RS65119B1 - Kompozicija za regeneraciju tkiva, postupak proizvodnje i njena primena - Google Patents

Kompozicija za regeneraciju tkiva, postupak proizvodnje i njena primena

Info

Publication number
RS65119B1
RS65119B1 RS20240093A RSP20240093A RS65119B1 RS 65119 B1 RS65119 B1 RS 65119B1 RS 20240093 A RS20240093 A RS 20240093A RS P20240093 A RSP20240093 A RS P20240093A RS 65119 B1 RS65119 B1 RS 65119B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tissue
cells
composition
macrophages
culture
Prior art date
Application number
RS20240093A
Other languages
English (en)
Inventor
Fernández Juan Pedro Lapuente
Gregorio Juan Carlos De
Bielsa Paula Desportes
Vicente Pablo Fernández
Calvo María Cayuela
Martínez Alejandro Blázquez
Anjos Vilaboa Severiano Dos
Moreno Carmen Iglesias
Cepa Gonzalo Gómez
Moreno Jara Sanz
Original Assignee
Peaches S L
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peaches S L filed Critical Peaches S L
Publication of RS65119B1 publication Critical patent/RS65119B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/086—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system glial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1317—Chondrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1335—Skeletal muscle cells, myocytes, myoblasts, myotubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1341—Tenocytes, cells from tendons and ligaments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na proizvodnju na proizvodnju tkivno-specifičnih faktora rasta i/ili citokina. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na kompozicije koje sadrže navedene faktore rasta i/ili citokine dobijene navedenim postupkom. Pronalazak pripada oblasti lekova za humane ili životinje, posebno regeneracije tkiva.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Faktori rasta (GF – growth factor) igraju važnu ulogu u promovisanju ćelijske diferencijacije i ćelijske deobe. To su supstance aktivne u stimulisanju rasta ćelija i tkiva i mogu ih proizvoditi mnoge različite vrste tkiva. Primeri ovih supstanci uključuju faktore rasta slične insulinu (somatomedini), koji stimulišu rast posredovanjem lučenja hormona rasta iz hipofize; epidermalni faktor rasta, koji stimuliše rast epitelnih ćelija; faktor rasta koji potiče od trombocita, koji stimuliše rast mišićnih ćelija i ćelija vezivnog tkiva; i faktor rasta nerava, koji stimuliše rast neuronskih ćelija.
[0003] GF može biti izveden iz trombocita, plazme, koštanog matriksa, osteocita i osteoblasta, fibroblasta, koštane srži, i praktično iz svakog tkiva. Pokazalo se da GF iz uzoraka krvi ima važna biološka svojstva, kao što su regeneracija tkiva i smanjenje bolesti (Civinini A i sarad., 2010. Clin Cases Miner Bone Metab 7(3):194).
[0004] GF iz uzoraka krvi se uglavnom koristi u obliku plazme bogate trombocitima (PRP), tj., dela plazme koji je, nakon centrifugiranja, bogat trombocitima. PRP sadrži faktore rasta i citokine kao što su faktor rasta izveden iz trombocita, transformišući faktor rasta beta, faktor rasta fibroblasta, insulinu sličan faktor rasta 1, insulinu sličan faktor rasta 2, vaskularni endotelni faktor rasta, epidermalni faktor rasta, interleukin 8, keratinocitni faktor rasta i faktor rasta vezivnog tkiva. Efikasnost faktora rasta u zarastanju povreda i koncentracije GF pronađene u PRP su teorijska osnova za upotrebu PRP u obnavljanju tkiva. Trombociti sakupljeni u PRP se aktiviraju dodatkom trombina i kalcijum hlorida.
[0005] Dugi niz godina, PRP koji sadrži faktore rasta i citokine se koristi u lečenju sportskih povreda. Ovo je dovelo do različitih zaključaka u pogledu delotvornosti i efikasnosti u lečenju povreda u različitim tkivima, jer su rezultati pokazali veliku varijabilnost, najčešće povezanu sa uzrastom pacijenta. Javnosti je stavljeno na uvid da koncentracija faktora rasta u PRP značajno opada kod subjekata starijih od 25 godina u zdravoj populaciji, posebno kod muškaraca, (Evanson JR i sarad, 2014. Mil Med 179(7): 799). Štaviše, bilo koja bolest subjekta može dodatno da promeni koncentraciju GF u PRP, ključnu u procesu regeneracije-oporavka sportske povrede u mekom ili osteokartilaginoznom tkivu.
[0006] Svi medicinski proizvodi u stanju tehnike koji sadrže GF i usmereni su na regeneraciju tkiva su autologni, odnosno, ista osoba je donor ćelije i primalac. Jedna od važnijih karakteristika ovih kompozicija je da se moraju primeniti na pacijente odmah nakon pripreme, kako bi se izbeglo gubljenje bioloških svojstava GF. Tokom skladištenja ovih medicinskih proizvoda može doći do promena u svojstvima GF, kao što je smanjenje pH, povećanje nivoa kalijuma u plazmi i promene u njihovom metabolizmu, koje utiču na biološki efekat GF (Martinez MC i sarad. Transfusion medical applications and practice.2012. prvo izdanje Cortés A. tom I, poglavlje 4, str.71).
[0007] Štaviše, pošto jedinjenja u krvi ne mogu da opstanu na sobnoj temperaturi tokom dužeg vremenskog perioda, preporučuje se odmah primeniti kompozicije koje ih sadrže. Preporučeni period između vađenja krvi pacijenta i administriranja PRP ne bi trebalo da bude duži od 45 minuta (Moreno R i sarad., 2015. Farm Hosp 39(3):130). Supernatant plazme se mora upotrebiti u roku od osam sati od njegove pripreme kako bi se izbegla degradacija ili denaturalizacija faktora rasta, a takođe i bakterijska kontaminacija. Sav proces se odvija u sterilnim i aseptičnim uslovima, pošto će se kompozicija koja sadrži PRP uvesti u telo subjekta.
[0008] Da bi se GF administrirao pacijentu, nedavne medicinske primene autolognih faktora rasta krvi zahtevaju infiltraciju ili kontinuirano administriranje proizvoda sa kratkim intervalom između doza, kako bi proizvod bio efikasan. Za ove primene, priprema kompozicije koja sadrži autologna jedinjenja u krvi, zahteva kontinuiranu ekstrakciju krvi iz pacijenta, pošto se sveže kompozicije moraju pripremiti svaki put kada je kompozicija potrebna. Ovo negativno utiče na kvalitet života pacijenta i čini ovu proceduru neprikladnom za dugotrajno lečenje hroničnih ili degenerativnih stanja. Stoga, bila bi prednost imati kompoziciju koja sadrži GF koja može da se skladišti dok njegove komponente ostaju stabilne i biološki aktivne tokom vremena. Ovo bi omogućilo skladištenje proizvoda, bez potrebe da se odmah primeni na pacijenta.
[0009] Na sportskom terenu, povređenom pacijentu je potrebno administriranje kompozicije za obnavljanje tkiva što je pre moguće, najbolje odmah nakon što je pretrpeo/pretrpela povredu, kako bi oporavak pacijenta mogao da počne što je pre moguće. Ovo je posebno važno kod vrhunskih sportista. Skladištena kompozicija bi omogućila lečenje povrede odmah nakon što se dogodi, što bi koristilo prognozi oporavka i kvalitetu života pacijenta, jer ne bi bilo potrebno dodatno vađenje krvi.
[0010] Zbog obavezne potrebe za čestim administriranjem autolognih PRP kompozicija pacijentu, postoji više hroničnih ili degenerativnih patologija koje bi se potencijalno mogle lečiti ovim kompozicijama, ali nisu lečene zbog stalnih zahteva pacijenta, što negativno utiče na njegov/njen kvalitet života. Primeri ovih bolesti su patologije oka, patologije centralnog nervnog sistema, degenerativne patologije zglobova, reumatske patologije, endokrine patologije, sportske povrede i bilo koja druga bolest ili patologija koja bi zahtevala ponovljeno administriranje kompozicije izvedene iz krva koji sadrži GF.
[0011] Štaviše, PRP kompozicije koje su izvedene iz trombocita pokazuju dodatni nedostatak: faktori rasta, citokini i hemokini dobijeni iz ovih ćelija pokazuju veoma veliku varijabilnost, i kvantitativnu i kvalitativnu, što otežava dobijanje ponovljivih serija kompozicije. Različite koncentracije GF-a rezultuju različitim biološkim efektima. Stoga, nivoe GF u svakoj kompoziciji treba analizirati radi pouzdane interpretacije bioloških funkcija i standardizovane primene PRP (Soon i sarad., 2011. Korean J Lab Med 31: 212). U stvari, pokazalo se da drugi faktori kao što su starenje, ishrana, način života, stres, bolesti itd. negativno utiču na njihov sadržaj (Bai MY i sarad., 2018. Scientific Reports 8:10642).
[0012] Drugi interesantan aspekt koji treba razmotriti u regeneraciji ili popravljanju tkiva primenom kompozicija koje sadrže faktore rasta je njihov pleiotropizam. Iako je svakom tipu GF moguće pripisati glavno svojstvo, njegov efekat na svako tkivo je uslovljen prisustvom drugih komponenti u kompoziciji, kao što su drugi faktori rasta ili citokini, koji mogu proizvesti efekat suprotan željenom efektu za određeni faktor rasta. Pleiotropizam je posledica činjenice da se ćelijski odgovori na različite citokine i faktore rasta aktiviraju kada navedena jedinjenja aktiviraju svoje receptore u ciljnim ćelijama. Svaki citokin ili svaki faktor obično prepoznaju samo 1 ili 2 različita tipa receptora i interakcija je veoma specifična, iako se može modulirati različitim koadjuvansima ili antagonistima drugih citokina i/ili faktora.
[0013] Dokument TW I640631-B stavlja na uvid javnosti ferencijaciju M0-makrofaga u M2-makrofage korišćenjem baikalina, dobijanje kondicioniranog medijuma iz kulture navedenih M2-makrofaga i njegovo korišćenje za zarastanje rana (proliferacija fibroblasta i angiogeneza).
[0014] Shodno tome, postoji potreba za kompozicijom faktora rasta i/ili citokina koja je pogodna za regeneraciju tkiva. Ova kompozicija treba da ima profil faktora rasta i/ili citokina koji je pogodan za regeneraciju specifičnog ciljnog tkiva. Ova kompozicija može da se skladišti tokom dužeg vremenskog perioda, dok faktori rasta i/ili citokini održavaju svoju funkciju i biološku aktivnost. Kompozicija treba da bude pogodna za alogeno administriranje i da bude efikasan za regeneraciju tkiva.
[0015] Predmetni pronalazak obezbeđuje rešenje za ovaj problem stavljajući na uvid javnosti proces za dobijanje kompozicije koja sadrži faktore rasta i/ili citokine, pri čemu se kompozicija dobijena navedenim postupkom može skladišti i biološki je aktivna najmanje godinu dana. Ova kompozicija se može primeniti odmah po dobijanju ili u bilo kom drugom trenutku subjektu kome je to potrebno.
OPIS PRONALASKA
Kratak opis pronalaska
[0016] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje kompozicije za regeneraciju tkiva, koji obuhvata sledeće korake:
obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanja M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferencijacija prečišćenih monocita u M2-makrofage;
zajedničko kultivisanje M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma; i sakupljanje supernatanta ko-kulture,
pri čemu je odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi 1:1 do 40:1
[0017] U poželjnom tehničkom rešenju, odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je, poželjno 1:1 do 20:1, poželjnije 10:1.
[0018] U poželjnom tehničkom rešenju, ko-kultura se izvodi na temperaturi između 30 i 40°C, poželjnije na 37 °C.
[0019] U poželjnom tehničkom rešenju, M2-makrofazi se kultivišu zajedno sa ćelijama specifičnim za tkivo tokom perioda od 3 do 28 dana.
[0020] U poželjnom tehničkom rešenju, postupak dalje obuhvata krioprezervaciju i/ili liofilizaciju kompozicije.
[0021] U daljem tehničkom rešenju, postupak dodatno obuhvata korak odmrzavanja kompozicije koja je kriokonzervirana ili rekonstituisanja kompozicije koja je liofilizovana.
[0022] U poželjnom tehničkom rešenju, ćelije specifične za tkivo su ćelije koje odgovaraju tkivu da se regeneriše.
[0023] U poželjnom tehničkom rešenju ćelije specifične za tkivo su izabrane od miocita, mišićnih skeletnih ćelija, mišićnih satelitskih ćelija, tenocita, Švanovih ćelija, dermalnih fibroblasta, hondrocita, sinoviocita, osteocita, limfocita, ćelija folikula dlake, ćelija miokarda, limfnih endotelnih ćelija, ćelija iz respiratornog epitela, mezenhimalnih matičnih ćelija ili njihovih kombinacija.
[0024] U poželjnom tehničkom rešenju, korak zajedničkog kultivisanja M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma se izvodi u Transwell-u.
[0025] U drugom tehničkom rešenju, pronalazak stavlja na uvid javnosti kompoziciju za regeneraciju tkiva dobijenu postupkom koji obuhvata sledeće korake:
- obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanje M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferencijacija prečišćenih monocita u M2-makrofage; - zajedničko kultivisanje M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma; i
- sakupljanje supernatanta ko-kulture,
pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 40:1,, pri čemu su ćelije specifične za tkivo izabrane iz grupe koja sadrži miocite, mišićne skeletne ćelije, mišićne satelitske ćelije, tenocite, osteocite, Švanove ćelije, dermalne fibroblaste, hondrocite, sinoviocite, limfocite, ćelije folikula dlake, ćelije miokarda, ćelije iz respiratornog epitela, limfne endotelne ćelije ili mezenhimalne matične ćelije ili njihove kombinacije i pri čemu M2-makrofazi u zajedno kultivisani sa tkivno specifičnim ćelijama tokom 3 do 28 dana.
[0026] U drugom tehničkom rešenju, pronalazak stavlja na uvid javnosti farmaceutsku kompoziciju koja sadrži kompoziciju pronalaska.
[0027] U drugom tehničkom rešenju, pronalazak stavlja na uvid javnosti kompoziciju u skladu sa predmetnim pronalaskom, za primenu u postupku lečenja bolesti, pri čemu kompozicija za primenu se administrira u tkivo koje ima ćelije iste vrste kao što su ćelije specifične za tkivo.
[0028] U drugom tehničkom rešenju pronalazak stavlja na uvid javnosti kompoziciju u skladu sa predmetnim pronalaskom za primenu u postupku lečenja bolesti izabrane od tendinoze, preloma mišićnih fibrilara, tendinitisa, burzitisa, sinovitisa, ,artroze, lomljenja hrskavice, respiratorne bolesti ili hondropatije, pri čemu se kompozicija za primenu administrira u tkivo koje sadrži ćelije istog tipa kao što su ćelije specifične za tkivo.
[0029] U drugom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu se administrira subjektu koji nije subjekt donor monocita ili ćelija specifičnih za tkivo.
[0030] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za modifikovanje kompozicije faktora rasta i/ili citokina medijuma za kulturu u kulturi M2-makrofaga, koji obuhvata: obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanja M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferenciranje prečišćenih monocita u M2-makrofage; i
zajedničko kultivisanje M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma, pri čemu kompozicija faktora rasta i/ili citokina medijuma za kulturu je modifikovana u poređenju sa kompozicijom faktora rasta i/ili citokina medijuma za kulturu u kulturi M2-makrofaga bez ćelija specifičnih za tkivo u medijumu bez seruma, pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 40:1.
Opis slika
[0031] Sledeće slike ilustruju predmetni pronalazak i ne treba ih tumačiti kao ograničenje navedenog pronalaska na bilo koji način.
Slika 1. Apsolutne koncentracije (pg/ml) faktora arsta i citokina u kondicioniranom medijumu M2-makrofaga (M2-CM) i modifikovanim kompozicijama specifičnim za tkivo proizvedenim zajedničkim kultivisanjem sa specifičnim vrstama ćelija. Zvezde predstavljaju načajno različite vrednosti u poređenju sa onima dobijenim u M2-CM; CON: hondrocit; SIN: sinoviocit; TEN: tenocit; OST: osteocit; MIO: Miocit; MSC: mezenhimalna matična ćelija; LEC: Limfo- endotelna ćelija; SCH: Švanova.
Slika 2. Proseci koncentracija prikazani na slici 1. Osenčene kutije predstavljaju značajno različite vrednosti u poređenju sa onima dobijenim u M2-CM; ND: nije detektovano (koncentracija niža od osetljivosti testa).
Slika 3. Obrasci modifikacije koncentzracija faktora rasta i citokina kompozicija specifičnih za tkivo. Kompozicije specifične za tkivo imaju karakterističan obrazac modifikacije, bez obzira na početne koncentracije u M2-CM. Centralna linija: molekularna koncentracija slična makrofagu M2 kondicionirani medijum; gornja linija: molekularna koncentracija značajno veća od M2-CM; donja linija: molekularna koncentracija znatno niža od M2-CM. Sve statistike su izračunate sa podacima od pet različitih pacijenata (pet različitih početnih koncentracija u M2-CM) i i ponovljene tri puta za svaki u nezavisnim testovima. ANOVA je izvršena da bi se utvrdile statistički značajne razlike između nezavisnih eksperimentalnih grupa koje su proučavane, upoređujući srednju vrednost svake kolone sa srednjom vrednošću kontrolne grupe (makrofazi). Korišćena je GraphPad Prism verzija 8.4.0 za Mac OS X (GraphPad softver, San Dijego, Kalifornija SAD). Nivo statističke značajnosti postavljen je na P<0.05.
Slika 4. Razvoj procenta pacijenata obolelih od tendinitisa patelarne tetive u fazi II (II, crno) i fazi III (III, belo) od 0. dana (kontrola) do 27. dana nakon tretmana.
Slika 5. Razvoj procenta pacijenata obolelih od tendinitisa Ahilove tetive u fazi II (II, crno) i fazi III (III, belo) od 0. dana (kontrola) do 30. dana nakon tretmana.
Slika 6. Razvoj procenta pacijenata obolelih od rupture mišića u fazi II (II, crno) i fazi III (III, belo) od 0. dana (kontrola) do 42. dana nakon tretmana.
Slika 7. Ehografija subjekta sa rupturom mišića urađena dan pre tretmana (-1), 4. dana nakon tretmana (+4) i 8. dana nakon tretmana (+8).
Slika 8. Razvoj procenta pacijenata obolelih od gonartroze u fazi II (II, crno) i fazi III (III, belo) od 0. dana (kontrola) do 56. dana nakon tretmana.
Slika 9. Razvoj procenta pacijenata obolelih od bola u kolenu u fazi II (II, crno) i fazi III (III, belo) od 0. dana (kontrola) do 56. dana nakon tretmana.
Slika 10. Razvoj procenta pacijenata obolelih od rupture prednjeg ukrštenog ligamenta u fazi II (II, crno) i fazi III (III, belo) od 0. dana (kontrola) do 5. meseca nakon tretmana.
Slika 11. Razvoj procenta pacijenata koji boluju od dinamičke osteopatije pubisa u fazi II (II, crno), fazi III (III, belo) i fazi IV (IV, sivo) od 0. dana (kontrola) do 4. meseca nakon tretmana.
Slika 12. Razvoj procenta pacijenata koji pate od istezanja fibularnog ligamenta astragalusa u fazi II (II, crno) i fazi III (III, belo) od 0. dana (kontrola) do 24. dana nakon tretmana.
Detaljan opis pronalaska
[0032] Za potrebe predmetnog pronalaska, izrazi "regenerativna medicina", "popravka tkiva", "povrede u tkivu", "oporavak tkiva", "regeneracija tkiva" ili "zaceljivanje tkiva" treba da se smatraju sinonimima za bilo koji proces koji podrazumeva zarastanje tkiva koje se sastoji od ćelija sisara prethodno povređenih na bilo koji način. Poželjno, proces podrazumeva regeneraciju povređenog tkiva.
[0033] Za potrebe predmetnog pronalaska, izrazi "kompozicija za regeneraciju tkiva", "kompozicija specifična za tkivo" ili jednostavno "kompozicija" su svi sinonimi i odnose se na kompozicije proizvedene postupkom predmetnog pronalaska. Kao što je opisano u nastavku, primeri takvih kompozicija uključuju supernatant ko-kulture M2-makrofaga i ćelija specifičnih za tkivo, i srodne prečišćene i/ili koncentrovane kompozicije, liofilizovane kompozicije, kriokonzervirane kompozicije i farmaceutske kompozicije.
[0034] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje kompozicije za regeneraciju tkiva, koji obuhvata sledeće korake:
obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanja M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferencijacija prečišćenih monocita u M2-makrofage;
zajedničko kultivisanje M2-makrofaga i ćelija specifičnih za tkivo u medijumu bez seruma; i sakupljanje supernatanta ko-kulture,
pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 40:1.
[0035] U skladu sa predmetnim pronalaskom, M2-makrofazi korišćeni u koraku sa ko-kulturom su obezbeđeni diferencijacijom monocita.
[0036] Kao što je stručnjaku poznato, monociti se diferenciraju u makrofage, koji zauzvrat mogu biti podvrgnuti polarizaciji u M2-makrofage. Izvor monocita može biti uzorak krvi istog ili različitog subjekta davaoca ćelija specifičnih za tkivo. U poželjnom tehničkom rešenju, poreklo monocita je uzorak krvi istog subjekta davaoca ćelija specifičnih za tkivo. Dalje, monociti mogu biti autologni ili alogeni, tako da monociti koji se koriste za dobijanje kompozicije za regeneraciju tkiva mogu pripadati donatoru koji je isti ili različit subjekt koji će biti lečen navedenom kompozicijom.
[0037] Monociti se mogu dobiti ili aferezom, iz pune krvi gradijentnim centrifugiranjem sa Ficoll medijumom, ili bilo kojom drugom tehnikom poznatom u tehnici. Afereza je vantelesna medicinska tehnologija u kojoj se krv osobe propušta kroz aparat koji odvaja jedan određeni sastojak i vraća ostatak do cirkulacije. Krv se filtrira da bi se uklonile matične ćelije. Gradijentna centrifugacija pomoću Ficoll medijuma (Ficoll-Paque tj.) je tehnika koja razdvaja krv na njene komponente. Medijum se obično postavlja na dno konične cevi, a krv se zatim polako nanosi iznad medijuma. Nakon centrifugiranja, sledeći slojevi su vidljivi u konusnoj cevi, od vrha do dna: plazma i drugi sastojci, sloj mononuklearnih ćelija zvan „buffy coat“ (PBMC/MNC)- Peripheral Blood Mononucleated Cells - mononukleisane ćelije periferne krvi.
[0038] Poželjno, prečišćeni monociti se koriste za dobijanje M2-makrofaga. Prečišćavanje monocita se može izvršiti stavljanjem istih u kulturu pod normoksičnim ili hipoksičnim uslovima potpunog steriliteta. Pošto će se kompozicija dobijena postupkom pronalaska primeniti na subjektu, neophodno je da se svi koraci izvode u sterilnim uslovima. U telu, koncentracije kiseonika se kreću od 1 do 12%, a ne 21% u atmosferi. Ćelije kultivisane u uslovima malog kiseonika ili hipoksije rastu brže, žive duže i pokazuju manji stres. Koncentracija kiseonika u uslovima hipoksije je 3 - 5 %. Monociti se mogu odabrati, na primer, adherencijom posle 24-časovne inkubacione kulture ili drugim centrifugiranjem u gradijentu gustine.
[0039] Monociti se mogu diferencirati u M2-makrofage prema metodama poznatim u tehnici. Na primer, monociti se mogu kultivisati u medijumu bez seruma u prisustvu faktora koji stimuliše kolonije makrofaga (M-CSF - macrophage colony-stimulating factor), čime se izaziva diferencijacija monocita u M2-makrofage. Alternativne metode za izazivanje diferencijacije su poznate u tehnici, koje uključuju korišćenje IL-4, IL-10, IL-13 i/ili TGF-beta kao agenasa za diferencijaciju. Poželjno, monociti se kultivišu tokom 3-5 dana, u prisustvu 10 ng/ml M-CSF. Tako proizvedene ćelije se zatim mogu koristiti za korak ko-kulture sa ćelijama specifičnim za tkivo.
[0040] Kao što će stručnjak razumeti, nediferencirani monociti mogu ostati u ćelijskoj kulturi nakon procesa diferencijacije. Prema tome, M2-makrofagi koji se koriste za korak ko-kulture mogu biti praćeni brojem monocita, poželjno manjim od 30%, poželjnije manje od 20% monocita. Veoma je važno izbegavati bilo koji sastojak koji može da ometa diferencijaciju u M2-makrofage, kao što je goveđi fetalni serum, fenol crveno, antibiotici ili antifungici između ostalog.
[0041] Za potrebe ovog pronalaska, ćelije specifične za tkivo se odnose na jednu ili više ćelija specifičnih za tkivo. Ćelije specifične za tkivo mogu biti odabrane prema ciljnom tkivu koje se regeneriše, tako da se proizvedu kompozicije za regeneraciju tkiva koje imaju faktor rasta i/ili profil citokina koji je optimalan za lečenje ciljnog tkiva. Posebno, ćelije specifične za tkivo mogu odgovarati tkivu koje treba tretirati kompozicijom za regeneraciju tkiva. U poželjnom tehničkom rešenju, ćelije specifične za tkivo su ćelije odabrane od: miocita, mišićnih skeletnih ćelija, mišićnih satelitskih ćelija, tenocita, osteocita, Švanovih ćelija, dermalnih fibroblasta, hondrocita, sinoviocita, limfocita, limfnih endotelnih ćelija, ćelija respiratornog epitela, ćelije folikula dlake, ćelije miokarda, mezenhimalnih matičnih ćelija ili njihovih kombinacija. U poželjnom tehničkom rešenju, ćelije su ljudskog porekla. Ćelije se mogu dobiti iz kolekcije ćelija, ili iz primarne ćelijske kulture iz tkiva subjekta (donora). Ćelije specifične za tkivo mogu biti autologne ili alogene, tako da ćelije specifične za tkivo koje se koriste za dobijanje kompozicije za regeneraciju tkiva mogu pripadati donatoru koji je isti ili različit subjekt koji će biti lečen navedenim kompozicijama. Ćelije tkiva mogu se dobiti iz zdravog tkiva ili iz oštećenog tkiva (zbog bolesti ili povrede).
[0042] Ko-kultura M2-makrofaga i ćelija specifičnih za tkivo modifikuje proizvodnju faktora rasta i/ili citokina, u poređenju sa proizvodnjom faktora rasta i/ili citokina samo od strane M2-makrofaga. Tokom koraka ko-kulture, faktori rasta i/ili citokini se izlučuju u medijum za kulturu, čime se proizvodi kondicionirani medijum. Stoga, faktori rasta i/ili citokini proizvedeni prema predmetnom pronalasku su prisutni u supernatantu ćelijske kulture. Kondicionirani medijum (koji bi se mogao nazvati "kondicionirani medijum modifikovan M2-makrofagom") ima drugačiji faktor rasta i/ili profil citokina u poređenju sa kompozicijom proizvedenom kultivisanjem M2-makrofaga bez ćelija specifičnih za tkivo (M2- medijum kondicioniran makrofagom (M2-CM -M2-macrophage conditioned medium)). U okviru obima predmetnog pronalaska, "kondicionirani medijum", "kondicionirani medijum modifikovan M2-makrofagom" i "supernatant", su svi sinonimi i predstavljaju kompozicije korisne za regeneraciju tkiva.
[0043] Stoga, u daljem tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na na postupak za modifikaciju kompozicije faktora rasta i/ili citokina medijuma za kulturu u kulturi M2-makrofaga, koji obuhvata::
obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanja M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferencijaciju prečišćenih monocita u M2-makrofage; i
zajedničko kultivisanje M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma, pri čemu kompozicija faktora rasta i/ili citokina kompozicija medijuma za kulturu je modifikovana u poređenju sa kompozicijom faktora rasta i/ili cytokina medijuma kulture u kulturi M2-makrofaga bez ćelija specifičnih za tkivo u medijumu bez seruma, pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 40:1.
[0044] U skladu sa predmetnim pronalaskom, zajedničko kultivisanje ćelija specifičnih za tkivo sa M2-makrofazima izaziva proizvodnju faktora rasta i/ili citokina u poređenju sa količinama koje su optimalne za lečenje cilnog tkiva. Tačnije, profil faktora rasta i/ili citokina medijuma koji je uslovljen zajedničkim kultivisanim ćelijama prema predmetnom pronalasku je specifičan za svako tkivo, sa specifičnim molekularnim obrascima ili potpisima koji optimizuju prirodni regenerativni proces odgovarajućeg tkiva. Ovo omogućava dobijanje kompozicija koje imaju različite profile faktora rasta i/ili citokina u zavisnosti od ćelija specifičnih za tkivo koje se koriste u ko-kulturi. Prema tome, kompozicije specifične za tkivo dobijene inventivnim postupkom optimalno tretiraju specifično ciljno tkivo.
[0045] Ko-kultura M2-makrofaga i ćelija specifičnih za tkivo može dalje da sadrži odrasle mezenhimske ćelije, koje su istog ili različitog porekla (kolekcija ćelija ili primarna ćelijska kultura iz tkiva donora) od ćelija specifičnih za tkivo ( autologne ili alogene odrasle mezenhimske ćelije). Slično, ko-kultura M2-makrofaga i ćelije specifične za tkivo mogu dalje da sadrže monocite, koji su od istog ili različitog subjekta donora tkivno-specifičnih ćelija. Takvi monociti mogu biti nediferencirani monociti iz kulture iz koje su dobijeni M2-makrofazi.
[0046] U poželjnom tehničkom rešenju, M2-makrofazi su zajedno kultivisani sa primarnom kulturom ćelija tkiva koje može biti isto tkivo u koje će se dobijena kompozicija primeniti kod subjekta.
[0047] U poželjnom tehničkom rešenju korak sa ko-kulturom se izvodi između 30 i 40°C, poželjno na 37 °C. Vreme kulture može biti od 3 do 28 dana. Ko-kultura se takođe može izvesti u uslovima hipoksije. Poželjno, ko-kultura se izvodi u sterilnim uslovima.
[0048] Poželjno, ko-kultura se izvodi pri odnosu M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo od 1:1 do 20:1, poželjnije 10:1.
[0049] Ko-kultura se može izvesti u bilo kom medijumu za kulturu koji je pogodan za kultivisanje monocita i/ili makrofaga, pod uslovom da je medijum za kulturu bez seruma. Ovo uključuje standardne medijume bez seruma.
[0050] Sakupljanje supernatanta se može obaviti bilo kojom metodom poznatom od strane stručnjaka. Faktori rasta i/ili citokini se izlučuju u medijum za kulturu tokom faze ko-kulture i specifični su za tkivo iz kojeg potiču ćelije specifične za tkivo. Stoga, supernatant je obogaćen sekretomom zajedno kultivisanih ćelija. Sakupljanje supernatanta se može izvršiti odvajanjem od ćelija kulture korišćenjem bilo koje metode poznate u tehnici. Poželjno, sakupljanje se vrši na temperaturi između 5 i 40 °C, poželjnije na 15 °C. Ove niske temperature izbegavaju ili minimuju gubitak isparljivih konstituenata prisutnih u plazmi ili supernatantu kulture i omogućavaju održavanje veoma niskog rizika od mikrobne kontaminacije u kompoziciji. Sakupljeni supernatant se može naknadno obraditi tako da se prečiste i/ili koncentrišu faktori rasta i/ili citokini koje sadrži. Na primer, ćelijski ostaci se mogu ukloniti filtriranjem sa membranom od 0,22 µm ili ultracentrifugirati da bi se dobila koncentrovana kompozicija. Takav prečišćeni i/ili koncentrovani supernatant je/su inventivna kompozicija korisna za regeneraciju tkiva.
[0051] Postupak može dalje da obuhvata nanokapsuliranje faktora rasta i/ili citokina dobijenih u skladu sa predmetnim pronalaskom. Nanokapsuliranje terapijskih agenasa povećava njihovu efikasnost, specifičnost i sposobnost ciljanja. Nanonosači štite svoj teret od prerane degradacije u biološkoj sredini, povećavaju bioraspoloživost i produžavaju prisustvo u krvi i ćelijskom unosu. U poželjnom tehničkom rešenju, faktori rasta su inkapsulirani mikrofluidnom tehnologijom.
[0052] Kompozicija se može dalje obraditi da bi se omogućilo dugotrajno skladištenje i naknadna primena. Na primer, može se kriokonzervisati i/ili liofilizovati.
[0053] Krioprezervacija sakupljenih faktora rasta i/ili citokina može se izvršiti zamrzavanjem kompozicije koja ih sadrži (koji može biti supernatant ko-kulture ili njegova prečišćena i/ili koncentrovana verzija) na temperaturi između -20 i -196° C. U poželjnom tehničkom rešenju, kompozicija je zamrznuta na -35 °C i zatim kriokonzervira na temperaturi između -35 °C do -86 °C. U još poželjnijem tehničkom rešenju, kompozicija je zamrznuta na -35 °C, a zatim podvrgnuta temperaturnoj rampi zamrzavanja (-1 °C/min) do -86 °C. U najpoželjnijem teničkom rešenju, kompozicija se prvo zamrzava i kriokonzervira na -35 °C tokom 24 sata, a zatim se postepeno podvrgava nižim temperaturama do -86 °C.
[0054] Liofilizacija sakupljenih faktora rasta i/ili citokina može se izvesti hlađenjem i sušenjem kompozicije koja ih sadrži. Poželjno, kompozicija se hladi na temperaturi od -20 do -80 °C i pritisku od 10-500 mbara.
[0055] Kriokonzervirana ili liofilizovana kompozicija može se čuvati između -80 i -86 °C do upotrebe. Eksperimentalno je dokazano da skladištenje na -40 °C obezbeđuje stabilnost i biološku aktivnost GF i/ili citokina prisutnih u kompoziciji i njihovu aktivnost in vivo obnavljajući i povređeno tkivo. Kriokonzervirana kompozicija može da se održava najmanje 1 godinu između -20 i -196 °C. Poželjno ne više od 3 godine. U poželjnom tehničkom rešenju, supernatant se dozira u pojedinačnim dozama.
[0056] Kompoziciju pronalaska, kao i bilo koju drugu kompoziciju za regeneraciju tkiva, treba primeniti na sobnoj temperaturi (25 - 30 °C) i/ili fiziološkim temperaturama (blizu 37 °C). Ova temperatura je važna, jer je svrha kompozicije da se koristi kao tretman u regenerativnoj medicini, koji se izvodi uvek na ovim temperaturama, pošto se tretman primenjuje direktno na povređeno tkivo subjekta.
[0057] Iz tog razloga, odmrzavanje kriokonzervirane kompozicije treba da se vrši održavanjem kompozicije na temperaturi između 20 do 37 °C u trajanju od 5 minuta do 1 sata. U poželjnom tehničkom rešenju, odmrzavanje kriokonzervirane kompozicije se izvodi održavanjem između 25 i 30 °C između 20 i 40 minuta. Slično, liofilizovana kompozicija se može rekonstituisati rehidratacijom i zatim zagrejati na odgovarajuću temperaturu pre svoje primene.
[0058] Kompozicija pronalaska se može koristiti kod subjekta donora ćelija specifičnih za tkivo (autologne) ili kod drugog subjekta (alogene), bez rizika od imunološke reakcije kod primaoca.
[0059] Odmrznuta ili rekonstituisana kompozicija ima analognu koncentraciju faktora rasta i/ili citokina sa istom biološkom aktivnošću, u odnosu na medijum za kulturu iz kojeg su sakupljeni faktori rasta i/ili citokini tokom koraka ko-kulture. Prema tome, kompozicija dobijena ovde opisanim postupkom je stabilna tokom vremena nakon krioprezervacije i/ili liofilizacije. Ova stabilnost i efikasnost kompozicije nakon krioprezervacije i/ili liofilizacije omogućava skladištenje kompozicije i izbegava svaku naknadnu ekstrakciju krvi u donatora, pošto se doze kompozicije dobijene ovde opisanim procesom mogu naknadno primeniti prema potrebama pacijenta (isti subjekt kao davalac ili bilo koji drugi primalac).
[0060] Takođe je eksperimentalno dokazano da su efekti na proliferaciju ćelija, migraciju ćelija, hemotaksiju i auto i parakrinu sintezu faktora rasta indukovane kompozicijom nakon skladištenja identični efektima kompozicije pre krioprezervacije ili liofilizacije. Prema tome, krioprezervacija i/ili liofilizacija kompozicije nemaju efekta na biološku aktivnost u tkivu receptora.
[0061] Nečistoće se mogu preneti iz uzorka krvi u kompoziciju pronalaska. Prema tome, u jednom tehničkom rešenju, kompozicija dobijena postupkom pronalaska može da sadrži trombocite, crvene ćelije ili leukocite u količini manjoj od 1% ukupne količine komponenti u uzorku; na primer, manje od 0.5%, manje od 0.1%, posebno, manje od 0.001% trombocita, crvenih krvnih zrnaca ili leukocita od ukupne količine komponenti u uzorku
[0062] Drugi aspekt pronalaska se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži kompoziciju predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što će proceniti stručnjak u ovoj oblasti, nosači mogu biti izabrani na osnovu puta adminisdtriranja kako je opisano u nastavku, lokacije ciljanog problema, leka koji se isporučuje, vremenskog toka isporuke leka, itd. U jednom tehničkom rešenju, farmaceutski prihvatljiv nosač je odabran tako da ne utiče neopravdano na biološku aktivnost kompozicije pronalaska. Oni mogu uključivati emulgatore, soli, farmakološki prihvatljive pufere, veziva, sredstva za klizanje, lubrikanse, dezintegrante, zaslađivače, pigmente, ko-rastvarače, surfaktante, ulja, humektante, emolijense, konzervanse, stabilizatore, antioksidante ili njihove kombinacije.
[0063] Farmaceutska kompozicija se može administrirati subjektu na bilo koji način poznat u tehnici, poželjno usmeren na povređeno tkivo. Termin "subjekat" kako se ovde koristi, odnosi se na ljude kao i na one koji nisuljude. Na primer, oni koji nisu ljudi mogu biti sisari (npr., glodar, miš, pacov, zec, majmun, pas, mačka, primat, ili svinja).
[0064] U jednom tehničkom rešenju, kompozicija ili farmaceutska kompozicija koja je ovde stavljena na uvid može se čuvati u sterilnoj bočici za injekciju. Kompozicija ili farmaceutska kompozicija se može administrirati direktno na povređeno tkivo. U poželjnijom tehničkom rešenju, kompozicija se administrira, na primer, putem intraartikularne, subdermalne, subkutane, intravenske ili intratendinozne injekcije.
[0065] U tehničkom rešenju, kompozicija ili farmaceutska kompozicija je sterilni fiziološki vodeni rastvor bez ćelija sa složenim kompozicijama koji sadrži mešavinu faktora rasta i citokina koji pokazuju specifične obrasce koncentracije tkiva da bi se obezbedili optimalni regenerativni efekti specifični za tkivo.
[0066] U drugom tehničkom rešenju, pronalazak stavlja na uvid javnosti kompoziciju predmetnog pronalaska; za primenu u postupku lečenja bolesti, pri čemu se kompozicija administrira u tkivu koje sadrži ćelije istog tipa kao i ćelije specifične za tkivo koraka ko-kulture.
[0067] U drugom tehničkom rešenju, pronalazak stavlja na uvid javnosti kompoziciju predmetnog pronalaska; za primenu u postupku lečenja bolesti izabrane između tendinoze, preloma mišićnih fibrilara, tendinitisa, burzitisa, sinovitisa, artroze, lomljenja hrskavice, plućne bolesti, bolesti srca ili hondropatije; pri čemu se kompozicija administrira u tkivu koje sadrži ćelije istog tipa kao i ćelije specifične za tkivo u koraku ko-kulture.
[0068] Koraci postupka za dobijanje kompozicije za primenu kao što je gore navedeno treba da se tumače kao što je prethodno opisano za druga tehnička rešenja u predmetnom dokumentu.
[0069] Kompozicija, ili farmaceutska kompozicija, je za primenu u lečenju bolesti za koje je potrebna regenerativna medicina, popravka tkiva, regeneracija tkiva ili zarastanje tkiva. Bolest može biti bilo koja bolest koja zahteva zarastanje tkiva nakon što je pretrpela bilo kakav traumatski događaj. Termin "reparacija", kada se koristi u kontekstu zarastanja oštećenog tkiva, definiše se kao obnavljanje arhitekture i funkcije tkiva nakon povrede. Određena tkiva tela su sposobnija za ćelijsku proliferaciju (a samim tim i regeneraciju) od drugih. Regenerativna medicina je definisana kao lečenje bolesti koje zahtevaju regeneraciju oštećenih bioloških tkiva.
[0070] Kompozicija koja je ovde opisana je za primenu u lečenju tkiva koja su povređena i zahtevaju regeneraciju tkiva. U poželjnom tehničkom rešenju, faktori rasta i/ili citokini prisutni u kompoziciji su specifični za tkivo. To znači da su proizvedeni u kulturi koja se sastoji od M2-makrofaga i, kao ćelije specifične za tkivo, ćelije istog tipa ćelija koje čine deo tkiva koje treba oporaviti/lečiti/regenerisati. Ovo omogućava specifičan tretman tkiva sa specifičnim faktorima rasta i/ili citokinima koje proizvode ćelije istog tkiva. Eksperimentalno je pokazano da kompozicije specifične za tkivo - imaju poboljšana biološka svojstva, dajući bolje rezultate in vitro i in vivo u regeneraciji tkiva.
[0071] U poželjnijem tehničkom rešenju, kompozicija je za primenu u lečenju bolesti koja pripada oblasti odontologije, maksofacijalne hirurgije, sportske medicine, traumatologije, anesteziologije, upravljanja bolom, dermatologije, estetske medicine, plastične, rekonstruktivne i estetske hirurgije, reumatologije, neurologije, oftalmologije, opšte medicine, endokrinologije, uroginekologije, neurohirurgije, kardiologije, pneumologije, kardiovaskularne hirurgije ili rehabilitacije, između ostalih.
[0072] U poželjnijem tehničkom rešenju, kompozicija je za primenu kod tendinoze, preloma mišićnih fibrilara, tendinitisa, burzitisa, sinovitisa, artroze, lomljenja hrskavice, ili hondropatije [0073] U poželjnijem tehničkom rešenju, tretman je za primenu u regenerativnoj medicini.
[0074] U poželjnijem tehničkom rešenju, kompozicija, ili farmaceutska kompozicija za primenu u regenerativnoj medicini je usmerena na reparaciju tkiva izabranog iz grupe koja obuhvata hrskavično tkivo, koštovano tkivo, sinovijalno tkivo, tkivo rožnjače, nervno tkivo, masno tkivo, tkivo tetiva, ligamentno tkivo, mišićno tkivo, epitelno tkivo, endotelno tkivo, folikula dlake i bilo koje drugo tkivo ili specifičnu ćelijsku grupu bilo kog deo ljudskog ili životinjskog tkiva.
[0075] U specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji hrskavičnog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, hondrocita i/ili hondroblasta.
[0076] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji koštanog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, osteoblasta i/ili osteocita i/ili osteoklasta.
[0077] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji sinovijalnog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, fibroblastnih sinovijalnih ćelija ili ćelija tipa B i/ili sinovijalnih ćelija sličnih makrofagu.
[0078] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji kornealnog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, kornealnih epitelnih ćelija i/ili kornealnih endotelnih ćelija.
[0079] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji nervog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, neurona i/ili glijalnih i/ili Švanovih ćelija.
[0080] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji masnog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, adipocita.
[0081] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji tetivskog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, tenocita (fibrocita) i/ili tenoblasta (fibroblasta).
[0082] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji ligamentnog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, matičnih ćelija parodontalnog ligamenta i/ili fibrocita.
[0083] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji mišićnog tkiva dobija se korišćenjem ćelija specifičnih za tkivo, miocita.
[0084] Kompozicija za primenu u reparaciji epitelnog tkiva dobije se korišćenjem kao ćelija specifičnih za tkivo, epitelnih ćelija i/ili fibroblasta.
[0085] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji endotelnih tkiva dobije se korišćenjem kao ćelija specifičnih za tkivo, endotelnih ćelija.
[0086] Kompozicija za primenu u reparaciji folikula dlake dobije se korišćenjem kao ćelija specifičnih za tkivo, primarnih folikula dlake i/ili fibroblasta.
[0087] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu u reparaciji plućnog tkivo dobije se korišćenjem kao ćelija specifičnih za tkivo, ćelija koje potiču iz respiratornog epitela.
[0088] U poželjnijem tehničkom rešenju, kompozicija za primenu opisana u prethodnim tehničkim rešenjima, usmerena je na lečenje patelarne tendinoze, delimičnih mišićnih ruptura, upala Ahilove tetive, gonartroze, patelarne hondropatije, kidanja prednjeg ukrštenog ligamenta, dinamičke osteopatije pubisa ili uganuća ligamenta astragalusa.
[0089] Ovde je stavljen na uvid javnosti postupak za lečenje bolesti koja zahteva regeneraciju tkiva, koji obuhvata administriranje efikasne farmaceutske količine farmaceutske kompozicije opisane iznad. U poželjnom tehničkom rešenju, bolesti je odabrana iz grupe koja obuhvata endinozu, prelom mišićnih fibrilara, tendinitis, burzitis, sinovitis, artrozu, lomljenje hrskavice, respiratornu bolest, srčanu bolest, ili hondropatiju ili bilo koju drugu bolest koja zahteva regenerativnu medicinu.
[0090] U poželjnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu prema prethodnim tehničkim rešenjima se administrira subjektu različitom od subjekta donora monocita ili ćelija specifičnih za tkivo, to jest, kompozicija je za alogenu primenu.
[0091] U tehničkom rešenju, kompozicija predmetnog pronalaska se primenjuje na ciljno tkivo nakon završetka postupka njegovog dobijanja. Alternativno, u poželjnom tehničkom rešenju, kompozicija za primenu se kriokonzervira ili liofilizuje nakon koraka prikupljanja i odmrzne pre primene u lečenju bolesti. U poželjnijom tehničkom rešenju, kompozicija se odmrzava održavanjem kompozicije između 25 i 30 °C između 10 i 60 minuta.
[0092] Kompozicija predmetnog pronalaska se pokazala efikasnom u lečenju oštećenih tkiva, smanjujući vreme oporavka subjekta koji obuhvata oštećenje tkiva. Glavni razlog za uspeh kompozicije je prisustvo specifičnih faktora rasta i/ili citokina za svako specifično tkivo. Kompozicije su takođe posebno korisne jer održavaju svoju biološku funkciju uprkos tome što su bile kriokonzervirane ili liofilizovane.
[0093] U predmetnoj objavi, tehnički i naučni termini korišćeni u opisima ovde će imati značenja koja obično razumeju stručnjaci u ovoj oblasti tehnike, osim ako nije drugačije definisano.
PRIMERI
[0094] Primeri opisani u nastavku imaju za cilj da ilustruju ovaj pronalazak, ali bez ograničavanja njegovog obima.
Primer 1: Priprema kompozicije
[0095] Kese monocitne afereze (N=5 pacijenata) su centrifugirane u gradijentu gustine sa Ficollom 30 minuta na 400 xg. Sakupljen je srednji pojas mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Frakcija je isprana četiri puta sa uravnoteženim rastvorom soli. Ćelije su resuspendovane u medijumu za kulturu za brojanje ćelija korišćenjem TC-20 uređaja za brojanje ćelija (Biorad).
[0096] Dobijene ćelije su kultivisane u T175 pločama tokom 24 sata na 37 °C i monociti su odabrani prianjanjem na ploču za kulturu.
[0097] Monociti su ekstrahovani iz gradijentne frakcije i kultivisani u GMP medijumu (GIBCO® CTS™ AIM V® SFM, Thermofisher) bez fenol crvenog i bez antibiotika. Dodato je 100 µL dipeptivena na 100 mL medijuma za kulturu (1 µL /mL).
[0098] Monociti su diferencirani u M2-makrofage dodavanjem 10 ng/ml M-CSF i kultivisanjem četiri dana.
[0099] Primarne kulture ćelija, specifičnih za tkivo, kao što su humani hondrociti, humani sinoviociti, humane Švanove ćelije, ćelije humanih skeletnih mišića, humani osteoblasti i limfne endotelne ćelije, obezbedio je Innoprot (Derio, Španija). Humani tenociti su dobijeni iz Zen-Bio (NC, SAD), a humane mezenhimalne matične ćelije potiču iz primarnih kultura dobijenih iz uzoraka abdominalnog masnog tkiva.
[0100] Ćelije specifične za tkivo su kultivisane na 37 °C u posudama za kulturu prethodno tretiranim poli-lizinom u medijumu za kulturu kao što je opisano u nastavku dok se ne dobije dovoljan broj ćelija za eksperimente:
- Humani tenociti: 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 mL antibiotika (penicilin-streptomicin), 1 mL glutamina, 0.5 mL amfotericina B.
- Mezenhimalne matične ćelije: 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 mL antibiotika (penicilin-streptomicin), 1 mL glutamina, 0.5 mL amfotericina B.
- Ćelije humanih skeletnih mišića (miociti): 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 mL suplementa za rast ćelija skeletnih mišića (SKMCGS, Innoprot Ref: P10975), 1 mL antibiotika (penicilin-streptomicin), 1 mL glutamina, 0.5 mL amfotericina B.
- Humani hondrociti: 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 mL CGS (suplement za rast hondrocita, Innoprot Ref: P10970), 1 mL antibiotika (penicilin-streptomicin), 1 mL glutamina, 0.5 mL amfotericina B.
- Humane Švanove ćelije: 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 mL SCGS (suplement za rast Švanovih ćelija, Innoprot Ref: P10351), 1 mL antibiotika (penicilin-streptomicin), 1 mL glutamina, 0.5 mL amfotericina B.
- Humani sinoviociti: 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 mL SGS (suplement za rast sinovicita, Innoprot Ref: P10972), 1 mL antibiotika.
- Humane limfne endotelne ćelije (LEC): 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 ml ECGS (suplementa za rast endotelnih ćelija, Innoprot Ref: ECGS),1 mL antibiotika (penicilin-streptomicin), 1 mL glutamine, 0.5 mL amfotericina B.
- Humani osteoblasti: 100 mL alfa-MEM, 240 µL heparina, 5 mL liziranih trombocita, 1 ml OGS (suplementa za rast osteocita, Innoprot Ref: P10979), 1 mL antibiotika (penicilin-streptomicin), 1 mL glutamina, 0.5 mL amfotericina B.
[0101] Ćelije specifične za tkivo su zatim zajedno kultivisane sa M2-makrofazima. Kokultura makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo je izvedena korišćenjem Transwell umetaka (Corning) korišćenjem specifičnog odnosa M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo nakon čega je usledila inkubacija na 37°C i 5 % CO2 u Gibco medijumu bez seruma. Svaka ko-koltura i i eksperimentalno stanje su analizirani u duplikatu ili tri primerka.
[0102] Tačnije, za ploče za kulturu sa 6 bunarića 2 miliona monocita/makrofaga je zasejano po umetku (750.000 za ploče sa 12 bunarića). Za ćelije specifične za tkivo u svakoj ko-kulturi zasejano je između 50.000 i 100.000 ćelija po bunariću (25.000-50.000 u pločama za kulturu sa 12 bunarčića). Ukupna zapremina po korišćenom bunariću varirala je od 2,25 (12-bunarića) do 3,5 ml (6-bunarića). Bunarići za kulturu su zatim inkubirani na 37°C i 5% CO2 najmanje 4 dana a maksimalno 28 dana. Supernatanti kulture su dobijani svaka 3-4 dana, a medijum za kulturu je svaki put menjan svežim medijumom. Sakupljeni medijum koji sadrži faktore rasta i citokine je zatim centrifugiran na 3000 ob/min tokom 10 minuta i supernatant je čuvan na -80°C za dalju analizu.
Primer 2: Analiza kompozicije
[0103] Kada su ćelije specifične za tkivo prethodno zamrznute, odmrzavanje je sprovedeno zasejavanjem ćelija u T75 ploče sa PLL i dodavanjem 20 mL medijuma za kulturu, osim humanih tenocita i mezenhimalnih matičnih ćelija, koje su centrifugirane na 400 g tokom 7 minuta pre dodavanje ćelija u medijum za kulturu. Različite interne kontrole su korišćeni u svakom eksperimentu: monociti svakog pacijenta sami i ćelije specifične za tkivo.
[0104] Citokini i faktori rasta u kompozicijama dobijenim od 5 različitih pacijenata korišćenjem 8 različitih ćelija specifičnih za tkivo su kvantifikovani Multiplex analizom korišćenjem Multiplex tehnologije (Procarta Plex23 (PPX-23), Merck Millipore) i takođe pojedinačno pomoću ELISA kompleta (humani IGF-1, ref EH0165, Fine test; humani TGF-beta 3, ref EH0289 Fine Test; humani BMP-6, ref.EHBMP6; humani VEGF-C, ref BMS297-2; humani TGF beta 1, ref BMS249-4; humani IL-1B, ref BMS224-2; humani IL-4, ref BMS225-2) . Sledeća jedinjenja su sva zajedno analizirana u Multiplex testu:, faktor rasta izveden iz trombocita BB (PdGF BB), , vaskularni endotelni faktor rasta A (VEGFA,), epidermalni faktor rasta (EGF), interleukin 2 (IL 2), interleukin 6 (IL 6), interleukin 8 (IL 8), interleukin 10 (IL 10), interleukin IL-12p70 (IL 12p70), adiponektin, faktor rasta fibroblasta 2 (FGF-2) , GM-CSF, HGF, IL-1RA, Leptin, MCP-1, MIP-1 alfa, MMP-1, MMP-3, NGF beta, RANTES, TIMP-1, TRAIL i faktor nekroze tumora alfa (TNF alfa). Pratili smo protokol prema uputstvima proizvođača.
[0105] Rezultati dobijeni u multiplex testovima su kvantifikovani u Luminex LabScan 100 (Luminex), a ti rezultati iz ELISA testova su mereni korišćenjem iMark čitača apsorpcije mikroploče (Biorad). Izmereni nivoi iz svih uzoraka i faktora su interpolirani korišćenjem internih standardnih krivih da bi se dobila koncentracija, a svi rezultati su izraženi u pg/ml na slici 1 i slici 2.
[0106] Faktori rasta PDGF, TGF- β, IGF 1, VEGF i EGF povezani su sa migracijom i proliferacijom ćelija, igrajući važnu ulogu u zarastanju mišićnih povreda. Štaviše, IL-1 beta i IL-6 su proinflamatorni interleukini, dok je IL-10 antiinflamatorni interleukin. Ravnoteža među njima modulira inhibitorne ili stimulativne signale tokom procesa zapaljenja, u autokrinom, parakrinom i endokrinom obliku.
[0107] Modifikacija kompozicije, na osnovu biohemijskog profila, medijuma uslovljenog antiinflamatornim makrofazima M2 (M2-CM) dobijenim opisanom postupkom ko-kulture je specifičan za svako tkivo, sa specifičnim molekularnim obrascima ili potpisima (slika 3) koji optimizuju prirodni regenerativni proces svakog tkiva. Dobijeni obrasci pokazuju da koncentracije različitih proučavanih molekula održavaju iste relativne proporcije među njima, a ove proporcije su specifične za svako tkivo.
[0108] Tako dobijene kompozicije specifične za tkivo održavaju tipična antiinflamatorna svojstva sekretoma M2 makrofaga, kao što su visoke koncentracije IL-1 RA (IL-1 β antagonista), ali su modifikovane da bi se dobila veća koncentracija, na primer, IGF -1 ili HGF; prvi, je povišen u svim različitim kondicioniranim medijima specifičnim za tkivo, dok je drugi značajno više koncentrisan samo u kondicioniranom mediju specifičnom za mišićno tkivo (sl.2). Slično, može se primetiti kako je svaka modifikacija M2-CM specifična za svako tkivo od interesa, koncentrišući, smanjujući ili održavajući relativne nivoe svakog citokina ili faktora rasta posebno (sl. 3). Mnoge druge koncentracije molekula su modifikovane u proizvodima dobijenim opisanim postupkom, ali uvek zadržavajući iste specifične obrasce tkiva za navedene molekule. U stvari, koncentrovane formulacije bilo centrifugiranjem, liofilizacijom, sušenjem, vakuumom, kolonama za prečišćavanje, ili bilo kojim drugim metodama će zadržati opisane obrasce modifikacije ili potpise kompozicija specifične za tkivo.
Primer 3: Klinički test
[0109] Kompozicije specifične za tkivo dobijene kao što je opisano u primeru 1 su testirane u lečenju povreda mišića, tetiva, ligamenata, hrskavica i kostiju kod ukupno 327 pacijenata koji su bolovali od bilo koje od ovih povreda. Svaka kompozicija je dobijena kultivisanjem M2-makrofaga sa ćelijama istog tipa kao i ciljno tkivo. Kompozicije specifične za tkivo su zamrznute na -35 °C, kriokonzervirane na -86 °C, i odmrznute pre njihove kliničke upotrebe.
[0110] Pacijenti su se bavili sportskim aktivnostima kao što su fudbal, tenis, trčanje, atletika, treking, veslanje i košarka. Starost ispitanika bila je između 15 i 58 godina (prosečna starost 36 godina). 67% pacijenata su bili muški ispitanici, a 33% ženski ispitanici.
[0111] Povrede u svakom slučaju su klasifikovane prema Rutlijevoj skali patelarne tendinopatije, kao što je prikazano u tabeli 1 (Rutli M i sarad., 2010. N Am J Sports Phys Ther 5(3):166).
Tabela 1. Faze patelarne tendinopatije
[0112] Subjekti tretirani u testu su klasifikovani kako je naznačeno u tabeli 2 prema nivou povrede za svaki slučaj:
Tabela 2. Klasifikacija pacijenata prema vrsti i težini povrede.
[0113] Da bi se procenio oporavak tkiva subjekta, korišćen je VISA skor (Victoria Institute of Sport Assessment, Visentini PJ i sarad., 1998. J Sci Med Sport 1(1):22).
Primer 4: Lečenje patelarne tendinoze
[0114] Odabrano je 22 subjekata koji boluju od patelarne tendinoze (ili tendinopatije). Patelarna tendinoza je mišićnoskeletni poremećaj koji pogađa i rekreativne i elitne sportiste, potencijalno dovodeći do invaliditeta koji traje nekoliko meseci. 12 od ovih subjekata imalo je početnu fazu II, a 10 je bolovalo od početne faze III. Da bi se procenio oporavak tkiva subjekata, korišćen je VISA skor.
[0115] Kompozicija, koja je dobijena zajedničkim kultivisanjem sa tenocitima, ubrizgana je u patelarnu tetivu subjekta. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon ubrizgavanja kompozicije, u kojoj su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon lečenja rađeni su 10 dana nakon implantacije.
[0116] Slika 4 prikazuje evoluciju procenta razmere svake faze bolesti, od dana 0 (kontrola) do 27. dana.
[0117] Skoro 50% pacijenata sa povredama faze II koji su lečeni kompozicijom moglo je da se vrati sportskoj praksi 3. dana nakon tretmana (PRS). 18. dana, svi ovi pacijenti su se bavili sportom. Štaviše, vreme oporavka pacijenata bilo je čak i kraće od drugih tretmana, kao što je PRS. Nakon 27 dana, svi pacijenti sa povredama faze III vratili su se normalnoj sportskoj aktivnosti.
Primeri 5: Lečenje tendinitisa Ahilove tetive
[0118] Odabrano je 19 subjekata koji boluju od patelarne tendinoze (ili tendinopatije). Patelarna tendinoza je mišićnoskeletni poremećaj koji pogađa i rekreativne i elitne sportiste, potencijalno dovodeći do invaliditeta koji traje nekoliko meseci. 8 od ovih subjekata imalo je početnu fazu II a 11, bolovalo je od početne faze III.
[0119] Kompozicija, koja je dobijena zajedničkim kultivisanjem sa tenocitima, ubrizgana je u omotač tetive i u tetivu u aseptičnim uslovima u patelarnu tetivu subjekata. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon ubrizgavanja kompozicije, pri čemu su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon lečenja rađeni su 10 dana nakon implantacije.
[0120] Slika 5 prikazuje evoluciju procenta razvoja svake faze bolesti, od dana 0 (kontrola) do 30. dana. 6. dana, više od 50% pacijenata sa povredama faze II koji su tretirani kompozicijom moglo bi se vratiti na sportsku praksu nakon tretmana (PRS).
Primer 6: Lečenje kidanja mišića
[0121] Odabrano je 47 subjekata koji pate od kidanja mišića. 28 subjekata je bolovalo od tetive kolena, a 19 je pretrpelo rupturu prednjeg desnog kvadricepsa.24 subjekta je imala početnu fazu II a 23, je bolovalo od početne faze III. Da bi se procenio efekat kompozicije kod svakog subjekta, procenjen je procenat igrača koji su se nakon tretmana vratili sportskoj aktivnosti (RTP).
[0122] Kompozicija, koja je dobijena zajedničkim kultivisanjem sa miocitima, ubrizgana je u omotač tetive i u tetivu u aseptičnim uslovima u patelarnu tetivu subjekta. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon ubrizgavanja kompozicije, u kojoj su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon lečenja rađeni su 10 dana nakon implantacije.
[0123] Slika 6 prikazuje rezultat lečenje sa procentom pacijenata koji su se vratili sportskoj aktivnosti u određenom danu. Kod povreda stepena II, više od 50% pacijenata lečenih PRS vratilo se sportu 10. dana nakon lečenja, pri čemu 100% 15. dana nakon završetka lečenja.
[0124] Da bi se procenila progresija oporavka od povrede, izvršeno je praćenje jednog od pacijenata, muškarca starog 36 godina sa fibrilarnim rascepom donje trećine bicepsa femorisa, kako bi se procenilo zarastanje mišića. Slika 7 prikazuje rezultat ehografije urađen dan pre lečenja (-1), 4. dan posle lečenja (+4) i 8. dan posle lečenja (+8).
[0125] Iz ovih rezultata, može se zaključiti da su se pacijenti na kojima je primenjena kompozicija, poboljšali tokom lečenja, oporavljali se od povreda.
Primer 7: Lečenje gonartroze
[0126] Odabran je 71 subjekt koji boluje od gonartroze.45 subjekata je imalo početnu fazu II, a 26 je bolovalo od početne faze. III. Da bi se procenio efekat kompozicije kod svakog subjekta, procenjena je funkcionalna i skala bolova u kolenu WOMAC skala (The Western Ontario i McMaster Universities Osteoarthritis Index).
[0127] Kompozicija, koja je dobijena zajedničkim kultivisanjem sa hondrocitima, ubrizgana je intraartikularno u aseptičnim uslovima u patelarnu tetivu subjekata. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon ubrizgavanja kompozicije, u kojoj su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon lečenja rađeni su 10 dana nakon implantacije.
[0128] Slika 8 prikazuje rezultat lečenja sa procentom pacijenata koji su se vratili sportskoj aktivnosti u određenom danu. Kod povreda stepena II, više od 60% pacijenata lečenih PRS vratilo se sportu 7. dana nakon lečenja, 100% 35. dana nakon završetka lečenja.
[0129] Iz ovih rezultata može se zaključiti da su se pacijenti na koje je preparat primenjen, poboljšali tokom lečenja, oporavljajući se od povreda.
Primer 8: Lečenje hondromalacije patele
[0130] Odabrano je 66 subjekata koji boluju od gonartroze.34 subjekta su imala početnu fazu II, a 32 su bolovala od početne faze III. Da bi se procenio efekat kompozicije kod svakog subjekta, procenjena je međunarodna KOOS skala za procenu funkcije i bola kolena (Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score.
[0131] Kompozicija, koja je dobijena zajedničim kultivisanjem sa hondrocitima, ubrizgana je intraartikularno u aseptičnim uslovima u patelarnu tetivu subjekta. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon iubrizgavanja kompozicije, u kojoj su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon tretmana rađeni su 10 dana nakon implantacije [0132] Slika 9 prikazuje rezultat lečenja sa procentom pacijenata koji su se vratili sportskoj aktivnosti u određenom danu (RTP, povratak u igru).
Primer 9: Lečenje rupture prednjeg ukrštenog ligamenta (ACL)
[0133] 14 subjekata koji boluju od gonartroze je odabrano.8 subjekata je imalo početnu fazu II, a 6 je bolovalo od početne faze III. Da bi se procenio efekat kompozicije kod svakog subjekta, procenjena je KOOS skala. Slučaj faze III je bio pod plastičnom operacijom semtendinozusa.
[0134] Kompozicija, koja je dobijena zajedničkom kultivisanjem sa tenocitima, ubrizgana je intraartikularno u aseptičnim uslovima u patelarnu tetivu subjekta. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon ubrizgavanja kompozicije, u kojoj su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon lečenja rađeni su 10 dana nakon implantacije.
[0135] Slika 10 prikazuje rezultat lečenja sa procentom pacijenata koji su se vratili sportskoj aktivnosti u određenom danu.
Primer 10: Lečenje dinamičke osteopatije pubisa (DOC)
[0136] 38 subjekata koji boluju od DOC je odabrano.18 subjekata je imalo početnu fazu II, 12 je bolovalo od početne faze III, a 8 od početne faze IV. Da bi se procenio efekat kompozicije kod svakog subjekta, procenjen je procenat igrača koji su se nakon lečenja vratili sportskoj aktivnosti (RTP).
[0137] Kompozicija, koja je dobijena zajedničkom kultivisanjem sa hondroblastima, je ubrizgana intraartikularno u aseptičnim uslovima u patelarnu tetivu subjekata. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon ubrizgavanja kompozicije, u kojoj su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon lečenja rađeni su 10 dana nakon implantacije.
[0138] Slika 11 prikuje rezultat lečenja sa procentom pacijenata koji su se vratili sportskoj aktivnosti u određenom danu.
Primer 11: Lečenje uganuća fibularnog ligamenta astragalusa (AFL)
[0139] 50 subjekata koji boluju od LPA je odabrano. 35 subjekata je imalo početnu fazu II, a 15 je bolovalo od početne faze III. Da bi se procenio efekat kompozicije kod svakog subjekta, procenjena je FAAM skala (Foot and Ankle Ability Measure.
[0140] Kompozicija, koja je dobijena zajedničkom kultivisanjem sa osteocitima, ubrizgana je intraartikularno u aseptičnim uslovima u patelarnu tetivu subjekta. Pacijenti su praćeni 10 dana, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon ubrizgavanja kompozicije, u kojoj su procenjeni podaci VISA skale. Pored toga, prethodni i ultrazvuk nakon lečenja rađeni su 10 dana nakon implantacije.
[0141] Slika 12 prikazuje rezultate lečenja sa procentom pacijenata koji su se vratili sportskoj aktivnosti u određenom danu.

Claims (26)

Patentni zahtevi
1. Postupak za dobijanje kompozicije za regeneraciju tkiva, koji obuhvata sledeće korake:
- obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanja M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferencijaciju prečišćenih monocita u M2-makrofage;
- zajedničko kultivisanje M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma; i
- sakupljanje supernatanta ko-kulture,
pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 40:1.
2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu su M2-makrofazi zajednički kultivisani sa ćelijama specifičnim za tkivo na temperaturi između 30 i 40°C.
3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu su M2-makrofazi zajednički kultivisani sa ćelijama specifičnim za tkivo tokom perioda od 3 do 28 dana.
4. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 20:1.
5. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu se ko-kultura izvodi u hipoksiji.
6. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time da korak diferencijacije prečišćenih monocita u M2-makrofage obuhvata kultivisanje monocita u medijumu bez seruma u prisustvu faktora koji stimuliše koloniju makrofaga (M-CSF).
7. Postupak prema zahtevu 6, naznačen time da korak diferencijacije prečišćenih monocita u M2-makrofage obuhvata kultivisanje monocita u medijumu bez seruma u prisustvu faktora koji stimuliše koloniju makrofaga (M-CSF) tokom 3-5 dana.
8. Postupak prema zahtevima 1 do 7, pri čemu su monociti autologni ili alogeni.
9. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji dalje obuhvata korake krioprezervacije ili liofilizacije sakupljenog supernatanta.
10. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu ćelije specifične za tkivo su ćelije koje odgovaraju tkivu koje se regeneriše.
11. Postupak prema zahtevu 10, pri čemu su ćelije specifične za tkivo autologne ili alogene.
12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu su ćelije specifične za tkivo odabrane iz grupe koja se sastoji od miocita, mišićnih skeletnih ćelija, mišićnih satelitskih ćelija, tenocita, osteocita, Švanovihovih ćelija, dermalnih fibroblasta, hondrocita, sinoviocita, limfocita, ćelija folikula dlake, ćelija miokarda, ćelija iz respiratornog epitela, limfnih endotelnih ćelija ili mezenhimalnih matičnih ćelija ili njihovih kombinacija.
13. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 12, pri čemu se korak zajedničkog kultivisanja M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma izvodi u Transwell-u.
14. Kompozicija za regeneraciju tkiva dobijena postupkom koji obuhvata sledeće korake:
- obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanja M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferencijaciju prečišćenih monocita u M2-makrofage;
- zajedničko kultivisanje M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma; i
- sakupljanje supernatanta ko-kulture,
pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 40:1, pri čemu su ćelije specifične za tkivo odabrane iz grupe koja se sastoji od miocita, mišićnih skeletnih ćelija, mišićnih satelitskih ćelija, tenocita, osteocita, Švanovih ćelija, dermalnih fibroblasta, hondrocita, sinoviocita, limfocita, ćelija folikula dlake, ćelija miokarda, ćelija iz respiratornog epitela, limfnih endotelnih ćelija ili mezenhimalnih matičnih ćelija ili njihovih kombinacija i pri čemu M2-makrofazi se zajedno kutlivišu sa ćelijama specifičnim za tkivo tokom perioda od 3 do 28 dana.
15. Kompozicija prema zahtevu 14, pri čemu se korak zajedničkog kultivisanja M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma izvodi u Transwell-u.
16. Kompozicija prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, pri čemu su ćelije specifične za tkivo odabrane iz grupe koja se sastoji od tenocita, mezenhimalnih matičnih ćelija, miocita, hondrocita, Švanovih ćelija, sinoviocita, limfnih endotelnih ćelija ili osteoblasta.
17. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 14 do 16, pri čemu je ukupna količina trombocita, crvenih krvnih zrnaca ili leukocita u kompoziciji manja od 0.1% ukupne količine komponenti u uzorku.
18. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 14 do 17, pri čemu sadrži trombocite, crvene ćelije ili leukocite u količini manjoj od 0.001% ukupne količine komponenti u uzorku.
19. Farmaceutska kompozicija koja sadrži kompoziciju prema zahtevima 14 do 18 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
20. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 14 do 18 za primenu u postupku lečenja bolesti, pri čemu se kompozicija administrira u tkivo koje sadrži ćelije iste vrste kao što su ćelije specifične za tkivo.
21. Kompozicija za primenu prema zahtevu 20, pri čemu je bolest odabrana od tendinoze, preloma mišićnih fibrilara, tendinitisa, burzitisa, sinovitisa, artroze, lomljenja hrskavice, respiratorne bolesti, srčane bolesti ili hondropatije.
22. Kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 20 ili 21, pri čemu je bolest odabrana od patelarne tendinoze, delimičnih mišićnih ruptura, Ahilove tetive, gonartroze, patelarne hondropatije, kidanja prednjeg ukrštenog ligamenta, dinamičke osteopatije pubisa ili uganuća astragalnog ligamenta.
23. Kompozicija za primenu prema zahtevima 20 do 22, pri čemu se kompozicija administrira subjektu koji je drugi nego subjekt donor monocita ili ćelija specifičnih za tkivo.
24. Kompozicija za primenu prema zahtevima 20 do 23, pri čemu je kompozicija kriokonzervirana ili liofilizovana.
25. Kompozicija za primenu prema zahtevima 21 do 24, pri čemu se kompozicija administrira u tkivo koje sadrži ćelije iste vrste kao što su ćelije specifične za tkivo.
26. Postupak za modifikovanje kompozicije faktora rasta i/ili citokina medijuma za kulturu u kulturi M2-makrofaga, koji obuhvata:
- obezbeđivanje M2-makrofaga, pri čemu ovaj korak obezbeđivanja M2-makrofaga obuhvata prečišćavanje monocita iz uzorka i diferencijaciju prečišćenih monocita u M2-makrofage; i
- zajedničko kultivisanje M2-makrofaga sa ćelijama specifičnim za tkivo u medijumu bez seruma,
pri čemu je kompozicija faktora rasta i/ili citokina medijuma za kulturu modifikovana u poređenju sa kompozicijom faktora rasta i/ili citokina medijuma za kulturu u kulturi M2-makrofaga bez ćelija specifičnih za tkivo u medijumu bez seruma, pri čemu odnos M2-makrofaga prema ćelijama specifičnim za tkivo u ko-kulturi je 1:1 do 40:1.
RS20240093A 2019-04-03 2020-04-02 Kompozicija za regeneraciju tkiva, postupak proizvodnje i njena primena RS65119B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19382247.5A EP3719119B8 (en) 2019-04-03 2019-04-03 Tissue-specific growth factors, method of production and uses thereof
EP20715377.6A EP3947648B1 (en) 2019-04-03 2020-04-02 Composition for tissue regeneration, method of production and uses thereof
PCT/EP2020/059365 WO2020201404A1 (en) 2019-04-03 2020-04-02 Composition for tissue regeneration, method of production and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65119B1 true RS65119B1 (sr) 2024-02-29

Family

ID=66240019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240093A RS65119B1 (sr) 2019-04-03 2020-04-02 Kompozicija za regeneraciju tkiva, postupak proizvodnje i njena primena

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20220169987A1 (sr)
EP (2) EP3719119B8 (sr)
CN (1) CN113825833A (sr)
AU (1) AU2020252248B2 (sr)
BR (1) BR112021019745A2 (sr)
CA (1) CA3135661A1 (sr)
CL (1) CL2021002567A1 (sr)
CO (1) CO2021014689A2 (sr)
CR (1) CR20210549A (sr)
DO (1) DOP2021000207A (sr)
EC (1) ECSP21078755A (sr)
ES (2) ES3009758T3 (sr)
HR (1) HRP20240153T1 (sr)
HU (1) HUE065101T2 (sr)
MX (1) MX2021012141A (sr)
PE (1) PE20220424A1 (sr)
PL (1) PL3947648T3 (sr)
PT (1) PT3719119T (sr)
RS (1) RS65119B1 (sr)
WO (1) WO2020201404A1 (sr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12285636B2 (en) 2021-08-05 2025-04-29 The University Of Washington Non-planar holographic beam shaping lenses for acoustics

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9950035B2 (en) * 2013-03-15 2018-04-24 Biomet Biologics, Llc Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders
TWI640631B (zh) * 2017-08-16 2018-11-11 國立屏東科技大學 Macrophage conditioned medium, dressing, preparation method and use thereof for promoting wound healing

Also Published As

Publication number Publication date
PE20220424A1 (es) 2022-03-29
ES2971499T3 (es) 2024-06-05
CL2021002567A1 (es) 2022-06-17
HRP20240153T1 (hr) 2024-04-26
PL3947648T3 (pl) 2024-04-15
BR112021019745A2 (pt) 2021-12-21
EP3719119A1 (en) 2020-10-07
EP3719119B1 (en) 2024-11-13
HUE065101T2 (hu) 2024-05-28
EP3947648C0 (en) 2023-11-15
EP3947648B1 (en) 2023-11-15
PT3719119T (pt) 2024-12-18
AU2020252248A1 (en) 2021-11-25
US20220169987A1 (en) 2022-06-02
ES3009758T3 (en) 2025-03-31
DOP2021000207A (es) 2021-11-21
EP3719119B8 (en) 2026-02-18
MX2021012141A (es) 2021-11-03
EP3947648A1 (en) 2022-02-09
CR20210549A (es) 2021-11-30
CN113825833A (zh) 2021-12-21
WO2020201404A1 (en) 2020-10-08
AU2020252248B2 (en) 2026-03-26
CA3135661A1 (en) 2020-10-08
EP3719119C0 (en) 2024-11-13
ECSP21078755A (es) 2021-12-30
CO2021014689A2 (es) 2021-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Muthu et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies
CN116555174B (zh) 一种关节修复蛋白组合物及其制备方法和其应用
TWI908184B (zh) 含有粒線體之組合物及其用途
KR20190107686A (ko) 골 및 연골 손상 또는 질환의 예방 및 치료
Damianakis et al. Stem cell therapy for spinal cord injury: a review of recent clinical trials
KR20160105363A (ko) 건 또는 인대 손상 치유를 위한 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포 조성물 및 이의 제조방법
US20120177619A1 (en) Composition comprising a haematic component and its use for the treatment of degenerative joint disease
Del Buono et al. Platelet rich plasma and tendinopathy: state of the art
Acosta IV et al. New Approach with Personalized Platelet-Rich Plasma
EP3947648B1 (en) Composition for tissue regeneration, method of production and uses thereof
KR20150138700A (ko) 건 또는 인대 손상 치유를 위한 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포 조성물 및 이의 제조방법
HK40057167A (en) Composition for tissue regeneration, method of production and uses thereof
Abd El-Rahman et al. Repair of experimentally induced femoral chondral defect in a rabbit model using Lyophilized growth promoting factor extracted from horse blood platelets (L-GFequina)
Khare et al. Plate-rich plasma and its utility in clinical conditions: a systematic review
KR20090119428A (ko) 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물
Leonova et al. A systematic review of the safety and efficacy of platelet-rich plasma for the treatment of posttraumatic knee osteoarthritis
RU2646791C1 (ru) Средство для кошек, обладающее регенеративной активностью
RU2646793C1 (ru) Средство для собак, обладающее регенеративной активностью
Moorman Regenerative therapies: what is available and how to use them.
Grassi et al. Orthobiologics for the treatment of muscle lesions
Williams et al. Platelet-rich plasma and other cellular strategies in orthopedic surgery
Leong et al. Autologous growth factors: a biological treatment in sports medicine
RU2646792C1 (ru) Средство для лошадей, обладающее регенеративной активностью
Alhomrani Regenerative Medicine Therapies for Osteoarthritis and Cartilage
KR20240101473A (ko) 연골 분화능이 증진된 줄기세포의 선별 방법 및 이를 포함하는 세포 치료제