RS65150B1 - Pirol-supstituisan derivat indolona ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i postupak njihove pripreme i njihova primena - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovo otkriće se odnosi na oblast medicine, posebno na pirol-supstituisani derivat indolona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i na postupak njihove pripreme i njihovu primenu.

Stanje tehnike

[0002] Leukemija je vrsta maligne klonalne bolesti hematopoetskih matičnih ćelija, poznata i kao kancer krvi. Akutna mijeloidna leukemija (AML) je najčešća akutna leukemija kod odraslih, koja čini 40% ukupne incidence leukemije i oko 80% ukupne incidence akutne leukemije. Uzrok AML je abnormalna proliferacija i diferencijacija nezrelih mijeloidnih progenitorskih ćelija koja je rezultat abnormalne diferencijacije primitivnih hematopoetskih matičnih ćelija i progenitorskih ćelija. (Gilliland, D.G. et al. Cancer Cell, 2002, 1, 417.). Trenutni postupci lečenja AML uglavnom uključuju terapiju lekovima i transplantaciju koštane srži. Terapija lekovima se uglavnom odnosi na tradicionalnu hemoterapiju, koja se može podeliti u dve faze tretmana indukcione remisije i tretmana posle remisije. Trenutno, indukcioni tretman remisije za AML se i dalje zasniva na antraciklinskim antitumorskim antibioticima u kombinaciji sa citarabinom. Tretman posle remisije obuhvata intenzivan konsolidacioni tretman, tretman održavanja i prevenciju i lečenje leukemije centralnog nervnog sistema, a generalno se bira kombinovana hemoterapija sa visokim dozama citarabina. Poslednjih godina, kroz unapređenje suportivnog lečenja i povećanje intenziteta hemoterapije, poboljšana je efikasnost hemoterapije. Ukupna stopa potpune remisije hemoterapije za pacijente sa AML može da dostigne 50% do 70%, a dugoročna stopa preživljavanja bez bolesti je 25% do 30%. Međutim, zbog značajne individualne heterogenosti i visoke stope recidiva AML, značajan deo pacijenata i dalje ima loše rezultate ili recidiv. Transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) je pouzdani postupak za izlečenje AML. Ipak, pacijenti i dalje imaju rizik od recidiva nakon transplantacije. Stopa recidiva kod pacijenata sa standardnim rizikom je 8% do 12%, a kod pacijenata sa visokim rizikom stopa recidiva može da dostigne 39% do 74%. Ponovna pojava posle transplantacije jedan je od glavnih razloga neuspeha transplantacije.

[0003] Istraživanje i razvoj novih lekova za lečenje AML kako bi se poboljšala efikasna stopa terapije lekovima i produžio preživljavanje je i dalje hitna potreba za pacijente sa AML. FMS-slična tirozin kinaza 3 (FLT3) je novo terapeutsko ciljno mesto za AML koje je privuklo veliku pažnju poslednjih godina.

[0004] Studije pokazuju da se FLT3 protein uglavnom eksprimira u normalnim prekursorima mijeloidnih i limfoidnih ćelija, i eksprimira se kod 70% do 90% ćelija AML i akutne limfocitne leukemije. FLT3 protein pripada porodici protein tirozin kinaze (PTK), koju su nezavisno i odvojeno otkrile istraživačka grupa Rosnet i istraživačka grupa Matthews 1991. Protein FLT3 pripada porodici proteina tirozin receptora III, i sastoji se od ekstracelularnog domena koji sadrži pet imunoglobulina, transmembranskog domena, jukstamembranskog fragmenta i citoplazmatskog regiona. Veliki broj studija pokazuje da su mutacija i abnormalna aktivacija proteina tirozin kinaze FLT3 usko povezani sa pojavom i razvojem AML (Marrin, C. et al. Blood, 2014, 124, 3.). Prvi tip mutacije je tandemska duplikacija fragmenta jukstamembrane (Internal Tandem Duplication, ITD), koja čini oko 23% mutacija FLT3 proteina. Drugi tip mutacije je tačkasta mutacija aktivacionog domena (Tyrosine Kinase Domain, TKD), koja čini oko 8% mutacija u FLT3 proteinu. Treći tip mutacije je tačkasta mutacija u fragmentu jukstamembrane, koja čini oko 2% mutacije FLT3 proteina. Nakon mutacije proteina FLT3, on će izazvati dimerizaciju proteina FLT3, što zauzvrat dovodi do autofosforilacije receptora. U isto vreme, aktivacioni domen u citoplazmi se približava membrani, a intracelularni supstrat se lakše kombinuje sa aktivnim mestom vezivanja FLT3, što rezultira aktivacijom FLT3. Nakon aktivacije FLT3, FLT3 aktivira nishodni Ras put i put fosfatidil inozitol 3-kinaze (PI3K), a zatim reguliše apoptotičke i anti-apoptotičke faktore u putevima tako da utiče na rast ćelije, proliferaciju i preživljavanje kako bi se postigao efekat inhibicije rast tumora (Choudhari, C. et al. Int. J. Hematol., 2005, 82, 93-99.). S obzirom na ulogu FLT3 u nastanku i razvoju AML, protein FLT3 se može koristiti kao važno ciljno mesto za lečenje AML. Stoga, razvoj efikasnih, bezbednih i niskotoksičnih inhibitora FLT3 ima određenu naučnu vrednost i društveni značaj za lečenje AML.

[0005] Sunitinib je multi-ciljni inhibitor tirozin kinaze koji je razvio Pfizer. On uglavnom inhibira PDGFR-β i VEGFR-2 u vaskularnim endotelnim ćelijama da bi imao efekat antineoangiogeneze, a takođe može delovati na tumorske ćelije sa abnormalno aktiviranim RTK da bi imao direktan antitumorski efekat. FDA je 2006. godine odobrila Sunitinib da uđe na tržište za lečenje gastrointestinalnih stromalnih tumora i karcinoma bubrežnih ćelija, a kasnije je odobren za lečenje progresivnih neuroendokrinih tumora pankreasa (pNET) koji se ne mogu hirurški ukloniti ili su se proširili (metastaza). Sunitinib ima snažan inhibitorni efekat na VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-β, c-Kit, FLT3 i druge receptorske tirozin kinaze: VEGFR-1 (IC50: 15.1 nM), VEGFR-2 (IC50: 38.1 nM), VEGFR-3 (IC50: 30.6 nM), PDGFR-β (IC50: 55.1 nM), c-Kit (IC50: 211.34 nM), CSF-1R (IC50: 35.6 nM), FIT3 (IC50: 21.5 nM) (PWManley et al. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1697, 17.). Iako se FLT3 može inhibirati na nivou nM, Sunitinib takođe ima značajnu inhibitornu aktivnost protiv VEGFR, PDGFR i slično povezanih sa neoangiogenezom. Pokazano je da je sunitinib neselektivni inhibitor FLT3, i da ima jaku inhibitornu aktivnost protiv FLT3-ITD i FLT3-TKD sa FLT3 mutacijom. Sunitinib može inhibirati fosforilaciju posredovanu FLT3 in vitro, indukovati ćelijsku apoptozu i inhibirati in vitro proliferaciju FLT3-ITD pozitivnih sojeva ćelija. Oralna primena od 20 mg/kg/d pokazala je značajan inhibitorni efekat tumora u modelu tumora ksenografta golih miševa MV-4-11 (FLT3-ITD). Jedna primena može da održi inhibitorni efekat fosforilacije FLT3-ITD tokom 16 sati. (Anne-Marie O'Farrell, Tinya J. Abrams, et al. Blood, 2003, 101(9), 3597.)

[0006] U kliničkoj studiji faze I, odabrano je 29 pacijenata sa AML koji su bili refraktorni i koji su imali recidiv ili nisu bili pogodni za standardni tretman da prime jednu dozu Sunitiniba od 50 mg do 350 mg. Uočena je podnošljivost i sprovedena je studija korelacije PK/PD. Rezultat je pokazao da su neželjene reakcije povezane sa lekom primećene kod 31% pacijenata, uglavnom gastrointestinalne reakcije kao što su dijareja i povraćanje, i bile su ograničene na dozu ne manju od 250 mg, sa stepenom od 1/2. Snažan inhibitorni efekat na fosforilaciju FLT3 primećen je kod više od 50% pacijenata pri dozi ne manjoj od 200 mg, a srodni nishodni signalni putevi su inhibirani (Anne-Marie O'F, James M. F, et al. Clinical Cancer Research, 2003, 9(15), 5465.)

[0007] U kliničkoj studiji sunitiniba za AML faze I koju su sproveli Fiedler et al., 16 pacijenata sa relapsom ili refraktornom AML podeljeno je u dve grupe A i B i lečeni su različitim primenama (grupa A: 50 mg·d<-1>, 4/2 šema, grupa B: 75 mg·d<-1>, 4/1 šema). Rezultati su pokazali da je 1 slučaj imao morfološku reakciju, 5 slučajeva je imalo delimičnu reakciju (PR), toksična reakcija grupe od 50 mg je bila slična onoj u kliničkim ispitivanjima na solidnim tumorima, ali je povećana incidenca supresije koštane srži, dok je tolerancija pacijenata u grupi od 75 mg smanjena, što je rezultiralo umorom i hipertenzijom koji ograničava dozu 4. stepena (Fiedler, W. et. al. Blood, 2005, 105, 986.). Može se videti da iako su rane kliničke studije Sunitiniba pokazale određene terapeutske efekte na AML, njegovi toksični neželjeni efekti su bili relativno jaki, tolerisana doza je bila niska, a izloženost plazmi potrebna za inhibitornu aktivnost FLT3 nije mogla da se postigne. Sunitinib nije bio uspešan kada se koristio kao inhibitor FLT3 u lečenju AML. Zbog toga je neophodno optimizovati njegovu hemijsku strukturu kako bi se smanjili toksični neželjeni efekti, optimizovala mogućnost primene leka i pronašao bezbedniji i efikasniji idealni lek.

Sažetak otkrića

[0008] S obzirom na nedostatke prethodnog stanja tehnike koji su gore pomenuti, cilj predmetnog otkrića je da obezbedi pirol-supstituisan derivat indolinona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i postupak njihove pripreme i njihovu primenu, za rešavanje problema u stanju tehnike.

[0009] Da bi se postigao gornji cilj i drugi srodni ciljevi, prvi aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Strukturna formula jedinjenja je kao što je prikazana u Formuli I:

pri čemu,

R1je izabran od H, metil, etil, n-propil, izopropil;

R2je izabran od supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikloalkila;

ili, R1i R2formiraju grupe kao što su prikazane u nastavku sa atomom azota:

pri čemu je Ra izabran od linearnog ili razgranatog C1-C3 alkila; Rb je izabran od amino; linearnog ili razgranatog, supstituisanog ili nesupstituisanog C1-C3 alkila i supstituent je izabran od amino.

[0010] U nekim primerima izvođenja ovog otkrića, R2je izabran od monosupstituisanog, polisupstituisanog ili nesupstituisanog 5-članog ili 6-članog heterocikloalkila i supstituent je izabran od linearnog ili razgranatog C1-C3 alkila.

[0011] U nekim primerima izvođenja ovog otkrića, R2je izabran od 4-piperidinila i N-metil-4-piperidinila.

[0012] U nekim primerima izvođenja ovog otkrića, jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli su izabrani od jedinjenja formule 1, jedinjenja formule 2, jedinjenja formule 3, jedinjenja formule 4, jedinjenja formule 5, jedinjenja formule 6, jedinjenja formule 7 i jedinjenja formule 8, pri čemu su strukturne formule jedinjenja prikazane kao u nastavku:

[0013] Drugi aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje postupak za pripremu jedinjenja ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, koji sadrži sledeći korak: jedinjenje formule VI reaguje sa jedinjenjem formule VII i jedinjenjem formule IX u prisustvu alkalija za proizvodnju jedinjenja formule I. Reakciona jednačina je kao u nastavku:

pri čemu, R1i/ili R2u jedinjenju formule IX imaju/ima istu definiciju kao u jedinjenju formule I.

[0014] Treći aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu kao inhibitori receptor tirozin kinaze.

[0015] U nekim primerima izvođenja predmetnog otkrića, inhibitor je višeciljni inhibitor receptor tirozin kinaze.

[0016] U nekim primerima izvođenja predmetnog otkrića, receptor tirozin kinaza je FLT3 ili njegovi mutanti.

[0017] U nekim primerima izvođenja predmetnog otkrića, inhibitor je selektivni inhibitor, tačnije selektivni inhibitor za FLT3 ili njegove mutante.

[0018] Četvrti aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu u lečenju tumora. Tumor je poželjno odabran od AML.

[0019] Peti aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

Primeri izvođenja

[0020] Kroz mnogo prakse i istraživanja, pronalazač ovog otkrića obezbeđuje derivat indolinona supstituisan pirolom, koji ima primetan inhibitorni efekat na receptor tirozin kinazu (RTK) i ima karakteristike niskih toksičnih sporednih efekata. Na osnovu toga, ovo otkriće je završeno.

[0021] Jedan aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Jedinjenje je pirol-supstituisan derivat indolinona. Strukturna formula jedinjenja je prikazana u Formuli I:

pri čemu,

R1je izabran od H, metil, etil, n-propil, izopropil;

R2je izabran od supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikloalkila;

ili, R1i R2formiraju grupe kao što su prikazane u nastavku sa atomom azota:

[0022] U ovom pronalasku, "alkil" se odnosi na zasićenu alifatičnu grupu.

[0023] U ovom otkriću, "heterocikloalkil" se odnosi na zasićeni ili nezasićeni (ali ne aromatični) ciklični ugljovodonik, koji izborno može biti nesupstituisan, monosupstituisan ili polisupstituisan i koji u svojoj strukturi ima najmanje jedan heteroatom izabran od N, O ili S.

[0024] U ovom otkriću, "farmaceutski prihvatljive soli" se odnose na bilo koju so koja je fiziološki tolerantna (obično netoksična) kada se koristi za lečenje na odgovarajući način, posebno kada je objekat primene čovek i/ili sisar. Tačnije, farmaceutski prihvatljive soli su obično soli formirane od jedinjenja (obično protonisanog) koje je dato ovim otkrićem i najmanje jednog fiziološki tolerantnog anjona. Na primer, soli se mogu formirati od hlorovodonične kiseline, bromovodonične kiseline, sumporne kiseline, metansulfonske kiseline, mravlje kiseline, sirćetne kiseline, oksalne kiseline, ćilibarne kiseline, jabučne kiseline, vinske kiseline, bademove kiseline, fumarne kiseline, mlečne kiseline, limunske kiseline ili slično.

[0025] U jedinjenju formule I koje je dato ovim otkrićem, R1može se preciznije izabrati od H, metila, etila, n-propila, izopropila.

[0026] U jedinjenju formule I koje je dato ovim otkrićem, R2je izabran od monosupstituisanog, polisupstituisanog ili nesupstituisanog 5-članog ili 6-članog heterocikloalkila i supstituent može biti linearni ili razgranati C1-C3 alkil, na primer, metil, etil, n-propil ili izopropil. U nekim primerima izvođenja ovog otkrića, R2je izabran od 4-piperidinila i N-metil-4-piperidinila.

[0027] U jedinjenju formule I kao što je gore opisano, R1i R2mogu formirati monosupstituisani, polisupstituisani ili nesupstituisani 5-člani ili 6-člani heterocikloalkil sa premošćenim atomom azota i formirani heterocikloalkil može uključivati jedan ili dva atoma azota. Prilikom izračunavanja atoma azota, uključen je premošćeni atom azota. Supstituent može biti linearni ili razgranati C1-C3 alkil, amino, itd. Na primer, heterocikloalkil formiran od R1i R2i premošćeni atom azota može biti 6-člani heterocikloalkil, koji može da uključuje dva atoma azota i može biti supstituisan sa jednom ili više alkil grupa i koji takođe može uključivati atom azota i može biti supstituisan sa jednom ili više amino grupa. Prema specifičnom primeru izvođenja ovog otkrića, R1i R2i premošćeni atom azota formiraju grupu kao što je prikazana u nastavku:

pri čemu,

Ra je izabran od linearnog ili razgranatog C1-C3 alkila (na primer, metil, etil, n-propil, izopropil); i

Rb je izabran od amino, linearnog ili razgranatog C1-C3 alkila (na primer, metil, etil, n-propil, izopropil).

[0028] Jedinjenje formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli obezbeđeni ovim otkrićem mogu posebno biti jedinjenje formule 1, jedinjenje formule 2, jedinjenje formule 3, jedinjenje formule 4, jedinjenje formule 5, jedinjenje formule 6, jedinjenja formule 7 ili jedinjenje formule 8. Strukturne formule jedinjenja formule 1 do 8 su prikazane u Tabeli 1:

Tabela 1

[0029] Sledeći aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje postupak za pripremu jedinjenja, koji sadrži sledeći korak: jedinjenje formule VI reaguje sa jedinjenjem formule VII i jedinjenjem formule IX, respektivno, u prisustvu alkalija da bi se dobilo jedinjenje formule I. Jednačina reakcije je kao u nastavku:

pri čemu, R1i/ili R2u jedinjenju formule IX imaju/ima istu definiciju kao u jedinjenju formule I.

[0030] U gornjoj reakciji, jedinjenje formule VI reaguje sa jedinjenjem formule VII u prisustvu alkalija da bi se dobilo jedinjenje formule VIII i jedinjenje formule VIII dalje reaguje sa jedinjenjem formule IX u prisustvu alkalije za proizvodnju jedinjenja formule I.

[0031] U reakciji dobijanja jedinjenja formule I iz jedinjenja formule VI, količina jedinjenja formule VII i/ili jedinjenja formule IX koja se koristi je obično jednaka ili veća od količine upotrebljenog jedinjenja formule VI. Na primer, molarni odnos jedinjenja formule VII prema jedinjenju formule VI može biti 1-1.5:1, a molarni odnos jedinjenja formule IX prema jedinjenju formule VI može biti 1-5:1.

[0032] U reakciji pripreme jedinjenja formule I iz jedinjenja formule VI, alkalija obično može biti organska alkalija, na primer, DIPEA ili slično. Količina korišćene alkalije je obično jednaka ili veća od količine jedinjenja formule VI. Na primer, molarni odnos alkalije prema jedinjenju formule VI može biti 1-1.5:1.

[0033] U reakciji dobijanja jedinjenja formule I iz jedinjenja formule VI, reakcija se može izvesti u rastvaraču, a rastvarač obično može biti aprotični rastvarač. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da izaberu odgovarajući tip rastvarača i odgovarajuću količinu rastvarača u skladu sa sirovim materijalima u reakciji tako da sirovi materijali imaju dobru rastvorljivost u rastvaraču. Na primer, rastvarač može biti tetrahidrofuran (THF) ili slično.

[0034] U reakciji pripreme jedinjenja formule I iz jedinjenja formule VI, reakciona temperatura može biti od sobne temperature do temperature refluksa rastvarača; na primer, reakcija se može izvesti na sobnoj temperaturi. Reakcija se obično može izvesti pod uslovom zaštite od gasa. Gas koji se koristi za stvaranje uslova zaštite gasa može biti azot, inertni gas, itd., a tačnije inertni gas može biti helijum, neon, argon, kripton, ksenon, itd. Stručnjaci mogu podesiti vreme reakcije prema reakcionom postupku. Reakcioni postupak se može pratiti postupcima kao što su TLC i HPLC. Vreme reakcije može biti 0.1-24 h. Nakon što je reakcija završena, reakcioni proizvod se može desolvatovati i prečistiti da bi se dobilo jedinjenje formule I. Stručnjaci mogu izabrati odgovarajući postupak za prečišćavanje. Na primer, za ispiranje proizvoda može se koristiti odgovarajući rastvarač. Dalje, na primer, rastvarač koji se može koristiti može biti jedan od vode, etil acetata (EA), metanola, itd. ili kombinacija nekoliko njih. Jedinjenje formule I može dalje da formira svoje farmaceutski prihvatljive soli sa odgovarajućom kiselinom.

[0035] Pored toga, postupak pripreme jedinjenja formule VI može uključivati sledeći korak: jedinjenje formule V se podvrgava reakciji redukcije u rastvoru elektrolita da bi se dobilo jedinjenje formule VI. Jednačina reakcije je sledeća:

[0036] U reakciji dobijanja jedinjenja formule VI iz jedinjenja formule V, redukciono sredstvo koje se koristi u reakciji redukcije normalno može biti, na primer, jedan od Zn praha, Fe praha, itd. ili kombinacija nekoliko njih. Količina korišćenog redukcionog agensa je obično jednaka ili veća od one jedinjenja formule V. Na primer, molarni odnos redukcionog sredstva prema jedinjenju formule V može biti 1-50:1.

[0037] Stručnjaci mogu izabrati odgovarajući rastvor elektrolita za redukciju jedinjenja formule V u jedinjenje formule VI. Na primer, elektrolit može biti jedan od amonijum hlorida, itd. ili kombinacija nekoliko njih, a koncentracija elektrolita u rastvoru može biti 1/10 do 1/2 njegove koncentracije zasićenja. Dalje, na primer, rastvarač za formiranje rastvora elektrolita može biti jedan od vode, tetrahidrofurana, metanola, itd. ili kombinacija nekoliko njih. Dalje, na primer, koncentracija jedinjenja formule V u rastvoru elektrolita može biti 1-20 mmol/L. U specifičnom primeru izvođenja ovog pronalaska, rastvarač za formiranje rastvora elektrolita je smeša vode, tetrahidrofurana i metanola, pri čemu je zapreminski odnos vode, tetrahidrofurana i metanola 1:0.5-3:0.5-3.

[0038] U reakciji dobijanja jedinjenja formule VI iz jedinjenja formule V, reakciona temperatura reakcije redukcije može biti od sobne temperature do temperature refluksa rastvarača; na primer, reakcija se može izvesti na oko 50°C. Reakcija se obično može izvesti pod uslovom zaštite od gasa. Gas koji se koristi za stvaranje uslova zaštite gasa može biti azot, inertni gas, itd., a tačnije inertni gas može biti helijum, neon, argon, kripton, ksenon, itd. Stručnjaci mogu podesiti vreme reakcije prema reakcionom postupku. Reakcioni postupak se može pratiti postupcima kao što su TLC i HPLC. Vreme reakcije može biti 0.5-24 h. Nakon što je reakcija završena, najmanje deo organskog rastvarača u proizvodu reakcije može da se ukloni, pH se podesi na alkalni, a ekstrakcija organskim rastvaračem i desolvatacija organske faze se izvode da bi se dobilo jedinjenje formule VI. Organski rastvarač koji se koristi tokom ekstrakcije može biti, na primer, etil acetat.

[0039] Dalje, postupak pripreme jedinjenja formule V može uključivati sledeći korak: jedinjenje formule III i jedinjenje formule IV imaju reakciju kondenzacije da bi proizveli jedinjenje formule V. Reakciona jednačina je kao u nastavku:

[0040] U reakciji pripreme jedinjenja formule V iz jedinjenja formule III, reakcija se obično izvodi u prisustvu katalizatora. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da izaberu odgovarajući tip i količinu katalizatora za reakciju kondenzacije jedinjenja formule III i jedinjenja formule IV. Na primer, katalizator može biti pirolidin ili slično, i na primer, molarni odnos katalizatora prema jedinjenju formule III može biti 1-1.5:1.

[0041] U reakciji pripreme jedinjenja formule V iz jedinjenja formule III, količina korišćenog jedinjenja formule IV je obično jednaka ili veća od količine jedinjenja formule III. Na primer, molarni odnos jedinjenja formule III prema jedinjenju formule IV može biti 1:1-1.5.

[0042] U reakciji pripreme jedinjenja formule V iz jedinjenja formule III, reakcija se može izvesti u rastvaraču, a rastvarač obično može biti polarni protični rastvarač. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da izaberu odgovarajući tip i količinu rastvarača u skladu sa sirovinama u reakciji tako da sirovine imaju dobru rastvorljivost u rastvaraču. Na primer, rastvarač može biti etanol (EtOH) ili slično.

[0043] U reakciji pripreme jedinjenja formule V iz jedinjenja formule III, reakciona temperatura reakcije redukcije može biti od sobne temperature do temperature refluksa rastvarača; na primer, reakcija se može izvesti na oko 50°C. Reakcija se obično može izvesti pod uslovom zaštite od gasa. Gas koji se koristi za stvaranje uslova zaštite gasa može biti azot, inertni gas, itd., a tačnije inertni gas može biti helijum, neon, argon, kripton, ksenon, itd. Stručnjaci mogu podesiti vreme reakcije prema reakcionom postupku. Reakcioni postupak se može pratiti postupcima kao što su TLC i HPLC. Vreme reakcije može biti 0.5-24 h. Nakon što je reakcija završena, proizvod reakcije može proći kroz razdvajanje čvrstog i tečnog, a supstanca čvrste faze je jedinjenje formule V.

[0044] Dalje, postupak pripreme jedinjenja formule III može uključivati sledeći korak: nitriranje jedinjenja formule II u prisustvu sredstva za nitriranje i sredstva za dehidrataciju da bi se dobilo jedinjenje formule III. Jednačina reakcije je sledeća:

[0045] U reakciji dobijanja jedinjenja formule III iz jedinjenja formule II, stručnjaci u ovoj oblasti mogu da izaberu pogodan tip i količinu sredstva za nitriranje i/ili sredstva za dehidrataciju da bi sproveli reakciju nitriranja. Na primer, sredstvo za nitriranje može biti azotna kiselina, nitrat, itd., a nitrat može biti, na primer, kalijum nitrat itd. Formula II. Na primer, molarni odnos sredstva za nitriranje prema jedinjenju formule II može biti 1-1.5:1; a sredstvo za dehidrataciju može biti koncentrovana sumporna kiselina i slično.

[0046] U reakciji pripreme jedinjenja formule III iz jedinjenja formule II, reakciona temperatura je obično niža od sobne temperature; na primer, reakcija se može izvesti na oko -10°C. Reakcija se obično može izvesti pod uslovom zaštite od gasa. Gas koji se koristi za stvaranje uslova zaštite gasa može biti azot, inertni gas, itd., a tačnije inertni gas može biti helijum, neon, argon, kripton, ksenon, itd. Stručnjaci mogu podesiti vreme reakcije prema reakcionom postupku. Reakcioni postupak se može pratiti postupcima kao što su TLC i HPLC. Vreme reakcije može biti 0.5-24 h. Nakon što je reakcija završena, reakcioni proizvod se može razblažiti vodom, i proći kroz ekstrakciju organskim rastvaračem i desolvataciju organske faze (nakon desolvatacije, reakcioni proizvod se može dalje isprati organskim rastvaračem) da bi se dobilo jedinjenje formule III. Organski rastvarač koji se koristi za ekstrakciju i/ili ispiranje može biti, na primer, etil acetat, itd.

[0047] Sledeći aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje upotrebu jedinjenja ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli u pripremi inhibitora receptorske tirozin kinaze. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli su specifično multiciljni inhibitor receptor tirozin kinaze, a preciznije mogu biti inhibitori FLT3 ili njegovih mutanata (Fms-slična tirozin kinaza, FMS-slična tirozin kinaza 3, na primer, FLT3, FLT3-ITD, FLT3 D835Y, itd.), FLT3 ili njegovi mutanti su članovi porodice receptor tirozin kinaze tipa III. Inhibitor može biti selektivni inhibitor, a selektivna inhibicija može značiti da, u poređenju sa KDR (receptor 2 faktora rasta humanog vaskularnog endotela, VEGFR2), jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli imaju bolji inhibitorni efekat na FLT3 ili njegove mutante. Na primer, u poređenju sa KDR, jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli imaju IC50koncentracija koja ne može biti veća od 10% za FLT3 ili njegove mutante.

[0048] Sledeći aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje upotrebu jedinjenja ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli u pripremi leka za lečenje tumora. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu inhibirati rast tumorskih ćelija, i na taj način se mogu koristiti za pripremu lekova za lečenje tumora, a tumor može biti preciznije akutna mijelocitna leukemija (AML) i slično.

[0049] Sledeći aspekt predmetnog otkrića obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju, koja uključuje jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, a konkretnije može uključiti terapeutski efikasnu količinu jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutska kompozicija može takođe uključiti farmaceutski prihvatljive nosače, aditive, ađuvanse ili ekscipijense i slično.

[0050] Prema ovom otkriću, "terapeutski efikasna količina" se generalno odnosi na količinu koja može postići terapeutski efekat nakon odgovarajućeg perioda primene. Uopšteno govoreći, smanjenje jednog ili više simptoma ili kliničkih pokazatelja znači da je tretman efikasan. Zadovoljavajući efekat znači da tretman može medicinski smanjiti jedan ili više simptoma tumora ili potpuno eliminisati tumor, ili blokirati ili odložiti nastanak tumora i/ili smanjiti rizik od razvoja ili pogoršanja tumora.

[0051] Pirol-supstituisani derivat indolinona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli pripremljene u skladu sa ovim otkrićem ne samo da se lako sintetišu, lako se pripremaju i bogati su sintetičkim sirovinama, već takođe imaju inhibitorni efekat na različite tirozin kinaze, posebno imaju veću selektivna inhibitornu aktivnost protiv FLT3 i njegovih mutanata u poređenju sa KDR (VEGFR2), i može izbeći toksične nuspojave izazvane inhibicijom KDR, na primer, toksične nuspojave povezane sa inhibicijom ekstenzivne angiogeneze, što može povećati tolerisanu dozu. Pored toga, srodni eksperimenti dalje pokazuju da ovaj tip jedinjenja može selektivno inhibirati rast tumora, što ukazuje da se ovaj tip jedinjenja može koristiti za lečenje raznih tumorskih bolesti, kao što je AML. Pored toga, pirol-supstituisani derivat indolinona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli obezbeđeni prema ovom pronalasku imaju veoma niske toksične sporedne efekte, tako da takav tip jedinjenja ima bolje izglede za primenu.

[0052] U nastavku su opisani načini implementacije ovog otkrića sa referencom na specifične primere. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da razumeju druge prednosti i efekte ovog otkrića iz sadržaja koji je ovde otkriven.

[0053] Treba napomenuti da su aparati ili uređaji postupka koji nisu posebno objašnjeni u sledećim primerima svi konvencionalni aparati ili uređaji u tehnici.

[0054] Pored toga, treba razumeti da jedan ili više koraka u postupcima pomenutim u predmetnom otkriću ne isključuju druge korake koji mogu postojati pre ili posle kombinovanih koraka ili druge korake koji mogu doći između ovih izričito navedenih koraka, osim ako nije drugačije naznačeno. Pored toga, osim ako nije drugačije naznačeno, numerisanje odgovarajućih koraka služi samo kao pogodan alat za identifikaciju svakog koraka, a ne za ograničavanje redosleda koraka ili ograničavanje obima primene ovog otkrića. Promena ili prilagođavanje relativnog odnosa između koraka, bez suštinske promene tehničkog sadržaja, trebalo bi da se smatra da spada u delokrug primene ovog otkrića. Svi rastvarači u primerima su ponovo destilovani pre upotrebe, a upotrebljeni anhidrovani rastvarači su svi dobijeni tretmanom sušenjem prema standardnim postupcima.

[0055] U svakom primeru,<1>H-NMR je meren sa Varian Mercury AMX300, 400, 500 i MS je meren sa VG ZAB-HS ili VG-7070 i Esquire 3000 plus-01005.

[0056] Osim ako nije drugačije naznačeno, sve reakcije su izvedene pod zaštitom argona i praćene pomoću TLC, i prošle su kroz ispiranje zasićenim rastvorom soli i postupak sušenja anhidrovanim magnezijum sulfatom tokom naknadnog tretmana. Osim ako nije drugačije naznačeno, za prečišćavanje proizvoda je korišćena hromatografija na koloni silika gela, a korišćeni silika gel je bio 200-300 „mesh“. GF254proizvodi Qingdao Ocean Chemical Plant ili Yantai Yuanbo Silica Gel Company.

Primer 1

Priprema jedinjenja formule 1:

Priprema jedinjenja formule III:

[0057]

60 mL koncentrovane sumporne kiseline je stavljeno u posudu sa okruglim dnom zapremine 250 mL i polako je dodavan sirov materijal 3,5-dimetil-2-pirolkarbaldehida (jedinjenje formule II, 5 g, 40 mmol). Sistem je održavan ispod -10°C tokom postupka dodavanja. Posle postupka dodavanja, polako je dodavan kalijum nitrat (4.35 g, 42 mmol) u serijama na ovoj temperaturi, a ovaj postupak dodavanja je završen za oko 2 sata. U ovom postupku, temperatura je održavana na -10°C, a mešanje je vršeno na ovoj temperaturi oko 2 sata nakon postupka dodavanja. Nakon što TLC otkrije završetak reakcije, rastvor je dodat u 1 L ledene vode i ekstrahovan dva puta sa 1 L etil acetata, a organski sloj je ispran zasićenim rastvorom soli, osušen anhidrovanim natrijum sulfatom i filtriran, a organski rastvarač je isparavan do sušenja pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 7 g sirovog proizvoda, koji je dodat u 10-20 mL etil acetata, snažno mešan i filtriran da bi se dobilo 5 g čistog ciljnog jedinjenja III.<1>H NMR (400 MHz, Hloroformd) δ : 10.22 (brs, 1H), 9.68 (s, 1H), 2.71 (s, 3H), 2.66 (s, 3H).

Priprema jedinjenja formule V:

[0058]

[0059] Jedinjenje III (1.68 g, 10 mmol) i jedinjenje IV (1.8 g, 12 mmol) su dodati u 50 mL apsolutnog etil alkohola i dodat je tetrahidropirol (850 mg, 12 mmol) na sobnoj temperaturi. Nakon dodavanja, boja sistema je postala žuta, temperatura je podignuta na 50°C i reakcija je nastavljena 2 sata na ovoj temperaturi. Po završetku reakcije, sistem je direktno filtriran, a filterski kolač je ispran sa malom količinom etanola i etil acetata da bi se dobilo 2.7 g čistog ciljnog jedinjenja V.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6):11.14 (s, 1H), 7.88 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.05-6.97 (m, 1H), 6.88 (dd, J = 8.5, 4.5 Hz, 1H), 2.64 (s, 3H), 2.58 (s, 3H).

Priprema jedinjenja formule VI:

[0061] Jedinjenje V (900 mg, 3 mmol) je stavljeno u bocu sa dva grlića zapremine 500 mL i zatim je u to dodato 200 mL tetrahidrofurana, 100 mL metanola, 60 mL vode i 60 mL zasićenog rastvora amonijum hlorida, respektivno. Nakon dodavanja, temperatura je podignuta na 50°C, zatim je uz mešanje dodat cink u prahu (1.8 g, 30 mmol), a zatim je reakcija nastavljena 2 sata pod ovim uslovima, tokom kojih je sistem postao bistar, a zatim ponovo zamućen. Nakon što je sistem postao mutan, LC-MS je detektovao završetak reakcije. Nakon što je reakcija završena, rastvor je isparavan do sušenja i dodat mu je zasićeni rastvor natrijum karbonata da bi se sistem podesio na alkalni i ekstrahovan dva puta sa 2 L etil acetata. Etil acetatni sloj je ispran zasićenim fiziološkim rastvorom, osušen anhidrovanim natrijum sulfatom i filtriran, a organski rastvarač je isparavan do sušenja pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ciljno jedinjenje VI (800 mg).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.55 (s, 1H), 10.62 (s, 1H), 7.63 -7.55 (m, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.82 - 6.79 (m, 1H), 6.79 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 4.01 (s, 2H), 2.25 (s, 3H), 2.15 (s, 3H). Priprema jedinjenja formule 1-A:

[0062] Jedinjenje VI (100 mg, 0.37 mmol) je rastvoreno u tetrahidrofuranu (5 mL), dodat je DIPEA (0.1 mL, 0.55 mmol) na sobnoj temperaturi, a zatim je dodat p-nitrofenil hloroformat (110 mg, 0.55 mmol). Posle dodavanja, reakcija je izvedena na sobnoj temperaturi oko 20 minuta, a TLC je detektovao završetak reakcije. Nakon što je reakcija završena, u sistem je dodat N-BOC-piperazin (275 mg, 1.48 mmol) i mešan 30 minuta. LC-MS je detektovao završetak reakcije. Nakon što je reakcija završena, rastvarač je isparavan do suđenja, razmućen sa EA, filtriran i ispran metanolom da bi se dobio čist proizvod.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.55 (s, 1H), 10.78 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 9.5, 2.2 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.87 (ddd, J = 9.5, 9.1, 2.2 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.4, 4.7 Hz, 1H), 3.37-3.20 (m, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 1.82-1.88 (m, 4H).

Priprema jedinjenja formule 1:

[0063]

[0064] Jedinjenje formule 1-A (100 mg, 0.21 mmol) je rastvoreno u 3 mL etanola, zatim je dodato 3 mL rastvora hlorovodonične kiseline u etanolu i mešano 30 minuta. LC-MS je detektovao završetak reakcije i smeša je direktno osušena centrifugiranjem da bi se dobilo čisto jedinjenje formule 1.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.57 (s, 1H), 10.81 (s, 1H), 9.35 (s, 2H), 8.07 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 9.5, 2.5 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.88 (ddd, J = 9.5, 9.0, 2.5 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.4, 4.7 Hz, 1H), 3.68 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.11 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.17 (s, 3H).

Primer 2

Priprema jedinjenja formule 2:

[0065]

[0066] Postupak pripreme se odnosi na sintezu jedinjenja formule 1, gde je N-BOC-piperazin supstituisan sa N-metilpiperazinom da bi se dobilo ciljno jedinjenje formule 2.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.56 (s, 1H), 10.78 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 9.5, 2.3 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.88 (ddd, J =9.5, 9.1, 2.3 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.3, 4.7 Hz, 1H), 3.45-3.39 (m, 4H), 2.33-2.28 (m, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.16 (s, 3H).

Primer 3

Priprema jedinjenja formule 3:

[0067]

[0068] Postupak pripreme odnosi se na sintezu jedinjenja formule 1, gde je N-BOC-piperazin supstituisan sa N-etilpiperazinom da bi se dobilo ciljno jedinjenje formule 3.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.56 (s, 1H), 10.79 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 9.5, 2.4 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 6.88 (ddd, J = 9.5, 9.0, 2.5 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.4, 4.7 Hz, 1H), 3.46-3.38 (m, 4H), 2.40-2.30 (m, 6H), 2.18 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

Primer 4

Priprema jedinjenja formule 4:

[0069]

[0070] Postupak pripreme odnosi se na sintezu jedinjenja formule 1, gde je N-BOC-piperazin supstituisan sa 4-BOC-aminopiperidinom da bi se dobilo ciljno jedinjenje formule 4-A, a zatim je BOC uklonjen rastvorom hlorovodonične kiseline u etanolu da bi se dobilo jedinjenje formule 4.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.56 (s, 1H), 10.81 (s, 1H), 8.16 (brs, 3H), 7.88 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 9.5, 2.3 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.88 (ddd, J = 9.5, 9.0, 2.3 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.4, 4.8 Hz, 1H), 4.15-4.06 (m, 2H), 3.28-3.16 (m, 1H), 2.90-2.80 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 1.95-1.86 (m, 2H), 1.53-1.40 (m, 2H).

Primer 5

Priprema jedinjenja formule 5:

[0071]

[0072] Postupak pripreme odnosi se na sintezu jedinjenja formule 1, gde je N-BOC-piperazin supstituisan sa 4-N-BOC-4-N-metilaminopiperidinom da bi se dobilo ciljno jedinjenje formule 5-A, a zatim je BOC uklonjen rastvorom hlorovodonične kiseline u etanolu da bi se dobilo jedinjenje formule 5.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.57 (s, 1H), 10.80 (s, 1H), 8.87 (brs, 2H), 7.89 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 9.5, 2.4 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.88 (ddd, J = 9.5, 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.4, 4.8 Hz, 1H), 4.20-4.10 (m, 2H), 3.22-3.11 (m, 1H), 2.86-2.77 (m, 2H), 2.56 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.05-1.97 (m, 2H), 1.53-1.39 (m, 2H).

Primer 6

Priprema jedinjenja formule 6:

[0073]

[0074] Postupak pripreme se odnosi na sintezu jedinjenja formule 1, gde je N-BOC-piperazin supstituisan sa 1-BOC-4-aminopiperidinom da bi se dobilo ciljno jedinjenje formule 6-A, a zatim je BOC uklonjen etanolskim rastvorom hlorovodonične kiseline da bi se dobilo jedinjenje formule 6.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.56 (s, 1H), 10.80 (s, 1H), 8.78 (brs, 1H), 8.69 (brs, 1H), 7.68 (dd, J= 9.5, 2.4 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 6.88 (ddd, J = 9.5, 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.4, 4.7 Hz, 1H), 6.49 (brs, 1H), 3.78-3.65 (m, 1H), 3.28-3.18 (m, 2H), 3.02-2.90 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.00-1.84 (m, 2H), 1.69-1.51 (m, 2H).

Primer 7

Priprema jedinjenja formule 7:

[0075]

[0076] Postupak pripreme odnosi se na sintezu jedinjenja formule 1, gde je N-BOC-piperazin supstituisan sa 1-amino-4-metilpiperazinom da bi se dobilo ciljno jedinjenje formule 7.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.55 (s, 1H), 10.79 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 9.5, 2.4 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.87 (ddd, J = 9.4, 9.0, 2.5 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.4, 4.7 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.45-3.36 (m, 1H), 2.65 (d, J = 11.4 Hz, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.94 (t, J = 10.6 Hz, 2H), 1.76-1.69 (m, 2H), 1.45-1.32 (m, 2H).

Primer 8

Priprema jedinjenja formule 8:

[0077]

[0078] Postupak pripreme odnosi se na sintezu jedinjenja formule 1, gde je N-BOC-piperazin supstituisan sa 1-BOC-4-metilaminopiperidinom da bi se dobilo ciljno jedinjenje formule 8-A, a zatim je BOC uklonjen etanolskim rastvorom hlorovodonične kiseline da bi se dobilo jedinjenje formule 8.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:13.56 (s, 1H), 10.80 (s, 1H), 8.83 (brs, 2H), 7.70~7.63 (m, 3H), 6.88 (td, J = 9.5, 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 8.4, 4.8 Hz, 1H), 4.37-4.22 (m, 1H), 3.32-3.28 (m, 2H), 3.02-2.90 (t, J = 12.6 Hz, 2H), 2.82 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.04-1.88 (m, 2H), 1.76-1.66 (m, 2H).

Primer 9

Priprema hidrohlorida jedinjenja formule 2:

[0079] 0.5 mL zasićenog etanolskog rastvora hlorovodonika je razblaženo deset puta sa apsolutnim etanolom, dodato je jedinjenje formule 2 (397 mg, 1 mmol) i mešano 5-10 minuta, a reakcioni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ispran sa malom količinom metanola da bi se dobio hidrohlorid jedinjenja formule 2.

[0080] Hidrohloridi svih ostalih jedinjenja mogu se dobiti ovim postupkom reakcijom odgovarajućih jedinjenja sa razblaženim rastvorom hlorovodonične kiseline u etanolu.

Primer 10

Određivanje in vitro biohemijske aktivnosti tirozin kinaze;

[0081] In vitro inhibitorna aktivnost jedinjenja na tirozin kinazu je merena postupkom HTRF (Homogena vremenski razložena fluorescencija).

[0082] Jedinjenja su serijski razblažena sa DMSO u ploči sa 96 bunarčića u 8 rastvora različitih koncentracija sa 100 puta većom koncentracijom. Zatim puferski rastvor, koji je pripremljen dodavanjem 5 mM MgCl2i 1 mM DTT do 1 puta enzimskog pufera obezbeđenog u kompletu, razblažen je u ploči sa 96 bunarčića u rastvor sa 5 puta većom koncentracijom.

[0083] Razblažena jedinjenja su dodata na ploču sa 384 bunarčića, respektivno, i za svaku koncentraciju su obezbeđeni dupli bunarčići. Zatim je dodato 0.25 ng kinaze po bunarčiću. Istovremeno su obezbeđene negativni i pozitivni bunarčići, a za kontrolu je uzet bunarčić u koji je dodato 5% DMSO iste zapremine. Konačna koncentracija DMSO je bila 1%, a negativan bunarčić nije sadržao kinazu. Predinkubacija je izvedena 10 minuta na sobnoj temperaturi. Dodati su supstrat sa konačnom koncentracijom od 1 µM i ATP sa konačnom koncentracijom od 120 µM i inkubirani na sobnoj temperaturi 90 minuta. Zatim je dodat fluorescentni akceptor (streptavidin obeležen sa XL665) sa konačnom koncentracijom od 0.0625 µM i 1-struki fluorescentni donor (TK antitelo obeleženo EuropiJum kriptatom) sa konačnom koncentracijom od 0.0625 µM i inkubirano na sobnoj temperaturi 60 minuta. Ploče su očitane čitačem mikropločica pod uslovima λeX=330 nm, λem=620 nm i λem=665 nm. Izračunat je odnos između očitavanja na 665 nm i očitavanja na 620 nm I stopa inhibicije je izračunata prema ovom odnosu.

[0084] Rezultati su pokazali da su sva gore pomenuta jedinjenja iz primera (jedinjenja formule 1-8) imala značajnu inhibitornu aktivnost protiv FLT3, sa IC50<20 nM. Iako su imali određenu inhibitornu aktivnost protiv KDR (VEGFR2), inhibitorna aktivnost je bila relativno slaba (IC50>200 nM), pokazujući selektivnu inhibitornu aktivnost FLT3. Jedinjenje formule 5 pokazalo je snažnu inhibitornu aktivnost protiv FLT3, FLT3-ITD, FLT3 D835Y i određenu inhibitornu aktivnost protiv PDGFRβ, c-Kit, RET, KDR, AxL, itd., sa IC50>100 nM, što ukazuje da je to bio selektivni inhibitor FLT3.

Tabela 1. Inhibitorna aktivnost jedinjenja formule 5 protiv različitih tirozin kinaza

Primer 11

[0085] Ćelija humane akutne leukemije MV-4-11 je Flt-3 mutantni ćelijski soj. MTS postupak je korišćen za određivanje in vitro antiproliferativne aktivnosti jedinjenja protiv MV-4-11 (izveden iz ATCC): tripsinizacija ćelija u logaritamskoj fazi rasta, njihovo brojanje, resuspendovanje odgovarajućeg broja ćelija u rastvoru kulture, dodavanje rastvora kulture na ploču sa 96 bunarčića za 150 µL po bunarčiću i kultivisanje preko noći. Nakon toga, 50 µL 4-struko serijski razblaženog test jedinjenja ili rastvora kontrolne kulture je dodato u svaki bunarčić i kultivisano 72 sata. Rastvor kulture je isceđen i 120 µL rastvora za detekciju MTS (100 µL svežeg medijuma za kulturu i 20 µL MTS rastvora) je dodato u svaki bunarčić, i inkubirano na 37°C, i očitana je vrednost OD490. Za analizu i obradu podataka korišćen je softver Graphpad PrismS za dobijanje IC50.

[0086] Rezultati su pokazali da su jedinjenja 1-8 u gornjim primerima pokazala značajnu antiproliferativnu aktivnost protiv MV-4-11 i neka jedinjenja su imala istu ili jaču aktivnost kao Sunitinib (videti tabelu 2).

Tabela 2. Inhibitorni efekat jedinjenja formule 1-8 na in vitro proliferaciju humanog soja MV-

4-11

Primer 12

Inhibitorni efekat na MV-4-11 subkutano transplantirani tumor kod golih miševa u vivo;

[0087] MV-4-11 ćelije (FLT3-ITD mutantni soj ćelija humane akutne bifenotipske mijeloidne leukemije, ATCC) su kultivisane i proširene in vitro, a ćelije u logaritamskoj fazi rasta su sakupljene i resuspendovane u rastvoru EMEM kulture bez seruma, i suspenzija ćelija je injektirana supkutano špricem u pazuh prednjeg desnog ekstremiteta mužjaka Balb/c golih miševa. Rast životinja i transplantirani tumor je praćen redovno; kada je zapremina tumora narasla na oko 100-300 mm<3>, životinje sa umerenom veličinom tumora su nasumično podeljene u različite grupe, svaka grupa se sastojala od 6 životinja, i dat im je blanko rastvarač (0.5% CMC) ili jedinjenje formule 5 u gornjim primerima (jedinjenje je bilo hidrohlorid, sa dozama od 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 80 mg/kg, 160 mg/kg), jedinjenje formule 1 u gornjim primerima (hidrohlorid, sa dozama od 5 mg/kg, 160 mg/kg) ili Sunitinib (sa dozama od 10 mg/kg, 80 mg/kg), respektivno, intragastrična primena, jednom dnevno, i uzastopni ciklus primene od 3 nedelje; i tokom perioda primene, prečnik tumora i težina životinje su praćeni, i posmatrano je životno stanje životinje; i eksperiment je prekinut posle 3 nedelje primene, a životinje su žrtvovane pomoću CO2i disekovane.

[0088] Formula za izračunavanje zapremine tumora (TV) je TV=1/2×a×b<2>, gde a predstavlja dugi prečnik tumora, a b predstavlja kratki prečnik tumora.

[0089] Rezultati su pokazali da se posle intragastrične primene tokom 21 dana (36. dan nakon inokulacije), tumor u kontrolnoj grupi rastvarača povećao na skoro 6.6 puta veći od početne zapremine, a jedinjenje formule 5 pokazalo je značajan antitumorski efekat. Sa dozom od 2.5 mg/kg, jedinjenje formule 5 pokazalo je značajnu inhibiciju rasta transplantiranog tumora, a sa dozom ne manjom od 5 mg/kg transplantirani tumor je splasnuo. Antitumorski efekat u dozi od 10 mg/kg bio je očigledno jači od Sunitiniba u istoj dozi i bio je ekvivalentan onom Sunitiniba u dozi od 80 mg/kg. Pored toga, čak i pri dozi od 160 mg/kg, jedinjenje formule 5 nije pokazalo očiglednu toksičnost za životinje (ništa abnormalno nije otkriveno u opštim kliničkim simptomima i anatomiji, a težina životinje je samo malo smanjena). Obe doze jedinjenja formule 1 učinile su da transplantirani tumori golih miševa skoro potpuno nestanu, a nije bilo očigledne promene u težini životinje. Međutim, sa Sunitinibom u dozi od 80 mg/kg, težina životinje je značajno smanjena, a toksičnost je bila očigledna, što je bilo blizu maksimalno tolerisane doze.

Tabela 3. Inhibitorni efekat hidrohlorida jedinjenja formule 5 na MV-4-11 transplantirani tumor kod golih miševa

[0090] Iz eksperimentalnih rezultata MV-4-11 transplantiranih tumora kod golih miševa, može se naći da jedinjenje formule 5 (hidrohlorid) i jedinjenje formule 1 (hidrohlorid) prema ovom pronalasku imaju selektivni antitumorski efekat na humanim AML ćelijama (MV-4-11) sa FLT3-ITD mutacijom subkutano transplantiranim u gole miševe. U poređenju sa sunitinibom, jedinjenje formule 5 (hidrohlorid) i jedinjenje formule 1 (hidrohlorid) imaju manju efikasnu dozu, manju toksičnost, veći terapeutski prozor i bolju razvojnu vrednost.

[0091] Ukratko, ovo otkriće efikasno prevazilazi različite nedostatke u prethodnom stanju tehnike i ima visoku industrijsku vrednost.

[0092] Podrazumeva se da su ovde opisani primeri namenjeni samo da objasne principe i efekte predmetnog otkrića, umesto da ograniče ovo otkriće. Svako ko je upoznat sa ovom tehnologijom može da modifikuje ili promeni gornje primere bez odstupanja od obima ovog otkrića,

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je strukturna formula jedinjenja prikazana u formuli I:

   pri čemu, R1je izabran od: H, metil, etil, n-propil, izopropil; R2je izabran od supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikloalkila, ili, R1i R2formiraju grupe kao što su prikazane u nastavku sa atomom azota:

   pri čemu je Ra izabran od linearnog ili razgranatog C1-C3 alkila; Rb je izabran od amino; linearnog ili razgranatog, supstituisanog ili nesupstituisanog C1-C3 alkila i supstituent je izabran od amino.
2. 2. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što R2je izabran od monosupstituisanog, polisupstituisanog ili nesupstituisanog 5-članog ili 6-članog heterocikloalkila i supstituent je izabran od linearnog ili razgranatog C1-C3 alkila.
3. 3. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što R2je izabran od 4-piperidinila i N-metil-4-piperidinila.
4. 4. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što R1je izabran od H, metil, etil, n-propil, izopropil, R2je izabran od 4-piperidinila i N-metil-4-piperidinila.
5. 5. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli izabrano od jedinjenja formule 1, jedinjenja formule 2, jedinjenja formule 3, jedinjenja formule 4, jedinjenja formule 5, jedinjenja formule 6, jedinjenje formule 7 i jedinjenje formule 8, pri čemu su strukturne formule jedinjenja prikazane na sledeći način:
6. 6. Postupak pripreme jedinjenja ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, koji sadrži korak: reagovanja jedinjenja formule VI sa jedinjenjem formule VII i jedinjenjem formule IX u prisustvu alkalija da bi se proizvelo jedinjenje formule I, reakciona jednačina je sledeća:

   pri čemu, R1i/ili R2u jedinjenju formule IX imaju/ima istu definiciju kao u jedinjenju formule I.
7. 7. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za upotrebu kao inhibitor receptor tirozin kinaze.
8. 8. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što inhibitor je višeciljni inhibitor receptor tirozin kinaze; i/ili, receptor tirozin kinaze je FLT3 ili njegovi mutanti; i/ili, inhibitor je selektivni inhibitor, posebno selektivni inhibitor za FLT3 ili njegove mutante.
9. 9. Jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 za upotrebu u lečenju tumora, pri čemu je tumor poželjno izabran od akutne mijeloidne leukemije.
10. 10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd 31