RS65281B1

RS65281B1 - 3-beta-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on za upotrebu u lečenju poremećaja koji se odnose na kanabinoide

Info

Publication number: RS65281B1
Application number: RS20240255A
Authority: RS
Inventors: Pier Vincenzo Piazza; Sandy Fabre; Mathilde Metna; Stéphanie Monlezun; Arnau Busquet-Garcia; Daniela Cota; Giovanni Marsicano; Jean-Michel Revest; Monique Vallée
Original assignee: Aelis Farma; Inst Nat Sante Rech Med; Univ Bordeaux
Priority date: 2018-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2024-03-29
Also published as: CL2020002147A1; US12447159B2; IL276697B2; WO2019162328A1; JP2021514009A; PT3755339T; SI3755339T1; ES2971103T3; US20230226076A1; EP3755339B1; PL3755339T3; IL276697A; US11484537B2; AU2019223049A1; DK3755339T3; MA51891B1; IL276697B1; KR20200122324A; CN111757740A; SMT202400112T1

Description

Opis

Ovaj pronalazak se odnosi na oblast poremećaja usled upotrebe supstanci, a posebno na oblast<poremećaja povezanih sa kanabinoidima. Odnosi se na određeni derivat pregnenolona, "3β-(4->metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on", koji se ne može metabolisati in vivo u aktivne metabolitepregnenolona i njegovu upotrebu za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima.

Preparat kanabinoida koji sadrži sintetičke CB1 agoniste ili ekstrakt dobijen iz biljke Cannabis<sativa su najčešće korišćene nedozvoljene psihoaktivne supstance u Sjedinjenim Državama i evropskim zemljama.>

U Sjedinjenim Državama, 12-mesečna prevalencija zavisnosti od kanabinoida, kako je definisano u jednom od najčešće korišćenih dijagnostičkih priručnika kao poremećaj upotrebe kanabisa, iznosi približno 3,4% među 12- do 17-godišnjacima i 1,5% među odraslim osobama starijim od 18 godina. Stope poremećaja upotrebe kanabinoida su veće među odraslim muškarcima (2,2%) nego među odraslim ženama (0,8%) i među muškarcima od 12 do 17 godina (3,8%) nego među đenskim osobama od 12 do 17 godina (3,0%). Dvanaestomesečne stope prevalencije poremećaja upotrebe kanabinoida među odraslima opadaju sa godinama, sa najvišim stopama među osobama od 18 do 29 godina (4,4%), a najnižim među pojedincima starijim od 65 godina (0,01%). Etničke i rasne razlike u prevalenciji su umerene. Upotreba kanabinoida je takođe odgovorna u SAD za 450000 prijema u hitnu pomoć godišnje (DAWN izveštaj, 2013). Kod ovih pacijenata primećuje se nekoliko<vrsta simptoma. Najčešći su: a. stanje duboke anksioznosti koje se približava napadu panike: b.>psihoza, delirijum i duboko dezorganizovano ponašanje; c. sindrom hiperemeze; d. katatoničnoponašanje (Adams et al 2017, Khan et al., 2016).

<Konačno, upotreba kanabinoida se povećava i samo će dalje eskalirati sa legalizacijom rekreativne i>medicinske upotrebe kanabisa u zapadnim zemljama, sa prevalencom većom od 30% u SAD i većinievropskih zemalja za pojedince između 16 i 24 godina. Otprilike 9% onih koji koriste kanabispostaće zavisni. Broj se penje na otprilike 1 od 6 među onima koji počnu da koriste marihuanu kaotinejdžeri i na 25 do 50% među onima koji svakodnevno puše marihuanu.

<Poremećaji u vezi sa kanabinoidima su rezultat aktivacije CB1 receptora pomoću Δ9->tetrahidrokanabinola (THC), primarnog psihoaktivnog sastojka kanabisa ili bilo kog drugog<sintetičkog jedinjenja, poput sintetičkih kanabinoida.>

<Metode koje imaju za cilj blokiranje aktivnosti CB1 kroz inhibiciju ortosteričnog vezivnog mesta, mesta na kome se endogeni ligandi vezuju da bi aktivirali receptor, su razvijeni i podneti na klinička ispitivanja za smanjenje telesne težine. Jedno od ovih jedinjenja, rimonabant, čak je stavljeno na tržište pod brendom Acomplia®. Nažalost, dostupni ortosterični antagonisti kao što je rimonabant>inhibiraju celokupnu aktivnost receptora i takođe deluju kao inverzni agonisti CB1 receptora, tj. ne samo da inhibiraju aktivaciju CB1, već i bazalnu aktivnost receptora u odsustvu endogenog liganda. Zbog ovog inverznog delovanja agonista i potpune inhibicije aktivnosti receptora, dostupne metode zasnovane na primeni ortosteričnih CB1 antagonista takođe imaju niz ozbiljnih neželjenih efekata. Zbog ovih štetnih efekata, komercijalizacija Acomplia® je obustavljena i razvoj drugih metoda za inhibiciju ortosterične lokacije CB1 je obustavljen.

Ortosterični CB1 antagonisti, a posebno Acomplia<®>, imaju sledeće poznate neželjene efekte koji ih<čine nepraktičnim sredstvima za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima:>

<1. Smanjuju unos hrane što ukazuje na opšti poremećaj sistema vrednovanja;>

<2. Izazivaju anksiozna ponašanja kod životinja i anksioznost kod ljudi;>

<3. Izazivaju depresivna ponašanja kod životinja i depresiju kod ljudi;>

<4. Povećavaju sekreciju glukokortikoida i izazivaju poremećaj hormonskog statusa subjekta.>

<Posebno povećanje glukokortikoida može povećati aktivnost dopaminergičkog sistema koji je>posredovao u efektima vrednovanja pri zloupotrebi droga uključujući kanabinoide. Povećana sekrecija glukokortikoida onda može rezultirati povećanom osetljivošću na efekte kanabinoida koji mogu da se suprotstave terapeutskim efektima CB1 inhibitora na poremećaje povezane sa kanabinoidima;

5. Izazivaju povlačenje kod životinja zavisnih od THC-a;

6. Izazivaju konvulzije i opšte poremećaje u ponašanju i kliničku sliku u GLP bezbednosnim farmakološkim i toksikološkim studijama;

<7. Imaju hepatotoksične efekte.>

<Nedavno je otkriveno da kada se CB1 receptor preterano aktivira sintetičkim kanabinoidima ili veoma visokim dozama THC-a, prilično većim od doze THC-a koju koriste korisnici kanabisa, koncentracija steroidnog hormona pregnenolona raste (3000%) u mozgu. Pregnenolon se zatim vezuje za specifično mesto na CB1 receptoru, različito od onog koji vezuju CB1 agonisti kao što je THC, i deluje kao endogeni signalno specifični inhibitor CB1 receptora (eCB1-SSi). Dakle, pregnenolon selektivno inhibira CB1 indukovanu aktivaciju MAPK (Mitogen-Aktivirana Protein Kinaza) putanje, ali ne inhibiciju adenilat ciklaze izazvanu CB1. Uprkos ovom ograničenom molekularnom delovanju, kada se pregnenolon primenjuje pre izlaganja THC-u, on inhibira većinu>efekata ponašanja posredovanih THC-om kod glodara (Vallée et al., 2014).

Busquets-Garcia i dr. takođe pokazuju da pregnenolon može da blokira čitav spektar neuslovljenih efekata THC-a koji su povezani sa simptomima sličnim psihotičnostima koji se primećuju nakon upotrebe kanabinoida kod ljudi. Time sugeriše da se lekovi koji oponašaju aktivnost pregnenolona mogu koristiti za lečenje akutnih psihotičnih stanja (CIAPS) izazvanih kanabinoidima (Busquets-Garcia et al., 2017).

Iz ovih razloga, izgleda da je pregnenolon obećavajući tretman poremećaja povezanih sa kanabinoidima.

<Međutim, pregnenolon se ne može koristiti kao farmakološki tretman jer je slabo dostupan, ima veoma kratko vreme poluraspada i dalje se pretvara u aktivne steroide.>

<17-metilpregnenolon, 3-fluoro-17-metilpregnenolon, testirana su na pacovima ili miševima nakon>stimulacije THC-om i/ili nakon nedostatka hrane. Ova jedinjenja su bila u stanju da inhibiraju efekte aktivacije CB1 na unos hrane.

Druga jedinjenja, a posebno 3β-benziloksipregnenolon su testirana na njihovu sposobnost da inhibiraju: i. efekti kanabinoidne tetrade izazvane THC-om (smanjenje telesne temperature i lokomotorne aktivnosti); ii. Povećanje unosa hrane izazvano THC-om, tipičan efekat aktivacije CB1;<iii. povećanje TNFalfa izazvano LPS-om, još jedan efekat tipičan za CB1 antagoniste.>

WO2014/083068 otkriva "3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20 on" i njegovu upotrebu zainhibiciju CB1 receptora, međutim na veoma opšti način. Ne pominje se posebno inhibiranje aktivacije CB1 uzrokovano THC-om.

<Međutim, ne postoje odobreni farmakološki tretmani za poremećaje povezane sa kanabinoidima, što je posledično važna, a nezadovoljena medicinska potreba.>

Shodno tome, ostaje potreba za lečenjem poremećaja povezanih sa kanabinoidima.

Razvijanje lečenja poremećaja povezanih sa kanabinoidima zasnovano na specifičnoj inhibiciji CB1 receptora za signalizaciju koji se može koristiti kod ljudi predstavlja nekoliko izazova. Dakle, takvo jedinjenje treba istovremeno da pokazuje sve sledeće karakteristike:

<1. Trebalo bi da inhibira aktivnost CB1 receptora na selektivan i signalno specifičan način.>

<2. Trebalo bi da inhibira širok spektar neuslovljenih i uslovljenih bihevioralnih efekata CB1 agonista da bi bio od koristi za lečenje različitih poremećaja povezanih sa kanabinoidima. Ovo je poseban izazov za signalni specifični inhibitor. Pošto ovo jedinjenje modifikuje samo određene ćelijske>efekte aktivacije CB1 agonistom. Shodno tome, nemoguće je predvideti koji će, među različitim efektima kanabinoida u ponašanju, biti modifikovan signalno specifičnim inhibitorom.

3. Trebalo bi da bude lišen poznatih štetnih efekata CB1 inhibitora. Naročito ne bi trebalo da izazove: a. smanjenje unosa hrane; b. povećanje ponašanja povezanih sa anksioznošću i depresijom; c. povećanje sekrecije glukokortikoida; d. povlačenje kod životinja zavisnih od THC-a; e. konvulzije i<kliničke znake poremećaja centralnog nervnog sistema; f. hepatotoksičnost.>

<4. Ne bi trebalo da ima nespecifične efekte na ponašanje uključujući, ali ne ograničavajući se na>sedaciju, ekscitabilnost, izmenjeno spontano ponašanje koje može da ometa njegove terapeutske efekte.

5. Trebalo bi da se dobro apsorbuje, da je stabilno i da se ne transformiše in vivo, u značajnim<količinama nizvodnih metabolita koji mogu imati neželjene efekte, uključujući ali ne ograničavajući>se na aktivne steroide.

6. Trebalo bi da pristupi mozgu tako da je on ciljni organ terapeutskog sredstva za lečenje<poremećaja povezanih sa kanabinoidima.>

<7. Ne bi trebalo da modifikuje glavne metaboličke enzime tela i transportere koji mogu da izazovu modifikacije na nivou ili aktivnosti endogenih molekula ili egzogenih terapijskih lekova.>

<8. Trebalo bi da ima dobar terapeutski indeks (odnos između aktivne doze i doze koja pokazuje neželjene efekte). Prihvatljivim terapeutskim indeksom se generalno smatra najmanje 10.>

Uopštenije, praktično nijedno jedinjenje koje se koristi za lečenje poremećaja ponašanja nema sveove karakteristike. Dakle, tri glavne klase psihoaktivnih lekova, anksiolitici, antidepresivi i neuroleptici izazivaju štetne efekte u ponašanju u rasponu terapijskih doza. Na primer: a.

Anksiolitici izazivaju pospanost, smanjuju budnost i narušavaju pamćenje; b. Antidepresiv izaziva ekscitabilnost, nesanicu i smanjenje libida; c. Neuroleptik izaziva hormonalni poremećaj, sedaciju, diskineziju i nevoljno kretanje.

Shodno tome, jedinjenje koje ima sve karakteristike opisane u tačkama od 1 do 8 ne bi bilo samo velika inovacija za lek dizajniran za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima, već i velika inovacija za čitavo polje psihoaktivnih lekova koji imaju za cilj lečenje poremećaja ponašanja.

<SUŠTINA PRONALASKA>

Ovaj pronalazak se generalno odnosi na specifičan derivat pregnenolona za njegovu upotrebu za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima.

Tačnije, pronalazak se odnosi na jedinjenje Formule (I)

<Zaista, jedinjenje pronalaska ima jedinstvenu karakteristiku da ima sva dole opisana svojstva koja ga čine veoma inovativnim terapeutskim sredstvom za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima.>

<1. Selektivno inhibira aktivnost CB1 receptora na signalno specifičan način;>

2. Veoma je moćan u inhibiciji velikog spektra neuslovljenih i uslovljenih efekata na ponašanje CB1 agonista i stoga može biti od koristi za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima;

3. Lišen je poznatih štetnih efekata CB1 inhibitora i antagonista. Posebno ne: a. smanjuje unos hrane; b. povećava ponašanja vezana za anksioznost i depresiju; c. povećava sekreciju glukokortikoida; d. ubrzava povlačenje kod životinja zavisnih od THC-a; e. izaziva konvulzije i<oštećenje i kliničke znakove povezane sa centralnim nervnim sistemom; f. indukuje toksičnost jetre u GLP studijama.>

<4. Nema nespecifične efekte u ponašanju kao što su sedacija, ekscitabilnost, izmenjeno spontano ponašanje koje bi moglo da ometa njegovo terapijsko delovanje.>

<5. Dobro se apsorbuje, stabilan je i ne transformiše se u značajnim količinama u nizvodne>metabolite.

6. Pristupa mozgu.

7. Ne modifikuje glavne telesne metaboličke enzime i transportere.

8. Ima odličan terapeutski indeks >7200.

KRATAK OPIS CRTEŽA

SLIKA 1: Dijagram toka sinteze jedinjenja formule (I) (3pMBP).

SLIKE 2: In vitro efekti 3pMBP na THC-indukovane modifikacije CB1-posredovane signalizacije i ćelijske aktivnosti.

SLIKA 2A: Efekat 3pMBP (0, 1, 10 i 100 nM) na THC-indukovanu fosforilaciju MAPK. OdnosP-MAPK/CoxIV iz ćelija HEK293 stabilno transfektovanih sa hCB1.

SLIKA 2B: Efekat 3pMBP (0, 1, 10 i 100 nM) na THC-indukovanu fosforilaciju MAPK. OdnosP-MAPK/MAPK iz ćelija HEK293 prolazno transfektovanih sa hCB1.

<SLIKA 2C: Efekat 3pMBP (1 nM, 10 nM, 100 nM i 1 μm) na THC indukovano smanjenje nivoa cAMP>u CHO ćelijama koje su stabilno transfektovane sa hCB1. NT= Nije Tretirano, tj. ćelije koje su primilei nosač 3pMBP i THC.

SLIKA 2D: Efekat 3pMBP (0, 1, 10 i 100 nM) na THC-indukovanu inhibiciju ćelijske respiracije u<ćelijama HEK293 koje su prolazno transfektovane sa hCB1.>

***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05, grupe tretirane THC-om naspram grupe tretirane nosačem THC-a;###p<0,001; ##p<0,01; #p<0,05, grupe tretirane sa 3pMBP+THC naspram grupe tretiranenosačem 3pMBP (0 nM) THC. (A, B Tukey test, D. Dunnett test).

SLIKE 3: Efekti 3pMBP na THC-indukovanu hiperfagiju, psihomotornu stimulaciju i oštećenjeprepulsne inhibicije:

***p<0,001, THC u odnosu na nosilac THC-a; ###p<0,001, 3pMBP+THC u odnosu na nosač od 3pMBP (0 μg/kg) THC (Dunnett test).

<Neprekidne crne linije odgovaraju sredstvima; isprekidane crne linije odgovaraju SEM vrednostima grupa tretiranih nosačem THC-a (VEH) ili THC-om u odsustvu 3pMBP. Crni krugovi, srednje>vrednosti ± SEM za grupe tretirane sa 3pMBP i THC.

p>0,05, 3pMBP (0,00015 mg/kg)+THC u odnosu na nosač od 3pMBP THC,

p<0,01, 3pMBP (0,0005 mg/kg)+THC u odnosu na nosač od 3pMBP THC,

p<0,001, 3pMBP (0,0015 mg/kg)+THC, 3pMBP (0,015 mg/kg)+THC i 3pMBP (0,15 mg/kg)+THC u odnosu na nosač 3pMBP+THC. (Dunnett test nakon jednosmerne ANOVA, p<0,001).

Neprekidne crne linije odgovaraju sredstvima; isprekidane crne linije odgovaraju SEM vrednostimagrupa tretiranih nosačem THC-a (VEH) ili sa THC-om u odsustvu 3pMBP. Crni krugovi, srednje vrednosti ± SEM za grupe tretirane sa 3pMBP i THC.

0,05, 3pMBP (0,0015 mg/kg)+THC i 3pMBP (0,005 mg/kg)+THC u odnosu na nosač od 3pMBP THC,>

<p<0,05, 3pMBP (0,015 mg/kg)+THC i 3pMBP (0,05 mg/kg)+THC u odnosu na nosač od 3pMBP>+THC,

p<0,01, 3pMBP (0,03 mg/kg)+THC u odnosu na nosač od 3pMBP THC

(Dunnett test nakon jednosmerne ANOVA, p<0,001).

SLIKE 4: Efekti 3pMBP na THC-indukovana oštećenja radne memorije, prepoznavanje objekata,društvene interakcije i testiranje stvarnosti.

<SLIKA 4A: 3pMBP (per os) doza u zavisnosti od doze sprečava kod miševa oštećenje radne memorije izazvano sa THC-om (5 mg/kg) u vodenom lavirintu. **p<0,01, THC u odnosu na nosač>THC-a (VEHTHC; Dunett test). #p<0,05, 3pMBP+THC u odnosu na nosač od 3pMBP (0 mg/kg) THC (Dunnett test).

***p<0,001, Poznati u odnosu na Novi objekat (Sidak test).

###p<0,001, vreme istraživanja novog objekta: nosač 3pMBP (0 mg/kg) THC naspram nosača 3pMBP (0 mg/kg) i bez THC-a ili naspram 3pMBP+THC (Sidak test).

**p<0,01, THC u odnosu na nosač THC-a (VEHTHC; Dunett test).

###p<0,001; #p<0,05, 3pMBP+THC u odnosu na nosač od 3pMBP (0 mg/kg) THC (Dunnett test).

<SLIKA 4D: 3pMBP (per os) u zavisnosti od doze sprečava kod miševa oštećenje testiranja stvarnosti>izazvano THC-om (1 mg/kg).

*p<0,05, THC u odnosu na nosač THC-a (VEHTHC; neupareni t-test).

SLIKE 5: Efekti 3pMBP na katalepsiju izazvanu THC-om, uslovljeno razdvajanje i oslobađanjedopamina u nukleus akumbensu.

<***p<0,001, THC u odnosu na THC nosač (Mann-Whitney test).>

#p<0,05, 3pMBP+THC u odnosu na nosač od 3pMBP (0 mg/kg) THC (Mann- Whitney test).

<(10 mg/kg). Srednji ± SEM broj razdvajanja izazvanih rastvorom saharina uparenog sa THC-om kada se prethodno tretira sa 3pMBP (0,005 i 0,015 mg/kg) ili nosačem 3pMBP (0 mg/kg) tokom>kondicioniranja i testnog ispitivanja.

*p<0,05, 3pMBP+THC u odnosu na nosač 3pMBP (0 mg/kg) THC (jednosmerna ANOVA, glavni efekat primene 3pMBP).

SLIKA 5C: 3pMBP inhibira povećanje odliva dopamina tokom vremena u nukleus akumbensupacova tretiranih THC-om (1 mg/kg). Crna strelica, vreme ubrizgavanja THC-a.

<SLIKA 5D: 3pMBP smanjuje srednje površine ispod krive (AUC, izračunato od vremena "0" do 60>min za svaku grupu) odliva dopamina u nukleus akumbensu pacova tretiranih THC-om (1 mg/kg).***p<0,001; **p<0,01, 3pMBP+THC naspram nosača 3pMBP (0 mg/kg) THC (Dunnett test).

<SLIKA 6: Efekti 3pMBP na intravensku samoprimenu WIN 55,212-2 kod miševa. 3pMBP (per os) smanjuje WIN 55-512,2 (0,0125 mg/kg/infuziju; iv) samo-primenu kod miševa. Broj infuzija tokom sticanja samoadministriranja (prvih 10 sesija, crni popunjeni krugovi) i tokom sesija samo->administriranja sa 3pMBP (0,005 mg/kg, sesije 11-14 i 0,015 mg/kg, sesije 15-18; sivi kvadrati ) ili sa nosačem od 3pMBP (0 mg/kg, beli popunjeni krugovi).

*p<0,05, grupa tretirana 3pMBP (0,015 mg/kg) u odnosu na nosač (0 mg/kg) (dvosmerna ANOVA, glavni efekat primene 3pMBP).

SLIKE 7 Efekti 3pMBP na samoprimenu i vraćanje THC-a kod majmuna

<SLIKA 7A: 3pMBP doza zavisno od doze smanjuje broj injekcija THC-a kod veveričastih majmuna tokom intravenskog samo-administriranja (sesije od 1 sata) THC-a (4 μg/kg/injekcija) pod fiksnim>odnosom deset (FR10)

*p < 0,05, u odnosu na nosač od 3pMBP THC (Bonferroni test).

<SLIKA 7B: 3pMBP doza zavisno od doze smanjuje stope odgovora za THC kod veveričastih majmuna tokom intravenskog samo-administriranja (sesije od 1 sata) THC-a (4 μg/kg/injekcija)>pod fiksnim odnosom deset (FR10).

*p < 0,05, u odnosu na nosač od 3pMBP THC (Bonferroni test).

<SLIKA 7C: 3pMBP (per os) smanjuje THC-indukovano ponovno uspostavljanje (0,04 mg/kg)>traženja leka kod majmuna. Traka predstavlja srednju vrednost ± SEM (n = 4) broja ubrizgavanja<nosača. "0 mg/kg" predstavlja nosač od 3pMBP.>

*p < 0,05, u odnosu na 'priming nosača' (Tukeiy test).

#p < 0,05, u odnosu na 'THC priming', (Tukey test).

<SLIKA 7D: 3pMBP (per os) smanjuje stopu odgovora tokom testa za ponovno uspostavljanje THC-indukovanog (0,04 mg/kg) traženja leka kod majmuna. Crtica predstavlja srednju vrednost ± SEM>(n = 4) stopa odgovora. "0 mg/kg" predstavlja nosač od 3pMBP.

*p < 0,05, u odnosu na 'priming nosača' (Tukey test).

#p < 0,05, u odnosu na 'THC priming', (Tukey test).

SLIKE 8 Efekti 3pMBP i rimonabanta na unos hrane i telesnu težinu i na povlačenje izazvano THC-om.

U poređenju sa životinjama koje su tretirane nosačem (VEH), Rimonabant (Rimo 10 mg/kg; ip), aline i 3pMBP (0,005, 0,015, 0,05, 5 i 15 mg/kg; per os), smanjuje telesnu težinu kod gojaznih miševa. Dani 1 do 4: nema značajnog efekta rimonabanta.

Dani 7 do 15: p<0,01, Rimo vs VEH (Dunnett test).

U poređenju sa životinjama koje su tretirane nosačem (VEH), Rimonabant (Rimo 10 mg/kg; ip), aline i 3pMBP (0,005, 0,015, 0,05, 5 i 15 mg/kg; per os), smanjuje unos hrane kod gojaznih miševa. Dan 1 do 5: p<0,001, Rimo naspram VEH (Tukey test).

<Rimonabant (Rimo, 10 mg/kg; ip), ali ne i 3pMBP (0,15 mg/kg; per os) povećava trajanje drhtanja>glavom kod miševa koji su primili ponovljeni tretman sa THC-om (20 mg/kg; ip) u poređenju sa životinjama koje su više puta tretirane THC-om koje su primale injekciju nosača (VEH).

***p<0,001; VEH-THC naspram Rimo-THC grupe (Studentski t-test).

<Rimonabant (Rimo, 10 mg/kg; ip), ali ne 3pMBP (0,15 mg/kg; per os) povećava trajanje tremora>šapa kod miševa koji su primili ponovljeni tretman sa THC-om (20 mg/kg; ip) u poređenju sa životinjama koje su više puta tretirane THC-om koje su primale injekciju nosača (VEH).

*p<0,05; VEH-THC naspram Rimo-THC grupe (Studentski t-test).

SLIKE 9: Efekti ponovljenih administracija 3pMBP ili rimonabanta na anksioznost i ponašanjepovezano sa depresijom kod miševa.

<SLIKA 9A: Efekti kod miševa ponovljenih (28 dana, jednom dnevno) primena 3pMBP (0, 0,05, 5, 15 mg/kg, per os) ili rimonabanta (Rimo 0 i 10 mg/kg; ip) na anksiozno ponašanje kako je mereno>procentom vremena provedenog u otvorenim krakovima podignutog plus lavirinta.3pMBP nemauticaja na vreme provedeno u otvorenim krakovima, dok rimonabant smanjuje vreme provedeno u otvorenim krakovima.

<SLIKA 9B: Efekti kod miševa ponovljenih (28 dana, jednom dnevno) primena 3pMBP (0, 0,05; 5; 15 mg/kg, per os) ili rimonabanta (Rimo 0 i 10 mg/kg; ip) na anksiozno ponašanje kako je mereno>procentom ulaženja u otvorene krakove podignutog plus lavirinta.3pMBP nema uticaja na ulaženjeu otvorene krakove, dok rimonabant smanjuje procenat ulaženja u otvorene krakove.

**p<0,01; *p<0,05; Rimo naspram nosača (0 mg/kg) (Studentski t-test).

<SLIKA 9C: Efekti kod miševa ponovljenih (28 dana, jednom dnevno) primena 3pMBP (0, 0,05; 5;>15 mg/kg, per os) na ponašanje povezano sa depresijom mereno u testu preferencije saharoze.3pMBP nema uticaja na unos saharoze.

<SLIKA 9D: Efekti kod miševa ponovljenih (28 dana, jednom dnevno) primena rimonabanta (Rimo 0>i 10 mg/kg; ip) na ponašanje povezano sa depresijom mereno u testu preferencije saharoze.

Rimonabant smanjuje unos saharoze (kašnjenje od 8.30 do 22.00). *p<0,05, Rimo u odnosu nanosač (0 mg/kg) (Studentskit-test).

SLIKE 10: Efekat 3pMBP na koncentraciju kortikosterona u plazmi kod miševa.

SLIKA 10A: Kod mužjaka miševa, primena 3pMBP (0,3 ili 10 mg/kg; per os) ili nosača (VEH) nema značajan uticaj na koncentracije kortikosterona u plazmi merene 2, 5, 8 i 24 sata nakon primene.

SLIKA 10B: Kod ženki miševa, primena 3pMBP (0,3 ili 10 mg/kg; per os) ili nosača (VEH) nema značajan uticaj na koncentracije kortikosterona u plazmi merene 2, 5, 8 i 24 sata nakon primene.

Podaci su predstavljeni u log(10) skali.

Ovaj pronalazak se generalno odnosi na jedinjenje Formule (I):

<Jedinjenje iz ovog pronalaska, 3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on, ne blokira celokupnu>aktivnost ciljnog receptora, već samo deo njegove aktivnosti. Specifični ciljni receptor jedinjenja iz ovog pronalaska je CB1 receptor.

Jedinjenje Formule (I) je u stanju da reprodukuje efekte novootkrivenog moždanog mehanizma koji<obezbeđuje endogenu negativnu povratnu spregu, regulišući prekomernu aktivaciju CB 1. Važno je napomenuti da se ovaj regulatorni mehanizam pokreće samo kada je CB 1 snažno prekomerno>aktiviran, ali ne kada je aktivacija receptora unutar više fiziološkog opsega. Zbog toga je jedinjenje iz ovog pronalaska izuzetno snažno u blokiranju efekata CB1 agonista THC-a i stoga je efikasno za<lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima. Štaviše, zbog svog signalno specifičnog mehanizma delovanja, jedinjenje ovog pronalaska nema efekta na ponašanje samo po sebi kod>zdravih subjekata kod kojih CB1 nije aktiviran kanabinoidima.

Mehanizam delovanja jedinjenja ovog pronalaska je u ovom pogledu veoma različit od onog koje je<među CB1 ortosteričnim antagonistima, koji blokiranjem vezivanja endogenih i egzogenih agonista CB 1 receptora, indukuju potpunu inhibiciju svih CB1 aktivnosti i poremećuju ponašanje po sebi. Osim toga, mehanizam delovanja antagonista ne postoji fiziološki, odnosno, koliko je nama poznato,>ne postoje endogena jedinjenja, koja poput antagonista blokiraju vezivanje CB1 agonista za receptor. Zbog veštačke prirode ovog mehanizma delovanja, ovi antagonisti, pored toga što ispravljaju prekomernu aktivaciju ciljnog receptora, generalno snižavaju njegovu aktivnost ispod bazalnih nivoa, remeteći fiziologiju i stvarajući neželjene efekte.

<Drugačiji mehanizam delovanja između jedinjenja iz ovog pronalaska i ortosteričnih antagonista,>kao što je rimonabant, objašnjava zašto oba leka mogu da inhibiraju THC efekte, ali ne dele drugeefekte ponašanja.

<Dakle, jedinjenje iz ovog pronalaska nije CB1 antagonist i kao takvo ne blokira sve ćelijske efekte>THC-a, kao što to čini ortosterični CB1 antagonist rimonabant. U stvari, jedinjenje iz ovogpronalaska transformiše THC u cAMP-prijemčivi agonist CB 1.

<Prijemčivi agonist je jedinjenje koje je u stanju da aktivira samo neke od ćelijskih efekata posredovanih njegovim ciljnim receptorom. U slučaju CB1, dva glavna efekta agonista, kao što je THC, su da istovremeno inhibiraju proizvodnju cAMP i stimulišu aktivnost MAPK. Prijemčivi agonist CB1 bi tada bio u stanju ili da selektivno inhibira cAMP (cAMP-prijemčivi CB1 agonist) ili da aktivira>MAPK (MAPK prijemčivi CB1 agonist). Kada je jedinjenje iz ovog pronalaska uključeno, THC je i dalje u stanju da inhibira proizvodnju cAMP, ali ne i da aktivira MAPK.

Drugim rečima, jedinjenje iz ovog pronalaska je transformisalo THC u agonist koji je prijemčiv na cAMP.

Pretklinički podaci dobijeni sa jedinjenjem iz ovog pronalaska ukazuju na to da kao cAMP-<prijemčivi agonist, THC gubi većinu svojih neuslovljenih i uslovljenih bihevioralnih efekata, što>postaje manje pojačano i manje sposobno da ponovo uspostavi traženje leka nakon periodaukidanja leka.

<Međutim, THC i dalje ima neke od svojih ćelijskih efekata. Ovo je verovatno razlog zašto jedinjenje iz ovog pronalaska ne izaziva povlačenje kod miševa zavisnih od THC, dok rimonabant to čini. Povoljno je da jedinjenje iz ovog pronalaska ne pokazuje efekte ponašanja CB1 antagonista. Zaista, CB1 ortosterični antagonisti blokiraju celokupnu ćelijsku aktivnost receptora, dok jedinjenje iz ovog pronalaska blokira samo neke od njih.>

Još uvek povoljno i generalno, nikakvi neželjeni efekti nisu primećeni kod jedinjenja ovog pronalaska.

Nedostatak štetnih efekata, i u mnogim slučajevima, nikakav efekat jedinjenja ovog pronalaska na glodare i pse verovatno su posledica specifične strukture, mehanizma delovanja i karakteristikaadsorpcije/distribucije/metabolizma/izlučivanja jedinjenja sadašnjeg pronalaska.

<Pronalazači pokazuju da jedinjenje pronalaska ima prateće karakteristike koje ga čine jedinstvenim idealnim alatom za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima. Ove karakteristike uključuju, ali nisu ograničene na:>

<1. Jedinjenje iz ovog pronalaska ima jedinstven mehanizam delovanja skrojen kao endogeni moždani mehanizam za prevazilaženje prekomerne aktivacije CB1 receptora, ali izgleda da nema efekta na bazalnu aktivnost receptora. Poremećaj bazalne aktivnosti ciljnog sistema je često>odgovoran za neke od štetnih efekata antagonista. Pored toga, jedinjenje iz ovog pronalaska je veoma selektivno i ne stupa u interakciju ni sa jednim od 85 testiranih receptora. Efekti van cilja su često odgovorni za neke od štetnih efekata novih hemijskih entiteta. Ćelijska aktivnost CB1 receptora se zatim inhibira na selektivan i signalno-specifičan način.

2. Jedinjenje iz ovog pronalaska pokazuje in vivo veoma visoku moć u inhibiciji velikog spektra neuslovljenih i uslovljenih efekata CB1 agonista uključujući, ali ne ograničavajući se na THC.

3. Jedinjenje iz ovog pronalaska nema nijedan od štetnih efekata ortosteričnih CB1 antagonista,<uključujući, ali ne ograničavajući se na: a. smanjenje unosa hrane; b. povećanje ponašanja>povezanih sa anksioznošću i depresijom: c. povećanu sekreciju glukokortikoida; d. ubrzano<povlačenje kod životinja zavisnih od THC-a; e. indukciju kloničnih konvulzija i klinički znak koji se odnosi na oštećenje centralnog nervnog sistema; f. hepatotoksičnost.>

4. Jedinjenje iz ovog pronalaska ne izaziva nikakve relevantne promene u ponašanju per se, čak ipri dozama koje su hiljade puta veće od ID50 za inhibiciju THC-a.

5. Jedinjenje iz ovog pronalaska ima dobre karakteristike apsorpcije, distribucije, metabolizma i<izlučivanja sa ne značajnom konverzijom u glavne metabolite uključujući ali ne ograničavajući se na nizvodno aktivne steroide.>

<6. Jedinjenje iz ovog pronalaska predstavlja dobar pristup mozgu.>

<7. Jedinjenje iz ovog pronalaska ne modifikuje aktivnost glavnog endogenog metaboličkog enzima i transportnih sistema.>

<8. Jedinjenje iz ovog pronalaska nema štetne i toksične efekte, in vitro i in vivo, u dozama hiljadama puta većim od ID50 za inhibiciju THC efekata. Shodno tome, jedinjenje iz ovog pronalaska ima veoma dobar terapeutski indeks >7200.>

U skladu sa ovim pronalaskom, "poremećaji povezani sa kanabinoidima" ili "poremećaji povezani sa kanabinoidima" ili "CRD" uključuju poremećaj usled upotrebe kanabinoida (CUD); Kanabinoidna intoksikacija; Naknadno dejstvo kanabinoida; Drugi poremećaji izazvani kanabinoidima;

Nespecifikovani poremećaj povezan sa kanabinoidima; Sindrom hiperemeze kanabinoida, Katatonija izazvana kanabinoidima i svi poremećaji koji se mogu pripisati upotrebi kanabinoida.

Da bismo dali primer glavnih poremećaja povezanih sa kanabinoidima (CRD), ovde koristimo kriterijume petog izdanja Dijagnostičkog i statističkog priručnika za mentalne poremećaje (DSM-5™) koji se odnosi na kanabis i sintetičke kanabinoide.

Međutim, ovo nije isključivi opis poremećaja povezanih sa kanabinoidima, već obuhvata slične poremećaje opisane u drugim dijagnostičkim priručnicima uključujući, ali ne ograničavajući se na<Međunarodnu klasifikaciju bolesti (Svetska zdravstvena organizacija) i uopšteno sve poremećaje izazvane preparatima dobijenim od kanabisa ili koji sadrže sintetičke kanabinoide.>

<Primeri takvih poremećaja dobro su opisani u publikaciji Svetske zdravstvene organizacije iz 2016. pod naslovom „Zdravstveni i društveni efekti nemedicinske upotrebe kanabisa“. Kratkoročni efekti>upotrebe kanabinoida uključuju poremećaje kao što su oštećenje kognicije i koordinacije, anksioznost i psihotične simptome, akutnu toksičnost, akutne kardiovaskularne efekte i akutne efekte na pluća i disajne puteve. Dugotrajna upotreba kanabinoida podrazumeva ne samo štetne ishode psihosocijalnog i mentalnog zdravlja, već i kardiovaskularne poremećaje povezane sa kanabinoidima i ishemijski moždani udar povezan sa kanabinoidima.

<„Poremećaj upotrebe kanabinoida“ ili „CUD“ treba shvatiti kao problematičan obrazac upotrebe kanabinoida koji vodi do klinički značajnog oštećenja ili uznemirenosti, što se manifestuje sa>najmanje dva od sledećih, a koja se javljaju u periodu od 12 meseci:

1. Kanabinoidi se često uzimaju u većim količinama ili tokom dužeg perioda nego što je bilopredviđeno.

<2. Postoji uporna želja ili neuspešni napori da se smanji ili kontroliše upotreba kanabinoida. 3. Mnogo vremena se provodi u aktivnostima neophodnim za dobijanje kanabinoida, upotrebu kanabinoida ili oporavak od njegovih efekata.>

<4. Žudnja, ili snažna želja ili nagon za upotrebom kanabinoida.>

5. Ponavljajuća upotreba kanabinoida dovodi do neispunjavanja ključnih uloga na poslu, u školi ili kod kuće.

6. Kontinuirana upotreba kanabinoida uprkos postojanim ili periodičnim društvenim ili<međuljudskim problemima uzrokovanim ili pogoršanim efektima kanabinoida.>

<7. Odustaje se od ili se smanjuju važne društvene, profesionalne ili rekreativne aktivnosti zbog upotrebe kanabinoida.>

<8. Ponovljena upotreba kanabinoida u situacijama u kojima je to fizički opasno.>

<9. Upotreba kanabinoida se nastavlja uprkos saznanju o postojanom ili ponavljajućem fizičkom ili psihičkom problemu koji je verovatno bio uzrokovan ili pogoršan kanabinoidima.>

<10. Tolerancija, kako je definisano bilo kojim od sledećih:>

<a. Potreba za značajno povećanom količinom kanabinoida da bi se postigla intoksikacija ili željeni efekat.>

<b. Primetno smanjen efekat uz nastavak upotrebe iste količine kanabinoida.>

<11. Naknadno dejstvo, koje se manifestuje bilo kojim od sledećih:>

a. Karakterističan sindrom naknadnog dejstva kanabinoida.

b. Kanabinoidi (ili blisko povezana supstanca) se uzimaju da bi se ublažili ili izbegli simptomi naknadnog dejstva.

Prema DSM-5™, poremećaj upotrebe kanabinoida će se smatrati „blagim” ako su prisutna 2 do 3 simptoma, „umerenim” ako je prisutno 4 do 5 simptoma i „ozbiljnim” ako je prisutno 6 ili više simptoma.

Kako se ovde koristi, „Intoksikacija kanabinoidima“ treba da se dijagnostikuje prema sledećim kriterijumima:

A. Nedavna upotreba kanabisa ili sintetičkog kanabinoida.

B. Klinički značajne problematične promene u ponašanju ili psihološke promene (npr. poremećena<motorička koordinacija, euforija, anksioznost, osećaj usporenog vremena, narušeno rasuđivanje, socijalno povlačenje) koje su se razvile tokom ili ubrzo nakon upotrebe kanabinoida.>

<C. Dva (ili više) od sledećih znakova ili simptoma koji se razvijaju u roku od 2 sata od upotrebe kanabinoida:>

<1. Konjunktivalna injekcija.>

2. Povećan apetit.

3. Suva usta.

4. Tahikardija.

D. Znaci ili simptomi se ne mogu pripisati drugom zdravstvenom stanju i nisu bolje objašnjeni drugim mentalnim poremećajem, uključujući intoksikaciju drugom supstancom.

<B. Tri (ili više) od sledećih znakova i simptoma se razvijaju u roku od približno 1 nedelje nakon Kriterijuma A:>

<1. Razdražljivost, bes ili agresija.>

<2. Nervoza ili anksioznost.>

<3. Poteškoće sa spavanjem (npr. nesanica, uznemirujući snovi).>

<4. Smanjen apetit ili gubitak težine.>

<5. Nemir.>

<6. Depresivno raspoloženje.>

7. Najmanje jedan od sledećih fizičkih simptoma koji izazivaju značajnu nelagodnost: bol u stomaku, drhtanje/tremor, znojenje, groznica, mrzlica ili glavobolja.

C. Znaci ili simptomi u Kriterijumu B izazivaju klinički značajan stres ili oštećenje u društvenim, profesionalnim ili drugim važnim oblastima funkcionisanja.

D. Znaci ili simptomi se ne mogu pripisati drugom zdravstvenom stanju i nisu bolje objašnjeni drugim mentalnim poremećajem, uključujući intoksikaciju ili odvikavanje od druge supstance. Prema DSM-5™, "Ostali poremećaji izazvani kanabinoidima" su poremećaj anksioznosti izazvan kanabinoidima; psihotični poremećaj izazvan kanabinoidima; poremećaj spavanja izazvan kanabinoidima; delirijum usled intoksikacije kanabinoidima. Ovi poremećaji izazvani kanabinoidima se dijagnostikuju umesto intoksikacije kanabinoidima ili naknadnih dejstava kanabinoida kada su simptomi dovoljno jaki da zahtevaju nezavisnu kliničku pažnju.

<„Psihotični poremećaj izazvan kanabinoidima“ treba da se dijagnostikuje prema sledećim kriterijumima:>

<A. Prisustvo jednog ili oba sledeća simptoma:>

<1. Deluzije.>

<2. Halucinacije.>

<B. Postoje dokazi iz istorije, fizičkog pregleda ili laboratorijskih nalaza oba (1) i (2):>

1. Simptomi u Kriterijumu A razvili su se tokom ili ubrzo nakon intoksikacije kanabinoidima ili naknadnog dejstva ili nakon izlaganja lekovima.

2. Uključeni kanabinoidi su sposobni da izazovu simptome u Kriterijumu A.

C. Poremećaj se ne može bolje objasniti psihotičnim poremećajem koji nije izazvan supstancama. Takvi dokazi nezavisnog psihotičnog poremećaja mogu uključivati sledeće:

<D. Poremećaj se ne javlja isključivo tokom delirijuma.>

<E. Poremećaj uzrokuje klinički značajan stres ili oštećenje u društvenim, profesionalnim ili drugim važnim oblastima funkcionisanja.>

<„Anksiozni poremećaj izazvan kanabinoidima“ treba da se dijagnostikuje prema sledećim kriterijumima:>

<A. U kliničkoj slici dominiraju napadi panike ili anksioznost.>

1. Simptomi u Kriterijumu A razvili su se tokom ili ubrzo nakon intoksikacije kanabinoidima ili odvikavanja ili nakon izlaganja kanabinoidima.

2. Uključeni kanabinoidi su sposobni da izazovu simptome iz Kriterijuma A.

C. Poremećaj se ne može bolje objasniti anksioznim poremećajem koji nije izazvan kanabinoidima. Takvi dokazi nezavisnog anksioznog poremećaja mogu uključivati sledeće:

Simptomi prethode početku upotrebe supstance/lekova; simptomi traju značajan vremenski period (npr. oko 1 mesec) nakon prestanka akutnog povlačenja ili teške intoksikacije: ili postoje drugi dokazi koji ukazuju na postojanje nezavisnog anksioznog poremećaja koji nije izazvan supstancama/medikamentima (npr. ponavljajućih epizoda koje nisu povezane sa

supstancom/medikamentima).

D. Poremećaj se ne javlja isključivo tokom delirijuma.

E. Poremećaj uzrokuje klinički značajan stres ili oštećenje u društvenim, profesionalnim ili drugim važnim oblastima funkcionisanja.

Napomena: Ovu dijagnozu treba postaviti umesto dijagnoze intoksikacije kanabinoidima ili naknadnog dejstva kanabinoida samo kada simptomi iz Kriterijuma A preovlađuju u kliničkoj slici i kada su dovoljno jaki da zahtevaju kliničku pažnju.

<„Poremećaj spavanja izazvan kanabinoidima“ treba da se dijagnostikuje prema sledećim>

<kriterijumima:>

<A. Izražen i ozbiljan poremećaj sna.>

B. Postoje dokazi iz istorije, fizičkog pregleda ili laboratorijskih nalaza oba (1) i (2):

1. Simptomi u Kriterijumu A razvili su se tokom ili ubrzo nakon intoksikacije kanabinoidima ili nakon povlačenja ili izlaganja kanabinoidima.

2. Uključeni kanabinoidi su sposobni da izazovu simptome iz Kriterijuma A.

<C. Poremećaj se ne može bolje objasniti poremećajem spavanja koji nije izazvan kanabinoidima. Takvi dokazi nezavisnog poremećaja spavanja mogu uključivati sledeće:>

<D. Poremećaj se ne javlja isključivo tokom delirijuma.>

<Napomena: Ovu dijagnozu treba postaviti umesto dijagnoze intoksikacije kanabinoidima ili naknadnog dejstva kanabinoida samo kada simptomi iz Kriterijuma A preovlađuju u kliničkoj slici i kada su dovoljno jaki da zahtevaju kliničku pažnju.>

<"Delirijum intoksikacije" treba da se dijagnostikuje prema sledećim kriterijumima:>

<A. Poremećaj pažnje (tj. smanjena sposobnost usmeravanja, fokusiranja, održavanja i prebacivanja pažnje) i svesti (smanjena orijentacija na okolinu).>

B. Poremećaj se razvija tokom kratkog vremenskog perioda (obično sati do nekoliko dana), predstavlja promenu u odnosu na početnu pažnju i svest, i ima tendenciju da fluktuira u težini tokom dana.

C. Dodatni poremećaj u kogniciji (npr. nedostatak pamćenja, dezorijentacija, jezik, vizuelnoprostorna sposobnost ili percepcija).

D. Poremećaji u Kriterijumima A i C nisu bolje objašnjeni drugim već postojećim, uspostavljenim ili evoluirajućim neurokognitivnim poremećajem i ne javljaju se u kontekstu ozbiljno smanjenog nivoa uzbuđenja, kao što je koma.

E. Postoje dokazi iz istorije, fizičkog pregleda ili laboratorijskih nalaza da je poremećaj direktna fiziološka posledica intoksikacije kanabinoidima ili povlačenja.

Dijagnozu trovanja delirijuma usled intoksikacije kanabinoidima treba postaviti umesto intoksikacije kanabinoidima kada simptomi iz Kriterijuma A i C preovlađuju u kliničkoj slici i kada su dovoljno jaki da zahtevaju kliničku pažnju.

Dijagnozu delirijuma odvikavanja od kanabinoida treba postaviti umesto odvikavanja od supstance kada simptomi iz kriterijuma A i C preovlađuju u kliničkoj slici i kada su dovoljno jaki da zahtevaju<kliničku pažnju.>

<Kako se ovde koristi, a prema DSM-5™, kategorija "nespecifikovanog poremećaja povezanog sa>kanabinoidima" primenjuje se na prezentacije u kojima simptomi karakteristični za poremećaj povezan sa kanabinoidima koji izazivaju klinički značajan stres ili oštećenje u društvenim, profesionalnim ili drugim važnim oblasti funkcionisanja preovlađuju, ali ne ispunjavaju pune kriterijume za bilo koje specifične poremećaje povezane sa kanabinoidima ili bilo koji od<poremećaja u dijagnostičkoj klasi poremećaja povezanih sa supstancama i zavisnosti.>

Kao što se ovde koristi, „Sindrom hiperemeze kanabinoida“ se odnosi na prezentacije kojekarakteriše upotreba kanabinoida, ciklične epizode mučnine i povraćanja često povezane sa čestim<kupanjem u toploj vodi. Klinički tok sindroma hiperemeze kanabinoida može se podeliti u tri faze: prodromalnu, hiperemetičku i fazu oporavka. Hiperemetska faza obično prestaje u roku od 48 sati. Pacijenti često pokazuju naučeno ponašanje čestog toplog kupanja, što dovodi do privremenog>prestanka mučnine, povraćanja i bolova u stomaku (Galli et al., 2011).

Kao što se ovde koristi, „Katatonija izazvana kanabinoidima“ primenjuje se na prezentacije koje karakteriše upotreba kanabinoida praćena stanjem nalik katatonici, sa smanjenom pokretljivošću,<budnošću i odgovorom na spoljašnju stimulaciju kao preovlađujućom kliničkom>simptomatologijom (Adams et al 2017, Khan et al., 2016).

Dakle, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje Formule (I):

<za upotrebu u lečenju poremećaja povezanog sa kanabinoidima izabranog među poremećajem>upotrebe kanabinoida (CUD); Intoksikacija kanabinoidima; Povlačenje kanabinoida; Drugi<poremećaji izazvani kanabinoidima, nespecifikovani poremećaji povezani sa kanabinoidima; Sindrom hiperemeze kanabinoida i katatonija izazvana kanabinoidima.>

<Kako se ovde koristi, "kanabinoidi" se odnose na supstance koje su potpuni ili delimični agonisti>koji deluju na kanabinoidne receptore. Kanabinoidi uključuju prirodne ekstrakte i sintetička jedinjenja poznata i kao supstance slične kanabisu.

Opisana su dva glavna tipa kanabinoidnih (CB) receptora: CB1 i CB2 receptori.

<Obično se prirodni kanabinoidi mogu ekstrahovati iz biljke Cannabis L., posebno Cannabis sativa. Tokom vremena, biljni materijal dobijen od biljke Cannabis L. akumulirao je mnoga imena (npr. weed, pot, biljka, trava, rifer, marijana, daga, dop, bhang, skank, bum, gangster, kif i gandža).>

<Korisnici kanabinoida mogu ili da unose delove biljke, na primer cvet ili listove, ili različite vrste>koncentrisane ekstrakcije biljke od kojih je jedan od najčešće korišćenih hašiš. Biljne komponente ili biljni ekstrakti se obično puše ili unose sa nekoliko prehrambenih preparata.

Kanabis je psihoaktivna biljka koja sadrži više od 500 komponenti, od kojih su 104 kanabinoida trenutno identifikovana.

<Δ9-tetrahidrokanabinol (THC) je glavna psihoaktivna komponenta u biljci kanabisa. Potencija>kanabisa se prvenstveno procenjuje prema koncentraciji THC-a. Iz tog razloga, ekstrakt koji sadrži čisti THC (čisto zlato) može se kupiti i koristi ga potrošači kanabinoida. Neželjeni efekti nakon<akutne ili redovne upotrebe kanabisa su u direktnoj vezi sa koncentracijom THC-a u proizvodu (Lafaye et al., 2017).>

<Kanabidiol (CBD), kanabinol (CBN), kanabavarin (THCV), kanabigerol (CBG), kanabihromen (CBC),>delta-8-THC, kanabiciklol (CBL), kanabitriol (CBT) i kanabijelzoin su među mnogim različitimprirodno-postojećim kanabinoidima koji se pojavljuju u biljci kanabisa. Za većinu se zna da imajupsihoaktivna svojstva.

<Sintetički kanabinoidi se vezuju za kanabinoidne receptore i izazivaju efekte slične Δ9-tetrahidrokanabinolu (THC). Neki primeri sintetičkih kanabinoida su opisani, ali bez ograničenja, u>Tabeli 1.

Supstance koje sadrže sintetičke kanabinoide (SCB) su takođe poznate pod brendovima "Spice", "K2", "biljni tamjan", "Cloud 9", "Mojo".

<Zato, i kako se ovde koristi, poremećaji povezani sa kanabinoidima uključuju poremećaje koji su povezani sa upotrebom kanabinoida.>

<Termini „3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on“ ili „C29H40O3“ ili „3β-(para->metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on“ ili „3pMBP“ ili „1-((3S,8S,9S,10R,13S,14S,17S)-3-((4-metoksibenzil)oksi)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro -1H-ciklopenta[a]fenantren-17-il)etan-1-on" označavaju derivat pregnenolona prema ovom pronalasku koji ima sledeću Formulu (1):

<Termin „lečenje“ ili „metoda lečenja“ ili njegov ekvivalent nije zamišljen kao apsolutni termin i, kada>se primenjuje na, na primer, poremećaje povezane sa kanabinoidima, odnosi se na proceduru ili tokdelovanja koji je osmišljen da smanji ili eliminiše ili za ublažavanje jednog ili više simptomaporemećaja povezanih sa kanabinoidima.

Često će se „lečenje“ ili „metod lečenja“ poremećaja povezanih sa kanabinoidima izvoditi čak i samalom verovatnoćom uspeha, ali se ipak smatra da izaziva ukupan koristan efekat. Lečenjeporemećaja povezanih sa kanabinoidima odnosi se, na primer, na odlaganje početka, smanjenu učestalost jednog ili više simptoma ili smanjenu težinu jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem. U nekim okolnostima, učestalost i težina jednog ili više simptoma se smanjuju na ne-patološke nivoe.

<Tačnije, termin "lečenje" ili "metod lečenja" poremećaja povezanih sa kanabinoidima odnosi se na poboljšanje kliničkih bihejvioralnih ili bioloških kriterijuma kod subjekta. Na primer, "lečenje" ili>"metod lečenja" poremećaja upotrebe kanabinoida može se posebno odnositi na smanjenje brojai/ili intenziteta kriterijuma od 1 do 11 kako je gore definisano za poremećaje upotrebe kanabinoida. Takođe se može odnositi na prevenciju ili odlaganje početka ili smanjenje intenziteta<kliničkih bihejvioralnih ili bioloških kriterijuma povezanih sa drugim poremećajima povezanim sa kanabinoidima.>

Formule (I), koji se sastoji od tri hemijske faze od lako dostupnog polaznog materijala<pregnenolona.>

Navedeni postupak za proizvodnju jedinjenja Formule (I) obuhvata:

- Prvu fazu zaštitnog pregnenolona:

u jedinjenje Formule (IV):

- Drugi korak u kome pomenuto jedinjenje Formule (IV) reaguje sa jedinjenjem Formule (III):

da bi se dobilo jedinjenje Formule (II):

- Treći korak u kome se uklanja zaštita jedinjenja Formule (II) da bi se dobilo jedinjenje Formule (I):

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje Formule (I):

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje proces pripreme farmaceutske kompozicije, koji postupak obuhvata mešanje jedinjenja Formule (I), zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom.

Farmaceutska kompozicija će tipično sadržati najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Prihvatljivi ekscipijenti za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj veštini i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, 21. izdanje 2011. Izbor farmaceutskog ekscipijenta može biti izabran u odnosu na nameravani put primene i standardnu farmaceutsku praksu. Ekscipijent mora biti prihvatljiv u smislu da nije štetan za svog primaoca. Najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent može biti, na primer, vezivo, diluent, nosač, lubrikant, dezintegrator, agens za vlaženje, agens za dispergovanje, agens za suspendovanje i slično.

<Putevi za davanje (isporuku) gore definisanog jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na: oralni (npr. kao tableta, kapsula ili kao rastvor koji se može progutati), lokalni, mukozni (npr. kao sprej za>nos ili aerosol za inhalaciju), nazalni, gastrointestinalni, intraspinalni, intraperitonealni,intramuskularni, intravenozni, intrauterini, intraokularni, intradermalni, intrakranijalni, intratrahealni, intravaginalni, intracerebroventrikularni, intracerebralni, subkutani, oftalmološki<(uključujući intravitrealni ili intrakameralni), transdermalni, rektalni, bukalni, epiduralni, sublingvalni.>

<Poželjni putevi primene uključuju oralni, mukozni, parenteralni i sublingvalni.>

m<e>

o<k>

g

u<h>

s<ž>

a<e>

d<la>

rž<ti>

a<n>

t<s>

i<k>

a

r<h>

om<ka>

e

i<s>

l

i<l>

b<a>

o<,>

j<o>

e<r>

,<a>

z<l>

a<n>

u<ih>

p

o<r>

tr<a>

e<h>

b<o>

u<va>

s<,>

a<g>

t<r>

r<a>

e<n>

n

u<l>

t<a>

n<,>

i<o>

m<v>

,

o<la>

d<,>

l<eliksira, rastvora ili suspenzija, koji>oženim, modifikovanim, produženim, pulsnim ili kontrolisanim oslobađanjem.

Tablete mogu sadržati ekscipijente kao što su mikrokristalna celuloza, laktoza, natrijum citrat, kalcijum karbonat, dvobazni kalcijum fosfat i glicin, dezintegrant kao što je skrob (poželjno kukuruzni, krompirov ili tapioka skrob), natrijum skrob glikolat, natrijum kroskarmeloze i<određene komplekne silikate, vezivo kao što je polivinilpirolidon, hidroksipropilmetilceluloza (HPMC), hidroksipropilceluloza (HPC), saharoza, želatin i bagrem, lubrikant kao što je magnezijum stearat, stearinska kiselina, gliceril behenat. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu se takođe koristiti kao fileri u tvrdim želatinskim kapsulama. Poželjni ekscipijenti u ovom pogledu uključuju>laktozu, saharozu, sorbitol, manitol, krompirov skrob, kukuruzni skrob, amilopektin, derivateceluloze ili želatin. Tvrde želatinske kapsule mogu da sadrže granule jedinjenja pronalaska.

Meke želatinske kapsule se mogu pripremiti sa kapsulama koje sadrže jedinjenje pronalaska, biljno ulje, voskove, mast ili drugi pogodan nosač za meke želatinske kapsule. Kao primer, prihvatljiv<nosač može biti uljni nosač, kao što je biljno ulje dugog lanca triglicerida (npr. kukuruzno ulje). Disperzibilni praškovi i granule pogodni za pripremu vodene suspenzije dodavanjem vode mogu sadržati aktivni sastojak u smeši sa disperzionim agensima, agensima za vlaženje i agensima za>suspendovanje i jednim ili više konzervansa. Dodatni ekscipijenti, na primer zaslađivači, arome i boje, takođe mogu biti prisutni. Ove kompozicije se mogu sačuvati dodatkom antioksidansa kao što je askorbinska kiselina. Tečni dozni oblici za oralnu primenu mogu uključivati farmaceutski prihvatljive rastvore, emulzije, suspenzije, sirupe i eliksire koji sadrže inertne razblaživače koji seobično koriste u tehnici, kao što je voda ili uljni nosač. Tečni dozni oblik se može predstaviti kao suvproizvod za sastavljanje sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takve kompozicije<takođe mogu sadržati pomoćna sredstva, kao što su sredstva za vlaženje, agensi za emulgovanje i suspendovanje, agensi za stvaranje kompleksa kao što su 2-hidroksipropil-beta- ciklodekstrin, sulfobutiletar-beta-ciklodekstrin, i zaslađivači, arome, sredstva za miris, materije za bojenje ili boje sa diluentima kao što su voda, etanol, propilen glikol i glicerin, i njihove kombinacije. Ove kompozicije se mogu sačuvati dodatkom antioksidansa kao što je butilovani hidroksianizol ili alfa->tokoferol.

Fino usitnjeni prah jedinjenja pronalaska može se pripremiti na primer mikronizacijom ili postupcima poznatim u stanju tehnike. Jedinjenje pronalaska se može samleti korišćenjem poznatih postupaka mlevenja kao što je mokro mlevenje da bi se dobila veličina čestica prikladna za formiranje tableta i za druge tipove formulacija.

<Farmaceutske kompozicije za parenteralnu primenu od spremne dostupne formulacije mogu biti u>obliku sterilnog injektabilnog vodenog ili uljnog rastvora ili suspenzije u ne-toksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču i mogu sadržati formulaciona sredstva kao što su suspendovanje, stabilizacijsko dispergovanje, sredstva za vlaženje i/ili kompleksiranje kao što je ciklodekstrin npr. 2-hidroksipropil-beta-ciklodekstrin, sulfobutiletar-beta-ciklodekstrin.

Formulacija depo tipa za parenteralnu primenu može se pripremiti konvencionalnim tehnikama sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom uključujući, bez ograničenja na, biokompatibilne i biorazgradive polimere (npr. poli(β-kaprolakton), poli(etilen oksid), poli(glikolnu kiselinu),<poli[(mlečnu kiselinu)-ko-(glikolnu kiselinu)...)], poli(mlečnu kiselinu)...), ne-biorazgradive polimere (npr. kopolimer etilen vinilacetata, poliuretan, poliestar(amid), polivinil hlorid ...) vodeni i ne-vodeni nosači (npr. voda, susamovo ulje, pamučno ulje, sojino ulje, ricinusovo ulje, bademovo ulje, uljni estri, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja, propilen glikol, DMSO, THF, 2-pirolidon, N-metilpirolidinon, N-vinilpirolidinon...).>

<Alternativno, aktivni sastojak može biti u suvom obliku kao što je prah, kristalna ili čvrsta supstanca osušena zamrzavanjem za konstituisanje sa odgovarajućim nosačem. Priprema pogodnih parenteralnih formulacija u sterilnim uslovima se lako postiže standardnim farmaceutskim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.>

<Kao što je naznačeno, jedinjenje iz ovog pronalaska može se davati intranazalno ili inhalacijom i pogodno se isporučuje u obliku inhalatora suvog praha ili u obliku aerosol spreja iz posude pod pritiskom, pumpe, spreja ili nebulizatora uz upotrebu odgovarajućeg potisnog gasa, na primer. dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, (na primer iz Ineos Fluor),>ugljen dioksid ili drugi pogodan gas. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kontejner pod pritiskom, pumpa, sprej ili nebulizator mogu da sadrže rastvor ili suspenziju aktivnog jedinjenja. Kapsule i kertridži (napravljeni, na primer, od želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulisani da sadrže mešavinu praha jedinjenja i pogodne praškaste baze kao što je laktoza ili skrob. Za kompozicije pogodne i/ili prilagođene za inhalaciono davanje, poželjno je da jedinjenje ili so formule (I) budu u obliku smanjene veličine čestica, a poželjnije da se oblik smanjene veličine dobije ili se može dobiti mikronizacijom. Poželjna veličina čestica jedinjenja ili soli ili solvata smanjene veličine (npr. mikronizovanog) je definisana D50 vrednošću od oko 0,5 do oko 50 mikrona (na primer, kao što je mereno korišćenjem laserske difrakcije). Alternativno, jedinjenje iz ovog pronalaska se može primeniti u obliku supozitorija ili pesarijuma, ili se može primeniti lokalno u obliku gela, hidrogela, losiona, rastvora, kreme, masti ili praškastog pudera. Jedinjenje iz ovog pronalaska se takođe može primeniti dermalno ili transdermalno, na primer, upotrebom flastera za kožu. Mogu se davati i plućnim ili rektalnim putem. Može se davati i okularnim putem. Zaoftalmičku upotrebu, jedinjenje se može formulisati kao mikronizovane suspenzije u izotoničnom,sterilnom fiziološkom rastvoru sa podešenim pH, ili, poželjno, kao rastvori u izotoničnom,<sterilnom fiziološkom rastvoru sa podešenim pH, opciono u kombinaciji sa konzervansom kao što je>benzilalkonijum hlorid. Alternativno, može se formulisati u obliku masti kao što je vazelin.

Za topikalnu primenu na kožu, agens ovog pronalaska se može formulisati kao pogodna mast koja sadrži aktivno jedinjenje suspendovano ili rastvoreno u, na primer, mešavini sa jednim ili više od<sledećeg: mineralno ulje, tečni vazelin, beli vazelin, propilen glikol, polioksietilen, polioksipropilen jedinjenje, emulgujući vosak i voda. Alternativno, može se formulisati kao odgovarajući losion ili>krema, suspendovan ili rastvoren u, na primer, mešavini jednog ili više od sledećeg: mineralno ulje,sorbitan monostearat, polietilen glikol, tečni parafin, polisorbat 60, vosak cetil estara, cetearil alkohol, 2-oktildodekanol, benzil alkohol i voda.

<Obično, lekar će odrediti stvarnu dozu koja će biti najpogodnija za pojedinačnog subjekta. Specifični nivo doze i učestalost doziranja za svakog određenog pojedinca mogu varirati i zavisiće od niza faktora uključujući aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi i dužinu delovanja tog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, ishranu, način i vreme primene, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova, ozbiljnost određenog stanja i pojedinca koji je podvrgnut terapiji. Gore definisano jedinjenje može se davati subjektu radi njegove upotrebe u lečenju poremećaja povezanih sa kanabinoidima u bilo kojoj dozi pogodnoj za postizanje terapeutskog efekta.>

Za oralnu i parenteralnu primenu kod ljudi, dnevni nivo doze agensa može biti u pojedinačnim ili podeljenim dozama.

Predloženi opseg doze jedinjenja prema sadašnjem pronalasku za davanje čoveku (od približno 70 kg telesne težine) je, uključujući ali bez ograničenja na 1 μg do 1000 mg, tipičnije 1 μg do 500 mg,<tipičnije 1 μg do 100 mg, tipičnije od 1 μg do 50 mg, tipičnije od 1 μg do 10 mg, tipičnije od 1 μg do 5>mg, tipičnije od 1 μg do 1 mg, tipičnije od 1 μg do 600 μg, tipičnije od 1 μg do 200 μg, tipičnije 1 μgdo 100 μg, tipičnije 1 μg do 60 μg, tipičnije 10 μg do 1000 mg, tipičnije 10 μg do 500 mg, tipičnije 10μg do 100 mg, tipičnije 10 μg do 50 mg, tipičnije 10 μg do 10 mg, tipičnije 10 μg do 5 mg, tipičnije 10 μg do 1 mg, tipičnije 10 μg do 600 μg, tipičnije 10 μg do 200 μg, tipičnije 10 μg do 100 μg, tipičnije20 μg do 1000 mg, tipičnije 20 μg do 600 mg, tipičnije 20 μg do 200 mg, tipičnije 20 μg do 60 mg,tipičnije 20 μg do 20 mg, tipičnije 20 μg do 6 mg, tipičnije 20 μg do 2 mg, tipičnije 20 μg do 600 μg, tipičnije 20 μg do 200 μg aktivnog sastojka po jediničnoj dozi, izraženo kao težina slobodne kiseline.<Jedinična doza se može primeniti, na primer, 1 do 4 puta dnevno. Doza će zavisiti od načina primene. Smatraće se da će možda biti neophodno napraviti rutinske varijacije u dozi u zavisnosti>od starosti i težine pacijenta, kao i težine stanja. Doziranje će takođe zavisiti od načina primene. Precizna doza i način primene će na kraju biti na diskreciji nadležnog lekara ili veterinara.

<"Odgovarajuća doza", "efektivna količina" jedinjenja pronalaska se odnosi na efektivnu količinu dovoljnu da spreči, smanji, eliminiše, kontroliše, leči ili inhibira poremećaj povezan sa kanabinoidima. Termin "kontrolisanje" ima za cilj da se odnosi na sve procese u kojima može doći>do usporavanja, prekida, sprečavanja ili zaustavljanja napredovanja bolesti i stanja opisanih ovde, ali ne mora da ukazuje na potpuno eliminisanje svih simptoma bolesti i stanja. Doze koje se koriste za primenu mogu se prilagoditi u zavisnosti od različitih parametara, posebno u zavisnosti od<načina primene, relevantne patologije, ili alternativno od željenog trajanja lečenja. Naravno, oblik>farmaceutske kompozicije, način primene, doziranje i režim prirodno zavise od stanja koje se leči,težine bolesti, starosti, težine i pola subjekta, itd. Efektivne doze date u nastavku nisu namenjene daograniče pronalazak i predstavljaju poželjne opsege doza.

Međutim, poželjna doza može biti prilagođena pojedinačnom subjektu, kako to razume i može odrediti stručnjak u ovoj oblasti, bez nepotrebnog eksperimentisanja.

Prema aspektu koji nije deo ovog pronalaska, ovde je otkrivena upotreba jedinjenja Formule (I):

za proizvodnju farmaceutskog preparata za lečenje poremećaja povezanih sa kanabinoidima.<PRIMERI>

Primer 1: Sinteza, priprema i formulacija 3pMBP

3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on (3pMBP) je hemijski entitet koji sadrži 7 hiralnihcentara 3S, 8S, 9S, 10R, 13S, 14S, 17S kao što je opisano u Formuli (I):

Stereohemijska konfiguracija u ovim centrima je identična onoj kod početnog materijalapregnenolona.

<• Faza 1: Priprema jedinjenja Formule (IV): (3S, 8S, 9S, 10R, 13S, 14S, 17S)-10,13-dimetil-17-(2->metil-1,3-dioksolan-2-vl)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-ol

Faza 1 je izvedena u jednoj seriji. Etilen glikol (11,676 kg), pregnenolon (6,992 kg) i paratoluensulfonska kiselina (0,840 kg, 4,42 mol, 0,2 ekviv.) su stavljeni u reaktor. Reakciona smeša je mešana na temperaturi između 15°C i 25°C tokom 25 min. Trietilortoformat (20,939 kg) je dodat u tri porcije i smeša je mešana najmanje 1 sat na temperaturi između 15°C i 25°C. Kada je završena,<reakciona smeša je sakupljena i polako sipana na rastvor natrijum bikarbonata (2,943 kg u 35,51 vode) između 0°C i 10°C. Na kraju dodavanja, reakciona smeša je mešana između 0°C i 10°C tokom 1 h, zatim je reakciona smeša filtrirana i isprana vodom (121). Filtrat je takođe ispran sa 2-propanolom (12 l) i osušen pod vakuumom pod strujom azota. Osušena čvrsta supstanca je sakupljena i stavljena u reaktor sa 2-propanolom (351). Suspenzija je zagrevana na refluksu 2 h. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi 12 h.>

<• Faza 2: Priprema jedinjenja Formule (II): 2-(3S, 8S, 9S, 10R, 13S, 14S, 17S)-3-((4-metoksibenzil)oksi)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-17-il)-2-metil-1,3-dioksolan>

<Jedinjenje Formule (IV) (3,460 kg) i tetrahidrofuran (THF) (691) su stavljeni u reaktor. Reakciona smeša je mešana na temperaturi između 20°C i 25°C tokom 80 minuta. Reakciona smeša je>filtrirana i rastvor jedinjenja Formule (IV) u THF je stavljen u reaktor. t-BuOK (2,835 kg) je dodat u porcijama u rastvor jedinjenja Formule (IV) u THF na temperaturi između 20°C i 25°C. Na kraju dodavanja, para-metoksibenzilhlorid Formule (III) (2,832 kg) i THF (4 l) su dodati u reakcionu smešu preko levka za dodavanje. Reakciona smeša je zagrevana između 38°C i 42°C. TBAI (1.555 kg) je u porcijama dodavan u reakcionu smešu na temperaturi između 38°C i 42°C. Reakciona smeša je zagrevana između 55°C i 60°C tokom 16h30.

Kada je završena, reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom da bi se destilovala između 34 1 i 361 THF. Reakciona smeša je zatim ohlađena do sobne temperature.

Voda (521) je stavljena u reaktor, a zatim ohlađena između 0°C i 10°C. Reakciona smeša je pažljivo izlivena u vodu uz održavanje temperature između 0°C i 10°C. Na kraju dodavanja, reakciona smeša je mešana 1h50 između 0°C i 10°C. Reakciona smeša je filtrirana i isprana vodom (131). Filtrat je ispran acetonitrilom (13,51) i čvrsta supstanca je sušena pod vakuumom pod strujom azota tokom 4 dana.

<Čvrsta supstanca je sakupljena i napunjena u reaktor sa acetonitrilom (131). Smeša je zagrevana na refluksu 4 h. Dodatni acetonitril (111) je stavljen u reaktor i zagrevan na refluksu dok se ne dobije bistar rastvor. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi 14 h. Reakciona smeša je hlađena između 0°C i 10°C, mešana 45 minuta između 0°C i 10°C, a zatim filtrirana. Acetonitril (10,51) je stavljen u reaktor, hlađen između 0°C i 10°C, zatim dodat na filter da bi se isprao filtrat i čvrsta supstanca je sušena pod vakuumom pod strujom azota tokom 21 h. Jedinjenje Formule (II) (2,449 kg) je dobijeno u prinosu od 59,2%.>

<• Faza 3: Priprema jedinjenja Formule (I): 3pMBP>

Jedinjenje Formule (II) (2,448 kg) i dihlorometan (101) su stavljeni u reaktor. Rastvor je mešan 20 minuta. Hlorovodonična kiselina 1 M (4,91) je dodata u rastvor između 15°C i 25°C. Reakciona smeša je mešana do završetka između 15°C i 25°C. Dodat je dihlorometan (81) (da bi se potpuno rastvorio talog) i faze su ostavljene da se razdvoje. Organski sloj je dva puta ispran vodom (51). Organski sloj je sakupljen i napunjen 2-propanolom (24,51) u reaktoru između 15°C i 25°C.

Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom sa temperaturom ispod 40°C. Kada je završena, reakciona smeša je zagrejana do refluksa.2-propanol (401) je dodat dok se ne primeti bistar<rastvor. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi 12 h. Reakciona smeša je hlađena između 0°C i 10°C, mešana 1 h između 0°C i 10°C. Čvrsta supstanca je>filtrirana i isprana sa 2-propanolom (51), a zatim osušena pod vakuumom opremljena brzinomprotoka azota uz zagrevanje filtera između 35°C i 45°C tokom 20 h. Jedinjenje Formule (I) (1,907 kg) je dobijeno u prinosu od 85,8 %.

Farmaceutska kompozicija

<3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on se može formulisati kao dozni oblik kapsule koji sadrži rastvor 3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-ona u kukuruznom ulju. Sastav ovog doznog oblika je opisan u tabeli 2.>

1. 3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on je mešan u kukuruznom ulju do potpunog rastvaranja.

2. Zatim je rastvor 3β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-ona iz koraka 1 napunjen u meku želatinsku kapsulu.

Svi ekscipijenti su u skladu sa važećim monografijama Evropske farmakopeje (Ph. Eur.) i Monografijama Farmakopejskog Nacionalnog Formulara Sjedinjenih Država (USP-NF).

Tabela 2: Sastav 3,β-(4-metoksibenziloksi)pregn-5-en-20-on mekih želatinskih kapsula

Primer 2: Specifična inhibicija aktivnosti CB1 receptora pomoću 3pMBP

Razumevanje efekata jedinjenja ovog pronalaska, 3pMBP, na aktivnost CB1 receptora je praćenoproučavanjem efekata 3pMBP na sledeće ćelijske efekte indukovane aktivacijom CB1 receptora pomoću THC-a. Specifičnost efekata 3pMBP na CB1 receptor je proučavana analizom efekata ovogjedinjenja na vezivanje ostalih 85 receptora.

Materijali i metode

Cilj ove studije je bio da se procene efekti 3pMBP na povećanje fosforilacije Erk1/2MAPK, koji se obično naziva MAPK (Mitogen-Aktivirane Protein Kinaze), indukovanog davanjem THC-a u ćelije<humanog embrionalnog bubrega 293 (HEK-293) stabilno ili prolazno transfektovano sa humanim CB1 (hCB1) receptorom.>

<HEK-293 ćelije su odabrane zato što ne eksprimiraju endogene CB1 receptore, lako se mogu transfektovati i ranije su korišćene u eksperimentima proučavanja in vitro aktivnosti CB1 receptora (Shore et al., 2014) i u eksperimentima koji pokazuju da pregnenolon je u stanju da inhibira THC-indukovanu fosforilaciju MAPK (Vallée et al.2014). Efekat 3pMBP u tri doze (1 nM, 10 nM i 100 nM, rastvoren u acetonitrilu 0,01 %) je testiran na efekat THC u 1 μM (rastvoren u EtOH 6,2e-4 %,>Eksperiment 1) i 10 μM ( rastvoren u EtOH 6,2<e-3>%, Eksperiment 2) na fosforilaciji MAPK. Razlika u koncentracijama THC-a korišćenih u dva eksperimenta povezana je sa različitom efikasnošću transfekcije hCB1 cDNK plazmida, koji je stabilan u Eksperimentu 1 i prolazan u Eksperimentu 2. Tretman THC-om i 3pMBP je bio istovremen i trajao je 5 min.

Fosforilacija MAPK (P-Erk1/2MAPK proteini) merena je western blot-om. U eksperimentu 1 mitohondrijalni marker CoxIV i u eksperimentu 2 ne-fosforilovani MAPK proteini su korišćeni kao kontrole opterećenja. Odnosi P-MAPK/CoxIV i P-MAPK/MAPK su izračunati i podaci izraženi kao %ćelija tretiranih nosačem.

<Cilj ove studije je bio da se procene efekti 3pMBP na smanjenje cAMP indukovanog primenom THC-a u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) koje stabilno eksprimiraju humani CB1 receptor CHO->hCB 1.

CHO-hCB1 ćelije su izabrane u ovim eksperimentima jer ne eksprimiraju endogeno CB 1 receptor i ranije su korišćene u eksperimentima proučavanja efekata CB1 agonista (Rinaldi Carmona, 1996),<uključujući THC, na cAMP i P-MAPK.>

<Efekti 3pMBP u četiri doze (1 nM, 10 nM, 100 nM i 1 μM, rastvoreni u N,N-dimetilformamidu 0,01%) su testirani u odnosu na funkciju odgovora na dozu THC-a (0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM i 300 nM, rastvoreno u etanolu 0,0063%). CHO-CB1-C2 ćelije su tretirane istovremenim dodavanjem THC-a i test jedinjenja tokom 4 kođe istovremeno>dodat u svim uslovima testiranim da bi se od<5>

r<m>

ža

o<nu>

b<t>

a<a>

z<.>

a<F>

ln<o>

i<rskolin (2,5 μM) je ta>

nivo cAMP. Na kraju tretmana, ćelije su lizirane da bi se nastavilo sa cAMP kvantifikacijom. Sve mere su izvedene u tri primerka u jednom eksperimentu.

Kvantitativno određivanje cAMP je obavljeno kompetitivnim fluorescentnim imunoesejem. Podaci su izraženi kao % Delta Fluorescencije (Delta F) koji je izračunat na sledeći način: Delta F % = (Fluorescencija uzorka - negativna kontrola fluorescencije) / negativna kontrola fluorescencije.<Efekat 3pMBP na THC-indukovano smanjenje ćelijske respiracije>

Cilj ove studije bio je da se ispita efekat 3pMBP na inhibiciju ćelijskog disanja izazvanog THC-om (1 μM) u ćelijama HEK-293 koje su prolazno transfektovane ljudskim CB1 receptorima (hCB1).

<Ćelije HEK-293 koje su prolazno transfektovane plazmidom koji ekspresuje hCB1 prvo su tretirane>sa 3pMBP (0, 1, 10 i 100 nM rastvorenim u acetonitrilu 0,01%). Posle 15 minuta inkubacije, THC(0,1 μM, rastvoren u EtOH 0,0034%) je dodat u posude za kulturu tokom 30 minuta.

<Ćelijska respiracija je merena u kalibrisanom oksigrafu opremljenom Clark elektrodom. Stopa potrošnje kiseonika (OC) je korišćena za merenje ćelijske respiracije. Efekti THC-a, u odsustvu i u prisustvu 3pMBP, na stopu OC izraženi su kao procenti osnovne linije OC ćelije tretirane nosačem>od 3pMBP i nosačem THC-a istog eksperimenta. Izvedeno je 10 nezavisnih eksperimenata da bi se dobilo n=10 po eksperimentalnom uslovu. Svaki eksperiment je imao n=5 sadržeći n=1 po eksperimentalnoj grupi.

Testirana je potencijalna sposobnost 3pMBP i pregnenolona, u koncentraciji od 10 μM, da istisnu vezivanje liganada 85 receptora (CEREP visoko-propusni profil 4 steroidna receptora kanabinoidni tip 2 receptor). CEREP visoko-propusni profil sastoji se od široke kolekcije od 80 transmembranskih i rastvorljivih receptora, jonskih kanala i receptora vezanih za G-protein.

Posebno je dizajniran da pruži informacije za određivanje prioriteta jedinjenja koja najvišeobećavaju u procesu selekcije hit-to-lead. Androgeni, estrogenski, progesteronski i PXR receptori, azatim kanabinoidni receptor tipa 2 su dodati ovom testu kako bi se test bolje prilagodio 3pMBP,upotpunjavajući spektar steroidnih receptora koji su već sadržani u CEREP visoko-propusnomprofilu.

<3pMBP ima profil sličan eCB1-SSi pregnenolonu. 3pMBP inhibira THC-indukovano povećanje fosforilacije MAPK (SLIKA 2A i 2B) i THC-indukovano smanjenje ćelijske respiracije (IC50 =1,2-11>nM) u ćelijama HEK-293 koje su stabilno ili prolazno transfektovane sa hCB1 (SLIKA 2).

Nasuprot tome, 3pMBP nije inhibirao THC-indukovano smanjenje cAMP u CHO ćelijama koje stabilno eksprimiraju humani CB1 receptor CHO-hCB1 (SLIKA 2C).

Pored toga, 3pMBP (10 μM) nije modifikovao vezivanje nijednog od 85 receptora koji su testirani in<vitro korišćenjem CEREP visoko-propusnog profila, uključujući glavne steroidne receptore, PXR receptore i CB1 i CB2 receptore. U tom pogledu 3pMBP je bio selektivniji od pregnenolona (10 μM), koji je zamenio (>80%) vezivanje glukokortikoidnih, androgenih i progesteronskih receptora i u>manjoj meri (>40%) vezivanje centralnih i perifernih benzodiazepinskih receptora.

Efekti 3pMBP su sažeti u tabeli ispod:

Tabela 3: In vitro procena mehanizma delovanja 3pMBP

<Zaključak>

Dakle, 3pMBP in vitro deluje kao signalno-specifičan inhibitor CB1 (CBl-SSi). Dakle, 3pMBP, u ćelijskim linijama koje eksprimiraju humani CB1 receptor (hCB1) inhibira THC-indukovano povećanje fosforilacije MAPK (protein kinaze aktivirane mitogenom) i THC-indukovano smanjenje ćelijske respiracije. Nasuprot tome, 3pMBP nije inhibirao THC-indukovano smanjenje cAMP<(ciklični adenozin monofosfat).>

<Štaviše, 3pMBP in vitro je selektivniji od endogenog signalno specifičnog inhibitora pregnenolona.>Zaista, pregnenolon (10 μM) zamenjuje vezivanje (>80%) progesteronskih, glukokortikoidnih i androgenih receptora, kao i vezivanje benzodiazepinskih receptora (>40%).3pMBP (10 μM) nije modifikovao vezivanje ovih receptora ili bilo kog drugog receptora (ukupno 85) koji su proučavanikorišćenjem CEREP visoko-propusnog profila.

Primer 3: Pretklinička evaluacija 3pMBP kao tretmana poremećaja povezanih sa

1. Bezuslovni farmakodinamički efekti kanabinoida koji uključuju duboka kognitivna, motivaciona i bihevioralna oštećenja. Ova tri efekta mogu sinergijski proizvesti ozbiljne posledice za različite vrste poremećaja povezanih sa kanabinoidima. Oni su posebno odgovorni za: a. Narušene društvene odnose i slabije zadovoljstvo životom; b. Slabije obrazovne rezultate, niže prihode, veću zavisnost od socijalne pomoći i nezaposlenost, posebno za najskloniju populaciju (14-25 godina); c. psihijatrijske poremećaje uključujući ali ne ograničavajući se na depresiju, anksioznost i psihozu; i d. Otpor na angažovanje u psihološkim tretmanima;<2. Uslovljeni efekti kanabinoida koji dovode do razvoja traženja kanabinoida, redovne upotrebe i na kraju do zavisnosti od kanabinoida. Sposobnost kanabinoida da uslovljavaju ponašanje, što dovodi do zavisnosti od kanabinoida, otežava prestanak upotrebe kanabinoida i olakšava recidiv nakon perioda apstinencije, što dovodi do kontinuiranog izlaganja štetnim efektima kanabinoida.>

1. Antagonizira široki spektar bezuslovnih efekata kanabinoida, kako bi se smanjio negativan uticaj upotrebe kanabinoida na funkcionisanje mozga i ponašanje.

2. Olakša smanjenje upotrebe kanabinoida i smanji ponovnu upotrebu kanabinoida nakon prestanka, kako bi se smanjila izloženost mozga kanabinoidima i njegove negativne posledice.

Ova dva kombinovana efekta, stvarajući pozitivni napredni niz petlju (smanjenje efekata kanabinoida i smanjenje količine uzetih kanabinoida), trebalo bi da obezbede moćno sredstvo zalečenje različitih poremećaja povezanih sa kanabinoidima.

Uzimajući u obzir ova razmatranja, pretklinička procena potencijala 3pMBP kao tretmana<poremećaja povezanih sa kanabinoidima je izvršena proučavanjem:>

<1. Nekoliko modela ponašanja koji reprodukuju bezuslovne efekte CB 1 agonista kod korisnika>kanabinoida. Za ove studije korišćen je aktivni princip kanabisa THC jer je to najkorišćeniji kanabinoid kod ljudi.

2. Nekoliko modela ponašanja (kod miševa i ne-humanih primata) koji procenjuju sposobnost THC-a i sintetičkih kanabinoida da uslovljavaju ponašanje i izazivaju zavisnost.

1. Inhibicija 3pMBP od neuslovljenih efekata THC-a

<Proučavana je inhibicija oralnom primenom 3pMBP dole opisanih bezuslovnih bihejvioralnih i neurohemijskih efekata THC-a koji se odnose na poremećaje povezane sa kanabinoidima:>

<a. Povećanje unosa hrane izazvano THC-om;>

<b. THC-indukovano povećanje psihomotorne stimulacije;>

<c. THC-indukovano oštećenje pre-pulsne inhibicije;>

d. THC-indukovana oštećenja memorije;

e. THC-indukovano oštećenje socijalne interakcije;

f. THC-indukovano oštećenje testiranja realnosti;

g. THC-indukuju katalepsiju;

h. THC-indukovani raskorak u ponašanju;

i. Oslobađanje dopamina izazvano THC-om u nukleus akumbensu.

<a. Povećanje unosa hrane izazvano THC-om>

<Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost 3pMBP da inhibira povećanje unosa hrane>izazvano primenom THC-a kod miševa. Ovo ponašanje je odabrano zato što kod korisnika kanabisa postoji poremećaj ponašanja u ishrani sa sklonošću hiperfagiji i sklonošću ukusnoj hrani neposredno nakon konzumiranja droge (Kirkham, 2005).

<Efekti THC-a na unos hrane proučavani su korišćenjem modela ponovnog hranjenja natašte (Bellochio et al., 2010) kod CB1f/f mužjaka miševa. Efekat 3pMBP u tri doze (5, 15 i 50 μg/kg) je>testiran na povećanju unosa hrane izazvanog THC-om (1 mg/kg; ip) kod miševa bez hrane tokom24 sata koji su hranjeni 30 minuta nakon THC. Unos hrane je meren jedan sat. Za svako stanje tretmana korišćene su nezavisne grupe životinja (najmanje n=8 po grupi).3pMBP je primenjen tri sata pre primene THC-a.

<Kao što je opisano na Slici 3A, 3pMBP inhibira (ID50 ≈15 i ID100 ≈50 μg/kg) povećanje unosa hrane>izazvano THC-om (1 mg/kg) kod miševa.

<b. Povećanje psihomotorne stimulacije izazvano THC-om>

<Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost 3pMBP da inhibira povećanje>psihomotorne stimulacije izazvane primenom THC-a kod miševa. Ovo ponašanje je odabrano jer se smatra surogatom psihotičnih simptoma koji mogu biti izazvani upotrebom kanabisa (Wiley et al., 2008; DSM 5TH ed., 2013).

<Psihomotorna stimulacija izazvana THC-om proučavana je kod C57BL/6N mužjaka miševa merenjem lokomotorne aktivnosti na otvorenom polju sa kvadratnim podom. Lokomocija je procenjena 45 minuta nakon THC-a tokom 5 minuta brojanjem broja ukrštenih kvadrata i izražena>kao procenat kontrola tretiranih nosačem.

Efekat 3pMBP u pet doza (0,00015, 0,0005, 0,0015, 0,015 i 0,15 mg/kg) je testiran na povećanje lokomotorne aktivnosti izazvane THC-om (0,3 mg/kg). Nezavisne grupe životinja (najmanje n = 9 po grupi) su korišćene za svaku dozu od 3pMBP.3pMBP je primenjen tri sata pre primene THC-a.

<3pMBP inhibira (ID>50<≈0,0004 i ID>100<≈0,0015 mg/kg) psihomotornu stimulaciju izazvanu THC-om>(0,3 mg/kg) kod miševa (Slika 3B).

<c. THC-indukovano oštećenje pre-pulsne inhibicije>

<Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost 3pMBP da inhibira oštećenje senzornog gejtinga izazvano primenom THC-a kod miševa kako je proučavano testom prepulsne inhibicije>(PPI). Ovo ponašanje je odabrano jer je to model oštećenja senzorno-motornog gejtinga uočenog kod psihoze (DSM 5th ed., 2013; Kedzior et al.2006) za koju se pokazalo da je indukovano THC-om (Nagai, 2006).

<PPI je meren korišćenjem automatizovanih PPI kaveza koji su omogućavali isporuku PPI protokola i>beleženje reakcija stresa životinje. Svaki miš (najmanje n = 8 po grupi) je stavljen u PPI test 60 minuta nakon THC-a tokom 45 minuta.

PPI test je uključivao različite tipove ispitivanja koja se sastoje od predstavljanja bilo pozadinske buke, samo stimulusa iznenađenja (S; 120 dB), jednog od samih predpulsnih (73 dB, 76 dB ili 82 dB) stimulusa ili kombinacije jednog od svakih predpulsnih stimulusa praćenog stimulusomiznenađenja (PPI-S). iznenađenja nakon prezentacije pulsa je zabeležena i izračunat je indeks PPI(% PPI = 100 x (S - PPI-S)/S).

<3pMBP inhibira (ID50 ≈0,005 i ID100 ≈0,015 mg/kg) oštećenje pre-pulsne inhibicije izazvane THC->om (10 mg/kg) kod miševa. Slika 3C prikazuje efekat 3pMBP sa predpulsom od 82dB.

<d. Efekti 3pMBP na oštećenja memorije izazvana THC-om>

U ovim eksperimentima proučavani su efekti 3pMBP na oštećenje izazvano THC-om na dva testa<pamćenja: a. radna memorija i b. dugoročno pamćenje. Radna memorija je sposobnost privremenog>skladištenja i obrade informacija. Neophodno je obavljanje svakodnevnih životnih aktivnosti kaošto su vođenje razgovora, rasuđivanje, razumevanje pročitanog. Deficit radne memorije je jedan od<ključnih kognitivnih simptoma kod psihoze koji se ne poboljšavaju postojećim antipsihoticima (Pratt et al., 2012). Oštećenje radne memorije je takođe tipična posledica akutne primene THC-a i>kod ljudi i kod životinja (D’Souza, 2007). Dugoročna memorija je sposobnost čuvanja naučenih informacija u stabilnom memorijskom odeljku koji omogućava da ih se prisetimo dugo nakonučenja. Oštećenje dugoročne memorije je takođe tipičan efekat primene THC-a.

Materijal i metode

<Oštećenje radne memorije izazvano THC-om>

Kod miševa, radna memorija se može proceniti u verziji Morris-ovog vodenog lavirinta saodloženim podudaranjem-do-mesta, zadatku prostorne memorije u kojem životinje treba da<obrađuju nove i prethodno stečene informacije kako bi pronašle lokaciju skrivene platforme za bekstvo.>

<Kod miševa, akutna primena THC-a (5 mg/kg) narušava radnu memoriju u ovom zadatku>(Busquets-Garcia et al., 2017).

<Aparat se sastojao od belog kružnog bazena (150 cm prečnika i 60 cm visine) postavljenog u sredini eksperimentalne sobe sa intenzitetom svetlosti od 90 do 100 luksa. Bazen je napunjen vodom (19-21°C) koja je postala neprozirna korišćenjem netoksične bele kozmetičke boje bez mirisa. Bela platforma prečnika 14 cm bila je sakrivena 1 cm ispod površine vode. Ovaj bihevioralni test sastojao se od tri faze: navikavanja, treninga i testiranja. Tokom faze navikavanja životinje su jednom stavljene u bazen na 90 sekundi, a zatim puštene na platformu na 30 sekundi da se naviknu>na eksperimentalne uslove i da smanje stres tokom treninga i testa. Kada su se navikli, miševi su prošli obuku. Slike različitih oblika postavljene na zidove sobe služile su kao prostorni znaci. Svaki trening (jedan dnevno) sastojao se od četiri pokušaja. Na svakom ogledu miš je stavljen u vodu, licem prema zidu bazena, a zatim ostavljen da pliva dok ne stigne do skrivene platforme. Ako miš nije stigao do platforme u roku od 90 sekundi, bio je vođen do nje. Miš je zatim ostao na platformi 30 sekundi (interval između pokušaja). Početne lokacije su bile iste za prvi i četvrti ogled, ali<različite za ostale. Položaj platforme se menjao svaki dan, tako da je na prvom ispitivanju svake sesije miš uvek slučajno pronalazio. Sesije obuke se ponavljaju sve dok miševi ne postignu značajno smanjenje latencije da bi došli do platforme između prvog ispitivanja i svakog od 3 sledeća ispitivanja tokom tri uzastopna dana. Trening je trajao 8 do 12 dana. Nakon treninga, miševi su>primili farmakološke tretmane, a zatim su izvršili jednu testnu sesiju koristeći isti protokol kao što je i trening (tj. 4 pokušaja, intervali između pokušaja od 30 sekundi, prekid na 90 sekundi).

Performanse radne memorije na test sesiji merene su izračunavanjem odnosa uštede vremena<koristeći sledeću formulu: odnos uštede = (ispitivanje latencije bega 1 - ispitivanje latencije bega 4) / (ispitivanje latencije bega 1 ispitivanje latencije bega 4).>

Miševima je davan THC (5 mg/kg, ip) ili njegov nosač 30 minuta pre test sesije.3pMBP (0,015; 0,15ili 0,45 mg/kg, per os oralnom gavažom) ili njegov nosač je dat 3 sata pre primene THC-a ili njegovog nosača.

<Oštećenje dugoročne memorije izazvano THC-om.>

<Kod miševa se dugoročna memorija može proceniti pomoću testa prepoznavanja objekata u kome>se pamćenje jednog određenog objekta procenjuje 24 sata kasnije. Za ovaj specifični eksperiment,CD1-SWISS mužjaci miševa su primili akutno per os davanje nosača od 3pMBP (0,005 mg/kg) ili kukuruznog ulja (5 ml/kg), nakon čega je 3 sata kasnije usledila intraperitonealna (ip) injekcija THC-a (6 mg/kg; 10 ml/kg). Deset minuta pre injekcije THC-a, miševima je dozvoljeno da istraže 2identična objekta u lavirintu u obliku slova "L". Dan kasnije, jedan objekat je zamenjen novim.Prema preferencijama spontanih novina, miševi istražuju duže nove objekte (Ennaceur, 2010).<Poređenje vremena provedenog u istraživanju poznatih i novih objekata koristi se kao indeks>diskriminacije između poznatosti i novine. Zato se ovaj parametar koristi za procenu performansiprepoznavanja objekata.

<3pMBP u potpunosti inhibira THC-indukovano oštećenje prepoznavanja objekata (Slika 4B) pri>0,005 mg/kg sa ID50 koji je bio <0,005 mg/kg. Slično, 3pMBP primenjen na 0,015; Doza od 0,15 ili 0,45 mg/kg zavisno od doze blokira oštećenje performansi radne memorije izazvano THC-om (5 mg/kg) sa ID100 od 0,15 mg/kg (Slika 4A).

<e. Efekti 3pMBP na THC-indukovano oštećenje društvene interakcije>

<Socijalno povlačenje kod psihoze se definiše kao ravnodušnost ili nedostatak želje za socijalnom interakcijom (Wilson i Koenig, 2014). Društvena interakcija se može proceniti kod miševa>merenjem njihove spontane sklonosti prema susretu sa kongenerom u poređenju sa ne-socijalnim susretom. U ovoj paradigmi, akutna primena THC-a (3 mg/kg) smanjuje društvenu preferenciju (Busquets-Garcia et al., 2017; Slika 4C), pružajući pouzdan model endofenotipa socijalnogpovlačenja kod psihoze.

Miševi su testirani na otvorenom polju (35 x 35 cm) sa dva plastična kontejnera (plastični cilindri<prečnika 8 cm sa rupama za interakciju mirisa) postavljena na dva suprotna ugla, od kojih je jedan bio domaćin miša (odrasli mužjak starosti od 8 do 10 nedelja C57BL/6-N), dok je drugi kontejner ostao prazan. U svakom uglu su definisane 'socijalne' i 'ne-socijalne' zone kao područje od 8 cm koje>okružuje kontejnere. Za svaku eksperimentalnu grupu, položaj kontejnera sa mišem je biokontrabalansiran. Eksperimentalni miš je postavljen u centar otvorenog polja da istražuje 5 minuta, snimljen kamerom. Vreme provedeno u obe zone računalo se s obzirom da se životinja nalazi u jednoj zoni kada su joj sve četiri šape unutar nacrtanih linija. Socijalni indeks je izračunat na sledeći

<način:>

<Socijani indeks= Vreme provedeno u „socijalnoj zoni“/ Ukupno vreme>provedeno u obe zone.

Miševima je davan THC (3 mg/kg, ip) ili njegov nosač 2 sata pre ulaska u otvoreno polje.3pMBP (0,005; 0,015; 0,05 mg/kg, per os u kukuruznom ulju) ili njegov nosač je primenjen 3 sata pre THC-a ili njegovog nosača.

3pMBP primenjen na 0,005; 0,015 ili 0,05 mg/kg, zavisno od doze, blokira smanjenje socijalneinterakcije izazvane THC-om sa ID100 na 0,015 mg/kg (Slika 4C).

<f. THC-indukovano oštećenje testiranja realnosti>

Ovaj test je zasnovan na paradigmi uslovljene averzije. Dva stimulansa jednake valentnosti, tipično ukus i miris, se prvo prikazuju istovremeno na ponovljen način (6 puta). Jedan od stimulansa, na primer miris, je tada povezan sa štetnim događajem (tj. LiCI indukovana gastrična slabost). Nakon kondicioniranja, miševi pokazuju specifičnu averziju za stimulus uparen sa štetnim događajem (tj. miris), ali ne i za neutralni stimulus (tj. ukus) iako su miris i ukus prethodno predstavljeni zajedno. Ovi odgovori sugerišu da su miševi izgradili specifične reprezentacije svakog od stimulusa.

<Međutim, psihogeni lekovi uključujući MK-801, amfetamin i THC dovode do averzije za oba stimulusa uključujući i onaj koji nije uslovljen štetnim događajem (posredovana averzija). Ovaj>efekat sugeriše da psihogeni lekovi izazivaju netačnu reprezentaciju „neutralnog“ stimulusa. Ove promene su poništene atipičnim antipsihotičnim risperdonom (Busquets-Garcia et al., 2017). Zato,oštećenje 'testiranja stvarnosti' indukovano THC-om kao i drugim psihogenim lekovima kod miševapokazuje i lice i prediktivnu validnost za ispitivanje pozitivnih psihotičnih simptoma.

<Miševi su bili lišeni vode 24 sata pre početka navikavanja koja se sastojala u 1-satnom pristupu vodi dnevno tokom 3 dana kako bi se navikli da primaju tečnost svaki dan po 1 sat i tako postigli konstantnu potrošnju preko protokola. Nakon toga je usledila faza predkondicioniranja u kojoj su>miševi dobijali 1-satni pristup dnevno mešanom rastvoru (O1T1) sa jednim mirisom (ili badem ili banana, O1) i jednim ukusom (bilo maltodekstrin ili saharoza, T1) u vodi . 2. dana, miševi su dobili 1-satni pristup rastvoru sa mirisom i ukusom koji nisu dati prethodnog dana (O2T2). Nakon 6 uparivanja O1T1 i O2T2 (12 dana), započela je faza kondicioniranja.

Prvog dana kondicioniranja, miševima je dat 1-satni pristup odorizovanoj vodi (O1), nakon čega je direktno usledila intraperitonealna injekcija fiziološkog rastvora. Sledećeg dana, miševima je dat pristup drugoj odorizovanoj vodi (O2) direktno praćenoj intraperitonealnom injekcijom LiCI (0,3 M) u zapremini od 10 ml/kg da bi se stvorila nelagodnost u želucu. Posle 3 uparivanja O1/fiziološki rastvor i O2/LiCI (6 dana), miševima je dat dan oporavka sa 1-satnim pristupom vodi.

<Sledećeg dana, posredovana averzija je procenjena izvođenjem testa sa dva izbora sa dve boce vode koje sadrže jedan od dva ukusa: ukus uparen sa mirisom povezanim sa LiCI injekcijom (T2)>nazvanom C+; ili ukus uparen sa drugim mirisom koji je bio povezan sa injekcijom fiziološkograstvora (T1) nazvanom C-. U ovom testu, pojava posredovane averzije je signalizirana smanjenjem potrošnje vode koja sadrži ukus uparen sa mirisom koji je prethodno bio uparen sa LiCI (T2, C+) upoređenju sa vodom koja sadrži drugi ukus koji je povezan sa mirisom koji nikada nije bio uparensa LiCI (T1, C-). Rezultati testova su izraženi indeksom averzivnosti na sledeći način:

Miševima je davan THC (1 mg/kg, ip) ili njegov nosač 2 sata pre testa sa dva izbora koji procenjujeposredovanu averziju.3pMBP (0,015; 0,05 mg/kg, per os) ili njegov nosač je primenjen 3 sata pre THC-a ili njegovog nosača.

<Nakon injekcije fiziološkog rastvora, životinje ne pokazuju averziju prema ukusu koji je ranije bio povezan sa mirisom koji tokom kondicioniranja stiče svojstvo da predviđa slabost izazvanu LiCI>(Slika 4D). Ovo je ispravno tumačenje jer ukus nikada nije bio direktno povezan sa averzivnimstimulusom (injekcija LiCI). Naprotiv, THC izaziva odbojnost prema istom ukusu, bihevioralni odgovor koji ukazuje na to da životinja pogrešno tumači spoljašnje stimuluse (Slika 4D). 3pMBP primenjen u dozi od 0,015 ili 0,05 mg/kg u potpunosti sprečava ovu pogrešnu interpretaciju izazvanu THC-om (1 mg/kg) sa ID100 pri 0,015 mg/kg (Slika 4D).

<g. Katalepsija izazvana THC-om>

Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost 3pMBP da inhibira katalepsiju izazvanuTHC-om kod miševa. Katalepsija je proučavana jer se može smatrati modelom katatonskog stanjauočenog kod određenih subjekata nakon upotrebe kanabinoidnih lekova (Khan et al., 2016).

Efekti 3pMBP u četiri doze (0,0015, 0,005, 0,015 ili 0,05 mg/kg) u 5 ml/kg kukuruznog ulja) proučavani su na katalepsiju izazvanu THC-om (10 mg/kg u 10 ml/kg od 0,9% NaCl koji sadrži 2%etanola i 3% Tween80) u C57BL6/J mužjaka miševa (24,8 ± 0,1 g, srednja vrednost ± SEM, na<početku eksperimenata), soja koji se rutinski koristi za ovu vrstu testa (Vallée et al., 2014). THC je ubrizgan 3h00 nakon 3pMBP. Merenje katalepsije izazvane THC-om započeto je 30 minuta nakon injekcije THC-a.>

Katalepsija je merena testom katalepsije. Prednje šape miševa su postavljene na šipku fiksiranuhorizontalno na 3,5 cm od površine klupe. Latencija za pomeranje sa trake je zabeležena sa vremenskim prekidom fiksiranim na 420 s (7 min). Svaki miš je podvrgnut najviše četiri uzastopna ispitivanja. Maksimalna latencija prikazana u jednom ispitivanju izabrana je kao mera katalepsije.

3pMBP je inhibirao (za 50%) katalepsiju izazvanu THC-om (10 mg/kg) sa ID50≈0,005 i ID100≈0,05mg/kg (Slika 5A).

<h. THC-indukovano uslovljeno zjapeće ponašanje>

<Zjapenje izazvano THC-om korišćeno je ovde kao model sindroma hiperemeze kanabinoida. Dakle,>iako pacovi nisu u stanju da povraćaju, oni pokazuju duboke uslovljene zjapeće reakcije tokom ponovnog izlaganja ukusu koji je prethodno bio uparen sa emetičkim lekom. Ovo robusno učenje se dešava u jednom ispitivanju i sa dugim kašnjenjima (satima) između konzumiranja novog ukusa iemetičkog tretmana. Uslovljene zjapeće reakcije konzistentno proizvode emetički lekovi i sprečavaju ih anti-emetički lekovi, što ukazuje da su one čvrsta mera malaksalosti i mučnineizazvane lekom.

Tri dana nakon operacije kanulacije, pacovi su prilagođeni komori za reaktivnost ukusa. Pacovi su<pojedinačno stavljeni u komoru za reakciju ukusa (TR) sa njihovim kanilama pričvršćenim na infuzionu pumpu da bi ubrizgali vodu u njihovu intraoralnu šupljinu tokom perioda od 2 minuta brzinom od 1 ml/min, a zatim vraćeni u svoj kućni kavez. Pacovi su primili prvu od tri dnevna ispitivanja kondicioniranja tri dana nakon adaptacije. Pacovi su nasumično raspoređeni u uslove>pre tretmana; 3pMBP 0,015 mg/kg (n=8), 3pMBP 0,005 mg/kg (n=8), nosač 0 mg/kg (n=8). Pacovi su primili lek za prethodnu obradu 3 sata pre kondicioniranja preko cevi za hranjenje. Zatim su stavljeni u TR komoru i infuzirani sa 0,1% rastvorom saharina tokom 2 min brzinom od 1 ml/min dok su zabeležene orofacijalne reakcije. Odmah nakon infuzije saharina, pacovima je ubrizgano (per<os) 10 mg/kg THC ili VEH i vraćeni su u svoj kućni kavez. Dvadeset četiri sata kasnije, pacovi su>podvrgnuti testu bez lekova gde su smešteni u TR komoru i infuzijom sa 0,1% rastvorom saharinatokom 2 minuta brzinom od 1 ml/min i zabeležene su orofacijalne reakcije.

<Kada su kondicionirani sa 10 mg/kg THC-a, pacovi su više zjapili tokom testnog ispitivanja nego tokom ispitivanja kondicioniranja. Kao što se može videti na Slici 5B, prethodni tretman sa obe doze>3pMBP (0,005 i 0,015 mg/kg) je ometao uspostavljanje uslovljenog zjapljenja smanjenjem srednjeg broja zjapećih reakcija (razlika između nosača i 3pMBP 0,005 mg/kg, p = 0,023, između nosača i 3pMBP 0,015 mg/kg, p = 0,029).

<i. Oslobađanje dopamina izazvano THC-om u nukleus akumbensu>

<Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost 3pMBP da inhibira povećanje oslobađanja>dopamina (DA) izazvano THC-om u nukleus akumbensu (Nac) pacova koji se slobodno kreću, mereno tehnikom mikrodijalize. Oslobađanje DA u Nac-u je proučavano jer se smatra glavnim biološkim supstratom zavisnih svojstava droga, uključujući THC.

<Pacovi (n=5-7 po grupi) su implantirani pod anestezijom sa kanilom za vođenje neposredno iznad podregiona školjke desnog Nac. Na dan farmakološkog eksperimenta (5-7 dana nakon operacije),>pacova koji se slobodno kreću su primili jednu od doza 3pMBP ili VEH3pMBP, a sonda za mikrodijalizu je implantirana u kanilu-vodiča koja je zatim perfundirana veštačkom cerebrospinalnom tečnošću. Dijalizati su sakupljani svakih 15 minuta.180 minuta nakon početka perfuzije, sve životinje su dobile injekciju THC-a. Odliv DA je zatim praćen tokom 120 minuta. Koncentracije DA u uzorcima dijalizata su analizirane tečnom hromatografijom visokih performansi reverzne faze (HPLC) u kombinaciji sa elektrohemijskom detekcijom, kao što je prethodno opisano (Leggio et al., 2009). Sadržaj DA u svakom uzorku je izražen kao procenat prosečnog osnovnog nivoa izračunatog iz trifrakcije koje su prethodile davanju THC-a. Površina ispod krive (AUC) je izračunata za svaku grupuod vremena uzorkovanja od 0 min do 60 min nakon injekcije THC-a.

<3pMBP inhibira (ID50≈0,005 i ID100≈0,015 mg/kg) povećanje oslobađanja dopamina u nukleus akumbensu izazvano 1 mg/kg THC-a kod pacova (Slike 5C i 5D).>

2. Inhibicija 3pMBP sposobnosti THC i CB1 agonista da uslovljavaju ponašanje i izazivajuzavisnost

<Proučavana je inhibicija oralnom primenom 3pMBP dole opisanih uslovljenih farmakodinamičkih efekata CB1 agonista i THC-a:>

<a. Intravenska sam-oprimena CB1 agonista WIN 55, 212-2;>

b. Intravenska samo-primena THC-a i ponovno uspostavljanje traženja THC-a.

<a. Intravenska samo-primena CB1 agonista WIN 55, 212-2>

Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene na miševima sposobnost 3pMBP da inhibira pojačavajuće efekte CB1 agonista WIN 55,212-2 (WIN) kako je proučavano intravenoznim testomsamo-primene, koji se smatra zlatnim standardom za merenje efekata pojačavanja lekova.

<Pre početka sesija samo- primene, miševi su implantirani pod anestezijom sa kateterima u desnu>jugularnu venu. Eksperimenti sa samo- primenom su sprovedeni 3 dana nakon operacije uoperantnim komorama miša opremljenim sa jednom "aktivnom" i jednom "neaktivnom" rupom. Kada je životinja umetnula svoj nos (dodir nosa) u aktivnu rupu, primila je iv infuziju WIN-a (12,5 μg/kg). Miševi su trenirani prema rasporedu pojačanja fiksnog odnosa 1 (FR1).

Dvosatne dnevne sesije samo- primene su vođene 6 dana u nedelji tokom 19 dana. Miševi su primilinosač kukuruznog ulja (2 ml/kg) per os 9. i 10. dana da bi se navikli na proceduru oralne gavaže.Dana 11, miševi su randomizovani u dve grupe (n=13 po grupi), jedna je primila 3pMBP, a druganosač kukuruznog ulja 3 sata pre početka sesije samo- primene tokom 9 uzastopnih dana.3pMBP jedavan u dozi od 0,005 mg/kg prva četiri dana i u dozi od 0,015 mg/kg preostalih pet dana.

3pMBP inhibira (ID50≈0,005 i ID100≈0,015 mg/kg) intravensku samo-primenu WIN 55,212-2 kod miševa (Slika 6).

b. Intravenska samo-primena THC-a i ponovno uspostavljanje traženja THC-a kod ne-ljudskih primata Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost 3pMBP da inhibira pojačavajuće efekteTHC-a, kod ne-ljudskih primata (veveričastih majmuna), što je zlatni standardni model za<proučavanje zavisnosti od kanabisa i relapsa kod životinja. Korišćena su dva eksperimentalna modela:>

<• THC-posredovana intravenska samo-primena>

• Ponovno uspostavljanje traženja THC-a uz pomoć THC priming-medijacije

Ova dva modela su korišćena jer se smatraju najboljim modelima za merenje sklonosti individue da koristi kanabis i sklonosti da se ponovo koristi kanabis nakon perioda apstinencije.

Za sve eksperimente 3pMBP je davan per os u grožđu u zapremini od 0,1 ml kukuruznog ulja 4h pretestiranja.

<Četiri mužjaka veveričastih majmuna (Saimiri Sciureus) su korišćena jer su oni vrsta kod koje se samo-primena THC-a može najpouzdanije proučavati.>

<(4 μg/kg/injekcija) prema rasporedu ubrizgavanja leka sa fiksnim odnosom (FR10, svaki 10. odgovor na poluzi je proizvodio injekciju THC-a).>

<Zabeležen je broj pritisaka poluge i broj injekcija po sesiji. Stope odgovora se izračunavaju na osnovu raspoloživog vremena sesije za odgovaranje (tj. vreme čekanja se oduzima). Statistika se>vrši za broj injekcija i stope odgovora po sesiji koristeći jednosmerne ili dvosmerne ponovljene mere ANOVA sa dozom THC-a ili vremenom kao faktorima.

Majmuni korišćeni u prethodnim eksperimentima su bili podvrgnuti svakodnevnim sesijama ekstinkcije tokom kojih su pritisci na poluge doveli do infuzije nosača plus vizuelnih signala koji su prethodno bili upareni sa infuzijama THC-a, ali ne i THC. Posle najmanje dve sesije ekstinkcije, kada je reagovanje dostiglo nizak nivo, određeni su efekat prethodnog tretmana sa 3pMBP (0,0015, 0,005 i 0,015 mg/kg) ili kontrolnim nosačem od 3pMBP na THC priming-indukovano (0,04 mg/kg iv) ponovno uspostavljanje traženja THC-a. Injekcije za pripremu THC-a date su neposredno prepočetka testnih sesija. Tokom testiranja, pritisci poluge (FR10) su nastavili da proizvode samoinjekcije nosača i diskretne redove. Takođe je testiran efekat 0,015 mg/kg od 3pMBP na primingnosača kako bi se utvrdilo da li će 3pMBP per se uticati na reagovanje nakon ekstinkcije.

<3pMBP inhibira (ID50≈0,005 i ID100≈0,015 mg/kg) intravenoznu samo-primenu THC-a kod neljudskih primata (veveričastih majmuna) (Slike 7A i 7B). 3pMBP je takođe inhibirao (ID100≤ 0,0015>mg/kg) ponovno uspostavljanje traženja THC-a kod ne-ljudskih primata (veveričasti majmuni) izazvano primingom THC-a, ali nije imao uticaja na priming nosača (Slike 7C i 7D).

<Zaključak>

<Rezultati eksperimenata za procenu efekata 3pMBP na uslovljene i neuslovljene efekte THC-a prikazani su u tabeli u nastavku (Tabela 4). Ova tabela jasno pokazuje da je 3pMBP veoma moćan u>inhibiciji velikog spektra efekata THC-a povezanih sa nekoliko poremećaja koji se javljaju nakon upotrebe kanabinoida. U skladu sa time, 3pMBP se pojavljuje kao opšti tretman poremećaja povezanih sa kanabinoidima.

Tabela 4: Rezime pretkliničke procene 3pMBP kao tretmana poremećaja povezanih sa kanabinoidima

Primer 4: 3pMBP nema nijedan od bihevioralnih i endokrinoloških neželjenih efekataortosteričnih CB1 antagonista

Upoređeni su farmakološki profil i efekti na fenotipove koji se odnose na neželjene efekte 3pMBP i ortosteričnog CB1 antagonista rimonabanta. Ortosterični CB1 antagonisti kao što je Acomplia<®>su<povučeni sa tržišta zbog štetnih efekata. Shodno tome, da bi terapeutsko sredstvo koje inhibira CB1>bilo od praktične upotrebe kod ljudi, ne bi trebalo da ima poznate štetne efekte ortosteričnih CB1antagonista.

<Poznati neželjeni efekti ortosteričnih antagonista CB1 receptora i posebno rimonabanta su: 1. Smanjenje unosa hrane i telesne težine što je znak nespecifičnog efekta na putanje nagrađivanja; 2.>Indukcija ponašanja povezanih sa anksioznošću i depresijom; 3. Povećanje sekrecijeglukokortikoida što dovodi do oštećenja hormonskog statusa subjekta; 4. Indukcija precipitirane apstinencije kod subjekata zavisnih od kanabinoida.

<Pronalazači su zatim analizirali efekte 3pMBP na sve ove parametre.>

<1. Efekti ponovljenog tretmana sa 3pMBP na unos hrane i telesnu težinu>

<Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost ponovljenog tretmana sa 3pMBP da smanji>unos hrane i telesnu težinu indukovano ishranom kod modela miša sa gojaznošću (DIO) i dauporede ove efekte sa efektima CB1 ortosteričnog antagonista rimonabanta. Proučavani su telesna težina i unos hrane jer su smanjeni ponovljenim tretmanom CB1 ortosterskim antagonistima i kod miševa i kod ljudi (Wiley et al., 2005; Mazier et al., 2015; Bermudez-Silva FJ, et al., 2012. ). DIO miševi su korišćeni jer su efekti CB1 antagonista veće amplitude kod gojaznih miševa nego kod mršavih miševa.

<Mužjaci C57BL/6J miševa su hranjeni ad libitum ishranom sa visokim sadržajem masti (HFD) tokom 8 nedelja pre početka farmakoloških tretmana. Tokom farmakoloških tretmana, HFD je održavan i svakodnevno su mereni unos hrane i telesna težina. Potrošena hrana je izračunata>oduzimanjem hrane koja je ostala u rezervoarima od početne prethodno izmerene količine. Uprvom eksperimentu (n=10-7 po grupi) analiziran je efekat 3pMBP (0, 0,005, 0,015 i 0,05 mg/kg; u 2 ml/kg kukuruznog ulja) tokom četiri nedelje. U drugom eksperimentu (n=8 po grupi) upoređeni su efekti 3pMBP (0, 5 i 15 mg/kg u 5 ml/kg kukuruznog ulja) sa efektima rimonabanta (10 mg/kg u 5 ml/kg kukuruznog ulja) tokom dve nedelje lečenja. 3pMBP i rimonabant su davani oralnom gavažom jednom dnevno, dva sata pre početka tamne faze ciklusa svetlo/mrak.

<3pMBP ni u jednoj od testiranih doza nije promenio unos hrane ili telesnu težinu tokom celog trajanja eksperimenta (četiri nedelje za 0,005, 0,015 i 0,05 mg/kg i dve nedelje za 5 i 15 mg/kg). Nasuprot tome, rimonabant antagonist CB1 smanjio je i unos hrane i telesnu težinu (Slike 8A i 8B).>

2. Efekti 3pMBP na precipitirano povlačenje

Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost 3pMBP da precipitira povlačenje kod miševa koji su hronično tretirani THC-om. Precipitirano povlačenje je proučavano jer bi moglo da predstavlja potencijalni neželjeni efekat THC inhibitora kod subjekata zavisnih od kanabinoida. Na primer, poznato je da ortosterični CB1 antagonist rimonabant izaziva povlačenje kod miševa koji suhronično lečeni THC-om.

Materijali i metode

<Hronični režim THC-a (20 mg/kg, dva puta dnevno) koji je korišćen u ovim eksperimentima je izabran jer oponaša obilnu upotrebu marihuane (Cook et al., 1998) i smatra se modelom zavisnosti od kanabinoida kod miševa (Cutando et al.., 2013; Hutcheson et al., 1998). Efekti rimonabanta (10>mg/kg) i 3pMBP (0,15 mg/kg) su proučavani u nezavisnim eksperimentima na CD1-Swiss miševima. Od dana 1 do 4-5, miševima je ip injektiran nosač ili THC (20 mg/kg u NaCl 0,9% koji sadrži 2% etanola i 2% Tween80, 10 ml/kg) dva puta dnevno. Poslednjeg dana tretmana, miševi u THC grupi primili su rimonabant ili 3pMBP. Sve ostale životinje su dobile administraciju

<odgovarajućeg nosača. Snimci su analizirani 45 minuta odmah (rimonabant) ili 3h (3pMBP) nakon primene. Doza i raspored primene rimonabanta odabrani za ovu studiju se obično koriste za ubrzavanje povlačenja THC-a kod miševa (Cook et al. 1998, Hutcheson et al., 1998, Huang et al.,>2009).

Za merenje ubrzanog povlačenja, miševi su smešteni u novi kućni kavez, a video kamera postavljena ispred svakog kaveza je snimala ponašanje životinja. Bodovanje je vršeno 1 minut svakih 5 minuta. Analizirana su dva znaka povlačenja: tremor šapa i drhtanje glave, jer su tonajčešći znaci povlačenja THC-a uočeni kod miševa (Cook et al.1998, Hutcheson et al., 1998,Lichtman et al., 2001).

3pMBP nije precipitirao povlačenje kod miševa. Nasuprot tome, u istim eksperimentalnimuslovima, znaci povlačenja pojavili su se nakon primene CB1 ortosteričnog antagonista rimonabanta (Slike 8C i 8D).

3. Efekti ponovljene primene 3pMBP na ponašanje povezano sa anksioznošću i depresijom<kod miševa>

Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene sposobnost ponovljenog tretmana sa 3pMBP da povećaponašanje povezano sa anksioznošću i depresijom kod miševa i da uporede ove potencijalne efekte sa efektima ortosteričnog CB1 antagonista rimonabanta. Proučavana su ponašanja povezana sa

<anksioznošću i depresijom jer su porast anksioznosti i depresije posledica ponovljenog tretmana ortosterskim antagonistima CB1 i kod glodara i kod ljudi (Bellocchio et al., 2013, Patel et al., 2006, Moreira et al. , 2009, Tzavara et al., 2003). Ponašanja slična anksioznosti proučavana su u povišenom plus lavirintu (EPM) jer se ovaj model široko koristi kod glodara za procenu>pretpostavljenih anksiogenih ili anksiolitičkih efekata farmakoloških jedinjenja (Walf et al., 2007). Ponašanje vezano za depresiju proučavano je korišćenjem testa preferencije saharoze koji se u velikoj meri koristi kao model anhedonije, jednog od kardinalnih simptoma depresije.

<EPM aparat je sačinjen od četiri podignuta kraka raspoređena u krstastom rasporedu, pri čemu su>dva suprotna kraka ograđena zidovima, a druga dva kraka otvorena. Za sve eksperimente, nakon dobijanja odgovarajućeg tretmana, miševi su postavljeni u centar EPM-a i pušteni da istražuju lavirint 5 minuta. Provedeno vreme i broj ulazaka u otvorene i zatvorene krakove mereni su<automatskim sistemom za video praćenje. Smanjenje procenta poseta i/ili vremena provedenog na krakovima smatra se indeksom povećanja nivoa anksioznosti.>

<Test preferencije saharoze izveden je u kućnom kavezu miševa. Dve identične boce, jedna sa vodom,>a druga sa 2% rastvora saharoze stavljene su u rezervoar svakog kućnog kaveza. Miševi su imali<neograničen pristup vodi i rastvorima saharoze tokom faze aktivnosti, mračne faze ciklusa svetlo/mrak koja je počela u 19 časova. Zapremine vode i rastvora saharoze koje su pili miševi merene su u dva intervala od 1,30 h, prvi između 19:00 i 20:30, a drugi između 20:30 i 22:00. U svakoj vremenskoj tački, boce su izvagane i zapremina unosa je izračunata oduzimanjem početne težine boce od konačne težine boce.>

Mužjaci C57BL/6J miševa (n=6-8 po grupi) primali su jednu dnevnu primenu 3pMBP (0,05; 5 ili 15 mg/kg), rimonabanta (10 mg/kg) ili odgovarajućih vehikuluma tokom 28 dana. 26. dana, miševi su podvrgnuti EPM-u, a 28. dana testu preferencije saharoze. Sve procedure ponašanja počele su 3 sata nakon tretmana sa 3pMBP ili vehikulumom 3pMBP (0 mg/kg) i 30 minuta nakon tretmana rimonabantom ili vehikulumom rimonabanta (0 mg/kg).

<3pMBP nije imao uticaja na ponašanja vezana za anksioznost i depresiju mereno u EPM (Slike 9A i 9B) i testu preferencije saharoze (Slika 9C). Nasuprot tome, rimonabant je pojačao ponašanje povezano sa anksioznošću i depresijom, što je prikazano smanjenjem vremena provedenog u otvorenim kracima EPM-a (Slika 9A) i procentom poseta na otvorenim kracima (Slika 9B) i smanjenjem preferencije za saharozu (Slika 9D).>

4. Efekti 3pMBP na sekreciju glukokortikoida kod miševa

Ovi eksperimenti su imali za cilj da procene efekte 3pMBP kod miševa na koncentraciju kortikosterona u plazmi, glavnog glukokortikoida koji proizvodi nadbubrežna žlezda kod glodara koji odgovara kortizolu kod ljudi. Proučavani su efekti 3pMBP na nivoe kortikosterona jerortosterični CB1 antagonist rimonabant povećava koncentraciju kortikosterona u plazmi (Steiner etal., 2008).

Materijali i metode

<Proučavani su efekti 3pMBP (0,3 i 10 mg/kg) ili nosača (VEH) na nivoe kortikosterona u plazmi kod mužjaka i ženki CD-1 Swiss miševa. Uzimanje krvi je obavljeno 2, 5, 8 i 24 h nakon doziranja (n=3 po polu, po dozi i vremenu uzorkovanja). Za uzimanje uzoraka krvi miševi su anestezirani pod>izofluranom i krv je sakupljena srčanom punkcijom. Krv je centrifugirana, plazma je uzeta i zamrznuta na -80°C do kvantifikacije kortikosterona pomoću GC-MS/MS (gasna hromatografijatandem masena spektrometrija) korišćenjem validirane GC-MS metode opisane na drugom mestu (Vallee et al., 2014; Vallée et al., 2000; George et al., 2010).

3pMBP u dozi od 0,3 i 10 mg/kg nije povećao lučenje glukokortikoida kod mužjaka (Slika 10A) i kodženki (Slika 10B) miševa.

<Zaključak>

Neželjeni efekat rimonabanta je upoređen sa efektima 3pMBP u tabeli 5.

Tabela 5: 3pMBP nema nijedan od štetnih efekata rimonabanta

Efekti 3pMBP su veoma različiti od efekata CB1 ortosteričnog antagonista rimonabanta.

3pMBP nema tipičnih štetnih efekata rimonabanta i drugih CB1 ortosteričnih antagonista, kao što je smanjenje unosa hrane, povećanje ponašanja povezanih sa anksioznošću i depresijom, ubrzano<povlačenje kod životinja zavisnih od THC-a i povećanje sekrecije glukokortikoida.>

<Ovaj nedostatak efekata 3pMBP primećen je za sve najveće doze korišćene u svakom testu. Ove>doze su bile nekoliko puta veće (u mg/kg) od ID50 (0,005 mg/kg) od 3pMBP da bi inhibiralisamodavanje CB1 agonista i THC-a, respektivno: 30 puta veće za precipitirano povlačenje; 2000 puta veće za sekreciju glukokortikoida; i 3000 puta veća za ponašanje u vezi sa unosom hrane, telesnom težinom, anksioznošću i depresijom.

Primer 6: 3pMBP nema uticaja na raspoloženje i kognitivne performanse kod ljudi.

Ovi eksperimenti su dizajnirani da procene efekte pojedinačnih i ponovljenih rastućih doza 3pMBP na raspoloženje, spoznaju i suicidalnost kod ljudi koristeći niz validiranih testova.

Materijal i metode

<Urađene su dve studije. U prvoj studiji nezavisne kohorte zdravih dobrovoljaca primile su jednokratnu primenu 3pMBP u jednoj od 3 rastuće doze (0,2, 0,6; 2 mg/subjekat) ili placebo. U svakoj dozi kohorte, koristeći dvostruko-slepu proceduru, 6 subjekata je primilo dodeljenu dozu od 3pMBP, a 2 subjekta su primila placebo. U drugoj studiji, nezavisne grupe zdravih dobrovoljaca primile su ponovljene administracije od 0,6 mg po subjektu 3pMBP (jednom dnevno tokom 7 dana). U svakoj dozi kohorte, koristeći dvostruko-slepu proceduru, 6 subjekata je primilo dodeljenu dozu>od 3pMBP, a 2 subjekta su primila placebo. Doza od 0,2 mg/subjekat indukuje povećanje koncentracija u plazmi od 3pMBP koje su u rasponu od onih koje se primećuju pri najopaženijem ED100 (0,015 mg/kg) za inhibiciju THC efekata ponašanja kod glodara.

U obe studije, nakon doziranja 3pMBP, subjekti su takođe podvrgnuti opštem posmatranju njihovog ponašanja od strane sertifikovanog kliničara i izvršeni su sledeći testovi.

<Vizuelna analogna skala Bond i Lader (Bond i Lader, 1974) sastoji se od 16 bipolarnih linija dužine 100 mm sa samoocenjivanjem između dva suprotna adjektiva. Test je kompjuterski potpomognut.>Ispitanik mora u svakoj liniji da naznači kako se oseća u vreme testa, koristeći miš. Odgovor se ocenjuje merenjem rastojanja u mm između levog kraja linije i oznake subjekta. Rezultat se sastoji od tri izvedena faktorska pod-rezultata: budnost, zadovoljstvo (dobro stanje) i smirenost. Veći rezultat ukazuje na veću budnost, zadovoljstvo i smirenost.

Ovaj upitnik koji se samo-primenjuje i sprovodi uz pomoć kompjutera sastoji se od 49 stavki. Svakopitanje se pojavljuje jedno po jedno na ekranu. Koristeći miš, subjekt mora da klikne na "netačno" ili<"tačno" za svaku stavku, s obzirom na to šta oseća u trenutku kada je čita. Zatim se izvodi 5 rezultata: PCAG (Pentobarbital Hlorpromazin Alkohol Grupna Skala), BG (Benzedrin grupa), AG>(Skala Amfetamin Grupe), LSD (Skala LSD Grupe) i MBG (Skala Morfujum Benzedrin Grupe) (Martinet al., 1971) .

<Ova verzija je kompjuterizovana verzija. Svaki adjektiv se pojavljuje jedan po jedan na ekranu i od subjekta se traži da opiše kako ovi adjektivi odražavaju njegovo raspoloženje u vreme kada>popunjava upitnik, ocenjujući svaki opis na skali od 5 poena povećanja slaganja: od „uopšte ne“ do „izuzetno“.

Iz upitnika je klasično izvedeno šest rezultata: anksioznost - napetost (TA); depresija - potištenost (DD); bes - neprijateljstvo (AH); snaga - aktivnost (VA); zamor - inercija (FI); zbunjenost – smušenost (CB).

Odnos između lekova koji ulaze u CNS i potencijala za samoubistvo (suicidalne ideje i ponašanje)nedavno je dobio povećanu pažnju regulatornih agencija, kao što je FDA, i podigla je potrebu za proaktivnom implementacijom konzistentnijih i strožih mehanizama prikupljanja podataka u<kliničkim ispitivanjima.>

Prospektivna procena suicidalnosti prikuplja se korišćenjem skale za ocenjivanje ozbiljnostisamoubistava Kolumbije (CSSRS). C-SSRS je dizajniran da proceni i samoubilačko ponašanje i<samoubilačke ideje i sastoji se od dva upitnika: jednog dizajniranog za osnovnu procenu (pokriva>životni vek subjekta do osnovne posete) i jednog koji se koristi tokom studije (upitnik „Odposlednje posete“) .

U zaključku, podaci pokazuju da kod ljudi, kao što je primećeno kod životinja, primena 3pMBP ne menja značajno bazalno ponašanje, raspoloženje i kognitivne performanse.

Primer 7: Bezbednosna farmakologija i toksikologija 3pMBP poređenja sa rimonabantom 1. GLP bezbednosna farmakološka evaluacija 3pMBP

Materijali i metode

Procena efekata 3pMBP na hERG struju u stabilno transfektovanim ćelijama HEK-293:

<3pMBP je proučavan u 3 ćelije HEK-293 stabilno transfektovane sa hERG. Na svakoj ćeliji su>testirani sledeći tretmani: Tyrode; Vehikulum od 3pMBP (0,3% DMSO u Tyrode) i 3pMBP na 10,98x10-8 M, 10,98x107 M i 3pMBP na 10,98x10-6 M.

E-4031 je korišćen kao pozitivna kontrola i testiran je u jednoj zasebnoj ćeliji HEK-293 da bi se potvrdila validnost korišćene metode.

<Ćelije su pričvršćene na -80 mV, depolarizovane na 0 mV tokom 5 sekundi što je omogućilo aktivaciju hERG struje i repolarizovane su na -50 mV tokom 5 sekundi omogućavajući deaktivaciju hERG rep struje. Ovaj eksperimentalni postupak je ponovljen na frekvenciji od 0,06 Hz. Struje su>filtrirane na 1 kHz i dobijene na frekvenciji od 2 kHz. Amplituda rep struje hERG merena je tokomrepolarizacionog impulsa od 0 do -50 mV. Ćelije su perfuzirane sa Tyrode rastvorom, a zatim sa Tyrode rastvorom koji sadrži 3pMBP tokom najmanje 5 minuta dok se nije postiglo stabilno stanje za svaki period perfuzije. Struje su merene pre i posle izlaganja testnom predmetu.

Studija je uključivala 4 grupe od 6 mužjaka pacova Wistar, težine između 154,0 i 185,9 g. Grupama je davan nosač (kukuruzno ulje, tj. kontrolna grupa), ili 3pMBP u dozi od 2, 9 ili 36 mg/kg.

Na dan ispitivanja, životinje su prvo bile ocenjene pomoću Irwin standardizovane baterije za posmatranje i izmerena je telesna temperatura. Nakon toga, oralnim putem im je dozirana jedna od doza 3pMBP ili njegov nosač u zapremini od 4 ml/kg. Zatim su ponovo izvršeni Irwin rezultati kao i merenje telesne temperature 1, 3, 6, 8 i 24 sata nakon primene.

<Procena efekta 3pMBP na disanje kod nesputanog svesnog pacova nakon jednokratne oralne primene Cilj ove studije je bio da se proceni svaki mogući efekat jednokratne oralne primene 3pMBP na respiratorne parametre (brzinu disanja, vršne tokove udisaja i vršnog izdisaja, vremena udisaja i>izdisaja, indeks otpora disajnih puteva, zapreminu dihalnog i minutnog volumena) merene pomoću metoda pletizmografije celog tela kod svesnih pacova.

Studija je sprovedena u skladu sa opštim zahtevima GLP-a, a dizajn studije je u skladu sa smernicama ICH S7A (2001) za bezbednu farmakologiju.

<Dan pre studije, životinjama je bilo dozvoljeno da piju samo vodu. Na dan ispitivanja, životinje su stavljene u pletizmograf i merenja su počela odmah nakon toga. Metoda pletizmografije celog tela>meri u zatvorenoj komori varijacije u protoku vazduha usled pomeranja torakalnog kapka tokom disanja i omogućava merenje respiratornih parametara kod svesne životinje, koja se potpuno slobodno kreće. Najmanje 15 minuta nakon početka merenja, životinjama je oralno dozirano 3pMBP ili njegov nosač u zapremini od 4 ml/kg. Disanje je zabeleženo u ukupnom periodu od 6 sati nakon doziranja. Respiratorni parametri su određeni analizom respiratornih ciklusa.

Procena efekata 3pMBP na krvni pritisak, broj otkucaja srca, elektrokardiogram i telesnu<temperaturu nakon jednokratne oralne primene kod svesnih pasa>

<Studija je uključivala 4 mužjaka Bigla koji su prethodno opremljeni telemetrijskim predajnicima za>merenje arterijskog krvnog pritiska, telesne temperature i elektrokardiograma.

Studija je sprovedena u dva dela. U delu I, svaka životinja je primila nosač (tj. kukuruzno ulje), 3pMBP u dozi od 2, 9 i 36 mg/kg oralnim putem prema rastućoj dozi sa periodom ispiranja od jedne nedelje između doza. Telemetrijska merenja arterijskog krvnog pritiska, brzine otkucaja srca, telesne temperature i elektrokardiograma (epikardijalna elektroda II) počela su najmanje 2 sata pre svakog doziranja i nastavila se najmanje 24 sata nakon doziranja. U delu II, životinjama je ponovo doziran 3pMBP bilo u dozi od 9 ili 36 mg/kg (n=2 po nivou doze) oralnim putem za komplementarna ispitivanja, tj. uzorkovanje krvi i posmatranje životinja.

<3pMBP nije pokazao nikakve neželjene efekte na GLP testove bezbednosti farmakologije:>

<1. In vitro, 3pMBP (100 nM, 1 μM i 10 μM) nije modifikovao hERG (human eter-ago-go-related gene) rep struje u HEK-293 ćelijama koje su stabilno transfektovane sa hERG-1 cDNK.>

2. In vivo, 3pMBP (2, 9 i 36 mg/kg) nije modifikovao: a. Ponašanje (Irwin test) i telesnu temperaturu kod pacova; b. disanje kod svesnih pacova; i c. krvni pritisak, broj otkucaja srca, elektrokardiogram i telesnu temperaturu kod svesnih pasa.

Jedini prijavljen efekat je smanjenje ritmova visoke stope srčane frekvencije i oscilacija povezanih sa smanjenjem varijabilnosti srčane frekvencije pri dozi od 9 mg/kg samo kod psa. Ovaj nalaz sugeriše efekat na autonomnu ravnotežu i, tačnije, smanjenje vagalne aktivnosti. Međutim, ovaj<efekat je bio blag jer nije izazvao nikakvu promenu u otkucaju srca i ne može se smatrati štetnim>dejstvom sam po sebi.

2. GLP toksikološka procena 3pMBP

Materijali i metode

<Citotoksični, mutageni i genotoksični efekti 3pMBP su testirani do maksimalnih koncentracija prihvatljivih za test sisteme, odnosno između 74 i 100 μM.>

Ove doze su približno 7400 i 10000 veće od najvišeg IC50 od 3pMBP (10 nM) da inhibiraju ćelijske efekte THC-a posredovane sa CB1.

Toksikološke studije in vitro sprovedene za karakterizaciju 3pMBP bile su: 1. AMES test /-<metabolička aktivacija (GLP); 2. Test humanih hromozomskih aberacija /- metabolička aktivacija (GLP); 3. Citotoksičnost na primarnoj kulturi neurona i hepatocita (ne-GLP). Studije toksičnosti>ponovljenih doza su sprovedene na pacovima i psima. Ove dve vrste su odabrane zato što obe vrste eksprimiraju CB1 receptor i klasično i uspešno su korišćene za identifikaciju toksičnih efekata CB1<ortosteričnih antagonista, kao što je rimonabant. Pored toga, pretpostavljeno mesto vezivanja pregnenolona ima 100% homologiju kod pacova, pasa i ljudi. Konačno, studije vezivanja za proteine sugerišu da se vezivanje 3pMBP nije razlikovalo između pacova (84-94%), pasa (84-105%) i ljudi>(88-98%), dok se činilo da je veće kod majmuna (97-99%).

Ponovljene toksikološke studije sprovedene za karakterizaciju 3pMBP bile su 28-dnevne studije oralne toksičnosti (GLP) na pacovima i psima sa tri doze (2 mg/kg, 9 mg/kg i 36 mg/kg).

Rezultati

3pMBP nije pokazao nikakvu citotoksičnost, genotoksičnost i mutagenezu čak ni pri najvišojtestiranoj koncentraciji (između 74 i 100 μM). Koncentracije 3pMBP od 74 i 100 μM su

7 400-10 000 puta veće od IC503pMBP za inhibiciju fosforilacije MAPK zavisne od CB1.

In vivo studije

Tabela 6: Rezime in vivo studi a toksičnosti sa 3 MBP kod acova i asa

(nastavak)

In vivo, 3pMBP kod pacova ima NOAEL (nivo nezapaženog štetnog efekta) >36 mg/kg/dan/28 dana,a kod pasa NOEL (nivo nezapaženog efekta) >36 mg/kg/dan/28 dana.

Uzimajući u obzir da je najčešće primećeni ID50 od 3pMBP za inhibiciju efekata THC-a kod miševa,pacova i ne-humanih primata 0,005 mg/kg, 3pMBP ima terapeutski indeks (TI) > 7200.

<Zaključak>

<Na osnovu rezultata toksikoloških eksperimenata, 3pMBP pokazuje povoljan profil toksičnosti sa TI >7200. Tako veliki TI može biti rezultat dve karakteristike 3pMBP: 1. Jedinstven i veoma selektivan mehanizam delovanja (MoA) koji nije pronađen u drugim odobrenim lekovima i, prema našem saznanju, još nije testiran u drugim pretkliničkim razvojima. Zato se čini da 3pMBP samo inhibira aktivnost jednog od THC-indukovanih signalnih puteva (MAPK) i nema efekta na THC>nezavisne CB1-posredovane fenotipove in vivo.

2. Niska konverzija u metabolite dobijene lekom koji su vrlo često odgovorni za in vivo toksičnost NCE-ova.

Kao što je prikazano u tabeli ispod (Tabela 7), profil bezbednosti i toksičnosti 3pMBP se veoma razlikovao od profila ortosteričnog CB1 antagonista rimonabanta. Tako je rimonabant izazvao nekoliko neželjenih događaja u dozama koje su bile prilično blizu terapijskoj, a posebno klonične konvulzije, hepatotoksičnost i nekoliko dubokih promena u ponašanju.

Tabela 7 Poređenje toksičnog efekta 3pMBP i rimonabanta u GLP studijama

(nastavak)

Primer 8: Studije farmakokinetike, adsorpcije, distribucije, metabolizma i izlučivanja 3pMBP

1. Farmakokinetika i apsorpcija 3pMBP kod životinja

<Farmakokinetika (PK) 3pMBP u plazmi proučavana je kod mužjaka i ženki miševa pacova i pasa>nakon per os primene (u kukuruznom ulju) putem gavaže. Distribucija 3pMBP u mozgu proučavanaje kod miševa i pacova. Kod pasa, 3pMBP je takođe primenjen intravenozno nakon solubilizacije u ciklodekstrinu. I u plazmi i u mozgu, koncentracije 3pMBP su merene korišćenjem tečne hromatografije povezane sa tandem masenom spektrometrijom (LC/MS-MS).

<Nije bilo razlike između mužjaka i ženki u PK parametrima 3pMBP u plazmi nakon davanja miševima (0,3, 4 i 10 mg/kg, per os), pacovima (1,6 mg/kg, per os) i psima (0,7 mg/ kg, per os i iv). Kao što je opisano u Tabeli 8 (rezultati od muških i ženskih životinja su kumulirani), povećanje AUC>u plazmi nakon jednokratne primene 3pMBP bilo je linearno u odnosu na tri doze proučavane na miševima (0,3, 4 i 10 mg/kg). Kod miševa, pacova i pasa, tmax od 3pMBP je bio sličan (≈3h) što ukazuje na uporedivu brzinu apsorpcije 3pMBP. Polu-život 3pMBP bio je najduži kod pasa (28,0 h<per os; 35,9 iv), praćen miševima (17,8-18,3 h) i najkraći kod pacova (8-13,9 h). Odnosi AUC/doze nakon per os primene su bili veći kod pasa (2074), praćenih miševima (848-1132); najmanja je bila>kod pacova (661).

Kod miševa i pacova, 3pMBP je imao duži tmax (7 h vs ≈3 h) i veći AUC i Cmax u mozgu nego u plazmi.<Činilo se da su AUC i Cmax odnos mozak/plazma obrnuto povezani sa dozom, pri čemu su najveći odnosi (Cmax =2,8 i AUC= 7,38) primećeni za 0,3 mg/kg 3pMBP kod miševa. Polu-život 3pMBP u mozgu i plazmi bio je sličan.>

Nakon oralne ili intravenske primene 3pMBP, miševi, pacovi i psi su pokazali dvofazni profil eliminacije, brzo smanjenje (faza distribucije) praćeno mnogo postepenijim opadanjem do poslednjeg vremena uzorkovanja (faza eliminacije).

Kod pasa, bioraspoloživost 3pMBP je bila približno 68%.

Tabela 8: Sumirani srednji farmakokinetički parametri u plazmi miševa, pacova i pasa nakon jednokratne primene 3pMBP

2. Farmakokinetika 3pMBP kod ljudi

koristila dvostruko slepu proceduru, 6 subjekata je primilo dodeljenu dozu od 3pMBP, a 2 subjekta su primila placebo.

Koncentracije 3pMBP u plazmi su procenjene vršenjem pune farmakokinetike tokom prva 24 sata nakon doziranja i svaka 24 sata nakon toga.

Oralna primena 3pMBP indukovala je koncentraciju leka u plazmi koja je bila u rasponu od onih<predviđenih PK studijama na životinjama koristeći konverziju odnosa površine tela, što potvrđuje>dobru apsorpciju 3pMBP kod ljudi. Doza od 0,2 mg/subjekat izazvala je povećanje koncentracija uplazmi od 3pMBP koje su u rasponu od onih koje su primećene pri najopaženijem ED100 (0,015 mg/kg) za inhibiciju THC efekata ponašanja kod glodara.

3. Metabolizam 3pMBP

Materijali i metode

<Metabolička stabilnost 3pMBP u mikrozomima jetre ljudi, pacova, miša i pasa:>

<Istraživanje je sprovedeno na mikrozomima jetre (LM) koji potiču od miša (MLM), pacova (RLM),>psa (DLM) i čoveka (HLM).

<3pMBP je inkubiran sa skupovima mikrozoma jetre dopunjenim NADPH kao kofaktorom. Uzorci su uzeti u 5 različitih vremena (0, 10, 20, 30 i 60 minuta) i uzorci su praćeni za nestanak matičnog>jedinjenja u MRM režimu korišćenjem LC/MS-MS. Utvrđeni su Intrinzički Klirens i polu-život. Verapamil je korišćen kao referentno jedinjenje.

Metaboličko profilisanje [3H]-3pMBP u plazmi i izlučevinama kod pacova

<Metabolički profil je procenjen u plazmi, u urinu i fecesu, a radio-obeleženi metaboliti su>identifikovani prema njihovom vremenu zadržavanja korišćenjem Radio-HPLC analize. Rezultati suizraženi kao % zbira svih detektovanih oblasti pikova.

<Konverzija 3pMBP u nizvodnim steroidima proučavana je kod miševa, merenjem pregnenolona>nizvodnih steroida progesterona i 17α,OH pregnenolona, koji su prva dva koraka metabolizma pregnenolona. Konverzija 3pMBP u nizvodnim steroidima je takođe proučavana kod pacova i pasa nakon primene 2, 9 i 36 mg/kg jedinjenja merenjem testosterona, DHEA i alopregnanolona.

<Konačno, konverzija u nizvodne steroide (DHEA, alopregnanolon i testosteron) je proučavana kod ljudi nakon akutne primene jedne od tri doze (0,2, 0,6 i 2 mg/subjektu) 3pMBP. U svim ovim>studijama koncentracije steroida u plazmi merene su gasnom hromatografijom-tandemskom masenom spektrometrijom (GC/MS-MS).

Rezultati

<Metabolička stabilnost mikrozoma jetre (LM)>

3pMBP je imao nizak klirens u LM kod ljudi i pacova (intrinzični klirens = 3,38 i 12,3 μl/min/mg;polu-život = 410 i 113 min, respektivno) i umeren klirens kod LM pasa i miševa (intrinzični klirens = 26,0 i 29,7 μl/min/mg i polu-život = 53,4 i 46,6 min, respektivno).

Metabolički profil kod pacova

In vivo, [<3>H]-3pMBP ne proizvodi nikakve glavne metabolite u plazmi. Jedinjenje se uglavnom<izlučuje fecesom gde se čini da se najveći deo metabolizma odvija. U plazmi tri i šest sati nakon oralne primene [3H]3pMBP, primećen je samo jedan glavni pik, koji odgovara 3pMBP, što čini 100% (3h) odnosno 78% (6h) svih integrisanih pikova. Nakon 24 sata, 3pMBP nije bio prisutan u plazmi i postojali su samo tragovi jednog metabolita. U urinu je otkriveno malo 3pMBP (manje od 0,5%>doze) u svakom vremenskom intervalu. U intervalu od 0-6 sati, otkrivena su tri glavna pika (≈30% svaki) uključujući onaj koji odgovara 3pMBP. U 6-24h i 24-48h nije otkriven 3pMBP u urinu i bila su prisutna samo dva druga pika. Većina izlučene doze pronađena je u fecesu u kojem je, pored 3pMBP, pronađeno sedam drugih pikova koji čine svaki između 30 i 10% integrisanih pikova.

Primena 3pMBP u dozi od 0,3 i 10 mg/kg per os nije povećala koncentraciju progesterona i 17-OH-pregnenolona u plazmi, prva dva koraka metabolizma pregnenolona, mereno kod mužjaka i ženki<miševa 2, 5, 8 ili 24 sata nakon 3pMBP primene. Slično, kod mužjaka i ženki pacova i pasa nije bilo efekta akutne ili ponovljene (28 dana) primene 3pMBP (2, 9 i 36 mg/kg) na koncentraciju>testosterona, DHEA i alopregnanolona u plazmi, merene pri pred-doziranju i zatim 1h, 2h, 4h, 8h i24h post-doze. Konačno, nisu primećene promene u aktivnim steroidima kod ljudi za sve testirane doze 3pMBP.

4. Interakcija 3pMBP sa metaboličkim enzimom CYP, UGT i ćelijskim transporterima<Materijal i metode>

<3pMBP je prethodno inkubiran u jednoj koncentraciji (10 μM) sa supstratom i spojenim mikrozomima ljudske jetre. Reakcija je započeta dodavanjem jedinjenja koja stvaraju NADPH i nakon prekida reakcije i tretmana uzoraka; HPLC-UV/VIS i HPLC-MS/MS detekcija su korišćeni za detekciju oblasti pikova koje odgovaraju metabolitu svakog supstrata.>

<3pMBP (10 μM) je testiran u testu inhibicije UGT1A1 (rekombinantni, skopoletin supstrat). 3pMBP je prethodno inkubiran sa UGT1A1 i fluorescentnim supstratom skopoletinom u Tris puferu (pH 7,5) tokom 15 minuta na 37°C. Reakcija se pokreće dodavanjem ko-faktora uridindifosfoglukuronske kiseline (UDPGA), inkubacija se nastavlja 60 minuta i relativni intenzitet>fluorescencije (RFI) se meri na čitaču fluorescentne ploče.

Potencijal test jedinjenja 3pMBP da indukuje CYP1A2, CYP2B6 i CYP3A4 testiran je in vitro u tri primerka pri test koncentracijama od 0,01, 0,1 i 1 μM korišćenjem nivoa mRNA kao krajnje tačke. Inhibicija 3pMBP aktivnosti različitih ćelijskih transportera (OCT2, BCRP, OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, P-gp) je testirana in vitro.

Efekti 3pMBP (10 μM;), i referentnih inhibitora svakog transportera, proučavani su u ćelijskoj liniji preko ekspresije ciljnih ćelijskih transportera. Ovarijumi kineskog hrčka (CHO) su korišćeni za sve transportere osim za P-gp koji je proučavan u ćelijama Madin-Darby Canine Kidnei (MDR1-MDCKII). Inhibicija aktivnosti svakog transportera se procenjuje merenjem promena u transportu njihovih specifičnih supstrata pomoću fluorometrije.

<3pMBP na 10 μM nije indukovao značajnu inhibiciju aktivnosti CYP izozima (1A, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 3A) i pri 10 nM, 100 nM i 1 μM nije povećao ekspresiju CYP1A2, CYP2B6 i CYP3A4.>U skladu sa smernicama FDA, 3pMBP bi se mogao označiti kao lek koji ne reaguje sa CYP enzimima. Pored toga, 3pMBP (10 μM) nije modifikovao aktivnost UGT1A1 i nekoliko ćelijskih transportera (OCT2, BCRP, OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, P-gp).

<Zaključak>

Ukupno 3pMBP pokazuje povoljne karakteristike adsorpcije / distribucije / metabolizma /<izlučivanja koje se ne razlikuju između mužjaka i ženki i koje su slične između miševa, pacova, pasa i ljudi sa izuzetkom dužeg polu-života i veće AUC kod pasa i kod ljudi nego kod druge dve vrste. 3pMBP takođe ima dobru bioraspoloživost (68% kod pasa).>

<3pMBP pokazuje četiri puta veći AUC u mozgu nego u plazmi.>

3pMBP je takođe metabolički stabilan. Ne pretvara se u nizvodne steroide kod miševa, pacova, pasa i ljudi. Pokazuje najveću in vitro stabilnost mikrozoma jetre i hepatocita kod ljudi u poređenju sa drugim vrstama. Kod pacova, in vivo, 3pMBP ne proizvodi nijedan metabolit iznad nivoa u tragovima u plazmi i većina jedinjenja se kao takva izlučuje fecesom.

<Konačno, 3pMBP ne inhibira aktivnost glavnih humanih CYP, UGT izoenzima i ćelijskih transportera, niti indukuje ekspresiju CYP izoenzima.>

<Bermudez-Silva FJ, Cardinal P, Cota D. The role of the endocannabinoid system in the neuroendocrine regulation of energy balance. J Psychopharmacol. 2012 Jan;26(1):114-24.>

Bond and Lader, Br. J. Med. Psychol.1974; 47 : 211-218

Busquets-Garcia A, Soria-Gómez E, Redon B, Mackenbach Y, Vallée M, Chaouloff F, Varilh M, Ferreira G, Piazza PV, Marsicano G. Pregnenolone blocks cannabinoid-induced acute psychotic-like states in mice, 2017 Nov;22(11):1594-1603

Cayrou S., Dickès P. & Dolbeault S. Profile Of Mood States (POMS-f) Journal de Thérapie Comportementale et Cognitive, 2003, 13(2), 83-88.

Cayrou S., Dickès P., Gauvain-Piquard A., Dolbeault S., Callahan S. &Roge B. Validation de la traduction française du POMS (Profile Of Mood States). Psychologie et Psychométrie, 2000, 21(4), 5-22.

Cerdá M, Wall M, Keyes K.M, Galea S, and Hasin D. Medical marijuana laws in 50 states: investigating the relationship between state legalization of medical marijuana and marijuana use, abuse and dependence. Drug Alcohol Depend. 2012; 120, 22-27;

C<ook SA, Lowe JA, Martin BR. CB1 receptor antagonist precipitates withdrawal in mice exposed to Delta9-tetrahydrocannabinol. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Jun;285(3):1150-6. Cutando L, Busquets-Garcia A, Puighermanal E, Gomis-González M, Delgado-Garcia JM, Gruart A, Maldonado R, Ozaita A. Microglial activation underlies cerebellar deficits produced by repeated cannabis exposure. J Clin Invest. 2013 Jul;123(7):2816-31.>

<D’Souza DC. Cannabinoids and psychosis. Int Rev Neurobiol. 200778:289-326.>

<DSM-V Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5th Edition. 2013 Washington DC, USA: American Psychiatric Press.>

Hall W, and Degenhardt L. Adverse health effects of non-medical cannabis use. Lancet 2009374, 1383-1391.

Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol Rev.2002 Jun;54(2): 161-202.

Huang P, Liu-Chen LY, Unterwald EM, Cowan A. Hyperlocomotion and paw tremors are two highly quantifiable signs of SR141716-precipitated withdrawal from delta9-tetrahydrocannabinol in C57BL/6 mice. Neurosci Lett.2009 Nov 6;465(1):66-70.

Hutcheson DM, Tzavara ET, Smadja C, Valjent E, Roques BP, Hanoune J, Maldonado R. Behavioural and biochemical evidence for signs of abstinence in mice chronically treated with delta-9-tetrahydrocannabinol. Br J Pharmacol.1998 Dec;125(7):1567-77.

International Conference On Harmonisation Of Technical Requirements For Registration Of Pharmaceuticals For Human Use. The nonclinical evaluation of the potential for delayed ventricular repolarization (QT interval prolongation) by Human pharmaceuticals S7B. Revised Step.

Khan M, Pace L, Truong A, Gordon M, Moukaddam N, Catatonia secondary to synthetic cannabinoid use in two patients with no previous psychosis Am J Addict, 25 (1) (2016), pp.25-27

<20: 471-84.>

<Martin WR, Sloan JW, Sapira JD and Jasinski DR. Physiologic, subjective, and behavioral effects of>amphetamine, methamphetamine, ephedrine, phenmetrazine, and methylphenidate in man. Clin. Pharm. Ther. 197112: 245-258, 1971.

Mazier W, Saucisse N, Gatta-Cherifi B, Cota D. The endocannabinoid system as pivotal orchestrator of obesity and metabolic disease. Trends Endocrinol Metab. 2015 Oct;26(10):524-37.

McNair DM, Lorr M, Droppleman LF. Edits manual for the profile of mood states. San-Diego, California : Educational and industrial testing service, 1992.

Moreira FA, Grieb M, Lutz B. Central side-effects of therapies based on CB1 cannabinoid receptor agonists and antagonists: focus on anxiety and depression. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab.

2009 Feb;23(1):133-44.

Nagai H, Egashira N, Sano K, Ogata A, Mizuki A, Mishima K et al. Antipsychotics improve Delta9-tetrahydrocannabinol-induced impairment of the prepulse inhibition of the startle reflex in mice. Pharmacol Biochem Behav. 2006. 84: 330-6.

Patel S and Hillard CJ. Pharmacological evaluation of cannabinoid receptor ligands in a mouse model of anxiety: further evidence for an anxiolytic role for endogenous cannabinoid signaling. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Jul 318(1):304-11.

Petit-Demouliere B, Chenu F, Bourin M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology (Berl).2005 Jan;177(3):245-55.

Substance Abuse and Mental Health Services Administration, Center for Behavioral Health Statistics and Quality. The DAWN Report: Highlights of the 2011 Drug Abuse Warning Network (DAWN) Findings on Drug-Related Emergency Department Visits. Rockville, MD: 2013. Feb 22

Tzavara ET, Davis RJ, Perry KW, Li X, Salhoff C, Bymaster FP, Witkin JM, Nomikos GG. The CB1 receptor antagonist SR141716A selectively increases monoaminergic neurotransmission in the medial prefrontal cortex: implications for therapeutic actions. Br J Pharmacol.2003 Feb;138(4):544-53.

Vallée M, Rivera JD, Koob GF, Purdy RH, Fitzgerald RL. Quantification of neurosteroids in rat plasma and brain following swim stress and allopregnanolone administration using negative chemical ionization gas chromatography/mass spectrometry. Anal Biochem. 2000 Dec 1;287(1):153-66. Vallée M, Vitiello S, Bellocchio L, Hébert-Chatelain E, Monlezun S, Martin-Garcia E, et al.

Pregnenolone can protect the brain from cannabis intoxication. Science.2014 Jan 3;343(6166):94-8.

Volkow N.D, Baler R.D, Compton W.M, and Weiss S.R.B. Adverse health effects of marijuana use. N. Engl. J. Med. 2014370, 2219-2227;

Walf AA and Frye CA. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc.2007; 2(2):322-8.

<145(3):293-300.>

13, 277-86.

Wilson CA, Koenig JI. Social interaction and social withdrawal in rodents as readouts for investigating the negative symptoms of schizophrenia. Eur Neuropsychopharmacol. 2014;24:759-773.

Svetska zdravstvena organizacija, The Health and Social Effects of Nonmedical Cannabis Use, 2016

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje prema formuli (I):

naznačeno time, što je za upotrebu u lečenju poremećaja povezanih sa kanabinoidima. <2. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1, naznačeno time, što je poremećaj povezan sa>kanabinoidima izabran između poremećaja upotrebe kanabinoida; Kanabinoidna Intoksikacija;<Povlačenje kanabinoida; Drugi poremećaji izazvani kanabinoidima; Nespecifikovan poremećaj>povezan sa kanabinoidima; Kanabinoidni sindrom hiperemeze; Katatonija izazvana kanabinoidima. 3. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevima 1 ili 2, naznačeno time, što je poremećaj povezan sakanabinoidima poremećaj usled upotrebe kanabinoida. 4. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što je poremećaj povezan sakanabinoidima intoksikacija kanabinoidima. 5. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što je poremećaj povezan sakanabinoidima povlačenje kanabinoida. <6. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što je poremećaj povezan sa kanabinoidima drugi poremećaj izazvan kanabinoidima, odabran između poremećaja anksioznosti>izazvanih kanabinoidima, psihotičnog poremećaja izazvanog kanabinoidima, poremećaja spavanjaizazvanog kanabinoidima, delirijum usled intoksikacije kanabinoidima. 7. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što je poremećaj povezan sakanabinoidima nespecifikovan poremećaj povezan sa kanabinoidima. 8. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevima 1 ili 2, naznačeno time, što je poremećaj povezan sakanabinoidima sindrom kanabinoidne hiperemeze. 9. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevima 1 ili 2, gde je poremećaj povezan sa kanabinoidimakatatonija izazvana kanabinoidima. 10. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što sukanabinoidi izvedeni iz biljke Cannabis L. 11. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što sukanabinoidi sintetička jedinjenja sa CB1 agonističkom aktivnošću. 12. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što senavedeno jedinjenje daje subjektu oralnim putem. <13. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se>pomenuto jedinjenje daje subjektu parenteralnim putem ili sa formulacijom koja se možeapsorbovati ili sa formulacijom depo-tipa. <14. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se>navedeno jedinjenje daje subjektu intravenskim putem ili subkutanim putem ili intramuskularnimputem. <15. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se>navedeno jedinjenje primenjuje intranazalno ili inhalacijom ili sublingvalno ili lokalno ilitransdermalno ili u obliku supozitorija ili pesara. 16. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što senavedeno jedinjenje daje subjektu u dozi koja se sastoji između 1 μg do 1000 mg. <17. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se>pomenuto jedinjenje primenjuje u uljnom nosaču, kao što je biljno ulje dugog lanca triglicerida ipoželjno kukuruzno ulje.