RS65152B1

RS65152B1 - Preparati za lečenje granulomatoze sa poliangiitisom

Info

Publication number: RS65152B1
Application number: RS20240092A
Authority: RS
Inventors: Adam Haeberle
Original assignee: Canem Holdings Llc
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2024-02-29
Also published as: US11446366B2; EP3253406A1; PT3253406T; PL3253406T3; US20230241189A1; EP4335460A2; EP3253406B1; US20160228520A1; FI3253406T3; DK3253406T5; DK3253406T3; EP3253406A4; EP4335460A3; ES2970115T3; WO2016127137A1

Description

Opis

POZADINA

[0001] Granulomatoza sa poliangiitisom (GPA ili Vegenerova granulomatoza) je redak neizlečiv oblik vaskulitisa (inflamacije krvnih sudova) koji zahvata nos, pluća, bubrege i druge organe. GPA karakteriše zapaljenje krvnih sudova (vaskulitis). Kod GPA, oštećenje organa nastaje kao rezultat inflamacije u vaskulitisu koji zahvata male i srednje velike krvne sudove, te usled vrste povrede tkiva koja se naziva granulomatozna inflamacija. Granulom je vrsta upale koja se obično može videti na biopsijama zahvaćenih organa.

[0002] Na početnoj stranici Američkog koledža za reumatologiju, od svakih 100.000 ljudi u Sjedinjenim Državama troje ima GPA. Prema objavljenim izveštajima, učestalost u SAD se procenjuje na čak 8,6 na 1.000.000 ili 2.580 novih slučajeva godišnje. Procenjuje se da prevalenca u SAD iznosi između 26 i 90 tretiranih slučajeva na 1.000.000 godišnje ili više od 7.800 slučajeva godišnje (Watts R, Epidemiology of Systemic Vasculitis, 1995). Bolest se teško dijagnostikuje, a trenutno dostupni tretmani su neadekvatni.

[0003] Najčešće, GPA pogađa sinuse, pluća i bubrege, ali takođe može zahvatiti oči, uši, kožu, nerve, zglobove i druge organe. Usled raznovrsnosti potencijalnog napadanja organa, može se razviti širok raspon simptoma tokom dana do meseci. Za 90% ljudi, prvi simptomi se javljaju u respiratornom traktu (na primer, nosu, sinusima i plućima) i uključuju začepljenje nosa, učestala krvarenja iz nosa, kratak dah i kašalj koji može da produkuje krvavu sluz. Drugi rani simptomi mogu da uključuju, bol u zglobovima, oslabljen sluh, kožne osipe, crvenilo očiju i/ili promene vida, umor, groznicu, gubitak apetita i gubitak težine, noćno znojenje i utrnulost ili gubitak pokreta prstiju ruku, nogu ili udova.

[0004] Trenutno dostupne opcije lečenja su neadekvatne za GPA, sa pacijentima koji imaju smanjen očekivani životni vek i smanjen kvalitet života. Dodatno, svi dostupni tretmani za GPA imaju stalne bezbednosne probleme i funkcionišu po istom opštem principu suzbijanja reaktivnog telesnog odgovora i imuno sistema. Hronična terapija sa glukokortikoidima sama po sebi dovodi do višestrukih sindroma. Samo polovina pacijenata u pogoršanju lečena rituksimabom ima pozitivan odgovor na lečenje, a više ključnih vodećih mišljenja je postavilo pitanja o opravdanosti ponovljenog doziranja rituksimabom. U osnovnoj studiji rituksimaba u lečenju GPA, broj i ozbiljnost neželjenih događaja se nisu smatrali značajno različitim između rituksimaba i ciklofosfamida (CYC, visoko toksično imunosupresivno sredstvo, koje dovodi do steriliteta, problema sa bubrezima itd.). Iako ovo može biti efikasno u spasavanju života pacijenta, ovi tretmani nisu bez problema vezanih za njihovu sopstvenu bezbednost i kvalitet života; dalje oni se ne bave uzrokom same bolesti. Postoji trenutna nezadovoljena potreba za tretmanima jednake ili veće efikasnosti koji imaju povećan sigurnosni profil. Dugotrajno hronično doziranje A1PI se pokazalo u velikoj populaciji kao bezbedno sa profilom benignih neželjenih događaja. Najveći izazovi u upravljanju GPA su održavanje remisije bolesti i izbegavanje morbiditeta i mortaliteta povezanih sa lečenjem.

[0005] Dodatno, više od 70% PR3 pozitivnih GPA pacijenata će imati recidiv i dok je rituksimab odobren za lečenje indikacije, medicinski čelnici u oblasti reumatologije su mišljenja da je ovo radije pomerilo potrebe pacijenata nego da ih eliminiše.

[0006] Na primer, Perez i sar., Rheumatology, 2012 saopštavaju lečenje pacijenta sa teškom deficijencijom A1AT udruženom sa PIZZ genotipom standardnom negom koja obuhvata metilprednizon i prednizon. US 2014/228301 razmatra ideju korišćenja inhibitora alfa-1 proteinaze za lečenje pacijenta koji ima A1PI deficijentni genotip koji boluje od GPA.

[0007] Shodno tome, postoji potreba za novim efikasnim tretmanom GPA koji zaobilazi dugotrajne neželjene efekte dobijene sa trenutno dostupnim terapijama i fokusira se na lečenje osnovnog stanja, a ne na suzbijanje imunološkog sistema.

SAŽETAK

[0008] Pronalazak se odnosi na preparat koji sadrži inhibitor proteinaze 3 (PR3), za upotrebu u lečenju granulomatoze sa poliangiitisom (GPA) kod pacijenta koji nema A1PI deficijentni genotip, pri čemu je inhibitor PR3 inhibitor α-1 proteaze (A1PI), gde preparat sadrži efikasnu količinu navedenog A1PI, i pri čemu primena preparata kod pacijenta inhibira fiziološku funkciju PR3 na taj način tretirajući GPA.

[0009] PR3 inhibitor je prema sadašnjem pronalasku A1 PI. Generalno, PR3 inhibitor može biti protein, njegov polipeptidni fragment ili njegova varijanta ili mali molekul. Neograničavajući primeri PR3 inhibitora koji su ovde otkriveni uključuju, inhibitor α-1 proteaze (A1 PI), serpin B1, Trappin-2, elafin, eglin c, modifikovani α-1 antihimotripsin, α-2 makroglobulin, azapeptid, PR3 antitelo ili njegov fragment antitela, derivat 1,2,5-tiadiazolidin-3-on 1,1 dioksida, derivat N-hidroksisukcinimida, 7-NH2-4-Cl-3-(2-bromoetoksi)izokumarin, 3,4-dihloroizokumarin, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val(OPh)2, Boc-Val-Pro-Val(OPh)2, MeOSuc-Ala-Ala-Pro-ValCh2Cl, ili SURAMIN™. Vaskulitisni sindrom uključuje granulomatozu sa poliangiitisom (GPA ili Vegenerovu granulomatozu).

[0010] Drugi aspekti sadašnje specifikacije otkrivaju komplet koji sadrži PR3 inhibitor.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0011]

Slike 1A-C prikazuju ćelijsku površinu neutrofila sa izloženim i aktiviranim PR3 receptorom. Bez A1 PI, ANCA vezuje PR3 receptor (Slika 1A). Egzogeni A1 PI cepa aktivni domen od PR3 receptora (Slika 1B) što uklanja sposobnost ANCA da se veže za receptor i aktivira neutrofil (Slika 1C).

Slika 2 prikazuje stubasti grafikon koji prikazuje A1 PI inhibiciju proizvodnje IL-6 na način zavisan od doze.

DETALJAN OPIS

[0012] Sadašnji pronalazak je definisan priključenim patentnim zahtevima.

[0013] Stoga, sadašnje otkriće upućuje na potrebu za novom, efikasnom terapijom za GPA, koja se direktno bavi samim mehanizmom delovanja bolesti i zaobilazi kratkoročne i dugoročne neželjene efekte dobijene sa sadašnjim terapijama.

[0014] GPA je deo veće grupe vaskulitisnog sindroma, od kojih svi karakterišu autoimuni napad od strane abnormalnog tipa cirkulišućih antitela nazvanih ANCA (anti-neutrofilna citoplazmatska antitela) protiv malih i srednjih krvnih sudova. ANCA se može podeliti u četiri obrasca kada se vizuelizuje imunofluorescencijom: citoplazmatska ANCA (c-ANCA), C-ANCA (atipična), perinuklearna ANCA (p-ANCA) i atipična ANCA (a-ANCA), takođe poznata kao x-ANCA. ANCA su povezane sa vaskulitisima malih krvnih sudova uključujući, granulomatozu sa poliangiitisom (ranije poznata kao Vegenerova granulomatoza), mikroskopski poliangiitis, primarni tzv. pauci-immune nekrotizirajući polumesečasti glomerulonefritis (vrsta bubrežno-ograničenog mikroskopskog poliangiitisa), Čarg-Strausov (Churg-Strauss) sindrom i vaskulitise indukovane lekom. c-ANCA usmerena na proteinazu 3 (PR3) je prisutna kod 80-90% granulomatoza sa poliangiitisom, 20-40% mikroskopskog poliangiitisa, 20-40% slabo-imuno polumesečastog glomerulonefritisa i 35% Čarg-Strausovog (Churg-Strauss) sindroma. c-ANCA (atipična) su prisutna u 80% cistične fibroze (sa BPI kao ciljnim antigenom) i takođe u zapaljenskoj bolesti creva, primarnom sklerozirajućem holangitisu i reumatoidnom artritisu (sa antitelima na više antigenskih meta). p-ANCA sa MPO specifičnošću nalaze se kod 50% mikroskopskih poliangiitisa, 50% primarnog pauci-immune nekrotizirajućeg polumesečastog glomerulonefritisa i 35% Čarg-Strausovog sindroma. p-ANCA sa specifičnošću za druge antigene povezana su sa inflamatornom bolešću creva, reumatoidnim artritisom, vaskulitisom izazvanim lekovima, autoimunom bolešću jetre, sindromima izazvanim sa lekovima i parazitskim infekcijama. Atipična ANCA je povezana sa sistemskim vaskulitisom izazvanim lekovima, inflamatornom crevnom bolešću i reumatoidnim artritisom.

[0015] PR3 je serinska proteaza prikazana na membranskoj površini neaktivnih i aktiviranih neutrofila. Neutrofili izolovani od pacijenata sa GPA imaju povećan PR3 na ćelijskoj površini u poređenju sa pacijentima bez GPA. Ovo povećanje površinskog PR3 javlja se i kod osoba sa teškim nedostatkom A1PI i kod pacijenata sa normalnim nivoima cirkulišućeg A1PI. Kao što je gore pomenuto, GPA karakteriše autoimunski napad od strane ANCA. U GPA, cirkulišuća c-ANCA vezuju PR3 površinu neutrofila. ANCA vezivanje aktivira ove neutrofile što dovodi do napada i oštećenja krvnih sudova.

[0016] Inhibitor alfa-1 proteinaze ("A1PI"; zvani "alfa 1 antitripsin", "A1AT", "alfa-1-antiproteinaza" ili "serpin A1") je fiziološki inhibitor PR3. Egzogeni A1PI cepa aktivni domen PR3 receptora na površini ćelije neutrofila. Ovo cepanje PR3 receptora sprečava vezivanje citoplazmatskih ANCA (c-ANCA) za PR3 receptor, čime se sprečava PR3-FcyR11a unakrsna veza neophodna za aktivaciju neutrofilnih ćelija. Neutrofili izolovani od pacijenata sa GPA su proučavani in-vitro i potvrđeno je da A1PI može blokirati vezivanje i aktivaciju neutrofila pomoću anti-PR3 IgG i kod zdravih odraslih osoba i kod pacijenata sa GPA. Iako su postojali brojni izveštaji koji zapažaju povećanu incidencu GPA u populaciji sa nedostatkom alfa 1 tripsina (AATD), niko se nije pomakao dalje od toga da bi ispitivao potencijal jedinjenja kao tretmana za bolest, bez obzira na cirkulišuće nivoe A1PI.

[0017] Većina pacijenata sa GPA nema smanjenu količinu endogenog A1PI. Međutim, subjekti koji imaju smanjenu količinu endogenog A1PI, mogu biti pod povećanim rizikom od GPA. Stoga se može smatrati da su subjekti koji imaju bilo S ili Z alele A1PI gena u populaciji sa većom verovatnoćom od GPA ili pod rizikom od razvoja GPA. Rizik je povišen kod pacijenata sa homozigotnim (ZZ ili SS) ili složenim homozigotnim (SZ) genotipovima, iako postoji manji rizik od GPA kod pacijenata koji nose jednu kopiju bilo S ili Z alela. (Mahr i sar. Arthritis Rehem. 2010 December; 62(12): 3760-3767. Međutim, iako postoji povećan rizik, svi subjekti sa endogenim nedostatkom A1PI ne razvijaju GPA. Dakle, ključna karakteristika dijagnoze GPA i pogodnost primene sadašnjih preparata je prisustvo c-ANCA kod subjekta, a ne genotipa A1PI.

[0018] Stoga, ovde je opisan inhibitor PR3 ili PR3 inhibitor za upotrebu u lečenju sindroma vaskulitisa. PR3 inhibitor je agens koji inhibira fiziološku funkciju PR3, kao što su vezivanje PR3, smanjenje, sprečavanje ili inhibiranje vezivanja c-ANCA za PR3, ili sprečavanje PR3 aktivirane degranulacije od strane neutrofila. PR3 inhibitor može biti reverzibilni PR3 inhibitor ili ireverzibilni PR3 inhibitor. Reverzibilni PR3 inhibitor je sastav sa aktivnim sastojkom koji ima afinitet za PR3 preko nekovalentnih interakcija. Ireverzibilni inhibitor PR3 stupa u interakciju koristeći stabilne, kovalentne interakcije sa PR3. PR3 inhibitor može biti nespecifični inhibitor PR3 ili specifični inhibitor PR3. Posebno, mnogi nespecifični PR3 inhibitori su takođe inhibitori humane neutrofilne elastaze (HNE), a ponekad i katepsina G (CG). PR3 inhibitor može da uključuje, bez ograničenja, A1PI, elafin, pre-elafin (tj. Trappin-2), Serpin B1, α-2 makroglobuline, α-2 makroglobulin, Eglin C, modifikovani α-1 antihimtripsin (ACT), azapeptide i antitela na PR3.

[0019] Sadašnje primene takođe, razmatraju upotrebu agensa za uklanjanje domena PR3 koji telo prepoznaje za proizvodnju auto-antitela. Uklanjanjem cilja koncentracija ANCA se može redukovati usled nedostatka stimulusa za b-ćelije imunskog sistema.

[0020] Inhibitori PR3 uključuju, ali nisu ograničeni na: proteine, peptidna antitela i njihove fragmente koji selektivno vezuju PR3, i male molekule. Primeri proteina koji se ovde koriste mogu da uključuju A1PI, Serpin B1, Trappin-2, Elafin, α-2 makroglobulin, modifikovani α-1 antihimotripsin, eglin c, azapeptide i njihove fragmente i varijante. Jedinjenje "male molekule" koje se ovde koristi, može biti na primer, derivat 1,2,5-tiadiazolidin-3-on 1,1 dioksida, derivat N-hidroksisukcinimida, 7-NH2-4-Cl-3-(2-bromoetoksi)izokumarin, 3,4-dihloroizokumarin, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val(OPh)2, Boc-Val-Pro-Val(OPh)2, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-ValCh2CI i SURAMIN™.

[0021] Modifikovani protein ili "varijanta" proteina, kao što je ovde opisano je protein koji ima jedan ili više aminokiselinskih dodataka, delecija ili supstitucija. Kao što je objašnjeno u nastavku, ovi dodaci, delecije ili supstitucije mogu biti konzervativne ili nekonzervativne. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija", kako se ovde koristi, je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici, uključujući bazične bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kiselinske bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Razmene koje se najčešće javljaju su Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gli, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gli, Ala/Pro, Lis/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu i Asp/Gli, u oba smera. Izmene aminokiselina u proteinima i peptidima, koje generalno ne menjaju aktivnost proteina ili peptida, poznate su u tehnici (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

[0022] Izraz "derivat proteina" odnosi se na peptid koji ima jedan ili više ostataka hemijski derivatizovanih reakcijom funkcionalne bočne grupe. Takvi derivatizovani molekuli uključuju, na primer, one molekule u kojima su slobodne amino grupe derivatizovane da obrazuju amin hidrohloride, p-toluen sulfonil grupe, karbobenzoksi grupe, t-butiloksikarbonil grupe, hloracetil grupe ili formil grupe. Slobodne karboksilne grupe, mogu biti derivatizovane da obrazuju soli, metil i etil estre ili druge vrste estara ili hidrazida. Slobodne hidroksilne grupe, mogu biti derivatizovane da bi se obrazovali O-acil ili O-alkil derivati. Imidazolni azot histidina se može derivatizovati da bi se obrazovao N-im-benzilhistidin. Kao derivati su takođe, uključeni oni peptidi koji sadrže jedan ili više prirodnih derivata aminokiselina od dvadeset standardnih aminokiselina. Na primer: 4-hidroksiprolin može biti supstituisan prolinom; 5-hidroksilizin može biti supstituisan za lizin; 3-metilhistidin može biti supstituisan za histidin; homoserin može biti supstituisan za serin; a ornitin može biti supstituisan za lizin.

[0023] Varijante mogu biti okarakterisane bilo identičnošću sekvence ili brojem aminokiselinskih dodataka, delecija ili supstitucija. Fragmenti ili izoforme proteina o kojima se ovde razmatra, mogu uključivati aminokiselinske dodatke, delecije ili supstitucije, koje opet mogu biti okarakterisane identičnošću sekvence ili brojem aminokiselinskih promena.

[0024] Termin "homologija sekvence" ili "identičnost sekvence" kako se ovde koristi odnosi se na procenat identičnosti sekvence između dve polipeptidne sekvence. Da bi se odredio procenat identičnosti između dve polipeptidne sekvence, aminokiselinske sekvence takve dve sekvence su poravnane, poželjno korišćenjem Clustal W algoritma (Thompson, J D, Higgins D G, Gibson T J, 1994, Nucleic Acids Res. 22 (22): 4673-4680), zajedno sa matricom bodovanja BLOSUM 62 (Henikoff S, i Henikoff J. G., 1992, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 89: 10915-10919) i kaznom otvaranja praznine od 10 i kaznom proširenja praznine od 0,1, tako da se podudaranje najvišeg reda dobije između dve sekvence u kojima je najmanje 50% ukupne dužine jedne od sekvenci uključeno u poravnanje. Druge metode koje se mogu koristiti za poravnavanje sekvenci su Needlemanova i Wunschova metoda poravnanja (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443), revidirana od strane Smith i Watermana (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482) tako da se dobije poklapanje najvišeg reda između dve sekvence i da je određen broj identičnih aminokiselina između dve sekvence. Druge metode za izračunavanje procentualne identičnosti između dve aminokiselinske sekvence su generalno poznate u tehnici i uključuju, na primer, one koje su opisali Carillo i Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073) i one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, Njujork, 1988, Bioračunarstvo: projekti informatike i genomike. Generalno, za takve proračune biće korišćeni kompjuterski programi. Kompjuterski programi koji se mogu koristiti u ovom pogledu uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG (Devereux i sar., Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul i sar., J. Molec. Biol., 1990: 215: 403). U jednom aspektu, sadašnje modifikovane varijante sekvence imaju najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 87%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94% najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičnosti sekvence sa drugom sekvencom, bilo na lokalnoj ili punoj dužini osnova.

[0025] Ako je na lokalnoj osnovi, lokalitet je određen regionom nemodifikovane ili nativne sekvence, ili specifično identifikovanim motivom nemodifikovane ili nativne sekvence. U jednom aspektu, lokalitet je najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15, najmanje 16, najmanje 17, najmanje 18 najmanje 19, najmanje 20, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35, najmanje 40, najmanje 45, najmanje 50, najmanje 55, najmanje 60, najmanje 65, najmanje 70, ili najmanje 75 nukleinskih kiselina ili aminokiselina nemodifikovane ili prirodne sekvence.

[0026] U jednoj realizaciji, PR3 inhibitor je A1PI ili njegova varijanta. A1PI je serpin (gen "Serpin A1"). A1PI ima tri izoforme, od kojih je prva sekvenca od 418 aminokiselina iz SEK ID BR: 1. Druga su aminokiseline 1-359 iz SEK ID BR: 1 sa dodatkom VRSP na C-terminalu, a treća izoforma je sekvenca koja ima aminokiseline 1-306 iz SEK ID BR: 1. Signalni peptid u A1PI sekvencama su aminokiseline 1-24 iz SEK ID BR: 1. Kada je izražena kod ljudi glikozilacija se događa na aminokiselinskim položajima 70 (N-vezan), 107 (N-vezan) i 271 (N-vezan). S-cisteinil cistein se može javiti na aminokiselinskom položaju 256 SEK ID BR: 1. A1PI je komercijalizovan u obliku intravenskih formulacija kao ZEMAIRA™ (CSL Behring), ARALAST™ (BAXTER), ARALAST NP™ (BAXTER), GLASSIA™ (Baxter), PROLASTIN™ (Grifols Therapeutics), PROLASTIN-C™ (Grifols Therapeutics).

[0027] U aspektima ove realizacije, inhibitor PR3 je A1PI koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 1 sa dodatkom VRSP na C-terminalu, ili aminokiseline 1-306 iz SEK ID BR: 1. U drugim aspektima ove realizacije, inhibitor PR3 je A1PI koji ima identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 1, aminokiseline 1-359 od SEK ID BR: 1 sa dodatkom VRSP na C-terminalu, ili aminokiseline 1-306 od SEK ID BR: 1. U još drugim aspektima ovog izvođenja, PR3 inhibitor je A1PI koji poseduje identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najviše 70%, najviše 75%, najviše 80%, najviše 85%, najviše 86%, najviše 87%, najviše 88%, najviše 89%, najviše 90%, najviše 91%, najviše 92%, najviše 93%, najviše 94%, najviše 95%, najviše 96%, najviše 97%, najviše 98% ili najviše 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 1, aminokiseline 1-359 od SEK ID BR: 1 sa dodatkom VRSP na C-terminalu, ili aminokiseline 1-306 od SEK ID BR: 1.

[0028] U drugim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je A1PI koji ima, npr., najmanje 5 aminokiselina, najmanje 6 aminokiselina, najmanje 7 aminokiselina, najmanje 8 aminokiselina, najmanje 9 aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina, najmanje 11 aminokiselina, najmanje 12 aminokiselina, najmanje 13 aminokiselina, najmanje 14 aminokiselina, najmanje 15 aminokiselina, najmanje 16 aminokiselina, najmanje 17 aminokiselina, najmanje 18 aminokiselina kiselina, najmanje 19 aminokiselina, najmanje 20 aminokiselina, najmanje 21 aminokiselina, najmanje 22 aminokiseline, najmanje 23 aminokiseline, najmanje 24 aminokiseline, najmanje 25 aminokiselina, najmanje 26 aminokiselina, najmanje 27 aminokiselina, najmanje 28 aminokiselina, najmanje 29 aminokiselina, najmanje 30 aminokiselina, najmanje 31 aminokiselina, najmanje 32 aminokiseline, najmanje 33 aminokiseline, najmanje 34 aminokiseline, najmanje 35 aminokiselina, najmanje 36 aminokiselina, najmanje 37 aminokiselina, najmanje 38 aminokiselina, najmanje 39 aminokiselina ili najmanje 40 aminokiselina, susedne i/ili nesusedne aminokiselinske delecije, dodavanja i/ili supstitucije u odnosu na SEK ID BR: 1, aminokiseline 1-359 od SEK ID BR: 1 sa dodatkom VRSP na C-terminalu, ili aminokiseline 1-306 od SEK ID BR: 1. U još drugim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je A1PI koji ima, npr., najviše 5 aminokiselina, najviše 6 aminokiselina, najviše 7 aminokiselina, najviše 8 aminokiselina, najviše 9 aminokiselina, najviše 10 aminokiselina, najviše 11 aminokiselina, najviše 12 aminokiselina, najviše 13 aminokiselina, najviše 14 aminokiselina, najviše 15 aminokiselina, najviše 16 aminokiselina, najviše 17 aminokiselina, najviše 18 aminokiselina, najviše 19 aminokiselina, najviše 20 aminokiselina, najviše 21 aminokiselina, najviše 22 aminokiseline, najviše 23 aminokiseline, najviše 24 aminokiseline, najviše 25 aminokiselina, najviše 26 aminokiselina, najviše 27 aminokiselina, najviše 28 aminokiselina, najviše 29 aminokiselina, najviše 30 aminokiselina, najviše 31 aminokiselina, najviše 32 aminokiseline, najviše 33 aminokiseline, najviše 34 aminokiseline, najviše 35 aminokiselina, najviše 36 aminokiselina, najviše 37 aminokiselina, najviše 38 aminokiselina, najviše 39 aminokiselina ili najviše 40 aminokiselina, susedne i/ili nesusedne aminokiselinske delecije, dodavanja i/ili supstitucije u odnosu na SEK ID BR: 1, aminokiseline 1-359 od SEK ID BR: 1 sa dodatkom VRSP na C-terminalu, ili aminokiseline 1-306 od SEK ID BR: 1.

[0029] U još nekim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je A1PI koji ima sledeće aminokiselinske promene u odnosu na SEK ID BR: 1: S4L, aminokiselina 12 može biti uklonjena, L23P, D26H, D26A, T37A, H39L, A58T, L61P, R63C, L65P, S69F, aminokiselina 75 može nedostajati, S75F, A84T, G91E, T92I, T96A, T109M, P112T, I116N, R125H, G139S, G139D i N140G, G172R, G172W, Q180E, T174H, aminokiseline 190-198 se menjaju iz QGKIVDVLK u GFQNAILVR, E228K, E229D, V237A, T273N, D280V, D280G, E288V, aminokiselina 305 može biti uklonjena, V326I, S354F, A360T, D365N, E366K, M382R, P386H, P386T, E387K, P393L, E400D, G410L, N414S i P415H.

[0030] U jednoj realizaciji, inhibitor PR3 je Serpin B1 ili njegova varijanta. Serpini su ireverzibilni samoubilački inhibitori serinskih proteaza. Serpini stupaju u interakciju sa svojim ciljem pomoću mehanizma koji uključuje cepanje reaktivne centralne petlje (RCL) serpina između P1 i P1' ostatka i njegovo potpuno umetanje u A list serpina, što rezultira pomeranjem od pola do pola kovalentno vezane proteaze unutar kompleksa. (Jegot i sar., FASEB J., 25: 3019-3031, 2011). Vezivanje modifikovanog Serpina B1 za aktivirane neutrofile je pokazalo smanjenje vezivanja između PR3 i ANCA. (Jegot i sar., FASEB J., 25: 3019-3031, 2011). Serpin B1 je sekvenca od 379 aminokiselina od SEK ID BR: 2. Serpin B1 RCL je aminokiselinski segment Serpina B1 koji se nalazi na ostacima 339-349 SEK ID BR: 2 i ima aminokiselinsku sekvencu GIATFCMLMPE (SEK ID BR: 3).

[0031] U aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je serpin B1 koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 2. U drugim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je Serpin B1 koji ima identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 2. U još drugim aspektima ovog izvođenja, PR3 inhibitor je Serpin B1 koji poseduje identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najviše 70%, najviše 75%, najviše 80%, najviše 85%, najviše 86%, najviše 87%, najviše 88%, najviše 89%, najviše 90%, najviše 91%, najviše 92%, najviše 93%, najviše 94%, najviše 95%, najviše 96%, najviše 97%, najviše 98% ili najviše 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 2.

[0032] U drugim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je Serpin B1 koji ima, npr., najmanje 5 aminokiselina, najmanje 6 aminokiselina, najmanje 7 aminokiselina, najmanje 8 aminokiselina, najmanje 9 aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina, najmanje 11 aminokiselina, najmanje 12 aminokiselina, najmanje 13 aminokiselina, najmanje 14 aminokiselina, najmanje 15 aminokiselina, najmanje 16 aminokiselina, najmanje 17 aminokiselina, najmanje 18 aminokiselina kiselina, najmanje 19 aminokiselina, najmanje 20 aminokiselina, najmanje 21 aminokiselina, najmanje 22 aminokiseline, najmanje 23 aminokiseline, najmanje 24 aminokiseline, najmanje 25 aminokiselina, najmanje 26 aminokiselina, najmanje 27 aminokiselina, najmanje 28 aminokiselina, najmanje 29 aminokiselina, najmanje 30 aminokiselina, najmanje 31 aminokiselina, najmanje 32 aminokiseline, najmanje 33 aminokiseline, najmanje 34 aminokiseline, najmanje 35 aminokiselina, najmanje 36 aminokiselina, najmanje 37 aminokiselina, najmanje 38 aminokiselina, najmanje 39 aminokiselina ili najmanje 40 aminokiselina, susedna i/ili nesusedna brisanja, dodavanja i/ili supstitucije aminokiselina u odnosu na SEK ID BR: 2. U još drugim aspektima ovog izvođenja, inhibitor PR3 je serpin B1 koji ima, npr., najviše 5 aminokiselina, najviše 6 aminokiselina, najviše 7 aminokiselina, najviše 8 aminokiselina, najviše 9 aminokiselina, najviše 10 aminokiselina, najviše 11 aminokiselina, najviše 12 aminokiselina, najviše 13 aminokiselina, najviše 14 aminokiselina, najviše 15 aminokiselina, najviše 16 aminokiselina, najviše 17 aminokiselina, najviše 18 aminokiselina, najviše 19 aminokiselina, najviše 20 aminokiselina, najviše 21 aminokiselina, najviše 22 aminokiseline, najviše 23 aminokiseline, najviše 24 aminokiseline, najviše 25 aminokiselina, najviše 26 aminokiselina, najviše 27 aminokiselina, najviše 28 aminokiselina, najviše 29 aminokiselina, najviše 30 aminokiselina, najviše 31 aminokiselina, najviše 32 aminokiseline, najviše 33 aminokiseline, najviše 34 aminokiseline, najviše 35 aminokiselina, najviše 36 aminokiselina, najviše 37 aminokiselina, najviše 38 aminokiselina, najviše 39 aminokiselina ili najviše 40 aminokiselina, susedna i/ili nesusedna brisanja, dodavanja i/ili supstitucije aminokiselina u odnosu na SEK ID BR: 2.

[0033] U drugom aspektu ove realizacije, serpin B1 može biti modifikovan izvan RCL, ali takođe sadrži do 1, do 2 ili do 3 aminokiselinske supstitucije u RCL regionu od SEK ID BR: 3.

[0034] U drugom aspektu ovog izvođenja, serpin B1 može biti modifikovan na jednom ili više od svoja dva funkcionalna mesta: F343-C344 iz SEK ID BR: 2 (interreaguje sa CG); i C344M345 iz SEK ID BR: 2 (otcepljen pomoću PR3 i HNE da bi se pokrenulo ireverzibilno vezivanje proteaze).

F343 je P1 za reakciju sa CG, a P2 je za inhibiciju PR3 i HNE, i reaguje sa ostatkom proteaze 99 PR3. U drugom aspektu ovog izvođenja, F343 je supstituisan asparaginom (Asp) koji potiskuje cepanje pomoću CG i poboljšava cepanje pomoću PR3. U drugom aspektu ove realizacije, M345 je supstituisan argininom (Arg), koji pomaže kod odvajanja HNE.

[0035] U drugom aspektu ove realizacije, modifikovani RCL, može biti bilo koji od: GIATDCMLMPE (SEK ID BR: 4), GIATDCRMLMPE (SEK ID BR: 5), GIATDARLMPE (SEK ID BR: 6), GDATDARLMPE (SEK ID BR: 7), GISTDARLMPE (SEK ID BR: 8) (poželjni inhibitor PR3 jer se samo polako otcepljuje pomoću HNE).

[0036] U jednoj realizaciji, inhibitor PR3 je Trappin-2 ili njegova varijanta. Trappin-2 (aka "pre-elafin") je prekursor elafina. Elafin je zreli proizvod Trappin-2, koji predstavlja 57 C-terminalnih aminokiselina iz Trappin-2 (aminokiseline 61-117 od SEK ID BR: 9). Elafin je inhibitor epitelne proteinaze i poznat je i kao anti-leukoproteinaza dobijena iz kože (SKALP), inhibitor peptidaze 3 ili elastaza-specifični inhibitor (ESI). Trappin-2 ima dužinu od 117 aminokiselina i poseduje aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 9. Drugi izvori uključuju proteinske sekvence koje su prikazane u GENBANK.TM. Pristupni br. NP002629, P19957, NP003055, BAA02441, JH0614, AAB34627, CAA79223 i AAB26371, kao što je pristupljeno 5. novembra 2014. EntrezGene broj 5266. Disulfidne veze se mogu javiti između aminokiselina 76 i 105, 83 i 109, 92 i 104 i 98 i 113 SEK ID BR: 9. Trappin-2, inhibitor proteaze, ima jedinstveni N-terminalni domen koji mu omogućava da se pomoću transglutaminaze poveže sa proteinima ekstracelularnog matriksa. Ovaj domen (aminokiseline 31-47 i/ili 55-71 iz SEK ID BR: 9) sadrži nekoliko ponovljenih motiva (predstavljenih ovim unosom) sa konsenzus sekvencom Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys (SEK ID BR : 10), a oni zajedno mogu učvrstiti celi molekul za proteine ekstracelularnog matriksa, kao što su laminin, fibronektin, beta-kristalin, kolagen IV, fibrinogen i elastin, unakrsnim vezama katalizovanim transglutaminazom. Ceo domen je bogat glutaminom i lizinom, što omogućava i transglutaminazi(ama) da katalizuju obrazovanje intermolekularne epsilon-(gama-glutamil)lizin izopeptidne veze [PMID: 17964057]. Genski proizvod pre-elafin se sastoji od 117 aminokiselina: inicijatora Met, navodno signalnog peptida od 22 aminokiseline, prosekvence od aminokiselina 23-60 iz SEK ID BR: 9 i 57 C-terminalnih aminokiselina za zreli elafin (amino kiseline 61-117 SEK ID BR: 9).

[0037] U aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je Trappin-2 koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 9, aminokiseline 26-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 35-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 61-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 31-47 iz SEK ID BR: 9, ili aminokiseline 55-71 iz SEK ID BR: 9. U drugim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je Trappin-2 koji ima identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 9, aminokiseline 26-117 od SEK ID BR: 9, aminokiseline 35-117 od SEK ID BR: 9, aminokiseline 61-117 od SEK ID BR: 9, aminokiseline 31-47 od SEK ID BR: 9 ili aminokiseline 55-71 od SEK ID BR: 9. U još drugim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je Trappin-2 koji ima identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najviše 70%, najviše 75%, najviše 80%, najviše 85%, najviše 86%, najviše 87%, najviše 88%, najviše 89%, najviše 90%, najviše 91%, najviše 92%, najviše 93%, najviše 94%, najviše 95%, najviše 96%, najviše 97%, najviše 98% ili najviše 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 9, aminokiseline 26-117 od SEK ID BR: 9, aminokiseline 35-117 od SEK ID BR: 9, amino kiseline 61-117 od SEK ID BR: 9, aminokiseline 31-47 od SEK ID BR: 9, ili aminokiseline 55-71 od SEK ID BR: 9.

[0038] U drugim aspektima ove realizacije, inhibitor PR3 je Trappin-2 koji ima, npr., najmanje 5 aminokiselina, najmanje 6 aminokiselina, najmanje 7 aminokiselina, najmanje 8 aminokiselina, najmanje 9 aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina, najmanje 11 aminokiselina, najmanje 12 aminokiselina, najmanje 13 aminokiselina, najmanje 14 aminokiselina, najmanje 15 aminokiselina, najmanje 16 aminokiselina, najmanje 17 aminokiselina, najmanje 18 aminokiselina, najmanje 19 aminokiselina ili najmanje 20 aminokiselina, susedne i/ili nesusedne aminokiselinske delecije, dodavanja i/ili supstitucije u odnosu na SEK ID BR: 9, aminokiseline 26-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 35-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 61-117 iz SEK ID BR: 9, amino kiseline 31-47 iz SEK ID BR: 9, ili aminokiseline 55-71 iz SEK ID BR: 9. U još drugim aspektima ove realizacije, PR3 inhibitor je Trappin-2 koji ima, na primer, najviše 5 aminokiselina, najviše 6 aminokiselina, najviše 7 aminokiselina, najviše 8 aminokiselina, najviše 9 aminokiselina, najviše 10 aminokiselina, najviše 11 aminokiselina, najviše 12 aminokiselina, najviše 13 aminokiselina, najviše 14 aminokiselina, najviše 15 aminokiselina, najviše 16 aminokiselina, najviše 17 aminokiselina, najviše 18 aminokiselina, najviše 19 aminokiselina ili najviše 20 aminokiselina, susedne i/ili nekontinualne delecije aminokiselina, dodavanja i/ili supstitucije u odnosu na SEK ID BR: 9, aminokiseline 26-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 35-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 61-117 iz SEK ID BR: 9, aminokiseline 31-47 iz SEK ID BR: 9, ili aminokiseline 55-71 iz SEK ID BR: 9.

[0039] U jednoj realizaciji, Trappin-2 uključuje aminokiselinske sekvence koje imaju supstitucije na aminokiselinama 17, 34, 91 i 92 iz SEK ID BR: 9. U jednoj realizaciji, Trappin-2 može uključivati do 4, do 3, do 2 ili do 1 supstitucije aminokiselina kao što sledi: T17M, T34P, R91C ili C92A u poređenju sa SEK ID BR: 9.

[0040] Elafin gen je smešten unutar lokusa od 700 kilobaza na hromozomu 20q13 koji sadrži četrnaest gena koji kodiraju proteine domena kiselog proteina surutke (WAP) (npr. aminokiselinske položaje 69-117 od SEK ID BR: 9). Sam Elafin je WAP domen koji sadrži protein. Elafin pripada genskoj familiji Trappin i po nedavnoj klasifikaciji dobio je sistematski naziv Trappin-2. Trappin familija je definisana N-terminalnim domenom supstrata transglutaminaze i C-terminalnim jezgrom sa četiri disulfida. Pretpostavlja se da trappini igraju ulogu u regulaciji inflamacije i zaštiti od oštećenja tkiva u slojevitom epitelu. Elafin je inhibitor leukocitne elastaze i proteinaze-3 i dodatno je supstrat za transglutaminaze. Protein je konstitutivno eksprimiran u različitim epitelima, uključujući one folikula dlake, jednjaka, vagine i usne duplje. Elafin nije prisutan u normalnoj ljudskoj koži, ali je snažno indukovan u inflamatornim stanjima, kao što su psorijaza i zarastanje rana. Protein pune dužine se prevodi kao protein od 12,3 kDa od 117 aminokiselina nazvan pre-Elafin ili Trappin-2. Cepanjem signalnog peptida dobija se zreli protein sa molekulskom masom od 9,9 kDa. Izlučeni protein od 9,9 kDa je glavni oblik koji se nalazi u medijumu kulture. U ekstraktima kože prisutan je oblik od 6 kDa koji sadrži najviše 57 C-terminalnih aminokiselina. U serumu izgleda da su prisutna oba oblika od 9,9 i 6 kDa. U serumu/plazmi zdrave osobe prisutno je oko 10-50 ng/mL Elafina.

[0041] Konstante brzine asocijacije i disocijacije za Elafin su izmerene kao konstanta brzine asocijacije od 4,0 x 10<-6>M<-1>s<-1>, konstanta brzine disocijacije od 1,7 x 10<-3>s<-1>i konstanta inhibicije od 4,2 x 10<-10>M. (Ying i Simon, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, V. 24, 2001, str. 83-89). Ravnotežna konstanta disocijacije (Ki) za asocijaciju proteinaza-3/elafin je 20 nM. Asocijacije proteinaze-3/Trappin-2 navodno imaju Ki od 12 nm. Međutim, ispitivane su vrednosti Ki i za trapin i elafin da budu u sub-nanomolarnom opsegu (vidi npr. Nobar i sar, FEBS 272 (2005) 588305893 apstrakt).

[0042] Drugi proteinski ili peptidni inhibitori PR3, uključuju alfa-2 makroglobulin, Eglin C (Rao i sar., J. Biol. Chem 1991; 266:9540-8), modifikovani Alfa-1 antihimtripsin (ACT) (Grouas i sar., Biochem Biophys Res Commun 1997, 33: 697-9 koji opisuju bioinženjersku, rekombinantnu varijantu ACT (LEX032)) i azapeptide (Korkmaz i sar., Current Pharmaceutical Design, 2013, v. 19, br. 6, str. 966-76). Jedan primer azapeptida od interesa ima strukture Abz-VADCAQ-EDDnp (SEK ID BR: 12) i Abz-VADCRDRQ-EDDnp (SEK ID BR: 13), Abz-VAECCQ-EDDnp (SEK ID BR: 14) i Abz-QPMDVVQSVPQ-EDDnp (SEK ID BR: 15). (EDDnp=N-(2,4-dinitrofenil)etilendiamin); Abz= orto-aminobenzojeva kiselina).

[0043] Antitela protiv PR3 ili njegovih fragmenata vezuju se za jedan ili više epitopa PR3. Primeri epitopa uključuju pojedinačnu aminokiselinsku sekvencu, trodimenzionalnu strukturu obrazovanu od aminokiselinske sekvence, aminokiselinsku sekvencu koja ima šećerni lanac vezan za nju, trodimenzionalnu strukturu obrazovanu od aminokiselinske sekvence koja ima vezan šećerni lanac na nju, i slično, a koje monoklonsko antitelo prepoznaje i za koje se vezuje. Antitelo može biti poliklonsko ili monoklonsko.

[0044] PR3 ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 11. Aminokiseline 1-25 od SEK ID BR: 11 su signalna sekvenca. PR3 ima aktivne položaje na aminokiselinama 71, 118 i 203 iz SEK ID BR: 11. Aminokiseline 26 i 27 i 249-256 iz SEK ID BR: 11 se cepaju tokom obrade, a zreli protein uključuje aminokiseline 28-248 iz SEK ID BR: 11.

[0045] U drugim aspektima ove realizacije, PR3 ima identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 11 ili aminokiselinama 28-248 od SEK ID BR: 11. U još drugim aspektima ovog izvođenja, PR3 ima identičnost aminokiselinske sekvence od, npr., najviše 70%, najviše 75%, najviše 80%, najviše 85%, najviše 86%, najviše 87%, najviše 88%, najviše 89%, najviše 90%, najviše 91%, najviše 92%, najviše 93%, najviše 94%, najviše 95%, najviše 96%, najviše 97%, najviše 98% ili najviše 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 11 ili aminokiselinama 28-248 od SEK ID BR: 11.

[0046] U drugim aspektima ove realizacije, PR3 ima, npr., najmanje 5 aminokiselina, najmanje 6 aminokiselina, najmanje 7 aminokiselina, najmanje 8 aminokiselina, najmanje 9 aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina, najmanje 11 aminokiselina, najmanje 12 aminokiselina, najmanje 13 aminokiselina, najmanje 14 aminokiselina, najmanje 15 aminokiselina, najmanje 16 aminokiselina, najmanje 17 aminokiselina, najmanje 18 aminokiselina, najmanje 19 aminokiselina, najmanje 20 aminokiselina, najmanje 21 aminokiselina, najmanje 22 aminokiseline, najmanje 23 aminokiseline, najmanje 24 aminokiseline, najmanje 25 aminokiselina, najmanje 26 aminokiselina, najmanje 27 aminokiselina, najmanje 28 aminokiselina, najmanje 29 aminokiselina, najmanje 30 aminokiselina, najmanje 31 aminokiselina, najmanje 32 aminokiseline, najmanje 33 aminokiseline, najmanje 34 aminokiseline, najmanje 35 aminokiselina, najmanje 36 aminokiselina, najmanje 37 aminokiselina, najmanje 38 aminokiselina, najmanje 39 aminokiselina ili najmanje 40 aminokiselina, susedne i/ili nesusedne delecije aminokiselina, dodavanja i/ili supstitucije u odnosu na SEK ID BR: 11 ili aminokiseline 28-248 od SEK ID BR: 11. U još drugim aspektima ove realizacije, PR3 ima, npr., najviše 5 aminokiselina, najviše 6 aminokiselina, najviše 7 aminokiselina, najviše 8 aminokiselina, najviše 9 aminokiselina, najviše 10 aminokiselina, najviše 11 aminokiselina, najviše 12 aminokiselina, najviše 13 aminokiselina, najviše 14 aminokiselina, najviše 15 aminokiselina, najviše 16 aminokiselina, najviše 17 aminokiselina, najviše 18 aminokiselina, najviše 19 aminokiselina, najviše 20 aminokiselina, najviše 21 aminokiselina, najviše 22 aminokiseline, najviše 23 aminokiseline, najviše 24 aminokiseline, najviše 25 aminokiselina, najviše 26 aminokiselina, najviše 27 aminokiselina, najviše 28 aminokiselina, najviše 29 aminokiselina, najviše 30 aminokiselina, najviše 31 aminokiselina, najviše 32 aminokiseline, najviše 33 aminokiseline, najviše 34 aminokiseline, najviše 35 aminokiselina, najviše 36 aminokiselina, najviše 37 aminokiselina, najviše 38 aminokiselina, najviše 39 aminokiselina ili najviše 40 aminokiselina, susedne i/ili nesusedne aminokiselinske delecije, dodavanja i/ili supstitucije u odnosu na SEK ID BR: 11 ili aminokiseline 28-248 od SEK ID BR: 11.

[0047] U drugom aspektu ove realizacije, PR3 može da uključuje do 12, do 11, do 10, do 9, do 8, do 7, do 7, do 6, do 5, do 4, do 3, do 2 ili do 1 aminokiselinske delecije ili supstitucije iz SEK ID BR: 11 kao što sledi: A2R, S38I, P40PI, Q46E, R48A, S64D, A70P, V119I, A135T, T136S i/ili se može ukloniti aminokiselina 255.

[0048] U drugom aspektu ove realizacije, antitelo prepoznaje jedan ili više od Lys99, Ser195, Asp102 i His57 iz SEK ID BR: 11.

[0049] Antitelo koje se vezuje za PR3 sa visokim afinitetom je antitelo koje ima dovoljan afinitet kao terapijsko antitelo, poželjno antitelo koje se vezuje za PR3 sa vrednošću konstante disocijacije KD manjom od 1x10<7>M, manjom od 1x10<8>M, manjom od 1x10<9>M, manjom od 7x10<-10>M, ili manjom od 2x10<-10>Μ u pogledu afiniteta. Stoga, antitelo iz sadašnjeg pronalaska može da ispolji visoke terapeutske efekte. U jednoj realizaciji, antitelo se sporo odvaja od PR3 vezivanja.

[0050] U jednoj realizaciji, epitop je linearni epitop, i antitelo ili fragment antitela specifično prepoznaju sekvencu od najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, ili najmanje 15 susednih aminokiselina od SEK ID BR: 11, ili sekvence koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87 %, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili najmanje 100% identičnost sekvence sa odgovarajućim regionom iz SEK ID BR: 11.

[0051] Antitela mogu biti kompletna antitela ili delovi antitela koji su sposobni da se selektivno vezuju za PR3 i inhibiraju interakciju PR3 sa c-ANCA ili degranulaciju neutrofila. Izraz "antitelo" kako se ovde koristi ima za cilj da uključuje antitela, imunoglobulinske lance, monoklonska antitela, poliklonska antitela, himerna antitela i varijante antitela koje sadrže jednu ili više karakterističnih struktura antitela. Karakteristične strukture antitela uključuju fragmente antitela, zglobne regione antitela, Fc region, teški lanac pune dužine, laki lanac pune dužine, varijabilni region, konstantni region, CDR (1, 2 ili 3), itd. Antitela takođe, uključuju himerna antitela i fuzione proteine. Strukture antitela se mogu uzeti iz imunoglobulina kao što su IgM, IgG, IgE, IgA ili IgD.

[0052] Pored toga, sadašnje primene razmatraju primenu malih molekula. Jedinjenje "male molekule" za upotrebu ovde može biti, na primer, derivat 1,2,5-tiadiazolidin-3-on 1,1 dioksida, derivat N-hidroksisukcinimida, 7-NH2-4-Cl-3-(2-bromoetoksi)izokumarin, 3,4-dihloroizokumarin, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val(OPh)2, Boc-Val-Pro-Val(OPh)2, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-ValCh2Cl, N-tozil-L-fenilalanin-hlorometil keton (TPCK) i SURAMIN™. Mali molekuli od interesa se mogu naći u Korkmaz i sar., Current Pharmaceutical Design, 2013, 19, 966-976. [0053] Kako se ovde koristi, izraz "subjekt" označava bilo kog sisara, a posebno čoveka, i takođe se može nazvati, npr., kao pojedinac ili pacijent. "Subjekt kome je potrebno lečenje" za GPA prema metodama koje su ovde otkrivene je subjekt koji ima GPA, subjekt koji ima c-ANCA, ili subjekt koji je pod rizikom od GPA.

[0054] Primarna populacija pacijenata od interesa su pacijenti kojima je dijagnostikovan GPA (tj. Vegenerova granulomatoza (WG)). Ovu populaciju karakteriše prisustvo c-ANCA.

[0055] U jednoj realizaciji, doza koja je administrirana nedeljno se kreće od 1-1000 mg/kg, 1-500 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 1-50 mg/kg, 10-500 mg/ kg, 10-250 mg/kg, 10-200 mg/kg, 10-150 mg/kg, 10-100 mg/kg, 10-50 mg/kg, 50-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg, 50-250 mg/kg, 50-200 mg/kg, 50-150 mg/kg, 50-100 mg/kg, 20-500 mg/kg, 20-250 mg/kg, 20-200 mg/kg, 20-150 mg/kg, 20-100 mg/kg, 60-120 mg/kg ili 20-60 mg/kg. U jednoj realizaciji, kada se daje protein, na primer sa A1PI, opseg doziranja može da se kreće od 60-240 mg/kg telesne težine koji se primenjuje jednom nedeljno. U jednoj realizaciji, A1PI se primenjuje u dozi od 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 120 mg/kg, 140 mg/kg, 160 mg/kg ili 180 mg/kg.

[0056] U jednoj realizaciji, režim doziranja tokom toka lečenja uključuje "dozu punjenja" i "dozu održavanja". Terapija se može započeti sa "dozom punjenja" (tj., početnom višom dozom leka koja se može dati na početku toka lečenja pre nego što se daje niža doza održavanja tokom dužeg vremenskog perioda). Doza održavanja može uključivati 25%, 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 66%, 70%, 75%, 80% ili više aktivnog sastojka sadržanog u dozi punjenja.

[0057] U jednoj realizaciji, režim doziranja tokom toka lečenja uključuje dozu punjenja, jednu ili više doza "smanjenja" i dozu održavanja. Doza "smanjenja (korak-niže)" je doza između doze punjenja i doze održavanja.

[0058] Ako se primenjuje intravenozno, brzina primene može da varira u zavisnosti od koncentracije leka, jačine leka i karakteristika pacijenta. Poželjno je da brzina primene bude dovoljna za isporuku kompletne doze u periodu od 5 minuta do 1 sata, od 5 minuta do 45 minuta, od 10 minuta do 40 minuta, od 15 minuta do 35 minuta, od 5 minuta do 30 minuta, ili od 10 minuta do 30 minuta. U jednoj realizaciji, brzina primene može biti približno 0,2 mL/kg/min.

[0059] Primena jedinjenja ili formulacije može biti jednom mesečno, jednom svake druge nedelje, jednom nedeljno, jednom dnevno, dva puta dnevno ili češće. Učestalost se može smanjiti tokom faze održavanja lečenja, na primer, jednom svake druge nedelje umesto svake nedelje ili svakog dana. Doza i učestalost primene mogu biti podešeni na osnovu procene lekara koji leči, na primer, uzimajući u obzir kliničke znakove, patološke znakove i kliničke i subkliničke simptome bolesti stanja lečenih sadašnjim metodama, kao i klinička istoriju pacijenta. Na primer, veće doze ili učestalost primene, ili duže trajanje lečenja mogu biti indikovani kada pacijent pokazuje simptome GPA ili pogoršanje vaskulitisa, ili ako pacijent ima istoriju prethodnog GPA. Specifični primeri doziranja i učestalosti su dati u primerima.

[0060] U jednoj realizaciji, primenjena doza će biti rAAV hA1PI pri nivoima doze koji se sastoje od vektorskih genoma (VG)/kg telesne težine intramuskularnom injekcijom, subkutanom injekcijom, intravenskom infuzijom ili inhalacijom pomoću raspršivača.

[0061] U jednoj realizaciji, primenjena doza će biti doza punjenja proteina primenjena pre upotrebe rAAV hA1 PI, pri nivoima doze koji se sastoje od vektorskih genoma (VG)/kg telesne težine intramuskularnom injekcijom, subkutanom injekcijom, intravenskom infuzijom ili inhalacijom raspršivačem.

[0062] Dužinu lečenja, tj. broj dana, meseci ili godina, će lako odrediti lekar koji leči subjekta; međutim, broj dana lečenja može da se kreće od oko 1 dana do oko 365 dana ili više. Na primer, dužina lečenja dozom punjenja može biti samo prva primena, ili može biti kurs doze jednom nedeljno u periodu od dve nedelje do mesec dana ili više. Period postupnog lečenja nakon početne doze punjenja može varirati od jedne nedeljne doze do doze jednom nedeljno tokom 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja ili više. Zatim naredni period održavanja doziranja može da se kreće od jednog meseca, do 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, 12 nedelja, 13 nedelja, 14 nedelja, 15 nedelja, 16 nedelja, 18 nedelja, 20 nedelja, 24 nedelje, 25 nedelja, 28 nedelja, 30 nedelja, 6 meseci, 8 meseci, godinu dana, dve godine ili više. U jednoj realizaciji, dužina perioda održavanja može trajati do kraja životnog veka pacijenta da bi se suzbili hronični simptomi ili recidiv ili pogoršanje. U jednoj realizaciji, ovaj doživotni tretman je A1PI dopunska terapija. Kao što je predviđeno sadašnjim metodama, i razmatrano u nastavku, efikasnost lečenja može biti praćena tokom samog toka lečenja da bi se utvrdilo da li je lečenje bilo uspešno, ili je neophodno dodatno (ili modifikovano) lečenje.

[0063] Kako se ovde koriste izrazi "terapeutski efikasna" i "efikasna količina", koji se koriste naizmenično, primenjeni na dozu ili količinu odnose se na količinu sastava, jedinjenja ili farmaceutske formulacije koja je dovoljna da dovede do željene aktivnosti nakon primene kod subjekta kome je to potrebno.

[0064] U kontekstu sadašnjeg pronalaska, izraz "terapeutski efikasan" se odnosi na onu količinu preparata, jedinjenja ili farmaceutske formulacije koja je dovoljna da smanji, eliminiše ili odloži najmanje jedan simptom bolesti ili stanja koje je ovde navedeno, npr. GPA . Kada se primenjuje kombinacija aktivnih agenasa, efikasna količina kombinacije, ili pojedinačnih agenasa, može, ili ne mora da uključuje količine od svakog agensa koje bi bile efikasne ako se primenjuju pojedinačno. Doziranje terapeutske formulacije će varirati, u zavisnosti od prirode bolesti ili stanja, pacijentove medicinske istorije, učestalosti primene, načina primene, uklanjanja agensa iz domaćina i slično. Početna doza može biti veća, praćena manjim dozama održavanja. Doza može biti administrirana, na primer, nedeljno, dvonedeljno, dnevno, polunedeljno, itd., da bi se održao efikasan nivo doziranja.

[0065] Kako se ovde koristi, "lečenje" ili "tretman" stanja, poremećaja ili stanja (npr. GPA) uključuje: (1) sprečavanje ili odlaganje pojave kliničkih ili subkliničkih simptoma stanja, poremećaja ili stanja koje se razvija kod sisara koji može biti pogođen ili je predisponiran na stanje, poremećaj ili stanje, ali još ne doživljava ili ne ispoljava kliničke ili subkliničke simptome stanja, poremećaja ili stanja; i/ili (2) inhibiranje stanja, poremećaja ili stanja, uključujući zaustavljanje, smanjenje ili odlaganje razvoja bolesti ili njenog recidiva (u slučaju održavanja lečenja) ili najmanje jednog njenog kliničkog ili subkliničkog simptoma; i/ili (3) ublažavanje bolesti, tj. izazivanje regresije stanja, poremećaja ili stanja ili najmanje jednog od njegovih kliničkih ili subkliničkih simptoma; i/ili (4) izazivanje smanjenja težine jednog ili više simptoma bolesti. Korist za subjekta koji će biti lečen je bilo statistički značajna ili je u najmanju ruku primetna za pacijenta ili za lekara.

[0066] Lečenje može uključiti inhibiciju nivoa c-ANCA ili inhibiciju vezivanja c-ANCA za PR3, ili inhibiciju aktivacije neutrofila pomoću PR3, ili inhibiciju degranulacije neutrofila kod subjekta tokom najmanje unapred određenog vremenskog okvira kod subjekta. Na primer, prethodno određeni vremenski okvir može biti, na primer, najmanje jedna nedelja, najmanje dve nedelje, najmanje tri nedelje, najmanje 1 mesec, najmanje 2 meseca, najmanje 3 meseca, najmanje 4 meseca, najmanje 5 meseci, najmanje 6 meseci, najmanje 7 meseci, najmanje 8 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci ili najmanje 12 meseci. U jednoj realizaciji, prethodno određeni vremenski okvir je najmanje 6 meseci.

[0067] Lečenje može da uključuje inhibiciju vaskulitisa kod subjekta. Kada je vaskulitis inhibiran, Birminghamska ocena aktivnosti vaskulitisa modifikovana za Vegenerovu granulamatozu (BVAS za WG) smanjuje se za najmanji unapred određeni vremenski okvir. Na primer, prethodno određen vremenski okvir može biti, npr., najmanje jedna nedelja, najmanje dve nedelje, najmanje 1 mesec, najmanje 2 meseca, najmanje 3 meseca, najmanje 4 meseca, najmanje 5 meseci, najmanje 6 meseci, najmanje 7 meseci, najmanje 8 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine ili više. U jednoj realizaciji, unapred određeni vremenski okvir je najmanje 6 meseci.

[0068] Lečenje može da uključuje inhibiciju broja ili težine pogoršanja bolesti kod subjekta. U jednoj realizaciji, broj ili ozbiljnost širenja bolesti su smanjeni za najmanje 25%, za najmanje 30%, za najmanje 35%, za najmanje 40%, za najmanje 50%, za najmanje 60%, za najmanje 70%, za najmanje 75%, za najmanje 80%, ili za najmanje 90% tokom vremenskog perioda od najmanje mesec dana, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, najmanje sedam meseci, najmanje osam meseci, najmanje devet meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci ili najmanje godinu dana. U jednoj realizaciji, smanjenje ozbiljnosti ili pojave pogoršanja je za najmanje 50% tokom najmanje šest meseci.

[0069] Lečenje može da uključuje produženje perioda pre relapsa GPA kod subjekta. Na primer, produženje može biti za prethodno određeni vremenski okvir, na primer, najmanje 1 mesec, najmanje 2 meseca, najmanje 3 meseca, najmanje 4 meseca, najmanje 5 meseci, najmanje 6 meseci, najmanje 7 meseci, najmanje 8 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine ili više. U jednoj realizaciji, unapred određeni vremenski okvir je najmanje 6 meseci.

[0070] Dalje, lečenje može označiti smanjenje pojave ili težine jednog ili više od sledećih simptoma: bol u zglobovima bez očiglednog otoka; zapaljenje zglobova; dokumentovano povišenje temperature, npr. oralna temperatura (38,0°C) (nije pripisana drugim uzrocima), petehije (male crvene mrlje), opipljiva purpura ili ekhimoze (veliki plakovi) na koži ili curenje (u odsustvu traume) u mukoznim membranama; opsežna nekroza tkiva usled teške ishemije (npr. prstiju); čirevi u ustima (koji se ne pripisuju drugim uzrocima); konjunktivitis ustiju; episkleritis ustiju; retro-orbitalna masa/proptoza; uveitis; skleritis; eksudati mrežnjače (isključujući čvrste eksudate); retinalne hemoragije; krvavi nazalni iscedak; nazalne kraste; nazalna ulceracija (nije usled traume); osetljivost ili bol oko paranazalnih sinusa ili rendgenski dokaz sinusitisa; kolaps nazalnog mosta; otečene pljuvačne žlezde; subglotična upala; konduktivna gluvoća; gluvoća uzrokovana oštećenjem slušnog nerva ili cochlea; perikarditis; mezenterična ishemija (definisana kao jaki stomačni bol, krvava dijareja, perforacija/infarkt creva); pleuritis; grudni čvorovi ili šupljine (novi); pseudotumor ili ulceracija na traheobronhijalnom stablu (osim onih uzrokovanih tumorima ili infekcijama); alveolarno krvarenje; dispneja koja zahteva veštačku ventilaciju; hematurija bez taloženja eritrocita (≧1 pri analizi urina; ≧10 rbc/hpf); taloženi eritrociti u sedimentu urina; porast kreatinina > 30% ili pad klirensa kreatinina > 25%; meningitis (jaka glavobolja /- ukočenost vrata, pripisana inflamatornom meningitisu nakon isključenja infekcije, krvarenja i drugih uzroka); moždani udar; lezija kičmene moždine; paraliza kranijalnih nerva, senzorna periferna neuropatija (npr. distribucija gubitka osećaja u rukavicama ili čarapama); multipleks motornog mononeuritisa; gubitak težine (>2 kg tokom perioda od 28 dana koji se ne pripisuje drugim uzrocima); napadi; zahvaćenost genitourinarnog sistema; lezije srčanih zalistaka; kožni infarkti (splinter hemoragije, prsni infarkti); plućni infiltrati (nisu usled alveolarnog krvarenja, šupljine); gubitak pulsa/preteći gubitak ekstremiteta; angina; kardiomiopatija; pankreatitis; ili slušni D/C. Opet, smanjenje pojave ili težine ovih simptoma može se dogoditi tokom unapred određenog vremenskog okvira, na primer, najmanje 1 meseca, najmanje 2 meseca, najmanje 3 meseca, najmanje 4 meseca, najmanje 5 meseci, najmanje 6 meseci, najmanje 7 meseci, najmanje 8 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine ili više. U jednoj realizaciji, unapred određeni vremenski okvir je najmanje 6 meseci.

[0071] Smanjenje ozbiljnosti ili pojave može biti smanjenje u poređenju sa istim subjektom ili grupom subjekata tokom datog vremenskog perioda ili u poređenju sa subjektom ili grupom subjekata kojem(ima) nisu primenjeni sadašnji preparati.

[0072] U jednoj realizaciji, PR3 inhibitor je samostalno administriran. U drugoj realizaciji, PR3 se primenjuje u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim agensom ili terapeutikom. U jednoj realizaciji, farmaceutski aktivni agens ili terapeutik je kortikosteroid, kao što su prednizon, hidrokortizon, hidrokortizonacetat, kortizonacetat prednizolon, metilprednizolon i njihove varijante. U drugoj realizaciji, dodatni aktivni agens je ciklofosfamid, metotreksat ili azotiprin. [0073] Kompozicije i formulacije koje uključuju PR3 inhibitor („agens“), kao što je ovde opisano, mogu biti primenjivane oralno, lokalno ili parenteralno, ili bilo kojim drugim pogodnim metodama poznatim u tehnici. Izraz "parenteralni" uključuje, injekciju ili depo ili produženo oslobađanje putem nosača ili uređaja (npr. intravenozno, subkonjunktivalno, subtenonsko, episkleralno, intraskleralno, subskleralno, intraperitonealno, epiduralno, intratekalno, intramuskularno, intraluminalno, intratrahealno, epidermalno, intradermalno, subdermalno ili potkožno). Štaviše, različiti agensi koji se primenjuju u kombinovanoj terapiji koja je ovde otkrivena, mogu se primenjivati različitim putevima. Na primer, ovde otkriveni PR3 inhibitor, može biti injektovan intravenski, potkožno, inhaliran ili u nekim formulacijama, uzet oralno.

[0074] Iako je moguće koristiti ovde otkriveni agens kakav jeste u terapiji, može biti poželjno da se agens primenjuje u obliku farmaceutske formulacije, npr., u mešavini sa pogodnim farmaceutskim ekscipijensom, razblaživačem ili nosačem odabranim u pogledu željenog puta primene i standardne farmaceutske prakse. Farmaceutske formulacije uključuju, najmanje jedno aktivno jedinjenje, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, razblaživačem i/ili nosačem.

[0075] Fraza "farmaceutski prihvatljiv" se ovde koristi da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili oblike doziranja koji su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacije, srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika.

[0076] Preparat koji je ovde otkriven, može dalje da sadrži jednu ili više farmaceutski prihvatljivih komponenata (ili farmaceutskih komponenti), uključujući, bez ograničenja, pufere, konzervanse, sredstva za podešavanje toničnosti, soli, antioksidanse, agense za podešavanje osmolalnosti, fiziološke supstance, farmakološke supstance, agense za povećanje zapremine, agense za emulgovanje, agense za kvašenje, zaslađivače ili arome i slično. Za pripremu farmaceutskog preparata opisanog u sadašnjoj specifikaciji, mogu se koristiti različiti puferi i sredstva za podešavanje pH, pod uslovom da je dobijeni preparat farmaceutski prihvatljiv. Takvi puferi uključuju, bez ograničenja, acetatne pufere, citratne pufere, fosfatne pufere, neutralno puferovane slane rastvore, fosfatno puferovane slane rastvore i boratne pufere. Podrazumeva se da se kiseline ili baze mogu koristiti za podešavanje pH preparata po potrebi. Farmaceutski prihvatljivi antioksidansi uključuju, bez ograničenja, natrijum metabisulfit, natrijum tiosulfat, acetilcistein, butilovani hidroksianizol i butilovani hidroksitoluen. Korisni konzervansi uključuju, bez ograničenja, benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, timerosal, fenilživin acetat, fenilživin nitrat, stabilizovan oksi hloro preparat, kao što su, na primer, PURITE<®>i helanti, kao što su, npr., DTPA ili DTPA-bisamid, kalcijum-DTPA i CaNaDTPA-bisamid. Regulatori toničnosti korisni u farmaceutskom preparatu uključuju, bez ograničenja, soli kao što su, na primer, natrijum hlorid, kalijum hlorid, manitol ili glicerin i druge farmaceutski prihvatljive regulatore toničnosti. Farmaceutski preparat može biti obezbeđen u obliku soli i može se obrazovati sa mnogim kiselinama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hlorovodoničnu, sumpornu, sirćetnu, mlečnu, vinsku, jabučnu, jantarnu, itd. Soli imaju tendenciju da budu rastvorljivije u vodenim ili drugim protonskim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza. Podrazumeva se da ove i druge supstance poznate u oblasti farmakologije, mogu biti uključene u farmaceutskom preparatu.

[0077] Ovde otkriveni preparat, može dalje da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Farmaceutski prihvatljivi nosači korisni u ovde otkrivenim imunogenim preparatima, uključuju, bilo koji kompatibilni agens koji je u korišćenim dozama i koncentracijama netoksičan za pojedinca, i nema u suštini dugotrajni ili trajni štetni efekat kada se primenjuje, a obuhvata izraze kao što su farmakološki prihvatljiv nosač, stabilizator, solubilizator, razblaživač, aditiv, pomoćni ili ekscipijens. Takav nosač se generalno meša sa aktivnim jedinjenjem, ili omogućava razblaživanje ili inkorporiranje aktivnog jedinjenja i može biti čvrst, polučvrst ili tečni agens. Podrazumeva se da aktivni sastojci mogu biti rastvorljivi ili mogu biti isporučeni u obliku suspenzije u željenom nosaču ili razblaživaču. Nosač koji je ovde otkriven, može takođe delovati kao pomoćno sredstvo. Može se koristiti bilo koji od mnoštva farmaceutski prihvatljivih nosača uključujući, bez ograničenja, vodene medijume kao što su, na primer, voda, fiziološki rastvor, glicin, hijaluronska kiselina i slično; čvrste nosače kao što su, na primer, manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celuloza, glukoza, saharoza, magnezijum karbonat i slično; rastvarači; disperzioni mediji; sredstva za oblaganje; antibakterijski i antifungalni agensi; izotonični agensi i sredstva za odlaganje apsorpcije; ili bilo koji drugi neaktivni sastojak. Izbor farmakološki prihvatljivog nosača može zavisiti od načina primene. Osim ako je bilo koji farmakološki prihvatljiv nosač inkompatibilan sa aktivnim sastojkom, razmatra se njegova upotreba u farmaceutski prihvatljivim kompozicijama. Neograničavajući primeri specifične upotrebe takvih farmaceutskih nosača mogu se naći u FARMACEUTSKIM DOZNIM OBLICIMA I SISTEMIMA ISPORUKE LEKOVA (Howard C. Ansel i sar., ur., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7. izdanje 1999); REMINGTONU: NAUKA I PRAKSA FARMACIJE (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20. izdanje 2000); GOODMAN & GILMAN'S FARMAKOLOŠKA OSNOVA TERAPEUTIKA (Joel G. Hardman i sar., ur., McGraw-Hill Professional, 10. izdanje 2001); i PRIRUČNIKU FARMACEUTSKIH EKSCIPIJENASA (Raymond C. Rowe i sar., APhA Publications, 4. izdanje 2003).

[0078] Podrazumeva se da će količina agensa, ovde opisanog, za upotrebu u lečenju varirati u zavisnosti od načina primene, prirode stanja za koje je lečenje potrebno, i starosti, telesne težine i stanja pacijenta, i da će konačno biti po diskrecionom pravu nadležnog lekara ili veterinara. Preparati će tipično sadržati efikasnu količinu aktivnog(ih) agensa(a), samostalno ili u kombinaciji. U jednoj realizaciji, aktivni agens se primenjuje u kombinaciji sa glukokortikoidom, kao što je prednizon ili prednizolon. Preliminarne doze se mogu odrediti prema testovima na životinjama, a preračunavanje doza za primenu kod ljudi može se izvršiti u skladu sa praksama prihvaćenim u struci.

[0079] Sadašnje otkriće obezbeđuje komplete za lečenje GPA kod subjekta. Kompleti mogu da uključe ovde otkrivenog inhibitora PR3. Prosečan stručnjak će razumeti da doze gornjih PR3 inhibitora mogu varirati bez odstupanja od prirode sadašnjeg otkrića, i stoga su druge doze takođe obuhvaćene sadašnjim otkrićem. Stručnjak će znati koje doze PR3 inhibitora, opisanih ovde, mogu biti bezbedno i efikasno primenjene kod subjekta u skladu sa standardom nege i znanja u struci, i mogu uključivati ovde opisane PR3 inhibitore.

[0080] Komplet može da uključuje PR3 inhibitorni preparat koji je ovde otkriven. U određenim realizacijama, komplet je za lečenje GPA. Komplet može dodatno opciono da uključi uputstva za upotrebu. Komplet može dalje opciono da uključuje (npr. sadrži, sastoji se u suštini od, sastoji se od) špriceve ili aplikatore prethodno napunjene gore pomenutim agensima i/ili bočice koje sadrže jedan ili više agenasa.

[0081] Kompleti, bez obzira na tip, mogu generalno da uključuju jedan ili više kontejnera u kojima su smešteni biološki agensi (npr. inhibitori) i, poželjno, pogodno raspodeljeni. Komponente kompleta mogu biti pakovane bilo u vodenom medijumu ili u liofilizovanom obliku.

[0082] Mnogi od prisutnih inhibitora PR3, posebno inhibitori proteina ili peptida, mogu biti dobijeni konvencionalnim sredstvima, kao što je rekombinacija. Pored toga, prisutni inhibitori mogu biti izolovani iz plazme sisara (uključujući ljude) ili napravljeni od sopstvenih telesnih ćelija putem virusne transfekcije.

[0083] U skladu sa sadašnjim pronalaskom, mogu se koristiti konvencionalna molekularna biologija, mikrobiologija, rekombinantna DNK, imunologija, ćelijska biologija i druge srodne tehnike u okviru veštine tehnike. Videti, npr., Sambrook i sar., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook i sar., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel i sar., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Bonifacino i sar., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coico i sar., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan i sar., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Enna i sar., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Hames i sal., eds. (1999) Ekspresija proteina: praktičan pristup. Oxford University Press Oxford; Freshney (2000) Kultura životinjskih ćelija: Priručnik za osnovnu tehniku. 4. izd. Wiley-Liss; među drugima. Trenutni protokoli gore navedeni se ažuriraju nekoliko puta svake godine.

[0084] Preparati mogu da uključuju DNK ili RNK sekvence koje kodiraju ovde opisane proteinske ili peptidne inhibitore PR3, uključujući DNK ili RNK sekvence koje kodiraju antitela ili fragmente antitela.

[0085] Izraz "rekombinantni" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid proizveden preko biološkog domaćina, izabranog iz ekspresionog sistema sisara, ekspresionog sistema ćelija insekata, sistema ekspresije kvasca i sistema ekspresije bakterija.

[0086] Shodno tome, ovde otkriveni molekuli nukleinske kiseline, mogu biti inkorporirani na poznati način u odgovarajućem ekspresionom vektoru koji obezbeđuje dobru ekspresiju proteina prema pronalasku. Mogući ekspresioni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na kozmide, plazmide ili modifikovane viruse (npr. retroviruse sa defektnom replikacijom, adenoviruse i adeno-povezane viruse), sve dok je vektor kompatibilan sa korišćenom ćelijom domaćina. Ekspresioni vektori su „pogodni za transformaciju ćelije domaćina“, što znači da ekspresioni vektori sadrže molekul nukleinske kiseline prema pronalasku i regulatorne sekvence odabrane na osnovu ćelija domaćina koje će biti korišćene za ekspresiju, a koje su operativno povezane sa molekulom nukleinske kiseline. Operativno povezana znači da je nukleinska kiselina povezana sa regulatornim sekvencama na način koji omogućava ekspresiju nukleinske kiseline.

[0087] Stoga, sadašnja specifikacija posmatra rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira proteinski ili peptidni PR3 inhibitor, ili njegov fragment, i potrebne regulatorne sekvence za transkripciju i translaciju ubačene proteinske sekvence.

[0088] Odgovarajuće regulatorne sekvence mogu biti izvedene iz različitih izvora, uključujući bakterijske, gljivične, virusne, sisarske ili gene insekata (na primer, videti regulatorne sekvence opisane od strane Goeddel, Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornija. (1990)). Odabir odgovarajućih regulatornih sekvenci zavisi od izabrane ćelije domaćina kao što je diskutovano u nastavku, i može lako biti postignut od strane prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti. Primeri takvih regulatornih sekvenci uključuju: transkripcioni promoter i pojačivač ili vezujuću sekvencu RNK polimeraze, ribozomalnu vezujuću sekvencu, uključujući signal inicijacije translacije. Dodatno, u zavisnosti od izabrane ćelije domaćina i korišćenog vektora, druge sekvence, kao što je poreklo replikacije, dodatni položaji DNK restrikcije, pojačivači i sekvence koje daju inducibilnost transkripcije, mogu biti inkorporirane u ekspresionom vektoru.

[0089] Rekombinantni ekspresioni vektori takođe, mogu da sadrže odabrani markerski gen koji olakšava selekciju ćelija domaćina transformisanih ili transfektovanih sa rekombinantnim molekulom prema pronalasku. Primeri izabranih markerskih gena su geni koji kodiraju proteine kao što su G418 i higromicin koji daje rezistenciju na određene lekove, βgalaktozidazu, hloramfenikol acetiltransferazu, luciferazu svica ili imunoglobulin ili njegov deo, kao što je Fc deo imunoglobulina, poželjno IgG. Transkripcija odabranog markerskog gena je praćena promenama u koncentraciji izabranog markerskog proteina kao što su βgalaktozidaza, hloramfenikol acetiltransferaza ili luciferaza svica. Ako selektabilni markerski gen kodira protein koji daje rezistenciju na antibiotike, kao što transformišuće ćelije rezistentne na neomicin, mogu biti odabrane pomoću G418. Ćelije koje imaju inkorporiran izabrani markerski gen preživljavaju, dok druge ćelije umiru. Ovo omogućava vizuelizaciju i analizu ekspresije rekombinantnih ekspresionih vektora prema pronalasku i posebno određivanje efekta mutacije na ekspresiju i fenotip. Biće cenjeno da izabrani markeri mogu biti uvedeni na odvojenom vektoru od nukleinske kiseline od interesa.

[0090] Rekombinantni ekspresioni vektori, mogu takođe da sadrže gene koji kodiraju fuzioni deo koji obezbeđuje povećanu ekspresiju rekombinantnog proteina; povećanu rastvorljivost rekombinantnog proteina; i pomoć u prečišćavanju ciljnog rekombinantnog proteina delujući kao ligand u afinitetnom prečišćavanju. Na primer, ciljnom rekombinantnom proteinu može biti dodato mesto proteolitičkog cepanja da bi se omogućilo odvajanje rekombinantnog proteina od fuzionog dela nakon prečišćavanja fuzionog proteina. Tipični fuzioni ekspresioni vektori uključuju pGEX (AmradCorp., Melburn, Australija), pMal (New England Biolabs, Beverly, Mass.) i pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) koji spajaju glutation S-transferazu (GST), maltoza E vezivni protein, ili protein A, respektivno, sa rekombinantnim proteinom.

[0091] Rekombinantni ekspresioni vektori, mogu biti uvedeni u ćelije domaćina da bi se proizvela transformisana ćelija domaćina. Izrazi "transformisan sa", "transfektovan sa", "transformacija" i "transfekcija" imaju za cilj da obuhvate uvođenje nukleinske kiseline (npr. vektora) u ćeliju pomoću jedne od mnogih mogućih tehnika poznatih u struci. Izraz "transformisana ćelija domaćina" kako se ovde koristi takođe, uključuje ćelije sposobne za glikozilaciju koje su transformisane sa rekombinantnim ekspresionim vektorom prema pronalasku. Prokariotske ćelije mogu biti transformisane sa nukleinskom kiselinom, na primer, elektroporacijom ili transformacijom posredovanom sa kalcijum-hloridom. Na primer, nukleinska kiselina može biti uvedena u ćelije sisara putem konvencionalnih tehnika, kao što su koprecipitacija kalcijum fosfatom ili kalcijum hloridom, transfekcija posredovana DEAE-dekstranom, lipofektin, elektroporacija ili mikroinjekcija. Pogodne metode za transformaciju i transfekciju ćelija domaćina mogu se naći u Sambrook i sar. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), i drugim laboratorijskim udžbenicima.

[0092] Pogodne ćelije domaćina uključuju široku raznovrsnost eukariotskih ćelija domaćina i prokariotskih ćelija. Na primer, proteini pronalaska mogu biti eksprimirani u ćelijama kvasca ili ćelijama sisara. Druge pogodne ćelije domaćini mogu se naći u Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornija. (1991). Pored toga, proteini prema pronalasku mogu biti eksprimirani u prokariotskim ćelijama, kao što je Escherichia coli (Zhang i sar., Science 303(5656): 371-3 (2004)). Pored toga, može se koristiti ekspresioni sistem na bazi Pseudomonasa, kao što je Pseudomonas fluorescens (publikacija patentne prijave SAD br. US 2005/0186666, Schneider, Jane C i sar.).

[0093] Ćelije domaćina kvasca i gljiva mogu da uključuju, ali nisu ograničene na Saccharomyces cerevisiae, rodove Pichia ili Kluyveromyces i različite vrste roda Aspergillus. Primeri vektora za ekspresiju u kvascu S. cerevisiae uključuju pYepSec1 (Baldari. i sar., Embo J. 6:229-234 (1987)), pMFa (Kurjan i Herskowitz, Cell 30:933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz i sar., Gene 54:113-123 (1987)), i pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Kalifornija). Protokoli za transformaciju kvasca i gljivica su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti (videti Hinnen i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 75:1929 (1978); Itoh i sar., J. Bacteriology 153:163 (1983), i Cullen i sar. (Bio/Technology 5:369 (1987)).

[0094] Ćelije sisara uključuju, između ostalih: COS (npr., ATCC br. CRL 1650 ili 1651), BHK (npr. ATCC br. CRL 6281), CHO (ATCC br. CCL61), HeLa (npr. ATCC br. CCL2), 293 (ATCC br. 1573) i NS-1 ćelije. Pogodni ekspresioni vektori za usmeravanje ekspresije u ćelijama sisara generalno, uključuju promotera (npr., izveden iz virusnog materijala kao što su poliom, adenovirus 2, citomegalovirus i Simijan virus 40), kao i druge transkripcione i translacione kontrolne sekvence. Primeri vektora ekspresije sisara, uključuju pCDM8 (Seed, B., Nature 329:840 (1987)) i pMT2PC (Kaufman i sar., EMBO J.6:187-195 (1987)).

[0095] S obzirom na ovde obezbeđena saznanja, promoteri, terminatori i metode za uvođenje ekspresionih vektora odgovarajućeg tipa u ćelije biljaka, ptica i insekata takođe, mogu lako biti izvedene. Na primer, proteini prema pronalasku, mogu biti eksprimirani iz biljnih ćelija (videti Sinkar i sar., J. Biosci (Bangalore) 11:47-58 (1987), koji daju pregled upotrebe vektora Agrobacterium rhizogenes; videti takođe Zambryski i sar., Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender i Setlow (eds.), Vol. VI, str. 253-278, Plenum Press, New York (1984), koji opisuju upotrebu ekspresionih vektora za biljne ćelije, uključujući, između ostalih, PAPS2022, PAPS2023 i PAPS2034).

[0096] Ćelije insekata uključuju ćelije i ćelijske linije iz vrsta Bombyx, Trichoplusia ili Spodotera. Bakulovirusni vektori dostupni za ekspresiju proteina u kultivisanim ćelijama insekata (SF 9 ćelije) uključuju serije pAc (Smith i sar., Mol. Cell. Biol.3:2156-2165 (1983)) i serije pVL (Lucklow, V.A., i Summers, M.D., Virology 170:31-39 (1989)).

[0097] Alternativno, proteini iz pronalaska, mogu takođe biti izraženi u nehumanim transgenim životinjama kao što su pacovi, zečevi, ovce i svinje (Hammer i sar. Nature 315:680-683 (1985); Palmiter i sar. Science 222:809-814 (1983); Brinster i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985); Palmiter i Brinster Cell 41:343-345 (1985) i Američki Pat. br.4,736,866).

[0098] Proteini iz pronalaska takođe, mogu biti dobijeni hemijskom sintezom korišćenjem tehnika dobro poznatih u hemiji proteina, kao što su sinteza na čvrstoj fazi (Merrifield, J. Am. Chem. Assoc.85:2149-2154 (1964); Frische i sar., J. Pept. Sci.2(4): 212-22 (1996)) ili sinteza u homogenom rastvoru (Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol.15 I i II, Thieme, Štutgart (1987)).

[0099] Pacijenti sa otkrivenim nivoima nedostatka ANCA i A1PI, koji dovode do oštećenja pluća, mogu imati koristi od augmentacijske terapije. Augmentacijska terapija su obično nedeljne intravenske infuzije, od alfa-1 antitripsin proteina prečišćenog iz zdravih donora plazme. Cilj je da se poveća nivo alfa-1 proteina u krvi i plućima kako bi se usporilo ili zaustavilo napredovanje alfa-1 plućne bolesti. Kod pacijenata koji takođe imaju detektabilne nivoe ANCA, povećanje A1PI bi efikasno uklonilo sve PR3 receptore na cirkulišućim neutrofilima kod GPA pacijenata. Augmentacijska terapija se priprema od sakupljene humane krvne plazme koja se testira na hepatitis A, B i C i testira na HIV, kao i na druge infektivne viruse. Tokom procesa prečišćavanja korišćene su dodatne antivirusne procedure od strane svih proizvođača. Od neželjenih efekata koji su prijavljeni, najčešće pritužbe su glavobolje, bolovi u mišićima i zglobovima i privremeni simptomi nalik gripu.

PRIMERI

[0100] Sledeći neograničavajući primeri su dati samo u ilustrativne svrhe kako bi se olakšalo potpunije razumevanje predstavljenih realizacija koje se sada razmatraju. Ove primere ne treba tumačiti tako da ograničavaju bilo koju od realizacija opisanih u sadašnjoj specifikaciji, uključujući, one koje se odnose na ovde otkrivena jedinjenja i farmaceutske preparate.

Primer 1

Ćelijski bazirani testovi

[0101] Aktivnost IL-1β proizvedena proteinazom 3 (PR3) blokirana je od strane plazmatskog A1PI (Sigma Aldrich, Kat# A9024, takođe nazvan AAT) u humanim ćelijama A549 (model aktivnosti serinske proteaze, ATCC<®>CCL-185™). Humane ćelije A549 su stimulisane u PR3-preinkubiranom prekursoru interleukina-1β (pro IL-1β, Sigma Aldrich, bez životinjskih komponenti, rekombinantni, eksprimiran u E. coli, ≧98% (SDS-PAGE), ≧98% (HPLC), ispitivana ćelijska kultura) u prisustvu rastućih koncentracija A1PI dobijenog iz plazme tokom noći. Sledećeg dana, sakupljen je medijum ćelijske kulture i IL-6 je meren pomoću ELISA (Thermo Scientific, Human IL-6 ELISA komplet).

[0102] A1PI značajno smanjuje proizvodnju IL-6 na način koji zavisi od doze (Tabela 1, Slika 2).

U poređenju sa kontrolom, kulture tretirane sa PR3 ili prekursorom interleukina-1β su pokazale zanemarljivu stimulaciju proizvodnje IL-6 (kontrola 0,15 ng/mL IL-6 u odnosu na 0,21 ng/mL i 0,23 ng/mL proizvodnje IL-6 za PR3 i pro IL-1β, respektivno). Kao što je očekivano, kultura tretirana sa oba PR3 ili prekursorom interleukina-1β ispoljila je značajno povećanje proizvodnje IL-6 (0,92 ng/mL). Međutim, kulture tretirane sa rastućim količinama A1PI pokazuju smanjenje proizvodnje IL-6 zavisno od doze (Tabela 1). Normalni fiziološki opseg serumskog A1PI je približno 80 mg/dL ili 800.000 ng/mL. Kao takvi, ovi rezultati imaju fiziološki značaj.

Primer 2

Ispitivanje citototoksičnosti

[0103] Ćelijska kultura obezbeđuje model krvnih sudova korišćenjem HUVEC-a (endotelnih ćelija humane pupčane vene) kultivisanih do konfluencije 80-90% kao prikaz zidova krvnih sudova. Prateći je model GPA u ćelijskoj kulturi koji koristi HUVEC i neutrofile humane krvi koji su pripremljeni i aktivirani pomoću c-ANCA na isti način kao i kod bolesti. HUVEC su senzibilisane na inflamatorna oštećenja prethodnim izlaganjem na BCNU i jonomicin. U bolesnom stanju granulomatoze sa poliangiitisom (GPA/Vegenerov sindrom), aktivirani neutrofili napadaju zidove krvnih sudova. Ova studija je ocenila dva jedinjenja, A1PI (α-1-antitripsin; Sigma Aldrich kat.

br. A9024, serija SLBL9794V, 90% čistoće) i elafin (AnaSpec kat. br. AS-61641, serija 1360190, 95% čistoće), i njihovu sposobnost da ublaže indukovano oštećenje HUVEC-a kao modela vaskularnog endotela u poređenju sa negativnom kontrolom α1-antihimotripsinom (Athens Research & Technology, kat. br.16-16-012400, serija AX2014-02, >95% čistoće). α1-antihimotripsin je izabran kao negativna kontrola zbog svoje strukturne sličnosti sa A1PI i nedostatka aktivnosti protiv PR3 receptora. α1-Antihimotripsin inhibira neutrofilni katepsin G i himazu mastocitnih ćelija.

[0104] Konfluentni HUVEC je obeležen kalceinom-AM kao fluorescentnim markerom. Kalcein-AM je ćelijski propusna boja koja se može koristiti za određivanje održivosti ćelija u HUVEC-u (i većini eukariotskih ćelija). U živim ćelijama nefluorescentni kalcein AM se konvertuje u zeleno-fluorescentni kalcein nakon preuzimanja posle hidrolize acetoksimetil estra od strane intracelularnih esteraza. Boja kalcein-AM zahteva veoma male količine ćelija dok održava istu osetljivost kao tradicionalni<51>Cr test. Jednom kada ga ćelija preuzme, slobodni kalcein je generalno nepropustan za membranu i prodire samo kroz praznine. Iako postoji izvesno curenje tokom perioda inkubacije, ovo se objašnjava upotrebom samo kontrole HUVEC-a, obeleženog sa kalcein-AM i korišćenog za određivanje osnovnog nivoa fluorescencije koji uzima u obzir normalne ćelijske procese.

[0105] Neutrofili periferne krvi su pripremljeni da poboljšaju ekspresiju PR3 receptora (proteinaze 3) sa 50 U/mL TNF-a. Visok koeficijent membranskih PR3 pozitivnih neutrofila je faktor rizika za razvoj vaskulitisa, a povišeni nivoi PR3 u membrani su povezani sa većom stopom recidiva kod pacijenata sa Vegenerovom granulomatozom. Aktivirani neutrofili su zatim dodati (5 x 10<5>neutrofila/bazenčiću) u HUVEC nanet na pločicu, obeležen kalceinom da bi se produkovao inflamatorni odgovor. Četiri dozne koncentracije A1PI (0,25, 0,5, 1,0 i 2,0 mg/mL) i jedna doza elafina (0,25 mg/mL) su procenjene za prevenciju aktivacije neutrofila i lizu ćelija. Procenjena je koncentracija jedne doze negativne kontrole α1 antihimotripsina (0,25 mg/mL).

[0106] Za aktiviranje neutrofila da napadnu HUVEC, uzrokujući lizu HUVEC-a dodata su tri α-PR3 MoAt-a [monoklonska antitela (15 μg/mL od α-PR3 WGM2 i 5 μg/mL svakog od α-PR3 4A5 i α-PR 6A6, za ukupno od 25 μg/mL]. Klonovi α-PR34A5 i α-PR36A6 su dobijeni od Eurodiagnostica, a α-PR3 WGM2 od Abcam-a. Ova 3 klona su odabrana da obezbede model poliklonskog odgovora koji bi bio viđen in vivo i predstavljaju tri mesta vezivanja na PR-3 receptoru (Van Der Geld, Karakterizacija monoklonskih antitela na PR3 kao kandidata oruđa za mapiranje epitopa ili humana anti-PR3 autoantitela, 1999). Nakon dodavanja aktiviranih neutrofila, ispitivanih jedinjenja i α-PR3 mAt-a, ćelije su inkubirane 4 sata na 37 °C. Nakon inkubacije, supernatant je procenjen na fluorescenciju. Kada neutrofili napadnu HUVEC i dođe do lize ćelija, kalceinska fluorescentna oznaka se oslobađa sa oštećenih membrana i meri u supernatantima.

[0107] A1PI i elafin su pokazali funkcionalni odgovor sa negativnom kontrolom α1 antihimotripsinom koji nije uspeo da obezbedi značajnu promenu u oslobađanju fluorescencije (Tabela 2). A1 PI je obezbedio odgovor koji je bio dozno zavisan i usmeren po prirodi. Srednja fluorescencija je određena iz 3 x 100 μL alikvota od supernatanta iz svakog bazenčića, sa 6 bazenčića za svako stanje (ukupno 18 ponavljanja). HUVEC liziran sa deterdžentom je obezbedio kriterijume za 100% oslobađanje. Fluorescentni testovi su izvedeni korišćenjem čitača TECAN Genios i Magellan softvera.

Primer 3

Tretmani GPA korišćenjem PR3 inhibitora

[0108] Pacijent se žali na krvarenje iz nosa i nakon kompletnog lekarskog pregleda i dijagnostičkih ispitivanja lekar mu postavlja dijagnozu GPA. Pacijent ima normalne nivoe A1 PI, ali takođe, ima detektabilne nivoe c-ANCA, sa čestim pogoršanjima. Pacijentu se daje egzogeni A1 PI intravenski u dozi od 60 mg/kg nedeljno, tokom perioda od šest meseci. Njegovi simptomi, kao što je krvarenje iz nosnog prolaza, smanjuju se nakon šest meseci lečenja i smatra se da je GPA „u remisiji. "Ovo smanjenje simptoma GPA ukazuje na uspešan tretman sa farmaceutskim preparatom koji je ovde otkriven.

[0109] Pacijent se žali na krvarenje iz nosa i nakon kompletnih fizikalnih i dijagnostičkih ispitivanja lekar mu postavlja dijagnozu GPA. Pacijent ima normalne nivoe A1 PI, ali takođe ima detektabilne nivoe c-ANCA, sa čestim pogoršanjima. Pacijentu se daje početna doza punjenja egzogenog A1 PI intravenski od 180 mg/kg, a nedelju dana kasnije se primenjuje egzogeni A1 PI u dozi od 120 mg/kg/nedeljno tokom perioda od sedam nedelja. Naknadno mu se dozira egzogeni A1 PI u dozi od 60 mg/kg nedeljno tokom perioda od 16 nedelja. Njegovi simptomi, kao što je krvarenje iz nosnog prolaza, se smanjuju nakon mesec dana lečenja, a naknadna pogoršanja su potisnuta tokom lečenja. Pogoršanja su sprečena tokom perioda nakon prekida terapije. Ovo smanjenje simptoma GPA ukazuje na uspešan tretman sa farmaceutskom kompozicijom koja je ovde otkrivena.

[0110] Pacijent se žali na krvarenje iz nazalnog prolaza i nakon kompletnih fizikalnih i dijagnostičkih ispitivanja lekar mu postavlja dijagnozu GPA. Pacijent ima normalne nivoe A1 PI, ali takođe ima otkrivene nivoe c-ANCA. Pacijentu se daje početna doza punjenja egzogenog A1 PI intravenski od 120 mg/kg nedeljno tokom četiri nedelje. Zatim mu se dozira egzogeni A1 PI u dozi od 60 mg/kg nedeljno u periodu od 20 nedelja. Njegovi simptomi, kao što je krvarenje iz nosnog prolaza, se smanjuju nakon mesec dana lečenja. Ovo smanjenje simptoma GPA ukazuje na uspešan tretman sa ovde otkrivenom farmaceutskom kompozicijom.

[0111] Pacijent se žali na teškoće u disanju i nakon kompletnih fizikalnih i dijagnostičkih testova, lekar mu postavlja dijagnozu GPA usled otkrivenih nivoa ANCA i nedostatka A1PI, što dovodi do oštećenja pluća. Terapija povećanja α-1 antitripsin proteina je pripremljena iz sakupljene humane krvne plazme zdravih davalaca plazme koja se testira na hepatitis A, B i C i testira na HIV, kao i na druge infektivne viruse. Tokom procesa prečišćavanja koriste se dodatne antivirusne procedure. Pacijentu se daju nedeljne intravenske infuzije proteina α-1 antitripsin. Njegovi simptomi, kao što je otežano disanje, se smanjuju nakon mesec dana lečenja. Ovo smanjenje simptoma GPA ukazuje na uspešan tretman sa farmaceutskom kompozicijom koja je ovde otkrivena.

[0112] Grupacije alternativnih realizacija, elemenata ili koraka iz sadašnjeg pronalaska ne treba da se tumače kao ograničenja. Svaki član grupe se može pozivati i zahtevati pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji sa drugim članovima grupe koji su ovde otkriveni. Predviđeno je da jedan ili više članova grupe, mogu biti uključeni u grupu ili izbrisani iz grupe iz razloga pogodnosti i/ili patentibilnosti. Kada se desi bilo koje takvo uključivanje ili brisanje, smatra se da specifikacija sadrži grupu koja je modifikovana, čime se ispunjava napisani opis svih Markuš-ovih grupa korišćenih u priloženim patentnim zahtevima.

[0113] Osim ako nije drugačije naznačeno, svi brojevi koji izražavaju karakteristiku, stavku, količinu, parametar, svojstvo, izraz i tako dalje, korišćeni u sadašnjoj specifikaciji i zahtevima treba da budu shvaćeni kao modifikovani u svim slučajevima pomoću izraza "oko". Kako se ovde koristi, izraz "oko" označava da karakteristika, stavka, količina, parametar, svojstvo ili izraz tako kvalifikovan obuhvata opseg od plus ili minus deset procenata iznad i ispod vrednosti navedene karakteristike, stavke, količine, parametra, svojstva ili izraza. Shodno tome, osim ako nije suprotno naznačeno, numerički parametri navedeni u specifikaciji i priloženim zahtevima su aproksimacije koje mogu da variraju. Na primer, pošto instrumenti masene spektrometrije mogu neznatno da variraju u određivanju mase datog analita, izraz „oko“ u kontekstu mase jona ili odnosa masa/naelektrisanje jona odnosi se na /-0,50 jedinica atomske mase. U najmanju ruku, a ne kao pokušaj da se ograniči primena doktrine ekvivalenata na obim patentnih zahteva, svaku numeričku indikaciju treba tumačiti najmanje u pogledu broja prijavljenih značajnih cifara i primenom uobičajenih tehnika zaokruživanja.

[0114] Uprkos tome što su numerički opsezi i vrednosti koje postavljaju široki obim pronalaska aproksimacije, numerički opsezi i vrednosti dalje navedeni u specifičnim primerima prikazani su što je preciznije moguće. Bilo koji numerički opseg ili vrednost, međutim, inherentno sadrži izvesne greške koje su nužno rezultat standardne devijacije nađene u njihovim odgovarajućim ispitivanim merenjima. Navođenje numeričkih opsega vrednosti je ovde samo namenjeno da služi kao skraćeni metod za pojedinačno upućivanje na svaku zasebnu numeričku vrednost koja ulazi u opseg. Osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost numeričkog opsega je uključena u sadašnju specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena.

[0115] Izrazi "jedan", "izvestan", "taj" i slične reference koje se koriste u kontekstu opisa sadašnjeg pronalaska (posebno u kontekstu pratećih zahteva) treba tumačiti tako da obuhvataju i jedninu i množinu, osim ako ovde nije drugačije naznačeno ili jasno protivrečno kontekstom. Dalje, redni indikatori – kao što su „prvi“, „drugi“, „treći“ itd. – za identifikovane elemente, koriste se za razlikovanje između elemenata i ne ukazuju ili impliciraju potreban ili ograničen broj takvih elemenata, i ne ukazuju na određeni položaj ili redosled takvih elemenata osim ukoliko nije drugačije posebno navedeno. Sve metode ovde opisane, mogu biti izvedene bilo kojim pogodnim redosledom, osim ukoliko je drugačije ovde naznačeno ili je na drugi način jasno u suprotnosti sa kontekstom. Upotreba bilo kog i svih primera, ili primernog jezika (npr., "kao što je") ovde obezbeđenog je namenjena samo da bolje sagleda sadašnji pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska koji se inače zahteva. Nijedan iskaz u sadašnjoj specifikaciji ne treba tumačiti kao naznaku bilo kojeg elementa koji nije zahtevan u patentnim zahtevima, suštinski za primenu pronalaska.

[0116] Kada se koristi u patentnim zahtevima, bez obzira da li je podnet ili dodat po amandmanu, otvoreni prelazni izraz „sadrži“ (i njegove ekvivalentne otvorene prelazne fraze kao što su uključujući, koji sadrže i koji imaju) obuhvata sve izričito navedene elemente, ograničenja, korake i /ili karakteristike samostalno ili u kombinaciji sa nenabrojanim predmetima; imenovani elementi, ograničenja i/ili karakteristike su suštinski, ali drugi neimenovani elementi, ograničenja i/ili karakteristike mogu biti dodate i dalje formirati konstrukt u okviru obima zahteva. Specifične realizacije koje su ovde otkrivene, mogu biti dalje ograničene u patentnim zahtevima korišćenjem zatvorenih prelaznih izraza "koji se sastoje od“ ili "sastoje se suštinski od“ umesto ili kao izmenjene za "koji sadrže". Kada se koristi u patentnim zahtevima, bilo da je podnet ili dodat po amandmanu, zatvoreni prelazni izraz "koji se sastoji od“ isključuje bilo koji element, ograničenje, korak ili osobinu koja nije izričito navedena u patentnim zahtevima. Prelazni izraz zatvorenog tipa „koji se u suštini sastoji od“ ograničava obim zahteva na izričito navedene elemente, ograničenja, korake i/ili karakteristike i sve druge elemente, ograničenja, korake i/ili karakteristike koji ne utiču materijalno na osnovnu i novu karakteristiku(e) zahtevanog predmetnog pronalaska. Stoga, se značenje otvorenog prelaznog izraza „koji sadrži“ definiše kao obuhvatanje svih specifično navedenih elemenata, ograničenja, koraka i/ili karakteristika, kao i svih opcionih, dodatnih nespecifikovanih. Značenje prelaznog izraza zatvorenog tipa „koji se sastoji od“ se definiše tako da uključuje samo one elemente, ograničenja, korake i/ili karakteristike koje su specifično navedene u zahtevu, dok se značenje prelaznog izraza zatvorenog tipa „koji se u suštini sastoji od“ definiše kao što uključuje samo one elemente, ograničenja, korake i/ili karakteristike koje su specifično navedene u zahtevu i one elemente, ograničenja, korake i/ili karakteristike koje materijalno ne utiču na osnovne i nove karakteristike predmeta za koji se traži zaštita. Prema tome, prelazni izraz otvorenog tipa „koji sadrži“ (i ekvivalentni prelazni izrazi otvorenog tipa) uključuju u svom značenju, kao ograničavajući slučaj, predmet za koji se zahteva da je specifikovan prelaznim izrazima zatvorenog tipa „koji se sastoji od ili „koji se u suštini sastoji od". Pošto su ovakve realizacije koje su ovde opisane ili ovako zahtevane sa izrazom "koji

Claims

sadrži" izričito ili inherentno nedvosmisleno opisane, omogućene i podržane ovde za izraze "koji se u suštini sastoje od i "sastoje se od".

[0117] Na kraju, ovde korišćena terminologija služi samo za opisivanje određenih realizacija i nije namenjena da ograniči obim sadašnjeg pronalaska, koji je definisan isključivo patentnim zahtevima. Shodno tome, sadašnji pronalazak nije ograničen na ono što je precizno prikazano i opisano.

PATENTNI ZAHTEVI

1. Preparat koji sadrži inhibitor proteinaze 3 (PR3), za upotrebu u lečenju granulomatoze sa poliangiitisom (GPA) kod pacijenta koji nema A1PI deficijentni genotip, naznačen time, da je inhibitor PR3 inhibitor α-1 proteaze (A1PI), gde preparat sadrži efikasnu količinu pomenutog A1PI, i gde primena preparata kod pacijenta inhibira fiziološku funkciju PR3 na taj način tretirajući GPA.
2. Preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, da će se PR3 inhibitor administrirati nedeljno ili dvonedeljno.
3. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, naznačen time, da će PR3 inhibitor biti primenjen sistemski.
4. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time, da će PR3 inhibitor biti primenjen inhalacijom, enteralno ili parenteralno.
5. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time, da će PR3 inhibitor biti primenjen intravenski, inhalacijom, oralno, intramuskularno, intraarterijski, nazalno, intrakardijalno, subkutano ili transmukozno.
6. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time, da preparat dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
7. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time, da tretman rezultira inhibicijom ili smanjenjem vaskulitisa, nivoa c-ANCA, aktivacijom neutrofila ili degranulacijom neutrofila.
8. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačen time, da tretman rezultira smanjenjem Birmingenskog skora aktivnosti vaskulitisa modifikovanog za Vegenerovu granulamatozu (BVAS za GPA), inhibicijom ili smanjenjem pogoršanja bolesti, produženjem perioda pre recidiva, ili smanjenjem pojave ili težine jednog ili više od: bola u zglobovima bez očiglednog otoka; zapaljenje zglobova; dokumentovano povišenje temperature, petehije, palpabilna purpura, ekhimoze na koži ili curenje u mukoznim membranama; opsežna nekroza tkiva usled teške ishemije; čirevi u ustima (koji se ne pripisuju drugim uzrocima); usni konjunktivitis; usni episkleritis; retro-orbitalna masa/proptoza; uveitis; skleritis; retinalni eksudati; retinalne hemoragije; krvavi nazalni iscedak; nazalne kore; ulceracija nosa; osetljivost ili bol oko paranazalnih sinusa; rendgenski dokaz sinusitisa; kolaps nosnog mosta; otečene pljuvačne žlezde; zapaljenje subglotisa; konduktivna gluvoća; gluvoća uzrokovana oštećenjem slušnog nerva ili pužnice; perikarditis; mezenterična ishemija; pleuritis; grudni čvorovi ili šupljine; pseudotumor ili ulceracija traheobronhijalnog stabla; alveolarno krvarenje; dispneja koja zahteva veštačku ventilaciju; hematurija bez izlivanja eritrocita; staloženi eritrociti u sedimentu mokraće; porast kreatinina > 30% ili pad klirensa kreatinina > 25%; meningitis; moždani udar; lezija kičmene moždine; paraliza kranijalnog nerva, senzorna periferna neuropatija; multipleks motornog mononeuritisa; gubitak težine; napadi; zahvaćenost genitourinarnog sistema; lezije srčanih zalistaka; kožni infarkti; plućni infiltrati; gubitak pulsa/preteći gubitak udova; angina; kardiomiopatija; pankreatitis; ili slušni D/C.
9. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačen time, da tretman rezultira inhibicijom, smanjenjem ili smanjenjem jednog ili više simptoma u periodu od najmanje 1 meseca, najmanje 2 meseca, najmanje 3 meseca, najmanje 4 meseca, najmanje 5 meseci, najmanje 6 meseci, najmanje 7 meseci, najmanje 8 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, najmanje 2 godine, ili najmanje 3 godine ili više.
10. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, pri čemu se doza PR3 inhibitora koja će biti primenjena nedeljno kreće od 1-1000 mg/kg, 1-500 mg/kg, 1-200 mg/kg, 1-100 mg/kg, 1-50 mg/kg, 10-500 mg/kg, 10-250 mg/kg, 10-200 mg/kg, 10-150 mg/kg, 10-100 mg/kg, 10-50 mg/kg, 50-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg, 50-250 mg/kg, 50-200 mg/kg, 50-150 mg/kg, 50-100 mg/kg, 20-500 mg/kg, 20-250 mg/kg, 20-200 mg/kg, 20-150 mg/kg, 20-100 mg/kg ili 20-60 mg/kg.
11. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, gde se doza koja će biti primenjena dnevno kreće od 0,05 pg/kg do 5 mg/kg, 0,1 pg/kg do 5 mg/kg, 1 pg/kg do 5 mg/kg, 50 pg/kg do 5 mg/kg, 0,1 mg/kg do 5 mg/kg ili 1 mg/kg do 5 mg/kg,
12. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time, da pacijent ima otkrivene nivoe citoplazmatskih anti-neutrofilnih citoplazmatskih antitela (c-ANCA).
13. Preparat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 i 12, naznačen time, da se preparat primenjuje u režimu doziranja koji obuhvata dozu punjenja i dozu održavanja.
14. Preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačen time, da doza održavanja sadrži 25% ili više A1PI sadržanog u dozi punjenja.