RS65094B1 - Car t-ćelije prema bcma za lečenje multiplog mijeloma - Google Patents

Description

Opis

Tehnička oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak obezbeđuje terapeutike za lečenje multiplog mijeloma. Posebno, premetni pronalazak obezbeđuje T-ćelije koje sadrže himerni antigenski receptor (CAR) koje mogu da ciljno deluju na antigen maturacije B ćelija.

Pozadina pronalaska

[0002] Multipli mijelom (MM) ostaje neizlečiv hematološki malignitet koji je odgovoran za 1% svih kancera i 15-20% svih hematoloških maligniteta, sa prosečnim porastom od 0,8% novih slučajeva svake godine tokom protekle decenije. MM se karakteriše klonskim umnožavanjem malignih plazma ćelija u kostnoj srži (BM), što dovodi do prekomerne proizvodnje monoklonskog imunoglobulina (Ig) u krvi i/ili urinu, uzrokujući osteolitičke lezije sa povezanim kliničkim simptomima koji uključuju hiperkalcemiju, infekcije i disfunkciju organa. Prirodni tok MM je relaps do refraktorne bolesti bez dostizanja platoa preživljavanja sa manje od 10% pacijenata koji su postigli trajnu potpunu remisiju (CR) nakon 5-10 godina posle transplantacije autolognih matičnih ćelija (ASCT). Štaviše, pacijenti se retko izleče posle visoke doze hemioterapije praćene sa ASCT i što je važno, pacijenti koji postižu CR imaju duže preživljavanje od onih koji ne uspeju da postignu CR. Prema tome, potrebne su nove strategije za poboljšanje preživljavanja pacijenata sa R/R MM, naročito kod pacijenata koji su u visokom riziku, sa nepovoljnom citogenetikom.

[0003] Poslednjih godina, imunoterapija T-ćelijama koje sadrže himerni antigenski receptor (CAR), zasnovana na infuziji genetički modifikovanih autolognih T ćelija tako da prepoznaju antigen koji se eksprimira na tumorskoj ćeliji, promenila je modalitet lečenja određenih hematoloških maligniteta. Specifično, kod akutne limfoblastne leukemije (ALL) i limfoma ovo lečenje sa ciljnim delovanjem na CD19 postiglo je izvanredne odgovore što je dovelo do odobrenja ovih novih lečenja od strane FDA. Kod MM, antigen maturacije B ćelija (BCMA), transmembranski glikoprotein koji je uključen u regulaciju maturacije i preživljavanja B ćelija, sa specifičnom i ograničenom ekspresijom na zrelim B i plazma ćelijama, pojavio se kao najperspektivniji cilj za imunoterapiju CART ćelijama.

[0004] Sve tekuće kliničke studije kod pacijenata sa MM sa CARTBCMA ćelijama pokazale su da je u poređenju sa CART19, veća doza CART ćelija potrebna kako bi se postigao odgovor, pošto je 150×106 CART ćelija niža doza potrebna za dobijanje odgovora. Štaviše, pokazano je da se produbljivanje odgovora postiže tokom vremena kako se broj veoma dobrih delimičnih odgovora razvija do potpunih odgovora tokom vremena. Pored toga, sa ciljem da se izbegnu relapsi usled ranog nestanka CART ćelija, upotreba humanizovanih ili humanih CAR umesto murinskih CAR pojavljuje se kao trenutna tendencija u imunoterapiji CART ćelijama (Sommermeyer D, Hill T, Shamah SM, et al. Fully human CD19-specific chimeric antigen receptors for T-cell therapy. Leukemia. 2017;31(10):2191-2199; Turtle CJ, Hanafi LA, Berger C, et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. J Clin Invest.2016;126(6):2123-2138).

[0005] WO2017211900, CN108395478, CN108285489, CN108004259 objavljuju CART-ćelije prema BCMA zasnovane na antitelu J22.9 i njegovim varijantama.

[0006] Ovde, počevši od CART19 (ARI1) koje se već upotrebljavaju u fazi II multicentričnog kliničkog ispitivanja za malignitete B ćelija (Castella M, Boronat A, Martin-Ibanez R, Rodriguez V, Sune G, Caballero M, et al. Development of a Novel Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor: A Paradigm for an Affordable CAR T Cell Production at Academic Institutions. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Mar 15;12:134-44), generisali smo murinske CART ćelije prema BCMA (ARI2m) koje bi mogle da upotrebljavaju pacijenti u javnom zdravstvenom sistemu. Kada smo potvrdili njihovu in vitro i in vivo efikasnost, ARI2m su humanizovane u ARI2h. Efikasnost i inflamatorni odgovor i ARI2m i ARI2h su upoređeni pokazujući uporedivu efikasnost oba CAR, i uočen je niži inflamatorni profil za ARI2h. Štaviše, umnožavanje pod GMP uslovima u kliničkoj razmeri u našoj ustanovi uspešno je postignuto za oba CAR. Konačno, analiziran je uticaj solubilnog BCMA (sBCMA) na aktivnost ARI2 demonstrirajući kako sBCMA može negativno uticati na aktivnost CART. Svi ovi rezultati će omogućiti izvođenje multicentričnog kliničkog ispitivanja za pacijente sa MM sa našim ARI2h ćelijama u Španiji.

Kratak opis slika

[0007]

Slika 1: Dizajn i funkcionalna karakterizacija CARTBCMA murina (ARI2m) prema ćelijama multiplog mijeloma (MM). (A) Dizajn ARI2m. (B) Efikasnost transdukcije ARI2 i NT T ćelija pre i posle krioprezervacije. (C) Testovi citotoksičnosti ARI2 prema dve ćelijske linije MM (ARP1 i U266) i jedne nemijelomske ćelijske linije (K562). Test citotoksičnosti graničnog razblaženja prema ARP1 i U266 (ćelijske linije MM) i K562 (CML) izveden je u odnosima od 1:1 do 0,125:1 (T ćelija:tumorska ćelijska linija) na 36 h (D) i na 72 h (E). (F) Profil citokina IFNγ, IL-6 i TNF-α posle 24 h i 48 h kokulture (T ćelije i ARP1 ćelije). (G-K) In vivo efikasnost ARI2m ćelija: (G): Dijagram eksperimentalnog dizajna i kvantifikacija progresije bolesti pomoću bioluminescencije nedeljno (H) i sveukupno preživljavanje miševa koji su tretirani sa ARI2m naspram grupe sa NT T ćelijama naspram netretirane grupe (I). (J) Protočna citometrija kostne srži (BM) i slezine miševa na kraju eksperimenta. (K) Procenat ukupnih T ćelija i CART ćelija u BM i slezini kod miševa koji su tretirani sa ARI2m. (L). ELISA solubilnog BCMA (sBCMA) iz seruma miševa pošto su tretirani sa ARI2m ili NT T ćelijama.

Slika 2: Humanizacija ARI2m u ARI2h i poređenje ARI2m naspram ARI2h: (A) Šematski prikaz dispariteta amino-kiselina za teški i laki lanac scFv u humanizovanim ARI2 na osnovu BLAST ili Germline algoritama. (B) Test citotoksičnosti graničnog razblaženja ARI2m naspram obe humanizovane verzije (Blast i Germline). (C) Dugotrajni test citotoksičnosti koji upoređuje murinske naspram humanizovanih ARI2 prema ARP1 (MM) i K562 (CML) i njihove proizvodnje IFNγ. (D-I) In vivo rezultati: Progresija bolesti pomoću nedeljne bioluminescencije u ranom modelu (D) i uznapredovalom modelu (E) i njihova kvantifikacija respektivno (F). (G) Kaplan-Majerova (Kaplan-Maier) kriva koja predstavlja sveukupno preživljavanje netretirane, ARI2m i ARI2h grupe miševa u modelima rane i uznapredovale bolesti. (H) Ukupne CD3+ T ćelije i procenat ARI2 ćelija iz CD3+ T ćelijske populacije koje su pronađene u BM i slezini za modele rane i uznapredovale bolesti. (I) ELISA IFNγ iz seruma miševa na dan 3 i 31 za model rane bolesti i na dan 5 i 21 za model uznapredovale bolesti.

Slika 3: Profil T ćelija i inflamatorni odgovor ARI2m naspram ARI2h: (A) Šema ponovljenog testa stimulacije antigenom. (B) Profil odnosa CD4/CD8 T ćelija ARI2m, ARI2h i NT T ćelija duž 4 uzastopna izazova i procenat CART ćelija u podgrupama CD4 ili CD8 T ćelija (C). (D) Šematski prikaz izolacije autolognih monocita i T ćelija iz istog sloja istaloženih leukocita i krvnih pločica i njihovo umnožavanje, diferencijacija i kokultura sa ćelijskim linijama MM. (E) Citotoksičnost i proizvodnja proinflamatornih citokina (IL6, TNFα i IL1β) (F) ARI2m prema ARP1 ćelijama sa ili bez makrofaga. (G) Proizvodnja citokina tokom 48 h IFNγ, IL6, TNFα i IL1β posle kokultivisanja ARI2m/ARI2h sa makrofagima i ARP1.

Slika 4: Klinička proizvodnja i aktivnost ARI2m i ARI2h: Kliničko umnožavanje ARI2m i ARI2h ćelija (A i B) koje pokazuje ukupne T ćelije postignute na kraju umnožavanja (levo) i procenat postignutih CART ćelija (desno). (C) Medijana četiri klinička umnožavanja ARI2m i ARI2h ćelija. Rezultati pokazuju procenat i ukupan broj ARI2 ćelija koji je postignut na kraju umnožavanja. (D) Testovi citotoksičnosti i ARI2m i ARI2h ćelija prema U266 ćelijskoj liniji MM na kraju umnožavanja.

Slika 5: Solubilni BCMA utiče na aktivnost ARI2: (A) ELISA sBCMA od 5 pacijenata sa monoklonskom gamapatijom neutvrđenog značaja (MGUS), MM pri postavljanju dijagnoze (Dx) i pri relapsu. (B) Konfokalni fluorescentni snimak gde su ćelije MM obojene sa tragačem ćelija CMAC i BCMA bojenjem sa monoklonskim anti-TNFRSF17. (C i D) Reprezentativni snimci iz dva različita in vivo eksperimenta sa vremenskim odmakom tokom tri sata ARI2m obojenih sa tragačem ćelija CMAC i ARP1 ćelijama MM koje prekomerno eksprimiraju BCMA u GFP. (E) Test citotoksičnosti i proizvodnja IFNγ (F) ARI2m koje su kokultivisane sa ARP1 ćelijama MM, dodavanjem rekombinantnog BCMA proteina (BCMA) sa i bez antitela prema BCMA (Ab). (G) MFI BCMA ARP1 ćelijske linije MM same ili u kokulturi sa ARI2/NT T ćelijama sa ili bez DAPT i njegova sBCMA kvantifikacija (H). (I) Šema testova citotoksičnosti sa i bez transbunarića (TW). Kokultura ARI2m/NT T ćelija sa ARP1 ćelijskom linijom izvedena je u bunariću, i dodatne ARP1 ćelije su dodate u TW kao izvor za kontinuirano oslobađanje sBCMA. DAPT je takođe dodat paralelno. (J) Rezultati citotoksičnosti eksperimenta pokazanog u (I).

Slika 6: Dodatno poređenje ARI2m naspram ARI2h u modelu veoma uznapredovale bolesti. (A) CFSE test tokom 4 dana za analizu proliferacije ARI2 posle susreta sa ARP1 ćelijama MM. (B) Proizvodnja TNFα i IL6 tokom 7 dana kokultivisanja ARI2m i ARI2h ćelija sa ARP1 ćelijama MM u odnosu 0,125:1 (E:T). (C) Šematski prikaz in vivo eksperimenta kod miševa koji primaju ARP1 ćelije MM i bilo ARI2m i ARI2h ćelije. (D) Progresija bolesti praćena pomoću nedeljne bioluminescencije eksperimenta u (C).

Detaljan opis pronalaska

Definicije

[0008] "Primenjivanje" ili "primena" medikamenta pacijentu (i gramatički ekvivalenti ove fraze) označava direktnu primenu, koja može biti primena pacijentu od strane medicinskog profesionalca ili može biti samoprimena, i/ili indirektnu primenu, što može biti čin propisivanja leka. Na primer, lekar koji daje uputstva pacijentu da samoprimeni medikament ili obezbeđuje pacijentu recept za lek, primenjuje lek pacijentu.

[0009] Termin "afitelo" označava protein koji je poreklom iz Z domena proteina A i koji je projektovan da se vezuje za specifični cilj (videti Frejd & Kim, 2017. Exp Mol Med. 49(3): e306).

[0010] Termin "antitelo" označava molekul koji sadrži najmanje jedan imunoglobulinski domen koji se vezuje za određeni cilj, ili je imunološki reaktivan sa njim. Termin uključuje cela antitela i bilo koji antigen-vezujući deo ili njihove pojedinačne lance i njihove kombinacije; na primer, termin "antitelo" posebno uključuje bivalentna antitela i bivalentna bispecifična antitela.

[0011] Tipičan tip antitela sadrži najmanje dva teška lanca ("HC") i dva laka lanca ("LC") međusobno povezana disulfidnim vezama.

[0012] Svaki "teški lanac" sadrži "varijabilni domen teškog lanca" (ovde skraćeno kao "VH") i "konstantni domen teškog lanca" (ovde skraćeno kao "CH"). Konstantni domen teškog lanca tipično sadrži tri konstantna domena, CH1, CH2, i CH3.

[0013] Svaki "laki lanac" sadrži "varijabilni domen lakog lanca" (ovde skraćeno kao "VL") i "konstantni domen lakog lanca" ("CL"). Konstantni domen lakog lanca (CL) može biti kapa tipa ili lambda tipa. VH i VL domeni se mogu dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost ("CDR"), ispresecani regionima koji su više konzervirani, nazvanim "regioni okvira" ("FW").

[0014] Svaki VH i VL je sačinjen od tri CDR i četiri FW, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Predmetna objava između ostalog predstavlja sekvence VH i VL kao i podsekvence koje odgovaraju CDR1, CDR2, i CDR3.

[0015] Precizne granice amino-kiselinske sekvence datog CDR mogu se odrediti upotrebom bilo koje od brojnih dobro poznatih šema, uključujući one koje su opisali Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Služba javnog zdravlja, Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, MD ("Kabat" šema numerisanja), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" šema numerisanja).

[0016] U skladu sa tim, osoba sa iskustvom u struci razume da su sekvence FW1, FW2, FW3 i FW4 podjednako objavljene. Za određeni VH, FW1 je podsekvenca između N-terminusa VH i N-terminusa H-CDR1, FW2 je podsekvenca između C-terminusa H-CDR1 i N-terminusa H-CDR2, FW3 je podsekvenca između C-terminusa H-CDR2 i N-terminusa H-CDR3, i FW4 je podsekvenca između C-terminusa H-CDR3 i C-terminusa VH. Slično, za određeni VL, FW1 je podsekvenca između N-terminusa VL i N-terminusa L-CDR1, FW2 je podsekvenca između C-terminusa L-CDR1 i N-terminusa L-CDR2. FW3 je podsekvenca između C-terminusa L-CDR2 i N-terminusa L-CDR3, i FW4 je podsekvenca između C-terminusa L-CDR3 i C-terminusa VL.

[0017] Varijabilni domeni teških i lakih lanaca sadrže region koji interaguje sa vezujućim ciljem, i ovaj region koji interaguje sa vezujućim ciljem se ovde takođe označava kao "antigen-vezujuće mesto" ili "antigen vezujuće mesto". Konstantni domeni antitela mogu posredovati u vezivanju antitela za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa. Primeri antitela iz predmetne objave uključuju tipična antitela, ali takođe bivalentne fragmente i njihove varijacije kao što je F(ab')2.

[0018] Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo" obuhvata intaktna poliklonska antitela, intaktna monoklonska antitela, bivalentne fragmente antitela (kao što je F(ab')2), multispecifična antitela kao što su bispecifična antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži antigen vezujuće mesto.

[0019] Antitelo može biti iz bilo koje od pet glavnih klasa (izotipova) imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, ili njihovih podklasa (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identiteta njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se označavaju kao alfa, delta, epsilon, gama, i mu, respektivno. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije. Antitela mogu biti gola ili konjugovana za druge molekule kao što su terapijski agensi ili dijagnostički agensi kako bi se formirali imunokonjugati.

[0020] Termin "antigen-vezujući fragment" ili "Fab" označava fragment antitela koji sadrži jedan konstantni i jedan varijabilni domen svakog teškog i lakog lanca. Fab fragment se može dobiti digestijom intaktnog monoklonskog antitela sa papainom.

[0021] Termin "multipli mijelom" poznat i kao mijelom plazma ćelija, je kancer plazma ćelija, tipa belih krvnih zrnaca koja normalno proizvode antitela. Često se u početku ne primećuju nikakvi simptomi. Kada uznapreduje, mogu se javiti bol u kostima, krvarenje, česte infekcije, i anemija. Komplikacije mogu uključivati amiloidozu.

[0022] Termin "antigen maturacije B-ćelija" (BCMA ili BCM), takođe poznat kao član superporodice receptora faktora nekroze tumora 17 (TNFRSF17), je protein koji je kod ljudi kodiran TNFRSF17 genom.

[0023] Termin "BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa" označava supstancu koja je u stanju da vezuje BCMA. U kontekstu CAR, BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa usmerava T ćelije na BCMA-pozitivnu ćeliju, poželjno kancersku ćeliju. U kontekstu CAR, treba razumeti da je BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa genetički kodirana.

[0024] Termin "himerni antigenski receptor" ili "CAR" označava sintetički receptor koji usmerava T ćelije na odabrani antigen i reprogramira funkciju, metabolizam i postojanost T ćelija (videti Rivière & Sadelain, 2017. Mol Ther.25(5):1117 -1124). Slično, termin "CART" označava T ćeliju koja sadrži CAR.

[0025] "Kombinovana terapija", "u kombinaciji sa" ili "u vezi sa" kao što se ovde upotrebljava označava bilo koji oblik istovremenog, paralelnog, simultanog, uzastopnog ili intermitentnog lečenja sa najmanje dva različita modaliteta lečenja (tj. jedinjenja, komponenti, ciljnih agenasa ili terapijskih agenasa). Kao takvi, termini označavaju primenu jednog modaliteta lečenja pre, tokom, ili posle primene drugog modaliteta lečenja subjektu. Modaliteti u kombinaciji mogu se primenjivati bilo kojim redosledom. Terapijski aktivni modaliteti primenjuju se zajedno (npr. simultano u istoj ili odvojenim kompozicijama, formulacijama ili jediničnim doznim oblicima) ili odvojeno (npr. istog dana ili različitim danima i bilo kojim redosledom u skladu sa odgovarajućim doznim protokolom za odvojene kompozicije, formulacije ili jedinične dozne oblike) na način i dozni režim koje propisuje zdravstveni radnik ili u skladu sa regulatornom agencijom. Generalno, svaki modalitet lečenja će se primenjivati u dozi i/ili prema vremenskom rasporedu određenom za taj modalitet lečenja. Opciono, tri ili više modaliteta mogu se upotrebljavati u kombinovanoj terapiji. Pored toga, kombinovane terapije koje su ovde obezbeđene mogu se upotrebljavati zajedno sa drugim tipovima lečenja. Na primer, druga antikancerska lečenja mogu biti odabrana iz grupe koja se sastoji od hemioterapije, operacije, radioterapije (zračenja) i/ili hormonske terapije, između ostalih lečenja koja su povezana sa trenutnim standardom nege za subjekta.

[0026] "Potpuni odgovor" ili "potpuna remisija" ili "CR" ukazuje na nestanak svih ciljnih lezija kao što je definisano u RECIST v1.1 smernici. To ne znači uvek da je kancer izlečen.

[0027] Termin "kostimulatorni signalni domen" označava signalnu funkcionalnu grupu koja T ćelijama obezbeđuje signal koji, pored primarnog signala koji obezbeđuje, na primer, CD3ζ lanac TCR/CD3 kompleksa, posreduje u T ćelijskom odgovoru, uključujući, ali ne ograničavajući se na, aktivaciju, proliferaciju, diferencijaciju, sekreciju citokina, i slično. Kostimulatorni domen, u kontekstu predmetnog pronalaska, je 4-1BB. Termin "4-1BB" označava protein membranskog receptora koji se takođe naziva CD137, koji je član superporodice receptora faktora nekroze tumora (TNFR) koji se eksprimira na površini aktiviranih T-ćelija kao tip pomoćnog molekula [Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1963 (1989); PoUok et al., J. Immunol. 151:771 (1993)].4-1BB ima molekulsku težinu od 55 kDa, i nalazi se kao homodimer. Smatra se da 4-1BB posreduje u putu transdukcije signala iz spoljašnosti ćelije ka unutra [Kim et al., J. Immunol. 151:1255 (1993)]. Humani 4-1BB gen je izolovan iz cDNA biblioteke napravljene od iRNK aktivirane humane periferne T-ćelije [Goodwin et al., Eur. J. Immunol. 23:2631 (1993);]. Amino-kiselinska sekvenca humanog 4-1BB pokazuje 60% homologije sa mišjim 4-1BB [Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1963 (1989); Gen Bank No: NM_011612] što ukazuje da su sekvence visoko konzervirane. Kao što je prethodno pomenuto, 4-1BB pripada superporodici TNFR, zajedno sa CD40, CD27, TNFR-I, TNFR-II, Fas, i CD30 [Alderson et al., Eur. J. Immunol. 24:2219 (1994)]. Kada je monoklonsko antitelo vezano za 4-1BB koji se eksprimira na površini T-ćelija, aktivacija anti-CD3 T-ćelija višestruko se povećava [Pollok et al., J. Immunol. 150:771 (1993)]. 4-1BB se vezuje za ligand visokog afiniteta (4-1BBL, takođe nazvan CD137L) koji se eksprimira na nekoliko antigen-prezentujućih ćelija, kao što su makrofagi i aktivirane B ćelije [Pollok et al., J. Immunol. 150:771 (1993) Schwarz et al., Blood 85:1043 (1995)]. Za 4-1BBL je podnet zahtev za zaštitu patenta i opisan je u S.A.D. patentu 5,674,704. Interakcija 4-1BB i njegovog liganda obezbeđuje kostimulatorni signal koji dovodi do aktivacije i rasta T ćelija [Goodwin et al., Eur. J. Immunol. 23:2631 (1993); Alderson et al., Eur. J. Immunol.

24:2219 (1994); Hurtado et al., J. Immunol.155:3360 (1995); Pollock et al., Eur. J. Immunol.

25:488 (1995); DeBenedette et al., J. Exp. Med.181:985 (1995)].

[0028] "Preživljavanje bez bolesti" (DFS) označava dužinu vremena tokom i posle lečenja tokom kojeg pacijent ostaje bez bolesti.

[0029] Kao što se ovde upotrebljava, termin "efikasna količina" agensa, npr. terapijskog agensa kao što je CART, je ona količina koja je dovoljna da se postignu korisni ili željeni rezultati, na primer, klinički rezultati, i, kao takva, "efikasna količina" zavisi od konteksta u kom se primenjuje. Na primer, u kontekstu primene terapijskog agensa koji leči multipli mijelom, efikasna količina može smanjiti broj kancerskih ćelija; smanjiti veličinu tumora ili opterećenje tumorom; inhibirati (tj. usporiti do neke mere i u određenom primeru izvođenja, zaustaviti) infiltraciju kancerskih ćelija u periferne organe; inhibirati (tj. usporiti do neke mere i u određenom primeru izvođenja, zaustaviti) tumorske metastaze; inhibirati, do neke mere, rast tumora; ublažiti, do neke mere, jedan ili više simptoma koji su povezani sa kancerom; i/ili rezultovati povoljnim odgovorom kao što je povećano preživljavanje bez progresije (PFS), preživljavanje bez bolesti (DFS), ili sveukupno preživljavanje (OS), potpuni odgovor (CR), delimični odgovor (PR) ili, u nekim slučajevima, stabilna bolest (SD), smanjenje progresije bolesti (PD), smanjeno vreme do progresije (TTP) ili bilo koja njihova kombinacija. Termin "efikasna količina" se može upotrebljavati naizmenično sa "efikasnom dozom", "terapijski efikasnom količinom", ili "terapijski efikasnom dozom".

[0030] Termini "pojedinac", "pacijent" ili "subjekt" upotrebljavaju se naizmenično u predmetnoj prijavi da označe ljudsko biće i ne treba da budu ograničavajući na bilo koji način. "Pojedinac", "pacijent" ili "subjekt" može biti bilo kog uzrasta, pola i fizičkog stanja.

[0031] "Infuzija" ili "davanje infuzije" označava introdukovanje rastvora koji sadrži terapijski agens u telo kroz venu u terapijske svrhe. Generalno, ovo se postiže putem intravenske vrećice.

[0032] "Unutarćelijski signalni domen" kao što se ovde upotrebljava označava ceo ili deo jednog ili više domena molekula (ovde himerni receptorski molekul) koji obezbeđuje aktivaciju limfocita. Unutarćelijski domeni takvih molekula posreduju u signalu interagovanjem sa ćelijskim medijatorima što rezultuje proliferacijom, diferencijacijom, aktivacijom i drugim efektorskim funkcijama. Primeri unutarćelijskih signalnih domena za upotrebu u CAR iz pronalaska uključuju unutarćelijske sekvence CD3ζ lanca, i/ili koreceptore koji deluju zajedno da iniciraju transdukciju signala nakon CAR angažovanja, kao i bilo koji derivat ili varijantu ovih sekvenci i bilo koju sintetičku sekvencu koja ima istu funkcionalnu sposobnost.

[0033] Termin "monotelo" označava protein koji je poreklom iz domena fibronektina tipa III koji je projektovan tako da se vezuje za specifičan cilj (videti Koide et al., 2013. J Mol Biol.

415(2):393-405).

[0034] Termin "nanotelo" označava protein koji sadrži solubilni pojedinačni antigen-vezujući V-domen teškog lanca antitela, poželjno teškog lanca antitela kamelida (videti Bannas et al., 2017. Front Immunol. 8:1603).

[0035] "Sveukupno preživljavanje" (OS) označava vreme od početka praćenja pacijenta do smrti ili cenzurisano do datuma kada je poslednje poznato da je bio živ. OS uključuje produženje očekivanog životnog veka u poređenju sa naivnim ili nelečenim pojedincima ili pacijentima. Sveukupno preživljavanje označava situaciju pri čemu pacijent ostaje živ tokom definisanog vremenskog perioda, kao što je jedna godina, pet godina, itd. npr. od trenutka postavljanja dijagnoze ili početka lečenja.

[0036] "Delimični odgovor" ili "PR" označava najmanje 30% smanjenja zbira prečnika ciljnih lezija, uzimajući kao referencu početni zbir prečnika, kao odgovor na lečenje, kao što je definisano u RECIST v1.1 smernici.

[0037] Termin "peptidni aptamer" označava kratku sekvencu od 5-20 amino-kiselinskih ostataka koja se može vezati za specifični cilj. Peptidni aptameri se tipično inseriraju unutar regiona petlje stabilne proteinske skele (videti Reverdatto et al., 2015. Curr Top Med Chem.

15(12):1082-101).

[0038] Kao što se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "farmaceutski prihvatljiv razblaživač" znači bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u struci. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i, bez ograničavanja obima predmetnog pronalaska, uključuju: dodatne agense za puferisanje; konzervanse; korastvarače; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; helatne agense kao što je EDTA; komplekse metala (npr. Zn-protein kompleksi); biorazgradive polimere, kao što su poliestri; kontrajone koji formiraju soli, kao što su natrijum, polihidroksilni šećerni alkoholi; amino-kiseline, kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, i treonin; organske šećere ili šećerne alkohole, kao što su laktitol, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr. inozitol), polietilen glikol; redukcione agense koji sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol, i natrijum tiosulfat; proteine male molekulske težine, kao što su albumin iz humanog seruma, albumin iz goveđeg seruma želatin, ili drugi imunoglobulini; i hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon. Drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori, kao što su oni opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) takođe mogu biti uključeni u farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana, pod uslovom da ne utiču negativno na željene karakteristike farmaceutske kompozicije.

[0039] "Progresivna bolest" ili "bolest koja je progredirala" označava pojavu još jedne nove lezije ili tumora i/ili nedvosmislenu progresiju postojećih neciljnih lezija kao što je definisano u RECIST v1.1 smernici. Progresivna bolest ili bolest koja je uznapredovala takođe može označavati rast tumora od više od 20 procenata od početka lečenja, bilo usled povećanja mase ili širenja tumora.

[0040] "Preživljavanje bez progresije" (PFS) označava vreme od početka praćenja do progresije bolesti ili smrti. PFS se generalno meri upotrebom Kaplan-Majer postupka i kriterijuma za procenu odgovora kod čvrstih tumora (RECIST) 1.1 standarda. Generalno, preživljavanje bez progresije označava situaciju u kojoj pacijent ostaje živ, bez da se kancer pogoršava.

[0041] Termin "RECIST" znači kriterijumi za procenu odgovora kod čvrstih tumora. RECIST smernice, kriterijumi, ili standardi, opisuju standardni pristup merenju čvrstog tumora i definicije za objektivnu procenu promene veličine tumora za upotrebu u kliničkim ispitivanjima kancera kod odraslih i dece. RECIST v1.1 znači verziju 1.1 revidirane RECIST smernice i ona je publikovana u European Journal of Cancers 45 (2009) 228-247.

[0042] Termin "repetelo" označava protein koji je poreklom iz leucinom-bogatog ponavljajućeg modula i koji je projektovan tako da se vezuje za specifični cilj (videti Lee et al., 2012. PNAS.109(9): 3299-3304).

[0043] Termin "odgovara povoljno" generalno označava uzrokovanje blagotvornog stanja kod subjekta. Što se tiče lečenja kancera, termin označava obezbeđivanje terapijskog efekta subjektu. Pozitivni terapijski efekti kod kancera mogu se izmeriti na više načina (videti, Weber, 2009. J Nucl Med.50 Suppl 1:1S-10S). Na primer, inhibicija rasta tumora, ekspresija molekulskih markera, ekspresija serumskih markera, i tehnike molekulskog snimanja mogu se upotrebljavati za procenu terapijske efikasnosti antikancerskog terapeutika. Što se tiče inhibicije rasta tumora, u skladu sa NCI standardima, T/C ≤42% je minimalni nivo antitumorske aktivnosti. T/C <10% se smatra visokim nivoom antitumorske aktivnosti, sa T/C (%) = medijana zapremine tumora lečenog / medijana zapremine tumora kontrole × 100. Povoljan odgovor se može proceniti, na primer, povećanim preživljavanjem bez progresije (PFS), preživljavanjem bez bolesti (DFS), ili sveukupnim preživljavanjem (OS), potpunim odgovorom (CR), delimičnim odgovorom (PR) ili, u nekim slučajevima, stabilnom bolešću (SD), smanjenjem progresivne bolesti (PD), skraćenim vremenom do progresije (TTP) ili bilo kojom njihovom kombinacijom.

[0044] Termin "identičnost sekvence" označava procentualnu vrednost dobijenu kada se dve sekvence uporede upotrebom alata za poravnanje sekvenci u paru. U predmetnom slučaju, identičnost sekvence se dobija upotrebom alata za globalno poravnanje "EMBOSS Needle" upotrebom podrazumevanih podešavanja (Rice et al., 2000. Trends Genet. 16(6):276-7; Li et al., 2015. Nucleic Acids Res. 43(W1):W580-4). Alat za globalno poravnanje dostupan je na: https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/.

[0045] Termin "jednolančani antigen-vezujući fragment" ili "scFab" označava fuzioni protein koji sadrži jedan varijabilni i jedan konstantni domen lakog lanca antitela prikačen za jedan varijabilni i jedan konstantni domen teškog lanca antitela, pri čemu su teški i laki lanci povezani preko kratkog peptida.

[0046] Termin "jednolančani varijabilni fragment" ili "scFv" označava fuzioni protein koji sadrži varijabilne domene teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL) antitela koji su međusobno povezani peptidnim linkerom. Termin takođe uključuje disulfidom stabilizovan Fv (dsFv). Postupci stabilizovanja scFv sa disulfidnim vezama objavljeni su u Reiter et al., 1996. Nat Biotechnol. 14(10):1239-45.

[0047] "Stabilna bolest" označava bolest bez progresije ili relapsa kao što je definisano u RECIST v1.1 smernici. Kod stabilne bolesti ne postoji ni dovoljno smanjenje tumora da bi se kvalifikovala za delimičan odgovor, niti dovoljno povećanje tumora da bi se kvalifikovala kao progresivna bolest.

[0048] "Vreme do progresije tumora" (TTP) definiše se kao vreme od početka praćenja do progresije bolesti. TTP se generalno meri upotrebom RECIST v1.1 kriterijuma.

[0049] Termini "lečenje" i "terapija", kao što se upotrebljavaju u predmetnoj prijavi, označavaju skup higijenskih, farmakoloških, operativnih i/ili fizičkih sredstava koja se upotrebljavaju sa namerom da se izleči i/ili ublaži bolest i/ili simptomi sa ciljem saniranja zdravstvenog problema. Termini "lečenje" i "terapija" uključuju preventivne i kurativne postupke, pošto su oba usmerena na održavanje i/ili ponovno uspostavljanje zdravlja pojedinca ili životinje. Bez obzira na poreklo simptoma, bolesti i invaliditeta, primenu pogodnog medikamenta za ublažavanje i/ili lečenje zdravstvenog problema treba tumačiti kao oblik lečenja ili terapije unutar konteksta ove prijave.

Opis

[0050] Uspešno smo razvili CART ćelije usmerene prema BCMA sa 4-1BB kao kostimulatornim domenom (ARI2m ćelije) koje će se primenjivati u fazi I multicentričnog kliničkog ispitivanja za lečenje pacijenata sa MM koji su imali relaps ili postali refraktorni (R/R) na najmanje dve linije lečenja uključujući inhibitore proteazoma, imunomodulatorne agense i anti-CD38 monoklonsko antitelo. Naše ARI2m ćelije su humanizovane u ARI2h demonstrirajući da je anti-MM aktivnost zadržana u humanizovanoj verziji i štaviše, uočen je niži profil citotoksičnosti za ARI2h ćelije.

[0051] BCMA se pojavio kao obećavajući antigen za lečenje MM sa CART ćelijama 2013. godine (Carpenter RO, Evbuomwan MO, Pittaluga S, et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clin Cancer Res.

2013;19(8):2048-2060), što je dovelo 2016. godine do prve kliničke studije kod pacijenata sa MM koji su primali CART BCMA ćelije sa CD28 kao kostimulatornim domenom (Ali SA, Shi V, Maric I, et al. T cells expressing an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of multiple myeloma. Blood. 2016;128(13):1688-1700). Iako su ove CART ćelije demonstrirale efikasnost, pokazale su visok profil citotoksičnosti, pošto su svi pacijenti lečeni sa aktivnim dozama razvili teški CRS. Prema tome, CD28 je zamenjen sa 4-1BB, i novi CAR, nazvan bb2121, demonstrirao je toksičnost kojom se može upravljati i da je potrebna minimalna doza od 150×10<6>CART ćelija za dobijanje odgovora (Raje N, Berdeja J, Lin Y, et al. Anti-BCMA CAR T-Cell Therapy bb2121 in Relapsed or Refractory Multiple Myeloma. N Engl J Med. 2019;380(18):1726-1737). Paralelno, dve dodatne studije kod pacijenata sa MM (Cohen AD, Garfall AL, Stadtmauer EA, et al. B cell maturation antigenspecific CAR T cells are clinically active in multiple myeloma. J Clin Invest. 2019;130; i Zhao WH, Liu J, Wang BY, et al. A phase 1, open-label study of LCAR-B38M, a chimeric antigen receptor T cell therapy directed against B cell maturation antigen, in patients with relapsed or refractory multiple myeloma. J Hematol Oncol. 2018; 11(1):141), demonstrirale su da je manji broj prethodnih lečenja doveo do boljih odgovora, i da iako limfodeplecija nije apsolutno potrebna za in vivo umnožavanje i aktivnost CAR T ćelija, kratkoročno umnožavanje je konzistentnije posle limfodeplecije. Različiti faktori utiču na umnožavanje i postojanost CART koje će poboljšati dugoročnu kontrolu bolesti, faktor koji treba poboljšati sa CARTBCMA terapijom, pošto su studije pokazale da većina pacijenata sa MM završi sa relapsom, nalaz nije uočen kod SVIH pacijenata koji su lečeni sa CART19. S tim u vezi, postojanost CART ćelija bi se mogla poboljšati upotrebom humanih ili humanizovanih CAR, pošto murinske komponente scFv CAR iniciraju imunološku reakciju od strane humanog imunskog sistema što dovodi do ranog nestanka CART ćelija. Na osnovu ovih prethodnih studija, i podržano našim rezultatima koji pokazuju da se i sa ARI2m i sa ARI2h podjednako izbegava progresija bolesti, odabrali smo ARI2h ćelije, koje su bile humanizovane CARTBCMA ćelije sa 4-1BB kostimulatornim domenom.

[0052] Drugi faktori koji utiču na postojanost CART ćelija uključuju profil iscrpljivanja CART ćelija, i CD4/CD8 odnos u proizvodu leukafereze, koji je u CARTBCMA ćelijama bio u korelaciji sa in vivo umnožavanjem CART. U predmetnom pronalasku, bez obzira na inicijalni CD4/CD8 odnos, sva in vitro umnožavanja postigla su CD4/CD8>1 koji se posle izlaganja tumorskim ćelijama normalizovao na približno jednake količine CD4 i CD8 usled preferencijalne proliferacije CD8 T ćelija. Štaviše, uzastopno izlaganje tumorskim ćelijama demonstriralo je da ARI2h ćelije postižu veću proliferaciju u poređenju sa ARI2m, što sugeriše manje iscrpljivanje ARI2h ćelija. S tim u vezi, studije sa CART19 sa CD28 i 4-1BB kostimulatornim domenima demonstrirale su da snažna aktivacija CART ćelija usled visokog afiniteta ili visoke ekspresije ciljnog antigena dovodi do fenotipa efektorske T ćelije sa povećanim iscrpljivanjem; nasuprot tome, slabija aktivacija usled nižeg afiniteta dovodi do fenotipa memorijske T ćelije koji redukuje iscrpljivanje. Ovde, postupak humanizacije uključivao je promenu u amino-kiselinskoj sekvenci koja je mogla da smanji afinitet CART u ARI2h ćelijama objašnjavajući njihovu sporiju in vitro aktivnost u testovima posle jednog izazova, i nasuprot tome, trajnu i veću proliferaciju CART ćelija posle uzastopnih izazivanja tumorskim ćelijama, i dužu in vivo kontrolu bolesti u modelu veoma uznapredovalog tumora.

[0053] Visoka incidenca CRS i neurotoksičnost uobičajeni su događaji koji se javljaju posle primene CART ćelija, iako se njima efikasno upravlja prateći međunarodne smernice, idealno CART lečenje treba da pokuša da minimalizuje razvoj CRS. Ovde, upotreba ARI2h ćelija umesto ARI2m dodatno je podržana uočavanjem nižeg in vivo profila toksičnosti i niže in vitro proizvodnje TNFα od strane ARI2h u poređenju sa ARI2m ćelijama. Dok je IL6 efektorski citokin za CRS koji proizvode monociti i makrofagi koji se eksponencijalno povećava kako se razvija CRS, drugi citokini kao što su TNFα i IL1β su glavni inicijatori CRS, pošto ih monociti i makrofagi proizvode u ranim vremenskim tačkama nakon što se aktiviraju od strane IFNγ koji proizvode CART ćelije. U stvari, TNFα deluje kao inicijator citokina koji orkestrira kaskadu citokina u mnogim inflamatornim bolestima koji se pojavljuju kao terapijski cilj za različite inflamatorne bolesti. Ovde, naš in vitro model sa makrofagima koji oponaša model sličniji in vivo scenariju, demonstrira da su ARI2h ćelije dovele do niže proizvodnje TNFα od strane makrofaga, što je relevantan nalaz, pošto je CRS kod pacijenata sa MM posle CARTBCMA povezan sa višim pikom TNFα.

[0054] Na kraju, u ovoj studiji je pažljivo analiziran uticaj sBCMA na aktivnost CART potvrđujući da sBCMA zaokuplja CART ćelije od njihovih ciljeva i štaviše, može uzrokovati bratoubistvo između CARTBCMA ćelija. Iako pretkliničke i kliničke studije sa CARTBCMA kod MM nisu pronašle nikakvu korelaciju između sBCMA i aktivnosti CART, uočili smo da visoka in vitro aktivnost CART koja brzo eliminiše ćelije MM ometa pravilnu analizu uloge sBCMA u pretkliničkim studijama. Štaviše, visoka doza CARTBCMA ćelija potrebna kod MM u poređenju sa CART19 kod SVIH pacijenata kako bi izazvale odgovore navela nas je da pretpostavimo da bi sBCMA mogao biti odgovoran za ovu potrebnu visoku dozu CART. Prema tome, naši in vitro modeli izvedeni pri niskom CARTBCMA:MM odnosu, uz stvaranje okruženja sa kontinuiranim oslobađanjem sBCMA, i dodatkom inhibitora γ-sekretaze, potvrdili su negativan uticaj sBCMA na aktivnost CARTBCMA.

[0055] U zaključku, ovde predstavljamo CART BCMA (pri čemu CAR odgovara ARI2h SEQ ID NO 13) sa 4-1BB kao kostimulatornim domenom koji je humanizovan i zadržava visoku efikasnost i demonstrira niži profil toksičnosti od svog murinskog parnjaka (ARI2m). Ovaj CAR (ARI2h) se efikasno umnožava pod GMP uslovima za njegovu upotrebu u kliničkom ispitivanju. Prema tome, glavni cilj predmetnog pronalaska je da zaštiti himerni antigenski receptor ARI2h kao i njegove varijante kao što je opisano u opisu u nastavku.

Himerni antigenski receptor iz ARI2h i njegove varijante.

[0056] Predmet pronalaska je definisan priloženim patentnim zahtevima. Dopunski aspekti objave obezbeđeni su samo kao ilustracija. U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR) iz ARI2h ili njegove varijante, koji sadrži vanćelijski domen koji sadrži BCMA-ciljno delujuću funkcionalnu grupu, transmembranski domen, i unutarćelijski signalni domen. Takvi domeni su detaljno opisani u nastavku.

BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa

[0057] U nekim aspektima, BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa je antitelo, antikalin, repetelo, monotelo, scFv, Fab, scFab, afitelo, finomer, DARPin, nanotelo, ili peptidni aptamer koji se specifično vezuje za BCMA.

[0058] Vezujući molekuli koji se specifično vezuju za BCMA mogu biti veoma korisni u dijagnozi i lečenju MM. Nekoliko murinskih monoklonskih antitela prema BCMA poznato je u ovoj oblasti. Međutim, murinska antitela su ograničena za in vivo upotrebu usled problema koji su povezani sa primenom murinskih antitela na ljude, kao što je kratak poluživot u serumu, nemogućnost da se aktiviraju određene humane efektorske funkcije i stvaranje neželjenog imunskog odgovora prema murinskom antitelu. Razvijena su nova humana antitela koja prevazilaze ove prethodno pomenute nedostatke.

[0059] Prikazivanje faga i kombinatorni postupci za generisanje antitela su poznati u struci (kao što je opisano u, npr. Ladner et al. S.A.D. patentu br. 5,223,409; Kang et al.

Međunarodna publikacija br. WO 92/18619; Dower et al. Međunarodna publikacija br. WO 91/17271, Winter et al. Međunarodna publikacija WO 92/20791, Markland et al. Međunarodna publikacija br. WO 92/15679, Breitling et al. Međunarodna publikacija WO 93/01288, McCafferty et al. Međunarodna publikacija br. WO 92/01047; Garrard et al. Međunarodna publikacija br. WO 92/09690; Ladner et al. Međunarodna publikacija br. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; i Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982).

[0060] Dodatno, postupci generisanja i selekcije ne-imunoglobulinskih skela koje se vezuju za određeni cilj poznati su u struci (videti, na primer, Skrlec, et al., 2015. Trends Biotechnol.

33(7):408-18).

[0061] U nekim aspektima, BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa, poželjno antitelo, scFv, Fab, ili scFab, sadrži VH domen, pri čemu navedeni VH domen sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 1:

ili njene varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 1.

[0062] U nekim aspektima, BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa, poželjno antitelo, scFv, Fab, ili scFab, sadrži prethodno pomenuti VH domen i dodatno sadrži VL domen, pri čemu navedeni VL domen sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 2:

ili njene varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 2.

[0063] U nekim aspektima, BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa, poželjno antitelo, scFv, Fab, ili scFab, sadrži VL domen i VH domen, pri čemu navedni VL i VH domen sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 1 i 2 ili varijante bilo koje od ovih sekvenci kao što je prethodno definisano. Poželjno navedena sekvenca VL i VH domena sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 3:

ili njene varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 3.

[0064] Ovde je napomenuto da prethodno pomenuti VL i VH domen SEQ ID NO 3 sadrži linker sekvencu, posebno SEQ ID NO 4: GGGGSGGGGSGGGGS. Međutim, mogu se upotrebljavati i druge linker sekvence.

[0065] Dodatno se napominje da VL i VH domen, posebno SEQ ID NO 3, može dodatno da sadrži peptidni signal, pri čemu poželjno navedeni signalni peptid sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 5: MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG ili njene varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 5.

[0066] U nekim aspektima, BCMA-ciljno delujuća funkcionalna grupa, poželjno antitelo, scFv, Fab, ili scFab, sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 6:

ili njene varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 6.

Transmembranski domen

[0067] Transmembranski domen može biti poreklom bilo iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Kada je izvor prirodan, domen može biti poreklom iz bilo kog proteina koji je vezan za membranu ili transmembranskog proteina. Transmembranski regioni mogu sadržati najmanje transmembranski(e) region(e) α-, β- ili ζ- lanca CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ili CD154. Poželjno, transmembranski regioni sadrže najmanje transmembranski(e) region(e) CD8a.

[0068] Transmembranski domen može biti sintetički ili varijanta transmembranskog domena koji se javlja u prirodi. U nekim aspektima, sintetički ili varijantni transmembranski domeni sadrže pretežno hidrofobne ostatke kao što su leucin i valin.

[0069] U nekim aspektima, transmembranski domen sadrži transmembranski domen CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ili njihove varijante, pri čemu njihova varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno, navedeni transmembranski domen sadrži ili se sastoji od najmanje transmembranskog domena CD8a.

[0070] U nekim aspektima, transmembranski domen sadrži ili se sastoji od transmembranskog domena CD8a ili njegove varijante, pri čemu njegova varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence.

[0071] Posebno, u nekim aspektima, transmembranski domen sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 7 ili njene varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 7.

[0072] U nekim aspektima, domen koji je poreklom iz CD8a je vezan direktno za CD8 zglob, poželjno za SEQ ID NO 8:

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

ili njenu varijantu koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 8.

[0073] Prema tome, u nekim dodatnim aspektima, transmembranski domen dodatno sadrži CD8 zglob i sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 9

ili njene varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 9.

Unutarćelijski signalni domen

[0074] Unutarćelijski signalni domen obezbeđuje aktivaciju najmanje jedne funkcije ćelije koja eksprimira CAR nakon vezivanja za ligand koji se eksprimira na tumorskim ćelijama. U nekim primerima izvođenja, unutarćelijski signalni domen sadrži jedan ili više unutarćelijskih signalnih domena. U nekim primerima izvođenja, unutarćelijski signalni domen je deo i/ili varijanta unutarćelijskog signalnog domena koji obezbeđuje aktivaciju najmanje jedne funkcije ćelije koja sadrži CAR.

[0075] U nekim aspektima, unutarćelijski signalni domen sadrži ili se sastoji od unutarćelijskog domena CD3ζ, FcRγ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66b, ili njihove varijante, pri čemu njihova varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence.

[0076] U nekim aspektima, unutarćelijski signalni domen sadrži ili se sastoji od unutarćelijskog domena CD3ζ ili njegove varijante, pri čemu njegova varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence.

[0077] U nekim aspektima, unutarćelijski signalni domen sadrži SEQ ID NO: 10, ili njegovu varijantu koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 10. Napominje se da je SEQ ID NO: 10 predstavljena sledećom sekvencom:

Kostimulatorni signalni domen

[0078] Napominje se da CAR iz objave, ARI2h CAR ili njegove varijante, moraju dodatno da sadrže kostimulatorni signalni domen. U nekim aspektima, kostimulatorni signalni domen sadrži unutarćelijski domen 4-1BB ili njegovu varijantu, pri čemu njegova varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence.

[0079] U nekim aspektima, kostimulatorni signalni domen sadrži ili se sastoji od unutarćelijskog domena 4-1BB ili njegove varijante, pri čemu njegova varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence.

[0080] U nekim aspektima, kostimulatorni signalni domen sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 11 ili od njegove varijante koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 11. Napominje se da je kostimulatorni signalni domen poreklom iz 4-1BB ovde predstavljen pomoću SEQ ID NO: 11:

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL.

CAR pune sekvence u skladu sa predmetnim pronalaskom

[0081] Napominje se da puna amino-kiselinska sekvenca ARI2h CAR u skladu sa predmetnim pronalaskom sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 13:

pri čemu se signalni peptid sastoji od SEQ ID NO 5;

pri čemu se VH domen sastoji od SEQ ID NO 1;

pri čemu se linker sekvenca sastoji od SEQ ID NO 4;

pri čemu se VL domen sastoji od SEQ ID NO 2;

pri čemu se CD8 zglob sastoji od SEQ ID NO 8;

pri čemu se transmembranski domen sastoji od SEQ ID NO 7;

pri čemu se 4-1BB domen sastoji od SEQ ID NO 11; i

pri čemu se CD3z domen sastoji od SEQ ID NO 10.

[0082] U nekim aspektima, CAR se može okarakterisati time što sadrži:

(i) BCMA-ciljno delujuću funkcionalnu grupu, poželjno antitelo, scFv, Fab, ili scFab, koja sadrži ili se sastoji od VL domena i VH domena, pri čemu navedeni VH i VL domeni respektivno sadrže ili se sastoje od SEQ ID NO 1 i 2 ili bilo koje njihove varijante, pri čemu njihove varijante imaju najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO 1 i/ili 2;

(ii) transmembranski domen vezan za domen zgloba koji sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 9 ili njene varijante, pri čemu njena varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 9;

(iii) kostimulatorni signalni domen koji sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 11 ili njene varijante, pri čemu njena varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 11; i

(iv) unutarćelijski signalni domen koji sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 10 ili njene varijante, pri čemu njena varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 10.

[0083] U nekim aspektima, CAR sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 13

ili njene varijante, pri čemu njena varijanta ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO 13.

Nukleinska kiselina

[0084] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koji od CAR iz predmetnog pronalaska. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni receptor povezuje niz modularnih komponenti koje se mogu izrezati i zameniti drugim komponentama kako bi se prilagodio himerni receptor za efikasnu aktivaciju T ćelija i prepoznavanje BCMA.

[0085] U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je pogodna za transdukciju ili transformaciju ćelije. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je pogodna za transdukciju ili transformaciju T ćelije za upotrebu u adoptivnoj imunoterapiji.

[0086] U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je kodon optimizovana za ekspresiju u ćelijama sisara. Postupci kodon optimizacije su poznati u struci (videti, na primer, Parret et al., 2016. Curr Opin Struct Biol.39: 155-162).

[0087] Nukleinska kiselina iz predmetnog pronalaska može biti sadržana u lentivirusnom vektoru koji se može upotrebljavati za transdukciju ili transformaciju T ćelije (videti Rivière & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5):1117-1124). Trenutno je transdukcija T ćelija sa lentivirusnim vektorima tehnika koja se više upotrebljava kod ljudi. Nukleinska kiselina se takođe može insertovati u ćeliju upotrebom DNK transpozona, transfekcije RNK ili tehnika za editovanje genoma kao što su TALEN, ZFN i CRISPR/Cas9 (videti Rivière & Sadelain, 2017. Mol Ther.25(5):1117- 1124).

[0088] Poželjno, puna nukleotidna sekvenca CARS u skladu sa predmetnim pronalaskom sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 12:

Ćelije

[0089] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu iz predmetnog pronalaska i/ili CAR iz predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, ćelija je T-ćelija (koja se označava kao CART).

[0090] U nekim primerima izvođenja, ćelija je naivna T ćelija, memorijska matična T ćelija ili centralna memorijska T ćelija. Trenutno se smatra da su ove ćelije pogodnije za adoptivnu imunoterapiju (videti Rivière & Sadelain, 2017. Mol Ther.25(5):1117-1124).

[0091] U nekim primerima izvođenja, ćelija je autologna T ćelija. Termin "autologna ćelija" označava ćeliju dobijenu od istog pacijenta koji treba da se leči upotrebom bilo kog od postupaka iz predmetnog pronalaska.

[0092] U nekim primerima izvođenja, ćelija je alo-tolerantna T ćelija. Termin "alo-tolerantna ćelija" označava ćeliju koja je projektovana tako da smanji rizik od odgovora kalem protiv domaćina bolesti. U nekim primerima izvođenja, ovo se postiže genomskim editovanjemposredovanom delecijom TCR i/ili β2-mikroglobulina15,19. Alo-tolerantne ćelije su poznate u struci (videti odeljak o alogenim T ćelijama u Rivière & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5): 1117-1124).

[0093] U nekim primerima izvođenja, ćelija je limfoidni prekursor, embrionalna matična ćelija ili indukovana pluripotentna matična ćelija sa sposobnošću da se diferencira u zrelu T ćeliju (videti Rivière & Sadelain, 2017. Mol Ther. 25(5): 1117-1124) .

Farmaceutska kompozicija

[0094] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži mnoštvo ćelija iz predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

[0095] Farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisana može takođe da sadrži druge supstance. Ove supstance uključuju, ali nisu ograničene na, krioprotektante, surfaktante, antioksidanse, i agense za stabilizovanje. Termin "krioprotektant" kao što se ovde upotrebljava, uključuje agense, koji obezbeđuju stabilnost CART protiv zamrzavanjemindukovanih stresova. Neograničavajući primeri krioprotektanata uključuju šećere, kao što su saharoza, glukoza, trehaloza, manitol, manoza, i laktoza; polimere, kao što su dekstran, hidroksietil skrob i polietilen glikol; surfaktante, kao što su polisorbati (npr. PS-20 ili PS-80); i amino-kiseline, kao što su glicin, arginin, leucin, i serin. Uobičajeno se upotrebljava krioprotektant koji pokazuje nisku toksičnost u biološkim sistemima.

[0096] U nekim primerima izvođenja, ćelije se formulišu tako što se prvo sakupe iz njihovog medijuma za kulturu, i zatim se ćelije isperu i koncentruju u sistemu medijuma i kontejnera pogodnom za primenu ("farmaceutski prihvatljiv" nosač) u terapijski efikasnoj količini. Pogodan infuzioni medijum može biti bilo koja formulacija izotoničnog medijuma, tipično normalni fiziološki rastvor, Normosol R (Abbott) ili Plasma-Lyte A (Baxter), ali se takođe može koristiti 5% dekstroza u vodi ili Ringerov (Ringerꞌs) laktat. Infuzioni medijum može biti suplementovan sa albuminom iz humanog seruma, fetalnim goveđim serumom ili drugim komponentama humanog seruma.

[0097] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju u skladu sa predmetnim pronalaskom ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu kao medikament.

Postupci lečenja

[0098] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja multiplog mijeloma koji sadrži primenu ćelije iz predmetnog pronalaska ili farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska pacijentu kome je to potrebno.

[0099] U nekim primerima izvođenja, pacijentu se primenjuje terapijski efikasna količina ćelija. U nekim primerima izvođenja, pacijentu se primenjuje 10<2>, 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>ili 10<10>ćelija. Broj ćelija zavisiće od krajnje upotrebe za koju je kompozicija namenjena, kao i od tipa ćelija koje su u njoj uključene.

[0100] U nekim primerima izvođenja, ćelija ili farmaceutska kompozicija primenjuje se intravenski, intraperitonealno, u kostnu srž, u limfni čvor, i/ili u cerebrospinalnu tečnost.

[0101] U nekim primerima izvođenja, postupak sadrži kombinovanu terapiju. U nekim primerima izvođenja, postupak sadrži dodatnu primenu inhibitora imunske kontrolne tačke (videti Lim & June, 2017. Cell. 168(4):724-740). U dodatnom primeru izvođenja, postupak sadrži dodatnu primenu inhibitora imunske kontrolne tačke i/ili inhibitora IAP (videti WO 2016/054555).

[0102] U nekim primerima izvođenja, ćelija ili farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisano primenjuje se u kombinaciji sa hemioterapijskim agensima i/ili imunosupresivima. U jednom primeru izvođenja, pacijent se prvo leči hemioterapijskim agensom koji inhibira ili uništava druge imunske ćelije, i zatim ćelijom ili farmaceutskom kompozicijom koja je ovde opisana. U nekim slučajevima, hemioterapija se može u potpunosti izbeći.

[0103] Sledeći primeri služe da ilustruju predmetni pronalazak ali ga ne ograničavaju.

Primeri

Materijal i postupci

[0104] Etička izjava: istraživanje koje uključuje humane materijale odobrio je Etički komitet za klinička istraživanja (Bolnička klinika, Barselona). T ćelije periferne krvi (PB) dobijene su od zdravih donora koji su dali informisani pristanak. Sav rad na životinjama je obavljen pod Etičkim komitetom za istraživanja na životinjama (Bolnička klinika, Barselona).

[0105] Ćelijske kulture: RPMI8226, U266 i K562 kupljene su od Američke kolekcije kulture tkiva (ATCC, Manassas, VA). ARP1 ćelijsku liniju je ljubazno obezbedio Centar za istraživanje multilog mijeloma (Little Rock, AK, SAD). Ćelijske linije (K562, RPMI8226 i ARP1) su kultivisane u RPMI sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS) i 1% penicilinom/streptomicinom (Pen/Strep) i U266 sa 15% FBS. 293-T ćelije su kultivisane sa DMEM sa 10% FBS i 1% Pen/Strep. Limfociti su dobijeni od zdravih donora pomoću Ficoll i magnetne deplecije sa kompletom za izolaciju T ćelija (Miltenyi Biotec). T ćelije su umnožene u Klikovom (Clickꞌs) medijumu (50% RPMI, 50% Klikovi medijumi od Irvine Scientific i suplementovano sa 5% humanim serumom i 1% Pen/strep) i aktivirane sa Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific) i IL-2 (100 IU) svaki drugi dan. Eksperimenti su izvedeni posle 8-10 dana umnožavanja T ćelija. Makrofagi su diferencirani od monocita posle umnožavanja sa RPMI 10% FBS i 0,1 mg/ml M-CSF (Thermo Fisher Scientific) tokom 1 nedelje.

[0106] Kloniranje i humanizacija: ARI2m transmembranski domen, kostimulatorni domen (4-1BB) i CD3ζ dobijeni su iz lentivirusnog vektora koji je sadržao CART19 koji se upotrebljava u našoj ustanovi (pCCL-EF1 α-CD19-CD8a-41 BB-CD3ζ). ScFv-CD19 je supstituisan za scFv BCMA koji je dobijen iz anti-BCMA antitela J22.9, koje su prethodno objavili Oden F. et al i koje je bilo dostupno besplatno u NCBI-Protein Genbank. Puna amino-kiselinska sekvenca koja odgovara signalnom peptidu, VH, linkeru, VL, CD8 zglobu, CD8 TM, 4-1BB i CD3ζ koja odgovara murinskom ARI2m pokazana je ovde u nastavku:

MURINSKA (ARI2m) (SEQ ID NO 14):

Signalni peptid (SEQ ID NO 5):

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG

VH (SEQ ID NO 15):

Linker (SEQ ID NO 4):

GGGGSGGGGSGGGGS

VL (SEQ ID NO 16):

CD8 zglob (SEQ ID NO 8):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

CD8 TM (SEQ ID NO 7):

YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

4-1BB (SEQ ID NO 11):

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

CD3ζ (SEQ ID NO 10):

[0107] Da bi se dobile ARI2h, scFv ARI2m sekvence je humanizovan upotrebom dva prediktivna modela (Blast i Germline) kako bi se supstituisale murinske amino-kiseline za njihove homologe kod ljudi, isključujući i region koji određuje komplementarnost (CDR) i Vernije (Vernier) zonu. Kada je sekvenca bila spremna, klonirana je u pCCL vektor upotrebom iste procedure kao za ARI2m. Humanizovana sekvenca kao i razlike u aminokiselinskoj sekvenci između ARI2h i ARI2m pokazane su ovde u nastavku:

HUMANIZOVANA (ARI2h (Germline varijanta) koja odgovara SEQ ID NO 13):

Linker (SEQ ID NO 4):

GGGGSGGGGSGGGGS

VL (SEQ ID NO 2):

CD8 zglob (SEQ ID NO 8):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

CD8 TM (SEQ ID NO 7):

YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

4-1BB (SEQ ID NO 11):

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

CD3ζ (SEQ ID NO 10):

Razlike u amino-kiselinama napravljene tokom postupka humanizacije (poređenje između ARI2m i ARI2h):

masna slova: CDR

kurziv: Vernije zona

podvučeno: promenjene AA

VH:

Murinska (ARI2m):

Humanizovana (ARI2h):

VL:

Murinska (ARI2m):

Humanizovana (ARI2h):

[0108] Proizvodnja virusa i ekspresija CAR: 293-T ćelije su transfektovane sa lentivirusnim vektorima (pCCL-EF1α-BCMA, pREV-REV, pMDLg/pRRE i pCMV-VSV-G) kako bi se proizveo lentivirusni virus i posle 48 sati supernatant je sakupljen i koncentrovan sa LentiX-Concentrator (Clontech, Takara) prema protokolu proizvođača. Koncentrovani lentivirus je držan na -80 °C do upotrebe. T ćelije zdravih donora su aktivirane na dan 0 sa Dynabeads i transdukovane sa koncentrovanim lentivirusom na dan 2 dodavanjem Polybrene (Merck Millipore) i centrifugirane na 2000 o/min tokom 1 sata.

[0109] Protočna citometrija: Za detekciju CAR-BCMA, ćelije su inkubirane sa rekombinantnim BCMA-Fc proteinom (Enzo Life Sciences) i zatim sa sekundarnim antitelom antihumano IgG FC konjugovano za Brilliant Violet (BV)-421 (Biolegend). Antitela koja su upotrebljena za bojenje T ćelija i iscrpljivanje su CD3-APC i CD8-PE (Becton Dickinson), PD1-APC, TIM3-APC i LAG3-APC (Thermo Fisher Scientific). Ćelije multiplog mijeloma su obojene sa CD138-BV421 (Becton Dickinson) i BCMA-APC (Biolegend). Analiza protočnom citometrijom za sve eksperimente izvršena je upotrebom FlowJo softvera.

[0110] Testovi proliferacije: CAR-T ćelije su obojene sa CellTrace<™>CFSE kompletom za proliferaciju ćelija (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) pre nego što su kokultivisane u različitim uslovima i ćelijskim linijama tokom 96 sati. Proliferacija je analizirana pomoću protočne citometrije.

[0111] Proizvodnja citokina i sBCMA: IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-1β citokini su kvantifikovani pomoću ELISA (ELISA MAXTM Deluxe Set, Biolegend) prema protokolu proizvođača. Solubilni BCMA detektovan je pomoću ELISA (Human BCMA/TNFRSF17 DuoSet ELISA, R&D systems) prema protokolu proizvođača.

[0112] Konfokalna mikroskopija: RPMI ćelijska linija je transdukovana sa lentivirusnim česticama kako bi se prekomerno eksprimirao BCMA fuzionisan za zeleni fluorescentni protein (GFP), i zatim kokultivisana sa CART ćelijama obojenim sa CellTrackerTM Blue CMAC bojom (Thermo Fisher Scientific). Štaviše, BCMA je takođe detektovan pomoću konfokalne fluorescentne mikroskopije sa monoklonskim anti-TNFRSF17 mišjim antitelom (Sigma-Aldrich) i sekundarnim antimišjim IgG Alexa 647 (Cell signaling Technologies). Snimci su dobijeni upotrebom Leica SP5 mikroskopa. Upotrebljeni su laseri 405, 488 i 633 za ekscitaciju, uz pravljenje Z-stack akvizicionih snimaka i primenu odgovarajućih filtera. Za in vivo snimke sa vremenskim odmakom akvizicije su izvedene svakih 20 sekundi.

[0113] Citotoksičnost: testovi su izvedeni u različitim efektor:cilj odnosima od 1:1 do 0,125:1 od 24 do 96 h kokultivisanja T ćelija i tumorskih ćelija modifikovanih lentivirusnim vektorom (pLV) za prekomernu ekspresiju GFP-luciferaze svica (GFP-ffLuc). Procenat preostalih živih GFP+ tumorskih ćelija je proučavan pomoću protočne citometrije primenom formule: % živih ćelija=% GFP+ ćelija u vreme x/% GFP+ ćelija u 0 h.

[0114] In vivo model murinskog mijeloma: 8-12 nedelja stari NOD/SCID IL-2Rcnull (NSG) miševi ozračeni su pri 2G na dan -1 i na dan 0 miševi su inokulisani sa GFP-ffLuc-ARP-1 ćelijama. Miševi su primili bilo 1 ili 1,5×106 ARP1 ćelija/mišu u zavisnosti od toga da li su ženke ili mužjaci miša, respektivno. Tumorskim ćelijama je omogućeno da proliferišu tokom 6 do 14 dana, i zatim su u miševe inokulisane bilo NT T ćelije ili CART ćelije. Miševi su podvrgnuti nedeljnom bioluminescentnom snimanju (BLI). BLI je izvedeno upotrebom Hamamatsu CDD kamere u boji (Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ) nakon IP injekcije 100 µl D-luciferina (20 mg/ml PBS). Kvantifikacija signala je izvedena pomoću ImageJ softvera.

Rezultati

Dizajn i funkcionalna karakterizacija murinskih CARTBCMA (ARI2m)

[0115] Dizajn ARI2m zasnovan je na našim CART19 (ARI1) koje sadrže CD8a, 4-1BB i CD3ζ kao zglob, transmembranski domen, kostimulatorni domen i signalni domen, respektivno. Jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji kodira za anti-CD19 (A3B1 antitelo) zamenjen je za sekvencu anti-BCMA antitela J22.9 21, koja je uspešno testirana prema MM 22. Ova cela sekvenca je klonirana u 3. generaciju pCCL lentivirusnog vektora (Slika 1A). Efikasnost transfekcije CART ćelija bila je veća od 30% i varirala je između 30-60% u svim našim in vitro i in vivo eksperimentima, koja je očuvana posle krioprezervacije i odmrzavanja CART ćelija (Slika 1B). Efikasnost ARI2 prema različitim ćelijskim linijama MM (ARP1 i U266) potvrđena je posle kokultivisanja T ćelija i ćelija MM u E:T odnosu 1:1 tokom četiri dana, što je demonstriralo efikasnu eliminaciju ćelija MM u poređenju sa netransdukovanim T ćelijama (Slika 1C). Štaviše, K562 ne-MM ćelije, koje ne eksprimiraju BCMA, nisu eliminisane od strane ARI2m ćelija demonstrirajući specifičnost ARI2m ćelija (Slika 1C). Pored toga, testovi citotoksičnosti graničnog razblaženja od 1:1 do 0,125:1 E:T odnosa demonstrirali su visoku efikasnost ARI2m ćelija eliminacijom ćelija MM na 36 h (Slika 1D) pri niskom E:T odnosu koji je nastavio da raste na 72 h (Slika 1E). Kao što se očekivalo, nije detektovana toksičnost prema K562 ćelijama (Slike 1D i 1E).

[0116] Proizvodnja proinflamatornih citokina od strane ARI2m ćelija je takođe analizirana na 24 i 48 h kokultivisanja ARI2 ćelija i ćelija MM pri različitim E:T odnosima. Visoka proizvodnja IFNγ uočena je od strane ARI2m ćelija na 24 h, koja je nastavila da raste na 48 h (Slika 1F). Izvesna proizvodnja IFNγ detektovana je za netransdukovane (NT) T ćelije kao što se očekivalo, pošto se NT T ćelije aktiviraju usled in vitro umnožavanja. Minimalni nivoi IL6 su takođe detektovani na 24 h, i povećavaju se na 48 h kokultivisanja. Štaviše, kao što se očekivalo, uočena je izvesna sekrecija IL6 za same ćelije MM (Slika 1F). Proizvodnja TNFα se smanjila na 48 h u poređenju sa 24 h, demonstrirajući da se TNFα proizvodi u ranim vremenima aktivacije CART (Slika 1F). Nažalost, proizvodnja IL1β nije mogla biti detektovana u ovom in vitro sistemu.

[0117] In vivo efikasnost ARI2m ćelija analizirana je u našem murinskom modelu gde su NSG-miševi primili 1×10<6>ARP1 ćelija MM, i tretirani su 6 dana kasnije bilo sa 10×10<6>NT ćelija ili sa 10×10<6>T ćelija koje sadrže 2×10<6>ARI2m ćelija (Slika 1G). Progresija bolesti praćena bioluminescencijom pokazala je da se sa ARI2m ćelijama izbegava progresija bolesti u poređenju sa netretiranim miševima i miševima koji su tretirani sa NT T ćelijama (Slika 1H), što je dovelo do većeg preživljavanja (Slika 1I). Štaviše, analiza tkiva miševa na kraju eksperimenta pokazala je odsustvo ćelija MM u BM i slezini (Slika 1J); i da dok su T ćelije pronađene uglavnom u slezini (Slika 1K), CART ćelije proliferisale su uglavnom u BM, na šta ukazuje veći procenat CART ćelija iz cele populacije T ćelija u BM nego u slezini (Slika 1K), nalaz koji je veoma relevantan pošto je MM bolest BM. Štaviše, kao dodatni marker za progresiju MM, analizirali smo količinu sBCMA u serumu miševa potvrđujući visoku količinu sBCMA kod miševa koji su tretirani sa NT T ćelijama i potpuno odsustvo sBCMA kod miševa koji su tretirani sa ARI2m ćelijama (Slika 1L).

Humanizacija ARI2m u ARI2h i poređenje ARI2m naspram ARI2h

[0118] Rani nestanak CART ćelija kod pacijenata, koji može dovesti do odgovora koji nisu dugotrajni, povezan je sa ksenoprepoznavanjem od strane humanog imunskog sistema prema murinskoj komponenti scFv u CAR. Zbog toga je izvedena scFv humanizacija ARI2m. Dve različite varijante ARI2 (Blast i Germline) kreirane su na osnovu dva različita prediktivna algoritma supstitucijom murinskih amino-kiselina (aa) za aa koje se češće nalaze u humanom kodu. Dok su za teški lanac obe varijante pokazale isti broj supstituisanih aa u poređenju sa murinskom sekvencom, za laki lanac, Germline varijanta je imala manji broj supstituisanih aa od Blast varijante (Slika 2A). In vitro poređenje efikasnosti obe varijante demonstriralo je nešto veću anti-MM aktivnost za Germline varijantu (Slika 2B) i specifičnost prema ćelijama MM za obe varijante, pošto nijedna od njih nije eliminisala K562 ćelije (Slika 2B). Prema tome, Germline varijanta je odabrana za sve dodatne testove kako bi se uporedile ARI2m naspram ARI2h (za pune sekvence oba CAR molimo pogledati materijale i postupke). Pošto je uočena nešto niža in vitro efikasnost ARI2h naspram ARI2m (Slika 2B), izveden je dugotrajni test citotoksičnosti kokultivacijom tumorskih i CART ćelija pri niskom E:T (0,125:1) odnosu. Ovaj test je demonstrirao da iako su ARI2h sporije od ARI2m, one postižu svoj cilj eliminacijom svih ćelija MM (Slika 2C). Štaviše, test proliferacije je potvrdio sporiju stopu proliferacije za ARI2h ćelije. Pored toga, dok je ista proizvodnja IFNγ in vitro uočena za oba CAR u dugotrajnom testu citotoksičnosti (Slika 2C), demonstrirana je niža proizvodnja TNFα i IL6 za ARI2h naspram ARI2m, što sugeriše niži profil toksičnosti za ARI2h.

[0119] ARI2h i ARI2m su upoređene in vivo u dva različita modela bolesti MM (rani i uznapredovali). Miševi su primili ćelije MM na dan 0 i tretirani su sa 5×10<6>CART ćelija bilo na dan 6 ili dan 14 kako bi se stvorio model rane i uznapredovale bolesti, respektivno (Slika 2D i 2E). U modelu rane bolesti, i sa ARI2h i sa ARI2m podjednako se izbegava progresija bolesti MM (Slika 2D i 2F). Kao što se očekivalo, oko dana 50 miševi su počeli da pokazuju znake bolesti kseno-kalem protiv domaćina (GVHD), koja je bila teža u grupi sa ARI2m i što je dovelo do manjeg preživljavanja za ovu grupu (Slika 2G). U modelu uznapredovale bolesti, dok sa ARI2m nije omogućena nikakva progresija bolesti, izvesni signal bolesti je detektovan u ARI2h grupi u određenim vremenskim tačkama (Slika 2E), ali nije bio značajan (Slika 2F). Štaviše, miševi koji su tretirani sa ARI2h preživeli su duže usled mnogo manje toksičnosti u poređenju sa ARI2m (Slika 2G). Analiza tkiva miševa ponovo je pokazala veće smeštanje T ćelija u slezini u poređenju sa BM (Slika 2H). U oba modela, proliferacija T ćelija bila je veća za ARI2m nego za ARI2h, što bi moglo objasniti veću toksičnost ARI2m (Slika 2H); i što je važno, za oba CAR, i u oba modela bolesti, većina T ćelija u BM su bile CART ćelije (Slika 2H). Na kraju, analiza seruma miševa pokazala je da oba CAR sekretuju velike količine IFNγ. Međutim, i u skladu sa prethodnim zapažanjima nižeg profila toksičnosti za ARI2h, proizvodnja IFNγ od strane ARI2h bila je sporija nego za ARI2m. Stoga, u ranom modelu, dok 3 dana posle CART infuzije, proizvodnja IFNγ nije mogla biti detektovana u ARI2h grupi, 31 dan posle CART infuzije i ARI2m i ARI2h su pokazale visoku količinu proizvodnje IFNγ (Slika 2I). U uznapredovalom modelu, uočen je isti obrazac, koji pokazuje odsustvo proizvodnje IFNγ kod ARI2h na 5 dana od primene CART, i na 21 dan visoku proizvodnju IFNγ za oba CAR, iako nižu za ARI2h (Slika 2I).

[0120] Ovi rezultati sugerišu bržu aktivnost ARI2m naspram ARI2h, što čini verovatnim da će u slučajevima visokog opterećenja tumorom, ovo dovesti do bržeg iscrpljivanja CART ćelija. Prema tome, izveden je treći in vivo eksperiment sa nižom dozom CART ćelija (3×10<6>). U ovom slučaju, bioluminescentno snimanje je pokazalo da je bolest više uznapredovala kada su miševi primili CART ćelije na dan 14 u poređenju sa prethodnim uznapredovalim modelom. U ovom modelu, ni sa ARI2m ni sa ARI2h nije mogla da se izbegne progresija bolesti. Međutim, ARI2h su imale bolje performanse od ARI2m, pokazujući nižu progresiju bolesti i sugerišući da bi njihova sporija aktivnost mogla dovesti do manjeg iscrpljivanja CART ćelija u slučajevima visokog opterećenja tumorom.

Odgovor na uzastopne izazove sa tumorskim ćelijama i inflamatorni odgovor ARI2m naspram ARI2h

[0121] Prethodni rezultati pokazali su da su ARI2h imale sporiju in vivo aktivnost što je dovelo do niže toksičnosti u smislu kseno-GVHD. Štaviše, veliko opterećenje tumorom smanjilo je efikasnost ARI2m, za šta smo pretpostavili, da može biti usled bržeg iscrpljivanja ARI2m naspram ARI2h. Kako bismo potvrdili ovu hipotezu, izložili smo CART ćelije uzastopnim in vitro izazovima sa tumorskim ćelijama (Slika 3A). Ovi eksperimenti su prvo pokazali da je umnožavanje T ćelija in vitro postiglo veći broj CD4 T ćelija u poređenju sa CD8 T ćelijama, nalaz uočen i za CART i za NT T ćelije. Međutim, izlaganje tumorskim ćelijama dovelo je do veće proliferacije CD8 T ćelija, što je dovelo do normalizacije ovog CD4/CD8 odnosa (Slika 3B).

[0122] Štaviše, uzastopni izazovi CART ćelija sa tumorskim ćelijama demonstrirali su povećanu proliferaciju CD4 i CD8-CART ćelija za ARI2h, dok za ARI2m ova proliferacija nije bila kontinuirana (Slika 3C), što sugeriše da su posle uzastopnih izazova sa ćelijama MM, ARI2m ćelije postajale bilo iscrpljene ili su umirale.

[0123] Štaviše, uporedili smo proinflamatorni profil oba CAR uspostavljajući sličniji model sindromu oslobađanja citokina (CRS) koji je uočen kod pacijenata, gde su makrofagi, pošto ih aktiviraju CART ćelije, glavni proizvođači IL6, IL1β i TNFα. Prema tome, monociti i T ćelije izolovani od istih pojedinaca diferencirani su u makrofage i CART ćelije, respektivno, i obe su dodate u in vitro kokulture sa ćelijama MM kako bi se procenila citotoksičnost i proizvodnja citokina (Slika 3E). Dodavanje makrofaga nije negativno uticalo na CART anti-MM aktivnost (Slika 3F), blago je povećalo proizvodnju IFNγ (Slika 3G), i indukovano je ogromno povećanje proizvodnje IL6 i TNFα (Slika 3G). Štaviše, IL1β, koji nije mogao biti detektovan u odsustvu makrofaga, detektovan je u velikim količinama posle dodavanja makrofaga (Slika 3G). Prema tome, u ovoj postavci upoređena je proinflamatorna aktivnost ARI2m i ARI2h tokom dva dana, demonstrirajući sličnu proizvodnju IL6 i IL1β za oba CAR (Slika 3G) i nižu proizvodnju TNFα za ARI2h (Slika 3H) što sugeriše nižu proinflamatornu i toksičnu aktivnost za ARI2h, kao što je prethodno naznačeno u in vivo studijama (Slika 2D-2G).

Efikasna klinička proizvodnja i aktivnost ARI2m i ARI2h

[0124] Ovi prethodni podaci podržali su razvoj faze I multicentričnog kliničkog ispitivanja za pacijente sa MM (EudraCT kod: 2019-001472-11) koje je počelo 2019. godine sa ARI2 ćelijama koje su proizvedene u našoj ustanovi i obezbeđene svim centrima koji učestvuju. Prema tome, ARI2m i ARI2h su umnožene u GMP objektu u našoj ustanovi prema istom protokolu koji se upotrebljava u našoj ustanovi za fazu II multicentričnog kliničkog ispitivanja kod maligniteta B ćelija sa ARI1 ćelijama 17. I ARI2m (Slika 4A i 4C) i ARI2h (Slika 4B i 4C) su efikasno umnožene postižući veći broj CART ćelija od minimalno potrebnog (>150×10<6>CART ćelija) za postizanje odgovora kod pacijenata sa MM. Poređenje 4 klinička umnožavanja pokazalo je da je na kraju umnožavanja postignut uporediv broj ARI2h i ARI2m ćelija, čak iako je dobijen veći procenat ARI2h ćelija, ova razlika nije bila značajna, i verovatno je nastala usled veće titracije virusa za ARI2h (Slika 4C). Štaviše, ove CART ćelije su pokazale visoku efikasnost eliminisanja ćelija MM pri niskim E:T odnosima (Slika 4D).

Solubilni BCMA utiče na aktivnost ARI2

[0125] Kliničke studije sa CART19 kod ALL pokazale su da je potrebna niža doza CART ćelija (100×10<6>) za postizanje potpunih odgovora (CR) u poređenju sa studijama kod MM sa CARTBCMA (>150×10<6>). U tom smislu, ekspresija BCMA na površini ćelija MM nije stabilna, pošto se kontinuirano oslobađa kao sBCMA u vanćelijski milje. Prema tome, pretpostavili smo da se sBCMA može vezati za CARTBCMA ćelije i privremeno inhibirati njihovu aktivnost, što objašnjava visoku dozu koja je potrebna kod pacijenata sa MM za postizanje CR. Prema tome, prvo smo izmerili količinu sBCMA u serumu kod pacijenata sa monoklonskom gamapatijom neutvrđenog značaja (MGUS), kod novodijagnostikovanih pacijenata sa MM i kod relapsa, potvrđujući veću količinu sBCMA kod pacijenata sa MM (Slika 5A). Štaviše, konfokalna fluorescentna mikroskopija je potvrdila da se BCMA oslobađa sa ćelija MM u vezikulama (Slika 5B). Prema tome, kako bi se potvrdilo da sBCMA može privremeno da utiče na aktivnost CARTBCMA, ćelije MM koje prekomerno eksprimiraju BCMA fuzionisane za GFP (MM-BCMA-GFP) kokultivisane su sa ARI2 ćelijama tokom 3 sata uz izvođenje in vivo snimanja sa vremenskim odmakom. Potvrdili smo da se sBCMA oslobođen u vezikulama vezuje za ARI2 ćelije zaokupljajući ARI2 ćelije od njihovih ciljnih ćelija MM (Slika 5C). Štaviše, takođe smo uočili da ARI2 ćelije posle dovođenja u kontakt sa ćelijama MM mogu da steknu na svojim membranama deo BCMA sa površine ćelija MM, i kao posledica toga, uočeno je bratoubistvo između ARI2 ćelija (Slika 5D).

[0126] Kako bi se dodatno potvrdilo da sBCMA inhibira aktivnost CART, ćelije MM su kokultivisane sa ARI2m ćelijama u prisustvu rekombinantnog BCMA proteina sa i bez anti-BCMA antitela. Rezultati su potvrdili da rekombinantni BCMA protein inhibira aktivnost ARI2m u smislu citotoksičnosti i proizvodnje IFNγ (Slika 5E i 5F). Dodavanje anti-BCMA delimično je obnovilo ovu inhibiciju samo u smislu proizvodnje IFNγ a ne citotoksičnosti (Slika 5E i 5F). Štaviše, sBCMA koji se oslobađa sa ćelija MM dovodi do smanjene ekspresije BCMA na ćelijama MM, efekta posredovanog γ-sekretazom, koja direktno iseca BCMA oslobađajući solubilni BCMA, i to se može izbeći upotrebom inhibitora γ-sekretaze. Prema tome, prvo smo analizirali uticaj inhibitora γ-sekretaze (DAPT) na ekspresiju BCMA na ćelijama MM i na količinu oslobođenog sBCMA. Kao što se očekivalo, DAPT tretman je povećao ekspresiju BCMA na ćelijama MM i smanjio oslobađanje sBCMA (Slika 5G i 5H). Ova povećana ekspresija BCMA povezana sa DAPT je takođe detektovana posle kokultivisanja ćelija MM sa NT T ćelijama (Slika 5G). Dodatak DAPT kokulturama ARI2/MM ćelija smanjio je i količinu sBCMA. Međutim, uticaj na ekspresiju BCMA jedva je detektovan u normalnim in vitro kokulturama usled visoke aktivnosti ARI2 in vitro koja eliminiše ćelije MM (Slika 5G i 5H). Kako bismo potvrdili moguću ulogu DAPT koji poboljšava aktivnost ARI2 smanjenjem količine sBCMA, analizirali smo njegov uticaj u in vitro postavci sa kontinuiranim oslobađanjem sBCMA od strane ćelija MM koje nisu dodirnute ARI2 ćelijama. Prema tome, izveli smo iste in vitro eksperimente paralelno u transbunarić pločama, gde su ćelije MM koje nisu dodirnute ARI2 ćelijama mogle kontinuirano da oslobađaju sBCMA (Slika 5I). U ovoj postavci, potvrđeno je da kontinuirano oslobađanje sBCMA od strane nedodirnutih ćelija MM smanjuje aktivnost ARI2 (Slika 5J), i da se sa dodavanjem DAPT delimično izbegava negativan uticaj sBCMA koji oslobađaju nedodirnute ćelije MM (Slika 5J).

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Himerni antigenski receptor (CAR) naznačen time što sadrži:

a. jednolančani varijabilni fragment "scFv" BCMA-ciljno delujuću funkcionalnu grupu, koja sadrži VL domen i VH domen, pri čemu navedeni VH i VL domeni respektivno sadrže SEQ ID NO 1 i 2;

b. transmembranski domen vezan za domen zgloba koji sadrži SEQ ID NO: 9; c. kostimulatorni signalni domen koji sadrži SEQ ID NO: 11; i

d. unutarćelijski signalni domen koji sadrži SEQ ID NO: 10.

2. Himerni antigenski receptor (CAR) prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što se CAR sastoji od SEQ ID NO: 13.

3. Nukleinska kiselina koja kodira CAR u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 2.

4. Ćelija naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 3.

5. Ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačena time što je ćelija T-ćelija.

6. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži mnoštvo ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

7. Ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6, za upotrebu kao medikament.

8. Ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6, za upotrebu u postupku lečenja multiplog mijeloma, naznačeno time što postupak sadrži primenu ćelije ili kompozicije pacijentu kome je to potrebno.