RS64987B1 - Monoklonsko antitelo koje antagonizuje i inhibira vezivanje humanog pd-1 antigena za njegov ligand, metoda njegovog pripremanja i njegova primena - Google Patents

Description

Техничка област

Предметни проналазак спада у област биотехнологије – моноклонско антитело. Предметни проналазак се односи на моноклонско антитело које антагонизује и инхибира везивање рецептора програмиране смрти PD-1 (програмирана смрт-1) за његов лиганд, његову кодирајућу секвенцу, као и његово припремање и примену.

Основа проналаска

Дуго се у биомедицинској области веровало да су формирање и развој тумора уско повезани са стањем функције имуног система домаћина. Нормално, имуни систем домаћина има улогу имунолошког праћења тако што прати раст мутираних туморских ћелија и инхибира појаву туморских метастаза и поновно појављивање. Међутим, у случају хипофункције или супресије имунског система домаћина, појава туморских метастаза и поновно појављивање ће се убрзати и могу бити опаснe по живот у тешким случајевима. Стога, имунотерапија тумора, која директно напада или убија тумор стимулисањем имунитета домаћина, је један од циљева коме се тежи у клиничком лечењу тумора. Од 2011. године, низ великих открића у имунотерапији донео је револуцију у лечењу рака (Topalian SL et al: Cancer immunotherapy comes of age. JCO 2011; 29:4828-4836; Pardoll D & Drake C: Immunotherapy earns its spot in the ranks of cancer therapy. J Exp Med 2012; 209: 201-209; Page DB, Postow MA, Callahan MK, Allison JP and Wolchok JD: Immune modulation in cancer with antibodies. Annu Rev Med 2014; 65:185–202). Ова револуционарна открића углавном су резултат напретка у основним имунолошким истраживањима, као и појаве и развоја модерне биотехнологије представљене хибридомом, генетски модификованим антителом итд.

Основна имунолошка истраживања показују да је ћелијски имунитет посредован Т лимфоцитима (који се развијају из тимуса) изузетно важан у праћењу и/или директном нападању и убијању ћелија рака. Т лимфоцити се уопштено могу поделити у две категорије: Помоћне Т ћелије, које углавном регулишу и контролишу имунолошку функцију, и цитотоксичне Т ћелије (CTL), које учествују препознавању циљних антигена и директно нападају и убијају циљне ћелије.

За потпуну активацију и пролиферацију помоћних Т ћелија или CTL-ова, генерално је потребна синергија два сигнална пута. Сигнал 1 је специфичан за антиген и посредован је интеракцијом између Т-ћелијског рецептора (TcR) експримираног на Т ћелијама и антиген пептида-MHC (главни комплекс хистокомпатибилности) експримираног на циљним ћелијама или антигенски презентирајућим ћелијама (APC); сигнал 2 је антигенски неспецифичан и посредован је интеракцијом између костимулативних молекула или коинхибиторних молекула експримираних на Т-ћелијама и њихових одговарајућих лиганада експримираних на циљним ћелијама или антигенски презентирајућим ћелијама (APC).

Костимулативни молекули, који појачавају имунолошки одговор, углавном укључују CD28 и његов лиганд B7-1 (CD80) или B7-2 (CD86), CD40 и његов лиганд CD40L, CD137 (познат и као 4-1BB) и његов лиганд CD137-L и CD278 (ICOS, индуцибилни Т ћелијски костимулатор) и његов лиганд ICOS-L.

Коинхибиторни молекули, исто тако познати као инхибитори имунолошке контролне тачке, смањују имуни одговор и углавном укључују CTLA-4 (цитотоксични Т-лимфоцитни антиген 4) и његов лиганд B7-1 (CD80) или B7-2 (CD86), PD-1 (програмирана смрт-1) и његов лиганд PD-L1 или PD-L2, LAG-3 (ген за активацију лимфоцита-3) и његов лиганд, TIM-3 (домен имуноглобулина Т-ћелије и домен муцина 3) и његов лиганд, BTLA (атенуатор B и Т лимфоцита) и његов лиганд.

Ови костимулативни/коинхибиторни молекули имају веома сличну структуру, а већина њих су чланови суперфамилије имуноглобулина (Chen LP: Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T cell immunity. Nature Immunol 2004, 336-347).

У принципу, постоје најмање два различита приступа за појачани имуни одговор: 1. приступ је да се директно појача функција Т-ћелија повећањем експресије или функције костимулативних молекула, као што је CD28 на Т ћелијама; 2. приступ је да се индиректно појача функција Т ћелија ослобађањем имуносупресије посредоване коинхибиторним молекулима, као што су CTLA-4, PD-1/PD-L1, TIM-3, LAG-3, BTLA или други фактори.

Појачани имуни одговор 1. приступом може се лако архивирати коришћењем антитела агониста која се везују за CD28 или друге костимулативне молекуле.

Међутим, у медицинској области је широко распрострањено веровање да антитела агониста, као што су анти-CD28 антитела, имају веома висок безбедносни ризик, што показују катастрофални резултати у фази I клиничког испитивања лека на бази анти-CD28 моноклонског антитела (шифра: TGN1412) у Енглеској 2006. године, у коме је 6 здравих испитаника имало изузетно тешку нежељену реакцију на овај лек на дан инфузије (Suntharalingam G, et al, N Engl J Med 2006; 355: 1018-1028).

Насупрот томе, лек на бази антагонистичког моноклонског антитела који елиминише или смањује имуносупресију посредовану CTLA-4 или PD-1/PD-L1 и другим факторима био је најуспешнија фокус група у истраживању и развоју антитуморских лекова широм света, због свог карактеристичног антитуморског куративног ефекта и прихватљиве безбедности доказане у више међународних клиничких испитивања; развој антитуморских лекова усмерених на PD-1/PD-L1 је посебно значајан (Quezada SA and Peggs KS: British Journal of Cancer 2013; 108: 1560–1565; Flemming A: Nat Rev Drug Discov.2012, 11:601).

Ген PD-1 је први открио и клонирао Tasuku Honjo и његове колеге 1992. године, и он има један домен сличан са IgV у свом ванћелијском простору са 23% хомологије са CTLA-4 (Ishida, Y., Agata, Y., Shibahara, K. and Honjo, T.: EMBO J.1992; 11:3887).

PD-1 се углавном експримира на активираним Т лимфоцитима, Б лимфоцитима, мононуклеарним и другим имунским ћелијама (Yasutoshi Agata et al, International Immunology 1996; 8: 675). Постоје два рецептора или лиганда PD-1: PD-L1 (Freeman GJ et al, JEM 2000; 192: 1027-1034), познат и као B7-H1 (Dong H et al, Nature Medicine 1999; 5: 1365-1369), и PD-L2 (Latchman Y et al, Nat. Immunol.2001; 2: 261-268), познат и као B7-DC (Tseng SY et al, JEM 2001; 193: 839-845). PD-L1 и PD-L2 се углавном експримирају на циљној ћелији, као што је туморска ћелија или антигенски презентирајућа ћелија (Thompson RH et al, Cancer Res 2006; 66: 3881-3885).

Феномен PD-1 који учествује у смањеној регулацији-in vivo имунолошке функције први су уочили Tasuku Honjo и његов колега код PD-1 нокаут мишева. Открили су да су PD-1 нокаут мишеви развили лупоидни гломерулонефритис и артритис (Nishimura H et al: Immunity 1999; 11:141) у позадини C57BL/6, док су у позадини Balb/c, развили висок титар антитела против срчаног мишићног ткива, узрокујући тешку аутоимуну кардиомиопатију (Nishimura H. et al: Science 2001; 291:319).

Нормална ткива или ћелије in vivo могу бити спречена помоћу PD-L1 или PD-L2 експримираних у њима да буду нападнуте или убијене и одбачене од стране периферних лимфоцита (Keir M.E. et al: J Exp Med 2006; 203: 883-895; Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, Sharpe AH: Annu Rev Immunol 2008; 26: 677-704).

Нажалост, мутиране туморске ћелије такође могу повећати експресију PD-L1 или PD-L2 да се вежу са PD-1 на лимфоцитима и инхибирају функцију лимфоцита да избегну имунолошки напад или убијање и одбацивање како би наставиле да расту (Dong H et al, Nature Medicine 2002; 8: 793-800; Azuma T et al, Blood 2008; 111: 3635-3643). Неутрални PD-1 или PD-L1 дати in-vivo да блокирају везивање PD-1 на лимфоцитима за PD-L1/PD-L2 на туморским ћелијама, могу обновити функцију лимфоцита да имунолошки препознају и убију мутиране туморске ћелије, на тај начин сузбију раст тумора, па чак и искорене или одбаце туморске ћелије (Iwai Y et al, PNAS 2002; 99: 1229; Hirano F et al, Cancer Res 2005; 65: 1089-1096).

На основу ових претходних фундаменталних клиничких испитивања и охрабрујућих резултата претклиничких експеримената на животињама, од 2003. године су многе међународне фармацеутске компаније, као што су Bristol-Myers Squibb (BMS) /Medarex, Merck и Genentech започеле развој нових лекова на бази антитела у сврху блокирања везивања PD-1 за његов лиганд PD-L1 и поднеле пријаве релевантних патената.

На пример, у америчком патентном документу инвентивног нивоа за одобрени патент бр.8, 008, 449, компаније Medarex и Ono Pharmaceutical су откриле такве хибридоме анти-хуманог PD-1 антитела које је скриновано унакрсном имунизацијом мишева HuMab Mouse са хуманим Ig са трансфицираним CHO ћелијама и такве хумане PD-1 протеине пуне дужине или са екстрацелуларним доменом који су тиме експримирани као мешани антиген, протеини антитела који се притом излучују, и његове нуклеотидне секвенце које кодирају протеине антитела, као и примену таквог антитела у детекцији PD-1 протеина и лечењу рака и других болести.

У америчком патентном документу инвентивног нивоа за одобрени патент бр. 8, 168, 757, компанија Merck Sharp & Dohme Corporation („Merck”) је такође открила више хибридома антихуманог PD-1 антитела скриновано имунизацијом мишева са ДНК која се састоји од PD-1, протеина антитела који се притом излучује и његове кодирајуће нуклеотидне секвенце, и да се такво антитело користи у сврху лечења рака и инфективних болести побољшањем имунолошке функције in vivo.

У америчком патентном документу инвентивног нивоа за одобрени патент бр. 8, 217, 149, компанија Genentech је открила фрагменте протеина антитела вишеструког анти-хуманог PD-L1 добијених скриновањем и пролиферацијом из приказа фага, њихове кодирајуће нуклеотидне секвенце и њихову сврху.

Ове међународне фармацеутске компаније су такође поднеле патентне пријаве инвентивног нивоа за PD-1 Државном заводу за интелектуалну својину (SIPO) у Кини. У документу патентне пријаве бр. 200680028238.9 за такво анти-PD-L1 хумано моноклонско антитело компаније Medarex која је ушла у Кину путем међународне пријаве PCT (PCT/US2006/026046), откривено је да се такво моноклонско антитело специфично везује за хумани PD-L1 са високим афинитетом, као што је компанија испитала код имунизованих мишева, његова кодирајућа ДНК секвенца и методе помоћу којих компанија користи такво антитело за лечење рака, инфективних и других болести.

У патентном документу инвентивног нивоа за патент бр.201010170022.4 о анти-PD-1 антителу и његовој сврси, компаније Weythe и Medimmune су откриле фрагмент таквог анти-PD-1 антитела, које је скриновано из библиотеке приказа scFv фазмида, његову кодирајућу ДНК секвенцу и примену таквог антитела као фармацеутског састојка у лечењу аутоимуних болести, алергијске реакције, рака и других болести повезаних са имуним системом.

Поред страних фармацеутских компанија, од 2013. године су многе домаће кинеске компаније и институције за истраживање и развој такође сукцесивно подносиле PCT пријаве или кинеске патентне пријаве инвентивног нивоа за PD-1 код SIPO-а. Дана 27. маја 2013. године, као прва домаћа институција која је поднела патентну пријаву за McAb PD-1, Универзитет Џенгџоу је поднео документ под називом „Потпуно хуманизовано анти-PD-1 моноклонско антитело, као и метода његовог припремања и примене” патентне пријаве бр. CN201310199947.5 са документом у објави пријаве бр. CN103242448B. У документу патентне пријаве откривено је потпуно хуманизовано анти-PD-1 моноклонско антитело веома високог афинитета и веома ниске имуногености за PD-1, као и његове аминокиселинске секвенце тешког и лаког ланца. У документу је даље описана примена таквог потпуно хуманизованог анти-PD-1 моноклонског антитела у специфичном блокирању PD-1/PD-L сигнала инхибиције, појачавајући и убрзавајући опоравак онеспособљене цитобиолошке функције in vivo, интензивирајући способност убијања лимфоцита против туморских антигена, инвазивних вируса итд., побољшавајући имунитет организма и благовремено елиминишући туморске ћелије и вирусе. Патент је одобрен 14. јануара 2015. године, али је због заосталих плаћања годишње накнаде укинут 20. јула 2016. године.

У наставку је дато неколико патентних пријава инвентивног нивоа за McAb PD-1 које су поднеле друге домаће истраживачке институције и компаније које су високо рангиране на листи пријава: Дана 26. јуна 2013. године, компаније TopAlliance Biosciences Inc. и Suzhou Junmeng Biosciences Inc. поднеле су документ под називом „Анти-PD-1 антитело и његова примена” заједничке патентне пријаве бр. CN201310258289, који открива ново PD-1 антитело или његов функционални фрагмент и сврху антитела у припремању лека за лечење рака.

Дана 13. септембра 2013. године, компанија BeiGene је поднела документ под називом „Анти-PD-1 и његова примена као терапеутско средство и дијагностичко средство” патентне пријаве бр. CN201380079581.6 са документом у објави пријаве патента бр. CN105531288A), који пружа PD-1, Pdcd-1 или CD279, инхибирање ћелијске сигнализације и активност посредоване PD1 у имунским ћелијама, и везивање са скупом антитела аминокиселинских остатака потребних за лиганд PD1 и примену ових антитела у лечењу или дијагностици таквог рака, инфективне болести или других патолошких симптома који су регулисани функцијом посредованом PD-1. Дана 25. октобра 2013. године, компанија Stainwei Biotech Inc. је поднела документ под називом „Моноклонско антитело које антагонизује и инхибира везивање PD-1 за његов лиганд, као и секвенцу кодирања и његову примену” патентне пријаве бр. CN201310512512.1 са документом у објави пријаве патента бр. CN104558177А, који открива мишје моноклонско антитело које антагонизује и инхибира везивање PD-1 за његов лиганд и његове аминокиселинске секвенце варијабилног региона тешког и лаког ланца, нуклеотидну секвенцу ДНК молекула која кодира варијабилне регионе тешког и лаког ланца таквог антитела, као и методу припремања химерног хуманог-мишјег антитела таквог антитела и његовог деривата и његову примену у детекцији PD-1 протеина.

Дана 14. новембра 2013. године, компаније Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. и Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. су поднеле документ под називом „PD-1, фрагмент антигена везивања и његова медицинска примена” патентне пријаве бр. CN201480011008.6 са документом у објави пријаве патента бр. CN105026428А.

Већина горе наведених патентних пријава и пријава патента за PD-1 антитело је након тога у фази откривања документа или суштинског испитивања.

Дана 28. октобра 2015. године, патентна пријава под називом „Људско моноклонско антитело PD-1 и начин лечења рака анти-PD-1 антителом” коју су поднеле компаније Ono Pharmaceutical of Japan и Medarex прописно је признао SIPO са одобреним патентом. бр. CN103059138B. Одобрени патент штити PD-1 хумано моноклонско антитело ограничавајући специфичну структуру антитела CDR секвенце и начин лечења рака таквим PD-1 антителом.

У погледу глобалног развоја PD-1/PD-L1 лекова, до сада је FDA одобрила само следећа три лека на бази антитела:

1) Opdivo (генерички назив: Ниволумаб, ранија шифра: BMS-936558, MDX-1106) је потпуно хуманизовани PD-1 McAb (IgG4 капа) који су заједнички развили компаније Bristol-Myers Squibb/Medarex и Ono Pharmaceutical. Јула 2014. године, први пут је одобрен за лечење меланома у завршном стадијуму у Јапану и тако постао први лек за инхибицију PD-1 на свету који је одобрен за стављање у промет. FDA је 12. децембра 2014. године одобрила Opdivo (Ниволумаб) за прву линију третмана код пацијената са меланомом који не реагује ни на један други лек, који је неоперабилан операцијом или има метастазе.

2) Анти-PD-1 McAb лек Keytruda (генерички назив: Пембролизумаб, ранија шифра: MK3475, ламбролизумаб) је хуманизовани PD-1 McAb (IgG4 капа) који је развила компанија Merck. Дана 4. септембра 2014. године, кроз убрзани поступак одобрења FDA, први пут је одобрен за лечење пацијената са меланомом у завршном стадијуму, који су примили терапију ипилимумабом (антихумани CTLA4 McAb) или који су примили терапију BRAF инхибитором за ношење мутације BRAF гена, и тако постао први анти-PD-1 лек који је у САД-у одобрен за стављање у промет.

3) Tecentriq (генерички назив: Атезолизумаб, ранија шифра: MPDL3280А) је хуманизовани PD-L1 McAb (IgG1 капа) који је развила компанија Genentech/Roche, а FDA га је 19. маја 2016. године први пут одобрила за стављање у промет као лека друге линије за рак мокраћне бешике у завршном стадијуму.

У ЕУ, Opdivo (Ниволумаб) и Keytruda (Пембролизумаб) су одобрени за стављање у промет јуна, односно јула 2015. године.

У Кини, до сада, ниједан лек PD-1 или PD-L1 McAb још није одобрен за стављање у промет. Сва претходно наведена два лека PD-1 McAb и један лек PD-L1 McAb одобрена за стављање у промет у САД-у, ЕУ или Јапану и другим земљама/регионима показали су клинички користан одговор за супресију раста тумора, па чак и брисање и одбацивање тумора, и значајно продужење времена преживљавања пацијената током њихове ране фазе клиничког испитивања (фаза I), уз прихватљиву безбедност за дуготрајну примену (Brahmer JR et al, JCO 2010; 28: 3167-3175; Topalian S et al, NEJM 2012; 366: 2443-2454; Brahmer JR et al, NEJM 2012; 366: 2455-2465; Hamid O et al, NEJM 2013; 369:134-144). Најсензационалнији, велики резултат клиничког испитивања који је први пут јавно објављен био је онај који су Topalian и други објавили у међународном медицинском часопису N Engl J Med јуна 2012. године (Topalian S et al: N Engl J Med 2012, 366: 2443-2454). Према чланку, у фази I клиничког испитивања које је укључивало 296 пацијената са малигним тумором у завршном стадијуму, након што је пацијентима сваке две недеље интравенозно инјектиран ниволумаб (шифра: BMS-93655), лек PD-1 McAb развијен од стране компаније BMS, 28% пацијената са меланомом, 27% пацијената са карциномом бубрежних ћелија и неочекивано 18% пацијената са NSCLC приметило је инхибицију или смањење у величини њихових тумора. Ниволумаб је такође показао дуготрајне клиничке ефекте лечења тумора. На пример, међу 31 пацијентом који је праћен дуже од годину дана, 20 (64,5%) остало је клинички ефикасно.

Следеће клиничко испитивање је даље показало да је куративни ефекат ниволумаба био чак бољи од лекова за хемотерапију у клиничком лечењу малигног тумора у завршном стадијуму. На пример, према чланку који су Robert и други објавили у часопису N Egnl J Med (Robert C et al: N Engl J Med. 2015;372:320-30) јануара 2015. године, у клиничком испитивању под називом CheckMate066 коју је спонзорисала компанија BMS, 418 таквих пацијената са метастатским меланомом у завршном стадијумом и без BRAF мутације као нелечени и груписани насумично, узимало је ниволумаб једном у две недеље или лек за хемотерапију дакарбазин, а након таквог третмана током једне године, у поређењу са групом леченом дакарбазином, дошло је до значајног побољшања укупног преживљавања и преживљавања без прогресије болести код пацијената у групи која је примала ниволумаб. Укупна стопа преживљавања у групи која је примала ниволумаб била је 72,9%, док је у групи која је примала дакарбазин била 42,1% (P <0,001); медијана преживљавања без прогресије болести у групи која је примала ниволумаб била је 5,1 месец, док је у групи која је примала дакарбазин била 2,2 месеца (P<0,001); објективна стопа ремисије у групи која је примала ниволумаб била је 40%, док је у групи која је примала дакарбазин била 13,9% (P<0,001).

Слично бројним резултатима клиничког испитивања ниволумаба, резултати клиничког испитивања пембролизумаба су такође невероватни и инспиративни. Према чланку који су Hamid и други објавили у N Egnl J Med (Hamid O et al: N Engl J Med 2013, 369:134-144) јула 2013. године, у фази I међународног мултицентричног испитивања, пацијенти са меланомом у завршном стадијуму са напредовањем болести након што су најмање два пута примили терапију ипилимумабом, насумично су распоређени да им се једном у три недеље интравенозно инјектира 2 mg/kg или 10 mg/kg пембролизумаба, до појаве било какве прогресије болести или нетолерантне токсичности или до добровољног повлачења пацијената из клиничког испитивања. Анализом резултата клиничког испитивања, утврђено је да је 38% пацијената приметило инхибицију или смањење у величини њихових тумора након терапије пембролизумабом; међу 52 пацијента са раком са медијаном периода праћења од 11 месеци, 42 (81%) је и даље било добро и наставило је да прима терапију пембролизумабом.

Према чланку који су Robert и други објавили у међународном часопису Lancet (Robert C et al: Lancet. 2014 Sept. 20; 384:1109-17) септембра 2014. године, 173 пацијента са меланомом у завршном стадијуму који су примили неефикасну терапију ипилимумабом насумично су груписани да им се интравенозно инјектира пембролизумаб (доза: 2 mg/kg, н=89) или пембролизумаб (доза: 10 mg/kg, н=84) једном у три недеље, до појаве било какве прогресије болести или нетолерантне токсичности или до добровољног повлачења пацијената из клиничког испитивања. Резултати су показали, са медијаном периода праћења од 8 месеци, да је укупна стопа одговора, ОРР, код две групе са дозом McAb пембролизумаба била 26%, међу којима 21 од 81 пацијента у групи са дозом од 2 mg/kg и 20 од 76 пацијената у групи са дозом од 10 mg/kg је преживело.

Упркос револуцији у лечењу рака, клинички још увек постоје многи недостаци McAb лекова Opdivo (Ниволумаб) и Keytruda (Пембролизумаб), укључујући, између осталог, следеће проблеме:

1) McAb лекови Opdivo (Ниволумаб) и Keytruda (Пембролизумаб) су одобрени само за клиничко лечење неколико типова тумора, као што су меланом у завршном стадијуму, карцином бубрега, NSCLC, HNSCC и рак мокраћне бешике, а безбедност и валидност клиничког лечења других уобичајених и вишеструких малигних тумора таквим лековима треба испитати и верификовати.

2) Што се тиче типова тумора за које је одобрено лечење McAb лековима Opdivo (Ниволумаб) и Keytruda (Пембролизумаб), ефективна стопа лечења таквим лековима је само 15-50%, а медијана ПФС пацијената траје само неколико месеци, што значи да за већину пацијената са раком, чак и ако су узимали тренутне лекове PD-1 McAb, не постоји гаранција да ће имати користи или да им се период преживљавања може значајно продужити.

3) Пацијенти који дуготрајно користе McAb лекове Opdivo (Ниволумаб) и Keytruda (Пембролизумаб) могу да пате од нежељених догађаја повезаних са имунитетом, као што је имунски посредован пнеумонитис; наведени нежељени догађаји понекад могу укључити кожу, гастроинтестинални тракт, јетру, унутрашњу секрецију и многа друга ткива и органе (Naidoo J et al: Ann Oncol.2015; 26:2375-91).

Да би се превазишли наведени недостаци, поред даљег спровођења фундаменталних и клиничких испитивања о специфичном епитопу, начину деловања, узроцима нежељених реакција на лек итд. постојећих лекова Opdivo (Ниволумаб) и Keytruda (Пембролизумаб), нови анти-PD-1 McAb лекови са јединственим антиген-везујућим регионом/епитопом и већом биолошком активношћу/антитуморским ефектима од постојећих Opdivo (Ниволумаб) и Keytruda (Пембролизумаб) in-vitro и in-vivo морају бити развијени и клинички покренути, тако да задовољи медицинске потребе бројних пацијената оболелих од рака, у Кини и у иностранству.

Како се везивање PD-1 за његов лиганд (PD-L1 или PD-L2) карактерише широким доменом везивања, са више десетина аминокиселинских места која учествују у везивање итд., и пошто хумани PD-1 протеин дели само 60% хомологије са мишјим PD-1 протеином у аминокиселинској секвенци, теоретски се спекулише да је могуће направити или развити различите нове анти-PD-1 McAb-ове са специфично везујућим доменима/различитим епитопима применом традиционалне имунизације мишева и хибридомске технологије. Очекује се да ће ови McAb-ови, са новим и јединственим антиген-везујућим доменима или епитопима, имати јачу in-vitro и in-vivo биолошку активност или имати безбедније и супериорније куративне ефекте од тренутно стављеног у промет PD-1 McAb Opdivo (Ниволумаб) или Keytruda (Пембролизумаб). С једне стране, ови нови McAb-ови могу се користити као фармацеутски састојци, било у комбинацији или секвенци са лековима стављеним у промет PD-1 McAb или лековима PD-L1 McAb, како би се додатно побољшала имунолошка функција домаћина и антитуморски ефекат. С друге стране, очекује се да ће се ти нови McAb-ови развити у нове појачиваче имунолошке функције или користити самостално као антитуморски фармацеутски препарати.

WO2017/055547 А1 открива антитела која припадају групи Bin 1E (12865, 12892 и 12777) која не везују епитопе везане за позната антитела ниволумаб или пембролизумаб. WO2016/020856 А2 открива антитела која нису у компетицији са пембролизумабом. WO2017/025051 А1 такође открива антитела која нису у компетицији са пембролизумабом. WO2015/035606 А1 се односи на анти-PD1 антитела и проучава епитопе везивања хуманизованих анти-PD-1 mAb-ова, међу којима је ниволумаб.

Сажетак

Један од техничких проблема који треба решити предметним проналаском је обезбеђивање новог анти-PD-1 McAb или његовог деривата, као што је Fab фрагмент антитела и једноланчано антитело, са антиген-везујућим доменима или епитопима који се разликују од оних у тренутном Opdivo (Ниволумаб) или Keytruda (Пембролизумаб). McAb може да делује као антагонист и инхибитор везивања PD-1 антигена за његове лиганде (PD-L1 и PD-L2).

Други технички проблем који треба решити предметним проналаском је обезбеђивање ДНК молекула или гена који кодирају претходно наведено антитело.

Трећи технички проблем који треба решити предметним проналаском је обезбеђивање лекова или фармацеутских састава који садрже претходно наведено антитело.

Четврти технички проблем који треба решити предметним проналаском је обезбеђивање примене лекова или фармацеутских састава који садрже претходно наведено антитело у лечењу тумора.

Пети технички проблем који треба решити предметним проналаском је обезбеђивање методе припремања претходно наведеног антитела.

У циљу решавања горе наведених техничких проблема, предметни проналазак примењује следећа техничка решења:

Прво, предметни проналазак обезбеђује нови анти-PD-1 McAb или његов дериват, као што је Fab фрагмент антитела или једноланчано антитело, са антиген-везујућим местима или епитопима који се разликују од оних код Opdivo (Ниволумаб) или Keytruda (Пембролизумаб). Ово ново антитело се састоји од првог и другог варијабилног региона: први варијабилни регион је варијабилни регион лаког ланца антитела, од којих су антиген CDR 1, CDR 2 и CDR 3 аминокиселинске секвенце приказане у ИД. БР. СЕК.: 3, ИД. БР. СЕК.: 4 и ИД. БР. СЕК.: 5, респективно, док је други варијабилни регион варијабилни регион тешког ланца антитела, од којих су антиген CDR 1, CDR 2 и CDR 3 аминокиселинске секвенце приказане у ИД. БР. СЕК.: 8, ИД. БР. СЕК.:9 и ИД. БР. СЕК.: 10, респективно, и назначено тиме што наведени први варијабилни регион је варијабилни регион лаког ланца антитела, са аминокиселинском секвенцом приказаном у ИД. БР. СЕК.: 11, док је наведени други варијабилни регион варијабилни регион тешког ланца антитела, са аминокиселинском секвенцом приказаном у ИД. БР. СЕК.: 12. Као пожељно техничко решење предметног проналаска, оно садржи наведени варијабилни регион лаког ланца антитела и константни регион лаког ланца хуманог антитела, као и зглобни регион, CH1, CH2 и CH3 наведеног варијабилног региона тешког ланца антитела и константни регион тешког ланца хуманог антитела.

Као пожељно техничко решење предметног проналаска, наведени константни регион лаког ланца хуманог антитела је из капа ланца хуманог антитела или ламбда ланца антитела, а наведени константни регион тешког ланца хуманог антитела је из хуманог подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или, пожељно IgG4.

Друго, предметни проналазак обезбеђује молекул ДНК или нуклеотидну секвенцу гена која кодира наведено антитело или његов дериват, од којих је нуклеотидна секвенца гена варијабилног региона лаког ланца антитела приказана у ИД. БР. СЕК.: 13, а нуклеотидна секвенца гена варијабилног региона тешког ланца антитела приказана је у ИД. БР. СЕК.: 14.

Треће, предметни проналазак обезбеђује вектор експресије, који садржи нуклеотидну секвенцу ДНК молекула/гена која кодира наведено антитело, и регулаторну секвенцу експресије која је оперативно са њим повезана.

Четврто, предметни проналазак обезбеђује рекомбинантну ћелију домаћина, која је трансформисана из наведеног вектора експресије. Рекомбинантна ћелија домаћина или њена ћерка ћелија експримира наведено антитело или његов дериват. Антитело укључује хуманизовано моноклонско антитело, а његов дериват укључује Fab фрагмент антитела, једноланчано антитело и биспецифично антитело.

Пето, предметни проналазак обезбеђује лек или фармацеутски састав , који садржи фармацеутски ефикасну количину антитела или његовог деривата и фармацеутски прихватљив носач.

Шесто, предметни проналазак обезбеђује примену лека или фармацеутске саставе претходно наведеног антитела у припремању лека за лечење тумора, пожељно рака дебелог црева. У својим специфичним отелотворењима, предметни проналазак описује примену хуманизованог антитела у инхибицији раста рака дебелог црева in vivo.

Седмо, предметни проналазак обезбеђује методу припремања таквог антитела или његовог деривата, која укључује следеће кораке:

а) Обезбедити вектор експресије који садржи ДНК секвенцу и регулаторну секвенцу експресије која је оперативно са њим повезана;

б) Трансформисати ћелије домаћина са вектором експресије наведеним у кораку а); ц) Ћелијска култура домаћина добијена из корака б) под условима погодним за експресију наведеног антитела; и

д) Добити наведено антитело одвајањем и пречишћавањем течности ћелијске културе домаћина.

Термин „моноклонско антитело (McAb или mAb)” овде се односи на имуноглобулине добијене из ћелије чисте линије, који имају исту структуру и хемијска својства и специфични су за једну антигенску детерминанту. За разлику од конвенционалних препарата поликлонског антитела (са различитим антителима специфичним за генерално различите детерминанте), свако моноклонско антитело је специфично за једну детерминанту на антигену. Поред своје специфичности, моноклонска антитела имају предност у томе што су култивисана из хибридома или ћелија рекомбинационог инжењеринга без икакве смеше других имуноглобулина. Модификатор „моноклонско” показује карактер антитела да потиче из хомогеног кластера антитела, што не треба тумачити јер су му потребне посебне методе за стварање антитела. Термин „хуманизовано моноклонско антитело” овде се односи на мишје моноклонско антитело чије су све или суштински све аминокиселинске секвенце осим региона који одређују комплементарност (CDR) и укључујући секвенце оквирног региона у варијабилном региону замењене аминокиселинским секвенцама хуманог имуноглобулина како би се максимално смањила имуногеност мишјег моноклонског антитела.

Термини „антитело” и „имуноглобулин” овде су хетерогени тетрамерни гликопротеини од 15.000 или више далтона са истим карактеристикама структуре и који се састоје од два иста лака ланца (L) и два иста тешка ланца (H). Сваки L је повезан са H ковалентном дисулфидном везом, док број дисулфидних веза између изотипских L-ија варира са сваким имуноглобулином. Сваки H и сваки L имају унутарланчане дисулфидне везе на правилним размацима. На крају сваког H, налази се VH, праћен вишеструким константним регионима; на оба краја сваког L постоје VL и константни региони; константни региони L су окренути према првом константном региону H, док је VL окренут према VH. Посебни аминокиселински остаци формирају међупростор између VL и VH.

Термин „варијабилан” овде значи да разлика неких делова варијабилних региона антитела у секвенци чини да се различита специфична антитела везују за њихове специфичне антигене и да су специфична за њих. Међутим, варијабилност није распоређена равномерно у целом варијабилном региону антитела, већ је концентрисана у три таква фрагмента VL и VH који постају CDR или HVR. Релативно конзервативни део варијабилног региона је оквирни регион (FR). Сваки VH и VL антитела се састоји од четири FR-а, који су отприлике у β-савијеној конфигурацији повезани са три CDR-а који формирају спојну везу, и могу делимично да формирају β-савијену структуру у неким случајевима. CDR-ови сваког ланца су близу један другом преко FR-а и формирају антиген-везујуће место антитела заједно са CDR-овима другог ланца (Kabat et al, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. 1, Page 647-669 (1991)). Константни региони антитела не учествују у директном везивању антитела за антигене, али показују различите ефекторске функције, као што је укључење у ћелијску цитотоксичност зависну од антитела (ADCC) или цитотоксичност зависну од комплемента (CDC) антитела.

Генерално, антитело предметног проналаска се може припремити следећом методом:

Прво, ген који кодира антитело предметног проналаска уметнути у вектор експресије са одговарајућим регулаторним секвенцама експресије.

Термин „регулаторна секвенца експресије” овде се обично односи на секвенцу која учествује у контроли експресије гена. Регулаторна секвенца експресије укључује такве промотере и сигнале терминације који су оперативно повезани са циљним генима. ДНК секвенце које кодирају антитело предметног проналаска могу се добити конвенционалним методама које су добро познате техничарима у овој области, као што је вештачка синтеза према секвенцама протеина откривеним у предметном проналаску или PCR пролиферација. Затим, тако добијени фрагменти ДНК могу бити уметнути у погодне векторе експресије методама добро познатим у овој области. Вектори експресије који се користе у предметном проналаску могу бити они који се продају на тржишту и који су познати техничарима у овој области, као што је pCDNA3.1 компаније Invitrogen. Ћелије домаћина погодне за трансформацију векторима експресије генерално укључују прокариотске ћелије и еукариотске ћелије. Уобичајена прокариотска ћелија домаћина укључује бактерије Escherichia coli и bacillus subtilis; уобичајена еукариотска ћелија домаћина укључује ћелију квасца, ћелију инсекта, ћелију сисара. У предметном проналаску, пожељна ћелија домаћина је ћелија сисара, посебно ћелија оваријума кинеског хрчка (CHO).

Узети супернатантну течност ћелијске културе након култивисања ћелија домаћина трансформисаних помоћу вектора експресије под погодним условима, као што су адхезивна или суспензијска ћелијска култура са медијумом без серума у боци за ћелијску културу или биореактору, а затим узети антитело предметног проналаска након пречишћавања конвенционалним корацима одвајања или методама које су добро познате техничарима у овој области, укључујући афинитетну хроматографију са протеином А, јоноизмењивачку хроматографију у колони и стерилизацију филтрацијом.

Антитело предметног проналаска добијено пречишћавањем може да се раствори у стерилном физиолошком раствору и другим погодним растварачима, са концентрацијама од 0,01-100 mg/ml, идеално 1-20 mg/ml).

Да би се добила мишја моноклонска антитела која антагонизују и инхибирају везивање PD-1 (програмирана смрт-1) за његов лиганд, хибридомске ћелијске линије су генерисане имунизацијом мишева са рекомбинованим хуманим екстрацелуларним PD-1 протеином кроз понављајућу супкутану имунизацију у малој дози, након чега следи скрининг поликлонских антитела са високом потенцијом против PD-1 протеина, а затим генерисање броја хибридома које стабилно лучи анти-хумани-PD-1 mAb спајањем ћелија слезине узетих од имунизованих мишева са мијеломским ћелијама миша in-vitro. Након селекције лека, субклонирања и скрининга помоћу ЕЛИСА теста, вестерн блотинга, имунохистохемије итд., идентификована је једна хибридомска ћелијска линија миша бр. Ab21 која се не само специфично везује за хумани PD-1 протеин, већ је такође способна да блокира/инхибира везивање PD-1 протеина за његове лиганде PD-L1 и PD-L2.

Предметни проналазак добија фрагмент гена који кодира варијабилни регион тешког ланца и варијабилни регион лаког ланца овог мишјег антитела помоћу генетског инжењеринга, итд., чиме се спроводи хуманизациона трансформација антитела и успоставља његов вектор експресије (pCDNA3.1-hAB21). Узети ћелије реинжењеринга које стабилно и ефикасно луче хуманизовано антитело увођењем вектора експресије у CHO ћелије након трансфекције, а биоактивни хуманизовани hAb21 протеин се добија одвајањем и пречишћавањем супернатаната културе из ћелија реинжењеринга.

Компетитивна ЕЛИСА анализа показује да се епитоп који се везује за PD-1 хуманизованог hAb21 значајно разликује од оног код ниволумаба или пембролизумаба (MK3475). Хуманизовани hAb21 има инхибиторни ефекат на раст тумора након примене in vivo, и очигледно има много бољи куративни ефекат од стављеног лека у промет пембролизумаб (MK3475).

1

Кратак опис цртежа

Слика 1 представља дијаграмски цртеж упоредне анализе хуманих PD-1 и мишјих PD-1 аминокиселинских секвенци у отелотворењу 1 предметног проналаска.

Слика 2 представља дијаграмски цртеж ЕЛИСА резултата, који показује везивање узорака супернатанта ћелијске културе из хибридома миша за рекомбинантни екстрацелуларни PD-1 протеин претходно обложен на микротитарској плочи са 96 места у отелотворењу 1 предметног проналаска. mAB21 и mAb11 су узорци супернатанта из два различита хибридома, а нефузионисани узорак мијеломске ћелијске културе SP2/0 служио је као негативна контрола. Слика 3 представља дијаграмски цртеж FCM резултата, који приказује везивање узорака мишјих антитела за CHO ћелије које су стабилно трансфектоване хуманим PD-1 геном (CHO/PD-1) у отелотворењу 2 предметног проналаска. Слика 3А представља узорак из контроле-IgG, постављен као негативна контрола.

Слика 3Б представља узорак фузионог протеина PDL2-Fc, постављен као позитивна контрола. Слика 3Ц представља узорак из супернатанта хибридома mAb7.

Слика 3Д представља узорак из супернатанта хибридома mAB21.

Слика 4 представља дијаграмски цртеж резултата имунохистохемије (IHC), који показује специфично везивање узорка mAB21 McAb за пресеке ткива у отелотворењу 3 предметног проналаска.

Слика 4А представља пресек ткива слезине мајмуна.

Слика 4Б представља пресек ткива лимфног чвора мајмуна.

Слика 5А представља дијаграмски цртеж in-vitro компетитивног ЕЛИСА резултата, који показује антагонизацију и блокирање везивања биотин-PDL2-Fc протеина за хумани PD-1 протеин који је претходно обложен на микротитарским плочама са 96 места са mAB21 или MK3475, као што је описано у отелотворењу 4 предметног проналаска. hPV19 је ирелевантан McAb, постављен као узорак негативне контроле.

Слика 5Б представља дијаграмски цртеж in-vitro компетитивног ЕЛИСА резултата, који показује антагонизацију и блокирање везивања битотин-MK3475 за хумани PD-1 протеин који је претходно обложен на микротитарским плочама са 96 места са mAB21 или MK3475, као што је описано у отелотворењу 5 предметног проналаска. hPV19 је ирелевантан McAb, постављен као узорак негативне контроле.

Слика 6А представља дијаграмски цртеж упоредне анализе аминокиселинских секвенци у варијабилном региону лаког ланца хуманизованог hAb21, ниволумаба и MK3475 у отелотворењу 8 предметног проналаска. Уоквирена подручја представљају аминокиселинске секвенце у CDR1, CDR2 и CDR3.

Слика 6Б представља дијаграмски цртеж упоредне анализе аминокиселинских секвенци у варијабилним регионима тешког ланца хуманизованог hAb21, ниволумаба (Nivo) и MK3475 у отелотворењу 8 предметног проналаска. Уоквирена подручја аминокиселинских секвенци у CDR1, CDR2 и CDR3.

Слика 7 представља дијаграмски цртеж упоредне анализе, који приказује везивање три IgG4 McAb-ова (hAb21, ниволумаб и MK3475) и три IgG1 McAb-ова (Avastin, hPV19 и Erbitux) за рекомбинантни хумани FcR протеин (CD64 протеин) претходно обложен на микротитарским плочама са 96 места, као што је описано у отелотворењу 10 предметног проналаска.

Слика 8 представља дијаграмски цртеж ЕЛИСА резултата, упоредне анализе везивања хуманизованог hAb21, ниволумаба (Nivo) и MK3475 за хумани PD-1-Fc и друге Fc фузионе протеине повезане са имунитетом, као што је описано у отелотворењу 11 предметног проналаска. hPV19 је ирелевантан McAb узорак, постављен као негативна контрола.

Слика 9А представља дијаграмски цртеж in-vitro компетитивних ЕЛИСА резултата, који показује антагонизацију и блокирање везивања биотин-MK3475 за хумани PD-1 протеин обложен на микротитарској плочи са 96 места хуманизованим hAb21, ниволумабом (Nivo) и MK3475, као што је описано у отелотворењу 12 предметног проналаска. hPV19 је ирелевантан McAb, постављен као узорак негативне контроле.

Слика 9Б представља дијаграмски цртеж in-vitro компетитивних ЕЛИСА резултата, који показује антагонизацију и инхибицију везивања биотин-Ниволумаба за хумани PD-1 протеин обложен на микротитарској плочи са 96 места хуманизованим hAb21, ниволумабом (Nivo) и MK3475, као што је описано у отелотворењу 12 предметног проналаска. hPV19 је ирелевантан McAb, постављен као узорак негативне контроле.

Слика 9Ц представља дијаграмски цртеж in-vitro компетитивних ЕЛИСА резултата, који показује антагонизацију и инхибицију везивања ботин-hAb21 за хумани PD-1 протеин обложен на микротитарској плочи са 96 места хуманизацијом hAb21, ниволумабом, MK3475, ниволумабом и MK3475+Nivo, као што је описано у отелотворењу 12 предметног проналаска. hPV19 је ирелевантно антитело.

Слика 10А представља дијаграмски цртеж FCM резултата, који показује везивање ниволумаба у различитим концентрацијама за CHO ћелије које су стабилно трансфектоване са PD-1 геном, као што је описано у отелотворењу 13 предметног проналаска. Хистограми тачака представљају резултате IgG, постављени као негативна контрола.

Слика 10Б представља дијаграмски цртеж FCM резултата, који показује везивање mAB21 у различитим концентрацијама за CHO ћелије које су стабилно трансфектоване са PD-1 геном, као што је описано у отелотворењу 13 предметног проналаска. Хистограми тачака представљају резултате IgG, постављени као негативна контрола.

Слика 10Ц представља криву дозе-одговора која показује средњи флуоресцентни интензитет (MFI) и концентрације hAb21 или ниволумаба, као што је описано у отелотворењу 12 предметног проналаска.

Слика 11 представља дијаграмски цртеж FCM резултата, који показују везивање ниволумаба (Nivo, лево) или hAb211 (hAb21, десно) у различитим концентрацијама за хумане Јуркат Т ћелије активиране помоћу PHA, као што је описано у отелотворењу 14 предметног проналаска. Хистограми тачака представљају нормалне резултате IgG, постављени као негативна контрола. Слика 12 представља дијаграмски цртеж FCM резултата, који показују везивање hAb21 (десно) или ниволумаба (лево) у различитим концентрацијама за хумани PBMC активиран помоћу PHA, као што је описано у отелотворењу 15 предметног проналаска. Хистограми тачака представљају нормалне резултате IgG, постављени као негативна контрола.

Слика 13А представља криву раста мишјих ћелија рака дебелог црева MC38, под кожу hPD-1 хуманизованих мишева у отелотворењу 16 предметног проналаска након примене hAb21 или MK3475 (Пембролизумаб) у фази 1 претклиничког испитивања.

Слика 13Б представља криву раста тежине миша након примене hAb21 или MK3475 (Пембролизумаб) у фази 1 претклиничког испитивања. Мишје ћелије рака дебелог црева MC38 су инокулиране под кожу hPD-1 хуманизованих мишева у отелотворењу 16 предметног проналаска.

Слика 14А приказује тренд раста запремине тумора код сваке појединачне животиње из негативне контролне групе третиране нормалним физолошким раствором (NS) (Група А) у фази 1 претклиничког испитивања. Мишје ћелије рака дебелог црева MC38 су инокулиране под кожу hPD-1 хуманизованих мишева у отелотворењу 16 предметног проналаска.

Слика 14Б приказује тренд раста запремине тумора код сваке појединачне животиње у третираној групи са McAb пембролизумабом (MK3475) (Група Б) у фази 1 претклиничког испитивања. Мишје ћелије рака дебелог црева MC38 су инокулиране под кожу hPD-1 хуманизованих мишева у отелотворењу 16 предметног проналаска.

Слика 14Ц приказује тренд раста запремине тумора код сваке појединачне животиње у третираној групи са McAb hAb21 (Ц) (Група А) у фази 1 претклиничког испитивања. Мишје ћелије рака дебелог црева MC38 су инокулиране под кожу hPD-1 хуманизованих мишева у отелотворењу 16 предметног проналаска.

Слика 15 представља поређење графикона раста поново инокулираних тумора са оним инокулираним под кожу дивљег соја мишева C57BL/6, у фази 2 претклиничког испитивања. Мишје ћелије рака дебелог црева MC38 су инокулиране под кожу hPD-1 хуманизованих мишева у отелотворењу 16 предметног проналаска.

Слика 16 приказује тренд раста запремине тумора код третираних животиња са hAb21 или контролних са NS. Мишје ћелије рака дебелог црева MC38 су инокулиране под кожу обичних мишева C57BL/6 у отелотворењу 17 предметног проналаска.

Слика 17 представља профил концентрације лека-времена за hAB21 након једне интравенске инјекције код мајмуна у отелотворењу 18 предметног проналаска.

Детаљан опис отелотворења

У наставку је дат детаљни опис предметног проналаска у комбинацији са неколико отелотворења, која се користе за илустрацију, а не ограничавање предметног проналаска. Отелотворење 1. Генерисање, скрининг и идентификација хибридомских ћелијских линија миша које луче анти-PD-1 антитела

1) Упоредна анализа аминокиселинских секвенци хуманог PD-1 и мишјег PD-1 протеина Погледајте слику 1 за поређење и анализу аминокиселинских секвенци хуманих PD-1 протеина и мишјих PD-1 протеина; аминокиселинске секвенце означене курзивом у оквиру су сигнални пептиди који воде екстрацелуларну секрецију и експресију PD-1, а аминокиселинске секвенце означене подебљаним словима у оквиру су трансмембрански регион (TM) PD-1 протеина. Као што је приказано на слици 1, у погледу аминокиселинских секвенци, хумани PD-1 протеин и мишји PD-1 протеин у целини деле само 60% хомологије, док постоји преко тридесет (30) диференцијалних тачака аминокиселина у екстрацелуларном региону (укључујући IgV регион) који учествује у препознавању и директном везивању његовог лиганда код човека и миша. Стога се спекулише да се McAb мишјег анти-хуманог PD-1 за низ различитих региона везивања или епитопа аминокиселина може генерисати применом традиционалне имунизације антиген протеинским антигеном код мишева и технологије припремања хибридома. Очекује се да ће ови анти-хумани PD-1 McAb-ови, са антигеном везаним регионима или епитопима другачијим од оних код тренутних PD-1 McAb-ова, као што су Opdivo (Ниволумаб) или Keytruda (Пембролизумаб), имати другачију или чак супериорну биолошку активност in vitro и vivo и куративне ефекте од оних Opdivo (Ниволумаб) или Keytruda (Пембролизумаб). С једне стране, делујући као састојак лека, ови нови McAb-ови који препознају нове епитопе могу се користити као састојак лека, било у комбинацији или секвенци тренутног лека PD-1 McAb или лека PD-L1 McAb како би се додатно појачала имунолошка функција органа и побољшао антитуморски ефекат, а са друге стране, независно развијали како би постали нови тип појачивача имунолошке функције или препарат антитуморског лека који се може користити самостално.

Дакле, предметни проналазак спроводи развој и припремање ове врсте новог PD-1 McAb, са детаљним поступцима припремања на следећи начин:

2) Генерисање, скрининг и идентификација хибридомских ћелијских линија миша које луче антитела која антагонизују PD-1

Корак 1. Извор рекомбинационог хуманог PD-1 протеина (имунизујући антиген) и имунизација животиња

У овој реализацији предметног проналаска, антиген за имунизацију је рекомбиновани екстрацелуларни PD-1 протеин експримиран у ћелијама сисара (производ компаније Sino Biological Inc.). Након мешања са Фројндовим комплетним адјувансом (FCA) (производ компаније Sigma Corporation), затим инјектирати на више места под кожу Balb/c мишева (сваки пут 100 μл по мишу и 10 μл PD-1 протеина). 2 до 3 недеље након ове прве имунизације, поново на више места инјектирати смешу хуманих PD-1 протеина и FCA-ова (производ компаније Sigma Corporation). Након појачане имунизације 3 до 4 пута, сакупити аликвот мишјег серума и тестирати активност антитела која антагонизују PD-1 у мишјим серумима помоћу ЕЛИСА у микротитарској плочи са 96 места претходно обложеној рекомбинованим PD-1 хуманим PD-1 протеином, а затим узети ћелије из слезине код оних мишева који показују већу анти-PD-1 активност, за припремање фузије ћелија у следећем кораку.

Корак 2. Фузија ћелија

1

3 до 4 дана након последње имунизације, припремљене су суспензије ћелија слезине миша и спојене са SP2/0 мијеломском ћелијом миша (купљено од Cell Preservation Center of Shanghai Faculty of Life Sciences, CAS) у односу 5:1 или 10:1 под дејством 50% PEG-1000 (производ компаније Sigma Corporation). Фузија ћелија је обављена додавањем PEG од 1 мл према конвенционалној методи (Kohler G. and Milstein C: Nature 1975; 256:495-497), што би требало да се заврши за 60 сек. Након што се реакција одвијала 90 сек., фузија је прекинута додавањем медијума за ћелијску културу RPMI-1640 без серума, центрифугирањем брзином од 1000 о/мин током 10 минута, затим одбацивањем супернатанта и ресуспендовањем ћелијског талога до концентрације од 1Х10<6>ћелија/мл са RPMI 1640 који садржи 10%-тни HAT (H означава хипоксантин, А аминоптерин, а Т тимидин, производ компаније Sigma Corporation) FCS медијума за ћелијску културу, нанети ћелијску културу у микротитарску плочу са 96 места (200 μл по месту) и култивисати 2 до 3 недеље у инкубатору са 5%-тним CO2 (производ компаније Thermo Corporation) на температури од 37 °C.

Корак 3. Скрининг хибридомских ћелија миша које позитивно луче антитела помоћу ЕЛИСА

Слично, обложити микротитарску плочу са 96 места рекомбинационим хуманим PD-1 протеином (2 μg/ml, pH 9,6, 0,1 М NaHCO3 течност), додати 2%-тни BSA и затворити на температури од 4 °C, након облагања на температури од 37 °C током 2 сата.

Следећег дана, након испирања обложене микротитарске плоче са PBS који садржи 0,1%-тни Tween20, додати супернатанте хибридомске ћелијске културе који ће се детектовати (са нефузионисаним супернатантима мијеломске ћелијске културе SP2/0 као негативном контролом) у микротитарску плочу са 96 места и инкубирати 2 сата на температури од 37 °C. Након испирања са PBS који садржи 0,1%-тни Tween20,

додати HRP-ом обележен козји антимишји IgG (производ компаније Sigma Corporation), у микротитарску плочу са 96 места и инкубирати 2 сата на температури од 37 °C. Након довољног поновног испирања са PBS који садржи 0,1%-тни Tween20, додати супстрат (OPD који садржи 0,1%-тни H2O2) за развијање боје током 10-15 минута, а затим додати 0,1М раствор HCI за прекидање реакције. Након тога, OD вредност је измерена на 492 nm у MK3-Multiskan ELISA (производ компаније Thermo Scientific Corporation). Хибридомске ћелије са вредношћу ОД 4925-10 пута већом од негативне контроле су поново субклониране, амплификоване и криоконзервиране.

Корак 4. Испитивање субклонирања и ограничавања разблажења позитивних хибридомских ћелија

Након примарног скрининга, разблажити позитивне хибридомске ћелије до 1-10 ћелија/месту микротитарске плоче са RPMI-1640 који садржи 10%-тни FCS медијум за ћелијску културу, засејати ћелијску културу у микротитарску плочу са 96 места и култивисати у инкубатору са 5%-тним CO2 на температури од 37 °C током 2 до 3 недеље. Након клонирања и узгоја, сакупити супернатанте и поново испитати анти PD-1 mAb ЕЛИСА методом. Слика 2 представља дијаграмски цртеж ЕЛИСА резултата који показује везивање супернатаната из субклонираних хибридомских ћелија за рекомбинационе PD-1 протеине. Супернатанти из хибридомске ћелијске линије mAB21 су показали везивање за PD-1.

Отелотворење 2. Проточно-цитометријска (FCM) анализа везивања мишјег mAB21 за CHO/PD-1

У овом отелотворењу, за детекцију и анализу везивања узорка mAB21 за CHO ћелије које стабилно експримирају хумани PD-1 (CHO/PD-1) помоћу проточне цитометрије, мишји супернатант mAB21 или мишји супернатант mAB7 за који је познато да се везује за хумане PD-1 протеине (погледајте јавни документ кинеске патентне пријаве, CN104558177А) је коришћен као прво антитело, а FITC-ом флуоресцентно обележен козји анти-мишји IgG као друго антитело. У ту сврху, везати CHO-PD-1 ћелије са мишјим IgG (негативна контрола, А), хуманим PDL2-Fc фузионим протеинима (Б), течним супернатантима mAB7 (Ц, слабљење 1:5) или течним супернатантима mAB21 (Д, слабљење 1:5) респективно; након једночасовне инкубације на температури од 4 °C и испирања са PBS који садржи 0,1%-тни FCS, додати FITC-ом обележен козји анти-мишји IgG (производ компаније Sigma Corporation) (додати FITC-ом обележен козји анти-хумани IgG-Fc за узорке хуманих PDL2-Fc фузионих протеина); након једночасовне инкубације на температури од 4 °C и поновног испирања са PBS који садржи 0,1%-тни FCS, узорци су подвргнути проточно-цитометријској анализи (Cytomics FC500 MCL) (производ компаније Beckman Coulter Corporation).

Слика 3 представља дијаграмски цртеж репрезентативних FCM резултата. Као што је приказано на слици 3, у поређењу са узорком негативне контроле мишјег IgG (видети слику 3А), узорком хуманог PDL2-Fc фузионог протеина (видети слику 3Б), позитивним узорком супернатанта mAB7 (видети слику 3Ц) или тестираним узорком супернатанта mAB21 (видети слику 3Д) сви показују специфично везивање за CHO/PD-1 ћелије; интензитет везивања узорка mAB21 је већи од интензитета везивања mAB7.

Отелотворење 3. Имунохистохемијска (IHC) детекција везивања mAB21 за ткива циномолгус мајмуна (Macaca fascicularis)

У овом отелотворењу, везивање узорака mAB21 за нормална ткива циномолгус мајмуна (обезбеђује компанија JOINN Laboratories (Суџоу)) је детектовано имунохистохемијом (IHC). Након рехидрације и излагања антигену, супернатанти mAB21 су додати у парафинске пресеке ткива слезине и лимфних чворова мајмуна. Након једночасовне инкубације на нормалној температури и испирања, додати DAB за развијање боје, хематоксилин за контрастно бојење, монтирати и фотографисати. Слика 4 представља репрезентативне резултате имунохистохемије, који показују специфично везивање узорака mAB21 за ткива слезине (видети слику 4А) и ткива лимфних чворова (видети слику 4Б) мајмуна.

Отелотворење 4. Компетитивна ЕЛИСА метода за откривање mAB21 који антагонизује и инхибира везивање PD-1 протеина за његове лиганде

Један од начина да се детектује биолошка активност mAB21 in-vitro је коришћење компетитивне ЕЛИСА методе за испитивање антагонизације везивања PD-1 протеина за његов рецептор (PD-L1 и PD-L2) помоћу mAB21.

Принцип и поступак компетитивне ЕЛИСА методе су следећи:

Помешати узорке mAB21 или узорке позитивне контроле различитих концентрација. На пример, помешати MK3475 са фиксним концентрацијама биотином обележених хуманих PD-1 рецепторских протеина (као што су PDL1-Fc или PDL2-Fc). Пренети смешу на микротитарску плочу са 96 места претходно обложену PD-1 протеином, након тога инкубирати и испрати, а затим додати ензимом обележен авидин (као HRP-ом обележен авидин). Након инкубације и поновног испирања, додати супстанцу за развијање боје и измерити OD вредност.

Детаљни кораци за ову компетитивну ЕЛИСА методу су следећи:

1) Обложити микротитарску плочу са 96 места рекомбинационим хуманим екстрацелуларним PD-1 протеинима (производ компаније Sino Biological Inc.) у концентрацији од 2 μg/ml и 50 μл/ по месту микротитарске плоче на температури од 4 °C, оставити преко ноћи;

2) Након испирања са PBS и 2%-тним BSA (разблажен у течностима PBS који садржи 0,1%-тни tween20) и затварања на собној температури у затвореном простору, додати фиксну количину биотином обележених PDL1-Fc протеина или PDL2-Fc протеина (производи компаније Sino Biological Inc.), AB7 антитела или неповезани мишји IgG у различитим концентрацијама и инкубирати 2 сата на температури од 37 °C;

3) Након испирања са PBS-Т раствором, додати HRP-ом обележен авидин (1:5000) и инкубирати 1 ч на температури од 37 °C;

4) Након испирања са PBS-Т раствором, додати раствор боје и супстрата (о-фенилендиамин) који садржи 3%-тни водоник пероксид и развити боју након 10 мин. на собној температури; и

1

5) Додати HCL за прекидање реакције, а затим детектовати вредност апсорпције светлости сваког места микротитарске плоче на таласној дужини од 492 nm помоћу ЕЛИСА.

Слика 5А представља репрезентативне резултате компетитивне ЕЛИСА методе који показују инхибицију везивања Biotin-PDL2Fc за PD-1 протеин од стране тестираног узорка mAB21 и позитивног узорка MK3475 in vitro. Као што је приказано на слици 5А, у узорку са mAB21 или MK3475 различитих концентрација и фиксном количином биотином обележеног PDL2-Fc протеина, OD вредност хромогене реакције сваког места микротитарске плоче је обрнуто пропорционална количини протеина антитела, тј. што је већа количина mAB21 или MK3475 додата, развија се нижа OD вредност боје. Додавање неповезаних McAb узорака има мало утицаја на OD вредност сваког места микротитарске плоче. Ови резултати јасно показују да mAB21, слично као MK3475, инхибира везивање PD-1 за његов рецептор in vitro.

Отелотворење 5. ЕЛИСА тест за компетиционо везивање mAB21 и MK3475 за PD-1 протеин

Сличан компетитивни ЕЛИСА тест се користи за детекцију и анализу компетитивног везивања mAB21 и MK3475 за PD-1 протеине, принцип и поступак ове детекције су следећи:

Помешати mAB21 или MK3475 различитих концентрација са фиксном количином биотином обележеног М3475 (биотин-MK3475), и пренети смешу на микротитарску плочу са 96 места претходно обложену PD-1 протеинима, након тога инкубирати и испрати, а затим додати ензимом обележен авидин (као HRP-ом обележен авидин), додати супстрат и измерити OD вредност.

Слика 5Б представља репрезентативне компетитивне ЕЛИСА резултате. Као што је приказано на слици 5Б, узорци из mAB21 или MK3475 различитих концентрација са фиксном количином биотином обележеног М3475 (биотин-MK3475), OD вредност хромогене реакције сваког места микротитарске плоче је обрнуто пропорционална количини протеина антитела. тј. што је већа количина mAB21 или MK3475 додата, развија се нижа OD вредност боје. Додавање неповезаних McAb узорака hPV19 има мало утицаја на OD вредност места микротитарске плоче. Ови резултати су показали да mAB21 може да буде у компетицији са MK3475 у везивању за PD-1 in vitro.

Отелотворење 6. Клонирање mAB21 гена који кодирају варијабилни регион

У ту сврху, екстраховати укупну РНК из хибридомских ћелија mAB21 и узети сегмент цДНК гена варијабилног ланца тешког ланца и варијабилног ланца лаког ланца mAB21 путем клонирања и амплификовања, респективно помоћу РТ-ПЦР (Реакција ланчане полимеразе са реверзном транскрипцијом) (Wang Y et al: Degenerated primer design to amplify the heavy chain variable region from immunoglobulin cDNA. BMC Bioinformatics. 2006; 7 Suppl (4): S9), са наведеном РНК као шаблоном и употребом дегенерисаних прајмера. Кораци за клонирање цДНК гена су следећи:

Корак 1. Екстраховати мРНК из хибридомских ћелија mAB21 користећи комплет (производ компаније Beyotime Biotechnology); и

Корак 2. Узети цДНК шаблон у епендорфову епрувету помоћу ПЦР (РТ-ПЦР).

Секвенца ПЦР прајмера (AB21-L) која се користи за реверзну транскрипцију у варијабилном региону лаког ланца mAB21 је TGT CGT TCA CTG CCA TCA AT, као што је приказано у ИД. БР. СЕК.: 15;

Секвенца ПЦР прајмера (AB21-H) која се користи за реверзну транскрипцију у варијабилном региону тешког ланца mAB21 је GCA AGG CTT ACA ACC ACA ATC, као што је приказано у ИД. БР. СЕК.: 16;

реакциони систем РТ-ПЦР:

прајмер 2 µl

РНК шаблон 30 µл

10 минута инкубирати на температури од 72 °C и ставити на лед 2 минута Након тога, додати:

1

5×РТ-ПЦР реакциони пуфер 10 µл

дНТП 5 µл

PrimeScript реверзна транскриптаза 1,5 µl

дестилована вода 1,5 µl

Укупна запремина 50 µl

Пустити реакцију на температури од 42 °C сат времена, а затим повећати температуру на 75 °C, а затим на -20 °C 15 минута да се реакција прекине. Након тога, сачувати и резервисати цДНК.

Корак 3. ПЦР клонирање и амплификација гена који кодирају варијабилни регион лаког ланца и варијабилни регион тешког ланца mAB21

Пар прајмера који се користи за клонирање и амплификацију гена у варијабилном региону лаког ланца mAB21 помоћу дегенерисаних прајмера ПЦР су:

Предњи прајмер: GAC ATT GTG ATG WCM CA, као што је приказано у ИД. БР. СЕК.: 17 Реверзни прајмер: CTG AGG CAC CTC CAG ATG TT, као што је приказано у ИД. БР. СЕК.: 18 W=A или T, M=A или C.

Пар прајмера који се користи за клонирање и амплификацију гена у варијабилном региону тешког ланца mAB21 помоћу дегенерисаних прајмера ПЦР су:

Предњи прајмер: GTR CAG CTT CAG GAG TC, као што је приказано у ИД. БР. СЕК.: 19 R=A или G.

Реверзни прајмер: GTG CTG GAG GGG ACA GTC ACT, као што је приказано у ИД. БР. СЕК.: 20 Након ПЦР амплификације, спровести електрофоретску анализу у 1%-тној агарози за ДНК производе. Након електрофорезе, одсећи одвојене ДНК траке за нуклеотидно секвенцирање ДНК у варијабилном региону лаког ланца и варијабилном региону тешког ланца антитела. ИД. БР. СЕК.: 1 је нуклеотидна секвенца ДНК варијабилног региона лаког ланца; ИД. БР. СЕК.: 2 је нуклеотидна секвенца ДНК варијабилног региона лаког ланца изведена из аминокиселинских секвенци варијабилног региона лаког ланца. Аминокиселинске секвенце региона који одређују комплементарност (CDR) CDR 1, CDR 2 и CDR 3 лаког ланца антитела су приказане у ИД. БР. СЕК.:3, ИД. БР. СЕК.:4 и ИД. БР. СЕК.:5, редом.

ИД. БР. СЕК.: 6 је нуклеотидна секвенца ДНК варијабилног региона тешког ланца и ИД. БР. СЕК.: 7 је изведена из аминокиселинских секвенци варијабилног региона тешког ланца. Аминокиселинске секвенце региона који одређују комплементарност (CDR) CDR 1, CDR 2 и CDR 3 тешког ланца антитела су приказане у ИД. БР. СЕК.:8, ИД. БР. СЕК.:9, редом.

Отелотворење 7. Конструкција химерног хуманог-мишјег антитела cAB21

Спојити гене у варијабилном региону лаког ланца и варијабилног региона тешког ланца AB21 добијене клонирањем и амплификовањем у отелотворењу 6 са сегментом гена у C-домену лаког ланца хуманог-капа и C-домену тешког ланца хуманог IgG1 да се добије ген хуманог-мишјег cAB21L и хуманог-мишјег cAB21H, респективно. Након тога, клонирати cAB21L и cAB21H до експресионог плазмида pcDNA3.1 респективно и пренети у Escherichia coli за амплификацију, а затим добити велики број експресионих плазмида са геном који кодира химерна хумана-мишја антитела (cAB21) након одвајања.

Помешати експресионе плазмиде са инсерцијом гена cAB21 са Fugen-6 липозомом (Roche), а затим истовремено трансфектовати у CHO ћелије. Два до 3 дана након трансфекције ћелија, сакупити супернатанте културе и додати их у микротитарску плочу са 96 места претходно обложену хуманим PD-1 протеином и HRP ензимом обележен козји анти-хумани IgG (купљено од компаније Shanghai Westang Bio-Tech Co., Ltd.) као друго антитело за детекцију везивања cAB21 у супернатантима за хумани PD-1 протеин путем ЕЛИСА.

Приказани у табели 1 су репрезентативни резултати ЕЛИСА методе.

1

Табела 1: ЕЛИСА тест за везивање супернатаната из ћелија које су пролазно трансфектоване са cAB21 геном за хумани PD-1 протеин

Резултати у табели 1 показују да супернатанти из CHO ћелија трансфектованих експресионим плазмидима cAB21 могу специфично да се вежу за хумани PD-1 протеин.

Након пуњења наведених супернатаната из трансфектованих ћелија у Protein A-Sepharose Fast Flow (производ компаније GE), затим центрифугирања и мембранске филтрације од 0,45 μm, добијени су протеини химерног хуманог-мишјег антитела (cAB21).

Отелотворење 8. Инжењеринг хуманизације mAB21

На основу чињенице да ЕЛИСА резултати показују да cAB21 одржава високо афинитетно везивање за хумани PD-1 протеин, затим коришћењем ПЦР-а или других начина клонирања генетским инжењерингом, трансплантирати CDR-ове и лаког и тешког ланца cAB21 у оквирне регионе (FR-ове) хуманог капа-лаког ланца и IgG4-тешког ланца, респективно, чиме се добија хуманизована верзија овог антитела, односно hAB21.

1) Хуманизација лаког ланца mAB21

Анализом аминокиселинске секвенце, утврђено је да продукти експресије гена заметне линије у првом V региону капа лаког ланца хуманог имуноглобулина (IgKV1-9, NCBI ген ИД: 28941) и варијабилном региону лаког ланца mAB21 деле највећу хомологију. Сходно томе, заменити FR-ове лаког ланца mAB21 хомологним секвенцама хуманог IgKV1-9, а затим спојити замењени варијабилни регион са кодирајућим секвенцама константног региона лаког ланца IgG-капа да бисте успешно добили хуманизоване гене који кодирају лаки ланац (hAB21-L). Видети ИД. БР. СЕК.: 11 за аминокиселинску секвенцу у варијабилном региону лаког ланца hAB21, и ИД. БР. СЕК.: 13 за његову нуклеотидну секвенцу.

Слика 6А представља компаративну анализу аминокиселинских секвенци варијабилног региона лаког ланца hAb21 са варијабилним регионом лаког ланца ниволумаба, као и варијабилним регионом лаког ланца MK3475, означеног са „X” где се аминокиселинске секвенце у варијабилном региону лаког ланца hAb21 разликују од оних за ниволумаб или MK3475, а оквир је означен за аминокиселинске секвенце CDR1, CDR 2 и CDR 3 у варијабилним регионима лаког ланца сваког McAb. Као што је приказано на слици 6А, секвенце у варијабилном региону лаког ланца и CDR-ови hAb21 се разликују од оних за ниволумаб и MK3475.

2) Хуманизација тешког ланца mAb21

Анализом аминокиселинске секвенце, утврђено је да продукти експресије гена заметне линије у трећем V региону капа тешког ланца хуманог имуноглобулина (IgHV3-23, NCBI ген ИД: 28442) и у варијабилном региону тешког ланца mAB21 деле највећу хомологију. Сходно томе, заменити FR-ове тешког ланца mAB21 хомологним секвенцама хуманог IgHV3-23, и, у међувремену, спојити гене који кодирају варијабилни регион тешког ланца хуманизованог mAB21 са секвенцама у константном региону које кодирају тешки ланац хуманог имуноглобулина-IgG4, и заменити серлин, оригиналну аминокиселину на локацији 228. тачке у зглобном региону у константном региону тешког ланца IgG4 са пролином (S228P), у циљу смањења леталног ефекта на PD-1 експресију позитивне имунолошке ћелије (лимфоцит) путем ћелијске цитотоксичности зависне од антитела (АДЦЦ) у везивању рецептора за Fc имуноглобулина (FcR) и посредованог у хуманизацији антитела и тела. Након серије генетског инжењеринга, успешно је добијен хуманизовани ген пуне дужине који кодира варијабилни ланац тешког ланца hAB21 и константни регион тешког ланца хуманог IgG4 (S228P). Видети ИД. БР. СЕК.: 12 за аминокиселинску секвенцу у варијабилном региону тешког ланца hAB21, и ИД. БР. СЕК.: 14 за његову нуклеотидну секвенцу.

Слика 6Б представља компаративну анализу аминокиселинских секвенци у варијабилном региону тешког ланца hAb21 и варијабилном региону тешког ланца ниволумаба, као и варијабилном региону тешког ланца MK3475, означеног са „X” где се аминокиселинске секвенце

1

у варијабилном региону тешког ланца hAb21 разликују од оних за ниволумаб или MK3475, а оквир је означен за аминокиселинске секвенце CDR1, CDR 2 и CDR 3 у варијабилним регионима тешког ланца сваког McAb. Као што је приказано на слици 6Б, секвенце у варијабилном региону тешког ланца и CDR-ови hAb21 се разликују од оних за ниволумаб и MK3475.

Отелотворење 9. Успостављање инжењерских CHO ћелијских линија које стабилно луче и експримирају хуманизовано антитело hAb21, и ефикасно одвајање и пречишћавање протеина антитела

Клонирати корак по корак хуманизовани ген тешког ланца (hAB21H) и хуманизовани ген лаког ланца (hAB21) у вектор експресије pcDNA3.1-Hygro, а експресиони плазмид hAB21 добити амплификацијом и одвајањем након преусмеравања у Escherichia coli. Након тога, пролазно трансфектовати CHO ћелије са рекомбинантним плазмидима који експримирају cAB21 и hAB21.

48 сати након трансфекције, додати супернатант ћелијске културе у место микротитарске плоче и детектовати везивање супернатанта трансфектоване ћелије за хумани PD-1 антиген директном ЕЛИСА методом, са PD-1 протеином као антигеном за облагање, HRP ензимом обележеним козјим анти-хуманим IgG као другим антителом за детекцију (купљено од компаније Shanghai Westang Bio-Tech Co., Ltd.), и OPD-ом као хромогеним супстратом.

Табела 2 у наставку приказује репрезентативне ЕЛИСА резултате.

Табела 2: ЕЛИСА тест за везивање супернатаната из ћелија које су пролазно трансфектоване са cAB21 или hAB21 геном за хумани PD-1 протеин б

Као што је приказано у табели 2, хуманизована hAB21 антитела (IgG4-капа) одржавају везивање за хумане PD-1 протеине, што је исто као и хумано-мишје cAB21 антитело.

Успешно је добијено више сојева CHO ћелијског инжењеринга који стабилно и ефикасно луче и експримирају hAB21 протеине. Након субклонирања, скрининга и култивисања у суспензији и у медијуму без серума, наведене трансфектоване ћелије могу да експримирају антитело у титрима преко 1 г/Л.

Након тога, изабрана је једна инжењерска ћелијска линија, амплификована. Након поновног култивисања у медијуму без серума и центрифугирања, сакупити супернатанте културе и филтрирати преко мембране од 0,45 μm. Супернатанти су затим подвргнути вишеструким корацима процеса одвајања и пречишћавања, укључујући Protein A-Sepharose Fast Flow (производ компаније GE), колону са јонским измењивачем, уклањање и инактивацију вируса, стерилну филтрацију (мембранска филтрација од 0,22 μm). Након тога, коначно је добијен hAB21 високе чистоће (чистоћа протеина преко 99%). Пречишћени hAb21 је растворен у физиолошком раствору соли (1-20 mg/ml) и држан је на температури испод -20<o>C.

Отелотворење 10. ЕЛИСА тест за везивање пречишћеног hAb21 за FcR протеин

1

Везивање пречишћеног hAb21 (IgG4-капа) за рекомбинантни FcR рецепторски протеин (као што је FcγRⅠ, CD64) обложен на микротитарској плочи са 96 места може се детектовати директном ЕЛИСА методом, а резултати су упоређени са два друга McAb-а типа IgG4 (Ниволумаб и MK3475) и три McAb-а типа IgG1 (Avastin, hPV19 и Eribitux).

Основни поступци за ову ЕЛИСА детекцију су следећи:

Додати серијски разблажене узорке McAb-ова типа IgG4 (hAb21, ниволумаб и MK3475) или McAbова типа IgG1 (Avastin, hPV19 и Eribitux) у микротитарску плочу са 96 места претходно обложену рекомбинантним хуманим FcγRⅠ рецепторским протеинима (CD64, производ компаније Sino Biological Inc.). Након 2-часовне инкубације на температури од 37 °C и испирања, додати HRP-ом обележен козји антихумани IgG-Fab (производ компаније Sigma) у свако место микротитарске плоче. Након још једне 1-часовне инкубације на температури од 37 °C и испирања, додати OPD супстрат у свако место микротитарске плоче за развијање боје.

Слика 7 представља репрезентативне ЕЛИСА резултате. Као што је приказано у резултатима, у поређењу са три McAb-а IgG1, (Avastin, hPV19 и Eribitux), активност везивања три McAb-а IgG4 (hAb21, ниволумаб и MK3475) за FcγRⅠ акцептор (CD64) је значајно смањена, што је у складу са прогнозом.

Отелотворење 11. ЕЛИСА тест за везивање hAb21 за PD-1 и друге протеине повезане са имунитетом

Активност везивања пречишћеног hAb21, ниволумаба и MK3475 за PD-1 протеине и друге повезане протеине може се открити помоћу ЕЛИСА.

Основни поступци за ЕЛИСА методу су следећи:

Додати серијски разблажене узорке PD-McAb-ова (hAb21, ниволумаб и MK3475) или узорке неповезаних hPV19 у микротитарску плочу са 96 места претходно обложену рекомбинантним PD1-Fc или другим фузионим протеинима Fc гена повезаним са имунитетом (укључујући CD28, B7, CTLA4, CD3, PD-L1, PD-L2, BTLA итд.). Након 2-часовне инкубације на температури од 37 °C и испирања, додати HRP-ом обележен козји анти-хумани IgG-Fab (производ компаније Sigma) у свако место микротитарске плоче; након 1-часовне инкубације на температури од 37 °C и испирања, додати OPD супстрат у свако место микротитарске плоче за развијање боје.

Слика 8 представља репрезентативне ЕЛИСА резултате. Као што је приказано у резултатима, слично ниволумабу и MK3475, hAb21 се везује само за хумани PD-1 протеин и не везује друге протеине повезане са имунитетом, као што су CD28, B7, CTLA4, CD3, PD-L1, PD-L2 и BTLA.

Отелотворење 12. Компетитивни ЕЛИСА тест за анализу везујућег епитопа mAB21, ниволумаба и MK3475 за PD-1 протеин

Да би се доказало да ли се PD-1 везујући епитоп Ab21 разликује од места везивања код ниволумаба или MK3475, ово отелотворење упоређује и анализира PD-1 везивање mAB21, са оним код ниволумаба и MK3475 на компетитивни ЕЛИСА начин, што је слично отелотворењу 5. Слика 9А представља репрезентативне резултате детектовања hAb21, ниволумаба (Nivo) и MK3475 у антагонизацији или инхибицији везивања биотином обележеног MK3475 (биотин-MK3475) за хумане PD-1 протеине обложене на микротитарској плочи са 96 места, на компетитивни ЕЛИСА начин. Као што је приказано на слици 9А, hAb21 има скоро исти ефекат као MK3475 у антагонизацији или инхибицији везивања биотина-MK3475 за PD-1 протеине, а ефикасност истог код ниволумаба остаје на око 50%, док неповезани McAb, hPV19 нема антагонистичко дејство.

Слика 9Б представља репрезентативне резултате детектовања hAb21, ниволумаба (Nivo) и MK3475 у антагонизацији или инхибицији везивања биотином обележеног ниволумаба (биотинниволумаб) за хумане PD-1 протеине обложене на микротитарској плочи са 96 места на компетитивни ЕЛИСА начин. Као што је приказано на слици 9Б, hAb21 има скоро исти ефекат као ниволумаб у антагонизацији или инхибицији везивања биотина-ниволумаба за PD-1

2

протеине, а ефикасност истог код MK3475 остаје на око 70%, док неповезани McAb hPV19 нема антагонистичко дејство.

Слика 9Ц представља репрезентативне резултате детектовања hAb21, ниволумаба (Nivo), MK3475 и MK3475+Nivo у антагонизацији или инхибицији везивања биотином обележеног hAb21 (биотин-hAb21) за хумане PD-1 протеине обложене на микротитарској плочи са 96 места на компетитивни начин. Као што је приказано на слици 9Ц, ниволумаб или MK3475 само делимично антагонизује везивање биотина-hAb21 за PD-1 протеине, при чему однос антагонизације/инхибиције ниволумаба и MK3475 остаје на око 20% и 50% респективно; осим тога, однос антагонизације и инхибиције везивања биотина-hAb21 за PD-1 протеине може достићи само око 70%, упркос комбиновању и истовременом додавању ниволумаба и MK3475. Након свеобухватне анализе наведених компетитивних ЕЛИСА резултата, може се спознати да се епитоп PD-1 протеина са којим се везује hAb21 у предметном проналаску значајно разликује од оног код ниволумаба и MK3475.

Отелотворење 13. Проточно-цитометријска (FCM) анализа везивања hAb21 и ниволумаба за CHO ћелије које експримирају хумане PD-1 гене (CHO/PD-1)

У овом отелотворењу, везивање hAb21 или ниволумаба за CHO ћелије које експримирају хумане PD-1 гене се детектује методом проточне цитометрије (FCM), са hAb21 или ниволумабом као првим антителом и FITC-ом флуоресцентно обележеним козјим анти-хуманим IgG као другим антителом.

У ту сврху, помешати CHO ћелије које стабилно експримирају хумане PD-1 гене (CHO/PD-1) и нормалне CHO ћелије у односу 1:2, а затим са раствором који садржи hAb21 или ниволумаб различитих концентрација (0,003-10 μg/ml); након једночасовне инкубације на температури од 4 °C и испирања са PBS који садржи 0,1%-тни FCS, додати FITC-ом обележени козји анти-хумани IgG (производ компаније Sigma, 1:200) и инкубирати сат времена на температури од 4 °C; након још једног испирања са PBS који садржи 0,1%-тни FCS, подвргнути узорке на проточном цитометру Cytomics FC500 MCL (производ компаније Beckman Coulter) ради детекције.

Слика 10А представља график репрезентативних резултата FCM детекције и анализе за ниволумаб. Као што је приказано на Слици 10А, ниволумаб у концентрацијама од 0,03-10 μg/ml може да веже CHO/PD-1 ћелије, а средњи флуоресцентни интензитет везивања (MFI) је у позитивној корелацији са количином ниволумаба.

Слика 10Б представља график репрезентативних резултата FCM детекције и анализе за hAb21. Као што је приказано на слици 10Б, hAb21 у концентрацијама од 0,03-10 μg/ml може да веже CHO/PD-1 ћелије, а флуоресцентни интензитет везивања (MFI) је у позитивној корелацији са количином hAb21.

Слика 10Ц представља графикон средњег флуоресцентног интензитета (MFI) и концентрације hAb21 или ниволумаба сходно резултатима FCM анализе. Као што је приказано на слици 10ц, флуоресцентни интензитет везивања hAb21 за CHO-PD-1 ћелије је очигледно јачи него код ниволумаба.

Отелотворење 14. Проточна цитометрија (FCM) за детекцију и анализу везивања hAb21 и ниволумаба за хумане Јуркат Т ћелије активиране помоћу PHA

У овом отелотворењу, везивање hAb21 или ниволумаба за хуману Јуркат Т ћелијску линију активирану помоћу PHA се детектује методом проточне цитометрије, са hAb21 или ниволумабом као првим антителом и FITC-ом обележеним козјим анти-хуманим IgG као другим антителом. У ту сврху, култивисати сојеве хуманих Јуркат Т ћелија (купљено од Cell Preservation Center of Shanghai Faculty of Life Sciences, CAS) у раствору ћелијске културе RPMI који садржи 10%-тни FCS са фактором активирања лимфоцита-фитохемаглутинином PHA (Phytohemagglutinin, производ компаније Sigma) у концентрацији од 3 μg/ml, да би се активирале Јуркат Т ћелије и индуковала експресија PD-1 протеина. 24 до 28 сати након PHA активације и индукције, ћелије су центрифугиране, одвојене и растворене у растворима са hAb21 или ниволумабом у различитим концентрацијама (0,1-3 μg/ml), или са нормалним хуманим IgG у концентрацији од 1 μg/ml као негативном контролом. Након једночасовне инкубације на температури од 4 °C и испирања са PBS који садржи 0,1%-тни FCS, додати FITC-ом обележен козји анти-хумани IgG (производ компаније Sigma, 1:200); након једночасовне инкубације на температури од 4 °C и поновног испирања са течностима PBS који садржи 0,1%-тни FCS, подвргнути узорке на проточном цитометру Cytomics FC500 MCL (производ компаније Beckman Coulter) ради детекције.

Слика 11 представља график FCM резултата за hAb21 (десно) и ниволумаб (лево). Као што је приказано на графику, у поређењу са узорцима IgG негативне контроле, и hAb21 и ниволумаб везују PHA -активиране Јуркат ћелије, у концентрацији од 1-3 μg/ml; hAb21 и даље може да веже Јуркат ћелије чак и при нижим концентрацијама од 0,1-0,3 μg/ml, међутим, везивање ниволумаба за Јуркат ћелије није значајно.

Отелотворење 15. Проточна цитометрија (FCM) за детекцију и анализу везивања hAb21 за ниволумаб и мононуклеарне хумане ћелије периферне крви (PBMC) активиране помоћу PHA

У овом отелотворењу, везивање hAb21 или ниволумаба за PHA -активиране мононуклеарне хумане ћелије периферне крви (PBMC) се детектује методом проточне цитометрије, са hAb21 или ниволумабом као првим антителом, и FITC-ом флуоресцентно обележеним козјим антихуманим IgG као другим антителом.

У ту сврху, додати периферну крв здравих добровољаца у одређену запремину Фикол течности, одвојити мононуклеарне ћелије у њој након центрифугирања на нормалној температури, а затим растворити у раствору ћелијске културе RPMI који садржи 10%-тни FCS са фактором активације лимфоцита-фитохемаглутинином (PHA, производ компаније Sigma) у концентрацији од 3 μg/ml, да би се активирали лимфоцити и индуковала експресија PD-1 протеина. 48 до 72 сата након PHA активације и индукције, ћелије су центрифугиране, одвојене и растворене у растворима са hAb21 или ниволумабом у различитим концентрацијама (0,015-4 μg/ml), са нормалним хуманим IgG узорцима у концентрацији од 1 μg/ml као негативном контролом. Након једночасовне инкубације на температури од 4 °C и испирања са PBS који садржи 0,1%-тни FCS, додати FITC-ом обележен козји анти-хумани IgG (производ компаније Sigma, 1:200). Након једночасовне инкубације на температури од 4 °C и поновног испирања са PBS који садржи 0,1%-тни FCS, подвргнути узорке на проточном цитометру Cytomics FC500 MCL (производ компаније Beckman Coulter) ради детекције.

Слика 12 представља график резултата FCM анализе за hAb21 (десно) и ниволумаб (лево). Као што је приказано на слици 12, у поређењу са нормалним узорком IgG (као негативна контрола), hAb21 и ниволумаб могу да вежу PHA-активиране хумане PBMC ћелије у концентрацијама од 0,25-4,0 μg/ml.

Отелотворење 16. Антинеопластично дејство hAb21 у хуманизованом PD-1 моделу миша С обзиром да hAb21 не препознаје мишји PD-1, ефекат hAb21 се не може испитивати директно код нормалног миша in-vivo. Стога су хуманизовани PD-1 мишеви са реконструкцијом генетичког инжењеринга изабрани као домаћин за in-vivo претклиничко испитивање антинеопластичног дејства hAb21 у овом отелотворењу.

Експериментално претклиничко испитивање има две фазе. У наставку су описани модел, дозирање, груписање и експериментални резултати.

Фаза 1 претклиничког испитивања:

Животињски модел, дозирање и груписање

Супкутано инокулирати 1x10<6>MC38 ћелија рака дебелог црева, које потичу од мишева C57BL/6 (обезбеђује компанија Shanghai Model Organisms) на десној страни леђа хуманизованих PD-1 хомозиготних мишева порекла C57BL/6 (ови хуманизовани PD-1 мишеви, заменом мишјег PD-1 гена са хуманим PD-1 геном путем хомологне рекомбинације гена, експримирају хумани PD-1 уместо мишјег ендогеног PD-1 протеина); када запремина инокулисаних тумора достигне величину зрна пиринча (око 40-50 mm<3>, 6 до 7 дана након инокулације туморских ћелија) насумично поделити животиње у 3 различите третиране групе на следећи начин:

Група А: третман са нормалним физиолошким раствором (NS), негативна контрола (н=6, иста запремина физиолошког раствора)

Група Б: третман пембролизумабом (MK3475) (н=6, доза примене: 10 mg/kg)

Група Ц: третман са hAb21 (н=6, доза примене: 10 mg/kg)

Животиње су примале интраперитонеалном инјекцијом (i.p.) два пута недељно (свака 3 до 4 дана), 4 пута узастопно, укупно 2 недеље дозирања, од истог дана груписања животиња, односно од шестог до седмог дана након инокулације тумора. Током периода третмана, посматрати животиње у погледу општих клиничких симптома сваки дан и мерити велику осу (mm) и малу осу (mm) тумора и тежину животиња свака 3 до 4 дана. Формула за израчунавање запремине тумора је Запремина (mm<3>) = главна оса (mm) X мала оса (mm) X 0,5. Животиње ће бити еутаназиране у случају запремине тумора веће од 4000 mm<3>приликом мерења.

Резултати третмана животиња:

Слика 13А приказује тренд просечног повећања запремине тумора код испитиваних животиња у свакој групи.

Слика 13Б приказује тренд раста просечне тежине испитиваних животиња у свакој групи.

Слика 14А, слика 14Б и слика 14Ц показују тренд повећања запремине тумора сваке појединачне животиње у свакој третираној групи.

Табела 3-5 у наставку приказује резултате мерења запремине раста тумора код сваке животиње из сваке третиране групе.

2

Табела 3: Запремина тумора (mm<3>) код мишева третираних са NS - контролна група (н=6) Дан

(*) A01 A02 A03 A04 A05 A06

Мужјак Мужјак Мужјак Мужја Женка Женка X±SD

к

6 (1) 41,43 0,00 38,44 12,41 48,09 42,49 36,57±13,95 1

(5) 118,61 77,18 101,82 51,47 120,54 118,38 98,00±28,15 0

1 (8) 160,43 215,27 133,71 57,95 221,13 171,34 159,97±60,04 3

1 (12 184,8 337,51±119,7 7 ) 424,24 289,95 259,86 8 517,78 348,34 7

2 (15 342,4 560,87±202,4

721,57 512,14 436,79 884,80 467,41

0 ) 9 6

2 (19 1713,94 917,43 820,05 534,3 1172,97 1003,12±403, 4 ) 4 860,01 78

2 (22 1502, 1689,42±450,

2247,93 2181,73 1632,56 1064,69 1507,39

7 ) 21 78

3 (26 2231,64 4633,67 3604,40 3323, 1831,16 3228,38 3142,17±1002 1 ) 73 ,64

3 (28 3008,70 еутаназир 5114,15 умрла 1815,58 3111,68 3262,53±1367 3 ) ана ,40

3 (30 4012,72 - еутаназир - 1649,23 4503,91 5031,74±2773 6 ) ана ,09

4 (35 еутаназир еутаназир

- - - 3680,48

1 ) ана ана

4 (37

- - - - 3978,30 -3 )

4 (41

- - - - 4099,00 -7 )

5 (44 еутаназир

- - - - -0 ) ана

*: Бројеви у ( ) су дани након примљеног 1. третмана

Табела 4: Запремина тумора (mm<3>) код мишева третираних са пембролизумабом (н=6) Дан (*) Б01 Б02 Б03 Б04 Б05 Б06

Мужјак Мужјак Мужјак Мужјак Женка Женка X±SD 6 (1) 30,56 22,79 29,32 24,18 30,70 41,16 29,78±6,50

10 (5) 23,33 128,52 63,63 47,67 103,59 70,55 72,88±38,00

13 (8) 51,16 105,06 41,73 23,81 167,18 23,80 68,79±56,72

17 (12) 22,77 241,38 59,74 26,19 255,82 0,00 121,18±11732 20 (15) 50,06 430,81 113,29 84,15 умрла 0,00 169,58±176,06 24 (19) 107,61 840,71 218,00 223,65 - 0,00 347,49±333,12 27 (22) 136,26 1642,37 485,24 414,80 - 0,00 669,67±665,74 31 (26) 381,32 3217,38 982,94 871,32 - 0,00 1363,24±1263,41 33 (28) 452,82 2831,28 1991,67 1403,44 - 0,00 1669,80±1000,17 36 (30) 970,64 4294,38 2153,35 1903,74 - 0,00 2330,53±1404,70 41 (35) 2296,81 died 6356,19 4431,87 - 0,00 4361,62±2030,60

еутаназиран

43 (37) 8852,36 - умрла - 0,00

а

еутаназиран

47 (41) - - - -а 0,00

еутаназиран

50 (44) - - - - 0,00

а

*: Бројеви у ( ) су дани након примљеног 1. третмана

Табела 5: Запремина тумора (mm<3>) код мишева третираних са hAb21 mAb (н=6)

Дан (*) Ц01 Ц02 Ц03 Ц04 Ц05 Ц06

Мужјак Мужјак Мужјак Мужјак Женка Женка X±SD 6 (1) 42,19 28,25 36,29 21,62 36,80 31,52 32,78±7,26

10 (5) 58,82 21,18 58,63 25,74 40,78 66,18 45,22±18,87

13 (8) 0,00 0,00 0,00 8,10 17,85 20,89 15,61±6,68

17 '(12) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

20 '(15) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

24 (19) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

27 (22) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

31 (26) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

33 '(28) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

36 (30) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

41 (35) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

43 '(37) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

47 '(41) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

50 (44) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00±0,00

*: Бројеви у ( ) су дани након примљеног 1. третмана

Као што је приказано у табели 3-5, слици 13А, слици 14А, слици 14Б и слици 14Ц, у поређењу са NS негативном контролном групом, раст тумора у третираној групи са hAb21 или пембролизумабом је инхибиран 5 до 8 дана након почетка третмана.

Још више изненађује и охрабрује то што је дејство hAb21 у третману трансплантованог тумора рака дебелог црева MC38 много боље од пембролизумаба. Након примене дозе два пута у третираној групи са hAb21, односно 8. дана након прве дозе, тумори свих испитиваних животиња (6/6) атрофирају или потпуно нестају; ови тумори не расту ни након престанка третмана леком након примене дозе 4 пута (последња доза) (испитивање је посматрано 50 дана након инокулације тумора, односно 32. дана након последње дозе). Што се тиче третиране групе пембролизумабом, само код једне животиње (1/6) се видело да тумор атрофира или нестаје након примене дозе три пута, односно 12. дана након прве дозе, док су тумори код осталих животиња поново расли након третмана примене дозе 4 пута (и једна животиња је пронађена мртва 15. дана након прве дозе), и ове 4 животиње су мртве или морају бити еутаназиране 43. дана након инокулације тумора.

Слика 13Б приказује тренд раста просечне тежине испитиваних животиња у свакој групи. Као што је приказано на слици 13Б, у поређењу са NS негативном контролном групом, доза hAb21 или пембролизумаба не утиче на раст тежине третираних животиња.

Фаза 2 претклиничког испитивања

2

Циљ претклиничког испитивања, животињски модел и третирана група

Фаза 2 претклиничког испитивања треба да процени да ли би претходни хуманизовани PD-1 мишеви третирани са hAB21 успешно одбацили поново инокулирани тумор MC38 без континуиране примене (прелиминарна верификација функције имунолошке меморије).

Експериментални модел и груписање животиња

Третман има две групе: групу Ц и групу Д.

Третирана група Ц: Отприлике 20 дана након што је тумор одбачен (тј.10. дана након последње дозе hAB21 mAb), супкутано поново инокулирати 1x10<6>MC38 туморских ћелија на другој страни (лево) од оних 6 хуманизованих PD-1 мишева који су претходно примили третман са hAB21 и потпуно одбацили MC38 туморе.

Контролна група Д: Инокулирати 1x10<6>MC38 туморских ћелија под кожу на левој страни код 5 мишева дивљег типа C57BL/6 (старих 6 до 8 недеља)

Животиње у ове две групе не добијају никакав третман током претклиничког испитивања. Посматрати опште клиничке симптоме животиња сваки дан од 6. дана након инокулације тумора и мерити велику осу (mm) и малу осу (mm) тумора и тежину животиња свака 3 до 4 дана. Формула за израчунавање запремине тумора је Запремина (mm<3>) = главна оса (mm) X мала оса (mm) X 0,5.

Резултати третмана животиња:

Слика 15 приказује тренд просечног повећања запремине тумора код испитиваних животиња у свакој групи.

Табела 6 у наставку представља резултате мерења запремине раста тумора код појединачне животиње из сваке групе.

Табела 6: Запремина раста тумора MC38 (mm<3>) код дивљег типа мишева C57BL/6 или хуманизованих PD-1 мишева су претходно третирани са hAb21 mAb

Група Ц: Хуманизовани PD-1 мишеви су третирани са hAb21 mAb (н=6)

Дан (*) Ц01 Ц02 Ц03 Ц04 Ц05 A06

Мужјак Мужјак Мужјак Мужјак Женка Женка X±SD

6 (36) 41,52 4,96 4,00 0,00 123,66 51,68 37,64 ± 4739

8 (38) 4,90 0,50 0,00 0,00 66,32 60,67 22,07 ± 32,20

13 (43) 0,00 0,00 0,00 0,00 55,05 8,94 10,66±22,04

15 (55) 0,00 0,00 0,00 0,00 36,34 0,00 6,06 ±14,84

19 (49) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 ±0,00

22 (52) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 ±0,00

26 (56) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 ±0,00

Група Д: Дивљи тип мишева C57BL/6 (н=5)

Дан Д01 Д02 Д03 Д04 Д05

Женка Женка Женка Женка Женка X±SD

6 53,42 48,68 60,62 36,92 16,28 43,18 ±1733

8 69,39 95,23 80,78 38,65 90,40 74,89 ±22,54

13 199,95 283,99 186,53 47,24 112,44 166,03±90,09

15 231,42 356,01 235,80 52,27 149,21 204,94 ± 112,80

19 405,98 588,07 481,48 80,93 222,19 355,73±203,51

22 543,46 1204,30 693,60 143,40 247,52 566,46±419,60

26 1414,89 2142,11 1290,40 328,72 613,29 1157,88±713,51

● : Бројеви у ( ) су дани након 1. инокулације MC38 тумора код хуманизованих PD-1 мишева

2

Као што је приказано у табели 6 и слици 15, тумори MC38 инокулисани код мишева дивљег типа C57BL/6 брзо расту, док поново инокулисани тумори MC38 код оних хуманизованих PD-1 мишева који су претходно третирани са hAb21 не расту током периода посматрања и потпуно се одбацују почев од 8. до 15. дана након инокулације тумора. Ови прелиминарни резултати показују да хуманизовани PD-1 мишеви, након што су успешно третирани са hAB21, имају имунолошку меморију и да су у стању да одбаце поново инокулисане MC38 туморе без икаквог новог третмана.

Отелотворење 17. Антинеопластична активност hAb21 испитивана на нормалним мишевима дивљег типа C57BL/6

Циљ претклиничког испитивања:

Циљ претклиничког испитивања је да се процени да ли ће третман са hAB21 одбацити тумор код нормалних мишева дивљег типа који не експримирају хумани PD-1 ген.

Експериментални модел и груписање животиња:

Супкутано инокулирати 1x10<6>MC38 туморских ћелија у нормалне мишеве дивљег типа C57BL/6 (старих 6 до 8 недеља), када запремина инокулисаних тумора достигне величину зрна пиринча (око 40-50 mm<3>, отприлике 6. дана након инокулације туморских ћелија) насумично поделити животиње у 2 групе на следећи начин:

Група А: Третман са NS, негативна контрола (н=6, једнака запремина нормалног физиолошког раствора)

Група Б: третирана група са hAb21 (н=6, доза примене: 10 mg/kg)

Почев од истог дана груписања животиња (тј. 6. дана након инокулације тумора), давати животињама интраперитонеалном инјекцијом (i.p.) два пута недељно (свака 3 до 4 дана), 4 пута, укупно 2 недеље за примену дозе.

Током периода третмана, посматрати опште клиничке симптоме животиња сваки дан и мерити велику осу (mm) и малу осу (mm) тумора и тежину животиња свака 3 до 4 дана.

Формула за израчунавање запремине тумора је Запремина (mm<3>) = главна оса (mm) X мала оса (mm) X 0,5. Третиране животиње ће бити еутаназиране у случају запремине тумора веће од 4000 mm<3>приликом мерења.

Резултати третмана:

Слика 16 приказује тренд просечног повећања запремине тумора код третираних животиња из ове две групе.

Табела 7 представља резултат мерења запремине раста тумора код појединачних животиња из сваке групе.

Табела 7: Запремина раста тумора MC38 (mm<3>) код мишева дивљег типа C57BL/6

Група А: Мишеви дивљег типа третирани NS - контрола (н=6) Дан (*) A01 A02 A03 A04 A05 A06

Мужјак Мужјак Мужјак Мужјак Женка Женка X±SD

6 (1) 33,36 20,22 52,24 57,48 4,00 4,00 28,55±23,22 10 (5) 99,91 128,04 127,58 158,06 56,73 241,41 135,29±62,15 13 (8) 138,56 131,20 151,95 357,05 100,33 267,11 191,03± 99,44 17 (12) 336,01 355,12 441,55 829,60 193,00 807,96 493,87±264,12

Група Б: Мишеви дивљег типа третирани са hAb21 mAb (н=6) Дан (*) Б01 Б02 Б03 Б04 Б05 Б06

Мужјак Мужјак Мужјак Мужјак Женка Женка X±SD

6 (1) 98,18 93,25 49,80 36,65 0,00 0,00 4631 ±43,10 10 (5) 286,47 205,51 114,13 147,57 44,74 113,91 152,05 ±84,09 13 (8) 383,45 216,66 178,88 204,04 95,37 152,77 205,20 ±97,38

2

17 (12) 833,31 392,57 389,95 390,62 229,95 559,44 465,98 ±207,95 *: Бројеви у ( ) су дани након примљеног 1. третмана

Као што је приказано у горњој табели 7 и на горњој слици 16, тренд раста запремине тумора MC38 у третираној групи са hAb21 је у суштини идентичан оном у контролној групи третираној са NS. Ови резултати показују да hAB21 нема очигледан утицај на раст тумора код нормалних мишева дивљег типа који не експримирају хумани PD-1 ген.

Отелотворење 18. Експериментална процена прелиминарног метаболизма лека и токсикологије/безбедности hAb21 код мајмуна

Пошто је познато да mAB21 може да препозна и веже PD-1 мајмуна (видети отелотворење 3), нормални мајмуни су изабрани као домаћини за испитивање, да би се прелиминарно проценила фармакокинетика и токсикологија/безбедност hAb21 када се интравенозно инфундира (IV). Ове експерименте у овом отелотворењу је обавила компанија JOINN Laboratories (Суџоу).

Два мужјака циномолгус мајмуна су изабрана за овај експеримент и сваки је примио једну инјекцију hAB21 у дози од 10 mg/kg тежине. Након ове инјекције, сакупити серуме у различитим временским тачкама, а количина hAB21 у узорцима серума је детектована доказаном ЕЛИСА методом. Током периода експеримента, ове две животиње нису показале абнормалност у менталном понашању или активности након што су примиле једну IV инјекцију hAB21 у дози од 10 mg/kg.

Главни фармакокинетички параметри за hAB21 у свакој животињи након дозирања су израчунати коришћењем софтвера WinNonlin.

Табела 8: Фармакокинетички параметри за hAb21 након једне интравенске инфузије код мајмуна

*значи да животиња може да генерише антитело отпорно на лек које утиче на детекцију концентрације у крви

Као што је приказано у табели 8 и слици 17, након интравенске инфузије hAB21 у дози од 10 mg/kg, Cmax за hAB21 код ова два мајмуна је веома сличан, што износи 234,06 μg/ml односно 247,22 μg/ml; t1/2 је 402,56 ч и 58,84 ч респективно. Концентрација hAB21 у крви нагло опада 28. дана након инјекције код животиње бр. 2, а сумња се да је ова животиња могла да генерише антитела против лека око 17. дана након инјекције, што би утицало на фармакокинетичке параметре за hAB21, као што је t1/2.

Пошто се аминокиселинске секвенце хуманог имуноглобулина разликују од оних имуноглобулина код нехуманих примата (као што су мајмуни), није изненађујуће да се након примене имуногених хуманих или хуманизованих антитела код мајмуна, генеришу антитела против лека (антитела против антитела) (vanMeer PJ, et al. Имуногеност mab-ова код нехуманих примата током неклиничке процене безбедности. MAbs 2013; 5:810–6). У ствари, током неклиничке студије BMS-а његовог потпуно хуманог mAb ниволумаба код нехуманих примата (мајмуна), такође је откривено да су анти-ниволумаб антитела (укључујући позитивна неутрализујућа антитела) откривена 28. дана након доза, код 5 од 6 животиња из дозне групе од 1 mg/kg и 2 од 3 животиње из дозне групе од 10 mg/kg. Међутим, појава антитела против антитела

2

нема негативан ефекат на животиње које се испитују (Wang C et al: Cancer Immunol Res.2014; 2: 1-11).

Попис секвенци

<110>Suzhou Stainwei Biotech Inc.

<120>Моноклонско антитело које антагонизује и инхибира везивање хуманог PD-1 антигена за његов лиганд, метода његовог припремања и његова примена

<130>HPCT17-13449

<160> 14

<170> PatentIn верзија 3.5

<210> 1

<211> 321

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 1

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtgggaga cagggtcagc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgcgggt tctgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccactc ggcacactgg agtccctggt 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgt cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa g 321

<210> 2

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 2

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDAG SAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRHTGVPG 60 RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLSDYFCQQ YSSYPWTFGG GTKLEIK 107 <210> 3

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 3

KASQDAGSAV A 11

<210> 4

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 4

WASTRHT 7

<210> 5

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 5

SSYPWTFGG 9

2

<211> 357

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 6

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac tttgtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aggtatgata tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtcgtta cacctactat 180

ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccattt atttctgtac aagtccctat 300

ggtaactacg gaatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagcc 357

<210> 7

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Mus musculus

<400> 7

EVQLVESGGD FVKPGGSLKL SCAASGFTFS RYDMSWVRQT PDKRLEWVAT ISGGGRYTYY 60 PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLKSED TAIYFCTSPY GNYGMDYWGQ GTSVTVSSA 119

<210> 8

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 8

GFTFSRYD 8

<210> 9

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 9

ISGGGRYTYY 10

<210> 10

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 10

PYGNYGMDY 9

<210> 11

<211> 107

<212> ПРТ

<213> Вештачка секвенца

<400> 11

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQDAG SAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS 60 RFSGSGSGTE FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSSYPWTFGG GTKLEIK 107 <210> 12

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Вештачка секвенца

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYDMSWVRQA PGKGLEWVST ISGGGRYTYY 60

PDSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTSPY GNYGMDYWGQ GTSVTVSSA 119

<210> 13

<211> 321

<212> ДНК

<213> Вештачка секвенца

<400> 13

gacatccagc tgacccagtc ccccagcttc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgca aggcctccca ggatgccgga tccgctgtgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctactgg gcttccacca ggcacaccgg cgtgccttcc 180

aggttttccg gctccggctc cggcacagag ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagctcct acccttggac cttcggcggc 300

ggcaccaagc tggagatcaa g 321

<210> 14

<211> 357

<212> ДНК

<213> Вештачка секвенца

<400> 14

gaggtgcagc tggtggagtc cggcggagga ctggtgcaac ctggcggaag cctgaggctg 60

tcctgtgccg cctccggctt caccttctcc aggtacgaca tgtcctgggt gaggcaggct 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtgtccacc atttccggcg gcggcaggta cacctactac 180

cccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tccagggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcac cagcccctac 300

ggcaactacg gcatggacta ctggggccag ggcacctccg tgacagtgtc ctccgct 357

1

Claims (11)

ПАТЕНТНИ ЗАХТЕВИ

1. Моноклонско антитело које антагонизује и инхибира везивање хуманог PD-1 антигена за његов лиганд, карактерисано тиме, да садржи први и други варијабилни регион: први варијабилни регион је варијабилни регион лаког ланца антитела, од којих су аминокиселинске секвенце CDR 1, CDR 2 и CDR 3 приказане у ИД. БР. СЕК.: 3, ИД. БР. СЕК.: 4 и ИД. БР. СЕК.: 5, респективно, док је други варијабилни регион варијабилни регион тешког ланца антитела, од којих су аминокиселинске секвенце CDR 1, CDR 2 и CDR 3 приказане у ИД. БР. СЕК.: 8, ИД. БР. СЕК.:9 и ИД. БР. СЕК.: 10, респективно и назначено тиме што је наведени први варијабилни регион варијабилни регион лаког ланца антитела, са аминокиселинском секвенцом приказаном у ИД. БР. СЕК.: 11, док је наведени други варијабилни регион варијабилни регион тешког ланца антитела, са аминокиселинском секвенцом приказаном у ИД. БР. СЕК.: 12.

2. Антитело или његов дериват према патентном захтеву 1, карактерисано тиме, да садржи наведени варијабилни регион лаког ланца антитела и константни регион лаког ланца хуманог антитела, као и зглобни регион, CH1, CH2 и CH3 наведеног варијабилног региона тешког ланца антитела и константног региона тешког ланца хуманог антитела.

3. Антитело или његов дериват према патентном захтеву 2, карактерисано тиме, да је наведени константни регион лаког ланца хуманог антитела из капа ланца хуманог антитела или ламбда ланца антитела, а да је наведени константни регион тешког ланца хуманог антитела из хуманог подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

4. Молекул или ген ДНК који кодира антитело или његов дериват према патентном захтеву 1, карактерисан тиме, да је нуклеотидна секвенца варијабилног региона лаког ланца антитела приказана у ИД. БР. СЕК.: 13, а да је нуклеотидна секвенца варијабилног региона тешког ланца антитела приказана је у ИД. БР. СЕК.: 14.

5. Вектор експресије, карактерисан тиме, да садржи секвенцу ДНК молекула према патентном захтеву 4 и регулаторну секвенцу експресије која је оперативно са њим повезана.

6. Рекомбинантна ћелија домаћин, карактерисана тиме, да је трансформисана из вектора експресије наведеног у патентном захтеву 5.

7. Рекомбинантна ћелија домаћин према патентном захтеву 6, карактерисана тиме, да наведена реконституисана ћелија домаћин експримира антитело или његов дериват према патентном захтеву 1.

8. Фармацеутски састав, назначен тиме, да садржи фармацеутски ефикасну количину антитела према патентном захтеву 1 и фармацеутски прихватљив носач.

9. Фармацеутски састав према патентном захтеву 8 за употребу у лечењу рака.

10. Фармацеутски састав за употребу према патентном захтеву 9, карактерисан тиме, да је рак, рак дебелог црева.

11. Метода припремања антитела или његовог деривата наведена у патентном захтеву 1, карактерисана тиме, да метода укључује следеће кораке:

а) Обезбедити вектор експресије који садржи секвенцу ДНК молекула према патентном захтеву 4 и регулаторну секвенцу експресије која је оперативно са њим повезана;

б) Трансформисати ћелије домаћина са вектором експресије наведеним у кораку а); ц) Ћелијска култура домаћина добијена из корака б) под условима погодним за експресију наведеног антитела; и

д) Добити наведено антитело одвајањем и пречишћавањем течности ћелијске културе домаћина помоћу афинитетне хроматографије.

2