeđeni proizvodi koji sadrže farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane u odgovarajućem pakovanju. Odgovarajuća pakovanja za kompozicije (kao što su oftalmološke kompozicije) koje su ovde opisane poznata su u struci i uključuju, na primer, bočice (kao što su zaptivene bočice), posude, ampule, boce, teglice, fleksibilno pakovanje (npr. zaptivene Mylar ili plastične kese) i slično. Ovi proizvodi mogu biti dodatno sterilisani i/ili zaptiveni.

[0394] Dalje su obezbeđeni kompleti koji sadrže ovde opisane farmaceutske kompozicije (ili proizvode), koji mogu dalje da sadrže uputstvo za postupke upotrebe kompozicije, kao što su upotrebe koje su ovde opisane. Kompleti koji su ovde opisani mogu takođe da sadrže druge materijale koji su poželjni iz komercijalnog i korisničkog ugla, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i uputstva za obavljanje bilo kojih postupaka koji su ovde opisani.

VII. TERAPEUTSKE PRIMENE

[0395] Ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije za primenu u postupcima za modulaciju imunskog odgovora, farmaceutske kompozicije koje sadrže varijantu ovde opisanog polipeptida PD-L1, imunomodulatornog proteina, konjugovane konstruisane ćelije ili infektivnog agensa, uključujući one u vezi sa lečenjem bolesti ili stanja kod ispitanika, kao što je ljudski pacijent. Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane (uključujući farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ovde opisane varijante polipeptida PD-L1, imunomodulatornih proteina, konjugata, konstruisanih ćelija i infektivnih agensa) mogu da se

1

koriste u raznovrsnim terapeutskim primenama, kao što je lečenje bolesti. Na primer, u nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija se koristi za lečenje inflamatornih ili autoimunih poremećaja, kancera, transplantacije organa, virusnih infekcija i/ili bakterijskih infekcija kod sisara. Farmaceutska kompozicija može da modulira (npr. poveća ili smanji) imunski odgovor za lečenje bolesti.

[0396] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni postupci mogu da se primene na terapeutsku primenu varijante ovde opisanih polipeptida PD-L1, imunomodulatornih proteina, konjugata, konstruisanih ćelija i infektivnih agensa. Imajući u vidu obezbeđeno otkriće, stručnjak za ovu oblast može da izabere format za indikaciju, u zavisnosti od vrste modulacije imunskog odgovora koji se želi, npr. povećanje ili smanjenje.

[0397] U nekim otelotvorenjima, primenjuje se farmaceutska kompozicija koja stimuliše imunski odgovor koja je ovde obezbeđena, a koja može biti korisna, na primer, u lečenju kancera, virusnih infekcija ili bakterijskih infekcija. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija sadrži varijantu polipeptida PD-L1 u formatu koji pokazuje antagonističku aktivnost njegovog srodnog vezujućeg partnera PD-1 i/ili koji inhibira kostimulatornu signalizaciju putem PD-1. Primeri za formate polipeptida PD-L1 za upotrebu kod takvih terapeutskih primena uključuju, na primer, varijantu polipeptida PD-L1 koja je rastvorljiva (npr. varijanta PD-L1-Fc fuzionog proteina), imunomodulatorni protein ili

„naslaganu“ varijantu polipeptida PD-L1 i još jednog domena IgSF, uključujući njihove rastvorljive oblike koji su fuzije Fc, konstruisanu ćeliju koja eksprimira sekretabilni imunomodulatorni protein, ili infektivni agens koji sadrži molekul nukleinske kiseline koja kodira sekretabilni imunomodulatorni protein, recimo za ekspresiju i izlučivanje sekretabilnog imunomodulatornog proteina u inficiranoj ćeliji (npr. tumorska ćelija ili APC, npr. dendritska ćelija). U takve postupke spadaju postupci koji se sprovode isporučivanjem varijante polipeptida PD-L1 u rastvorljivom formatu. Ovde su opisani primeri za rastvorljive formate, uključujući formate u kojima je ekstracelularni deo varijante polipeptida PD-L1 koji sadrži afinitetno modifikovani domen IgSF (npr. IgV) vezan, neposredno ili posredno, sa domenom multimerizacije, npr. domenom ili regionom Fc. U nekim otelotvorenjima, takav terapeutski agens je varijanta PD-L1-Fc fuzionog proteina.

[0398] Obezbeđeni postupci za modulaciju imunskog odgovora mogu da se koriste za lečenje bolesti ili stanja, kao što je tumor ili kancer. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska

1

kompozicija može da se koristi za inhibiciju rasta ćelija kancera sisara (kao što su ljudske ćelije kancera). Postupak za lečenje kancera može da uključuje primenu delotvorne količine bilo koje od farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane na ispitaniku koji ima kancer. Delotvorna količina farmaceutske kompozicije može da se primeni da inhibira, zaustavi ili preokrene progresiju kancera, uključujući kancere koji su osetljivi na modulaciju imunološke aktivnosti, na primer pomoću obezbeđenih varijanti ili imunomodulatornih proteina. Ljudske ćelije kancera mogu da se leče in vivo ili ex vivo. Kod ex vivo lečenja ljudskog pacijenta, tkivo ili tečnosti koje sadrže ćelije kancera se leče izvan tela, a zatim se tkivo ili tečnosti ponovo uvode u pacijenta. U nekim otelotvorenjima, kancer se leči kod ljudskog pacijenta in vivo putem primene terapeutske kompozicije na pacijentu. Tako, predmetni pronalazak obezbeđuje ex vivo i in vivo postupke za inhibiciju, zaustavljanje ili preokretanje progresije tumora, ili na drugi način dovodi do statistički značajnog povećanja preživljavanja bez progresije (tj. vremena tokom lečenja i nakon njega u kom pacijent živi sa kancerom koji se ne pogoršava) ili ukupnog preživljavanja (takođe se naziva „stopa preživljavanja“, tj. procenat ljudi u studiji ili terapijskoj grupi koji su živi tokom određenog vremena nakon što im je dijagnostikovan kancer ili su od njega lečeni) u poređenju sa lečenjem kontrolom.

[0399] Kanceri koji mogu da se leče farmaceutskim kompozicijama i postupcima lečenja koji su ovde opisani uključuju, ali nisu ograničeni na, melanom, kancer mokraćne bešike, hematološke malignitete (leukemija, limfom, mijelom), kancer jetre, moždani kancer, renalni kancer, kancer dojke, kancer pankreasa (adenokarcinom), kolorektalni kancer, kancer pluća (mikrocelularni kancer pluća i nemikrocelularni kancer pluća), kancer slezine, kancer timusa ili krvnih zrnaca (tj. leukemija), kancer prostate, kancer testisa, kancer jajnika, kancer materice, muskuloskeletni kancer, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer germinativnih ćelija ili endokrini i neuroendokrini kancer. U nekim otelotvorenjima, kancer je Juingov sarkom. U nekim otelotvorenjima, kancer je izabran od melanoma, kancera pluća, kancera mokraćne bešike i hematološkog maligniteta. U nekim otelotvorenjima, kancer je limfom, limfoidna leukemija, mijeloidna leukemija, kancer grlića materice, neuroblastom ili multipli mijelom.

[0400] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija se primenjuje kao monoterapija (tj. kao pojedinačni agens) ili kao kombinovana terapija (tj. u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih agensa protiv kancera, kao što je hemoterapijski lek, vakcina protiv kancera ili inhibitor imunske kontrolne tačke. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija

1

takođe može da se primenjuje sa radioterapijom. U nekim aspektima predmetnog otkrića, inhibitor imunske kontrolne tačke je nivolumab, tremelimumab, pembrolizumab, ipilimumab, i slično.

[0401] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija potiskuje imunski odgovor, što može biti korisno u lečenju inflamatornih ili autoimunih poremećaja, ili kod transplantacije organa. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija sadrži varijantu polipeptida PD-L1 u formatu koji pokazuje agonističku aktivnost njegovog srodnog vezujućeg partnera PD-1 i/ili koji stimuliše inhibitornu signalizaciju putem PD-1. U nekim aspektima, varijanta polipeptida PD-L1 stimuliše inhibitorni signal preko CD80, na primer, eksprimira se na limfocitu ili APC. Primeri formata polipeptida PD-L1 za upotrebu kod takvih terapeutskih primena uključuju, na primer, imunomodulatorni protein ili „naslaganu“ varijantu polipeptida PD-L1 i domena IgSF ili njegovu varijantu koja lokalizuje ćeliju ili tkivo inflamatornog okruženja, konjugat koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 vezanu sa ostatkom koji lokalizuje ćeliju ili tkivo inflamatornog okruženja, konstruisanu ćeliju koja eksprimira transmembranski imunomodulatorni protein ili infektivni agens koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira transmembranski imunomodulatorni protein, na primer za ekspresiju transmembranskog imunomodulatornog proteina u inficiranoj ćeliji.

[0402] Obezbeđeni postupci za modulaciju imunskog odgovora mogu da se koriste za lečenje bolesti ili stanja, kao što je inflamatorni ili autoimuni poremećaj. U nekim otelotvorenjima, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je vaskulitis povezan sa antitelima na antigene citoplazme neutrofilnih leukocita (ANCA), vaskulitis, autoimuna bolest kože, transplantacija, reumatska bolest, inflamartorna gastrointestinalna bolest, inflamatorna bolest oka, inflamatorna neurološka bolest, inflamatorna bolest pluća, inflamatorna endokrina bolest, ili autoimuna hematološka bolest.

[0403] U nekim otelotvorenjima, inflamatorni i autoimuni poremećaji koji mogu da se leče pomoću farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane su Adisonova bolest, alergije, alopecia areata, Alchajmerova bolest, vaskulitis povezan sa antitelima na antigene citoplazme neutrofilnih leukocita (ANCA), antifosfolipidni sindrom (Hjuzov sindrom), astma, ateroskleroza, reumatoidni artritis, autoimuna hemolitička anemija, autoimuni hepatitis, autoimuna bolest unutrašnjeg uha, autoimuni limfoproliferativni sindrom, autoimuni miokarditis, autoimuni ooforitis, autoimuni orhitis, azoospermija, Behčetova bolest,

1

Bergerova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatija, kardiovaskularna bolest, celijačna bolest, sindrom hroničnog umora usled imunske disfunkcije (CFIDS), hronični idiopatijski polineuritis, hronična inflamatorna demijelinacija, poliradikalneuropatija (CIDP), hronična relapsna polineuropatija (Gijom-Bareov sindrom), Čarg-Štrausov sindrom (CSS), ožiljavajući pemfigoid, bolest hladnih aglutinina (CAD), HOBP (hronična opstruktivna bolest pluća), CREST sindrom, Kronova bolest, dermatitis, herpetiformus, dermatomiozitis, dijabetes, diskoidni lupus, ekcem, stečena bulozna epidermoliza, esencijalna mešana krioglobulinemija, Evansov sindrom, egzoftalmus, fibromijalgija, Gudpaščerov sindrom, Grejvsova bolest, Hašimotov tiroiditis, idiopatska fibroza pluća, idiopatska trombocitopenija purpura (ITP), IgA nefropatija, imunoproliferativna bolest ili poremećaj, inflamatorna bolest creva (IBD), intersticijalna bolest pluća, juvenilni artritis, juvenilni idiopatski artritis (JIA), Kavasakijeva bolest, Lambert-Itonov mijastenični sindrom, lichen planus, lupus nefritis, limfocitni hipofizitis, Menijerova bolest, Miler-Fišerov sindrom/akutna diseminovana encefalomijeloradikulopatija, bolest mešovitog vezivnog tkiva, multipla skleroza (MS), mišićni reumatizam, mijalgijski encefalomijelitis (ME), mijastenija gravis, inflamacija oka, pemphigus foliaceus, pemphigus vulgaris, perniciozna anemija, poliarteritis nodoza, polihondritis, poliglandularni sindromi (Vitakerov sindrom), polimijalgija reumatika, polimiozitis, primarna agamaglobulinemija, primarna bilijarna ciroza/autoimuna holangiopatija, psorijaza, psorijatski artritis, Rejnoov fenomen, Rajterov sindrom/reaktivni artritis, restenoza, reumatska groznica, reumatska bolest, sarkoidoza, Šmitov sindrom, skleroderma, Sjogrenov sindrom, sindrom ukočene osobe, sistemski eritemski lupus (SLE), sistemska skleroderma, Takajasuov arteritis, temporalni arteritis/arteritis gigantskih ćelija, tiroiditis, dijabetes tipa 1, ulcerozni kolitis, uveitis, vaskulitis, vitiligo, intersticijalna bolest creva ili Vegenerova granulomatoza. U nekim otelotvorenjima, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je izabran od intersticijalne bolesti creva, transplantata, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, multiple skleroze, astme, reumatoidnog artritisa i psorijaze.

[0404] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija se primenjuje da modulira autoimuno stanje. Na primer, prigušivanje imunskog odgovora može biti korisno u postupcima za inhibiciju odbacivanja tkiva, ćelije ili organa transplantiranog od donora kod pacijenta. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane koriste se da ograniče ili spreče bolesti ili poremećaje povezane sa kalemom ili transplantatom, kao što je bolest kalem protiv domaćina (GVHD). U nekim otelotvorenjima, farmaceutske kompozicije se koriste za prigušivanje autoimunog odbacivanja transplantirane

1 1

ili graftovane koštane srži, organa, kože, mišića, neurona, ćelijskih ostrvaca ili ćelija parenhima.

[0405] Farmaceutske kompozicije koje sadrže konstruisane ćelije i postupci koji su ovde opisani mogu da se koriste kod adoptivnog ćelijskog transfera. U nekim otelotvorenjima, ćelijske kompozicije koje sadrže konstruisane ćelije mogu da se koriste u povezanim postupcima da, na primer, moduliraju imunološku aktivnost u imunoterapijskom pristupu za lečenje, na primer, kancera sisara ili, u drugim otelotvorenjima, lečenje autoimunih poremećaja. Postupci koji se koriste generalno obuhvataju postupak za dovođenje u kontakt TIP iz predmetnog pronalaska sa ćelijom sisara u uslovima koji dopuštaju specifično vezivanje afinitetno modifikovanog domena IgSF i modulaciju imunološke aktivnosti ćelije sisara. U nekim otelotvorenjima, imunske ćelije (kao što su limfociti koji infiltriraju tumor (TIL), T-ćelije (uključujući CD8+ ili CD4+ T-ćelije) ili APC) konstruisane su da eksprimiraju membranski protein i/ili rastvorljivu varijantu polipeptida PD-L1, imunomodulatorni protein ili konjugat, kao što je ovde opisano. Konstruisane ćelije zatim mogu da se dovedu u kontakt sa ćelijom sisara, kao što je APC, drugi limfocit ili tumorska ćelija u kojoj je modulacija imunološke aktivnosti poželjna u uslovima koji dopuštaju specifično vezivanje afinitetno modifikovanog domena IgSF sa kontrastrukturom na ćeliji sisara, tako da imunološka aktivnost može da se modulira u ćeliji sisara. Ćelije mogu da se dovedu u kontakt in vivo ili ex vivo.

[0406] U nekim otelotvorenjima, konstruisane ćelije su autologne ćelije. U drugim otelotvorenjima, ćelije su alogene. U nekim otelotvorenjima, ćelije su autologno konstruisane ćelije koje su infuzijom vraćene u sisara iz kog su izolovane. U nekim otelotvorenjima, ćelije su alogene konstruisane ćelije koje su infuzijom ubačene u sisara. U nekim otelotvorenjima, ćelije su sakupljene iz pacijentove krvi ili tumora, konstruisane da eksprimiraju polipeptid (kao što je varijanta polipeptida PD-L1, imunomodulatorni protein ili konjugat kao što je ovde opisano), ekspandirane u in vitro sistemu za uzgajanje (na primer, stimulisanjem ćelija) i infuzijom vraćene u pacijenta da posreduju u uništavanju tumora. U nekim otelotvorenjima, postupci se vrše adoptivnim ćelijskim transferom kada se ćelije koje eksprimiraju TIP (npr. T-ćelija) infuzijom vraćaju u pacijenta. U nekim otelotvorenjima, terapeutske kompozicije i postupci iz pronalaska koriste se u lečenju pacijenta sisara od kancera kao što su limfom, limfoidna leukemija, mijeloidna leukemija, kancer grlića materice, neuroblastom ili multipli mijelom.

1 2

[0407] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija se primenjuje na ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je ljudski ispitanik. Uopšteno, doze i postupci primene farmaceutske kompozicije se određuju u skladu sa veličinom i stanjem ispitanika, u skladu sa uobičajenom farmaceutskom praksom. Na primer, terapeutski delotvorna doza prvo može da se proceni u testovima ćelijske kulture ili na životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi, svinje ili majmuni. Životinjski model takođe može da se koristi da se odredi odgovarajući raspon koncentracije i postupak primene. Takve informacije će se zatim koristiti da se odrede korisne doze i postupci primene kod ljudi. Tačna doza će biti utvrđena uzimajući u obzir faktore vezane za ispitanika kome je potrebno lečenje. Doza i primena se prilagođavaju da se dobiju dovoljni nivoi aktivnog jedinjenja ili da se održi željeno dejstvo. Faktori koji mogu da se uzmu u obzir uključuju težinu bolesti, opšte zdravstveno stanje ispitanika, starost, težinu i pol ispitanika, vreme i učestalost primene, kombinacije lekova, reakcije senzitivnosti i odgovor na terapiju.

[0408] Farmaceutske kompozicije sa dugotrajnim dejstvom mogu da se primenjuju na svaka 3 do 4 dana, ili dva puta nedeljno, u zavisnosti od poluživota i brzine klirensa određene formulacije. Učestalost doziranja će zavisiti od farmakokinetičkih parametara molekula u korišćenoj formulaciji. Kompozicija se obično primenjuje sve dok se ne dostigne doza koja postiže željeno dejstvo. Kompozicija stoga može da se primeni kao jedna doza, ili kao više doza (sa istim ili različitim koncentracijama/dozama) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija. Rutinski se vrši dalje podešavanje odgovarajuće doze. Odgovarajuće doze mogu da se utvrde korišćenjem odgovarajućih podataka o odgovoru na dozu. Može da se prati više biomarkera ili fizioloških markera za terapeutsko dejstvo, uključujući aktivaciju ili proliferaciju T-ćelija, sintezu ili proizvodnju citokina (npr. proizvodnja TNF-α, IFN-γ, IL-2), indukciju različitih markera aktivacije (npr. CD25, receptor IL-2), inflamaciju, oticanje ili osetljivost zglobova, nivo C-reaktivnog proteina u serumu, proizvodnju antitela na kolagen i/ili odgovor antitela zavisan od T-ćelija.

[0409] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija se primenjuje na ispitaniku bilo kojim putem, uključujući oralno, transdermalno, inhalacijom, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, neposrednom primenom na mesto rane, primenom na mesto hirurškog zahvata, intraperitonealno, putem supozitorije, supkutano, intradermalno, transkutano,

1

nebulizacijom, intrapleuralno, intraventrikularno, intraartikularno, intraokularno ili intraspinalno.

[0410] U nekim otelotvorenjima, doza farmaceutske kompozicije je jedna doza ili ponovljena doza. U nekim otelotvorenjima, doze se daju ispitaniku jednom dnevno, dva puta dnevno, tri puta dnevno ili četiri ili više puta dnevno. U nekim otelotvorenjima, nedeljno se daje oko 1 ili više (kao što je oko 2 ili više, oko 3 ili više, oko 4 ili više, oko 5 ili više, oko 6 ili više ili oko 7 ili više) doza. U nekim otelotvorenjima, više doza se daje tokom nekoliko dana, nedelja, meseci ili godina. U nekim otelotvorenjima, tok lečenja je oko 1 ili više doza (kao što je oko 2 ili više doza, oko 3 ili više doza, oko 4 ili više doza, oko 5 ili više doza, oko 7 ili više doza, oko 10 ili više doza, oko 15 ili više doza, oko 25 ili više doza, oko 40 ili više doza, oko 50 ili više doza, ili oko 100 ili više doza).

[0411] U nekim otelotvorenjima, primenjena doza farmaceutske kompozicije je oko 1 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više (kao što je oko 2 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 5 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 10 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 25 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 50 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 100 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 250 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 500 µg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više oko 1 mg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više, oko 2 mg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više ili oko 5 mg proteina po kg ispitanikove telesne mase ili više).

[0412] U nekim otelotvorenjima, primenjuje se terapeutska količina ćelijske kompozicije. Preciznu količinu kompozicija iz predmetnog pronalaska koja treba da se primeni obično može da odredi lekar imajući u vidu pojedinačne razlike u starosti, težini, veličini tumora, obimu infekcije ili metastaze i stanju pacijenta (ispitanika). Generalno može da se kaže da farmaceutska kompozicija koja sadrži konstruisane ćelije, npr. T-ćelije, kao što je ovde opisana, može da se primenjuje sa dozom od 10<4>do 10<9>ćelija/kg telesne težine, kao što je 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne težine, uključujući sve cele vrednosti u tim rasponima.

Konstruisane ćelijske kompozicije, kao što su kompozicije T-ćelija, takođe mogu da se primene više puta sa ovim dozama. Ćelije mogu da se primene koristeći tehnike infuzije koje su uobičajeno poznate kao imunoterapija (vidite, npr. Rosenberg et al, New Eng. J. of Med.

1 4

319: 1676, 1988). Optimalnu dozu i režim lečenja za konkretnog pacijenta lako može da odredi stručnjak za oblast medicine putem praćenja znakova bolesti kod pacijenta i prilagođavanja lečenja u skladu sa tim.

[0413] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija sadrži infektivne agense koji sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija sadrži dozu infektivnog agensa koja je pogodna za primenu na ispitaniku koji je podoban za lečenje. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija sadrži infektivni agens koji je virus, sa pojedinačnom ili višestrukom doznom količinom, od oko 1×10<5>do oko 1×10<12>jedinica koje formiraju plak (pfu), 1×10<6>do 1×10<10>pfu, ili 1×10<7>do 1×10<10>pfu, uključujući granične vrednosti, kao što je najmanje ili najmanje oko ili oko 1×10<6>, 1× 10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>pfu ili oko 1×10<10>pfu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija može da sadrži koncentraciju virusa od ili od oko 10<5>do oko 10<10>pfu/ml, na primer, 5×10<6>do 5×10<9>ili 1×10<7>do 1×10<9>pfu/ml, kao što je najmanje ili najmanje oko ili oko 10<6>pfu/ml, 10<7>pfu/ml, 10<8>pfu/ml ili 10<9>pfu/ml. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija sadrži infektivni agens koji je bakterija, sa pojedinačnom ili višestrukom doznom količinom, od oko 1×10<3>do oko 1×10<9>jedinica koje formiraju koloniju (cfu), 1×10<4>do 1×10<9>cfu, ili 1×10<5>do 1×10<7>cfu, uključujući granične vrednosti, kao što je najmanje ili najmanje oko ili oko 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>ili 1×10<9>cfu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija može da sadrži koncentraciju bakterija od ili od oko 10<3>do oko 10<8>cfu/ml, na primer, 5×10<5>do 5×10<7>ili 1×10<6>do 1×10<7>cfu/ml, kao što je najmanje ili najmanje oko ili 10<5>cfu/ml, 10<6>cfu/ml, 10<7>cfu/ml ili 10<8>cfu/ml.

[0414] Poznati su različiti postupci za utvrđivanje da li primena terapeutske kompozicije iz pronalaska dovoljno modulira imunološku aktivnost putem eliminacije, sekvestriranja, ili inaktivacije imunskih ćelija koje posreduju ili mogu da posreduju u neželjenom imunskom odgovoru; indukcije, stvaranja ili uključivanja imunskih ćelija koje posreduju ili mogu da posreduju u zaštitnom imunskom odgovoru; promene fizičkih i funkcionalnih osobina imunskih ćelija; ili kombinacije ovih dejstava. Primeri za merenje modulacije imunološke aktivnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, ispitivanje prisustva ili odsustva populacije imunskih ćelija (koristeći protočnu citometriju, imunohistohemiju, histologiju, elektronsku mikroskopiju, lančanu reakciju polimeraze (PCCR)); merenje funkcionalnog kapaciteta imunskih ćelija, uključujući sposobnost ili otpornost na proliferaciju ili deobu kao odgovor na

1

signal (kao što je korišćenje testova proliferacije T-ćelija i pepscan analize na osnovu inkorporacije 3H-timidina nakon čega sledi stimulacija anti-CD3 antitelom, antitelom na T-ćelijski receptor, anti-CD28 antitelom, kalcijum jonoforima, PMA (forbol 12-miristat 13-acetat) antigen prezentujućim ćelijama sa peptidom ili proteinskim antigenom; test proliferacije B-ćelija); merenje sposobnosti ubijanja ili liziranja drugih ćelija (kao što su testovi citotoksičnosti T-ćelija); merenje citokina, hemokina, ćelijskih površinskih molekula, antitela i drugih ćelijskih proizvoda (npr. putem protočne citometrije, testa sa imunosorbentom vezanim za enzim, vestern blot analize, analize mikronizova proteina, analize imunoprecipitacije); merenje biohemijskih markera aktivacije imunskih ćelija ili signalnih puteva u imunskim ćelijama (npr. vestern blot i analiza imunoprecipitacije fosforilacije tirozina, serina ili treonina, raskidanja polipeptida i nastanka ili disocijacije proteinskih kompleksa; analiza niza proteina; profilisanje transkripcione DNK koristeći nizove DNK ili subtraktivnu hibridizaciju); merenje ćelijske smrti putem apoptoze, nekroze ili drugih mehanizama (npr. bojenje aneksina V, test TUNEL, gel elektroforeza za merenje fragmentacije molekula DNK na gelu, histologija; testovi fluorogene kaspaze, vestern blot analiza supstrata kaspaze); merenje gena, proteina i drugih molekula koje proizvode imunske ćelije (npr. nortern blot analiza, lančana reakcija polimeraze, mikronizovi DNK, mikronizovi proteina, 2-dimenzionalna gel elektroforeza, vestern blot analiza, test sa imunosorbentom vezanim za enzim, protočna citometrija); i merenje kliničkih simptoma ili ishoda kao što je poboljšanje autoimunih, neurodegenerativnih i drugih bolesti koje uključuju svojstvene proteine ili svojstvene polipeptide (klinički rezultati, zahtevi za korišćenje dodatnih terapija, funkcionalni status, studije snimanjem), na primer, putem merenja stope relapsa ili težine bolesti (koristeći kliničke rezultate koji su poznati stručnjaku za ovu oblast) u slučaju multiple skleroze, merenje glukoze u krvi u slučaju dijabetesa tip I, ili inflamacije zglobova u slučaju reumatoidnog artritisa.

VIII. PRIMERI

[0415] Sledeći primeri su dati samo u ilustrativne svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničenje opsega pronalaska. Svi primeri koji ne spadaju u navedeni opseg patentnih zahteva su uključeni samo kao osnovne informacije ili u svrhe poređenja.

PRIMER 1

1

Stvaranje mutantnih konstrukta DNK domena IgSF

[0416] Primer 1 opisuje stvaranje mutantnih konstrukta DNK domena IgSF humanog PD-L1 za translaciju i ekspresiju na površini kvasaca kao biblioteka displeja kvasaca.

A. Degenerativne biblioteke

[0417] Konstrukti su stvoreni na osnovu sekvence humanog PD-L1 divljeg tipa koja je data u SEQ ID NO:309 koja sadrži domen nalik imunoglobulinu tipa V (IgV) na sledeći način:

[0418] Za biblioteke koje ciljaju specifične ostatke za potpunu ili delimičnu randomizaciju sa degenerativnim kodonima, degenerativni kodoni, kao što su specifični mešoviti skupovi baza za kodiranje različitih aminokiselinskih supstitucija, stvoreni su koristeći algoritam koji se može naći na URL:

rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/.

[0419] Pozicije za mutaciju su generalno birane na osnovu direktnih informacija o strukturi kristala za kompleks PDL1::PD1 (npr. PDB: 4ZQK). Alternativno, ako su dostupne strukture homolognih proteinskih kompleksa, mogu da se naprave modeli homologije. Koristeći strukturne informacije, pregledač strukture (dostupan na URL: spdbv.vital-it.ch) korišćen je za identifikaciju kontaktnih ili nekontaktnih ostataka međupovršine za mutagenezu sa degenerativnim kodonima.

[0420] Sledeći korak u konstruisanju biblioteke je bio poravnanje sekvenci PD-L1 čoveka, miša, pacova i majmuna da se identifikuje koji ostaci izabrani za mutagenezu predstavljaju očuvane ostatke. Na osnovu ove analize, očuvani ciljni ostaci su mutirani sa degenerativnim kodonima koji su naznačavali samo konzervativne aminokiselinske promene i ostatak divljeg tipa. Ostaci koji nisu očuvani mutirani su na agresivniji način, ali takođe uz ostatak divljeg tipa. Degenerativni kodoni koji su takođe kodirali ostatak divljeg tipa korišćeni su da se

1

izbegne prekomerna mutageneza ciljnog proteina. Iz istog razloga, samo do 20 pozicija je ciljano za mutagenezu za svaku biblioteku. Analiza mutacije je bila fokusirana na kontaktne i nekontaktne ostatke međupovršine koji su bili u okviru od 6 Å od vezujuće površine sa bočnim lancima usmerenim ka ligandu/kontrastrukturi. Za stvaranje DNK koja kodira ciljnu biblioteku, preklapajući oligonukleotidi dužine do 80 nukleotida koji sadrže degenerativne kodone na pozicijama ostataka koje su ciljane za mutagenezu poručeni su od kompanije Integrated DNA Technologies (Coralville, SAD). Oligonukleotidi su rastvoreni u sterilnoj vodi, pomešani u ekvimolarnom odnosu, zagrevani na 95 °C tokom pet minuta i polako ohlađeni na sobnu temperaturu radi komplementarnog vezivanja prajmera. Oligonukleotidni prajmeri specifični za domen IgV koji se komplementarno vezuju za početak i kraj genske sekvence domena IgV su zatim korišćeni za stvaranje prvog PCR proizvoda. Oligonukleotidi specifični za domen IgV koji se preklapaju sa 40 bp sa klonirajućim vektorom pBYDS03 (Life Technologies USA), uključujući mesta kloniranja BamHI i KpnI i van njih, zatim su korišćeni za amplifikaciju 100 ng PCR proizvoda iz prethodnog koraka dajući ukupno najmanje 12 µg DNK za svaku elektroporaciju. Oba PCR su dobijena lančanom reakcijom polimeraze (PCR) koristeći glavnu smešu OneTaq 2x PCR (New England Biolabs, SAD). Drugi PCR proizvodi su prečišćeni koristeći komplet za prečišćavanje PCR (Qiagen, Nemačka) i ponovo suspendovani u dejonizovanoj vodi. Alternativno su korišćeni ultrameri (Integrated DNA Technologies) dužine do 200 bp zajedno sa PCR megaprajmerom (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf) da se dobiju veći nizovi degenerativnih kodona koji nisu lako mogli da se stvore koristeći više malih preklapajućih prajmera. Nakon stvaranja proizvoda kompletne dužine koristeći PCR megaprajmer, biblioteka mutantnih domena IgV je ponovo PCR amplifikovana koristeći prajmere DNK koji sadrže region preklapanja od 40 bp sa modifikovanom klonirajućom varijantom pBYDS03 za homolognu rekombinaciju u kvasce.

[0421] Za pripremu insercije iz biblioteke, vektor pBYDS03 je digestovan sa restrikcionim enzimima BamHI i KpnI (New England Biolabs, SAD) i veliki fragment vektora je prečišćen na gelu i rastvoren u sterilnoj, dejonizovanoj vodi. DNK spremna za elektroporaciju za sledeći korak dobijena je mešanjem 12 µg inserta DNK iz biblioteke sa 4 µg linearizovanog vektora u dejonizovanoj i sterilnoj vodi ukupne zapremine 50 µl. Alternativni postupak za stvaranje ciljanih biblioteka je da se izvrši mutageneza usmerena na mesto (komplet Multisite, Agilent, SAD) ciljnog domena IgV sa oligonukleotidima koji sadrže degenerativne kodone. Ovaj pristup je korišćen za stvaranje podbiblioteka koje ciljaju samo nekoliko

1

specifičnih nizova DNK za mutagenezu. U ovim slučajevima, podbiblioteke su pomešane pre prelaska na korake odabira. Veličina biblioteke je obično bila u rasponu od 10E7 (10<7>) do 10E8 (10<8>) klonova, osim podbiblioteka koje su u rasponu od samo 10E4 (10<4>) do 10E5 (10<5>).

B. Nasumične biblioteke

[0422] Takođe su konstruisane nasumične biblioteke za identifikovanje varijanti domena IgV PD-L1 koje su date u SEQ ID NO:309 (sadrže domen IgV PD-L1 koji odgovara ostacima 19-132 kao što je dato u UniProt pristupnom br. Q9NZQ7 okružen susednim N- i C-terminalnim ostacima sekvence divljeg tipa). DNK koja kodira domen IgV divljeg tipa je klonirana između BamHI i KpnI mesta vektora displeja kvasca pBYDS03. DNK je zatim mutagenizovana pomoću kompleta Genemorph II (Agilent, SAD) za dobijanje u proseku tri do pet aminokiselinskih promena po varijanti biblioteke. Mutagenizovana DNK je zatim amplifikovana putem PCR u dva koraka i dalje obrađena kao što je opisano za ciljane biblioteke.

PRIMER 2

Uvođenje biblioteka DNK u kvasce

[0423] Primer 2 opisuje uvođenje biblioteka DNK PD-L1 u kvasce.

[0424] Za uvođenje degenerativne i nasumične biblioteke DNK u kvasac, ćelije sposobne za elektroporaciju soja kvasca BJ5464 (ATCC.org; ATCC broj 208288) pripremljene su i elektroporirane na Gene Pulser II (Biorad, SAD) sa DNK spremnom za elektroporaciju iz prethodnih koraka u suštini kao što je opisano (Colby, D.W. et al.2004 Methods Enzymology 388, 348-358). Jedina razlika je što su transformisane ćelije uzgajane u neindukujućem minimalno selektivnom SCD-Leu medijumu da bi se smestio LEU2 selektivni marker koji nosi modifikovani plazmid pBYDS03. Jedan litar SCD-Leu medijuma se sastoji od 14,7 grama natrijum citrata, 4,29 grama monohidrata limunske kiseline, 20 grama dekstroze, 6,7 grama azotne baze kvasca i 1,6 grama suplementa sintetičkog medijuma za gubitak kvasca bez leucina. Medijum je sterilisan filtracijom pre upotrebe koristeći uređaj za vakuum filtraciju od 0,22 µm.

1

[0425] Veličina biblioteke je određena zasejavanjem serijskih razblaženja sveže izolovanih ćelija na SCD-Leu agar ploče, a zatim ekstrapolacijom veličine biblioteke od broja pojedinačnih kolonija iz zasejavanja koja su dala najmanje 50 kolonija po ploči. Ostatak elektroporisane kulture je uzgajan do zasićenja, i ćelije iz ove kulture su još jednom poduzgajane 1/100 u isti medijum i uzgajane do zasićenja kako bi se minimizovala frakcija netransformisanih ćelija i omogućilo razdvajanje plazmida iz ćelija koje mogu da sadrže dve ili više varijanti biblioteke. Za održavanje raznovrsnosti biblioteke, ovaj korak poduzgajanja je izvršen koristeći inokulum koji je sadržao najmanje 10x više ćelija od izračunate veličine biblioteke. Ćelije iz druge zasićene kulture su ponovo suspendovane u svežem medijumu koji je sadržao 25% (masa/zapremina) glicerola do gustine od 10E10/ml i zamrznute su i skladištene na -80 °C (zamrznuti osnovni rastvor biblioteke).

PRIMER 3

Odabir kvasca

[0426] Primer 3 opisuje odabir ćelija kvasca koje eksprimiraju afinitetno modifikovane varijante PD-L1.

[0427] Broj ćelija koji je bio jednak najmanje 10-strukoj procenjenoj veličini biblioteke je odmrznut iz pojedinačnih osnovnih rastvora biblioteke, suspendovan do 0,1 × 10E6 ćelija/ml u neindukujućem SCD-Leu medijumu i uzgajan preko noći. Sledećeg dana, broj ćelija koji je bio jednak 10-strukoj veličini biblioteke je centrifugiran na 2000 o/min tokom dva minuta i ponovo suspendovan do 0,5 × 10E6 ćelija/ml u indukujućem SCDG-Leu medijumu. Jedan litar SCDG-Leu indukcionog medijuma sastoji se od 5,4 grama Na2HPO4, 8,56 grama NaH2PO4•H20, 20 grama galaktoze, 2,0 grama dekstroze, 6,7 grama azotne baze kvasca i 1,6 grama suplementa sintetičkog medijuma za gubitak kvasca bez leucina rastvorenih u vodi i sterilisanih propuštanjem kroz uređaj sa membranskim filterom od 0,22 µm. Kultura je uzgajana u indukcionom medijumu tokom 1 dana na sobnoj temperaturi da bi se indukovala ekspresija proteina biblioteke na površini ćelija kvasca.

[0428] Ćelije su razvrstane dva do tri puta koristeći magnetne perlice proteina A (New England Biolabs, SAD) na koje je nanet srodni ligand da se smanje one koje se ne vezuju i

2

obogate sve varijante PD-L1 koje imaju sposobnost da vezuju egzogene rekombinantne proteine kontrastrukture. Nakon toga je usledila jedna do dve runde fluorescentno aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS) koristeći bojenje egzogenog proteina kontrastrukture radi obogaćivanja frakcije ćelija kvasca koje pokazuju poboljšano vezivanje. Obogaćivanje magnetnim perlicama i odabir putem protočne citometrije obavljeni su u suštini kao što je opisano u Miller K.D. et al., Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008.

[0429] Kod biblioteka PD-L1, ciljni proteini liganda su humani rPD-1.Fc (tj. rekombinantni PD-1-Fc fuzioni protein kompanije R&D Systems, SAD). Magnetne perlice proteina A su nabavljene od kompanije New England Biolabs, SAD. Za dvobojno sortiranje protočnom citometrijom korišćen je sorter Bio-Rad S3e. Nivoi prikaza PD-L1 su praćeni pomoću antihemaglutininskog antitela označenog sa Alexafluor 488 (Life Technologies, SAD). Vezivanje liganda Fc fuzionog proteina za rPD-1.Fc detektovano je sa PE konjugovanim kozjim Fab specifičnim za humani Ig (Jackson ImmunoResearch, SAD). Dubletni kvasci su izdvojeni koristeći parametre prednjeg rasipanja (FSC) / bočnog rasipanja (SSC) i gejtovi za sortiranje su zasnovani na većem vezivanju liganda koje je detektovano kod FL2 koje je imalo ograničenije vezivanje sa ekspresijom oznake kod FL1. Odabir je alternativno obavljen sa humanim rCD80.Fc (tj. humanim rekombinantnim fuzionim proteinom CD80 Fc kompanije R&D Systems, SAD). Odabir je obavljen u velikoj meri kao što je prethodno opisano za PD-1.

[0430] Dobijeni kvasci iz sortiranja protočnom citometrijom su testirani na specifičniji afinitet vezivanja. Sortirani dobijeni kvasci su ekspandirani i ponovo indukovani da eksprimiraju konkretne varijante afinitetno modifikovanog domena IgSF koje kodiraju. Ova populacija zatim može da se poredi sa matičnim sojem kvasaca divljeg tipa ili bilo kojim drugim odabranim izlazima, kao što je izlaz populacije kvasaca sa perlica, putem protočne citometrije.

[0431] Za PD-L1, drugi krug izlaza FACS (F2) poređen je sa matičnim na vezivanje rPD-1.Fc ili rCD80.Fc dvostrukim bojenjem svake populacije sa ekspresijom anti-HA (hemaglutinin) oznake i drugim anti-humanim Fc da bi se detektovalo vezivanje liganda.

[0432] Izabrane varijante domena IgV PD-L1 su dalje formatirane kao fuzioni proteini i testirane na vezivanje i funkcionalnu aktivnost kao što je opisano ispod.

2 1

PRIMER 4

Ponovno formatiranje izlaza selekcije kao Fc-fuzija i različitih vrsta imunomodulatornih proteina

[0433] Primer 4 opisuje ponovno formatiranje izlaza selekcije koji su u primeru 3 identifikovani kao imunomodulatorni proteini koji sadrže afinitetno modifikovani domen (varijantu) nalik imunoglobulinu tipa V (IgV) PD-L1 fuzionisan sa molekulom Fc ( varijanta domena IgV-Fc fuzioni molekuli).

[0434] Objedinjene ćelije iz finalnih sortiranja PD-L1 protočnom citometrijom uzgajane su do terminalne gustine u SCD-Leu medijumu. Plazmidna DNK iz svakog izlaza izolovana je koristeći komplet za izolovanje plazmidne DNK kvasca (Zymoresearch, SAD). Za Fc fuzije su korišćeni PCR prajmeri sa dodatnim mestima restrikcije pogodni za kloniranje u Fc fuzioni vektor po izboru, za amplifikaciju šarže iz pripremljene plazmidne DNK kodirajuće DNK za mutantne ciljne domene IgV. Nakon restrikcione digestije, proizvodi PCR su ligirani u Fc fuzioni vektor, nakon čega je usledila transformacija toplotnim šokom u soj E. coli XL1 Blue (Agilent, SAD) ili NEB5alpha (New England Biolabs, SAD) prema uputstvu proizvođača. Alternativno, izlazi su PCR amplifikovani sa prajmerima koji na bilo kom kraju sadrže regione preklapanja od 40 bp sa Fc fuzionim vektorom da bi se izvršila in vitro rekombinacija koristeći Gibson Assembly Mastermix (New England Biolabs), što je zatim korišćeno u transformaciji toplotnim šokom u NEB5alpha soj E. Coli. Primer Fc fuzionog vektora je pFUSE-hIgG1-Fc2 (Invivogen, SAD).

[0435] Razblaženja reakcija transformacije su zasejana na LB-agar koji sadrži 100 µg/ml karbenicilina (Teknova, SAD) kako bi se izolovale pojedinačne kolonije za odabir. Do 96 kolonija iz svake transformacije zatim je uzgajano do zasićenja na pločama sa 96 bunarčića preko noći na 37 °C u LB-rastvoru koji sadrži 100 µg/ml karbenicilina (Teknova kat. br. L8112), i mali alikvot iz svakog bunarčića je priložen za sekvenciranje DNK inserta domena IgV kako bi se identifikovale mutacije u svim klonovima. Priprema uzorka za DNK sekvenciranje obavljena je koristeći protokole koje obezbeđuje pružalac usluge (Genewiz; South Plainfield, NJ). Nakon uklanjanja uzorka za sekvenciranje DNK, u preostale kulture je zatim dodat glicerol do finalnog sadržaja glicerola od 25%, i ploče su skladištene na -20 °C

2 2

da se kasnije koriste kao glavne ploče (vidite ispod). Uzorci za DNK sekvenciranje su alternativno dobijeni replikativnim zasejavanjem iz uzgajanih tečnih kultura na čvrste agar ploče koristeći jednokratni replikator sa 96 bunarčića (VWR, SAD). Te ploče su inkubirane preko noći za dobijanje mestimičnog rasta, i ploče su poslate kompaniji Genewiz u skladu sa njenim uputstvom.

[0436] Nakon identifikovanja klonova od interesa na osnovu analize podataka o sekvenciranju DNK koje je kreirala kompanija Genewiz, klonovi od interesa su izolovani sa glavnih ploča i pojedinačno uzgajani do gustine u tečnom LB-rastvoru koji sadrži 100 µg/ml karbenicilina (Teknova, SAD) i kulture su zatim korišćene za pripremu plazmidne DNK za svaki klon koristeći standardni komplet kao što je komplet PureYield Plasmid Miniprep System (Promega, SAD) ili MidiPlus (Qiagen). Identifikovanje klonova od interesa iz podataka o sekvenciranju kompanije Genewiz generalno je obuhvatalo sledeće korake. Prvo, datoteke podataka o sekvencama DNK su preuzete sa veb stranice kompanije Genewiz. Sve sekvence su zatim ručno uređene tako da počinju na početku regiona koji kodira domen IgV. Uređene sekvence su zatim zajedno prevedene koristeći odgovarajući program koji je dostupan na URL: www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/. Prevedene sekvence su zatim poravnate koristeći odgovarajući program koji je dostupan na URL:

multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. Genewiz sekvence su alternativno obrađene da se dobije poravnanje koristeći softver Ugene (http://ugene.net).

[0437] Klonovi od interesa su zatim identifikovani iz poravnanja koristeći sledeće kriterijume: 1.) identični klon se javlja najmanje dva puta u poravnanju i 2.) mutacija se javlja najmanje dva puta u poravnanju i poželjno u zasebnim klonovima. Pretpostavljeno je da su klonovi koji ispunjavaju najmanje jedan od ovih kriterijuma klonovi koji su obogaćeni u procesu sortiranja usled poboljšanog vezivanja.

[0438] Za dobijanje rekombinantnih imunomodulatornih proteina koji su Fc fuzioni proteini koji sadrže afinitetno modifikovanu varijantu domena IgV PD-L1 (npr. varijanta IgV-Fc PD-L1), generisana je kodirajuća DNK da kodira protein na sledeći način: varijanta (mutant) domena IgV nakon koga sledi linker od tri alanina (AAA) nakon koga sledi humani IgG1 Fc dat u SEQ ID NO: 1157 koji sadrži mutacije R292C, N297G i V302C na osnovu EU numeracije (odgovara R77C, N82G i V87C kada se posmatra divlji tip humanog IgG1 Fc dat

2

u SEQ ID NO: 187). Pošto konstrukt ne uključuje nijedan laki lanac antitela koji može da gradi kovalentnu vezu sa cisteinom, humani Fc IgG1 takođe sadrži zamenu cisteinskih ostataka ostatkom serina na poziciji 220 (C220S) na osnovu EU numeracije (odgovara poziciji 5 (C5S) kada se gleda divlji tip ili nemodifikovani Fc dat u SEQ ID NO: 187.

PRIMER 5

Ekspresija i prečišćavanje Fc-fuzija

[0439] Primer 5 opisuje visokopropusnu ekspresiju i prečišćavanje Fc-fuzionih proteina koji sadrže varijantu IgV PD-L1 kao što je opisano u prethodnim primerima.

[0440] Rekombinantne varijante Fc fuzionih proteina proizvedene su iz ćelija ljudskih bubrega (HEK) 293 adaptiranih u suspenziji koristeći ekspresioni sistem Expi293 (Invitrogen, SAD).4 µg svake plazmidne DNK iz prethodnog koraka dodato je u 200 µl Opti-MEM (Invitrogen, SAD) u isto vreme kada je 10,8 µl ExpiFektamina zasebno dodato u još 200 µl Opti-MEM. Nakon 5 minuta, 200 µl plazmidne DNK je pomešano sa 200 µl ExpiFektamina i dalje inkubirano još 20 minuta pre dodavanje ove smeše u ćelije. Deset miliona Expi293 ćelija je raspoređeno u zasebne bunarčiće sterilne ploče za uzgajanje sa 24 duboka bunarčića od 10 ml sa konusnim dnom (Thomson Instrument Company, SAD) u 4 ml zapremine medijuma Expi293 (Invitrogen, SAD). Ploče su tresene tokom 5 dana na 120 o/min u inkubatoru za ćelijsku kulturu sisara koji je podešen na 95% vlažnosti i 8% CO2. Nakon 5-dnevne inkubacije, ćelije su peletirane i supernatanti kulture su zadržani.

[0441] Proteini su prečišćeni iz supernatanta koristeći visokopropusnu filter ploču sa 96 bunarčića (Thomson kataloški broj 931919), pri čemu je svaki bunarčić napunjen sa 60 µl slegnutih perlica Mab SelectSure (GE Healthcare kat. br.17543801). Protein je eluiran sa četiri uzastopne frakcije od 200 µl 50 mM acetata pH 3,3. pH vrednost svake frakcije je podešena da bude veća od pH 5,0 dodatkom 4 µl 2M Tris pH 8,0. Frakcije su objedinjene i kvantifikovane koristeći apsorbancu na 280 nm izmerenu pomoću instrumenta Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, SAD), i čistoća proteina je procenjena nanošenjem 5 µg proteina na prethodno izlivene poliakrilamidne gelove NUPAGE (Life Technologies, SAD) u denaturišućim i neredukujućim uslovima a zatim gel elektroforezom. Proteini su vizuelizovani u gelu koristeći standardno kumasi bojenje.

2 4

PRIMER 6

Procena vezivanja molekula koji sadrže afinitetno sazreli domen IgSF

A. Vezivanje za kontrastrukturu koju eksprimira ćelija

[0442] Ovaj primer opisuje studije vezivanja Fc-fuzije prečišćenih proteina iz prethodnih primera da bi se procenili specifičnost i afinitet imunomodulatornih proteina varijante domena PD-L1 prema srodnom vezujućem partneru.

[0443] Studije vezivanja su obavljene koristeći reporterske ćelije JurkabII,-2 (kupljene od kompanije Promega Corp. SAD) koje su zatim transdukovane da stabilno eksprimiraju humani PD-1 (Jurkatove/PD-1 ćelije). Za bojenje protočnom citometrijom, 100.000 Jurkatovih/PD-1 ćelija ili negativne kontrole (samo Jurkat) zasejano je na ploče sa okruglim dnom sa 96 bunarčića. Ćelije su centrifugirane i ponovo suspendovane u puferu za bojenje (PBS (fiziološki rastvor puferovan fosfatom), 1% BSA (albumin goveđeg seruma) i 0,1% natrijum azid) tokom 20 minuta da se blokira nespecifično vezivanje. Nakon toga, ćelije su centrifugirane i suspendovane u 50 µl pufera za bojenje koji sadrži 100 nM do 46 pM svake potencijalne varijante fuzionog proteina PD-L1 Fc. Kao kontrole su testirani kompletni ekstracelularni domen PD-L1 divljeg tipa (sačinjen od jednog domena IgV i jednog IgC) fuzionisan sa Fc („ECD PD-L1 kompletne dužine“) i domen IgV PD-L1 divljeg tipa („IgV PD-L1 divljeg tipa“). Primarno bojenje je obavljeno na ledu tokom 45 minuta, pa su ćelije dva puta isprane u 150 µl pufera za bojenje. PE-konjugovani anti-humani Fc (Jackson ImmunoResearch, SAD) razblažen je 1: 150 u 50 µl pufera za bojenje i dodat u ćelije i inkubiran još 30 minuta na ledu. Sekundarno antitelo je dva puta isprano, ćelije su fiksirane u 4% formaldehidu/PBS, i uzorci su analizirani na protočnom citometru Intellicyt (Intellicyt Corp, SAD).

[0444] Izračunat je prosečni intenzitet fluorescencije (MFI) i upoređen sa IgV PD-L1 divljeg tipa kao kontrolom pomoću aparata FlowJo verzija 10 (FlowJo verzija 10, SAD). Rezultati studija vezivanja za reprezentativne testirane varijante PD-L1 IgV-Fc fuzionih molekula prikazani su u tabeli 10. Tabela 10 takođe pokazuje aminokiselinske supstitucije (zamene ili insercije označene sa „ins“) u IgV varijante PD-L1 izabrane u prethodno opisanom

2

ispitivanju. Reprezentativne aminokiselinske supstitucije i insercije u domenu IgV u tabeli su naznačene putem broja aminokiselinske pozicije koji odgovara aminokiselinskim pozicijama u odgovarajućoj referentnoj sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) nemodifikovanog zrelog PD-L1 koja je data u SEQ ID NO:30 ili 1728. Aminokiselinska pozicija se navodi u sredini, pri čemu je odgovarajuća nemodifikovana aminokiselina (npr. divljeg tipa) navedena pre broja, a identifikovana varijanta aminokiselinske supstitucije (ili insercija označena sa „ins“) navedena je nakon broja. Kolona 2 daje oznaku SEQ ID NO za svaku varijantu domena IgV koja je sadržana u varijanti fuzionog molekula IgV-Fc.

[0445] Takođe je prikazana vezujuća aktivnost izmerena putem vrednosti prosečnog intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje 50 nM svake varijante Fc-fuzionog molekula za Jurkatove/PD-1 ćelije i odnosa MFI u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg nemodifikovanog (divlji tip) fuzionog molekula IgV-Fc koji ne sadrži aminokiselinske supstitucije za PD-1. Kao što je prikazano u tabeli 10, selekcija je dovela do identifikacije više varijanti domena IgSF (npr. IgV) PD-L1 koje su afinitetno modifikovane da pokazuju povećano vezivanje za PD-1.

2

TABELA 10: Odabrane varijante PD-L1 i podaci o vezivanju.

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID NO Vezivanje za Jurkatove/PD-1 ćelije

(IgV) MFI pri 50 Umnožak povećanja u

2

B. ForteBio Octet test vezivanja

[0446] Proteinske interakcije između imunomodulatornih proteina varijante domena PD-L1 i vezujućih partnera PD-1 i CD80 su procenjene koristeći testove vezivanja Fortebio. PD-1 ili CD80 su pojedinačno naneti na antihumane senzore za hvatanje (ForteBio Octet AHC) i Fc fuzije divljeg tipa kompletne dužine (nemodifikovanog) ECD PD-L1, divljeg tipa (nemodifikovanog) fuzionog molekula IgV-Fc PD-L1 ili fuzionih molekula varijante IgV-Fc PD-L1 vezane su za receptore sa jednom koncentracijom od 100 nM.

[0447] Odgovor antihumanih senzora za hvatanje na nanošenje svakog vezujućeg proteina koji se testira sa varijantom fuzionog molekula IgV-Fc je utvrđen i upoređen sa odgovorom divljeg tipa IgV-Fc PD-L1. Takođe je utvrđen odnos između odgovora svake varijante fuzionog molekula IgV-Fc PD-L1 na PD-1 i CD80, kao što je prikazano u tabeli 11A-B. U svakoj od tabela u nastavku, kolona 2 prikazuje SEQ ID NO oznaku za svaku varijantu domena IgV koja je sadržana u testiranim varijantama fuzionog molekula IgV-Fc.

[0448] Kao što je prikazano u tabeli 11A-B, selekcija je dovela do identifikacije više varijanti domena IgSF (npr. IgV) PD-L1 koje su afinitetno modifikovane da pokazuju povećano vezivanje za PD-1 i/ili CD80.

21

TABELA 11A: ForteBio podaci o vezivanju.

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID PD-1: Fc Umnožak Odgovor Umnožak PD-1:

NO odgovor u odnosu CD80:Fc u odnosu CD80

TABELA 11A: ForteBio podaci o vezivanju.

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID PD-1: Fc Umnožak Odgovor Umnožak PD-1:

NO od ovor u odnosu CD80:Fc u odnosu CD80

os TABELA 11A: ForteBio podaci o vezivanju.

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID PD-1: Fc Umnožak Odgovor Umnožak PD-1:

NO odgovor u odnosu CD80:Fc u odnosu CD80

TABELA 11B. ForteBio podaci o vezivanju.

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID PD-1: Fc Umnožak Odgovor Umnožak PD-1:

NO odgovor u odnosu CD80:Fc u odnosu CD80

21

TABELA 11A: ForteBio podaci o vezivanju.

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID PD-1: Fc Umnožak Odgovor Umnožak PD-1:

NO odgovor u odnosu CD80:Fc u odnosu CD80

TABELA 11A: ForteBio podaci o vezivanju.

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID PD-1: Fc Umnožak Odgovor Umnožak PD-1:

NO odgovor u odnosu CD80:Fc u odnosu CD80

PRIMER 7

Procena biološke aktivnosti molekula koji sadrže afinitetno sazreli domen IgSF koristeći reporterski test Jurkat/IL2/PD-1

[0449] Ovaj primer opisuje reporterski test Jurkat/IL2/PD-1 za procenu biološke aktivnosti imunomodulatornih proteina varijante domena PD-L1 za blokiranje PD-1.

[0450] Jurkatove efektorske ćelije koje eksprimiraju reporter IL-2-luciferaze i PD-1 na svojoj površini supendovane su u Jurkatovom test puferu (RPMI1640 5%FBS) sa 2×10<6>ćelija/ml i dodato je 2 µg/ml anti-CD28. Jurkatove ćelije su zatim zasejane sa 50 µl/bunarčiću, ukupno 100.000 ćelija po bunarčiću.

[0451] Varijante fuzionih molekula PD-L1 IgV-Fc i kontrolni proteini (PD-L1-Fc kompletne dužine, IgV-Fc PD-L1 divljeg tipa) ili anti-PD-1 monoklonsko antitelo (nivolumab) razblaženi su do 200 nM i 25 µl svakog proteina je dodato u zasejane Jurkatove ćelije.

Jurkatove ćelije sa fuzionim molekulima IgV-Fc varijante PD-L1 ili kontrolnim proteinima

21

inkubirane su tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Veštačke antigen prezentujuće ćelije (aAPC) dobijene od ćelija K562 koje prikazuju anti-CD3 jednolančani Fv (OKT3) i PD-L1 na ćelijskoj površini dovedene su do 0,67×10<6>ćelija/ml i 25 µl je dodato u svaki bunarčić, pa je finalna zapremina svakog bunarčića iznosila 100 µl. Svaki bunarčić je imao finalni odnos Jurkatovih ćelija:ćelijama K562 jednak 6:1, 1 ug/ml anti-CD28 i koncentraciju testiranog proteina od 50 nM. Jurkatove ćelije i ćelije K562 inkubirane su tokom 5-6 sati na 37 stepeni Celzijusa u humidifikovanoj komori za inkubaciju sa 5% CO2. Ploče su zatim uklonjene iz inkubatora i aklimatizovane na sobnu temperaturu tokom 15 minuta. 100 µl rastvora za ćelijsku lizu i supstrata luciferaze (BioGlo<®>, Promega Corp, SAD) dodato je u svaki bunarčić i ploče su stavljene na orbitalnu tresilicu tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi.

Luminescencija je izmerena sa vremenom integracije od 1 sekunde po bunarčiću koristeći luminometar BioTek Cytation (BioTek Corp., SAD).

[0452] Vrednost prosečne relativne luminescencije je utvrđena za svaku varijantu IgV Fc PD-L1 i umnožak povećanja signalizacije reportera IL-2 je izračunat za svaku varijantu u poređenju sa varijantom proteina PD-L1 IgV-Fc divljeg tipa.

[0453] Kao što je prikazano u tabeli 12, aktivnost luciferaze Jurkatovih efektorskih ćelija koje eksprimiraju reporter PD-1 i IL-2-luciferaze uzgajanih zajedno sa anti-CD3/PD-L1 aAPC i varijantom molekula PD-L1 IgV-Fc je izmenjena (povećana i smanjena). Razlike u vrednosti luminescencije pokazuju vezivanje varijante molekula IgV-Fc PD-L1 za PD-1 i sposobnost da blokira interakcije PD-1 i PD-L1. Veće vrednosti ukazuju na povećano blokiranje inhibicije posredovane sa PD-1. U ovoj tabeli, kolona 2 daje oznaku SEQ ID NO za svaku varijantu domena IgV koja je sadržana u testiranoj varijanti fuzionog molekula IgV-Fc.

TABELA 12. Reporterski test

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID Jedinice prosečne Umnožak povećanja NO (IgV) relativne luminescencije signala reportera

21

TABELA 12. Reporterski test Jurkat/IL2/PD-1

PRIMER 8

Dodatni afinitetno modifikovani domeni IgSF

[0454] Ovaj primer opisuje dizajn, stvaranje i skrining dodatnih afinitetno modifikovanih CD80 (B7-1), PD-L2, CD155 i CD112, i CD86 (B7-2) imunomodulatornih proteina, koji su druge komponente imunske sinapse (IS) koje su pokazale dvojnu ulogu u imunskoj aktivaciji, kao i inhibiciji. Takođe su stvorene i ispitane afinitetno modifikovane varijante NKp30. Ovi primeri pokazuju da afinitetna modifikacija domena IgSF daje protein koje može da deluje u smeru povećanja, kao i smanjenja imunološke aktivnosti. Različite kombinacije ovih domena mogu da se fuzionišu u parove (tj. naslažu) sa varijantom afinitetno modifikovanog PD-L1 dajući imunomodulatorni protein tipa II za postizanje imunomodulatorne aktivnosti.

[0455] Konstrukti mutantne DNK koja kodira varijantu domena IgV humanog CD80, ili domena IgV PD-L2, CD155 i CD112 za translaciju i ekspresiju biblioteka displeja kvasaca kreirani su u suštini kao što je opisano u primeru 1. Konstruisane su ciljne biblioteke koje ciljaju specifične ostatke za potpunu ili delimičnu randomizaciju sa degenerativnim kodonima i/ili nasumične biblioteke za identifikovanje varijanti IgV CD80 (SEQ ID NO:2030), varijanti IgV PD-L2 (SEQ ID NO: 1263), varijanti IgV CD155 (SEQ ID NO:353), i varijanti IgV CD112 (SEQ ID NO:761) suštinski kao što je opisano u primeru 1. Slični

22

postupci su takođe korišćeni za dobijanje biblioteka domena nalik IgC NKp30 (SEQ ID NO:1190).

[0456] DNK iz degenerativne ili nasumične biblioteke je uvedena u kvasac suštinski kao što je opisano u primeru 2 da bi se dobile biblioteke kvasaca. Ove biblioteke su zatim korišćene za odabir kvasca koji eksprimira afinitetno modifikovane varijante CD80, PD-L2, CD155, CD112, CD86 (B7-2) i NKp30, suštinski kao što je opisano u primeru 3. Ćelije su obrađene da bi se smanjio broj onih koje se ne vezuju i da bi se obogatile za varijante CD80, PD-L2, CD155 ili CD112, CD86 (B7-2) i NKp30 sposobne da vezuju egzogene rekombinantne proteine kontrastrukture, suštinski kao što je opisano u primeru 3.

[0457] Za biblioteke CD80, CD86 i NKp30, proteini ciljnih liganda su nabavljeni od kompanije R&D Systems (SAD) na sledeći način: humani rCD28.Fc (tj. rekombinantni fuzioni protein CD28-Fc), rPDL1.Fc, rCTLA4.Fc i rB7H6.Fc. Dvobojna protočna citometrija je obavljena suštinski kao što je opisano u primeru 3. Dobijeni kvasci iz sortiranja protočnom citometrijom testirani su na specifičniji afinitet vezivanja. Sortirani dobijeni kvasci su ekspandirani i ponovo indukovani da eksprimiraju konkretne varijante afinitetno modifikovanog domena IgSF koje kodiraju. Ova populacija zatim može da se poredi sa matičnim sojem kvasaca divljeg tipa ili bilo kojim drugim odabranim izlazima, kao što je izlaz populacije kvasaca sa perlica, putem protočne citometrije.

[0458] U slučaju varijanti kvasca NKp30 koje su izabrane za vezivanje za B7-H6, izlazi F2 sortiranja su dali vrednost MFI od 533 kada su obojeni sa 16,6 nM rB7H6.Fc, dok je izmereni MFI matičnog soja NKp30 bio 90 kada je obojen istom koncentracijom rB7H6.Fc (6-struko poboljšanje).

[0459] Među varijantama NKp30 koje su identifikovane nalazila se varijanta koja je sadržala mutacije L30V/A60V/S64P/S86G kada se gledaju pozicije u ekstracelularnom domenu NKp30 koje odgovaraju pozicijama koje su date u SEQ ID NO: 54.

[0460] Za varijante CD80 koje su date u tabeli 13A-B, biblioteke CD80 su se sastojale od pozitivnih odabira sa željenom kontrastrukturom CTLA4 i negativnog odabira sa kontrastrukturom CD28.

[0461] Za varijante CD155 koje su date u tabeli 14A, biblioteke CD155 su zasebno izabrane za svaki od TIGIT, CD96 i CD226. Za varijante CD155 koje su date u tabeli 14B-F, selekcija je uključivala dva pozitivna odabira sa željenim kontrastrukturama TIGIT i CD96, nakon čega je sledio jedan negativni odabir sa kontrastrukturom CD226 za odabir pored CD226 i poboljšanje specifičnosti vezivanja varijante CD155. Selekcija je obavljena suštinski kao što je opisano iznad u primeru 3, osim što su koncentracije kontrastruktura (TIGIT/CD96) i striktnost pozitivnih sortiranja varirani za optimizaciju identifikacije favorita. Koncentracija CD226 za negativnu selekciju zadržana je na 100 nM.

[0462] Za varijante CD112 koje su date u tabeli 15A, biblioteke CD112 su zasebno izabrane za svaki od TIGIT, CD112R i CD226. Za dodatne varijante CD112 koje su date u tabeli 15B-15C, selekcija je uključivala dva pozitivna odabira sa željenim kontrastrukturama TIGIT i CD112R, nakon čega je sledio jedan negativni odabir sa kontrastrukturom CD226 za odabir pored CD226 i poboljšanje specifičnosti vezivanja varijante CD112. Selekcija je obavljena suštinski kao što je opisano iznad u primeru 3, osim što su koncentracije kontrastruktura (TIGIT/CD112R) i striktnost pozitivnih sortiranja varirani za optimizaciju identifikacije favorita. Koncentracija CD226 za negativnu selekciju zadržana je na 100 nM.

[0463] Za varijante PD-L2 koje su date u tabeli 16A-B, ciljane ili nasumične biblioteke PD-L2 displeja kvasaca su izabrane u odnosu na PD-1. Nakon toga su usledile dve do tri runde sortiranja protočnom citometrijom koristeći bojenje egzogenog proteina kontrastrukture radi obogaćivanja frakcije ćelija kvasca koje pokazuju poboljšano vezivanje. Obogaćivanje magnetnim perlicama i odabir putem protočne citometrije su u suštini kao što je opisano u Miller K.D. et al., Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008.

[0464] Reprezentativni dobijeni odabiri su ponovo formatirani kao imunomodulatorni proteini koji sadrže afinitetno modifikovani IgV CD80 (varijantu), varijantu IgV PD-L2, varijantu IgV CD155, varijantu IgV CD112, pri čemu je svaka fuzionisana sa molekulom Fc (varijanta fuzionih molekula ECD-Fc ili varijanta fuzionih molekula IgV-Fc), suštinski kao što je opisano u primeru 4, i Fc-fuzioni protein je eksprimiran i prečišćen suštinski kao što je opisano u primeru 5.

[0465] Vezivanje reprezentativnih varijanti domena IgSF za kontrastrukturu koju eksprimiraju ćelije zatim je procenjeno suštinski kao što je opisano u primeru 6. Proizvedene su ćelije koje eksprimiraju srodne vezujuće partnere, i studije vezivanja i protočna citometrija su obavljeni suštinski kao što je opisano u primeru 6. Pored toga, biološka aktivnost varijante Fc-fuzionog proteina je okarakterisana testom reakcije pomešanih limfocita (MLR) ili anti-CD3 koimobilizacije, suštinski kao što je opisano u primeru 6.

[0466] Kao i iznad, za svaku tabelu, reprezentativne aminokiselinske supstitucije su označene brojem aminokiselinske pozicije koji odgovara odgovarajućoj referentnoj sekvenci nemodifikovanog ECD (tabela 2). Aminokiselinska pozicija se navodi u sredini, pri čemu je odgovarajuća nemodifikovana aminokiselina (npr. divljeg tipa) navedena pre broja, a identifikovana varijanta aminokiselinske supstitucije (ili insercija označena sa a) navedena je nakon broja.

[0467] Takođe je prikazana vezujuća aktivnost izmerena putem vrednosti prosečnog intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje svake varijante Fc-fuzionog molekula za ćelije koje su konstruisane da eksprimiraju ligand srodne kontrastrukture, i odnos MFI je upoređen sa vezivanjem odgovarajućeg nemodifikovanog Fc fuzionog molekula koji ne sadrži aminokiselinske supstitucije za isti ligand kontrastrukture koji eksprimiraju ćelije.

Funkcionalna aktivnost varijanti Fc-fuzionih molekula za modulaciju aktivnosti T-ćelija je takođe pokazana na osnovu izračunatog nivoa IFN-gama u supernatantima kulture (pg/ml) koji su dobijeni i) sa naznačenom varijantom Fc fuzionog molekula koji je koimobilisan sa anti-CD3 ili ii) sa naznačenom varijantom Fc fuzionog molekula u testu MLR. Tabele takođe prikazuju odnos IFN-gama koji proizvodi svaka varijanta ECD-Fc ili IgV-Fc u poređenju sa odgovarajućim ECD-Fc ili IgV-Fc u funkcionalnim testovima.

[0468] Kao što je prikazano u tabelama 13A-16F, odabiri su doveli do identifikacije više varijanti domena IgSF PD-L2, CD155, CD112 i CD80 koje su bile afinitetno modifikovane da pokazuju povećano vezivanje najmanje za jedan ligand srodne kontrastrukture, a u nekim slučajevima za više od jednog. Pored toga, rezultati pokazuju da afinitetna modifikacija varijanti molekula takođe pokazuje poboljšanu aktivnost povećavanja i smanjivanja imunološke aktivnosti u zavisnosti od formata molekula.

22

TABELA 13A: Vezivanje varijante CD80 za HEK293 ćelije transficirane sa CTLA4,

22

TABELA 13A: Vezivanje varijante CD80 za HEK293 ćelije transficirane sa CTLA4,

22

TABELA 13A: Vezivanje varijante CD80 za HEK293 ćelije transficirane sa CTLA4,

<∗>Zaustavni kodon na naznačenoj poziciji

22

TABELA 13A: Vezivanje varijante CD80 za HEK293 ćelije transficirane sa CTLA4,

Q MFI Umnoža MFI Umnoža MFI Umnoža Odnos ID sa k sa k sa k CTLA4 NO 66,6 promen 66,6 promen 22,2 promen : CD28

22

2

21

22

2

24

2

24

ID NO MFI pri Umnožak MFI pri Umnožak MFI pri Umnožak Mutacije (IgV) 100 nM povećanja 100 nM povećanja 100 nM povećanja

Mutacije ID NO MFI pri Umnožak MFI pri Umnožak MFI pri Umnožak CD155 (IgV) 11,1 nM promene u 11,1 nM promene u 11,1 nM promene u

odnosu na

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

ID MFI pri Umnoža MFI Umnoža MFI Umnoža MFI Umnoža NO 25 nM k pri 25 k pri 25 k pri 25 k Mutacije (IgV) promene nM promene nM promene nM promene

2

SEQ TIGIT CD112R CD226 Lažni Anti-CD3 IFN-ID tfxn tfxn MFI MFI Expi29 gama (pg/m)

NO MFI (matični (matičn 3 MFI (matični odnos Mutacija(e

(IgV) (matičn odnos MFI i odnos (lažni anti-CD3 IFN-CD112

2 1

2 2

CD155 u odnosu u odnosu u odnosu u odnosu

2

2 4

2

CD155 u odnosu u odnosu u odnosu u odnosu

2

CD155 u odnosu u odnosu u odnosu u odnosu

2

ID MFI Umnožak MFI Umnožak MF Umnožak MFI Umnožak NO 100n povećanj pri povećanj I pri povećanj pri povećanj Mutacija(e

(IgV) M a u 100 a u 100 a u 100 a u ) CD112

2

21

22

2

24

2

(IgV) M a u 100 a u 100 a u 100 a u ) CD112

SEQ TIGIT CD226 CD112R CD96

ID MFI Umnožak MFI Umnožak MF Umnožak MFI Umnožak NO 20nM povećanj pri povećanj I pri povećanj pri povećanj Mutacija(e

(IgV) a u 20 a u 20 a u 20 a u CD112

2

21

22

(IgV) M a u 100 a u 100 a u 100 a u ) CD112

TABELA 16A: Varijanta PD-L2 izabrana u odnosu na PD-1. Sekvenca molekula i

podaci o vezivanju.

2

TABELA 16A: Varijanta PD-L2 izabrana u odnosu na PD-1. Sekvenca molekula i podaci o vezivanju.

2 4

2

1

TABELA 16A: Varijanta PD-L2 izabrana u odnosu na PD-1. Sekvenca molekula i

PRIMER 9

2

Procena biološke aktivnosti molekula koji sadrže afinitetno sazreli domen IgSF koristeći reakciju pomešanih limfocita (MLR)

[0469] Ovaj primer opisuje karakterizaciju biološke aktivnosti varijante Fc-fuzionog proteina u in vitro testovima humanih primarnih T-ćelija.

[0470] Biološka aktivnost rastvorljive varijante PD-L1 IgV-Fc je testirana u reakciji pomešanih humanih limfocita (MLR). Humane primarne dendritske ćelije (DC) stvorene su in vitro uzgajanjem monocita izolovanih iz PBMC (BenTech Bio, SAD) tokom 7 dana sa 50 ng/ml rIL-4 (R&D Systems, SAD) i 80 ng/ml rGM-CSF (R&D Systems, SAD) u medijumu Ex-Vivo 15 (Lonza, Švajcarska). Za potpunu indukciju sazrevanja DC, lipopolisaharid (LPS) (InvivoGen Corp., SAD) dodat je u kulture DC 6. dana i ćelije su inkubirane još 24 sata. Približno 10.000 sazrelih DC i 100.000 prečišćenih alogenih CD3+ T-ćelija (BenTech Bio, SAD) uzgajano je zajedno sa nekoliko koncentracija varijanti fuzionih proteina PD-L1 IgV-Fc na pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom u 200 µl finalne zapremine medijuma Ex-Vivo 15. Nebitni humani IgG ili samo medijum (označeni sa „bez dodatka“) korišćeni su kao negativna kontrola. Kao pozitivna kontrola, ispitani su PDL1-Fc (kompletan ekstracelularni domen PD-L1), PD-L1 IgV-Fc divljeg tipa i ili anti-PD-1 monoklonsko antitelo (nivolumab) kao pozitivna kontrola. Varijante fuzionih proteina PD-L1 IgV-Fc su testirane pri različitim koncentracijama kao što je naznačeno na SL.8 i 9. Izlučivanje IFN-gama u supernatantima kulture analizirano je 5. dana koristeći komplet Human IFN-gamma Duoset ELISA (R&D Systems, SAD). Optička gustina je izmerena na multimodalnom čitaču mikroploča BioTek Cytation (BioTek Corp., SAD) i kvantifikovana u odnosu na titrisani standard rIFN-gama koji je priložen u kompletu IFN-gamma Duo-set (R&D Systems, SAD).

[0471] Rezultati studija biološke aktivnosti reprezentativnih testiranih varijanti PD-L1 IgV-Fc prikazani su na SL.8 i SL.9, koje prikazuju izračunate nivoe IFN-gama u supernatantima kulture (pg/ml) pri naznačenim koncentracijama varijante IgV-Fc fuzionog molekula.

Varijante su identifikovane pomoću aminokiselinskih supstitucija u IgV PD-L1 kada se gledaju pozicije koje odgovaraju pozicijama nemodifikovane sekvence (divlji tip) ECD PD-L1 koja je data u SEQ ID NO:30 ili 1728. Kao što je prikazano na SL.8, reprezentativne varijante molekula PD-L1 IgV-Fc pokazuju poboljšanu aktivnost povećanja proizvodnje IFNg na testu MLR. Kao što je prikazano na SL.9, reprezentativne varijante fuzionih molekula PD-L1 IgV-Fc pokazuju aktivnost uporedivu sa nivolumabom na testu MLR.

PRIMER 10

Stvaranje naslaganih molekula koji sadrže različite afinitetno modifikovane domene

[0472] Ovaj primer opisuje imunomodulatorne proteine koji su generisani kao multidomenski naslagani konstrukti koji sadrže najmanje dva različita afinitetno modifikovana domena IgV iz identifikovanih polipeptida varijante PD-L1, identifikovanih polipeptida varijante CD112 i identifikovanih polipeptida varijante CD155 koji su prethodno opisani. Konkretno, reprezentativna varijanta PD-L1 IgV D43G/N45D/L56Q/V58A/ G101G-ins (G101GG) (SEQ ID NO: 303), CD112 IgV molekula S118F (SEQ ID NO: 768) i/ili reprezentativna varijanta CD155 IgV molekula P18S/S65W/S67A/L104Q/G111R (SEQ ID NO: 1576) vezane su međusobno i fuzionisane sa Fc u različitim konfiguracijama.

[0473] Naslagani homodimeri su dobijeni u različitim konfiguracijama kao što je dato na SL.

5A i 5B i na sledeći način. U stvorenim konstruktima naslaganih homodimera, varijanta IgV CD155, varijanta IgV CD112 i/ili varijanta IgV PD-L1 na različite načine su vezane sa N- ili C-terminusom Fc regiona humanog IgG1 preko peptidnog linkera 2xGGGS (SEQ ID NO: 240) ili 3x GGGGS (SEQ ID NO: 239). U ovoj studiji, reprezentativni Fc region IgG1 dat je u SEQ ID NO:1155 i sadržao je mutacije L234A, L235E, G237A, E356D i M358L prema EU numeraciji (odgovara L19A, L20E, G22A, E141D i M143L kada se gleda Fc humanog IgG1 divljeg tipa dat u SEQ ID NO:187). Nadalje, Fc region je sadržao zamenu cisteinskih ostataka ostacima serina na poziciji 5 (C5S) u poređenju sa divljim tipom ili nemodifikovanim Fc koji je dat u SEQ ID NO: 187 (odgovara C220S prema EU numeraciji). U nekim primerima, Fc je dalje modifikovan da se ukloni C-terminalni lizin na poziciji 232 divljeg tipa ili nemodifikovani Fc koji je dat u SEQ ID NO: 197 (odgovara K447del prema EU numeraciji). Reprezentativni Fc region IgG1 koji sadrži deleciju lizina dat je u SEQ ID NO: 1715. Drugi Fc regioni su takođe pogodni za stvaranje naslaganih molekula. Ispod su dati reprezentativni stvoreni naslagani konstrukti.

[0474] Ekspresioni konstrukti koji kodiraju Fc fuzione proteine od interesa prolazno su eksprimirani u Expi293 HEK293 ćelija kompanije Invitrogen koristeći proizvođačeve komercijalne reagense i medijume Expifectamine. Supernatanti su sakupljeni i protein je uhvaćen i eluiran sa kolone proteina A koristeći sistem za prečišćavanje proteina AKTA.

4

Eluirana susptanca je zatim razdvojena pomoću dodatnog koraka preparativne SEC dajući monomernu, veoma prečišćenu supstancu. Prečišćeni proteini su formulisani u 15 mM acetatu, 200 mM NaCl, 9% saharozi, pH 5,0 (ASU5). Protein je u bočicama stavljen u sterilni biobezbednosni kabinet i zamrznut na -80 C. Bočica je odmrznuta i procenjena pomoću analitičke SEC da bi se pokazalo da je supstanca stabilna i pretežno monomerna nakon odmrzavanja.

[0475] Za svaki naslagani konstrukt, molekul kodirajuće nukleinske kiseline je konstruisan za proizvodnju homodimernih naslaganih konstrukta sa različitim konfiguracijama, sa sekvencama po prikazanom redosledu:

A. Naslagani konstrukti koji sadrže PD-L1 i CD155

[0476] Molekul kodirajuće nukleinske kiseline je konstruisan da se dobiju homodimerni naslagani konstrukti sa različitim konfiguracijama sekvenci po prikazanom redosledu:

● PD-L1/CD155 Naslagani konstrukt 1 (SEQ ID NO: 1716): CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576) - 2xGGGS (SEQ ID NO: 240) - Fc (SEQ ID NO: 1155) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 239) - PD-L1 (SEQ ID NO: 303)

●

● PD-L1/CD155 Naslagani konstrukt 2 (SEQ ID NO: 1717): PD-L1 (SEQ ID NO: 303) - 2xGGGS (SEQ ID NO: 240) - Fc (SEQ ID NO: 1155) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576)

●

● PD-L1/CD155 Naslagani konstrukt 3 (SEQ ID NO: 1718): CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576) -3x GGGGS (SEQ ID NO: 239) - PD-L1 (SEQ ID NO: 303) - 2xGGGS (SEQ ID NO: 240) -Fc (SEQ ID NO: 1155)

●

● PD-L1/CD155 Naslagani konstrukt 4 (SEQ ID NO: 1719): PD-L1 (SEQ ID NO: 303) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576) - 2xGGGS (SEQ ID NO: 240) -Fc (SEQ ID NO: 1155)

●

● PD-L1/CD155 Naslagani konstrukt 5 (SEQ ID NO: 1720): N-terminalni HMSSVSAQ dat u SEQ ID NO: 1156 - Fc (SEQ ID NO: 1155) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576) - 3xGGGS (SEQ ID NO: 239) -PD-L1 (SEQ ID NO: 303)

●

● PD-L1/CD155 Naslagani konstrukt 6 (SEQ ID NO: 1721): N-terminalni HMSSVSAQ dat u SEQ ID NO: 1156 - Fc (SEQ ID NO: 1155) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 239) - PD-L1 (SEQ ID NO: 303) - 3xGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576)

●

B. Naslagani konstrukti koji sadrže PD-L1, CD112 i CD155

[0477] Molekul kodirajuće nukleinske kiseline je konstruisan da se dobiju homodimerni naslagani konstrukti sa različitim konfiguracijama sekvenci po prikazanom redosledu:

● PD-L1/CD112/CD155 Naslagani konstrukt 1 (SEQ ID NO: 1722): PD-L1 (SEQ ID NO: 303) - 3xGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576) -2xGGGS (SEQ ID NO: 240) - Fc sa uklonjenim lizinom (SEQ ID NO: 1715) - 3x GGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD112 (SEQ ID NO: 768)

●

● PD-L1/CD112/CD155 Naslagani konstrukt 2 (SEQ ID NO: 1723): PD-L1 (SEQ ID NO: 303) - 3xGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576) -3xGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD112 (SEQ ID NO: 768) - 2xGGGS (SEQ ID NO: 240) - Fc (SEQ ID NO: 1155)

●

● PD-L1/CD112/CD155 Naslagani konstrukt 3 (SEQ ID NO: 1724): PD-L1 (SEQ ID NO: 303) - 3xGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD112 (SEQ ID NO: 768) - 3xGGGS (SEQ ID NO: 239) - CD155 varijanta (SEQ ID NO: 1576) - 2xGGGS (SEQ ID NO: 240) - Fc (SEQ ID NO: 1155)

●

PRIMER 11

Procena vezivanja i biološke aktivnosti molekula koji sadrže naslagani afinitetno sazreli domen IgSF PD-L1/CD155

[0478] Ovaj primer opisuje studije vezivanja za procenu specifičnosti i afiniteta reprezentativnih naslaganih imunomodulatornih proteina varijante IgV PD-L1/CD155 (PD-L1/CD155 naslagani IgV-Fc) koji su dobijeni u primeru 10, za vezivanje za srodne vezujuće partnere. Reporterski test Jurkat/II,2/PD1/TIGIT je pored toga korišćen za procenu aktivnosti blokiranja PD-1 i TIGIT naslaganih molekula IgV-Fc PD-L1/CD155. Kao kontrola, takođe je ispitana aktivnost vezivanja i blokiranja nenaslaganih fuzionih molekula varijante IgV-Fc PD-L1 ili IgV-Fc CD155 koji su sadržali istu varijantu IgV PD-L1 (SEQ ID NO:303) ili varijantu IgV CD155 (SEQ ID NO:1576), datim redosledom, koja je korišćena u naslaganim konstruktima. Takođe je procenjen CD155-ECD-Fc divljeg tipa i PD-L1-ECD-Fc divljeg tipa koji je sadržao ECD CD155 divljeg tipa (SEQ ID NO:20) ili ECD PD-L1 divljeg tipa (SEQ ID NO:3), datim redosledom.

A. Vezivanje za kontrastrukturu koju eksprimira ćelija

[0479] Studije vezivanja su obavljene koristeći Jurkatove/IL-2 reporterske ćelije (kupljene od Promega Corp. SAD) koje su transdukovane da stabilno eksprimiraju humani PD-1 (Jurkatove/PD-1 ćelije), humani TIGIT (Jurkatove/TIGIT ćelije) ili PD-1 i TIGIT (Jurkatove/PD-1/TIGIT ćelije). Za bojenje protočnom citometrijom, 100.000 Jurkatovih/PD-1, Jurkatovih/TIGIT, Jurkatovih/PD-1/TIGIT ćelija ili negativne kontrole (samo Jurkatove ćelije) zasejano je na ploče sa okruglim dnom sa 96 bunarčića. Ćelije su centrifugirane i ponovo suspendovane u puferu za bojenje (PBS (fiziološki rastvor puferovan fosfatom), 1% BSA (albumin goveđeg seruma) i 0,1% natrijum azid) tokom 20 minuta da se blokira nespecifično vezivanje. Ćelije su nakon toga centrifugirane i suspendovane u 50 µl pufera za bojenje koji sadrži 100 nM do 6 pM svakog kandidata za Fc fuzioni protein, fuzione molekule varijante IgV-Fc PD-L1 ili IgV-Fc CD155 ili naslagane fuzione molekule IgV-Fc PD-L1/CD155 koji su opisani ispod. Primarno bojenje je obavljeno na ledu tokom 90 minuta, pa su ćelije isprane dva puta u 200 µl pufera za bojenje. PE-konjugovani anti-humani Fc (Jackson ImmunoResearch, SAD) razblažen je 1: 150 u 50 µl pufera za bojenje i dodat u ćelije i inkubiran još 30 minuta na ledu. Sekundarno antitelo je dva puta isprano, ćelije su fiksirane u 4% formaldehidu/PBS, i uzorci su analizirani na protočnom citometru Intellicyt (Intellicyt Corp., SAD).

[0480] Prosečni intenzitet fluorescencije (MFI) izračunat je pomoću softvera FlowJo verzije 10 (FlowJo LLC, SAD). Tabela 17 prikazuje vezujuću aktivnost izmerenu putem vrednosti prosečnog intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje 20 nM svakog naslaganog Fcfuzionog molekula, nenaslagane varijante kontrola IgV-Fc PD-L1 ili IgV-Fc CD155 ili kontrola ECD divljeg tipa, za Jurkatove/PD-1, Jurkatove/TIGIT i Jurkatove/PD-1/TIGIT ćelije. Kao što je prikazano u tabeli 17, nekoliko naslaganih proteina je vezivalo i PD-1 i TIGIT sa velikim afinitetom. Studije su obavljene suštinski kao što je prethodno opisano za dalju procenu vezivanja naslaganih proteina pri različitim dozama.

TABELA 17: Vezivanje naslaganih konstrukta za kontrastrukturu koju eksprimira ćelija

B. Procena biološke aktivnosti molekula koji sadrže afinitetno sazreli domen IgSF

[0481] Jurkatove efektorske ćelije koje eksprimiraju reporter IL-2-luciferaze i PD-1 i TIGIT na ćelijskoj površini supendovane su sa 2×10<6>ćelija/ml u Jurkatovom test puferu (RPMI1640 5%FBS) i anti-CD28 je dodat do finalne koncentracije 3 µg/ml. Jurkatove ćelije su zatim zasejane sa 50 µl/bunarčiću, ukupno 100.000 ćelija po bunarčiću.

[0482] U svaki bunarčić, u Jurkatove ćelije je dodato 25 µl naslaganog testiranog proteina IgV-Fc PD-L1/CD155. Nenaslagane varijante fuzionih molekula IgV-Fc PD-L1 ili IgV-Fc CD155, samostalno ili u kombinaciji, takođe su procenjene radi poređenja. Anti-TIGIT antitelo (klon MBSA43), anti-PD-1 antitelo (nivolumab) ili prazan molekul Fc takođe su korišćeni kao kontrole. Svi proteini su dodati u pet koncentracija: 400 nM, 100 nM, 25 nM, 6,25 nM i 1,56 nM. Jurkatove ćelije sa testiranim ili kontrolnim proteinima inkubirane su tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Veštačke antigen prezentujuće ćelije (aAPC) dobijene od CHO koje prikazuju transdukovani anti-CD3 jednolančani Fv (OKT3), PD-L1 i CD155 na ćelijskoj površini dovedene su do 0,8×10<6>ćelija/ml i 25 µl ćelija je dodato u svaki bunarčić, dajući finalnu zapreminu od 100 µl u svakom bunarčiću. Svaki bunarčić je imao finalni odnos Jurkatovih ćelija:CHO ćelijama 5:1 i koncentraciju testiranog proteina od 100, 25, 6,25, 1,56 ili 0,47 nM i koncentraciju anti-CD28 od 1,5 µg/ml. Jurkatove ćelije i CHO ćelije su inkubirane tokom 5 sati na 37 stepeni Celzijusa u humidifikovanoj komori za inkubaciju sa 5% CO2. Ploče su zatim uklonjene iz inkubatora i aklimatizovane na sobnu temperaturu tokom 15 minuta.100 µl rastvora za ćelijsku lizu i supstrata luciferaze (BioGlo luciferase reagent, Promega) dodato je u svaki bunarčić i ploče su inkubirane na orbitalnoj tresilici tokom 10 minuta. Luminescencija je izmerena sa vremenom integracije od 1 sekunde po bunarčiću koristeći luminometar BioTek Cytation.

[0483] Vrednost prosečne relativne luminescencije je utvrđena za svaki testirani uzorak i umnožak povećanja (ili smanjenja) signala reportera IL-2 izračunat je za svaki naslagani molekul u poređenju sa nenaslaganim proteinima varijante IgV-Fc PD-L1 i varijante IgV-Fc CD155. Pošto test predstavlja meru blokiranja inhibitornih signala, povećanje luminescentnog signala u poređenju sa kontrolom ukazuje na prisustvo aktivnosti blokiranja.

[0484] Kao što je prikazano u tabeli 18, aktivnost luciferaze Jurkatovih efektorskih ćelija koje su uzgajane zajedno sa anti-CD3/PD-L1/CD155 aAPC i 100 nM naslaganih Fc molekula PD-L1/CD155 izmenjena je (povećana) za svaki testirani molekul u poređenju sa kontrolom. Razlike u luminescentnim signalima pokazuju razlike u vezivanju naslaganih Fc molekula PD-L1/CD155 za PD-1 i TIGIT i posledično zajedničko blokiranje inhibitorne aktivnosti. U ovoj tabeli, kolona 1 prikazuje SEQ ID NO oznaku za svaku testiranu varijantu naslaganog Fc PD-L1/CD155. Studije su obavljene suštinski kao što je prethodno opisano za dalju procenu vezivanja naslaganih proteina pri različitim dozama.

TABELA 18: Rezultati reporterskog testa Jurkat/IL2/PD1/TIGIT CHO/OKT3/PD-

1

TABELA 18: Rezultati reporterskog testa Jurkat/IL2/PD1/TIGIT CHO/OKT3/PD-

PRIMER 12

Procena vezivanja i biološke aktivnosti molekula koji sadrže naslagani afinitetno sazreli domen IgSF PD-L1/CD112/CD155

[0485] Ovaj primer opisuje studije vezivanja za procenu specifičnosti i afiniteta naslaganih imunomodulatornih proteina PD-L1/CD112/CD155 (PD-L1/CD112/CD155 naslagani IgV-Fc), koji su dobijeni u primeru 10 za vezivanje za srodne vezujuće partnere. Reporterski test

11

Jurkat/IL2/PD1/CD112R/TIGIT je pored toga korišćen za procenu aktivnosti blokiranja PD-1, CD112R i TIGIT naslaganih molekula IgV-Fc PD-L1/CD112/CD155. Radi poređenja, takođe je ispitana aktivnost vezivanja i blokiranja nenaslaganih fuzionih molekula varijante IgV-Fc PD-L1, IgV-Fc CD112 ili IgV-Fc CD155 koji su sadržali istu varijantu IgV PD-L1 (SEQ ID NO:303), IgV CD112 (SEQ ID NO:768) ili varijantu IgV CD155 (SEQ ID NO:1576), datim redosledom, koja je korišćena u naslaganim konstruktima.

A. Vezivanje za kontrastrukturu koju eksprimira ćelija

[0486] Studije vezivanja su obavljene koristeći Jurkatove/IL-2 reporterske ćelije koje endogeno eksprimiraju CD112R (kupljene od Promega Corp. SAD) koje su transdukovane da stabilno eksprimiraju humani PD-1 (Jurkatove/PD-1 ćelije), humani TIGIT (Jurkatove/TIGIT ćelije) ili PD-1 i TIGIT (Jurkatove/PD-1/TIGIT ćelije). Za bojenje protočnom citometrijom, 100.000 Jurkatovih matičnih (CD112R), Jurkat/PD-1, Jurkat/TIGIT, Jurkat/PD-1/TIGIT ćelija zasejano je na ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Ćelije su centrifugirane i ponovo suspendovane u puferu za bojenje (PBS (fiziološki rastvor puferovan fosfatom), 1% BSA (albumin goveđeg seruma) i 0,1% natrijum azid) tokom 20 minuta da se blokira nespecifično vezivanje. Nakon toga, ćelije su centrifugirane i suspendovane u 50 µl pufera za bojenje koji sadrži 100 nM do 6 pM svakog potencijalnog Fc fuzionog proteina. Primarno bojenje je obavljeno na ledu tokom 90 minuta, pa su ćelije isprane dva puta u 200 µl pufera za bojenje. PE-konjugovani anti-humani Fc (Jackson ImmunoResearch, SAD) razblažen je 1: 150 u 50 µl pufera za bojenje i dodat u ćelije i inkubiran još 30 minuta na ledu. Sekundarno antitelo je dva puta isprano, ćelije su fiksirane u 4% formaldehidu/PBS, i uzorci su analizirani na protočnom citometru LSRII (Becton Dickinson Corp., SAD).

[0487] Vrednosti vezivanja, izražene kao prosečni intenzitet fluorescencije (MFI), utvrđene su za koncentraciju od 33,3 nM svakog naslaganog Fc fuzionog proteina i nenaslaganih proteina varijante PD-L1 IgV-Fc, CD112-IgV-Fc i CD155-IgV-Fc. Podaci su analizirani koristeći softver FlowJo verziju 10 (FlowJo LLC, SAD). Rezultati studija vezivanja za reprezentativne testirane naslagane Fc fuzione molekule PD-L1/CD112/CD155 (testirani pri 33,3 nM) prikazani su u tabeli 19. Kao što je prikazano, nekoliko naslaganih proteina je vezivalo i PD-1, TIGIT i/ili CD112R sa velikim afinitetom.

12

TABELA 19: Vezivanje naslaganih konstrukta za kontrastrukturu koju eksprimira ćelija

Kategorija SEQ Vezivanje za Jurkatove transfektanse

[0488] Jurkatove efektorske ćelije koje eksprimiraju reporter IL-2-luciferaze i PD-1, CD112R i TIGIT na ćelijskoj površini supendovane su sa 2×10<6>ćelija/ml u Jurkatovom test puferu (RPMI1640 5%FBS) i anti-CD28 je dodat do finalne koncentracije od 3 µg/ml. Jurkatove ćelije su zatim zasejane sa 50 µl/bunarčiću, ukupno 100.000 ćelija po bunarčiću.

[0489] U svaki bunarčić, u Jurkatove ćelije je dodato 25 µl naslaganog testiranog proteina IgV-Fc PD-L1/CD112/CD155. Nenaslagane varijante fuzionih molekula PD-L1 IgV-Fc,

1

CD112 IgV-Fc ili CD155 IgV-Fc, samostalno ili u kombinaciji, takođe su procenjene kao kontrola za poređenje. Anti-TIGIT antitelo (klon MBSA43), anti-PD-1 antitelo (nivolumab) ili prazan molekul Fc takođe su korišćeni kao kontrole. Svi proteini su dodati u pet koncentracija: 400 nM, 100 nM, 25 nM, 6,25 nM, 1,56 nM ili 0,49 nM. Jurkatove ćelije sa testiranim ili kontrolnim proteinima inkubirane su tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Veštačke antigen prezentujuće ćelije (aAPC) dobijene od CHO koje prikazuju transdukovani anti-CD3 jednolančani Fv (OKT3), PD-L1 i CD112 na ćelijskoj površini dovedene su do 0,8×10<6>ćelija/ml i 25 µl ćelija je dodato u svaki bunarčić, dajući finalnu zapreminu od 100 µl u svakom bunarčiću. Svaki bunarčić je imao finalni odnos Jurkatovih ćelija:CHO ćelijama 5:1 i koncentraciju testiranog proteina od 100, 25, 6,25, 1,56, 0,47 ili 0,12 nM i koncentraciju anti-CD28 od 1,5 µg/ml. Jurkatove ćelije i CHO ćelije su inkubirane tokom 5 sati na 37 stepeni Celzijusa u humidifikovanoj komori za inkubaciju sa 5% CO2. Ploče su zatim uklonjene iz inkubatora i aklimatizovane na sobnu temperaturu tokom 15 minuta. 100 µl rastvora za ćelijsku lizu i supstrata luciferaze (BioGlo luciferase reagent, Promega) dodato je u svaki bunarčić i ploče su inkubirane na orbitalnoj tresilici tokom 10 minuta.

Luminescencija je izmerena sa vremenom integracije od 1 sekunde po bunarčiću koristeći luminometar BioTek Cytation.

[0490] Vrednost prosečne relativne luminescencije (RLU) utvrđena je za svaki testirani uzorak i umnožak povećanja (ili smanjenja) signala reportera IL-2 izračunat je za svaki naslagani molekul u poređenju sa nenaslaganim proteinima varijante IgV-Fc PD-L1, varijante IgV-Fc CD112 i varijante IgV-Fc CD155. Pošto test predstavlja meru blokiranja inhibitornih signala, povećanje luminescentnog signala u poređenju sa kontrolom ukazuje na prisustvo aktivnosti blokiranja.

[0491] Kao što je prikazano u tabeli 20, aktivnost luciferaze Jurkatovih efektorskih ćelija koje su uzgajane zajedno sa anti-CD3/PD-L1/CD112 aAPC i naslaganim Fc molekulima PD-L1/CD112/CD155 je izmenjena (povećana) za svaki testirani molekul. Razlike u luminescentnim signalima pokazuju razlike u vezivanju naslaganih Fc molekula PD-L1/CD112/CD155 za PD-1, CD 112R i TIGIT i posledično zajedničko blokiranje inhibitorne aktivnosti. U ovoj tabeli, kolona 2 prikazuje SEQ ID NO oznaku za svaku testiranu varijantu naslaganog Fc PD-L1/CD112/CD155.

14

Tabela 20: Reporterski test Jurkat/IL2/TIGIT/PD1

1

PRIMER 13

Procena vezivanja molekula koji sadrže afinitetno sazreli domen IgSF za kontrastrukturu koju eksprimiraju ćelije

[0492] Ovaj primer opisuje studije vezivanja protočnom citometrijom za procenu specifičnosti i afiniteta imunomodulatornih proteina varijante PD-L1-ekstracelularnog domena (ECD) prema srodnim vezujućim partnerima PD-1 i CD80 koristeći šemu selekcije koja je opisana u primeru 3 za drugi krug odabira u odnosu na rPD-1.Fc ili rCD80.Fc, osim što su mutantni konstrukti stvoreni na osnovu sekvence humanog PD-L1 divljeg tipa koja je data u SEQ ID NO: 1728 koja sadrži kompletan ekstracelularni domen (IgV IgC) na sledeći način.

[0493] Za merenje vezivanja za PD-1, studije su obavljene koristeći reporterske ćelije Jurkat/IL-2 (kupljene od kompanije Promega Corp. SAD) koje su transdukovane da stabilno eksprimiraju humani PD-1 (Jurkatove/PD-1 ćelije). Za merenje vezivanja za CD80, studije su obavljene koristeći ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) koje su transdukovane da stabilno eksprimiraju humani CD80 (CHO/CD80).100.000 ćelija po bunarčiću Jurkat/PD-1, CHO/CD80, Jurkatovih matičnih ili CHO matičnih ćelija zasejano je na ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Ćelije su centrifugirane i ponovo suspendovane u puferu za bojenje (PBS (fiziološki rastvor puferovan fosfatom), 1% BSA (albumin goveđeg seruma) i 0,1% natrijum azid) tokom 20 minuta da se blokira nespecifično vezivanje. Nakon toga, ćelije su centrifugirane i suspendovane u 50 µl pufera za bojenje koji sadrži 100 nM do 3,7 nM svakog potencijalnog Fc fuzionog proteina. Primarno bojenje je obavljeno na ledu tokom 90 minuta, pa su ćelije isprane dva puta u 200 µl pufera za bojenje. APC-konjugovani anti-humani Fc (Jackson ImmunoResearch, SAD) razblažen je 1:150 u 50 µl pufera za bojenje i dodat u ćelije i inkubiran još 30 minuta na ledu. Sekundarno antitelo je dva puta isprano, ćelije su fiksirane u 4% formaldehidu/PBS, i uzorci su analizirani na protočnom citometru LSRII (Becton Dickinson Corp., SAD).

1

[0494] Prosečni intenzitet fluorescencije (MFI) izračunat je pri koncentraciji 20 nM i upoređen sa proteinom PD-L1 ECD-Fc divljeg tipa pomoću softvera FlowJo verzija 10 (FlowJo LLC, SAD). Rezultati studija vezivanja za reprezentativne testirane fuzione molekule PD-L1-ECD-Fc prikazani su u tabeli 21. Kao što je pokazano, selekcije su dovele do identifikacije proteina varijante PD-L1 koji vezuju samo PD-1, samo CD80 ili oba proteina sa velikim afinitetom.

Tabela 21: Protočno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju PD-1 ili

Mutacija( PD-1 CD80

PD-L1 MFI pri Umnožak promene MFI pri Umnožak promene

20 nM u poređenju sa WT 20 nM u poređenju sa

1

Tabela 21: Protočno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju PD-1 ili CD80

Mutacija( PD-1 CD80

PD-L1 MFI pri Umnožak promene MFI pri Umnožak promene

20 nM u poređenju sa WT 20 nM u poređenju sa

1

2

Tabela 21: Protočno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju PD-1 ili CD80

Mutacija( PD-1 CD80

PD-L1 MFI pri Umnožak promene MFI pri Umnožak promene

20 nM u poređenju sa WT 20 nM u poređenju sa

[0495] Dodatne varijante koje su identifikovane u pretraživanju kao što je opisano u primeru 3 date su u tabeli 22A.

21

TABELA 22A. Dodatni molekuli koji sadrže afinitetno sazreli domen IgSF Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID NO (ECD) Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID NO (ECD)

22

[0496] Studije vezivanja protočnom citometrijom obavljene su suštinski kao što je prethodno opisano za procenu specifičnosti i afiniteta imunomodulatornih proteina varijante PD-L1-ekstracelularnog domena (ECD) prema srodnom vezujućem partneru PD-1. Za merenje vezivanja za PD-1, kao što je prethodno opisano, korišćene su reporterske ćelije Jurkat/IL-2

2

transdukovane da stabilno eksprimiraju humani PD-1 (Jurkatove/PD-1 ćelije). Prosečni intenzitet fluorescencije (MFI) izračunat je pri koncentraciji od 20 nM i upoređen sa proteinom PD-L1 ECD-Fc divljeg tipa i kontrolom koja sadrži samo Fc. Rezultati studija vezivanja za reprezentativne testirane fuzione molekule PD-L1-ECD-Fc prikazani su u tabeli 22B. Kao što je pokazano, selekcije su dovele do identifikacije proteina varijante PD-L1 koji vezuju samo PD-1 sa velikim afinitetom.

TABELA 22B. Protočno vezivanje za Jurkatove ćelije koje eksprimiraju PD-1

Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID NO MFI pri konc. Umnožak povećanja u odnosu (ECD) 20 nM na WT PD-L1 ECD-Fc

24

TABELA 22B. Protočno vezivanje za Jurkatove ćelije koje eksprimiraju PD-1 Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID NO MFI pri konc. Umnožak povećanja u odnosu (ECD) 20 nM na WT PD-L1 ECD-Fc

2

TABELA 22B. Protočno vezivanje za Jurkatove ćelije koje eksprimiraju PD-1 Mutacija(e) PD-L1 SEQ ID NO MFI pri konc. Umnožak povećanja u odnosu

[0497] Biološka aktivnosti dodatnih molekula koji sadrže afinitetno sazreli domen PD-L1 je dalje procenjena koristeći Jurkatove efektorske ćelije koje eksprimiraju reporter IL-2-luciferaze i površinski ćelijski PD-1, suštinski kao što je opisano u primeru 12B. Kao što je prikazano u tabeli 22C, povećana aktivnost luciferaze Jurkatovih efektorskih ćelija koje su uzgajane zajedno sa anti-CD3 i K562/CD80 ćelijama uočena je za neke Fc fuzione molekule sa naznačenom varijantom PD-L1. Vrednost prosečne relativne luminescencije (RLU) utvrđena je za svaki testirani uzorak i umnožak promene signala reportera IL-2 izračunat je za svaki testirani molekul u poređenju sa divljim tipom PD-L1 ili kontrolnim proteinom koji sadrži samo Fc. U ovoj tabeli, kolona 2 prikazuje SEQ ID NO oznaku za svaku testiranu varijantu PD-L1. Razlike u luminescentnim signalima pokazuju razlike u vezivanju naslaganih Fc molekula varijante PD-L1 za PD-1 i posledično zajedničko blokiranje inhibitorne aktivnosti.

2

TABELA 22C: Reporterski test Jurkat/IL2/PD-1 K562/CD80 rastvorljivi anti-CD3

2

TABELA 22C: Reporterski test Jurkat/IL2/PD-1 K562/CD80 rastvorljivi anti-CD3

2

TABELA 22C: Reporterski test Jurkat/IL2/PD-1 K562/CD80 rastvorljivi anti-CD3

TABELA 22C: Reporterski test Jurkat/IL2/PD-1 K562/CD80 rastvorljivi anti-CD3 Mutacija(e) PD- SEQ ID NO Relativne jedinice Umnožak povećanja u L1 (ECD) luciferaze (RLU) odnosu na WT PD-L1

PRIMER 14

Stvaranje izlučenog imunomodulatornog proteina i procena proliferacije Pan T-ćelija koje su transdukovane sa PD-L1 SIP

[0498] Za stvaranje PD-L1 izlučenog imunomodulatornog proteina (SIP), DNK koja kodira reprezentativne SIP dobijena je u vidu genskih blokova od kompanije Integrated DNA Technologies (Coralville, SAD) i zatim je klonirana pomoću kompleta za sklapanje Gibson (New England Biolabs Gibson komplet za sklapanje) u modifikovanu verziju vektora pRRL (Dull et al., (1998) J Virol, 72(11): 8463-8471) između mesta restrikcije nishodno od promotera MND za uklanjanje GFP. Dobijeni su reprezentativni konstrukti SIP za kodiranje proteina koji je dat u SEQ ID NO: 2012-2013, uključujući i signalni peptid. U ovom

1

reprezentativnom primeru, konstrukti su generisani tako da dodatno sadrže i ostatak oznake. Genski blokovi su imali sledeću strukturu datim redosledom: preklapanje od 39 baznih parova sa pRRL pre prvog mesta restrikcije-prvo mesto restrikcije-GCCGCCACC (Kozak); potpuna sekvenca aminokiselina koja kodira ORF PD-L1 IgV divljeg tipa data u SEQ ID NO: 309 ili varijanta PD-L1 IgV data u SEQ ID NO: 303 (D43G/N45D/L56Q/V58A/G101G-ins (G101GG), takođe u svim slučajevima sadrži signalni peptid MGSTAILALLLAVLQGVSA kao što je dato u SEQ ID NO: 2009; DNK koja kodira Flag-oznaku kao što je dato u SEQ ID NO:2010 (DYKDDDDK); DNK koja kodira His oznaku kao što je dato u SEQ ID NO: 2011 (HHHHHH); TAA zaustavni kodon; drugo mesto restrikcije- preklapanje od 41 baznog para sa pRRL posle drugog mesta restrikcije. SIP koji kodira PD-L1 divljeg tipa je takođe procenjen radi poređenja.

[0499] 3×10<6>HEK293 ćelija je zasejano na 100 mm posude za pripremu lentivirusnih vektora. Sutradan, 4,5 µg P-Mix (3 µg PAX2 i 1,5 µg pMD2G) dodato je u 6 µg DNK koja kodira konstrukte SIP u polipropilenskoj epruveti od 5 ml. U epruvetu je dodat pufer za razblaživanje (10 mM HEPES/150 mM NaCl pH 7,05/1 l H20 TC kvaliteta) za povećanje ukupne zapremine do 500 µl. U razblaženu DNK (PEI:ukupna DNK 4:1) dodato je 42 µl PEI (1 µg/µl) i pomešano centrifugiranjem. Smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta i ćelije su pripremljene nežnom aspiracijom medijuma iz posude bez ometanja zalepljenih ćelija, zatim zamenjene sa 6 ml Opti-MEM (1X). Smeša DNK/PEI je zatim dodata u posudu i inkubirana na 37 °C tokom 24 sata. Nakon 24 sata, medijum je aspiriran iz posuda i zamenjen sa 10 ml svežeg DMEM medijuma i zatim inkubiran na 37 °C. Virusni supernatant je sakupljen nakon 48 sati koristeći špric na koji je pričvršćen PES filter od 0,45 µm za uklanjanje ćelija i otpada iz kulture (Thermo Scientific Nalgene špric filter). Takođe je pripremljen zasebni stok lentivirusnog vektora koji kodira anti-CD19 CAR (sadrži anti-CD19 scFv, domen šarke i transmembranski domen dobijen od CD8 i CD3zeta signalnog domena), suštinski kao što je opisano. Reprezentativni anti-CD19 CAR koji je korišćen dat je u SEQ ID NO: 2016 (kodiran sekvencom koja je data u SEQ ID NO: 2017) i sadrži scFv dat u SEQ ID NO:1163, domen šarke i transmembranski domen dobijen od CD8 dat u SEQ ID NO: 242 i CD3zeta dat u SEQ ID NO:243.

[0500] T-ćelije su odmrznute i aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 perlicama (Dynal) u odnosu 1:1. T-ćelije (1 × 10<6>ćelija) pomešane su sa ukupno 1 ml supernatanta lentivirusnog vektora koji sadrži jednaku zapreminu (po 0,5 ml) supernatanta lentivirusnog vektora koji kodira

2

naznačeni PD-L1 SIP (D43G/N45D/L56Q/V58A/G101GG ili divlji tip) i supernatanta lentivirusnog vektora koji kodira anti-CD19 CAR. Radi kontrole, ćelije su transdukovane samo lentivirusnom vektorom koji kodira anti-CD19 CAR ili su transdukovane lažnom vektorskom kontrolom. Transdukcija je obavljena u prisustvu 10 µg/ml polibrena i 50 IU/ml IL-2. Ćelije su centrifugirane na 2500 o/min tokom 60 min na 30 °C. Nakon 24 sata, 3 ml medijuma Xvivo15 plus i IL2 dodato je u svaki bunarčić. Ćelijama su na svaka dva dana dolivani svež medijum i citokini.

[0501] 14 dana nakon aktivacije, ćelije su ponovo stimulisane sa Nalm6 ćelijama koje su transdukovane lentivirusnim vektorom za dobijanje ekspresije PD-L1 (Nalm6 PDL1+).

Transdukovane T-ćelije su označene sa Cell Trace Far Red i proliferacija je izmerena 3. dana utvrđivanjem frakcije ćelija koje pokazuju razblaživanje boje. Rezultati studija proliferacije za T-ćelije transdukovane sa reprezentativnim testiranim varijantama PD-L1 SIP su prikazani na SL.10.

PRIMER 15

Procena multidomenskih naslaganih molekula PD-L1 na aktivnost primarnih iscrpljenih T-ćelija

[0502] Ovaj primer opisuje studije za procenu specifičnosti i afiniteta reprezentativnih naslaganih imunomodulatornih proteina IgV varijante PD-L1/CD155 i PD-L1/CD112/CD155 (naslagani IgV-Fc), koji su dobijeni kao što je opisano u primeru 10, za modulaciju aktivnosti iscrpljenih T-ćelija putem blokiranja interakcija koje uključuju srodne vezujuće partnere PD-1, TIGIT i/ili CD112R.

A. Dobijanje iscrpljenih T-ćelija

[0503] Za dobijanje iscrpljenih T-ćelija, primarne humane T-ćelije su stimulisane tokom 7 dana K562 ćelijama koje su tretirane mitomicinom C koje stabilno eksprimiraju anti-CD3 jednolančani Fc (OKT3) u odnosu 10 T-ćelija prema 1 ćeliji K562/OKT3.50 IU/ml rekombinantnog IL-2 je 3. dana dodato u medijume za uzgajanje za promovisanje T-ćelijske ekspanzije i preživljavanja. T-ćelije su 7. dana sakupljene, prebrojane i zatim pripremljene za dva dodatna ciklusa ponovne stimulacije sa K562/OKT3 plus IL-2. Nakon 21 dana (3 kruga stimulacije), T-ćelije su prebrojane, okarakterisane na ekspresiju inhibitornih receptora PD-L1, TIGIT i Lag-3 i zatim zamrznute za dalje testove. Iscrpljene T-ćelije su detektovane na osnovu povišene ekspresije inhibitornih receptora PD-1, TIGIT i Lag-3.

B. Vezivanje za iscrpljene T-ćelije

[0504] Iscrpljene T-ćelije su dobijene kao što je prethodno opisano putem tri kruga stimulacije i ekspanzije sa K562/OKT3 IL-2. Studije vezivanja su obavljene suštinski kao što je opisano u primeru 12, osim što su korišćene iscrpljene T-ćelije. Reprezentativni naslagani molekuli koji su testirani uključuju PD-L1/CD155 naslagani konstrukt 4 (SEQ ID NO: 1719) i PD-L1/CD112/CD155 naslagani konstrukt 2 (SEQ ID NO: 1724) koji su dobijeni kao što je prethodno opisano u primeru 10. Kao kontrola, procenjena je vezujuća aktivnost nenaslaganih formata svake varijante IgV fuzionisane sa Fc (dat u SEQ ID NO: 1157 koji sadrži mutacije C220S, R292C, N297G i V302C na osnovu EU numeracije (odgovara C5S, R77C, N82G i V87C kada se posmatra divlji tip humanog IgG1 Fc dat u SEQ ID NO: 187), tj. varijanta IgV-Fc PD-L1 (sadrži varijantu PD-L1 IgV koja je data u SEQ ID NO:303), IgV-Fc CD155 (sadrži varijantu CD155 IgV koja je data u SEQ ID NO:1576), ili IgV-Fc CD112 (sadrži varijantu CD112 IgV koja je data u SEQ ID NO: 768).

[0505] Na SL.11 su prikazani rezultati studija vezivanja za reprezentativne testirane naslagane Fc fuzione molekule PD-L1/CD155 i PD-L1/CD112/CD155 koji su testirani pri različitim koncentracijama. Kao što je prikazano, reprezentativni naslagani Fc fuzioni molekul PD-L1/CD155 pokazuje superiorno vezivanje za iscrpljene T-ćelije u odnosu na bilo koji domen samostalno.

C. Stimulacija i procena biološke aktivnosti

[0506] Prethodno dobijene iscrpljene T-ćelije, pripremljene kao što je prethodno opisano, odmrznute su i zasejane sa 100.000 ćelija po bunarčiću na ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom u test puferu (medijum X-vivo 15 (Lonza, Corp., SAD) sa dodatkom Glutamax (ThermoFisher, Inc. SAD)). Reprezentativni naslagani Fc fuzioni molekul PD-L1/CD155 naslagani konstrukt 4 SEQ ID NO: 1719, ili kontrolna nenaslagana varijanta PD-L1 IgV-Fc ili CD155 IgV-Fc dodati su u T-ćelije sa finalnom koncentracijom od 100 nM, 10 nM i 1 nM. Kontrolni nenaslagani fuzioni molekuli varijante PD-L1 IgV-Fc ili CD155 IgV-Fc su sadržali

4

istu varijantu PD-L1 IgV (SEQ ID NO:303) ili varijantu CD155 IgV (SEQ ID NO:1576) koje su korišćene u naslaganim konstruktima. Anti-TIGIT antitelo (eBioscience, Inc., SAD) i anti-PD-1 antitelo (Bristol-Myers Squibb, Inc., SAD) ili humano IgG1 antitelo (BioLegend, Inc., SAD) takođe su korišćena kao kontrole i dodata u T-ćelije sa naznačenim koncentracijama.

[0507] K562 ćelije koje su prethodno transdukovane da eksprimiraju anti-CD3 jednolančani Fv (OKT3) i humani PD-L1 tretirane su tokom 20 minuta sa 50 µg/ml mitomicina C (Millipore Sigma, Corp., SAD) za zaustavljanje proliferacije, isprane su i zatim dodate u test ploču sa 10.000 ćelija po bunarčiću. Za dalju kontrolu, T-ćelije su inkubirane sa K562-OKT3-PD-L1 ćelijama u odsustvu dodatog molekula ili su inkubirane bez stimulacije K562-OKT3-PD-L1 ćelijama. Test ploča je zatim inkubirana tokom tri dana na 37 °C u humidifikovanom inkubatoru sa 5% CO2. Nakon tri dana, IL-2, IFNγ i T-ćelijska proliferacija su izmereni koristeći standardne tehnike ELISA i protočne citometrije.

[0508] Rezultati studija biološke aktivnosti su prikazani na SL.12, koja prikazuje nivoe IFN-gama u supernatantima kulture (pg/ml) pri naznačenim koncentracijama testiranih molekula. Kao što je prikazano, reprezentativni testirani naslagani Fc fuzioni molekul PD-L1/CD155 pokazuje poboljšanu aktivnost povećanja proizvodnje IFNg u poređenju sa nenaslaganim kontrolama, što ukazuje na blokadu PD-1 i TIGIT puteva koja dovodi do povećanog signala u poređenju sa blokadom samo jednog puta.

[0509] Opseg predmetnog pronalaska ne treba da bude ograničen na konkretna otkrivena otelotvorenja koja su data, na primer, za ilustrovanje različitih aspekata pronalaska. Različite izmene kompozicija i postupaka koji su opisani će biti poznate na osnovu opisa i razmatranja koja su ovde data.

Claims

Patentni zahtevi

1. Varijanta polipeptida PD-L1, koja sadrži domen IgV ili domen IgV i domen IgC, pri čemu varijanta polipeptida PD-L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju u nemodifikovanom humanom PD-L1 koja odgovara aminokiselinskoj supstituciji N45D sa osvrtom na numeraciju SEQ ID NO:30, pri čemu, varijanta polipeptida PD-L1 se specifično vezuje za ektodomen PD-1 sa povećanim afinitetom u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog humanog PD-L1 za ektodomen PD-1;

pri čemu nemodifikovani PD-L1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u SEQ ID NO:30 ili njen deo koji obuhvata domen IgV ili domen IgV i domen IgC; i pri čemu varijanta polipeptida PD-L1 sadrži sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:30, 55, 309 ili 1728.

2. Varijanta polipeptida PD-L1 iz zahteva 1, pri čemu varijanta PD-L1 sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija izabranih od I20L/N45D, I36T/N45D, D43G/N45D, N45D/V58A, N45D/S75P, N45D/N78I, I20L/I36T/N45D, D43G/N45D/V58A, I20L/E27G/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/A33D/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/D43G/N45D/N78I, V11A/I20L/E27G/D43G/N45D/H51Y/S99G, I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R, I20L/I36T/N45D, A33D/D43G/N45D/V58A/S75P, K23R/D43G/N45D, D43G/N45D/L56Q/V58A/G101G-ins (G101GG), I20L/K23E/D43G/N45D/V58A/N78I, I20L/K23E/D43G/N45D/V50A/N78I, I20L/K28E/D43G/N45D/V58A/Q89R/G101G-ins (G101GG), N45D, N45D/K144E, N45D/P198S, N45D/P198T, N45D/R195G, N45D/R195S, N45D/S131F, N45D/V58D, N45D/I148V/R195G, N45D/K111T/R195G, N45D/N113Y/R195S, N45D/N165Y/E170G, N45D/Q89R/I98V, N45D/S131F/P198S, N45D/S75P/P198S, N45D/V50A/R195T, E27D/N45D/T183A/I188V, K23N/N45D/S75P/N120S, N45D/I148V/R195G/N201D, N45D/K111T/T183A/I188V, N45D/Q89R/F189S/P198S, N45D/T163I/K167R/R195G, N45D/V50A/I119T/K144E, T19A/N45D/K144E/R195G, V11E/N45D/T130A/P198T, V26A/N45D/T163I/T185A, K23N/N45D/L124S/K167T/R195G, K23N/N45D/Q73R/T163I, K28R/N45D/K57E/I98V/R195S, K28R/N45D/V129D/T163N/R195T, M41K/D43G/N45D/R64S/R195G, M41K/D43G/N45D/R64S/S99G, N45D/R68L/F173L/D197G/P198S, N45D/V50A/I148V/R195G/N201D, M41K/D43G/K44E/N45D/R195G/N201D, N45D/V50A/L124S/K144E/L179P/R195G.

3. Varijanta polipeptida PD-L1 iz zahteva 1 ili zahteva 2, pri čemu:

varijanta polipeptida PD-L1 sadrži ekstracelularni domen PD-L1 (ECD); ili varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV i domen IgC; ili

varijanta polipeptida PD-L1 sadrži domen IgV, opciono, pri čemu, domen IgV ili njegov specifični vezujući fragment je jedini deo PD-L1 varijante polipeptida PD-L1.

4. Varijanta polipeptida PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-3, pri čemu varijanta polipeptida PD-L1 sadrži sekvencu aminokiselina koja je data u bilo kom od SEQ ID NO: 66, 82, 101-104, 107, 109-110, 112-113, 115-117, 131, 147, 166-169, 172, 174-175, 177-178, 180-182, 254, 270, 289-292, 295, 297-298, 300-301, 303-305, 1725-1727, 1774-1780, 1785-1793, 1795, 1798-1800, 1802, 1804-1809, 1811-1818, 1863-1869, 1874-1882, 1884, 1887-1889, 1891, 1893-1898, 1900-1907, 1920-1922, 1935-1937, 1953, 1969, 1988-1991, 1994, 1996-1997, 1999-2000, 2002-2004, 2008 ili njen specifični vezujući fragment, ili sekvencu aminokiselina koja pokazuje najmanje 95% identičnosti sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 66, 82, 101-104, 107, 109-110, 112-113, 115-117, 131, 147, 166-169, 172, 174-175, 177-178, 180-182, 254, 270, 289-292, 295, 297-298, 300-301, 303-305, 1725-1727, 1774-1780, 1785-1793, 1795, 1798-1800, 1802, 1804-1809, 1811-1818, 1863-1869, 1874-1882, 1884, 1887-1889, 1891, 1893-1898, 1900-1907, 1920-1922, 1935-1937, 1953, 1969, 1988-1991, 1994, 1996-1997, 1999-2000, 2002-2004, 2008.

5. Varijanta polipeptida PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-4, pri čemu:

varijanta polipeptida PD-L1 je rastvorljivi protein, opciono, pri čemu varijanta polipeptida PD-L1 je vezana za domen multimerizacije.

6. Imunomodulatorni Fc fuzioni protein koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-5 vezan sa Fc domenom ili njegovom varijantom sa smanjenom efektorskom funkcijom.

7. Varijanta polipeptida PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-5, koji je transmembranski imunomodulatorni protein koji dalje sadrži transmembranski domen, opciono pri čemu je transmembranski domen vezan, neposredno ili posredno, sa ekstracelularnim domenom (ECD) ili njegovim specifičnim vezujućim fragmentom iz varijante polipeptida PD-L1, opciono, pri čemu polipeptid PD-L1 dalje sadrži domen citoplazmatske signalizacije.

8. Imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu polipeptid PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-7 vezan, neposredno ili posredno preko linkera, sa drugim polipeptidom koji sadrži domen superfamilije imunoglobulina (IgSF) člana familije IgSF, opciono pri čemu, domen IgSF je afinitetno modifikovani domen IgSF, pri čemu pomenuti afinitetno modifikovani domen IgSF sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom domena IgSF člana familije IgSF i pokazuje izmenjeno vezivanje za jednog ili više srodnih vezujućih partnera u poređenju sa nemodifikovanim ili divljim tipom domena IgSF.

9. Imunomodulatorni protein iz zahteva 8, pri čemu imunomodulatorni protein dalje sadrži domen multimerizacije vezan sa najmanje jednom varijantom polipeptida PD-L1, ili drugim polipeptidom, opciono pri čemu, domen multimerizacije je domen Fc.

10. Konjugat koji je fuzioni protein koji sadrži varijantu polipeptida PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-5, ili imunomodulatorni protein iz bilo kog od zahteva 6, 8 i 9 vezan sa ciljajućim ostatkom koji se specifično vezuje za molekul na površini ćelije, opciono pri čemu, ćelija je imunska ćelija ili tumorska ćelija, i opciono pri čemu, ostatak je antitelo ili antigen vezujući fragment.

11. Molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantu polipeptid PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-5, imunomodulatorni protein iz bilo kog od zahteva 6, 8 i 9 ili konjugat koji je fuzioni protein iz zahteva 10.

12. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 11, opciono pri čemu, vektor je ekspresioni vektor.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži varijantu polipeptida PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-7, imunomodulatorni protein iz bilo kog od zahteva 6, 8 i 9, ili konjugat iz zahteva 10, opciono, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u modulaciji imunskog odgovora kod ispitanika, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži varijantu polipeptida PD-L1 iz bilo kog od zahteva 1-7, imunomodulatorni protein iz bilo kog od zahteva 6, 8 i 9 ili konjugat iz zahteva 10, opciono, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, pri čemu modulacija imunskog odgovora leči bolest ili stanje kod ispitanika.