RS64951B1 - Konjugati leka koji sadrže antitela protiv klaudina 18.2 - Google Patents

Konjugati leka koji sadrže antitela protiv klaudina 18.2

Info

Publication number
RS64951B1
RS64951B1 RS20231193A RSP20231193A RS64951B1 RS 64951 B1 RS64951 B1 RS 64951B1 RS 20231193 A RS20231193 A RS 20231193A RS P20231193 A RSP20231193 A RS P20231193A RS 64951 B1 RS64951 B1 RS 64951B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
cancer
imab362
cells
seq
Prior art date
Application number
RS20231193A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Özlem Türeci
Korden Walter
Maria Kreuzberg
Rita Mitnacht-Kraus
Gall Fabrice Le
Stefan Jacobs
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astellas Pharma Inc, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical Astellas Pharma Inc
Publication of RS64951B1 publication Critical patent/RS64951B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Monoklonska antitela (mAB) su napravila revoluciju u lečenju kancera u poslednje dve decenije (Sliwkowski, M. X. et al. (2013) Science 341 (6151), 1192-1198). Kritična karakteristika mAB je njihova visoka specifičnost i njihova sposobnost da ciljno deluju na tumorske ćelije, označavajući ih za ubijanje posredovano imunološkim efektorskim ćelijama (citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)) i/ili dovodeći do smanjenja proliferacije i apoptoze (Kubota, T. et al. (2009) Cancer Sci. 100 (9), 1566-1572). Konjugacija sa citotoksičnim lekovima može da proširi korisnost mAB i poboljša njihovu potencu i efikasnost (Goldmacher, V. S. et al. (2011) Ther. Deliv. 2 (3), 397-416; Sievers, E. L. (2013) Annu. Rev. Med.64, 15-29).
[0002] Istorijski gledano, upotreba citotoksičnih lekova za lečenje kancera bila je usredsređena na hemoterapije usmerene na ćelije kancera koje se dele. Ova jedinjenja ne deluju ciljno samo na ćelije kancera već i na druge zdrave ćelije koje se dele u telu, a pacijenti koji primaju terapiju doživljavaju ozbiljne neželjene efekte koji ograničavaju dozu. Terapijski indeks (maksimalna tolerisana doza/minimalna efikasna doza) za ove lekove je nizak, što rezultuje uskim terapijskim okvirom (Ismael, G.F.V. et al. (2008) Cancer Treat Rev. 34 (1), 81-91). Da bi se zaobišla ova prepreka u razvoju leka i poboljšao terapijski indeks, antitela mogu da se koriste za isporuku citotoksičnog leka specifično do tumora. Kombinovanjem jedinstvenih mogućnosti ciljnog delovanja antitela sa sposobnošću citotoksičnog leka da ubije kancer, konjugati antitelo-lek (ADC) pokazuju niže neželjene efekte i pružaju širi terapijski okvir u poređenju sa tradicionalnim hemoterapijskim agensima (Gerber, H.-P. et al (2013) Nat. Prod. Rep.30 (5), 625-639).
[0003] ADC su dizajnirani da ubijaju ćelije kancera na način koji zavisi od cilja. Prvi korak u ovom procesu je vezivanje antitela za njegov antigen. Nakon vezivanja ADC, ceo kompleks antigen-ADC se internalizuje i citotoksično opterećenje se oslobađa u ćeliju tumora što dovodi do smrti ćelije. Faktori koji utiču na terapijski indeks za ADC uključuju antitelo, ciljni antigen tumora, citotoksični lek i linker (Panowksi, S. et al. (2014) MAbs 6 (1), 34-45).
[0004] Kao osnovni preduslov za razvoj ADC, ciljni antigen tumora mora da bude lokalizovan na površini ćelije i dostupan cirkulišućem antitelu. Štaviše, selektivnost za tumor i nivo ekspresije ciljnog antigena su kritični parametri za dizajn bezbednih i efikasnih ADC. Trenutno se procenjuju različiti površinski antigeni koji su povezani sa tumorom kao ciljni molekuli za ADC za lečenje kancera (Trail, P. A. (2013) Antibodies 2 (1), 113-129; Teicher, B. A. (2009) Curr. Cancer Drug Targets 9 (8), 982-1004).
[0005] Efikasnost ADC takođe zavisi od citotoksičnog leka. Pošto je količina antitela koja se lokalizuje na tumoru veoma mala u poređenju sa primenjenom dozom, potrebna su toksična jedinjenja sa sub-nanomolarnom potencom. Auristatini i majtanzinoidi su dve klase visoko potentnih citotoksina koji se trenutno koriste u razvoju ADC (Trail, P. A. (2013) Antibodies 2 (1), 113-129). Oba su antimitotički agensi koji blokiraju polimerizaciju tubulina i izazivaju ćelijsku smrt zaustavljanjem ćelijskog ciklusa u G2/M fazi (Lopus, M. et al. (2010) Mol. Cancer Ther. 9 (10), 2689-2699; Francisco, J. A et al. (2003) Blood 102 (4), 1458-1465). Pored specifičnosti mAB i potence leka, linker je važan element u razvoju ADC. Linker treba da bude stabilan da bi iskoristio farmakokinetički poluživot mAB i ne bi trebalo da oslobađa citotoksični lek sve do internalizacije posredovane antigenom. Linkeri mogu da se klasifikuju prema mehanizmu oslobađanja leka: otcepivi linkeri oslobađaju lek hidrolizom ili enzimskim cepanjem nakon internalizacije specifične za antigen, dok neotcepivi linkeri oslobađaju lek putem degradacije mAB u lizozomima nakon internalizacije (Dosio, F. et al. (2011) Toxins (Bazel) 3 (7), S.848-883).
[0006] U zavisnosti od dizajna linkera, membranski permeabilni (lipofilni) toksini koji se oslobađaju unutar ćelija pozitivnih na ciljni molekul mogu da prođu kroz ćelijsku membranu i ubiju druge ćelije koje su u neposrednoj blizini, uključujući susedne ćelije kancera koje ne eksprimiraju antigen („bystander“ efekat) (Kovtun, Y.V. et al. (2006) Cancer Res. 66 (6), 3214-3221). Sposobnost ovih citotoksičnih lekova da posreduju u lokalnom „bystander“ ubijanju ćelija je važan kriterijum selekcije za one ADC usmerene protiv antigena koji su heterogeno eksprimirani u tumorima.
[0007] Molekul čvrste veze klaudin 18 izotip 2 (CLDN18.2) je varijanta splajsovanja klaudina 18 povezana sa kancerom. CLDN18.2 je transmembranski protein od 27.8 kDa koji sadrži četiri domena koja se protežu kroz membranu sa dve male ekstracelularne petlje (petlja 1 obuhvaćena hidrofobnim regionom 1 i hidrofobnim regionom 2; petlja 2 obuhvaćena hidrofobnim regionima 3 i 4). CLDN18.2 je visoko selektivan antigen želudačne loze, eksprimiran isključivo na kratkoživućim diferenciranim epitelnim ćelijama želuca koji ne može da se otkrije u bilo kom drugom normalnom ljudskom tkivu. Antigen je ektopično eksprimiran na značajnim nivoima kod različitih kancera ljudi, uključujući gastroezofagealni kancer i kancer pankreasa (Sahin, U., et al., Clin Cancer Res, 2008. 14(23): p. 7624-34). Protein CLDN18.2 se takođe često otkriva u metastazama u limfnim čvorovima kancera želuca i u udaljenim metastazama. Čini se da je CLDN18.2 uključen u proliferaciju CLDN18.2-pozitivnih tumorskih ćelija, budući da nishodna regulacija ciljnog molekula pomoću siRNA tehnologije dovodi do inhibicije proliferacije ćelija kancera želuca.
[0008] Dokument EP1997832 opisuje pripremu antitela koja se vezuju za CLDN18.2 i predlaže pripremu ADC.
[0009] IMAB362 je himerno monoklonsko antitelo podtipa IgG1 usmereno protiv CLDN18.2, IMAB362 prepoznaje prvi ekstracelularni domen CLDN18.2 sa visokim afinitetom i specifičnošću i ne vezuje se za bilo kog drugog člana porodice klaudina, uključujući blisko srodnu varijantu splajsovanja 1 klaudina 18 (CLDN18.1). Kod humanih ksenotransplantata koji eksprimiraju CLDN18.2 korist preživljavanja i regresija tumora primećeni su kod miševa nakon primene IMAB362. Kada se primenjuje intravenski kod relevantnih životinjskih vrsta, nije primećena toksičnost u tkivu želuca jer ciljni epitop nije dostupan. Međutim, ciljni molekul tumora postaje dostupan za IMAB362 tokom maligne transformacije. IMAB362 objedinjuje četiri nezavisna visoko potentna mehanizma delovanja: (i) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), (ii) citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), (iii) indukciju apoptoze indukovane unakrsnim povezivanjem ciljnog molekula na površini tumora i (iv) direktnu inhibiciju proliferacije. Prethodno ispitivanje faze I je procenilo IMAB362 kao monoterapiju u jednoj dozi kod pacijenata sa kasnim stadijumom gastroezofagealnog kancera. Ova studija pokazuje da je jednokratna primena ovog antitela bezbedna i dobro se toleriše u dozama do 1000 mg/m<2>, budući da se ne mogu uočiti relevantne razlike u profilu AE i drugim bezbednosnim parametrima između doznih grupa (AE = neželjeni događaj). Najbolji rezultati u pogledu antitumorske aktivnosti dobijeni su za grupe od 300 mg/m<2>i 600 mg/m<2>. Sprovedeno je kliničko ispitivanje faze IIa da bi se utvrdila bezbednost, podnošljivost i antitumorska aktivnost ponovljenih doza IMAB362 kod pacijenata sa metastatskom, refraktornom ili rekurentnom bolešću uznapredovalog adenokarcinoma želuca ili donjeg jednjaka što je proveravano histološki.
[0010] Kao što je gore opisano, CLDN18.2 ima ograničen obrazac ekspresije u normalnim ćelijama i stoga se čini da je idealan cilj za terapiju kancera koji eksprimira CLDN18.2 usmerenu antitelima. Shodno tome, postoji potreba za terapijom usmerenom protiv ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 koja je sposobna da ispoljava klinički koristan citotoksični ili citostatski efekat na ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2, posebno bez ispoljavanja neželjenih efekata na ćelije koje ne eksprimiraju CLDN18.2. Poželjno, terapija ne bi trebalo da bude povezana sa nedostacima i neželjenim sporednim efektima koji su obično povezani sa pristupima koji su korišćeni za povećanje terapijske efikasnosti antitela kao što je radioaktivno obeležavanje i kombinacija sa hemoterapijom. Na primer, izotopska terapija je povezana sa mijelosupresijom, a kombinovana terapija sa antitelima i hemoterapeuticima je povezana sa imunosupresijom. Dalje, izotopski obeležene supstance je teško proizvesti, a pacijenti često doživljavaju recidiv nakon početnog tretmana izotopski obeleženim supstancama.
[0011] Predmetni navodi pokazuju postojanje anti-CLDN18.2 monoklonskih antitela koja mogu veoma efikasno da budu internalizovana nakon vezivanja CLDN18.2 na ćelije koje eksprimiraju CLND18.2 i stoga su pogodna za razvoj ADC. Dalje, otkrivena je uspešna konjugacija takvih antitela sa lekovima DM4 i MMAE korišćenjem otcepivih linkera SPDB, odnosno Val-Cit (vc). In vitro, konjugati antitela smanjuju vijabilnost ćelija kancera želuca i pankreasa koje eksprimiraju CLDN18.2. IMAB362-vcMMAE i IMAB362-DM4 se ne vezuju za CLDN18.2-negativne ćelije, niti utiču na njihovu vijabilnost. Oba, DM4 i vcMMAE konjugati ispoljavaju „bystander“ efekte ubijanja CLDN18.2-negativnih ćelija kancera koje su zajedno kultivisane sa CLDN18.2-pozitivnim ćelijama kancera in vitro. Dalje, in vivo, intravenska primena konjugata antitela kod golih miševa sa CLDN18.2-pozitivnim ksenotransplantatima tumora želuca ili pankreasa dovodi do dozno-zavisne inhibicije rasta tumora, koristi preživljavanja, pa čak i potpune regresije ranih i uznapredovalih tumora. Značajni terapijski efekti se primećuju pri intravenskoj primeni pojedinačne doze od ~4-8 mg/kg; optimalni terapijski efekti se postižu na 15-16 mg/kg. Maksimalna tolerisana pojedinačna doza oba konjugata nije mogla da se odredi budući da najveće moguće testirane doze od 15.2 i 16 mg/kg nisu dovele do toksičnosti za jetru ili drugih toksičnih efekata.
[0012] Iz ovde predstavljenih podataka može da se zaključi da su konjugati anti-CLDN18.2 antitelo-lek, kao što su oni koji su ovde opisani, veoma moćni lekovi za lečenje humanih karcinoma pozitivnih na CLDN18.2, kao što su karcinomi želuca i pankreasa.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0013] Predmetni pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
[0014] Pronalazak se zasniva na navodima koji će biti objašnjeni u nastavku:
IZLAGANJE SUŠTINE
[0015] Predmetni navodi generalno obezbeđuju terapiju za efikasno lečenje i/ili prevenciju kancera povezanog sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, kao što je kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave-vrata i kancer žučne kese i njihove metastaze, posebno metastaze kancera želuca kao što su Krukenbergovi tumori, peritonealne metastaze i metastaze u limfnim čvorovima. Posebno poželjne bolesti kancera su adenokarcinomi želuca, jednjaka, kanala pankreasa, žučnih kanala, pluća i jajnika.
[0016] U jednom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za lečenje ili prevenciju kancera koji eksprimira CLDN18.2, koji obuhvata davanje konjugata antitelo-lek koji sadrži antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 kovalentno vezano za najmanje jednu komponentu leka na bazi toksina pacijentu obolelom od kancera.
[0017] Konjugat antitelo-lek se internalizuje u ćelije nakon vezivanja za CLDN18.2 koji ćelije eksprimiraju.
[0018] Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se specifično vezuje za CLDN18.2. Konjugat antitelo-lek se specifično vezuje za CLDN18.2.
[0019] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je monoklonsko, himerno ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je monoklonsko antitelo.
[0020] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se vezuje za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se vezuje za ekstracelularni domen CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se vezuje za prvu ekstracelularnu petlju CLDN18.2.
[0021] U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela koje je proizvedeno i/ili koje može da se dobije iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ili DSM ACC2810, (ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), (iii) antitela koje ima specifičnost antitela pod (i) i (iv) antitela koje sadrži antigen-vezujući deo ili mesto za vezivanje antigena, konkretno varijabilni region, antitela pod (i) i poželjno ima specifičnost antitela pod (i). U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 17 ili 51 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 24 U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 30 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 35. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 15 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 20. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 17 ili 51 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 24 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 30 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 35 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 15 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 20 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. Antitelo koje kompetira sa drugim antitelom za vezivanje za ciljni molekul poželjno je antagonističko prema navedenom drugom antitelu.
[0022] U jednom primeru izvođenja, komponenta leka na bazi toksina prolazi kroz ćelijsku membranu. U jednom primeru izvođenja, komponenta leka na bazi toksina je citotoksični ili citostatski agens. U jednom primeru izvođenja, komponenta leka na bazi toksina je majtanzinoid ili auristatin. U jednom primeru izvođenja, majtanzinoid je izabran iz grupe koja se sastoji od DM1 i DM4. U jednom primeru izvođenja, auristatin je izabran iz grupe koja se sastoji od monometil auristatina E (MMAE) i monometil auristatina F (MMAF).
[0023] Prema pronalasku, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je kovalentno vezano za komponentu leka na bazi toksina pomoću linkera koji može da se otcepi intracelularnom proteazom. U jednom primeru izvođenja, linker je linker koji može da se otcepi katepsinom. U jednom primeru izvođenja, linker sadrži dipeptid. U jednom primeru izvođenja, dipeptid je val-cit ili phe-lis. U jednom primeru izvođenja, antitelo je vezano za linker preko tiola cisteina antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo je vezano za linker preko aminskih grupa, posebno aminskih grupa lizinskih ostataka antitela.
[0024] U jednom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek se primenjuje u količini efikasnoj za lečenje ili prevenciju kancera koji eksprimira CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek se primenjuje u dozi od između 3 do 30 mg/kg telesne težine, kao što je između 4 do 25, 5 do 20, 10 do 18 ili 15 do 16 mg/kg telesne težine. U jednom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek se primenjuje u dozi od između 8 do 150, 9 do 100 ili 9 do 90 mg/m<2>telesne površine humanog pacijenta, kao što je između 12 do 75, 15 do 60, 30 do 54, odnosno 45 do 48 mg/m<2>površine tela humanog pacijenta. U jednom primeru izvođenja, primenjuje se jedna doza konjugata antitelo-lek ili dve ili više doza konjugata antitelo-lek. U jednom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek se primenjuje intravenskom injekcijom.
[0025] U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima dalje obuhvata primenu hirurške operacije, hemoterapije i/ili terapije zračenjem.
[0026] U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 je na površini ćelije ćelija kancera. U jednom primeru izvođenja, kancer je adenokarcinom, posebno uznapredovali adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancera dojke, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera jetre, kancera glave-vrata, kancera žučne kese i njihove metastaze, Krukenbergovog tumora, peritonealne metastaze i/ili metastaze u limfnim čvorovima. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezofagogastričnog prelaza i gastroezofagealnog kancera. U jednom primeru izvođenja, pacijent je HER2/neu negativan pacijent ili pacijent sa HER2/neu pozitivnim statusom, ali koji ne ispunjava uslove za terapiju trastuzumabom.
[0027] U jednom primeru izvođenja, CLDN18.2 ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 1.
[0028] U sledećem aspektu, ovo učenje obezbeđuje konjugat antitelo-lek koji sadrži antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 kovalentno vezano za najmanje jednu komponentu leka na bazi toksina.
[0029] Konjugat antitelo-lek se internalizuje u ćelije nakon vezivanja za CLDN18.2 eksprimiran u ćelijama.
[0030] Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se specifično vezuje za CLDN18.2. Konjugat antitelo-lek se specifično vezuje za CLDN18.2.
[0031] U jednom aspektu, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je monoklonsko, himerno ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela. U jednom aspektu, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je monoklonsko antitelo.
[0032] U jednom aspektu, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se vezuje za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. U jednom aspektu, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se vezuje za ekstracelularni domen CLDN18.2. U jednom aspektu, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 se vezuje za prvu ekstracelularnu petlju CLDN18.2.
[0033] U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela koje je proizvedeno i/ili koje može da se dobije iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ili DSM ACC2810, (ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), (iii) antitela koje ima specifičnost antitela pod (i) i (iv) antitela koje sadrži antigen-vezujući deo ili mesto za vezivanje antigena, konkretno varijabilni region, antitela pod (i) i poželjno ima specifičnost antitela pod (i). U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 17 ili 51 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 24 U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 30 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 35. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 15 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 20. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 17 ili 51 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 24 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 30 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 35 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao CLDN18.2-vezujuće antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 15 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 20 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2. Antitelo koje kompetira sa drugim antitelom za vezivanje za ciljni molekul poželjno je antagonističko prema navedenom drugom antitelu.
[0034] U jednom primeru izvođenja, komponenta leka na bazi toksina prolazi kroz ćelijsku membranu. U jednom primeru izvođenja, komponenta leka na bazi toksina je citotoksični ili citostatski agens. U jednom primeru izvođenja, komponenta leka na bazi toksina je majtanzinoid ili auristatin. U jednom primeru izvođenja, majtanzinoid je izabran iz grupe koja se sastoji od DM1 i DM4. U jednom primeru izvođenja, auristatin je izabran iz grupe koja se sastoji od monometil auristatina E (MMAE) i monometil auristatina F (MMAF).
[0035] Prema pronalasku, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je kovalentno vezano za komponentu leka na bazi toksina pomoću linkera koji može da se otcepi intracelularnom proteazom. U jednom primeru izvođenja, linker je linker koji može da se otcepi katepsinom. U jednom primeru izvođenja, linker sadrži dipeptid. U jednom primeru izvođenja, dipeptid je val-cit ili phe-lis. U jednom primeru izvođenja, antitelo je vezano za linker preko tiola cisteina antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo je vezano za linker preko aminskih grupa, posebno aminskih grupa lizinskih ostataka antitela.
[0036] U jednom primeru izvođenja, CLDN18.2 ima aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 1.
[0037] U sledećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju farmaceutsku formulaciju koja sadrži konjugat antitelo-lek prema navodima, i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač ili ekscipijens.
[0038] U sledećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju medicinski preparat koji sadrži konjugat antitelo-lek prema navodima. U jednom primeru izvođenja, medicinski preparat je prisutan u obliku kompleta koji sadrži posudu koja uključuje konjugat antitelo-lek. U jednom primeru izvođenja, medicinski preparat dalje uključuje štampana uputstva za upotrebu preparata u postupku lečenja ili prevencije kancera, posebno kancera koji eksprimira CLDN18.2.
[0039] U sledećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju konjugat antitelo-lek prema navodima, farmaceutsku kompoziciju prema navodima ili medicinski preparat prema navodima za upotrebu u terapiji, posebno za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju kancera, posebno kancera koji eksprimira CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, postupak za lečenje ili prevenciju kancera je postupak za lečenje kancera koji eksprimira CLDN18.2 prema navodima.
[0040] Ostale karakteristike i prednosti predmetnih navoda biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0041]
Slika 1: Konjugacija antitela sa lekom.
Slika 2: Smanjenje vijabilnosti nakon ko-inkubacije ćelija HEK293~CLDN18.2 sa himernim anti-CLDN18.2 mAb i Fab-ZAP (indirektna evaluacija internalizacije).
Ćelije HEK293~CLDN18.2 su inkubirane 72 h sa anti-CLDN18.2 specifičnim antitelima i saporinom konjugovanim anti-humanim IgG Fab fragmentom (humani Fab-ZAP). Endocitoza IMAB362, chim mAB294, chim mAB308 i chim mAB359 određena je indirektno merenjem vijabilnosti ćelija. Tačke podataka (n=3 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD.
Slika 3: Smanjenje vijabilnosti nakon ko-inkubacije ćelija HEK293~CLDN18.2 sa mišjim anti-CLDN18.2 antitelima i Fab-ZAP (indirektna evaluacija internalizacije).
Ćelije HEK293~CLDN18.2 su inkubirane 72 h sa anti-CLDN18.2 reaktivnim mišjim antitelima i saporinom konjugovanim anti-mišjim IgG Fab fragmentom (mišji Fab-ZAP). Endocitoza različitih anti-CLDN18.2 reaktivnih mišjih antitela je indirektno određena merenjem vijabilnosti ćelija.
Slika 4: Relativni afiniteti vezivanja IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE za CLDN18.2-pozitivne ćelije.
Relativni afiniteti vezivanja konjugata IMAB362-toksin u poređenju sa nekonjugovanim IMAB362 su određeni na ćelijama (A) NUGC-4 10cF7-5 sort3a i (B) DAN-G 1C5F2 ćelijama koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2, (C) NCI-N87~CLDN18.2 i (D) BxPC-3~CLDN18.2 koje ektopično prekomerno eksprimiraju CLDN18.2 pomoću protočne citometrije pri koncentracijama antitela do 20 µg/ml. Tačke podataka (n=2 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD.
Slika 5: Vezivanje IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE posredovano CLDN18.2.
CLDN18.2-posredovano vezivanje konjugata IMAB362-toksin analizirano je na (A) NCI-N87~CLDN18.2 ćelijama koje ektopično prekomerno eksprimiraju CLDN18.2 i na (B) odgovarajućoj CLDN18.2-negativnoj humanoj tumorskoj ćelijskoj liniji pomoću protočne citometrije pri koncentracijama antitelu do 20 µg/ml. Tačke podataka (n=2 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD.
Slika 6: Specifičnosti vezivanja IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE.
Specifičnosti vezivanja konjugata IMAB362-toksin određene su na (A) HEK293-CLDN18.2, (B) HEK293~CLDN18.1 ili (C) HEK293~kontrolnim ćelijama kao negativnoj kontroli. Vezivanje je analizirano protočnom citometrijom pri koncentracijama antitela do 20 µg/ml. Tačke podataka (n=2 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD.
Slika 7: Efekat IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE na vijabilnost ćelijskih linija humanog karcinoma koje eksprimiraju CLDN18.2.
Krive doza-odgovor IMAB362-DM4- i IMAB362-vcMMAE-posredovanog smanjenja vijabilnosti ćelija (A) NUGC-4 10cF7-5 sort 3a, (B) NCI-N87-CLDN18.2 i (C) BxPC-3~CLDN18.2. IMAB362 je korišćen kao negativna kontrola (nema efekta u testovima vijabilnosti pod ovim uslovima). Ćelije su inkubirane 72 h u prisustvu antitela u koncentracijama do 16875 ng/ml. Smanjenje vijabilnosti ćelija je mereno korišćenjem testa vijabilnosti zasnovanog na XTT. Tačke podataka (n=3 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD.
Slika 8: CLDN18.2 zavisnost od IMAB362-vcMMAE-posredovanog smanjenja vijabilnosti tumorskih ćelija.
Zavisnost smanjenja vijabilnosti ćelija posredovanog IMAB362-vcMMAE od prisustva ciljnog molekula određena je na ćelijama NCI-N87 (CLDN18.2-negativne) i NCI-N87~CLDN18.2 ćelijama koje ektopično eksprimiraju ciljni molekul. Ćelije su inkubirane 72 h sa IMAB362-vcMMAE ili nekonjugovanim IMAB362 u koncentracijama do 16875 ng/ml. Poznato je da IMAB362 nema aktivnost pod eksperimentalnim uslovima koji se ovde koriste. Smanjenje vijabilnosti ćelija je mereno korišćenjem testa vijabilnosti zasnovanog na XTT. Tačke podataka (n=3 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD.
Slika 9: Specifičnost smanjenja vijabilnosti ćelija posredovane IMAB362-vcMMAE.
Ciljna specifičnost smanjenja vijabilnosti ćelija posredovanog IMAB362-vcMMAE testirana je sa stabilno transfektovanim HEK293-CLDN18.2, HEK293~CLDN18.1 i HEK293~kontrolom. Ćelije su inkubirane 72 h u prisustvu IMAB362-vcMMAE u koncentracijama do 16875 ng/ml. Smanjenje vijabilnosti ćelija je mereno korišćenjem testa vijabilnosti zasnovanog na XTT. Tačke podataka (n=3 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD.
Slika 10: „Bystander“ aktivnosti IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE.
IMAB362-DM4- i IMAB362-vcMMAE-posredovana indukcija „bystander“ efekata određena je u eksperimentima ko-kulture korišćenjem ćelija PA-1(Luc) (CLDN18.2-negativne/luciferaza-pozitivne) i ćelija NUGC-410cE8 (CLDN18.2-pozitivne/luciferazanegativne). Kao kontrola, ćelije PA-1(Luc) su inkubirane sa IMAB362-DM4- ili IMAB362-vcMMAE. Za tretman, ćelije su kultivisane 4 dana u prisustvu 200 ng/ml IMAB362-DM4, 800 ng/ml IMAB362-vcMMAE ili 800 ng/ml IMAB362. Merena je aktivnost luciferaze.
Slika 11: Inhibicija rasta tumora uznapredovalih tumora ksenotransplantata BxPC-3~CLDN18.2 pomoću IMAB362-DM4.
CLDN18.2-pozitivne ćelije BxPC-3~CLDN18.2 su supkutano transplantirane u bok ženki golih atimičnih miševa. Četrnaestog dana miševi su organizovani u 4 grupe i intravenski im je ubrizgana jedna doza vehikuluma, 7.5 mg/kg, 15 mg/kg IMAB362-DM4 ili ponovljena doza od 15 mg/kg IMAB362-DM4 (14. i 21. dan). Veličina potkožnih tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM). Veličina grupe n=5. SD: pojedinačna doza, RD: ponovljena doza.
Slika 12: Srednja telesna težina miševa tretiranih sa IMAB362-DM4.
Telesna težina golih miševa sa tumorom BxPC-3~CLDN18.2 tretiranih jednom dozom kontrole vehikuluma, 7.5 mg/kg ili 15 mg/kg ili ponovljenim dozama od 15 mg/kg IMAB362-DM4, redom, praćena je dva puta nedeljno. Telesna težina 4 grupe je predstavljena kao srednja vrednost. Veličina grupe n=5.
Slika 13: Parametri kliničke hemije iz primene pojedinačne i ponovljene doze IMAB362-DM4 kod golih miševa sa ksenotransplantatom.
Klinička hemija ženki golih miševa sa tumorom BxPC-3~CLDN18.2 tretiranih intravenski jednom dozom vehikuluma, 7.5 mg/kg, 15 mg/kg IMAB362-DM4 ili ponovljenom dozom od 15 mg/kg IMAB362-DM4 bila je analizirana 49. dana nakon transplantacije. A) Alanin transaminaza (GPT), B) aspartat transaminaza (GOT), C) glutamat dehidrogenaza, D) alkalna fosfataza, E) α-amilaza, F) holinesteraza, G) kreatin kinaza (CK), H) laktat dehidrogenaza (LDH), I) lipaza, J) urea, K) glukoza, L) ukupni protein i M) albumin. Slika 14: Histološka analiza isečaka želuca miševa tretiranih sa IMAB362-DM4 i vehikulumom.
Miševi koji nose tumore ksenotransplantata BxPC-3~CLDN18.2 tretirani su sa IMAB362-DM4. Četrdeset devetog dana nakon transplantacije miševi su žrtvovani, a odabrani organi disekovani i fiksirani formalinom. Isečci ovih FFPE tkiva su obojeni hematoksilineozinom i mikroskopski ispitani na morfološke promene. (A, C) Tkiva želuca reprezentativnog miša iz tretirane grupe sa najvećom izloženošću IMAB362-DM4 (15 mg/kg IMAB362-DM4 14. i 21. dana nakon transplantacije). (B, D) Tkivo želuca miša iz kontrolne grupe tretiranog samo vehikulumom. Uvećanje: videti skalu.
Slika 15: Inhibicija rasta tumora uznapredovalih tumora ksenotransplantata BxPC-3~CLDN18.2 IMAB362-vcMMAE.
CLDN18.2-pozitivne ćelije BxPC-3~CLDN18.2 su supkutano transplantirane u bok ženki golih miševa. Četrnaestog dana, miševi su organizovani u 4 grupe i intravenski im je ubrizgana jedna doza vehikuluma, 8 mg/kg, 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE ili ponovljena doza od 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE (14. i 21. dan). Veličina potkožnih tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM). Veličina grupe n=5.
Slika 16: Srednja telesna težina miševa tretiranih sa IMAB362-vcMMAE.
Telesna težina ženki golih miševa sa tumorom tretiranih jednom dozom kontrole vehikuluma, 8 mg/kg ili 16 mg/kg, ili ponovljenim dozama od 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE je praćena dva puta nedeljno. Telesna težina 4 grupe je predstavljena kao srednja vrednost. Veličina grupe n=5.
Slika 17: Parametri kliničke hemije iz primene pojedinačne i ponovljene doze IMAB362-vcMMAE kod golih miševa sa ksenotransplantatom.
Klinička hemija ženki golih miševa sa tumorom BxPC-3~CLDN18.2 intravenski tretiranih jednom dozom vehikuluma, 8 mg/kg, 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE ili ponovljenom dozom od 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE analizirana je 37. dan nakon transplantacije. A) Alanin transaminaza (GPT), B) aspartat transaminaza (GOT), C) glutamat dehidrogenaza, D) alkalna fosfataza, E) α-amilaza, F) holinesteraza, G) kreatin kinaza (CK), H) laktat dehidrogenaza (LDH), I) lipaza, J) urea, K) glukoza, L) ukupni protein i M) albumin. Slika 18: Dozno-zavisna antitumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE u modelu uznapredovalog ksenotransplantata humanog tumora želuca NCI-N87~CLDN18.2. Ćelije NCI-N87~CLDN18.2 koje ektopično eksprimiraju humani CLDN18.2 su supkutano transplantirane u bok ženki golih miševa. Desetog dana nakon transplantacije, miševi su organizovani u grupe i intravenski im je ubrizgana jedna doza vehikuluma, 3.8, 7.6 ili 15.2 mg/kg IMAB362-DM4 ili 4, 8 ili 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE 13. dana. Druga kontrola grupa je primala ponovljene doze od ~8 mg/kg IMAB362 dva puta nedeljno naizmenično IV i i.p. injekcijama. Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno. Životinje su žrtvovane kada je zapremina tumora prešla 1400 mm<3>ili kada su tumori ulcerirali. Statistička analiza rasta tumora je izvršena korišćenjem Kruskal-Wallisovog i post-hoc Dunn testa. Preživljavanje je analizirano korišćenjem Mantel Cox testa poređenjem kontrolne grupe vehikuluma sa IMAB362-DM4, odnosno IMAB362-vcMMAE. (A-H) Krive rasta tumora, (I, K) srednji rast tumora (± SEM) i (J, L) dijagrami preživljavanja miševa tretiranih kontrolom vehikuluma, IMAB362 ili IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE. Veličina grupe: n=11; *: p<0.05; ***p<0.001. Strelica označava početak tretmana.
Slika 19: Antitumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE u modelu ksenotransplantata ranog humanog tumora želuca NUGC-4 10cF7-5 sort3a.
Ćelije NUGC-4 10cF7-5 sort3a koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 su supkutano transplantirane u bok ženki golih miševa. Trećeg dana, miševi su primili vehikulum, 15.2 mg/kg IMAB362-DM4 ili 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE jednom IV injekcijom. Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno. Životinje su žrtvovane kada je zapremina tumora prešla 1400 mm<3>ili kada su tumori ulcerirali ili nakon unapred definisanog perioda posmatranja od 120 dana. Statistička analiza rasta tumora je izvršena korišćenjem Kruskal-Wallisovog i post-hoc Dunn testa. Preživljavanje je analizirano korišćenjem Mantel Cox testa. (A-C) Krive rasta tumora, (D) srednji rast tumora (± SEM) i (E, F) dijagrami preživljavanja miševa tretiranih kontrolom vehikuluma, IMAB362-DM4 ili IMAB362vcMMAE. Veličina grupe: n=10; ***: p<0.001; ****: p<0.0001. Strelica označava vremensku tačku tretmana.
Slika 20: Dozno-zavisna antitumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE u modelu uznapredovalog ksenotransplantata humanog tumora pankreasa BxPC-3~CLDN18.2.
Ćelije BxPC-3~CLDN18.2 koje ektopično eksprimiraju humani CLDN18.2 su supkutano transplantirane u bok ženki golih miševa. Trinaestog dana miševi su organizovani u grupe i intravenski im je ubrizgana jedna doza vehikuluma, 3.8, 7.6 ili 15.2 mg/kg IMAB362-DM4 ili 4, 8 ili 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE 14. dana. Miševi iz kontrolne grupe antitela su primili ~8 mg/kg nekonjugovanog IMAB362 dva puta nedeljno naizmenično IV i i.p. injekcijom. Veličina tumora je merena dva puta nedeljno. Životinje su žrtvovane kada je zapremina tumora prešla 1400 mm<3>ili kada su tumori ulcerirali. Statistička analiza rasta tumora je izvršena korišćenjem Kruskal-Wallisovog i post-hoc Dunn testa. Preživljavanje je analizirano korišćenjem Mantel Cox testa upoređivanjem kontrolne grupe vehikuluma sa IMAB362-DM4, odnosno IMAB362-vcMMAE. (A-H) Krive rasta tumora (I, K) srednji rast tumora (± SEM) i (J, L) dijagrami preživljavanja miševa tretiranih kontrolom vehikuluma, IMAB362, IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE. Veličina grupe: n=11; p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ****: p<0.0001. Strelica označava vremensku tačku tretmana.
Slika 21: Anti-tumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE u modelu ranog ksenotransplantata humanog tumora pankreasa DAN-G 1C5F2.
Ćelije DAN-G 1C5F2 koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 su supkutano transplantirane u bok ženki golih miševa. Trećeg dana nakon presađivanja, miševi su tretirani jednom IV injekcijom kontrole vehikuluma, 15.2 mg/kg IMAB362-DM4 ili 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE. Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno. Životinje su žrtvovane kada su miševi izgubili više od 10% telesne težine zbog kaheksije kancera, kada su tumori ulcerirali ili nakon unapred definisanog perioda posmatranja od 120 dana. Statistička analiza rasta tumora je izvršena korišćenjem Kruskal-Wallisovog i post-hoc Dunn testa. Preživljavanje je analizirano korišćenjem Mantel Cox testa. (A-C) Krive rasta tumora, (D) srednji rast tumora (± SEM) i (E, F) dijagrami preživljavanja miševa tretiranih kontrolom vehikuluma, IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE. Veličina grupe: n=10; **: p<0.01; ***: p<0.001. Strelica označava vremensku tačku tretmana.
Slika 22: Histološka analiza isečaka želuca miševa tretiranih sa IMAB362-vcMMAE i vehikulumom.
Miševi koji nose ksenotransplantate tumora BxPC-3~CLDN18.2 tretirani su sa IMAB362-vcMMAE. Trideset sedmog dana nakon transplantacije miševi su žrtvovani, a odabrani organi disekovani i fiksirani formalinom. Isečci ovih FFPE tkiva su obojeni hematoksilineozinom i mikroskopski ispitani na morfološke promene. (A, C) Tkivo želuca reprezentativnog miša iz tretirane grupe sa najvećom izloženošću IMAB362-vcMMAE (16 mg/kg IMAB362-vcMMAE 14. i 21. dan nakon transplantacije). (B, D) Tkivo želuca miša kontrolne grupe tretirano samo vehikulumom. Uvećanje: videti skalu.
Slika 23: Indukcija apoptoze pomoću IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE.
IMAB362-DM4- i IMAB362-vcMMAE-posredovana indukcija apoptoze određena je merenjem aktivnosti kaspaze 3/7 i bojenjem aneksinom V korišćenjem ćelija NUGC-4 10cE8 pozitivnih na ciljni molekul. A) Aktivnost kaspaze 3/7 je analizirana nakon što su ćelije inkubirane 3 dana u prisustvu 2.5 µg/ml antitela IMAB362 (n=3 replikata, srednja vrednost ± SD). B) Protočna citometrijska analiza ćelija obojenih sa aneksinom V i propidijum jodidom (PI) izvedena je 4 dana nakon tretmana sa 2.5 µg/ml antitela IMAB362 (n=3 replikata). Netretirane ćelije su služile kao kontrola.
Slika 24: Antitumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE u modelu uznapredovalog ksenotransplantata humanog tumora želuca NUGC-4 10cF7-5 sort3a.
Ćelije NUGC-4 10cF7-5 sort3a koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 su supkutano transplantirane u bok ženki golih miševa. Desetog dana, miševi su primili vehikulum, 15.2 mg/kg IMAB362-DM4 ili 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE jednom IV injekcijom. Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno. Životinje su žrtvovane kada je zapremina tumora prešla 1400 mm3, kada su tumori ulcerirali ili nakon unapred definisanog perioda posmatranja od 120 dana. Statistička analiza rasta tumora je izvršena korišćenjem Kruskal-Wallisovog i post-hoc Dunn testa. Preživljavanje je analizirano korišćenjem Mantel Cox testa. (A-C) Krive rasta tumora, (D) srednji rast tumora (± SEM) i (E, F) dijagrami preživljavanja miševa tretiranih kontrolom vehikuluma, IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE. Veličina grupe: n=10; *: p<0.05; ***: p<0.001. Strelica označava vremensku tačku tretmana.
Slika 25: ADCC posredovana antitelima IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE na ćelijama humanog kancera koje eksprimiraju CLDN18.2.
A) Krive doza-odgovor za ADCC posredovanu antitelima IMAB362-DM4 (puni crni krugovi), IMAB362-vcMMAE (puni crni trouglovi) i IMAB362 (prazni crni kvadrati) na ćelijama NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 humanog karcinoma želuca koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Eksperimenti su izvedeni korišćenjem odnosa efektora prema ciljnom molekulu od -40:1. Tačke podataka (n=4 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD. B) Protočna citometrijska analiza ekspresije CLDN18.2 na ćelijama NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10. Histogram popunjen sivom bojom: anti-CLDN18.2 (IMAB362, 50 µg/ml). Crna tačkasta linija: izotipska kontrola.
Slika 26: CDC posredovana antitelima IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE na ćelijama humanog kancera koje eksprimiraju CLDN18.2. A) Krive doza-odgovor CDC posredovane antitelima IMAB362-DM4 (puni crni krugovi), IMAB362-vcMMAE (puni crni trouglovi) i IMAB362 (prazni crni kvadrati) na ćelijama humanog karcinoma želuca KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25 (levo) i NUGC-410cF7_5 sort3a p3151#10 (desno) koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Ciljne ćelije koje eksprimiraju luciferazu su inkubirane 90 minuta sa 20% humanog seruma (pul dobijen od zdravih humanih davalaca) i odgovarajućim antitelima u naznačenim koncentracijama. Tačke podataka (n=3 replikata) su prikazane kao srednja vrednost ± SD. B) Protočne citometrijske analize ekspresije CLDN18.2 na ćelijama KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25 (levo) i NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 (desno). Histogram popunjen sivom bojom: anti-CLDN18.2 (IMAB362, 50 µg/ml). Crna tačkasta linija: izotipska kontrola.
DETALJAN OPIS
[0042] Pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0043] Iako su predmetni navodi u nastavku detaljno opisani, podrazumeva se da ovi navodi nisu ograničeni na određene metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, jer oni mogu da variraju. Takođe se podrazumeva da ovde korišćena terminologija služi samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da ograničava obim predmetnog navoda koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja koja uobičajeno podrazumeva stručnjak u ovoj oblasti.
[0044] U nastavku dokumenta, biće opisani elementi predmetnih navoda. Ovi elementi su nabrojani sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, podrazumeva se da mogu da budu kombinovani na bilo koji način i u bilo kom broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Različito opisani primeri i poželjni primeri izvođenja ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju predmetne navode samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba razumeti tako da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem opisanih i/ili poželjnih elemenata. Štaviše, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati otkrivenim u opisu ove prijave osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.
[0045] Poželjno, ovde korišćeni termini su definisani kao što je opisano u „A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)“, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).
[0046] Izvođenje predmetnih navoda koristiće, ukoliko nije naznačeno drugačije, konvencionalne postupke hemije, biohemije, biologije ćelije, imunologije i tehnika rekombinantne DNK koje su opisane u literaturi iz ove oblasti (videti, npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0047] Kroz ovu specifikaciju i patentne zahteve koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrže“, i varijacije kao što su „sadrži“ i „koji sadrži“, podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takvi drugi članovi, celi brojevi ili koraci ili grupe članova, celih brojeva ili koraka mogu da budu isključeni, tj. predmet se sastoji u uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Treba shvatiti da navođenje termina u jednini upotrebljeno u kontekstu opisa navoda (naročito u kontekstu patentnih zahteva) obuhvata i jedninu i množinu, ukoliko nije ovde naznačeno drugačije ili jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Predviđeno je da nabrajanje opsega vrednosti ovde služi samo kao skraćeni postupak za pojedinačno označavanje svake zasebne vrednosti koja se nalazi unutar opsega. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom, ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili na drugi način jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Upotreba bilo kog ili svih primera, ili jezički označenog primera (npr. „kao što je“), koja je ovde data, predviđena je samo da bolje ilustruje navode i ne predstavlja ograničenje obima navoda za koje se inače traži zaštita. Nikakvi jezički termini u specifikaciji ne treba da budu shvaćeni kao da naznačuju element za koji nije tražena zaštita koji je esencijalan za izvođenje navoda.
[0048] Klaudini su porodica proteina koji su najvažnije komponente čvrstih veza, gde uspostavljaju paraćelijsku barijeru koja kontroliše protok molekula u međućelijskom prostoru između ćelija epitela. Klaudini su transmembranski proteini koji prolaze kroz membranu 4 puta sa N-terminalnim i C-terminalnim krajem koji se nalaze u citoplazmi. Prva ekstracelularna petlja ili domen se sastoji u proseku od 53 aminokiseline, a druga ekstracelularna petlja ili domen se sastoji od oko 24 aminokiseline. Proteini ćelijske površine porodice klaudina, kao što je CLDN18.2, eksprimirani su u tumorima različitog porekla, i posebno su pogodni kao ciljne strukture u vezi sa imunoterapijom kancera posredovanom antitelom zbog njihove selektivne ekspresije (bez ekspresije u normalnom tkivu relevantnom za toksičnost) i lokalizacije na plazma membrani.
[0049] Termin „CLDN“, kako se ovde koristi, označava klaudin i uključuje CLDN18.2. Poželjno, klaudin je humani klaudin.
[0050] Termin „CLDN18“ odnosi se na klaudin 18 i uključuje bilo koje varijante, uključujući varijantu 1 klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (klaudin 18.1 (CLDN18.1)) i varijantu 2 klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (klaudin 18.2 (CLDN18.2)).
[0051] Termin „CLDN18.2“ poželjno se odnosi na humani CLDN18.2, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 1 iz listinga sekvenci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence. Prva ekstracelularna petlja ili domen molekula CLDN18.2 poželjno sadrži aminokiseline 27 do 81, poželjnije aminokiseline 29 do 78 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1. Druga ekstracelularna petlja ili domen molekula CLDN18.2 poželjno sadrži aminokiseline 140 do 180 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1. Navedena prva i druga ekstracelularna petlja ili domen poželjno obrazuju ekstracelularni deo ili domen molekula CLDN18.2.
[0052] CLDN18.2 se selektivno eksprimira u normalnim tkivima u diferenciranim epitelnim ćelijama sluznice želuca. CLDN18.2 se eksprimira u kancerima različitog porekla kao što su karcinom pankreasa, karcinom jednjaka, karcinom želuca, bronhijalni karcinom, karcinom dojke i tumori uha, nosa i grla (ENT). CLDN18.2 je važno ciljno mesto za prevenciju i/ili lečenje primarnih tumora, kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave i vrata i kanceri žučne kese i njihove metastaze, posebno metastaze kancera želuca kao što su Krukenbergovi tumori, peritonealne metastaze i metastaze u limfnim čvorovima.
[0053] Termin „CLDN18.1“ se poželjno odnosi na humani CLDN18.1, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2 iz listinga sekvenci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.
[0054] Termin „varijanta“ prema navodima se odnosi, naročito, na mutante, varijante nastale alternativnim splajsovanjem, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Potpuno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline poreklom od vrste drugačije od one od koje potiče data sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline. Termin „varijanta“ obuhvataće bilo koje posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.
[0055] Prema navodima, termin „kancer koji eksprimira CLDN18.2“ ili „CLDN18.2-pozitivni kancer“ označava kancer koji uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, poželjno na površini pomenutih ćelija kancera.
[0056] „Ćelijska površina“ je korišćena u skladu sa njenim normalnim značenjem u tehnici, i stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje od strane proteina i drugih molekula.
[0057] CLDN18.2 je eksprimiran na površini ćelija ukoliko je lociran na površini pomenutih ćelija i dostupan je za vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima koja su dodata ćelijama.
[0058] Termin „ekstracelularni deo“ ili „ekstracelularni domen“ u kontekstu predmetnih navoda odnosi se na deo molekula kao što je protein koji je okrenut prema ekstracelularnom prostoru ćelije i poželjno je dostupan sa spoljašnje strane navedene ćelije, npr. antigen-vezujućim molekulima, kao što su antitela koja se nalaze van ćelije. Poželjno, termin se odnosi na jednu ili više ekstracelularnih petlji ili domena ili njihov fragment.
[0059] Prema navodima, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije niži od ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca. Poželjno, nivo ekspresije je niži od 10%, poželjno niži od 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% ili 0.05% ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca, ili čak niži. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko nivo ekspresije ne prelazi nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu različitom od želuca za više od 2 puta, poželjno 1.5 put, i poželjno ne prelazi nivo ekspresije u pomenutom ne-kanceroznom tkivu. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije ispod granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije suviše nizak da bi omogućio vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama.
[0060] Prema navodima, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko nivo ekspresije prelazi nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu različitom od želuca, poželjno za više od 2 puta, poželjno 10 puta, 100 puta, 1000 puta, ili 10000 puta. Poželjno, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije iznad granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije dovoljno visok da omogući vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama. Poželjno, CLDN18.2 eksprimiran u ćeliji je eksprimiran ili izložen na površini pomenute ćelije.
[0061] Termin „bolest“ se odnosi na abnormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest se često tumači kao medicinsko stanje povezano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može da bude uzrokovana faktorima koji potiču iz spoljašnjeg izvora, kao što je zarazna bolest, ili može da bude uzrokovana unutrašnjim disfunkcijama, kao što su autoimune bolesti. Kod ljudi, „bolest“ se često koristi u širem smislu za bilo koje stanje koje uzrokuje bol, disfunkciju, uznemirenost, socijalne probleme ili smrt pojedincu koji je oboleo, ili slične probleme za one u kontaktu sa tom osobom. U ovom širem smislu, ponekad uključuje povrede, invaliditet, poremećaje, sindrome, infekcije, izolovane simptome, devijantno ponašanje i atipične varijacije strukture i funkcije, dok se u drugim kontekstima i za druge svrhe oni mogu smatrati prepoznatljivim kategorijama. Bolesti obično utiču na pojedince ne samo fizički, već i emocionalno, jer dobijanje mnogih bolesti i život sa njima mogu da promene nečiju perspektivu života i nečiju ličnost. Prema navodima, termin „bolest“ uključuje kancer, naročito one oblike kancera opisane ovde. Bilo koja referenca ovde na kancer ili naročite oblike kancera takođe uključuje njegove metastaze. U poželjnom primeru izvođenja, bolest koja se tretira prema predmetnom pronalasku uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2.
[0062] „Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2“ ili „bolest povezana sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2“ ili slični izrazi označavaju prema navodima da je CLDN18.2 eksprimiran u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 u ćelijama bolesnog tkiva ili organa je povećana u odnosu na stanje u odgovarajućem zdravom tkivu ili organu. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se javlja samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u odgovarajućem zdravom tkivu sprečena. Prema navodima, bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 uključuju bolesti kancera. Dodatno, prema navodima, bolesti kancera su poželjno one gde ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2.
[0063] Termini „oboljenje kancera“ ili „kancer“ odnose se ili opisuju fiziološko stanje kod pojedinca koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Tačnije, primeri takvih kancera uključuju kancer kostiju, kancer krvi, kancer pluća, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, karcinom polnih i reproduktivnih organa, Hočkinovu bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer štitne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), neuroektodermalni kancer, tumore kičmene moždine, gliom, meningiom i adenom hipofize. Termin „kancer“ prema navodima obuhvata i metastaze kancera. Poželjno, „oboljenje kancera“ se karakteriše ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, i ćelija kancera eksprimira CLDN18.2. Ćelija koja eksprimira CLDN18.2 je poželjno ćelija kancera, poželjno ovde opisanih kancera.
[0064] Prema navodima, termin „tumor“ ili „oboljenje tumora“ se odnosi na abnormalni rast ćelija (koje se nazivaju neoplastične ćelije, tumorigene ćelije ili tumorske ćelije) koje poželjno formiraju otok ili leziju. Pod „tumorskom ćelijom“ se podrazumeva abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon što prestanu stimulansi koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimični ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i obično formiraju posebnu masu tkiva, koja može da bude benigna, predmaligna ili maligna. Prema navodima, „oboljenje kancera“ je poželjno „oboljenje tumora“. Međutim, generalno, termini „kancer“ i „tumor“ se ovde koriste kao sinonimi.
[0065] U jednom primeru izvođenja, kancer prema navodima uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, kancer je pozitivan na CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 je na površini ćelija. U jednom primeru izvođenja, najmanje 50%, poželjno 60%, 70%, 80% ili 90% ćelija kancera je pozitivno na CLDN18.2 i/ili najmanje 40%, poželjno najmanje 50% ćelija kancera je pozitivno za površinsku ekspresiju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, najmanje 95% ili najmanje 98% ćelija kancera je pozitivno na CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% ćelija kancera je pozitivno na površinsku ekspresiju CLDN18.2.
[0066] U jednom primeru izvođenja, kancer koji eksprimira CLDN18.2, kancer koji uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 ili CLDN18.2-pozitivan kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera jetre, kancera glave i vrata i kancera žučne kese i njihovih metastaza, posebno metastaza kancera želuca kao što su Krukenbergovi tumori, peritonealna metastaza i metastaza u limfnim čvorovima. U jednom primeru izvođenja, kancer je adenokarcinom, posebno uznapredovali adenokarcinom. Posebno poželjna oboljenja kancera su adenokarcinomi želuca, jednjaka, kanala pankreasa, žučnih kanala, pluća i jajnika. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezofagogastričnog prelaza i gastroezofagealnog kancera. U posebno poželjnom primeru izvođenja, kancer je gastroezofagealni kancer kao što je metastatski, refraktorni ili rekurentni uznapredovali gastroezofagealni kancer.
[0067] Prema navodima, „karcinom“ je maligni tumor koji potiče od epitelnih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući uobičajene oblike kancera dojke, prostate, pluća i debelog creva.
[0068] „Adenokarcinom“ je kancer koji je poreklom iz žlezdanog tkiva. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznatog kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i različito drugo tkivo koje oivičava šupljine i organe tela. Epitel vodi embrionalno poreklo iz ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi bile klasifikovane kao adenokarcinom, ćelije ne moraju obavezno da budu deo žlezde, sve dok imaju sekretorne osobine. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi teže sličnosti sa žlezdanim tkivom iz koga potiču, dok slabo diferencirani ne moraju. Bojenjem ćelija iz biopsije, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela usled sveprisutnosti žlezda u telu. Iako svaka žlezda ne mora izlučivati istu supstancu, sve dok postoji egzokrina funkcija ćelije, smatra se žlezdanom i stoga je njen maligni oblik nazvan adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi vrše invaziju drugih tkiva i često metastaziraju ukoliko im je dato dovoljno vremena. Adenokarcinom jajnika je najčešći tip karcinoma jajnika. Uključuje serozne i mucinozne adenokarcinome, adenokarcinom bistrih ćelija i endometrioidni adenokarcinom.
[0069] Pod „metastazom“ se podrazumeva širenje ćelija kancera sa njihovog originalnog mesta u drugi deo tela. Formiranje metastaze je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstracelularnog matriksa, penetracije endotelnih bazalnih membrana da bi ćelije ušle u telesne šupljine i sudove, i zatim, nakon transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaze tumora se često dešavaju čak i nakon uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu da ostanu i razviju metastazni potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin „metastaza“ prema navodima odnosi se na „udaljenu metastazu“ koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnog čvora. U jednom primeru izvođenja, termin „metastaza“ prema navodima se odnosi na metastaze limfnih čvorova. Jedan naročiti oblik metastaze koji može da se leči terapijom prema navodima je metastaza poreklom od kancera želuca kao primarnog mesta. U poželjnim primerima izvođenja takva metastaza kancera želuca su Krukenbergovi tumori, peritonealna metastaza i/ili metastaza limfnog čvora.
[0070] Krukenbergov tumor je neuobičajeni metastazirani tumor jajnika koji čini 1% do 2% svih tumora jajnika. Prognoza Krukenbergovog tumora je još uvek veoma loša i ne postoji ustanovljeni tretman za Krukenbergove tumore. Krukenbergov tumor je metastazni adenokarcinom ćelija tipa pečatnog prstena jajnika. Želudac je u većini slučajeva primarno mesto Krukenbergovog tumora (70%). Karcinomi debelog creva, slepog creva i dojke (uglavnom invazivni lobularni karcinom) su sledeća najčešća primarna mesta. Registrovani su retki slučajevi Krukenbergovog tumora poreklom od karcinoma žučne kese, žučnog kanala, pankreasa, tankog creva, ampule Vateri, grlića materice i mokraćne bešike/urahusa. Interval između dijagnoze primarnog karcinoma i naknadnog otkrivanja uključenosti jajnika je obično 6 meseci ili manje, ali su registrovani i duži periodi. U mnogim slučajevima, primarni tumor je veoma mali i može da ostane neprimećen pri detekciji. Istorija prethodnog karcinoma želuca ili drugog organa može da se dobije u samo 20% do 30% slučajeva.
[0071] Pacijenti sa Krukenbergovim tumorima imaju ukupnu stopu mortaliteta koja je značajno visoka. Većina pacijenata umre u roku od 2 godine (srednje preživljavanje, 14 meseci). Nekoliko studija pokazuje da je prognoza loša kad je primarni tumor identifikovan nakon otkrivanja metastaziranja u jajnik, i prognoza postaje lošija ukoliko primarni tumor ostaje neotkriven.
[0072] U literaturi nije jasno ustanovljena nikakva optimalna strategija tretmana Krukenbergovih tumora. Nije adekvatno obrađeno ni to da li treba da se izvede hirurška resekcija. Hemoterapija ili radioterapija nema značajan efekat na prognozu za pacijente sa Krukenbergovim tumorima.
[0073] Termin „(terapijski) tretman“, posebno u vezi sa lečenjem kancera kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji tretman koji ima za cilj poboljšanje zdravstvenog statusa i/ili prolongiranje (produžavanje) životnog veka pacijenta. Navedeni tretman može da eliminiše kancer, smanji veličinu ili broj tumora kod pacijenta, zaustavi ili uspori razvoj kancera kod pacijenta, inhibira ili uspori razvoj novog kancera kod pacijenta, smanji učestalost ili težinu simptoma kod pacijenta, i/ili smanji recidive kod pacijenta koji trenutno ima ili je ranije imao kancer. (Terapijski) tretman kancera može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od hirurške operacije, hemoterapije, terapije zračenjem i ciljane terapije.
[0074] Termin „hirurška operacija“, kako se ovde koristi, uključuje uklanjanje tumora operacijom. To je uobičajeni tretman za kancer. Hirurg može ukloniti tumore koristeći lokalnu eksciziju.
[0075] Termin „hemoterapija“, kako se ovde koristi, odnosi se na upotrebu hemoterapijskih agenasa ili kombinacija hemoterapijskih agenasa, poželjno da bi se zaustavio rast ćelija kancera, bilo ubijanjem ćelija ili zaustavljanjem njihove deobe. Kada se hemoterapija uzima na usta ili se ubrizgava u venu ili mišić, lekovi ulaze u krvotok i mogu da dospeju do ćelija kancera u celom telu (sistemska hemoterapija). Kada se hemoterapija dostavlja direktno u cerebrospinalnu tečnost, organ ili telesnu šupljinu kao što je abdomen, lekovi uglavnom utiču na ćelije kancera u tim oblastima (regionalna hemoterapija).
[0076] Hemoterapijski agensi prema navodima uključuju citostatska jedinjenja i citotoksična jedinjenja. Tradicionalni hemoterapijski agensi deluju tako što ubijaju ćelije koje se brzo dele, što je jedno od glavnih svojstava većine ćelija kancera. To znači da hemoterapija takođe šteti ćelijama koje se brzo dele pod normalnim okolnostima, kao što su ćelije koštane srži, digestivnog trakta i folikula dlake. Ovo dovodi do najčešćih neželjenih efekata hemoterapije. Prema navodima, termin „hemoterapija“ poželjno ne uključuje antitela usmerena na proteine koji su abnormalno eksprimirani u ćelijama kancera (tumorski antigeni kao što je CLDN18.2) i deluju putem regrutovanja imunološkog sistema pacijenta da uništi ćelije tumora. Antitela usmerena na proteine koji su abnormalno eksprimirani u ćelijama kancera (tumorski antigeni kao što je CLDN18.2) i deluju putem terapijske komponente ili agensa konjugovanog sa antitelom, međutim, mogu se posmatrati kao oblik hemoterapije. Međutim, u najstrožem smislu, pojam „hemoterapija“ prema navodima ne uključuje ciljanu terapiju.
[0077] Prema navodima, termin „ciljana terapija“ se odnosi na bilo koju terapiju koja se može koristiti za ciljno delovanje prvenstveno na obolele ćelije, kao što su ćelije kancera, dok na ćelije koje nisu obolele nema ciljnog delovanja ili se ciljno delovanje ispoljava u manjoj meri. Ciljno delovanje na obolele ćelije poželjno rezultuje ubijanjem i/ili oštećenjem proliferacije ili vijabilnosti obolelih ćelija. Takva terapija uključuje i) antitela, fragmente antitela i proteine koji su ili goli ili konjugovani sa terapijskom komponentom koji su usmereni određene ciljne molekule ćelijske površine na obolelim ćelijama, kao što su tumorski antigeni, na primer, CLDN18.2, (npr. antitela ili konjugati antitela protiv CLDN18.2 kako je ovde opisano) ili ii) male molekule koji narušavaju proliferaciju ili vijabilnost obolelih ćelija. U specifičnom primeru izvođenja, agens se vezuje za antigen koji se eksprimira na većem nivou kod obolelih nego kod normalnih matičnih ćelija. U specifičnom primeru izvođenja, agens se specifično vezuje za tumorski antigen. Tradicionalna hemoterapija ili radioterapija se ne smatra „ciljanom terapijom“ uprkos tome što je često usmerena na tumore. Dalje, termin „terapija antitelima“ prema navodima poželjno ne uključuje terapiju antitelima, njihovim fragmentima ili derivatima koji su konjugovani sa terapijskom komponentom, već se samo odnosi na terapiju antitelima, njihovim fragmentima ili derivatima koji deluju putem regrutovanja imunološkog sistema pacijenta da uništi tumorske ćelije.
[0078] U kontekstu predmetnih navoda, termini kao što su „zaštiti“, „sprečiti“ ili „profilaktički“ odnose se na prevenciju pojave i/ili širenja bolesti kod subjekta i, posebno, na minimiziranje mogućnosti da će subjekt razviti bolest ili na odlaganje razvoja bolesti. Na primer, subjekt u riziku od kancera bi bio kandidat za terapiju za prevenciju kancera.
[0079] Pod pojmom „biti u riziku“ podrazumeva se subjekt za koga je utvrđeno da ima verovatnoću veću od normalne za razvoj bolesti, posebno kancera, u poređenju sa opštom populacijom. Pored toga, subjekt koji je imao ili trenutno ima bolest, posebno kancer, je subjekt koji ima povećan rizik za razvoj bolesti, jer kod takvog subjekta bolest može da nastavi da se razvija. Subjekti koji trenutno imaju, ili su imali, kancer takođe imaju povećan rizik od metastaza kancera.
[0080] Termini „pojedinac“ i „subjekat“ se ovde koriste kao sinonimi. Oni se odnose na ljudska bića, primate koji nisu ljudi ili druge sisare (npr. miš, pacov, zec, pas, mačka, goveda, svinja, ovca, konj ili primat) koji mogu da budu pogođeni bolešću ili su podložni bolesti ili poremećaju (npr. kancer), ali mogu i ne moraju da imaju bolest ili poremećaj. U mnogim primerima izvođenja, pojedinac je ljudsko biće. Osim ako nije drugačije navedeno, termini „pojedinac“ i „subjekt“ ne označavaju određeni uzrast, pa tako obuhvataju odrasle, starije, decu i novorođenčad. U poželjnim primerima izvođenja ovih navoda, „pojedinac“ ili „subjekt“ je „pacijent“. Izraz „pacijent“ označava prema navodima subjekta za lečenje, posebno obolelog subjekta.
[0081] Termin „antigen“ odnosi se na agens kao što je protein ili peptid koji sadrži epitop protiv koga je usmeren imuni odgovor i/ili treba da bude usmeren. U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen povezan sa tumorom, kao što je CLDN18.2, tj., konstituent ćelija kancera koji može da potiče iz citoplazme, površine ćelije i jedra ćelije, naročito antigeni koji su proizvedeni, poželjno u velikim količinama, intracelularno ili kao antigeni na ćelijama kancera.
[0082] U kontekstu predmetnih navoda, termin „antigen povezan sa tumorom“ ili „tumorski antigen“ poželjno se odnosi na proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima, i eksprimirani su, ili aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U kontekstu predmetnih navoda, antigen povezan sa tumorom je poželjno povezan sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno nije ili je samo retko eksprimiran u normalnim tkivima.
[0083] Termin „epitop“ se odnosi na antigenu determinantu u molekulu, tj., na deo u molekulu koji je prepoznat od strane imunog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane antitela. Na primer, epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja su prepoznata od strane imunog sistema. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i ne-konformacioni epitopi razlikuju se po tome što je vezivanje za prvo pomenuti, ali ne za poslednje navedeni, izgubljeno u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop proteina kao što je CLDN18.2 poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina, na primer, epitop može da bude poželjno 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina dužine.
[0084] Termin „antitelo“ uključuje glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, i bilo koji molekul koji sadrži antigenvezujući deo takvog glikoproteina. Termin „antitelo“ uključuje monoklonska antitela rekombinantna antitela, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, molekule koji sadrže vezujuće fragmente ili derivate antitela, uključujući, bez ograničenja, jednolančana antitela, npr. scFv i antigen-vezujuće fragmente antitela kao što su Fab i Fab’ fragmenti i takođe uključuje sve rekombinantne oblike antitela, npr. antitela eksprimirana u prokariotima, neglikozilovana antitela, i bilo koje antigen-vezujuće fragmente i derivate antitela kao što su ovde opisani. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde označen skraćenicom VH) i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde označen skraćenicom VL) i konstantni region lakog lanca. VH i VL regioni mogu se dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), naizmenično poređane sa regionima koji su više konzervisani, označenim kao okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR i četiri FR regiona, raspoređena od amino-kraja ka karboksi-kraju sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0085] Termin „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na preparat molekula antitela jedinstvene molekulske kompozicije. Monoklonsko antitelo prikazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet. U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela su proizvedena u hibridomu koji uključuje B ćeliju dobijenu iz životinje koja nije čovek, npr. miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.
[0086] Termin „rekombinantno antitelo“, kako se ovde koristi, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim načinima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna u odnosu na imunoglobulinske gene ili hibridom pripremljen od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane tako da eksprimira antitelo, npr. iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim načinima koji uključuju splajsovanje sekvenci imunoglobulinskih gena sa drugim DNK sekvencama.
[0087] Predviđeno je da termin „humano antitelo“, kako je ovde korišćen, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione poreklom iz sekvenci imunoglobulina humane klicine linije. Humana antitela mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr. mutacije introdukovane mutagenezom po principu slučajnosti ili specifičnom za mesto in vitro ili sa somatskom mutacijom in vivo).
[0088] Termin „humanizovano antitelo“ odnosi se na molekul koji ima mesto vezivanja antigena koje suštinski potiče od imunoglobulina ne-humanih vrsta, pri čemu je preostala struktura imunoglobulinskog molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može da sadrži ili kompletne varijabilne regione fuzionisane sa konstantnim domenima ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) kalemljene na odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Antigen-vezujuća mesta mogu da budu divljeg tipa ili modifikovana jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana da više liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela imaju očuvane CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR iz mišjeg antitela). Drugi oblici imaju jedan ili više CDR koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.
[0089] Termin „himerno antitelo“ odnosi se na ona antitela u kojima je jedan deo svake od aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homolog odgovarajućim sekvencama antitela poreklom iz određenih vrsta ili koje pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homolog odgovarajućim sekvencama u drugoj. Tipično, varijabilni region lakih, kao i teških lanaca imitira varijabilne regione antitela poreklom iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologi sekvencama antitela poreklom iz druge. Jedna jasna prednost takvih himernih oblika je da se varijabilni region može pogodno izvesti iz trenutno poznatih izvora korišćenjem lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz ne-humanih organizama domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima poreklom iz, na primer, preparata humanih ćelija. Dok varijabilni region ima prednost lakoće pripreme i na specifičnost ne utiče izvor, manje je verovatno da će humani konstantni region izazvati imuni odgovor humanog subjekta kada se antitela ubrizgaju, nego što bi to bio slučaj kod konstantnog regiona iz ne-humanog izvora. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj posebni primer.
[0090] Termini „antigen-vezujući deo“ antitela (ili jednostavno „vezujući deo“) ili „antigenvezujući fragment“ antitela (ili jednostavno „vezujući fragment“), ili slični termini odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da specifično vezuju antigen. Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom „antigen-vezujući deo“ antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab’)2 fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezena disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jedne ručice antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDR koji se izborno mogu spojiti sintetičkim linkerom. Dodatno, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani zasebnim genima, mogu se spojiti, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji omogućava da se naprave kao jedan lanac proteina u kojem su VL i VH regioni upareni da bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Predviđeno je da takva jednolančana antitela takođe budu obuhvaćena terminom „antigen-vezujući fragment“ antitela. Dodatni primer je vezujući domen imunoglobulinskih fuzionih proteina koji sadrži (i) vezujući domen polipeptida koji je fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Vezujući domen polipeptida može da bude varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni proteini sa vezujućim domenom imunoglobulina su dodatno opisani u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima, i izvršen je skrining fragmenata za upotrebu na isti način kao kod intaktnih antitela.
[0091] Prirodna antitela su generalno monospecifična, tj. vezuju se za jedan antigen. Predmetni navodi sadrže antitela koja se vezuju za ciljnu ćeliju (angažovanjem tumorskog antigena) i drugi entitet kao što je citotoksična ćelija (npr. angažovanjem CD3 receptora). Antitela predmetnih navoda mogu da budu bispecifična ili multispecifična, kao što su trispecifična, tetraspecifična i tako dalje.
[0092] Predviđeno je da termin „bispecifični molekul“ uključuje agens koji ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa (a) antigenom na površini ćelije kao što je CLDN18.2, i (b) receptorom kao što je Fc receptor na površini efektorske ćelije. Predviđeno je da termin „multispecifični molekul“ uključuje agens koji ima više od dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa a) antigenom na površini ćelije kao što je CLDN18.2, (b) receptorom kao što je Fc receptor na površini efektorske ćelije, i (c) najmanje jednom različitom komponentom. Shodno tome, termin „antitelo“ uključuje, ali nije ograničen na, bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispecifične molekule koji su usmereni na tumorski antigen, i na druge ciljne strukture, kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama. Termin „bispecifična antitela“ takođe uključuje dijatela. Dijatela su bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koriste linker koji je prekratak da bi dozvolio uparivanje između dva domena na istom lancu, čime se prisiljavaju domeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca čime se stvaraju dva antigen vezujuća mesta (videti npr. Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
[0093] Antitela mogu da potiču iz različitih vrsta, uključujući, ali bez ograničenja miša, pacova, zeca, zamorca i čoveka.
[0094] Kako se ovde koristi, „izotip“ se odnosi na klasu antitela (npr. IgM ili IgG1) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca.
[0095] Kako se ovde koristi, „zamena izotipa“ se odnosi na fenomen kojim se klasa, ili izotip, antitela menja iz jedne klase Ig u jednu od drugih klasa Ig.
[0096] Ovde opisana antitela uključuju IgA kao što je IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM i IgD antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, konkretnije IgG1, kapa ili IgG1, lambda izotip (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ).
[0097] Kako se ovde koristi, „heterologno antitelo“ je definisano u odnosu na transgeni organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj koja se nalazi u organizmu koji se ne sastoji od transgenog organizma, i koje generalno potiče iz vrste koja nije transgeni organizam.
[0098] Kako se ovde koristi, „heterohibridno antitelo“ se odnosi na antitelo koje ima lake i teške lance koji potiču iz različitih organizama. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan sa mišjim lakim lancem je heterohibridno antitelo.
[0099] Ovde opisana antitela su poželjno izolovana. „Izolovano antitelo“ kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za tumorski antigen je u suštini bez antitela koja specifično vezuju antigene različite od tumorskog antigena). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog tumorskog antigena može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost na druge srodne antigene, na primer, iz drugih vrsta (npr. homolozi vrste tumorskih antigena). Štaviše, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom primeru izvođenja navoda, kombinacija „izolovanih“ monoklonskih antitela se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanu kompoziciju ili smešu.
[0100] U kontekstu predmetnih navoda, antitelo je sposobno da deluje tako što regrutuje imuni sistem pacijenta da uništi ćelije tumora ako antitelo, posebno kada je vezano za svoj ciljni molekul kao što je tumorski antigen na oboleloj ćeliji, izaziva imunološke efektorske funkcije, kao što je ovde opisano. Poželjno, pomenute imunološke efektorske funkcije su usmerene protiv ćelija kao što su ćelije kancera koje na svojoj površini nose tumorski antigen kao što je CLDN18.2.
[0101] Termin „imunološke efektorske funkcije“ u kontekstu predmetnih navoda obuhvata sve funkcije posredovane komponentama imunog sistema koje rezultuju npr. inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije tumora i metastaza. Poželjno, imunološke efektorske funkcije rezultuju ubijanjem ćelija kancera. Takve funkcije obuhvataju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), ćelijski-posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ćelijski-posredovanu fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), indukciju apoptoze u ćelijama koje nose tumorski antigen, citolizu ćelija koje nose tumorski antigen, i/ili inhibiciju proliferacije ćelija koje nose tumorski antigen.
Ćelijski-posredovana citotoksičnost zavisna od antitela
[0102] ADCC opisuje sposobnost efektorskih ćelija da ubijaju ćelije, naročito limfocita, koji poželjno zahtevaju da ciljna ćelija bude označena antitelom.
[0103] ADCC se poželjno javlja kada se antitela vezuju za antigene na ćelijama tumora i Fc domeni antitela zauzimaju Fc receptore (FcR) na površini imunskih efektorskih ćelija. Identifikovano je nekoliko familija Fc receptora, i specifične ćelijske populacije karakteristično eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC se može posmatrati kao mehanizam za direktno indukovanje varijabilnog stepena neposredne destrukcije tumora koja dovodi do prezentovanja antigena i indukcije T-ćelijskih odgovora usmerenih na tumor. Poželjno, in vivo indukcija ADCC će dovesti do T-ćelijskih odgovora usmerenih na tumor i odgovora antitela poreklom od domaćina.
Citotoksičnost zavisna od komplementa
[0104] CDC je drugi postupak za ubijanje ćelija koji može da bude usmeren pomoću antitela. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 su takođe oba veoma efikasni u usmeravanju CDC preko klasičnog puta aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigen-antitelo rezultuje u otkrivanju višestrukih C1q vezujućih mesta u neposrednoj blizini na CH2 domenima molekula antitela koja učestvuju, kao što su molekuli IgG (C1q je jedna od tri supkomponente komplementa C1). Poželjno ova otkrivena C1q vezujuća mesta prevode ovu nisko-afinitetnu C1q-IgG interakciju u interakciju visokog aviditeta, koja pokreće kaskadu događaja koji uključuju seriju drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja hemotaktičnih/aktivirajućih agenasa C3a i C5a efektorske ćelije. Poželjno, kaskada komplementa završava formiranjem kompleksa koji napada membranu, koji stvara pore u ćelijskoj membrani koje olakšavaju slobodan prolaz vode i rastvorenih supstanci u, i izvan ćelije.
[0105] Iznenađujuće je pronađeno da su konjugati antitelo-lek koji su ovde opisani u stanju da posreduju u ubijanju ćelija, posebno ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2, kao što su ćelije kancera, indukovanjem lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC) i/ili lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC). Dakle, u jednom primeru izvođenja, konjugati antitelo-lek prema navodima posreduju u ubijanju ćelija indukujući lizu posredovanu citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC) i/ili lizu posredovanu ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC), poželjno indukujući CDC-posredovanu lizu i ADCC-posredovanu lizu.
[0106] Kako se ovde koristi, antitelo je „poreklom iz“ određene sekvence klicine linije ukoliko je antitelo dobijeno iz sistema imunizacijom životinja ili skriningom biblioteke imunoglobulinskih gena, i gde je izabrano antitelo najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, čak poželjnije najmanje 96%, 97%, 98% ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom klicine linije. Tipično, antitelo koje potiče iz određene sekvence klicine linije prikazaće razliku koja nije veća od razlike u 10 aminokiselina, poželjnije, ne više od razlike u 5, ili čak još poželjnije, ne više od 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline od aminokiselinske sekvence kodirane imunoglobulinskim genom klicine linije.
[0107] Kako se ovde koristi, termin „heteroantitela“ odnosi se na dva ili više antitela, njihove derivate, ili antigen vezujuće regione vezane zajedno, od kojih najmanje dva imaju različite specifičnosti. Ove različite specifičnosti uključuju vezujuću specifičnost za Fc receptor na efektorskoj ćeliji, i vezujuću specifičnost za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, npr. tumorskoj ćeliji.
[0108] Termin „transfektom“, kako se ovde koristi, uključuje rekombinantne eukariotske ćelijedomaćine koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, ćelije biljaka, ili gljiva, uključujući ćelije kvasca.
[0109] Navodi obuhvataju sva antitela i derivate antitela, kao što je ovde opisano, koja su u svrhu navoda obuhvaćena terminom „antitelo“. Termin „derivati antitela“ označava bilo koji modifikovani oblik antitela, npr. konjugat antitela i drugi agens ili antitelo, ili fragment antitela.
[0110] Termin „antitelo protiv tumorskog antigena“ ili slični termini se odnose na antitelo usmereno ka, ili koje ima sposobnost vezivanja za tumorski antigen. Termin „vezivanje“ prema navodima se poželjno odnosi na specifično vezivanje.
[0111] Prema predmetnim navodima antitelo ili konjugat antitelo-lek je sposoban da se vezuje za unapred određeno ciljno mesto ako ima značajan afinitet za navedeno unapred određeno ciljno mesto i vezuje se za navedeno unapred određeno ciljno mesto u standardnim analizama. „Afinitet“ ili „afinitet vezivanja“ se često meri pomoću ravnotežne konstante disocijacije (KD). Poželjno, termin „značajan afinitet“ označava vezivanje za unapred određeno ciljno mesto sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>M ili niže, 10<-6>M ili niže, 10<-7>M ili niže, 10<-8>M ili niže, 10<-9>M ili niže, 10<-10>M ili niže, 10<-11>M ili niže ili 10<-12>M ili niže.
[0112] Antitelo ili konjugat antitelo-lek nije (suštinski) sposoban za vezivanje za ciljno mesto ako nema značajan afinitet za navedeno ciljno mesto i ne vezuje se značajno, konkretno, ne vezuje se detektabilno, za navedeno ciljno mesto u standardnim analizama. Poželjno, antitelo ili konjugat antitelo-lek se ne vezuje detektabilno za navedeno ciljno mesto ako je prisutno u koncentraciji do 2, poželjno 10, poželjnije 20, naročito 50 ili 100 µg/ml ili više. Poželjno, antitelo ili konjugat antitelo-lek nema značajan afinitet za ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta ili 10<6>puta viša od KDza vezivanje za unapred određeno ciljno mesto za koje je antitelo ili konjugat antitelo-lek sposoban da se vezuje. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela ili konjugata antitelo-lek za ciljno mesto za koje je antitelo ili konjugat antitelo-lek sposoban da se vezuje jednaka 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje antitelo ili konjugat antitelo-lek nema značajan afinitet bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M ili 10<-1>M.
[0113] Antitelo ili konjugat antitelo-lek je specifičan za unapred određeno ciljno mesto ako je sposobno da se vezuje za navedeno unapred određeno ciljno mesto, dok nije sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta, tj. nema značajan afinitet za druga ciljna mesta i ne vezuje se značajno za druga ciljna mesta u standardnim analizama. Prema navodima, antitelo ili konjugat antitelo-lek je specifičan za tumorski antigen kao što je CLDN18.2 ako je sposobno da se vezuje za tumorski antigen, ali nije (suštinski) sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta. Poželjno, antitelo ili konjugat antitelo-lek je specifičan za tumorski antigen ako afinitet za vezivanje za takva druga ciljna mesta značajno ne prevazilazi afinitet za ili vezivanje za tumorski antigen-nesrodne proteine kao što su goveđi serum albumin (BSA), kazein, humani serum albumin (HSA), ili transmembranske proteine koji nisu tumorski antigen, kao što su MHC molekuli ili receptor za transferin ili bilo koji drugi naznačeni polipeptid. Poželjno, antitelo ili konjugat antitelo-lek je specifičan za unapred određeno ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta niža od KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela ili konjugata antitelo-lek za ciljno mesto za koje je specifično jednaka 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M ili 10<-1>M.
[0114] Vezivanje antitela za ciljno mesto može da bude određeno eksperimentalno upotrebom bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer, Berzofsky et al., „Antibody-Antigen Interactions“ In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), i postupcima opisanim ovde.
Afiniteti mogu da budu lako određeni upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je pomoću ravnotežne dijalize; upotrebom BIAcore 2000 instrumenta, upotrebom opštih postupaka navedenih od strane proizvođača; pomoću radioimunološke analize upotrebom radioaktivno obeleženog ciljnog antigena; ili pomoću drugog postupka poznatog stručnjaku iz date oblasti tehnike. Podaci o afinitetu mogu da budu analizirani, na primer, pomoću postupka opisanog kod Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može da varira ako je meren pod različitim uslovima, npr. koncentracija soli, pH. Prema tome, merenja afiniteta i drugih antigen-vezujućih parametara, npr. KD, IC50, poželjno se izvode upotrebom standardizovanih rastvora antitela i antigena, i standardizovanog pufera.
[0115] Termin „prirodan“, kako se ovde koristi, primenjen na objekat označava činjenicu da objekat može da bude nađen u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može da bude izolovana iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji je prirodna.
[0116] Termin „preuređena“ kako se ovde koristi označava konfiguraciju lokusa teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina gde je V segment postavljen neposredno pored D-J ili J segmenta u konformaciji koja kodira esencijalno kompletan VH ili VL domen, redom. Preuređeni genski lokus imunoglobulina (antitela) može da bude identifikovan poređenjem sa DNK klicine linije; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamerni/nonamerni element homologije.
[0117] Termin „nepreuređena“ ili „konfiguracija klicine linije“ kako se ovde koristi u vezi sa V segmentom označava konfiguraciju u kojoj V segment nije rekombinovan tako da bude neposredno pored D ili J segmenta.
[0118] Prema navodima antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje za epitop prisutan u CLDN18.2, poželjno epitop lociran unutar ekstracelularnih domena CLDN18.2, naročito prvi ekstracelularni domen, poželjno za aminokiselinske položaje 29 do 78 u CLDN18.2. U posebnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje za (i) epitop na CLDN18.2 koji nije prisutan na CLDN18.1, poželjno SEQ ID NO: 3, 4 i 5, (ii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 1, poželjno SEQ ID NO: 8, (iii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 2, poželjno SEQ ID NO: 10, (iv) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 11, (v) epitop, koji obuhvata CLDN18.2-petlju 1 i CLDN18.2-petlju D3 ili (vi) neglikozilovani epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 9.
[0119] Prema navodima antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, ali ne za CLDN18.1. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za CLDN18.2. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 eksprimiran na ćelijskoj površini. U naročito poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za jedan ili više peptida izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za gore navedene proteine, peptide ili imunogene fragmente ili njihove derivate. Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 može da bude dobijeno pomoću postupka koji sadrži korak imunizacije životinje sa proteinom ili peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćinom koja eksprimira navedeni protein ili peptid. Poželjno, antitelo se vezuje za ćelije kancera, naročito ćelije tipova kancera navedenih u prethodnom tekstu i, poželjno, ne vezuje se značajno za nekancerozne ćelije.
[0120] U naročito poželjnom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je proizvedeno pomoću hibridoma deponovanog kod DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Nemačka; nova adresa: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Nemačka) i ima sledeću oznaku i pristupni broj:
a. 182-D1106-055, pristupni br. DSM ACC2737, deponovan 19.10.2005.
b. 182-D1106-056, pristupni br. DSM ACC2738, deponovan 19.10.2005.
c. 182-D1106-057, pristupni br. DSM ACC2739, deponovan 19.10.2005.
d. 182-D1106-058, pristupni br. DSM ACC2740, deponovan 19.10.2005.
e. 182-D1106-059, pristupni br. DSM ACC2741, deponovan 19.10.2005.
f. 182-D1106-062, pristupni br. DSM ACC2742, deponovan 19.10.2005.,
g. 182-D1106-067, pristupni br. DSM ACC2743, deponovan 19.10.2005.
h. 182-D758-035, pristupni br. DSM ACC2745, deponovan 17.11.2005.
i. 182-D758-036, pristupni br. DSM ACC2746, deponovan 17.11.2005.
j. 182-D758-040, pristupni br. DSM ACC2747, deponovan 17.11.2005.
k. 182-D1106-061, pristupni br. DSM ACC2748, deponovan 17.11.2005.
l. 182-D1106-279, pristupni br. DSM ACC2808, deponovan 26.10.2006.
m. 182-D1106-294, pristupni br. DSM ACC2809, deponovan 26.10.2006,
n. 182-D1106-362, pristupni br. DSM ACC2810, deponovan 26.10.2006.
[0121] Poželjna antitela prema navodima su ona proizvedena pomoću, i koja se mogu dobiti od, prethodno opisanih hibridoma; tj. 37G11 u slučaju 182-D1106-055, 37H8 u slučaju 182-D1106056, 38G5 u slučaju 182-D1106-057, 38H3 u slučaju 182-D1106-058, 39F11 u slučaju 182-D1106-059, 43A11 u slučaju 182-D1106-062, 61C2 u slučaju 182-D1106-067, 26B5 u slučaju 182-D758-035, 26D12 u slučaju 182-D758-036, 28D10 u slučaju 182-D758-040, 42E12 u slučaju 182-D1106-061, 125E1 u slučaju 182-D1106-279, 163E12 u slučaju 182-D1106-294 i 175D10 u slučaju 182-D1106-362; i njihovi himerizovani i humanizovani oblici.
[0122] U jednom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela koje je proizvedeno i/ili koje može da se dobije iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ili DSM ACC2810, (ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), (iii) antitela koje ima specifičnost antitela pod (i) i (iv) antitela koje sadrži antigen-vezujući deo ili mesto za vezivanje antigena, konkretno varijabilni region, antitela pod (i) i poželjno ima specifičnost antitela pod (i).
[0123] Poželjna antitela, posebno himerizovana antitela i njihove sekvence prikazana su u sledećoj tabeli.
[0124] U poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region teškog lanca (CH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog teškog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 13 ili njen fragment. U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region lakog lanca (CL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog lakog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 12 ili njen fragment. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže CH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CH kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 13 ili njen fragment i koji sadrži CL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CL kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 12 ili njen fragment.
[0125] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je himerno mišje/humano IgG1 monoklonsko antitelo koje sadrži kapa mišji varijabilni laki lanac, konstantni region humanog kapa lakog lanca alotip Km(3), mišji varijabilni region teškog lanca, humani IgG1 konstantni region, alotip G1m(3).
[0126] U određenim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela obuhvataju antitela koja sadrže teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51 i njihovog fragmenta i/ili koja sadrže laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 i njihovog fragmenta.
[0127] U određenim poželjnim aspektima otkrića, himerizovani oblici antitela obuhvataju antitela koja sadrže kombinaciju teških lanaca i lakih lanaca izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (ix):
(i) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 14 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 21 ili njen fragment,
(ii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 15 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 20 ili njen fragment,
(iii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 16 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 22 ili njen fragment,
(iv) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 18 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 25 ili njen fragment,
(v) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 17 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 24 ili njen fragment,
(vi) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 23 ili njen fragment,
(vii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 26 ili njen fragment,
(viii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 27 ili njen fragment,
(ix) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 28 ili njen fragment, i
(x) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 51 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 24 ili njen fragment.
[0128] Antitela prema (ii), (v) ili (x) su poželjni primeri izvođenja „antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2“. Antitelo prema (v) ili (x) je posebno poželjno.
[0129] „Fragment“ ili „fragment aminokiselinske sekvence“, kako se ovde koristi, označava deo sekvence antitela, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu antitela skraćenu na N-i/ili C-kraju, koja kada menja navedenu sekvencu antitela u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što su ovde opisane, npr. CDC-posredovana liza ili ADCC-posredovana liza. Poželjno, fragment aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% aminokiselinskih ostataka iz navedene aminokiselinske sekvence. Fragment aminokiselinske sekvence izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 i 51 poželjno se odnosi na navedenu sekvencu gde je uklonjeno 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 aminokiselina na N-kraju.
[0130] U poželjnom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, i njenog fragmenta.
[0131] U poželjnom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, i njenog fragmenta.
[0132] U određenim poželjnim aspektima otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sledećih mogućnosti (i) do (ix):
(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 29 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 36 ili njen fragment,
(ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 30 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 35 ili njen fragment,
(iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 31 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 37 ili njen fragment,
(iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 33 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 40 ili njen fragment,
(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 39 ili njen fragment,
(vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 38 ili njen fragment,
(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 41 ili njen fragment,
(viii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 42 ili njen fragment,
(ix) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 43 ili njen fragment.
[0133] Antitela prema (ii) ili (v) su poželjni primeri izvođenja „antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2“. Antitelo prema (v) je posebno poželjno.
[0134] Prema navodima, termin „fragment“ se odnosi, konkretno, na jedan ili više od regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno bar varijabilni region CDR3, varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL). U jednom primeru izvođenja navedeni jedan ili više od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) su odabrani iz seta regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3. U posebno poželjnom primeru izvođenja, termin „fragment“ se odnosi na regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL).
[0135] U poželjnom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži VH koji sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (vi):
(i) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 sekvence SEQ ID NO: 14,
(ii) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 15,
(iii) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 sekvence SEQ ID NO: 16,
(iv) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 17,
(v) CDR1: položaji 44-51 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 sekvence SEQ ID NO: 18 i
(vi) CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19.
[0136] U poželjnom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost da se vezuje za CLDN18.2 sadrži VL koji sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):
(i) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 20,
(ii) CDR1: položaji 49-53 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 sekvence SEQ ID NO: 21,
(iii) CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 22,
(iv) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 23,
(v) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 24,
(vi) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 sekvence SEQ ID NO: 25,
(vii) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 26,
(viii) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 27, i
(ix) CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 28.
[0137] U poželjnom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju VH i VL od kojih svaki sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3, izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):
(i) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 sekvence SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: položaji 49-53 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 sekvence SEQ ID NO: 21,
(ii) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 20,
(iii) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 sekvence SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 22,
(iv) VH: CDR1: položaji 44-51 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 sekvence SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 sekvence SEQ ID NO: 25,
(v) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: položaji 4758 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 24,
(vi) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 23,
(vii) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 26,
(viii) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 27, i
(ix) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 28.
[0138] Antitela prema (ii) ili (v) su poželjni primeri izvođenja „antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2“. Antitelo prema (v) je posebno poželjno.
[0139] U dodatnim poželjnim aspektima otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 koje je ovde opisano, i poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) koji su ovde opisani. U jednom aspektu otkrića navedeni jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) su izabrani iz grupe regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 koji su ovde opisani. U naročito poželjnom aspektu otkrića, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 opisanog ovde, i poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) koji su ovde opisani.
[0140] U jednom aspektu otkrića, antitelo koje sadrži jedan ili više CDR, grupu CDR ili kombinaciju grupa CDR kao što je ovde opisano, sadrži navedene CDR zajedno sa njihovim umetnutim okvirnim regionima. Poželjno, deo će takođe da obuhvata najmanje oko 50% bilo kog, ili oba, od prvog i četvrtog okvirnog regiona, pri čemu tih 50% predstavlja C-terminalnih 50% prvog okvirnog regiona i N-terminalnih 50% četvrtog okvirnog regiona. Konstrukcija antitela napravljenih pomoću tehnika rekombinantne DNK može da rezultuje u uvođenju ostataka N- ili C-terminalno u odnosu na varijabilne regione kodirane linkerima uvedenim da olakšaju kloniranje ili druge korake manipulacije, uključujući uvođenje linkera da bi se spojili varijabilni regioni prema navodima sa dodatnim proteinskim sekvencama, uključujući teške lance imunoglobulina, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji dijatela) ili proteinske obeleživače.
[0141] U jednom aspektu otkrića, antitelo koje sadrži jedan ili više CDR, grupu CDR ili kombinaciju grupa CDR, kao što je ovde opisano, sadrži navedene CDR u okvirnom regionu humanog antitela.
[0142] Pozivanje u ovom dokumentu na antitelo koje sadrži, u odnosu na njegov teški lanac, određeni lanac, ili određeni region ili sekvencu, poželjno se odnosi na situaciju u kojoj svi teški lanci navedenog antitela sadrže navedeni određeni lanac, region ili sekvencu. Ovo, na analogni način, važi za laki lanac antitela.
[0143] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 prema navodima se odnosi na antitelo koje prepoznaje, tj. vezuje se za isti ili suštinski isti epitop kao ovde opisano CLDN18.2-vezujuće antitelo, i/ili kompetira sa navedenim CLDN18.2-vezujućim antitelom za vezivanje za CLDN18.2.
[0144] Prema navodima, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, posebno kada se nalazi u konjugatu antitelo-lek, poželjno ima afinitet i/ili specifičnost za CLDN18.2 prikladnu da omogući endocitozu antitela i/ili konjugata antitelo-lek.
[0145] Termin „endocitoza“ se odnosi na proces u kome eukariotske ćelije internalizuju segmente plazma membrane, receptore na ćelijskoj površini i komponente iz ekstracelularne tečnosti. Mehanizmi endocitoze uključuju endocitozu posredovanu receptorima. Termin „endocitoza posredovana receptorom“ se odnosi na biološki mehanizam kojim ligand, nakon vezivanja za svoj ciljni molekul, pokreće invaginaciju i zatvaranje membrane, internalizuje se i isporučuje u citosol ili prenosi u odgovarajuće intracelularne odeljke.
[0146] Predmetni navodi takođe predviđaju primere izvođenja, u kojima „antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2“ ima značenje koje obuhvata bilo koje „vezujući agens za CLDN18.2“. Prema navodima, „vezujući agens za CLDN18.2“ uključuje svako jedinjenje koje ima kapacitet vezivanja za CLDN18.2. Poželjno, takav vezujući agens sadrži najmanje jedan vezujući domen za CLDN18.2. Termin obuhvata sve veštačke vezujuće molekule (skafolde) koji imaju kapacitet vezivanja za CLDN18.2 uključujući, ali ne ograničavajući se na nanotela, afitela, antikaline, DARPine, monotela, avimere i mikrotela. U jednom primeru izvođenja pomenuti vezujući agens se vezuje za ekstracelularni domen CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja pomenuti vezujući agens se vezuje za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja pomenuti vezujući agens se vezuje za prvu ekstracelularnu petlju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja navedeno vezivanje za CLDN18.2 je specifično vezivanje.
[0147] Termin „vezujući domen“ karakteriše u vezi sa predmetnim navodima strukturu, npr. antitela, koje se vezuje za/interaguje sa datom ciljnom strukturom/antigenom/epitopom. Dakle, vezujući domen prema navodima označava „mesto interakcije sa antigenom“.
[0148] Bilo koji agens koji ima terapijski efekat na ćelije kancera može da se koristi kao lek za konjugaciju sa anti-CLDN18.2 antitelom ili njegovim derivatom. Poželjno, konjugacija leka ne menja ili ne menja značajno karakteristike vezivanja, posebno specifičnost antitela, kako je ovde diskutovano. Prema tome, konjugat antitelo-lek prema navodima poželjno ima iste ili suštinski iste karakteristike vezivanja, posebno specifičnost, kao antitelo koje se koristi za konjugaciju. Shodno tome, ako su ovde opisane određene karakteristike vezivanja za antitelo koje se koristi za konjugaciju, poželjno je da i konjugat antitelo-lek ima takve karakteristike vezivanja. Na primer, ako je opisano da se antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje za ekstracelularni domen CLDN18.2 i/ili se vezuje za prvu ekstracelularnu petlju CLDN18.2, poželjno je da se i konjugat antitelo-lek vezuje se za ekstracelularni domen CLDN18.2 i/ili da se vezuje za prvu ekstracelularnu petlju CLDN18.2.
[0149] Tipično, lek je citotoksični ili citostatski agens. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćelije i, konkretno, ubija ćelije.
[0150] Korisne klase citotoksičnih agenasa obuhvataju, na primer, antitubulinske agense, agense koji se vezuju za manje žlebove DNK (npr. enediini i leksitropsini), inhibitore replikacije DNK, alkilujuće agense (npr. kompleksi platine kao što su cis-platina, mono(platina), bis(platina) i trinuklearni kompleksi platine i karboplatin), antracikline, antibiotike, antifolate, antimetabolite, senzibilizatore za hemoterapiju, duokarmicine, etopozide, fluorovane pirimidine, jonofore, nitrozouree, platinole, prekursorska jedinjenja, antimetabolite purina, puromicine, senzibilizatore za zračenje, steroide, taksane (npr. paklitaksel i docetaksel), inhibitore topoizomeraze, vinka alkaloide, ili slično.
[0151] Pojedinačni citotoksični agensi uključuju, na primer, androgen, antramicin (AMC), asparaginazu, 5-azacitidin, azatioprin, bleomicin, busulfan, butionin sulfoksimin, kamptotecin, karboplatin, karmustin (BSNU), CC-1065, hlorambucil, cisplatin, kolhicin, ciklofosfamid, citarabin, citidin arabinozid, citohalazin B, dakarbazin, daktinomicin (ranije aktinomicin), daunorubicin, dekarbazin, docetaksel, doksorubicin, estrogen, 5-fluordeoksiuridin, 5-fluorouracil, gramicidin D, hidroksiureu, idarubicin, ifosfamid, irinotekan, lomustin (CCNU), mehloretamin, melfalan, 6-merkaptopurin, metotreksat, mitramicin, mitomicin C, mitoksantron, nitroimidazol, paklitaksel, plikamicin, prokarbizin, streptozotocin, tenopozid, 6-tioguanin, tioTEPA, topotekan, vinblastin, vinkristin, vinorelbin, VP-16 i VM-26.
[0152] Primeri antitubulinskih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na dolastatine (npr. auristatin E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB), majtanzinoide, taksane (npr. paklitaksel, docetaksel), T67 (Tularik), vinka alkiloide (npr. vinkristin, vinblastin, vindezin i vinorelbin), derivate bakatina, analoge taksana (npr. epotilon A i B), nokodazol, kolhicin i kolcimid, estramustin, kriptofizine, cemadotin, kombretastatine, diskodermolid i eleuterobin.
[0153] U specifičnim primerima izvođenja, citotoksični ili citostatski agens je auristatin E (takođe poznat u struci kao dolastatin-10) ili njegov derivat. Tipično, derivat auristatina E je, npr. estar formiran između auristatina E i keto kiseline. Na primer, auristatin E može da reaguje sa paraacetil benzojevom kiselinom ili benzoilvalerinskom kiselinom da bi se proizveo AEB i AEVB, respektivno. Drugi tipični derivati auristatina uključuju AFP, MMAF i MMAE.
[0154] U određenim primerima izvođenja, citotoksični ili citostatski agens je majtanzinoid, još jedna grupa antitubulinskih agenasa. Na primer, u specifičnim primerima izvođenja, majtanzinoid je majtanzin, DM-1 ili DM-4.
[0155] Majtanzinoidi su snažna jedinjenja usmerena na mikrotubule koja inhibiraju proliferaciju ćelija u mitozi. Majtanzinoidi su derivati majtanzina koji je 19-člana ansamakrolidna struktura vezana za hlorovani benzenski prsten. Majtanzin ima sledeću formulu:
[0156] Otkriveno je da određeni mikrobi takođe proizvode majtanzinoide, kao što su majtanzinol i C-3 majtanzinol estri (SAD pat. br.4,151,042). Sintetički majtanzinol i analozi majtanzinola su prijavljeni, na primer, u SAD pat. br. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,362,663; i 4,371,533, i Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull.3441-3451.
[0157] Majtanzinoidi su dobro poznati u tehnici i mogu se sintetizovati poznatim tehnikama ili izolovati iz prirodnih izvora. Naročito poželjni majtanzinoidi prema navodima su derivati majtanzina koji sadrže tiol, kao što su DM1 i DM4. Takvi derivati majtanzina koji sadrže tiol uključuju jedinjenja u kojima je metil grupa vezana za karbonil grupu zamenjena grupom koja sadrži slobodnu sulfhidrilnu grupu kao što je grupa - R-SH gde R predstavlja alkilensku grupu ili drugu grupu atoma koja sadrži ugljenik.
[0158] DM1, takođe poznat kao mertanzin, je majtanzinoid koji ima sledeću formulu:
[0159] Posebno, termin „mertanzin“ ili „DM1“ se odnosi na jedinjenje N<2'>-deacetil-N<2'>-(3-merkapto-1-oksopropil)-majtanzin.
[0160] „DM4“ se odnosi na jedinjenje N<2'>-deacetil-N<2'>-(4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-majtanzin.
[0161] Konjugati anti-CLDN18.2 antitelo-majtanzinoid mogu da budu pripremljeni hemijskim povezivanjem anti-CLDN18.2 antitela sa molekulom majtanzinoida bez značajnog smanjenja biološke aktivnosti bilo antitela ili molekula majtanzinoida. U proseku se može konjugovati 3-4 molekula majtanzinoida po molekulu antitela, iako se očekuje da će čak i jedan molekul toksina/antitela povećati citotoksičnost u odnosu na upotrebu golog antitela.
[0162] U tom pogledu, izraz „antitelo kovalentno vezano za najmanje jednu komponentu leka na bazi toksina“ uključuje situacije u kojima je jedan ili više molekula istog leka kovalentno vezano za molekul antitela, kao i gde su različiti lekovi kovalentno vezani za molekul antitela. U poslednjoj situaciji, jedan ili više molekula svakog od različitih lekova mogu biti vezani za molekul antitela ili njihovu kombinaciju (npr. vezan je jedan molekul jednog leka, dok je vezano nekoliko molekula drugog leka).
[0163] U nekim primerima izvođenja prema navodima, antitelo je konjugovano sa dolastatinima ili peptidnim analozima i derivatima dolostatina, auristatinima (SAD patent br. 5,635,483; 5,780,588). Auristatini su sintetički analozi dolostatina 10, prirodnog proizvoda dobijenog od morskog mekušaca, Dolabela auricularia. Kao i majtanzinoidi, auristatini su agensi koji narušavaju strukturu mikrotubula. Komponenta leka na bazi dolastatina ili auristatina može da bude vezan za antitelo preko N (amino) kraja ili C (karboksilnog) kraja peptidnog komponente leka.
[0164] Primeri izvođenja auristatina uključuju komponente leka na bazi monometilauristatina, kao što su MMAE i MMAF koji su poželjno vezani preko N-terminusa.
[0165] MMAE, takođe poznat kao monometil auristatin E, ima sledeću formulu:
[0166] Konkretno, termin „MMAE“ se odnosi na jedinjenje (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-hidroksi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil)pirolidin-1-il)-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido) butanamid. MMAE je zapravo desmetil-auristatin E, tj. N-terminalna amino grupa ima samo jedan metil supstituent umesto dva, kao u samom auristatinu E.
[0167] Naročito poželjni prema navodima su konjugati antitelo-vcAuristatin kao što su konjugati antitelo-vcMMAE. Prema navodima, termin „antitelo-vcAuristatin“ ili „vcMMAE“ odnosi se na konjugat antitelo-lek (ADC) koji sadrži auristatin kao što je MMAE, vezan preko linkera koji sadrži lizozomski otcepivi dipeptid, valin-citrulin (vc), sa antitelom.
[0168] MMAF, takođe poznat kao monometil auristatin F, odnosi se na jedinjenje (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamido)-3-metoksi-5-metilheptanoil)pirolidin-2-il)-3-metoksi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropansku kiselinu.
[0169] Generisanje konjugata antitelo-lek može se postići bilo kojom tehnikom poznatom stručnjaku. Konjugati antitelo-lek se mogu pripremiti vezivanjem leka za antitelo u skladu sa konvencionalnom tehnikom. Antitelo i lek mogu da budu direktno vezani jedno za drugo preko sopstvenih linkerskih grupa ili indirektno preko linkera ili druge supstance.
[0170] Dostupan je niz različitih reakcija za kovalentno vezivanje lekova za antitela. Ovo se često postiže reakcijom aminokiselinskih ostataka molekula antitela, uključujući aminske grupe lizina, slobodne grupe karboksilne kiseline glutaminske i asparaginske kiseline, sulfhidrilne grupe cisteina i različite delove aromatičnih aminokiselina. Jedan od najčešće korišćenih nespecifičnih postupaka kovalentnog vezivanja je karbodiimidna reakcija za povezivanje karboksi (ili amino) grupe jedinjenja sa amino (ili karboksi) grupama antitela. Pored toga, bifunkcionalni agensi kao što su dialdehidi ili imidoestri su korišćeni da se amino grupa jedinjenja poveže sa amino grupama molekula antitela. Takođe dostupna za vezivanje lekova za antitela je reakcija Šifove baze. Ovaj postupak uključuje perjodatnu oksidaciju leka koji sadrži glikol ili hidroksi grupe, čime se formira aldehid koji zatim reaguje sa molekulom antitela. Vezivanje se dešava formiranjem Šifove baze sa amino grupama molekula antitela. Izotiocijanati se takođe mogu koristiti kao agensi za kuplovanje za kovalentno vezivanje lekova za antitela. Druge tehnike su poznate stručnjaku i obuhvaćene su obimom ovih navoda.
[0171] Postoje mnoge grupe za vezivanje koje su poznate u tehnici za pravljenje konjugata antitelo-lek. Linker poželjno sadrži jednu ili više funkcionalnih grupa koje reaguju sa jednim ili oba antitela i leka. Primeri funkcionalnih grupa uključuju amino, karboksil, merkapto, maleimid i piridinil grupe.
[0172] U jednom primeru izvođenja navoda, antitelo je vezano sa lekom preko bifunkcionalnog reagensa za umrežavanje. Kako se ovde koristi, „bifunkcionalni reagens za umrežavanje“ se odnosi na reagens koji poseduje dve reaktivne grupe od kojih je jedna sposobna da reaguje sa antitelom, dok je druga sposobna da reaguje sa lekom da poveže antitelo sa lekom, čime se formira konjugat. Bilo koji pogodan bifunkcionalni reagens za umrežavanje može da se koristi prema navodima, sve dok linkerski reagens obezbeđuje zadržavanje svojstva leka, npr. citotoksičnosti i karakteristike ciljnog delovanja antitela. Poželjno, molekul linkera spaja lek sa antitelom hemijskim vezama, tako da su lek i antitelo međusobno hemijski spojeni (npr. kovalentno vezani).
[0173] U jednom primeru izvođenja, bifunkcionalni reagens za umrežavanje sadrži neotcepive linkere. Neotcepivi linker je bilo koja hemijska grupa koja je sposobna da veže lek, kao što je majtanzinoid, sa antitelom na stabilan, kovalentan način. Poželjno, neotcepivi linker ne može da se otcepi u fiziološkim uslovima, posebno unutar ćelije. Prema tome, neotcepivi linkeri su suštinski otporni na otcepljivanje izazvano kiselinom, otcepljivanje izazvano svetlošću, otcepljivanje izazvano peptidazom, otcepljivanje izazvano esterazom i cepanje disulfidne veze, u uslovima pod kojima lek ili antitelo ostaju aktivni. Pogodni reagensi za umrežavanje koji formiraju neotcepive linkere između leka i antitela su dobro poznati u tehnici. U jednom primeru izvođenja, lek je vezan za antitelo preko tioetarske veze.
[0174] U posebno poželjnom primeru izvođenja, reagens za povezivanje je otcepivi linker. Poželjno, otcepivi linker je otcepiv u fiziološkim uslovima, posebno unutar ćelije. Primeri pogodnih otcepivih linkera uključuju disulfidne linkere, linkere nestabilne u kiseloj sredini, fotolabilne linkere, linkere nestabilne pod dejstvom peptidaze i linkere nestabilne pod dejstvom esteraze.
[0175] Primeri linkera uključuju, ali nisu ograničeni na N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat (SPDB), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sulfosukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (Sulfo-SMCC), N-sukcinimidil-4-(maleimidometil)cikloheksankarboksilat (SMCC), N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproat) (LC-SMCC), N-hidroksisukcinimid estar 4-maleimidobuterne kiseline (GMBS), N-hidroksisukcinimid estar 3-maleimidokaproične kiseline (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS), N-(α-maleimidoacetoksi)-sukcinimid estar (AMAS), sukcinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)heksanoat (SMPH), N-sukcinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirat (SMPB), N-(p-maleimidofenil)izocijantet (PMPI), 6-maleimidokaproil (MC), maleimidopropanoil (MP), p-aminobenziloksikarbonil (PAB), N-sukcinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP) i N-sukcinimidil (4-jodoacetil)aminobenzoat (SIAB). Može se koristiti i peptidni linker kao što je valin-citrulin (Val-Cit) ili alanin-fenilalanin (ala-phe), i bilo koji od gore navedenih linkera može da se koristi u adekvatnoj kombinaciji.
[0176] Linkeri koji sadrže disulfide su linkeri koji mogu da se otcepe putem razmene disulfida, što se može desiti u fiziološkim uslovima. U sledećim primerima izvođenja, linker može da se otcepi u redukcionim uslovima (npr. disulfidni linker). U struci su poznati različiti disulfidni linkeri, uključujući, na primer, one koji mogu da se formiraju korišćenjem SATA (N-sukcinimidil-5-acetiltioacetata), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionata), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidil-oksikarbonil-alfametil-alfa-(2-piridilditio)toluen).
[0177] Linkeri nestabilni u kiseloj sredini su linkeri koji su otcepivi na kiselom pH. Na primer, određeni odeljci unutar ćelije, kao što su endozomi i lizozomi, imaju kiseli pH (pH 4-5) i obezbeđuju uslove pogodne za otcepljivanje linkera nestabilnih u kiseloj sredini. Linkeri nestabilni u kiseloj sredini su relativno stabilni pod neutralnim pH uslovima, kao što je slučaj kod krvi, ali su nestabilni pri pH ispod 5.5 ili 5.0. Na primer, mogu da se koriste hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitski amid, ortoestar, acetal, ketal ili slično.
[0178] Fotolabilni linkeri su korisni na površini tela i u mnogim telesnim šupljinama koje su dostupne svetlosti. Osim toga, infracrveno svetlo može da prodre kroz tkivo.
[0179] Linkeri nestabilni pod dejstvom peptidaza mogu da se koriste za otcepljivanje određenih peptida unutar ili izvan ćelija. U jednom primeru izvođenja, otcepivi linker se otcepljuje u blagim uslovima, odnosno uslovima unutar ćelije koji ne utiču na aktivnost citotoksičnog agensa.
[0180] Linker može da bude, ili može da sadrži, npr. peptidil linker koji se otcepljuje intracelularnim enzimom peptidazom ili proteazom, uključujući, ali bez ograničenja, lizozomalnu ili endozomalnu proteazu. Tipično, peptidil linker je dugačak najmanje dve aminokiseline ili najmanje tri aminokiseline. Agensi za otcepljivanje mogu da uključuju katepsine B i D i plazmin, za koje je poznato da hidrolizuju dipeptidne derivate leka što dovodi do oslobađanja aktivnog leka unutar ciljnih ćelija. Na primer, može da se koristi peptidil linker koji može da se otcepi pomoću tiol-zavisne proteaze katepsin-B, koja je visoko eksprimirana u kanceroznom tkivu (npr. linker Phe-Leu ili Gly-Phe-Leu-Gly). U specifičnim primerima izvođenja, peptidil linker koji može da se otcepi intracelularnom proteazom je linker valin-citrulin (Val-Cit; vc) ili linker fenilalanin-lizin (Phe-Lys). Jedna prednost upotrebe intracelularnog proteolitičkog oslobađanja terapijskog agensa je da je agens tipično oslabljen kada je konjugovan i da je stabilnost konjugata u serumu tipično visoka.
[0181] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, linker prema navodima sadrži ili se sastoji od dipeptida valina (Val) - citrulina (Cit) (vc), koji se otcepljuje katepsinom unutar tumorskih ćelija.
[0182] U jednom primeru izvođenja, lek je majtanzinoid kao što je DM4 koji je kuplovan sa antitelom koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 preko amino i sulfhidril reaktivnog heterobifunkcionalnog proteinskog umreživača koji reaguje sa primarnim aminima (kakvi se nalaze u bočnom lancu lizina ili N-kraju proteina) antitela i sa sulhidril grupom majtanzinoida da bi se dobila reverzibilna disulfidna veza. U jednom primeru izvođenja, amino i sulfhidril reaktivni heterobifunkcionalni proteinski unakrsno vezivač je SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat), koji reaguje preko N-hidroksisukcinimidnog (NHS) estra sa primarnim aminima (kakvi se nalaze u bočnom lancu lizina ili N-kraju proteina) antitela i preko piridinildisulfidne grupe sa sulhidril grupom DM4 da bi se dobila reverzibilna disulfidna veza (Slika 1).
[0183] U jednom primeru izvođenja, lek je auristatin kao što je MMAE koji je kuplovan sa antitelom koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 preko peptidnog linkera kao što je peptidni linker koji se cepa katepsinom, posebno Val-Cit (vc). U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je tiolovano, npr. sa heterobifunkcionalnim linkerom 2-IT (2-iminotiolan) koji reaguje sa slobodnim aminima lizinskih ostataka.
[0184] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek prema navodima sadrži antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment kuplovan (poželjno preko svojih amino grupa) sa DM4 (preferirano preko njegove sulfhidrilne grupe). U jednom primeru izvođenja, antitelo je kuplovano sa DM4 preko linkera SPDB.
[0185] U jednom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek prema navodima sadrži antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 17 ili 51 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 24 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment kuplovan (poželjno preko svojih amino grupa) sa DM4 (poželjno preko njegove sulfhidrilne grupe). U jednom primeru izvođenja, antitelo je kuplovano sa DM4 preko linkera SPDB.
[0186] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek prema navodima sadrži antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment kuplovan (poželjno preko svojih amino grupa) sa MMAE (poželjno preko njegove N-terminalne amino grupe). U jednom primeru izvođenja, antitelo je kuplovano sa MMAE preko linkera koji sadrži dipeptid vc.
[0187] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek prema navodima sadrži antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 17 ili 51 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 24 ili njen fragment ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragment kuplovan (poželjno preko svojih amino grupa) sa MMAE (poželjno preko njegove N-terminalne amino grupe). U jednom primeru izvođenja, antitelo je kuplovano sa MMAE preko linkera koji sadrži dipeptid vc.
[0188] Termin „nukleinska kiselina“, kako se ovde koristi, namenjen je da obuhvata DNK i RNK. Nukleinska kiselina može da bude jednolančana ili dvolančana, ali je poželjno dvolančana DNK.
[0189] Prema navodima, termin „ekspresija“ koristi se u najuopštenijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK, ili RNK i proteina/peptida. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može da bude izvedena prolazno ili stabilno.
[0190] Navodi koji su ovde dati u vezi sa specifičnim aminokiselinskim sekvencama, npr. onim prikazanim u listingu sekvenci, posebno one na koje se ovde poziva navođenjem SEQ ID NO:, trebalo bi da se tumače tako da se takođe odnose na varijante navedenih specifičnih sekvenci. Takve varijante sekvenci mogu da budu funkcionalno ekvivalentne navedenim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinskim sekvencama koje ispoljavaju osobine identične ili slične onima kod specifičnih aminokiselinskih sekvenci. Jedna važna osobina je zadržavanje vezivanja antitela za njegovo ciljno mesto. Poželjno, sekvenca koja je varijanta u odnosu na specifičnu sekvencu, kada menja specifičnu sekvencu u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2.
[0191] Stručnjacima iz date oblasti tehnike biće jasno da naročito sekvence CDR, hipervarijabilnih i varijabilnih regiona mogu da budu modifikovane bez gubitka sposobnosti da se vežu za CLDN18.2. Na primer, CDR regioni biće ili identični ili visoko homologi sa regionima ovde naznačenih antitela. „Visoko homologi“ označava da od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3, ili 1 ili 2 supstitucije mogu da budu uvedene u CDR regione. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu da budu modifikovani tako da pokazuju značajnu homologiju sa regionima antitela koji su ovde specifično navedeni.
[0192] Izraz „varijanta“ prema navodima se odnosi, posebno, na mutante, varijante splajsovanja, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrste i homologe vrste, posebno one koji su prirodno prisutni. Alelna varijanta se odnosi na promenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Kompletno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselinska sekvenca koja potiče iz vrste drugačije od one iz koje potiče data sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselinska sekvenca. Termin „varijanta“ obuhvata sve posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.
[0193] U svrhu predmetnih navoda, „varijante“ aminokiselinske sekvence sadrže aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i/ili aminokiselinske supstitucione varijante. Aminokiselinske delecione varijante koje sadrže deleciju na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina su takođe označene N-terminalne i/ili C-terminalne skraćene varijante.
[0194] Aminokiselinske insercione varijante sadrže insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenoj aminokiselinskoj sekvenci. U slučaju varijanti aminokiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su umetnuti na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, iako je takođe moguća slučajna insercija sa odgovarajućim skriningom rezultirajućeg proizvoda.
[0195] Aminokiselinske adicione varijante sadrže amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što je 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina.
[0196] Aminokiselinske delecione varijante su okarakterisane uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina. Delecije mogu da budu u bilo kom položaju proteina.
[0197] Aminokiselinske supstitucione varijante su okarakterisane najmanje jednim ostatkom u sekvenci koji je uklonjen i drugim ostatkom koji je inseriran na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama koje su na položajima u aminokiselinskoj sekvenci koji nisu konzervativni između homologih proteina ili peptida, i/ili zameni aminokiselina drugim koje imaju slične osobine. Poželjno, aminokiselinske promene u proteinskim varijantama su konzervativne aminokiselinske promene, tj., supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna aminokiselinska promena obuhvata supstituciju jedne iz familije aminokiselina koje su srodne po njihovim bočnim lancima. Prirodne aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaleketrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) aminokiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin su nekada klasifikovani zajedno kao aromatične aminokiseline.
[0198] Poželjno, stepen sličnosti, poželjno identičnosti, između date aminokiselinske sekvence, kao što je aminokiselinska sekvenca na koju se ovde poziva navođenjem SEQ ID NO:, i aminokiselinske sekvence koja je varijanta navedene aminokiselinske sekvence biće najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti je poželjno dat za aminokiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% cele dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvenci, poželjno identičnosti sekvenci može se izvesti pomoću alata poznatih u tehnici, poželjno upotrebom najboljeg poravnanja sekvenci, na primer, upotrebom Align, upotrebom standardnih postavki, poželjno EMBOSS::needle, Matrix:Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
[0199] „Sličnost sekvenci“ označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. „Identičnost sekvenci“ dve aminokiselinske sekvence ukazuje na procenat aminokiselina koje su identične u tim sekvencama.
[0200] Termin „procenat identičnosti“ je određen tako da označava procenat aminokiselinskih ostataka koji su identični kod dve sekvence koje se porede, dobijen posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence su raspoređene slučajno i duž cele dužine. Poređenja sekvenci dve aminokiselinske sekvence se konvencionalno izvode poređenjem ovih sekvenci posle njihovog optimalnog poravnanja, pri čemu je navedeno poređenje izvedeno pomoću segmenta ili pomoću „prozora poređenja“ u cilju identifikacije i poređenja lokalnih regiona sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može da se dobije, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije autora Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math.
2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije autora Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
48, 443, pomoću postupka traženja sličnosti autora Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
[0201] Procenat identičnosti je izračunavan određivanjem broja identičnih položaja kod dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem položaja koji se porede i množenjem dobijenog rezultata sa 100, tako da se dobije procenat identičnosti ove dve sekvence.
[0202] Termin „transgena životinja“ označava životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgena teškog i/ili lakog lanca, ili transhromozoma (bilo integrisanih ili neintegrisanih u prirodnu genomsku DNK životinje) i koja je poželjno sposobna da eksprimira transgene. Na primer, transgeni miš može imati transgen humanog lakog lanca i transgen humanog teškog lanca ili transhromozom humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humana anti-CLDN18.2 antitela kada je imunizovan CLDN18.2 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2. Transgen humanog teškog lanca može da bude integrisan u hromozomalnu DNK miša, kao u slučaju transgenih miševa, npr. HuMAb miševa, kao što su HCo7 ili HCo12 miševi, ili transgen humanog teškog lanca može da bude održavan ekstrahromozomalno, kao u slučaju transhromozomalnih (npr. KM) miševa kao što je opisano u WO 02/43478. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi mogu da budu sposobni da proizvode višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela za CLDN18.2 (npr. IgG, IgA i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i promeni izotipa.
[0203] „Redukovati“, „smanjiti“ ili „inhibirati“, kako se ovde koristi, označava ukupno smanjenje ili sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije od 75% ili više, nivoa, npr. nivoa ekspresije ili nivoa proliferacije ćelija.
[0204] Termini kao što su „povećanje“ ili „pojačanje“ poželjno se odnose na povećanje ili pojačanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, čak poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više.
[0205] Antitela koja su ovde opisana mogu da budu proizvedena različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskog antitela, npr. standardne tehnike hibridizacije somatske ćelije autora Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su postupci hibridizacije somatske ćelije poželjni, u principu, mogu se koristiti druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr. virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike fagnog prikaza upotrebom biblioteka gena antitela.
[0206] Poželjan životinjski sistem za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro ustanovljeni postupak. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su dobro poznati u stanju tehnike. Fuzioni partneri (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i fuzioni postupci su takođe poznati.
[0207] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela su sistem pacova i zeca (npr. opisan u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).
[0208] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, humana monoklonska antitela mogu da budu generisana upotrebom transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema umesto mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomalni miševi obuhvataju miševe poznate kao HuMAb miševi i KM miševi, respektivno, i zajednički su označeni ovde kao „transgeni miševi“. Proizvodnja humanih antitela u takvim transgenim miševima može da bude izvedena kao što je detaljno opisano za CD20 u WO2004035607.
[0209] Sledeća strategija za generisanje monoklonskih antitela je direktna izolacija gena koji kodiraju antitela iz limfocita koji proizvode antitela definisane specifičnosti npr. videti Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Za detalje o inženjeringu rekombinantnog antitela takođe videti Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
[0210] Da bi se generisala antitela, miševi mogu da budu imunizovani peptidima konjugovanim sa nosačem poreklom od sekvence antigena, tj. sekvence protiv koje su usmerena antitela, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog antigena ili njegovih fragmenata i/ili ćelijama koje eksprimiraju antigen, kao što je opisano. Alternativno, miševi mogu da budu imunizovani sa DNK koja kodira antigen ili njegove fragmente. U slučaju da imunizacije koje koriste prečišćeni ili obogaćeni preparat antigena ne rezultiraju u antitelima, miševi takođe mogu da budu imunizovani ćelijama koje eksprimiraju antigen, npr. ćelijskom linijom, za stimulaciju imunih odgovora.
[0211] Imuni odgovor može da bude praćen tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma koji su dobijeni iz krvi repne vene ili retroorbitalnog vađenja krvi. Miševi sa dovoljnim titrovima imunoglobulina mogu da budu korišćeni za fuzije. Može se izvršiti busterizacija miševa intraperitonealno ili intravenski ćelijama koje eksprimiraju antigen, 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine, kako bi se povećala stopa hibridoma koji izlučuju specifično antitelo.
[0212] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, splenociti i ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa mogu da budu izolovani i fuzionisani sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. U rezultirajućim hibridomima može zatim da se ispita proizvodnja antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bunarčići mogu zatim da budu ispitivani pomoću ELISA testa za hibridome koji izlučuju antitelo. Pomoću imunofluorescencije i FACS analize upotrebom ćelija koje eksprimiraju antigen, mogu da budu identifikovana antitela sa specifičnošću za antigen. Hibridomi koji izlučuju antitelo mogu da budu ponovo zasejani na ploču, ponovo ispitivani, i ako su još uvek pozitivni na monoklonska antitela mogu da budu supklonirani metodom graničnog razblaženja. Stabilni subklonovi zatim mogu da budu kultivisani in vitro da bi se generisalo antitelo u medijumu za kulturu tkiva za karakterizaciju.
[0213] Antitela takođe mogu da budu proizvedena u transfektomu ćelije-domaćina upotrebom, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena kao što je dobro poznato u tehnici (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
[0214] Na primer, u jednom primeru izvođenja, gen(i) od interesa, npr. geni antitela, mogu da budu vezani u ekspresioni vektor kao što je eukariotski ekspresioni plazmid, kakav je korišćen u GS genskom ekspresionom sistemu opisanom u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338841 ili drugim ekspresionim sistemima dobro poznatim u tehnici. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima za antitelo može da bude uveden u eukariotske ćelije domaćine kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293T ćelije ili HEK293 ćelije ili alternativno druge eukariotske ćelije, kao što su ćelije poreklom od biljaka, ćelije gljiva ili ćelije kvasca. Postupak koji se koristi za uvođenje ovih gena može da predstavlja postupke opisane u tehnici kao što su elektroporacija, lipofektin, lipofektamin ili drugi. Posle uvođenja ovih gena antitela u ćelije-domaćine, ćelije koje eksprimiraju antitelo mogu da budu identifikovane i selektovane. Ove ćelije predstavljaju transfektome koji mogu zatim da budu amplifikovani u odnosu na njihov ekspresioni nivo i proizvedeni u većem obimu za proizvodnju antitela. Rekombinantna antitela mogu da budu izolovana i prečišćena iz ovih supernatanata kulture i/ili ćelija.
[0215] Alternativno, klonirani geni antitela mogu da budu eksprimirani u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, npr. E. coli. Pored toga, antitela mogu da budu proizvedena u transgenim ne-humanim životinjama, kao što je u mleku ovaca i zečeva ili jajima kokošaka, ili u transgenim biljkama; videti npr. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth.216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth.231: 147-157; i Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem.380: 825-839.
Himerizacija
[0216] Imunogenost mišjih antitela kod čoveka može da bude smanjena ili potpuno izbegnuta ako su odgovarajuća antitela himerizovana ili humanizovana. Himerna antitela su antitela, čiji su različiti delovi poreklom od različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju varijabilni region poreklom od mišjeg antitela i konstantni region humanog imunoglobulina. Himerizacija antitela je postignuta spajanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjeg antitela sa konstantnim regionom humanog teškog i lakog lanca (npr. kao što su opisali Kraus et al., u Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). U poželjnom primeru izvođenja himerna antitela su generisana spajanjem konstantnog regiona humanog kapa-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. U takođe poželjnom primeru izvođenja himerna antitela mogu da budu generisana spajanjem konstantnog regiona humanog lambda-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG1, IgG3 i IgG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.
Humanizacija
[0217] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno preko aminokiselinskih ostataka koji su locirani u šest regiona koji određuju komplementarnost teškog i lakog lanca (CDR). Iz ovog razloga, aminokiselinske sekvence unutar CDR su raznovrsnije između pojedinačnih antitela od sekvenci izvan CDR. Kako su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antitelo-antigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih prirodnih antitela konstrukcijom ekspresionih vektora koji obuhvataju CDR sekvence iz specifičnog prirodnog antitela kalemljenog na okvirne sekvence iz drugačijeg antitela sa drugačijim osobinama (videti, npr. Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.86: 10029-10033). Takve okvirne sekvence mogu da budu dobijene iz javnih baza podataka DNK koje obuhvataju genske sekvence antitela klicine linije. Ove sekvence klicine linije će se razlikovati od zrelih genskih sekvenci antitela zbog toga što neće obuhvatati potpuno sklopljene varijabilne gene, koji se formiraju pomoću V (D) J spajanja u toku sazrevanja B ćelija. Genske sekvence klicine linije će se takođe razlikovati od sekvenci sekundarnog repertoara antitela visokog afiniteta kod pojedinca ravnomerno duž varijabilnog regiona.
[0218] Sposobnost antitela da vežu antigen može da bude određena upotrebom standardnih analiza vezivanja (npr. ELISA, Western Blot, imunofluorescencija i analiza protočne citometrije).
[0219] Da bi se antitela prečistila, izabrani hibridomi mogu da budu gajeni u dvolitarskim spiner bocama za prečišćavanje monoklonskog antitela. Alternativno, antitela mogu da budu proizvedena u bioreaktorima na bazi dijalize. Supernatanti mogu da budu filtrirani i, ako je neophodno, koncentrovani pre afinitetne hromatografije sa protein G-sefarozom ili protein A-sefarozom. Eluirani IgG može da bude proveren pomoću gel elektroforeze i tečne hromatografije visokog učinka da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da bude zamenjen PBS-om, i koncentracija može da bude određena pomoću OD280 upotrebom koeficijenta ekstinkcije od 1.43. Monoklonska antitela mogu da budu podeljena u alikvote i čuvana na -80°C.
[0220] Da bi se odredilo da li se izabrana monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, može se koristiti mutageneza usmerena na mesto ili mutageneza usmerena na više mesta.
[0221] Da bi se odredio izotip antitela, mogu da budu izvedeni ELISA testovi izotipa pomoću različitih komercijalnih kompleta (npr. Zymed, Roche Diagnostics). Bunarčići mikrotitarskih ploča mogu da budu obloženi anti-mišjim Ig. Posle blokiranja, ploče reaguju sa monoklonskim antitelima ili prečišćenim kontrolama izotipa, na temperaturi sredine u trajanju od dva časa. Bunarčići zatim mogu da reaguju sa mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3, IgA ili mišjim IgM-specifičnom peroksidazom-konjugovanim probama. Posle ispiranja, ploče mogu da budu razvijene sa ABTS supstratom (1 mg/ml) i analizirane na OD 405-650. Alternativno, može da bude korišćen komplet IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, kat. br.1493027), kao što je opisao proizvođač.
[0222] Za demonstriranje prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa, ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može da se koristi protočna citometrija. Ćelijske linije koje eksprimiraju antigen prirodno, ili posle transfekcije, i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena (gajene pod standardnim uslovima gajenja) mogu da budu pomešane sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u supernatantima hibridoma ili u PBS koji sadrži 1% FBS, i mogu da budu inkubirane na 4°C u trajanju od 30 min.
Posle ispiranja, APC- ili Alexa647-obeleženo anti-IgG antitelo može da se veže za antigen-vezano monoklonsko antitelo pod istim uslovima kao za bojenje primarnim antitelom. Uzorci mogu da budu analizirani protočnom citometrijom pomoću FACS instrumenta upotrebom upravnog rasejanja i bočnog rasejanja svetlosti da bi se izdvojile pojedinačne žive ćelije. Da bi se razlikovala antigen-specifična monoklonska antitela od nespecifičnih vezujućih agenasa u jednom merenju, može da bude korišćen postupak ko-transfekcije. Ćelije prolazno transfektovane plazmidima koji kodiraju antigen i fluorescentnim markerom mogu da budu obojene kao što je opisano u prethodnom tekstu. Transfektovane ćelije mogu da budu detektovane u različitom fluorescentnom kanalu u odnosu na ćelije obojene antitelom. Kako većina transfektovanih ćelija eksprimira oba transgena, antigen-specifična monoklonska antitela se vezuju pretežno za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se nespecifična antitela vezuju u sličnom odnosu za netransfektovane ćelije. Alternativna analiza koja koristi fluorescentnu mikroskopiju može da bude korišćena uz, ili umesto analize protočne citometrije. Ćelije mogu da budu obojene tačno kao što je opisano u prethodnom tekstu i ispitane fluorescentnom mikroskopijom.
[0223] U cilju demonstriranja prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može se koristiti analiza imunofluorescentne mikroskopije. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju antigen bilo spontano, ili posle transfekcije, i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena gaje se u pločama sa bunarčićima pod standardnim uslovima rasta u DMEM/F12 medijumu, sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 IU/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelije zatim mogu da budu fiksirane metanolom ili paraformaldehidom ili ostavljene netretirane. Ćelije zatim mogu da reaguju sa monoklonskim antitelima protiv antigena u trajanju od 30 min. na 25°C. Posle ispiranja, ćelije mogu da reaguju sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom (Molecular Probes) pod istim uslovima. Ćelije zatim mogu da budu ispitivane pomoću fluorescentne mikroskopije.
[0224] Ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju antigen i odgovarajućih negativnih kontrola mogu da budu pripremljeni i podvrgnuti natrijum dodecil sulfatnoj (SDS) poliakrilamid gel elektroforezi. Posle elektroforeze, odvojeni antigeni će biti prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani i dovedeni u kontakt sa monoklonskim antitelima koja treba da se ispitaju. Vezivanje IgG može da bude detektovano upotrebom anti-mišjeg IgG konjugovanog sa peroksidazom i razvijeno sa ECL supstratom.
[0225] Reaktivnost antitela sa antigenom može da bude dodatno ispitana pomoću imunohistohemije na način koji je dobro poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike, npr. upotrebom krioisečaka fiksiranih u paraformaldehidu ili acetonu ili isečaka tkiva ukalupljenih u parafin fiksiranih paraformaldehidom iz uzoraka ne-kanceroznog tkiva ili tkiva kancera dobijenih od pacijenata u toku rutinskih hirurških procedura ili iz miševa koji nose ksenotransplantirane tumore inokulisane ćelijskim linijama koje eksprimiraju antigen spontano ili posle transfekcije. Za imunološko bojenje, antitela reaktivna na antigen mogu da budu inkubirana, a zatim kozja antimišja antitela konjugovana sa peroksidazom rena ili kozja anti-zečja antitela (DAKO) prema uputstvima dobavljača.
[0226] Konjugati antitela koji se vezuju za CLDN18.2 takođe mogu da budu testirani u in vivo modelu (npr. u imunodeficijentnim miševima koji nose ksenotransplantirane tumore inokulisane ćelijskim linijama koje eksprimiraju CLDN18.2, npr. DAN-G, SNU-16 ili KATO-III, ili posle transfekcije, npr. HEK293) da bi se odredila njihova efikasnost u kontroli rasta ćelija tumora koje eksprimiraju CLDN18.2.
[0227] Konjugati antitela mogu se primene kod miševa bez tumora nakon injekcije ćelija tumora kako bi se merili efekti konjugata antitela u sprečavanju formiranja tumora ili simptoma povezanih sa tumorom. Konjugati antitela mogu da se primene kod miševa koji nose tumor da bi se odredila terapijska efikasnost odgovarajućih konjugata antitela u smanjenju rasta tumora, metastaze ili simptoma povezanih sa tumorom. Primena konjugata antitela može da bude kombinovana sa primenom drugih supstanci, kao citostatskih lekova, inhibitora faktora rasta, blokatora ćelijskog ciklusa, inhibitora angiogeneze ili drugih antitela, za određivanje sinergističke efikasnosti i potencijalne toksičnosti kombinacija. Da bi se analizirali toksični sporedni efekti posredovani konjugatima antitelima, životinje mogu da budu inokulisane konjugatima antitelima ili kontrolnim reagensima, i simptomi koji mogu da budu povezani sa terapijom konjugatom anti-CLDN18.2 antitela temeljno ispitani. Mogući sporedni efekti in vivo primene konjugata anti-CLDN18.2 antitela naročito obuhvataju toksičnost na tkivima koja eksprimiraju CLDN18.2, uključujući želudac.
[0228] Mapiranje epitopa prepoznatih od strane antitela može da bude izvedeno kao što je detaljno opisano u „Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) autora Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u „Epitope Mapping: A Practical Approach“ Practical Approach Series, 248 autora Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.
[0229] Jedinjenja i agensi koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije.
[0230] Farmaceutske kompozicije su poželjno sterilne i sadrže efikasnu količinu konjugata antitela opisanih ovde i opciono drugih agenasa kako je ovde diskutovano da bi se stvorila željena reakcija ili željeni efekat.
[0231] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u jednačenom doznom obliku i mogu da budu pripremljene na način koji je sam po sebi poznat. Farmaceutska kompozicija može npr. da bude u obliku rastvora ili suspenzije.
[0232] Farmaceutska kompozicija može da sadrži soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijense od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Termin „farmaceutski prihvatljiv“ označava netoksičnost materijala koji ne interaguje sa delovanjem aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0233] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu da budu korišćene za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli i obuhvaćene su u navodima. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže na neograničavajući način one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, ćilibarne kiseline i slično. Farmaceutski prihvatljive soli takođe mogu da budu pripremljene kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su soli natrijuma, soli kalijuma ili soli kalcijuma.
[0234] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.
[0235] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0236] Injektabilna formulacija može da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens kao što je Ringerov laktat.
[0237] Termin „nosač“ označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili sintetičku po prirodi, u kojoj je aktivna komponenta kombinovana u cilju olakšavanja, pojačavanja ili omogućavanja primene. Prema navodima, termin „nosač“ takođe obuhvata jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su pogodne za primenu kod pacijenta.
[0238] Moguće nosačke supstance za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringerov rastvor, Ringerov laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenisani naftaleni i, naročito, biokompatibilni laktidni polimeri, laktid/glikolid kopolimeri ili polioksietilen/polioksipropilen kopolimeri.
[0239] Termin „ekscipijens“, kada se ovde koristi, namenjen je da označava sve supstance koje mogu da budu prisutne u farmaceutskoj kompoziciji i koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr. nosači, vezujuća sredstva, lubrikanti, sredstva za zgušnjavanje, površinski aktivna sredstva, konzervansi, emulgatori, puferi, sredstva za poboljšanje ukusa ili boje.
[0240] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani bilo kojim konvencionalnim putem, kao parenteralnom primenom uključujući injekcije ili infuzije. Primena je poželjno parenteralna, npr. intravenska, intraarterijska, supkutana, intradermalna ili intramuskularna.
[0241] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih vehikuluma i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, uobičajeno se koriste sterilna, fiksna ulja kao medijum za rastvaranje ili suspendovanje.
[0242] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani primenjuju se u efikasnim količinama. „Efikasna količina“ označava količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat pojedinačno ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo obuhvata usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, prekid ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja takođe može da bude odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja.
[0243] Efikasna količina agensa ili kompozicije koji su ovde opisani zavisiće od stanja koje se leči, težine bolesti, pojedinačnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje tretmana, tip prateće terapije (ako je prisutna), specifičan put primene i slične faktore. Prema tome, doze primenjenih agenasa opisane ovde mogu da zavise od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna pri početnoj dozi, mogu da se koriste veće doze (ili efikasno veće doze koje se postižu različitim, lokalizovanijim putem primene).
[0244] Agensi i kompozicije date ovde mogu da se koriste sami ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim režimima kao što su hirurška operacija, zračenje, hemoterapija i/ili transplantacija koštane srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).
[0245] Lečenje kancera predstavlja oblast u kojoj su kombinovane strategije posebno poželjne jer često kombinovano dejstvo dva, tri, četiri ili čak više lekova/terapije protiv kancera stvara sinergističke efekte koji su znatno jači od uticaja monoterapijskog pristupa. Prema tome, u još jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, lečenje kancera može da bude efikasno kombinovano sa raznim drugim lekovima. Među takvima su npr. kombinacije sa konvencionalnim terapijama za tumor, strategijama sa više epitopa, dodatnom imunoterapijom i pristupima lečenja usmerenim na angiogenezu ili apoptozu (za pregled videti npr. Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743.) Sekvencijalna primena različitih agenasa može da inhibira rast ćelija kancera na različitim kontrolnim tačkama, dok drugi agensi mogu npr. da inhibiraju neoangiogenezu, preživljavanje malignih ćelija ili metastaza, potencijalno pretvarajući kancer u hroničnu bolest.
[0246] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani kod pacijenata, npr. in vivo, za lečenje ili prevenciju različitih poremećaja kao što su oni ovde opisani. Poželjni pacijenti obuhvataju humane pacijente koji imaju poremećaje koji mogu da budu korigovani ili poboljšani primenom agenasa i kompozicija koje su ovde opisane. Ovo obuhvata poremećaje koji uključuju ćelije koje se karakterišu izmenjenim obrascem ekspresije CLDN18.2.
[0247] Na primer, u jednom primeru izvođenja, agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da budu korišćeni za lečenje pacijenta obolelog od kancera, npr. bolesti kancera, kao što je ovde opisano, okarakterisane prisustvom ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2.
[0248] Farmaceutske kompozicije i postupci za lečenje opisani prema navodima takođe mogu da budu korišćeni za imunizaciju ili vakcinaciju za prevenciju bolesti koja je ovde opisana.
[0249] Predmetni navodi su dodatno ilustrovani sledećim primerima koje ne treba smatrati ograničavajućim za obim navoda.
PRIMERI
PRIMER 1: MATERIJALI I METODE
1. Endocitoza
[0250] Endocitoza IMAB362 vezanog za CLDN18.2 je određena korišćenjem testa endocitoze zasnovanog na citotoksičnosti koji se oslanja na ko-internalizaciju antitela vezanog za ciljni molekul i saporinom konjugovanog antihumanog ili antimišjeg IgG Fab fragmenta (Fab-ZAP humani, Advanced Targeting Systems, IT-51, Lot: #93-23; Fab-ZAP mišji, Advanced Targeting Systems, IT-48, Lot: #93-21). Saporin je protein koji inaktivira ribozome, koji nakon internalizacije inhibira biosintezu proteina i stoga dovodi do smrti ćelije. Da bi se garantovala optimalna ćelijska liza, antitelo Fab-ZAP je primenjeno pri molarnosti koja je najmanje 6 puta veća nego kod ciljnog antitela.
[0251] Stabilno transfektovane ćelije HEK293~CLDN18.2 su sakupljene pomoću 0.05% tripsina/EDTA (Gibco, 25300-054) i 2.5 × 10<3>ćelija/bunarčiću je zasejano u 50 µl medijuma za rast u ploči za ćelijsku kulturu sa 96 bunarčića. Nakon 24 h, ćelijama je dodato 25 µl Fab-ZAP i 25 µl anti-CLDN18.2 mAB ili izotipskog kontrolnog antitela razblaženog u medijumu ćelijske kulture (Tabela 1). Ćelije su kultivisane još 72 h.
Tabela 1: Koncentracije anti-CLDN18.2 mAB i Fab-ZAP za test endocitoze. Molekulska težina:<~>150 kDa za IMAB362 i 110 kDa za FabZAP.
[0252] Vijabilnost ćelija je analizirana kao što je opisano pod 6. Ćelije inkubirane bez antitela u prisustvu Fab-ZAP korišćene su kao kontrola.
2. Mapiranje epitopa
[0253] Antigeni epitop odgovoran za specifičnost CLDN18.2 analiziran je protočnom citometrijom (videti 5) na ćelijama HEK293T koje prolazno prekomerno eksprimiraju mutante CLDN18.2. Ukupno osam mutanata CLDN18.2 sa supstitucijama jedne aminokiseline unutar prvog ekstracelularnog domena generisano je PCR tehnikom. U tom cilju, aminokiseline u CLDN18.2 su supstituisane aminokiselinama homolognog proteina CLDN18.1 na odgovarajućim pozicijama. Ćelije HEK293T su ko-transfektovane plazmidima koji kodiraju specifični mutant CLDN18.2 i EGFP kao reporterski gen. Prečišćena antitela su testirana u koncentraciji od 5 µg/ml, dok su antitela dobijena iz supernatanta hibridoma razblažena do 1:4 pre testiranja. Da bi se utvrdilo da li je na vezivanje antitela uticala specifična supstitucija aminokiselina, srednji intenzitet fluorescencije (MFI) izmeren u transfektovanoj (EGFP pozitivnoj) ćelijskoj populaciji je upoređen između mutanta koji pokazuje najveću vrednost MFI i mutanta od interesa. Ako je MFI mutanta od interesa bio ispod 50%, aminokiselinski ostatak je okarakterisan kao esencijalni za vezivanje antitela i specifičnost CLDN18.2.
3. Konjugati antitela i leka
[0254] Konjugacije DM4 i vcMMAE na monoklonsko antitelo IMAB362 (serija # p412118) i analitička karakterizacija su obavljene u Piramal Healthcare (Grangemouth, UK). Postupci su ukratko opisani u sledećem odeljku:
DM4 je kuplovan sa IMAB362 preko SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat). Reagens SPDB je amino i sulfhidril reaktivni heterobifunkcionalni proteinski agens za umrežavanje koji reaguje preko N-hidroksisukcinimidnog (NHS) estra sa primarnim aminima (kakvi se nalaze u bočnim lancima lizina ili N-kraju proteina) antitela i preko piridinildisulfidne grupe sa sulhidril grupom DM4 da bi se dobila reverzibilna disulfidna veza (Slika 1). Ukratko, za konjugaciju DM4, IMAB362 je dijafiltriran u PBS pufer (pH 7.2) korišćenjem filtera ultra centrifuge i kuplovan sa SPDB u molarnom odnosu 1:6 (IMAB362:SPDB) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Modifikovano antitelo je dijalizovano nasuprot 35 mM citratnog pufera (pH 5.5) i određen je odnos linkera i antitela. DM4 je konjugovan sa IMAB362-SPDB u molarnom odnosu 1:6 (IMAB362-SPDB:DM4) tokom 19 h na 2-8 °C. Konjugovano antitelo je podešeno puferom za skladištenje (20 mM His, 85 mg/ml saharoze, pH 5.8) i čuvano na -80 °C. Odnos antitela i leka je analiziran UV spektrometrijom, sadržaj monomera pomoću SEC-HPLC, a sadržaj slobodnog leka pomoću RP-HPLC.
vcMMAE je kuplovan sa tiolovanim IMAB362. Stoga je IMAB362 inicijalno tiolovan heterobifunkcionalnim linkerom 2-IT (2-iminotiolan) koji reaguje sa slobodnim aminima lizinskih ostataka. Zatim je vcMMAE, koji sadrži peptidni linker Val-Cit (vc), koji može da se otcepi katepsinom, konjugovan preko valina sa sulfhidrilnom grupom tiolovanog antitela (Slika 1). Ukratko, IMAB362 je dijafiltriran u PBS pufer (pH 7.2) korišćenjem filtera ultra centrifuge i inkubiran sa 2-IT u molarnom odnosu 1:20 (IMAB362:2-IT) tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Modifikovano antitelo je dijalizovano u 35 mM citratni pufer (pH 5.5) i određen je odnos linkera i antitela. Nakon toga, vcMMAE je konjugovan sa tiolovanim IMAB362 u molarnom odnosu 1:6 (IMAB362-SH:vcMMAE) inkubacijom tokom 20 h na 2-8 °C. Konjugovana antitela su dijalizovana u pufer za skladištenje (20 mM His, 85 mg/mL saharoze, pH 5.8) i čuvana na -80 °C. Odnos antitela leka je analiziran UV spektrometrijom, sadržaj monomera pomoću SEC-HPLC, a sadržaj slobodnog leka pomoću RP-HPLC.
4. Ćelijska kultura
[0255] Ćelijske linije su kultivisane u skladu sa uputstvima dobavljača i Ganimedovim podacima o ćelijskim linijama u medijumu specifičnom za ćelijski tip na 37 °C u inkubatorima sa ovlaživačem sa 5% ili 7.5% CO2(Tabela 2). Mediji i suplementi za ćelijske kulture su nabavljeni od kompanija Invitrogen, Gibco i Sigma.
Tabela 2: Sistemi ćelijskih modela.
5. Protočna citometrija
[0256] Relativni afiniteti vezivanja i specifičnosti golih anti-CLDN18.2 antitela i konjugata leka antitela određeni su protočnom citometrijom korišćenjem ćelijskih linija pozitivnih i negativnih na CLDN18.2.
[0257] Ćelije iz eksponencijalno rastuće kulture su sakupljene pomoću 0.05% tripsina/EDTA (Gibco, 25300-054) i prebrojane korišćenjem Neubauerove komore za brojanje. Ćelije su centrifugirane 5 minuta na 1500 o/min (468 × g), supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u FACS puferu (PBS koji sadrži 2% FCS (Gibco, 10270-106) za analizu sa antitelima konjugovanim sa toksinom, PBS koji sadrži 2% FCS i 2 mM EDTA za skrining golih antitela reaktivnih na CLDN18.2) pri 2 × 10<6>ćelija/ml. Na mikrotitarsku ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom preneto je po 100 µl ćelijske suspenzije po bunarčiću (odgovara 2 × 10<5>ćelija/bunariću). Nakon centrifugiranja u trajanju od 1 min na 1500 o/min, supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u FACS puferu koji sadrži antitela konjugovana sa toksinom ili gola antitela u odgovarajućim koncentracijama (do 20 µg/ml za merenje relativnog afiniteta ili 50 µg/ml za kontrolu ekspresije) i inkubirano 30-45 min na 4 °C (Tabela 3). Ćelije su centrifugirane 1 min na 1500 o/min i supernatant je odbačen. Nakon što su ćelije isprane tri puta FACS puferom, ponovo su suspendovane u FACS puferu koji sadrži APC-konjugovani anti-humani IgG (Jackson Immuno Research, 109-136-170) ili APC-konjugovani kozji-anti-mišji IgG (Jackson Immuno Research, 115-136-146) ili Protein L-FITC (1 µg/ml, analiza chim mAB294) i inkubirana 30 minuta na 4 °C (Tabela 3). Posle inkubacije, 100 µl FACS pufera je dodato u svaki uzorak, ćelije su centrifugirane 1 min na 1500 o/min i supernatant je odbačen. Korak ispiranja sa FACS puferom je ponovljen dva puta. Na kraju, ćelije su resuspendovane u 100 µl FACS pufera i vezivanje je određeno korišćenjem uređaja BD FACS Array Bioanalyzer.
[0258] Treba napomenuti da su antitela konjugovana toksinom i gola antitela primenjena u jednakim koncentracijama. Razlike između molekulske težine antitela su zanemarene.
Tabela 3: Eksperimentalni detalji protočne citometrije.
6. Test vijabilnosti
[0259] Efekat IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE na vijabilnost ćelija određen je kolorimetrijskim testom koji detektuje ćelijske metaboličke aktivnosti. Test se zasniva na sposobnosti metabolički aktivnih ćelija da redukuju žuti XTT (2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolijum-5-karboksanilid) u narandžasto obojeno jedinjenje formazan koje može da se detektuje spektrofotometrijom. Intenzitet boje je proporcionalan broju živih ćelija.
[0260] Ćelije su sakupljene pomoću 0.05% tripsina/EDTA (Gibco, 25300-054), resuspendovane u medijumu ćelijske kulture (Tabela 2) i 50 µl ćelijske suspenzije sa odgovarajućom količinom ćelija je zasejano po bunarčiću u ploče za ćelijsku kulturu sa 96 bunarčića. (Tabela 4). Posle 24 h, dodata su IMAB362 konjugovana sa toksinom ili kontrolna antitela razblažena u 50 µl medijuma u odgovarajućim koncentracijama i ćelije su kultivisane još 72 h.
Tabela 4: Pregled ćelijskih linija korišćenih u testovima vijabilnosti.
[0261] Vijabilnost ćelija je analizirana korišćenjem kompleta AppliChem Cell proliferation Kit II (AppliChem, A8088, 1000) prema uputstvima proizvođača. Posle 3-5 h inkubacije sa XTT reagensom, merena je apsorpcija na 480 nm (referenca 630 nm) korišćenjem spektrofotometra (Tecan). Smanjenje vijabilnosti je izračunato korišćenjem sledeće jednačine:
blank: kontrola medijuma
kontrola: ćelije bez antitela
uzorak: ćelije sa antitelom
[0262] Vrednosti EC50 su određene pomoću GraphPad Prism 6 korišćenjem nelinearne regresije.
7. Test „bystander“
[0263] Analizirana je „bystander“ aktivnost antitela IMAB362 konjugovanih sa toksinom na ciljno-negativnim ćelijama in vitro ko-kultivisanjem CLDN18.2-negativne, ćelijske linije PA-1(Luc) koja eksprimira luciferazu u prisustvu ili odsustvu CLDN18.2-pozitivne ćelijske linije NUGC-4 10cE8. Dakle, 1.5 × 10<3>PA-1(Luc) ćelija po bunarčiću je zasejano kao pojedinačna kultura ili zajedno sa 1.5 × 10<3>NUGC-4 10cE8 ćelija po bunarčiću za ko-kulturu u RPMI medijumu sa dodatkom 10% FCS i 1% pen/strep. Posle 24 h, dodati su IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE ili nekonjugovani IMAB362 kao negativna kontrola i ćelije su kultivisane još 72 h. Vijabilnost ćelija je analizirana kao što je opisano pod 6. Liza ciljno-negativnih ćelija je određena merenjem bioluminiscencije ćelija PA-1(Luc) koje eksprimiraju luciferazu. U tom cilju, dodato je 50 µl mešavine luciferina (1.92 mg/ml D-luciferina (Sigma, 50227) i 160 mM HEPES u ddH2O) po bunarčiću. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi 90 min i bioluminiscencija je merena pomoću luminometra (Infinite M200, TECAN). Rezultati su izraženi kao integrisane relativne vrednosti svetlosnih jedinica (RLU). Smanjenje vijabilnosti je izračunato kao što je opisano pod 6.
8. Eksperimenti na životinjama
[0264] Sve studije ksenotransplantata su sprovedene u skladu sa nacionalnim propisima i etičkim smernicama za eksperimentalne studije na životinjama. Sve životinje su držane u specifičnim uslovima bez patogena u pojedinačnim ventilisanim kavezima i u ciklusu veštačkog svetla i mraka od 12 sati. Hrana i voda su bile dostupne po želji. Pre početka studija, miševima je dozvoljeno da se aklimatiziraju najmanje 6 dana.
8.1. Studija maksimalne tolerisane doze (MTD)
[0265] Ksenotransplantati tumora su inokulisani supkutanom injekcijom od 8.5 × 10<6>BxPC-3~CLDN18.2 ćelija humanog tumora pankreasa u 200 µl PBS u bokove ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu. Da bi se odredila MTD i efikasnost konjugata anti-CLDN18.2 antitela i leka, miševi sa tumorom su primili različite doze IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE. Maksimalna primenljiva doza bila je ograničena koncentracijom antitela i zapreminom injekcije koju preporučuje GV-SOLAS za intravenoznu injekciju kod miševa (~200 µl). Oba antitela su primenjena u maksimalnoj koncentraciji kao pojedinačna i ponovljena doza (tj. 15, odnosno 16 mg/kg), kao i polovina ove koncentracije (tj. 7.5, odnosno 8 mg/kg) ili kontrola vehikuluma (veličina grupe: n = 5). Antitela su ubrizgana intravenski 14. dana nakon transplantacije i za ponovljene doze dodatno 21. dana nakon transplantacije. Telesna težina, zdravlje životinja, ponašanje i veličina tumora su praćeni dva puta nedeljno pomoću kalipera, a zapremine tumora su izračunate prema sledećoj formuli: [dužina × širina × (širina/2)]. Sve životinje su secirane kada je prvi tumor grupe koja je primala vehikulum dostigao maksimum od 1400 mm<3>ili kada je tumor postao ulcerozan (49. dan nakon transplantacije za IMAB362-DM4, 37. dan nakon transplantacije za IMAB362-vcMMAE). Uzorci krvi za kliničku hemiju su sakupljeni pod opštom anestezijom započetom sa 250 µl i.p. smeše koja se sastoji od 1.25 ml ketamina, 1 ml ksilazina (2%) i 7.75 ml H2O. Nakon toga, miševima je urađena perfuzija sa PBS-om, nakon čega je usledila perfuzija sa 4% formalina pod opštom anestezijom. Odabrani organi i tkiva (želudac, jednjak, mozak, srce, bubreg, jetra, pluća, pankreas, slezina, dvanaestopalačno crevo, ileum, debelo crevo, materica i jajnici) su secirani i fiksirani u 4% formalinu, čuvani na 4 °C i na kraju obloženi parafinom. Isečci tkiva od tri mikrometra su isečeni iz svakog uzorka FFPE (fiksiranog formalinom i obloženog parafinom) i postavljeni na lepljive pločice (SuperFrost Ultra Plus, Thermo Fisher Scientific). Posle očvršćavanja od 60 minuta na 58 °C, FFPE isečci tkiva su deparafinizovani korišćenjem ksilena i rehidrirani kroz seriju razblaženja etanola (2x 100%, 2x 96%, 2x 70% etanol, svaki po 3 min). Nukleusi su bojeni Mayerovim hematoksilinom 5 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledilo plavljenje pomoću česmenske H2O. Nakon toga, citoplazma je obojena 0.5% vodenim rastvorom eozina tokom 2 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon dehidracije kroz seriju razblaženja etanola i ksilena, isečci su pričvršćeni korišćenjem nevodenog medijuma za pričvršćivanje X-TRA Kit.
8.2. Klinička biohemija
[0266] Da bi se ispitala moguća toksičnost za organe, relevantni markeri toksičnosti za pankreas, nefrotoksičnosti i hepatotoksičnosti su analizirani u uzorcima seruma.
[0267] Nivoi alanin aminotransferaze/glutaminsko-piruvične transaminaze (GPT), aspartat aminotransferaze/glutaminsko-oksalosirćetne transaminaze (GOT), gama-glutamiltransferaze (gama-GT), alkalne fosfataze (AP), glutamat-dehidrogenaze (GLDH), kreatinina, kreatinin kinaze (CK), uree, holinesteraze, bilirubin, lipaze, alfa-amilaze, laktat dehidrogenaze (LDH), albumina i ukupnog proteina su određivani na univerzitetu Univerzitetske medicine Johannes Gutenberg (Mainz, Nemačka). Uzorci seruma su pripremljeni iz krvi dobijene nakon konačnog krvarenja. Krv je sakupljena retrobulbarnom venepunkcijom nakon što su miševi anestezirani ketaminom/ksilazinom.
8.3. Studije efikasnosti
[0268] Za uspostavljanje ksenotransplantata humanih tumora, odgovarajući broj ćelija je suspendovan u zapremini od 200 µl PBS i ubrizgan su supkutano u bok ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu. Miševi koji nose tumor lečeni su jednom intravenskom injekcijom IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE u dozama koje ne prelaze MTD. Kontrola golih antitela davana je dva puta nedeljno naizmenično IV/i.p. injekcijama od ~8 mg/kg IMAB362. U studijama lečenja rane faze, lečenje je započeto 3 dana nakon transplantacije. U studijama lečenja uznapredovale faze, tumori su porasli do zapremine između 50 i 200 mm<3>, a miševi su preraspoređeni u kontrolne grupe i grupe koje se tretiraju antitelima sa homogenim srednjim zapreminama tumora pre tretmana. Telesna težina, zdravlje životinja, ponašanje i veličina tumora praćeni su dva puta nedeljno pomoću kalipera. Zapremine tumora su izračunate po sledećoj formuli: [dužina × širina × (širina/2)]. Kriterijum za prekid bila je veličina tumora >16 mm u dužinu ili širinu ili izračunata zapremina > 1400 mm<3>. Sledeći kriterijumi za prekid bili su ulcerozni tumori ili gubitak više od 10% telesne težine kod životinje. U slučaju potpune inhibicije rasta tumora, miševi su posmatrani 120 dana nakon tretmana. Perzistentni tumori su preparirani i fiksirani u 4% formalinu za naredne IHC studije.
9. Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)
[0269] Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) određena je merenjem sadržaja intracelularnog ATP-a u neliziranim ćelijama nakon dodavanja humanih PBMC u ciljne ćelije u prisustvu konjugata IMAB362 i toksina. Bioluminiscencija generisana luciferazom je korišćena za kvantifikaciju ATP-a.
[0270] Ciljne ćelije NUGC-410cF7_5 sort3a p3151#10 su zasejane u definisanom broju ćelija (8 × 10<6>ćelija) dva dana pre testa da bi se dobila ponovljiva konfluentnost.
[0271] Ciljne ćelije su sakupljene pomoću 0.05% tripsina/EDTA (Gibco, 25300-054) i podešene na koncentraciju od 1.6 × 10<5>ćelija/ml u medijumu za rast koji sadrži 20 mM HEPES (Gibco, 15630-056). 8 × 10<3>ćelija po bunarčiću je zasejano u belu PP ploču sa 96 bunarčića i inkubirano ~5 h na 37 °C i 5% CO2.
[0272] PBMC su pripremljeni iz svežih leukocitno-trombocitnih slojeva dobijenih od zdravih davalaca. Oko 20-25 ml krvi je razblaženo (1:2) PBS-om u 3 Falcon epruvete i pažljivo naneto na 15 ml Ficol-Paque Plus (GE Healthcare, 17144003) u četiri Falcon epruvete od 50 ml. Gradijenti su centrifugirani (25 min, 700 × g, bez kočenja). Nakon centrifugiranja PBMC su sakupljeni iz interfaze, isprani u 50 ml PBS/2mM EDTA, centrifugirani (5 min, 468 × g), ponovo resuspendovani u 50 ml PBS/2 mM EDTA i ponovo centrifugirani (10 min, 208 × g) da bi se uklonili trombociti. Talozi su resuspendovani u 50 ml PBS/2 mM EDTA i ćelije su izbrojane. Nakon toga, PBMC su centrifugirani (5 min, 468 × g), resuspendovani u medijumu za kulturu X-Vivo-15 (Lonza, BE04-418Q) koji sadrži 5% humanog seruma i kultivisani 1.5 h na 37 °C, 5% CO2. PBMC su sakupljeni, centrifugirani (5 min, 468xg) i resuspendovani u medijumu za kulturu X-Vivo-15 (Lonza, BE04-418Q) podešavanjem koncentracije ćelija (za odnos E:T od 40:1) na 1.28 × 10<7>ćelija/ml. IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE i IMAB362 su serijski razblaženi (u koracima razblaživanja od 4.5 puta) 11 puta, što je rezultovalo opsegom koncentracije između 160 µg/ml i 0.05 ng/ml (finalna koncentracija od 40 µg/ml/ml do 0.01 ng/ml). Ciljnim ćelijama je dodato po 25 µl svakog razblaženja i svaki uslov je urađen u četiri primerka. PBS bez antitela je dodat u medijum i kontrolne bunarčiće za potpunu lizu. Nakon toga, 25 µl pripremljenih PBMC (3.2 × 10<5>ćelija) je dodato u svaki bunarčić da bi se postigao odnos E:T od 40:1 i ploče su inkubirane 15h ± 1h na 37 °C, 5% CO2. Posle inkubacije preko noći, 10 µl 8% rastvora Triton X-100/PBS je dodato u kontrolne bunarčiće za maksimalnu lizu i 10 µl PBS u druge bunarčiće. Konačno, 50 µl sveže pripremljenog štok rastvora luciferina je dodato (160 mM HEPES, 1x PBS, 3.84 mg/ml D-Luciferin (Sigma Aldrich, 50227)) u svaki bunarčić i ploče su inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Bioluminiscencija je merena pomoću luminometra (Infinite M200, TECAN). Rezultati su izraženi kao integrisane relativne vrednosti svetlosnih jedinica (RLU).
[0273] Specifična liza se izračunava kao:
(maks. vijabilnih ćelija: 10 µl PBS, bez antitela; potpuna liza: 10 µl 8% (zapr./zapr.) Triton X-100 u PBS-u, bez antitela)
[0274] Svi ADCC podaci su obrađeni pomoću GraphPad Prism 6 korišćenjem funkcije „log(agonist) vs response - find EC anything“. Maksimalna liza je definisana kao raspon (razlika od vrha do dna) krive doza-odgovor, pri čemu je maksimum 100%.
10. Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC)
[0275] Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) određena je merenjem sadržaja intracelularnog ATP-a u neliziranim ćelijama nakon dodavanja humanog komplementa ciljnim ćelijama u prisustvu konjugata IMAB362 i toksina. Kao očitavanje merena je bioluminiscencija zavisna od ATP-a koju generiše luciferaza.
[0276] Ciljne ćelije NUGC-410cF7_5 sort3a p3151#10 ili KATO-III FGF-BP#12 adM p3151#25 su zasejane u definisanom broju ćelija (8 × 10<6>, odnosno 9 × 10<6>ćelija) dva dana pre testa da bi se dobila ponovljiva konfluentnost.
[0277] Ciljne ćelije su sakupljene pomoću 0.05% tripsina/EDTA i podešene na koncentraciju od 1.6 × 10<5>ćelija/ml u njima odgovarajućem medijumu za kulturu koji sadrži 10% (zapr./zapr.) FCS. U belu ploču sa 96 bunarčića zasejano je 8 × 10<3>ćelija i inkubirano na 37 °C i 5% CO2. Nakon 24 h, dodato je 50 µl antitela serijski razblaženih u medijumu za test (60% RPMI, koji sadrži 20 mM HEPES; 40% humanog seruma, prikupljenog od nekoliko zdravih davalaca) (konačna koncentracija 80 µg/ml do 78.13 ng/ml) i ćelije su inkubirane 80 minuta na 37 °C i 5% CO2. Nakon toga, 10 µl 8% (zapr./zapr.) Triton X-100 u PBS-u je dodato kontrolama potpune lize, dok je 10 µl PBS-a dodato u sve ostale bunarčiće (kontrole maksimuma vijabilnih ćelija i pravi uzorci). Reakcija luciferaze je započeta dodavanjem 50 µl smeše luciferina (3.84 mg/ml D-luciferina, 160 mM HEPES u ddH2O) po bunarčiću. Ploča je držana u mraku na sobnoj temperaturi 90 min i bioluminiscencija je merena pomoću luminometra (Infinite M200, TECAN). Rezultati su izraženi kao integrisane relativne vrednosti svetlosnih jedinica (RLU).
[0278] Specifična liza se izračunava kao:
(maks. vijabilnih ćelija: 10 µl PBS, bez antitela; potpuna liza: 10 µl 8% (zapr./zapr.) Triton X-100 u PBS-u, bez antitela)
[0279] Svi CDC podaci su obrađeni pomoću GraphPad 6 korišćenjem funkcije „log(agonist) vs response - find EC anything“. Maksimalna liza je definisana kao raspon (razlika od vrha do dna) krive doza-odgovor, pri čemu je maksimum 100%.
PRIMER 2: SKRINING ENDOCITOZE SPECIFIČNIH ANTI-CLDN18.2 ANTITELA
[0280] Dok u terapiji tumora golim antitelima, internalizacija antitela vezanih za ciljni molekul može da smanji broj membranski vezanih antitela dostupnih za glavni način delovanja, npr. ADCC i CDC, endocitoza je karakteristika od suštinskog značaja za razvoj konjugata antitelo-lek (ADC). Jedna važna osobina ADC je endocitoza kompleksa ciljni molekul-ADC. Stoga je stopa endocitoze golog antitela jedan od suštinskih ključnih faktora za razvoj antitela konjugovanih sa toksinom.
[0281] Svojstva vezivanja, tj. relativni afinitet prema CLDN18.2, unakrsna reaktivnost na CLDN18.1 i antigeni epitop koji posreduje u specifičnosti za CLDN18.2, određeni su za različita mišja i himerna anti-CLDN18.2 antitela analizom protočnom citometrijom (Tabela 5 i Tabela 6). Antitela koja pokazuju visoko vezivanje za CLDN18.2 su odabrana za dalji skrining endocitoze.
[0282] Efikasnost endocitoze različitih CLDN18.2-specifičnih i CLDN18.2/CLDN18.1-reaktivnih antitela je testirana in vitro ko-inkubacijom antitela sa Fab fragmentima konjugovanim sa saporinom (Fab-ZAP) zajedno sa HEK293~CLDN18. 2 ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2. Nakon ko-internalizacije sa antitelom vezanim za ciljni molekul, saporin inhibira biosintezu proteina ćelije što dovodi do smrti ćelije koja se može pratiti testom vijabilnosti ćelija. Ovaj postupak je indirektan način za procenu endocitoze kompleksa ciljni molekul-antitelo. Antitela su testirana kao himerna antitela kada su dostupna, inače je skrining endocitoze obavljen sa mišjim antitelima.
[0283] Chim mAb362 (IMAB362) kao i chim mAB294 mogu efikasno da se internalizuju nakon vezivanja za CLDN18.2, što dovodi do smanjenja vijabilnosti ćelija HEK293~CLDN18.2 čak i pri veoma niskim koncentracijama antitela (IMAB362: EC50 = 11 ng/ml; chim mAB294: EC50 = 10 ng/ml). Nasuprot tome, chim mAB308 i chim mAB359 nisu smanjili vijabilnost ćelija (Slika 2). Kako chim mAB294 i chim mAB359 pokazuju slične relativne afinitete vezivanja i pokazuju značajna odstupanja u internalizaciji (chim mAB294: EC50 = 10 ng/ml; chim mAB359: bez endocitoze), izgleda da je efikasnost endocitoze ne samo u korelaciji sa afinitetom vezivanja antitela, već zavisi i od vezujućeg epitopa.
[0284] Čak je i internalizacija mu mAB362 bila superiornija u odnosu na sva druga testirana mišja CLDN18.2-reaktivna antitela koja nisu pokazala značajnu endocitozu u Fab-Zap testu (Slika 3). Ukratko, CLDN18.2-specifična antitela IMAB362 i chim mAB294 su efikasno internalizovana nakon vezivanja za CLDN18.2 i pogodna su za dalju evaluaciju kao konjugati antitela i leka.
Tabela 5: Relativni afinitet vezivanja i specifičnost CLDN18.2-reaktivnih antitela. Vezivanje za CLDN18.2 (EC50 normalizovano [%] i maksimalno vezivanje normalizovano [%] su normalizovani na IMAB362) i CLDN18.1-reaktivnost su određeni protočnom citometrijom na ćelijama HEK293 koje stabilno eksprimiraju odgovarajući protein. Antigeni epitop odgovoran za specifičnost za CLDN18.2 analiziran je protočnom citometrijom na HEK293T ćelijama koje prolazno prekomerno eksprimiraju odgovarajući mutant CLDN18.2. n.a.: nije analizirano. Antitela označena istim brojem (1, 2, 3 ili 4) su testirana u istom testu vezivanja. 1 -3: detekcija sa APC-konjugovanim sekundarnim antitelom; 4: detekcija sa ProteinL-FITC; n.a:.nije analizirano.
. P iil iaksA
-Z1im 2
83arn
ab sa ilim
nd97 ] Fo im 19[% snen
seku
2. jenoačEP
36an do znimiz
AB
aoan
je eziv
ovaI vi<j>e,etr li<m>gatnju
znasaaks.
om tit<e>
o
tpoanalucm
],ci C-k
4 e
[%čn<e>s
AP29ažeto cij
cerjasa AB
m van
proiza
i an knal a
cijvezi
jemek 2 jetert
čen36<e>tde
ain
<n>itćen
1:ABi riš ele
IM
i af
ko cen
i<j>a.
isuja<v>npro
op<o>zu
aćel
ion
8 cit tnelati
sti
oreg
77g6.Rdo<e>k
iln
endir
b o4 laIniln 41i<t>e
jei
.vij<a>
b01nt
aannja
st<u>ij<a>
O2 a
hte var ineziv
iv
a. vvez omcafi<č>
zagecii st<u>t<e>lven tidru
an an
-sp te
usek
h.2 m
ikaz 3 kaeni8 rto
saed N1 p is
u i<n>s
v Dsu a im
nna2 kis<e>lu CLan36
t<i>račeo za zn in ebestr to AB
tm
A poi ao
ocsu .
i<m>uu daIM
n2)
js<k>en
i oITC
ilitit<e>l
van
(1 anL-F api njaterzom isa
tein iva
ali ,ro<u>je rm broje
mPvez pistnom no<e>eo ] dsa
s<t>i jeja đ i<n>it
% aiu afo kci
takosti[
inteji ačen
jed detivn
ilno
: ko a bozn
za4 ija e i3
40Rella
aj2 74tit<e>n;16:jev
j<e>m 3 en l oela.An
el 01bav ab anj
st<a>oO2 T smte 2anti<t>
PRIMER 3: KONJUGACIJA IMAB362 SA TOKSINOM
[0285] Piramal Healthcare je izvršio konjugaciju toksina uključujući finalnu izmenu pufera. Studije stabilnosti su sprovedene kako bi se pokazalo da ADC ostaju unutar specifikacije tokom određenog perioda ako se čuvaju pod definisanim uslovima skladištenja. IMAB362 je konjugovan sa MMAE preko valin-citrulin linkera (vc linker) ili sa DM4 preko otcepivog N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)butirat linkera (linker SPDB). Konjugati IMAB362 i toksina su čuvani u puferu za skladištenje (20 mM histidina i 85 mg/ml saharoze, pH 5.8) na 2-8 °C.
Tabela 7: 28-dnevno testiranje stabilnosti IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE. DAR:
odnos antitela i leka
[0286] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE pokazuju visok sadržaj monomera od ≥ 95% i samo male količine slobodnog leka (≤1%). Studija stabilnosti od 28 dana za antitela IMAB362 konjugovana sa toksinom na temperaturi skladištenja od 2-8 °C pokazuje samo mali pad sadržaja monomera i nisko povećanje slobodnog leka za oba ADC. Oba antitela su efikasno konjugovana i pokazuju odnos leka i antitela od 3.2 za IMAB362-DM4 i 4.5 za IMAB362-vcMMAE (Tabela 7).
PRIMER 4: VEZIVANJE IMAB362-ADC
[0287] Svojstva vezivanja IMAB362 su ranije detaljno ispitana:
● IMAB362 se vezuje za prvu ekstracelularnu petlju klaudina 18 varijante splajsovanja 2 (CLDN18.2).
● Afinitet prema CLDN18.2 je u niskom nanomolarnom opsegu.
● Nema unakrsne reaktivnosti sa bilo kojom CLDN18.2-negativnom ćelijom ili tipom tkiva.
● Nema unakrsne reaktivnosti sa najbližim srodnim članom porodice klaudina 18 varijante splajsovanja-1 (CLDN18.1).
[0288] Relativni afiniteti vezivanja antitela IMAB362 konjugovanih sa DM4 i MMAE upoređeni su sa nekonjugovanim IMAB362 protočnom citometrijom korišćenjem ćelijskih linija koje endogeno i ektopično eksprimiraju CLDN18.2. Svojstva vezivanja su testirana na različitim koncentracijama antitela u opsegu od 0.1 do 20 µg/ml (Slika 4, Tabela 8).
Tabela 8: Pregled testova vezivanja izvedenih sa konjugatima IMAB362-toksin na CLDN18.2-pozitivnim ćelijskim linijama. Bmax: maksimalno vezivanje, MFI: srednji intenzitet fluorescencije
[0289] U poređenju sa nekonjugovanim IMAB362, IMAB362 konjugovano sa DM4 i MMAE pokazao je blago smanjene relativne afinitete vezivanja za ćelije koje endogeno i ektopično eksprimiraju CLDN18.2 (Slika 4, Tabela 8). Oba antitela konjugovana sa toksinom su imala veoma slične vrednosti EC50, ali neznatno različite maksimalne vrednosti vezivanja, pri čemu je IMAB362-DM4 pokazao veće maksimalno vezivanje (Tabela 8).
[0290] Vezivanje antitela IMAB362 konjugovanih sa toksinom posredovano sa CLDN18.2 je testirano na ćelijama sa ektopičnom prekomernom ekspresijom CLDN18.2 i na odgovarajućim CLDN18.2-negativnim parentalnim ćelijskim linijama (Slika 5, Tabela 8).
[0291] Vezivanje IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE striktno zavisi od prisustva njegovog ciljnog molekula CLDN18.2 (Slika 5). Specifičnost vezivanja je analizirana protočnom citometrijom korišćenjem HEK293 transfektanata konstruisanih da prekomerno eksprimiraju humani CLDN18.2 ili visoko homologni protein humanog CLDN18.1. HEK293~kontrolne ćelije su korišćene kao negativne kontrole (Slika 6, Tabela 8).
[0292] IMAB362 i antitela konjugovana sa toksinom IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE vezala su se sa sličnim relativnim afinitetima za ćelije HEK293~CLDN18.2 koje ektopično eksprimiraju humani CLDN18.2 (Tabela 8). Štaviše, IMAB362, IMAB362 konjugovana sa DM4 i MMAE nisu pokazala unakrsnu reaktivnost na humani CLDN18.1 ili lažno transfektovane ćelije (Slike 6B i C).
PRIMER 5: EFIKASNOST I SPECIFIČNOST IMAB362-ADC IN VITRO
1. Uticaj na vijabilnost ćelija
[0293] Uticaj IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE na vijabilnost ćelija testiran je sa nekoliko humanih ćelijskih linija kancera želuca i pankreasa koje endogeno i ektopično eksprimiraju CLDN18.2 korišćenjem kolorimetrijskog XTT testa za spektrofotometrijsku kvantifikaciju metabolički aktivnih ćelija. Antitumorske aktivnosti su testirane na različitim koncentracijama antitela u opsegu od 3 do 16875 ng/ml (Slika 7, Tabela 9).
[0294] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su efikasno inhibirali vijabilnost ćelijske linije kancera želuca NUGC-4, NCI-N87~CLDN18.2 i ćelijske linije pankreasa BxPC-3~CEDN18.2 in vitro (Slika 7). Oba konjugata IMAB362-toksin su inhibirala ćelijsku vijabilnost ćelija NUGC-4 koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 (EC50 vrednosti: 155 - 631 ng/ml, maksimalno smanjenje vijabilnosti: ≥85%) i ćelija BxPC-3~CEDN18.2 koje ektopično eksprimiraju CLDN18.2 (EC50 vrednosti: 43 - 54 ng/ml, maksimalno smanjenje vijabilnosti: ≥83%) i ćelija NCI-N87~CLDN18.2 (EC50 vrednosti: 75 - 180 ng/ml, maksimalno smanjenje vijabilnosti: 45 - 61%) pri sličnim koncentracijama (Slika 7, Tabela 9).
Tabela 9: Pregled testova vijabilnosti ćelija izvedenih sa konjugatima IMAB362-toksina na ćelijskim linijama pozitivnim na CLDN18.2.
[0295] Pored toga, testirana je ciljno posredovana antitumorska aktivnost konjugata IMAB362-toksin in vitro korišćenjem NCI-N87 CLDN18.2-negativne ćelijske linije i stabilno transfektovane ćelijske linije NCI-N87~CLDN18.2 (Slika 8). IMAB362-vcMMAE je inhibirao vijabilnost ćelija samo kod CLDN18.2-pozitivnih, ali ne i kod CLDN18.2-negativnih ćelija. Stoga, aktivnost IMAB362-vcMMAE striktno zavisi od ekspresije CLDN18.2 (Slika 8).
[0296] Specifičnost IMAB362 antitela konjugovanih sa toksinom je analizirana korišćenjem HEK293 transfektanata koji prekomerno eksprimiraju humani CLDN18.2 ili visoko homologni protein humani CLDN18.1. HEK293 ćelije koje su stabilno transfektovane praznim vektorom korišćene su kao negativne kontrole (Slika 9). IMAB362-vcMMAE smanjuje vijabilnost ćelija kod CLDN18.2-pozitivnih, ali ne i kod CLDN18.2-negativnih ćelija. Efekat je striktno specifičan za CLDN18.2 jer se nije mogla primetiti inhibicija proliferacije ćelija kod ćelija koje eksprimiraju homologni protein 18.1 (Slika 9).
[0297] Ukratko, IMAB362-vcMMAE i IMAB362-DM4 su pokazali sličnu efikasnost in vitro i oba ADC su visoko efikasno inhibirala vijabilnost ćelija nekoliko humanih ćelijskih linija kancera želuca i pankreasa. Efekat striktno zavisi od ciljne ekspresije.
2. „Bystander“ efekat
[0298] „Bystander“ aktivnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE in vitro određena je korišćenjem mešanih kultura ćelija tumora koje se sastoje od CLDN18.2-pozitivnih i negativnih ćelijskih linija. Ciljno-negativne PA-1(Luc) ćelije koje stabilno eksprimiraju luciferazu svica korišćene su kao reporterske ćelije za merenje ćelijske lize.
[0299] Aktivnost luciferaze ko-kultura ćelija PA-1(Luc) koje eksprimiraju luciferazu i luciferazanegativnih ćelija NUGC-4 pokazala je da tretman sa IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE veoma efikasno eliminiše ciljno-negativne ćelije PA-1(Luc) u prisustvu ciljno-pozitivnih ćelija NUGC-4. Štaviše, nije bilo uticaja na ćelije PA-1(Luc) u odsustvu ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 (Slika 10).
[0300] Ukratko, ADC IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su bili u stanju da izazovu „bystander“ efekat kod susednih CLDN18.2-negativnih tumorskih ćelija. Oba toksina su efikasno oslobođena iz IMAB362 unutar CLDN18.2-pozitivnih ćelija kancera i, zbog svoje membranske permeabilnosti, mogu da ispolje citotoksičnu aktivnost na „bystander“ ćelijama.
PRIMER 6: ANTITUMORSKA EFIKASNOST IMAB362-ADC IN VIVO
1. Studije maksimalne tolerisane doze
[0301] U prvom in vivo eksperimentu, maksimalna tolerisana doza (MTD) IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE je određena kod golih miševa sa uznapredovalim ksenotransplantatima humanog tumora pankreasa BxPC-3~CLDN18.2. MTD se odnosi na najveću dozu u tretmanu koja će proizvesti željeni efekat bez neprihvatljive toksičnosti.
1.1. MTD za IMAB362-DM4
[0302] Ćelije BxPC-3~CLDN8.2 koje ektopično eksprimiraju humani CLDN18.2 su ubrizgane supkutano u bok ženki miševa Hsd:Athymic Nude-Foxnlnu. Nakon što su tumori dostigli prosečnu veličinu od 75 ± 13 mm<3>(srednja vrednost ± SD) 13. dana, miševi su grupisani u kontrolne grupe i grupe antitela. Miševi su primili jednu dozu od 7.5 ili 15 mg/kg IMAB362-DM4 IV bolus injekcijom 14. dana ili ponovljene doze od 15 mg/kg IMAB362-DM4 IV bolus injekcijama 14. i 21. dana, redom. Miševi kontrolne grupe su dobili vehikulum 14. dana. Životinje su žrtvovane 49. dana nakon transplantacije. Da bi se testirala toksičnost, uzeti su uzorci krvi i organi su pripremljeni i uskladišteni za dalja histopatološka ispitivanja.
Rast tumora:
[0303] IMAB362-DM4 je inhibirao rast tumora kod miševa sa uznapredovalim ksenotransplantatima humanog tumora BxPC-3~CLDN8.2. Pojedinačni ili ponovljeni tretmani sa IMAB362-DM4 doveli su do skoro potpune regresije tumora kod svih tretiranih miševa tokom perioda posmatranja u studiji (49 dana), nezavisno od doze. Dakle, pojedinačna doza od 7.5 mg/kg IMAB362-DM4 može da bude dovoljna za potpunu remisiju tumora (Slika 11).
Zdravstveno stanje:
[0304] Telesna težina, ponašanje životinja i opšte zdravstveno stanje praćeni su dva puta nedeljno. Sve životinje su pokazale normalnu telesnu težinu tokom eksperimenata (Slika 12). Nisu primećene nikakve abnormalnosti u ponašanju. Međutim, jedna životinja je uginula nakon intravenske primene druge doze od 15 mg/kg IMAB362-DM4 iz nepoznatog razloga.
Klinička hemija:
[0305] Odredili smo serumske nivoe alanin transaminaze (GPT), aspartat transaminaze (GOT), glutamat dehidrogenaze (GLDH), alkalne fosfataze (AP), α-amilaze, holinesteraze, kreatinin kinaze (CK), laktat dehidrogenaze (LDH), lipaze, uree, glukoze, ukupnog proteina i albumina. Nisu otkrivene nikakve razlike između grupa sa vehikulumom i sa IMAB362-DM4 (Slika 13). Kreatinin i gama-glutamil transferaza bili su ispod granice detekcije u svim grupama (podaci nisu prikazani). Sve životinje u svim grupama pokazale su normalne serumske nivoe testiranih surogat markera hepatotoksičnosti, nefrotoksičnosti ili toksičnosti za pankreas, čak i nakon ponovljenih doza od 15 mg/kg IMAB362-DM4.
[0306] Ukratko, 15 mg/kg IMAB362-DM4 (ekvivalentno 45 mg/m<2>kod ljudi) u vidu jednokratne primene pokazalo je dobru podnošljivost kod miševa i visoku antitumorsku efikasnost u lečenju ksenotransplantata pozitivnih na CLDN18.2. Zbog ograničenja koncentracije i zapremine injekcije, intravenska injekcija većih doza nije bila izvodljiva i nije se mogla odrediti maksimalna tolerisana pojedinačna doza.
Histološka analiza:
[0307] Za histološku analizu, parafinski isečci mozga, srca, bubrega, jetre, pluća, pankreasa, slezine i želuca obojeni su hematoksilin-eozinom i mikroskopski ispitani na morfološke promene posredovane IMAB362-vcMMAE. Nisu se mogle primetiti morfološke promene u isečcima tkiva životinja tretiranih sa IMAB362-DM4 u poređenju sa miševima tretiranim vehikulumom. Značajno je da želudac, jedino tkivo koje eksprimira mišji Cldn18.2, nije pokazao oštećenje tkiva posredovano terapijom antitelima (Slika 14).
1.2. MTD za IMAB362-vcMMAE
[0308] MTD za IMAB362-vcMMAE je testirana korišćenjem istog mišjeg modela kao za IMAB362-DM4 (1.1). Miševi su grupisani nakon što su tumori dostigli prosečnu veličinu od 111 ± 27 mm<3>(srednja vrednost ± SD) 13. dana i tretirani jednom IV bolus injekcijom od 8 ili 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE (ekvivalentno 24 i 48 mg/m<2>kod ljudi) 14. dana ili ponovljenim dozama IV bolus injekcija od 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE 14. i 21. dana. Miševi kontrolne grupe su primili kontrolu vehikuluma 14. dana. Životinje su žrtvovane 37. dana. Određena je klinička biohemija, a organi su sakupljeni i uskladišteni za dalja histopatološka ispitivanja.
Rast tumora:
[0309] Tretman sa IMAB362-vcMMAE je izazvao regresiju tumora i dalje inhibirao rast tumora kod miševa sa uznapredovalim ksenotransplantatima humanog tumora BxPC-3~CLDN8.2. Na kraju studije (37 dana), pojedinačni ili ponovljeni tretmani IMAB362-vcMMAE doveli su do skoro potpune regresije tumora kod svih tretiranih miševa, nezavisno od doze. Dakle, pojedinačna doza od 8 mg/kg IMAB362-vcMMAE može da bude dovoljna za potpunu remisiju tumora (Slika 15).
Zdravstveno stanje:
[0310] Telesna težina, ponašanje životinja i opšte zdravstveno stanje praćeni su dva puta nedeljno. Sve životinje su pokazale normalnu telesnu težinu tokom eksperimenata (Slika 16). Dve životinje (po jedan miš iz grupe SD i RD) bile su apatične kratko vreme neposredno nakon prve injekcije 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE. Međutim, ovo abnormalno ponašanje nije primećeno ni kod jedne druge životinje ili nakon druge primene IMAB362-vcMMAE.
Klinička hemija:
[0311] Određeni su serumski nivoi surogat markera hepatotoksičnosti, nefrotoksičnosti ili toksičnosti za pankreas (alanin transaminaza (GPT), aspartat transaminaza (GOT), glutamat dehidrogenaza (GLDH), alkalna fosfataza (AP), alfa-amilaza, holinesteraza, kreatinin kinaza (CK), laktat dehidrogenaza (LDH), lipaza, urea, glukoza, ukupni proteini i albumin). U poređenju sa kontrolnom grupom vehikuluma, nisu primećena veća odstupanja u serumskim surogat markerima kod životinja tretiranih sa IMAB362-vcMMAE (Slika 17). Kreatinin i gama-glutamil transferaza su bili ispod granice detekcije u svim grupama. Stoga se u kliničkoj biohemiji u procenjivanom opsegu doza ne primećuju znaci hepatotoksičnosti, toksičnosti za pankreasa ili nefrotoksičnosti.
Histološka analiza:
[0312] Za histološku analizu, parafinski isečci mozga, srca, bubrega jetre, pluća, pankreasa, slezine i želuca obojeni su hematoksilin-eozinom i mikroskopski ispitani na morfološke promene posredovane IMAB362-vcMMAE.
[0313] Morfološke promene povezane sa IMAB362-vcMMAE nisu se mogle primetiti u isečcima tkiva životinja tretiranih IMAB362-vcMMAE u poređenju sa miševima tretiranim vehikulumom, što ukazuje da IMAB362-vcMMAE ne izaziva ni oštećenje tkiva ni upalu. Primetno je da čak ni želudac, jedino tkivo koje eksprimira mišji Cldn18.2, nije pokazao oštećenje tkiva posredovano terapijom antitelima (Slika 22).
2. Studije efikasnosti
[0314] Antitumorski efekti IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su dalje analizirani in vivo kod atimičnih Nude-Foxn1<nu>miševa kojima su supkutano transplantirane ćelije humanog karcinoma koje endogeno ili ektopično eksprimiraju CLDN18.2. Optimalna terapijska doza IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE u životinjskim modelima tumora određena je u studijama za utvrđivanje raspona doza (Slika 18, odnosno Slika 20). Dalje studije efikasnosti na ksenotransplantatima humanih tumora su sprovedene sa optimalnom dozom IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE (Slika 19, odnosno Slika 21).
[0315] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE visoko značajno inhibiraju rast tumora i poboljšavaju preživljavanje miševa koji nose tumor u različitim ranim modelima ksenotransplantata (početak terapije 3 dana nakon implantacije tumora), kao i u tretmanima uznapredovalih solidnih tumora (početak terapije pri veličini tumora od -100 mm<3>).
Lečenje uznapredovalih ksenotransplantata humanih tumora želuca NCI-N87~CLDN18.2:
[0316] U studiji utvrđivanja raspona doza, antitumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE je analizirana na miševima sa uznapredovalim ksenotransplantiranim tumorima NCI-N87~CLDN18.2 pozitivnim na CLDN18.2. Trinaest dana nakon presađivanja, životinje su tretirane sa 15.2, 7.6 ili 3.8 mg/kg IMAB362-DM4 ili 16.8 ili 4 mg/kg IMAB362-vcMMAE ili kontrolom vehikuluma primenjenim kao pojedinačne IV bolus injekcije. Životinje iz kontrolne grupe primale su 8 mg/kg nekonjugovanog IMAB362 (dva puta nedeljno, IV /i.p.).
[0317] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su visoko značajno inhibirali rast tumora, posredovali u regresiji tumora i produžili preživljavanje miševa koji nose tumor na dozno-zavisan način, dok golo antitelo IMAB362 u ovom modelu lečenja uznapredovalog tumora nije pokazalo statistički značajne antitumorske efekte (Slika 18). Oba antitela IMAB362 konjugovana sa toksinom produžila su preživljavanje miševa sa tumorom (medijana preživljavanja: 73 dana u grupi vehikuluma u poređenju sa 143 dana u grupi IMAB362-vcMMAE 16 mg/kg i 136 dana u grupi IMAB362-DM4 15.2 mg/kg) (Slika 18).
Tretman ranih ksenotransplantata humanih tumora želuca NUGC-4 10cF7-5 sort3a:
[0318] Antitumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE je analizirana kod miševa kojima su supkutano transplantirane ćelije karcinoma želuca NUGC-4 10cF7-5 sort3a koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Životinje su tretirane 3. dana nakon transplantacije jednom dozom IV injekcije od 15.2 mg/kg IMAB362-DM4, 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE ili kontrole vehikuluma.
[0319] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su sprečili rast tumora kod tretiranih životinja, dok su svi miševi kontrolne grupe razvili tumore (p<0.0001) (Slika 19). Nakon unapred definisanog vremena posmatranja od 120 dana, 9 od 10 životinja koje su primile IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE bile su žive i bez tumora, dok su sve životinje iz kontrolne grupe vehikuluma morale da budu eutanazirane zbog kriterijuma za prekid najkasnije 41. dana nakon transplantacije (medijana preživljavanja 34 dana, p <0.0003) (Slika 19).
Lečenje uznapredovalih ksenotransplantata humanog tumora pankreasa BxPC-3~CLDN18.2:
[0320] Dozno-zavisna antitumorska aktivnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE in vivo je analizirana u studiji utvrđivanja raspona doza kod miševa sa uznapredovalim ksenotransplantatima humanog tumora pankreasa BxPC-3~CLDN18.2. Životinje su tretirane 14. dana sa 15.2, 7.6 ili 3.8 mg/kg IMAB362-DM4, 16.8 ili 4 mg/kg IMAB362-vcMMAE, vehikulumom primenjenim kao pojedinačne bolus IV injekcije ili sa ponovljenim dozama od 8 mg/kg IMAB362 (dva puta nedeljno, IV /i.p.).
[0321] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su visoko značajno inhibirali rast tumora, posredovali u regresiji tumora i produžili preživljavanje miševa koji nose tumor na dozno-zavisan način. Nasuprot tome, nekonjugovani IMAB362 nije pokazao statistički značajne antitumorske aktivnosti u ovom modelu uznapredovalog tumora (Slika 20). Oba antitela IMAB362 konjugovana sa toksinom značajno su produžila preživljavanje miševa sa tumorom (medijana preživljavanja: 48 dana u grupi sa vehikulumom u poređenju sa 98.5 dana u grupi IMAB362-vcMMAE 16 mg/kg i 81 dan u grupi IMAB362-DM4 15.2 mg/kg). (Slika 20).
Lečenje ranih ksenotransplantata humanog tumora pankreasa DAN-G 1C5F2:
[0322] Antitumorska aktivnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE in vivo ispitana je na miševima kojima su supkutano transplantirane ćelije karcinoma pankreasa DAN-G 1C5F2 koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Ćelije DAN-G 1C5F2 imaju samo izuzetno niske količine CLDN18.2 na površini ćelije; iako se znatne količine proteina ili RNK mogu detektovati imunoblotom ili qRT-PCR metodom. IHC analize ksenotransplantata tumora DAN-G 1C5F2 su pokazale da je samo subpopulacija tumorskih ćelija pokazala umereno do jako bojenje CLDN18.2 povezanog sa membranom. Stoga, ksenotransplantati tumora DAN-G 1C5F2 mogu da budu pogodni za lečenje konjugatima antitela i leka koji pokazuju „bystander“ efekat ubijanja ćelija. Životinje su tretirane 3. dana nakon transplantacije jednom dozom IV injekcije od 15.2 mg/kg IMAB362-DM4, 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE ili kontrole vehikuluma.
[0323] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su visoko značajno inhibirali rast tumora i produžili preživljavanje miševa koji nose tumor u poređenju sa kontrolom vehikuluma (Slika 21). Kod većine miševa (>50%) rast tumora je potpuno sprečen. Nakon perioda posmatranja od 120 dana, 2 od 7 životinja u grupi tretmana IMAB362-DM4 (medijana preživljavanja 87 dana, p = 0.0002) i 4 od 7 životinja u grupi tretmana IMAB362-vcMMAE su još uvek bile žive (preživljavanje nedefinisano, p = 0.0006), dok su sve životinje iz grupe vehikuluma morale da budu eutanazirane u roku od 31 dana zbog kriterijuma za prekid kao što je kaheksija kancera (medijana preživljavanja 24 dana) (Slika 21). I IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE značajno inhibiraju rast tumora i produžavaju preživljavanje miševa sa ksenotransplantatima tumora koji pokazuju heterogenu ekspresiju CLDN18.2.
[0324] Ukratko, tumori sa niskom i/ili heterogenom ekspresijom CLDN18.2 (npr. ksenotransplantati tumora NUGC-4 i DAN-G) mogu efikasno da se leče pomoću IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE i veliki deo životinja koje nose tumor je izlečen. Antitumorske aktivnosti oba ADC mogu da se objasne na osnovu „bystander“ efekta: oslobađanje oblika DM4 i MMAE za koje je ćelijska membrana propustljiva nakon obrade u ćeliji olakšava ubijanje susednih tumorskih ćelija čak i ako su ciljno-negativne. Stoga su oba ADC veoma efikasna u eradikaciji tumora koji sadrže samo frakcije CLDN18.2-pozitivnih ćelija.
PRIMER 7: INDUKCIJA APOPTOZE
[0325] Citotoksičnost IMAB362 konjugovanog sa toksinom je procenjena testovima apoptoze koji su merili aktivnost kaspaze 3/7 i eksternalizaciju fosfatidilserina. Aktivacija kaspaze predstavlja jedan od najranijih merljivih markera apoptoze koji je važan za iniciranje programirane ćelijske smrti (Henkart 1996). Aktivnost kaspaze 3/7 je određena u testu zasnovanom na luciferazi cepanjem proluminogenog supstrata specifičnog za kaspazu 3/7. Još jedan rani događaj u apoptozi je praćen protočnom citometrijom korišćenjem fluorescentno konjugovanog aneksina V (Vermes et al. 1995). Aneksin V se specifično vezuje za fosfatidilserin koji se translocira iz unutrašnjeg sloja plazma membrane u spoljašnji sloj odmah nakon indukcije apoptoze. Da bi se napravila razlika između živih i mrtvih ćelija, ćelije su istovremeno obojene DNK bojom propidijum jodidom (PI).
[0326] Da bi se analizirala indukcija apoptoze, ćelije NUGC4 pozitivne na CLDN18.2 su tretirane jednom dozom konjugata IMAB362-toksin nekoliko dana. Netretirane ćelije i ćelije tretirane nekonjugovanim IMAB362 služile su kao kontrole (Slika 23). Posle 3 dana, ćelije tretirane sa IMAB362-DM4 ili IMAB362-vcMMAE pokazale su povećanu aktivnost kaspaze 3/7, dok inkubacija sa golim antitelom nije uticala na aktivnost kaspaze (Slika 23A). Istovremeno bojenje aneksinom V i PI korišćeno je kao nezavisni parametar za verifikaciju indukcije apoptoze antitelima IMAB362 konjugovanim sa toksinom. Nađeno je da je, 4 dana nakon tretmana, ~50% ćelija tretiranih sa IMAB362-DM4- ili IMAB362-vcMMAE pozitivno na aneksin V ili aneksin V/PI, što ukazuje da je do smrti ćelije došlo indukovanjem apoptoze. Nasuprot tome, goli IMAB362 bez unakrsnog povezivanja ne indukuje apoptozu u primenjenom opsegu koncentracija (Slika 23B). Ukratko, tretman CLDN18.2-pozitivnih tumorskih ćelija antitelom IMAB362 konjugovanim sa DM4 ili vcMMAE indukuje apoptozu.
PRIMER 8: LEČENJE UZNAPREDOVALIH KSENOTRANSPLANTATA HUMANIH TUMORA ŽELUCA NUGC-4 10CF7-5 SORT3A
[0327] Antitumorska efikasnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE je analizirana kod miševa kojima su supkutano transplantirane ćelije karcinoma želuca NUGC-4 10cF7-5 sort3a koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Životinje sa uznapredovalim tumorima (veličina tumora od ~200 mm3) tretirane su 10. dana nakon transplantacije IV injekcijom od 15.2 mg/kg IMAB362-DM4, 16 mg/kg IMAB362-vcMMAE ili kontrole vehikuluma i nakon recidiva tumora u grupama tretiranim konjugatom IMAB362 drugom injekcijom odgovarajućeg leka (38. dan).
[0328] IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE su značajno inhibirali rast tumora i posredovali u regresiji tumora kod svih tretiranih životinja (52. dan) dok su svi miševi kontrolne grupe razvili tumore (IMAB362-DM4: p<0.05; IMAB362-vcMMAE: p<0.001) (Slika 24). Dvadeset osam dana nakon terapije (38. dan nakon transplantacije) uočen je rekurentni rast tumora (veličina tumora ≥~100 mm3) kod 50% životinja iz grupe tretirane sa IMAB362-DM4. Druga injekcija odgovarajućih IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE je ponovo rezultovala delimičnom ili potpunom remisijom tumora. Rekurentni rast tumora je na kraju primećen kod 7 od 8 životinja u grupi IMAB362-DM4 i kod 4 od 8 životinja u grupi IMAB362-vcMMAE. Nakon unapred definisane vremenske tačke završetka tretmana (108. dan nakon transplantacije), 4 od 8 životinja u grupi IMAB362-vcMMAE i jedna životinja u grupi IMAB362-DM4 i IMAB362 su bile žive, dok su sve životinje u grupi vehikuluma uginule najkasnije 52. dana nakon transplantacije (medijana preživljavanja 32.5 dana za vehikulum, 90 dana za IMAB362-DM4 (p<0.0003 u odnosu na vehikulum) i nedefinisano za IMAB362-vcMMAE (p<0.0003 u odnosu na vehikulum)) (Slika 24).
PRIMER 9: INDUKCIJA ĆELIJSKE CITOTOKSIČNOSTI ZAVISNE OD ANTITELA (ADCC) I CITOTOKSIČNOSTI ZAVISNE OD KOMPLEMENTA (CDC)
Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC):
[0329] ADCC aktivnosti antitela IMAB362 konjugovanih sa DM4 i MMAE su upoređene sa nekonjugovanim IMAB362 korišćenjem ćelija humanog karcinoma želuca NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 (Slika 25, Tabela 10).
Tabela 10: ADCC aktivnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE na ćelijama NUGC-4
10cF7_5 sort3a p3151#10
[0330] Oba antitela konjugovana sa toksinom, IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE, pokazala su slične vrednosti EC50 i maksimalne lize u poređenju sa nekonjugovanim antitelom IMAB362, što ukazuje da je ADCC aktivnost zadržana nakon konjugacije sa lekom.
Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC):
[0331] CDC aktivnosti IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE analizirane su na ćelijama humanog karcinoma želuca NUGC-4 10cF7_5 sort3A p3151#10 i KATO-III FGF-BP#12 adM p3151#25 koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2 (Slika 26, Tabela 11).
Tabela 11: CDC-aktivnost IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE na ćelijama karcinoma koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2.
[0332] Konjugacija toksina sa antitelom IMAB362 nije uticala na CDC aktivnost. Oba antitela konjugovana sa toksinom, IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE, pokazala su najmanje slične vrednosti EC50 i maksimalne lize u poređenju sa nekonjugovanim antitelom IMAB362.
[0333] Dakle, IMAB362-DM4 i IMAB362-vcMMAE kombinuju citotoksičnost posredovanu toksinom sa ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela i citotoksičnošću zavisnom od komplementa, glavnim načinima delovanja nekonjugovanog IMAB362 čime se poboljšav ukupna terapijska aktivnost.
Dodatni list za biološki materijal
Identifikacija sledećih depozita:
[0334]
1) Naziv i adresa institucije za deponovanje za depozite (DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748) su:
DSMZ-Nemačka kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura GmbH Mascheroder Weg 1b
38124 Braunschweig
DE
2) Naziv i adresa institucije za deponovanje za depozite (DSM ACC2808, DSM ACC2809, DSM ACC2810) su:
DSMZ- Nemačka kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura GmbH
Inhoffenstr. 7 B
38124 Braunschweig
DE
Dodatne indikacije za sve gore pomenute depozite:
[0335]
- Mijelom miša (Mus musculus) P3X63Ag8U.1 fuzionisan sa splenocitima miša (Mus musculus) - Hibridom koji izlučuje antitelo protiv humanog klaudina-18A2
3) Podnosilac depozita:
[0336] Sva gore navedena deponovanja je izvršio:
Ganymed Pharmaceuticals AG
Freiligrathstrasse 12
55131 Mainz
DE

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Konjugat antitelo-lek za upotrebu u lečenju kancera koji eksprimira CLDN18.2 davanjem konjugata antitelo-lek pacijentu, gde navedeni konjugat antitelo-lek sadrži antitelo koje se vezuje za CLDN18.2 kovalentno vezano za najmanje jednu komponentu leka na bazi toksina, naznačen time, što je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od:
(a) antitela koje sadrži teški lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 i laki lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39; i
(b) antitela koje sadrži teški lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 30 i laki lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 35,
pri čemu je antitelo vezano za komponentu leka na bazi toksina pomoću otcepivog linkera koji može da se otcepi intracelularnom proteazom i pri čemu je opciono komponenta leka na bazi toksina citotoksični ili citostatski agens.
2. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema zahtevu 1, naznačen time, što antitelo sadrži teški lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 32 i laki lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 39.
3. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što antitelo sadrži teški lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 17 ili 51 i laki lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 24.
4. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema zahtevu 1, naznačen time, što antitelo sadrži teški lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 30 i laki lanac antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koju predstavlja SEQ ID NO: 35.
5. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačen time, što je komponenta leka na bazi toksina majtanzinoid ili auristatin, gde je majtanzinoid poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od DM1 i DM4 i gde je auristatin poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od monometil auristatina E (MMAE) i monometil auristatina F (MMAF).
6. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačen time, što je linker linker koji može da se otcepi katepsinom.
7. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time, što linker sadrži dipeptid.
8. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema zahtevu 7, naznačen time, što je dipeptid val-cit ili phelys.
9. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 8, koja dalje obuhvata primenu hirurške operacije, hemoterapije i/ili terapije zračenjem.
10. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 9, naznačen time, što je kancer adenokarcinom, konkretno uznapredovali adenokarcinom.
11. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10, naznačen time, što je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancera dojke, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera jetre, kancera glave-vrata, kancera žučne kese i njihovih metastaza, Krukenbergovog tumora, peritonealne metastaze i/ili metastaze u limfnim čvorovima.
12. Konjugat antitelo-lek za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 11, naznačen time, što je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezofagogastričnog prelaza i gastroezofagealnog kancera.
RS20231193A 2015-04-15 2016-04-13 Konjugati leka koji sadrže antitela protiv klaudina 18.2 RS64951B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/058206 WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2015-04-15 Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
EP16715583.7A EP3283521B1 (en) 2015-04-15 2016-04-13 Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
PCT/EP2016/058056 WO2016166122A1 (en) 2015-04-15 2016-04-13 Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64951B1 true RS64951B1 (sr) 2024-01-31

Family

ID=52875694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231193A RS64951B1 (sr) 2015-04-15 2016-04-13 Konjugati leka koji sadrže antitela protiv klaudina 18.2

Country Status (28)

Country Link
US (2) US11541127B2 (sr)
EP (2) EP4331578A3 (sr)
JP (4) JP6800883B2 (sr)
KR (5) KR102336566B1 (sr)
CN (1) CN107667118A (sr)
AU (1) AU2016249782B2 (sr)
BR (1) BR112017018521A2 (sr)
CA (1) CA2982401C (sr)
DK (1) DK3283521T5 (sr)
ES (1) ES2964813T3 (sr)
FI (1) FI3283521T3 (sr)
HR (1) HRP20231609T1 (sr)
HU (1) HUE064753T2 (sr)
IL (2) IL254085B2 (sr)
LT (1) LT3283521T (sr)
MA (1) MA41937B1 (sr)
MD (1) MD3283521T2 (sr)
MX (2) MX2017013075A (sr)
PL (1) PL3283521T3 (sr)
PT (1) PT3283521T (sr)
RS (1) RS64951B1 (sr)
RU (1) RU2017139490A (sr)
SG (2) SG10202105142VA (sr)
SI (1) SI3283521T1 (sr)
SM (1) SMT202300455T1 (sr)
UA (1) UA127469C2 (sr)
WO (2) WO2016165762A1 (sr)
ZA (1) ZA201705923B (sr)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ746691A (en) 2012-11-13 2020-08-28 Astellas Pharma Inc Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
AU2018337815A1 (en) 2017-09-20 2020-03-12 Ph Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs
CA3089653A1 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
TW202003562A (zh) * 2018-03-14 2020-01-16 中國大陸商北京軒義醫藥科技有限公司 抗密連蛋白18.2(cldn18.2)抗體
SG11202007074PA (en) * 2018-05-18 2020-08-28 Lanova Medicines Ltd Company Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
CN110606891B (zh) * 2018-06-17 2022-12-06 上海健信生物医药科技有限公司 一种针对人cldn18.2的抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
CN111867630B (zh) * 2018-06-17 2023-10-13 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用
WO2020009165A1 (ja) * 2018-07-03 2020-01-09 味の素株式会社 修飾抗体およびその製造方法
US11505618B2 (en) * 2018-07-18 2022-11-22 Askgene Pharma Inc. Antibodies and methods for making and using the same
WO2020038404A1 (zh) * 2018-08-22 2020-02-27 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人claudin 18.2单克隆抗体及其应用
CN110857322A (zh) * 2018-08-22 2020-03-03 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人claudin 18.2单克隆抗体及其应用
EP3878863A4 (en) * 2018-08-27 2022-06-22 Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. ANTI-CLAUDIN18.2 ANTIBODIES AND ITS USE
JP7401538B2 (ja) * 2018-10-22 2023-12-19 シャンハイ、ケンパーソー、バイオテクノロジー、カンパニー、リミテッド 抗ｃｌｄｎ１８．２抗体およびその使用
SG11202105885WA (en) * 2018-12-07 2021-07-29 Zlip Holding Ltd Anti-claudin antibodies and uses thereof
WO2020135201A1 (zh) * 2018-12-28 2020-07-02 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种抗体及其用途
MX2021007939A (es) 2018-12-28 2021-10-22 Nanjing Genscript Biotech Co Ltd Porciones de union a claudina 18.2 y usos de estas.
CN114106183B (zh) * 2019-01-15 2023-06-23 浙江道尔生物科技有限公司 抗cld18a2纳米抗体及其应用
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
KR20210134321A (ko) * 2019-02-01 2021-11-09 노바록 바이오테라퓨틱스 리미티드 항-클라우딘 18 항체 및 이의 이용 방법
SG11202109052YA (en) * 2019-03-29 2021-10-28 Phanes Therapeutics Inc Humanized anti-claudin 18.2 chimeric antigen receptors and uses thereof
MY208022A (en) 2019-04-01 2025-04-08 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Anti-claudin 18.2 antibody and application thereof
CN111944048B (zh) * 2019-05-16 2023-10-03 启愈生物技术(上海)有限公司 抗cldn抗体及其药物组合物和检测方法
WO2020228806A1 (zh) * 2019-05-16 2020-11-19 齐鲁制药有限公司 针对密蛋白18a2的抗体及其应用
US20220211861A1 (en) * 2019-05-22 2022-07-07 The Board of Trustees of the Leland Staford Junior University Drug conjugates and methods of using same
WO2020239005A1 (zh) * 2019-05-30 2020-12-03 山东博安生物技术有限公司 靶向Claudin18.2的抗体或嵌合抗原受体
US20220235129A1 (en) * 2019-07-12 2022-07-28 Futuregen Biopharmaceutical (Beijing) Co., Ltd. Cldn18.2 antibody and use thereof
JP2022541435A (ja) 2019-07-17 2022-09-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア クローディン１８抗体及びがんを処置する方法
KR20220045040A (ko) * 2019-08-20 2022-04-12 쑤저우 트랜스센타 테라퓨틱스 컴퍼니 리미티드 신규 항-cldn18.2 항체
CN114981303B (zh) * 2019-09-13 2024-01-23 安徽俊义医疗管理咨询有限公司 人源化抗Claudin18.2（CLDN18.2）抗体
CN112707965A (zh) * 2019-09-30 2021-04-27 和铂医药(苏州)有限公司 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用
EP4054648A4 (en) * 2019-11-05 2023-12-27 LaNova Medicines Limited ANTIBODY DRUG CONJUGATES DIRECTED AGAINST CLAUDIN 18.2
CN114901696B (zh) 2019-12-06 2025-08-05 斯迪安生物技术公司 人源化cldn18.2抗体
TW202128227A (zh) 2019-12-12 2021-08-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗密蛋白抗體藥物偶聯物及其醫藥用途
BR112022012327A2 (pt) 2019-12-23 2022-10-18 Sotio Biotech A S Anticorpos ou fragmentos dos mesmos, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
EP4081551A4 (en) * 2019-12-27 2024-04-10 Legend Biotech Ireland Limited CLAUDIN18.2 BINDING FRACTIONS AND THEIR USES
EP4151235A4 (en) * 2020-05-15 2025-08-06 Sichuan Kelun Biotech Biopharmaceutical Co Ltd ANTIBODY-DRUG CONJUGATE, ITS PREPARATION METHOD AND ITS USE
TWI878541B (zh) * 2020-05-25 2025-04-01 中國大陸商蘇州創勝醫藥集團有限公司 抗ｃｌｄｎ１８.２抗體及其診斷用途
TWI809426B (zh) * 2020-06-19 2023-07-21 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８.２抗體以及其用途
CN116284403A (zh) * 2020-06-23 2023-06-23 德琪(杭州)生物有限公司 用于治疗claudin相关疾病的抗体和方法
CN111808194B (zh) * 2020-07-13 2021-04-20 北京凯因科技股份有限公司 一种结合密蛋白的用于治疗癌症的人源化抗体
CN111704669B (zh) * 2020-07-13 2022-05-13 北京凯因科技股份有限公司 一种用于治疗晚期胃癌的抗cldn18全人源化抗体
CN114222761B (zh) * 2020-07-14 2024-02-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
WO2022042673A1 (zh) 2020-08-28 2022-03-03 江苏恒瑞医药股份有限公司 用于降低异源多肽末端异质性的信号肽
EP4217396A4 (en) * 2020-09-28 2025-06-18 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. NEW ANTI-CLAUDIN18 ANTIBODIES
JP2023545382A (ja) 2020-09-30 2023-10-30 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗体薬物複合体を含む医薬組成物及びその使用
CN114366818B (zh) * 2020-10-15 2025-02-25 上海美雅珂生物技术有限责任公司 抗体药物偶联物及其应用
WO2022100590A1 (zh) * 2020-11-10 2022-05-19 齐鲁制药有限公司 针对密蛋白18a2的adcc增强型人源化抗体及其应用
CN112480248B (zh) * 2020-11-24 2023-05-05 三优生物医药(上海)有限公司 与cld18a2特异性结合的分子
WO2022111616A1 (zh) 2020-11-30 2022-06-02 石药集团巨石生物制药有限公司 抗cldn18.2抗体、药物偶联物及其制备方法和用途
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
PE20231561A1 (es) * 2020-12-23 2023-10-03 Sotio Biotech A S Conjugados anticuerpo-farmaco especificos para tumores con claudina 18.2
WO2022171134A1 (zh) * 2021-02-09 2022-08-18 江苏迈威康新药研发有限公司 包含抗cldn18.2的抗体或其抗原结合片段的抗体药物偶联物及其用途
US12577320B2 (en) 2021-05-08 2026-03-17 Remegen Co., Ltd. Anti-Claudin 18.2 antibody and antibody-drug conjugate thereof
WO2023017191A1 (en) 2021-08-13 2023-02-16 Cytune Pharma Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer
US20250127915A1 (en) * 2021-08-26 2025-04-24 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-cldn-18.2 antibody-drug conjugate and use thereof
CN115991784A (zh) * 2021-10-19 2023-04-21 宝船生物医药科技(上海)有限公司 抗cd47-cldn18.2双特异性抗体及其用途
AU2023278315A1 (en) * 2022-05-31 2024-12-12 CSPC Megalith Biopharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical composition of recombinant anti-human cldn18.2 monoclonal antibody-mmae conjugate
CN117143237A (zh) * 2022-06-01 2023-12-01 百奥泰生物制药股份有限公司 抗cldn18.2抗体及其抗体药物偶联物和用途
CN117229398A (zh) * 2022-06-15 2023-12-15 中山康方生物医药有限公司 抗cldn18.2抗体、其药物组合物及用途
AU2023371751A1 (en) 2022-11-01 2025-05-15 AbTis Co., Ltd. Antibody-drug conjugate comprising anti-claudin-18.2 antibody, and therapeutic use thereof for cancer
CN115969997B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用
TW202434307A (zh) 2023-01-18 2024-09-01 大陸商泰勵生物科技（上海）有限公司 抗體偶聯藥物及其用途
CN121263210A (zh) 2023-04-17 2026-01-02 沛科生物公司 抗体和抗体-药物偶联物以及使用方法和合成工艺及中间体
CN119139489A (zh) * 2023-06-16 2024-12-17 信达生物制药(苏州)有限公司 靶向Claudin18.2的抗体-药物偶联物用于治疗实体瘤的方法
US20250049810A1 (en) 2023-08-07 2025-02-13 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras protein-related disease or disorder
WO2025059162A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Car-engager containing il-2 variants to enhance the functionality of car t cells
TW202530228A (zh) 2023-10-12 2025-08-01 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
WO2025078881A2 (en) * 2023-10-13 2025-04-17 Ligachem Biosciences Inc. Anti-claudin 18.2 antibody drug conjugates comprising topoisomerase i inhibitor and uses thereof
TW202535476A (zh) * 2023-10-27 2025-09-16 大陸商康諾亞生物醫藥科技（成都）有限公司 使用抗密連蛋白１８．２ ａｄｃ之癌症治療
WO2025086268A1 (en) * 2023-10-27 2025-05-01 Keymed Biosciences (Chengdu) Co., Ltd. Cancer treatment with anti-claudin 18.2 adc
WO2025171296A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
TW202547461A (zh) 2024-05-17 2025-12-16 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
WO2025255438A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras protein-related disease or disorder
WO2025265060A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Revolution Medicines, Inc. Therapeutic compositions and methods for managing treatment-related effects
KR20250180155A (ko) 2024-06-21 2025-12-31 주식회사 트리오어 항-클라우딘18.2 항체, 항-클라우딘18.2 항체-약물접합체 및 이의 용도
WO2026006747A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
WO2026015801A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras related disease or disorder
WO2026015825A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Use of ras inhibitor for treating pancreatic cancer
WO2026015796A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras related disease or disorder
WO2026015790A1 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Revolution Medicines, Inc. Methods of treating a ras related disease or disorder
WO2026050446A1 (en) 2024-08-29 2026-03-05 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
PL216630B1 (pl) 2002-10-17 2014-04-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
DE10254601A1 (de) * 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004024617A1 (de) * 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
MX2013006392A (es) * 2010-12-09 2013-12-06 Genentech Inc Tratamiento de cancer positivo para her2 con paclitaxel y trastuzumab-mcc-dm1.
MX2014006739A (es) * 2011-12-05 2015-06-05 Igenica Biotherapeutics Inc Conjugados de anticuerpo-farmaco y compuestos relacionados, composiciones , y metodos.
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2015014376A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
WO2016165765A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Methods and compositions for prediction of therapeutic efficacy of cancer treatments and cancer prognosis
WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017018521A2 (en) 2018-04-17
JP2018513146A (ja) 2018-05-24
MA41937A (fr) 2018-02-28
MD3283521T2 (ro) 2024-03-31
JP2022031979A (ja) 2022-02-22
DK3283521T3 (da) 2023-12-18
SMT202300455T1 (it) 2024-01-10
US20180117174A1 (en) 2018-05-03
EP4331578A2 (en) 2024-03-06
MA41937B1 (fr) 2023-12-29
US11541127B2 (en) 2023-01-03
RU2017139490A (ru) 2019-05-15
HK1247210A1 (en) 2018-09-21
WO2016165762A1 (en) 2016-10-20
AU2016249782B2 (en) 2022-04-28
AU2016249782A1 (en) 2017-11-02
MX2023013476A (es) 2023-12-15
HRP20231609T1 (hr) 2024-03-15
PL3283521T3 (pl) 2024-01-29
RU2021131990A (ru) 2022-02-04
SG10202105142VA (en) 2021-06-29
CA2982401A1 (en) 2016-10-20
SI3283521T1 (sl) 2024-04-30
LT3283521T (lt) 2023-12-27
EP3283521A1 (en) 2018-02-21
EP4331578A3 (en) 2024-06-05
JP6800883B2 (ja) 2020-12-16
UA127469C2 (uk) 2023-09-06
ZA201705923B (en) 2019-06-26
JP7024152B2 (ja) 2022-02-24
HUE064753T2 (hu) 2024-04-28
ES2964813T3 (es) 2024-04-09
JP2024036444A (ja) 2024-03-15
KR102401299B1 (ko) 2022-05-24
KR20240011250A (ko) 2024-01-25
KR102787417B1 (ko) 2025-03-28
IL314928A (en) 2024-10-01
DK3283521T5 (da) 2024-10-07
CN107667118A (zh) 2018-02-06
KR20180082325A (ko) 2018-07-18
JP2021038255A (ja) 2021-03-11
SG11201708271TA (en) 2017-11-29
FI3283521T3 (fi) 2023-12-12
KR20210150612A (ko) 2021-12-10
IL254085B1 (en) 2024-09-01
RU2017139490A3 (sr) 2020-01-17
EP3283521B1 (en) 2023-11-15
KR20250044466A (ko) 2025-03-31
KR20220072874A (ko) 2022-06-02
MX2017013075A (es) 2018-02-19
IL254085B2 (en) 2025-01-01
PT3283521T (pt) 2023-12-18
WO2016166122A1 (en) 2016-10-20
KR102626316B1 (ko) 2024-01-18
KR102336566B1 (ko) 2021-12-23
CA2982401C (en) 2024-06-11
IL254085A0 (en) 2017-10-31
US20230270878A1 (en) 2023-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230270878A1 (en) Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
US9358304B1 (en) Methods of making DLL3 antibody drug conjugates
RU2841168C2 (ru) Конъюгаты лекарственных средств, содержащие антитела против клаудина 18.2
HK40109406A (en) Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
AU2022206771A1 (en) Drug conjugates comprising antibodies against Claudin 18.2
HK1247210B (en) Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2