RS64998B1 - Anti-c5 antitela i postupci upotrebe - Google Patents

Anti-c5 antitela i postupci upotrebe

Info

Publication number
RS64998B1
RS64998B1 RS20231255A RSP20231255A RS64998B1 RS 64998 B1 RS64998 B1 RS 64998B1 RS 20231255 A RS20231255 A RS 20231255A RS P20231255 A RSP20231255 A RS P20231255A RS 64998 B1 RS64998 B1 RS 64998B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
antibodies
human
binding
Prior art date
Application number
RS20231255A
Other languages
English (en)
Inventor
Zenjiro Sampei
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of RS64998B1 publication Critical patent/RS64998B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Description

Opis
[Oblast pronalaska]
Predmetni pronalazak se odnosi na anti-C5 antitela i postupke njihovog korišćenja. Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[Stanje tehnike]
Sistem komplementa igra centralnu ulogu u čišćenju imunih kompleksa i u imunološkim odgovorima na infektivne agense, strane antigene, ćelije inficirane virusom i tumorske ćelije. Postoji oko 25-30 proteina komplementa, koji se nalaze kao složena kolekcija proteina plazme i membranskih kofaktora. Komponente komplementa postižu svoje imunološke odbrambene funkcije interakcijom u nizu složenih cepanja enzima i događaja vezivanja za membranu. Nastale kaskade komplementa dovode do proizvodnje proizvoda sa opsoničnom, imunoregulatornom i litičkom funkcijom.
Trenutno je široko prihvaćeno da se sistem komplementa može aktivirati kroz tri različita puta: klasični put, lektinski put i alternativni put. Ovi putevi dele mnoge komponente, i iako se razlikuju u svojim početnim koracima, oni konverguju i dele iste krajnje (terminalne) komponente komplementa (C5 do C9) odgovorne za aktivaciju i uništavanje ciljnih ćelija.
Klasični put se normalno aktivira formiranjem kompleksa antigen-antitelo. Nezavisno, prvi korak u aktivaciji lektinskog puta je vezivanje specifičnih lektina kao što su lektin koji vezuje manan (MBL), H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin i lektin C-tipa CL-11. Nasuprot tome, alternativni put spontano prolazi kroz nizak nivo aktivacije obrta, koji se lako može pojačati na stranim ili drugim abnormalnim površinama (bakterijama, kvascu, ćelijama inficiranim virusom ili oštećenom tkivu). Ovi putevi konverguju na tački gde komponentu komplementa C3 cepa aktivna proteaza da bi se dobile C3a i C3b.
C3a je anafilatoksin. C3b se vezuje za bakterijske i druge ćelije, kao i za određene viruse i imune komplekse, i označava ih za uklanjanje iz cirkulacije (uloga poznata kao opsonin). C3b, takođe, formira kompleks sa drugim komponentama da bi formirao C5 konvertazu, koja cepa C5 na C5a i C5b.
C5 je 190 kDa protein koji se nalazi u normalnom serumu sa približno 80 mikro g/ml (0,4 mikro M). C5 je glikozilovan sa oko 1,5-3% njegove mase koji se pripisuje ugljenim hidratima. Zreli C5 je heterodimer alfa lanca od 115 kDa koji je disulfidno vezan za beta lanac od 75 kDa. C5 se sintetiše kao protein prekursora jednog lanca (pro-C5 prekursor) od 1676 amino-kiselina (videti, npr. PTL 1 i PTL 2). Pro-C5 prekursor se cepa da bi se dobio beta lanac kao amino terminalni fragment i alfa lanac kao karboksilni terminalni fragment. Fragmenti polipeptida alfa lanca i beta lanca povezani su jedan sa drugim preko disulfidne veze i čine zreli protein C5.
Zreli C5 se cepa na C5a i C5b fragmente tokom aktivacije puteva komplementa. C5a se cepa od alfa lanca C5 pomoću C5 konvertaze kao amino terminalni fragment koji sadrži prve 74 aminokiseline alfa lanca. Preostali deo zrelog C5 je fragment C5b, koji sadrži ostatak alfa lanca disulfidno vezan za beta lanac. Otprilike 20% mase C5a od 11 kDa pripisuje se ugljenim hidratima.
C5a je još jedan anafilatoksin. C5b se kombinuje sa C6, C7, C8 i C9 da bi formirao kompleks koji napada membranu (MAC, C5b-9, terminalni kompleks komplementa (TCC)) na površini ciljne ćelije. Kada se dovoljan broj MAC-ova ubaci u membrane ciljnih ćelija, formiraju se pore MAC-a kako bi posredovale brzu osmotsku lizu ciljnih ćelija.
Kao što je gore pomenuto, C3a i C5a su anafilatoksini. Oni mogu pokrenuti degranulaciju mastocita, koja oslobađa histamin i druge medijatore upale, što dovodi do kontrakcije glatkih mišića, povećane vaskularne permeabilnosti, aktivacije leukocita i drugih inflamatornih fenomena uključujući ćelijsku proliferaciju koja rezultira hipercelularnošću. C5a, takođe, funkcioniše kao hemotaktički peptid koji služi za privlačenje granulocita kao što su neutrofili, eozinofili, bazofili i monociti na mesto aktivacije komplementa.
Aktivnost C5a je regulisana enzimom karboksipeptidaze N u plazmi koji uklanja karboksiterminalni arginin iz C5a formirajući C5a-des-Arg derivat. C5a-des-Arg ispoljava samo 1% anafilaktičke aktivnosti i polimorfonuklearne hemotaktične aktivnosti nemodifikovanog C5a.
Dok sistem komplementa koji pravilno funkcioniše pruža snažnu odbranu od infektivnih mikroba, neodgovarajuća regulacija ili aktivacija komplementa je implicirana u patogenezi raznih poremećaja uključujući, na primer, reumatoidni artritis (RA); lupus nefritis; ishemijskoreperfuzionu povredu; paroksizmalnu noćnu hemoglobinuriju (PNH); atipični hemolitičkouremijski sindrom (aHUS); bolest gustih depozita (DDD); makularna degeneracija (npr. senilna makularna degeneracija (AMD)); hemoliza, povišeni enzimi jetre i sindrom niskog broja trombocita (HELLP); trombotična trombocitopenijska purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauci-imuni vaskulitis; bulozna epidermoliza; ponavljajući gubitak fetusa; multipla skleroza (MS); traumatska povreda mozga; i povrede nastale usled infarkta miokarda, kardiopulmonalnog bajpasa i hemodijalize (videti, npr. NPL 1). Stoga, inhibicija prekomerne ili nekontrolisane aktivacije kaskade komplementa može da obezbedi kliničku korist pacijentima sa takvim poremećajima.
Paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH) je neuobičajeni poremećaj krvi, pri čemu su crvena krvna zrnca ugrožena i stoga se uništavaju brže od normalnih crvenih krvnih zrnaca. PNH je rezultat klonske ekspanzije hematopoetskih matičnih ćelija sa somatskim mutacijama u genu PIG-A (fosfatidilinozitol glikan klase A) koji se nalazi na X hromozomu. Mutacije u PIG-A dovode do ranog bloka u sintezi glikozilfosfatidilinozitola (GPI), molekula koji je neophodan za sidrenje mnogih proteina na ćelijskim površinama. Shodno tome, PNH krvne ćelije imaju manjak proteina GPI-usidrenih proteina, koji uključuju proteine koji regulišu komplement CD55 i CD59. U normalnim okolnostima, ovi proteini regulacije komplementa blokiraju formiranje MAC-a na ćelijskim površinama, čime sprečavaju lizu eritrocita. Odsustvo GPI-usidrenih proteina uzrokuje hemolizu posredovanu komplementom u PNH.
PNH karakteriše hemolitička anemija (smanjenje broja crvenih krvnih zrnaca), hemoglobinurija (prisustvo hemoglobina u urinu, posebno vidljivo nakon spavanja) i hemoglobinemija (prisustvo hemoglobina u krvotoku). Poznato je da osobe koje pate od PNH imaju paroksizme, koji su ovde definisani kao pojave tamne boje urina. Hemolitička anemija je posledica intravaskularnog uništavanja crvenih krvnih zrnaca komponentama komplementa. Ostali poznati simptomi uključuju disfaziju, umor, erektilnu disfunkciju, trombozu i ponavljajući bol u stomaku.
Ekulizumab je humanizovano monoklonsko antitelo usmereno protiv proteina komplementa C5 i prva terapija odobrena za lečenje paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH) i atipičnog hemolitičko-uremičkog sindroma (aHUS) (videti, npr. NPL 2). Ekulizumab inhibira cepanje C5 na C5a i C5b pomoću C5 konvertaze, čime se sprečava stvaranje terminalnog kompleksa komplementa C5b-9. I C5a i C5b-9 izazivaju događaje posredovane terminalnim komplementom koji su karakteristični za PNH i aHUS (videti takođe, PTL 3, PTL 4, PTL 5 i PTL 6).
Nekoliko izveštaja opisuje anti-C5 antitela. Na primer, PTL 7 je opisao anti-C5 antitelo koje se vezuje za alfa lanac C5, ali se ne vezuje za C5a, i blokira aktivaciju C5, dok je PTL 8 opisao anti-C5 monoklonsko antitelo koje inhibira formiranje C5a. S druge strane, PTL 9 je opisao anti-C5 antitelo koje prepoznaje proteolitičko mesto za C5 konvertazu na alfa lancu C5 i inhibira konverziju C5 u C5a i C5b. PTL 10 je opisao anti-C5 antitelo koje ima konstantu afiniteta od najmanje 1 × 10<7>M<-1>.
Antitela (IgG) se vezuju za neonatalni Fc receptor (FcRn) i imaju dugo vreme zadržavanja u plazmi. Vezivanje IgG za FcRn se obično primećuje u kiselim uslovima (npr. pH 6.0), a retko se primećuje u neutralnim uslovima (npr. pH 7.4). Obično, IgG se nespecifično inkorporiraju u ćelije putem endocitoze i vraćaju se na ćelijske površine vezivanjem za endozomalni FcRn pod kiselim uslovima u endozomima. Zatim se IgG disosuje od FcRn pod neutralnim uslovima u plazmi. IgG koji nisu uspeli da se vežu za FcRn degradiraju se u lizozomima. Kada se sposobnost vezivanja IgG za FcRn u kiselim uslovima eliminiše uvođenjem mutacija u njegov Fc region, IgG se ne reciklira iz endozoma u plazmu, što dovodi do značajnog oštećenja zadržavanja IgG u plazmi. Da bi se poboljšalo zadržavanje IgG u plazmi, prijavljen je postupak koji pojačava njihovo FcRn vezivanje u kiselim uslovima. Kada se FcRn vezivanje IgG u kiselim uslovima poboljša uvođenjem aminokiselinske supstitucije u njegov Fc region, IgG se efikasnije reciklira iz endozoma u plazmu, i na taj način pokazuje poboljšano zadržavanje u plazmi. U međuvremenu, takođe je objavljeno da se IgG sa pojačanim vezivanjem FcRn pod neutralnim uslovima ne odvaja od FcRn pod neutralnim uslovima u plazmi čak i kada se vrati na površinu ćelije preko svog vezivanja za FcRn pod kiselim uslovima u endozomima, i shodno tome, njegovo zadržavanje u plazmi ostaje nepromenjeno ili se čak pogoršava (videti, na primer, NPL 3; NPL 4; NPL 5).
Nedavno su prijavljena antitela koja se vezuju za antigene na pH zavisan način (videti, na primer, PTL 11 i PTL 12). Ova antitela se snažno vezuju za antigene pod neutralnim uslovima u plazmi i odvajaju se od antigena pod endozomskim kiselim uslovima. Nakon odvajanja od antigena, antitela postaju ponovo sposobna da se vežu za antigene kada se recikliraju u plazmu preko FcRn. Dakle, jedan molekul antitela može se više puta vezati za više molekula antigena. Generalno, zadržavanje antigena u plazmi je mnogo kraće nego kod antitela koje ima gore pomenuti mehanizam recikliranja posredovan FcRn. Stoga, kada je antigen vezan za antitelo, antigen normalno pokazuje produženo zadržavanje u plazmi, što dovodi do povećanja koncentracije antigena u plazmi. S druge strane, prijavljeno je da gore opisana antitela, koja se vezuju za antigene na pH zavisan način, eliminišu antigene iz plazme brže od uobičajenih antitela jer se odvajaju od antigena unutar endozoma tokom FcRn posredovanog procesa reciklaže. PTL 13 je, takođe, opisao analizu računarskog modeliranja koja pokazuje da antitelo sa pH zavisnim vezivanjem usmereno protiv C5 može produžiti nokdaun antigena. Anti-C5 antitela za inhibiciju terminalnog komplementa i C5a upale posredovane anafilatoksinom i lečenje poremećaja povezanih sa komplementom opisana su u PTL 14.
[Lista citata]
[Patentna literatura]
[PTL 1]
U.S. Patent br.6,355,245
[PTL 2]
U.S. Patent br.7,432,356
[PTL 3]
WO 2005/074607
[PTL 4]
WO 2007/106585
[PTL 5]
WO 2008/069889
[PTL 6]
WO 2010/054403
[PTL 7]
WO 95/29697
[PTL 8]
WO 02/30985
[PTL 9]
WO 2004/007553
[PTL 10]
WO 2010/015608
[PTL 11]
WO 2009/125825
[PTL 12]
WO 2011/122011
[PTL 13]
WO 2011/111007
[PTL 14]
U.S. Patent br.9,079,949
[Literatura koja nije patentirana]
[NPL 1]
Holers et al., Immunol. Rev.223:300-316 (2008)
[NPL 2]
Dmytrijuk et al., The Oncologist 13(9):993-1000 (2008) [NPL 3]
Yeung et al., J Immunol. 182(12): 7663-7671 (2009)
[NPL 4]
Datta-Mannan et al., J Biol. Chem.282(3): 1709-1717 (2007) [NPL 5]
Dall’Acqua et al., J. Immunol. 169(9):5171-5180 (2002) [Suština pronalaska]
[Tehnički problem]
Cilj pronalaska je da obezbedi anti-C5 antitela i postupke za njihovu upotrebu.
[Rešenje problema]
Pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela koja sadrže VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu SEQ ID NO: 111 i postupke za njihovu upotrebu. Pronalazak je izložen u priloženom skupu patentnih zahteva.
U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar beta lanca C5. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar MG1-MG2 domena beta lanca C5. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska vezuje se za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od amino-kiselina 33-124 beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz grupe koja se sastoji od amino-kiselina 47-57, 70 -76 i 107-110. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar fragmenta beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109, i His110 SEQ ID NO: 40. U daljim realizacijama, antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U daljim realizacijama, antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8. U još jednoj realizaciji, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za isti epitop kao antitelo opisano u tabeli 2. U daljim realizacijama, antitelo se vezuje za isti epitop kao antitelo opisano u tabeli 2 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8. U još jednoj realizaciji, anti-C5 antitelo iz predmetnog pronalaska se vezuje za isti epitop kao antitelo opisano u tabelama 7 ili 8. U daljim realizacijama, antitelo se vezuje za isti epitop kao antitelo opisano u tabelama 7 ili 8 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO: 1 i VL iz SEQ ID NO:11; (b) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO:15; (c) VH iz SEQ ID NO:4 i VL iz SEQ ID NO:14; (d) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16; (e) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO: 12; (f) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (g) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO: 19; (h) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO: 17; (i) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO:18; i (j) VH iz SEQ ID NO:10 i VL iz SEQ ID NO:20. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo prema predmetnom pronalasku ima karakteristiku izabranu iz grupe koju čine: (a) antitelo dolazi u kontakt sa amino-kiselinama D51 i K109 iz C5 (SEQ ID NO:39); (b) afinitet antitela za C5 (SEQ ID NO:39) je veći od afiniteta antitela za C5 mutanta koji se sastoji od E48A supstitucije SEQ ID NO:39; ili (c) antitelo se vezuje za C5 protein koji se sastoji od sekvence amino-kiselina SEQ ID NO:39 na pH 7.4, ali se ne vezuje za C5 protein koji se sastoji od sekvence amino-kiselina SEQ ID NO:39 sa H72Y supstitucijom na pH 7.4. U daljim realizacijama, antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U daljim realizacijama, antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo prema predmetnom pronalasku inhibira aktivaciju C5. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska inhibira aktivaciju C5 varijante R885H. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je monoklonsko antitelo. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je fragment antitela koji se vezuje za C5. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je IgG1 antitelo pune dužine.
U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska sadrži okvir varijabilnog domena teškog lanca FR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 133; FR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 135; FR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 138; i FR4 koji sadrži sekvencu amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 140. U nekim realizacijama, izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska sadrži okvir varijabilnog domena lakog lanca FR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 143; FR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 145; FR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 147; i FR4 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 148.
Izolovano anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu SEQ ID NO: 111.
Pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu SEQ ID NO: 111.
Pronalazak, takođe, obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju anti-C5 antitelo iz predmetnog pronalaska. Pronalazak, takođe, obezbeđuje ćelije domaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu predmetnog pronalaska. Pronalazak, takođe, obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela koji se sastoji od kultivisanja ćelije domaćina predmetnog pronalaska tako da se proizvodi antitelo. Pronalazak, takođe, obezbeđuje anti-C5 antitelo koje se može dobiti postupkom za proizvodnju antitela predmetnog pronalaska.
Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju anti-C5 antitela. U nekim realizacijama, postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži MG1-MG2 domen (SEQ ID NO: 43) beta lanca C5. U nekim realizacijama, postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži region koji odgovara amino-kiselinama na pozicijama 33 do 124 beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5. U nekim realizacijama, postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz amino-kiselina 47-57, 70-76 i 107-110 beta lanca (SEQ ID NO: 40) od C5. U nekim realizacijama, postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži fragment beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5, koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinu izabranu izm Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109, i His110.
Pronalazak, takođe, obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Anti-C5 antitela predmetnog pronalaska mogu biti za upotrebu kao lek. Anti-C5 antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja posredovanih komplementom koja uključuju prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. Anti-C5 antitela predmetnog pronalaska mogu biti za upotrebu u postupku za poboljšanje klirensa C5 iz plazme.
Anti-C5 antitela predmetnog pronalaska mogu se koristiti u proizvodnji leka. U nekim realizacijama, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja posredovanog komplementom, koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U nekim realizacijama, lek je za upotrebu u postupku za poboljšanje klirensa C5 iz plazme.
Pronalazak, takođe, obezbeđuje anti-C5 antitela za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska treba da se daje pojedincu u efikasnoj količini. Pronalazak, takođe, obezbeđuje anti-C5 antitela za upotrebu u postupku za povećanje klirensa C5 iz plazme kod pojedinca. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo prema predmetnom pronalasku treba da se daje pojedincu u efikasnoj količini da bi se poboljšao klirens C5 iz plazme.
[Kratak opis crteža]
[Slika 1]
Slika 1 prikazuje vezivanje epitopa anti-C5 antitela, kao što je opisano u Primeru 2.2. Antitela grupisana u istu grupu epitopa su uokvirena debelom linijom.
[Slika 2A]
Slika 2A prikazuje BIACORE (registrovani žig) senzorgrame anti-C5 antitela na pH 7.4 (puna linija) i pH 5.8 (isprekidana linija) za procenu zavisnosti od pH, kao što je opisano u Primeru 3.2. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538 i CFA0599 su antitela grupisana u epitop C, kao što je opisano u Primeru 2.2.
[Slika 2B]
Slika 2B prikazuje BIACORE (registrovani žig) senzorgrame anti-C5 antitela na pH 7.4 (puna linija) i pH 5.8 (isprekidana linija) za procenu zavisnosti od pH, kao što je opisano u Primeru 3.2. CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C, a CFA0330 i CFA0341 su antitela grupisana u epitop B, kao što je opisano u Primeru 2.2.
305LO5 je humanizovano antitelo na CFA0305, kao što je opisano u Primeru 2.3.
[Slika 3]
Slika 3 prikazuje Western Blot analizu protiv fragmenata izvedenih iz C5 beta lanca (amino-kiseline 19-180, 161-340, 321-500 i 481-660 SEQ ID NO:40) fuzionisanih sa GST-oznakom, kao što je opisano u Primeru 4.1. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C. Anti-GST antitelo je pozitivna kontrola. Položaj GST-fuzionisanih C5 fragmenata (46-49 kDa) je označen strelicom.
[Slika 4]
Slika 4 prikazuje BIACORE (registrovani žig) senzorgrame anti-C5 antitela prema MG1-MG2 domenu C5 beta-lanca, kao što je opisano u Primeru 4.3. Gornji panel prikazuje rezultate CFA0305 (puna linija), CFA0307 (isprekidana linija), CFA0366 (crta-tačka linija) i ekulizumab (tačkasta linija). Srednji panel prikazuje rezultate CFA0501 (puna linija), CFA0599 (isprekidana linija), CFA0538 (crta-tačka linija) i ekulizumab (tačkasta linija). Donji panel prikazuje rezultate CFA0666 (puna linija), CFA0672 (isprekidana linija), CFA0675 (crta-tačka linija) i ekulizumab (tačkasta linija). CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C. Ekulizumab je kontrolno anti-C5 antitelo.
[Slika 5A]
Slika 5A prikazuje Western Blot analizu protiv fragmenata peptida izvedenih iz domena MG1-MG2 (amino-kiseline 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 i 45-111 SEQ ID NO:40) fuzionisanih na GST-oznaku, kao što je opisano u Primeru 4.4. Anti-GST antitelo se koristi kao antitelo za reakciju. Položaj GST-fuzionisanih C5 fragmenata (35-37kDa) je označen strelicom.
[Slika 5B]
Slika 5B prikazuje Western Blot analizu protiv fragmenata peptida izvedenih iz domena MG1-MG2 (amino-kiseline 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 i 45-111 SEQ ID NO:40) fuzionisanih na GST-oznaku, kao što je opisano u Primeru 4.4. CFA0305 se koristi kao antitelo za reakciju.
[Slika 5C]
Slika 5C sumira reakcije vezivanja anti-C5 antitela za fragmente izvedene iz C5 beta lanca, kao što je opisano u Primeru 4.4. Fragmenti za koje se vezuju anti-C5 antitela grupisana u epitop C (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675) prikazani su sivom bojom, a fragmenti za koje se ne vezuju prikazani su belom.
[Slika 6]
Slika 6 prikazuje Western Blot analizu protiv mutanata C5 tačke u kojima je E48, D51 i K109 beta lanca supstituisan sa alaninom (E48A, D51A i K109A, tim redosledom), kao što je opisano u Primeru 4.5. Na levom panelu, ekulizumab (anti-C5 antitelo, koje vezuje alfa lanac) se koristi kao antitelo za reakciju, a pozicija alfa lanca C5 (približno 113 kDa) je označena strelicom. Na desnom panelu, CFA0305 (grupisan u epitop C, koje vezuje beta lanac) se koristi kao antitelo za reakciju, a položaj beta lanca C5 (približno 74 kDa) je označen vrhom strelice.
[Slika 7]
Slika 7 predstavlja BIACORE (registrovani žig) senzorgrame koji pokazuju interakciju ekulizumaba-F760G4 (gornji panel) ili 305LO5 (donji panel) sa C5 mutantima, kao što je opisano u Primeru 4.6. Senzorgrami su dobijeni ubrizgavanjem C5-wt (debela puna kriva), C5-E48A (kratko isprekidana kriva), C5-D51A (dugo isprekidana kriva) i C5-K109A (tanka puna kriva), tim redosledom, preko površine senzora imobilisane sa ekulizumabom-F760G4 ili 305LO5. Ekulizumab je kontrolno anti-C5 antitelo. 305LO5 je humanizovano antitelo CFA0305 (grupisano u epitop C), kao što je opisano u Primeru 2.3.
[Slika 8]
Slika 8 predstavlja BIACORE (registrovani žig) senzorgrame koji pokazuju interakciju 305LO5 sa C5 His mutantima za procenu zavisnosti od pH, kao što je opisano u Primeru 4.7. Senzorgrami su dobijeni ubrizgavanjem C5-wt (debela puna kriva), C5-H70Y (dugo isprekidana kriva), C5-H72Y (kratko isprekidana kriva), C5-H110Y (tačkasta kriva) i C5H70Y+H110Y (tanka puna kriva), tim redosledom, preko površine senzora imobilisane sa 305LO5. Kompleksi antitelo/antigen su ostavljeni da se disociraju na pH 7.4, nakon čega je usledila dodatna disocijacija na pH 5.8 (pokazano strelicom) da bi se procenile interakcije zavisne od pH.
[Slika 9A]
Slika 9A prikazuje inhibiciju lipozomske lize aktivirane komplementom sa anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.1. Prikazani su rezultati CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 grupisanih u epitop C, kao što je opisano u Primeru 2.2.
[Slika 9B]
Slika 9B prikazuje inhibiciju lipozomske lize aktivirane komplementom anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.1. Prikazani su rezultati antitela CFA0330 i CFA0341 grupisanih u epitop B, kao što je opisano u Primeru 2.2.
[Slika 10A]
Slika 10A prikazuje inhibiciju stvaranja C5a anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.2. Koncentracije C5a su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lipozomske lize opisanog na Slici 9A.
[Slika 10B]
Slika 10B prikazuje inhibiciju stvaranja C5a anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.2. Koncentracije C5a su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lipozomske lize opisanog na Slici 9B.
[Slika 11]
Slika 11 prikazuje inhibiciju hemolize aktivirane komplementom anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.3. Komplementi su aktivirani klasičnim putem.
[Slika 12]
Slika 12 prikazuje inhibiciju hemolize aktivirane komplementom anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.4. Komplementi su aktivirani alternativnim putem.
[Slika 13]
Slika 13 prikazuje vremenski tok koncentracije humanog C5 u plazmi nakon intravenske primene samo humanog C5 ili humanog C5 i anti-humanog C5 antitela kod miševa koji procenjuje klirens C5, kao što je opisano u Primeru 6.2. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C, a CFA0330 i CFA0341 su antitela grupisana u epitop B, kao što je opisano u Primeru 2.2.
[Slika 14]
Slika 14 prikazuje vremenski tok koncentracije anti-humanog C5 antitela u plazmi posle intravenske primene humanog C5 i anti-humanog C5 antitela kod miševa koji procenjuje farmakokinetiku antitela, kao što je opisano u Primeru 6.3. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C, a CFA0330 i CFA0341 su antitela grupisana u epitop B, kao što je opisano u Primeru 2.2.
[Slika 15]
Slika 15 prikazuje inhibiciju lipozomske lize aktivirane komplementom anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 9.1. Prikazani su rezultati antitela 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422 i 305L020-SG115.
[Slika 16]
Slika 16 prikazuje inhibiciju lipozomske lize aktivirane komplementom anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 9.1. Prikazani su rezultati antitela 305LO15-SG115 i 305LO23-SG429.
[Slika 17]
Slika 17 prikazuje inhibiciju lipozomske lize aktivirane komplementom anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 9.1. Prikazani su rezultati antitela 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 i 305LO23-SG422.
[Slika 18]
Slika 18 prikazuje inhibiciju stvaranja C5a anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 9.2. Koncentracije C5a su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lipozomske lize opisanog na slici 15.
[Slika 19]
Slika 19 prikazuje inhibiciju stvaranja C5a anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 9.2. Koncentracije C5a su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lipozomske lize opisanog na slici 16.
[Slika 20]
Slika 20 prikazuje inhibiciju aktivnosti komplementa u plazmi majmuna anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 9.3. Anti-C5 antitela su davana majmunima makaki rakojedima, a aktivnosti komplementa u plazmi majmuna merene su u testu hemolize.
[Slika 21]
Slika 21 prikazuje inhibiciju biološke aktivnosti divljeg tipa C5 (WT) i C5 varijanti (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D) pomoću anti-C5 antitela (ekulizumaba), kao što je opisano u Primeru 9.4.
[Slika 22]
Slika 22 prikazuje inhibiciju biološke aktivnosti divljeg tipa C5 (WT) i C5 varijanti (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D) anti-C5 antitelom (varijanta 305), kao što je opisano u Primeru 9.4.
[Slika 23]
Slika 23 prikazuje inhibiciju lipozomske lize aktivirane komplementom anti-C5 antitelima (BNJ441 i varijanta 305), kao što je opisano u Primeru 9.5.
[Slika 24]
Slika 24 prikazuje vremenski tok koncentracije C5 makaki rakojeda u plazmi nakon intravenske primene anti-humanog C5 antitela kod majmuna makaki rakojeda koji procenjuje klirens C5, kao što je opisano u Primeru 10.2.
[Slika 25]
Slika 25 prikazuje vremenski tok koncentracije anti-humanog C5 antitela u plazmi nakon intravenskog davanja anti-humanog C5 antitela kod majmuna makaki rakojeda koji procenjuje farmakokinetiku antitela, kao što je opisano u Primeru 10.3.
[Slika 26]
Slike 26A i 26B prikazuju kristalnu strukturu 305 Fab vezanog za humani C5 (hC5)-MG1 domen, kao što je opisano u Primeru 11.6. Slika 26A prikazuje asimetričnu jedinicu. MG1 je prikazan u površinskom prikazu, a 305 Fab je prikazan kao trake (tamnosiva: teški lanac, svetlosiva: laki lanac). Slika 26B prikazuje molekule 1 i 2 koji su međusobno postavljeni (tamnosiva: molekul 1, svetlosiva: molekul 2).
[Slika 27A]
Slika 27A prikazuje epitop kontaktnog regiona 305 Fab na MG1 domenu, kao što je opisano u Primeru 11.6. Slika 27A prikazuje mapiranje epitopa u aminokiselinskoj sekvenci MG1 (tamnosiva: bliže od 3,0 Angstroma, svetlosiva: bliže od 4,5 Angstroma).
[Slika 27B]
Slika 27B prikazuje epitop kontaktnog regiona 305 Fab na MG1 domenu, kao što je opisano u Primeru 11.6. Slika 27B prikazuje mapiranje epitopa u kristalnoj strukturi (tamnosive sfere: bliže od 3,0 Angstroma, svetlosivi štapići: bliže od 4,5 Angstroma). [Slika 28A]
Slika 28A prikazuje pogled izbliza na interakcije E48, D51 i K109 (reprezentacija štapićima) sa 305 Fab (površinska reprezentacija), kao što je opisano u Primeru 11.7. [Slika 28B]
Slika 28B prikazuje interakcije između E48 i njegovog okruženja (tamnosiva tačkasta linija: vodonična veza sa Fab, svetlosiva tačkasta linija: vodonična veza posredovana vodom), kao što je opisano u Primeru 11.7.
[Slika 28C]
Slika 28C prikazuje interakcije između D51 i njegovog okruženja (tamnosiva tačkasta linija: vodonična veza sa Fab), kao što je opisano u Primeru 11.7.
[Slika 28D]
Slika 28D prikazuje interakcije između K109 i njegovog okruženja (tamnosiva tačkasta linija: vodonična veza sa Fab, svetlosiva tačkasta linija: slani most sa H-CDR3_D95), kao što je opisano u Primeru 11.7.
[Slika 29A]
Slika 29A prikazuje pogled izbliza na interakcije H70, H72 i H110 (reprezentacija sa štapićima) sa 305 Fab (površinska reprezentacija), kao što je opisano u Primeru 11.8, u istoj orijentaciji kao na slici 28A.
[Slika 29B]
Slika 29B prikazuje interakcije između H70 i njegovog okruženja, kao što je opisano u Primeru 11.8. Ovaj histidinski ostatak je naznačen u reprezentaciji štapića i mreže. Vodonička veza je označena tačkastom linijom.
[Slika 29C]
Slika 29C prikazuje interakcije između H72 i njegovog okruženja, kao što je opisano u Primeru 11.8. Ovaj histidinski ostatak je naznačen u reprezentaciji štapića i mreže. Vodonička veza je označena tačkastom linijom.
[Slika 29D]
Slika 29D prikazuje interakcije između H110 i njegovog okruženja, kao što je opisano u Primeru 11.8. Ovaj histidinski ostatak je naznačen u reprezentaciji štapića i mreže. Udaljenost između H110 i H-CDR3_H100c je prikazana tačkastom linijom.
[Opis realizacija]
Tehnike i procedure koje su ovde opisane ili na koje se poziva su generalno dobro shvaćene i uobičajeno se primenjuju korišćenjem konvencionalne metodologije od strane stručnjaka u tehnici, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. DEFINICIJE
Osim ako nije drugačije definisano, tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde imaju isto značenje koje uobičajeno razume stručnjak u oblasti kojoj predmetni pronalazak pripada. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y.
1994), i March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y.1992) predstavljaju za stručnjaka u tehnici opšti vodič za mnoge izraze koji se koriste u ovoj prijavi.
Za potrebe tumačenja ove specifikacije, primenjivaće se sledeće definicije i kad god je to prikladno, izrazi koji se koriste u jednini će takođe uključivati množinu i obrnuto. Podrazumeva se da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisa određenih realizacija, i nije joj namera da bude ograničavajuća.
„Akceptorski humani okvir” za potrebe ovog dokumenta je okvir koji sadrži sekvencu aminokiselina okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) izvedenu iz okvira humanog imunoglobulina ili humanog konsenzusnog okvira, kako je definisano u daljem tekstu. Akceptorski humani okvir „izveden iz” okvira humanog imunoglobulina ili humanog konsenzusnog okvira može da sadrži istu njegovu sekvencu aminokiselina, ili može da sadrži promene sekvence amino-kiselina. U nekim realizacijama, broj promena amino-kiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim realizacijama, humani okvir VL akceptora je po sekvenci identičan sekvenci okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvenci humanog konsenzusnog okvira.
„Afinitet” se odnosi na jačinu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera za vezivanje (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja” se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y se generalno može predstaviti konstantom disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u tehnici, uključujući one opisane ovde. Specifične ilustrativne i primerne realizacije za merenje afiniteta vezivanja su opisane u daljem tekstu.
„Afinitetno zrelo” antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više alternacija u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa roditeljskim antitelom koje nema takve alternacije, a takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen.
Izrazi „anti-C5 antitelo” i „antitelo koje se vezuje za C5” odnose se na antitelo koje je sposobno da veže C5 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapeutsko sredstvo u ciljanju C5. U jednoj realizaciji, stepen vezivanja anti-C5 antitela za nepovezani, ne-C5 protein je manji od oko 10% vezivanja antitela za C5 mereno, npr. radioimunotestom (RIA). U određenim realizacijama, antitelo koje se vezuje za C5 ima konstantu disocijacije (Kd) od 1 mikro M ili manje, 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 0,1 nM ili manje, 0,01 nM ili manje, ili 0,001 nM ili manje (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, na primer, od 10-
<9>M do 10<-13>M). U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop C5 koji je sačuvan među C5 iz različitih vrsta.
Izraz „antitelo” se ovde koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok pokazuju željenu aktivnost vezivanja antigena.
„Fragment antitela” se odnosi na molekul koji nije intaktno antitelo koji sadrži deo intaktnog antitela koji vezuje antigen za koji se intaktno antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela (npr. scFv); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
„Antitelo koje se vezuje za isti epitop” kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u testu konkurencije, i/ili obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u testu takmičenja (kompetencije). Ovde je dat ogledni test takmičenja.
Izraz „himerično” antitelo se odnosi na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca izveden iz određenog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca izveden iz drugog izvora ili vrste.
„Klasa” antitela se odnosi na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko od njih se može dalje podeliti na podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgGs, IgG4, IgA1i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno.
Izraz „citotoksično sredstvo” kako se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksična sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivni izotopi Lu); hemoterapijska sredstva ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloidi (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druga interkalaciona sredstva); sredstva za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante; i različita antitumorska ili antikancerogena sredstva opisana u daljem tekstu.
„Efektorske funkcije” se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnim od antitela (ADCC); fagocitozu; smanjenje receptora na površini ćelije (npr. receptora B ćelija); i aktivaciju B ćelija.
„Efektivna količina” sredstva, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu efikasnu, u dozama i u vremenskim periodima neophodnim za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Izraz „epitop” uključuje bilo koju determinantu sposobnu da bude vezana antitelom. Epitop je region antigena koji je vezan antitelom koje cilja taj antigen i uključuje specifične amino-kiseline koje direktno kontaktiraju antitelo. Odrednice epitopa mogu da uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su amino-kiseline, bočni lanci šećera, fosforilne ili sulfonilne grupe, i mogu da imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen će preferencijalno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula.
Izraz „Fc region” ovde se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Izraz uključuje Fc regione nativne sekvence i varijante Fc regiona. U jednoj realizaciji, Fc region teškog lanca humanog IgG proteže se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog kraja teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) ili glicin-lizin (ostaci 446-447) Fc regiona može ili ne mora biti prisutan. Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, numerisanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema sistemu numerisanja EU, koji se takođe naziva EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena se generalno sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence se generalno pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Izrazi „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „celo antitelo” se ovde koriste naizmenično da označe antitelo koje ima strukturu u suštini sličnu strukturi nativnog antitela ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
Izrazi „ćelija domaćin”, „ćelijska linija domaćina” i „kultura ćelije domaćina” se koriste naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarnu transformisanu ćeliju i potomstvo izvedeno iz nje bez obzira na broj pasaža. Potomstvo možda nije potpuno identično u sadržaju nukleinske kiseline kao roditeljska ćelija, ali može da sadrži mutacije. Mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao skenirane ili odabrane za originalnu transformisanu ćeliju je uključeno ovde.
„Humano antitelo” je ono koje poseduje sekvencu amino-kiselina koja odgovara onoj antitela koje proizvodi čovek ili humana ćelija ili je izvedeno iz nehumanog izvora koji koristi repertoare humanih antitela ili druge sekvence koje kodiraju humana antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke koji se vezuju za nehumani antigen.
„Humani konsenzusni okvir” je okvir koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u selekciji sekvenci VL ili VH okvira humanog imunoglobulina. Generalno, selekcija VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. U jednoj realizaciji, za VL, podgrupa je podgrupa kappa I kao u Kabat et al., supra. U jednoj realizaciji, za VH, podgrupa je podgrupa III kao u Kabat et al., supra.
„Humanizovano” antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke iz nehumanih HVR i aminokiselinske ostatke iz humanih FR. U određenim realizacijama, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili u suštini svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima nehumanog antitela, i svi ili u suštini svi FR odgovaraju onima humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može sadržati barem deo konstantnog regiona antitela koji je izveden iz humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, na primer, nehumano antitelo, odnosi se na antitelo koje je prošlo humanizaciju.
Izraz „hipervarijabilni region” ili „HVR” kako se ovde koristi odnosi se na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost” ili „CDR”) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”) i/ili sadrže ostatke koji dolaze u kontakt sa antigenom („kontakti sa antigenom”). Generalno, antitela obuhvataju šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Primeri HVR-a ovde uključuju: (a) hipervarijabilne petlje koje se javljaju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987)); (b) CDR-ovi koji se javljaju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)); (c) kontakti antigena koji se javljaju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93 -101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)); i (d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući HVR aminokiselinske ostatke 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Osim ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) su ovde numerisani prema Kabat et al., supra.
„Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući ali bez ograničenja na, citotoksično sredstvo.
„Pojedinac” ili „subjekat” je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, pripitomljene životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i neljudske primate kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. pacove). U određenim realizacijama, pojedinac ili subjekt je čovek.
„Izolovano” antitelo je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim realizacijama, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforetskim (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografskim (npr. jonska razmena ili HPLC na rezverznim fazama) metodama. Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, videti, npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
„Izolovana” nukleinska kiselina se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina obuhvata molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje obično sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-C5 antitelo” se odnosi na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takav molekul(e) nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takav molekul(e) nukleinske kiseline prisutan na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Izraz „monoklonsko antitelo” kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije u suštini homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim mogućih varijanti antitela, npr. koja sadrže prirodne mutacije koje se javljaju ili nastaju tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, pri čemu su takve varijante generalno prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata poliklonskih antitela, koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo preparata monoklonskog antitela usmereno je protiv jedne determinante na antigenu. Prema tome, modifikator „monoklonalno” ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz u suštini homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti napravljena različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na metod hibridoma, metode rekombinantne DNK, metode prikaza faga i metode koje koriste transgene životinje koje sadrže sve ili deo lokusa humanog imunoglobulina, a takvi postupci i drugi primeri postupaka za pravljenje monoklonskih antitela su ovde opisani.
„Golo antitelo” se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa heterolognim delom (npr.
citotoksičnim delom) ili radiooznakom. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
„Nativna antitela” se odnose na molekule imunoglobulina koji se javljaju u prirodi sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su vezani disulfidom. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe naziva varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, a zatim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe naziva varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, nakon čega sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se dodeliti jednom od dva tipa, koji se nazivaju kapa (kappa) i lambda (lambda), na osnovu sekvence amino-kiseline njegovog konstantnog domena.
Izraz „umetak u pakovanju” se koristi da se označe uputstva koja su uobičajeno uključena u komercijalna pakovanja terapeutskih proizvoda, koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda.
„Procenat (%) identiteta sekvence amino-kiseline” u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Usklađivanje u svrhu određivanja procenta identiteta sekvence amino-kiselina može se postići na različite načine koji su u okviru stanja tehnike, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) softver, ili GENETYX (registrovani žig) (Genetyx Co., Ltd.). Stručnjaci u tehnici mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnanje sekvenci, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja preko cele dužine sekvenci koje se porede. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 je delo Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet uz korisničku dokumentaciju u Kancelariji za autorska prava SAD, Vašington D.C., 20559, gde je registrovan pod registracionim brojem autorskih prava SAD TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., Južni San Francisko, Kalifornija, ili se može kompajlirati iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba kompajlirati za upotrebu na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri poređenja sekvenci su podešeni programom ALIGN-2 i ne variraju.
U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje sekvenci amino-kiselina, % identiteta sekvence amino-kiselina date sekvence amino-kiselina A prema, sa ili protiv date sekvence aminokiselina B (koja se alternativno može izraziti kao data amino-kiselina sekvenca A koja ima ili sadrži određeni procenat identiteta sekvence amino-kiselina prema, sa ili protiv date sekvence amino-kiselina B) izračunava se na sledeći način: 100 puta udeo X/Y, gde je X broj aminokiselinskih ostataka koji se beleže kao identična poklapanja sa programom za poravnanje sekvenci ALIGN-2 u tom programu za poravnanje A i B, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Primetno je da gde dužina sekvence amino-kiselina A nije jednaka dužini sekvence amino-kiselina B, % identiteta sekvence amino-kiselina A prema B neće biti jednak % identiteta sekvence amino-kiselina B prema A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve vrednosti % identiteta sekvence amino-kiselina korišćene ovde se dobijaju kako je opisano u neposredno prethodnom pasusu pomoću računarskog programa ALIGN-2.
Izraz „farmaceutska formulacija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da dozvoljava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekta kome bi se dala formulacija.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač” se odnosi na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za subjekta. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Izraz „C5”, kako se ovde koristi, obuhvata bilo koji prirodni C5 iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare kao što su primati (npr. ljudi i majmuni) i glodari (npr. miševi i pacovi). Osim ako nije drugačije naznačeno, izraz „C5” se odnosi na humani C5 protein koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO: 39 i sadrži sekvencu beta lanca prikazanu u SEQ ID NO: 40. Izraz obuhvata „punu dužinu,” neprerađeni C5 kao i bilo koji oblik C5 koji nastaje preradom u ćeliji. Izraz, takođe, obuhvata varijante C5 koje se javljaju u prirodi, na primer, splajsne varijante ili alelne varijante. Sekvenca amino-kiseline primera humanog C5 je prikazana u SEQ ID NO: 39 („divlji tip” ili „WT” C5). Sekvenca amino-kiseline primera beta lanca humanog C5 je prikazana u SEQ ID NO: 40. Sekvence amino-kiselina primera MG1, MG2 i MG1-MG2 domena beta lanca humanog C5 su prikazane u SEQ ID NO: 41 , 42 i 43, tim redosledom. Sekvence amino-kiselina primera C5 majmuna makaki rakojeda i miša su prikazane u SEQ ID NO: 44 i 105, tim redosledom. Aminokiselinski ostaci 1-19 SEQ ID NO: 39, 40, 43, 44 i 105 odgovaraju signalnoj sekvenci koja se uklanja tokom obrade u ćeliji i stoga nedostaje u odgovarajućoj primernoj sekvenci aminokiselina.
Kako se ovde koristi, „lečenje” (i njegove gramatičke varijacije kao što su „lečiti” ili „koji leči”) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok pojedinca koji se leči, i može se izvesti ili radi profilakse ili tokom toka kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje pojave ili ponovne pojave bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo koje direktne ili indirektne patološke posledice bolesti, sprečavanje metastaza, smanjenje stope progresije bolesti, poboljšanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, antitela pronalaska su za upotrebu u postupku odlaganja razvoja bolesti ili usporavanja progresije bolesti.
Izraz „varijabilni region” ili „varijabilni domen” odnosi se na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (VH i VL, tim redosledom) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, a svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti, npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da dodeli specifičnost vezivanja antigena. Štaviše, antitela koja vezuju određeni antigen mogu da se izoluju korišćenjem VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen da bi se uradio skrining biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, tim redosledom. Videti, npr. Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Izraz „vektor”, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Izraz uključuje vektor kao strukturu nukleinske kiseline koja se samoreplicira, kao i vektor inkorporiran u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „ekspresioni vektori”.
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
U jednoj realizaciji, pronalazak se delimično zasniva na anti-C5 antitelima koja sadrže VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu SEQ ID NO: 111 i postupcima za njihovu proizvodnju. Antitela prema pronalasku su korisna, npr. za upotrebu u postupku dijagnoze ili lečenja bolesti ili stanja posredovanih komplementom, koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5.
A. Primeri anti-C5 antitela
Pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo prema predmetnom pronalasku se vezuje za epitop unutar beta lanca C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar MG1-MG2 domena beta lanca C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od amino-kiselina 19-180 beta lanca C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar MG1 domena (amino-kiseline 20-124 SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 41)) beta lanca C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od amino-kiselina 33-124 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40). U drugoj realizaciji, antitelo se ne vezuje za fragment kraći od fragmenta koji se sastoji od amino-kiselina 33-124 beta lanca C5, na primer, fragment koji se sastoji od amino-kiselina 45-124, 52-124, 33-111, 33-108, ili 45-111 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40).
Pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela koja pokazuju karakteristike vezivanja zavisne od pH. Kako se ovde koristi, izraz „vezivanje zavisno od pH“ znači da antitelo pokazuje „smanjeno vezivanje za C5 pri kiselom pH u poređenju sa njegovim vezivanjem pri neutralnom pH“ (za potrebe predmetnog pronalaska, oba izraza se mogu koristiti naizmenično). Na primer, antitela „sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH“ uključuju antitela koja se vezuju za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. Antitela iz predmetnog pronalaska vezuju se za C5 sa najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U nekim realizacijama, antitela se vezuju za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego pri pH 5.8. U daljim realizacijama, antitela iz predmetnog pronalaska vezuju se za C5 sa najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta većim afinitetom pri pH 7.4 nego pri pH 5.8.
„Afinitet” antitela za C5, za potrebe predmetnog pronalaska, izražen je u terminima KD antitela. KD antitela se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije interakcije antitelo-antigen. Što je veća KD vrednost za antitelo koje se vezuje za svoj antigen, to je slabiji njegov afinitet vezivanja za taj određeni antigen. Shodno tome, kako se ovde koristi, izraz „veći afinitet pri neutralnom pH nego pri kiselom pH” (ili ekvivalentan izraz „vezivanje zavisno od pH”) znači da je KD za vezivanje antitela za C5 pri kiselom pH veći od KD za antitelo koje se vezuje za C5 pri neutralnom pH. Na primer, u kontekstu predmetnog pronalaska, smatra se da se antitelo vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH ako je KD antitela koje se vezuje za C5 pri kiselom pH najmanje 2 puta veći od KD antitela koji se vezuje za C5 pri neutralnom pH. Dakle, predmetni pronalazak uključuje antitela koja se vezuju za C5 pri kiselom pH sa KD koji je najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 , 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veći od KD antitela koje se vezuje za C5 pri neutralnom pH. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela pri neutralnom pH može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10-
<10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili manja. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela pri kiselom pH može biti 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M ili veća.
Smatra se da se antitelo vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH ako je KD antitela koje se vezuje za C5 pri pH 5.8 najmanje 2 puta veći od KD antitela koje se vezuje za C5 pri pH 7.4. U nekim realizacijama, antitela pronalaska se vezuju za C5 na pH 5.8 sa KD koji je najmanje 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veći od KD antitela koji se vezuje za C5 pri pH 7.4. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela na pH 7.4 može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10-<12>M ili manja. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela na pH 5.8 može biti 10<-9>M, 10<-8>M, 10-
<7>M, 10<-6>M ili veća.
Svojstva vezivanja antitela za određeni antigen, takođe, mogu biti izražena u terminima kd antitela. kd antitela se odnosi na konstantu brzine disocijacije antitela u odnosu na određeni antigen i izražava se u recipročnim sekundama (tj., sek.<-1>). Povećanje kd vrednosti označava slabije vezivanje antitela za njegov antigen. Predmetni pronalazak stoga uključuje antitela koja se vezuju za C5 sa višom kd vrednošću pri kiselom pH nego pri neutralnom pH. Predmetni pronalazak uključuje antitela koja se vezuju za C5 pri kiselom pH sa kd koji je najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 , 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veći od kd antitela koje se vezuje za C5 pri neutralnom pH. U drugoj realizaciji, kd vrednost antitela pri neutralnom pH može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manja. U drugoj realizaciji, kd vrednost antitela pri kiselom pH može biti 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća. Otkriće takođe uključuje antitela koja se vezuju za C5 sa višom kd vrednošću pri pH 5.8 nego pri pH 7.4. Predmetni pronalazak uključuje antitela koja se vezuju za C5 na pH 5.8 sa kd koji je najmanje 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veći od kd antitela koji se vezuje za C5 pri pH 7.4. U drugoj realizaciji, kd vrednost antitela na pH 7.4 može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manja. U drugoj realizaciji, kd vrednost antitela na pH 5.8 može biti 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća.
U određenim slučajevima, „smanjeno vezivanje za C5 pri kiselom pH u poređenju sa njegovim vezivanjem pri neutralnom pH” se izražava u smislu odnosa KD vrednosti vezivanja antitela za C5 pri kiselom pH prema KD vrednosti vezivanja antitela za C5 pri neutralnom pH (ili obrnuto). Na primer, može se smatrati da antitelo pokazuje „smanjeno vezivanje za C5 pri kiselom pH u poređenju sa njegovim vezivanjem pri neutralnom pH”, za potrebe predmetnog pronalaska, ako antitelo pokazuje kiseli/neutralni KD odnos od 2 ili veći. U određenim primerima realizacija, KD odnos pH 5.8/pH 7.4 za antitelo prema predmetnom pronalasku je 2 ili veći. U određenim primerima realizacija, odnos kiseli/neutralni KD za antitelo predmetnog pronalaska može biti 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veći. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela pri neutralnom pH može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10-
<9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M, ili manja. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela pri kiselom pH može biti 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M ili veća. U daljim slučajevima, može se smatrati da antitelo pokazuje „smanjeno vezivanje za C5 pri kiselom pH u poređenju sa njegovim vezivanjem pri neutralnom pH”, za potrebe predmetnog pronalaska, ako antitelo pokazuje KD odnos pH 5.8/pH 7.4 od 2 ili više. U određenim primerima realizacija, KD odnos pH 5.8/pH 7.4 za antitelo prema predmetnom pronalasku može biti 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veći. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela na pH 7.4 može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili manja. U drugoj realizaciji, KD vrednost antitela na pH 5.8 može biti 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M ili veća.
U određenim slučajevima, „smanjeno vezivanje za C5 pri kiselom pH u poređenju sa njegovim vezivanjem pri neutralnom pH” se izražava u smislu odnosa kd vrednosti vezivanja antitela za C5 pri kiselom pH prema kd vrednosti vezivanja antitela za C5 pri neutralnom pH (ili obrnuto). Na primer, može se smatrati da antitelo pokazuje „smanjeno vezivanje za C5 pri kiselom pH u poređenju sa njegovim vezivanjem pri neutralnom pH”, za potrebe predmetnog pronalaska, ako antitelo pokazuje kiseli/neutralni kd odnos od 2 ili veći. U određenim primerima realizacija, kd odnos pH 5.8/pH 7.4 za antitelo prema predmetnom pronalasku je 2 ili veći. U određenim primerima realizacija, odnos kiseli/neutralni kd za antitelo prema predmetnom pronalasku može biti 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veći. U daljim primerima realizacija, kd odnos pH 5.8/pH 7.4 za antitelo predmetnog pronalaska može biti 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veći. U drugoj realizaciji, kd vrednost antitela pri neutralnom pH može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manja. U daljoj realizaciji, kd vrednost antitela na pH 7.4 može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manja. U drugoj realizaciji, kd vrednost antitela pri kiselom pH može biti 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća. U daljoj realizaciji, kd vrednost antitela na pH 5.8 može biti 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća.
Kako se ovde koristi, izraz „kiseli pH” označava pH od 4.0 do 6.5. Izraz „kiseli pH” uključuje pH vrednosti bilo koje od 44.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 i 6.5. U posebnim aspektima, „kiseli pH” je 5.8.
Kako se ovde koristi, izraz „neutralni pH” označava pH od 6.7 do oko 10.0. Izraz „neutralni pH” uključuje pH vrednosti bilo koje od 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 i 10.0. U posebnim aspektima, „neutralni pH” je 7.4.
KD vrednosti i kd vrednosti, kao što je ovde izraženo, mogu se odrediti korišćenjem biosenzora zasnovanog na rezonanciji površinskog plazmona da bi se karakterisale interakcije antiteloantigen. (videti, npr. Primer 3, ovde). KD vrednosti i kd vrednosti se mogu odrediti na 25 stepeni C ili 37 stepeni C.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar beta lanca C5 koji se sastoji od MG1 domena (SEQ ID NO:41). U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz grupe koju čine amino-kiseline 47-57, 70-76 i 107-110. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar fragmenta beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koju čine Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 i His110. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za epitop unutar fragmenta beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110. U određenim realizacijama, vezivanje anti-C5 antitela predmetnog pronalaska za C5 mutant je smanjeno u poređenju sa njegovim vezivanjem za divlji tip C5, pri čemu C5 mutant ima najmanje jednu supstituciju amino-kiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His72 i Lys109. U drugoj realizaciji, vezivanje zavisno od pH anti-C5 antitela predmetnog pronalaska za C5 mutant je smanjeno u poređenju sa njegovim pH-zavisnim vezivanjem za divlji tip C5, pri čemu C5 mutant ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koju čine His70, His72 i His110. U daljoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji izabranoj iz Glu48, Asp51 i Lys109 je supstituisana sa alaninom, a amino-kiselina na poziciji izabranoj iz His70, His72 i His110 je supstituisana tirozinom u C5 mutantu.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran iz: (a) VH SEQ ID NO:1 i VL SEQ ID NO:11; (b) VH SEQ ID NO: 22 i VL SEQ ID NO: 26; (c) VH SEQ ID NO:21 i VL SEQ ID NO:25; (d) VH SEQ ID NO: 5 i VL SEQ ID NO: 15; (e) VH SEQ ID NO: 4 i VL SEQ ID NO: 14; (f) VH SEQ ID NO: 6 i VL SEQ ID NO: 16; (g) VH SEQ ID NO: 2 i VL SEQ ID NO: 12; (h) VH SEQ ID NO: 3 i VL SEQ ID NO: 13; (i) VH SEQ ID NO:9 i VL SEQ ID NO:19; (j) VH SEQ ID NO: 7 i VL SEQ ID NO: 17; (k) VH SEQ ID NO: 8 i VL SEQ ID NO: 18; (l) VH SEQ ID NO: 23 i VL SEQ ID NO: 27; i (m) VH SEQ ID NO: 10 i VL SEQ ID NO: 20.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska vezuje se za C5 i dolazi u kontakt sa amino-kiselinom Asp51 (D51) SEQ ID NO:39. U dodatnim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska vezuje se za C5 i dolazi u kontakt sa amino-kiselinom Lys109 (K109) SEQ ID NO:39. U daljoj realizaciji, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska vezuje se za C5 i dolazi u kontakt sa amino-kiselinom Asp51 (D51) i amino-kiselinom Lys109 (K109) SEQ ID NO:39.
U određenim realizacijama, vezivanje anti-C5 antitela iz predmetnog pronalaska za C5 mutant je smanjeno u poređenju sa njegovim vezivanjem za divlji tip C5, pri čemu C5 mutant ima Glu48Ala (E48A) supstituciju SEQ ID NO:39. U drugoj realizaciji, vezivanje zavisno od pH anti-C5 antitela iz predmetnog pronalaska za C5 mutant je smanjeno u poređenju sa njegovim pH-zavisnim vezivanjem za divlji tip C5, pri čemu C5 mutant ima Glu48Ala (E48A) supstituciju SEQ ID NO:39.
U daljoj realizaciji, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 protein koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:39, ali se ne vezuje za C5 protein koji se sastoji od sekvence amino-kiselina SEQ ID NO:39 sa H72Y supstitucijom, pri čemu se C5 protein i H72Y supstituisani C5 protein pripremaju i testiraju pod istim uslovima. U daljoj realizaciji, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 protein koji se sastoji od sekvence amino-kiselina SEQ ID NO:39 na pH 7.4, ali se ne vezuje za H72Y supstituisani C5 protein na pH 7.4.
Bez ograničavanja na određenu teoriju, može se spekulisati da se vezivanje anti-C5 antitela za C5 smanjuje (ili skoro gubi) kada se aminokiselinski ostatak na C5 zameni drugom amino-kiselinom, što znači da je aminokiselinski ostatak na C5 kritičan za interakcije između anti-C5 antitela i C5, i da antitelo može prepoznati epitop oko aminokiselinskog ostatka na C5.
U predmetnom pronalasku je otkriveno da grupa anti-C5 antitela koja se takmiče jedno sa drugim ili se vezuju za isti epitop mogu da ispolje karakteristike vezivanja zavisne od pH. Među aminokiselinama, histidin, sa pKa vrednošću od približno 6,0 do 6,5, može imati različita stanja disocijacije protona između neutralnog i kiselog pH. Stoga, histidinski ostatak na C5 može doprineti pH-zavisnim interakcijama između anti-C5 antitela i C5. Bez ograničavanja na određenu teoriju, može se spekulisati da anti-C5 antitelo može da prepozna konformacionu strukturu oko histidinskog ostatka na C5, koji je promenljiva zavisna od pH. Ta spekulacija može biti u skladu sa eksperimentalnim rezultatima opisanim u daljem tekstu: da se pH-zavisnost anti-C5 antitela smanjuje (ili skoro gubi) kada se histidinski ostatak na C5 zameni drugom amino-kiselinom (tj. anti-C5 antitelo sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH se vezuje za histidin mutant C5 sa sličnim afinitetom za divlji tip C5 pri neutralnom pH, dok se isto antitelo vezuje za histidinski mutant C5 sa većim afinitetom nego za divlji tip C5 pri kiselom pH).
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo prema predmetnom pronalasku se vezuje za C5 iz više od jedne vrste. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 čoveka i životinje koja nije čovek. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 čoveka i majmuna (npr. makaki rakojeda, rezus makakija, marmozeta, šimpanze ili pavijana).
U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela koja inhibiraju aktivaciju C5. U određenim realizacijama, stavljena su na uvid anti-C5 antitela koja sprečavaju cepanje C5 da bi se formirali C5a i C5b, čime se sprečava stvaranje anafilatoksične aktivnosti povezane sa C5a, kao i sprečavanje sklapanja C5b-9 kompleksa koji napada membranu (MAC) povezanog sa C5b. U određenim realizacijama, obezbeđena su anti-C5 antitela koja blokiraju konverziju C5 u C5a i C5b pomoću C5 konvertaze. U određenim realizacijama, obezbeđena su anti-C5 antitela koja blokiraju pristup C5 konvertazi mestu cepanja na C5. U određenim realizacijama, stavljena su na uvid anti-C5 antitela koja blokiraju hemolitičku aktivnost izazvanu aktivacijom C5. U daljim realizacijama, anti-C5 antitela prema predmetnom pronalasku inhibiraju aktivaciju C5 preko klasičnog puta i/ili alternativnog puta.
U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela koja inhibiraju aktivaciju C5 varijante. C5 varijanta označava genetsku varijantu C5 koja je posledica genetske varijacije kao što je mutacija, polimorfizam ili alelna varijacija. Genetska varijacija može da obuhvata deleciju, supstituciju ili umetanje jednog ili više nukleotida. C5 varijanta može da sadrži jednu ili više genetskih varijacija C5. U određenim realizacijama, varijanta C5 ima biološku aktivnost sličnu divljem tipu C5. Takva C5 varijanta može da sadrži najmanje jednu varijaciju izabranu iz grupe koju čine V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D. Ovde, R885H, na primer, označava genetsku varijaciju gde je arginin na poziciji 885 supstituisan histidinom. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska inhibira aktivaciju i divljeg tipa C5 i najmanje jedne C5 varijante izabrane iz grupe koju čine V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437.
U jednoj realizaciji pronalaska, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu SEQ ID NO: 111.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska sadrži VH i VL kao u bilo kojoj od gore navedenih realizacija i konstantni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 114. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska obuhvata VH i VL kao u bilo kojoj od gore navedenih realizacija i konstantni region lakog lanca koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 38.
U drugoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-C5 antitelo dato ovde. Na primer, u određenim realizacijama, stavljeno je na uvid antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antitelo opisano u Tabeli 2. Kao što je pokazano u radnim primerima u daljem tekstu, sva anti-C5 antitela opisana u Tabeli 2 su grupisana u istu grupu (bin) za epitope C5 i pokazuju karakteristike vezivanja zavisne od pH.
U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antitelo dato ovde. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antitelo opisano u Tabelama 7 ili 8. U određenim realizacijama, stavljeno je na uvid antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od amino-kiselina 33-124 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40). U određenim realizacijama, stavljeno je na uvid antitelo koje se vezuje za epitop unutar beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40) koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz grupe koju čine aminokiseline 47-57, 70-76 i 107 -110. U određenim realizacijama, stavljeno je na uvid antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40) koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koju čine Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 i His110. U još jednoj realizaciji, epitop anti-C5 antitela prema predmetnom pronalasku je konformacioni epitop.
U daljem aspektu pronalaska, anti-C5 antitelo prema bilo kojoj od gore navedenih realizacija je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednoj realizaciji, anti-C5 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, diatelo ili F(ab’)2fragment. U drugoj realizaciji, antitelo je IgG1 antitelo pune dužine.
U daljem aspektu, anti-C5 antitelo prema bilo kojoj od gore navedenih realizacija može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-7 u daljem tekstu:
1. Afinitet antitela
U određenim realizacijama, ovde stavljeno na uvid antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) od 1 mikro M ili manju, 100 nM ili manju, 10 nM ili manju, 1 nM ili manju, 0,1 nM ili manju, 0,01 nM ili manju, ili 0,001 nM ili manju (npr.10<-8>M ili manju, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, na primer, od 10<-9>M do 10<-13>M).
U jednoj realizaciji, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA). U jednoj realizaciji, RIA se izvodi sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja rastvora Fabs za antigen se meri ekvilibracijom Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče obložene anti-Fab antitelom (videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Da bi se uspostavili uslovi za test, ploče sa više ležišta MICROTITER (registrovani žig) (Thermo Scientific) su obložene preko noći sa 5 mikro g/ml antiFab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (pH 9.6), a zatim blokirane sa 2% (w/v) goveđeg serumskog albumina u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23 stepena C). U neadsorbentnoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena se meša sa serijskim razblaženjima Fab-a od interesa (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, kod Presta et al., Cancer Res.57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija se može nastaviti tokom dužeg perioda (npr. oko 65 sati) kako bi se osiguralo postizanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor je zatim uklonjen i ploča je isprana osam puta sa 0,1% polisorbatom 20 (TWEEN-20 (registrovani žig)) u PBS. Kada se ploče osuše, 150 mikro l/ležištu scintilansa (MICROSCINT-20<™>; Packard) se dodaje, a ploče se prebrojavaju na TOPCOUNT<™>gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab-a koje daju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su izabrane za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.
Prema drugoj realizaciji, Kd se meri korišćenjem BIACORE (registrovani žig) testa rezonancije površinskog plazmona. Na primer, test koji koristi BIACORE (registrovani žig)-2000 ili BIACORE (registrovani žig)-3000 (BIACORE (registrovani žig), Inc., Piskatavej, NDž) se izvodi na 25 stepeni C sa imobilisanim antigen CM5 čipovima na ~ 10 jedinica odgovora (RU). U jednoj realizaciji, biosenzorski čipovi karboksimetilovanog dekstrana (CM5, BIACORE (registrovani žig), Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstva dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, pH 4.8, do 5 mikro g/ml (~0,2 mikro M) pre ubrzigavanja pri brzini protoka od 5 mikro l/min da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, 1 M etanolamin se ubrizgava da blokira neizreagovane grupe. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) se ubrizgavaju u PBS sa 0,05% polisorbatnog 20 (TWEEN-20<™>) surfaktanta (PBST) na 25 stepeni C pri brzini protoka od približno 25 mikro l/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) se izračunavaju korišćenjem jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja jedan-na-jedan (BIACORE (registrovani žig) Evaluation Software, verzija 3.2) istovremenim prilagođavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Konstanta disocijacije ravnoteže (Kd) se izračunava kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako on stopa prelazi 10<6>M<-1>s<-1>gornjim testom rezonancije površinskog plazmona, tada se on stopa može odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescencije koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm propusni opseg) na 25 stepeni C, 20 nM antiantigen antitela (Fab oblik) u PBS, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen zaustavnim protokom (Aviv Instruments) ili SLM-AMINCO<™>spektrofotometar serije 8000 (ThermoSpectronic) sa kivetom za mešanje.
2. Fragmenti antitela
U određenim realizacijama, ovde stavljeno na uvid antitelo je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente i druge fragmente opisane u daljem tekstu. Za pregled određenih fragmenata antitela, pogledajte Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003). Za pregled scFv fragmenata, pogledajte, npr. Pluckthun, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, Njujork), str.269-315 (1994); takođe videti WO 93/16185; i US Patente br.5,571,894 i 5,587,458. Za diskusiju o Fab i F(ab’)2fragmentima koji sadrže ostatke epitopa koji vezuju receptor za spasavanje i imaju produženi poluživot in vivo, videti US Patent br.5,869,046.
Diatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže ceo ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili ceo ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. U određenim realizacijama, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Valtam, MA; videti, npr. US Patent br.6,248,516 B1).
Fragmenti antitela se mogu napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteolitičku digestiju intaktnog antitela, kao i proizvodnju od strane rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U određenim realizacijama, ovde stavljeno na uvid antitelo je himerno antitelo. Određena himerna antitela su opisana u npr. US Patentu br.4,816,567; i kod Morrison et al., Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region izveden od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo „promenjene klase” u kome je klasa ili podklasa promenjena u odnosu onu roditeljskog antitela. Himerna antitela uključuju njihove fragmente koji se vezuju za antigen.
U određenim realizacijama, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Obično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, uz zadržavanje specifičnosti i afiniteta roditeljskog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo obuhvata jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR, npr. CDR, (ili njihovi delovi) izvedeni iz nehumanog antitela, a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono će takođe da sadrži barem deo humanog konstantnog regiona. U nekim realizacijama, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima iz nehumanog antitela (npr. antitela iz kojeg su izvedeni ostaci HVR), na primer, da bi se obnovila ili poboljšala specifičnost ili afinitet antitela.
Humanizovana antitela i postupci njihovog pravljenja su razmatrani, npr. u Almagro i Franson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr. u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patenti br.
5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (koji opisuje kalemljenje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (koji opisuje „ugradnju”); Dall’Ackua et al., Methods 36:43-60 (2005) (opisuje „FR mešanje”); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka i dr., Br. J. Cancer 83:252-260 (2000) (koji opisuje pristup „vođene selekcije” FR mešanju).
Humani okvirni regioni koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: okvirne regione odabrane metodom „najboljeg uklapanja” (videti, npr. Sims et al., J. Immunol.
151:2296 (1993)); okvirne regione izvedene iz konsenzusne sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr. Carter et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 89:4285 (1992); i Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili okvirne regione humane zametne linije (videti, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione izvedene iz skrininga FR biblioteka (videti, npr. Baca et al., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Humana antitela
U određenim realizacijama, ovde stavljeno na uvid antitelo je humano antitelo. Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u stanju tehnike. Humana antitela su generalno opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharma.5:368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Humana antitela se mogu pripremiti davanjem imunogena transgenskoj životinji koja je modifikovana da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje obično sadrže ceo ili deo lokusa humanog imunoglobulina, koji zamenjuju endogene lokuse imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u hromozome životinje. Kod takvih transgenih miševa, endogeni lokusi imunoglobulina su generalno inaktivirani. Za pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja, videti Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Videti, takođe, npr. US Patente br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE<™>tehnologiju; US Patent br. 5,770,429 koji opisuje HUMAB (registrovani žig) tehnologiju; US Patent br. 7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE (registrovani žig) tehnologiju, i Publikaciju prijave patenta u SAD br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE (registrovani žig). Humani varijabilni regioni iz intaktnih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, na primer, kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela se, takođe, mogu napraviti postupcima zasnovanim na hibridomima. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i heteromijeloma miša i čoveka za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Videti, npr. Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str.51-63 (Dekker, Inc., Nјujork, 1987); i Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991).) Humana antitela generisana tehnologijom hibridoma humanih B-ćelija su, takođe, opisana u Li et al., Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u US Patentu br.7,189,826 (koji opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz hibridomskih ćelijskih linija) i Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006) (opisivanje hibridoma čovek-čovek). Tehnologija humanog hibridoma (Trioma tehnologija) je, takođe, opisana u Vollmers, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) i Vollmers, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191 (2005).
Humana antitela, takođe, mogu da se generišu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena klona Fv izabranih iz biblioteka za prikaz faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena se zatim mogu kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za odabir humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u daljem tekstu.
5. Antitela izvedena iz biblioteke
Antitela pronalaska mogu biti izolovana skriningom kombinatornih biblioteka na antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u tehnici su poznati različiti postupci za generisanje biblioteka za prikaz faga i skrining takvih biblioteka za antitela koja poseduju željene karakteristike vezivanja. Takve metode su razmatrane u npr. Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i dalje opisani u, npr. McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks, Meth.Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004).
U određenim postupcima prikaza faga, repertoari VH i VL gena se odvojeno kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i nasumično rekombinuju u bibliotekama faga, koje se zatim mogu pregledati na fage koji vezuju antigen kao što je opisano u Winter et al., Ann. Rev. Immunol.
12:433-455 (1994). Fag obično prikazuje fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora obezbeđuju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može da se klonira (npr. od čoveka) da bi se obezbedio jedan izvor antitela na širok spektar nesopstvenih i takođe sopstvenih antigena bez ikakve imunizacije kako je opisano u Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Konačno, naivne biblioteke se, takođe, mogu napraviti sintetički kloniranjem nepreuređenih V-genskih segmenata iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preuređenja in vitro, kao što je opisano u Hoogenboom, J. Mol. Biol.227:381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br.
5,750,373, i US publikacije br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humani antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
U određenim realizacijama, ovde stavljeno na uvid antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim realizacijama, jedna od specifičnosti vezivanja je za C5, a druga za bilo koji drugi antigen. U određenim realizacijama, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa C5. Bispecifična antitela takođe mogu da se koriste za lokalizaciju citotoksičnih sredstava na ćelije koje eksprimuju C5. Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela.
Tehnike za pravljenje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva para teški lanac-laki lanac imunoglobulina koja imaju različite specifičnosti (videti Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.
10:3655 (1991)), i inženjering „knob-in-hole” (videti, npr. US Patent br. 5,731,168). Multispecifična antitela se, takođe, mogu napraviti inženjeringom elektrostatičkih efekata upravljanja za pravljenje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); unakrsnim povezivanjem dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr. US Patent br.4,676,980, i Brennan et al., Science 229:81 (1985)); korišćenjem leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992).)); korišćenjem tehnologije „diatela” za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela (videti, npr Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (scFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kako je opisano, npr. u Tutt et al., J. Immunol.147:60 (1991).
Konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „hobotnica antitela”, takođe su uključena ovde (videti, npr. US 2006/0025576).
Antitelo ili fragment ovde, takođe, uključuje „FAb sa dvostrukim dejstvom” ili „DAF” koji sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za C5 kao i drugi, drugačiji antigen (videti, US 2008/0069820, na primer).
7. Varijante antitela
U određenim realizacijama, razmatrane su varijante sekvence amino-kiselina ovde stavljenih na uvid antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante sekvence amino-kiselina antitela mogu biti pripremljene uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili sintezom peptida. Takve modifikacije obuhvataju, na primer, delecije iz, i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar sekvenci amino-kiselina antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije može da se napravi da bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike, na primer, vezivanje antigena.
a. Varijante supstitucije, insercije i delecije
U određenim realizacijama, obezbeđene su varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija amino-kiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Značajnije promene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primerne supstitucije” i kao što je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama bočnih lanaca amino-kiselina. Supstitucije amino-kiselina mogu biti uvedene u antitelo od interesa i proizvodi se skeniraju na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšani ADCC ili CDC.
[Tabela 1]
Amino-kiseline se mogu grupisati prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) kiseli: Asp, Glu; (4) osnovni: His, Lys, Arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i (6) aromatični: Trp, Tiy, Phe.
Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
Jedna vrsta supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuća varijanta(e) odabrane za dalju studiju će imati modifikacije (npr. poboljšanja) u određenim biološkim svojstvima (npr. povećan afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na roditeljsko antitelo i/ili će u značajnoj meri zadržati određena biološka svojstva roditeljskog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje se može pogodno generisati, npr. korišćenjem tehnika sazrevanja afiniteta zasnovanih na prikazu faga, kao što su one koje su ovde opisane. Ukratko, jedan ili više ostataka HVR su mutirani i varijanta antitela su prikazana na fagu i testirana na određenu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja).
Promene (npr. supstitucije) se mogu napraviti u HVR, npr. da bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene se mogu napraviti na HVR „vrućim tačkama”, tj. ostacima kodiranim kodonima koji prolaze kroz mutaciju na visokoj frekvenciji tokom procesa somatskog sazrevanja (videti, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili ostaci koji dolaze u kontakt sa antigenom, pri čemu se dobijena varijanta VH ili VL testira na afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr. kod Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001). U nekim realizacijama sazrevanja afiniteta, raznolikost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje bilo kojim od niza postupaka (npr. PCR sklon greškama, mešanje lanca ili mutageneza usmerena na oligonukleotide). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pregleda da bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznolikosti uključuje pristupe usmerene na HVR, u kojima je nekoliko HVR ostataka (npr. 4-6 ostataka istovremeno) randomizovano. Ostaci HVR uključeni u vezivanje antigena mogu se specifično identifikovati, na primer, korišćenjem alanin skenirajuće mutageneze ili modelovanja. Često su ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
U određenim realizacijama, supstitucije, insercije ili delecije se mogu javiti unutar jednog ili više HVR-a sve dok takve promene ne smanjuju značajno sposobnost antitela da veže antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne smanjuju u suštini afinitet vezivanja mogu se napraviti u HVR. Takve promene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji kontaktiraju antigen u HVR. U određenim realizacijama varijanti VH i VL sekvenci koje su gore date, svaka HVR ili je nepromenjena ili ne sadrži više od jedne, dve ili tri aminokiselinske supstitucije.
Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu naziva se „skenirajuća alaninska mutageneza” kako je opisano u Cunningham, Science 244:1081-1085 (1989). U ovoj metodi, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom amino-kiselinom (npr. alanin ili polialanin) da bi se odredilo da li je pogođena interakcija antitela sa antigenom. Dalje supstitucije se mogu uvesti na lokacijama amino-kiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo za identifikaciju kontaktnih tačaka između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
Insercije sekvence amino-kiselina uključuju fuzije amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije u rasponu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvenciona umetanja pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge insercione varijante molekula antitela uključuju fuziju sa Nor C-krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom koji povećava poluživot antitela u serumu.
b. Varijante glikozilacije
U određenim realizacijama, ovde stavljeno na uvid antitelo se menja da bi se povećao ili smanjio stepen do kojeg je antitelo glikozilovano. Adicija ili delecija glikozilacionih mesta na antitelo može se pogodno postići izmenom sekvence amino-kiselina tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
Tamo gde antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrat vezan za njega može biti izmenjen. Nativna antitela proizvedena u ćelijama sisara obično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti, npr. Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da uključuje različite ugljene hidrate, na primer, manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u „stablu” biantenarne strukture oligosaharida. U nekim realizacijama, modifikacije oligosaharida u antitelu pronalaska mogu da se naprave da bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
U jednoj realizaciji, stavljene su na uvid javnosti varijante antitela koje imaju strukturu ugljenih hidrata kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze unutar lanca šećera na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr. kompleksne, hibridne i visoko manozne strukture) mereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, kako je opisano u WO 2008/077546, na primer. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi na približno poziciji 297 u Fc regionu (Eu numerisanje ostataka Fc regiona); međutim, Asn297, takođe, može biti lociran oko /- 3 amino-kiseline uzvodno ili nizvodno od pozicije 297, tj. između pozicija 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvence u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu imati poboljšanu ADCC funkciju. Videti, npr. US patentne publikacije br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija u vezi sa „defukozilovanim” ili „deficijentnim fukozom” varijantama antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng.
87:614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije sa nedostatkom fukozilacije proteina (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys.
249:533-545 (1986); US 2003/0157108, Presta, L; i WO 2004/056312, Adams et al., posebno u Primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokautirajuće CHO ćelije (videti, npr. Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng.94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante antitela su dalje stavljene na uvid javnosti sa oligosaharidima podeljenim na pola, na primer, u kojima je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela podeljen na pola pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patentu br. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu imati poboljšanu funkciju CDC. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Varijante Fc regiona
U određenim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina mogu biti uvedene u Fc region ovde stavljenog na uvid antitela, čime se generiše varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koja sadrži aminokiselinsku modifikaciju (npr. supstituciju) na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija.
U određenim realizacijama, pronalazak razmatra varijantu antitela koja poseduje neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za aplikacije u kojima je poluživot antitela in vivo važan, ali određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC) su nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti da bi se potvrdilo smanjenje/deplecija aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) se mogu sprovesti da bi se osiguralo da antitelu nedostaje Fc gama R vezivanje (dakle, da verovatno nema ADCC aktivnost), ali da zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimuju samo Fc gama RIII, dok monociti eksprimuju Fc gama RI, Fc gama RII i Fc gama RIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je sumirana u tabeli 3 na strani 464. Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa su opisani u US Patentu br. 5,500,362 (videti, npr. Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); US Pat. br.
5,821,337 (videti Bruggemann et al., J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivne metode ispitivanja (videti, na primer, ACT1<™>test neradioaktivne citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96 (registrovani žig) test neradioaktivne citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr. na životinjskom modelu kao što je onaj koji je stavljen na uvid javnosti u Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja za C1q se takođe mogu sprovesti da bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da veže C1q i da stoga nema CDC aktivnost. Videti, na primer, C1k i C3c vezujući ELISA u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). Određivanje vezivanja FcRn i in vivo klirensa/poluživota se, takođe, može izvesti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici (videti, npr. Petkova et al., Int’l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više pozicija amino-kiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa zamenom ostataka 265 i 297 u alanin (US Patent br.7,332,581).
Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Videti, npr. US Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).)
U određenim realizacijama, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucijama na pozicijama 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numerisanje ostataka).
U nekim realizacijama, alternacije se prave u Fc regionu koje rezultiraju izmenjenim (tj. poboljšanim ili smanjenim) C1q vezivanjem i/ili citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), npr. kao što je opisano u US Patentu br. 6,194,551, WO 1999/51642, i Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), opisani su u US2005/0014934 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija u njemu koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucijama ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).
Takođe, videti Dankan, Nature 322:738-40 (1988); US Patent br.5,648,260; US Patent br.
5,624,821; i WO 1994/29351 što se tiče drugih primera varijanti Fc regiona.
d. Cistein konstruisane varijante antitela
U određenim realizacijama, može biti poželjno da se stvore cistein konstruisana antitela, npr. „thioMAbs”, u kojima su jedan ili više ostataka antitela supstituisani sa cisteinskim ostacima. U posebnim realizacijama, supstituisani ostaci se javljaju na dostupnim mestima antitela. Zamenom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiol grupe se na taj način postavljaju na pristupačna mesta antitela i mogu se koristiti za konjugaciju antitela sa drugim delovima, kao što su delovi leka ili linker delovi leka, da bi se stvorio imunokonjugat, kao što je opisano u daljem tekstu. U određenim realizacijama, bilo koji jedan ili više od sledećih ostataka može biti zamenjen cisteinom: V205 (Kabat numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela kreirana cisteinom mogu se generisati kako je opisano, npr. US Patentu br.7,521,541.
e. Derivati antitela
U određenim realizacijama, ovde stavljeno na uvid antitelo može biti dalje modifikovano da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u tehnici i lako dostupni. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola / propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliamino-kiseline (bilo homopolimeri ili nasumični kopolimeri) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, polipropilen glikol homopolimer, polipropilen oksid / etilen oksidni kopolimeri, polioksietilovani polioli (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira, a ako je vezano više od jednog polimera, oni mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili tip polimera koji se koriste za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja uključujući, ali ne ograničavajući se na, posebne osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U još jednoj realizaciji, obezbeđeni su konjugati antitela i neproteinskog dela koji se mogu selektivno zagrejati izlaganjem zračenju. U jednoj realizaciji, neproteinski deo je ugljenična nanocev (Kam et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali nije ograničeno na, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski deo do temperature na kojoj se ubijaju ćelije proksimalne do neproteinskog dela antitela.
B. Rekombinantni postupci i kompozicije
Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr. kao što je opisano u US Patentu br. 4,816,567. U jednoj realizaciji, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-C5 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu SEQ ID NO: 111 ovde opisanu. U daljoj realizaciji, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljoj realizaciji, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednoj takvoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži (npr. transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu amino-kiselina koja sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i sekvencu amino-kiselina koja sadrži VL sekvencu SEQ ID NO: 111, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu amino-kiselina koja sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu amino-kiselina koji sadrži VL sekvencu SEQ ID NO: 111. U jednoj realizaciji, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. I0, NS0, Sp20 ćelija). U jednoj realizaciji, obezbeđen je postupak za pravljenje anti-C5 antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što je gore navedeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela, i opciono dobijanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za kulturu ćelije domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju anti-C5 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, na primer, kao što je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvoditi u bakterijama, posebno kada glikozilacija i Fc efektorska funkcija nisu potrebne. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti, npr. US Patente br.5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (Takođe, videti Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str.245-254, koji opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E.
coli.) Nakon ekspresije, antitelo može biti izolovano iz paste bakterijske ćelije u rastvorljivoj frakciji i može se dalje prečistiti.
Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljivice ili kvasac su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitela, uključujući sojeve gljivica i kvasca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do proizvodnje antitela sa delimičnim ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Videti Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), i Li et al., Nat. Biotech.24: 210-215 (2006).
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su, takođe, izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi koji se mogu koristiti u sprezi sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr. US Patente br.
5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 (koji opisuju PLANTIBODIES<™>tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Na primer, ćelijske linije sisara koje su prilagođene da rastu u suspenziji mogu biti korisne. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije kako je opisano, npr. u Graham et al., J. Gen Virol.
36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK); mišje sertoli ćelije (TM4 ćelije kao što je opisano, npr. u Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA); ćelije bubrega pasa (MDCK; ćelije jetre bivoljeg pacova (BRL 3A); humane ćelije pluća (W138); humane ćelije jetre (Hep G2); tumor dojke kod miša (MMT 060562); TRI ćelije, kao što je opisano, npr. u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, pogledajte, npr. Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).
Poliklonska antitela se poželjno uzgajaju kod životinja višestrukim supkutanim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama relevantnog antigena i adjuvansa. Može biti korisno konjugovati relevantni antigen sa proteinom koji je imunogen za vrstu koja se imunizuje, na primer, hemacijanin iz puža priljepka ključaonice, serumski albumin, goveđi tiroglobulin ili inhibitor sojinog tripsina koji koristi bifunkcionalno ili derivatizujuće sredstvo, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimid (preko lizinskih ostataka), glutaraldehid, sukcinski anhidrid, SOCl2, ili R<1>N=C=NR, gde su R i R<1>su različite alkil grupe.
Životinje (obično nehumani sisari) se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombinovanjem, npr. 100 mikro g ili 5 mikro g proteina ili konjugata (za zečeve ili miševe, tim redosledom) sa 3 zapremine kompletnog Frojndovog adjuvansa i ubrizgavanjem rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije životinjama se daje 1/5 do 1/10 prvobitne količine peptida ili konjugata u Frojndovom kompletnom adjuvansu supkutanom injekcijom na više mesta. Sedam do 14 dana kasnije životinjama se uzima krv i serum se ispituje na titar antitela. Životinje se stimulišu do platoa titra. Poželjno, životinja se bustuje sa konjugatom istog antigena, ali konjugovaniom sa drugim proteinom i/ili preko drugog reagensa za unakrsno povezivanje. Konjugati se, takođe, mogu napraviti u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao proteinske fuzije. Takođe, sredstva za agregaciju kao što je stipsa se prikladno koriste za poboljšanje imunološkog odgovora.
Monoklonska antitela se dobijaju iz populacije u suštini homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija i/ili post-translacionih modifikacija (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Prema tome, modifikator „monoklonski” ukazuje na karakter antitela takav da nije mešavina diskretnih antitela.
Na primer, monoklonska antitela se mogu napraviti korišćenjem hibridomskog postupka koji je prvi opisao od Kohler et al. Nature 256(5517):495-497 (1975). U hibridomskom postupku, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, se imunizuje kao što je gore opisano da bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro.
Imunizujuće sredstvo će obično uključivati antigeni protein ili njegovu fuzionu varijantu. Generalno se koriste ili limfociti periferne krvi (PBLs) ako su željene ćelije humanog porekla, ili ćelije slezine ili ćelije limfnih čvorova ako se žele nehumani sisari kao izvor. Limfociti se zatim spajaju sa besmrtnom ćelijskom linijom korišćenjem odgovarajućeg fuzionog sredstva, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala ćelija hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), str.59-103).
Besmrtne ćelijske linije su obično transformisane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma glodarskog, goveđeg i humanog porekla. Obično se koriste ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Tako pripremljene ćelije hibridoma se zaseju i uzgajaju u pogodnom medijumu za kulturu koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljskim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin gvanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medijum za kulturu hibridoma će obično uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), koji su supstance koje sprečavaju rast ćelija sa nedostatkom HGPRT.
Poželjne besmrtne ćelije mijeloma su one koje se efikasno fuzionišu, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela na visokom nivou od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela, i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Među njima, poželjne su linije mijeloma miša, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 tumora miša koje su dostupne kod Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornija SAD, i SP-2 ćelije (i njihovi derivati, npr. X63-Ag8-653) dostupne u American Type Culture Collection, Manasas, Virdžinija, SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i heteromijeloma miša i čoveka takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor et al., J Immunol.133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nјujork (1987), str.51-63).
Podloga za kulturu u kojoj rastu ćelije hibridoma se ispituje za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena. Poželjno je da se specifičnost vezivanja monoklonskih antitela proizvedenih od strane hibridomskih ćelija određuje imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili enzimski imunosorbentni testovi (ELISA). Takve tehnike i testovi su poznati u tehnici. Na primer, afinitet vezivanja se može odrediti pomoću Scatchard analiza Munsona, Anal Biochem.107(1):220-239 (1980).).
Nakon što se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti supklonirani postupcima ograničavanja razblaživanja i uzgajani standardnim metodama (Goding, supra). Pogodni medijumi za kulturu za ovu svrhu uključuju, na primer, medijum D-MEM ili RPMI-1640. Pored toga, ćelije hibridoma mogu da se uzgajaju in vivo kao tumori kod sisara.
Monoklonska antitela koja luče supklonovi su na odgovarajući način odvojena od medijuma kulture, ascitne tečnosti ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, protein A-sefaroza, hidroksiapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
Antitela se mogu proizvesti imunizacijom odgovarajuće životinje domaćina protiv antigena. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži C5 pune dužine. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži beta lanac (SEQ ID NO: 40) C5. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži MG1-MG2 domen (SEQ ID NO: 43) beta lanca C5. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži MG1 domen (SEQ ID NO: 41) beta lanca C5. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži region koji odgovara amino-kiselinama na pozicijama od 19 do 180 beta lanca C5. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži region koji odgovara aminokiselinama na pozicijama 33 do 124 beta lanca C5. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz amino-kiselina 47-57, 70-76 i 107-110 beta lanca (SEQ ID NO: 40) od C5. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži fragment beta lanca C5 koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koju čine Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71 , His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 i His110. U jednoj realizaciji, antigen je polipeptid koji sadrži fragment beta lanca C5 koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110. U predmetni pronalazak su, takođe, uključena antitela proizvedena imunizacijom životinje protiv antigena. Antitela mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano gore u „Primeru anti-C5 antitela”.
C. Testovi
Anti-C5 antitela koja su ovde data mogu se identifikovati, podvrgnuti skrining ili naznačiti (okarakterisati) po njihovim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkim aktivnostima različitim testovima poznatim u tehnici.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednoj realizaciji, antitelo pronalaska se testira na njegovu aktivnost vezivanja antigena, na primer, poznatim metodama kao što su ELISA, Western blot, BIACORE (registrovani žig), itd.
U drugoj realizaciji, testovi konkurencije se mogu koristiti za identifikaciju antitela koje se takmiči za vezivanje za C5 sa anti-C5 antitelom ovde opisanim. U određenim realizacijama, kada je takvo konkurentsko antitelo prisutno u višku, ono blokira (npr. smanjuje) vezivanje referentnog antitela za C5 za najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili više. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili više. U određenim realizacijama, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) koji je vezan za anti-C5 antitelo opisano ovde (npr. anti-C5 antitelo opisano u Tabeli 2). Dati su detaljni primeri metoda za mapiranje epitopa za koji se antitelo vezuje u Morris, „Epitope Mapping Protocols”, u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totova, Nј) (1996).
U primernom testu konkurencije, imobilisani C5 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo (referentno) antitelo koje se vezuje za C5 i drugo neobeleženo antitelo koje se testira na njegovu sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za C5. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani C5 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Posle inkubacije u uslovima koji dozvoljavaju vezivanje prvog antitela za C5, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina oznaka povezanih sa imobilisanim C5. Ako je količina oznaka povezanih sa imobilisanim C5 značajno smanjena u test uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, onda to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za C5. Videti, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1988).
U drugom primernom testu konkurencije, BIACORE (registrovani žig) analiza se koristi za određivanje sposobnosti testnog anti-C5 antitela da se takmiči sa vezivanjem za C5 pomoću drugog (referentnog) anti-C5 antitela. U daljem aspektu u kojem BIACORE (registrovani žig) instrument (na primer, BIACORE (registrovani žig) 3000) radi u skladu sa preporukama proizvođača, C5 protein se hvata na CM5 BIACORE (registrovani žig) čip koristeći standardnu tehniku poznatu u tehnici da stvara površinu obloženu C5. Tipično 200-800 rezonantnih jedinica C5 bi bilo spojeno na čip (količina koja daje lako merljive nivoe vezivanja, ali koja se lako može zasititi koncentracijama testnih antitela koja se koriste). Dva antitela (tj. test i referentno antitelo) za procenu njihove sposobnosti da se takmiče jedno sa drugim se mešaju u molarnom odnosu 1:1 mesta vezivanja u odgovarajućem puferu da bi se stvorila test smeša. Kada se izračunavaju koncentracije na osnovu mesta vezivanja, pretpostavlja se da je molekulska težina testnog ili referentnog antitela ukupna molekulska težina odgovarajućeg antitela podeljena brojem C5-vezujućih mesta na antitelu. Koncentracija svakog antitela (tj. testnog i referentnog antitela) u test smeši treba da bude dovoljno visoka da lako zasiti mesta vezivanja za to antitelo na molekulima C5 uhvaćenim na BIACORE (registrovani žig) čipu. Testna i referentna antitela u smeši su u istoj molarnoj koncentraciji (na osnovu vezivanja), tipično između 1,00 i 1,5 mikromola (na osnovu mesta vezivanja). Takođe se pripremaju odvojeni rastvori koji sadrže samo testno antitelo i samo referentno antitelo. Testno antitelo i referentno antitelo u ovim rastvorima treba da budu u istom puferu i u istoj koncentraciji i uslovima kao u test smeši. Test smeša koja sadrži testno antitelo i referentno antitelo se prenosi preko C5 obloženog BIACORE (registrovani žig) čipa i beleži se ukupna količina vezivanja. Čip se zatim tretira na takav način da se ukloni vezano testno ili referentno antitelo bez oštećenja C5 vezanog za čip. Obično se to radi tretiranjem čipa sa 30 mM HC1 tokom 60 sekundi. Rastvor samog testnog antitela se zatim prenosi preko površine obložene C5 i beleži se količina vezivanja. Čip se ponovo tretira kako bi se uklonila sva vezana antitela bez oštećenja C5 vezanog za čip. Sam rastvor referentnog antitela se zatim prenosi preko površine obložene C5 i beleži se količina vezivanja. Zatim se izračunava maksimalno teorijsko vezivanje smeše testnog antitela i referentnog antitela, i to predstavlja zbir vezivanja svakog antitela (tj. testog i referentnog) kada se pređe samo preko površine C5. Ako je stvarno zabeleženo vezivanje smeše manje od ovog teoretskog maksimuma, tada se testno antitelo i referentno antitelo takmiče jedno sa drugim za vezivanje C5. Dakle, generalno, konkurentsko testno anti-C5 antitelo je ono koje će se vezati za C5 u gore navedenom BIACORE (registrovani žig) testu blokiranja tako da tokom testa i u prisustvu referentnog anti-C5 antitela zabeleženo vezivanje bude između 80% i 0,1% (npr. 80% > do 4%) od maksimalnog teoretskog vezivanja, konkretno između 75% i 0,1% (npr. 75% do 4%) od maksimalnog teoretskog vezivanja, a tačnije između 70% i 0,1% (npr.70% do 4%) maksimalnog teoretskog vezivanja (kao što je gore definisano) testnog antitela i referentnog antitela u kombinaciji.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par izabran iz antitela CFA0341 i CFA0330. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom izabranim iz: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 i CFA0672. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom CFA0329. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom CFA0666.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par antitela CFA0305 ili 305LO5.
U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par izabran iz: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 i CFA0672. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom CFA0666. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par antitela CFA0305 ili 305LO5. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran iz VH SEQ ID NO:22 i VL SEQ ID NO:26, ili VH SEQ ID NO:21 i VL SEQ ID NO:25. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran iz: (a) VH SEQ ID NO: 5 i VL SEQ ID NO: 15; (b) VH SEQ ID NO: 4 i VL SEQ ID NO: 14; (c) VH SEQ ID NO:6 i VL SEQ ID NO:16; (d) VH SEQ ID NO:2 i VL SEQ ID NO:12; (e) VH SEQ ID NO: 3 i VL SEQ ID NO: 13; (f) VH SEQ ID NO: 1 i VL SEQ ID NO: 11; (g) VH SEQ ID NO:9 i VL SEQ ID NO:19; (h) VH SEQ ID NO:7 i VL SEQ ID NO:17; i (i) VH SEQ ID NO:8 i VL SEQ ID NO:18. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH SEQ ID NO:23 i VL SEQ ID NO:27. U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH SEQ ID NO:7 i VL SEQ ID NO:17.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran iz: (a) VH SEQ ID NO:1 i VL SEQ ID NO:11; (b) VH SEQ ID NO: 22 i VL SEQ ID NO: 26; (c) VH SEQ ID NO:21 i VL SEQ ID NO:25; (d) VH SEQ ID NO: 5 i VL SEQ ID NO: 15; (e) VH SEQ ID NO:4 i VL SEQ ID NO:14; (f) VH SEQ ID NO: 6 i VL SEQ ID NO: 16; (g) VH SEQ ID NO:2 i VL SEQ ID NO:12; (h) VH SEQ ID NO: 3 i VL SEQ ID NO: 13; (i) VH SEQ ID NO:9 i VL SEQ ID NO:19; (j) VH SEQ ID NO: 7 i VL SEQ ID NO: 17; (k) VH SEQ ID NO:8 i VL SEQ ID NO:18; (l) VH SEQ ID NO: 23 i VL SEQ ID NO: 27; i (m) VH SEQ ID NO:10 i VL SEQ ID NO:20.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran iz: (a) VH SEQ ID NO: 22 i VL SEQ ID NO: 26; (b) VH SEQ ID NO:21 i VL SEQ ID NO:25; (c) VH SEQ ID NO: 5 i VL SEQ ID NO: 15; (d) VH SEQ ID NON i VL SEQ ID NO:14; (e) VH SEQ ID NO: 6 i VL SEQ ID NO: 16; (f) VH SEQ ID NO:2 i VL SEQ ID NO:12; (g) VH SEQ ID NO: 3 i VL SEQ ID NO: 13; (h) VH SEQ ID NO:9 i VL SEQ ID NO:19; (i) VH SEQ ID NO: 7 i VL SEQ ID NO: 17; (j) VH SEQ ID NO:8 i VL SEQ ID NO:18; (k) VH SEQ ID NO: 23 i VL SEQ ID NO: 27.
U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran iz VH SEQ ID NO:1 i VL SEQ ID NO:11, ili VH od SEQ ID NO:10 i VL SEQ ID NO:20.
U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH i takmiči se za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par izabran iz: (a) VH SEQ ID NO: 1 i VL SEQ ID NO:11; (b) VH SEQ ID NO: 5 i VL SEQ ID NO: 15; (c) VH SEQ ID NO:4 i VL SEQ ID NO:14; (d) VH SEQ ID NO: 6 i VL SEQ ID NO: 16; (e) VH SEQ ID NO:2 i VL SEQ ID NO:12; (f) VH SEQ ID NO: 3 i VL SEQ ID NO: 13; (g) VH SEQ ID NO:9 i VL SEQ ID NO:19; (h) VH SEQ ID NO: 7 i VL SEQ ID NO: 17; (i) VH SEQ ID NO:8 i VL SEQ ID NO:18; i (j) VH SEQ ID NO:10 i VL SEQ ID NO:20. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH i takmiči se za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par izabran iz: (a) VH SEQ ID NO: 5 i VL SEQ ID NO: 15; (b) VH SEQ ID NO: 4 i VL SEQ ID NO: 14; (c) VH SEQ ID NO:6 i VL SEQ ID NO:16; (d) VH SEQ ID NO:2 i VL SEQ ID NO:12; (e) VH SEQ ID NO: 3 i VL SEQ ID NO: 13; (f) VH SEQ ID NO: 1 i VL SEQ ID NO: 11; (g) VH SEQ ID NO:9 i VL SEQ ID NO:19; (h) VH SEQ ID NO: 7 i VL SEQ ID NO: 17; i (i) VH SEQ ID NO:8 i VL SEQ ID NO:18. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U nekim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom pri neutralnom pH nego pri kiselom pH i takmiči se za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par izabran iz VH SEQ ID NO:1 i VL SEQ ID NO:11, ili VH SEQ ID NO:10 i VL SEQ ID NO:20. U daljim realizacijama, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa većim afinitetom na pH 7.4 nego na pH 5.8.
U određenim realizacijama, da li se anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska vezuje za određeni epitop može se odrediti na sledeći način: mutanti C5 tačke u kojima je amino-kiselina (osim alanina) na C5 supstituisana sa alaninom su eksprimovani u 293 ćelije, i vezivanje anti-C5 antitela za C5 mutante se testira putem ELISA, Western blota ili BIACORE (registrovani žig); pri čemu značajno smanjenje ili eliminacija vezivanja anti-C5 antitela za C5 mutant u odnosu na njegovo vezivanje za divlji tip C5 ukazuje da se anti-C5 antitelo vezuje za epitop koji sadrži tu aminokiselinu na C5. U određenim realizacijama, amino-kiselina na C5 koja treba da bude supstituisana sa alaninom je izabrana iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110 beta lanca C5 (SEQ ID NO:40). U daljim realizacijama, amino-kiselina na C5 koja treba da bude supstituisana sa alaninom je Asp51 ili Lys109 beta lanca C5 (SEQ ID NO:40).
U drugoj realizaciji, da li se anti-C5 antitelo sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH vezuje za određeni epitop može se odrediti na sledeći način: eksprimovani su mutanti C5 tačke u kojima je histidinski ostatak na C5 supstituisan sa drugom amino-kiselinom (npr. tirozinom) u 293 ćelije, a vezivanje anti-C5 antitela za C5 mutante je testirano putem ELISA, Western blota ili BIACORE (registrovani žig); pri čemu značajno smanjenje vezivanja anti-C5 antitela za divlji tip C5 pri kiselom pH u odnosu na njegovo vezivanje za C5 mutant pri kiselom pH, ukazuje da se anti-C5 antitelo vezuje za epitop koji sadrži taj histidinski ostatak na C5. U daljim realizacijama, vezivanje anti-C5 antitela za divlji tip C5 pri neutralnom pH nije značajno smanjeno u odnosu na njegovo vezivanje za C5 mutant pri neutralnom pH. U određenim realizacijama, histidinski ostatak na C5 koji treba da bude supstituisan sa drugom amino-kiselinom se bira iz grupe koju čine His70, His72 i His110 beta lanca C5 (SEQ ID NO:40). U daljoj realizaciji, histidinski ostatak His70 je supstituisan sa tirozinom.
2. Testovi aktivnosti
U jednoj realizaciji, stavljeni su na uvid javnosti testovi za identifikaciju njihovih anti-C5 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, na primer, inhibiciju aktivacije C5, sprečavanje cepanja C5 da bi se formirali C5a i C5b, blokiranje pristupa C5 konvertaze mestu cepanja na C5, blokiranje hemolitičke aktivnosti izazvane aktivacijom C5, itd. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro su takođe obezbeđena.
U određenim realizacijama, antitelo prema pronalasku je testirano na takvu biološku aktivnost.
U određenim realizacijama, da li testno antitelo inhibira cepanje C5 na C5a i C5b, određuje se postupcima opisanim u, npr. Isenman et al., J Immunol. 124(1):326-331 (1980). U drugoj realizaciji, ovo se određuje metodama za specifičnu detekciju odcepljenih C5a i/ili C5b proteina, npr. ELISA ili Western blotom. Kada se detektuje smanjena količina proizvoda cepanja C5 (tj. C5a i/ili C5b) u prisustvu (ili nakon kontakta sa) testog antitela, testno antitelo se identifikuje kao antitelo koje može da inhibira cepanje C5 . U određenim realizacijama, koncentracija i/ili fiziološka aktivnost C5a mogu se meriti metodama, npr. hemotaksnim testovima, RIA ili ELISA (videti, npr. Ward and Zvaifler J. Clin. Invest.50(3):606-616 (1971)).
U određenim realizacijama, da li testno antitelo blokira pristup C5 konvertaze do C5 se određuje postupcima za detekciju proteinskih interakcija između C5 konvertaze i C5, npr. ELISA ili BIACORE (registrovani žig). Tamo gde su interakcije smanjene u prisustvu (ili nakon kontakta sa) testnog antitela, testno antitelo se identifikuje kao antitelo koje može da blokira pristup C5 konvertazi u C5.
U određenim realizacijama, aktivnost C5 se može meriti kao funkcija njegove sposobnosti lize ćelija u telesnim tečnostima subjekta. Sposobnost ćelijske lize, ili njeno smanjenje, C5 može se meriti postupcima dobro poznatim u tehnici, na primer, konvencionalnim hemolitičkim testom, kao što je test hemolize opisan od Kabat and Mayer (eds), Experimental Immunochemistry, 2nd Edition, 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), strane 135-139 ili konvencionalnom varijacijom tog testa, kao što je postupak hemolize pilećih eritrocita kao što je opisano u, npr. Hillmen et al., N. Engl. J. Med.350(6): 552-559 (2004). U određenim realizacijama, aktivnost C5, ili njena inhibicija, se kvantifikuje korišćenjem CH50eq testa. CH50eq test je postupak za merenje ukupne klasične aktivnosti komplementa u serumu. Ovaj test je litički test, koji koristi eritrocite osetljive na antitela kao aktivator klasičnog puta komplementa i različita razblaženja testnog seruma da bi se odredila količina potrebna da bi se dobila 50% liza (CH50). Procenat hemolize se može odrediti, na primer, pomoću spektrofotometra. CH50eq test pruža indirektnu meru formiranja terminalnog kompleksa komplementa (TCC), pošto su sami TCC direktno odgovorni za merenu hemolizu. Inhibicija aktivacije C5 se, takođe, može detektovati i/ili meriti korišćenjem metoda izloženih i ilustrovanih u radnim primerima. Korišćenjem testova ovih ili drugih pogodnih tipova, mogu se testirati kandidatska antitela sposobna da inhibiraju aktivaciju C5. U određenim realizacijama, inhibicija aktivacije C5 uključuje najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% ili veće smanjenje aktivacije C5 u testu u poređenju sa efektom negativne kontrole pod sličnim uslovima. U nekim realizacijama, to se odnosi na inhibiciju aktivacije C5 za najmanje 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% ili više.
D. Imunokonjugati
Pronalazak, takođe, obezbeđuje imunokonjugate koji sadrže anti-C5 antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih sredstava, kao što su hemoterapeutska sredstva ili lekovi, sredstva za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterija, gljivica, biljaka ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti) ili radioaktivnih izotopa.
U jednoj realizaciji, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali ne ograničavajući se na majtansinoid (videti, US Patenti br. 5,208,020, 5,416,064 i evropski patent EP 0 425 235 B1); auristatin kao što su monometilauristatinski delovi lekova DE i DF (MMAE i MMAF) (videti, US Patenti br.
5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); a dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (videti, US Patenti br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (vidi Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); i US Patent br. 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; a trihotecen; i CC1065.
U drugoj realizaciji, imunokonjugat sadrži antitelo kao što je ovde opisano konjugovano sa enzimski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, ali ne ograničavajući se na lanac A difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac A egzotoksina (iz lanca Pseudomonas aeruginosa), lanac A ricina, lanac A abrina, A lanac modekcina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugoj realizaciji, imunokonjugat sadrži antitelo kao što je ovde opisano konjugovano sa radioaktivnim atomom da bi se formirao radiokonjugat. Dostupni su različiti radioaktivni izotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivni izotopi Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (poznato i kao magnetna rezonanca, MRI), kao što je jod-123 ponovo, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog sredstva mogu se napraviti korišćenjem različitih bifunkcionalnih sredstava za spajanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin se može pripremiti kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti WO94/11026. Linker može biti „odcepljivi linker” koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu se koristiti linker osetljiv na kiselinu, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfide (Chari et al., Cancer Res.52:127-131 (1992); US Patent br.5,208,020).
Imunokonjugati ili ADC ovde izričito razmatraju, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za unakrsno povezivanje uključujući, ali ne ograničavajući se na, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SlAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. od Pierce Biotechnology, Inc., Rokford, IL, SAD).
E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju
U određenim realizacijama, bilo koje od anti-C5 antitela datih ovde je korisno za detekciju prisustva C5 u biološkom uzorku. Izraz „detekcija” kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim realizacijama, biološki uzorak obuhvata ćeliju ili tkivo, kao što je serum, puna krv, plazma, uzorak biopsije, uzorak tkiva, ćelijska suspenzija, pljuvačka, sputum, oralna tečnost, likvor, amnionska tečnost, ascitna tečnost, mleko, kolostrumi, sekrecija mlečne žlezde, limfa, urin, znoj, suzna tečnost, želudačna tečnost, sinovijalna tečnost, peritonealna tečnost, tečnost očnog sočiva i sluz.
U jednoj realizaciji, stavljeno je na uvid javnosti anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku dijagnostike ili detekcije. U daljem aspektu, dat je postupak detekcije prisustva C5 u biološkom uzorku. U određenim realizacijama, postupak obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa anti-C5 antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-C5 antitela za C5, i utvrđivanje da li se formira kompleks između anti-C5 antitela i C5. Takav postupak može biti in vitro metoda. U jednoj realizaciji, anti-C5 antitelo je za upotrebu u postupku odabira subjekata podobnih za terapiju sa anti-C5 antitelom, npr. gde je C5 biomarker za selekciju pacijenata.
U drugoj realizaciji, obezbeđeno je anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku odabira pojedinca koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5 kao pogodnog za terapiju. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku koji obuhvata (a) detekciju genetske varijacije C5 koja potiče od pojedinca, i (b) odabir pojedinca kao pogodnog za terapiju kada se detektuje genetska varijacija u C5 dobijenom od pojedinca. U drugoj realizaciji, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku odabira terapije za pojedinca koji ima bolest posredovanu komplementom ili stanje koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku koji se sastoji od (a) detekcije genetske varijacije C5 koja potiče od pojedinca i (b) odabira terapije pojedinca kada je genetska varijacija otkrivena u C5 dobijenom od pojedinca.
U drugoj realizaciji, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku koji obuhvata (a) detekciju genetske varijacije C5 koja potiče od pojedinca, (b) odabir pojedinca kao pogodnog za terapiju kada je genetska varijacija detektovana u C5 dobijenom od pojedinca, i (c) obezbeđivanje anti-C5 antitela koje se daje pojedincu.
U drugoj realizaciji, stavljeno je na uvid anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U određenim realizacijama, anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska je za upotrebu u postupku lečenja pojedinca kada se detektuje genetska varijacija u C5 izvedenom od pojedinca.
U drugoj realizaciji, obezbeđena je in vitro upotreba genetske varijacije C5 za odabir pojedinca koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5 kao pogodnog za terapiju koja sadrži anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska. U određenim realizacijama, pojedinac se bira kao pogodan za terapiju kada se detektuje genetska varijacija u C5 dobijenom od pojedinca. U drugoj realizaciji, obezbeđena je in vitro upotreba genetske varijacije u C5 za odabir terapije za pojedinca koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U određenim realizacijama, terapija koja sadrži anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska se bira za pojedinca kada se detektuje genetska varijacija u C5 dobijenom od pojedinca.
Prijavljeno je da neki pacijenti koji imaju genetsku varijaciju C5 pokazuju slab odgovor na terapiju koja sadrži postojeće anti-C5 antitelo (Nishimura et al., N. Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)). Preporučuje se da se takav pacijent leči terapijom koja sadrži anti-C5 antitelo iz predmetnog pronalaska, jer takvo antitelo ima inhibitornu aktivnost na aktivaciju C5 varijanti kao i divljeg tipa C5, kao što je pokazano u radnim primerima u daljem tekstu.
Detekcija genetske varijacije u C5 može se izvesti korišćenjem postupka poznatog u stanju tehnike. Takav postupak može da uključuje sekvenciranje, PCR, RT-PCR i metod zasnovan na hibridizaciji kao što je Southern blot ili Northern blot, ali nije ograničen na to. C5 varijante mogu da sadrže najmanje jednu genetsku varijaciju. Genetska varijacija se može izabrati iz grupe koju čine V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D. Ovde, R885H, na primer, označava genetsku varijaciju gde je arginin na poziciji 885 zamenjen histidinom. U određenim realizacijama, varijanta C5 ima biološku aktivnost sličnu divljem tipu C5.
Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati korišćenjem antitela prema pronalasku uključuju reumatoidni artritis (RA); sistemski eritemski lupus (SLE); lupus nefritis; ishemijskoreperfuziona povreda (IRI); astma; paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH); hemolitičkouremijski sindrom (HUS) (npr. atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS)); bolest gustih depozita (DDD); neuromijelitis optički (NMO); multifokalna motorna neuropatija (MMN); multipla skleroza (MS); sistemska skleroza; makularna degeneracija (npr. senilna makularna degeneracija (AMD)); hemoliza, povišeni enzimi jetre i sindrom niskog broja trombocita (HELLP); trombotična trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; buloza epidermolize; ponavljajući gubitak fetusa; preeklampsija; traumatska povreda mozga; mijastenija gravis; bolest hladnih aglutinina; Sjogrenov (Šegrenov) sindrom; dermatomiozitis; bulozni pemfigoid; fototoksične reakcije; Hemolitičko-uremijski sindrom povezan sa šiga toksinom E. coli; tipični ili infektivni hemolitičko-uremijski sindrom (tHUS); C3 Glomerulonefritis; Vaskulitis povezan sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelom (ANCA); odbacivanje humoralnog i vaskularnog transplantata; akutno odbacivanje posredovano antitelom (AMR); disfunkcija grafta; infarkt miokarda; alogena transplantacija; sepsa; koronarna arterijska bolest; nasledni angioedem; dermatomiozitis; Gravesova bolest; ateroskleroza; Alchajmerova bolest (AD); Hantingtonova bolest; Krojcfeld-Jacobova bolest; Parkinsonova bolest; rak; rane; septički šok; oštećenje kičmene moždine; uveitis; dijabetičke očne bolesti; retinopatija nedonoščadi; glomerulonefritis; membranozni nefritis; imunoglobulin A nefropatija; sindrom respiratornog distresa kod odraslih (ARDS); hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP); Cistična fibroza; hemolitička anemija; paroksizmalna hladna hemoglobinurija; anafilaktički šok; alergija; osteoporoza; osteoartritis; Hašimotov tiroiditis; dijabetes tipa I; psorijaza; pemfigus; autoimuna hemolitička anemija (AIHA); idiopatska trombocitopenična purpura (ITP); Goodpasture sindrom; Degoov sindrom; antifosfolipidni sindrom (APS); katastrofalni APS (CAPS); kardiovaskularni poremećaj; miokarditis; cerebrovaskularni poremećaj; periferni vaskularni poremećaj; renovaskularni poremećaj; mezenterični/enterični vaskularni poremećaj; vaskulitis; Henoh-Šenlajnova purpura nefritis; Takajasuova bolest; proširena kardiomiopatija; dijabetička angiopatija; Kavasakijeva bolest (arteritis); venska gasna embolija (VGE), restenoza nakon postavljanja stenta; rotaciona aterektomija; membranska nefropatija; Gilen Bareov sindrom (GBS); Fišerov sindrom; artritis izazvan antigenom; sinovijalna upala; virusne infekcije; bakterijske infekcije; gljivične infekcije; i povrede nastale usled infarkta miokarda, kardiopulmonalnog bajpasa i hemodijalize.
U određenim realizacijama, obezbeđena su obeležena anti-C5 antitela. Oznake obuhvataju, ali nisu ograničene na, oznake ili delove koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski guste, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i delove, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, na primer, kroz enzimsku reakciju ili molekularnu interakciju. Primeri oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofori kao što su retki zemni helati ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. US Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza,
heterociklične oksidaze kao što su urikaza i ksantin oksidaza, urikaza i ksantin oksidaza, zajedno sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilni slobodni radikali i slično.
F. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije anti-C5 antitela kako su ovde opisane se pripremaju mešanjem takvog antitela koji ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali nisu ograničeni na: pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; i cikloh3-penksol); polipeptide male molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; amino-kiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredtva kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji stvaraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske površinski aktivne materije kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju intersticijska disperzivna sredstva leka kao što su rastvorljivi neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 hijaluronidazni glikoproteini, kao što je rHuPH20 (HYLENEX (registrovani žig) Baxter International, Inc.). Određeni primeri sHASEGP-a i postupaka upotrebe, uključujući rHuPH20, opisani su u US publikacijama br.
2005/0260186 i 2006/0104968. U jednoj realizaciji, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza kao što su hondroitinaze.
Primeri formulacija liofilizovanih antitela su opisani u US Patent br. 6,267,958. Formulacije vodenih antitela uključuju one opisane u US Patent br. 6,171,586 i WO 2006/044908, poslednje formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može, takođe, da sadrži više od jednog aktivnog sastojka po potrebi za određenu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi aktivni sastojci su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međufaznom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatinmikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, tim redosledom, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomima, albuminu, mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su stavljene na uvid javnosti u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem obuhvataju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmova ili mikrokapsula.
Formulacije koje se koriste za in vivo primenu su generalno sterilne. Sterilnost se može lako postići, na primer, filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane.
G. Terapijski postupci i kompozicije
Bilo koje od anti-C5 antitela datih ovde može biti za upotrebu u terapijskim metodama.
U jednom aspektu, stavljeno je na uvid javnosti anti-C5 antitelo za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, stavljeno je na uvid anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja posredovanih komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U određenim realizacijama, stavljeno je na uvid anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U određenim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5, pri čemu se anti-C5 antitelo treba dati pojedincu u efektivnoj količini. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje obuhvata obezbeđivanje najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva koje se daje pojedincu u efektivnoj količini. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija je poželjno čovek.
Kada je antigen rastvorljivi protein, vezivanje antitela za njegov antigen može rezultirati produženim poluživotom antigena u plazmi (tj. smanjenim klirensom antigena iz plazme), pošto samo antitelo ima dužu polu-život u plazmi i služi kao nosač za antigen. Ovo je zbog recikliranja kompleksa antigen-antitelo od strane FcRn kroz endozomalni put u ćeliji (Roopenian, Nat. Rev.
Immunol. 7(9):715-725 (2007)). Međutim, očekuje se da antitelo sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH , koje se vezuje za svoj antigen u neutralnom vanćelijskom okruženju dok ga otpušta u kisele endozomne odeljke nakon ulaska u ćelije, ima superiorna svojstva u smislu neutralizacije i klirensa antigena u odnosu na njegov parnjak koji vezuje na pH nezavisan način (Igawa et al., Nat. Biotech.. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyina et al., mAbs 5(6):851-859 (2013.); WO 2009/125825).
U daljim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku za poboljšanje klirensa C5 iz plazme. U određenim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku za poboljšanje klirensa C5 iz plazme kod pojedinca, pri čemu anti-C5 antitelo treba da se daje pojedincu u efektivnoj količini za poboljšanje klirensa C5 iz plazme. U jednoj realizaciji, anti-C5 antitelo poboljšava klirens C5 iz plazme, u poređenju sa konvencionalnim anti-C5 antitelom koje nema karakteristike vezivanja zavisne od pH. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija je poželjno čovek.
U daljim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku supresije akumulacije C5 u plazmi. U određenim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku supresije akumulacije C5 u plazmi kod pojedinca, pri čemu anti-C5 antitelo treba da se daje pojedincu u efikasnoj količini za suzbijanje akumulacije C5 u plazmi. U jednoj realizaciji, akumulacija C5 u plazmi je rezultat formiranja kompleksa antigen-antitelo. U drugoj realizaciji, anti-C5 antitelo potiskuje akumulaciju C5 u plazmi, u poređenju sa konvencionalnim anti-C5 antitelom koje nema karakteristike vezivanja zavisne od pH. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija je poželjno čovek.
Anti-C5 antitelo prema predmetnom pronalasku može inhibirati aktivaciju C5. U daljim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku inhibicije aktivacije C5. U određenim realizacijama, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku inhibicije aktivacije C5 kod pojedinca, pri čemu anti-C5 antitelo treba da se daje pojedincu u efikasnoj količini da inhibira aktivaciju C5. U jednoj realizaciji, citotoksičnost posredovana C5 je potisnuta inhibicijom aktivacije C5. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija je poželjno čovek.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-C5 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja posredovanog komplementom koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja posredovanog komplementom, koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5, pri čemu lek treba da se daje osobi koja ima bolest ili stanje posredovano komplementom, koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5, u efektivnoj količini. U jednoj takvoj realizaciji, postupak dalje obuhvata obezbeđivanje najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva koji se daje pojedincu u efektivnoj količini. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija je poželjno čovek.
U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku za poboljšanje klirensa C5 iz plazme. U sledećoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku za povećanje klirensa C5 iz plazme kod pojedinca, pri čemu lek treba da se daje pojedincu u efektivnoj količini da bi se poboljšao klirens C5 iz plazme. U jednoj realizaciji, anti-C5 antitelo poboljšava klirens C5 iz plazme, u poređenju sa konvencionalnim anti-C5 antitelom, koje nema karakteristike vezivanja zavisne od pH. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija može biti čovek.
U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku supresije akumulacije C5 u plazmi. U sledećoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku supresije akumulacije C5 u plazmi kod pojedinca, pri čemu lek treba da se daje pojedincu u efektivnoj količini da suzbije akumulaciju C5 u plazmi. U jednoj realizaciji, akumulacija C5 u plazmi je rezultat formiranja kompleksa antigen-antitelo. U drugoj realizaciji, anti-C5 antitelo potiskuje akumulaciju C5 u plazmi, u poređenju sa konvencionalnim anti-C5 antitelom koje nema karakteristike vezivanja zavisne od pH. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija može biti čovek.
Anti-C5 antitelo prema predmetnom pronalasku može inhibirati aktivaciju C5. U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku inhibicije aktivacije C5. U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku inhibicije aktivacije C5 kod pojedinca, pri čemu lek treba da se daje pojedincu u efektivnoj količini da inhibira aktivaciju C5. U jednoj realizaciji, citotoksičnost posredovana C5 je potisnuta inhibicijom aktivacije C5. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od anti-C5 antitela datih ovde, npr. za upotrebu u bilo kom od gore navedenih terapijskih metoda. U jednoj realizaciji, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje od anti-C5 antitela datih ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugoj realizaciji, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje od anti-C5 antitela koja su ovde data i najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo.
U daljem aspektu, farmaceutska formulacija je za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja posredovanog komplementom, koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. U daljoj realizaciji, farmaceutska formulacija je za upotrebu u postupku za poboljšanje klirensa C5 iz plazme. U jednoj realizaciji, anti-C5 antitelo poboljšava klirens C5 iz plazme, u poređenju sa konvencionalnim anti-C5 antitelom koje nema karakteristike vezivanja zavisne od pH. U daljoj realizaciji, farmaceutska formulacija je za upotrebu u postupku supresije akumulacije C5 u plazmi. U jednoj realizaciji, akumulacija C5 u plazmi je rezultat formiranja kompleksa antigen-antitelo. U drugoj realizaciji, anti-C5 antitelo potiskuje akumulaciju C5 u plazmi, u poređenju sa konvencionalnim anti-C5 antitelom koje nema karakteristike vezivanja zavisne od pH. Anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska može da inhibira aktivaciju C5. U daljoj realizaciji, farmaceutska formulacija je za upotrebu u postupku inhibicije aktivacije C5. U jednoj realizaciji, citotoksičnost posredovana C5 je potisnuta inhibicijom aktivacije C5. U jednoj realizaciji, farmaceutska formulacija treba da se daje pojedincu koji ima bolest ili stanje posredovano komplementom, koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5. „Pojedinac” u skladu sa bilo kojom od gornjih realizacija je poželjno čovek.
U jednoj realizaciji, pojedinac ima divlji tip C5. U drugoj realizaciji, pojedinac ima varijantu C5. U određenim realizacijama, varijanta C5 ima biološku aktivnost sličnu divljem tipu C5. Takva varijanta C5 može da sadrži najmanje jednu varijaciju izabranu iz grupe koju čine V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D. Ovde, R885H, na primer, označava genetsku varijaciju gde je arginin na poziciji 885 zamenjen histidinom.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupke za pripremu leka ili farmaceutske formulacije, koje obuhvataju mešanje bilo kog od anti-C5 antitela datih ovde sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gore navedenih terapeutskih metoda. U jednoj realizaciji, postupci za pripremu leka ili farmaceutske formulacije dalje obuhvataju dodavanje najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva leku ili farmaceutskoj formulaciji.
U određenim realizacijama, komplementom posredovana bolest ili stanje koje uključuje prekomernu ili nekontrolisanu aktivaciju C5 je izabrano iz grupe koju čine reumatoidni artritis (RA); sistemski eritemski lupus (SLE); lupus nefritis; ishemijsko- reperfuziona povreda (IRI); astma; paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH); hemolitičko-uremijski sindrom (HUS) (npr. atipični hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS)); bolest gustih depozita (DDD); neuromijelitis optički (NMO); multifokalna motorna neuropatija (MMN); multipla skleroza (MS); sistemska skleroza; makularna degeneracija (npr. senilna makularna degeneracija (AMD)); hemoliza, povišeni enzimi jetre i sindrom niskog broja trombocita (HELLP); trombotična trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; buloza epidermolize; ponavljajući gubitak fetusa; preeklampsija; traumatska povreda mozga; mijastenija gravis; bolest hladnih aglutinina; Sjogrenov sindrom; dermatomiozitis; bulozni pemfigoid; fototoksične reakcije; Hemolitičkouremijski sindrom povezan sa šiga toksinom E. coli; tipični ili infektivni hemolitičko-uremijski sindrom (tHUS); C3 Glomerulonefritis; Vaskulitis povezan sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelom (ANCA); odbacivanje humoralnog i vaskularnog transplantata; akutno odbacivanje posredovano antitelom (AMR); disfunkcija grafta; infarkt miokarda; alogena transplantacija; sepsa; koronarna arterijska bolest; nasledni angioedem; dermatomiozitis; Gravesova bolest; ateroskleroza; Alchajmerova bolest (AD); Hantingtonova bolest; Krojcfeld-Jacobova bolest; Parkinsonova bolest; rak; rane; septički šok; oštećenje kičmene moždine; uveitis; dijabetičke očne bolesti; retinopatija nedonoščadi; glomerulonefritis; membranozni nefritis; imunoglobulin A nefropatija; sindrom respiratornog distresa kod odraslih (ARDS); hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP); Cistična fibroza; hemolitička anemija; paroksizmalna hladna hemoglobinurija; anafilaktički šok; alergija; osteoporoza; osteoartritis; Hašimotov tiroiditis; dijabetes tipa I; psorijaza; pemfigus; autoimuna hemolitička anemija (AIHA); idiopatska trombocitopenična purpura (ITP); Goodpasture sindrom; Degoov sindrom; antifosfolipidni sindrom (APS); katastrofalni APS (CAPS); kardiovaskularni poremećaj; miokarditis; cerebrovaskularni poremećaj; periferni vaskularni poremećaj; renovaskularni poremećaj; mezenterični/enterični vaskularni poremećaj; vaskulitis; Henoh-Šenlajnov purpura nefritis; Takajasuova bolest; proširena kardiomiopatija; dijabetička angiopatija; Kavasakijeva bolest (arteritis); venska gasna embolija (VGE), restenoza nakon postavljanja stenta; rotaciona aterektomija; membranozna nefropatija; Gilen-Bareov sindrom (GBS); Fišerov sindrom; artritis izazvan antigenom; sinovijalna upala; virusne infekcije; bakterijske infekcije; gljivične infekcije; i povrede nastale usled infarkta miokarda, kardiopulmonalnog bajpasa i hemodijalize.
U određenim realizacijama, bolest ili stanje posredovano komplementom je stanje očne bolesti. U daljim realizacijama, očno stanje je makularna degeneracija. U daljim realizacijama, makularna degeneracija je AMD. U daljim realizacijama, AMD je suvi oblik AMD.
U određenim realizacijama, bolest ili stanje posredovano komplementom je PNH.
U određenim realizacijama, bolest ili stanje posredovano komplementom je infarkt miokarda.
U određenim realizacijama, bolest ili stanje posredovano komplementom je RA.
U određenim realizacijama, bolest ili stanje posredovano komplementom je osteoporoza ili osteoartritis.
U određenim realizacijama, bolest ili stanje posredovano komplementom je zapaljenje.
U određenim realizacijama, bolest ili stanje posredovano komplementom je rak.
Antitela prema pronalasku mogu biti za upotrebu u postupku terapije bilo sama ili u kombinaciji sa drugim sredstvima. Na primer, antitelo pronalaska se opciono primenjuje zajedno sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim sredstvom.
Takve kombinovane terapije pomenute gore obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih sredstava uključena u iste ili odvojene formulacije) i odvojenu primenu, u kom slučaju se primena antitela prema pronalasku može desiti pre, istovremeno i/ili posle, davanja dodatnog terapeutskog sredstva ili sredstava. U jednoj realizaciji, davanje anti-C5 antitela i davanje dodatnog terapeutskog sredstva se dešavaju u roku od oko mesec dana, ili u roku od oko jedne, dve ili tri nedelje, ili u roku od oko jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedno od drugog.
Antitelo prema pronalasku (i bilo koje dodatno terapeutsko sredstvo) treba da se daje na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralno, intrapulmonalno i intranazalno, i, ako se želi za lokalni tretman, intraleziono. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim pogodnim putem, na primer, injekcijama, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, delimično u zavisnosti od toga da li je primena kratka ili hronična. Ovde se razmatraju različiti rasporedi doziranja uključujući, ali ne ograničavajući se na, pojedinačno ili višestruko davanje u različitim vremenskim tačkama, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela pronalaska bi se formulisala, dozirala i davala bi se na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke sredstva, način primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više sredstava koji se trenutno koriste za prevenciju ili lečenje dotičnog poremećaja. Efikasna količina takvih drugih sredstava zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, tipa poremećaja ili tretmana i drugih faktora o kojima je gore diskutovano. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa putevima primene kao što je ovde opisano, ili oko 1 do 99% doza opisanih ovde, ili u bilo kojoj dozi i bilo kojim putem za koga je empirijski/klinički utvrđeno da je prikladan.
Za upotrebu u postupku prevencije ili lečenja bolesti, odgovarajuća doza antitela prema pronalasku (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih sredstava) zavisiće od tipa bolesti koja se leči, tipa antitela, ozbiljnosti i toka bolesti, da li će se antitelo primeniti u preventivne ili terapijske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, kao i diskrecionog prava lekara koji prisustvuje. Antitelo treba na odgovarajući način davati pacijentu u jednom trenutku ili tokom serije tretmana. U zavisnosti od tipa i težine bolesti, oko 1 mikro g/kg do 15 mg/kg (npr.0,1mg/kg - 10mg/kg) antitela može biti početna doza kandidata za davanje pacijentu, bilo da na primer, jednom ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Jedna uobičajena dnevna doza može se kretati od oko 1 mikro g/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Za ponovljena davanja tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman bi se generalno održavao sve dok se ne pojavi željena supresija simptoma bolesti. Jedna primerna doza antitela bi bila u rasponu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Prema tome, pacijentu se može dati jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze se mogu davati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent dobije od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti početna veća udarna doza, praćena jednom ili više nižih doza. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
Podrazumeva se da se bilo koja od gornjih formulacija ili terapeutskih metoda može izvesti korišćenjem imunokonjugata pronalaska umesto ili kao dodatak anti-C5 antitelu.
H. Proizvodni artikli
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvodni artikal koji sadrži materijale za upotrebu u postupku lečenja, prevencije i/ili dijagnoze gore opisanih poremećaja. Proizvodni artikal se sastoji od pakovanja i etikete ili uloška pakovanja na ili u vezi sa pakovanjem. Pogodna pakovanja uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanja mogu biti formirana od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Pakovanje sadrži kompoziciju koja je sama ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom efikasna za upotrebu u postupku lečenja, prevencije i/ili dijagnostikovanja stanja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, pakovnaje može biti vreća za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probiti iglom za hipoderalnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je antitelo pronalaska. Etiketa ili umetak pakovanja označava da je kompozicija za upotrebu u postupku lečenja stanja po izboru. Štaviše, proizvodni artikal može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se nalazi u njoj, pri čemu kompozicija sadrži još jedan citotoksično ili na drugi način terapeutsko sredstvo.
Proizvodni artikal u ovoj realizaciji pronalaska može dalje da sadrži umetak pakovanja koji ukazuje da su kompozicije za upotrebu u postupku lečenja određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor puferovan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da bilo koji od gornjih proizvodnih artikala može da uključuje imunokonjugat iz pronalaska umesto ili kao dodatak anti-C5 antitelu.
[Primeri]
Slede primeri postupaka i kompozicija pronalaska. Podrazumeva se da se mogu praktikovati razne druge realizacije, s obzirom na opšti opis dat gore.
[PRIMER 1]
Priprema C5
1.1. Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog humanog i C5 majmuna makaki rakojeda.
Rekombinantni humani C5 (NCBI GenBank pristupni broj: NP_001726.2, SEQ ID NO: 39) je eksprimovan tranzitno korišćenjem FreeStyle293-F ćelijske linije (Thermo Fisher, Karlsbad, Kalifornija, SAD). Kondicionirani medijum koji je eksprimovao humani C5 je razblažen sa jednakom zapreminom milliQ vode, zatim nanet na kolonu za anjonsku izmenu Q-sefaroze FF ili Q-sefaroze HP (GE healthcare, Upsala, Švedska), nakon čega je usledilo eluiranje sa NaCl gradijentom. Frakcije koje sadrže humani C5 su sakupljene, zatim je koncentracija soli i pH podešen na 80 mM NaCl i pH 6.4, tim redosledom. Dobijeni uzorak je primenjen na SP-sefaroze HP kolonu za katjonsku izmenu (GE Healthcare, Upsala, Švedska) i eluiran sa NaCl gradijentom. Frakcije koje sadrže humani C5 su skupljene i podvrgnute CHT keramičkoj hidroksiapatitnoj koloni (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD). Humani C5 eluat je zatim primenjen na Superdex 200 kolonu za gel filtraciju (GE Healthcare, Upsala, Švedska). Frakcije koje sadrže humani C5 su sakupljene i uskladištene na -150 stepeni C.
Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog C5 majmuna makaki rakojeda (NCBI GenBank pristupni broj: XP_005580972, SEQ ID NO: 44) izvedeno je na isti način kao i humani pandan.
1.2. Prečišćavanje C5 (cynoC5) majmuna makaki rakojeda iz plazme
Uzorak plazme majmuna makaki rakojeda je primenjen na SSL7-agarozu (Invivogen, San Dijego, Kalifornija, SAD) nakon čega je usledilo eluiranje sa 100 mM NaAcetata, pH 3.5. Frakcije koje sadrže cynoC5 su odmah neutralisane i podvrgnute Protein A HP koloni (GE Healthcare, Upsala, Švedska) u tandemu sa Peptid M agarozom (Invivogen, San Dijego, Kalifornija, SAD). Protok kroz frakciju je zatim primenjen na Superdex 200 kolonu za gel filtraciju (GE Healthcare, Upsala, Švedska). Frakcije koje sadrže cynoC5 su sakupljene i čuvane na -80 stepeni C.
[PRIMER 2]
Generisanje anti-C5 antitela
2.1. Skrining antitela
Anti-C5 antitela su pripremljena, odabrana i ispitana na sledeći način:
Dvanaest do šesnaest nedelja stari NZW zečevi su imunizovani intradermalno sa humanim C5 i/ili majmunskim C5 (50-100 mikro g/dozi/zecu). Ova doza je ponovljena 4-5 puta tokom perioda od 2 meseca. Nedelju dana nakon završne imunizacije, sakupljeni su slezina i krv od imunizovanih zečeva. B-ćelije specifične za antigen su obojene obeleženim antigenom, sortirane sa FCM ćelijskim sorterom (FACS aria III, BD) i postavljene u ploče sa 96 ležišta u jednoj gustini ćelija/ležištu zajedno sa 25.000 ćelija/ležištu EL4 ćelija (Evropska kolekcija ćelijskih kultura) i aktiviranim medijumom za T-ćelije zeca razblaženim 20 puta i kultivisane 7-12 dana. EL4 ćelije su tretirane mitomicinom C (Sigma, Kat. br. M4287) tokom 2 sata i isprane 3 puta unapred. Aktivirani kondicionirani medijum za T-ćelije zeca pripremljen je kultivisanjem zečjih timocita u RPMI-1640 koji sadrži fitohemaglutinin-M (Roche, kat. br. 1 1082132-001), forbol 12-miristat 13-acetat (Sigma, kat. br. P1585) i 2% FBS. Nakon kultivacije, supernatanti kulture B-ćelija su sakupljeni za dalju analizu i pelete su kriokonzervirane.
ELISA test je korišćen za ispitivanje specifičnosti antitela u supernatantu kulture B-ćelija. Streptavidin (GeneScript, Kat. br. Z02043) je nanet na MAXISorp sa 384 ležišta (Nunc, Kat. br.
164688) na 50 nM u PBS-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim blokirane sa Blocking One (Nacalai Teskqe, Kat. br.03953-95) razblaženim 5 puta. Humani ili majmunski C5 je obeležen sa NHS-PEG4-biotinom (PIERCE, kat. br.21329) i dodat je u blokirane ELISA ploče, inkubiran 1 sat i ispran. Supernatanti kulture B ćelija su dodati u ELISA ploče, inkubirani 1 sat i isprani. Vezivanje je detektovano kozjom anti-zečjom peroksidazom IgG hrena (BETHYL, kat. br. A120-111P) nakon čega je usledio dodatak ABTS (KPL, kat. br.50-66-06).
ELISA test je korišćen za procenu vezivanja zavisnog od pH antitela protiv C5. Kozji anti-zečji IgG-Fc (BETHYL, Kat. br. A120-111A) razblažen do 1 mikro g/ml sa PBS(-) je dodat u MAXISorp sa 384 ležišta (Nunc, Kat. br.164688), inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi i blokiran sa Blocking One (Nacalai Tesque, Kat. br.03953-95) razblaženim 5 puta. Posle inkubacije, ploče su isprane i dodati su supernatanti kulture B-ćelija. Ploče su inkubirane 1 sat, isprane i dodato je 500 pM biotinilovanog humanog ili majmunskog C5 i inkubirano je 1 sat. Nakon inkubacije, ploče su isprane i inkubirane sa bilo pH 7.4 MES puferom (20 mM MES, 150 mM NaCl i 1,2 mM CaCl2) ili pH 5.8 MES puferom (20 mM MES, 150 mM NaCl i 1 mM EDTA) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, vezivanje biotinilovanog C5 detektovano je konjugatom Streptavidin - peroksidaza hrena (Thermo Scientific, Kat. br.21132) nakon čega je usledio dodatak ABTS (KPL, Kat. br.50-66-06).
Octet RED384 sistem (Pall Life Sciences) je korišćen za procenu afiniteta i vezivanja zavisnog od pH antitela protiv C5. Antitela izlučena u supernatantu kulture B-ćelija su stavljena na vrh biosenzora proteina A (Pall Life Sciences) i potopljena u 50 nM humanog ili majmunskog C5 u pH 7.4 MES puferu da bi se analizirala kinetika asocijacije. Kinetika disocijacije je analizirana u pH 7.4 MES puferu i pH 5.8 MES puferu.
Ukupno 41.439 B-ćelijskih linija je testirano na afinitet i vezivanje zavisno od pH za humani ili majmunski C5 i 677 linija je odabrano i označeno kao CFA0001-0677. RNK odabranih linija je prečišćena iz kriokonzerviranih ćelijskih peleta korišćenjem ZR-96 Quick-RNA kompleta (ZYMO RESEARCH, Kat. br. R1053). DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca antitela u odabranim linijama je amplifikovana PCR reverznom transkripcijom i rekombinovana sa DNK koja kodira F760G4 (SEQ ID NO: 33) ili F939G4 (SEQ ID NO: 34) konstantnim regionom teškog lanca. DNK koja kodira varijabilne regione lakog lanca antitela je amplifikovana PCR reverznom transkripcijom i rekombinovana sa DNK koja kodira konstantni region lakog lanca k0MTC (SEQ ID NO: 36). Odvojeno, sintetizovani su geni teškog i lakog lanca postojećeg humanizovanog anti-C5 antitela, ekulizumaba (EcuH-G2G4, SEQ ID NO: 29 i EcuL-k0, SEQ ID NO: 30). DNK koja kodira VH (EcuH, SEQ ID NO: 31) je fuzionisana u okviru sa DNK koja kodira modifikovani humani IgG4 CH (F760G4, SEQ ID NO: 33), a DNK koja kodira VL (EcuL, SEQ ID NO: 32) je fuzionisana u okviru sa DNK koja kodira konstantni region lakog lanca k0 (SEQ ID NO: 37). Svaka od fuzionisanih kodirajućih sekvenci je, takođe, klonirana u ekspresioni vektor. Antitela su eksprimovana u FreeStyle<™>293-F ćelijama (Invitrogen) i prečišćena iz supernatanta kulture da bi se procenila funkcionalna aktivnost. Neutralizujuća aktivnost antitela je procenjena testiranjem inhibicije aktivnosti komplementa korišćenjem testa lipozomske lize kao što je opisano u Primeru 5.1.
2.2. Grupisanje epitopa pomoću sendvič ELISA testa
Anti-C5 antitela sa visokim afinitetom, pH zavisnošću ili neutralizujućom aktivnošću su odabrana za dalju analizu. Sendvič ELISA test je korišćen za grupisanje odabranih antitela u različite epitopske grupe (binove) koje se vezuju za iste ili preklapajuće epitope C5 proteina. Neobeležena antitela za hvatanje su razblažena do 1 mikro g/ml sa PBS (-) i dodata u MAXISorp ploče sa 384 ležišta (Nunc, Kat. br. 164688). Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi i blokirane sa Blocking One (Nacalai Tesque, Kat. br.03953-95) razblaženim 5 puta. Ploče su inkubirane 1 sat, isprane i dodato je 2 nM humanog C5 i inkubirane su 1 sat. Posle inkubacije, ploče su isprane i dodata su obeležena detekciona antitela (1 mikro g/mL, biotinilovana pomoću NHS-PEG4-Biotina). Posle 1 sata inkubacije, vezivanje biotinilovanog antitela je detektovano konjugatom Streptavidin-Hren peroksidaze (Thermo Scientific, Kat. br.21132) nakon čega je usledio dodatak ABTS (KPL, Kat. br.50-66-06).
Sva anti-C5 antitela su korišćena i kao antitelo za hvatanje i kao antitelo za detekciju, i sveobuhvatno su uparena. Kao što je prikazano na slici 1, međusobno kompetitivna antitela su grupisana u 7 grupa za epitope: CFA0668, CFA0334 i CFA0319 su grupisani u epitop A, CFA0647, CFA0589, CFA0341, CFA0639, CFA0635, CFA0330 i CFA0318, su grupisani u epitop B, CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0305, CFA0675, CFA0666 i CFA0672 su grupisani u epitop C, ekulizumab i CFA0322 su grupisani u epitop D, CFA0329 je grupisan u epitop E, CFA0359 i CFA0217 u epitop F, a CFA0579, CFA0328 i CFA0272 su grupisani u epitop G. Slika 1 prikazuje grupisanje epitopa nekih anti-C5 himernih antitela. Sekvence VH i VL anti-C5 antitela grupisanih u epitop C navedene su u tabeli 2.
[Tabela 2]
2.3. Humanizacija i optimizacija
Humanizacija varijabilnog regiona nekih anti-C5 antitela je izvršena da bi se smanjila potencijalna imunogenost antitela. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) anti-C5 zečjeg antitela su kalemljeni na homologne okvire humanih antitela (FR) korišćenjem konvencionalnog pristupa CDR kalemljenja (Nature 321:522-525 (1986)). Geni koji kodiraju humanizovani VH i VL su sintetizovani i kombinovani sa modifikovanim humanim IgG4 CH (SG402, SEQ ID NO: 35) i humanim CL (SK1, SEQ ID NO: 38), tim redosledom, a svaka od kombinovanih sekvenci je klonirana u ekspresioni vektor.
Izvestan broj mutacija i kombinacija mutacija je ispitan da bi se identifikovale mutacije i kombinacije mutacija koje su poboljšale svojstva vezivanja nekih od vodećih antitela. Višestruke mutacije su zatim uvedene u humanizovane varijabilne regione da bi se poboljšao afinitet vezivanja za C5 pri neutralnom pH ili da bi se smanjio afinitet vezivanja za C5 pri kiselom pH. Jedna od optimizovanih varijanti, 305LO5 (VH, SEQ ID NO: 10; VL, SEQ ID NO: 20; HVR-H1, SEQ ID NO: 54; HVR-H2, SEQ ID NO: 64; HVR-H3, SEQ ID NO: 74; HVR-L1, SEQ ID NO: 84; HVR-L2, SEQ ID NO: 94; i HVR-L3, SEQ ID NO: 104), je stoga generisana iz CFA0305.
Antitela su eksprimovana u ćelijama HEK293 kotransfektovanim mešavinom vektora ekspresije teškog i lakog lanca i prečišćena su proteinom A.
[PRIMER 3]
Karakterizacija vezivanja anti-C5 antitela
3.1. Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnih antitela
Rekombinantna antitela su eksprimovana tranzitno korišćenjem FreeStyle293-F ćelijske linije (Thermo Fisher, Karlsbad, Kalifornija, SAD). Prečišćavanje iz kondicioniranog medijuma koji eksprimuje antitela je izvedeno korišćenjem konvencionalnog postupka korišćenjem proteina A. Filtracija gela je dalje sprovedena ako je potrebno.
3.2. Procena zavisnosti od pH
Kinetički parametri anti-C5 antitela protiv rekombinantnog humanog C5 su procenjeni na pH 7.4 i pH 5.8, na 37 stepeni C korišćenjem BIACORE (registrovani žig) T200 instrumenta (GE Healthcare). ProA/G (Pierce) je imobilisan na CM4 senzorski čip korišćenjem kompleta za spajanje amina (GE Healthcare) u skladu sa postavkama koje preporučuje GE Healthcare. Antitela i analiti su razblaženi u odgovarajućim tekućim puferima, ACES pH 7.4 i pH 5.8 (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20, 0,005% NaN3). Svako antitelo je uhvaćeno na površinu senzora pomoću ProA/G. Nivoi hvatanja antitela bili su tipično 60-90 rezonantnih jedinica (RU). Zatim je rekombinantni humani C5 ubrizgan u koncentracijama od 10 i 20 nM ili 20 i 40 nM, nakon čega je usledila disocijacija. Površina je regenerisana upotrebom 25 mM NaOH. Kinetički parametri u oba pH uslova su određeni prilagođavanjem senzorgrama sa 1:1 modelom vezivanja korišćenjem BIACORE (registrovani žig) T200 Evaluation softvera, verzija 2.0 (GE Healthcare). Senzorgrami svih antitela su prikazani na slikama 2A i 2B. Stopa asocijacije (ka), brzina disocijacije (kd) i afinitet vezivanja (KD) antitela su navedeni u Tabeli 3. Sva antitela osim CFA0330 (VH, SEQ ID NO: 21 i VL, SEQ ID NO: 25) i CFA0341 (VH, SEQ ID NO: 22 i VL, SEQ ID NO: 26) pokazala su relativno bržu stopu disocijacije pri pH 5.8 od pH 7.4.
Tabela 3
3.3. Unakrsna provera reaktivnosti
Da bi se posmatrala unakrsna reaktivnost anti-C5 antitela protiv humanog C5 (hC5) i C5 majmuna makaki rakojeda (cynoC5), urađena je kinetička analiza BIACORE (registrovani žig). Postavka analize bila je ista kao što je opisano u Primeru 3.2, Rekombinantni cynoC5 je ubrizgan u koncentracijama od 2, 10 i 50 nM. Kinetički parametri su određeni istim prilagođavanjem podataka kao što je opisano u Primeru 3.2. Kinetika vezivanja i afinitet pri pH 7.4 su navedeni u Tabeli 4. Kinetički parametri u odnosu na hC5 predstavljeni u Tabeli 4 su rezultati Primera 3.2. Sva anti-C5 antitela osim CFA0672 pokazala su uporedivu KD prema hC5 i cynoC5. KD CFA0672 prema cynoC5 bio je 8 puta slabiji nego prema hC5.
[Tabela 4]
[PRIMER 4]
Mapiranje epitopa anti-C5 antitela
4.1. Vezivanje anti-C5 MAbs za peptide izvedene iz C5 beta lanca. Anti-C5 monoklonska antitela (MAbs) su testirana na vezivanje za peptide izvedene iz C5 beta lanca u Western blot analizi. C5 peptidi: 19-180, 161-340, 321-500 i 481-660, fuzionisani sa GST-oznakom (pGEX-4T-1, GE Healthcare Life Sciences, 28-9545-49) eksprimovani su u E. coli (DH5 alfa, TOYOBO, DNK-903). Uzorci E. coli su sakupljeni nakon inkubacije sa 1 mM izopropil beta-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG) tokom 5 sati na 37 stepeni C i centrifugirani na 20000 x g tokom 1 min da bi se dobile pelete. Pelete su suspendovane sa puferskim rastvorom uzorka (2ME+) (Wako, 191-13272) i korišćene za Western blot analizu. Ekspresija svakog peptida je potvrđena anti-GST antitelom (Abcam, ab9085) (slika 3). Strelica pokazuje GST-fuzionisane C5 peptide (46-49kDa). Anti-C5 MAbs: CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675, vezani za 19-180 od C5 (Slika 3).
4.2. Ekspresija i prečišćavanje MG1-MG2 domena (1-225) humanog C5
Rekombinantni MG1-MG2 domen (SEQ ID NO: 43) humanog C5 beta lanca je eksprimovan tranzitno korišćenjem FreeStile293-F ćelijske linije (Thermo Fisher, Carlsbad, Kalifornija, SAD). Kondicionirani medijum koji eksprimuje MG1-MG2 domen je razblažen sa 1/2 vol milliQ vode, nakon čega je usledila primena na Q-sefaroza FF kolonu za anjonsku izmenu (GE healthcare, Upsala, Švedska). Protok kroz frakciju iz kolone za anjonsku izmenu je podešen na pH 5.0 i primenjen na SP- sefaroza HP kolonu za katjonsku izmenu (GE Healthcare, Upsala, Švedska) i eluiran sa NaCl gradijentom. Frakcije koje sadrže MG1-MG2 domen su sakupljene iz eluenta i zatim podvrgnute Superdex 75 koloni za gel filtraciju (GE Healthcare, Upsala, Švedska) ekvilibrisanoj sa 1 x PBS. Frakcije koje sadrže MG1-MG2 domen su zatim sakupljene i uskladištene na -80 stepeni C.
4.3. Sposobnost vezivanja za MG1-MG2 domen
Sposobnost vezivanja anti-C5 antitela prema MG1-MG2 domenu merena je korišćenjem istih testnih postavki kao što je opisano u Primeru 3.2, osim što su merenja vršena samo pod uslovima pH 7.4. MG1-MG2 domen je ubrizgan u koncentracijama od 20 nM i 40 nM. Kao što je prikazano na Slici 4, sva antitela osim ekulizumaba-F760G4 pokazala su povećanje odgovora vezivanja, što ukazuje da su ova antitela MG1-MG2 veziva. Ekulizumab-F760G4, koji je poznato vezivo alfa lanca, nije pokazao vezivanje za MG1-MG2 domen.
4.4. Vezivanje anti-C5 MAbs za peptide izvedene iz domena C5 MG1-MG2
Anti-C5 MAbs su testirani na vezivanje za peptide izvedene iz domena MG1-MG2 u Western blot analizi. C5 peptidi: 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 i 45-111 (SEQ ID NO:40), fuzionisani sa GST-oznakom, eksprimovani su u E. coli. Uzorci E. coli su sakupljeni nakon inkubacije sa 1 mM IPTG tokom 5 sati na 37 stepeni C i centrifugirani na 20000 x g tokom 1 min da bi se dobile pelete. Pelete su suspendovane sa puferskim rastvorom uzorka (2ME+) i korišćene za Western blot analizu. Ekspresija peptida izvedenih iz C5 je potvrđena anti-GST antitelom (Slika 5A). CFA0305 se vezuje samo za peptid 33-124 (Slika 5B). CFA0305 vezan za beta lanac rekombinantnog humanog C5 (rhC5) (približno 70 kDa), koji je korišćen kao kontrola. Slika 5C sumira reakciju anti-C5 MAbs na peptide izvedene iz C5.
4.5. Vezivanje anti-C5 MAbs za C5 mutante
Pošto je predviđeno da tri aminokiselinska ostatka u C5 beta lancu: E48, D51 i K109 budu uključena u vezivanje između C5 i anti-C5-MAbs analizom kristalne strukture, anti-C5 MAbs su testirani na vezivanje na humane C5 tačkaste mutante u Western blot analizi. C5 tačkasti mutanti, u kojima je bilo koji od E48, D51 i K109 supstituisan sa alaninom, eksprimovani su u FS293 ćelijama lipofekcijom. Medijum za kulturu je sakupljen 5 dana nakon lipofekcije, a zatim korišćen za Western blot. SDS-PAGE je sproveden u redukcionim uslovima. Rezultati su prikazani na Slici 6. Ekulizumab se vezuje za alfa lanac divljeg tipa (WT) C5 i tri mutanta C5 tačke, dok se CFA0305 snažno vezuje za beta lanac WT C5, a E48A mutant C5 slabo i nije se vezao na beta-lanac D51A i K109A C5 mutanata, što ukazuje da su ova 3 aminokiselinska ostatka uključena u interakcije antitelo/antigen. Tabela 5 predstavlja rezime Western blot analize anti-C5 MAbs (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675). Anti-C5 MAbs su grupisani u isti epitop C, ali se obrasci vezivanja malo razlikuju između antitela, što sugeriše da su regioni vezivanja C5 za anti-C5 MAb bliski jedan drugom, ali ne i identični.
[Tabela 5]
4.6. BIACORE (registrovani žig) analiza vezivanja anti-C5 antitela sa C5 mutantima
Da bi se testiralo da li su ostaci E48, G51 i K109 zaista uključeni u interakcije antitela/antigena, izvršena je BIACORE (registrovani žig) analiza vezivanja. Pripremljena su tri C5 mutanta: E48A, G51A i K109A, kao što je opisano u Primeru 4.5. Uzorci supernatanta kulture koji sadrže mutant C5 prekomerno eksprimovan u ćelijama FS293 pripremljeni su pri 40 mikro g/ml mutanta C5. Za BIACORE (registrovani žig) analizu vezivanja, uzorak je razblažen 10 x sa BIACORE (registrovani žig) puferom (ACES pH 7.4, 10 mg/ml BSA, 1 mg/ml karboksimetil dekstrana) do konačne koncentracije uzorka od 4 mikro g/ml mutanta C5.
Interakcije tri C5 mutanta sa anti-C5 antitelima su procenjene na 37 stepeni C sa BIACORE (registrovani žig) T200 instrumentom (GE Healthcare), korišćenjem uslova analize opisanih u Primeru 3.2. ACES pH 7.4 pufer koji sadrži 10 mg/ml BSA, 1 mg/ml karboksimetil dekstrana je korišćen kao tekući pufer. Ekulizumab-F760G4 i 305LO5 su uhvaćeni na različitim protočnim ćelijama monoklonskim mišjim anti-humanim IgG, antitelom specifičnim za Fc fragment (GE Healthcare). Protočna ćelija 1 je korišćena kao referentna površina. Proteini divljeg tipa i mutantni C5 proteini su ubrizgani preko površine senzora u koncentraciji od 4 mikro g/ml da bi stupili u interakciju sa uhvaćenim antitelima. Na kraju svakog ciklusa analize, površina senzora je regenerisana sa 3M MgCh. Rezultati su analizirani softverom Bia Evaluation, verzija 2.0 (GE Healthcare). Krive referentne protočne ćelije (protočna ćelija 1) i prazne injekcije tekućeg pufera su oduzete od krivih protočne ćelije sa uhvaćenim antitelima.
Kao što je prikazano na Slici 7, sva tri C5 mutanta bi se mogla vezati za ekulizumab sa sličnim profilom vezivanja u poređenju sa divljim tipom C5. Za 305LO5, sva tri mutanta su pokazala niži odgovor vezivanja za 305LO5 u poređenju sa divljim tipom C5. D51A i K109A mutanti su smanjili vezivanje C5 za 305LO5 na osnovni nivo.
4.7. Identifikacija His ostataka na C5 koji doprinose interakcijama zavisnim od pH između anti-C5 antitela i C5
Analiza kristalne strukture je otkrila da se 3 histidinska ostatka na humanom C5 nalaze na interfejsu antitelo/antigen. Poznato je da histidinski ostatak sa tipičnim pKa od približno 6,0 doprinosi protein-protein interakcijama zavisnim od pH (Igawa et al., Biochim Biophys Acta 1844(11):1943-1950 (2014)). Da bi se istražilo koji od His ostataka na interfejsu antitelo/antigen doprinose interakcijama zavisnim od pH između anti-C5 antitela i C5, izvršena je BIACORE (registrovani žig) analiza vezivanja. Tri humana C5 mutanta sa jednom His mutacijom (H70Y, H72Y i H110Y) i mutant sa dvostrukom His mutacijom (H70Y H110Y) pripremljena su na sledeći način: pojedinačni His mutanti u kojima je bilo koji od H70, H72 i H110 je supstituisan sa tirozinom, a dvostruki His mutant u kome su i H70 i H110 supstituisani sa tirozinom, eksprimovan je u FS293 ćelijama lipofekcijom. Svojstva vezivanja antigena C5 His mutanata za 305LO5, pH-zavisno anti-C5 antitelo, određena su modifikovanim BIACORE (registrovani žig) testom kao što je opisano u Primeru 4.6. Ukratko, dodatna faza disocijacije na pH 5.8 je integrisana u BIACORE (registrovani žig) test odmah nakon faze disocijacije na pH 7.4 da bi se procenila disocijacija zavisna od pH između antitela i antigena iz kompleksa formiranih na pH 7.4 . Brzina disocijacije na pH 5.8 određena je obradom i prilagođavanjem podataka korišćenjem softvera za podešavanje krive Scrubber 2.0 (BioLogic Software).
Kao što je prikazano na slici 8, C5 jednostruka His mutacija na H70 ili H110 i dvostruka His mutacija (H70 H110) nisu uticale na vezivanje C5 za 305LO5 pri neutralnom pH. U međuvremenu, pojedinačna His mutacija na H72 pokazala je značajno oštećenje vezivanja C5 za 305LO5. Stope disocijacije pri pH 5.8 za C5 His mutante i C5-wt protein su prikazane u Tabeli 6. Kao što je prikazano u Tabeli 6, C5-wt je pokazao najbržu disocijaciju od 305LO5 pri pH 5.8 među testiranim C5 antigenima. Pojedinačna His mutacija na H70 pokazala je skoro dvostruko sporiju stopu disocijacije pri pH 5.8, a pojedinačna His mutacija na H110 je rezultirala nešto sporijom brzinom disocijacije na pH 5.8 u poređenju sa C5-wt. Dvostruka His mutacija na H70 i H110 rezultirala je većim efektom na vezivanje zavisno od pH sa brzinom disocijacije na pH 5.8 skoro tri puta sporijom od C5-wt.
[Tabela 6]
[PRIMER 5]
Inhibitorna aktivnost anti-C5 antitela na aktivaciju C5
5.1. Inhibicija lipozomske lize aktivirane komplementom pomoću anti-C5 MAbs. Anti-C5 MAbs su testirane na inhibiciju aktivnosti komplementa testom lipozomske lize. Trideset mikrolitara normalnog humanog seruma (6,7%) (Biopredic, SER018) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog MAb u ploči sa 96 ležišta i inkubirano na šejkeru 30 minuta na 25 stepeni C. Lipozomi senzibilisani antitelima protiv dinitrofenila (Autokit CH50, Wako, 995-40801) su prebačeni u svako ležište i ploča je stavljena na šejker 2 minuta na 25 stepeni C. U svako ležište je dodato 50 mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) i mešano mućkanjem 2 minuta na 25 stepeni C. Konačna smeša je inkubirana na 37 stepeni C tokom 40 minuta, a zatim je izmerena OD na 340 nm smeše. Procenat lipozomske lize je definisan kao 100 × [(ODMAb- ODpozadina seruma i lipozoma)]/ [(ODbez MAb-ODpozadina seruma i lipozoma)]. Slika 9A pokazuje da anti-C5 Mabs: CFA0305, 0307, 0366, 0501, 0538, 0599, 0666, 0672 i 0675, inhibiraju lipozomsku lizu. Dva antitela koja nisu zavisna od pH: CFA0330 i 0341, takođe su inhibirala lizu (Slika 9B).
5.2. Inhibicija C5a generacije sa anti-C5 MAbs
Anti-C5 MAbs su testirani na stvaranje C5a tokom lipozomske lize da bi se potvrdilo da anti-C5 MAbs inhibiraju cepanje C5 na C5a i C5b. Nivo C5a u supernatantima iz testa lipozomske lize je kvantifikovan korišćenjem C5a ELISA kompleta (R&D systems, DY2037). Sva MAbs su inhibirala stvaranje C5a u supernatantima zavisno od doze (Slike 10A i 10B).
5.3. Inhibicija hemolize aktivirane komplementom od strane anti-C5 MAbs
Anti-C5 MAbs su testirani na inhibiciju klasične aktivnosti komplementa u hemolitičkom testu. Pileća crvena krvna zrnca (cRBCs) (Innovative research, IC05-0810) su isprana želatinom/veronalom puferovanim slanim rastvorom koji sadrži 0,5 mM MgCl2i 0,15 mM CaCl2(GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X), a nakon toga senzibilisana anti-pilećim RBC antitelom (Rockland 103-4139) pri 1 mikro g/ml tokom 15 minuta na 4 stepena C. Ćelije su zatim isprane GVB++ i suspendovane u istom puferu na 5×10<7>ćelije/ml. U posebnoj ploči za mikrotestiranje sa 96 ležišta sa okruglim dnom, 50 mikro l normalnog humanog seruma (20%) (Biopredic, SER019) je pomešano sa 50 mikro l razblaženog Mab i inkubirano na šejkeru na 37 stepeni C tokom 30 minuta. Šezdeset mikrolitara senzibilisane suspenzije cRBC je zatim dodato u ležišta koja sadrže serum, i smeša antitela je inkubirana na 37 stepeni C tokom 30 minuta. Nakon inkubacije, ploča je centrifugirana na 1000 × g tokom 2 minuta na 4 stepena C. Supernatanti (100 mikro l) su prebačeni u ležišta na mikrotest ploči sa 96 ležišta ravnog dna za merenje OD na 415 nm sa referentnom talasnom dužinom na 630 nm. Procenat hemolize je definisan kao 100 × [(ODMAb- ODserum i CRBC)]/ [(ODbez MAb- ODpozadina seruma i cRBC)]. Slika 11 pokazuje da anti-C5 Mabs: CFA0305 i 305LO5, inhibiraju hemolizu cRBC.
5.4. Inhibicija alternativnog puta komplementa od strane anti-C5 MAbs
Hemolitički test za alternativni put je izveden na sličan način kao i hemolitički test za klasični put. Krv sakupljena od novozelandskog belog zeca (InVivos) pomešana je sa istom zapreminom Alseverovog rastvora (Sigma, A3551), a smeša je korišćena kao zečji eritrociti (rRBC). rRBC su isprani sa GVB sa dodatkom 2 mM MgCl2i 10 mM EGTA i suspendovani u istom puferu na 7×10<8>ćelija/ml. U mikrotest ploči sa 96 ležišta sa okruglim dnom, 40 mikro l normalnog humanog seruma (25%) (Biopredic, SER019) je pomešano sa 40 mikro l razblaženog Mab i inkubirano na šejkeru na 37 stepeni C tokom 30 minuta. Potom je 20 mikrolitara suspenzije rRBC dodato u ležišta koja sadrže serum, i smeša antitela je inkubirana na 37 stepeni C tokom 60 minuta. Nakon inkubacije, ploča je centrifugirana na 1000 × g tokom 2 minuta na 4 stepena C. Supernatanti (70 mikro l) su prebačeni u ležišta na mikrotest ploči sa 96 ležišta ravnog dna za merenje OD na 415 nm sa referentnom talasnom dužinom na 630 nm. Slika 12 pokazuje da anti-C5 Mabs: CFA0305 i CFA0672, inhibiraju hemolizu rRBC, što ukazuje da ova antitela inhibiraju alternativne puteve komplementa.
[PRIMER 6]
Farmakokinetička studija anti-C5 monoklonskih antitela sa humanim C5 kod miševa
6.1. In vivo test korišćenjem C57BL/6 miševa
In vivo kinetika humanog C5 (Calbiochem) i anti-humanog C5 antitela je procenjena nakon davanja humanog C5 samog ili humanog C5 i anti-humanog C5 antitela C57BL/6 miševima (In vivos ili Biological Resource Centre, Singapur). Rastvor humanog C5 (0,01 mg/ml) ili rastvor smeše koja sadrži humani C5 i anti-humano C5 antitelo (0,01 mg/ml i 2 mg/ml (CFA0305F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4 i CFA0675-F760G4) ili 0,2 mg/ml (CFA0330-F760G4 i CFA0341-F760G4), tim redosledom) davan je u dozi od 10 ml/ kg u kaudalnu venu. U ovom slučaju, anti-humano C5 antitelo je prisutno u višku u odnosu na humano C5, i stoga se pretpostavlja da je skoro svaki humani C5 vezan za antitelo. Krv je uzeta 5 minuta, sedam sati, jedan dan, dva dana, tri dana i sedam dana nakon davanja. Sakupljena krv je odmah centrifugirana na 14.000 rpm i 4 stepena C tokom 10 minuta da bi se odvojila plazma. Odvojena plazma je čuvana u frižideru na -80 stepeni C pre analize. Anti-humana C5 antitela koja se koriste su: gore opisana CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0330-F760G4, CFA0341-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4 i CFA0675-F760G4.
6.2. Merenje ukupne koncentracije C5 u plazmi kod ljudi pomoću testa elektrohemiluminiscencije (ECL)
Koncentracija ukupnog humanog C5 u plazmi miša je merena pomoću ECL.
U prisustvu samo CFA0330-F760G4, CFA0341-F760G4 ili humanog C5 u uzorku plazme, korišćena je sledeća metoda. Anti-humano C5 antitelo (Santa Cruz) je raspoređeno na golu ploču MULTI-ARRAY sa 96 ležišta (Meso Scale Discovery) i ostavljeno da stoji preko noći na 4 stepena C da bi se pripremile ploče imobilisane protiv humanog C5. Uzorci kalibracione krive i uzorci mišje plazme razblaženi 100 puta ili više sa 1 mikro g/ml ubrizganim antitelom (CFA0330-F760G4 ili CFA0341-F760G4) su pripremljeni i inkubirani 30 minuta na 37 stepeni C. Uzorci su zatim stavljeni na anti-humane C5-imobilisane ploče i ostavljene da odstoje jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato anti-humano IgG antitelo obeleženo SULFO-TAG (Meso Scale Discovery) da reaguje jedan sat na sobnoj temperaturi i izvršeno je ispiranje. Odmah nakon toga, ispušten je pufer za čitanje T (x4) (Meso Scale Discovery) i merenje je izvršeno korišćenjem Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
U prisustvu CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4, ili CFA0675-F760G4 u uzorku plazme korišćena je sledeći postupak. Anti-humano C5 antitelo (CFA0329F939G4; VH, SEQ ID NO: 23 i VL, SEQ ID NO: 27) je naneto na golu ploču MULTI-ARRAY sa 96 ležišta (Meso Scale Discovery) i ostavljeno da stoji preko noći na 4 stepeni C za pripremu anti-humanih C5 imobilizovanih ploča. Uzorci kalibracione krive i uzorci mišje plazme razblaženi 100 puta ili više kiselim rastvorom (pH 5.5) su pripremljeni i inkubirani 30 minuta na 37 stepeni C. Nakon toga, uzorci su naneti na ploče imobilisane protiv humanog C5 i ostavljeni da odstoje jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato SULFO-TAG obeleženo anti-humano C5 antitelo (CFA0300-F939G4; VH, SEQ ID NO: 24 i VL, SEQ ID NO: 28) da reaguje jedan sat na sobnoj temperaturi, i izvršeno je ispiranje. Odmah nakon toga, nanet je pufer za čitanje (Read Buffer) T (x4) (Meso Scale Discovery) i merenje je izvršeno korišćenjem Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
Koncentracija humanog C5 je izračunata na osnovu odgovora kalibracione krive korišćenjem analitičkog softvera SOFTmax PRO (Molecular Devices). Vremenski tok koncentracije humanog C5 u plazmi posle intravenske primene izmeren ovim postupkom je prikazan na Slici 13. Podaci su prikazani kao procenat preostalih u poređenju sa koncentracijom humanog C5 u plazmi za 5 minuta.
6.3. Merenje koncentracije anti-humanog C5 antitela u plazmi pomoću ECL testa
Koncentracija anti-humanog C5 antitela u plazmi miša je merena pomoću ECL. Anti-humani IgG (specifičan za gama lanac) F(ab’)2 fragment antitela (Sigma) ili anti-humani IgG kapa lanac antitela (Antibody Solutions) je stavljen na golu ploču MULTI-ARRAY sa 96 ležišta (Meso Scale Discovery) i ostavljeno da stoji preko noći na 4 stepena C da bi se pripremile anti-humane IgG-imobilisane ploče. Pripremljeni su uzorci kalibracione krive i uzorci mišje plazme razblaženi 100 puta ili više. Nakon toga, uzorci su raspoređeni na anti-humane IgG-imobilisane ploče i ostavljeni da stoje jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato biotinilovano anti-humano IgG antitelo (Southernbiotech) ili SULFO-TAG obeleženo anti-humano IgG Fc antitelo (Southernbiotech) da reaguje jedan sat na sobnoj temperaturi i izvršeno je ispiranje. Nakon toga, samo kada je korišćeno biotinilovano anti-humano IgG antitelo, dodat je streptavidin obeležen SULFO-TAG (Meso Scale Discovery) da reaguje jedan sat na sobnoj temperaturi i izvršeno je ispiranje. Odmah nakon toga, ispušten je pufer za čitanje T (x4) (Meso Scale Discovery) i merenje je izvršeno korišćenjem Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Koncentracija anti-humanog C5 antitela je izračunata na osnovu odgovora kalibracione krive korišćenjem analitičkog softvera SOFTmax PRO (Molecular Devices). Vremenski tok koncentracije anti-humanog C5 antitela u plazmi posle intravenske primene izmeren ovim postupkom je prikazan na Slici 14. Podaci su prikazani kao procenat preostalih u poređenju sa koncentracijom anti-humanog C5 antitela u plazmi za 5 minuta.
6.4. Efekat vezivanja anti-humanog C5 antitela zavisnog od pH na klirens humanog C5 in vivo
Anti-humana C5 antitela zavisna od pH (CFA0305-F760G4, CFA0307-F760G4, CFA0366-F760G4, CFA0501-F760G4, CFA0538-F760G4, CFA0599-F760G4, CFA0666-F760G4, CFA0672-F760G4 i CFA0675-F760G4) i anti-humana C5 antitela koja ne zavise od pH (CFA0330-F760G4 i CFA0341-F760G4) su testirana in vivo i upoređena je dobijena koncentracija anti-humanog C5 antitela u plazmi i koncentracija humanog C5 u plazmi. Kao što je prikazano na Slici 14, izloženost antitelu je bila uporediva. U međuvremenu, klirens humanog C5 koji je istovremeno davan anti-humanim C5 antitelima zavisnim od pH je ubrzan u poređenju sa onim anti-humanih C5 antitela koja nisu zavisna od pH (Slika 13).
[PRIMER 7]
Optimizacija anti-C5 monoklonskih antitela (305 varijanti)
Izvestan broj mutacija je uveden u optimizovani varijabilni region anti-C5 antitela 305LO5 da bi se dodatno poboljšala njegova svojstva, a generisani su optimizovani varijabilni regioni 305LO15, 305LO16, 305LO18, 305LO19, 305LO20, 305LO22 i 305LO23. Sekvence amino-kiselina VH i VL od 305 varijanti su navedene u Tabelama 7 i 8, tim redosledom. Geni koji kodiraju humanizovani VH su kombinovani sa modifikovanom humanom IgG1 CH varijantom SG115 (SEQ ID NO: 114), i modifikovanom humanom IgG4 CH varijantom SG422 (SEQ ID NO: 115) ili SG429 (SEQ ID NO: 116). Geni koji kodiraju humanizovani VL su kombinovani sa humanim CL (SK1, SEQ ID NO: 38). Odvojeno, sintetisani su geni teškog i lakog lanca koji kodiraju humanizovano anti-C5 antitelo, BNJ441 (BNJ441H, SEQ ID NO: 149; BNJ441L, SEQ ID NO: 150), i svaki je kloniran u ekspresioni vektor.
Antitela su eksprimovana u ćelijama HEK293 ko-transfektovanim kombinacijom ekspresionih vektora teškog i lakog lanca i prečišćena su proteinom A.
Tabela 7
[Tabela 8]
[PRIMER 8]
Karakterizacija vezivanja anti-C5 antitela (305 varijanti)
Kinetički parametri anti-C5 antitela protiv rekombinantnog humanog C5 su procenjeni na 37 stepeni C korišćenjem BIACORE (registrovani žig) T200 instrumenta (GE Healthcare) u tri različita stanja; (1) i asocijacija i disocijacija su bile na pH 7.4, (2) i asocijacija i disocijacija su bile na pH 5.8, i (3) asocijacija je bila na pH 7.4, ali je disocijacija bila na pH 5.8. ProA/G (Pierce) je imobilisan na CM1 senzorski čip korišćenjem kompleta za spajanje amina (GE Healthcare) u skladu sa postavkama koje preporučuje GE Healthcare. Antitela i analiti za stanje (1) i (3) su razblaženi u ACES pH 7.4 puferu (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20, 0,005% NaN3) i za uslov (2) su razblaženi u ACES pH 5.8 puferu (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20, 0,005% NaN3). Svako antitelo je uhvaćeno na površinu senzora pomoću ProA/G. Nivoi hvatanja antitela bili su tipično 60-90 rezonantnih jedinica (RU). Zatim je rekombinantni humani C5 ubrizgan pri 3 do 27 nM ili 13,3 do 120 nM pripremljen trostrukim serijskim razblaženjem, nakon čega je usledila disocijacija. Površina je regenerisana upotrebom 25 mM NaOH. Kinetički parametri u uslovima (1) i (2) određeni su prilagođavanjem senzorgrama sa 1:1 modelom vezivanja, a brzina disocijacije u uslovima (3) je određena prilagođavanjem senzorgrama sa 1:1 disocijacijom za MCK model korišćenjem BIACORE (registrovani žig) T200 softvera za procenu, verzija 2.0 (GE Healthcare). pH zavisnost svih antitela prikazana je kao odnos brzine disocijacije stanja (2) i (1).
Brzina asocijacije (ka), brzina disocijacije (kd), afinitet vezivanja (KD) i zavisnost od pH su navedeni u Tabeli 9. Sva antitela su pokazala bržu brzinu disocijacije pri pH 5.8 od pH 7.4 i njihova pH zavisnost je bila oko 20 puta.
[Tabela 9]
Afinitet vezivanja anti-C5 antitela (BNJ441, ekulizumab i varijanta 305) za rekombinantni humani C5 na pH 7.4 i pH 5.8 je određen na 37 stepeni C korišćenjem BIACORE (registrovani žig) T200 instrumenta (GE Healthcare) za procenu efekta pH na vezivanje antigena. Kozje anti-humano IgG (Fc) poliklonsko antitelo (KPL #01-10-20) je imobilisano na CM4 senzorski čip korišćenjem kompleta za spajanje amina (GE Healthcare) u skladu sa preporučenim podešavanjima proizvođača. Antitela i analiti su razblaženi ili u ACES pH 7.4 puferu ili ACES pH 5.8 puferu koji sadrži 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20 i 0,005% NaN3. Antitela su uhvaćena na površini senzora korišćenjem anti-Fc metode, nivoi hvatanja su obično bili 50-80 rezonantnih jedinica (RU). Rekombinantni humani C5 je pripremljen trostrukim serijskim razblaženjem počevši od 27 nM za uslove ispitivanja na pH 7.4, ili 135 nM za uslove ispitivanja na pH 5.8. Površina je regenerisana korišćenjem 20 mM HCl, 0,01% Tween 20. Podaci su obrađeni i usklađeni sa 1:1 modelom vezivanja korišćenjem softvera BiaEvaluation 2.0 (GE Healthcare).
Afinitet vezivanja (KD) BNJ441, ekulizumaba i varijante 305 za rekombinantni humani C5 na pH 7.4 i pH 5.8 prikazan je u Tabeli 10. Varijanta 305 je pokazala odnos (KD na pH 5.8)/(KD na pH 7.4) od skoro 800, 8 puta veći od BNJ441 koji je pokazao samo odnos (KD na pH 5.8)/(KD na pH 7.4) od 93.
[Tabela 10]
[PRIMER 9]
Inhibitorna aktivnost anti-C5 antitela (305 varijanti) na aktivaciju C5
9.1. Inhibicija lipozomske lize aktivirane komplementom pomoću anti-C5 MAbs. Anti-C5 MAbs su testirane na inhibiciju aktivnosti komplementa testom lipozomske lize. Trideset mikrolitara normalnog humanog seruma (6,7%) (Biopredic, SER019) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog MAb u ploči sa 96 ležišta i inkubirano na šejkeru 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor liposoma senzibilisan antitelima protiv dinitrofenila (Autokit CH50, Wako, 995-40801) je prebačen u svako ležište i stavljen na šejker 2 minuta na 37 stepeni C. U svako ležište je dodato 50 mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) i mešano mućkanjem 2 minuta na 37 stepeni C. Konačna smeša je inkubirana na 37 stepeni C tokom 40 minuta, a zatim je izmerena OD na 340 nm. Procenat lipozomske lize je definisan kao 100 × [(ODMAb- ODpozadina seruma i liposoma)]/ [(ODbez MAb- ODpozadina seruma i liposoma)]. Slika 15 pokazuje da su anti-C5 Mabs: 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422 i 305LO20-SG115 inhibirali lipozomsku lizu. Dva antitela sa Fc varijantama: 305LO15-SG115 i 305LO23-SG429, takođe su inhibirala lipozomsku lizu (Slika 16).
Anti-C5 MAbs su testirani na inhibiciju rekombinantnog humanog C5 (SEQ ID NO: 39). Deset mikrolitara humanog seruma sa nedostatkom CS (Sigma, C1163) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog MAb i 20 mikro L rekombinantnog C5 (0,1 mikro g/mL) u ploči sa 96 ležišta i inkubirano na šejkeru 1 sat na 37 stepeni C. Lipozomi (Autokit CH50) su prebačeni u svako ležište i stavljeni na šejker 2 minuta na 37 stepeni C. U svako ležište je dodato 50 mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) i mešano mućkanjem 2 minuta na 37 stepeni C. Konačna smeša je inkubirana na 37 stepeni C tokom 180 minuta, a zatim je izmerena OD na 340 nm. Procenat lipozomske lize je definisan kao gore. Slika 17 pokazuje da anti-C5 Mabs: 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 i 305LO23-SG422 inhibiraju lipozomsku lizu.
9.2. Inhibicija C5a generacije anti-C5 MAbs
Anti-C5 MAbs su testirani na stvaranje C5a tokom lipozomske lize da bi se potvrdilo da anti-C5 MAbs inhibiraju cepanje C5 u C5a i C5b. Nivoi C5a u supernatantima iz testa lipozomske lize su kvantifikovani korišćenjem C5a ELISA kompleta (R&D sistemi, DY2037). Sva MAbs su inhibirala stvaranje C5a u supernatantima na način zavisan od doze (Slike 18 i 19).
9.3. Merenje aktivnosti komplementa u plazmi majmuna makaki rakojeda
Anti-C5 MAbs su testirani na inhibiciju aktivnosti komplementa u plazmi majmuna makaki rakojeda. Anti-C5 Mabs su intraprimenjene majmunima (20 mg/kg), a uzorci plazme su sakupljani periodično do 56. dana. Pileća crvena krvna zrnca (cRBC) (Innovative research, IC05-0810) su isprana želatinom/veronski puferisanim fiziološkim rastvorom koji sadrži 0,5 mM MgCl2i 0,15 mM CaCl2(GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X), a nakon toga senzibilisana anti-pilećim RBC antitelom (Rockland 103-4139) pri 1 mikro g/ml tokom 15 minuta na 4 stepena C. Ćelije su zatim isprane GVB++ i suspendovane u istom puferu na 1×10<8>ćelija/ml. U odvojenoj mikrotest ploči sa 96 ležišta sa okruglim dnom, plazma majmuna je inkubirana sa senzibilisanim cRBC na 37 stepeni C tokom 20 minuta. Nakon inkubacije, ploča je centrifugirana na 1000 × g tokom 2 minuta na 4 stepena C. Supernatanti su prebačeni u ležišta na mikrotest pločama sa 96 ležišta ravnog dna za merenje OD na 415 nm sa referentnom talasnom dužinom na 630 nm. Procenat hemolize je definisan kao 100 × [(ODNakon primene- ODpozadina plazme i cRBCs)]/ [(ODPre primene-ODpozadina plazme i cRBCs)]. Slika 20 pokazuje da anti-C5 MAbs: 305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115 i 305LO23-SG115 inhibira aktivnost komplementa u plazmi.
9.4. Inhibicija biološke aktivnosti C5 varijanti anti-C5 MAbs
Anti-CS MAbs su testirani na inhibiciju rekombinantnih humanih C5 varijanti: V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D. Prijavljeno je da pacijenti sa PNH koji imaju mutaciju R885H u C5 pokazuju slab odgovor na ekulizumab (videti, npr. Nishimura et al., New Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)). Svaka od varijanti humanog C5 je eksprimovana u FS293 ćelijama, a supernatanti su korišćeni za sledeću studiju. Deset mikrolitara humanog seruma sa nedostatkom CS (Sigma, C1163) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog MAb i 20 mikro L medijuma za ćelijsku kulturu koji sadrži rekombinantnu C5 varijantu (2-3 mikro g/mL) u ploči sa 96 ležišta i inkubirano na šejkeru 0,5 sata na 37 stepeni C. Lipozomi (Autokit CH50) su prebačeni u svako ležište i stavljeni na šejker 2 minuta na 37 stepeni C. U svako ležište je dodato 50 mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) i mešano mućkanjem 2 minuta na 37 stepeni C. Konačna smeša je inkubirana na 37 stepeni C tokom 90 minuta, a zatim je izmerena OD na 340 nm. Procenat lipozomske lize je definisan kao gore. Slika 21 pokazuje da anti-C5 MAb (ekulizumab) nije inhibirao R885H C5 varijantu, ali je inhibirao druge testirane varijante. Slika 22 pokazuje da anti-C5 MAb (varijanta 305) inhibira sve testirane varijante C5.
9.5. Inhibicija lipozomske lize aktivirane komplementom od strane anti-C5 MAbs
Anti-C5 MAbs su testirani na inhibiciju aktivnosti komplementa testom lipozomske lize. Trideset mikrolitara normalnog humanog seruma (6,7%) (Biopredic, SER019) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog MAb u ploči sa 96 ležišta i inkubirano na šejkeru 30 minuta na sobnoj temperaturi. Rastvor lipozoma senzibilisan antitelima protiv dinitrofenila (Autokit CH50, Vako, 995-40801) je prebačen u svako ležište i stavljen na šejker 2 minuta na 25 stepeni C. U svako ležište je dodato 50 mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) i mešano mućkanjem 2 min na 25 stepeni C. Konačna smeša je inkubirana na 37 stepeni C tokom 45 minuta, a zatim je izmerena OD na 340 nm. Procenat inhibicije lipozomske lize je definisan kao 100 × [(ODMAb- ODpozadina seruma i
liposoma)]/ [(ODbez MAb- ODpozadina seruma i liposoma)]. Slika 23 pokazuje da anti-C5 MAbs, BNJ441 i varijanta 305 inhibiraju lipozomsku lizu, i da varijanta 305 ima jaču inhibitornu aktivnost od BNJ441.
[PRIMER 10]
Farmakokinetička studija anti-C5 monoklonskih antitela (305 varijanti) kod majmuna makaki rakojeda
10.1. In vivo test korišćenjem majmuna makaki rakojeda
In vivo kinetika anti-humanog C5 antitela je procenjena nakon davanja anti-humanog C5 antitela kod majmuna makaki rakojeda (Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd., Japan). Rastvor antihumanog C5 antitela (2,5 mg/ml) je davan jednom u dozi od približno 8 ml/kg u cefaličnu venu podlaktice 30-minutnom infuzijom. Krv je uzeta pre davanja i 5 minuta, sedam sati, jedan dan, dva dana, tri dana, sedam dana, četrnaest dana, dvadeset jedan dan, dvadeset osam dana, trideset pet dana, četrdeset dva dana, četrdeset devet dana i pedeset šest dana nakon primene. Sakupljena krv je odmah centrifugirana na 1.700 × g i 4 stepena C tokom 10 minuta da bi se odvojila plazma. Odvojena plazma je čuvana u frižideru na -70 stepeni C ili ispod pre analize. Anti-humana C5 antitela su pripremljena kao što je opisano u Primeru 7.
10.2. Merenje ukupne koncentracije C5 u plazmi majmuna makaki rakojeda ELISA testom
Koncentracija ukupnog C5 majmuna makaki rakojeda u plazmi majmuna makaki rakojeda merena je ELISA testom. Anti-humano C5 antitelo (in-house antitelo generisano metodom opisanom u Primeru 2) je stavljeno na Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) i ostavljeno da stoji preko noći na 4 stepena C da bi se pripremile ploče imobilisane anti-C5 majmuna makaki rakojeda. Uzorci kalibracione krive i uzorci plazme majmuna makaki rakojeda razblaženi 20000 puta sa ubrizganim antitelom od 0,4 mikro g/ml su pripremljeni i inkubirani 60 minuta na 37 stepeni C. Nakon toga, uzorci su stavljeni na ploču imobilisanu anti-C5 majmuna makaki rakojeda i ostavljeni jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato anti-humano IgG antitelo obeleženo HRP (SouthernBiotech) da reaguje trideset minuta na sobnoj temperaturi i izvršeno je ispiranje. Zatim je dodat ABTS ELISA HRP supstrat (KPL). Signal je meren čitačem ploča na talasnoj dužini od 405 nm. Koncentracija C5 majmuna makaki rakojeda je izračunata na osnovu odziva kalibracione krive korišćenjem analitičkog softvera SOFTmax PRO (Molecular Devices). Vremenski tok koncentracije C5 majmuna makaki rakojeda u plazmi nakon intravenskog davanja izmeren ovom metodom je prikazan na slici 24. Podaci su prikazani kao procenat preostalih u poređenju sa koncentracijom C5 majmuna makaki rakojeda u plazmi pre davanja. Anti-humana C5 antitela zavisna od pH (305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG422 i 305LO23-SG115) pokazala su nižu akumulaciju C5 u plazmi u poređenju sa antihumanim C5 antitelima koja nisu zavisna od pH vrednosti.
10.3. Merenje koncentracije anti-humanog C5 antitela u plazmi pomoću ELISA testa
Koncentracija anti-humanog C5 antitela u plazmi majmuna makaki rakojeda merena je ELISA testom. Anti-humani IgG kapa lanac antitela (Antibody Solutions) je naneto na Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) i ostavljeno da stoji preko noći na 4 stepena C da bi se pripremile ploče imobilisane anti-humanim IgG. Pripremljeni su uzorci kalibracione krive i uzorci plazme majmuna makaki rakojeda razblaženi 100 puta ili više. Nakon toga, uzorci su naneti na anti-humane IgG-imobilisane ploče i ostavljeni da stoje jedan sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato anti-humano IgG antitelo obeleženo HRP (SouthernBiotech) da reaguje trideset minuta na sobnoj temperaturi i izvršeno je ispiranje. Zatim je dodat ABTS ELISA HRP supstrat (KPL). Signal je meren čitačem ploča na talasnoj dužini od 405 nm. Koncentracija anti-humanog C5 antitela je izračunata na osnovu odgovora kalibracione krive korišćenjem analitičkog softvera SOFTmax PRO (Molecular Devices). Vremenski tok koncentracije antihumanih C5 antitela u plazmi nakon intravenskog davanja mereno ovom metodom prikazan je na slici 25. Anti-humana C5 antitela zavisna od pH (305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG422 i 305LO23-SG115) pokazuju duži poluživot u poređenju sa antitelima C5 koja nisu zavisna od pH.
[PRIMER 11]
Analiza rendgenske kristalne strukture 305 varijante Fab i humanog C5-MG1 domenskog kompleksa
11.1. Ekspresija i prečišćavanje MG1 domena (20-124) humanog C5
MG1 domen (aminokiselinski ostaci 20-124 SEQ ID NO: 39) fuzionisan sa GST-oznakom preko linkera koji se cepa trombinom (GST-MG1) eksprimovan je u soju E. coli BL21 DE3 pLysS (Promega) korišćenjem pGEX- 4T-1 vektora (GE Healthcare). Ekspresija proteina je indukovana sa 0,1 mM izopropil beta-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG) na 25 stepeni C tokom 5 sati. Peleta bakterijskih ćelija je lizirana sa Bugbusterom (Merck) sa dodatkom lizonaze (Merck) i kompletnog koktela inhibitora proteaze (Roche), nakon čega je usledilo prečišćavanje GST-MG1 iz rastvorljive frakcije korišćenjem GSTrap kolone (GE healthcare) prema uputstvu proizvođača. GST oznaka je odcepljena trombinom (Sigma), a dobijeni MG1 domen je dalje prečišćen sa Superdex 75 kolonom za gel filtraciju (GE healthcare). Frakcije koje sadrže MG1 domen su objedinjene i uskladištene na -80 stepeni C.
11.2. Priprema Fab fragmenta varijante 305
Fab fragmenti jedne od optimizovanih varijanti iz 305 pripremljeni su konvencionalnim postupkom korišćenjem ograničene digestije sa papainom (Roche Diagnostics, Cat No.1047825), nakon čega je stavljeno na kolonu proteina A (MabSlect SuRe, GE Healthcare) da bi se uklonili Fc fragmenti, kolona za katjonsku izmenu (HiTrap SP HP, GE Healthcare) i kolona za gel filtraciju (Superdex200 16/60, GE Healthcare). Frakcije koje sadrže Fab fragment su sakupljene i čuvane na -80 stepeni C.
11.3. Priprema 305 varijante Fab i humanog C5-MG1 domenskog kompleksa
Prečišćeni rekombinantni humani C5-MG1 domen je pomešan sa prečišćenom 305 varijantom Fab fragmentom u molarnom odnosu 1:1. Kompleks je prečišćen hromatografijom sa gel filtracijom (Superdex200 10/300 povećanje, GE Healthcare) korišćenjem kolone ekvilibrisane sa 25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl.
11.4. Kristalizacija
Prečišćeni kompleksi su koncentrovani do oko 10 mg/mL, a kristalizacija je izvedena metodom difuzije pare u statičkom stanju u kombinaciji sa metodom zasejavanja na 4 stepena C. Rastvor rezervoara se sastojao od 0,2 M magnezijum format dehidrata, 15,0% w/v polietilen glikol 3350. Ovo je uspelo da dobije kristale nalik ploči za nekoliko dana. Kristal je natopljen rastvorom 0,2 M magnezijum formata dehidrata, 25,0% w/v polietilen glikola 3350 i 20% glicerola.
11.5. Prikupljanje podataka i određivanje strukture
Podaci o difrakciji rendgenskih zraka mereni su pomoću BL32XU na SPring-8. Tokom merenja, kristal je konstantno stavljan u struju azota na -178 stepeni C da bi se održalo zamrznuto stanje, a prikupljeno je ukupno 180 slika difrakcije rendgenskih zraka korišćenjem MX-225HS CCD detektora (RAYONIX) pričvršćenog za snop liniju, dok se rotira kristal za 1,0 stepen u isto vreme. Određivanje parametara ćelije, indeksiranje difrakcionih tačaka i obrada podataka o difrakciji dobijenih sa difrakcionih slika obavljeni su pomoću programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 43:186-190 (2010), XDS paket (Acta. Cryst. D66:125-132 (2010)), i Scala (Acta. Cryst. D62:72-82 (2006)), i konačno su dobijeni podaci o intenzitetu difrakcije do rezolucije od 2,11 Angstroma. Statistika kristalografskih podataka je prikazana u Tabeli 11.
[Tabela 11]
Struktura je određena molekularnom zamenom programom Phaser (J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007)). Model pretrage Fab domena je izveden iz objavljene humane IgG4 Fab kristalne strukture (PDB kod: 1BBJ), a model pretrage MG1 domena je iz objavljene humane C5 kristalne strukture (PDB kod: 3CU7, Nat.Immunol. 9:753-760 (2008)). Model je napravljen pomoću programa Coot (Acta Crist. D66:486-501 (2010)) i dorađen programom Refmac5 (Acta Cryst. D67:355-367 (2011)). Faktor kristalografske pouzdanosti (R) za podatke o intenzitetu difrakcije od 25-2.11 Angstroma bio je 20,42%, sa slobodnom R vrednošću od 26,44%. Statistika rafinacije strukture prikazana je u Tabeli 11.
11.6. Ukupna struktura 305 varijante Fab i C5-MG1 domenskog kompleksa
Fab fragment optimizovane varijante od 305 („305 Fab”) vezan za humani C5-MG1 domen („MG1”) u odnosu 1:1, a asimetrična jedinica kristalne strukture sadržala je dva kompleksa, Molekule 1 i 2, kao što je prikazano na Slici 26A. Molekuli 1 i 2 mogu biti dobro poređani na 0,717 Angstroma RMSD sa pozicijom C alfa atoma u svim ostacima, kao što je prikazano na Slici 26B. Cifre o kojima se govori u nastavku su pripremljene korišćenjem Molekula 1.
Na slikama 27A i 27B, epitop kontaktnog regiona 305 Fab je mapiran u sekvenci amino-kiselina MG1 i u kristalnoj strukturi, tim redosledom. Epitop uključuje aminokiselinske ostatke MG1 koji sadrže jedan ili više atoma koji se nalaze na udaljenosti od 4,5 Angstroma od bilo kog dela 305 Fab u kristalnoj strukturi. Pored toga, epitop unutar 3,0 Angstroma je istaknut na Slici 27A.
11.7. Interakcije E48, D51 i K109
Kao što je opisano u Primerima 4.5 i 4.6, anti-C5 Mab koji uključuju seriju antitela 305 su testirani na vezivanje za tri humana mutanta C5 tačke, E48A, D51A i K109A, Western blot i BIACORE (registrovani žig) analizom vezivanja. Dok su 305 varijante snažno vezivale WT C5, one su vezivale E48A mutant C5 samo slabo i nisu se vezivale za mutante D51A i K109A. Kristalna struktura kompleksa 305 Fab i MG1 otkrila je da su tri amino-kiseline E48, D51 i K109 sve unutar 3,0 Angstroma udaljenosti od 305 Fab, formirajući brojne vodonične veze sa Fab, kao što je prikazano na Slici 28A. Pri detaljnijem ispitivanju, K109 ostatak MG1 je zakopan u žlebu formiranom na interfejsu teškog lanca Fab i čvrsto je u interakciji sa Fab pomoću tri vodonične veze sa H-CDR3_G97, H-CDR3_Y100 i H-CDR3_T100b, i preko slanog mosta sa H-CDR3 _D95 (Slika 28D). D51 se nalazi između MG1 i teškog lanca 305 Fab i pravi dve vodonične veze sa H-CDR1_Ser32 i H-CDR2_Ser54 kako bi ispunio prostor (slika 28C). Ovo ukazuje da su K109 i D51 od C5 kritični ostaci za vezivanje serije 305 antitela. S druge strane, E48 se nalazi bliže površini i formira samo jednu vodoničnu vezu sa Fab, što sugeriše da bi njegov doprinos vezivanju antitela bio manji od doprinosa K109 i E51 (Slika 28B). Ovi odnosi su u skladu sa rezultatima Western blot i BIACORE (registrovani žig) analiza vezivanja humanih C5 mutanata (primeri 4.5 i 4.6). Dodatna napomena: numerisanje ostataka za Fab amino-kiseline je zasnovano na Kabat šemi numerisanja. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)
11.8. Interakcije H70, H72 i H110 humanih C5 i 305 serija antitela
Analiza kristalne strukture je otkrila da su tri histidinska ostatka na humanom C5, naime, H70, H72 i H110, uključena u epitop 305 varijante Fab, kao što je prikazano na slici 27A i slici 29A. BIACORE (registrovani žig) analiza vezivanja je izvršena da bi se istražio doprinos ovih histidinskih ostataka protein-protein interakciji zavisnoj od pH između humanog C5 i 305 varijante Fab korišćenjem humanih C5 mutanata H70Y, H72Y, H110Y i H70Y+H110Y (Primer 4.7). H72Y je rezultirao potpunim gubitkom vezivanja 305 varijante Fab za C5. Ovaj ostatak C5 nalazi se u džepu formiranom od CDR2 petlje teškog lanca 305 Fab i petlje MG1 (L73, S74 i E76) i čvrsto ispunjava ovaj prostor, kao što je prikazano na slici 29C. Pored toga, H72 ostatak C5 pravi vodoničnu vezu sa H-CDR2_Y58. Ne očekuje se da će se mutacija H72Y tolerisati jer nema dovoljno prostora za smeštaj glomaznijeg bočnog lanca tirozina. Takođe se ne može održati vodonična veza sa H-CDR2_Y58. Što se tiče doprinosa H70 i H110 zavisnosti od pH, mutacije H70Y i H110Y dovele su do sporije disocijacije 305 varijante Fab od C5 na pH 5.8. H70 formira intramolekularnu vodoničnu vezu sa T53 MG1, za koju se veruje da je prekinuta pri pH 5.8 kada protonacija H70 od C5 izazove konformacionu promenu u odgovarajućem delu interfejsa interakcije MG1 (Slika 29B). Za H110, očekivalo se da će protonacija ovog C5 ostatka izazvati odbijanje naelektrisanja 305 Fab, što može biti povećano protonacijom susednog ostatka histidina, H-CDR3 _H100c (Slika 29D).
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Anti-C5 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu SEQ ID NO: 111.
2. Antitelo prema zahtevu 1, koje sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 114 i konstantni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 38.
3. Antitelo prema zahtevu 1 ili 2, koje je IgG1 antitelo pune dužine.
4. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
5. Ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 4.
6. Postupak za proizvodnju antitela koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 5 tako da se proizvede antitelo.
7. Anti-C5 antitelo koje se može dobiti postupkom prema zahtevu 6.
8. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3 ili 7 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
RS20231255A 2015-12-18 2016-12-16 Anti-c5 antitela i postupci upotrebe RS64998B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015247069 2015-12-18
PCT/JP2016/087481 WO2017104779A1 (en) 2015-12-18 2016-12-16 Anti-c5 antibodies and methods of use
EP16875755.7A EP3390442B1 (en) 2015-12-18 2016-12-16 Anti-c5 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64998B1 true RS64998B1 (sr) 2024-01-31

Family

ID=58186002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231255A RS64998B1 (sr) 2015-12-18 2016-12-16 Anti-c5 antitela i postupci upotrebe

Country Status (35)

Country Link
EP (2) EP3390442B1 (sr)
JP (5) JP6088703B1 (sr)
KR (2) KR101789973B1 (sr)
CN (2) CN108401431B (sr)
AR (1) AR107077A1 (sr)
AU (1) AU2016372930B2 (sr)
CA (1) CA3005592C (sr)
CL (1) CL2018001577A1 (sr)
CO (1) CO2018007374A2 (sr)
CR (1) CR20180364A (sr)
DK (1) DK3390442T5 (sr)
EA (1) EA036756B1 (sr)
ES (1) ES2969440T3 (sr)
FI (2) FI3390442T3 (sr)
FR (1) FR24C1044I2 (sr)
HR (1) HRP20231456T1 (sr)
HU (2) HUE065073T2 (sr)
IL (1) IL259256B2 (sr)
LT (2) LT3390442T (sr)
MA (1) MA44081B1 (sr)
MX (2) MX2018007144A (sr)
MY (1) MY186948A (sr)
NL (1) NL301300I2 (sr)
PE (2) PE20240365A1 (sr)
PH (1) PH12018501282A1 (sr)
PL (1) PL3390442T3 (sr)
PT (1) PT3390442T (sr)
RS (1) RS64998B1 (sr)
RU (1) RU2742606C2 (sr)
SA (1) SA518391704B1 (sr)
SG (2) SG10201709415WA (sr)
SI (1) SI3390442T1 (sr)
TW (5) TWI747936B (sr)
UA (1) UA123774C2 (sr)
WO (1) WO2017104779A1 (sr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104761637B (zh) 2006-03-31 2021-10-15 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
ES2595638T3 (es) 2007-09-26 2017-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para modificar el punto isoeléctrico de un anticuerpo mediante la sustitución de aminoácidos en una CDR
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
BR112017011235A2 (pt) 2014-12-19 2018-02-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpos anti-c5 e métodos de uso
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
HUE065073T2 (hu) * 2015-12-18 2024-04-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-C5 antitestek és alkalmazási eljárások
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
CN116769024A (zh) 2016-06-14 2023-09-19 瑞泽恩制药公司 抗c5抗体及其用途
IL263657B2 (en) * 2016-06-17 2025-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
CA3274059A1 (en) 2017-12-13 2026-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibody combinations and uses thereof
JP7653909B2 (ja) 2018-09-06 2025-03-31 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒト化抗ｃ５抗体とその利用
EP3958901A4 (en) * 2019-04-24 2023-07-19 The Trustees of the University of Pennsylvania BI-FUNCTIONAL HUMANIZED ANTI-C5 ANTIBODIES AND H-FACTOR FUSION PROTEINS AND THEIR USES
KR20240033090A (ko) 2019-07-31 2024-03-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-c5 항체 크로발리맙의 사용에 의한 c5-관련 질병의 치료 또는 예방을 위한 투여량 및 투여 섭생
CR20220040A (es) 2019-07-31 2022-03-02 Hoffmann La Roche Régimen de dosificación y administración para el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con c5 mediante el uso del anticuerpo anti-c5 crovalimab
BR112023016996A2 (pt) 2021-02-24 2023-09-26 Hoffmann La Roche Métodos para purificar um polipeptídeo terapêutico e para produzir um polipeptídeo terapêutico e usos de uma solução ácida e de uma solução alcalina

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2283594T5 (es) 2001-08-17 2016-03-15 Genentech, Inc. Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a C5 y C5a sin impedir la formación de C5b
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
EP1500400A4 (en) 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
CN1780850A (zh) * 2003-02-28 2006-05-31 抗基因公司 凝集素在促进糖蛋白和抗原分子的低聚反应中的用途
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP5722524B2 (ja) * 2006-03-02 2015-05-20 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体活性を抑制することによる同種移植片の生存の延長
NZ571791A (en) * 2006-03-08 2012-03-30 Archemix Llc Complement binding aptamers and anti-C5 agents useful in the treatment of ocular disorders
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
AU2008228247A1 (en) * 2007-03-22 2008-09-25 Novartis Ag C5 antigens and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
KR102057826B1 (ko) * 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
WO2009152354A1 (en) * 2008-06-14 2009-12-17 Vytronus, Inc. System and method for delivering energy to tissue
PY09026846A (es) * 2008-08-05 2015-09-01 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos que se dirigen a la proteína de complemento c5
ES2615732T3 (es) 2010-03-01 2017-06-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Composiciones para tratar la enfermedad de Degos
JP5932670B2 (ja) * 2010-03-11 2016-06-08 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体
EP2825036B1 (en) * 2012-03-16 2018-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
TWI619729B (zh) * 2012-04-02 2018-04-01 再生元醫藥公司 抗－ｈｌａ－ｂ*２７抗體及其用途
US9540449B2 (en) * 2012-08-13 2017-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics
WO2014119969A1 (ko) * 2013-01-31 2014-08-07 서울대학교 산학협력단 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 c5 항체 및 방법
CA2920293A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of graft rejection by administering a complement inhibitor to an organ prior to transplant
WO2015127134A2 (en) * 2014-02-20 2015-08-27 Allergan, Inc. Complement component c5 antibodies
NZ631007A (en) * 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
BR112017011235A2 (pt) * 2014-12-19 2018-02-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpos anti-c5 e métodos de uso
HUE065073T2 (hu) * 2015-12-18 2024-04-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-C5 antitestek és alkalmazási eljárások

Also Published As

Publication number Publication date
NL301300I2 (nl) 2024-12-03
MA44081B1 (fr) 2023-11-30
EP3390442A1 (en) 2018-10-24
AU2016372930A1 (en) 2018-06-21
KR102467124B1 (ko) 2022-11-15
JP2017112996A (ja) 2017-06-29
PE20240365A1 (es) 2024-03-04
AU2016372930B2 (en) 2020-10-08
EA036756B1 (ru) 2020-12-16
HK1251942A1 (zh) 2019-05-03
TWI812979B (zh) 2023-08-21
CN114478760A (zh) 2022-05-13
WO2017104779A1 (en) 2017-06-22
CN108401431A (zh) 2018-08-14
LT3390442T (lt) 2023-12-11
JP2021121197A (ja) 2021-08-26
CA3005592C (en) 2024-01-23
JP7208299B2 (ja) 2023-01-18
TW202140545A (zh) 2021-11-01
MA44081A (fr) 2018-10-24
BR112018009067A2 (en) 2018-10-30
JP2017113013A (ja) 2017-06-29
PL3390442T3 (pl) 2024-03-18
IL259256B (en) 2022-10-01
CL2018001577A1 (es) 2018-09-28
RU2018125624A (ru) 2020-01-20
TWI597292B (zh) 2017-09-01
LTPA2024533I1 (sr) 2024-12-10
ES2969440T3 (es) 2024-05-20
HUS2400040I1 (hu) 2024-12-28
PE20181402A1 (es) 2018-09-07
DK3390442T3 (da) 2023-11-13
JP2023030197A (ja) 2023-03-07
BR112018009067A8 (pt) 2019-02-26
CN108401431B (zh) 2022-01-25
TW202344514A (zh) 2023-11-16
EP3390442A4 (en) 2021-01-06
EP3390442B1 (en) 2023-11-08
MY186948A (en) 2021-08-26
EP4342529A3 (en) 2024-10-09
MX2022014885A (es) 2023-01-04
CO2018007374A2 (es) 2018-07-19
FI3390442T3 (fi) 2023-11-10
SG10201709415WA (en) 2017-12-28
EA201891410A1 (ru) 2019-01-31
SG11201610782YA (en) 2017-07-28
FR24C1044I1 (fr) 2025-01-10
UA123774C2 (uk) 2021-06-02
IL259256B2 (en) 2023-02-01
JP6088703B1 (ja) 2017-03-01
KR20170107422A (ko) 2017-09-25
RU2018125624A3 (sr) 2020-03-27
TW202545989A (zh) 2025-12-01
SA518391704B1 (ar) 2021-12-23
JP2025063312A (ja) 2025-04-15
KR20180085678A (ko) 2018-07-27
FR24C1044I2 (fr) 2025-05-23
TW201726728A (zh) 2017-08-01
DK3390442T5 (da) 2024-09-23
IL259256A (en) 2018-07-31
FIC20240040I1 (fi) 2024-11-22
HUE065073T2 (hu) 2024-04-28
TW201741336A (zh) 2017-12-01
MX2018007144A (es) 2018-11-29
HRP20231456T1 (hr) 2024-03-01
SI3390442T1 (sl) 2024-01-31
PH12018501282A1 (en) 2019-01-28
RU2742606C2 (ru) 2021-02-09
KR101789973B1 (ko) 2017-10-26
JP6879751B2 (ja) 2021-06-02
TWI747936B (zh) 2021-12-01
AR107077A1 (es) 2018-03-21
CA3005592A1 (en) 2017-06-22
LTC3390442I2 (sr) 2026-04-27
PT3390442T (pt) 2024-01-08
EP4342529A2 (en) 2024-03-27
CR20180364A (es) 2018-08-22
NZ744333A (en) 2024-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240052021A1 (en) Anti-c5 antibodies and methods of use
EP3390442B1 (en) Anti-c5 antibodies and methods of use
KR101852739B1 (ko) 항-c5 항체 및 사용 방법
EA041632B1 (ru) Антитела к с5 и способы их применения
EA041304B1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИ-C5 АНТИТЕЛА С БОЛЕЕ ВЫСОКОЙ АФФИННОСТЬЮ ПРИ pH 7,4, ЧЕМ ПРИ pH 5,8 (ВАРИАНТЫ)