RS65191B1 - Farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat hijaluronske kiseline i karnozina i odgovarajuća primena - Google Patents

Farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat hijaluronske kiseline i karnozina i odgovarajuća primena

Info

Publication number
RS65191B1
RS65191B1 RS20240114A RSP20240114A RS65191B1 RS 65191 B1 RS65191 B1 RS 65191B1 RS 20240114 A RS20240114 A RS 20240114A RS P20240114 A RSP20240114 A RS P20240114A RS 65191 B1 RS65191 B1 RS 65191B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
carnosine
conjugate
hyaluronic acid
pharmaceutical composition
treatment
Prior art date
Application number
RS20240114A
Other languages
English (en)
Inventor
Antonella Schiavinato
Valentina Greco
Luciano Messina
Susanna Vaccaro
Enrico Rizzarelli
Sebastiano Sciuto
Original Assignee
Fidia Farm Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fidia Farm Spa filed Critical Fidia Farm Spa
Publication of RS65191B1 publication Critical patent/RS65191B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0029—Parenteral nutrition; Parenteral nutrition compositions as drug carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže hijaluronsku kiselinu i karnozin i njihovu odgovarajuću primenu.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Osteoartritis (OA) je patologija koja je ozbiljno onesposobljavajuća, koju karakteriše progresivna erozija zglobnih hrskavica usled degradacije matriksa i gubitka glavnih ćelijskih komponenti hrskavice: hondrocita.
[0003] Etiologija je još uvek delimično nepoznata, ali nedavni eksperimentalni rezultati su, međutim, pokazali da mehanička neravnoteža koja može da zahvati zglob u njegovoj složenosti takođe može biti početni uzrok nastanka gore pomenute patologije. Prekomerno i/ili nepravilno opterećenje zglobova može zapravo izazvati odgovor hondrocita koji se izražava u sintezi onih enzima odgovornih za degradaciju same hrskavice. Ovi proteazni enzimi se nazivaju metaloproteaza (MMP) i sintetišu ih hondrociti kada su stimulisani proinflamatornim citokinima, kao što su IL-1, IL-6 i TNF-α, koji se proizvode i oslobađaju u zglobnoj šupljini pre svega usled početka inflamatorne patologije. Ovi citokini takođe stimulišu sintezu visokih nivoa azotnog oksida (odgovornog za smrt hondrocita apoptozom) i, štaviše, inhibiraju sintezu proteoglikana (strukturnih komponenti matriksa) (Dozin B. i sarad, Matrix Biology, 2002, 21:449-459).
[0004] Visoki nivoi proinflamatornih molekula takođe su pronađeni u sinovijalnoj tečnosti pacijenata koji boluju od reumatoidnog artritisa (RA) i psorijatičnog artritisa (Arend V.P. i sarad, Arthritis Rheum, 1995, 38:151-160).
[0005] Reumatoidni artritis (RA) je hronični, ankilozni i progresivni inflamatorni poliartritis autoimune patogeneze i nepoznate etiologije, uglavnom zbog sinovijalnih zglobova u kojima izaziva deformacije i bol do gubitka funkcionisanja zgloba.
[0006] Progresija RA, zapravo, određuje jak inflamatorni odgovor sinovije sa posledičnim oticanjem njenih ćelija, viškom sinovijalne tečnosti i razvojem fibroznog tkiva. Tačnije, sinovija je membrana mezenhimalnog porekla koju formiraju sinoviociti (makrofagnog i fibrinoidnog tipa) koja, u bolesti, podleže hiperplaziji i hipertrofiji, a zatim naraste u debljinu (dva/tri sloja nepatološkog stanja postaju sedam ili više), formirajući sinovijalni panus koja počinje periferno da erodira kost koja nije pokrivena hrskavicom.
[0007] U isto vreme, polimorfonuklearne ćelije sa T, B limfocitima i plazma ćelijama se kreću u sinovijalnu tečnost, povećavajući upalu zahvaćenog zgloba, zglobna hrskavica zahvaćena RA (sa odgovarajućom donjom kosti) se zatim istanjuje sa progresivnim razaranjem.
[0008] Ova patologija se generalno manifestuje na sistemskom nivou, uključujući i druge organe i aparate. Tipični su reumatoidni čvorovi koji se mogu formirati na plućnom nivou sa posledičnom plućnom fibrozom, pleuritisom i pleuroperikarditisom, na srčanom nivou može doći do ubrzanja koronarne ateroskleroze, dok na očnom nivou može doći do kseroftalmije, uveitisa i skleritisa. Amiloidoza i osteoporoza su takođe komplikacije RA (Cecil, TEXTBOOK of MEDICINE, 1988).
[0009] Reumatoidni artritis pogađa od 0,5 do 1% odraslih u svetu, a obično počinje između 40 i 50 godina starosti.
[0010] Lečenje RA je teško, zavisi od njegove težine i vrste zahvaćenih organa i uključuje primenu lekova pogodnih za kontrolu upale radi prevencije i/ili lečenja oštećenja zglobova (pored drugih organa) sa ciljem usporavanja rezultirajuće invalidnosti. Lekovi za ublažavanje bolova i protiv inflamacije, uključujući steroide i NSAIL, potiskuju simptome, ali ne zaustavljaju napredovanje stanja, dok antireumatski lekovi koji modifikuju bolest (DMARD) mogu je, međutim, usporiti.
[0011] U agresivnijim oblicima uglavnom se koristi metotreksat, antimetabolit inhibitor sinteze folne kiseline koji, u malim dozama, deluje imunosupresivno, ali su nedavno uvedeni i biološki lekovi koji deluju na selektivniji i specifičniji način (Canete JD i sarad, Expert Opinion Biol Ther, 2017, 17:1-15), kao što je Etanercept, fuzioni protein koji deluje antagoniziranjem proinflamatornog TNF citokina.
[0012] TNF je deo one grupe citokina koji su odgovorni za akutnu fazu sistemske inflamacije; uključen je u brojne procese kao što su proliferacija ćelija, diferencijacija i apoptoza, karcinogeneza i replikacija virusa. Uglavnom ga proizvode makrofagi; njegova sinteza može biti stimulisana bakterijskim endotoksinima i inhibirana steroidima.
[0013] Delujući na brojne organe i sisteme, zajedno sa drugim citokinima, promoviše inflamatorni odgovor koji zauzvrat izaziva mnoge patologije (uključujući autoimune bolesti) kao što su RA i OA, Kronova bolest, psorijaza i astma; ovaj citokin je takođe sposoban da aktivira osteoklaste i stoga indukuje resorpciju kosti, sposoban je da stimuliše makrofagnu proizvodnju molekula sa oksidacionim delovanjem, uključen je u određene patologije kardiovaskularnog sistema koje učestvuju u formiranju venskih tromba, u patogenezu ateroskleroze i vaskulitisa (Alam J., Biomed Pharmacother, 2017, 92:615-633), i konačno u stanju je da poveća otpornost tkiva na insulin favorizujući nastanak dijabetesa tipa II (Nicolau J i sarad, Joint Bone Spine, 2017, 84 (4):411-416).
[0014] Za OA i RA postoje različite vrste lekova koji su efektivni u usporavanju napredovanja gore navedenih patologija ili u lečenju srodnih simptoma, međutim oni mogu imati važne nuspojave, često toksične, kao sintetički molekuli (stoga nisu prirodni), i zbog režima farmakološkog lečenja koji se mora održavati tokom veoma dugog vremenskog perioda, kao i zbog načina primene, uglavnom parenteralnog, ali pre svega oralnog i stoga se uključuje ceo organizam, čak i ako, u mnogim slučajevima, treba lečiti samo zapaljen zglob. Na primer EP 1724287 A1 stavlja na uvid javnosti konjugate metotreksat-HA za lečenje osteoartritisa. Konjugati posebno utiču na sinovitis, oticanje zglobova i razaranje hrskavice. U članku od FRANTISEK i sarad: „Camosine inhibits degradation of hyaluronan induced by free radical processes in vitro and improves the redox imbalance in adjuvant arthritis in vivo“, (NEUROENDOCRINOLOGY LET, MAGHIRA & MAAS PUBLICATIONS, tom 31, br. dodat.2, br.28. decembar 2010, strane 96-100,) stavljeno je na uvid javnosti da karnozin uključuje antioksidativna i antiinflamatorna svojstva kod artritičnih životinja. Dalje, članak od CAMPO i sarad. „Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression“, (BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. MOLECULAR BASIS OF DISEASE, tom 1812, br.9, 13. jun 2011, strane 1170-1181) ispituje efekte produžene intraperitonealne administracije HA visoke molekulske mase, u različitim molekularnim koncentracijama, na modulaciju TLR-2 i ILR-4 kod artritičnih miševa. Prijava patenta ITMI20081829 A1 stavlja na uvid javnosti primenu farmaceutske kompozicije koja sadrži hijaluronsku kiselinu i karnozin za lečenje zglobnih patologija, kao što je osteoartritis.
[0015] Cilj predmetnog pronalaska je stoga da se identifikuju farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat hijaluronska kiselina (HA)/karnozin posebno efikasan za primenu u lečenju i prevenciji OA i u lečenju RA, poželjno oralnom administracijom (pre svega kada bolest ima stečene jasne sistemske manifestacije) i/ili intraartikularnom administracijom u zglob u ranom stadijumu bolesti, ili u lokalizovanoj fazi intenziviranja u istom zglobu. Karnozin je dipeptid dobijen reakcijom kondenzacije između β-alanina i L-histidina, u telu. Nalazi se u velikim količinama u mišićima i u mozgu; naučna literatura je jednoglasna u tome da mu dodeljuje antioksidativno, anti-radikalsko i antiinflamatorno dejstvo (Budzen S. i sarad, Adv Clin Exp Med, 2013, 22 (5): 739-44).
[0016] Pretkliničke studije su demonstrirale njegov anti-radikalski kapacitet u prevenciji i lečenju katarakte (Babizhayev M. i sarad, Biochim, Biophys, Acta, 1989, 1004(3):363-371), dok je njegova antiinflamatorna aktivnost demonstrirana u nekim tkivima digestivnog sistema, u očima i na koži (US4508728, WO01/52808); takođe je demonstrirana njegova specifična aktivnost kao čistača protiv radikala hidroksila (La Mendola D. i sarad., Helv. Chim. Acta, 2002, 85 (6):1633-1643).
[0017] Peptidna priroda karnozina, međutim, nameće određena ograničenja njegovoj primeni, ograničenja koja su u vezi sa njegovom termolabilnom prirodom i visokom in vivo razgradljivošću zbog specifičnih peptidaza. Da bi se ovo ograničenje prevazišlo, predložena je primena N-acetilkarnozina (WO95/10294), koji se degradira mnogo sporije od slobodne verzije (Babizhayev MA i sarad, Clin. Chim. Acta, 1996, 254 (1):1-21) i, u isto vreme, hemijski derivat karnozina se takođe sintetiše sa ciklodekstrinima (EP1176154), prirodni ciklični oligosaharidi koji se koriste u medicini kao nosači lekova. U ovom slučaju, ciklodekstrin stabilizuje dipeptid, štiteći ga od hidrolitičke aktivnosti karnozinaze (Schaschke N. I sarad, JACS, 1998, 120 (28):7030-7038), omogućavajući tako gore pomenutom molekulu da ispolji svoju biološku aktivnost. Na osnovu istog obrazloženja, konjugat karnozina sa trehalozom je kasnije patentiran kao sistem sa antioksidativnim, antiglikacionim i antiagregacionim delovanjem (EP1860116).
[0018] Poznat je i derivat HA, koji se dobija konjugacijom karnozina sa navedenim polisaharidom pomoću amidne veze koja zahvata karboksilnu grupu HA i amino grupu dipeptida (WO2016016847).
[0019] Primena u lečenju RA i OA, međutim, nije razmatrana za ovaj derivat; dalje, prema gore pomenutoj referenci, ovaj derivat može biti derivatizovan samo do 25% (mol/mol odnos između HA i karnozina).
[0020] Predmetni pronalazak opisuje kompoziciju koja sadrži amidni derivat HA sa karnozinom sa stepenom derivatizacije većim od 25%, dakle konjugat čiju sintezu stručnjaci u ovoj oblasti nisu smatrali mogućom na osnovu učenja iz stanja tehnike.
[0021] HA je hetero-polisaharid sačinjen od naizmeničnih ostataka D-glukuronske kiseline i N-acetil-D-glukozamina. To je polimer linearnog lanca sa molekulskom masom u rasponu od 50.000 do 13 × 10<6>Da, u zavisnosti od izvora iz kojeg se dobija i korišćenih postupaka pripreme. U prirodi je prisutan u pericelularnim gelovima, u osnovnoj materiji vezivnog tkiva kičmenjaka, u sinovijalnoj tečnosti zglobova, u staklastom telu i u pupčanoj vrpci. HA stoga igra važnu ulogu u biološkom organizmu, i kao mehanička podrška ćelijama mnogih tkiva kao što su koža, tetive, mišići i hrskavica, ali i kao aktivni agens sposoban da modulira (preko CD44 receptora) mnoge procese koji se odnose na fiziologiju i biologiju ćelije, kao što su, na primer, proliferacija, migracija, ćelijska diferencijacija i angiogeneza; poznata je i njegova uloga u održavanju hidratacije tkiva i podmazivanja zglobova. HA je u stvari polisaharid koji ima posebna viskoelastična svojstva, sintetisan i sekretovan u zglobnu šupljinu uglavnom od strane sinoviocita (Asari A. i sarad, Arch. Histol. Citol., 1995, 58 (1): 65-76) i jedna je od glavnih komponenti sinovijalne tečnosti. Tokom sporih pokreta zgloba, HA deluje kao viskozni lubrikant, dok tokom brzih pokreta elastičnim svojstvima apsorbuje bilo koji moguću traumu ili mikrotraumu koje mogu da pogode zglob.
[0022] Razmena HA u nepatološkoj sinovijalnoj tečnosti je generalno izuzetno brza, dok je kod OA utvrđeno smanjenje koncentracije uz sniženje prosečne molekulske mase (MW), ali pre svega naglo smanjenje njenog toka razmene (Balazs EA, i sarad, J Rheumatol, dodat, 1993, 12: 75-82).
[0023] Iz ovih razloga, Balazs je prvo predložio mogućnost modifikacije evolucije procesa osteoartritisa kroz doprinos egzogene HA (posebno sa visokom MW) direktno u zglobnu šupljinu, a zahvaljujući ovoj terapiji lečenja bilo je moguće demonstrirati zaštitni efekat HA protiv razgradnje uključene u hrskavicu zgloba koji je oštećen inflamatornim bolestima ili traumom.
DETALJNI OPIS
[0024] Cilj predmetnog pronalaska se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugat hijaluronska kiselina (HA)/karnozin sa direktnom amidnom vezom između karboksilne grupe HA i amino grupe karnozina za primenu u prevenciji i lečenju OA i u lečenju RA, pri čemu se HA stepen derivatizacije kreće od 30 do 60%, a prosečna molekulska masa za HA se kreće od 1×10<5>Da do 1×10<6>Da.
[0025] Farmaceutske kompozicije za primenu prema predmetnom pronalasku sadrže konjugat HA/karnozin sa stepenom derivatizacije (amidacije) karboksilne grupe iz HA (DS) koji poželjno varira u opsegu od 35 ± 3% (tj. od 32% do 38) do 45 ± 5% (tj. od 40% do 50%). Navedeni amidni derivat HA sa karnozinom (tj. konjugat HA/karnozin) se dobija kovalentnim kombinovanjem dipeptida (tj. karnozina) sa hijaluronskom kiselinom (HA) formiranjem direktne amidne veze (bez pomoći trajnih odstojnika) između karboksila iz HA i aminske grupe karnozina.
[0026] Kao što je prikazano u nastavku, podnosilac prijave je u stvari iznenađujuće otkrio kako konjugatni predmet pronalaska, ima neočekivane sinergističke efekte između karnozina i HA u kurativnom tretmanu RA i OA, postižući značajno kliničko/histološko poboljšanje gore navedenih patologija, uz značajno smanjenje indikatora u plazmi i upale i oksidacije lipida. Stepen derivatizacije konjugatnog predmeta ovog pronalaska se meri postupkom opisanim u Primeru 4 koji sledi.
[0027] HA koji se koristi za sintezu konjugata HA/karnozin iz predmetnog pronalaska može se dobiti iz bilo kog izvora, na primer, ekstrakcijom iz petlovih kresta (EP138572), fermentacijom (iz Streptocuccus Equi ili Zooepidemicus, EP716688), ili biosintezom (iz Bacillus, EP2614087), i ima prosečnu molekulsku masu (MW) u rasponu od 1×10<5>Da do 1×10<6>Da, tačnije u opsegu od 130-220 kDa i/ili unutar opsega od 500-750 kDa. Farmaceutske kompozicije pronalaska imaju HA stepen derivatizacije koji varira u opsegu od 30 do 60% i prosečnu molekulsku masu za HA koja se kreće od 1×10<5>Da do 1×10<6>Da; poželjnije su farmaceutske kompozicije u kojima se DS od HA kreće u opsegu od 30 do 60% i prosečna molekulska masa za HA je u opsegu od 130-220 k Da, ili 500-750 k Da i odgovarajuće smeše.
[0028] Još poželjnije su farmaceutske kompozicije u kojima HA DS varira u opsegu od 31 do 34% (35±3%) ili u opsegu od 40 do 50% (45±5%) i odgovarajuće smeše, i prosečna molekulska masa za HA je u opsegu od 130-220 kDa ili 500-750 kDa i odgovarajuće smeše; posebno, poželjne su farmaceutske kompozicije u kojima, kada HA DS varira u opsegu od 35±3%, prosečna molekulska masa za HA je u opsegu od 500-750 kDa, i kada HA DS varira unutar opsega od 45±5%, prosečna molekulska masa za HA je u opsegu od 130-220 kDa.
[0029] Treba istaći da se prosečna molekulska masa odnosi na prosečnu masu MW izračunatu postupkom „intrinzičnog viskoziteta“ (Terbojevich i sarad., Carbohidr Res, 1986, 363-377).
[0030] Hijaluronska kiselina koja se koristi za sintezu pomenutog konjugata se bira između natrijumove soli od HA (EP138572), poželjno za sintezu konjugata HA/karnozin do DS od oko 40% (dakle od 25% do 40%), i tetrabutilamonijum (TBA) soli od HA (EP216453), poželjno za sintezu konjugata HA/karnozin sa DS većim od 40% (dakle od 40% do 100%), pri čemu se krajnji proizvod (opisan u primerima pripreme datim u nastavku) (poželjno) priprema kao natrijumova so konjugata HA/karnozin, bez obzira na HA so koja se koristi kao reagens.
[0031] Biomaterijali koji se sastoje od konjugovanih HS derivata (opet preko amidne veze) sa karnozinom, na načine i u stepenima opisanim za HA, koji su ovde definisani kao „HA/karnozin biomaterijali“ takođe su stavljeni na uvid javnosti (nisu predmet ovog pronalaska). Derivati HA koji se mogu koristiti u formiranju gore navedenih biomaterijala navedeni su u nastavku:
HYAFF<®>: estri od HA sa alkoholima alifatske, aralifatske, cikloalifatske, aromatične, ciklične i heterociklične serije, sa procentom esterifikacije koji može da varira u zavisnosti od vrste i dužine upotrebljenog alkohola, poželjno od 1 do 70%, dok preostali procenat neesterifikovane HA može biti konvertovan u so sa organskim i/ili neorganskim bazama (EP216453);
HYADD<®>: amidi od HA sa aminima alifatske, aralifatske, cikloalifatske, aromatične, ciklične i heterociklične serije, sa procentom amidacije u rasponu od 0,1 do 50%, dok preostali procenat HA koji nije podvrgnut amidaciji može biti konvertovan u so sa organskim i/ili neorganskim bazama (EP1095064);
ACP<®>: unutrašnji estri od HA sa procentom esterifikacije ne većim od 20%, poželjno u rasponu od 0,05 do 10% esterifikacije, dok preostali procenat neesterifikovane HA može biti konvertovan u so sa organskim i/ili neorganskim bazama (EP341745);
HYOXX<®>: derivati perkarboksilata od HA dobijeni oksidacijom primarnog hidroksila frakcije N-acetil-glukozamina sa stepenom perkarboksilacije u rasponu od 0,1 do 100% i, poželjno, od 25 do 75%. Karboksilne grupe iz HA mogu se konvertovati u so sa organskim i/ili neorganskim bazama (EP1339753).
[0032] O-sulfatni derivati od HA do 4. stepena sulfacije (EP702699). Takođe je moguće početi od konjugata HA/karnozin da bi se sintetisali (prema onome što je poznato stručnim osobama u ovoj oblasti) gore pomenuti HA/karnozin biomaterijali koji dalje daju HA derivat: stoga je moguće koristiti pomenuti konjugat kao polazni materijal (umesto natrijumove soli od HA ili TBA soli) da se nastavi sa sintezom HYAFF, ACP, HYADD, HYOXX ili sulfatnih derivata prema onome što je poznato stručnim licima u ovoj oblasti, da bi se dobili proizvodi prethodno definisani kao HA/karnozin biomaterijali.
[0033] Estri i amidi su, među derivatima HA, oni koji su posebno važni u procesu formiranja biomaterijala stavljenih na uvid javnosti, a nisu predmet pronalaska; pri čemu posebno interesantni pod ovim profilom su benzil estri (HYAFF) sa procentom esterifikacije poželjno u rasponu od 5 do 50% i heksadecil amid od HA (HYADD4) sa stepenom derivatizacije do 5% (mereno u HPLC), dokazano je da je ovaj amid posebno relevantan zbog svoje uloge viskoelastičnog gela koji se klinički može koristiti kao sinovijalna zamena u slučaju povrede zgloba (EP1853279).
[0034] Brojni naučni eksperimenti su u velikoj meri demonstrirali kako je HYAFF potpuno biokompatibilan biorazgradivi polimer (Campoccia D. i sarad, Biomaterials, 1998, 19:2101-2127) i kako primena estarskih derivata od HA za formiranje vlakana (EP618817) obrađenih u netkanom obliku ili kao sunđer, može da formira trodimenzionalnu matricu koja se može koristiti u dermatološkim i ortopedskim oblastima.
[0035] ACP derivati se uspešno koriste kao punioci kože i kao gelovi protiv adhezije (EP0850074), dok za sulfatni derivat od HA, njegovi antiinflamatorni efekti su proučavani kao topikalna komponenta kompozicija za dermatološku upotrebu (EP2429515), ili njegov zaštitni/regenerativni efekat matriksa hrskavice u slučaju oralnih ili intraartikularnih preparata (EP2021078, EP2786782). Shodno tome, biomaterijali koji su stavljeni na uvid javnosti formirani amidnom vezom karboksila gore pomenutih HA derivata sa karnozinom, koji nisu predmet ovog pronalaska, nalaze efektivnu primenu u lečenju RA (pored svih bolesti izazvanih direktno sa RA ili koje su indirektno u vezi sa/zavise od RA) i OA (a takođe i u prevenciji OA), kao biomaterijali prerađeni u obliku vlakana, gela, hidrogelova, mikrosfera, sunđera, tkanih ili netkanih tkanina, filmova.
[0036] Bolesti koje direktno izaziva RA su sistemske kliničke manifestacije iste patologije koje zahvataju organe i aparate koji nisu zglobovi. Konkretno, postoji RA kod kojeg su na plućnom nivou nastali reumatoidni čvorovi sa posledičnom plućnom fibrozom, pleuritisom i pleuroperikarditisom, dok su na očnom nivou prisutni kseroftalmija, uveitis i skleritis.
[0037] Patologije koje su indirektno uvezi sa/zavisne od RA su ovde definisane kao patologije koje su indirektno izazvane RA-om, jer su u vezi sa ozbiljnim situacijama izmenjenog imunološkog profila i/ili sa stanjima visokog oksidativnog stresa.
[0038] Izmenjena proizvodnja slobodnih radikala zapravo može izazvati ozbiljna oštećenja strukture vezivnog tkiva, strukture proteina, ćelijskih membrana i DNK gena. Oksidativni stres se stoga može smatrati patološkim stanjem uzrokovanim narušavanjem delikatne ravnoteže između proizvodnje i odstranjivanja slobodnih radikala.
[0039] Trenutno se smatra da oksidativni stres aktivno doprinosi nastanku RA i, posledično, drugih važnih bolesti koje se često javljaju kontekstualno i/ili zavise od RA, kao što su prerano patološko starenje, srčani udar, moždani udar, arterioskleroza i koronarna ateroskleroza, arterijska hipertenzija, demencija, dijabetes, osteoporoza i amiloidoza, mnogi oblici kancera, određena oboljenja jetre ili bubrega kao što su proteinurija i nefritis, lezije želuca, katarakta.
[0040] Bolesti koje su u vezi sa izmenjenim imunim profilom, s druge strane, uključuju psorijatični artritis, gastritis, vaskulitis, dijabetes tipa I i autoimune bolesti uključujući, na primer, autoimuni tiroiditis.
[0041] Farmaceutske kompozicije koje sadrže HA/karnozin konjugate prema pronalasku su opisane za lokalnu, oralnu, intraartikularnu, parenteralnu ili hiruršku primenu, u svim oblastima u kojima je navedena administracija potrebna u vezi sa prevencijom i lečenjem osteoartritisa ili lečenjem RA, i može biti u vezi sa farmakološki i/ili biološki aktivnim supstancama kao što su, na primer, steroidi, antiinflamatorni citokini, interferon, faktori rasta (kao što su, na primer, BMP2 i BMP7), NSAIL, i/ili sa kontrolisanim sistemima isporuke lekova kao što su, na primer, ciklodekstrini, i/ili prirodni polimeri, kao što su HA i njeni derivati, poželjno sa amidnim derivatom od HA sa heksadecilaminom zvanim HYADD4 (EP1095064), ili sintetičke prirode.
[0042] Sinteza HA/karnozin konjugata predmeta pronalaska je opisana u nastavku, čiji se proces konjugacije između metil estra karnozina i natrijumove soli hijaluronske kiseline ili tetrabutilamonijum soli odvija u medijumu koji sadrži DMSO ili DMSO/H2O kao glavni rastvarač.
[0043] U prijavi patenta WO2016016847 o kojoj se gore diskutovalo, isključivo je opisan proces konjugacije između natrijumove soli od HA i metil-estra karnozina u THF-u.
[0044] U postupku prema predmetnom pronalasku, sinteza se stoga odvija u dipolarnom rastvaraču, aprotičnom i jako higroskopnom, na sobnoj temperaturi. Sinteza u THF-u u skladu sa stanjem tehnike je izvršena u aprotičnom, isparljivom rastvaraču, koji ima niži polaritet, i stoga je izvedena na 4°C.
[0045] Hemijske karakteristike različitih rastvarača, koje su u vezi sa različitim reakcionim temperaturama koje takođe dozvoljavaju upotrebu soli od HA, različite od natrijumove soli, omogućile su dobijanje stepena derivatizacije HA sa karnozinom koji su opisani i za koje se traži zaštita u nastavku.
Postupci pripreme HA/karnozin konjugata predmeta pronalaska
Primer 1
Sinteza metil-estra karnozina (kao hidrohloridne soli)
[0046] Reakcija je izvedena u anhidrovanoj sredini.1,5 g karnozina je tretirano, uz mešanje, u boci od 250 ml, sa 50 ml rastvora acetil hlorida u anhidrovanom metanolu (prethodno pomešan) u odnosu 1:20 (v/v) tokom 12 sati, nakon čega je oko 90% rastvarača je uklonjeno uparavanjem pod vakuumom. 20 ml anhidrovanog metanola je dodato reakcionom ostatku i ponovo je oko 90% rastvarača uklonjeno uparavanjem. Operacija je ponavljana sve dok se sav HCl (koji je nastao tokom reakcije) nije uklonio; proizvod je zatim doveden do suva pod vakuumom.
[0047] Proizvod je podvrgnut kontroli elektroforezom na papiru i različite komponente uzorka su detektovane korišćenjem ninhidrina.
Primer 2
Sinteza HA/karnozin konjugata sa DS-om uključenim u rasponu od 35±3% mol/mol)
[0048] 1.1 g natrijumove soli hijaluronske kiseline (HANa) sa MW od 700 kDa je uveden u reaktor u koji je 80 ml smeše H2O:DMSO (u odnosu 1:1 v/v) naknadno dodato uz stalno mešanje (na sobnoj temperaturi) tokom najmanje 4 sata. 40 ml rastvora H2O:DMSO (1:1 v/v) koji sadrži 480 µl Tris [2-(2-metoksietoksi) etil] amina (TMEA), 400 mg 3-hidroksi-1,2,3-benzotriazin-4(3H) -ona (HOOBt) u obliku praha i 20 ml H2O koja sadrži 240 mg N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidro-hlorida (EDC HCl), je zatim dodato u nizu.
[0049] Posle 30 minuta, dodato je 20 ml rastvora koji sadrži 365 mg karnozin metil estra u DMSO. Ova smeša je zatim podvrgnuta snažnom mešanju tokom 4 dana na 25°C.
[0050] Proizvod gornje reakcije je zatim istaložen dodatkom etanola (1L) i uklanjanje zaštite (bazna hidroliza) sa metil estra karnozina je zatim izvedeno sa 0,1N NaOH, uz stalno mešanje tokom 2 sata na 25°C.
[0051] pH je zatim neutralizovan dodavanjem 1N HCl i proizvod je istaložen pomoću 800 ml etanola. Ovaj talog je zatim rastvoren u vodi, dijalizovan u vodi tokom 2 dana i zatim liofilizovan.
Primer 3
Sinteza HA/karnozin konjugata sa DS-om uključenim u rasponu od 50±5% mol/mol)
[0052] 1.5 g tetrabutilamonijum soli hijaluronske kiseline (HATBA) sa MW od 200 kDa je uvedeno u reaktor u koji je naknadno dodato 50 ml DMSO, uz stalno mešanje (na sobnoj temperaturi) najmanje 4 sata. 2,4 ml Tris [2-(2-metoksietoksi) etil]amina (TMEA), 400 mg 3-hidroksi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona (HOOBt) u obliku praha i 20 ml DMSO koji sadrži 240 mg N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorida (EDC HCl) je zatim dodato u nizu.
[0053] Posle 30 minuta, dodato je 10 ml rastvora koji sadrži 365 mg metil estra karnozina u DMSO. Ova smeša je zatim podvrgnuta snažnom mešanju tokom 1 dana na 25°C.
[0054] Drugo dodavanje je konačno izvršeno sa 10 ml DMSO koji sadrži 240 mg N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorida (EDC, HCl) i 10 ml rastvora koji sadrži 365 mg metil-estara karnozina u DMSO.
[0055] Ova smeša je ostavljena uz snažno mešanje tokom 3 dana na 25°C.
[0056] Gore navedeni reakcioni proizvod je zatim istaložen dodatkom 5 ml zasićenog rastvora NaBr i 800 ml etanola, a zatim je izvršena deprotekcija (bazna hidroliza) metil estra karnozina sa NaOH 0,1N, uz stalno mešanje tokom 2 sata na 25°C.
[0057] pH je zatim neutralisan dodavanjem 1N HCl i proizvod je istaložen pomoću 800 ml etanola. Ovaj talog je zatim rastvoren u vodi, ponovo dijalizovan u vodi tokom 2 dana i zatim liofilizovan.
Primer 4
HPLC analiza uzorka pripremljenog prema Primerima 2 i 3 (kvantitativna analiza palanina prisutnog u karnozinu vezanom za karboksil iz HA)
Priprema uzorka:
[0058]
● HA/karnozin konjugat je rastvoren u HCl 6M pri koncentraciji od 25 mg/ml na 70°C tokom 5 minuta, zatim razblažen 1110 u HCl 6M;
● 0.1 ml rastvora uzorka je prebačeno u test epruvetu u koju je dodato 1.9 ml HCl 6M; ● uzorak je hidrolizovan tokom 2 sata na 165°C, ostavljen da se ohladi, i 8 ml H2O MilliQ je zatim dodato, celokupan uzorak je mešan do potpune resuspenzije i filtriran:
● 8 ml ovog filtriranog uzorka je zatim prebačeno u bocu od 20 ml, u koju je dodato 10 ml NaOH 1M;
● 0.2 ml tako pripremljenog uzorka je prebačeno u vijalu i zatim 0.2 ml boratnog pufera 0.2M, pH 9.3, i 0.2 ml FMOC-Cl (pripremljen u koncentraciji od 1 mg/ml u ACN-u ( acetonitrilu)) su dodati; vreme reakcije: najmanje 30 minuta;
● uzorak je konačno ubrizgan u HPLC primenom sledeće HPLC metode sa UV detektorom:
- Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 kolona (15cm, 5µ, 100Å)
- protok: 1 ml/min
- Zapremina ubrizgavanja: 50 µl
- Talasna dužina: 262 nm
- Mobilna faza A: Na2HPO440 mM pH 7.8
- Mobilna faza B: ACN/MeOH/H2O 45/45/10
- Odnos faza A/ faza B = 60/40 (sa gradijentom).
[0059] Rezultati: uzorak iz Primera 2 je prikazao stepen derivatizacije u karboksil od HA od 35% mol/mol, dok je uzorak iz Primera 3 prikazao stepen derivatizacije od 50% mol/mol.
Eksperimenti na životinjama za HA/karnozin konjugate
Primer 5
Eksperimentalni model za RA: kolagenom indukovan artritis (CIA) kod miševa
Oralno lečenje HA/karnozin konjugatom
[0060] Već tokom više godina CIA je smatran validnim eksperimentalnim modelom za RA kod miševa ili pacova, kako određuje humoralne, ćelijske, histološke i patološke karakteristike RA kod životinje (Holmdahl i sard., Immunological reviews, 1990, 118: 193-232). Nakon indukcije CIA kod miševa, zapravo, veliki broj aktiviranih neutrofila/ makrofaga/limfocita je prisutan u njihovim zglobovima, sa posledičnom proizvodnjom sinovijalnog panusa RA.
[0061] CIA indukcija: Pileći kolagen tipa II (CII) rastvoren je u sirćetnoj kiselini 0,01M u koncentraciji od 2mg/ml, zatim je pripremljen kompletan Freund-ov adjuvans (CFA) dodavanjem Mycobacterium tuberculosis H37Ra (2mg/ml) do nekompletnog adjuvansa (sastavljenog od emulzije voda/mineralno ulje), dve komponente (CII i CFA) su zatim pomešane i emulgovane u istom odnosu v/v. 100 µl tako dobijene emulzije (koja sadrži 100 µg CII) je ubrizgano u bazu mišjeg repa intradermalnom injekcijom (1. dan). Drugo identično injektiranje je izvršeno nakon 21 dana.
Eksperimentalne grupe:
[0062] Korišćeni su mužjaci miševa DBA/IJ stari devet nedelja, svaki od oko 30 g, 20 miševa po grupi.
[0063] Grupa 1: CIA-kontrola: životinje su tretirane CIA indukcijom, a zatim destilovanom vodom koja je administrirana oralno svaka 24 sata počevši od 25. dana nakon CIA do 35. dana, kraja eksperimenta.
[0064] Grupa 2: CIA HA/karnozin konjugat: životinje su tretirane CIA indukcijom i naknadno gore navedenim konjugatom svaka 24 sata počevši od 25. dana nakon CIA do 35. dana. Konjugat korišćen za test je pripremljen prema Primeru 3, pa je stoga derivatizovan pri 50% mol/mol, doza, administrirana oralno, bila je 81 mg/kg konjugata (20 mg karnozina i 61 mg HA).
[0065] Grupa 3: CIA HA/karnozin smeša: životinje su tretirane CIA indukcijom, a zatim HA/karnozinom svaka 24 sata počevši od 25. dana nakon CIA do 35. dana. Ovaj preparat je bo sačinjen od mešavine natrijumove soli od HA pomešane sa karnozinom u vodi, administriran oralno u dozi od 20 mg/kg karnozina sa 61 mg/kg HA.
Klinička evaluacija
[0066] Razvoj bolesti je evaluiran dnevno 20 dana nakon prvog injektiranja u skladu sa sledećom shemom procenjivanja after za svaku pojedinačnu šapu:
0 = nema indikacija razvoja artritisa
1 = oticanje i/ili crvenilo šape
2 = oticanje i/ili crvenilo šape u najmanje 2 zgloba
3 = oticanje i/ili crvenilo šape u najmanje 3 zgloba
4= razvoj teškog oblika artritisa cele šape sa zahvatanjem svih prstiju.
[0067] Za svaku životinju, ukupan indeks razvoja CIA (definisan kao rezultat artritične šape) je izračunat sumiranjem dobijenih vrednosti (i procenjenih kao gore) za svaku šapu.
[0068] Indeks kliničke težine dat je zapreminom šapa (mereno svaka dva dana pletizmometrom) koji se progresivno povećavao tokom celog perioda analize na osnovu težine bolesti: povećanje stopala.
Histološka evaluacija
[0069] Na kraju perioda evaluacije, tj. 35. dana nakon početka eksperimenta, životinje su žrtvovane, tretirane šape su uklonjene (uključujući zglobove kolena) i fiksirane u 10% formalinu; zatim dekalcifikovane i natopljene parafinom za pripremu mikrotomom preseka od 5 µm, zatim obojenih hematoksilinom/kozinom. Analiza optičkim mikroskopom je izvršena prateći sledeće Histološko bodovanje:
0 = nema oštećenja
1 = edem
2 = prisustvo inflamatornog ćelijskog infiltrata
3 = dokaz resorpcije kosti
Analiza plazme:
Kvantifikacija TNF-α u plazmi
[0070] Nivoi TNF-α su mereni u plazmi životinja na kraju eksperimenta primenom ELISA kompleta Calbiochem-Novabiochem Corporation, IT, za određivanje nivoa TNF-α (granica očitavanja 10 pg/ml).
Kvantifikacija indeksa peroksidacije lipida u plazmi
[0071] Napad slobodnih radikala na lipide prisutne u biološkim membranama određuje početak procesa propadanja zavisnog od kiseonika (lipidna peroksidacija) koji dovodi do narušavanja integriteta bioloških membrana i stvaranja oksidovanih lipidnih proteina i lipidnih peroksida, sa nusproizvodima kao što su aldehidi uključujući malondialdehid (MDA). Svi ovi procesi dovode do oksidativnog stresa. Da bi se izmerila šteta izazvana slobodnim radikalima kod miša usled pojave CIA, uzorci plazme (koji sadrže gore navedene aldehide) tretiranih grupa uzetih na kraju eksperimenta reagovali su sa barbiturnom kiselinom (TBAR), u poređenju sa sa standardom koji daje MDA (tj. 99% rastvori tetrametoksipropana, Sigma, Milano). Rezultat je bio adukt koji se lako može detektovati spektrofotometrom OD650 nm (Ohkava H i sarad., Anal. Biochem., 1979, 95: 351-358).
Rezultati:
Klinička evaluacija
[0072] Kao što je prikazano na slici 1 (bodovanje artritične šape), maksimalni indeks patološke manifestacije je prikazan sa jasnim znacima periartikularnog eritema i edema šapa 30 do 35 dana nakon tretmana sa CIA (kontrolna grupa); oralna administracija konjugata HA/karnozin izazvala je značajno smanjenje upale zglobova, posebno nakon 30 dana, takođe u odnosu na CIA grupa smeša HA/karnozin. Ova značajna razlika u efikasnosti, indeks sinergije između HA i karnozina kada je kovalentno vezan za eksperimentisani DS, održava se još duže do kraja eksperimenta.
[0073] Slika 2 prikazuje trend porasta stopala: i u ovom slučaju lečenje konjugatom predmetnog pronalaska potvrđuje iznenađujući efekat sa slike 1, u kome je, na kraju eksperimenta, oticanje šape lečene konjugatom bilo značajno niže u odnosu na nelečenu kontrolnu grupu i takođe u odnosu na grupu koja je lečena smešom HA/karnozin.
Histološka evaluacija
[0074] Slika 3: 35. dana (kraj) eksperimenta, histološka evaluacija CIA kontrolnih životinja otkrila je jasne i važne histološke znake razvoja teškog oblika RA, sa erozijom kosti i umerenom/teškom nekrozom zglobnog tkiva. Lečenje konjugatom HA/karnozin, s druge strane, značajno je smanjio ovu eroziju i u odnosu na kontrolnu i u odnosu na grupu lečenu smešom HA/karnozin.
Analiza plazme: Kvantifikacija TNF-α u plazmi
[0075] Na kraju eksperimenta, nivo proinflamatornog citokina TNF-α u plazmi je analiziran kod svih životinja podvrgnutih CIA, a ne (lažnom uzorku, tj. kod kojeg CIA nije indukovana da bi se imala vrednost TNF u plazmi neoperisanih zdravih životinja kao poređenje).
[0076] Kao što je prikazano na slici 4, vrednost gore pomenutog inflamatornog citokina u CIA-kontrolnoj grupi bila je izuzetno visoka, skoro 5 puta veća od lažne kontrole, dok je lečenje konjugatom predmetnog pronalaska više nego prepolovilo TNF-α vrednost, pri čemu je takođe značajno smanjilo u odnosu na grupu kojoj je administrirana smeša HA/karnozin.
Primer 6
Eksperimentalni model OA: indukcija mononatrijum jodoacetatnog (MIA) osteoartritisa kod pacova.
[0077] OA je izazvan u zadnjim zglobovima kolena pacova koji su testirani, intraartikularnom injekcijom MIA: 25 µl fiziološkog rastvora koji sadrži 1 mg/kg MIA je ubrizgano u zglob (koleno) desne šape svake životinje (pod tretmanom) kroz infrapatalni ligament, dok je u levi zglob administrirana jednaka zapremina fiziološkog rastvora 0,9% (Sagar DR i sarad, Ann. Rheum. Dis., 2013, 73: 1558-1565).
Intra-artikularno lečenje konjugatom HA/karnozin
Eksperimentalne grupe:
[0078] Korišćeni su mužjaci Sprague-Dawley pacova, od oko 230 g svaki, 20 pacova po grupi.
[0079] Grupa 1: MIA-kontrola: životinje su tretirane MIA indukcijom i naknadno sa 25 µl destilovane vode administrirane intraartikularno u desno koleno 7, 10, 13, 16. i 19. dana nakon MIA, 21. dana, eksperiment je završen eutanazijom životinja.
[0080] Grupa 2: MIA HA/karnozin konjugat: životinje su tretirane MIA indukcijom, a zatim sa 25 µl konjugata pripremljenog prema Primeru 2, zatim derivatizovanog na 35% mol/mol, intraartikularno u desno koleno 7, 10, 13, 16. i 19. dana posle MIA do 21. dana. 25 µl konjugata HA/karnozin sadržalo je 250 µg konjugata, tj.45,75 µg karnozina i 204,25 µg HA.
[0081] Grupa 3: MIA smeša HA/karnozina: životinje su tretirane indukcijom MIA, a zatim sa 25 µl HA i karnozinom intraartikularno u desno koleno 7, 10, 13, 16. i 19. dana nakon MIA do 21. dana. Ovaj preparat je bio sačinjen od mešavine natrijumove soli od HA pomešane sa karnozinom u vodi, pa je 25 µl ovog preparata sadržalo 45,75 µg karnozina i 204,25 µg HA.
Kvantifikacija TNF-α u plazmi
[0082] Na kraju eksperimenta, nivoi TNF-α su mereni u plazmi životinja korišćenjem ELISA kompleta Calbiochem-Novabiochem Corporation, 1'1', za određivanje nivoa TNF-α (granica očitavanja 10 pg/ml).
Rezultati
[0083] Na slici 6 prikazani su rezultati dobijeni u grupama za lečenje i u lažnoj grupi, definisanoj kao grupa u kojoj životinje nisu bile podvrgnute tretmanu MIA: i u ovom slučaju, je dokazan izuzetno visok nivo TNF citokina MIA-kontrolne grupe, dok je lečenje HA/karnozin konjugatom značajno snizilo vrednost TNF-α ne samo u odnosu na ovu kontrolu, već i u odnosu na grupu kojoj je administrirana smeša HA/karnozin koja nije prikazala nikakvu efikasnost, demonstrirajući još jednom upečatljiv efekat konjugata predmeta pronalaska, a samim tim i njegov nivo derivatizacije koji je posebno visok u odnosu na stanje tehnike.
Oralno lečenje HA/karnozin konjugatom
Eksperimentalne grupe:
[0084] Korišćeni su mužjaci Sprague-Dawley pacova, od oko 230 g svaki, 20 pacova po grupi.
[0085] Grupa 1: MIA-kontrola: životinje su tretirane indukcijom MIA, a zatim destilovanom vodom oralno administriranom svaka 24 sata od 3. dana nakon MIA do 20. dana, kraja eksperimenta.
[0086] Grupa 2: MIA HA/karnozin konjugat: životinje su tretirane MIA indukcijom i naknadno gore navedenim konjugatom svaka 24 sata od 3. dana nakon MIA do 20. dana. Konjugat korišćen za eksperimentisanje je pripremljen prema Primeru 2, zatim je derivatizovan na 35% mol/mol, doza, oralno administrirana, bila je 88,5 mg / kg konjugata (16,2 mg karnozina i 72,3 mg HA).
[0087] Grupa 3: MIA smeša HA/karnozin: životinje su tretirane indukcijom MIA, a zatim HA/karnozinom svaka 24 sata počevši od 3. dana nakon MIA do 20. dana. Ovaj preparat je bio sačinjen od smeše natrijumove soli od HA pomešane sa karnozinom u vodi, primenjene oralno u dozi od 16,2 mg/kg karnozina sa 72,3 mg/kg HA.
[0088] Grupa 4: MIA naproksen: životinje su tretirane indukcijom MIA, a zatim naproksenom administriranim oralno u dozi od 10 mg/kg svaka 24 sata počevši od 3. dana nakon MIA do 20. dana.
Histološka evaluacija
[0089] Na kraju eksperimentalnog perioda, tj. 21. dana od početka indukcije MIA, životinje su žrtvovane, tretirane noge su uklonjene (uključujući zglobove kolena) i fiksirane u 10% formalinu. Nakon toga su dekalcifikovane i natopljene parafinom za pripremu mikrotomom preseka od 5 µm, zatim obojenih hematoksilinom/eozinom. Analiza optičkim mikroskopom je izvršena prema modifikovanom Histološkom bodovanju po Mankinu, sa opsegom bodova od 0-12, tj. od normalne ćelijske organizacije do potpune dezorganizacije i hipocelularnosti; (Mankin HJ i sarad., J Bone Joint Surg Am., 1971, 53 (3): 523-537).
Rezultati:
[0090] Histološko ispitivanje uzoraka grupe 1 prikazalo je neregularnosti u organizaciji tkiva sa fibrilacijom površinskog sloja, smanjenom celularnošću i degeneracijom sloja hrskavice. Oralno lečenje HA/karnozin konjugatom je veoma značajno smanjilo histološko oštećenje i degeneraciju hrskavice, potpuno uporedivo sa efektom koji izaziva naproksen (poznati NSAID sa dokumentovanom efikasnošću), dok lečenje HA/karnozin smešom nije dovelo ni do kakvog histološkog poboljšanja u odnosu na netretirane uzorke grupe 1 (MIA-kontrola) (slika 7).

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat hijaluronska kiselina (HA)/karnozin sa direktnom amidnom vezom između karboksilne grupe hijaluronske kiseline i aminske grupe karnozina za primenu u prevenciji i lečenju osteoartritisa i lečenju reumatoidnog artritisa (RA), pri čemu se stepen derivatizacije karboksilnih grupa iz HA karnozinom kreće od 30 do 60%, a prosečna molekulska masa za HA kreće se od 1×10<5>Da do 1×10<6>Da.
2. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se konjugat hijaluronska kiselina (HA)/karnozin dobija kovalentnom konjugacijom dipeptida karnozina sa hijaluronskom kiselinom formiranjem direktne amidne veze između karboksilne grupe iz HA i aminske grupe karnozina, sa stepenom derivatizacije, tj. amidacijom, karboksilnih grupa iz HA karnozinom koji varira u opsegu od 35±3% ili 45±5% i smeše istog.
3. Farmaceutska kompozicija za primenu prema jednom ili više prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se prosečna molekulska masa za HA kreće u opsegu od 130-220 k Da ili 500-750 k Da i smeše istog.
4. Farmaceutska kompozicija za primenu prema jednom ili više prethodnih patentnih zahteva, pri čemu hijaluronska kiselina koja se koristi za pripremu amidnog derivata od HA sa karnozinom je natrijumova so od HA ili tetrabutilamonijumova so od HA.
5. Farmaceutska kompozicija za primenu prema jednom ili više prethodnih patentnih zahteva za lokalnu, oralnu, intraartikularnu, parenteralnu ili hiruršku primenu.
6. Farmaceutska kompozicija za primenu prema prethodnim patentnim zahtevima, koja je u vezi sa farmakološki i/ili biološki aktivnim supstancama i/ili sa sistemima za kontrolisano oslobađanje lekova i/ili prirodnih polimera ili polimera sintetičke prirode.
RS20240114A 2017-10-03 2018-10-03 Farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat hijaluronske kiseline i karnozina i odgovarajuća primena RS65191B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102017000110784A IT201700110784A1 (it) 2017-10-03 2017-10-03 Composizioni farmaceutiche contenenti Acido Ialuronico e Carnosina e relativo uso
EP18796748.4A EP3691691B1 (en) 2017-10-03 2018-10-03 Pharmaceutical compositions containing a conjugate of hyaluronic acid and carnosine and relative use
PCT/IB2018/057697 WO2019069258A1 (en) 2017-10-03 2018-10-03 PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING HYALURONIC ACID AND CARNOSINE AND USE THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65191B1 true RS65191B1 (sr) 2024-03-29

Family

ID=61024973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240114A RS65191B1 (sr) 2017-10-03 2018-10-03 Farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat hijaluronske kiseline i karnozina i odgovarajuća primena

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20200289604A1 (sr)
EP (1) EP3691691B1 (sr)
KR (1) KR102735702B1 (sr)
CN (1) CN111163808A (sr)
AR (1) AR114337A1 (sr)
CA (1) CA3073797A1 (sr)
DK (1) DK3691691T3 (sr)
EA (1) EA202090524A1 (sr)
ES (1) ES2971097T3 (sr)
FI (1) FI3691691T3 (sr)
HR (1) HRP20240187T1 (sr)
HU (1) HUE066061T2 (sr)
IT (1) IT201700110784A1 (sr)
LT (1) LT3691691T (sr)
PL (1) PL3691691T3 (sr)
PT (1) PT3691691T (sr)
RS (1) RS65191B1 (sr)
SI (1) SI3691691T1 (sr)
SM (1) SMT202400022T1 (sr)
WO (1) WO2019069258A1 (sr)
ZA (1) ZA202001174B (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202000014017A1 (it) 2020-06-11 2021-12-11 Fidia Farm Spa Nuovi derivati ottenuti da acido ialuronico e carnosina
CN117700583B (zh) * 2023-12-22 2024-08-09 珠海瑞玞生物工程有限公司 一种透明质酸基生物材料的制备方法
WO2026104986A1 (en) * 2024-11-12 2026-05-21 Fidia Farmaceutici S.P.A. New molecules and their use in the treatment of pathologies related to oxidative stress

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1318640B1 (it) 2000-07-25 2003-08-27 Univ Catania Derivati di carnosina, procedimento per la loro preparazione ecomposizioni farmaceutiche che li contengono.
ME00426B (me) * 2003-04-09 2011-10-10 Genentech Inc Liječenje autoimunih bolesti kod pacijenata sa neadekvatnim odgovorom na tnf-alfa inhibitor
ITPD20040053A1 (it) * 2004-02-27 2004-05-27 Fidia Advanced Biopolymers Srl Biomateriali costituiti da derivati dell'acido ialuronico come nuova terapia di cura per la protezione e la la riparazione della cartilagine articolare danneggiata per osteoartrosi
JP4927536B2 (ja) * 2004-03-05 2012-05-09 電気化学工業株式会社 ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体
ITPD20050056A1 (it) * 2005-03-02 2006-09-03 Fidia Farmaceutici Derivati ammidici del'acido ialuronico in osteoartrosi
ITMI20060690A1 (it) 2006-04-07 2007-10-08 Univ Catania Coniugato di trealpsio con carnlsina ad attivita'antiossidante stabile all'idrolisi enzimatica procedimenti per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche cosmetiche e nutraceutiche che lo contengono
IT1391251B1 (it) * 2008-10-15 2011-12-01 Innovative Nutrition & Pharma Srl Composizione per il trattamento delle patologie articolari
IT1407283B1 (it) * 2010-12-06 2014-04-04 Paoli Ambrosi De Nuovo composto di carnosina
WO2012174555A2 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Nayan Patel Composition and method for stabilization and delivery of therapeutic molecules
EP2545897A1 (en) 2011-07-14 2013-01-16 Coty Germany Gmbh Cosmetic with enhanced collagen I synthesis
EA032076B1 (ru) * 2014-07-31 2019-04-30 Себастьяно Шюто Производные, полученные из гиалуроновой кислоты и карнозина

Also Published As

Publication number Publication date
PL3691691T3 (pl) 2024-04-29
US20220031797A1 (en) 2022-02-03
WO2019069258A1 (en) 2019-04-11
DK3691691T3 (da) 2024-02-05
ZA202001174B (en) 2021-08-25
EA202090524A1 (ru) 2020-05-28
SI3691691T1 (sl) 2024-03-29
ES2971097T3 (es) 2024-06-03
PT3691691T (pt) 2024-01-31
AR114337A1 (es) 2020-08-26
EP3691691A1 (en) 2020-08-12
KR20200091380A (ko) 2020-07-30
US12251416B2 (en) 2025-03-18
HUE066061T2 (hu) 2024-07-28
CN111163808A (zh) 2020-05-15
KR102735702B1 (ko) 2024-11-28
US20200289604A1 (en) 2020-09-17
SMT202400022T1 (it) 2024-03-13
LT3691691T (lt) 2024-02-26
IT201700110784A1 (it) 2019-04-03
FI3691691T3 (fi) 2024-02-08
CA3073797A1 (en) 2019-04-11
EP3691691B1 (en) 2023-12-13
HRP20240187T1 (hr) 2024-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lin et al. Injectable natural polymer hydrogels for treatment of knee osteoarthritis
CA2765739C (en) Process for the synthesis of conjugates of glycosaminoglycanes (gag) with biologically active molecules, polymeric conjugates and relative uses thereof
US12251416B2 (en) Pharmaceutical compositions containing hyaluronic acid and carnosine and relative use
JPH0672893A (ja) 抗リウマチ剤
EP2910248A1 (en) Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders
CA2426083A1 (en) Use of hyaluronic acid derivatives for inhibiting inflammatory arthritis
Du et al. Nanocomposite hydrogel to deliver the immunomodulator lenalidomide and anti-inflammatory hesperidin locally to joints affected by rheumatoid arthritis
AU2006220034B2 (en) Amide derivatives of hyaluronic acid in osteoarthrosis
Yang et al. Bond-centric modifications of hyaluronic acid: Synthesis, processing, and biomedical applications
Kaderli et al. A novel oxido-viscosifying Hyaluronic Acid-antioxidant conjugate for osteoarthritis therapy: Biocompatibility assessments
CN103635491A (zh) 类鲨鱼硫酸软骨素及其制备方法
Bhattacharjee et al. Hyaluronic acid hydrogel in therapeutics delivery and biomedical applications
CA2761590C (en) Lipid-polymer conjugates, their preparation and uses thereof
JPH0273019A (ja) 多環性芳香族化合物を含有する医薬品合成物
CA2641571C (en) Treatment of osteoarthritis
AU2013202151B2 (en) Lipid conjugates in the treatment of chronic rhinosinusitis
CN112969706A (zh) 刺激细胞外基质合成的葡糖胺的氨基酸衍生物和包含其的药物组合物
EA042176B1 (ru) Фармацевтические композиции, содержащие гиалуроновую кислоту и карнозин, и их соответствующее применение
Gianolio et al. Hyaluronan-tethered opioid depots: synthetic strategies and release kinetics in vitro and in vivo
JP2007126453A (ja) ヒアルロナン産生促進剤及びヒアルロナン分解抑制剤
ES2281265B1 (es) Composiciones para el tratamiento de la artrosis.
WO2015068155A1 (en) Lipid-polysaccharide conjugates, their preparation and uses thereof
JP2007084509A (ja) 細胞賦活剤
Sturabotti Functionalization of hyaluronic acid with a chondroprotective molecule and preparation of sulfonated HA-based materials
CN102159218B (zh) 用于医学用途的新型几丁低聚物组合物