RS65255B1 - Lek za lečenje infektivnih bolesti - Google Patents

Lek za lečenje infektivnih bolesti

Info

Publication number
RS65255B1
RS65255B1 RS20240275A RSP20240275A RS65255B1 RS 65255 B1 RS65255 B1 RS 65255B1 RS 20240275 A RS20240275 A RS 20240275A RS P20240275 A RSP20240275 A RS P20240275A RS 65255 B1 RS65255 B1 RS 65255B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
drug
infection
group
antibodies
mice
Prior art date
Application number
RS20240275A
Other languages
English (en)
Inventor
Dmitry Yurievich Pushkar
Oleg Iliich Epshtein
Original Assignee
Oleg Iliich Epshtein
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2019127185A external-priority patent/RU2778521C2/ru
Application filed by Oleg Iliich Epshtein filed Critical Oleg Iliich Epshtein
Publication of RS65255B1 publication Critical patent/RS65255B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/429—Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/43—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/7036—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin having at least one amino group directly attached to the carbocyclic ring, e.g. streptomycin, gentamycin, amikacin, validamycin, fortimicins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0004—Homeopathy; Vitalisation; Resonance; Dynamisation, e.g. esoteric applications; Oxygenation of blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast farmaceutike, posebno na lekove i postupke za lečenje infektivnih bolesti. Konkretno, pronalazak se odnosi na proizvode za lečenje infekcija bakterijskog porekla, za povećanje terapeutske efikasnosti antibiotika, uključujući njihovo dejstvo protiv rezistentnih bakterija i stimulaciju smanjenih efikasnih doza antibiotika, kao i na postupak lečenja bakterijskih infekcija, postupak za smanjenje rezistencije bakterija na terapiju antibioticima, postupak smanjenja efikasnih doza antibiotika i postupak za poboljšanje terapeutske efikasnosti antibiotika protiv bakterija otpornih na antibiotike; pronalazak se takođe odnosi na lekove i postupke za lečenje virusnih infekcija.
[0002] Infekcije se mogu klasifikovati na proste, odnosno infekcije izazvane jednim agensom, i mešovite infekcije, odnosno one izazvane sa dva ili više agenasa. Važno je razlikovati mešovite infekcije od sekundarnih infekcija (superinfekcija) koje proizilaze iz tekuće bolesti. Reinfekcija se definiše ponovnim pojavom bolesti izazvane istim agensom nakon potpunog oporavka i povezana je sa nedostatkom imuniteta.
[0003] Bakterijske infekcije su bolesti uzrokovane bakterijama. Bakterijske infekcije karakteriše lučenje toksina živih i mrtvih bakterija koje dovode do inflamacije, intoksikacije i oštećenja tkiva. Dijagnoza bakterijske infekcije zahteva propisivanje antibakterijskih lekova. Bakterije koje izazivaju različite bolesti na kraju razviju otpornost na antibiotike koji se koriste u lečenju. Ovo je prirodni adaptivni proces koji se naziva antimikrobna rezistencija. Razvoj velikog broja rezistentnih bakterija dovodi do sve većeg broja neizlečivih infekcija, što rezultira povećanjem rizika od bakterijskih infekcija, većim medicinskim troškovima povezanim sa lečenjem bakterijskih infekcija, dužim boravcima u bolnici i povećanjem mortaliteta [WHO. The evolving threat of antimicrobial resistance: Options for action.2013].
[0004] U maju 2015. godine, Svetska zdravstvena skupština je usvojila globalni akcioni plan za borbu protiv otpornosti na antimikrobne lekove, uključujući rezistenciju na antibiotike. Cilj globalnog akcionog plana je da se obezbedi lečenje i prevencija infektivnih bolesti efikasnim i bezbednijim lekovima [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/antibiotic-resistance/ru/].
[0005] Akutne infekcije gornjih disajnih puteva (URI) su najčešća grupa bolesti u svetu, koju čine grip, parainfluenca, infekcije izazvane respiratornim sincicijalnim virusom, rinovirusom i adenovirusom i druga kataralna zapaljenja gornjih disajnih puteva. Prenos virusa se obično dešava samo-inokulacijom virusa na sluznicu nosa ili konjuktive rukama nakon kontakta sa inficiranom osobom ili kontaminiranim površinama. Drugi način prenošenja je prenos vazdušnim putem koji se javlja usled udisanja aerosola koji sadrže virus ili izlaganja sluzokože infektivnim kapljicama kada je osoba u bliskom kontaktu sa inficiranom osobom. Odsustvo adekvatnog lečenja ili neefikasna terapija može dovesti do teških komplikacija kao što su otitis media, sinusitis, tonzilitis, diseminovana intravaskularna koagulacija itd.
[0006] Analiza zvaničnih statističkih podataka Svetske zdravstvene organizacije (SZO) pokazala je da su na početku 21. veka infektivne bolesti bile odgovorne za jednu četvrtinu svih smrtnih slučajeva u svetu, dok je u zemljama u razvoju smrtnost od infektivnih bolesti dostigla skoro 50%. Može se konstatovati da infektivne bolesti i dalje ostaju jedan od najvažnijih uzroka smrtnosti stanovništva širom sveta. Razvoj novih terapijskih opcija protiv ovih bolesti je prioritetni zadatak u medicinskoj i farmaceutskoj industriji.
[0007] Stoga su lečenje virusnih i bakterijskih infekcija, kao i načini smanjenja rezistencije na antibiotike i povećanja osetljivosti bakterija na antibiotike, postali izazovi od trenutnog značaja u zdravstvenoj industriji.
[0008] Stanje tehnike otkriva lekove za lečenje infektivnih bolesti, posebno antivirusna sredstva, na primer Arbidol, Amiksin, itd. [https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_4196.htm, https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_1526.htm]. Lekovi ove klase mogu imati neželjene efekte i neefikasni su protiv određenih virusnih bolesti [Leneva I.A. et al. Characteristics of arbidolresistant mutants of influenza virus: implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol. Antiviral Res 200981(2):132-40].
[0009] Stanje tehnike takođe otkriva lekove za lečenje infektivnih bolesti, posebno farmaceutske proizvode za lečenje bakterijskih infekcija kao što su amoksicilin, gentamicin, tetraciklin, levomicetin, itd. [https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_222.htm // https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_876.htm // https://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_82.htm // https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_4699.htm]. Antibiotski lekovi imaju dva glavna problema: sve veći broj mikroorganizama otpornih na antibiotike i širok spektar kontraindikacija i nuspojava povezanih sa njihovom upotrebom [Belozertseva V.N. et al. Antibiotics: resistance and toxicity. New St. Petersburg Medical Records, 2017.-N 2. -P.59-61].
[0010] Dakle, neodgovarajuća i nekontrolisana upotreba antibiotika može biti izuzetno štetna po ljudsko zdravlje. Osim neželjenih događaja kao što su alergije, toksične posledice za jetru i bubrege, kardiovaskularni poremećaji, poremećaji krvi i nervnog sistema, lečenje antibioticima takođe može dovesti do razvoja mikroba otpornih na antibiotike. Stoga su sveobuhvatni napori usmereni na smanjenje rezistencije mikroorganizama na antibiotike i stimulisanje mudre upotrebe antibiotika od aktuelnog značaja.
[0011] Postupak za suzbijanje rezistencije bakterija na lekove je poznat i podrazumeva primenu antibiotika u kombinaciji sa inhibitorima bakterijskih enzima. Na primer, klavulanska kiselina (ili klavulanat), inhibitor beta-laktamaze, čija hemijska struktura podseća na beta-laktamske antibiotike. Kao i drugi beta-laktami, klavulanska kiselina se može vezati za proteine koji vezuju penicilin (PBP) u gram-pozitivnim i gram-negativnim bakterijama i doprineti lizi bakterijskog zida. Osim toga, klavulanska kiselina ima sopstvenu antibakterijsku aktivnost. Na osnovu toga su kreirani kombinovani lekovi koji sadrže aminopenicilin i jedan od inhibitora beta-laktamaze (amoksicilin/klavulanat). Nedostatak ovog postupka je ograničen spektar antagonističkih efekata korišćenih kombinacija lekova, odnosno efikasni su samo protiv mikroorganizama sa rezistencijom posredovanom beta-laktamazom. Neželjeni efekti klavulanske kiseline su dispepsija, holestatska žutica, poremećaj funkcije jetre, hepatitis, infekcija Clostridium difficile, kandidijaza i alergije (multiformni eritem, angioedem, eksfolijativni dermatitis, alergijska urtikarija i anafilaktički šok) [https://www.kakprosto.ru/kak-899440-klavulanovaya-kislota-deystvie-i-svoystva-#ixzz5eej sFIpF].
[0012] Stanje tehnike otkriva postupak prevazilaženja rezistencije bakterija i gljivica na lekove koji poboljšavaju efikasno suzbijanje otpornosti mikroorganizama na lekove i to antimikrobne lekove sa različitim mehanizmima delovanja usled kombinovanih efekata anilinskih boja u niskim koncentracijama i antimikrobnih agenasa [patent RU2363470C1, 10.08.2009]. Treba napomenuti da anilinske boje imaju široku primenu u histologiji i imaju antibakterijsko dejstvo, dok neke od njih pokazuju kancerogeno dejstvo.
[0013] Stanje tehnike takođe otkriva farmaceutsku kombinaciju aktivnih antibakterijskih i proteolitičkih enzima za spoljnu i lokalnu primenu. Ova kompozicija sadrži bazu (na primer, lizoamidazu) i najmanje jedan ciljni suplement (antibiotik, sintetički antibakterijski agens, uključujući agens koji smanjuje otpornost mikroba, antimikotik, anestetik ili stimulans reparacije). Pronalazak obezbeđuje povećanu terapeutsku aktivnost farmaceutske kompozicije u poređenju sa poznatim agensima, uključujući i sojeve koji su otporni na pojedinačne komponente kompozicije. Takođe poboljšava proces zarastanja, stimuliše brže čišćenje rana i kraće vreme do rekonvalescencije [patent RU2655808C2, 29.05.2018]. Treba napomenuti da su enzimi osetljivi na različite faktore okoline (pH, temperaturu, pritisak, itd.) i izlaganje bilo kojim spoljnim faktorima može dovesti do denaturacije i nepovratnih promena u strukturi enzima, praćenih gubitkom njegovih svojstava. Na primer, preporučuje se čuvanje enzima lizoamidaze na <_+10°C u tamnom, suvom okruženju, što predstavlja dodatne izazove za njegovu proizvodnju, transport i skladištenje, jer može smanjiti njegovu efikasnost u bilo kom od ovih koraka.
[0014] Prethodno stanje tehnike otkriva lek koji sadrži aktivirani oblik ultraniskih doza monoklonskih i poliklonskih, imunih ili prirodnih, antitela na glavni antigen histokompatibilnosti (HLA kompleks) ili na HLA antigen kompleks i njegov pridruženi peptid [patent RU2205025C1, 26.12.2001]. Imunotropni lek dobijen u skladu sa pronalaskom je novo farmaceutsko sredstvo, koje karakteriše imunotropna aktivnost, nedostatak neželjenih efekata, čistoća životne sredine i niska cena. Međutim, nema podataka o efikasnosti ovog leka u lečenju bakterijskih i/ili virusnih infekcija.
[0015] Prethodno stanje tehnike otkriva složeni lek za lečenje virusnih infekcija koji sadrži aktivirano-potencirani oblik antitela na humani interferon gama i aktivirano-potencirani oblik antitela na CD4 receptor kao aktivne komponente [patent RU 2521392, 06.08.2010]. Međutim, nema podataka o efikasnosti ovog leka u lečenju bakterijskih ili mešovitih infekcija.
[0016] Ergoferon je najbliži analog navedenog leka [https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_46844.htm]. Farmakološka aktivnost Ergoferona uključuje antivirusne i imunomodulatorne efekte; pored toga, lek se takođe koristi u kombinovanom lečenju bakterijskih infekcija. Ergoferon sadrži takozvani aktivirano-potencirani oblik antitela na humani interferon gama (IFN-γ), aktivirano-potencirani oblik antitela na CD4 T ćelija (CD4) i aktivirano-potencirani oblik antitela na histamin (His).
[0017] Cilj ovog pronalaska je stvaranje novog efikasnog kompleksnog leka koji bi pokazao visoku antivirusnu, antibakterijsku i imunomodulatornu aktivnost i takođe bio efikasan protiv bakterija otpornih na jedan ili više poznatih antibakterijskih lekova (antibiotika), bez ikakvih toksičnih ili mutagenih efekata na organizam pacijenta. Pronalazak je takođe usmeren na razvoj leka koji bi mogao da poboljša farmakološku efikasnost antibiotika, posebno njegovu efikasnost protiv rezistentnih bakterija, i da smanji efektivne doze antibiotika.
[0018] Pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima. U jednom primeru izvođenja, lek ovog pronalaska je tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci, odnosno antitela na HLA-DRB1 i na β2-MG. U sledećem primeru izvođenja, lek ovog pronalaska je tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci, naime a) HLA-DRB1, b) β2-MG, c) IFN-γ i d) CD4. Oba primera izvođenja su efikasna za lečenje i prevenciju bakterijskih infekcija izazvanih različitim vrstama patogena.
[0019] Jedan aspekt pronalaska je lek za koji se traži zaštita za lečenje bakterijskih infekcija, koji stimuliše povećanu efikasnost antibiotika, smanjenu otpornost bakterija na antibiotsku terapiju i smanjene efikasne doze antibiotika i predstavlja tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci, tj. antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1) i antitela na β2-mikroglobulin (β2-MG).
[0020] Sledeći aspekt pronalaska je lek za koji se traži zaštita sa antibakterijskom i antivirusnom aktivnošću za lečenje infektivnih bolesti, koji predstavlja tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci: a) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1), b) antitela na β2-mikroglobulin (β2-MG), c) antitela na interferon gama (IFN-γ) i g) antitela na CD4.
[0021] Pomenute vrste bakterija mogu biti sledeće, na primer: spirohete (na primer, Treponema, Borrelia, Leptospira); gram-negativne aerobne i mikroaerofilne, pokretne, zakrivljene i spiralne bakterije (na primer, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum); gram-negativni aerobni i mikroaerofilni štapići i koke (na primer, Achromobacter, Bordetella, Kingella, Neisseria); gram-negativni fakultativni anaerobni štapići (na primer, Cedecea, Escherihia, Klebsiella, Plesiomona, Haemophilus, Streptobacillus (coli infekcije)); gram-negativne anaerobne ravne, zakrivljene i spiralne bakterije (na primer, Anaerobiospirrilum, Bacteroides, Porphyromonas); gram-negativne anaerobne koke (na primer, Veillonella); rikecije i hlamidije (na primer, Ehrlichia, Chlamydophila); gram-pozitivne koke (na primer, Aerococcus, Staphylococcus, Streptococcus); gram-pozitivni štapići koji formiraju endospore i koke (na primer, Bacillus, Clostridium); gram-pozitivni štapići pravilnog oblika koji ne formiraju spore (na primer, Erysipelothrix, Listeria); gram-pozitivni štapići nepravilnog oblika koji ne formiraju spore (na primer, Bifidobacterium, Corinebacterium, Rothia); mikobakterije (na primer, Mycobacterium); aktinomicete (na primer, Actinomadura, Nocardia, Streptomyces); mikoplazme (na primer, Mycoplasma, Ureaplasma) itd. [I.V. Smirnov. Pathogens of bacterial infections in humans. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, No.2, Vol. 2, 2000, p.4-11].
[0022] Lek za koji se traži zaštita, koji je tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 i na β2-MG, takođe je efikasan protiv bakterija koje su otporne na jedan ili više antibiotika.
[0023] Bakterijske infekcije koje se mogu lečiti navedenim lekom mogu se grupisati u klase na osnovu tipa patogene bakterije i njihovog načina prenošenja:
[0024] Bakterijske gastrointestinalne/crevne infekcije mogu biti uzrokovane šigelom, stafilokokom, bacilom kolere, bacilom tifusa ili salmonelom (salmoneloza, trbušni tifus, dizenterija, bakterijsko trovanje hranom, kampilobakterioza, enteritis, ešerihitis, gastritis, bolesti čira, trovanje hranom botulizam, itd.). Fekalno-oralni put prenosa je dominantan za ove infekcije.
[0025] Bakterijske infekcije respiratornog trakta sa vazdušnim prenosom mogu izazvati stafilokoke, pneumokoke, streptokoke, Bordetella pertussis, meningokoke, hlamidije, mikobakterije, mikoplazma itd. (sinuzitis, rinitis, akutni tonzilitis, laringitis, traheitis, tonzilitis, epiglotitis, maksilarni sinuzitis, pneumonija, bronhitis, tuberkuloza, itd.).
[0026] Bakterijske infekcije genitourinarnog sistema, kao što su bakterijska vaginoza (gardnereloza), hlamidija, cistitis, disbakterioza, pijelonefritis, glomerulonefritis, uretritis, bakterijski balanitis, prostatitis, bakterijski cistitis, bakterijski prostatitis, seminalni vezikulitis, itd.;
[0027] Bakterijske infekcije kože i mekih tkiva uzrokovane, na primer, stafilokokama i streptokokama, prenose se kontaktom sa kožom (erizipel, impetigo, celulitis, flegmon, furunkuloza, hidradenitis itd.).
[0028] Infekcije krvi uzrokovane, na primer, rikecijama, jersinijama i kokobacilima imaju prenosni put (zečja groznica, kuga, pegava groznica, rovovska groznica, itd.).
[0029] Infekcije limfnog sistema, kao što su zapaljenje limfnih žlezda i limfangitis, mogu biti uzrokovane streptokokom ili stafilokokom;
[0030] Infekcije nervnog sistema, na primer, meningitis, encefalitis, mijelitis i druge infekcije izazvane meningokokama, pneumokokama, Haemophilus influenzae tipa b, borelijom, mikoplazmom, gljivicama Candida itd., mogu se preneti i vazdušnim putem, kao i putem limfnog sistema;
[0031] Infekcije kostiju i zglobova mogu biti uzrokovane bakterijskim uzročnicima lajmske bolesti, stafilokokama, streptokokama, mikobakterijama i gonokokama i preneti se krvotokom, direktnim kontaktom, na primer, otvorenom ranom ili hirurškim zahvatima i sl., kao i infekcijama u najbližim telesnim strukturama (septični artritis, osteomijelitis, Reiterov sindrom, itd.);
[0032] Infekciju uha (mastoidne i sinusne infekcije) mogu izazvati streptokoke i stafilokoke, gljivice Candida, Haemophilus influenza itd. Putevi prenosa su preko Eustahijeve tube, iz spoljašnjeg slušnog kanala ili putem krvi (lavirintitis, senzorneuralni gubitak sluha, mastoiditis, itd.).
[0033] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska je kombinacija aktivnih sastojaka za lečenje bakterijskih infekcija, odnosno lek koji predstavlja tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 i antitela na β2-MG i odgovarajući antibiotik, kada se oba istovremeno primenjuju na pacijenta. Istovremena primena leka i odgovarajućeg antibiotika može se vršiti bilo istovremenim unosom lekova kao dva nezavisna proizvoda (kao pojedinačni dozni oblici) u isto vreme ili uzastopno u potrebnim vremenskim intervalima, posebno kada su ovi intervali omogućavaju kombinaciji proizvoda da ispolje poboljšane efekte. Postupak izbora se određuje na osnovu iskustva i zavisi od bolesti i korišćenog antibiotika.
[0034] Lek za koji se traži zaštita, zajedno sa poznatim antibiotikom, takođe može da gradi fiksnu ili nefiksnu farmaceutsku kombinaciju koja se koristi za lečenje bakterijskih infekcija. Termin "fiksna kombinacija" označava da se aktivni sastojci, tj. lek za koji se traži zaštita i partnerski lek (antibiotik), istovremeno primenjuju na pacijenta kao jedan farmaceutski oblik ili doza. Termini „nefiksna kombinacija“ ili „skup komponenti“ označavaju da se aktivni sastojci, tj. lek za koji se traži zaštita i partnerski lek (antibiotik), primenjuju na pacijenta zajedno kao odvojene komponente, bilo istovremeno ili uzastopno, bez bilo kakvih specifičnih vremenskih intervala u slučajevima kada takva primena obezbeđuje efikasne nivoe dva aktivna sastojka u telu. Navedena kombinacija leka i antibiotika može se primeniti istovremeno ili uzastopno za lečenje bakterijskih infekcija, pri čemu se antibiotik primenjuje u poznatoj efikasnoj dozi.
[0035] Lek za koji se traži zaštita (antitela na HLA-DRB1 i antitela na β2-MG) se koristi u efikasnoj dozi izabranoj eksperimentalno, dok antibiotik treba uzimati u skladu sa uputstvima za pacijenta ili po preporuci lekara. Antibiotik se može izabrati iz sledećih grupa, na primer: beta-laktamski antibiotici (penicilini (amoksicilin, meticilin, oksacilin, benzilpenicilin, itd.); cefalosporini (cefaleksin, cefazolin, ceftriakson, cefepim, itd.); karbapenemi (meropenem, doripenem, biapenem itd.)); makrolidi (ketolidi, eritromicin, roksitromicin, klaritromicin, itd.); tetraciklini (tetraciklin, oksitetraciklin, doksiciklin, metaciklin, itd.); aminoglikozidi (streptomicin, kanamicin, amikacin, gentamicin, itd.); hloromicetini; oksazolidinoni; glikopeptidi (targocid, daptomicin, vankomicin, itd.); linkozamidi (dalacin C); fluorohinoloni (levofloksacin, gemifloksacin, sparfloksacin, itd.); antifungalni antibiotici (nistatin, amfotericin B, itd.); antibiotici protiv tuberkuloze (ftivazid, metazid, saluzid, itd.); antileprotički lekovi (solusulfon, diucifon, itd.); antineoplastični agensi (doksorubicin, rubomicin, karminomicin, itd.); i drugi antibiotici (fosfomicin, fusidin, rifampicin, itd.) [https://ru.wikipedia.org/wiki/A
].
[0036] Efikasna doza (ED) ili efikasna koncentracija (EC) je definisana kao doza ili koncentracija leka koja proizvodi biološki odgovor. Termin "efikasna doza" se koristi za merenja in vivo, dok se termin "efikasna koncentracija" koristi za merenja in vitro.
[0037] Ovaj pronalazak ima za cilj da poboljša farmakološku aktivnost antibiotika, posebno njegove efekte protiv rezistentnih bakterija, putem istovremene ili uzastopne istovremene primene odgovarajućeg antibiotika i leka za koji se traži zaštita, koji predstavlja tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB 1 i na β2-MG. Dakle, zajednička primena leka za koji se traži zaštita i antibiotika stimuliše smanjenje doze antibiotika.
[0038] Lek ovog pronalaska, koji je tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci, naime a) HLA-DRB1, b) β2-MG, c) IFN-γ i d) CD4, može se koristiti u lečenju virusnih infekcija. Pomenute virusne infekcije mogu biti uzrokovane sledećim virusima: dvolančani DNK virusi (na primer, Herpesvirales, Adenoviridae, Papillomavirida, Polyomaviridae.); jednolančani DNK virusi (na primer, Circoviridae, Parvoviridae); virusi sa RNK sposobnim za replikaciju (na primer, Reoviridae, Birnaviridae); pozitivni-sens jednolančani RNK virusi (na primer, Nidovirales, Picornavirales, Tymovirales, Astroviridae, Caliciviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Virgaviridae); negativni-sens jednolančani RNK virusi (na primer, Bunyavirales, Mononegavirales, Arenaviridae, Ophioviridae, Orthomyxoviridae, Deltavirus); pozitivni-sens jednolančani RNK virusi koji se repliciraju preko DNK intermedijera (na primer, Retroviridae); i dvolančani DNK virusi koji se repliciraju preko jednolančanog RNK intermedijera (na primer, Caulimoviridae, Hepadnaviridae) [https://ru.vikipedia.org/viki/ ].
[0039] Pored toga, ovaj lek, koji je tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci, naime a) HLA-DRB1, b) β2-MG, c) IFN-γ i d) CD4, efikasan je protiv mešanih infekcija koje nastaju usled istovremene izloženosti dva ili više različitih patogena, i virusa i bakterija, i sekundarne infekcije (superinfekcije) koje se javljaju nakon infekcije od drugog patogena.
[0040] Tehnički rezultat ovog pronalaska je da se proširi opseg lekova sa složenim antivirusnim i antibakterijskim efektima i da se stvori antibakterijski agens širokog spektra koji bi bio efikasan protiv bakterija koje su otporne na jedan ili više antibiotika i koje bi pokazale nisku toksičnost ili mutagenost, na taj način se smanjuje opterećenje organizma pacijenta tokom antibakterijske terapije. Pored toga, lek za koji se traži zaštita poboljšava farmakološku efikasnost antibiotika, uključujući efikasnost protiv rezistentnih bakterija, i smanjuje njegovu efikasnu dozu, minimizirajući neželjene efekte tokom i nakon tretmana antibiotikom.
[0041] Tehnološki obrađeni proizvodi koji su rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1, antitela na β2-MG i antitela na IFN-γ, antitela na CD4 su vodeni ili vodeno-alkoholni rastvori antitela (ili kombinacija ovih rastvora) dobijeni serijskim razblaženjima (potenciranjem) matriksnog rastvora antitela, pri čemu je svako razblaženje podvrgnuto postupku sukusije.
[0042] U prethodnim radovima [videti RU2205025C1, 26.12.2001; RU2500422C206.08.2010 itd.], podnosilac prijave je koristio termine „aktivirani oblik antitela“, „aktivirano-potencirani oblik antitela“, „ultravisoka razblaženja“ i „ultraniske doze antitela“ da bi opisao tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat višestrukih serijskih razblaženja stok supstanci antitela. Podnosilac prijave takođe ističe da se termini „oslobođeni-aktivni oblik” i termini „aktivirani oblik antitela”, „aktivno-potencirani oblik antitela”, „ultraniske doze antitela”, „ultravisoka razblaženja” i „aktivna razblaženja” mogu koristi se naizmenično [Epstein O.I. Releasedactivity (contemporary view on homeopathy and non-homeopathy). Moscow: RAMS Publishing House, 2017.48 p. // Epstein O.I. Ultralow doses (history of one study). Moscow: RAMS Publishing House, 2008.336 p.].
[0043] U ovom pronalasku, razblaženje antitela je definisano kao bilo koje razblaženje matriksnog rastvora antitela, uključujući decimalna, centezimalna i milesimalna razblaženja, od C2 pa nadalje (tj. iz matriksnog rastvora razblaženog 100<2>puta), kao i bilo koje njihove kombinacije (na primer, C2+D34+M45, D20+C4, itd.) i bilo koje odnose razblaženja (na primer, 1:1:2, 2:3, itd.).
[0044] Predmetni lek se priprema korišćenjem prirodnih, monoklonskih ili uglavnom poliklonskih antitela kao osnovne supstance koja se može dobiti prema poznatim tehnologijama i postupcima opisanim u: Myagkova M.A., Morozova V.S. Immunochemical properties of natural antibodies to physiologically active compounds, Fundamental Research No.11, 2014, p.1066-1070 i Immunological methods edited by G. Frimel, Moscow, Meditsina, 1987, p.9-33; ili, na primer, u radu od Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 godina kasnije. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55, i koji imaju antigensku specifičnost za odgovarajuće antigene, odnosno HLA-DRB1, β2-MG, IFN-γ i CD4.
[0045] Prirodna antitela se definišu kao imunoglobulini koje telo luči u ograničenim količinama u odsustvu stimulacije egzogenim antigenom, pa su ova antitela prisutna i u cirkulaciji zdravih ljudi. Čini se da su prirodna autoantitela prvenstveno polireaktivna antitela niskog afiniteta prema određenom skupu autoantigena.
[0046] Monoklonska antitela su heterogena antitela koja prepoznaju specifični antigeni epitop i proizvodi ih jedan klon B ćelije [Lipman NS1, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR J. 2005;46(3):258-68. // IHC Staining Methods. Fifth edition. Preface Chapter 1. Thomas Boenisch. Antibodies. p:1-9]. Monoklonska antitela se mogu proizvesti korišćenjem hibridomske tehnologije. Ovaj postupak počinje imunizacijom na osnovu unapred razvijenih tehnika koje se koriste za proizvodnju poliklonskih antiseruma. Dalji koraci postupka se izvode da bi se uzgajale hibridne ćelije koje proizvode klonove antitela jedne specifičnosti. Njihova individualna izolacija se vrši istim postupcima kao i za poliklonske antiserume.
[0047] Poliklonska antitela su predstavljena kolekcijom imunoglobulina koji prepoznaju više epitopa specifičnog antigena i luče ih različite B ćelijske linije unutar tela [Lipman NS1, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR J.
2005;46(3):258-68. // IHC Staining Methods. Fifth edition. Preface Chapter 1. Thomas Boenisch. Antibodies. p:1-9]. Poliklonska antitela se mogu proizvesti aktivnom imunizacijom životinja. Za imunizaciju, životinjama se daju injekcije pogodnog jedinjenja zahtevanog pronalaskom, tj. antigena, prema razvijenom protokolu injekcije. Kao rezultat, ovaj postupak daje monospecifične antiserume sa visokom koncentracijom antitela koji se koriste u postupku višestrukih serijskih razblaženja za dobijanje gotovog proizvoda. Afinitetno prečišćavanje antitela prisutnih u antiserumu može se izvesti, na primer, korišćenjem postupka frakcione precipitacije ili hromatografije izmene jona, ako je potrebno.
[0048] Imajući u vidu gore navedeno, termin 'antitela' se odnosi na imunoglobuline bilo kog porekla (prirodna, poliklonska ili monoklonska antitela) koji se specifično vezuju za ciljni molekul (antigen). Specifičnost, odnosno sposobnost antitela da prepoznaju i interaguju sa određenim tipom antigenskih epitopa, je centralna karakteristika antitela koja definiše čitav niz njegovih efekata [Boyd WC. Fundamentals of immunology. Fundam. Immunol. 1946; Langman RE. The specificity of immunological reactions. Mol. Immunol.2000; 37: 555-561]. Specifičnost ne zavisi od prirode antitela ili načina njihove proizvodnje: prirodna, poliklonska ili monoklonska antitela identične specifičnosti će uticati na istu metu [A. Roitt et al., Essential Immunology. Translated from English. - Moscow: Mir, 2000, p.149-161, 527-544]; i stoga se mogu koristiti za proizvodnju leka za koji se traži zaštita.
[0049] U jednom primeru izvođenja, lek za koji se traži zaštita može da se pripremi korišćenjem poliklonskih antitela kao matriksnog (osnovnog) rastvora u koncentraciji od 0.5-5.0 mg/ml za tehnološku obradu koja se sprovodi višestrukim serijskim razblaženjima osnovnih supstanci antitela da bi se dobio gotov proizvod.
[0050] Tehnološka obrada, odnosno postupak višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela, je sistematsko smanjenje koncentracije kroz serijska razblaženja 1 dela pomenutog matriksnog rastvora u 9 delova (za decimalna razblaženja, D) ili 99 delova (za centezimalna razblaženja, C) ili 999 delova (za milesimalna razblaženja, M) neutralnog rastvarača u kombinaciji sa spoljnim mehaničkim delovanjem (na primer, mućkanjem) primenjenog na svako od dobijenih razblaženja, i kada se za svako sledeće razblaženje koristi nova posuda [videti W. Shwabe "Homeopathic medicines", Moscow, 1967, p.14-29].
[0051] Naizgled jednostavan postupak ponovljenog i uzastopnog smanjenja koncentracije supstanci ispostavlja se kao komplikovana tehnologija koja isporučuje proizvode sa jedinstvenim svojstvima. Istorijski gledano, proizvodi tehnologije potenciranja nazivani su 'male doze', 'potencirani preparati' ili 'visoka razblaženja'.
[0052] Gotov proizvod se može proizvoditi u različitim doznim oblicima [OFS.1.6.2.001.18, the State Pharmacopoeia of the Russian Federation, ed. XIV] i može sadržati farmaceutski prihvatljive ekscipijense.
[0053] Na primer, predmetni lek se može proizvesti kao čvrsti dozni oblik koji sadrži potrebnu (efikasnu) količinu farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, koji je predstavljen neutralnim nosačem (na primer, laktozom) impregniranim mešavinom tehnološki obrađenih proizvoda iz višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela, kao što su antitela na HLA-DRB1, β2-MG, IFN-γ, CD4, i farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, kao što su hipromeloza, maltitol, glicerol, kalijum sorbat, anhidrovana limunska kiselina, izomalt silicijum dioksid, natrijum ciklamat, natrijum saharin, mikrokristalna celuloza, magnezijum stearat itd.
[0054] Gotov proizvod ovog pronalaska je lek, koji je tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci: a) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti II klase (HLA-DRB1) i b) antitela na β2-mikroglobulin (β2-MG) ili a) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1), b) antitela na β2-mikroglobulin (β2-MG), c) antitela na interferon gama (IFN-γ) i g) antitela na CD4. Razblaženja korišćenih osnovnih supstanci mogu da variraju od decimalnih (D) do milesimalnih (M) razblaženja, sa različitim odnosima razblaženja. Optimalna razblaženja i odnosi početnih komponenti određuju se u skladu sa poznatim principima farmakodinamike i farmakokinetike, posebno krivom dozaodgovor.
[0055] Čvrsti oralni dozni oblik zahtevanog leka se priprema na sistemu fluidnog sloja (na primer, Hćttlin Pilotlab by Hćttlin GmbH) prskanjem prethodno pripremljenog vodenog ili vodeno-alkoholnog rastvora (koncentracija se bira eksperimentalno, OFS.1.6.2.0010.18, State Pharmacopoeia) tehnološki obrađenih proizvoda koji su rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na fluidizovani sloj neutralnih granula nosača, tj. laktoze (mlečni šećer), koje se istovremeno suše uzlaznom strujom zagrejanog vazduha na <_ 40°C. Dobijena mešavina tableta se ravnomerno meša, a zatim sabija postupkom suve direktne kompresije (na primer, u XL 400 presi za tablete kompanije Korsch) [WO2007105981(A1), 20.09.2007]. Postupak kompresije daje tablete od 300 mg impregnirane vodenim ili vodenoalkoholnim rastvorom tehnološki obrađenih proizvoda koji su rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci, tj. antitela na HLA-DRB1, antitela na β2-mikroglobulin, antitela na interferon gama i/ili antitela na CD4.
[0056] Slike ispod, zajedno sa priloženim crtežima, ponuđene su da ilustruju ovaj pronalazak:
Sl. 1. Težina bešike 7 dana nakon infekcije.
Sl. 2. Opterećenje bakterijama bešike kod miševa 7 dana nakon infekcije.
Sl. 3. Težina bubrega 7. dana nakon infekcije.
Sl. 4. Bakterijsko opterećenje bubrega kod miševa 7 dana nakon infekcije.
Sl. 5. Bakterijsko opterećenje urina 1, 3 i 6 dana nakon infekcije.
Sl. 6. Preživljavanje miševa (%) nakon infekcije Escherichia coli sa dozom od 2LD100 (tačka 0 na horizontalnoj osi). Napomena: * - razlika u odnosu na kontrolnu grupu je statistički značajna, p<0.05; # - razlika u odnosu na grupu enrofloksacina je statistički značajna, p<0.05. Sl. 7. Telesna težina miševa (M±m) kao marker antibakterijske aktivnosti kombinacije leka za koji se traži zaštita i AMC nakon infekcije (tačka 0 na horizontalnoj osi) sa AMC rezistentnim sojem Klebsiella pneumoniae BAA-1705 u dozi od 106 CFU /mišu.
Sl. 8. Preživljavanje miševa (%) kao marker antibakterijske aktivnosti kombinacije navedenog leka i AMC nakon infekcije (tačka 0 na horizontalnoj osi) sa AMC rezistentnim sojem Klebsiella pneumoniae BAA-1705 u dozi od 106 CFU/mišu. Napomena: * - razlika u odnosu na kontrolnu grupu je statistički značajna, p<0.05; # - razlika u odnosu na grupu kontrola+AMC je statistički značajna, p<0.05; $ - razlika u odnosu na AMC grupu je statistički značajna, p<0,05.
Sl. 9. Inhibiciona koncentracija AMC 50% (IC50, M±m) (Klebsiella pneumoniae BAA-1705 soj, 5×104 CFU/bunariću) i osetljivost bakterija (inhibicija %) na AMC 100% inhibitornu koncentraciju za intaktne bakterije i za bakterije izolovane iz životinje koje su primile test artikle in vivo. Napomena: * - razlika od vrednosti 'neoštećene bakterije' je statistički značajna. Sl. 10 Težina edema (M±m) kao marker antiinflamatorne aktivnosti leka za koji se traži zaštita u modelu karagenanom indukovanog edema šape kod pacova. Napomena: * - razlika u odnosu na kontrolnu grupu je statistički značajna, p<0.05; # - razlika u odnosu na indometacinsku grupu je statistički značajna, p<0.05.
Sl. 11. Poređenje između broja CFU soja Salmonella enterica osetljivog na streptomicin (JB270) i broja soja Salmonella enterica otpornog na streptomicin (JB271 [Strep<R>]) po g slezine kod miševa 2-4 dana nakon infekcije sa JB270 JB271 [Strep<R>] (1:1 u dozi od 5.0 log10 CFU/mišu). Podaci su predstavljeni kao M±SE. * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u istoj grupi 2. i 3. dana studije; # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupama 1 i 3, dana 2, 3, 4 i 5 studije (1, 2, 3 i 4 dan nakon infekcije, respektivno).
Sl. 12. Poređenje između broja CFU soja Salmonella enterica osetljivog na nalidiksičnu kiselinu (JB270) sa brojem rezistentnog soja Salmonella enterica (JB285 [Nal<R>]) po g slezine kod miševa 2-4 dana nakon infekcije sa JB270 JB285 [Nal<R>] (1:1 u dozi od 5.0 log10 CFU/mišu). Podaci su predstavljeni kao M±SE. * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u istoj grupi 3. dana studije; # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupama 4 i 6, dana 3, 4 i 5 studije (2, 3 i 4 dan nakon infekcije, respektivno), kao i u grupi 4 na dan 2 studije.
Sl. 13 Preživljavanje miševa (%) kao marker antibakterijske aktivnosti leka za koji se traži zaštita nakon infekcije (tačka 0 na horizontalnoj osi) sa Clostridium perfringens (ATCC 13124) intraperitonealnim putem (10<10>CFU/mišu). * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupama 1, 2, 4 i 5; # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupama 1, 4 i 5; $ p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupama 1 i 5.
Sl. 14. Preživljavanje miševa (%) kao marker antibakterijske aktivnosti leka za koji se traži zaštita u lečenju životinja inficiranih (tačka 0 na horizontalnoj osi) Chlamidophila pneumonijom (CM1) intratrahealnim putem (1.5*10<6>CFU/mišu). * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupama 1 i 2; # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 1. Sl. 15. Broj HEp2 ćelija inficiranih sa Chlamidophila pneumonia (CM1 soj) nakon inkubacije u trajanju od 72 sata sa homogenatom plućnog tkiva dobijenim od miševa 3, 6 i 12 dana nakon infekcije identičnim bakterijama intratrahealnim putem (1.5*10<6>CFU/mišu) koji su primili placebo, lek za koji se traži zaštita ili azitromicin. Podaci su predstavljeni kao M±SE, kao % kontrole - 1 (Placebo). * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 1 (Placebo) istog dana studije; # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 2 (lek) istog dana studije.
Sl. 16. Koncentracija interleukina-1β u plućnom tkivu miševa kao marker imunotropne aktivnosti leka za koji se traži zaštita da u lečenju životinja inficiranih (tačka 0 na horizontalnoj osi) Chlamidophila pneumonijom (CM1) intratrahealnim putem (1.5*10<6>CFU/mišu). Podaci su predstavljeni kao M±SE. * p < 0.05 u odnosu na pozadinske vrednosti (neoštećene); # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 1 (placebo); $ p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 2 (lek). Poređenja između grupa su obavljena u okviru jedne vremenske tačke (dan studije).
Sl. 17. Koncentracija interleukina-6 u plućnom tkivu miševa kao marker imunotropne aktivnosti leka za koji se traži zaštita u lečenju životinja inficiranih sa (tačka 0 na horizontalnoj osi) Chlamidophila pneumonijom (CM1) intratrahealnim putem (1.5 *10<6>CFU/mišu). Podaci su predstavljeni kao M±SE. * p < 0.05 u odnosu na pozadinske vrednosti (neoštećene); # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 1 (Placebo); $ p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 2 (lek). Poređenja između grupa su obavljena u okviru jedne vremenske tačke (dan studije).
Sl. 18. Efekti tretmana na koncentraciju TNF-α u plućnom tkivu miševa inficiranih (tačka 0 na horizontalnoj osi) Chlamidophila pneumonijom (CM1) intratrahealnim putem (1.5*10<6>CFU/mišu). Podaci su predstavljeni kao M±SE.
Sl. 19. Preživljavanje miševa (%) kao marker antibakterijske aktivnosti leka za koji se traži zaštita u lečenju neutropeničnih životinja inficiranih (tačka 0 na horizontalnoj osi) sojem Klebsiella pneumoniae 8637 intranazalnim putem (2*10<7>CFU/mišu). * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u kontroli (placebo).
Sl. 20. Opterećenje bakterijama u krvi i organima miševa inficiranih (tačka 0 na horizontalnoj osi) sojem Klebsiella pneumoniae 8637 intranazalnim putem (2*10<7>CFU/mišu). * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u kontroli (placebo).
Sl. 21. Efekti leka 1 i leka 2 na CFU broj S. pneumoniae u plućima miševa posle uzastopne infekcije virusom A/New Jersey/8/76 (H1N1) i S. pneumoniae. Napomena: * - razlika u grupi „Model kontrola“ je statistički značajna, p<0.05; # - razlika u odnosu na grupe „Netretirana kontrola“ i „Kontrola“ je statistički značajna, p<0.05; $ – razlika u odnosu na grupu „Lek 1” je statistički značajna, p<0.05.
Sl. 22. Preživljavanje miševa (%) nakon infekcije (tačka 0 na horizontalnoj osi) virusom gripa H1N1/A California 04/2009 i Staphylococcus aureus (soj iz 1986). Napomena: * - razlika u odnosu na kontrolnu grupu je statistički značajna, p<0.05; # - razlika u odnosu na negativnu kontrolnu grupu je statistički značajna, p<0.05.
Sl. 23. Promene relativne hiperreaktivnosti bronhija kod miševa inficiranih RSV (A2 soj). Napomena: u dijagramu, podaci o bronhijalnoj hiperreaktivnosti po grupi u tački „0 mg/ml metaholina“ (osnovna linija) uzeti su kao 1. Vrednosti dobijene u drugim tačkama su normalizovane na osnovnu liniju odgovarajuće grupe. Podaci su predstavljeni kao normalizovani M±CI 95%. * - razlika u odnosu na intaktnu grupu (grupa 6) je statistički značajna, p<0.05; # - razlika u odnosu na kontrolnu grupu (Grupa 3) je statistički značajna, p<0.05; & - razlika u odnosu na RSV grupu (Grupa 4) je statistički značajna, p<0.05.
Sl. 24. Broj kopija virusne RNK (M±m) u plućima miševa inficiranih RSV (A2). Napomena: * - razlika u odnosu na kontrolnu (grupa 3) i RSV (grupa 4) je statistički značajna, p<0.05; # -razlika u grupi 6 je statistički značajna, p<0.05, $ - razlika u grupi 2 je statistički značajna, p<0.05
Sl. 25. Telesna težina pacova inficiranih Pseudomonas aeruginosa (RP73) intratrahealnim putem u dozi od 6.5*10<7>CFU/ml koji su primili placebo, lek za koji se traži zaštita ili tobramicin kao terapijsku i preventivnu terapiju. Podaci su predstavljeni kao M±SE. * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u Grupi 1 (Netretirane životinje) i Grupi 2 (Placebo); # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u Grupi 4 (lekovi).
SL. 26. Bakterijsko opterećenje u plućima pacova 5. dana nakon intratrahealne infekcije sa Pseudomonas aeruginosa (RP73) u dozi od 6.5*10<7>CFU/ml i primena placeba, leka za koji se traži zaštita ili tobramicina kao terapijske i preventivne terapije. Podaci su predstavljeni kao % vrednosti dobijenih u Grupi 1 (Netretirane životinje), M±SE. * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 1 (netretirane životinje) i u grupi 2 (placebo).
Sl. 27. Bakterijsko opterećenje u bronhoalveolarnom ispiranju pacova 5. dana nakon intratrahealne infekcije sa Pseudomonas aeruginosa (RP73) u dozi od 6.5*10<7>CFU/ml i primena placeba, leka za koji se traži zaštita ili tobramicina kao terapijske i preventivne terapije. Podaci su predstavljeni kao % vrednosti dobijene u Grupi 1 (Netretirane životinje), M±SE. * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 1 (Netretirane životinje) i Grupi 2 (Placebo); # p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u grupi 4 (lekovi).
Sl. 28. Bakterijsko opterećenje u subkutano implantiranoj komornoj tečnosti kod miševa 4. dana nakon in vivo infekcije Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) u dozi od 10<8>CFU/životinja. Podaci su predstavljeni kao M±SE. * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u Grupi 1 (Netretirane životinje) i Grupi 2 (Placebo).
Sl. 29. Koncentracija interleukina-1β u subkutano implantiranim komorama kod miševa 4. dana nakon in vivo infekcije Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) u dozi od 10<8>CFU/životinja.
Podaci su predstavljeni kao M±SE*. p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u Grupi 1 (Netretirane životinje) i Grupi 2 (Placebo).
Sl. 30. Koncentracija interleukina-6 u subkutano implantiranim komorama kod miševa 4. dan nakon in vivo infekcije Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) u dozi od 10<8>CFU/životinja. Podaci su predstavljeni kao M±SE*. p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u Grupi 1 (Netretirane životinje) i Grupi 2 (Placebo).
Sl. 31. Bakterijsko opterećenje u plućima miševa 4 nedelje nakon infekcije Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) u dozi od 5*10<6>CFU/životinja i lečenje placebom, lekom za koji se traži zaštita ili kombinacijom izoniazid rifampicin etambutol azitromicin. Podaci su predstavljeni kao M±SE. * p < 0.05 u odnosu na vrednosti dobijene u Grupi 1 (Netretirane životinje) i Grupi 2 (Placebo).
Sl. 32. Procenat pacijenata sa izuzetkom simptoma ARVI (klinički dijagnostikovan, uključujući PCR potvrđen). Podaci PP analize.
Primer 1.
[0057] Antituberkulozna aktivnost leka za koje se traži zaštita protiv Mycobacterium tuberculosis indukovana kod zamoraca.
[0058] Cilj rada je da se ispita antituberkulotička aktivnost leka protiv Mycobacterium tuberculosis na modelu eksperimentalne tuberkuloze zamorca u poređenju sa antituberkuloznim sredstvom Isoniazid. Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance antitela na HLA-DRB1 (C12C150 vodeno-alkoholno razblaženje monoklonskih antitela na HLA-DRB1 u odnosu 2:3) i tehnologijom obrađeni proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance antitela na β2-MG (C12C150 vodeno razblaženje monoklonskih antitela na β2-MG u odnosu 2:3) u zapreminskom odnosu 1:2:
[0059] A) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance monoklonskih antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1) koji se dobija kombinovanjem dva različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora monoklonskih antitela na HLA-DRB1 u vodeno-alkoholnom rastvaraču (2.5 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanju u zapreminskom odnosu 2:3:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<150>puta što je ekvivalentno razblaženju C150, uz mućkanje svakog razblaženja.
[0060] B) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance monoklonskih antitela na β2-mikroglobulin (β2-MG) koji se dobija kombinovanjem dva različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora monoklonskih antitela na β2-MG u vodenom rastvaraču (1.0 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanju u zapreminskom odnosu 2:3:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<150>puta što je ekvivalentno razblaženju C150, uz mućkanje svakog razblaženja.
Eksperimentalne grupe:
[0061]
Grupa 1 - intaktna kontrola, neinficirane životinje (n=7);
Grupa 2 - negativna kontrola (inficirane netretirane životinje) (n=7);
Grupa 3 - životinje koje su primale placebo (prečišćenu vodu) oralno dva puta dnevno 5 dana pre infekcije i 6 dana nedeljno dva meseca nakon 2 nedelje infekcije u zapremini od 4 ml/kg (n=14);
Grupa 4 - životinje koje su primale placebo (prečišćenu vodu) oralno dva puta dnevno 5 dana pre infekcije i 6 dana nedeljno dva meseca posle 2 nedelje infekcije u zapremini od 4 ml/kg kao i izoniazid u dozi od 10 mg/ kg u zapremini 0.4 ml 6 dana nedeljno tokom dva meseca nakon 2 nedelje infekcije (n=14);
Grupa 5 - životinje koje su primale lek oralno dva puta dnevno tokom 5 dana pre infekcije i 6 dana nedeljno tokom dva meseca nakon 2 nedelje infekcije u zapremini od 4 ml/kg (n=14);
Dizajn studije:
[0062] Trajanje ove studije je 196 dana (6.5 meseci): septembar-decembar - tretman i praćenje oglednih životinja; Januar-mart - analiza uzoraka nekropsije mikrobiološkim i histološkim tehnikama. Fizički i vizuelni pregled, procena zdravlja i praćenje mortaliteta vršeni su svakodnevno pre hranjenja.
[0063] Ispitivani artikli su oralno primenjivani na zamorce preko šprica bez igle u ukupnoj zapremini od 8 ml/kg dva puta dnevno tokom 5 dana pre infekcije i 6 dana u nedelji (svakog dana osim nedelje) tokom 2 meseca nakon infekcije. Doza testova je prilagođavana jednom nedeljno na osnovu telesne težine životinje. Izoniazid suspendovan u vodi i skrobu je primenjivan na životinje u istim vremenskim intervalima po istom režimu kao i predmeti za ispitivanje. Doza izoniazida bila je 10 mg/kg telesne težine u 0.4 ml vodeno-skrobne suspenzije.
[0064] Smrtnost, telesna težina, rast M. tuberculosis u medijumima i histološke promene na organima životinja su procenjivani u svim grupama zamoraca tokom studije.
Rezultati studije:
[0065]
Tabela 1. Procena zahvatanja organa kod zamoraca.
Zaključak:
[0066] Na osnovu dobijenih rezultata studije, može se zaključiti da su grupa izoniazida i grupa leka za koji se traži zaštita pokazali jednake pozitivne terapeutske efekte. Histološkim pregledom životinjskih organa u obe grupe utvrđeni su znaci terapijskog patomorfizma. Navedeni lek je takođe pokazao efikasnost protiv plućnih infekcija.
Primer 2.
[0067] Antibakterijska aktivnost leka za koji se traži zaštita protiv Streptococcus pyogenes kod miševa sa i bez antibiotika.
[0068] Ovo je slepa placebo kontrolisana studija. Cilj studije je da se proceni efikasnost leka za koji se traži zaštita sa ili bez linezolida (sintetički antibiotik) ili telitromicina (ketolidni antibiotik) protiv Streptococcus pyogenes u modelu infekcije mekog tkiva kod neutropeničnih miševa. Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance antitela na HLA-DRB1 (C4D20 vodeno-alkoholno razblaženje monoklonskih antitela u odnosu 3:2, (2.5 mg/ml)) i tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance antitela na β2-MG (C10C150 vodeno-alkoholno razblaženje prirodnih antitela u odnosu 1:2, (2.5 mg/ml)) u zapreminskom odnosu 2: 3.
Eksperimentalne grupe:
[0069]
Grupa 1 - ženke miševa negativne kontrole bile su inficirane sa S. pyogenes i nisu primale lek ili antibiotik tokom perioda ispitivanja; n = 3;
Grupa 2 - ženke miševa su primale placebo (glicinski pufer) oralno svakog dana u zapremini od 20 ml/kg tokom 5 dana pre infekcije i na dan infekcije sa S. pyogenes; n = 6;
Grupa 3 - ženke miševa su primale placebo (glicinski pufer) oralno svakog dana u zapremini od 20 ml/kg tokom 5 dana pre infekcije i na dan infekcije sa S. pyogenes; u kombinaciji sa linezolidom (50 mg/kg) 2 i 14 sati nakon infekcije; n = 6;
Grupa 4 - ženke miševa su primale placebo (glicinski pufer) oralno svakog dana u zapremini od 20 ml/kg tokom 5 dana pre infekcije i na dan infekcije sa S. pyogenes; u kombinaciji sa telitromicinom (10 mg/kg) 2 i 14 sati nakon infekcije; n = 6.
Grupa 5 - ženke miševa su primale lek oralno svakog dana u količini od 20 ml/kg tokom 5 dana pre infekcije i na dan infekcije sa S. pyogenes; n = 6;
Grupa 6 - ženke miševa su primale lek oralno svakog dana u količini od 20 ml/kg tokom 5 dana pre infekcije i na dan infekcije sa S. pyogenes; u kombinaciji sa linezolidom (50 mg/kg) 2 i 14 sati nakon infekcije; n = 6;
Grupa 7 - ženke miševa su primale lek oralno svaki dan u količini od 20 ml/kg tokom 5 dana pre infekcije i na dan infekcije sa S. pyogenes; u kombinaciji sa telitromicinom (10 mg/kg) 2 i 14 sati nakon infekcije; n = 6;
Dizajn studije:
[0070] Trajanje studije je bilo 7 dana. Neutropenija je izazvana kod miševa sa dve intraperitonealne injekcije ciklofosfamida (150 mg/kg 4 dana pre infekcije i 100 mg/kg 1 dan pre infekcije). Imunokompromitovani miševi nisu primili nikakvu dalju supresiju imuniteta tokom studije.
[0071] Ispitni uzorci su davani oralno u dozi od 20 ml/kg tokom 5 dana pre infekcije i 2 i 14 sati nakon infekcije (dan infekcije). Na dan infekcije, miševi su inficirani sa S. pyogenes (ATCC BAA-2469) u dozi od 5.4 Ig CFU intramuskularnom injekcijom u butinu. Osim toga, 2 i 14 sati nakon infekcije, životinje su primale antibiotike - linezolid u dozi od 50 mg/kg i telitromicin u dozi od 10 mg/kg, na koje je S. pyogenes BAA-2469 osetljiv, odnosno otporan.
[0072] Preživljavanje životinja, klinički znaci infekcije i telesna težina su procenjivani u svim grupama miševa tokom studije.
Rezultati studije:
[0073] Dva sata nakon infekcije, femoralni mišići su sakupljeni od netretiranih miševa (Grupa 1) za analizu bakterijskog opterećenja (CFU/g, log10). U drugim grupama, femoralni mišići su sakupljeni 24 sata nakon infekcije da bi se procenilo bakterijsko opterećenje. Dobijeni podaci dati su u tabeli 2.
Tabela 2. Srednje bakterijsko opterećenje u femoralnom tkivu (CFU/g, log10)
Zaključak:
[0074] Statistički značajno smanjenje srednjeg bakterijskog opterećenja zabeleženo je za kombinaciju sa linezolidom u ispitivanim grupama (grupe 3 i 6) 24 sata nakon infekcije. Dakle, lek za koji se traži zaštita pokazuje efikasnost protiv muskuloskeletnih infekcija, a kada se primenjuje zajedno sa antibioticima, utvrđeno je da pojačava njihovu efikasnost.
Primer 3.
[0075] Efikasnost zahtevanog leka samog i u kombinaciji sa antibiotikom protiv E. coli u mišjem modelu infekcije urinarnog trakta.
[0076] Cilj studije je da se proceni efekat ispitivanog leka sa i bez antibiotika Norfloksacin na eksperimentalnom modelu infekcije E. coli kod miševa. Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 vodeno razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 1:1:1, (2.5 mg/ml)) i antitela do β2-MG (C12C30C50 vodeno razblaženje monoklonskih antitela u odnosu 1:1:1, (2.5 mg/ml)) u zapreminskom odnosu 1:1.
Eksperimentalne grupe:
[0077] Grupa 1 - mužjaci i ženke miševa (n=10) primali su lek za koji je tražena zaštita u dozi od 20 ml/kg svakog dana putem oralne sonde 5 dana pre infekcije i 7 dana nakon infekcije, kao i 1 sat nakon infekcije intraperitonealnim putem (zapremina 10 ml / kg).
[0078] Grupa 2 - mužjaci i ženke miševa (n=10) primali su lek za koji je tražena zaštita u dozi od 20 ml/kg svakog dana putem oralne sonde 5 dana pre infekcije i 7 dana nakon infekcije, kao i norfloksacin u dozi od 5 mg/kg (zapremina 10 ml / kg) intraperitonealnim putem 1 sat nakon infekcije.
[0079] Grupa 3 - kontrolni miševi oba pola (n=10) primali su glicinski pufer u dozi od 20 ml/kg svakog dana putem oralne sonde 5 dana pre infekcije i 7 dana nakon infekcije, kao i 1 sat nakon infekcije intraperitonealnim putem (zapremina 10 ml/kg).
[0080] Grupa 4 - mužjaci i ženke miševa (n=10) primali su glicinski pufer u dozi od 20 ml/kg svakog dana putem oralne sonde 5 dana pre infekcije i 7 dana nakon infekcije, kao i norfloksacin u dozi od 5 mg/kg (zapremina 10 ml/ kg) intraperitonealnim putem 1 sat nakon infekcije.
Dizajn studije:
[0081] Miševi su inficirani intrauretralnom inokulacijom E. coli UTI89 (2107 CFU/mišu) u bešiku (dan 0).
[0082] Jedan, tri i šest dana nakon infekcije, sakupljen je urin da bi se kvantitativno odredio CFU. Sedam dana nakon infekcije, 10 životinja iz svake grupe je žrtvovano, a bubrezi i bešike su sakupljeni za analizu bakterijskog opterećenja. Telesna težina je beležena svaka 2 dana tokom eksperimenta.
Rezultati studije:
[0083] Telesna težina je pokazala pozitivne promene u svim grupama, što ukazuje da su životinje dobro tolerisale test uzorke.
[0084] Težina bešike je bila značajno manja u grupi 2 (lek norfloksacin) u poređenju sa Grupom 4 (glicinski pufer norfloksacin). Ovo može sugerisati da navedeni lek u kombinaciji sa antibioticima može smanjiti oticanje bešike.
[0085] Navedeni lek u kombinaciji sa norfloksacinom (Grupa 2) značajno je smanjio bakterijsko opterećenje bešike. Dakle, ova kombinacija može imati potencijal kao terapijski režim (Sl.1, 2).
[0086] Nisu uočene statistički značajne razlike u težini bubrega između grupa.
[0087] Predloženi lek u kombinaciji sa norfloksacinom (Grupa 2) značajno je smanjio bakterijsko opterećenje bubrega u poređenju sa glicinskim puferom (Grupa 3). Dakle, ova kombinacija može imati potencijal kao terapijski režim (Sl.3, 4).
[0088] Od 3. dana, uzorak urina iz Grupe 2 (lek+norfloksacin) pokazao je smanjeno opterećenje bakterijama u poređenju sa Grupom 4 (glicinski pufer norfloksacin). Uzorak urina iz Grupe 3 (glicinski pufer) imao je veći broj CFU u svim vremenskim tačkama u poređenju sa Grupom 1 (lek) (Sl.5).
Zaključak:
[0089] Dakle, predmetni lek u kombinaciji sa antibiotikom Norfloksacinom ispoljava antibakterijska dejstva protiv E. coli u mišjem modelu infekcije urinarnog trakta.
Primer 4.
[0090] Antibakterijska aktivnost leka za koji se traži zaštita sa i bez antibiotika protiv Salmonella enteritidis rif 92 kod pilića.
[0091] Ovo je slepa placebo kontrolisana studija. Cilj studije je bio da se ispita efekat leka za koji se traži zaštita protiv Salmonella enteritidis rif92 kod pilića. Lek ovog pronalaska sadrži jednake količine dva tehnološki obrađena proizvoda koja su rezultat serijskih razblaženja (C12C30C50 razblaženja) osnovnih supstanci poliklonskih antitela afinitetno prečišćenih, tj.1) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti, klase II i ) antitela na β2-mikroglobulin molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I:
A) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance poliklonskih antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1) koji se dobija kombinovanjem tri različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora poliklonskih antitela na HLA-DRB1 u vodenom rastvaraču (2.5 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanja u odnosu 1:1:1:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<30>puta što je ekvivalentno razblaženju C30, uz mućkanje svakog razblaženja.
3) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<50>što je ekvivalentno C50 razblaženju, uz mućkanje svakog razblaženja.
B) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance poliklonskih antitela na β2-mikroglobulin (β2-MG) koji se dobija kombinovanjem tri različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora poliklonskih antitela na β2-MG u vodenom rastvaraču (2.5 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanju u zapreminskom odnosu 1:1:1:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<30>puta što je ekvivalentno razblaženju C30, uz mućkanje svakog razblaženja.
3) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<50>što je ekvivalentno C50 razblaženju, uz mućkanje svakog razblaženja.
Eksperimentalne grupe:
[0092] Grupa 1 - muški i ženski pilići (n=15) inficirani sa Salmonella enteritidis primali su lek ovog pronalaska intragastrično između 4. i 9. dana starosti u dozi od 0.2 ml/životinji/dan.
[0093] Grupa 2 - muški i ženski pilići (n=15) inficirani sa Salmonella enteritidis primali su lek iz ovog pronalaska intragastrično između 4. i 9. dana starosti u dozi od 0.2 ml/životinja/dan i ciprofloksacin (Ciprovet, OOO Research Innovation Center "Agrovetzashchita", antibiotik) intragastrično između 5. i 9. dana starosti u dozi od 0.5 mg/kg telesne težine (ED50). Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska i antibiotik su primenjivani u intervalu od jednog sata. Kako se telesna težina pilića povećavala svaki dan tokom studije, količina antibiotika je izračunata na dnevnoj bazi pre primene.
[0094] Grupa 3 - muški i ženski pilići (n=15) inficirani sa Salmonella enteritidis primali su placebo (prečišćenu vodu) intragastrično između 4. i 9. dana starosti u dozi od 0.2 ml/životinji/dan.
[0095] Grupa 4 - muški i ženski pilići (n=15) inficirani sa Salmonella enteritidis primali su placebo (prečišćenu vodu) intragastrično između 4. i 9. dana starosti u dozi od 0.2 ml/životinji/dan i ciprofloksacin intragastrično između 5. i 9. dana starosti u dozi od 0.5 mg/kg telesne težine (ED50). Test uzorak i antibiotik su primenjivani u intervalu od jednog sata.
[0096] Grupa 5 - intaktne kontrolne životinje - neinficirane i netretirane kokoške oba pola (n=15).
Dizajn studije:
[0097] Studija je trajala 12 dana (od 1. do 12. dana starosti). Pilići su bili u karantinu prva dva dana. Trećeg dana, sve ptice, sa izuzetkom pilića iz Grupe 5, inficirane su udvostručenom smrtonosnom dozom Salmonella enteritidis (serovar rif92, 2.5×10<9>CFU/g u zapremini od 0.5 ml/životinji) intraperitonealnim putem. Između 4. i 9. dana starosti, pilićima je davan ili navedeni lek ili prečišćena voda. Između 5. i 9. dana, pilići su primali Ciprovet (grupe 2 i 4).
[0098] Tokom studije su ispitivani sledeći parametri: stopa preživljavanja; telesna težina; efikasnost konverzije hrane (težina unesene hrane do kraja eksperimenta normalizovana na težinu koju je životinja dobila); i prisustvo i koncentracija S. enteritidis rif92 u gastrointestinalnom traktu i jetri pilića.
Statistička analiza:
[0099] Statistička analiza dobijenih podataka obavljena je korišćenjem dvosmernih generalizovanih linearnih modela (za procentualne vrednosti korišćena je gama raspodela sa podacima normalizovanim za 100 i log transformacija za ostale parametre) u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom i Kruskal-Wallis testom u kombinaciji sa post-hoc Wilcoxon testom. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0100] Prema dobijenim rezultatima, stopa preživljavanja u svim eksperimentalnim grupama bila je 100%. Maksimalna živa težina na kraju ispitivanja zabeležena je kod brojlera koji su primali navedeni lek (Grupa 1), premašivši onu u odgovarajućoj placebo grupi (Grupa 3) i intaktnoj grupi (Grupa 5) za 33.9 g i 38.7 g, respektivno. Efikasnost konverzije hrane bila je slična između grupa. Osnovni parametri hematološkog pregleda nisu pokazali nikakvu razliku između grupa.
[0101] Zbirni podaci o broju salmonele u jetri i sadržaju creva po grupi na kraju eksperimenata dati su u tabeli 3.
Tabela 3. Prisustvo salmonele nakon klanja i indeks antibakterijske aktivnosti (AAI)
[0102] Indeks antibakterijske aktivnosti (AAI) izračunat je pomoću formule: , gde je Bc - broj bakterijskih ćelija u homogenizovanim organima u kontrolnoj grupi do kraja perioda praćenja; Bt - broj bakterijskih ćelija u homogenizovanim organima u test grupi do kraja perioda praćenja [Okhapkina V.Y., Pyatkova N.V., Fedotov A.K. Express efficacy assessment method for antibacterial agents in experimental brucellosis // Challenges of Highly Infectious Diseases, 2016; 2:79-82.].
[0103] Prema podacima iz tabele 1, najmanji broj salmonele u jetri zabeležen je u grupi 2 i grupi 4, dok je najveći broj salmonele zabeležen u grupi 3. U međuvremenu, AAI za lek ovog pronalaska (Grupa 1) (10.6) značajno premašio onu za kombinaciju sa antibiotikom (3.6). U Grupi 1 i 2, opterećenje bakterijama u jetri je bilo 10.6 odnosno 3.5 puta manje nego u Grupi 3 i Grupi 4, respektivno, što ukazuje na prisustvo zaštitnog dejstva leka na jetru u smislu broja ćelija salmonele.
Zaključak:
[0104]
1. Predmetni lek je pokazao efikasnost (antibakterijsko dejstvo) koju karakteriše smanjenje broja obolelih pilića za 33.4% u poređenju sa placebo grupom i 10.6 puta smanjenje bakterijskog opterećenja jetre u grupi leka u odnosu na placebo grupu. Ovo ukazuje na prisustvo zaštitnih efekata leka na jetru u smislu broja ćelija salmonele. Navedeni lek je takođe efikasan protiv crevnih infekcija.
2. Lek primenjen zajedno sa antibiotikom na ED50 pilićima je poboljšao efikasnost poslednjeg, pošto je primećeno smanjenje bakterijskog opterećenja u gastrointestinalnom traktu pri klanju u poređenju sa grupom koja je uzimala lek i placebo grupom. Tako je potvrđeno da efikasna doza antibiotika može biti smanjena kada se istovremeno primenjuje sa navedenim lekom.
Primer 5.
[0105] Antibakterijska aktivnost leka za koji se traži zaštita sa i bez antibiotika protiv Escherichia coli CN 160 kod miševa.
[0106] Ovo je slepa placebo kontrolisana studija. Cilj rada je da se proceni farmakološki efekat ispitivanog leka u kombinaciji sa terapijom enrofloksacinom (Baytril, Bayer) kod eksperimentalne infekcije izazvane E. coli CN 160 kod miševa. Lek ovog pronalaska sadrži jednake količine dva tehnološki obrađena proizvoda koji su rezultat serijskih razblaženja (C12C30C50 razblaženja) osnovnih supstanci poliklonskih antitela prečišćenih afinitetom, tj.
1) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti, klase II (2.5). mg/ml) i 2) antitela na β2-mikroglobulin molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I (2.5 mg/ml).
Eksperimentalne grupe:
[0107] Grupa 1 - mužjaci i ženke miševa (n=10) primali su navedeni lek oralno jednom dnevno 5 dana pre infekcije, 1 sat nakon infekcije i narednih 14 dana u dozi od 10 ml/kg/dan.
[0108] Grupa 2 - kontrolni miševi oba pola (n=10) primali su placebo (prečišćenu vodu) oralno jednom dnevno 5 dana pre infekcije, 1 sat nakon infekcije i narednih 14 dana u dozi od 10 ml/kg/dan.
[0109] Grupa 3 - mužjaci i ženke miševa (n=10) primali su Baytril (antibakterijsko sredstvo) intramuskularnom injekcijom u dozi od 1.38 mg/kg 3 dana pre infekcije i 3 dana nakon infekcije.
[0110] Grupa 4 - mužjaci i ženke miševa (n=10) primali su navedeni lek oralno jednom dnevno 5 dana pre infekcije, 1 sat nakon infekcije i narednih 14 dana u dozi od 10 ml/kg/dan kao i Baytril (antibakterijski agens) koji se istovremeno daje intramuskularnom injekcijom u dozi od 1.38 mg/kg tokom 3 dana pre infekcije i 3 dana nakon infekcije.
Dizajn studije:
[0111] Ispitivani predmeti su davani oralno jednom dnevno tokom 5 dana pre infekcije E. coli, 1 sat nakon infekcije (6. dan) i narednih 14 dana tokom perioda praćenja (ukupno 20 dana). Dana 6, miševi su inficirani jednom intraperitonealnom injekcijom u dozi od 2 LD100 koja je unapred određena u preliminarnoj studiji (LD100=7.3×10<8>CFU/mišu). Antibakterijsko sredstvo Baytril je primenjivan intramuskularnom injekcijom 3 dana pre infekcije i 3 dana nakon infekcije (ukupno 6 dana) pri unapred određenom EF50, odnosno 1.38 mg/kg.
[0112] Stope mortaliteta su procenjene u svim grupama miševa tokom studije.
Statistička analiza:
[0113] Statistička analiza nalaza je obavljena korišćenjem Kaplan Meier krivih praćenih parnim upoređivanjem log-rank testova. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0114] Sve životinje u svakoj grupi, sa izuzetkom miševa koji su primali kombinaciju navedenog leka i Baytril (Grupa 4), umrle su u roku od četiri dana nakon infekcije smrtonosnom dozom Escherichia coli (Sl. 6). Najveće stope mortaliteta (70-80%) zabeležene su u prva dva dana nakon infekcije.
Zaključak:
[0115] Upotreba zahtevanog leka u kombinaciji sa Baytril pri ED50 kod miševa inficiranih sa 2LD100 E. coli CN 160 sprečila je smrt 50% životinja, što ukazuje na značajno antibakterijsko dejstvo ove kombinacije protiv udvostručene smrtonosne doze E. coli CN- 160. Prema tome, u ovoj studiji, utvrđeno je da istovremena primena leka ovog pronalaska i antibiotika za koje se traži zaštita pojačava farmakološko dejstvo antibiotika. Osim toga, pokazalo se da ova kombinacija smanjuje efikasnu dozu antibiotika.
[0116] Takođe je utvrđeno da je lek za koji se traži zaštita je efikasan protiv sistemskih infekcija, uključujući sepsu.
Primer 6.
[0117] Efikasnost leka protiv infekcije miševa sojem Klebsiella pneumoniae BAA-1705 otpornim na amoksicilin/klavulansku kiselinu.
[0118] Cilj studije je da se ispita antibakterijsko dejstvo leka za koji se traži zaštita u kombinaciji sa amoksicilinom+klavulanskom kiselinom (AMC) protiv soja Klebsiella pneumoniae otpornog na AMC. Lek ovog pronalaska sadrži jednake količine dva tehnološki obrađena proizvoda koji su rezultat serijskih razblaženja (C12C30C50 razblaženja) osnovnih supstanci poliklonskih antitela prečišćenih afinitetom, tj. 1) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (2.5). mg/ml) i 2) antitela na β2-mikroglobulin molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I (2.5 mg/ml).
[0119] Studija br.1.
Eksperimentalne grupe:
[0120]
Grupa 1 - mužjaci miševa primali su navedeni lek AMC kombinaciju intragastrično u dozi od 25 mg/kg u 10 ml/kg 0.9% NaCl 5 dana pre i 1 sat posle infekcije u dozi od 10 ml/kg/dan (n =15);
Grupa 2 - kontrolni mužjaci miševa primali su prečišćenu vodu intragastrično 5 dana pre i 1 sat posle infekcije u dozi od 10 ml/kg/dan (n=15);
Grupa 3 - mužjaci miševa primali su prečišćenu vodu AMC kombinaciju intragastrično u dozi od 25 mg/kg u 10 ml/kg 0.9% NaCl 5 dana pre i 1 sat posle infekcije u dozi od 10 ml/kg/dan (n =15);
Grupa 4 - mužjaci miševa su primili AMC intraperitonealnim putem 1 sat nakon infekcije u dozi od 25 mg/kg u 10 ml/kg 0.9% NaCl (n=15);
Grupa 5 - pozitivna kontrola mužjaka miševa primala je gentamicin (Sigma) intraperitonealnim putem u dozi od 15 mg/kg u 10 ml/kg 0.9% NaCl (n=15).
Dizajn studije:
[0121]
Postavljen je model bakterijske pneumonije kod neutropeničnih miševa. Pneumonija je izazvana intranazalnim davanjem Klebsiella pneumoniae (BAA-1705 soj sa otpornošću na AMC, 10<6>CFU/mišu). Da bi se izazvala neutropenija, miševi su primili ciklofosfamid četiri dana (dan -4) i jedan dan (dan -1) pre infekcije intraperitonealnim putem u dozi od 150 mg/kg, odnosno 100 mg/kg.
Procenjeno je opterećenje bakterijama u plućima i telesna težina kao parametar opšteg zdravlja. Preživljavanje je zabeleženo dva puta dnevno.
Statistička analiza podataka obavljena je korišćenjem Kruskal-Wallis testa u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom i Kaplan Meier krivama, praćeno parnim upoređivanjem log-rank testova. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0122] Nijedan od testova nije uticao na težinu pluća inficiranih životinja i broj CFU. Gubitak telesne težine izazvan infekcijom primećen je u svim test grupama (Sl. 7). U Grupi 5 (gentamicin) i Grupi 1 (AMC+ lek), evolucija telesne težine je primećena od 54 h perioda praćenja.
[0123] Stope mortaliteta u svim grupama su zabeležene u periodu od 48h-54h perioda praćenja (Sl. 8). Sve životinje u kontrolnoj grupi i AMC+kontrolnoj grupi su uginule, što je potvrdilo rezistenciju Klebsiella pneumoniae (BAA-1705) na antibiotik. Tretman gentamicinom i AMC+ lekovima je poboljšao preživljavanje miševa, 70% i 50% životinja je preživelo, shodno tome.
Zaključak:
[0124] Dakle, studija je pokazala značajne antibakterijske efekte navedenog leka u kombinaciji sa AMC protiv soja Klebsiella pneumoniae sa otpornošću na AMC. Ovaj efekat je bio uporediv sa efektom komparativnog gentamicina, na koji je soj otporan.
Studija br.2.
Eksperimentalne grupe:
Grupa 1 - mužjaci miševa primali su navedeni lek intragastrično u dozi od 20 ml/kg/dan 5 dana pre i 2 dana posle infekcije (n=5) kao i AMC u dozi od 25 mg/kg u 10 ml/ kg 0.9% NaCl intraperitonealnim putem 1 sat nakon infekcije;
Grupa 2 - kontrolni muški miševi primali su prečišćenu vodu intragastrično u dozi od 20 ml/kg/dan 5 dana pre i 2 dana posle infekcije (n=5), kao i AMC u dozi od 25 mg/kg u 10 ml/ kg 0.9% NaCl intraperitonealnim putem 1 sat nakon infekcije.
Dizajn studije:
[0126] Model bakterijske pneumonije je postavljen kod životinja primenom Klebsiella pneumoniae (BAA-1705 soj sa AMC rezistencijom, 10<7>CFU/mišu). Četrdeset osam sati nakon infekcije plućna tkiva miševa obe grupe su homogenizovana i korišćena za pripremu 1×10<4>CFU/ml Klebsiella pneumoniae. Bakterije (5×10<4>CFU/bunariću) su zatim inkubirane sa 2.5-1080 µg/ml AMC tokom 24 sata na 37°C. Na kraju eksperimenta, 50% inhibitorna koncentracija AMC (IC50) je procenjena spektrofotometrijom za svaku grupu, kao i vrednosti za 100% inhibiciju rasta bakterija, kada je izložen AMC na 1080 µg/ml. Eksperiment je izveden u duplikatu. Dodatni eksperiment je sproveden da bi se procenili efekti AMC IC50 na intaktne bakterije (pogledajte sliku 9).
[0127] Statistička analiza dobijenih podataka obavljena je korišćenjem jednosmerne i dvosmerne ANOVA praćene parovima poređenja log-rank testova. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0128] AMC je pokazao 100% inhibitornu koncentraciju od 1080 µg/ml potvrđujući rezistenciju Klebsiella pneumoniae (BAA-1705) na AMC. U in vitro studiji, istovremena primena navedenog leka i AMC smanjila je AMC IC50 za 27%, odnosno primenjena terapija je smanjila koncentraciju AMC koja je izazvala 50% inhibiciju rasta bakterija. Analiza efekata test kombinacije na fiksnu koncentraciju AMC od 1080 µg/ml (100% koncentracije inhibicije rasta) pokazala je slične rezultate, odnosno maksimalni inhibitorni efekat AMC je povećan za 26% (Sl.9).
Zaključak:
[0129] Dakle, studija je pokazala značajno antibakterijsko dejstvo navedenog leka i kombinacije AMC protiv soja Klebsiella pneumoniae otpornog na AMC, što je rezultiralo smanjenom otpornošću bakterija na AMC. Pokazalo se da je lek za koji se traži zaštita je efikasan protiv infekcije pluća.
Primer 7.
[0130] Anti-inflamatorna aktivnost leka za koji se zaštita traži u modelu zapaljenja indukovanog karagenanom kod pacova.
[0131] Cilj studije je da se proceni antiinflamatorna aktivnost leka za koji se traži zaštita u modelu inflamacije izazvane karagenanom kod pacova u poređenju sa antiinflamatornim lekom Indometacin (Sigma). Lek ovog pronalaska sadrži jednake količine dva tehnološki obrađena proizvoda koji su rezultat serijskih razblaženja (C12C30C50 razblaženja) osnovnih supstanci poliklonskih antitela prečišćenih afinitetom, tj. 1) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (2.5 mg/ml) i 2) antitela na β2-mikroglobulin molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I (2.5 mg/ml).
Eksperimentalne grupe:
[0132]
Grupa 1 - mužjaci pacova su primali navedeni lek intragastrično u dozi od 7.5 ml/kg/dan pet dana pre indukcije inflamacije (poslednja primena -1 h pre indukcije) (n=10);
Grupa 2 - kontrolni mužjaci pacova primali su prečišćenu vodu intragastrično u dozi od 7.5 ml/kg/dan pet dana pre indukcije upale (poslednja primena -1 h pre indukcije) (n=10);
Grupa 3 - pozitivna kontrola mužjaci pacova primali su indometacin intragastrično u dozi od 10 mg/kg (u 7.5 ml/kg/dan prečišćene vode.
Dizajn studije:
[0133] Inflamatorni odgovor je kod životinja izazvan subplantarnom injekcijom (u plantarnu aponeurozu leve zadnje šape) 0.1 ml 1% rastvora karagenana.
[0134] Ozbiljnost inflamatornog odgovora je procenjena procenom povećanja telesne težine edema u mg izračunato kao razlika između težine šape sa i bez edema.
[0135] Statistička analiza nalaza je sprovedena korišćenjem Kruskal-Wallis testa u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0136] Navedeni lek je smanjio težinu edema za 39.1% u odnosu na kontrolu, dok je indometacin za 57.9% (Sl.10).
Zaključak:
[0137] Dakle, predmetni lek, koji je kompozicija tehnološki obrađenog proizvoda koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance antitela na HLA DRB1 i tehnološki obrađenog proizvoda koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance antitela na β2-MG, pokazao je izražene antiinflamatorne efekte u modelu inflamacije izazvane karagenanom kod pacova smanjenjem težine edema šape.
Primer 8.
[0138] Antibakterijska aktivnost leka za koji se traži zaštita protiv sojeva Salmonella enterica otpornih na streptomicin ili nalidiksičnu kiselinu (JB271 i JB285, respektivno).
[0139] Ovo je slepa placebo kontrolisana studija. Cilj studije je da se proceni efekat leka za koji se traži zaštita na indeks rezistencije na antibiotike kod eksperimentalnog peritonitisa (sepse) kod miševa izazvanog Salmonella enterica serovar Typhimurium LT-2. Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela (2 mg/ml) u odnosu 2:1:3) i antitela na β2 -MG (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela (2 mg/ml) u odnosu 2:1:3) u zapreminskom odnosu 1:1.
Eksperimentalne grupe:
[0140] Grupa 1 - ženke BALB/c miševa (n=12) primale su placebo (prečišćenu vodu) oralno 1, 4 i 8 sati nakon infekcije Salmonella enterica (1:1 kombinacija Salmonella enterica Typhimurium LT-2 osetljive na streptomicin 1:1 (JB270). soj) i Salmonella enterica Typhimurium LT-2 otporna na streptomicin (soj JB271), intraperitonealnim putem pri 5.0 log10 CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0141] Grupa 2 - ženke BALB/c miševa (n=12) primale su navedeni lek oralno 1, 4 i 8 sati nakon infekcije Salmonella enterica (kombinacija Salmonella enterica Typhimurium LT-2 osetljive na streptomicin 1:1 (soj JB270) u odnosu 1:1) i na streptomicin rezistentnu Salmonella enterica Typhimurium LT-2 (soj JB271), intraperitonealnim putem pri 5.0 log10 CFU/životinja). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0142] Grupa 3 - ženke BALB/c miševa (n=12) inficirane Salmonella enterica (1:1 kombinacija Salmonella enterica Typhimurium LT-2 osetljive na streptomicin (soj JB270) i Salmonella enterica Typhimurium LT-2 otporne na streptomicin (soj JB271), intraperitonealnim putem pri 5.0 log10 CFU/životinja) kao miševi iz Grupe 1 i Grupe 2, koji nisu primili nikakva sredstva (netretirane životinje).
[0143] Grupa 4 - ženke BALB/c miševa (n=12) primale su placebo (prečišćenu vodu) oralno 1, 4 i 8 sati nakon infekcije Salmonella enterica (1:1 kombinacija Salmonella enterica Typhimurium LT-2 osetljive na nalidiksičnu kiselinu (JB270 soj) i Salmonella enterica Typhimurium LT-2 (soj JB285) otporne na nalidiksičnu kiselinu, intraperitonealnim putem pri 5.0 log10 CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0144] Grupa 5 - ženke BALB/c miševa (n=12) su primile navedeni lek oralno 1, 4 i 8 sati nakon infekcije sa Salmonella enterica (1:1 kombinacija Salmonella enterica Typhimurium LT-2 osetljive na nalidiksičnu kiselinu (soj JB270) i Salmonella enterica Typhimurium LT-2 otporna na nalidiksičnu kiselinu (soj JB285), intraperitonealnim putem pri 5.0 log10 CFU/životinja). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0145] Grupa 6 - ženke BALB/c miševa /c (n=12) inficirane sa Salmonella enterica (1:1 kombinacija Salmonella enterica Typhimurium LT-2 osetljive na nalidiksičnu kiselinu (soj JB270) i Salmonella enterica Typhimurium LT- rezistentne na nalidiksičnu kiselinu 2 (JB285 soj), intraperitonealnim putem pri 5.0 log10 CFU/životinji) kao miševi iz Grupe 4 i Grupe 5, koji nisu primili nikakve agense (netretirane životinje).
Dizajn studije:
[0146] Trajanje studije je bilo 5 dana. Peritonitis (sepsa) je indukovan kod miševa intraperitonealnom injekcijom Salmonella enterica ili osetljive ili otporne na streptomicin i nalidiksičnu kiselinu u dozi od 5.0 log10 CFU/životinji u odnosu 1:1, tj. JB270 JB271 [Strep<R>] u odnosu 1:1 ili JB270 JB285 [Nal<R>] u odnosu 1:1, respektivno).
[0147] Test uzorci su primenjivani oralno u dozi od 10 ml/kg 1, 4 i 8 sati nakon infekcije.
[0148] Dana 2, 3 i 4 nakon infekcije, 4 miša po grupi su eutanazirana dislokacijom vrata i sakupljene su im slezine. Sakupljeni organi su homogenizovani i serijski razblaženi. Količina od 20 µl rezultujućih decimalnih razblaženja je zatim postavljena u tri primerka na LB agar ploče sa bilo kojim od antibiotika (streptomicin u dozi od 50 µg/ml ili nalidiksična kiselina u dozi od 30 µg/ml).
[0149] Nakon 24 sata, izbrojan je broj jedinica koje formiraju kolonije (CFU) po razblaženju i indeks osetljivosti-otpornosti po gramu tkiva slezine za JB270 / JB271 [Strep<R>] ili JB270 / JB285 [Nal<R>] je izračunat za svakog miša.
[0150] Statistička analiza nalaza je sprovedena korišćenjem dvosmerne ponovljene mere ANOVA u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p < 0.05.
Rezultati studije:
[0151] Eksperiment sa Salmonella enterica otpornom na streptomicin (JB271 [Strep<R>]) i sojem JB270 osetljivim na streptomicin u odnosu 1:1 pokazao je da odsustvo tretmana (Grupa 3) nije promenilo broj CFU za svaki soj tokom eksperimenta. Primena placeba (prečišćena voda, grupa 1) dala je slične rezultate. Međutim, u Grupi 2 (miševi koji su primali test lek), utvrđeno je da se broj CFU soja otpornog na streptomicin smanjuje iz dana u dan tokom studije. Dana 4 i 5, JB270 / JB271 [Strep<R>] je premašio i početne vrednosti u ovoj grupi (za 66.7% i 63.6%, respektivno) i vrednosti u kontrolnim grupama. U poređenju sa grupom 1 (placebo), utvrđeno je da se vrednosti povećavaju na sledeći način: 75% i 72.7% 2. dana, 75% i 72.7% 3. dana, 66.7% i 63.6% 4. dana i 58.3% i 54.5% na dan 5 studije. U poređenju sa grupom 3 (netretirane životinje), utvrđeno je povećanje vrednosti na sledeći način: 75% i 72.7% na dan 2, 83.3% i 81.8% na dan 3 i 58.3% i 54.5% na dan 4 i 5 studije (Sl.11).
[0152] Eksperiment sa Salmonella enterica otpornom na nalidiksičnu kiselinu (JB285 [Nal<R>]) i soj JB270 osetljiv na nalidiksičnu kiselinu u 1:1 pokazao je da odsustvo tretmana (Grupa 6) nije značajno uticalo na CFU broj za svaki soj tokom eksperimenta. Primena placeba (prečišćena voda, grupa 4) dala je slične rezultate. Međutim, u Grupi 5 (miševi koji su primali test lek), CFU broj soja otpornog na nalidiksičnu kiselinu pokazao je progresivni pad od 2. dana nakon infekcije (3. dan studije). Do kraja studije, uočeni efekti su dostigli statistički značaj: JB270 / JB285 [Nal<R>] je premašio vrednosti dobijene u ovoj grupi za 50% trećeg dana studije. Osim toga, rezultat dobijen u Grupi 5, 5. dana studije takođe se značajno razlikovao od rezultata u obe kontrolne grupe tokom perioda ispitivanja. U poređenju sa Grupom 4 (placebo), utvrđeno je da se vrednosti povećavaju na 70-90%, dok je razlika u grupi 6 (netretirane životinje) varirala između 30 i 80% (Sl.12).
Zaključak:
[0153] Tako je studija pokazala izraženo antibakterijsko dejstvo navedenog leka protiv Salmonella enterica što je rezultiralo značajno smanjenom rezistencijom bakterija na ispitivane antibiotike - streptomicin i nalidiksičnu kiselinu (tj. smanjenje broja CFU za JB271 [Strep<R>] i JB285 [Nal<R>]).
Primer 9.
[0154] Efikasnost leka kod miševa inficiranih sa Clostridium perfringens (ATCC 13124).
[0155] Ovo je slepa, placebom kontrolisana, komparativna studija. Cilj studije je da se proceni antibakterijski efekat navedenog leka u eksperimentalnoj infekciji miševa bakterijama koje stvaraju gas Clostridium perfringens. Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 (C12D50D200 razblaženje monoklonskih antitela (1.5 mg/ml) u odnosu 1:2:3) i antitela na β2 -MG (C10D30D150 razblaženje poliklonskih antitela (1.5 mg/ml) u odnosu 2:1:3) u zapreminskom odnosu 2:1.
Eksperimentalne grupe:
[0156] Grupa 1 - ženke outbred švajcarskih miševa (n=20) primale su placebo (prečišćenu vodu) oralno 5 dana pre infekcije i 2 i 8 sati nakon infekcije sa Clostridium perfringens, ATCC 13124 (intraperitonealnim putem, 10<10>CFU/životinja). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0157] Grupa 2 - ženke outbred švajcarskih miševa Webster (n=20) primale su navedeni lek oralno 5 dana pre infekcije i 2 i 8 sati nakon infekcije sa Clostridium perfringens, ATCC 13124 (intraperitonealnim putem, 10<10>CFU/životinja). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0158] Grupa 3 - ženke outbred švajcarskih miševa (n=20) primale su tetraciklin intraperitonealnim putem u dozi od 21 mg/kg 30 minuta, kao i 4 i 8 sati nakon infekcije sa Clostridium perfringens, ATCC 13124 (intraperitonealnim putem, 10<10>CFU/životinja).
[0159] Grupa 4 - ženke outbred švajcarskih miševa (n=20) primale su cefoksicin intraperitonealnim putem u dozi od 160 mg/kg 30 minuta, kao i 4 i 8 sati nakon infekcije sa Clostridium perfringens, ATCC 13124 (intraperitonealnim putem, 10<10>CFU/životinja).
[0160] Grupa 5 - ženke outbred švajcarskih miševa (n=20) primale su dejonizovanu vodu intraperitonealnim putem u zapremini od 0.1 ml/kg 30 minuta, kao i 4 i 8 sati nakon infekcije Clostridium perfringens, ATCC 13124 (intraperitonealnim putem, 10<10>CFU/životinja).
Dizajn studije:
[0161] Trajanje studije je bilo 8 dana. Eksperimentalna infekcija kod miševa je izazvana intraperitonealnom injekcijom Clostridium perfringens (ATCC 13124) u dozi od 10<10>CFU/životinji.
[0162] Test uzorci su primenjivani oralno u dozi od 10 ml/kg 5 dana pre infekcije i 2 i 8 sati nakon infekcije. Komparativni lekovi - cefoksitin u dozi od 21 mg/kg i tetraciklin u dozi od 160 mg/kg - i njihova kontrola (dejonizovana voda, 0.1 ml/kg) injektirani su intraperitonealnim putem 30 minuta, kao i 4 i 8 sati nakon infekcije.
[0163] Preživljavanje životinja je procenjeno za svaku grupu 12, 24, 48 i 72 sata nakon infekcije.
[0164] Statistička analiza nalaza je obavljena korišćenjem Kaplan Meierovih krivih praćenih parnim upoređivanjem log-rank testova. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p < 0.05.
Rezultati studije:
[0165] Najveće stope smrtnosti među inficiranim miševima primećene su u obe kontrolne grupe: 24 sata nakon inokulacije bakterija životinjama, samo 5% miševa je još uvek bilo živo u Grupi 1 (prečišćena voda) i 100% miševa je umrlo u Grupi 5 (dejonizovana voda). Terapeutska i preventivna primena navedenog leka (5 dana pre infekcije i 2 i 8 sati posle infekcije) značajno je povećala preživljavanje životinja. U ovoj grupi, 85% životinja je bilo živo 12 sati nakon infekcije; 55% - nakon 24 sata, i 40% - nakon 48 sati i nadalje. U ovoj grupi, 85% životinja je bilo živo 12 sati nakon infekcije; 55% - nakon 24 sata, i 40% - nakon 48 sati i nadalje. U grupama komparativnih lekova, odnosno tetraciklin i cefoksitin, broj preživelih životinja 12, 24, 48 i 72 sata nakon infekcije bio je 95%, 85%, 80%, 80% (nema uginuća na poslednjem merenju) i 65%, 55%, 15%, 15% (nema smrtnih slučajeva pri poslednjem merenju), respektivno. Treba napomenuti da su antibakterijska dejstva leka za koje se za koji se traži zaštita su bila značajno intenzivnija od onih dobijenih za grupu cefoksitina. Ipak, oba leka su pokazala nižu aktivnost u poređenju sa tetraciklinom (Sl.13).
Zaključak:
[0166] Dakle, studija je pokazala značajno antibakterijsko dejstvo leka za koji se traži zaštita protiv Clostridium perfringens (ATCC 13124) što je rezultiralo značajnim povećanjem stope preživljavanja u poređenju sa dve kontrolne grupe (Grupe 1 i 5) i lekom za poređenje cefoksitin.
Primer 10.
[0167] Antibakterijska aktivnost leka za koji se traži zaštita protiv Chlamidophila pneumonia, CM1 soja.
[0168] Ovo je slepa, placebom kontrolisana komparativna studija. Cilj rada je da se proceni imunotropni i antibakterijski efekat navedenog leka u eksperimentalnoj infekciji miševa sojem Chlamidophila pneumonia CM1 (model infekcije pluća). Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 (C20C50C200 razblaženje poliklonskih antitela (1.5 mg/ml) u odnosu 2:1:3) i antitela na β2 -MG (C20C50C200 razblaženje poliklonskih antitela (3 mg/ml) u odnosu 2:1:3) u zapreminskom odnosu 1:2.
Eksperimentalne grupe:
[0169] Grupa 1 - mužjaci miševa C57BL/6J (n=21) primali su placebo (prečišćenu vodu) oralno 3 dana pre infekcije i 2, 24, 48 i 72 sata nakon injekcije soja Chlamidophila pneumonia CM1 (intratrahealnim putem, 1.5*10<6>IFU/životinji (IFU - jedinice koje formiraju inkluziju)). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0170] Grupa 2 - mužjaci miševa C57BL/6J (n=21) primali su navedeni lek oralno 3 dana pre infekcije i 2, 24, 48 i 72 sata nakon injekcije soja Chlamidophila pneumonia CM1 (intratrahealnim putem, 1.5*10<6>IFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0171] Grupa 3 - mužjaci C57BL/6J miševa (n=21) primali su azitromicin subkutano u dozi od 10 mg/kg 30 minuta, a zatim na svaka 24 sata (2, 3. i 4. dan) nakon injekcije soja Chlamidophila pneumonia CM1 (intratrahealnim putem, 1.5*10<6>IFU/životinji).
[0172] Grupa 4 - intaktni mužjaci miševa C57BL/6J (n=5) [pozadinska kontrola za procenu nivoa citokina].
Dizajn studije:
[0173] Trajanje studije je bilo 15 dana. Model infektina pluća indukovan je kod miševa intratrahealnom primenom Chlamidophila pneumonia (CM1) u dozi od 1.5*10<6>IFU/mišu.
[0174] U grupama 1 i 2, test uzorci su davani oralno u dozi od 10 ml/kg tokom 3 dana pre infekcije i 2, 24, 48 i 72 sata nakon injekcije bakterije. Komparativni lek azitromicin (Grupa 3) primenjen je subkutano u dozi od 10 mg/kg 30 minuta nakon infekcije, a zatim na svaka 24 sata (dani 2, 3 i 4).
[0175] Preživljavanje životinja je procenjeno 3, 6 i 12 dana nakon infekcije. Istih dana, 4 miša iz svake od tri grupe, odnosno grupe 1-3, žrtvovana su dislokacijom grlića materice i sakupljena su im pluća. Sakupljeni organi su homogenizovani i dobijeni homogenat je korišćen za merenje bakterijskog opterećenja Chlamidophila pneumonia (CM1) i nivoa citokina - IL-1β, IL-6 i TNF-α.
[0176] Intaktne životinje čiji su biouzorci (homogenat plućnog tkiva) korišćeni za merenje nivoa citokina da bi se dobile osnovne vrednosti žrtvovane su 3. dana nakon infekcije miševa iz grupa 1-3.
[0177] Da bi se procenilo opterećenje bakterijama, 20 µl uzoraka plućnog homogenata je postavljeno u tri primerka na medijum RPMI1640 koji sadrži 1 mg/ml cikloheksimida i HEp2 ćelije i inkubirani 72 sata. Ćelije su zatim isprane sa PBS, blokirane metanolom i obojene monoklonskim antitelima konjugovanim sa FITC protiv antigena klamidije specifičnog za rod (Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation System; BIO-RAD, Hercules, SAD). Preparati su pregledani pomoću fluorescentnog mikroskopa i inficirane ćelije su izbrojane.
[0178] Nivoi citokina su mereni korišćenjem ELISA test sistema kompanije Bender MedSystems (SAD) prema uputstvima proizvođača.
[0179] Statistička analiza nalaza je obavljena korišćenjem Kruskal-Wallis testa u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom i Kaplan Meier krivama praćeno parnim upoređivanjem log-rank testova. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p < 0.05.
Rezultati studije:
[0180] Intaktna grupa pokazala je stopu preživljavanja životinja od 100%.
[0181] Najveća stopa smrtnosti inficiranih miševa zabeležena je u kontrolnoj grupi: 3. dana studije, 53% miševa u grupi 1 (prečišćena voda kao placebo) bilo je živo nakon inokulacije bakterija, 6. dana i nadalje, 24% miševa. Terapeutska i preventivna primena navedenog leka (Grupa 2) (3 dana pre infekcije i 2, 24, 48 i 72 sata nakon inokulacije bakterija) značajno je povećala preživljavanje životinja. Trećeg dana nakon infekcije, 72% životinja je preživelo u ovoj grupi, 6. dana pa nadalje 62% miševa. Najveća stopa preživljavanja (81%) zabeležena je kod životinja koje su primale komparativni lek azitromicin (Grupa 3): smrtni slučajevi su prvi put zabeleženi 3. dana nakon infekcije, sa stopom smrtnosti od 19% (Sl.14).
[0182] Bakterijsko opterećenje određeno iz broja inficiranih HEp2 ćelija nakon izlaganja homogenatu plućnog tkiva kod miševa inficiranih Chlamidophila pneumonia (CM1) pokazalo je da se parametar testa linearno smanjio kao odgovor na traženu terapiju lekovima u poređenju sa placebom: broj inficiranih ćelija u grupi 2 (lek) je 67%, 58% i 21%, 3., 6. i 12. dana nakon infekcije, respektivno. Za komparativni lek Azitromicin (Grupa 3) primećeno je izraženije smanjenje bakterijskog opterećenja: do 15%, 17% i 5%, 3., 6. i 12. dana nakon infekcije (Sl.
15).
[0183] Proučavanje imunotropne aktivnosti leka za koji se traži zaštita je pokazalo da su i nivoi IL-1β i IL-6 značajno i linearno smanjeni kao odgovor na terapijski i preventivni tok leka (Grupa 2) u poređenju sa kontrolom. Dana 3, 6 i 12 nakon infekcije, koncentracija IL-1β je bila 55%, 21% i 20% kontrolnog nivoa (Grupa 1, prečišćena voda), a koncentracija IL6 je shodno tome bila 57%, 34% i 27%. U grupi 3 (komparativni lek azitromicin), nivoi oba interleukina su pokazali izraženiji linearni pad, slično vrednostima bakterijskog opterećenja (IL-1β: do 17%, 7% i 6% kontrolnih nivoa 3., 6. dana i 12 nakon infekcije, respektivno, IL-6: do 15%, 8% i 5%, respektivno) (Sl.16, Sl.17).
[0184] Nivoi TNF-α u plućnom tkivu miševa nisu pokazivali nikakve promene u svim grupama, što ukazuje na odsustvo promena u koncentraciji ovog citokina u indukovanom eksperimentalnom modelu infekcije pluća, te stoga nije primećen biološki značaj (Sl.18).
Zaključak:
[0185] Tako je studija na modelu infekcije pluća izazvane Chlamidophila pneumonia, soja CM1, pokazala izraženo i istovremeno antibakterijsko i imunotropno dejstvo navedenog leka.
Otkrivena aktivnost je dovela do više od 2.5 puta povećanja stope preživljavanja životinja do kraja studije, kao i do 79% opadanja bakterijskog opterećenja i nivoa proinflamatornih citokina (IL-1β za 80% i IL- 6 sa 73%) u plućima.
Primer 11.
[0186] Antibakterijska aktivnost leka za koji se traži zaštita protiv Klebsiella pneumoniae, 8637 soja.
[0187] Ovo je slepa, placebom kontrolisana, komparativna studija. Cilj studije je da se proceni antibakterijski efekat leka za koji se traži zaštita u eksperimentalnoj infekciji imunokompromitovanih miševa sojem Klebsiella pneumoniae 8637 (model neutropenične infekcije pluća). Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 (C30C200 razblaženje monoklonskih antitela (3 mg/ml) u odnosu 2:3) i antitela na β2-MG (C30C200 razblaženje poliklonskih antitela (3 mg/ml) u odnosu 3:1) u zapreminskom odnosu 1:1.
Eksperimentalne grupe:
[0188] Grupa 1 - ženke ICR miševa (n=20) primale su placebo (prečišćenu vodu) oralno 4, 6, 8, 24 i 48 sati nakon infekcije Klebsiella pneumoniae, 8637 soja (intranazalnim putem, 2*10<7>CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0189] Grupa 2 - ženke ICR miševa (n=20) primale su traženi lek oralno 4, 6, 8, 24 i 48 sati nakon infekcije Klebsiella pneumoniae, 8637 soja (intranazalnim putem, 2*10<7>CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0190] Grupa 3 - ženke ICR miševa ICR (n=20) primale su komparativni lek imipenem intraperitonealnim putem u dozi od 2 mg/kg 4, 24 i 48 sati nakon infekcije Klebsiella pneumoniae, 8637 soja (intranazalnim putem, 2*10<7>CFU/životinji).
Dizajn studije:
[0191] Trajanje studije je bilo 9 dana. Model plućne infekcije indukovan je kod imunokompromitovanih miševa intranazalnom inokulacijom Klebsiella pneumoniae (8637 soja) u dozi od 2*10<7>CFU/životinji. Da bi se izazvala neutropenija (imunosupresija), životinje su primale ciklofosfamid intraperitonealnim putem u dozi od 200 mg/kg 4 dana pre infekcije (dan -4).
[0192] U grupama 1 i 2, test uzorci su primenjivani oralno u dozi od 10 ml/kg kao terapijski režim, tj.4, 6, 8, 24 i 48 sati nakon inokulacije bakterija. Komparativni lek imipenem (Grupa 3) je primenjivan intraperitonealnim putem u dozi od 2 mg/kg 4, 24 i 48 sati nakon infekcije.
[0193] Preživljavanje životinja je procenjeno tokom 5 dana nakon infekcije Klebsiella pneumoniae (8637 soja). Po završetku eksperimenta, odnosno petog dana nakon infekcije, žrtvovano je 5 miševa po grupi i uklonjeni su im krv, pluća, jetra, slezina i bubrezi radi merenja broja CFU. Izolovani organi su homogenizovani i serijski razblaženi. 200 µl rezultujućih decimalnih razblaženja svih uzoraka tkiva postavljeno je u tri primerka na Mueller-Hinton agar i inkubirano 24 sata.
[0194] Statistička analiza nalaza je sprovedena korišćenjem jednosmerne ANOVA u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom kao i poređenjem krive preživljavanja korišćenjem logrank testa sa Benjamini-Hochberg korekcijom za višestruko testiranje. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p < 0.05.
Rezultati studije:
[0195] Najveća stopa smrtnosti inficiranih miševa zabeležena je u kontrolnoj grupi: 1. dana studije, 55% miševa u grupi 1 (prečišćena voda kao placebo) bilo je živo nakon inokulacije bakterija, 2. dana, 3. dana, 4. dana i dalje, 45%, 20% i 15% miševa, respektivno. Tretman navedenim lekom (Grupa 2) (4, 6, 8, 24 i 48 sati nakon inokulacije bakterija) značajno je povećao preživljavanje životinja. Prvog dana nakon infekcije, 85% životinja je preživelo u ovoj grupi, 2., 3., 4. dana i nadalje, 70%, 60% i 45% miševa, respektivno. Najveća stopa preživljavanja je primećena kod životinja koje su primale komparativni lek imipenem (Grupa 3): 85% 1. dana nakon infekcije, 70% 2. dana i 50% 3. dana i nadalje nakon infekcije (Sl.19).
[0196] Procena bakterijskog opterećenja u krvi, plućima, jetri, slezini i bubrezima imunokompromitovanih miševa inficiranih Klebsiella pneumoniae (8637 soja) pokazala je da se broj CFU smanjio u svim tkivima kao odgovor na traženu terapiju lekovima u poređenju sa kontrolom (placebo): za 68% u krvi, za 56% u plućima, za 36% u jetri, za 33% u slezini i za 44% u bubrezima. Za komparativni lek Imipenem (Grupa 3), primećeni su slični efekti: opterećenje bakterijama u krvi, plućima, jetri, slezini i bubrezima je smanjeno za 67%, 48%, 40%, 45% i 61%, respektivno (Sl.20).
Zaključak:
[0197] Tako je studija sprovedena na modelu infekcije pluća kod imunokompromitovanih miševa izazvanih primenom ciklofosfamida i Klebsiella pneumoniae (8637 soj) pokazala izražene antibakterijske efekte navedenog leka. Uočena aktivnost je dovela do povećanja stope preživljavanja za 30% do kraja studije u poređenju sa placebom, pri čemu je opterećenje bakterijama u krvi, plućima, jetri, slezini i bubrezima smanjeno za najmanje jednu trećinu.
Primer 12.
[0198] Antivirusni efekti leka za koje se za koji se traži zaštita na modelu smrtonosne infekcije gripa izazvane sojem gripa A/California/07/09(H1N1)pdm09 kod belih miševa.
[0199] Ovo je slepa placebo kontrolisana studija. Cilj studije je da se ispita antivirusna efikasnost leka za koji se traži zaštita u poređenju sa Tamifluom<™>(oseltamivir) u njegovoj efikasnoj dozi na soju gripa A/ California/07/09 (H1N1) pdm09 in vivo. Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci a) antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 razblaženje u odnosu 1:3:1), b) antitela na β2-mikroglobulin (razblaženje C12C30C50 u odnosu 1:3:1), c) antitela na interferon gama (razblaženje C12C30C50 u odnosu 1:3:1) i d) antitela na CD4 (razblaženje C12C30C50 u odnosu 1:3:1) u odnosu zapremine 1:1:1:1:
A) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance poliklonskih antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1) koji se dobija kombinovanjem tri različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora poliklonskih antitela na HLA-DRB1 u vodenom rastvaraču (2.5 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanju u odnosu 1:3:1:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<30>puta što je ekvivalentno razblaženju C30, uz mućkanje svakog razblaženja.
3) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<50>puta što je ekvivalentno razblaženju C50, uz mućkanje svakog razblaženja.
B) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance poliklonskih antitela na β2-mikroglobulin (β2-MG) koji se dobija kombinovanjem tri različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora poliklonskih antitela na β2-MG u vodenom rastvaraču (1.0 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanju u zapreminskom odnosu 1:3:1:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<30>puta što je ekvivalentno razblaženju C30, uz mućkanje svakog razblaženja.
3) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<50>puta što je ekvivalentno razblaženju C50, uz mućkanje svakog razblaženja.
C) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance poliklonskih antitela na interferon gama (IFN-γ) koji se dobija kombinovanjem tri različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora poliklonskih antitela na IFN-γ u vodenom rastvaraču (2.5 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanju u zapreminskom odnosu 1:3:1:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<30>puta što je ekvivalentno razblaženju C30, uz mućkanje svakog razblaženja.
3) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<50>puta što je ekvivalentno razblaženju C50, uz mućkanje svakog razblaženja.
D) tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovne supstance poliklonskih antitela na CD4 koji se dobija kombinovanjem tri različita uzastopna razblaženja osnovnog (matriksnog) rastvora poliklonskih antitela na CD4 u vodenom rastvaraču (1.0 mg/ml). Sledeća razblaženja su podvrgnuta mešanju u zapreminskom odnosu 1:3:1:
1) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<12>puta što je ekvivalentno razblaženju C12, uz mućkanje svakog razblaženja.
2) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<30>puta što je ekvivalentno razblaženju C30, uz mućkanje svakog razblaženja.
3) osnovni (matriksni) rastvor razblažen 100<50>puta što je ekvivalentno razblaženju C50, uz mućkanje svakog razblaženja.
Eksperimentalne grupe:
[0200]
Grupa 1 - životinje su primale placebo tokom eksperimenta (n=30) (negativna kontrola ('virusna kontrola'));
Grupa 2 - miševi su primili komparativni lek Tamiflu<™>(oseltamivir) 5 dana nakon infekcije, a zatim otvoreni placebo (n=30) (pozitivna kontrola-komparativni lek).
Grupa 3 - miševi su primali lek za koji je tražena zaštita tokom eksperimenta (n=30).
Grupa 4 - miševi su tokom eksperimenta dobijali aktivirano-potencirani oblik antitela na interferon gama (n=30).
Grupa 5 - miševi su tokom eksperimenta dobijali aktivirano-potencirani oblik antitela na CD4 (n=30).
Grupa 6 - miševi su tokom eksperimenta dobijali aktivirano-potencirani oblik antitela na HLA-DRB1 (n=30).
Grupa 7 - miševi su tokom eksperimenta dobijali aktivirano-potencirani oblik antitela na β2-mikroglobulin (n=30).
Dizajn studije:
[0201] Životinje su primale navedeni lek oralno svakog dana u količini od 0.4 ml/mišu dva puta dnevno, ujutru i uveče, u 10.00 i 17.00 časova. (0.8 ml/mišu/dan), 5 dana pre infekcije, 4 sata pre i 4 sata posle infekcije i 14 dana nakon infekcije do kraja eksperimenta (ukupno vreme primene testnih jedinica je 20 dana) ["Guidelines on non-clinical studies of pharmaceutical products" edited by A.N. Mironov (Moscow, 2012)].
[0202] Virus je inokulisan u životinje intranazalnim putem u zapremini od 0.05 ml/mišu (2.5×103 TCID50, 5 LD50) [He B, Fu Y, Xia S, et al. Intranasal application of polyethyleneimine suppresses influenza virus infection in mice. Emerging Microbes & Infections. 2016;5(4):e41-. doi:10.1038/emi.2016.64.].
[0203] Komparativni lek Tamiflu<™>(Oseltamivir) je primenjivan oralnom gavažom u dozi od 15 mg/kg u zapremini od 0.4 ml/mišu dva puta dnevno, u 10.00 i 17.00 časova. (30 mg/miš/dan) tokom 5 dana nakon infekcije, sa primenom započetom 1 sat pre infekcije [Oseltamivir in influenza A/H1N1 //Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005, 55, p.5-21]. U ovoj grupi, miševi su primali destilovanu vodu u zapremini od 0.4 ml/mišu dva puta dnevno (0.8 ml/mišu/dan) tokom 5 dana pre i 6-14 dana nakon infekcije do kraja perioda praćenja. Negativna kontrolna grupa je takođe primala placebo u dozi od 0.4 ml/mišu dva puta dnevno (0.8 ml/miš/dan) tokom perioda praćenja.
[0204] Svi miševi su ispitani na zootehničke parametre (živa težina, stopa preživljavanja, srednji očekivani životni vek (MLE), zaštitni indeks) i urađeno je virusološko testiranje.
Rezultati studije:
[0205] Neobrađeni podaci o aktivnosti leka za koje se za koji se traži zaštita pokazuju stope smrtnosti, srednji očekivani životni vek (MLE) i zaštitni indeks sumirani su u tabeli 1. Period praćenja je trajao 14 dana nakon infekcije životinja. Stope mortaliteta su beležene u kontrolnoj i testnoj grupi na dnevnom nivou. Na osnovu dobijenih podataka izračunati su sledeći parametri:
-stopa mortaliteta - broj mrtvih životinja tokom 14 dana prema ukupnom broju inficiranih životinja po grupi: M (% mortaliteta) = MINt;
indeks zaštite - razlika u stopama mortaliteta (%) između kontrolne i test grupe prema stopi mortaliteta (%) u kontrolnoj grupi: PI = ((Me - Me) / Me) × 100%;
srednji očekivani životni vek životinja tokom 14 dana perioda praćenja: MDD = (Σ N×D) / Nt; gde je M - broj mrtvih životinja tokom 14 dana po grupi; Me i Me - % mortaliteta u kontrolnoj (kontrola virusa) i test grupi; N - broj životinja koje su preživele D dana; Nt - ukupan broj inficiranih životinja po grupi.
Tabela 4.
[0206] Kao što se vidi iz dobijenih podataka, infekcija miševa gripom A/California/097/09 (H1N1)pdm09 je aktivirala patološki proces i rezultirala je 75% smrtnosti životinja u proseku 8.5 dana nakon infekcije. Primena navedenog leka smanjila je stopu mortaliteta na 25% (indeks zaštite 64.2%). Vrednost MLE u ovoj grupi bila je 8.9 dana.
[0207] Prilikom analize promena telesne mase samo su ispitivani podaci životinja koje su uključene u analizu mortaliteta (u toku 14 dana nakon infekcije).
Tabela 5. Telesne težine eksperimentalnih životinja izražene kao M ± SD.
[0208] Petog dana nakon infekcije životinja (n=10), određen je titar virusa u plućnom tkivu. Srednji infektivni titri virusa gripa u plućima životinja za svaku grupu dati su u tabeli 6.
Tabela 6.
[0209] Prema Uputstvu o nekliničkim studijama farmaceutskih proizvoda [Guidelines on nonclinical studies of pharmaceutical products / Ed. by A.N. Mironov. - Moscow: ZAO Grif and Co. - 2012. - Part 1. - 944 p.], smanjenje titra virusa za 1.75 lg i više u grupi tretiranih životinja ukazuje na inhibiciju njegove replikacije. U ovoj studiji, navedeni lek je smanjio titar virusa za 2.4 lgTCID50.
Zaključak:
[0210] Najveća aktivnost u smislu smanjenja mortaliteta zabeležena je za navedeni lek (PI=64.2), pri čemu je njegova kombinovana efikasnost veća od efikasnosti svake komponente pojedinačno. Osim toga, lek ovog pronalaska je pokazao izražene antivirusne efekte i smanjio titar virusa za 2-4 lgTCID50.
Primer 13.
[0211] Studija antimikrobne aktivnosti lekova 1 i 2 nakon uzastopne infekcije životinja virusom gripa A/New Jersey/8/76 (H1N1) i Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) in vivo.
[0212] Cilj studije je da se izvrši komparativna procena antimikrobnog delovanja lekova 1 i 2 protiv pneumokokne infekcije izazvane S. pneumoniae 7 dana nakon infekcije životinja virusom gripa A/New Jersey/8/76 (H1N1). Lek 1 je mešavina tri vodeno-alkoholna razblaženja antitela na humani IFN-γ, antitela na histamin i antitela na CD4 razblaženih 100<12>, 100<30>, 100<50>puta (Ergoferon). Lek 2 prema ovom pronalasku sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci a) antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela (2 mg/ml) u odnosu 1:1:1), b ) antitela na β2-mikroglobulin (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela (2 mg/ml) u odnosu 1:1:1), c) antitela na interferon gama (C12C30C50 razblaženje monoklonskih antitela (3 mg/ml) od 1:1:1) i g) antitela na CD4 (C12C30C50 razblaženje monoklonskih antitela (3 mg/ml) u odnosu 1:1:1) u zapreminskom odnosu 1:1:1:1.
Eksperimentalne grupe:
[0213]
Grupa 1 - ženke miševa su primale lek 1 intragastrično svakog dana u ukupnoj dozi od 20 ml/kg/dan (dva puta dnevno po približno 0.2 ml/mišu u intervalu od 2 sata) 5 dana pre virusne infekcije i 2 sata pre infekcije. Dan 0 (n=15);
Grupa 2 - ženke miševa su primale lek 2 za koji je tražena zaštita intragastrično svakog dana u ukupnoj dozi od 20 ml/kg/dan (dva puta dnevno po približno 0.2 ml/mišu u intervalu od 2 sata) 5 dana pre virusne infekcije i 2 sata pre infekcije na dan 0 (n=15);
Grupa 3 - kontrolne ženke miševa primale su prečišćenu vodu intragastrično svaki dan u ukupnoj dozi od 20 ml/kg/dan (dva puta dnevno po približno 0.2 ml/mišu u intervalu od 2 sata) 5 dana pre virusne infekcije i 2 sata pre infekcije na dan 0 (n=15);
Grupa 4 - netretirane kontrolne ženke miševa koje su inficirane sa A/New Jersey/8/76 (H1N1) i posle 7 dana sa S. pneumoniae. Ova kontrola može pokazati placebo efekat u grupi 2 (n=15); Grupa 5 - model kontrolnih ženki miševa koji su bili inficirani samo S. pneumoniae. Ova kontrola može pokazati efekte virusne pre-infekcije na ukupan broj CFU (n=15).
Dizajn studije:
[0214] Životinje su inficirane virusom gripa A/New Jersey/8/76 (H1N1) intranazalno u dozi od 1 × 10<6>TCID50/mišu i zatim inficiran sa S. pneumoniae na 1 × 10<6>CFU intratrahealnim putem 7. dana nakon virusne infekcije.24, 48 i 120 sati nakon inokulacije S. pneumoniae, 5 miševa po grupi je žrtvovano i njihova pluća su izolovana da bi se procenila koncentracija bakterija. Sakupljena pluća su homogenizovana u sterilnom fosfatnom puferu i serijski razblažena. Dobijena razblaženja su zatim stavljena na ploče sa čvrstim podlogama i izrasle kolonije su izbrojane. Dobijeni rezultati su izraženi kao CFU/g pluća.
Rezultati studije:
[0215] U ovoj studiji je ispitivana antimikrobna aktivnost lekova 1 i 2 protiv pneumokokne infekcije izazvane S. pneumoniae 7 dana nakon infekcije životinja virusom gripa A/New Jersey/8/76 (H1N1). Takođe je upoređena efikasnost leka 1 u odnosu na lek 2 u ovom eksperimentalnom modelu.
[0216] Dvadeset četiri sata nakon infekcije sa S. pneumoniae, najveći broj CFU za S. pneumoniae primećen je u netretiranim kontrolnim grupama (miševi uzastopno inficirani virusom gripa A/New Jersey/8/76 (H1N1) i S. pneumoniae, nelečene životinje) i kontrole (miševi uzastopno inficirani virusom influence A/New Jersey/8/76 (H1N1) i S. pneumoniae i tretirani prečišćenom vodom) (Sl. 21). Do tog vremenskog perioda, značajno smanjeno bakterijsko opterećenje pluća kod miševa inficiranih virusom i bakterijama je značajno smanjeno za 2 i 6 puta od leka 1 i leka 2 u poređenju sa kontrolom (Grupa 3), respektivno, pri čemu je lek 2 bio 3 puta efikasniji od leka 1.
[0217] Četrdeset osam sati nakon infekcije sa S. pneumoniae, najveći broj CFU za S. pneumoniae i dalje je primećen u netretiranoj kontrolnoj i kontrolnoj grupi. Međutim, apsolutni broj CFU u ovim grupama pokazao je pad više od 5 puta. Do tog trenutka, intenzitet antimikrobnih efekata leka 1 bio je dvostruko veći od kontrolnih vrednosti (grupe 3 i 4), dok je opterećenje plućnim bakterijama kod miševa koji su primali lek 2 (grupa 2) iznosilo 24.4% kontrolne vrednosti (Grupa 3) i 26.7% netretirane kontrolne vrednosti (Grupa 4). Nisu primećene statistički značajne razlike između grupe leka 1 i grupe leka 2.
[0218] 120 sati nakon infekcije miševa sa S. pneumoniae, izolovane CFU su primećene samo u svim grupama.
Zaključak:
[0219] Proučavanje antimikrobne aktivnosti lekova 1 i 2 pokazalo je da svaki od lekova ispoljava značajna antibakterijska dejstva. Komparativna analiza njihove specifične aktivnosti pokazala je da je lek za koji se traži zaštita ovog pronalaska (lek 2) imao izraženije efekte u poređenju sa lekom 1.
Primer 14.
[0220] Efikasnost navedenog leka kod eksperimentalne virusne/bakterijske pneumonije izazvane virusom gripa H1N1/A California 04/2009 i Staphylococcus aureus (soj 1986).
[0221] Cilj studije je da se ispita terapijska aktivnost leka za koje se za koji se traži zaštita kod eksperimentalne virusne/bakterijske pneumonije izazvane virusom gripa H1N1/A California 04/2009 i Staphylococcus aureus (soj 1986). Lek ovog pronalaska sadrži jednake količine četiri tehnološki obrađena proizvoda koji su rezultat serijskih razblaženja (C12C30C50 razblaženja) osnovnih supstanci poliklonskih antitela prečišćenih afinitetom, tj. 1) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1) (2.5 mg/ml), 2) antitela na β2-mikroglobulin molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I (2.5 mg/ml), 3) antitela na humani interferon gama (2.5 mg/ml) i 4) antitela na CD4 (2.5 mg/ml).
Eksperimentalne grupe:
[0222]
Grupa 1 - miševi su primali navedeni lek intragastrično 3 dana pre i 5 dana posle virusne infekcije u dozi od 20 ml/kg/dan (n=10);
Grupa 2 - miševi su primali prečišćenu vodu intragastrično 3 dana pre i 5 dana posle virusne infekcije (20 ml/kg/dan, n=10);
Grupa 3 - pozitivna kontrola 1, miševi su primali oseltamivir (Tamiflu<®>, Hoffmann-La Roche, 10 mg/kg/dan) intraperitonealnim putem 4 sata pre i 4 sata posle virusne infekcije, a zatim dva puta dnevno tokom 5 dana (n=10);
Grupa 4 - pozitivna kontrola 2, miševi su primali cefuroksim (Zinacef<®>, GlakoSmithKline) subkutano u dozi od 20 mg/kg tokom 3 dana nakon bakterijske infekcije (ili 4 dana nakon virusne infekcije) (n=10);
Grupa 5 - negativna kontrola, netretirani miševi koji su inficirani virusom i bakterijama gripa u istim vremenskim tačkama kao i ostale grupe (n=10).
Dizajn studije:
[0223] Sekundarna virusna/bakterijska pneumonija izazvana je kod životinja intranazalnom inokulacijom virusa gripa H1N1/A California 04/2009 u dozi od 10<4>/5 TCID50/0.1 ml i intranazalnom inokulacijom Staphylococcus aureus (1986 soj) u dozi od 2×10<7>CFU/ml. U svim eksperimentalnim grupama, Staphylococcus aureus (1986) je primenjen 5. dana nakon infekcije virusom gripa. Dva dana nakon toga, pluća životinja (n=3 po grupi) su homogenizovana i ispitana na bakterijsko opterećenje i virusni titar. Za preostale miševe, njihova telesna težina kao parametar opšteg zdravlja merena je na dnevnoj bazi i zabeležene su stope preživljavanja.
Statistička analiza:
[0224] Statistička analiza nalaza je sprovedena korišćenjem linearnih mešovitih modela uključujući Grupu kao faktor, Dan kao kovarijantu sa kubinim splajnom i ID subjekta kao slučajni efekat (poređenja između grupa su vršena za svaki dan korišćenjem post-hoc Tukey test); korišćenje Kaplan-Meier krivih praćenih poređenjem testa log ranga sa Benjamini-Hohbergovom korekcijom za višestruko testiranje; i korišćenjem Kruskal-Wallis testa u kombinaciji sa post-hoc Dunn testom korigovanim metodom Benjamini-Hohberg. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0225] Navedeni lek je smanjio stopu mortaliteta kod životinja sa eksperimentalnom sekundarnom (virusnom/bakterijskom) pneumonijom za 40% (u odnosu na kontrolu (Grupa 2)), što je bilo slično dejstvu komparativnog leka cefuroksima (Grupa 4) (Sl.22).
[0226] Lek ovog pronalaska, kao komparativni lek oseltamivir, smanjio je titar plućnog virusa za više od 15% u poređenju sa negativnom kontrolnom grupom.
[0227] Nisu primećene statistički značajne razlike u bakterijskom opterećenju ili telesnoj težini eksperimentalnih miševa.
Zaključak:
[0228] Prema tome, lek za koji se traži zaštita je pokazao terapeutsku efikasnost kod eksperimentalne sekundarne virusne/bakterijske pneumonije povećanjem stope preživljavanja kod inficiranih životinja i smanjenjem rasta virusa u plućima.
Primer 15.
[0229] Procena aktivnosti protiv respiratornog sincicijalnog virusa in vivo.
[0230] Cilj studije je da se proceni antivirusna aktivnost leka za koji se traži zaštita da protiv respiratornog sincicijalnog virusa (RSV, A2 soj). Lek ovog pronalaska sadrži jednake količine četiri tehnološki obrađena proizvoda koji su rezultat serijskih razblaženja (C12C30C50 razblaženja) osnovnih supstanci poliklonskih antitela prečišćenih afinitetom, tj. 1) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1) (2.5 mg/ml), 2) antitela na β2-mikroglobulin molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I (2.5 mg/ml), 3) antitela na humani interferon gama (2.5 mg/ml) i 4) antitela na CD4 (2.5 mg/ml).
Eksperimentalne grupe:
[0231]
Grupa 1 - miševi su primali navedeni lek intragastrično tokom 5 dana pre infekcije, uključujući 2 sata pre infekcije, a zatim tokom 4 dana u dozi od 20 ml/kg/dan (dva puta dnevno, približno 0.2 ml/mišu u 2-časovnim intervalima, n=10);
Grupa 2 - miševi su primali komponentu leka za decu (Anaferon za decu), odnosno razblaženje antitela na interferon gama, kao monoterapiju intragastrično tokom 5 dana pre infekcije, uključujući 2 sata pre infekcije, a zatim tokom 4 dana u dozi od 20 ml/kg/dan (dva puta dnevno, približno 0.2 ml/mišu u intervalima od 2 sata, n=10);
Grupa 3 - kontrolni miševi primali su prečišćenu vodu intragastrično tokom 5 dana pre infekcije, uključujući 2 sata pre infekcije, a zatim tokom 4 dana u dozi od 20 ml/kg/dan (dva puta dnevno, približno 0.2 ml/mišu u 2-časovnim intervalima, n=10);
Grupa 4 - kontrola RSV modela (n=10); miševi su inficirani sa RSV A2 u isto vreme kao i miševi iz Grupe 1, Grupe 2 i Grupe 3.
Grupa 5 - kontrola modela RSV+UV (n=10); miševi su inficirani UV-inaktiviranim RSV A2 u isto vreme kada i miševi iz Grupe 1, Grupe 2 i Grupe 3. UV inaktivacija je prethodno izvedena izlaganjem RSV UV svetlu tokom 20 minuta. Inaktivirani virus je adekvatna negativna kontrola, jer ne izaziva infekciju respiratornog trakta, ali komponente viriona koje su prisutne u inaktiviranom virusnom materijalu i dalje mogu uticati na parametre imunog sistema životinja. Ova kontrola može pokazati efekat virusa na respiratorni trakt životinja koji se postiže upravo njegovom replikacijom;
Grupa 6 - intaktni kontrolni miševi koji nisu bili inficirani virusom i ostali nelečeni (n=10).
Dizajn studije:
[0232] Životinje iz pet grupa inficirane su sojem RSV A2 (RSV A2) intraperitonealnim putem u dozi od 5×10<6>TCID50/mišu. Petog dana eksperimenta, bronhijalna hiperreaktivnost (pošto RSV A2 utiče na disajne puteve izazivajući inflamaciju) kod životinja je procenjena neinvazivnom pletizmografijom korišćenjem opreme kompanije BuxcoElectronics, Wilmington, NC. Nakon podešavanja i kalibracije opreme, miševi iz različitih grupa su smešteni u dvokomorne pletizmografe (plastične kutije) koje se sastoje od nosne i torakalne komore podeljene vratnom ogrlicom kao pregradom za zadržavanje životinja u pletizmografu (komori), gde su životinje izložene 10 µl rastvora metaholina u rastućim koncentracijama 0, 6.25, 12.5 i 25 mg/ml tokom 3 minuta.
[0233] Dana 6 nakon infekcije, virusno opterećenje pluća je mereno kod svih životinja PCR-om u realnom vremenu. Sakupljeno plućno tkivo je homogenizovano u RLT puferu (Qiagen) i zajednička RNK je izolovana korišćenjem komercijalnog RNasy mini kompleta (Qiagen) u skladu sa preporukama proizvođača. Zajednička RNK je dalje korišćena kao šablon za sintezu cDNK korišćenjem OT-1 kompleta (Syntol) u skladu sa preporukama proizvođača. Komplementarna DNK (cDNK) je korišćena u PCR-u u realnom vremenu za kvantitativno određivanje virusne RNK. Tehnika PCR u realnom vremenu je sprovedena korišćenjem komercijalnog kompleta reagensa kompanije Syntol prema preporukama proizvođača, specifičnog kompleta prajmera i IQ5 sistema za detekciju (BioRad).
Statistička analiza:
[0234] Statistička analiza nalaza je obavljena korišćenjem dvosmerne ANOVA, poređenja u paru su vršena metodom najmanjih kvadrata, a prilagođavanja višestrukosti su vršena simulacijom primenom SAS PROC MIXED postupka. Za RNK podatke, prilagođavanja višestrukosti su izvršena korišćenjem Dunn testa (zabeleženi brojevi su prvo izračunati). Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0235] Najveći rast bronhijalne hiperreaktivnosti zabeležen je kod miševa kontrolne grupe koji su primali prečišćenu vodu (Grupa 3). Kod miševa lečenih samo komponentom leka za koju se traži zaštita (Grupa 2), bronhijalna hiperreaktivnost je pokazala umeren rast, koji se statistički razlikovao od onog u kontroli. Najmanje povećanje bronhijalne rezistencije zabeleženo je nakon toka lečenja navedenim lekom (Sl.23).
[0236] Najveća koncentracija virusne RNK nađena je u uzorcima miševa iz grupe RSV (4. grupa). UV inaktivacija virusa je dovela do značajnog pada broja virusnih RNK (do 10 puta), međutim, virusna RNK se i dalje mogla otkriti. Ovo je bilo zbog prisustva značajnih količina genomske RNK u uzorcima virusa inaktiviranih UV zracima koji su otkriveni kvantitativnim PCR-om. Značajna razlika između broja virusne RNK u plućima miševa iz grupa RSV (Grupa 4) i RSV UV (Grupa 5) ukazuje da je inaktivirani virus sposoban za replikaciju u disajnim putevima. Ta činjenica je pokazala da je odabrani eksperimentalni model adekvatan.
[0237] Statistički značajno smanjenje količine virusne RNK zabeleženo je u uzorcima dobijenim od životinja Grupe 1 (lek za koji se traži zaštita) i Grupe 2 (monoterapija navedenom komponentom leka) u poređenju sa kontrolnom grupom (Grupa 3) i grupom RSV (Grupa 4) (Sl. 24). U grupi leka za koji se traži zaštita, broj virusne RNK bio je 4 puta manji nego u grupi samo njegove komponente.
Zaključak:
[0238] Proučavanje antivirusne aktivnosti leka za koji se traži zaštita na mišjem modelu RSV infekcije in vivo pokazalo je da lek ovog pronalaska smanjuje bronhijalnu hiper-reaktivnost i opterećenje virusnom RNK u plućima. Tako je potvrđeno značajno antivirusno dejstvo leka za koji se traži zaštita protiv RSV (A2 soja).
Primer 16.
[0239] Efikasnost leka u infekciji Pseudomonas aeruginosa (RP73) kod pacova.
[0240] Ovo je slepa, placebom kontrolisana, komparativna studija. Cilj studije je da se proceni antibakterijsko dejstvo leka za koji se traži zaštita u eksperimentalnoj infekciji pacova Pseudomonas aeruginosa (soj RP73), bakterijom koja izaziva hronične infekcije pluća sa ireverzibilnim oštećenjem pluća kod približno 80% odraslih pacijenata. Lek ovog pronalaska sadrži četiri tehnološki obrađena proizvoda koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci afinitetnih purifird monoklonskih antitela, tj. 1) antitela na HLA-DRB1 (C10D40C150 razblaženja (3 mg/ml) u odnosu 2:3:1), 2) antitela na β2-mikroglobulin (razblaženje C10C150 (3 mg/ml) u odnosu 3:1), 3) antitela na interferon gama (razblaženje C10D40C150 (3 mg/ml) u odnosu 2:3 :1) i 4) antitela na CD4 (razblaženje C10C30C200 (3 mg/ml) u odnosu 2:3:1) u zapreminskom odnosu 1:1:1:1.
Eksperimentalne grupe:
[0241] Grupa 1 - mužjaci Sprague-Dawley pacova (n=10) inficirani sojem Pseudomonas aeruginosa RP73 (intratrahealnim putem, 6.5*10<7>CFU/ml) koji nisu primali nikakve lekove (netretirane životinje).
[0242] Grupa 2 - mužjaci Sprague-Dawley pacova (n=10) primali su placebo (prečišćenu vodu) oralno 24 sata pre infekcije i 24, 48, 72 i 96 sati nakon inokulacije soja Pseudomonas aeruginosa RP73 (intratrahealnim putem, 6.5*10<7>CFU/ml). Zapremina doze - 7.5 ml/kg.
[0243] Grupa 3 – mužjaci Sprague-Dawley pacova (n=10) primali su komparativni lek tobramicin orofaringealnim putem u dozi od 3 mg/kg 24 sata pre infekcije i 24, 48, 72 i 96 sati nakon inokulacije soja Pseudomonas aeruginosa RP73 (intratrahealnim putem, 6.5*10<7>CFU/ml). Zapremina doze - 7.5 ml/kg.
[0244] Grupa 4 - mužjaci Sprague-Dawley pacova (n=10) primili su traženu test jedinicu oralno 24 sata pre infekcije i 24, 48, 72 i 96 sati nakon inokulacije soja Pseudomonas aeruginosa RP73 (intratrahealnim putem, 6.5*10<7>CFU/ml). Zapremina doze - 7.5 ml/kg.
Dizajn studije:
[0245] Trajanje studije je bilo 7 dana. Pacovi su inficirani sa Pseudomonas aeruginosa (RP73) intratrahealnim putem pri 6.5*10<7>CFU/ml. Placebo (prečišćena voda) i test artikal za koji se traži zaštita primenjivani su oralno u dozi od 7.5 ml/kg 24 sata pre infekcije i 24, 48, 72 i 96 sati nakon inokulacije bakterija. Komparativni lek tobramicin je davan životinjama orofaringealnim putem u dozi od 3 mg/kg u istim vremenskim tačkama.
[0246] Telesna težina životinja je merena tokom perioda studije.
[0247] Petog dana nakon infekcije, pacovi su žrtvovani i bronhoalveolarna lavaža i uzorci pluća su sakupljeni za analizu bakterijskog opterećenja. Pluća su homogenizovana i svi uzorci su serijski razblaženi i 40 µl rezultujućih razblaženja je zatim postavljeno u tri primerka na modifikovani Drygalski-Conradi medijum za gram-negativne bakterije. Posle 24 sata, broj CFU je prebrojan u pripremljenim uzorcima bronhoalveolarne lavaže i pluća.
[0248] Statistička analiza nalaza je sprovedena korišćenjem dvosmernih ponovljenih merenja ANOVA u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p < 0.05.
Rezultati studije:
[0249] Intratrahealna infekcija pacova sa Pseudomonas aeruginosa (RP73), najčešćom bakterijom koja izaziva hronične plućne infekcije povezane sa ireverzibilnim oštećenjem pluća, dovela je do pogoršanja opšteg stanja životinja i pratećeg smanjenja telesne težine. U grupi 1 (netretirane životinje), ovaj parametar je opao za 27% do kraja eksperimenta u poređenju sa početnom linijom. Sličan efekat je takođe primećen u grupi 2 (placebo) koja je pokazala smanjenje od 28%.
[0250] Upotreba navedenog leka (Grupa 4) je doprinela poboljšanju opšteg zdravlja inficiranih pacova: gubitak telesne težine je bio manje izražen u poređenju sa Grupom 1 i 2, sa ukupnim smanjenjem od 15%. Komparativni lek je pokazao maksimalne zaštitne efekte: u grupi 3 (Tobramicin), srednja telesna težina do kraja studije smanjena je samo za 4% (Sl.25).
[0251] Prilikom procene bakterijskog opterećenja u plućima i uzorcima bronhoalveolarne lavaže pacova 5. dana nakon intratrahealne infekcije Pseudomonas aeruginosa (RP73), utvrđeno je da navedeni lek ispoljava značajno antibakterijsko dejstvo, kada se primenjuje kao terapijski i preventivni tok lečenja, tj. 24 sata pre infekcije i 24, 48, 72 i 96 sati nakon intratrahealne inokulacije bakterija. Za razliku od placebo grupe (Grupa 2), gde broj CFU nije pokazao nikakve značajne razlike u poređenju sa onim u Grupi 1 (netretirane životinje), lek za koji se traži zaštita je smanjio broj CFU u plućima za 29% u poređenju sa netretiranim životinjama i za 19% u poređenju sa placebom (Sl.26); broj CFU u bronhoalveolarnoj lavaži smanjio se za 33% i 34%, respektivno (Sl. 27). Vrednosti plućnog bakterijskog opterećenja dobijene sa komparativnim lekom bile su slične onima za navedeni lek: smanjenje CFU pluća kao odgovor na tobramicin bilo je 29% u poređenju sa netretiranim životinjama i 19% u poređenju sa placebom. U uzorcima bronhoalveolarne lavaže utvrđeno je da je antibakterijska aktivnost tobramicina izraženija: 88% u poređenju sa dve kontrolne grupe (netretirane životinje i placebo).
Zaključak:
[0252] U studiji sprovedenoj korišćenjem eksperimentalne infekcije pacova sa Pseudomonas aeruginosa (soj RP73), bakterijom koja izaziva hronične infekcije pluća sa ireverzibilnim oštećenjem pluća kod približno 80% odraslih pacijenata, pokazalo se da navedeni lek ispoljava značajna antibakterijska dejstva. To se manifestovalo manjim smanjenjem težine, što je ključni pokazatelj opšteg zdravlja životinja i smanjenim bakterijskim opterećenjem u plućima (1.2-1.4 puta) i uzorcima bronhoalveolarne lavaže (1.5 puta).
Primer 17.
[0253] Efikasnost leka kod miševa inficiranih sa Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277).
[0254] Ovo je slepa placebo kontrolisana studija. Cilj rada je da se proceni antibakterijsko i imunotropno (antiinflamatorno) dejstvo navedenog leka u eksperimentalnoj infekciji miševa Porphyromonas gingivalis, jednim od glavnih patogena koji izazivaju periodontalne bolesti. Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji nastaju kao rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci afinitetno prečišćenih poliklonskih antitela, odnosno 1) antitela na HLA-DRB1 (C50C200 razblaženje (1.5 mg/ml) u odnosu 2:3), 2) antitela na β2-mikroglobulin (razblaženje C50C200 (1.5 mg/ml) u odnosu 1:2), 3) antitela na interferon gama (razblaženje C50C200 (1.5 mg/ml) u odnosu 1:3) i 4) antitela na CD4 (razblaženje C50C200 (1.5 mg/ml) u odnosu 3:2) u zapreminskom odnosu 2:3:2:1.
Eksperimentalne grupe:
[0255] Grupa 1 - mužjaci C57B6/Ntac miševa (n=10) inficirani sa Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (subkutano, 10<8>CFU/životinji) koja nije primala nikakve lekove (netretirane životinje).
[0256] Grupa 2 - mužjaci C57B6/Ntac miševa (n=10) primili su placebo (prečišćenu vodu) oralno 2, 24, 48 i 72 sata nakon infekcije sa Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (subkutano, 10<8>CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0257] Grupa 3 - mužjaci C57B6/Ntac miševa (n=10) primili su navedeni lek oralno 2, 24, 48 i 72 sata nakon infekcije sa Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (subkutano, 10<8>CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
Dizajn studije:
[0258] Trajanje studije je bilo 25 dana. Eksperimentalna infekcija izazvana je kod miševa subkutanom injekcijom Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) u dozi od 10<8>CFU/životinji u pre-implantiranu komoru [Infect Immun. 1991 Apr;59(4):1255-63].
[0259] Test artikli su primenjivani oralno u dozi od 10 ml/kg 2, 24, 48 i 72 sata nakon infekcije.
[0260] Na dan 4 posle inokulacije bakterija, prethodno implantirane subkutane komore su uklonjene i mereno je bakterijsko opterećenje i nivoi proinflamatornih citokina (IL-1β, IL-6) u komorama.
[0261] Za procenu bakterijskog opterećenja, 20 µl serijski razblaženih komorskih tečnosti je postavljeno u tri primerka na ploče sa krvnim agarom brucela i inkubirano u anaerobnim uslovima tokom 96 sati.
[0262] Nivoi citokina su mereni pomoću ELISA test sistema od strane R&D Systems (SAD) u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0263] Statistička analiza nalaza je obavljena korišćenjem Kruskal-Wallis testa u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom i Kaplan-Meier krivama praćeno parnim upoređivanjem log-rank testova. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p < 0.05.
Rezultati studije:
[0264] Na dan 4 posle in vivo injekcije bakterija u 10<8>CFU/mišu u subkutano implantirane komore, dobijene vrednosti bakterijskog opterećenja (broj Porphyromonas gingivalis CFU, ATCC 33277) su pokazale značajne antibakterijske efekte test artikla za koji je tražena zaštita, kada se primenjuje kao tok lečenja, tj.2, 24, 24, 2 sata nakon infekcije. Za razliku od placebo grupe (Grupa 2), gde je broj CFU bio sličan onom u Grupi 1 (netretirane životinje), lek za koji se traži zaštita je smanjio broj CFU za 41% u poređenju sa netretiranim životinjama i za 34% u poređenju sa placebom (Sl.28).
[0265] Utvrđeno je da je imunotropna aktivnost navedenog leka značajna kada se proceni merenjem uticaja proizvoda na nivoe citokina (IL-1β i IL-6) u subkutano implantiranim komorama 4. dana nakon in vivo injekcije Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) u dozi od 10<8>CFU/mišu. Zabeleženo je statistički značajno smanjenje nivoa citokina kao odgovor na navedeni lek u poređenju sa kontrolnom i grupom 1 (netretirane životinje): IL-1β je opao za 49% u odnosu na grupu 1 i za 41% u odnosu na grupu 2 (placebo); IL-6 je smanjen za 60% u odnosu na Grupu 1 i za 63% u odnosu na Grupu 2 (Sl.29, Sl.30).
Zaključak:
[0266] Tako je u studiji sprovedenoj eksperimentalnom infekcijom miševa sa Porphyromonas gingivalis, jednim od glavnih patogena koji izazivaju periodontalne bolesti, pokazano da navedeni lek ispoljava značajne antibakterijske i imunotropne (anti-inflamatorne) efekte koji su rezultirali u skoro 3 puta manjem bakterijskom opterećenju i smanjenom nivou proinflamatornih citokina (1.7 -struko smanjenje IL-1β i 2.7- struko smanjenje IL-6) u poređenju sa placebom.
Primer 18.
[0267] Antibakterijska aktivnost leka za koji se traži zaštita protiv Mycobacterium tuberculosis, soja H37Rv.
[0268] Ovo je slepa, placebom kontrolisana, komparativna studija. Cilj rada je da se proceni antibakterijsko dejstvo navedenog leka u eksperimentalnoj infekciji miševa Mycobacterium tuberculosis (soj H37Rv). Lek ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci afinitetno prečišćenih monoklonskih antitela, tj. 1) antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 razblaženje (2 mg/ml) u odnosu 3:2:1), 2) antitela na β2-mikroglobulin (razblaženje C12C30C50 (2 mg/ml) u odnosu 3:2:1), 3) antitela na interferon gama (razblaženje C12C30C50 (2 mg/ml) u odnosu 3: 2:1) i 4) antitela na CD4 (razblaženje C12C30C50 (2 mg/ml) u odnosu 3:2:1) u zapreminskom odnosu 2:2:1:2.
Eksperimentalne grupe:
[0269] Grupa 1 - ženke C57BL/6 miševa (n=15) inficirane intravenski sa Mycobacterium tuberculosis, H37Rv (5*10<4>CFU/životinji) koja nije primala nikakve lekove (netretirane životinje).
[0270] Grupa 2 - ženke C57BL/6 miševa (n=15) primale su placebo (prečišćenu vodu) oralno tokom 4 nedelje, od 22. dana nakon inokulacije Mycobacterium tuberculosis, H37Rv (intravenskom injekcijom, 5*10<4>CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
[0271] Grupa 3 - ženke C57BL/6 miševa (n=15) primale su komparativni lek, odnosno kombinaciju izoniazida (25 mg/kg) rifampicina (20 mg/kg) etambutola (100 mg/kg), oralno tokom 4 nedelje, od 22. dana nakon inokulacije Mycobacterium tuberculosis, H37Rv (intravenskom injekcijom, 5*10<4>CFU/životinji).
[0272] Grupa 4 - ženke C57BL/6 miševa (n=15) primale su navedeni lek oralno tokom 4 nedelje, od 22. dana nakon inokulacije Mycobacterium tuberculosis, H37Rv (intravenskom injekcijom, 5*10<4>CFU/životinji). Zapremina doze - 10 ml/kg.
Dizajn studije:
[0273] Trajanje studije je bilo 50 dana. Eksperimentalna infekcija je izazvana kod miševa intravenskom injekcijom soja Mycobacterium tuberculosis H37Rv u dozi od 5*10<4>CFU/životinji.
[0274] U grupama 2 i 4, test artikli su primenjivani oralno u dozi od 10 ml/kg kao tok lečenja, odnosno tokom 28 dana, od 22. dana nakon infekcije. U Grupi 3, komparativni lek (kombinacija izoniazida (25 mg/kg) rifampicina (20 mg/kg) etambutola (100 mg/kg)) je primenjen po identičnom režimu.
[0275] Do kraja eksperimenta, 50. dana nakon infekcije, miševi su žrtvovani i njihova pluća su ispitana na Mycobacterium tuberculosis CFU (H37Rv). Izolovana pluća su homogenizovana i serijski razblažena, 20 µl rastvora je postavljeno u tri primerka na 7H11 agar ploče i inkubirana 24 sata.
[0276] Statistička analiza nalaza je sprovedena korišćenjem dvosmerne ANOVA u kombinaciji sa post-hoc Tukey testom. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p < 0.05.
Rezultati studije:
[0277] Bakterijsko opterećenje pluća, kako je procenjeno kod miševa inficiranih Mycobacterium tuberculosis (H37Rv), pokazalo je smanjenje broja CFU kao odgovor na navedeni lek u poređenju sa Grupom 1 (netretirane životinje) i Grupom 2 (placebo) (za 43% i 37 %, shodno tome). Komparativni lek (kombinacija izoniazida (25 mg/kg) rifampicina (20 mg/kg) etambutola (100 mg/kg)) je pokazao slične efekte smanjenjem bakterijskog opterećenja za 54% i 49% u poređenju sa netretiranim životinjama i placebo grupama, respektivno (Sl.31).
Zaključak:
[0278] Dakle, studija sprovedena korišćenjem mišjeg modela infekcije izazvane Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) pokazala je značajno antibakterijsko dejstvo leka za koji se traži zaštita koje je povezano sa dvostrukim smanjenjem bakterijskog opterećenja pluća.
Primer 19.
[0279] Procena potencijalne mutagene aktivnosti navedenog leka testom mutagenosti Salmonella typhimurium.
[0280] Cilj studije je da se ispita potencijalna mutagenost leka za koji se traži zaštita u testu mutagenosti Salmonella typhimurium (Ames test). Lek 1 ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 vodeno razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 1:1:1, 2.5 mg/ml) i oslobođenih-aktivnih antitela na β2-MG (C12C30C50 vodeno razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 1:1:1, 2.5 mg/ml) u zapreminskom odnosu 1:1. Lek 2 ovog pronalaska sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci a) antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 1:1:1, 2.5 mg/ml), b) antitela na β2-mikroglobulin (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 1:1:1, 2.5 mg/ml), c) antitela na interferon gama (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela u odnosu od 1:1:1, 2.5 mg/ml) i d) antitela na CD4 (C12C30C50 razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 1:1:1, 2.5 mg/ml) u zapreminskom odnosu 1:1:1: 1.
Dizajn studije:
[0281] Ames test je korišćen korišćenjem Salmonella typhimurium tester sojeva TA97a, TA98, TA100, TA102 i TA1535 sa i bez sistema metaboličke aktivacije. Prilikom testiranja u prisustvu sistema za metaboličku aktivaciju, biotransformacija test artikla je postignuta upotrebom mešavine S9 frakcija koja sadrži mikrozomalne metabolizujuće enzime koja je pripremljena centrifugiranjem homogenata jetre dobijenog od belih outbred pacova na 9000g. Indukcija enzima je izvršena sa sovolom koji je na pacove primenjivan intraperitonealnim putem u dozi od 300 mg/kg.
[0282] Test lekovi i prečišćena voda (kontrola) su testirani u opsegu standardnih doza testa od 0.1-1000 µl/ploči sa faktorom razblaženja 10. Direktna mutagena aktivnost leka za koje se traži zaštita je procenjena u testovima bez metaboličke aktivacije. U ovim testovima, 100 µl leka i 100 µl bakterijske kulture je sipano na ploče, bez dodavanja mikrozomalne smeše u uzorke. Pozitivne kontrole su pripremljene korišćenjem standardnih mutagena: natrijum-azid za soj TA100 (u koncentraciji od 5 µg po ploči), 9-aminoakridin (10 µg/ploči) za soj TA97, 2,7-diamino-4,9-dioksi-5,10-diokso-4,5,9,10-tetrahidro-4,9-diazopiren (DDDTDP; 100 µg/ploči) za TA98 soj. Za testove bez metaboličke aktivacije, korišćen je promutagen ciklofosfan (500 µg/ploča). Posle inokulacije bakterija i test predmeta na pločama sa minimalnim medijumom i inkubacijom tokom 2 dana na 37°C, izbrojan je broj kolonija revertanata histidina. Svaka koncentracija je testirana na tri ploče.
[0283] Za svaki od eksperimentalnih modela određena je geometrijska sredina broja revertantnih kolonija po tri ploče. Standardna devijacija je izračunata kao maksimalno odstupanje broja revertanta za jednu od tri ploče od geometrijske srednje vrednosti. Značaj povećanja geometrijske sredine broja revertanata u testovima sa test kompozicijom u odnosu na kontrolne vrednosti je procenjen korišćenjem modifikovanog testa višestrukih poređenja (Dunnet-ov test). Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
Rezultati studije:
[0284] Broj revertanata bio je sličan onom u kontroli u uslovima ispitivanja primenjenim za navedene lekove.
Zaključak:
[0285] S obzirom da je sovol, koji pojačava aktivnost monooksigenaza različitih klasa zavisnih od citokroma P450, korišćen kao induktor enzima biotransformacije da bi se postigla metabolička aktivacija navedenih lekova, može se zaključiti da mogući metaboliti lekova ovog pronalaska nemaju nikakvu mutagenu aktivnost. Stoga lekovi za koje se traži zaštita smatraju se nemutagenim.
Primer 20.
[0286] Studije toksičnosti navedenih lekova.
[0287] Toksikološke studije su sprovedene u skladu sa Dobrom laboratorijskom praksom (GOST 33044-2014) i Uputstvom za neklinička ispitivanja farmaceutskih proizvoda [Mironov AN, Bunatyan ND. Guidelines on non-clinical studies of pharmaceutical products. Moscow, Grif and Co.2012;944 p.].
[0288] Budući da se rutinski farmakokinetički i farmakodinamički modeli (odnos doza -koncentracija - efekat) odobreni za većinu farmaceutskih proizvoda ne mogu se primeniti (dostupne fizičko-hemijske i imunološke metode ne omogućavaju detekciju koncentracije leka u biološkim tečnostima organizma) na lek za koji se traži zaštita (tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 i na β2-MG), izbor doze za studije toksičnosti zasniva se na fiziološki prihvatljivim zapreminama rastvarača (prečišćena voda u eksperimentalnim studijama), kome je dodat lek.
Akutna toksičnost:
[0289] Studija je sprovedena na zrelim outbred albino miševima oba pola (telesne težine 22-26 g, starosti 2.5 meseca) i zrelim pacovima Wistar oba pola (telesne težine 225-250 g, starosti 4 meseca) primenom intragastrične primene. Dve doze test lekova (n=18) ili prečišćene vode (kontrola, n=18) su primenjivani intragastrično u intervalu od 2 sata pri maksimalnoj zapremini doze: 25 ml/kg za miševe i 20 ml/kg za pacove. Intaktna grupa nije primila nikakva jedinjenja (n=18). Period praćenja nakon primene artikala bio je 2 nedelje.
[0290] Statistička analiza dobijenih podataka obavljena je korišćenjem dvosmerne ANOVA praćene poređenjem između grupa korišćenjem post-hoc Tukey testa. Razlike su smatrane statistički značajnim ako je p<0.05.
[0291] Primena leka za koji se traži zaštita koji sadrži tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 vodeno razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 2:1:3, 2.5 mg/ ml) i antitela na β2-MG (C12C30C50 vodene razblaženje poliklonskih antitela u odnosu 2:1:3, 2.5 mg/ml) na zrele miševe i pacove intragastričnim putem pri maksimalnim zapreminama doze nisu uticali na opšte zdravlje životinja (nema znakova anksioznosti, nema promena u apetitu, sekretu, sluzokožama, krznu, koži, itd.) ili povećanje telesne težine kod pacova i miševa (i mužjaka i ženki).
[0292] Slični rezultati su dobijeni pod istim uslovima kao što je gore opisano korišćenjem leka ovog pronalaska koji sadrži tehnološki obrađene proizvode koji su rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci a) antitela na HLA-DRB1 (C12C30C50 razblaženje poliklona u odnosu 1 :3:1, 2.5 mg/ml), b) antitela na β2-MG (C12C30C50 razblaženje poliklona u odnosu 1:3:1, 2.5 mg/ml), c) antitela na IFN-γ (C12C30C50 razblaženje poliklona u odnosu 1:3:1, 2.5 mg/ml) i d) antitela na CD4 (C12C30C50 razblaženje poliklona u odnosu 1:3:1, 2.5 mg/ml).
[0293] LD50 nije mogao da se izračuna zbog odsustva uginuća među životinjama koje su primale lekove. Zbog toga je doza koja prelazi maksimalnu zapreminu doze leka uzeta kao konvencionalni LD50.
[0294] Pošto nije utvrđeno da dve intragastrične doze navedenih lekova pri maksimalnim zapreminama doze nisu izazvale toksične efekte na zdravlje životinja, može se zaključiti da su navedeni lekovi bezbedni i da se mogu klasifikovati kao nisko toksični ili svrstani u kategoriju 5 prema GHS klasifikaciji.
Toksičnost ponovljene doze:
[0295] Istraživanje je sprovedeno na 200 konvencionalnih zrelih albino pacova oba pola (telesne mase 180-242 g, starosti 3.5-4 meseca) i 24 zrela zeca činčila oba pola (telesne težine 1.9 kg, starosti 2.5-3 meseca). Pošto nije bilo izvodljivo odrediti LD50 vrednost za lekove, u ovoj studiji hronične toksičnosti, lekovi ili prečišćena voda su primenjivani na pacove intragastrično u maksimalnoj zapremini doze prihvatljivoj za intragastričnu primenu i pri 25% zapremine maksimalne doze. Zečevi su primali lek u količini koja je približna dnevnoj zapremini vode.
[0296] Period primene je bio 6 meseci, zdravlje pacova i zečeva je procenjivano 3 i 6 meseci nakon početka uzimanja lekova kao i mesec dana nakon povlačenja.
[0297] Dugotrajna intragastrična primena lekova ovog pronalaska odraslim pacovima oba pola u dozama koje prelaze 100 puta maksimalnu dnevnu dozu za ljude nije rezultirala smrtnošću životinja tokom 6 meseci primene i nije izazvala nikakve značajne promene u ponašanju životinja ili morfološkim i funkcionalnim parametrima periferne krvi u poređenju sa kontrolnom grupom 3 i 6 meseci posle primene kao i 1 mesec nakon povlačenja leka.
[0298] Pored toga, dugotrajna primena lekova u naznačenim dozama nije bila povezana sa značajnim promenama u makro- i mikromorfologiji i histološkoj arhitekturi unutrašnjih organa pacova.
[0299] U studiji na zečevima, takođe nije primećen mortalitet tokom perioda istraživanja. Dugotrajna primena leka nije imala značajniji uticaj na opšte zdravlje, ponašanje i telesnu težinu životinja, kao ni na parametre hematopoeze periferne krvi i koštane srži. Biohemija krvne plazme zeca nije otkrila značajne promene. Osim toga, nisu primećene promene u urinu zečeva koji su primali lek tokom 6 meseci. Makroskopskim pregledom unutrašnjih organa zečeva koji su uzimali lek tokom 6 meseci nisu utvrđene abnormalne promene. Prilikom histološkog pregleda tkiva organa nisu uočene abnormalnosti.
Zaključak:
[0300] Na osnovu sprovedenih studija može se zaključiti da navedeni lekovi nemaju značajnije efekte na opšte zdravlje i ponašanje životinja i da ne izazivaju abnormalne ili morfofunkcionalne promene u kardiovaskularnom, gastrointestinalnom i ekskretornom sistemu, kada se primenjuju intragastrično na zrele pacove u dozi od 10 ml/kg i zečeve u dozi od 50 ml/kg (preko 100 puta prosečnih dnevnih doza za ljude) tokom 6 meseci.
Primer 21.
[0301] Multicentrično, dvostruko slepo, placebo kontrolisano, randomizovano kliničko ispitivanje leka za koji se traži zaštita u lečenju akutne respiratorne virusne infekcije.
[0302] Cilj studije je bio da se proceni efikasnost i bezbednost navedenog leka u lečenju akutne respiratorne virusne infekcije (ARVI). Preparat prema predmetnom pronalasku u obliku tablete za resorpciju sadrži, u istoj količini, četiri tehnološki obrađena proizvoda dobijena iz serijskih razblaženja (razblaženja C12C30C50) osnovnih supstanci poliklonskog afiniteta prečišćenih: a) antitela na HLA -DRB1, b) antitela na β2-mikroglobulin, c) antitela na interferon gama i d) antitela na CD4 primenjena na laktozu monohidrat u obliku smeše vode i alkohola.
Dizajn studije:
[0303] Studija je obuhvatila muške i ženske ambulantne pacijente uzrasta od 18 do 70 godina (240 pacijenata) sa kliničkim manifestacijama ARVI tokom prvog dana od pojave bolesti (aksilarna temperatura ne manja od 38.0°C u vreme pregleda ukupna težina opštih simptoma >_ 4 boda, simptomi nazalni / grla / grudi >_2 boda). Regrutovanje pacijenata je vršeno tokom perioda sezonske incidence ARVI.
[0304] Nakon skrining postupaka, 240 pacijenata je randomizirano u dve grupe, uključujući 118 u grupi lekova (5 dana uzimajući navedeni lek prema režimu) i 122 u placebo grupi (5 dana uzimajući placebo prema režimu leka). Rezultati lečenja i opservacije ovih pacijenata (n = 240) korišćeni su za procenu bezbednosti ispitivane terapije i ITT (namera-da-se-leči) analize efikasnosti, uključujući i kod pacijenata sa ARVI, potvrđenih pomoću PCR (n = 78, grupa lekova i n = 73, placebo grupa). Podaci od 6 pacijenata (3 pacijenta u grupi leka i 3 pacijenta u placebo grupi) nisu uključeni u PP (protokol set) analizu efikasnosti zbog odstupanja od protokola (propisivanje zabranjene terapije). Broj pacijenata koji su primili terapiju u potpunosti, završili sve propisane posete i nisu imali značajna odstupanja od protokola, iznosio je 234, od toga 115 u grupi leka i 119 u grupi koja je primala placebo. Podaci ovih pacijenata korišćeni su za RR analizu efikasnosti, uključujući i pacijente sa ARVI, potvrđenu pomoću PCR (n = 76, grupa lekova i n = 72, placebo grupa).
[0305] Pacijent je praćen 14 dana (skrining, randomizacija - do 1 dan, lečenje - 5 dana, praćenje - do 2 dana; odložena telefonska "poseta" - 14 dana). U toku lečenja i praćenja, pacijenti su obavili 3 posete lekaru/lekaru, a dodatno je obezbeđena i četvrta telefonska „poseta“. Tokom posete 2 i 3, lekar je izvršio objektivan pregled, evidentirao dinamiku simptoma bolesti, prateću terapiju i kontrolisao popunjavanje dnevnika. Tokom posete 3, procenjena je usklađenost i sprovedena laboratorijska ispitivanja. U studiji je korišćen i elektronski dnevnik pacijenata (EPD), u koji su svakodnevno ujutru i uveče beleženi aksilarna telesna temperatura i simptomi bolesti.
Dizajn terapije:
[0306] Šema uzimanja navedenog leka: 1 tableta po dozi. Prvog dana lečenja: prva 2 sata, 1 tableta na svakih 30 minuta, zatim, tokom prvog dana, još 3 puta u redovnim intervalima. Od 2 do 5 dana: 1 tableta 3 puta dnevno. Lek se uzima van obroka (u intervalu između obroka ili 15-30 minuta pre obroka), tablete držati u ustima, bez gutanja, dok se potpuno ne rastvore. Trajanje prijema je 5 dana.
[0307] Komparativna terapija: Placebo, pastile, prema režimu leka za koji se traži zaštita tokom 5 dana.
[0308] Osnovna i prateća terapija: Tokom studije pacijenti su mogli da primaju lekove za simptomatsku terapiju ARVI: antipiretik/nesteroidni antiinflamatorni lek (paracetamol/ibuprofen) i/ili vazokonstriktor nazalni lek – oksimetazolin/nafazolin i/ili antitusik/ekspektorans lek - btamirat / ambomirat, guajfenezin, acetilcistein.
Uzorci:
[0309] Ukupan skup - ovo su svi pacijenti upisani u studiju koji su potpisali informativni list o pacijentu i obrazac informisanog pristanka. Ovaj uzorak uključuje sve neželjene događaje (AE) zabeležene tokom studije, uključujući pre početka terapije studije.
[0310] Bezbednosna populacija - svi randomizovani pacijenti koji su primili najmanje jednu dozu ispitivanog leka. Ovaj uzorak je korišćen za analizu bezbednosti ispitivane terapije, pošto su zabeležene sve neželjene reakcije koje su identifikovane kod pacijenta nakon primene leka. Neželjeni efekti prijavljeni kod pacijenata u uzorku ukupnog skupa od trenutka potpisivanja informisanog pristanka, ali pre uzimanja ispitivanog leka, ne uzimaju se u obzir u analizi bezbednosti ispitivane terapije.
[0311] Kompletan skup analize (ITT populacija). Ovo su svi uključeni i randomizirani pacijenti sa izuzetkom onih koji su imali najmanje jedan od sledećih događaja:
1) neusaglašenost sa kriterijumima za uključivanje/isključivanje;
2) pacijent nije uzeo nijednu dozu ispitivanog leka;
3) nedostatak bilo kakvih podataka o pacijentima nakon randomizacije i primene ispitivanog leka.
[0312] Ovaj uzorak, koji je najkonzistentniji sa principom „Namera da se leči“, korišćen je za analizu „namera da se leči“ (ITT analiza) efikasnosti studijske terapije.
[0313] Za popunjavanje podataka koji nedostaju (indikatori/opcije) korišćen je postupak prenosa podataka poslednjeg posmatranja unapred „LOCF“ (Last Observation Carried Forward).
[0314] Po skupu protokola. Uzorak obuhvata sve pacijente koji su primili kompletan tretman propisan protokolom, obavili sve zakazane posete i nisu imali značajna odstupanja od protokola. Ovaj uzorak je korišćen za analizu po protokolu (PP analiza) efikasnosti terapije studije.
[0315] Skup uzoraka po protokolu nije uključivao pacijente čiji su podaci u potpunosti ili delimično neprikladni za analizu kao rezultat otkrivenog odstupanja od protokola.
Statističke metode:
[0316] Da bi se uporedili rezultati u dve grupe za kontinualne promenljive, korišćen je Studentov t-test sa dva uzorka ili neparametarski Wilcoxon test u zavisnosti od rezultata Shapiro-Wilk testa za normalnost. Analiza varijanse (mešoviti postupak u SAS) korišćena je za poređenje promena indikatora u dve grupe. Vitalni znaci pacijenata analizirani su Kruskal-Wallis testom. Da bi se uporedile proporcije (procenti) u dve grupe, korišćen je Fisher-ov egzaktni test ili Cochran-Mantel-Hensel test sa testom za primenljivost poslednjeg pomoću Breslow-Day testa.
Dodeljivanje potencije:
Analiza efikasnosti terapije prema primarnoj krajnjoj tački
Vreme do izuzeća od simptoma ARVI (potvrđeno pomoću PCR).
[0317] Vreme do oslobađanja od svih simptoma bolesti kod pacijenata sa ARVI, potvrđeno pomoću PCR (sa otkrivenim virusom u uzorcima nazofaringealne šupljine), prema pozadini lečenja MMN-407 bilo je 4.1 ± 1.9 [4.0 ± 1.9] dana (nasuprot 5.0 ± 2.5 [5.0 ± 2.5] dana na pozadini placebo terapije (Tabela 7).
Tabela.7. Vreme do izuzeća od simptoma ARVI (potvrđeno pomoću PCR)
[0318] U grupi sa lekovima, bolest je trajala manje od 3.0 [2.8] dana kod 25% pacijenata, a kod 50% - od 3.0 [2.8] do 5.0 [5.0] dana (granice donjeg i gornjeg kvartila). U placebo grupi, 25% pacijenata je imalo simptome bolesti duže od 6.0 [6.3] dana (gornja kvartilna granica).
[0319] Među pacijentima grupe lekova uključenih u ITT analizu, trajanje toka ARVI je u proseku bilo -0.89 ± 2.23 dana kraće nego u placebo grupi (delta između dve grupe). Kod pacijenata grupe leka koji su završili lečenje i opservaciju u skladu sa protokolom, trajanje ARVI je bilo približno 1 dan kraće ([-0.93 ± 2.25], podaci iz RR analize).
Analiza efikasnosti terapije po dodatnim krajnjim tačkama
[0320]
1) Procenat pacijenata sa izuzetkom simptoma ARVI (klinički dijagnostikovan i/ili potvrđen pomoću PCR).
[0321] Procenat pacijenata sa nestajanjem simptoma ARVI (klinički dijagnostikovanih, uključujući i one potvrđene pomoću PCR) progresivno se povećavao počevši od 3. dana lečenja. U grupi sa lekovima 5. dana terapije više od polovine pacijenata (62.7 [64.4] %) bilo je zdravo (Sl. 32). Na kraju 5 dana lečenja, 72.9 [73.0] % pacijenata koji su primali navedeni lek oporavilo se od ARVI.
[0322] Statistička analiza je pokazala da je tokom celog perioda lečenja procenat pacijenata sa oporavkom koji su završili učešće u studiji u skladu sa protokolom veći u grupi koja je uzimala lekove nego u placebo grupi (Cochran-Mantel-Hensel test; podaci iz RR analiza: [p = 0.0201]).
[0323] 2) Vreme do izuzeća od simptoma ARVI (klinički dijagnostikovan, uključujući potvrđen pomoću PCR).
[0324] Analiza podataka o dodatnoj krajnjoj tački koja procenjuje vreme do izuzimanja simptoma ARVI (klinički dijagnostikovan, uključujući potvrđen pomoću PCR među svim randomizovanim učesnicima, takođe pokazuje prednost upotrebe leka pored simptomatske terapije ARVI (Tabela 8).
Tabela.8 Vreme do izuzeća od simptoma ARVI (klinički dijagnostikovan, uključujući potvrđen pomoću PCR).
[0325] U grupi lekova, bolest je trajala manje od 3.0 dana kod 25% pacijenata, a kod 50% - od 3.0 do 5.5 dana (granice donjeg i gornjeg kvartila). U placebo grupi, 25% pacijenata je imalo simptome bolesti duže od 6.0 dana (gornja kvartilna granica).
[0326] Među pacijentima grupe lekova uključenih u ITT analizu, trajanje klinički dijagnostikovanog toka ARVI, uključujući potvrđeno pomoću PCR, bilo je u proseku -0.41 ± 2.34 dana kraće nego u placebo grupi (delta između dve grupe). Kod pacijenata grupe leka koji su završili lečenje i opservaciju u skladu sa protokolom, trajanje klinički dijagnostikovanog ARVI, uključujući potvrđeni PCR, bilo je kraće za [-0.47 ± 2.36] dana, podaci iz RR analize).
[0327] Dakle, vreme do oslobađanja od simptoma bolesti kod svih pacijenata sa ARVI, klinički dijagnostikovanih, uključujući potvrđeno pomoću PCR, u grupi lekova bilo je kraće nego u placebo grupi.
[0328] 3) Broj uzimanja antipiretičkih lekova prema indikacijama za 1-3 dana lečenja.
[0329] Antipiretici (paracetamol ili ibuprofen kako ih je izdao istraživač tokom posete 1) bili su dozvoljeni tokom studije, prema medicinskim indikacijama.
[0330] Antipiretici su propisivani prvog, drugog i trećeg dana bolesti u proseku 0.30 ± 0.68 [0.28 ± 0.67], 0.19 ± 0.48 [0.20 ± 0.48] i 0.03 ± 0.22 [0.02 ± 0.13] puta u grupi leka i 0.38 ± 0.67 [0.36 ± 0.64], 0.24 ± 0.53 [0.23 ± 0.53] i 0.04 ± 0.20 [0.04 ± 0.20] puta u placebo grupi.
[0331] Statistička analiza nije otkrila razlike između grupa u broju antipiretičkih lekova uzetih u roku od 1-3 dana od posmatranja.
[0332] Dakle, efikasnost leka za koji se traži zaštita u lečenju pacijenata sa ARVI pokazuje se u odsustvu razlika u upotrebi lekova za simptomatsku terapiju, uključujući antipiretike.
[0333] Procenat pacijenata kod kojih je došlo do pogoršanja toka bolesti (razvoj komplikacija koje zahtevaju antibiotike ili hospitalizaciju) od 4 do 14 dana od početka posmatranja.
[0334] U grupi leka (N = 118), među svim randomizovanim pacijentima sa ARVI (klinički dijagnostikovan, uključujući PCR potvrđen), akutni bronhitis je dijagnostikovan kod 1 (0.8%) kod koga je propisan antibakterijski lek. U placebo grupi (N = 122), 3 (2.5%) pacijenata su prepisani antibakterijski lekovi zbog bakterijskih komplikacija, uključujući pneumoniju (n = 1 zbog koje je pacijent hospitalizovan), akutni gnojni bronhitis (n = 1), sinuzitis ( n = 1).
[0335] Dakle, uključivanje navedenog leka u kompleks za lečenje ARVI je pomoglo da se spreči pogoršanje toka bolesti, spreči razvoj bakterijskih komplikacija koje zahtevaju antibakterijsku terapiju i hospitalizaciju pacijenata.
Procena bezbednosti:
[0336] Procena bezbednosti i podnošljivosti terapije sprovedena je na osnovu podataka svih uključenih i randomizovanih pacijenata koji su primili najmanje jednu dozu ispitivanog leka/placeba (Bezbednosna populacija; n = 240). Procenjeni su vitalni znaci učesnika studije, zabeleženi su neželjeni događaji (AE), njihov odnos sa uzimanjem leka, ozbiljnost, ishod; proučavana je dinamika laboratorijskih parametara (klinička analiza krvi, opšta analiza urina, biohemijski markeri).
1) Dinamika vitalnih znakova.
[0337] Navedeni lek nije negativno uticao na vitalne funkcije učesnika studije, uključujući sistolni (SBP), dijastolni (DBP) krvni pritisak, broj otkucaja srca (HR) i respiratornu brzinu (RR).
[0338] Srednje vrednosti SBP i DBP tokom studije odgovarale su normalnim i dobro kontrolisanim vrednostima. Statistička analiza nije pokazala razlike u SBP, DBP, pulsu i RR u posetama 1-3 u grupama za lek i placebo.
2) Neželjena dejstva.
[0339] Ukupno, tokom perioda lečenja i praćenja, zabeleženo je 9 neželjenih efekata kod 9 (7.6%) pacijenata u grupi sa lekovima i 11 neželjenih efekata kod 9 (7.4%) učesnika u placebo grupi. Od svih neželjenih efekata, najčešći su bili epigastrični bol (n = 2, grupa lekova, n = 0, placebo grupa), infekcije i invazije (uključujući pneumoniju stečenu u zajednici, n = 1, placebo grupa; sinuzitis, n = 1, grupa Placebo; akutni bronhitis, n = 1, grupa lekova i n = 1, placebo grupa; akutni nazofarintitis, n = 1, grupa lekova; akutni tubo otitis, n = 1, grupa lekova; herpes simpleks, n = 1, grupa lekova i n = 1, placebo grupa), kao i opšti poremećaji i reakcije na mestu ubrizgavanja (n = 2, placebo grupa u vidu edema usana, n = 1, pogoršanje bolesti, n = 1).
[0340] U grupi Lek 9 (100.0%) neželjeni efekti su bili blagi; u placebo grupi - 11 (100.0%), respektivno. Uzročno-posledična veza između AE i leka za koji se traži zaštita u studiji, prema istraživačima, nije bila odsutna.
3) Dinamika laboratorijskih parametara.
[0341] Da bi se procenila bezbednost terapije, proučavani su biohemijski i opšti klinički parametri krvi i urina. Prosečne vrednosti ovih laboratorijskih parametara, kako na početku tako i na kraju lečenja, nisu prelazile referentne vrednosti koje odgovaraju normalnim pokazateljima za datu starost i pol.
[0342] Dakle, analiza parametara bezbednosti pokazala je da je lek bezbedan u lečenju pacijenata sa ARVI.
Zaključak:
[0343] Studija pokazuje da je lečenje navedenim lekom u trajanju od 5 dana efikasno i bezbedno kod pacijenata sa ARVI. Upotreba leka prema predmetnom pronalasku dovodi do bržeg oslobađanja od simptoma ARVI (oporavka), što ukazuje na prednosti uključivanja leka u kompleks terapije ARVI.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Lek, koji predstavlja tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1) i na β2-mikroglobulin (β2-MG); pri čemu su višestruka serijska razblaženja decimalna, centezimalna i milesimalna razblaženja u bilo kojim odnosima razblaženja; i pri čemu su osnovne supstance u koncentraciji od 0.5 - 5.0 mg/ml.
2. Lek prema patentnom zahtevu 1 za lečenje bakterijskih infekcija; izborno pri čemu je bakterijska infekcija (i) uzrokovana bakterijama otpornim na jedan ili više poznatih antibiotika; (ii) infekcija urinarnog trakta izabrana od cistitisa i prostatitisa; (iii) je bakterijska crevna infekcija; (iv) bakterijska infekcija kože; (v) tuberkuloza; ili (vii) izabrana od salmoneloze, infekcije E. coli, streptokokne infekcije i Klebsiella pneumoniae.
3. Lek prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što su antitela monoklonska, poliklonska ili prirodna.
4. Lek prema patentnom zahtevu 1, formulisan kao čvrsti dozni oblik, koji sadrži efikasne količine neutralnih granula nosača impregnisanih tehnološki obrađenim proizvodom koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA DRB1 i antitela na β2-mikroglobulin, kao i farmaceutski prihvatljive ekscipijense.
5. Kombinacija antibiotika i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, za istovremenu ili uzastopnu primenu za lečenje bakterijskih infekcija; izborno pri čemu je bakterijska infekcija (i) uzrokovana bakterijama otpornim na jedan ili više poznatih antibiotika; (ii) infekcija urinarnog trakta izabrana od cistitisa i prostatitisa; (iii) je bakterijska crevna infekcija; (iv) bakterijska infekcija kože; (v) tuberkuloza; ili (vii) izabrana od salmoneloze, infekcije E. coli, streptokokne infekcije i Klebsiella pneumoniae.
6. Antibiotik i lek prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku smanjenja rezistencije bakterija na antibiotsku terapiju, koji sadrži istovremenu ili uzastopnu ko-primenu antibiotika i leka prema patentnom zahtevu 1.
7. Antibiotik i lek za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačeni time što se antibiotik primenjuje u poznatoj efikasnoj dozi.
8. Lek prema patentnom zahtevu 1 za upotrebu u postupku za pojačanje efikasnosti antibiotika, koji sadrži istovremeno ili uzastopno primenjivanje leka prema patentnom zahtevu 1.
9. Kombinacija prema patentnom zahtevu 5, antibiotik i lek za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 ili lek za upotrebu prema patentnom zahtevu 8; naznačeni time što je antibiotik izabran iz klase penicilina, aminoglikozida, makrolida i oksazolidinona.
10. Lek za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što se antibiotik primenjuje u 50% efikasne doze (ED50).
11. Lek, koji predstavlja tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci a) antitela na β1 domen molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (HLA-DRB1), b) antitela na β2-mikroglobulin β2-MG), c) antitela na interferon gama (IFN-γ) i d) antitela na CD4; pri čemu su višestruka serijska razblaženja decimalna, centezimalna i milesimalna razblaženja u bilo kojim odnosima razblaženja; i pri čemu su osnovne supstance u koncentraciji od 0.5 - 5.0 mg/ml.
12. Lek prema patentnom zahtevu 11 za lečenje infektivnih bolesti; izborno pri čemu infektivna bolest je (i) virusna infekcija; izborno izabrana od URI, gripa; (ii) bakterijska infekcija; (iii) mešana infekcija (iv) sekundarna infekcija; izborno pri čemu je sekundarna infekcija virusna/bakterijska pneumonija.
13. Lek prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 11, naznačen time što tehnološki obrađen proizvod koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovne supstance antitela je vodeni ili vodeno-alkoholni rastvor dobijen iz serijskih razblaženja matriksnog rastvora antitela, uz ponovljeno mućkanje svakog razblaženja; izborno pri čemu se matriksni rastvor antitela koristi u koncentraciji od 0.5 - 5.0 mg/ml.
14. Lek prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 13, naznačen time što su antitela monoklonska, poliklonska ili prirodna.
15. Lek prema patentnom zahtevu 11 formulisan kao čvrst dozni oblik, koji sadrži efikasne količine neutralnih nosećih granula impregnisanih tehnološki obrađenim proizvodom koji je rezultat višestrukih serijskih razblaženja osnovnih supstanci antitela na HLA DRB1, antitela na β2-MG, antitela na IFN-γ i antitela na CD4 kao i farmaceutski prihvatljive ekscipijense.
RS20240275A 2019-08-29 2020-08-19 Lek za lečenje infektivnih bolesti RS65255B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019127185A RU2778521C2 (ru) 2019-08-29 Лекарственное средство для лечения бактериальных инфекций
RU2019127186A RU2778522C2 (ru) 2019-08-29 Лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний
PCT/RU2020/050193 WO2021040570A1 (en) 2019-08-29 2020-08-19 Medicament and method for treating infectious diseases
EP20800353.3A EP4021505B1 (en) 2019-08-29 2020-08-19 Medicament for treating infectious diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65255B1 true RS65255B1 (sr) 2024-03-29

Family

ID=73040208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240275A RS65255B1 (sr) 2019-08-29 2020-08-19 Lek za lečenje infektivnih bolesti

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20220213197A1 (sr)
EP (1) EP4021505B1 (sr)
JP (2) JP2022545178A (sr)
CN (1) CN114375200A (sr)
BR (1) BR112022001472A2 (sr)
CY (1) CY1126747T1 (sr)
DK (1) DK4021505T3 (sr)
ES (1) ES2973183T3 (sr)
FI (1) FI4021505T3 (sr)
HR (1) HRP20240331T1 (sr)
HU (1) HUE065591T2 (sr)
MX (1) MX2022000536A (sr)
PL (1) PL4021505T3 (sr)
PT (1) PT4021505T (sr)
RS (1) RS65255B1 (sr)
SI (1) SI4021505T1 (sr)
WO (1) WO2021040570A1 (sr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117771379B (zh) * 2023-10-25 2024-08-30 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 特异性结合金黄色葡萄球菌Hla毒素的全人源抗体与抗生素的组合

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2181297C2 (ru) * 2000-06-20 2002-04-20 Эпштейн Олег Ильич Способ лечения патологического синдрома и лекарственное средство
RU2197266C1 (ru) * 2001-06-01 2003-01-27 Эпштейн Олег Ильич Лекарственное средство и способ лечения эрозивных и воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта
RU2205025C1 (ru) * 2001-12-26 2003-05-27 Гольдберг Евгений Данилович Способ коррекции иммунного ответа и лекарственное средство
RU2309732C1 (ru) * 2006-03-13 2007-11-10 Олег Ильич Эпштейн Спрессованная твердая оральная форма лекарственного препарата и способ получения твердой оральной формы лекарственного препарата
RU2363470C1 (ru) 2007-12-26 2009-08-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Самарский государственный медицинский университет Способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов
CN103096927A (zh) * 2010-07-15 2013-05-08 奥列格·伊里奇·爱泼斯坦 复合药物组合物以及治疗胃肠道功能性疾病或病症的方法
WO2012007847A2 (en) * 2010-07-15 2012-01-19 Oleg Iliich Epshtein Pharmaceutical compositions and methods of treatment
RU2521392C2 (ru) * 2010-08-06 2014-06-27 Олег Ильич Эпштейн Комплексное лекарственное средство для лечения вирусных заболеваний и способ лечения вирусных заболеваний
JP2013537532A (ja) * 2010-08-06 2013-10-03 イリイチ・エプシテイン オレグ 感染性疾患を治療及び予防する組み合わせ医薬組成物及び方法
RU2500422C2 (ru) 2010-08-06 2013-12-10 Олег Ильич Эпштейн Комплексное лекарственное средство для лечения вирусных инфекций и способ лечения вирусных инфекций
RU2655808C2 (ru) 2016-10-11 2018-05-29 Закрытое Акционерное Общество "Биологические Исследования И Системы" (Зао "Бис") Фармацевтическая комбинированная композиция для местного и наружного применения на основе бактериолитического и протеолитического комплекса ферментов

Also Published As

Publication number Publication date
PT4021505T (pt) 2024-03-11
HUE065591T2 (hu) 2024-06-28
JP2024156824A (ja) 2024-11-06
WO2021040570A1 (en) 2021-03-04
MX2022000536A (es) 2022-02-10
SI4021505T1 (sl) 2024-03-29
EP4021505B1 (en) 2023-12-13
CY1126747T1 (el) 2026-02-25
US20220213197A1 (en) 2022-07-07
HRP20240331T1 (hr) 2024-06-07
EP4021505A1 (en) 2022-07-06
ES2973183T3 (es) 2024-06-18
DK4021505T3 (da) 2024-02-12
BR112022001472A2 (pt) 2022-03-22
PL4021505T3 (pl) 2024-06-24
CN114375200A (zh) 2022-04-19
JP2022545178A (ja) 2022-10-26
FI4021505T3 (fi) 2024-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ojetti et al. Impact of Lactobacillus reuteri supplementation on anti‐Helicobacter pylori levofloxacin‐based second‐line therapy
Liu et al. A randomized, double-blind, multicenter Phase II study comparing the efficacy and safety of oral nemonoxacin with oral levofloxacin in the treatment of community-acquired pneumonia
WO2015047941A2 (en) Compositions and methods for treatment and prophylaxis of gastrointestinal diseases
JP6839329B2 (ja) ヘリコバクター・ピロリ感染症の管理のための組成物
Leelarasamee Burkholderia pseudomallei: the unbeatable foe?
CN116236479A (zh) Su3327在制备增强多黏菌素抗细菌感染效力的药物中的用途
WO2014011233A1 (en) Compositions and method for treatment and prophylaxis of inflammatory bowel disease
CN119405637A (zh) 紫萁酮在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染性肺炎药物中的应用
JP2024156824A (ja) 感染症を治療するための医薬及び方法
US20260042999A1 (en) Non-antibiotic antimicrobial compositions
KR102705354B1 (ko) 특이적인 치료학적 활성을 가진 항생제를, 동일한 치료학적 적응증과 비-전이성 항생제 내성을 가진 락토바실러스 및/또는 비피도박테리움의 동시 사용과 조합하는 병용 방법
CN117243966A (zh) 一种治疗耐碳青霉烯肺炎克雷伯氏菌感染的组合物
CN113262214A (zh) 盐酸西那卡塞在制备抗菌药物中的应用
Pacifici et al. Clinical pharmacology of ciprofloxacin in neonates: Effects and pharmacokinetics
EA049280B1 (ru) Лекарственное средство и способ лечения инфекционных заболеваний
KR20130136434A (ko) 발효된 대두 추출물의 프리바이오틱 조성물 제조를 위한 용도
Adelia et al. Non-antibiotic treatment modalities for bacterial vaginosis
RU2778521C2 (ru) Лекарственное средство для лечения бактериальных инфекций
JP2023554320A (ja) 自閉症スペクトラム症の処置のための方法および化合物
Iwao et al. In vitro and in vivo anti-Helicobacter pylori activity of Y-904, a new fluoroquinolone
US20140018324A1 (en) Method for improving tetracycline-resistance of acinetobacter baumannii
US20100113334A1 (en) Methods for reducing or preventing transmission of nosocomial pathogens in a health care facility
US20200352912A1 (en) Antimicrobial compositions and methods of using the same
KR101647899B1 (ko) 헬리코박터 균 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
RU2778522C2 (ru) Лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний