RS65172B1

RS65172B1 - Molekuli antitela protiv bk virusa

Info

Publication number: RS65172B1
Application number: RS20240013A
Authority: RS
Inventors: Marcel Weber; Simone Schmitt; Christoph Esslinger; Thomas Schachtner; Uyen Huynh-Do; Maurizio Provenzano
Original assignee: Memo Therapeutics Ag; Univ Bern; Univ Zuerich
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2024-03-29
Also published as: US20240132575A1; EP4327883A3; MX2022015071A; HUE065440T2; EP4126932B1; CA3181750A1; IL298803A; US20230192816A1; US20240228590A9; SI4126932T1; DK4126932T3; CL2022003491A1; LT4126932T; AU2021288986A1; KR20230035578A; WO2021250097A1; SMT202400015T1; BR112022024288A2; PT4126932T; DK4126932T5

Description

Opis

OBLAST

[0001] Ovo otkrivanje se odnosi na molekule antitela protiv BK virusa ili njihove vezujuće fragmente. Ovo otkrivanje se dodatno odnosi na nukleinske kiseline koja kodira molekule antitela ili njihove vezujuće fragmente, ekspresione vektore, ćelije domaćina i postupke za pravljenje molekula antitela ili njihove vezujuće fragmente. Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje obuhvataju molekule antitela ili njihove vezujuće fragmente. Molekuli antitela protiv BK virusa ili njihovi vezujući fragmenti ovog otkrivanje mogu da se koriste (sami ili u kombinaciji sa drugim agensima ili terapijskim modalitetima) za lečenje ili sprečavanje infekcije BK virusom i/ili poremećajem povezanim sa BK virusom. Samim tim, ovo otkrivanje se dodatno odnosi na molekule antitela protiv BK virusa ili njihove vezujuće fragmente, ili farmaceutske kompozicije koje obuhvataju molekule antitela protiv BK virusa ili njihovih vezujućih fragmenata, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju infekcije BK virusom i/ili poremećaja povezanog sa BK virusom. Takođe je obezbeđena dijagnostička kompozicija koja obuhvata molekul antitela ili njegov vezujući fragment.

POZADINA

[0002] Imunosupresivni lekovi predstavljaju standard u lečenju primalaca transplantata kako bi se omogućilo kalemljenje i sprečilo odbacivanje kalema. Imunosupresija može da podstakne ponovnu aktivaciju humanog BK poliomavirusa npr. kod 40 do 50% primalaca transplantata bubrega (Hurdiss et al., Structure, 2016 Apr 5;24(4):528-536) i kod do 10% slučajeva ovo dovodi do nefropatije (BKVAN) povezane sa BK virusom (BKV) (Bennett et al., Microbes Infect, 2012 Aug;14(9):672-83, Rinaldo et al, APMIS, 2013 Aug;121(8):728-45). BKVAN predstavlja ozbiljnu pretnju i može da dovede do gubitka funkcije kalema ili čak gubitka kalema (Ramos et al., Transplantation, 2009 Mar 15;87(5):621-30). Upotreba antivirusa nije usaglašena sa rezultatima efikasnosti i ne smatra se vrednom opcijom lečenja (Santeusanio et al. Am J Health Syst Pharm, 2017 Dec 15;74(24):2037-2045; Kable et al., Transplant Direct, 2017 Mar 10;3(4):e142).

[0003] Stoga je standard brige za akutnu viremiju da se smanji imunosupresija kako bi se imunom sistemu omogućila kontrola virusa. Međutim, to dovodi do značajnog rizika od kratkoročne i dugoročne disfunkcije usled imunih reakcija domaćina protiv kalema kao što je stvaranje antitela specifičnih za davaoca.

[0004] WO 2017/046676 i WO 2019/106578 opisuju neutralizujuća antitela poliomavirusa.

[0005] U smislu stalne potrebe za poboljšanim strategijama za profilaktičku ili kurativnu terapiju kod imunosupresivnih pacijenata, nove kompozicije za neutralizujuću BK virusnu aktivnost su izuzetno poželjne.

KRATAK SADRŽAJ

[0006] Ovaj pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.

Aspekt A

[0007] U jednom aspektu A1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa.

Strukturna svojstva

[0008] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, pri čemu molekul antitela ili vezujući fragment obuhvata najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) (ili zbirno svih CDR) iz varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u tabeli 3, pri čemu jedan ili više CDR (ili zbirno svi CDR) mogu da imaju jednu, dve, tri, četiri, pet, šest ili više izmena, npr., aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativnih aminokiselinskih supstitucija), umetanja ili brisanja, u odnosu na aminokiselinsku sekvencu prikazanu u tabeli 3.

[0009] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, koji obuhvata:

varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinske sekvence regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 21 ili sekvence sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinske sekvence regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 22 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinske sekvence regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 23 ili sekvence sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja; i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinske sekvence regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 24 ili sekvence sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinske sekvence regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 25 ili sekvence sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativnih aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinske sekvence regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 26 ili sekvence sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja.

[0010] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa koji obuhvata:

varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 23, ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 26, ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije).

[0011] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, koji obuhvata:

varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 21 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 22 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 23 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativnih aminokiselinske supstitucije); i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 24 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 25 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 26 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije).

[0012] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, koji obuhvata:

varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 21, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 22 ili sekvencu sa jednom, dve, ili tri aminokiselinske supstitucije, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 23; i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 24 ili sekvencu sa jednom, ili dve aminokiselinske supstitucije, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 25, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 26 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije.

[0013] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata:

varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 21, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 22, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 23; i

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 24, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 25, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 26,

pri čemu je jedna ili dve aminokiseline unutar CDR umetnuta, obrisana ili supstituisana.

[0014] Prema ovom pronalasku, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata:

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 24, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 25, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 26.

[0015] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 27.

[0016] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata (i) varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 28, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 28; ili (ii)

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 31, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 31.

[0017] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 27; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 28, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 28; ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 27; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 31, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 31;.

[0018] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 28; ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 31.

Funkcionalna svojstva

[0019] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9) od sledećih svojstava:

(i) vezuje se za serotip I VP 1 BK virusa sa EC50 od manje oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(ii) vezuje se za serotip II VP1 BK virusa sa EC50 manje od oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(iii) vezuje se za serotip III VP1 BK virusa sa EC50 manje od oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(iv) vezuje se za serotip IV VP1 BK virusa sa EC50 manje od oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(v) ne vezuje se za JC virus VP1; npr., kao što je opisano u primeru 6;

(vi) neutrališe BK virus serotip I;

(vii) neutrališe BK virus serotip II;

(viii) neutrališe serotip III BK virusa;

(ix) neutrališe serotip IV BK virusa.

[0020] Sledeći aspekt A2 nije prema ovom pronalasku i predstavljen je čisto radi ilustracije. U aspektu A2, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela ili njegov vezujući fragment koji stupa u kompeticiju za vezivanje za serotip I VP1 BK virusa, serotip II VP1 BK virusa, serotip III BK virusa VP1, i/ili serotip IV BK virusa VP1 sa ovde opisanim molekulom antitela ili njegovim vezujućim fragmentom . U nekim načinima ostvarivanja aspekta A2, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela ili njegov vezujući fragment koji stupa u kompeticiju za vezivanje za genotip I VP1 BK virusa, genotip II VP1 BK virusa, genotip III VP1 BK virusa, i/ili genotip IV VP1 BK virusa sa molekulom antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta koji obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 21, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 22, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 23; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 24, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 25, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 26.

[0021] U nekim načinima ostvarivanja aspekta A2, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela ili njegov vezujući fragment koji stupa u kompeticiju za vezivanje za genotip I VP1 BK virusa, genotip II VP1 BK virusa, genotip III VP1 BK virusa, i/ili genotip IV VP1 BK virusa sa molekulom antitela ili njegov vezujući fragment koji obuhvata (i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 28; ili

[0022] U jednom aspektu A3, ovo otkrivanje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata molekul antitela ili njegov vezujući ovde opisani fragment i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili stabilizator.

[0023] U jednom aspektu A4, ovo otkrivanje se odnosi na molekule antitela protiv BK virusa ili njihove ovde opisane vezujuće fragmente, ili farmaceutske kompozicije koje obuhvataju molekule antitela protiv BK virusa ili njihove ovde opisane vezujuće fragmente, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju infekcija BK virusom i/ili poremećaja povezanog sa BK virusom. U nekim načinima ostvarivanja aspekta A4, Poremećaj povezan sa BK virusom je izabran iz grupe koju čine nefropatija, nefropatija povezana sa BK virusom (BKVAN), hemoragijski cistitis (HC).

[0024] U jednom aspektu A5, ovo otkrivanje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog i/ili lakog lanca antitela molekula antitela ili njegov ovde opisani vezujući fragment.

[0025] U jednom aspektu A6, ovo otkrivanje se odnosi na ekspresioni vektor koji obuhvata ovde opisanu nukleinsku kiselinu.

[0026] U jednom aspektu A7, ovo otkrivanje se odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata ovde opisanu nukleinske kiselinu ili ovde opisani ekspresioni vektor.

[0027] U jednom aspektu A8, ovo otkrivanje se odnosi na postupak proizvodnje molekula antitela, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ovde opisanih ćelija domaćina u uslovima pogodnim za ekspresiju gena.

[0028] U jednom aspektu A9, ovo otkrivanje se odnosi na dijagnostičku kompoziciju koja obuhvata molekul antitela ili njegov ovde opisani vezujući fragment.

Aspekt B

[0029] Sledeći aspekti B1 do B9 nisu prema ovom pronalasku i predstavljaju samo ilustracije.

[0030] U jednom aspektu B1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa.

Strukturna svojstva

[0031] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, pri čemu molekul antitela ili vezujući fragment obuhvata najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) (ili zbirno svih CDR) iz varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u tabeli 4, pri čemu jedan ili više CDR (ili zbirno svi CDR) mogu da imaju jednu, dve, tri, četiri, pet, šest ili više izmena, npr., aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativnih aminokiselinskih supstitucija), umetanja ili brisanja, u odnosu na aminokiselinsku sekvencu prikazanu u tabeli 4.

[0032] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, koji obuhvata:

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 35 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja; i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja; ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja; i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja; ili

(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja; i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata jednu, dve ili tri od: aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 48 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), umetanja ili brisanja.

[0033] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa koji obuhvata:

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36, ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39, ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36, ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 48, ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije).

[0034] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, koji obuhvata:

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 35 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske

1

supstitucije), i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); i/ili

(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije); i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 48 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije).

[0035] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa, koji obuhvata:

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 35 ili sekvencu sa jednom, dve, ili tri aminokiselinske supstitucije, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36; i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37 ili sekvencu sa jednom, ili dve aminokiselinske supstitucije, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije; ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44 ili sekvencu sa jednom, dve, ili tri aminokiselinske supstitucije, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36; i/ili

(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44 ili sekvencu sa jednom, dve, ili tri aminokiselinske supstitucije, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36; i/ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37 ili sekvencu sa jednom, ili dve aminokiselinske supstitucije, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 48 ili sekvencu sa jednom, dve, tri, ili četiri aminokiselinske supstitucije.

[0036] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata:

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 35, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36; i

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39;

pri čemu je jedna ili dve aminokiseline unutar CDR umetnuta, obrisana ili supstituisana;

ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36; i

ili

(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR1) iz SEQ ID NO: 34, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR2) iz SEQ ID NO: 44, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (VHCDR3) iz SEQ ID NO: 36; i

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 48;

1

[0037] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata:

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39; ili

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 48.

[0038] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata (i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 40, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 40; ili (ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 45, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 45; ili (iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 49, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 49.

[0039] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata (i) varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 41, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 41; ili (ii) varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 50, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 50.

[0040] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 40, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 40; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 41, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 41; ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 45, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 45; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 41, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 41; ili

(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 49, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 49; i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 50, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 50.

[0041] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 40, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 41; ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 45, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 41; ili

(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 49, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 50.

Funkcionalna svojstva

[0042] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B1, molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa obuhvata jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9) od sledećih svojstava:

(i) vezuje se za serotip I VP 1 BK virusa sa EC50 od manje oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM,

1

0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(ii) binds to BK virus serotip II VP1 sa EC50 manje od oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(iii) vezuje se za serotip III BK virusa VP1 sa EC50 manje od oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(iv) vezuje se za serotip IV BK virusa VP1 sa EC50 manje od oko 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.19 nM, 0.18 nM, 0.17 nM, 0.16 nM, 0.15 nM, 0.14 nM, 0.13 nM, 0.12 nM, 0.11 nM, 0.10 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM ili 0.02 nM npr., kada se molekul antitela ili njegov vezujući fragment ispituje kao dvovalentni molekul pomoću ELISA, npr., kao što je opisano u primeru 2;

(v) ne vezuje se za JC virus VP1; npr., kao što je prikazano u primeru 6;

(vi) neutrališe serotip I BK virusa;

(vii) neutrališe serotip II BK virusa;

(viii) neutrališe serotip III BK virusa;

(ix) neutrališe serotip IV BK virusa.

[0043] U jednom aspektu B2, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela ili njegov vezujući fragment koji stupa u kompeticiju za vezivanje za serotip I VP1 BK virusa, serotip II VP1 BK virusa, serotip III BK virusa VP1, i/ili serotip IV BK virusa VP1 sa ovde opisanim molekulom antitela ili njegovim vezujućim fragmentom . U nekim načinima ostvarivanja aspekta B2, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela ili njegov vezujući fragment koji stupa u kompeticiju za vezivanje za genotip I VP1 BK virusa, genotip II VP1 BK virusa, genotip III VP1 BK virusa, i/ili genotip IV VP1 BK virusa sa molekulom antitela ili njegovim vezujućim fragmentom koji obuhvata

varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR1) iz SEQ ID NO: 37, aminokiselinsku sekvencu regiona 2 za

1

određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR2) iz SEQ ID NO: 38, i aminokiselinsku sekvencu regiona 3 za određivanje komplementarnosti lakog lanca (VLCDR3) iz SEQ ID NO: 39; ili

[0044] U nekim načinima ostvarivanja aspekta B2, ovo otkrivanje se odnosi na molekul antitela ili njegov vezujući fragment koji stupa u kompeticiju za vezivanje za genotip I VP1 BK virusa, genotip II VP1 BK virusa, genotip III VP1 BK virusa, i/ili genotip IV VP1 BK virusa sa molekulom antitela ili njegov vezujući fragment koji obuhvata

[0045] U jednom aspektu B3, ovo otkrivanje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata molekul antitela ili njegov vezujući fragment ovde opisane i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili stabilizator.

[0046] U jednom aspektu B4, ovo otkrivanje se odnosi na molekule antitela protiv BK virusa ili njihove ovde opisane vezujuće fragmente , ili farmaceutske kompozicije koje obuhvataju molekule antitela protiv BK virusa ili njihove ovde opisane vezujuće fragmente , za upotrebu u lečenju ili sprečavanju infekcija BK virusom i/ili poremećaja povezanog sa BK virusom. U nekim načinima ostvarivanja aspekta B4, poremećaj povezan sa BK virusom je izabran iz grupe koju čine nefropatija, nefropatija povezana sa

1

BK virusom (BKVAN), hemoragijski cistitis (HC).

[0047] U jednom aspektu B5, ovo otkrivanje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni region teškog i/ili lakog lanca antitela molekula antitela ili njegov vezujući fragment ovde opisane.

[0048] U jednom aspektu B6, ovo otkrivanje se odnosi na ekspresioni vektor koji obuhvata ovde opisanu nukleinsku kiselinu.

[0049] U jednom aspektu B7, ovo otkrivanje se odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata ovde opisanu nukleinsku kiselinu ili ovde opisani ekspresioni vektor.

[0050] U jednom aspektu B8, ovo otkrivanje se odnosi na postupak proizvodnje molekula antitela, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ovde opisane ćelije domaćina u uslovima pogodnim za ekspresiju gena.

[0051] U jednom aspektu B9, ovo otkrivanje se odnosi na dijagnostičku kompoziciju koja obuhvata molekul antitela ili njegov ovde opisani vezujući fragment.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0052]

Fig 1. Vezivanje antitela protiv BK virusa za BKV-VP1 serotipove I-IV u ELISA-i. Ovi podaci su korišćeni za određivanje EC50Evrednosti analizom od tri parametra u GraphPad Prism Software.

Fig 2. Kvantitativna ocena neutralizacije posredovane antitelima BKV sojeva (serotip la, Ib, II, III i IV).

293TT ćelije su korišćene kao cilj za infekciju luciferazom koja eksprimira BK-pseudovirus obrazovan sa bilo kojim od serotipova la, Ib, II, III i IV VP1. Antitela protiv BK virusa se koriste u naznačenim koncentracijama.

Fig 3. Dugoročna neutralizacija BKV virusa divljeg tipa na humanim primarnim renalnim tubularnim epitelinim ćelijama antitelima protiv BK virusa. Naznačeno je opterećenje rezidualnim virusom nakon dugoročne zajedničke inkubacije ćelija, BK virusa i antitela protiv BK virusa u naznačenim koncentracijama. Koncentracije antitela odgovaraju EC 95 (1.500), EC50 (0.15) i EC5 (0.015). P8D11 je označen sa "BM2" na ovom crtežu.

Fig 4. Vezivanje antitela protiv BK virusa za konformacioni epitop.

Fig 5. Ocena jačine vezivanja u ELISA-i za VP1-mutante i JCV- antitela 319C07 i antitela 336F07 u poređenju sa antitelom P8D11. EC50 vrednosti na razne mutantne oblike VP1 i JC-VP1 su određene u poređenju sa VP1 divljeg tipa. VP1 mutanti su označeni u standardnom formati gde broj označava položaj u VP1-STI sekvenci koji je promenjena iz aminokiseline levo od broja u aminokiselinu desno od broja.

Grafikoni prikazuju vezivanje antitela 319C07, antitela 336F07, antitela izotipne kontrole 24C03 i antitela P8D11 sa izborom BKV-VP1 mutanta i JCV-VP1 i kao irelevantnim antigenskim CMV-gH pentamerima.

Tabela prikazuje podatke za sve BKV-VP1 mutante ispitane i JCV-VP1. "+" se koristi za oznaku da nije

1

primećena razlika u afinitetu prema vezivanju između originalne sekvence i mutirane sekvence. "red' označava redukovano vezivanje "-" označava da nije primećeno vezivanje.

Fig 6. Inhibicija BKV širenja na HRPTEC antitelima protiv BK virusa (P8D11 je označena sa "BM2" na ovom crtežu).

Fig 7. ADCC aktivnost antitela protiv BKV na zaraženi i nezaraženi HPRTEC.

Fig 8. CDC aktivnost antitela protiv BKV na zaraženi i nezaraženi HPRTEC u prisustvu humanog seruma.

DETALJAN OPIS

[0053] Ovaj pronalazak kao što je ilustrativno prikazano u nastavku može pogodno da se praktikuje u odsustvu bilo kog elementa ili elemenata, ograničenja ili više ograničenja, koja nisu ovde konkretno otkrivena.

[0054] Ovaj pronalazak će biti opisan u odnosu na određene načine ostvarivanja uz pozivanje na određene crteže, ali ovaj pronalazak nije ograničen na iste već samo na patentne zahteve.

[0055] Tamo gde se u ovom opisu i patentnim zahtevima koristi pojam "koji obuhvata", ne isključuje druge elemente. U svrhu ovog pronalaska, pojam "koji se sastoji od " se smatra poželjnim načinom ostvarivanja pojma "koji obuhvata". Ako se u nastavku grupa definiše tako da obuhvata najmanje određeni broj načina ostvarivanja, takođe bi trebalo da se shvati kao otkrivanje grupe, koja se poželjno sastoji samo od ovih načina ostvarivanja.

[0056] Tamo gde se koristi neodređeni ili određeni član kada se označava imenica u jednini, npr. "neki", "jedan" ili "taj", ovo uključuje množinu imenice ukoliko nešto drugo nije konkretno navedeno. Pojmovi "oko" ili "približno" u kontekstu ovog pronalaska označavaju interval tačnosti koji će stručnjak iz oblasti shvatiti da i dalje obezbedi tehnički efekat karakteristike o kojoj se radi. Ovaj pojam označava odstupanje od naznačene numeričke vrednosti od ±20%, poželjno ±10%, i poželjnije od ±5%.

[0057] Tehnički pojmovi se koriste u njihovom uobičajenom značenju. Ako se konkretno značenje prenosi na određene pojmove, definicije pojmova će biti date u nastavku u kontekstu čiji se pojmovi koriste.

[0058] Određeni aspekti ovog otkrivanja su zasnovani, barem delimično, na identifikaciji molekula antitela protiv BK virusa ili njegovog vezujućeg fragmenta koji se

- vezuju za i neutrališu serotip I BK virusa; i/ili

- vezuju za i neutrališu neutrališe serotip II BK virusa; i/ili

- vezuju za i neutrališu neutrališe serotip III BK virusa; i/ili

- vezuju za i neutrališu neutrališe serotip IV BK virusa; i/ili

- ne vezuju se za JC virus VP1.

[0059] U poželjnom načinu ostvarivanja, molekuli antitela protiv BK virusa ili njihovi vezujući fragmenti neutrališu serotipove I, II, III, i IV BK virusa.

1

[0060] U drugom poželjnom načinu ostvarivanja, molekuli antitela protiv BK virusa ili njihovi vezujući fragmenti se ne vezuju za JC virus VP1. Povećana specifičnost se manifestuje odsustvom vezivanja za blisko povezani JC virus VP1. Povećana specifičnost se smatra kao bolja bezbednost usled manjeg rizika za reaktivnost van cilja.

[0061] Kao što je prethodno pomenuto, ovo otkrivanje uzima u razmatranje molekule antitela protiv BK virusa ili njihovih vezujućih fragmenata. Antitelo pune dužine uključuje konstantan domen i varijabilni domen. Konstantni region mora da bude prisutan u fragmentu koji se vezuje za antigen antitela.

[0062] Vezujući fragmenti samim tim mogu da uključuju delove intaktnog antitela pune dužine, kao što je vezivanje antigena ili varijabilni region potpunog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, F(ab')2, Id i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; molekuli antitela pojedinačnog lanca (npr., scFv); fragmenti multispecifičnog antitela kao što su bispecifična, trispecifična, i multispecifična antitela (npr., dijatela, trijatela, tetratela); minitela; helatna rekombinantna antitela; trijatela ili bitella; intratela; nanotela; mali modularni imunofarmaceutici (SMIP), fuzioni proteini imunoglobulina koji se vezuje za domen; kamelizovana antitela; VHH koji sadrži antitela; i bilo koji polipeptidi obrazovani od fragmenata antitela. Stručnjak iz oblasti je svestan da funkciju vezivanja antigena antitela mogu da izvedu fragmenti antitela pune dužine.

[0063] Ovde su otkriveni polipeptidi sa naznačenim sekvencama, ili sekvencama koje su suštinski njima identične ili slične, npr. sekvence koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci sa naznačenom sekvencom.

[0064] Određivanje procentualnog identiteta između dve sekvence je poželjno postiže pomoću matematičkog algoritma iz Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Takav algoritam je inkorporisan u BLASTp (Protein BLAST) program iz Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215: 403-410 dostupan na NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Određivanje procentualnog identiteta može biti izvedeno sa standardnim parametrima BLASTp programa. Za opšte parametre, kućica "maksimalne ciljane sekvence " može biti podešena na 100, kućica "kratki upiti" može biti štiklirana, kućica "očekivanje praga" može biti podešena na 10, kućica "veličina reči" može biti podešena na "3" a "maksimalni parovi u opsegu upita" može biti podešena na "0". Za dobijanje parametara kućia "matrica" može biti podešena na "BLOSUM62", kućica "troškovi praznine" može biti podešena na "postojanje: 11 produžetak:1", kućica "kompoziciona podešavanja" može biti podešena na "podešavanje matrice kondicionog kompozicionog rezultata". Za filtere i parametre maskiranja kućica "niži regioni kompleksnosti " možda neće biti štiklirana, kućica "maska samo za pretragu tabele" možda neće biti štiklirana i kućica "maskiranje malih slova" možda neće biti štiklirana.

[0065] Prema otkrivanju, "konzervativna aminokiselinska supstitucija" je aminokiselinska supstitucija u kojoj se aminokiselinski ostatak menja aminokiselinskim ostatkom sa sličnim bočnim lancem. Porodice aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima su definisani u ovoj oblasti. Ove porodice uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. , lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. ,

2

asparginska kiselina, glutaminska kiselina), nenapunjeni polarni bočni lanci (npr. , glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (npr. , alanin, valine, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranati bočni lanci (npr. , treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr. , tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin).

[0066] Kao što je pomenuto, ovo otkrivanje se takođe odnosi u nekim načinima ostvarivanja na nukleinsku kiselinu koja kodira molekule antitela ili njihove vezujuće fragmente, vektore koji obuhvataju takve nukleinske kiseline i ćelije domaćina koje obuhvataju takve nukleinske kiseline ili vektore.

[0067] Molekule antitela ili njihove vezujuće fragmente takođe može da kodira pojedinačna nukleinska kiselina (npr., pojedinačna nukleinska kiselina koja obuhvata nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptide lakog i teškog lanca antitela), ili dve ili više odvojenih nukleinskih kiselina, od kojih svaka kodira različit deo molekula antitela ili fragmenta antitela. Nukleinske kiseline mogu biti DNK, cDNK, RNK i njima slične.

[0068] Ovde opisane nukleinske kiseline mogu biti umetnute u vektore. „Vektor“ je bilo koji molekul ili kompozicija koja ima mogućnost da nosi sekvencu nukleinske kiseline u pogodnu ćeliju gde se dešava sinteza kodiranog polipeptida.

[0069] Ovo otkrivanje u nekim aspektima dodatno obezbeđuje ćeliju domaćina (npr., izolovanu ili prečišćenu ćeliju) koja obuhvata nukleinsku kiselinu ili vektor ovog pronalaska. Ćelija domaćina može biti bilo koji tip ćelije koji može da se transformiše sa nukleinskom kiselinom ili vektorom pronalaska kako bi se proizveo polipeptid koji se tim putem kodira.

[0070] Molekuli antitela protiv BK virusa ili njihovi vezujući fragmenti protiv BK virusa takođe mogu biti formulisani u kompozicijama, naročito farmaceutskim kompozicijama. Takve kompozicije obuhvataju terapijski efektivnu količinu antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta u mešavini sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijensom ili stabilizatorom.

[0071] Dalje, molekuli antitela protiv BK virusa ili njihovi vezujući fragmenti protiv BK virusa i farmaceutske kompozicije kao što su ovde opisane mogu da se primenjuju u postupcima lečenja ili sprečavanja infekcije BK virusom/ili poremećaja povezanog sa virusom.

[0072] Bilo koja pozivanja u opisu na postupke lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili zbog dijagnoze).

PRIMERI

Uvodni komentari

[0073] VP1 proteinski konstrukti aminokiselinske sekvence koji se koriste u sledećim primerima su sažeto prikazani u tabeli 1 u nastavku.

Tabela 1 - Aminokiselinske sekvence VP1 proteinskih konstrukata

Serotip I BKV II

SEQ ID NO: 6 VP1-III VP1-pentamer

2

Serotip

SEQ ID NO: 9 VP1-IVc BK pseudovir us

2

Uporedna antitela

[0074] P8D11 (WO 2017/046676) je kloniran kao što je opisano za druga antitela. VH i VL od P8D11 kao što je opisano u WO 2017/046676 je spojeno sa identičnim konstantnim domenima IgG kao što je

opisano u nastavku. Aminokiselinske sekvence za uporedno antitelo P8D11 su ukratko prikazane u tabeli 2 u nastavku.

[0075] Negativna kontrola 24C3 je antitelo izvedeno iz zdravih ljudi protiv toksoida tetanusa. Varijabilni fragmenti su spojeni sa identičnim konstantnim domenima IgG kao što je opisano u nastavku.

Tabela 2 - Aminokiselinske sekvence za uporedno antitelo P8D11 (WO 2017/046676)

2

Otkriće antitela

Primer 1

[0076] Memorijske B ćelije periferne krvi zdravih humanih davalaca ili primaoca presađenog bubrega korišćene su za pripremu biblioteka ekspresije repertoara antitela kloniranjem varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca imunoglobulina u ekspresionu kasetu koja daje konstantan težak region humanog

2

imunoglobulina u kombinaciji s transmembranskim domenom izvedenim iz humanog CD8 kako bi se omogućio prikaz antitela u ćelijama sisara. Skrining biblioteka antitela se sproveden nakon transdukcije biblioteke u HEK 293T ćelijama sortiranjem specifičnim za antigen pomoću fluorescentno obeleženih VP1-pentamera BK-Virusa.

[0077] Ovo sortiranje je dalo HEK ćelijske klonove koji eksprimiraju antitela specifična za BK-virus koji su dalje razmnožavani za povećanje proizvodnje antitela za nishodnu analizu svojstava antitela kao što su dodatna ispitivanja vezivanja u ELISA ili neutralizacija BK-virusa. Kapacitet neutralizacije antitela je ispitivan pomoću BK pseudovirusa (BK-PsV) koji nose reporterski plazmid koji eksprimira luciferazu i divlji tip BKV. Antitela specifična za BK-virus sa visokim afinitetom i kapacitetom neutralizacije virusa su zatim subklonirana u ekspresione vektore za ekspresiju topljivih antitela i eksprimirana nakon prolazne transfekcije u HEK 293F ili CHO ćelijama. Antitela su zatim pročišćena preko proteina G ili proteina A za karakterizaciju u različitim ispitivanjima. Aminokiselinske sekvence koje se odnose na identifikovano antitelo 319C07 su sažete u tabeli 3 u nastavku. Dodatno, pripremljene su varijante i odgovarajuće aminokiselinske sekvence takođe su sažete u tabeli 3 u nastavku. Aminokiselinske sekvence koje se odnose na identifikovano antitelo 336F07 su sažete u tabeli 4 u nastavku. Dodatno, pripremljene su varijante i odgovarajuće aminokiselinske sekvence su takođe sažete u tabeli 4 u nastavku.

Tabela 3 - Aminokiselinske sekvence za antitela protiv BK virusa 319C07 i 319C07-var1.

2

319C07-var1

2

Tabela 4 - Aminokiselinske sekvence za antitela protiv BK virusa 336F07, 336F07-var1 i 336F07-var4.

1

2

SEQ ID NO: VHCDR3 TYPTWGGVVIGAIDV

4

Ispitivanja

Primer 2 - Vezivanje za VP1-pentamer u ELISA-i

Materijal i postupci

[0078] Vezivanja antitela protiv BK virusa za BKV-VP1 pentamere je analizirano ELISA-om. Ukratko, ploče za ispitivanje sa 96 bunarčića Costar<®>96 well Assay Plates, ploče izuzetnog vezivanja polovine površine (Corning Inc. #3690) su obložene sa 30µl/bunarčić od 1µg/ml BKV-VP1 pentamera tokom noći na 4°C. Posle toga, ploča je blokirana pomoću 5% obranog mleka u prahu (Rapilait, Migros #7610200017598) razblaženog u PBS. Antitela su serijski razblažena u PBS sa 0.5% obranog mleka u prahu i dodaju se u ploče obložene antigenom tokom 1.5 h. zatim, ploče su oprane sa PBS 0.05% Tween20 (AppliChem, A4974) i inkubirane sa sekundarnim antitelom koje je obeleženo enzimom (HRP-konjugovano kozje antihumano IgG, Jackson-Immuno #109-035-098) razblaženim 1:10'000 u PBS sa 0.5% obranog mleka u prahu tokom 45min. Ploče su oprane tri puta sa PBS-om koji sadrži 0.05% Tween 20. Reakcija se razvija pomoću 30µl/bunarčić TMB tečnim supstratom (Sigma-Aldrich, #T0440) i zaustavljena sa 15µl/bunarčić H2SO4. Apsorbanca je detektovana na 450 nm (Tecan, CM INFINITE MONO 200). Podaci su uklopljeni i očigledne EC50 ELISA vrednosti (EC50E) su određene troparametarskom analizom u GraphPad Prism (GraphPad Software).

Rezultati

[0079] Antitelo 319C07 je pokazalo jako i selektivno vezivanje za sve BKV-VP1 serotipove (Fig.1, EC50Evrednosti u nastavku). U poređenju sa komparativnim antitelom P8D11, antitelo 319C07 je pokazalo viši afinitet za serotip I, II i IV i pokazalo je uporedivi afinitet na BKV-VP1-serotip III.

[0080] Takođe antitelo 336F07 je pokazalo jako i selektivno vezivanje za sve BKV-VP1 serotipove (Fig.1, EC50Evrednosti u nastavku). U poređenju sa komparativnim antitelom P8D11, antitelo 336F07 je pokazalo veći afinitet na sva četiri serotipa.

Primer 3 - Neutralizcija BK-pseudovirusa antitelima protiv BK virusa

Materijal i postupci

[0081] BK Pseudovirus (BK-PsV) koji nosi NanoLuc reporterski gen je proizveden kao što je opisano (Pastrana et al, J Virol, 2013 Sep; 87(18):10105-13). Pet različitih genotipova je proizvedeno: BKV-la (BK-D; JF894228), BKV-lb2 (PittVR2; DQ989796) BKV-II (Q85238; CAA79596), BKV-III (Q0PDA6; BAF03017) i BKV-IVc2 (A-66H; AB369093). VP1 je prečišćen preko perli od gela od agaroze kao što je opisano (Buck et al, J Virol, 2008 Jun;82(11):5190-7 i Buck et al, Curr Protoc Cell Biol, 2007 Dec; Chapter 26; 26.21).

Zaraženi virusni titar je određen na 293TT ćelijama. Različita razblaženja BK-PsV su ispitivana u ploči sa 96 bunarčića sa i bez inhibitora. Razblaženje izabrano za dodatna ispitivanja je dovelo do visokog luminescentnog signala kod neinhibiranih ćelija.

[0082] 20'000 ćelija (293TT) je posejano u ploču sa 96 bunarčića pomoću DMEM koji sadrži 9% FBS, HEPES i penicilin/streptavidin. Nakon 5h inkubacije, antitela u raznim koncentracijama i fiksna količina BK-Pseudovirusa se dodaje u svaki bunarčić i ploča se inkubira na 37C, 5% CO2. Posle 3 dana inkubacije aktivnost lucigeraze u supernatantnoj tečnosti se meri pomoću NanoGlo<™>reagensa za ispitivanje (Promega, #N1130).

[0083] 40ul ćelijske kulture ili zajedničke kulture u supernatantu virus-ćelija-antitelo se prenese u ploču sa 96 bunarčića belog dna, 40ul NanoGlo<™>supstrata se dodaje i inkubira tokom 2 minuta pre određivanja aktivnosti luciferaze pomoću čitača luminiscencije (BioTek Synergy). Podaci su grafički prikazani na koncentracionoj krivi signal nasuprot antitela. IC50 vrednosti su određene GraphPad Prism pomoću nelinearne regresije (uklapanje krive) i formule "log(inhibitor) u odnosu na normalizovani odgovor (varijabilni nagib)" (GraphPad Software).

Rezultati

[0084] 319C07 i varijanta 319C07-var1 pokazuju jaku inhibiciju BK-Pseudovirusa iz svih serotopiva. 319C07 značajno premašuje P8D11 po učinku (Fig.2, IC50 vrednosti u nastavku).

[0085] Takođe antitelo 336F07 i varijante 336F07-var1 i 336F07-var4 pokazuju jaku inhibiciju BK-pseudovirusa od svih serotipova.336F07 po učinku značajno prevazilazi P8D11 (Fig.2, IC50 vrednosti u nastavku).

Primer 4 – Dugoročna neutralizacija virusa antitelima protiv BK virusa

Materijal i postupci

[0086] Kako bi se pozabavila dugotrajnom neutralizacijom virusa anti-BK virusnim antitelima in vitro, ponavljajući ciklusi kokultura humanih primarnih bubrežnih proksimalnih tubularnih epitelnih ćelija (HPRTEC), soj I BK virusa divljeg tipa (ATCC<®>VR-837<™>) i korišćena su antitela protiv BK virusa. Na početku ispitivanja dodata su antitela protiv BK virusa u tri različite koncentracije koje odgovaraju njihovom EC95; EC50 i EC5 moć inhibicije virusa na kokulturama ćelijama i virusa tokom 1 nedelje. Nakon tog razdoblja virus je sakupljen iz ćelija i preostalog supernatanta 3 ciklusa smrzavanja i odmrzavanja.10 ul ovog virusnog ekstrakta se zatim dodaje u sveže posejane HRPTEC ćelije u prisustvu antitela u različitim koncentracijama. Nakon 2 nedelje inokulacije ponovno je kvantifikovano opterećenje virusom i generisani su ekstrakti virusa koji će se koristiti u sledećem ciklusu infekcije. Ovaj postupak je ponovljen 3 puta što je dovelo do ukupno 8 nedelja kokulture.

[0087] Ispitivanje je izvedene u triplikazu u pločama za kultivisanje ravnog dna sa 96 bunarčića.

Kvantifikacija virusnog opterećenja u supernatantu kulture se izvodi sakupljanjem 15µl podloga koje se zatim inaktiviraju toplotom na 95°C tokom 10 min i koriste se za qPCR sa prajmerima 5'-GGATGGGCAGCCTATGTATG-3' (SEQ ID NO: 53), i 5'-TCATATCTGGGTCCCCTGGA-3' (SEQ ID NO: 54) i TaqMan<™>probom FAM-AGGGTGTTTGATGGCACAGA-TAMRA (SEQ ID NO: 55). PCR se izvodi pomoću PerfeCTa qPCR ToughMix (Quantabio, #95140) sa sledećim uslovima: 95°C za 8 min i 40 ciklusa od 95°C tokom 10 sekundi i 60°C tokom 60 sekundi.

Rezultati

[0088] Antitelo 319C07 pokazuje potpuniju neutralizaciju virusa u poređenju sa P8D11. Ovo postaje najočiglednije kada se pogleda poslednji ciklus neutralizacije infekcije nakon 8 nedelja gde se pri koncentracijama koje odgovaraju EC95 i EC50 više nije mogao detektovati virus, dok P8D11 pokazuje merljivo opterećenje virusom i u EC95 i EC50. (Fig 3, P8D11 je na ovom crtežu označen sa "BM2").

[0089] Takođe, antitelo 336F07 pokazuje potpuniju neutralizaciju virusa u poređenju sa P8D11. Ovo postaje najočiglednije kada se pogleda zadnji ciklus neutralizacije infekcije nakon 8 nedelja (Fig.3, P8D11 je na ovoj slici označen sa"BM2").

Primer 5 - Antitela protiv BK virusa se vezuju za konformacioni epitop

Materijal i postupci

[0090] Kako bi se utvrdilo da li se antitela protiv BK virusa vezuju za konformacioni epitop, izvedeni su tačkasti blotovi VP1 u prirodnom i denaturisanom stanju. Pentameri BKV-VP1 serotipova I, II, III i IV uočeni su na nitroceluloznu membranu ili u svom nativnom obliku ili nakon hemijske i termalne denaturacije pomoću Tris pufera koji sadrži SDS i β-merkaptoetanol i zagrevanja na 85°C tokom 5 minuta. Obe membrane su inkubirane sa anti-BK virusnim antitelima i njihovo vezivanje je otkriveno pomoću HRP-konjugovanih sekundarnih antitela usmerenih protiv humanog Fc. Detekcija je urađena pomoću kolorimetrijskog supstrata (Sigma Fast DAB).

Rezultati

[0091] Antitelo 319C07 i antitelo 336F07 pokazuju selektivno vezivanje za konformacioni epitop (Fig.4). Zbog odsutnosti bojenja denaturisanog antigena, može se isključiti vezivanje za linearni epitop.

Komercijalno dostupno kontrolno antitelo (Ab53977, Abcam, zečje-lgG) za koje je poznato da prepoznaje linearni epitop, otkrilo je i denaturisani i nedenaturisani VP1.

Primer 6 - Vezivanje za mutacije BKV-VP1-pentamera i za JCV-VP1 pentamer u ELISA-i Materijal i postupci

[0092] Sekvenca divljeg tipa VP1-serotipa Ib korišćena je kao osnova za uvođenje mutacija na različitim položajima. Isto tako, korišćen je VP1 JC virusa. Vezivanje anti-BK virusnih antitela za divlji tip i varijantu VP1 pentamera je analizirano ELISA-om. Ukratko, ploča za ispitivanje Costar<®>Assay Plate sa 96 bunarčića, polovična ploča sa visokim vezivanjem (Corning Inc. #3690) obložena je sa 30 µl/bunarčiću 1 µg/ml BKV-VP1 pentamer varijanti preko noći na 4°C. Nakon 16 sati, nespecifično vezivanje je blokirano upotrebom 5% obranog mleka u prahu (Rapilait, Migros #7610200017598) razblaženog u PBS. Antitela su serijski razblažena od 67 nM do 0,02 nM u PBS-u koji je sadržavao 0,5% obranog mleka u prahu i inkubirana na pločama obloženim antigenom 1,5 h. Ploče su zatim isprane tri puta sa PBS 0,05% Tween20 (AppliChem, A4974) i zatim inkubirane sa sekundarnim antitelima (HRP-konjugovano kozje anti-humano IgG, Jackson-Immuno #109-035-098) razblaženim 1:10'000 u PBS-u sa 0,5% obranim mlekom u prahu 45 min. HRP aktivnost vezanih sekundarnih antitela je otkrivena korišćenjem 30 µl/bunarčić TMB tečnog supstrata (Sigma-Aldrich, #T0440). Reakcija je zaustavljena nakon 2,5 min dodatkom 15 ul/bunarčić 1M H2SO4. Apsorbanca je detektovana na 450 nm (Tecan, CM INFINITE MONO 200). Podaci su nacrtani i EC50 vrednosti su određene analizom tri parametra u GraphPad Prism (GraphPad Software) i nazivaju se EC50ELISA (EC50E).

Rezultati

[0093] Vezivanje za mutirane oblike BKV VP1 u poređenju sa divljim tipom VP1 i sa VP1 blisko srodnog JC polioma virusa je ispitano za antitelo 319C07 u poređenju sa antitelom P8D11. Antitelo 319C07 se uopšte ne vezuje za VP1 JC virusa, dok antitelo P8D11 pokazuje slabo, ali značajno vezivanje. Ako je aminokiselina na položaju N62, D175 ili S275 mutirana u alanin, 319C07 pokazuje blago smanjeni afinitet vezivanja. Promena aminokiseline K172 u alanin ne smanjuje vezivanje. S druge strane, P8D11 pokazuje smanjeno vezivanje za mutant VP1-I-K172A, dok na vezivanje ne utiču mutacije N62A, D175A ili S275A. U poređenju sa antitelom P8D11, 319C07 ovde pokazuje jasno jasan uzorak koji ukazuje da stupa u interakciju sa različitim aminokiselinama VP1 u poređenju sa P8D11 (Fig.5).

[0094] Vezivanje za mutantne oblike BKV VP1 u poređenju sa divljim tipom VP1 i sa VP1 blisko povezanog JC polioma virusa je takođe ispitan za antitelo 336F07 u poređenju sa antitelom P8D11. Antitelo 336F07 se ne vezuje uopšte za VP1 JC virusa dok antitelo P8D11 pokazuje slabo ali značajno vezivanje. Ako su aminokiseline na položaju N62 ili E73 mutirane, 336FC07 pokazuje blago smanjen afinitet vezivanja. Promena mainokiselina K172 u alanin ne snižava vezivanje. P8D11 sa druge strane, pokazuje smanjeno vezivanje za VP1-I-K172A mutant, dok na vezivanje ne utiču mutacije N62A ili E73Q. U poređenju sa antitelom P8D11, 336F07 ovde pokazuje jasno jasan model koji ukazuje da stupa u interakciju sa različitim VP1 aminokiselinama u poređenju sa P8D11 (Fig.5).

Primer 7 – Inhibicija širenja virusa iz zaraženih HRPTEC ćelija

Materijal i postupci

[0095] Primarne humane renalne proksimalne tubularne epitelne ćelija (HRPTEC) su zaražene sa BKV (soj 33-1, ATCC<®>45024<™>). Posle 5 dana, ćelije su nežno sastrugane sa strugalicom za ćelije i intenzivno oprane sa PBS-om kako bi se uklonio sav virus bez ćelija. Ćelije se zatim dodaju u bunarčiće koji sadrže prijanjajuće rastujuće HRPTEC i razna razna razblaženja BKV-neutrališućeg antitela.8 dana posle inokulacije ćelija 10µl supernatantne tečnosti se ukloni iz svakog bunarčića i odredi se virusno opterećenje pomoću kvantitativnog PCR pomoću prajmera 5'-GGATGGGCAGCCTATGTATG-3' (SEQ ID NO: 53), 5'-TCATATCTGGGTCCCCTGGA-3' (SEQ ID NO: 54) i probe FAM-5'-AGGGTGTTTGATGGCACAGA-3'-TAMRA (SEQ ID NO: 55) kao što je opisano (Martelli et al., Viruses, 2018 Aug 30;10(9):466).

Rezultati

[0096] Antitelo 319C07 pokazuje oko 100-struku superiornost u odnosu na P8D11 za inhibiciju širenja BKV među HRPTEC; takođe antitelo 336F07 pokazuje značajnu superiornost u odnosu na P8D11 za inhibiciju širenja BKV među HRPTEC (Fig.6, P8D11 je obeležen sa "BM2" na ovom crtežu).

Primer 8 – Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)

Materijal i postupci

[0097] HPRTEC posejane u ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića ili zaražene divljim tipom BK virusa soja I (ATCC<®>VR-837<™>) ili ostavljene nezaražene su korišćene kao ciljane ćelije. Kao efektorske ćelije korišćene su konstruisane Jurkat ćelije, komponente ADCC Reporter Bioassay G7015 kompanije Promega. U ovom testu, kao surogat za ADCC aktivnost, Fc-γRIIIa signaliziranje od strane efektorskih ćelija kvantifikuje se očitavanjem luminescencije. Anti-BKV ili kontrolna antitela u serijskim razblaženjima su dodata u HPRTEC kulturu zajedno sa efektorskim ćelijama i inkubirana 6 sati pre razvijanja i merenja bioluminiscencije kako je opisao proizvođač pribora za ispitivanje.

Rezultati

[0098] 319C7 i 336F07 su pokazali uporedivu ADCC aktivnost na zaraženim HPRTEC koja je za uzvrat uporediva sa onom od P8D11. Nije primećen ADCC na HPRTEC koje su ostavljene nezaražene ni sa 319C7 ni sa 336F07 ili P8D11 (Fig.7).

Primer 9 – Toksičnost zavisna od komplementa

Materijal i postupci

[0099] HPRTEC posejane u ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića ili zaražene divljim tipom BK virusa soja I (ATCC<®>VR-837<™>) ili ostavljene nezaražene su korišćene kao ciljane ćelije. Ćelije su inkubirane sa antitelima protiv BKV u serijskim razblaženjima počevši sa 100µg/ml i 20% humanim serumom preko noći a ćelijska vijabilnost je kvantifikovana određivanjem odnosa živih ćelija pomoću FSC/SSC kriterijuma u citometru.

Rezultati

[0100] 319C7 i 336F07 nisu pokazali CDC aktivnost pri koncentraciji od 100µg/ml na zaražene HPRTEC i

4

Claims

ista primedba je napravljena sa antitelom P8D11 i kontrolnim antitelom Rituksimab usmerenim protiv irelevantnog cilja na HRPTEC (Fig.8). Patentni zahtevi

1. Molekul antitela protiv BK virusa ili njegov vezujući fragment protiv BK virusa koji obuhvata:

2. Molekul antitela ili njegov vezujući fragment prema zahtevu 1, koji obuhvata

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 27, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 28, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 28; ili

(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 27, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 31, ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 90%, 95%, ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 31.

3. Molekul antitela ili njegov vezujući fragment prema zahtevima 1 ili 2, koji obuhvata

(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 28; ili (ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 27, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 31.

4. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata molekul antitela ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-3 i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili stabilizator.

5. Molekul antitela ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-3 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 4 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju infekcije BK virusom i/ili poremećaja povezanog sa BK virusom izabranog iz grupe koju čine nefropatija, nefropatija povezana sa BK virusom (BKVAN), i hemoragijski cistitis (HC).

6. Nukleinska kiselina koja kodira varijabilne regione antitela teškog i lakog lanca molekula antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 1-3.

7. Ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 6.

8. Ćelija domaćina koja obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 6 ili ekspresioni vektor prema zahtevu 7.

9. Postupak proizvodnje molekula antitela, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 8 u uslovima pogodnim za ekspresiju gena.

10. Dijagnostička kompozicija koja obuhvata molekul antitela ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-3.