RS65009B1 - Sastav za upotrebu u lečenju crevnih promena - Google Patents

Description

Opis

Predmetni pronalazak, kako je definisano patentnim zahtevima, odnosi se na sastav koji sadrži smešu koja sadrži ili, alternativno, sastoji se od ekstrakta (a) voća najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i najmanje jednog sastojka (b) prihvatljivog za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu i njihovu upotrebu u prevenciji i/ili lečenju divertikularne bolesti ili patologije koja proizilazi iz nje ili je povezana sa njom.

Crevo je ciljni organ brojnih inflamatornih patologija, koje mogu biti uzrok ozbiljnih poremećaja i često ih je doktorima teško lečiti.

Među njima, ulogu primarnog značaja zauzimaju:

- inflamatorna bolest creva (IBD).

- pouchitis.

- divertikularna bolest i divertikulitis.

Inflamatorne bolesti creva (IBD) karakteriše prisustvo hroničnog zapaljenja sluzokože creva, koje ima isprekidani tok i može izazvati teške komplikacije. Oni uključuju Crohnovu bolest (CD), ulcerozni rektokolitis (URC) i takozvani „neodređeni kolitis“ (IC).

Simptomi se razlikuju za dve najvažnije patologije grupe, a to su Crohnova bolest (CD) i ulcerozni rektokolitis (URC).

U slučaju CD-a, najčešći početni simptomi su dijareja i bol u stomaku, lokalizovani pre svega u desnoj ilijačnoj jami (koja odgovara poslednjoj ilealnoj petlji, najčešćem mestu bolesti).

URC se, s druge strane, skoro uvek manifestuje krvavom dijarejom (sadrži svetlo crvenu krv i sluz pomešanu sa stolicom), udruženom sa „tenezmom“ (osećaj nepotpune evakuacije) i ponekad anemijom.

Obe bolesti mogu imati periode latencije koji se smenjuju sa izbijanjem upale. Kada upala creva ponovo postane akutna, javljaju se i konstitucijski simptomi kao što su groznica, gubitak težine, astenija i gubitak apetita. Vremenom se CD može zakomplikovati formiranjem stenoze (suženje lumena zahvaćenog dela creva, što na kraju može dovesti do opstrukcije creva), fistula (komunikacija između creva i kože, ili između trbušnih organa) ili apscesa.

Takozvani „neodređeni kolitis“ - IC, nasuprot tome, je relativno nedavno stečena bolest, u kojoj je flogoza ograničena na debelo crevo, sa histološkim, kliničkim, radiološkim i endoskopskim karakteristikama koje onemogućavaju klasifikaciju, jer ne mogu biti pripisane ni CD-u ni URC-u; u 13-20% slučajeva predstavljaju početne forme jednog od ta dva.

Takozvani „neodređeni kolitis“ - IC generalno karakteriše: prisustvo segmentnih lezija, opsežna ulceracija, moguće zahvatanje desnog debelog creva -iako je distalno debelo crevo (levo debelo crevo) više ugroženo - i prisustvo upale koja se širi preko više od 50% površine sluzokože, uz moguću dilataciju debelog creva udruženu sa toksičnim megakolonom.

U velikoj većini slučajeva (95%), simptomi se u početku karakterišu dijarejnim pražnjenjem creva na početku; postoji prisustvo krvave dijareje u 72% slučajeva i bolova u stomaku u 74%. Manji procenat pacijenata ima gubitak težine (44%) i groznicu (26%).

Pouchitis je nespecifična upala ilealnog rezervoara ili kesice i najčešća je dugotrajna komplikacija hirurške intervencije poznate kao ilealna kesica-analna anastomoza.

Etiologija je još uvek nepoznata i najverovatnije ima više uzročnika.

Predložene su različite patogenetske hipoteze, uključujući stazu fekalije i prekomerni rast bakterija, recidiv URC-a i ishemiju sluzokože kesice.

Pouchitis se klinički karakteriše promenljivim simptomima, koji uključuju povećanje broja evakuacija i tečnosti fecesa, rektalno krvarenje, bolove u stomaku nalik grčevima, urgentnost i tenezmu, a ponekad i inkontinenciju i temperaturu.

Divertikuloza debelog creva je najčešća anatomska promena debelog creva, koja se često otkriva tokom kolonoskopije. Odnosi se na prisustvo strukturnih modifikacija zida debelog creva, i izgleda da je karakteriše prisustvo kesica koje se nazivaju „divertikule“; razlikuje se od inflamatorne bolesti creva (IBD) i pouchitisa.

Divertikule su male izbočene kesice koje se mogu formirati u sluznici debelog creva u tačkama relativne slabosti mišićnog sloja zida.

Stanje u kojem se otkrivaju divertikule, čak i ako nema simptoma povezanih sa njihovim prisustvom, nosi naziv „divertikuloza“. U praksi, divertikuloza je medicinsko stanje koje karakteriše prisustvo izbočina sluzokože i submukoze – definisanih kao divertikule, tačnije – duž zida šupljih organa digestivnog sistema.

Uglavnom se formiraju u oblastima relativne slabosti mišićnog sloja („Locus minoris resistentiae“) debelog creva (pre svega sigmoidnog debelog creva i rektuma zbog viših pritisaka). Divertikuloza se manifestuje bez simptoma; ako postane simptomatski, kao što je, na primer, u slučaju divertikulitisa, govori se o divertikularnoj patologiji ili bolesti.

Divertikuloza je najčešća u zapadnim zemljama, sa prevalencijom od 5% u populaciji od 30 do 39 godina i 60% u delu stanovništva preko 80 godina.

Divertikule su češće u donjem delu creva (ili debelog creva), zvanom sigmoidno debelo crevo.

Veruje se da je razvoj divertikula debelog creva rezultat povećanja intraluminalnog pritiska debelog creva. Da bude jasno, razvoj divertikula je fenomen koji se potpuno razlikuje od inflamatornih i/ili autoimunih fenomena kao što su hronična inflamatorna bolest creva (IBD), na primer Kronova bolest i ulcerozni kolitis, i, na osnovu naših sadašnjih saznanja, takve patologije nemaju veze sa divertikulozom i s njom povezanim poremećajima.

Prisustvo divertikula je trajna anatomska promena u strukturi zidova debelog creva, koja može ostati asimptomatska ili dovesti do razvoja simptoma.

Procenjuje se da oko 20% pacijenata razvije simptome, u prisustvu kojih se stanje definiše kao „divertikularna bolest“ (DD).

Nekomplikovana divertikularna bolest obično nije povezana sa specifičnim simptomima. Divertikularna bolest je čest uzrok značajnog krvarenja iz debelog creva.

Podtip DD je SUDD (simptomatska nekomplikovana divertikularna bolest), u kojoj su prisutni uporni abdominalni simptomi koji se pripisuju divertikulama u odsustvu makroskopski manifestnog kolitisa ili divertikulitisa.

Ostali simptomi su obično povezani sa komplikacijama divertikularne bolesti, kao što je „divertikulitis“, koji je makroskopska akutna upala divertikula.

Divertikulitis može biti jednostavan ili komplikovan, u zavisnosti od toga da li su karakteristike komplikacija kao što su apscesi, peritonitis, opstrukcija, fistule ili krvarenje uočene na kompjuterskoj tomografiji (CT) ili ne.

Divertikulitis može izazvati bol u stomaku, drhtavicu, groznicu i promenu navika u radu creva. Najintenzivniji simptomi su povezani sa ozbiljnim komplikacijama kao što su perforacija (slobodan prolom u stomaku), apscesi (nakupljanje gnoja) ili formiranje fistula (anomalni prolaz koji se stvara između debelog creva i drugog organa ili sa kožom koja prati perforacija divertikula).

Osnovni patološki mehanizmi koji uzrokuju formiranje divertikula debelog creva (divertikuloze) i dalje ostaju nejasni. Bez želje da budemo ograničeni ovom teorijom, takve formacije su verovatno rezultat složenih interakcija između ishrane, crevne mikrobiote, genetskih faktora, pokretljivosti debelog creva i mikroskopske upale.

Iako nije dokazano, trenutno preovlađujuća teorija je da je dijeta sa malim unosom vlakana među uzrocima divertikularne bolesti. Bolest je zabeležena u ranim godinama 20. veka u Sjedinjenim Državama, u vreme kada su određene namirnice uvedene u američku ishranu, što je značajno smanjilo unos vlakana američke populacije.

Divertikularna bolest je uobičajena u industrijalizovanim zemljama, a posebno u Sjedinjenim Državama, Engleskoj i Australiji gde preovlađuju dijete sa malim unosom vlakana. Nasuprot tome, bolest je retka u Aziji i Africi, gde većina ljudi ima visok unos vlakana.

Vlakna se nalaze u voću, povrću i nerafinisanim (celim) žitaricama koje telo nije u stanju da u potpunosti svari. Neka vlakna, koja se nazivaju rastvorljiva vlakna, lako se rastvaraju u vodi, stvarajući mekani želatinozni materijal u crevima, dok nerastvorljiva vlakna prolaze kroz creva skoro netaknuta. Obe vrste vlakana pomažu u sprečavanju zatvora, mekom stolicom koja se lako izbacuje.

Konstipacija se manifestuje potrebom za značajnim naporom da bi se izvršila nužda; napor može izazvati povećanje pritiska u debelom crevu, a to zauzvrat može izazvati oticanje sluznice debelog creva kroz slabe tačke u zidu debelog creva, što može dovesti do stvaranja kesica, odnosno divertikula.

Nedostatak fizičke vežbe može povećati rizik od formiranja divertikula, iako se njegov aspekt još nije smatrao determinantnim.

Trenutno se kao medicinska terapija za divertikularnu bolest i/ili divertikulitis propisuje mirovanje creva, specifična dijeta sa niskim sadržajem vlakana i antibiotici širokog spektra, koji se često povezuju sa antispastičnim lekom. Upotreba nesteroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAID) i kortikosteroida nije uobičajena, jer ovi lekovi mogu olakšati perforaciju u blizini divertikuluma. U najkomplikovanijim slučajevima, kao što su, na primer, peritonitis, apscesi i fistule, može biti neophodna hitna resekcija, sa ili bez anastomoze.

Trenutno, ne postoji dostupan tretman koji bi mogao da spreči stvaranje divertikula ili da izazove njihovo smanjenje ili da efikasno spreči divertikulitis kod osoba sa divertikularnom bolešću ili divertikulozom.

Da bi se odgovorilo na gore navedena ograničenja predmetne oblasti, predmetni pronalazak, kako je definisan patentnim zahtevima, obezbeđuje novi sastav za oralnu primenu, koja sadrži ekstrakt dobijen iz biljaka roda Vaccinium za upotrebu u prevenciji ili lečenju divertikuloze u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma, i patologija ili bolesti povezanih sa prisustvom divertikula, kao što je divertikularna bolest, SUDD (simptomatska nekomplikovana divertikularna bolest) i divertikulitis u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma.

Predmetni pronalazak se odnosi na sastav za oralnu primenu kako je definisano u patentnim zahtevima, a koji se odnosi na „(CR)“, koja sadrži ili se, alternativno, sastoji od:

(i) jezgra koje sadrži, ili se, alternativno, sastoji od ekstrakta (a) najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i najmanje jednog sastojka ili ekscipijenta (b) prihvatljivog za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu;

(ii) gastro-otpornog sloja izvan jezgra (i) i koji u potpunosti prekriva pomenuto jezgro (i) i koji sadrži najmanje jedan sastojak ili ekscipijent (c) prihvatljiv za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu, naznačeno time što navedeni gastro-otporni sloj ( ii) može da omogući oslobađanje ekstrakta (a) u sluzokoži creva; poželjno je da omogući oslobađanje ekstrakta (a) u debelom crevu.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav za oralnu primenu (CR) koji sadrži ili se, alternativno, sastoji od:

(i) jezgra koje sadrži, ili se, alternativno, sastoji od ekstrakta (a) najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i najmanje jednog sastojka ili ekscipijenta (b) prihvatljivog za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu;

(ii) gastro-otpornog sloja izvan jezgra (i) i koji u potpunosti prekriva pomenuto jezgro (i) i koji sadrži najmanje jedan sastojak ili ekscipijent (c) prihvatljiv za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu, naznačeno time što navedeni gastro-otporni sloj ( ii) može da omogući oslobađanje ekstrakta (a) u debelom crevu;

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav za oralnu primenu (CR) koji sadrži ili se, alternativno, sastoji od:

(i) jezgra koje sadrži, ili se, alternativno, sastoji od ekstrakta (a) najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i najmanje jednog sastojka ili ekscipijenta (b) prihvatljivog za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu;

(ii) gastro-otpornog sloja izvan jezgra (i) koji u potpunosti prekriva pomenuto jezgro (i) i koji sadrži najmanje jedan sastojak ili ekscipijent (c) prihvatljiv za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu, naznačeno time što navedeni gastro-otporni sloj ( ii) može da omogući oslobađanje ekstrakta (a) u debelom crevu; naznačeno time što je pomenuti sastav za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju divertikuloze u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma, i patologija ili bolesti povezanih sa prisustvom divertikula, kao što je divertikularna bolest, SUDD (simptomatski nekomplikovana divertikularna bolest) i divertikulitis u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma.

Sastav (CR) predmetnog pronalaska je gastro-zaštićen i nalazi se u čvrstom obliku praha, granula, pahuljica, tableta, pilula ili kapsula; poželjno je gastrozaštićena monolitna tableta. U ovom slučaju, jezgro (i) je predstavljeno i poklapa se sa monolitnom tabletom.

Dalje je otkriven, ali nije u obimu patentnih zahteva, sastav (C) koji sadrži, ili se, alternativno, sastoji od:

- ekstrakta (a) ploda najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i

- najmanje jednog sastojaka i/ili ekscipijenta (b) prihvatljivog za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu,

sastav je za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju divertikuloze u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma, i patologija ili bolesti povezanih sa prisustvom divertikula, kao što je divertikularna bolest, SUDD (simptomatski nekomplikovani divertikularna bolest) i divertikulitis u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma; poželjno naznačeno time što upotreba obuhvata oralnu primenu (C).

Takođe je moguće da se sastav (C) u čvrstom obliku, na primer, praha, granula, perli ili mikrozrnaca, ili ljuspica nalazi unutar školjke, na primer kapsule ili mekog gela, od gastro-otpornog materijala koji se može razložiti pri pH iznad 6, poželjno pH od 6,5 do 8, na primer pH od 7,5. U ovom slučaju, sastav (C) je sadržan u kapsuli ili mekom gelu i dalje ima validnu upotrebu u prevenciji i/ili lečenju divertikuloze u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma, i povezanih patologija ili bolesti povezanih sa prisustvom divertikula, kao što je divertikularna bolest, SUDD (simptomatska nekomplikovana divertikularna bolest) i divertikulitis u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma; poželjno naznačeno time što upotreba obuhvata oralnu primenu (C).

Poželjna otelotvorenja će biti ilustrovana u nastavku, bez namere da se na bilo koji način ograniči njihov obim i sadržaj.

Osim ako nije drugačije naznačeno, sadržaj sastojka u sastavu se odnosi na težinski procenat tog sastojka u odnosu na ukupnu težinu sastava.

Osim ako nije drugačije naznačeno, naznaka da sastav „sadrži“ jednu ili više komponenti znači da druge komponente mogu biti prisutne pored jedne ili onih koje su posebno imenovane, a naznaka da se sastav „sastoji“ od datih komponenti znači da je prisustvo drugih komponenti isključeno.

Sastav (C) može da se sastoji od (a) i (b) ili može da sadrži druge sastojke ili ekscipijente pored (a) i (b).

Kao neograničavajući primer, navedeni dodatni sastojci koji mogu biti prisutni u sastavima (CR) i (C) predmetnog pronalaska mogu biti drugi aktivni sastojci, kao što su:

� vlakna (npr. inulin, psilijum)

� enzimi (npr. galaktozidaza i slično)

� anti-inflamatorna sredstva (npr. mesalazin i derivati, beklometazon i slični aktivni sastojci)

� antibiotici (npr. rifaksimin i slični aktivni sastojci)

� supstance sa upijajućim delovanjem na nivou creva i/ili karminativnim i/ili oralnim dejstvom protiv pene, za smanjenje stvaranja crevnih gasova (npr. pepermint, simetikon i derivati, aktivni ugalj)

� antioksidansi

� supstance sa imunomodulirajućim dejstvom

� kratkolančane masne kiseline (SCFA, kao što su butirat i derivati)

� omega-3 polinezasićene masne kiseline

� probiotici ili, alternativno: mikroorganizmi u obliku lizata ili ekstrakta (paraprobiotici), metabolički bioproizvodi proizvedeni od mikroorganizama (postbiotici) i/ili bilo koji drugi proizvod dobijen od njih.

Neograničavajući primeri navedenih mikroorganizama koji mogu biti prisutni u sastavima (CR) i (C) predmetnog pronalaska su: probiotičke bakterije koje pripadaju rodovima Lactobacillus, Bifidobacterium i Enterococcus i kvasac, poželjno koji pripadaju rodu Saccharomices, uzeti pojedinačno ili u raznim kombinacijama.

U poželjnoj varijanti, jezgro (i) prisutno u sastavu (CR) ili (C) dalje sadrži manitol i/ili najmanje jedan aktivni sastojak sa anti-inflamatornim dejstvom izabran između steroidnog anti-inflamatornog leka, nesteroidni lek i supstancu ili smešu supstanci prirodnog porekla.

Predmetni pronalazak će se takođe pozivati na sledeće slike:

Slika 1: kalibraciona kriva za test rastvaranja.

Slika 2: rezultati testa rastvaranja na gastro-zaštićenoj tableti prema pronalasku u intestinalnoj fazi.

Slika 3-10: rezultati studije o zaštitnoj efikasnosti na crevnoj sluzokoži (CacoGoblet): Kolonizacija sa E.Coli.

Slika 11: ilustracija gastrointestinalnog trakta.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „anti-inflamatorni lek“ se koristi u uobičajenom značenju izraza i označava, kao što je poznato stručnjaku u predmetnoj oblasti, bilo koju supstancu sposobnu da smanji ili eliminiše inflamatorni proces -posebno, ali ne ograničavajući se na, oštećenje creva pojedinca.

U sastavu (CR), kako je gore definisano, gastro-otporni sloj (ii) izvan jezgra (i) sadrži ili, alternativno, sastoji se od najmanje jedne supstance odabrane između Eudragard biotičkog E1207, gastro-otpornog polimera, kao što je poli(metil akrilat-kometil metakrilat-ko-metakrilna kiselina) 7:3:1 ili drugog anjonskog metakrilnog kopolimera, trietil citrata E1505, talka, etil celuloze, anjonskog metakrilata kopolimera i njihove smeše, alginata, alginata od toga skrob i modifikovanih skrobovova, oleinske kiseline, stearinske kiseline i triglicerida srednjeg lanca.

Poželjni oblici gastro-otpornog sloja (ii) izvan jezgra (i) sadrže ili, alternativno, sastoje se od:

- gastro-otporni polimer, kao što je poli(metil akrilat-ko-metil metakrilat-ko-metakrilna kiselina) 7:3:1 ili drugi anjonski metakrilatni kopolimer: od 5 do 50 mg; 10 do 35 mg; 18-25 mg;

- trietil citrat E1505: od 0,1 do 5 mg; 0,3 do 3 mg; 0,5-2 mg;

- talk: od 1 do 30 mg; 3 do 20 mg; 5-15 mg; ili alternativno:

- etil celuloza: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,97 mg;

- natrijum alginat: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,30 mg;

- amonijum hidroksid: od 0,5 do 4 mg; 1,5 do 3 mg; 2,34 mg;

- trigliceridi srednjeg lanca: od 0,5 do 5 mg; 1,5 do 3 mg; 2,12 mg;

- oleinska kiselina: od 0,5 do 3 mg; 1 do 2 mg; 1,17 mg;

- prečišćena stearinska kiselina: od 0,01 do 0,5 mg; 0,05 do 0,3 mg; 0,1 mg; ili alternativno:

- etil celuloza: od 5 do 50 mg; 10 do 30 mg; 15-20 mg;

- titanijum dioksid: od 0,1 do 15 mg; 0,5 do 10 mg; 1-5 mg;

- natrijum alginat: od 0,1 do 5 mg; 0,3 do 4 mg; 0,5-2 mg;

- oleinska kiselina, stearinska kiselina, trigliceridi srednjeg lanca: svaki od 0,01 do 3 mg; između 0,05 i 1 mg.

Poželjni oblici gastro-otpornog sloja (ii) izvan jezgra (i) sadrže ili, alternativno, sastoje se od:

- Eudragard<®>biotik E1207 (Evonik): na primer 20,4 mg;

- trietil citrat E1505: na primer 1 mg;

- talk: na primer 10, 2 mg; ili, alternativno:

- etil celuloza: na primer 9,97 mg;

- natrijum alginat: na primer 9,30 mg;

- amonijum hidroksid: na primer 2,34 mg;

- trigliceridi srednjeg lanca: na primer 2,12 mg;

- oleinska kiselina: na primer 1,17 mg;

- prečišćena stearinska kiselina: na primer 0,1 mg.

Navedeni gastro-otporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (i) ima karakteristiku razlaganja i rastvaranja u funkciji pH vrednosti i/ili vremena; poželjno je da se navedeni sloj (ii) formuliše i pripremi tako da može da se razgradi i rastvori od pH vrednosti od oko 6,5 do pH od oko 8, poželjno od pH od oko 7 do oko 7,5 u vremenu koje se sastoji od 30 minuta do 120 minuta, poželjno od 45 minuta do 90 minuta; na primer na temperaturi od 30°C do 40°C, poželjno od 34°C do 37°C.

Nakon opsežnih istraživanja i brojnih eksperimentalnih pokušaja, nađeno je da je prednost upotreba jedne ili više navedenih supstanci za formiranje spoljašnjeg gastro-otpornog sloja omogućava dobijanje sastava (CR) za oralnu upotrebu, na primer tableta, sposobnog da prođe netaknut kroz oralni, ezofagealni i želudačni trakt i omogući početnu razgradnju pomenutog (ii) gastrorezistentnog sloja izvan jezgra (i) počevši od terminalnog ileuma pri pH od oko 6,5-7, sa ili bez početnog rastvaranja jezgra (i) i oslobađanja ekstrakta (a), i naknadnog razlaganja pomenutog (ii) gastrootpornog sloja spolja u odnosu na jezgro (i) u debelom crevu pri pH od oko 7- 8 sa rastvaranjem jezgra (i) i oslobađanjem ekstrakta (a), uglavnom u debelom crevu, pri pH od 7,5 (Slika 11).

Eksperimentalna ispitivanja sprovedena pokazuju da sastav (CR) predmetnog pronalaska, na primer u obliku monolitne tablete prema primerima 1 i 2, ostaje netaknut u roku od 2 sata pri pH od 1, dok pri pH od 6 ostaje netaknut u roku od 1 sata. Pri pH od 7,2, gastro-otporna obloga spolja u odnosu na jezgro (i) sastava (CR) počinje da se kida posle oko 30 minuta, dok se pomenuta obloga u velikoj meri kida pri pH od 7,2 posle 90 minuta; film/obloga se otvara i unutar njega ostaju mali delovi jezgra (i) ili u nekim slučajevima prah koji nastaje potpunim raspadom jezgra (i).

Što se tiče oslobađanja pomenutog ekstrakta (a) prisutnog u pomenutom jezgru (i), nema oslobađanja pre ileuma do pH od 6,5. U terminalnom ileumu postoji oslobađanje koje se sastoji od oko 5% do oko 20%, poželjno od oko 10% do oko 15%. U debelom crevu pri pH od oko 7,5, na primer pH od oko 7,2, postoji oslobađanje koje se sastoji od oko 80% do oko 95%, poželjno od oko 85% do oko 90%. Najveći deo oslobađanja navedenog ekstrakta (a) se dešava u debelom crevu, koje predstavlja, upravo, mesto gde su prisutni divertikuli i gde se manifestuje patologija ili bolest. Na ovaj način, ekstrakt (a) koji se oslobađa u debelom crevu je sposoban da deluje zahvaljujući prisustvu i PAC (proantocijanidina), koji su sposobni da vrše antiinflamatornu aktivnost.

Sastav (CR) prema pronalasku je u obliku sastava za dijetetski suplement ili sastava za medicinski uređaj ili sastava za hranu za posebne medicinske svrhe ili farmaceutskog sastava; svi sastavi su u farmaceutskom obliku za oralnu upotrebu.

U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „medicinski uređaj“ se koristi u značenju prema italijanskoj zakonskoj uredbi br.46 od 24. februara 1997. godine, koji odgovara definiciji Svetske zdravstvene organizacije i dostupan na URL http://www.who.int/medical_devices/full_deffinition/en/, odnosno označava supstancu ili drugi proizvod koji se koristi sam ili u kombinaciji, koju je proizvođač predvideo da se koristi, sam ili u kombinaciji, za ljude u svrhe dijagnoze, prevencije, praćenja, lečenja ili ublažavanja bolesti, pri čemu uređaj ne postiže svoje primarno predviđeno dejstvo farmakološkim, imunološkim ili metaboličkim sredstvima, u ili na ljudskom telu, ali kojima se takvim sredstvima može pomoći u njegovoj predviđenoj funkciji.

U sastavu (CR) kako je gore definisano, ekstrakt (a) može biti predstavljen voćem (tačnije bobičastim voćem), koji pripada rodu Vaccinium i, opciono, takođe Sambucus, Licium, Euterpe i njihovim kombinacijama. Ekstrakt (a) je poželjno suvi ekstrakt.

U sastavu (CR) kako je gore definisano, ekstrakt (a) je poželjno iz plodova najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i podrod Okicoccus, kao što su Vaccinium macrocarpon, Vaccinium okicoccos, ili podrod Vaccinium, kao što su Vaccinium arboreum, Vaccinium crassifolium, Vaccinium boreale, Vaccinium mirtillus ili njihove smeše; poželjno pri čemu je ekstrakt (a) plodova Vaccinium macrocarpon ili Vaccinium okicoccos ili njihova smeša. Još poželjnije, ekstrakt (a) sadrži, ili se sastoji, od plodova Vaccinium macrocarpon. Povoljno, ekstrakt (a) je suv ekstrakt; u jednom otelotvorenju to je suvi ekstrakt brusnice, poželjno koji sadrži PAC (proantocijanidine) u koncentraciji od 5% do 30% po težini ili zapremini, na primer 10%, ili 15%, ili 20% ili 25%.

Američka brusnica (Vaccinium macrocarpon) je mali zimzeleni žbun koji pripada porodici Ericaceae, koji raste u borealnim klimatskim zonama, posebno u Severnoj Americi i nekim severnim regionima Evrope i Azije, i daje crvene plodove slične bobicama, sa gustom pulpom i tipično kiselim ukusom.

U prošlosti, među Indijancima Severne Amerike, brusnica je smatrana svetim voćem i korišćena je i kao hrana i kao lek za bubrežne kamence i razne probleme urinarnog trakta.

Danas se američka brusnica koristi širom sveta zbog svojih bezbrojnih korisnih svojstava, u osnovi zbog visokog sadržaja proantocijanidina (PAC), posebno proantocijanidina A-tipa.

Ekstrakti američke brusnice koriste se pre svega u prevenciji i lečenju oboljenja urinarnog trakta, ali i kao prevencija protiv adhezije Helicobacter pilori, bakterija koja je često uzročnik čira na želucu i dvanaestopalačnom crevu, na zidovima želuca, ili adhezija bakterija koje naseljavaju usnu duplju i odgovorne su za stvaranje plaka ili adheziju potencijalno patogenih bakterija kao što je E. Coli na crevima.

Evropski patent EP 2135616 B1 se odnosi na upotrebu brusnice za lečenje IBD-a i ulceroznog kolitisa, koji su, kao što je gore navedeno, patologije koje su potpuno različite i različite od onih na koje se odnosi predmetni pronalazak.

Diverticulitis Forum, Anonymous ET AL, (2014-07-22), „Anyone try this approach to Diverticulosis?Topix“ otkrio je upotrebu soka od brusnice u lečenju divertikulitisa.

U kontekstu predmetnog pronalaska, upotreba brusnice za lečenje IBD i ulceroznog kolitisa je isključena i stoga nije predviđena, kao što je upotreba brusnice za sprečavanje adhezije Helicobacter pilori do zidova želuca nije predviđeno. Osim toga, upotreba brusnice za lečenje infekcija urinarnog trakta (UTls), kao što je cistitis (upala mokraćne bešike) ili bakterijski cistitis ili nebakterijski cistitis, kao što je, na primer, cistitis intersticijalnog tipa, je isključena a samim tim i nije predviđena.

Pronalazač je otkrio da ekstrakt plodova roda Vaccinium, posebno američka brusnica, korisna je u prevenciji i/ili lečenju, poželjno oralnom primenom, divertikuloze u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma, i/ili patologija ili bolesti koje potiču ili su povezane sa prisustvom divertikula, kao što je divertikularna bolest, simptomatska nekomplikovana divertikularna bolest (SUDD) i divertikulitis u debelom crevu, ili u delu sigmoidnog debelog creva i rektuma.

U sastavu (CR) prema predmetnom pronalasku, ekstrakt (a) poželjno sadrži najmanje 10%, poželjnije najmanje 15% ili 20% ili 30% i/ili ne više od 95% ili 60% ili 40% proantocijanidina po težini od ukupne težine ekstrakta (a), poželjnije, ali bez ograničenja, proantocijanidina A-tipa. Proantocijanidini (PAC) su oligomeri i polimeri flavan-3-ola, koji pripadaju porodici flavonoida i mogu se kvantifikovati, na primer, pomoću „BL-DMAC“ postupka od Prior, RL et al. J. Sci Food Agric 2010, 90(9), 1473-8, ili ekvivalentnog postupka. Navedeni ekstrakt (a) je poželjno suvi ekstrakt; još poželjnije, to je suvi ekstrakt brusnice.

Sastav (CR) prema pronalasku poželjno sadrži najmanje:

- ekstrakt (a) od 150 do 600 mg, poželjno 200 do 300 mg, poželjnije 240 do 260 mg, ekstrakta Vaccinium macrocarpon koji sadrži najmanje 10%, poželjnije najmanje 15% proantocijanidina (PAC) po težini od ukupne težine (a);

- najmanje jedan sastojak ili ekscipijent (b) prihvatljiv za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu, opciono odabran između celuloze, manitola, magnezijum stearata, magnezijumovih soli zasićenih i/ili nezasićenih masnih kiselina, silicijum dioksida, karboksimetil celuloze, karboksietil celuloze, umrežene natrijum karboksimetil celuloze i njihove smeše. Navedeni ekstrakt (a) je poželjno suvi ekstrakt; još poželjnije, to je suvi ekstrakt brusnice. Sastojci ili ekscipijenti (b) prihvatljivi za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu su poželjno odabrani između celuloze, manitola, silicijum dioksida, umrežene natrijum karboksimetil celuloze i magnezijumovih soli zasićenih i/ili nezasićenih masnih kiselina.

Sastav (CR) kako je gore definisan je posebno koristan u lečenju i/ili prevenciji divertikularne bolesti i patologija povezanih sa njom.

Dalje otkriven, ali ne u skladu sa pronalaskom, je sastav (C) koji sadrži, ili se, alternativno, sastoji od:

- ekstrakta (a) ploda najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i

- najmanje jednog sastojaka (b) prihvatljivog za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu,

sastav je za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju divertikularne bolesti ili patologije koja potiče od divertikuloze, naznačeno time što pomenuta upotreba obuhvata oralnu primenu (C). Primena se može odvijati bilo kojim putem. Poželjno, sastav se uzima oralno, poželjnije u obliku pilula, kapsula, tableta, granulisanog praha, kapsula sa tvrdom ljuskom, granula za oralno rastvaranje, kesica, pastila ili bočica za piće.

Alternativno, sastav pronalaska je formulisan kao tečnost, na primer kao sirup ili piće, ili se dodaje u hranu, na primer u jogurt, sir ili voćni sok.

Alternativno, sastav pronalaska je formulisan u obliku koji može da deluje lokalno, na primer putem klistira.

Sastav (C) je poželjno za upotrebu za lečenje ili prevenciju najmanje jedne od divertikularnih bolesti, simptomatske nekomplikovane divertikularne bolesti (SUDD) i divertikulitisa. Sastav (C) je poželjno za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji divertikulitisa.

U poželjnom otelotvorenju, sastav (C) za gore opisanu upotrebu je u obliku oralnog farmaceutskog preparata, ili dijetetskog suplementa ili medicinskog uređaja, koji sadrži gastro-otporni oblog i koji može da omogući oslobađanje ekstrakta (a) u debelom crevu.

U daljem obelodanjivanju, u sastavu (C) za upotrebu kako je gore navedeno, ekstrakt (a) je iz plodova najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i podroda Okicoccus, kao što su Vaccinium macrocarpon, Vaccinium okicoccos, ili podroda Vaccinium, kao što su Vaccinium arboreum, Vaccinium crassifolium, Vaccinium boreale, Vaccinium mirtillus (borovnica) ili njihove smeše.

U daljem obelodanjivanju, poželjnije, u sastavu (C) za upotrebu prema predmetnom pronalasku, ekstrakt (a) je iz plodova Vaccinium macrocarpon (američka brusnica) ili Vaccinium okicoccos ili njihova smeša. Još poželjnije, ekstrakt (a) sadrži, ili se sastoji od, plodova Vaccinium macrocarpon. Ekstrakt (a) je poželjno suvi ekstrakt.

U daljem obelodanjivanju sastava (C) za upotrebu prema predmetnom pronalasku, ekstrakt (a) poželjno sadrži najmanje 10%, poželjnije najmanje 15% ili 20% ili 30% i ne više od 95% ili 60% ili 40% proantocijanidina po težini od ukupne težine (a), poželjno, ali bez ograničenja, proantocijanidina A-tipa. Povoljno, ekstrakt (a) je suv ekstrakt; u jednom otelotvorenju to je suvi ekstrakt brusnice, poželjno koji sadrži PAC (proantocijanidine) u koncentraciji od 5% do 30% po težini ili zapremini, na primer 10%, ili 15%, ili 20% ili 25%.

Proantocijanidini (PAC) su oligomeri i polimeri flavan-3-ola, koji pripadaju porodici flavonoida i mogu se kvantifikovati, na primer, pomoću „BL-DMAC“ postupka od Prior, RL et al. J. Sci Food Agric 2010, 90(9), 1473-8, ili ekvivalentnog postupka.

U kontekstu predmetnog pronalaska, sastojci prihvatljivi za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu obuhvataju sve pomoćne supstance poznate stručnjaku u predmetnoj oblasti za pripremu oblika za oralnu primenu, kao što su, neograničavajući primer, razblaživači, apsorbenti, zaslađivači, arome, boje, maziva, nelepljiva sredstva, sredstva za klizanje, veziva, sredstva za dezintegraciju, surfaktanti, antimikrobni lekovi, antioksidansi, stabilizatori, zgušnjivači, želirni agensi i supstance koje mogu da modifikuju oslobađanje aktivnog sastojka tokom vremena dozvoljavajući njegovo oslobađanje samo pod datim fiziološkim stanjima, na primer u određenom pH intervalu.

U daljem obelodanjivanju sastav (C) za upotrebu kao što je gore opisano, poželjno sadrži najmanje:

- (a) od 150 do 600 mg, poželjno 200 do 300, poželjnije 240 do 260 mg, ekstrakta Vaccinium macrocarpon koji sadrži najmanje 10%, poželjnije najmanje 15% proantocijanidina po težini od ukupne težine (a);

- (b) najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv sastojak, opciono izabran između celuloze, manitola, magnezijum stearata, silicijum dioksida, karboksimetil celuloze i njihovih smeša. Još poželjnije, pomenuti sastav (C) dalje sadrži gastrozaštitni oblog, odnosno onaj koji je sposoban da zaštiti smešu koja sadrži najmanje (a) i (b) od delovanja želudačnih sokova.

Sledeći primeri pružaju praktična otelotvorenja pronalaska, bez namere ograničavanja njegovog obima i opsega.

Poželjni oblici sastava (CR) predmetnog pronalaska su navedeni u nastavku:

(i) Jezgro koje sadrži:

ekstrakt brusnice koji sadrži PACS u koncentraciji (težina/težina) od 10% ili 15% ili 30%: od 100 do 500 mg; 150 do 400 mg; 240-300 mg

celuloza: od 100 do 400 mg; 200 do 350 mg; 300-310 mg

manitol: od 1 do 50 mg; 5 do 30 mg; 10-18 mg

silicijum dioksid: od 1 do 50 mg; 3 do 30 mg; 5-8 mg

umrežena natrijum karboksimetil celuloza: od 1 do 30 mg; 3 do 20 mg; 5-12 mg

magnezijumove soli masnih kiselina: od 1 do 30 mg; 3 do 20 mg; 5-10 mg

(ii) prvi tip obloga (filma) jezgra (i), koji sadrži sledeće agense:

- gastro-otporni polimer, kao što je poli(metil akrilat-ko-metil metakrilatko-metakrilna kiselina) 7:3:1 ili drugi anjonski metakrilatni kopolimer: od 5 do 50 mg; 10 do 35 mg; 18-25 mg

- trietil citrat E1505: od 0,1 do 5 mg; 0,3 do 3 mg; 0,5-2 mg

- talk: od 1 do 30 mg; 3 do 20 mg; 5-15 mg; ili alternativno, (ii) drugi tip obloga (filma) jezgra (i), koji sadrži sledeće agense: - etil celuloza: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,97 mg

- natrijum alginat: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,30 mg

- amonijum hidroksid: od 0,5 do 4 mg; 1,5 do 3 mg; 2,34 mg - trigliceridi srednjeg lanca: od 0,5 do 5 mg; 1,5 do 3 mg; 2,12 mg - oleinska kiselina: od 0,5 do 3 mg; 1 do 2 mg; 1,17 mg

- prečišćena stearinska kiselina: od 0,01 do 0,5 mg; 0,05 do 0,3 mg; 0,1 mg.

Poželjni oblici sastava (CR) predmetnog pronalaska su navedeni u nastavku:

(i) Jezgro koje sadrži:

ekstrakt brusnice koji sadrži PACS u koncentraciji (težina/težina) od 10% ili 15% ili 30%: od 100 do 500 mg; 150 do 400 mg; 240-300 mg

mikrokristalna celuloza: od 100 do 400 mg; 200 do 350 mg; 320-335 mg magnezijum stearat: od 1 do 30 mg; 2 do 20 mg; 5-10 mg

silicijum dioksid: od 1 do 50 mg; 3 do 30 mg; 5-8 mg

(ii) prvi tip obloga (filma) jezgra (i), koji sadrži sledeće agense:

- etil celuloza: od 5 do 50 mg; 10 do 30 mg; 15-20 mg;

- titanijum dioksid: od 0,1 do 15 mg; 0,5 do 10 mg; 1-5 mg

- natrijum alginat: od 0,1 do 5 mg; 0,3 do 4 mg; 0,5-2 mg

- oleinska kiselina, stearinska kiselina, trigliceridi srednjeg lanca: svaki od 0,01 do 3 mg; između 0,05 i 1 mg; ili, alternativno,

(ii) drugi tip obloga (filma) jezgra (i), koji sadrži sledeće agense:

- etil celuloza: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,97 mg

- natrijum alginat: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,30 mg

- amonijum hidroksid: od 0,5 do 4 mg; 1,5 do 3 mg; 2,34 mg - trigliceridi srednjeg lanca: od 0,5 do 5 mg; 1,5 do 3 mg; 2,12 mg - oleinska kiselina: od 0,5 do 3 mg; 1 do 2 mg; 1,17 mg

- prečišćena stearinska kiselina: od 0,01 do 0,5 mg; 0,05 do 0,3 mg; 0,1 mg

Kao neograničavajući primer, sastav (CR) prema predmetnom pronalasku može da sadrži:

Primer 1:

(i) Jezgro koje sadrži:

ekstrakt brusnice koji sadrži 15% PACS (težina/težina): 240 mg celuloza: 304,4 mg

manitol: 15 mg

silicijum dioksid: 5,8 mg

umrežena natrijum karboksimetil celuloza: 9 mg

magnezijumove soli masnih kiselina: 5,8 mg.

ukupno jezgro 580 mg. Raspon težine: 575 mg - 585 mg

(ii) oblog (film) jezgra (i), koji sadrži:

- Eudragard<®>biotik E1207 (Evonik): 20,4 mg

- trietil citrat E 1505: 1 mg

- talk: 10, 2 mg

Ukupno oblog/film 31,6 mg. Raspon težine: 26,1 mg - 37,7 mg. ukupno oblog/filmom prekrivena tableta 612 mg. Raspon težine: 607 mg -mg.

Primer 2:

(i) Jezgro koje sadrži:

ekstrakt brusnice koji sadrži 15% PACS (težina/težina): 240 mg celuloza: 270 mg

manitol: 29 mg

silicijum dioksid: 5,8 mg

umrežena natrijum karboksimetil celuloza: 29 mg

magnezijumove soli masnih kiselina: 5,8 mg.

ukupno jezgro 580 mg. Raspon težine: 575 mg - 585 mg

(ii) oblog (film) jezgra (i), koji sadrži:

- etil celuloza: 9,97 mg

- natrijum alginat: 9,30 mg

- amonijum hidroksid: 2,34 mg

- trigliceridi srednjeg lanca: 2,12 mg

- oleinske kiseline: 1,17 mg

- prečišćena stearinska kiselina: 0,1 mg.

ukupno oblog/film 25 mg. Raspon težine: 20 mg - 30 mg.

ukupno oblog/filmom prekrivena tableta 605 mg. Raspon težine: 595 mg -615 mg.

Test rastvaranja

Materijali:

testirane su gastro-obložene tablete prema pronalasku, kao u primeru.

Reagensi:

- Dimetilaminocinamaldehid (DMAC, sigmoidno debelo crevo,šifra D-4506).

- Procijanidin A2 (PCAA2, Sigma, kod 28660).

- Enzimi i reagensi za GID (Sigma).

POSTUPCI:

- PCA test prema spektrofotometrijskom postupku koji su predložili Prior et al. (Multi-laboratory validation of a standard method for quantifying proanthocyanidins in cranberry powders. J. Sci. Food Agric. (2010), 9, 1473-1478. DOI 10.1002/jsfa.3966).

- in vitro GID prema postupku koju su predložili Minekus et al. („A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus“ Food Funct. (2014), 6, 1113-1124. DOI 10.1039/C3FO60702J).

Rezultati

Tablete su podvrgnute in vitro GID-u (u tri primerka), sa uzorcima uzetim posle 120 min gastrične faze i posle 30, 60, 90 i 120 min intestinalne faze. Različiti uzorci su analizirani na sadržaj PCAA2 u mg ekvivalentima korišćenjem DMAC postupka i kvantifikovani prema kalibracionoj krivoj prikazanoj na Slici 1 (dobijeni istim postupkom kao primenjenuim na PCAA2 standard na 640 nm).

Profil rastvaranja tableta prema predmetnom pronalasku je prikazan na Slici 2.

Suštinski ekvivalentni rezultati su dobijeni za gastro-obložene tablete iz primera 1 i 2.

Tokom gastrične faze in vitro GID-a, nije bilo analitički verifikovanog oslobađanja PCA.

Kinetika oslobađanja PCA (izražena kao ekvivalenti PCAA2 mg/tableti, srednja vrednost od tri ponavljanja) tokom in vitro intestinalne faze prikazana je na slici 2. Oslobađanje PCA je analitički primećeno tokom intestinalne faze nakon 60 minuta.

Nesvareni sadržaj PCAA2 u tableti u mg ekvivalentima određen je nakon mehaničkog lomljenja same tablete i ekstrakcije PCA gastrointestinalnim tečnostima i enzimima (GID blank) ili rastvaračem za ekstrakciju (aceton/voda/sirćetna kiselina, 75:24,5:0,5 v/v/v) koji su predložili Prior et al. (2010). Dobijeni rezultati su bili jednaki 19,39 odnosno 19,81 PCAA2 mg ekvivalenta/tableti.

Procena efikasnosti

U cilju procene efikasnosti predmetnog pronalaska, posebno u pogledu efikasnosti zaštite crevne sluzokože, sprovedeno je nekoliko in vitro testova da bi se utvrdilo:

• Delovanje sastava protiv adhezije sojeva Escherichia coli, blokiranjem mehanizama adhezije, na temelju analiza specifičnih proteina.

• Anti-inflamatorna aktivnost kroz smanjenje aktivacije monocita u makrofagima, na temelju studije crevne propusnosti, procenjene kako je opisano u nastavku:

○ Merenje TEER (trans-epitelnog električnog otpora)

Transepitelni električni otpor (TEER) je direktno merenje funkcionalnosti barijere epitelnog tkiva: odražava globalni otpor tkiva zbog debljine i strukture, i predstavlja indikaciju nivoa integriteta monosloja, a samim tim i formiranja tesnih spojevi između ćelija. Transepitelni električni otpor (izražen u Ωcm<2>) se meri pomoću volt-om metra (ERS Millicell).

○ ANALIZA SA LUCIFEROM ŽUTOM: u prisustvu supstance koja se procenjuje. Lucifer žuta je fluorescentni marker nepropustan za ćelijsku membranu koji omogućava proveru integriteta ćelijskih spojeva u procentima). Koristi se za proučavanje propustljivosti supstance na paraćelijskom nivou u monoćelijskim slojevima Caco-2/Caco peharastih ćelija. Transport LY se ocenjuje kao prolaz u bazolateralni odeljku posle definisanog perioda inkubacije. Očitavanje fluorescentne supstance se vrši pomoću spektrofluorometra sa ekscitacijom od 428 nm i emisijom od 525 nm.

Konkretno, biće napravljena procena efikasnosti predmetnog pronalaska u zaštiti crevne sluzokože posle stresa izazvanog E. coli, koristeći eksperimentalni model Caco2-goblet<®>, koji se sastoji ne samo od crevnih ćelija, već i od sluzi koja luči ćelije, HT29, u ko-kulturi, što je mnogo realniji sistem.

Sprovedena je studija o zaštitnoj efikasnosti na crevnoj sluzokoži (CacoGoblet): Kolonizacija sa E.Coli.

1. Uvod i cilj studije

Biološka relevantnost Caco-2 modela je dobro utvrđena, pošto je in vitro referentni model koji se koristi za reprodukciju funkcija crevne sluzokože.

CacoGoblet je model ćelija koje luče sluz, koji se sastoji od propusnih nosača na mikroporoznim polikarbonatnim filterima sa ljudskim muciparnim peharastim ćelijama i diferenciranim i polarizovanim Caco-2 ćelijama.

Eksperimentalni model zasnovan na CacoGoblet modelu primenjen je za procenu efikasnosti EKSTRAKTA BRUSNICE u ime Sofar S.p.A.

Necitotoksična koncentracija je testirana u preliminarnoj fazi MTT testom kako bi se isključila potencijalna intrinzična toksičnost proizvoda.

Korišćena su dva protokola:

1) ANTI-INFLAMATORNA SVOJSTVA EKSTRAKTA BRUSNICE U

SISTEMU KO-KULTURE (THP-1 ćelije i crevne epitelne ćelije)

2) SPOSOBNOST BRUSNICE DA SPREČAVA ADHEZIJU E.COLI ZA MUKOZU

2. Eksperimentalni dizajn

1) ANTI-INFLAMATORNA SVOJSTVA EKSTRAKTA BRUSNICE U IN-VITRO SISTEMU KO-KULTURE (THP-1 ćelije i crevne epitelne ćelije)

CacoGoblet ćelije su prethodno tretirane sa 10 ng/ml IL1 beta preko noći. Kada je IL1 beta uklonjen, intestinalni model je tretiran brusnicom u necitoksičnoj koncentraciji tokom 24 sata. Urađen je paralelni tretman sa referentnim molekulom etakortilena (deksametazon natrijum fosfat) od 0,15% u cilju proučavanja prevazilaženja inflamatornog stanja sluzokože.

Proizvodi su zatim uklonjeni i obeležene THP-1 ćelije (obeležene ćelijskim tragačem 5-hlorometil-fluorescein diacetat) su dodate CacoGoblet ćelijama u apikalni odeljak i inkubirane 1 sat na 37°C.

Kada su ćelije koje nisu adherentne uklonjene, zaostala površinska fluorescencija THP-1 ćelija je procenjena pod mikroskopom.

Anti-inflamatorna aktivnost različitih jedinjenja na nivou creva je procenjena u statičkom testu korišćenjem smanjenja ćelijske adhezije THP-1 na CacoGoblet-u kao parametra krajnje tačke.

2) SPOSOBNOST BRUSNICE DA SPREČAVA ADHEZIJU E.COLI ZA MUKOZU

CacoGoblet ćelije prethodno tretirane sa brusnicom tokom 4 sata kolonizovane su sa 50 ul Escherichia Coli (ATCC 8739) na 37°C tokom 2 sata. Na kraju kolonizacije, višak bakterija je uklonjen i procenjeni su sledeći parametri:

- transepitelni električni otpor (TEER) i paracelularni prolaz Lucifer žute

- imunofluorescencija alfa-aktinina: Alfa-aktinin stupa u interakciju sa Tir, proteinom E.Coli, da bi se formirao adhezivni plak poznat kao postolje, i marker je infekcije E.Coli.

- ultrastrukturna analiza E.Coli pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa (SEM) u cilju procene bakterijske gustine i adhezije na površini CacoGobleta.

3. Materijali

3.1 Eksperimentalni sistem

CacoGoblet<™>je komplet za izlučivanje sluzi spreman za upotrebu za in vitro procenu crevne apsorpcije. Komplet se sastoji od propustljivih nosača sa 24 otvora zasejanih humanim muciparnim peharastim ćelijama i Caco-2 ćelijama diferenciranim i polarizovanim u HTS Transvell pločama dopunjenim ekskluzivnim zaštićenim transportnim medijumom koji je stabilan na sobnoj temperaturi.

Ćelijska linija CacoGoblet je isporučena 20. dana diferencijacije i korišćena je 5 uzastopnih dana, kompletan medijum je modifikovan i TEER je izmeren na osnovu interne procedure. Tehnički list CacoGoblet<™>je priložen u Dodatku I.

DMEM (lot RNBF5082) koji sadrži 10% FBS, 1% glutamina 200 mM i 1% NEAA je korišćen kao medijum, kao što je prikazano u tabeli 1.

Tabela 1

3.1.1 Uslovi kulture i upotreba eksperimentalnog sistema

Kada primite CacoGoblet proizvod, izvadite vrećice sa rajsferšlusom u kojima se nalaze ploče. Otvorite rajsferšluse i ostavite torbu u mraku na sobnoj temperaturi do petka iste nedelje. U petak, inkubirajte ploče na 37°C, sa 5% CO2, zasićenom vlažnošću, 4 sata. Promenite medijum i počnite eksperiment sledećeg ponedeljka.

3.2 Supstanca pod ispitivanjem: identifikacija i karakterizacija

Sponzor je odgovoran za bezbednosni list i karakterizaciju supstanci koje se ispituju. (Tabela 2)

Tabela 2

3.3 Negativna i pozitivna kontrola

NEGATIVNA kontrola je bila medij za sebe.

POZITIVNA KONTROLA ZA PROTOKOL 1: INTERLEUKIN 1 BETA

(SRP6169; lot 9E126460). (Tabela 3)

Tabela 3

4. Metodologije

4.1 E.coli.

Soj: E.COLI ATCC 8739, broj lota.

Soj je inokulisan nedelju dana pre eksperimenta u hranljivom rastvoru. Štaviše, zasejan je na ploče sa agar medijumom da bi se potvrdila njegova normalna morfologija. Zatim je usledila inkubacija na 37°C tokom 16-24 sata.

4.1.1 Priprema suspenzije Escherichia coli i postupak kolonizacije

Na dan kolonizacije, proverena je optička gustina (OD) na 600 nm rastvora E.coli i korišćena za pripremu kolonizacionih suspenzija na osnovu internih procedura (PM 18).

Brojanje bakterija je obavljeno da se verifikuje svaki inokulum u hranljivoj agar podlozi, postavljanjem odgovarajućih 10k razblaženja na ploče (od nerazređene verzije do<10-7>razblaženja suspenzije svakog odeljka). Broj živih bakterija primenjen na CacoGoblet odgovara 1,2*10<7>CFU.

4.2 Test transepitelne otpornosti (TEER)

4.2.1 Princip

Transepitelni električni otpor (TEER) je direktna mera funkcije barijere kože: odražava ukupni otpor tkiva, kako zbog njegove strukture tako i zbog debljine, i meri integritet barijere u smislu čvrstih spojeva.

Vrednost TEER monosloja diferenciranih Caco-2 ćelija ukazuje na stepen integriteta samog monosloja i, shodno tome, formiranje čvrstih spojeva između enterocita. Merenje TEER (u Ω * cm<2>) se vrši pomoću volt-om metra (Millicell ERS) (opseg 200-2000 Ω).

4.2.2 Postupak

TEER je procenjen na monosloju dobro diferenciranih CacoGoblet ćelija nakon 21. dana kulture vršenjem merenja umetanjem koristeći ispravnu elektrodu i pozicioniranjem kratkog kraja elektrode unutar unoska, u apikalnim položajima (u 0,3 ml medijuma). Dugi kraj elektrode je potopljen u otvor, u bazolateralnom položaju (u 0,9 ml medijuma).

4.3 Test sa lucifer žutom

4.3.1 Princip

Lucifer žuta (LI) je fluorescentna boja nepropusna za ćelijsku membranu. Koristi se za proučavanje paracelularne permeabilnosti supstance. Kada su spojevi netaknuti, Lucifer žuta ima veoma nisku propustljivost; ako su, pak, spojevi oštećeni, protok Lucifer žute je veći. Stoga, ovaj test omogućava da se proveri integritet ćelijskih spojeva u prisustvu supstance koja se ispituje.

4.3.2 Postupak

Lucifer žuta (LY) se primenjuje u apikalni odeljak u koncentraciji od 100 µM, nakon izlaganja supstanci koja se ispituje, rastvorenoj u fiziološkom rastvoru (0,25 ml). U bazolateralni odeljak se dodaje 0,70 ml fiziološkog rastvora. Transport LI se ocenjuje u smislu prolaska iz apikalnog odeljka u bazolateralni odeljak posle definisanog perioda inkubacije od 1 sata na 37°C.

Očitavanje se vrši pomoću spektrofluorometra (TECAN INFINITE M200) sa ekscitacijom od 428 nm i emisijom od 525 nm.

Procenat propusnosti se izračunava pomoću sledeće formule:

LY protok = (RFUBL / RFUAP početni) x 100

U netaknutom CacoGoblet monosloju protok LY bi trebao biti manji od 1,4%.

4.4 Skenirujući elektronski mikroskop (SEM)

Uzorci koje ispituju SEM su fiksirani sa 2,5% rastvorom glutaraldehida u 0,1 M PBS tokom 24 sata, isprani u 0,1 M natrijum-kakodilat puferu, pH 7,4, i ekstrahovani u 1% osmijum tetroksid (OsO4) u istom uzorku (2 sata na sobnoj temperaturi). Uzorci su zatim dehidrirani u rastućim stepenima etanola na sobnoj temperaturi i heksametildisilazanom preko noći.

Uzorci su postavljeni na igle sa karbonskim jezičcima i obloženi slojem zlata pomoću SEM E5100 metalne obloge kompanije Polaron Ekuipment Limited, a zatim prebačeni u Zeiss Sigmoid elektronski skenirajući mikroskop debelog creva za gledanje i fotografije.

Sem uzorak genesiran tokom istraživanja (Tabela 4)

Tabela 4

4.5 Imunofluorescencija: alpha-actinin

4.5.1 Princip

Imunofluorescentno obeležavanje je histološka tehnika za otkrivanje specifičnih struktura ili molekula u ćelijskim odeljcima histoloških preseka. Tehnika se zasniva na specifičnosti antitela koje vezuje antigen za detekciju ciljnog molekula i sistemu detekcije pomoću fluorescentnog mikroskopa, korišćenjem indirektnog postupka: primarnog antitela sposobnog da specifično prepozna metu i sekundarnog antitela vezanog za fluorofor, sposoban da prepozna primarno antitelo.

4.5.2 Procedura

Posle fiksiranja u hladnom etanolu tokom 30 minuta i u hladnom acetonu tokom 3 minuta, crevna sluzokoža je isprana PBS-om i nespecifične reakcije su blokirane sa 1% BSA u PBS-u tokom 30 minuta. Svaki unosak je inkubiran preko noći na 4°C sa antitelom na alfa aktinin (monoklonsko mišje antitelo, ab18061, lot GR256204-1) pri 1 µg/ml u 1% BSA u PBS-u. Nakon ispiranja, tkiva su inkubirana na sobnoj temperaturi 1 sat sa sekundarnim antitelom (kozje anti-mišje antitelo Alexa Fluor 488, Invitrogen A10-680) 1:400 u 1% BSA u PBS-u. Nakon ispiranja, jezgra su obojena DAPI-iem i analizirana pod Leica DM 2500 fluorescentnim mikroskopom.

4.6 Ispitivanje adhezije monocit-epitelnih ćelija

4.6.1 Princip

CacoGoblet ćelije su tretirane preko noći sa IL-1beta, proinflamatornim citokinom, pre testa adhezije da bi se stvorila upaljena sluzokoža. Tretirani monoslojevi su zatim tretirani proizvodima tokom 24 sata. Označene THP-1 ćelije su dodane na vrh CacoGobleta u svaki otvor. THP-1 ćelije su obeležene fluorescentnom bojom hlorometilfluorescein diacetatom (CMFDA; Invitrogen). Posle inkubacije, monosloj je nežno ispran da bi se uklonile neadherentne THP-1 ćelije. Adherentne ćelije označene fluorescentnom bojom posmatrane su pod fluorescentnim mikroskopom.

4.6.2 Procedura

Jednom tretirane, obeležene THP-1 ćelije su primenjene na

vrh CacoGobleta.

THP-1 ćelije su obeležene fluorescentnom bojom hlorometilfluorescein diacetatom (CMFDA Exc.492, Em 517; Invitrogen).

Posle 1 sata inkubacije, monosloj je nežno ispran da bi se uklonile neadherentne THP-1 ćelije. Adherentne ćelije označene fluorescentnom bojom posmatrane su pod fluorescentnim mikroskopom.

5. Rezultati

5.1 Održivost ćelije preko MTT testa

Rezultati MTT testa su predstavljeni na slici 3. Slika 3 prikazuje vitalnost ćelija nakon 24 sata tretmana sa brusnicom pri 10-100-1000 µg/ml.

Negativna kontrola (samostalni medijum) dobila je održivost od 100%.

U svim ispitivanim koncentracijama, proizvodi nisu smanjili vitalnost u poređenju sa negativnom kontrolom.

Necitotoksična koncentracija odabrana za ispitivanje efikasnosti bila je 1000 µg/ml. Pri ovoj koncentraciji interferencija supstance ispitivane MTT testom iznosila je 32%.

Anti-inflamatorna svojstva ekstrakta brusnice u in-vitro sistemu ko-kulture (THP-1 ćelije i crevne epitelne ćelije)

5.2 Ispitivanje adhezije monocit-epitelnih ćelija

Jednom tretirane, obeležene THP-1 ćelije su primenjene na vrh CacoGobleta.

Posle 1 sata inkubacije, monosloj je nežno ispran da bi se uklonile neadherentne THP-1 ćelije. Adherentne ćelije označene fluorescentnom bojom posmatrane su pod fluorescentnim mikroskopom; Rezultati su predstavljeni na slici 4.

Slika 4 prikazuje adheziju monocitno-epitelne ćelije u netretiranom upaljenom CacoGobletu

✔ Kao što se očekivalo, nakon tretmana sa IL1beta primećeno je povećanje adhezije THP-1 ćelija.

✔ Kao što se očekivalo, vrlo mali broj THP-1 ćelija pokazao je da je adherentan za CacoGoblet epitel (negativna kontrola, NT).

✔ BRUSNICA SAMA, na zdravoj sluzokoži, smanjila je adheziju THP-1 ćelija.

✔ Primećeno je značajno smanjenje adhezije THP-1 ćelija nakon primene etakortilena na upaljenu sluzokožu.

✔ Primećeno je značajno smanjenje adhezije THP-1 ćelija nakon nanošenja BRUSNICE na upaljenu sluzokožu, nešto manje nego posle

tretmana etakortilenom.

Sposobnost brusnice da sprečava adheziju E.Coli za mukozu

5.3 Merenje TEER-A

Na slici 5 prikazani su rezultati trans-epitelijalne električne otpornosti (TEER) izražene u om * cm<2>na bazalnom nivou (0 sati), nakon 4 sata tretmana sa proizvodima i nakon 2 sata kolonizacije E.coli (6 sati od tretman u celini).

Vrednosti TEER pre tretmana (T = 0 sati) ukazuju na ukupnu otpornost barijere u korelaciji sa integritetom strukture uskih spojeva.

Za karakterizaciju uticaja proizvoda na paracelularni tok jona na nivou epitela sluzokože korišćen je TEER, fizički parametar integriteta barijere sluzokože.

Slika 5 prikazuje transepitelnu električnu otpornost (TEER) izraženu u OM *cm<2>na bazalnoj (0 sati), nakon 4 sata tretmana sa brusnicom 1000 µg/ml samostalno ili nakon 2 sata kolonizacije sa E.Coli.6 sati je bilo ukupno vreme kulture negativne kontrole.

Kao što je prikazano na slici 5, kolonizacija E.coli izazvala je smanjenje TEER-a sa 274,67 om * cm<2>na 218,68 om * cm<2>nakon 2 sata tretmana (-21%).

4-satni predtretman sa brusnicom je prouzrokovao povećanje TEER-a sa 315 om* cm<2>na 325,82 om* cm<2>i suprotstavio se adheziji E.coli (3% izdvajanje TEER-a).

Nakon 4 sata tretmana, brusnica je sama po sebi izazvala povećanje TEER vrednosti od 43% (sa 299,86 om*cm<2>na 430,54 om*cm<2>): ovi rezultati ukazuju na validna svojstva formiranja filma i pozitivnu efikasnost ekstrakta brusnice na epitelnoj barijeri i u prisustvu i u odsustvu E.coli.

5.4 Test sa lucifer žutom: paracelularna permeabilnost

Paracelularni tok Lucifer žute (LY) je procenjen na kraju perioda izlaganja; rezultati merenja fluorescencije prikazani su na slici 6.

Slika 6 prikazuje % protoka LY u poređenju sa LX u nultom vremenu u apikalnom odeljku. Slika 6 prikazuje tok LY nakon 6 sati tretmana (4 sata sa brusnicom i 2 sata kolonizacije E.coli).

Negativna kontrola (NC) je imala 0,52% permeabilnost za LY.

E.coli je imala veću permeabilnost za LY (0,91%) nego negativna kontrola (74% povećanje prolaska LY u odnosu na NC).

Nije uočena značajna razlika između negativne kontrole i testiranog proizvoda: predtretman brusnicom obnovio je crevni epitel i sprečio adheziju E.coli.

Brusnica sama po sebi ima zaštitnu efikasnost: primećeno je smanjenje prolaska LY za 29% u poređenju sa negativnom kontrolom.

5.5 Imunofluorescentno bojenje alfa-aktinina

Serija slika ispod prikazuje uzorke analizirane pod fluorescentnim mikroskopom. Zelena boja predstavlja protein alfa-aktinin koji se nalazi na nivou membrane. Alfa-aktinin stupa u interakciju sa Tir, proteinom E.Coli, da bi se formirao adhezivni plak poznat kao postolje, i marker je infekcije E.Coli.

Slika 7 prikazuje imunofluorescenciju alfa-aktinina u uzorcima kolonizovanim Escherichia Coli i tretiranim ili ne tretiranim brusnicom.

Povećanje fluorescentne boje na nivou membrane je evidentno nakon kolonizacije E.coli u poređenju sa negativnom kontrolom.

Brusnica je izazvala blagi pad alfa-aktinina kada je primenjena samostalno ili kao predtretman pre kolonizacije E.coli (neznačajna razlika u poređenju sa kolonizacijom E.Coli).

5.6 SKenirujući elektronski mikroskop

Na slici 8 prikazane su ultrastrukturne slike mikroresica Caco-2 ćelija koje su izvučene iz literature. (BCD Cancer 20088:227)

U netretiranim Caco-2 ćelijama može se uočiti veliki broj mikrovila. Ivice ćelije se ne pojavljuju. Unosak: prisutne su dugačke mikrovile, b. Ćelije tretirane EGF-om. Evidentne su brojne vezikule. Unosak: prisutan je smanjen broj mikrovila, cf: tretirane ćelije. Mikrovile se smanjuju i gube uspravan položaj.

Istorijski podaci VitroScreen-a o kolonizaciji Caco-2 ćelija sa E.coli:

Proliferacija i adhezija E.coli na ćelijski sloj su evidentne (crvena strelica).

Slike 9A i 9B prikazuju uzorke analizirane pod skenirajućim elektronskim mikroskopom.

Slika 10A prikazuje negativnu kontrolu: neobrađen CacoGoblet na 6 sati

Kao što se očekivalo, negativna kontrola nije pokazala ćelijski stres ili bakterijsku kontaminaciju. Tkivo je bilo trofično, sa dobro strukturiranim dezmozomima (1000k). Čini se da su mikroresice dobro organizovane po celoj površini: može se uočiti gusta ivica mikroresica nalik na četkicu (5000k, crvena kutija).

Slika 10B prikazuje kolonizaciju tkiva E.coli, 2 sata

Zbog rešavanja tehničkih problema, na površini CacoGobleta nije prisutna proliferacija E.coli. Međutim, monosloj pokazuje oštećene mikrovile na površini; manje ih je i izgubile su normalnu poziciju (10000k, crvena kutija) u poređenju sa negativnom kontrolom, što ukazuje da je E.coli oštetila rub nalik na četkicu.

Slika 10C prikazuje prethodni tretman sa CRANBERRI tokom 4 sata pre kolonizacije E.coli tokom 2 sata.

Čini se da je monosloj dobro strukturiran i pokazuje mikrovile na površini (5000k). Nekoliko ćelija E.coli je vidljivo i njihova morfologija je izmenjena (10000k, crvena strelica), sa jasnim znacima lize. Pored toga, evidentno je obilje bakterijskih ostataka (10000k, crvena zvezda), što ukazuje da je tretman brusnicom prouzrokovao oštećenje E.coli.

6. Zaključci

Primenjeni su različiti eksperimentalni modeli zasnovani na in vitro CacoGoblet crevnom epitelu da bi se procenila efikasnost EKSTRAKTA BRUSNICE u ime Sofar S.p.A.

Necitotoksična koncentracija je testirana u preliminarnoj fazi putem MTT testa kako bi se isključila potencijalna intrinzična toksičnost proizvoda.

Najviša necitotoksična koncentracija odabrana za studiju efikasnosti bila je 1000 µg/ml.

Korišćena su dva protokola:

1) ANTI-INFLAMATORNA SVOJSTVA EKSTRAKTA BRUSNICE U

SISTEMU KO-KULTURE (THP-1 ćelije i crevne epitelne ćelije)

2) SPOSOBNOST BRUSNICE DA SPREČI ADHEZIJU E.COLI

Procenjeni su sledeći parametri da bi se došlo do zaključka u vezi sa sledećim:

- Adhezija monocitno-epitelnih ćelija u CacoGoblet-u sa inflamacijom izazvanom IL1-beta (anti-inflamatorna efikasnost)

- Trans-epitelni električni otpor (TEER) i paracelularni tok LY (promena epitelne barijere)

- Ultrastrukturna analiza E.Coli sa skenirajućim elektronskim mikroskopom (SEM) (protiv adhezije i proliferacije E.coli)

- lokacija alfa-aktinina imunofluorescencijom (protiv adhezije E.coli) U zaključku, rezultati su pokazali da:

1) BRUSNICA, primenjena na upaljenu crevnu sluzokožu, je izazvala značajno smanjenje adhezije na THP-1 ćelije, što ukazuje na značajno antiinflamatorno dejstvo.

2) Predtretman brusnicom u trajanju od 4 sata je blago suprotstavio oštećenje barijere izazvano adhezijom E.coli; Brusnica je sama po sebi, nakon 4 sata tretmana, izazvala povećanje vrednosti TEER za 43%, što ukazuje na odličnu sposobnost stvaranja filma.

3) Brusnica sama vrši zaštitno dejstvo na integritet barijere: primećeno je smanjenje prolaska LY za 29% u poređenju sa negativnom kontrolom. Nije se pojavila značajna razlika sa testiranim proizvodom u poređenju sa negativnom kontrolom: predtretman brusnicom je obnovio crevni epitel i sprečio adheziju E.coli.

4) Bojenje α-aktininom, koji je relevantan kao biomarker za adheziju E.coli,nije u značajnoj meri izmenjeno tretmanom brusnicom u usvojenim eksperimentalnim uslovima; međutim, primećeno je blago smanjenje fluorescencije.

5) Analiza pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije je otkrila direktnu aktivnost brusnice protiv adhezije, vitalnosti i morfologije E.coli.

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Sastav za oralnu primenu, koja se odnosi na

koja sadrži, ili se alternativno sastoji od:

(i) jezgra koje sadrži, ili se, alternativno, sastoji od ekstrakta (a) najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium i najmanje jednog sastojka (b) prihvatljivog za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu;

(ii) gastro-otpornog sloja izvan jezgra (i) i koji potpuno prekriva (i) i sadrži najmanje jedan sastojak (c) prihvatljiv za farmaceutsku ili prehrambenu upotrebu, naznačeno time što je gastro-otporni sloj (ii) sposoban za omogućavanje oslobađanja ekstrakta (a) u debelom crevu; naznačeno time što je sastav za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju divertikuloze debelog creva, patologija ili bolesti povezanih sa prisustvom divertikula, izabranih između divertikularne bolesti, SUDD (simptomatska nekomplikovana divertikuloza) i divertikulitisa debelog creva.

2. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je navedeni ekstrakt (a) najmanje jedne biljke iz roda Vaccinium poželjno suvi ekstrakt prisutan u količini od 150 mg do 600 mg, u odnosu na ukupnu težinu (a).

3. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je navedeni ekstrakt (a) prisutan u količini od 200 mg do 300 mg, u odnosu na ukupnu težinu (a), i sadrži od 80% do 99% proantocijanidina po težini, u odnosu na ukupnu težinu (a).

4. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je navedeni ekstrakt (a) poželjno suvi ekstrakt brusnice, poželjno koji sadrži PAC (proantocijanidine) u koncentraciji od 5% do 30% po težini ili zapremini, na primer 10 %, ili 15%, ili 20%, ili 25%.

5. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što gastrootporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (i) ima karakteristiku razlaganja i rastvaranja u funkciji pH vrednosti i/ili vremena; poželjno je da navedeni sloj (ii) može da se razbije i rastvori od pH vrednosti od oko 6,5 do oko pH od 8.

6. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je pomenuti gastro-otporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (i) sposoban da se razbije i rastvori sa pH vrednosti od oko 7 do oko pH 7,5; poželjno u vremenu od 30 minuta do 120 minuta; još poželjnije od 45 minuta do 90 minuta.

7. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, 5 ili 6, naznačeno time što pomenuti gastro-otporni sloj (ii) izvan jezgra (i) sadrži ili se, alternativno, sastoji od najmanje jedne supstance izabrane između Eudragard biotičkih E1207, gastro-otporni polimer, kao što je poli(metil akrilat-ko-metil metakrilat-ko-metakrilna kiselina) 7:3:1 ili drugi anjonski metakrilni kopolimer, trietil citrat E1505, talk, etil celuloza, anjonska mešavina metakrilata i kopolilata, natrijum alginat i njihove smeše, skrob i modifikovani skrobovi, oleinska kiselina, stearinska kiselina i trigliceridi srednjeg lanca.

8. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačeno time što pomenuti gastro-otporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (1) sadrži, ili se, alternativno, sastoji od:

- gastro-otporni polimer, kao što je poli(metil akrilat-ko-metil metakrilat-kometakrilna kiselina) 7:3:1 ili drugi anjonski metakrilatni kopolimer: od 5 do 50 mg; 10 do 35 mg; 18-25 mg;

- trietil citrat E1505: od 0,1 do 5 mg; 0,3 do 3 mg; 0,5-2 mg;

- talk: od 1 do 30 mg; 3 do 20 mg; 5-15 mg;

9. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačeno time što pomenuti gastro-otporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (i) sadrži, ili se, alternativno, sastoji od:

- etil celuloza: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,97 mg;

- natrijum alginat: od 5 do 15 mg; 8 do 12 mg; 9,30 mg;

- amonijum hidroksid: od 0,5 do 4 mg; 1,5 do 3 mg; 2,34 mg;

- trigliceridi srednjeg lanca: od 0,5 do 5 mg; 1,5 do 3 mg; 2,12 mg;

- oleinska kiselina: od 0,5 do 3 mg; 1 do 2 mg; 1,17 mg;

- prečišćena stearinska kiselina: od 0,01 do 0,5 mg; 0,05 do 0,3 mg; 0,1 mg;

10. Sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačeno time što pomenuti gastro-otporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (i) sadrži, ili se, alternativno, sastoji od:

- etil celuloza: od 5 do 50 mg; 10 do 30 mg; 15-20 mg;

- titanijum dioksid: od 0,1 do 15 mg; 0,5 do 10 mg; 1-5 mg;

- natrijum alginat: od 0,1 do 5 mg; 0.3 do 4 mg; 0,5-2 mg;

- oleinska kiselina, stearinska kiselina, trigliceridi srednjeg lanca: svaki od 0,01 do 3 mg; između 0,05 i 1 mg.

11. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što pomenuti gastro-otporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (i) sadrži, ili se, alternativno, sastoji od:

- Eudragard<®>biotik E1207 (Evonik): na primer 20,4 mg;

- trietil citrat E1505: na primer 1 mg;

- talk: na primer 10,2 mg.

12. Sastav za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što pomenuti gastro-otporni sloj (ii) spolja u odnosu na jezgro (i) sadrži, ili se, alternativno, sastoji od:

- etil celuloza: na primer 9,97 mg;

- natrijum alginat: na primer 9,30 mg;

- amonijum hidroksid: na primer 2,34 mg;

- trigliceridi srednjeg lanca: na primer 2,12 mg;

- oleinska kiselina: na primer 1,17 mg;

- prečišćena stearinska kiselina: na primer 0,1 mg.