RS65284B1

RS65284B1 - Peptidi iz piwil1

Info

Publication number: RS65284B1
Application number: RS20240292A
Authority: RS
Inventors: Alex Powlesland; Alina Popa; Fiona Chester
Original assignee: Immunocore Ltd
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2024-03-29
Also published as: US20180346515A1; US20210061857A1; FI3380115T3; HUE066008T2; HRP20240359T1; LT3380115T; EP3380115B8; PL3380115T3; ES2973507T3; SI3380115T1; PT3380115T; EP3380115B1; SMT202400122T1; GB201520546D0; DK3380115T3; WO2017089771A1; EP3380115A1

Description

Opis pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nove peptide izvedene iz piwi-like proteina 1 (PIWIL1), komplekse koji sadrže peptide vezane za rekombinantne molekule MHC, i ćelije koje imaju navedeni peptid u kompleksu sa molekulima MHC. Takođe ovim pronalaskom se obezbeđuju delovi za vezivanje koji se vezuju za peptide i/ili komplekse prema pronalasku. Takvi delovi su korisni za razvoj imunoterapeutskih reagensa za lečenje bolesti kao što je kancer.

[0002] T ćelije su ključni deo ćelijske grane imunog sistema. Oni specifično prepoznaju fragmente peptida koji su izvedeni iz unutarćelijskih proteina i nalaze se u kompleksu sa molekulima glavnog kompleksa histokomplatibilnosti (MHC) na površini ćelija koje imaju antigen (APCs). Kod ljudi, molekuli MHC su poznati kao humani leukocitni antigeni (HLA), i oba termina se ovde koriste kao sinonimi. Molekuli MHC imaju žleb za vezivanje u koji se vezuju fragmenti peptida. Prepoznavanje određenih peptid-MHC antigena je posredovano odgovarajućim T ćelijskim receptorom (TCR). Tumorske ćelije eksprimiraju različite antigene povezane sa tumorom (TAA) i peptidi izvedeni iz ovih antigena mogu biti prikazani na površini tumorske ćelije. Detekcija peptida dobijenog od TAA iz klase I MHC od strane CD8+ T ćelije koja nosi odgovarajući T ćelijski receptor, dovodi do ciljanog ubijanja tumorske ćelije. Međutim, kao posledica postupaka selekcije koji se dešavaju tokom sazrevanja T ćelija u timusu, postoji nedostatak T ćelija (i TCRs) u cirkulaciji, koje prepoznaju peptide izvedene iz TAA sa dovoljno visokim nivoom afiniteta. Zbog toga se tumorske ćelije često ne otkrivaju.

[0003] Identifikacija određenih peptida dobijenih iz TAA koji se nalaze sa molekulima MHC na tumorskim ćelijama omogućava razvoj novih imunoterapijskih reagensa dizajniranih da specifično ciljano deluju i unište navedene tumorske ćelije. Takvi reagensi mogu biti delovi koji se vezuju za peptid izveden iz TAA i/ili komplekse peptida i MHC i oni tipično funkcionišu indukujući T ćelijski odgovor. Na primer, takvi reagensi mogu biti zasnovani, isključivo ili delimično, na T ćelijama, ili T ćelijskim receptorima (TCRs) ili antitelima. Identifikacija odgovarajućih TAAs za terapijsko ciljano delovanje zahteva pažljivo razmatranje da bi se ublažila toksičnost van tumora i ciljano delovalo u kliničkom okruženju.

TAAs koji su pogodni za ciljano delovanje prilikom imunoterapeutske intervencije treba da pokažu dovoljnu razliku u nivoima ekspresije između tumorskog tkiva i normalnih, zdravih tkiva; drugim rečima, trebalo bi da postoji odgovarajući terapeutski prozor, koji će omogućiti ciljano delovanje na tumorsko tkivo i minimizirati ciljano delovanje na zdrava tkiva. U idealnom slučaju, TAAs su visoko eksprimirane u tumorskom tkivu i imaju ograničenu ili nikakvu ekspresiju u normalnom zdravom tkivu. Tipično, stručnjak u ovoj oblasti bi koristio podatke o ekspresiji proteina da identifikuje da li postoji terapeutski prozor za dati TAA. Veća ekspresija proteina ukazuje na više nivoe peptid-MHC, peptida koji se nalazi na površini ćelije. Pronalazači ove aplikacije su otkrili da su razlike u ekspresiji RNK, a ne u ekspresiji proteina, pouzdaniji indikator nivoa pMHC, a samim tim i terapeutskog prozora.

[0004] Zbog toga je poželjno obezbediti peptide izvedene iz TAAs sa odgovarajućim terapeutskim prozorom, zasnovanim na ekspresiji RNK, njihovim kompleksima MHC i delovima za vezivanje koji se mogu koristiti za razvoj novih terapija kancera. Dalje, poželjno je da pomenuti peptidi nisu identični ili veoma slični bilo kom drugom MHC restriktivnom peptidu, izvedenom iz alternativnog(ih) proteina(a), i MHC koji se nalazi na površini nekancerogenih ćelija. Postojanje takvih imitacija peptida povećava rizik od in vivo toksičnosti za ciljano delovanje terapija kancera.

[0005] In silico algoritmi, kao što su SYFPETHEI (Rammensee, et al., Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4):213-9 (access via www.syfpeithi.de) i BIMAS (Parker, et al., J. Immunol. 1994 Jan 1;152(1):163-75 (access via http://wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla bind/)) su dostupni za predviđanje sekvenci aminokiselina MHC-prezentovanih peptida izvedenih iz proteina. Međutim, poznato je da ovi postupci stvaraju visok procenat lažnih pozitivnih rezultata (pošto jednostavno definišu verovatnoću da će dati peptid biti u stanju da veže dati MHC i ne uzimaju u obzir unutarćelijsku obradu). Stoga, nije moguće tačno predvideti da li se dati peptid-MHC zaista nalazi na tumorskim ćelijama. Obično su potrebni direktni eksperimentalni podaci.

[0006] PIWIL1 (takođe poznat kao piwi-like protein 1 ili HIWI i koji ima Uniprot pristupni broj Q96J94) je povezan sa mejotičkom deobom i ima centralnu ulogu tokom spermatogeneze. Ekspresija PIWIL1 je prijavljena kod različitih tumora, dok je ekspresija u normalnim tkivima ograničena na testise (He et al. BMC Cancer.2009 Dec 8;9:426; Grochola et al. Br J Cancer. 2008 Oct 7;99(7):1083-8; Taubert et al. Oncogene. 2007 Feb 15;26(7):1098-100; Li et al. Oncol Rep. 2010 Apr;23(4):1063-8; Zeng et al. Chin Med J (Engl). 2011 Jul;124(14):2144-9; WO2000032039). PIWIL1 je idealan za ciljano delovanje za imunoterapeutske primene. Pronalazači su otkrili da PIWIL1 ima posebno pogodan terapeutski prozor zasnovan na ekspresiji RNK. Pronalazači su pronašli nove peptide izvedene iz PIWIL1 koji se nalaze na površini ćelije u kompleksu sa MHC. Ovi peptidi su posebno korisni za razvoj reagenasa koji mogu da ciljano deluju na ćelije koje eksprimiraju PIWIL1 i za lečenje kancera, uključujući kancere debelog creva i jednjaka.

[0007] U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje peptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID Nos.: 1, 3 i 5, pri čemu peptid formira kompleks sa molekulom glavnog kompleksa histokomplatibilnosti (MHC).

[0008] Pronalazači su otkrili da se peptidi prema pronalasku nalaze sa MHC na površini tumorskih ćelija. Shodno tome, peptidi prema pronalasku, kao i delovi koji vezuju peptid-MHC komplekse, mogu se koristiti za razvoj terapeutskih reagenasa.

[0009] Kao što je poznato u struci, sposobnost peptida da formira imunogeni kompleks sa datim tipom MHC, i tako aktivira T ćelije, određena je stabilnošću i afinitetom interakcije peptid-MHC (van der Burg et al. J Immunol. 1996 May 1;156(9):3308-14). Stručnjak može, na primer, da utvrdi da li dati peptid formira kompleks sa molekulom MHC određivanjem da li se MHC može ponovo savijati u prisustvu peptida korišćenjem postupka koji je dat u Primeru 2. Ako peptid ne formira kompleks sa MHC onda se MHC neće ponovo savijati. Ponovno savijanje se obično potvrđuje korišćenjem antitela koje prepoznaje MHC samo u savijenom stanju. Dalji detalji se mogu naći u Garboczi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Apr 15;89(8) :3429-33. Alternativno, stručnjak može odrediti sposobnost peptida da stabilizuje MHC na površini ćelijskih linija sa nedostatkom TAP, kao što su T2 ćelije, ili drugi biofizički postupci za određivanje parametara interakcije (Harndahl et al. J Biomol Screen. 2009 Feb;14(2):173-80).

[0010] Peptidi SEQ ID NOs: 2, 4 i 6-17 i kompleksi koji sadrže ove peptide ne spadaju u obim ovog pronalaska.

[0011] Ovde su otkriveni peptidi koji sadrže, suštinski se sastoje od, ili se sastoje od

(a) bilo koje od sekvenci aminokiselina SEQ ID NOS: 2, 4 i 6-17, ili

(b) bilo koje od sekvenci aminokiselina SEQ ID NOs: 2, 4 i 6-17 sa izuzetkom 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselina, i/ili 1, 2 ili 3 insercije aminokiselina, i/ili 1, 2 ili 3 delecije aminokiselina,

pri čemu peptid formira kompleks sa molekulom glavnog histokompatibilnog komleksa (MHC).

[0012] Takođe ovde su otkriveni peptidi koji sadrže ili se suštinski sastoje od

(a) bilo koje od sekvenci aminokiselina SEQ ID NOs: 1, 3 i 5, ili

(b) bilo koje od sekvenci aminokiselina SEQ ID NOs: 1, 3 i 5 sa izuzetkom 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselina, i/ili 1, 2 ili 3 insercije aminokiselina, i/ili 1, 2 ili 3 delecije aminokiselina

[0013] Poželjno, peptidi koji su ovde otkriveni su dužine od oko 8 do oko 16 aminokiselina, a najpoželjnije su dužine od 8, 9, ili 10 ili 11 aminokiselina, najpoželjnije dužine 9 aminokiselina.

[0014] Peptidi koji su ovde otkriveni mogu da sadrže ili se suštinski sastoje od sekvenci aminokiselina datih u SEQ ID NO: 1, 3 i 5.

[0015] Ostaci aminokiselina koji sadrže peptide prema pronalasku mogu biti hemijski modifikovani. Primeri hemijskih modifikacija uključuju one koje odgovaraju posttranslacionim modifikacijama, na primer fosforilacija, acetilacija i deamidacija (Engelhard et al., Curr Opin Immunol. 2006 Feb;18(1):92-7). Hemijske modifikacije možda ne odgovaraju onima koje mogu biti prisutne in vivo. Na primer, terminalni N ili C krajevi peptida mogu biti modifikovani da bi se poboljšala stabilnost, biodostupnost i/ili afinitet peptida (videti na primer, Brinckerhoff et al Int J Cancer. 1999 Oct 29;83(3):326-34 ). Dalji primeri neprirodnih modifikacija uključuju ugradnju fotoreaktivnih umreženih aminokiselina, N-metilovanih aminokiselina, redukciju osnove, retroinverziju korišćenjem d-amino kiselina, N-terminalnu metilaciju i C-terminalnu amidaciju i pegilaciju. Primeri neprirodnih modifikacija koje nisu u okviru pronalaska uključuju inkorporaciju nekodiranih αaminokiselina i ß-aminokiselina.

[0016] Supstitucija aminokiseline znači da je ostatak aminokiseline zamenjen zamenskim ostatkom aminokiseline na istoj poziciji. Umetnuti ostaci aminokiselina mogu biti umetnuti na bilo kojoj poziciji i mogu biti umetnuti tako da su neki ili svi umetnuti ostaci aminokiselina neposredno jedni uz druge ili mogu biti umetnuti tako da nijedan od umetnutih ostataka aminokiselina nije neposredno pored drugog umetnutog ostatka aminokiseline. Jedna, dve ili tri aminokiseline mogu biti izbrisane iz sekvence SEQ ID NOs: 2, 4 i 6-17. Svaka delecija se može desiti na bilo kojoj poziciji SEQ ID NOs: 2, 4 i 6-17.

[0017] Peptidi koji su ovde otkriveni mogu da sadrže jednu, dve ili tri dodatne aminokiseline na C-terminalnom kraju i/ili na N-terminalnom kraju sekvence SEQ ID NOs: 2, 4 i 6-17. Peptid prema pronalasku može sadržati sekvencu aminokiselina SEQ ID NOs: 2, 4 i 6-17 sa izuzetkom jedne supstitucije aminokiseline i jedne insercije aminokiseline, jedne supstitucije aminokiseline i jedne delecije aminokiseline, ili jedne insercije aminokiseline i jedne delecije aminokiseline. Peptid koji je ovde otkriven može da sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NOs: 2, 4 i 6-17, sa izuzetkom jedne supstitucije aminokiseline, jedne insercije aminokiseline i jedne delecije aminokiseline.

[0018] Insertovane aminokiseline i zamenske aminokiseline mogu biti aminokiseline koje se javljaju u prirodi ili mogu biti aminokiseline koje se ne pojavljuju u prirodi i, na primer, mogu da sadrže neprirodni bočni lanac, i/ili da budu povezane zajedno preko ne-nativnih peptidnih veza. Ovakvi izmenjeni peptidni ligandi su dalje diskutovani u Douat-Casassus et al., J. Med. Chem, 2007 Apr 5;50(7):1598-609 and Hoppes et al., J. Immunol 2014 Nov 15;193(10):4803-13 i reference u njima). Ako je više od jednog ostatka aminokiseline supstituisano i/ili insertovano, zamenjeni/insertovani ostaci aminokiselina mogu biti međusobno isti ili različiti jedan od drugog. Svaka zamenjena aminokiselina može imati drugačiji bočni lanac od aminokiseline koja se zamenjuje.

[0019] Supstitucije aminokiselina mogu biti konzervativne, što znači da supstituisana aminokiselina ima slična hemijska svojstva kao originalna aminokiselina. Stručnjak bi podrazumevao koje aminokiseline dele slična hemijska svojstva. Na primer, sledeće grupe aminokiselina dele slična hemijska svojstva kao što su veličina, naelektrisanje i polarnost: Grupa 1 Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; Grupa 2 asp, asn, glu, gin; Grupa 3 His, Arg, Lys; Grupa 4 Met, Leu, Ile, Val, Cys; Grupa 5 Phe Thy Trp.

[0020] Poželjno, polipeptidi prema pronalasku se vezuju za MHC u žlebu za vezivanje peptida molekula MHC. Generalno, prethodno opisane modifikacije aminokiselina neće narušiti sposobnost peptida da se veže za MHC. Modifikacije aminokiselina mogu poželjno poboljšati sposobnost peptida da se veže za MHC. Na primer, mutacije mogu biti na pozicijama koje vezuju peptid za MHC. Takve pozicije povezivanja i poželjni ostaci na ovim lokacijama su poznati u tehnici, posebno za peptide koji vezuju HLA-A*02 (videti, npr. Parkhurst et al., J. Immunol. 1996 Sep 15;157(6):2539-48 and Parker et al. J Immunol. 1992 Dec 1 ;149(11):3580-7). Ostaci aminokiselina na poziciji 2, i na C terminalnom kraju, peptida se smatraju primarnim pozicijama povezivanja. Poželjni ostaci povezivača mogu biti različiti za svaki tip HLA. Poželjne aminokiseline na poziciji 2 za HLA-A*02 su Leu, Ile, Val ili Met. Na C terminalnom kraju preferiraju se valin ili leucin.

[0021] Peptid prema pronalasku može da se koristi da izazove imuni odgovor. Ako je to slučaj, važno je da imuni odgovor bude specifičan sa nameravanim ciljnim delovanjem da bi se izbegao rizik od nepoželjenih neželjenih efekata koji mogu biti povezani sa imunološkim odgovorom koji ne deluje ciljano. Zbog toga je poželjno da sekvenca aminokiselina peptida prema pronalasku ne odgovara sekvenci aminokiselina peptida iz bilo kog drugog proteina (drugih proteina), posebno sa sekvencom drugog humanog proteina. Stručnjak u ovoj oblasti bi podrazumevao kako da pretraži bazu podataka poznatih sekvenci proteina da bi utvrdio da li je peptid prema pronalasku prisutan u drugom proteinu.

[0022] Peptidi prema pronalasku mogu biti konjugovani sa dodatnim delovima kao što su molekuli nosači ili adjuvansi za upotrebu kao vakcine (za specifične primere videti Liu et al.

Bioconjug Chem. 2015 May 20; 26(5): 791-801 i reference u njima). Peptidi mogu biti biotinilovani ili uključiti oznaku, kao što je His obeleživač. Primeri adjuvansa koji se koriste u vakcinama protiv kancera uključuju mikrobe, kao što je bakterija Bacillus Calmette-Guérin (BCG), i/ili supstance koje proizvode bakterije, kao što je Detox B (emulzija uljnih kapljica monofosforil lipida A i skeleta mikobakterijskog ćelijskog zida). KLH (keyhole limpet hemocijanin) i goveđi serumski albumin su primeri odgovarajućih proteina nosača koji se koriste u kompozicijama vakcine Alternativno ili dodatno, peptid se može vezati, kovalentno ili na drugi način, za proteine kao što su molekuli MHC i/ili antitela (na primer, videti King et al. Cancer Immunol Immunother. 2013 Jun;62(6):1093-105). Alternativno ili dodatno, peptidi mogu biti inkapsulirani u lipozome (na primer videti Adamina et al Br J Cancer. 2004 Jan 12;90(1):263-9). Takvi modifikovani peptidi možda ne odgovaraju nijednom molekulu koji postoji u prirodi.

[0023] Peptidi prema pronalasku se mogu lako sintetizovati Merrifield sintezom, takođe poznatom kao sinteza čvrste faze, ili bilo kojim drugim postupkom sinteze peptida. GMP peptid se proizvodi tehnikama sinteze u čvrstoj fazi od strane Multiple Peptide Systems, San Diego, CA. Kao takvi, peptidi mogu biti imobilizovani, na primer na čvrstu podlogu kao što je kuglica. Alternativno, peptid se može proizvesti rekombinantno, ako se tako želi, prema postupcima poznatim u tehnici. Takvi postupci obično uključuju upotrebu vektora koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid koji treba da se eksprimira, za eksprimiranje peptida in vivo; na primer, u ćelijama bakterija, kvasca, insekata ili sisara. Alternativno, mogu se koristiti in vitro sistemi bez ćelija. Takvi sistemi su poznati u tehnici i komercijalno su dostupni na primer od Life Technologies, Paisley, UK. Peptidi mogu biti izolovani i/ili mogu biti obezbeđeni u suštinski čistom obliku. Na primer, oni mogu biti obezbeđeni u obliku koji je suštinski bez drugih peptida ili proteina.

[0024] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompleks peptida iz prvog aspekta i molekul MHC. Poželjno, peptid je vezan za žleb za vezivanje peptida molekula MHC. Molekul MHC može biti MHC klase I. Molekul MHC klase I može biti odabran od HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A11, HLA-A23, HLAA24, HLA-B* 07, HLA-B*08, HLA-B40, HLA-B44, HLA-B15, HLA-C*04, HLA*C*03 HLA-C*07. Kao što je stručnjacima poznato, postoje alelne varijante prethodno navedenih HLA tipova, od kojih su sve obuhvaćene ovim pronalaskom. Potpuna lista HLA alela se može naći u EMBL Immune Polymorphism Database (http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hIa/allele.html; Robinson et al. Nucleic Acids Research (2015) 43:D423-431). Molekul MHC može biti HLA-A*02.

[0025] Kompleks prema pronalasku može biti izolovan i/ili u suštinski čistom obliku. Na primer, kompleks može biti obezbeđen u obliku koji je suštinski bez drugih peptida ili proteina. Treba napomenuti da u kontekstu ovog pronalaska, termin "molekul MHC" uključuje rekombinantne molekule MHC, neprirodne molekule MHC i funkcionalno ekvivalentne fragmente MHC, uključujući njihove derivate ili varijante, pod uslovom da se zadrži vezivanje peptida. Na primer, molekuli MHC mogu biti fuzionisani za terapeutski deo, pričvršćeni za čvrsti nosač, u rastvorljivom obliku, pričvršćeni za oznaku, biotinilovani i/ili u multimernom obliku. Peptid može biti kovalentno vezan za MHC.

[0026] Postupci za proizvodnju rastvorljivih rekombinantnih molekula MHC sa kojima peptidi prema pronalasku mogu da formiraju kompleks su poznati u tehnici. Pogodni postupci uključuju, ali se ne ograničavaju na, ekspresiju i prečišćavanje iz ćelija E. coli ili ćelija insekata. Pogodan postupak je obezbeđen u Primeru 2. Alternativno, molekuli MHC se mogu proizvesti sintetički ili korišćenjem sistema bez ćelija.

[0027] Peptidi i/ili kompleksi polipeptid-MHC prema pronalasku mogu biti povezani (kovalentno ili drugačije) sa delom koji može da izazove terapeutski efekat. Takav deo može biti protein nosač za koji je poznato da je imunogen. KLH (keyhole limpet hemocijanin) i goveđi serumski albumin su primeri pogodnih proteina nosača koji se koriste u kompozicijama vakcine. Alternativno, peptidi i/ili kompleksi peptid-MHC prema pronalasku mogu biti povezani sa fuzionim partnerom. Partneri za fuziju se mogu koristiti u svrhe detekcije, ili za vezivanje pomenutog peptida ili MHC na čvrstu podlogu, ili za oligomerizaciju MHC. Kompleksi MHC mogu da inkorporiraju biotinilovano mesto na koje se može dodati biotin, na primer, korišćenjem enzima BirA (O’Callaghan et al., 1999 Jan 1;266(1):9-15). Drugi pogodni partneri za fuziju uključuju, ali se ne ograničavaju na, fluorescentne ili luminiscentne oznake, radiooznake, probe nukleinskih kiselina i kontrastne reagense, antitela ili enzime koji proizvode proizvod koji se može detektovati. Postupci detekcije mogu uključivati protočnu citometriju, mikroskopiju, elektroforezu ili scintilaciono brojanje. Partneri za fuziju mogu uključivati citokine, kao što su interleukin 2, interferon alfa i faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije.

[0028] Kompleksi peptid-MHC prema pronalasku mogu biti obezbeđeni u rastvorljivom obliku, ili mogu biti imobilizovani vezivanjem za odgovarajući čvrsti nosač. Primeri čvrstih nosača uključuju, ali se ne ograničavaju na, kuglicu, membranu, sefarozu, magnetnu kuglicu, ploču, cev, kolonu. Kompleksi peptid-MHC mogu biti pričvršćeni za ELISA ploču, magnetnu kuglicu ili površinski plazmonski rezonantni biosenzorski čip. Postupci vezivanja kompleksa peptid-MHC na čvrstu podlogu su poznati stručnjacima i uključuju, na primer, korišćenje afinitetnog para za vezivanje, npr. biotin i streptavidin, ili antitela i antigene. Kompleksi peptid-MHC mogu poželjno biti obeleženi biotinom i pričvršćeni za površine obložene streptavidinom.

[0029] Kompleksi peptid-MHC prema pronalasku mogu biti u multimernom obliku, na primer, dimernom, ili tetramernom, ili pentamernom, ili oktomernom, ili većem. Primeri pogodnih postupaka za proizvodnju multimernih kompleksa peptid MHC su opisani u Greten et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002 Mar;9(2):216-20 i reference u njemu. Generalno, multimeri peptid-MHC mogu se proizvesti korišćenjem obeleženog peptid-MHC ostatkom biotina i kompleksa preko fluorescentno obeleženog streptavidina. Alternativno, multimerni kompleksi peptid-MHC mogu se formirati korišćenjem imunoglobulina kao skeletni molekul. U ovom sistemu, ekstracelularni domeni molekula MHC su spojeni sa konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina odvojenim kratkim linkerom aminokiselina. Multimeri peptid-MHC su takođe proizvedeni korišćenjem molekula nosača kao što je dekstran (WO02072631). Multimerni kompleksi peptid MHC mogu biti korisni za poboljšanje detekcije vezujućih delova, kao što su receptori T ćelija, koji vezuju pomenuti kompleks, zbog efekata avidnosti.

[0030] Peptidi prema pronalasku se mogu nalaziti na površini ćelije u kompleksu sa MHC. Dakle, pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju koja na svojoj površini ima kompleks prema pronalasku. Takva ćelija može biti ćelija sisara, poželjno ćelija imunog sistema, a posebno specijalizovana ćelija na kojoj se nalazi antigen kao što je dendritična ćelija ili B ćelija. Druge poželjne ćelije uključuju T2 ćelije (Hosken, et al., Science. 1990 Apr 20;248(4953):367-70). Ćelije na kojima se nalazi peptid ili kompleks prema pronalasku mogu biti izolovane, poželjno u obliku populacije, ili obezbeđene u suštinski čistom obliku. Pomenute ćelije možda neće prirodno imati kompleks prema pronalasku, ili alternativno navedene ćelije mogu imati viši nivo kompleksa nego što bi to bilo u prirodi. Takve ćelije se mogu dobiti modeliranjem navedenih ćelija sa peptidom prema pronalasku. Modeliranje uključuje inkubaciju ćelija sa peptidom nekoliko sati koristeći koncentracije peptida koje se obično kreću od 10-5 do 10-12 M. Navedene ćelije mogu dodatno da se transdukuju sa HLA molekulima, kao što je HLA-A*02 da bi se dodatno indukovalo prikazivanje peptida . Ćelije se mogu proizvoditi rekombinantno. Ćelije na kojima se nalaze peptidi prema pronalasku mogu se koristiti za izolovanje T ćelija i T ćelijskih receptora (TCRs) koji se aktiviraju ili vezuju za navedene ćelije, kako je detaljno opisano u nastavku.

[0031] U trećem aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid iz prvog aspekta pronalaska. Nukleinska kiselina može biti cDNK. Molekul nukleinske kiseline može se u suštini sastojati od sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid iz prvog aspekta pronalaska ili može da kodira samo peptid prema pronalasku, tj. da ne kodira nijedan drugi peptid ili peptid.

[0032] Takav molekul nukleinske kiseline može da se sintetiše prema postupcima poznatim u tehnici. Zbog degeneracije genetičkog koda, stručnjaci u ovoj oblasti će znati da molekuli nukleinske kiseline različite nukleotidne sekvence mogu kodirati istu sekvencu aminokiselina.

[0033] U četvrtom aspektu, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema trećem aspektu pronalaska. Vektor može uključivati, pored sekvence nukleinske kiseline koja kodira samo peptid prema pronalasku, jednu ili više dodatnih sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više dodatnih peptida. Takvi dodatni peptidi mogu, kada se jednom eksprimiraju, biti fuzionisani sa N-terminalnim krajem ili C-terminalnim krajem peptida prema pronalasku. Vektor može uključivati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira oznaku peptida ili proteina kao što je, na primer, mesto biotinilacije, FLAGobeleživač, MYC-obeleživač, HA-obeleživač, GST-obeleživač, Strep-obeleživač ili poli- histidinski obeleživač.

[0034] Pogodni vektori su poznati u tehnici kao i konstrukcija vektora, uključujući odabir promotora i drugih regulatornih elemenata, kao što su elementi pojačivača. Vektor koji se koristi u kontekstu ovog pronalaska poželjno sadrži sekvence prikladne za uvođenje u ćelije. Na primer, vektor može biti vektor ekspresije, vektor u kome je kodirajuća sekvenca peptida pod kontrolom sopstvenih cis-regulatornih elemenata, vektor dizajniran da olakša integraciju gena ili zamenu gena u ćelijama domaćina, i slično.

[0035] U kontekstu ovog pronalaska, termin "vektor" obuhvata molekul DNK, kao što je plazmid, bakteriofag, fagemid, virus ili drugo sredstvo, koji sadrži jednu ili više heterolognih ili rekombinantnih nukleotidnih sekvenci (npr., prethodno opisan molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, pod kontrolom funkcionalnog promotora i, moguće, takođe pojačivača) i sposoban je da funkcioniše kao vektor u smislu koji podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Odgovarajući fagi i virusni vektori uključuju, ali se ne ograničavaju na, lambda (X) bakteriofag, EMBL bakteriofag, majmunski virus 40, goveđi papiloma virus, Epštajn-Bar virus, adenovirus, virus herpesa, virus vakcinije, Moloney virus leukemije miševa, Harvey virus sarkoma miševa, virus tumora dojki miševa, lentivirus i Rous-ov sarkom virus.

[0036] U petom aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži vektor iz četvrtog aspekta pronalaska. Ćelija može biti ćelija koja ima antigen i poželjno je ćelija imunog sistema. Konkretno, ćelija može biti specijalizovana ćelija koja ima antigen kao što je dendritična ćelija ili B ćelija. Ćelija može biti ćelija sisara.

[0037] Peptidi i kompleksi prema pronalasku mogu se koristiti za identifikaciju i/ili izolovanje delova za vezivanje koji se specifično vezuju za peptid i/ili kompleks prema pronalasku. Takvi delovi za vezivanje se mogu koristiti kao imunoterapeutski reagensi i mogu uključivati antitela i TCRs.

[0038] U šestom aspektu, pronalazak obezbeđuje deo za vezivanje koji vezuje peptid prema pronalasku kada je navedeni peptid u kompleksu sa MHC pri čemu je deo za vezivanje receptor T ćelije (TCR) ili antitelo. Deo za vezivanje se može delimično vezati za MHC, pod uslovom da se takođe vezuje za peptid. Deo za vezivanje može da vezuje samo peptid i to vezivanje može biti specifično. Deo za vezivanje može da vezuje samo kompleks peptid MHC i to vezivanje može biti specifično.

[0039] Kada se upotrebljava u odnosu na delove za vezivanje koji vezuju kompleks prema pronalasku, "specifičan" se generalno upotrebljava ovde da bi se odnosio na situaciju u kojoj deo za vezivanje ne pokazuje bilo kakvo značajno vezivanje za jedan ili više alternativnih kompleksa peptid-MHC osim za kompleks peptid-MHC prema pronalasku. TCRs koji se vezuju za jedan ili više, a posebno nekoliko, antigena koji se nalaze na ćelijama za koje nije predviđeno da na njih TCRs ciljano deluju, predstavljaju povećan rizik od toksičnosti kada se primenjuju in vivo zbog njihove potencijalne reaktivnosti van ciljanog delovanja. Takvi visoko reaktivni TCRs nisu pogodni za terapeutsku upotrebu.

[0040] Deo za vezivanje može biti receptor T ćelija (TCR). TCRs su opisani korišćenjem međunarodne imunogenetičke (IMGT) TCR nomenklature i povezivanjem sa javnom IMGT bazom podataka TCR sekvenci. Jedinstvene sekvence definisane IMGT nomenklaturom su široko poznate i dostupne onima koji rade u oblasti TCR. Na primer, mogu se naći u "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10; Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266, i na IMGT internet stranici (www.IMGT.org)

[0041] TCRs prema pronalasku mogu biti u bilo kom formatu poznatom stručnjacima. Na primer, TCRs mogu biti αß heterodimeri, ili αα ili ßß homodimeri.

[0042] Alfa-beta heterodimerni TCRs imaju alfa lanac i beta lanac. Uopšteno govoreći, svaki lanac se sastoji od varijabilnog, spojnog i konstantnog regiona, a beta lanac takođe obično sadrži kratak raznolik region između varijabilnog i spojnog regiona, ali se ovaj raznolik region često smatra delom spojnog regiona. Svaki varijabilni region se sastoji od tri hipervarijabilna CDRs (regioni za određivanje komplementarnosti) ugrađena u okvir čitanja sekvence; veruje se da je CDR3 glavni posrednik u prepoznavanju antigena. Postoji nekoliko tipova varijabilnih regiona alfa lanca (Vα) i nekoliko tipova varijabilnih regiona beta lanca (Vß) koji se razlikuju po svom okviru čitanja, CDR1 i CDR2 sekvencama i delimično definisanom CDR3 sekvencom.

[0043] TCRs prema pronalasku možda ne odgovaraju TCRs kakvi postoje u prirodi. Na primer, mogu da sadrže kombinacije alfa i beta lanaca koje nisu prisutne u prirodi. Alternativno ili dodatno, oni mogu biti rastvorljivi, i/ili konstantni domen alfa i/ili beta lanca može biti skraćen u odnosu na nativne/prirodne TRAC/TRBC sekvence tako da, na primer, C terminalni transmembranski domen i unutarćelijski regioni nisu prisutni. Takvo skraćivanje može dovesti do uklanjanja ostataka cisteina iz TRAC / TRBC koji formiraju nativnu međulančanu disulfidnu vezu.

[0044] Pored toga, TRAC/TRBC domeni mogu sadržati modifikacije. Na primer, ekstracelularna sekvenca alfa lanca može uključiti modifikaciju u odnosu na nativni/prirodni TRAC pri čemu je amino kiselina T48 TRAC, u odnosu na IMGT numerisanje, zamenjena sa C48. Slično, vanćelijska sekvenca beta lanca može uključiti modifikaciju u odnosu na nativni/prirodni TRBC1 ili TRBC2, pri čemu se S57 TRBC1 ili TRBC2, u odnosu na IMGT numerisanje, zamenjuje sa C57. Ove supstitucije cisteina u odnosu na vanćelijske sekvence nativnog alfa i beta lanca omogućavaju formiranje ne-nativne međulančane disulfidne veze koja stabilizuje ponovo presavijeni rastvorljivi TCR, tj. TCR formiran ponovnim presavijanjem vanćelijskih alfa i beta lanaca (WO 03/020763). Ova ne-nativna disulfidna veza olakšava prikaz pravilno presavijenih TCRs na fagu. (Li et al., Nat Biotechnol 2005 Mar;23(3):349-54). Pored toga, upotreba stabilnog rastvorljivog TCR vezanog disulfidom omogućava pogodniju procenu afiniteta vezivanja i poluživota vezivanja. Alternativni položaji za formiranje ne-nativne disulfidne veze su opisani u WO 03/020763. Ovo uključuje Thr 45 egzona 1 TRAC*01 i Ser 77 egzona 1 TRBC1*01 ili TRBC2*01; Tyr 10 egzona 1 TRAC*01 i Ser 17 egzona 1 TRBC1*01 ili TRBC2*01; Thr 45 egzona 1 TRAC*01 i Asp 59 egzona 1 TRBC1*01 ili TRBC2*01; i Ser 15 egzona 1 TRAC*01 i Glu 15 egzona 1 TRBC1*01 ili TRBC2*01. TCRs sa ne-nativnom disulfidnom vezom mogu biti pune dužine ili mogu biti skraćeni.

[0045] TCRs prema pronalasku mogu biti u jednolančanom formatu (kao što su oni opisani u WO9918129). Jednolančani TCRs uključuju αß TCR polipeptide tipa: Vα-L-Vß, Vß-L-Vα, Vα-Cα-L-Vß, Vα-L-Vß-Cß ili Vα-Cα -L-Vß -Cß, izborno u obrnutoj orijentaciji, pri čemu Vα i Vß su TCRα i (3 varijabilna regiona respektivno, Cα i Cß su TCR α i ß konstantni regioni respektivno, a L je linker sekvenca. Jednolančani TCRs mogu sadržati ne-nativnu disulfidnu vezu. TCR može biti u rastvorljivom obliku (tj. bez transmembranskih ili citoplazmatskih domena) ili može sadržati alfa i beta lance pune dužine. TCR može biti obezbeđen na površini ćelije, kao što je T ćelija.

[0046] TCRs prema pronalasku mogu biti konstruisani tako da uključuju mutacije. Postupci za proizvodnju mutiranih TCR varijanti visokog afiniteta kao što su prikaz faga i mutageneza usmerena na mesto poznati su stručnjacima (na primer videti WO 04/044004 i Li et al., Nat Biotechnol 2005 Mar;23(3):349-54). Poželjno je da se mutacije za poboljšanje afiniteta prave unutar varijabilnih regiona alfa i/ili beta lanaca. Poželjnije je da se mutacije za poboljšanje afiniteta prave unutar CDRs. Može postojati između 1 i 15 mutacija u varijabilnim regionima alfa i ili beta lanca.

[0047] TCRs prema pronalasku takođe mogu biti obeleženi jedinjenjem za snimanje, na primer etiketom koja je pogodna za dijagnostičke svrhe. Ovako obeleženi TCRs visokog afiniteta su korisni u postupku za detekciju TCR liganda odabranog od kompleksa CD1-antigen, bakterijskih superantigena i kompleksa MHC-peptid/superantigen, postupak koji obuhvata dovođenje u kontakt TCR liganda sa TCR visokog afiniteta (ili multimernim kompleksom TCR visokog afiniteta) koji je specifičan za TCR ligand; i otkrivanje vezivanja za TCR ligand. U multimernim kompleksima TCR visokog afiniteta opisanim u Zhu et al., J. Immunol. 2006 Mar 1;176(5):3223-32, (formiran, na primer, korišćenjem biotinilovanih heterodimera) fluorescentni streptavidin (komercijalno dostupan) se može koristiti za obezbeđivanje oznake koja se može detektovati. Fluorescentno obeleženi multimer je pogodan za upotrebu u FACS analizi, na primer za detekciju ćelija koje imaju antigen koje nose peptid za koji je specifičan TCR visokog afiniteta.

[0048] TCR prema ovom pronalasku (ili njegov multivalentni kompleks) može alternativno ili dodatno biti povezan sa (npr. kovalentno ili na drugi način povezan sa) terapeutskim agensom koji može biti, na primer, toksični deo za upotrebu u uništavanju ćelija, ili imunostimulišući agens kao što je interleukin ili citokin. Multivalentni kompleks TCR visokog afiniteta prema ovom pronalasku može imati poboljšanu sposobnost vezivanja za TCR ligand u poređenju sa ne-multimernim heterodimerom T ćelijskog receptora divljeg tipa ili ne-multimernim heterodimerom T ćelijskog receptora sa visokim afinitetom. Prema tome, multivalentni kompleksi TCR visokog afiniteta prema pronalasku su posebno korisni za praćenje ili ciljano delovanje na ćelije koje imaju određene antigene in vitro ili in vivo, a takođe su korisni kao intermedijeri za proizvodnju dalje multivalentnih TCR kompleksa visokog afiniteta koji imaju takvu upotrebu. TCR visokog afiniteta ili multivalentni TCR kompleks visokog afiniteta stoga može biti obezbeđen u farmaceutski prihvatljivoj formulaciji za upotrebu in vivo.

[0049] TCRs visokog afiniteta prema pronalasku se mogu koristiti u proizvodnji rastvorljivih bispecifičnih reagenasa. Reagens koji sadrži rastvorljivi TCR može poželjno biti fuzionisan preko linkera sa anti-CD3 specifičnim fragmentom antitela. Dalji detalji, uključujući kako da se proizvedu takvi reagensi, opisani su u WO 10/133828.

[0050] Pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira TCR prema pronalasku, TCR ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira TCR prema pronalasku, kao i ćeliju koja sadrži takav vektor. TCR može biti kodiran ili u jednom otvorenom okviru čitanja ili u dva različita otvorena okvira čitanja. U obim pronalaska je takođe uključena ćelija koja sadrži prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR prema pronalasku, i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR prema pronalasku. Alternativno, jedan vektor može da kodira i alfa i beta lanac TCR prema pronalasku.

[0051] Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju koja na svojoj površini ima TCR prema pronalasku. Ćelija može biti T ćelija ili druga imunska ćelija. T ćelija može biti modifikovana tako da ne odgovara T ćeliji kakva postoji u prirodi. Na primer, ćelija može biti transfektovana vektorom koji kodira TCR prema pronalasku tako da T ćelija eksprimira dalji TCR pored prirodnog TCR. Dodatno ili alternativno, T ćelija može biti modifikovana tako da nije u stanju da ima nativni TCR. Postoji veliki broj postupaka pogodnih za transfekciju T ćelija sa DNK ili RNK koje kodiraju TCRs prema pronalasku (videti na primer Robbins et al., J. Immunol. 2008 May 1;180(9):6116-31). T ćelije koje eksprimiraju TCRs prema pronalasku su pogodne za upotrebu u lečenju bolesti zasnovanom na usvajanju terapije kao što su kanceri. Kao što će biti poznato stručnjacima iz ove oblasti tehnike, postoji niz pogodnih postupaka pomoću kojih se može sprovesti usvajanje terapije (videti na primer Rosenberg et al., Nat Rev Cancer. 2008 Apr;8(4):299-308) .

[0052] TCRs prema pronalasku namenjeni za upotrebu u usvajanju terapije su generalno glikozilovani kada se eksprimiraju u transfektovanim T ćelijama. Kao što je dobro poznato, obrazac glikozilacije transficiranih TCRs može biti modifikovan mutacijama transfektovanog gena (Kuball J et al., J Exp Med.2009 Feb 16;206(2):463-75).

[0053] Primeri sekvenci aminokiselina varijabilnog regiona TCR koje su u stanju da specifično prepoznaju peptide prema pronalasku prikazani su na slikama. TCRs koji imaju 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identičnost sa datim sekvencama su takođe obuhvaćeni pronalaskom. TCRs sa istom upotrebom alfa i beta lanca su takođe obuhvaćeni pronalaskom.

[0054] Deo za vezivanje prema pronalasku može biti antitelo. Termin "antitelo" kako je upotrebljen ovde odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. na molekule koji sadrže mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje antigen, bilo prirodno ili delimično ili u potpunosti proizvedeno sintetički. Termin "antitelo" uključuje fragmente antitela, derivate, funkcionalne ekvivalente i homologe antitela, humanizovana antitela, uključujući bilo koji polipeptid koji sadrži domen za vezivanje imunoglobulina, bilo prirodan ili potpuno ili delimično sintetički i bilo koji polipeptid ili protein koji ima domen za vezivanje koji je, ili je homologan domenu za vezivanje antitela. Stoga su uključeni himerni molekuli koji sadrže domen za vezivanje imunoglobulina, ili ekvivalentan, fuzionisan sa drugim polipeptidom. Kloniranje i ekspresija himernih antitela opisani su u EP-A-0120694 i EP-A-0125023. Humanizovano antitelo može biti modifikovano antitelo koje ima ne-humane varijabilne regione, npr. mišje, antitelo i konstantni region humanog antitela. Postupci za pravljenje humanizovanih antitela su opisani u, na primer, US patentu br.5225539. Primeri antitela su izotipovi imunoglobulina (npr. IgG, IgE, IgM, IgD i IgA) i njihove izotipske podklase; fragmenti koji sadrže domen za vezivanje antigena kao što su Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; i dijatela. Antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska. Monoklonsko antitelo se ovde može nazvati "mab".

[0055] Moguće je uzeti antitelo, na primer monoklonsko antitelo, i koristiti tehnologiju rekombinantne DNK za proizvodnju drugih antitela ili himernih molekula koji zadržavaju specifičnost originalnog antitela. Takve tehnike mogu uključivati uvođenje DNK koja kodira varijabilni region imunoglobulina, ili komplementarne određujuće regione (CDRs) antitela na konstantne regione, ili konstantne regione plus regione okvira čitanja, različitog imunoglobulina (videti, na primer, EP-A-184187, GB 2188638A ili EP-A-239400). Hibridom (ili druga ćelija koja proizvodi antitela) može biti podložna genskoj mutaciji ili drugim promenama, koje mogu ili ne moraju da promene specifičnost vezivanja proizvedenih antitela.

[0056] Pokazalo se da fragmenti celog antitela mogu obavljati funkciju vezivanja antigena. Primeri fragmenata za vezivanje su (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iii) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog antitela; (iv) dAb fragment (Ward, E.S. et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6) koji se sastoji od VH domena; (v) izolovani CDR regioni; (vi) F(ab')2 fragmenti, bivalentni fragment koji sadrži dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančane Fv molekule (scFv), pri čemu su VH domen i VL domen povezani peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena povezuju da bi se formiralo mesto za vezivanje antigena (Bird et al., Science. 1988 Oct 21 ;242(4877):423-6; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Aug;85(16):5879-83); (viii) bispecifični jednolančani Fv dimeri (PCT/US92/09965) i (ix) "dijatela", multivalentni ili multispecifični fragmenti konstruisani fuzijom gena (WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Jul 15;90(14):6444-8). Dijatela su multimeri polipeptida, pri čemu svaki polipeptid sadrži prvi domen koji sadrži region za vezivanje lakog lanca imunoglobulina i drugi domen koji sadrži region za vezivanje teškog lanca imunoglobulina, pri čemu su dva domena povezana (npr. peptidnim linkerom), ali ne mogu da se međusobno povezuju da bi se formiralo mesto za vezivanje antigena: mesta za vezivanje antigena se formiraju povezivanjem prvog domena jednog polipeptida unutar multimera sa drugim domenom drugog polipeptida unutar multimera (WO94/13804). Tamo gde se koriste bispecifična antitela, to mogu biti konvencionalna bispecifična antitela, koja se mogu proizvesti na različite načine (Hollinger & Winter, Curr Opin Biotechnol. 1993 Aug;4(4):446-9), npr. pripremljeni hemijski ili iz hibridnih hibridoma, ili mogu biti bilo koji od fragmenata bispecifičnih antitela prethodno pomenutih. Možda bi bilo bolje koristiti scFv dimere ili dijatela pre nego cela antitela. Dijatela i scFv se mogu konstruisati bez Fc regiona, koristeći samo varijabilne domene, potencijalno smanjujući efekte antiidiotipske reakcije. Drugi oblici bispecifičnih antitela uključuju jednolančane "Janusins" opisane u Traunecker et al., EMBO J.1991 Dec;10(12):3655-9). Bispecifična dijatela, za razliku od bispecifičnih celih antitela, takođe mogu biti korisna jer se mogu lako konstruisati i eksprimirati u E. coli. Dijatela (i mnogi drugi polipeptidi kao što su fragmenti antitela) odgovarajućih specifičnosti vezivanja mogu se lako odabrati korišćenjem prikazivanjem faga (WO94/13804) iz biblioteka. Ako jedna grana dijatela treba da bude konstantna, na primer, sa specifičnošću usmerenom protiv antigena X, onda se može napraviti biblioteka gde se druga grana menja i odabere se antitelo odgovarajuće specifičnosti. "Domen za vezivanje antigena" je deo antitela koji obuhvata oblast koja se specifično vezuje za deo ili ceo antigen i komplementaran je sa njim. Kada je antigen veliki, antitelo se može vezati samo za određeni deo antigena, koji se naziva epitopom. Domen za vezivanje antigena može biti obezbeđen pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela. Domen za vezivanje antigena može da sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).

[0057] Deo za vezivanje može biti molekul sličan antitelu koji je dizajniran da specifično vezuje kompleks peptid-MHC prema pronalasku. Od posebne prednosti su antitela koja oponašaju TCR, kao što su, na primer, ona opisana u WO2007143104 i Sergeeva et al., Blood.

2011 Apr 21;117(16):4262-72 i/ili Dahan and Reiter. Expert Rev Mol Med. 2012 Feb 24;14:e6.

[0058] Ovde su takođe otkriveni delovi za vezivanje zasnovani na konstruisanim skeletnim proteinima. Skeletni proteini su izvedeni iz stabilnih, rastvorljivih, prirodnih proteinskih struktura koje su modifikovane da obezbede mesto za vezivanje za ciljani molekul od interesa.

Primeri konstruisanih skeletnih proteina uključuju, ali se ne ograničavaju na, afitela, koja se zasnivaju na Z-domenu stafilokoknog proteina A koji obezbeđuje vezu za povezivanje na dva njegova α-heliksa (Nygren, FEBS J. 2008 Jun;275(11):2668-76); antitikalini, izvedeni iz lipokalina, koji uključuju mesta za vezivanje za male ligande na otvorenom kraju nabora betabarela (Skerra, FEBS J. 2008 Jun;275(11):2677-83), nanotela i DARPins. Konstruisani skeletni proteini imaju obično ciljano delovanje da vežu iste proteine antigene kao i antitela, i potencijalni su terapeutski agensi. Oni mogu delovati kao inhibitori ili antagonisti, ili kao sredstva za isporuku molekula sa ciljanim delovanjem, kao što su toksini, u specifično tkivo in vivo (Gebauer and Skerra, Curr Opin Chem Biol. 2009 Jun;13(3):245-55). Kratki peptidi se takođe mogu koristiti za vezivanje ciljanog proteina. Filomeri su prirodni strukturirani peptidi izvedeni iz bakterijskih genoma. Takvi peptidi predstavljaju raznovrstan niz strukturnih nabora proteina i mogu se koristiti za inhibiciju/ometanje interakcija protein-protein in vivo (Watt, Nat Biotechnol.2006 Feb;24(2):177-83)].

[0059] U sedmom aspektu, pronalazak obezbeđuje peptid prema pronalasku, kompleks prema pronalasku, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, vektor prema pronalasku, ćeliju prema pronalasku ili deo za vezivanje prema pronalasku za upotrebu u medicini . Peptid, kompleks, nukleinska kiselina, vektor, ćelija ili deo za vezivanje mogu se koristiti za lečenje ili prevenciju kancera, posebno kancera dojke, debelog creva i jednjaka.

[0060] U osmom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži peptid prema pronalasku, kompleks prema pronalasku, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, vektor prema pronalasku, ćeliju prema pronalasku ili deo za vezivanje prema pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0061] Ova farmaceutska kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka primene na pacijentu). Može se obezbediti u obliku jedinične doze, generalno će biti obezbeđeno u zapečaćenom kontejneru i može se obezbediti kao deo kompleta. Takav komplet bi obično (iako ne nužno) uključivao uputstva za upotrebu. Može uključivati veći broj navedenih jediničnih doznih oblika. Pogodne kompozicije i postupci za primenu su poznati stručnjacima, na primer videti, Johnson et al., Blood. 2009 Jul 16;114(3):535-46, sa pozivanjem na klinička ispitivanja pod brojevima NCI-07-C-0175 i NCI-07-C-0174. Ćelije prema pronalasku će se obično isporučivati kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja će normalno uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, T ćelije transfektovane sa TCRs prema pronalasku mogu biti obezbeđene u farmaceutskoj kompoziciji zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Farmaceutski prihvatljiv nosač može biti krema, emulzija, gel, lipozom, nanočestica ili mast.

[0062] Farmaceutska kompozicija može biti prilagođena za primenu na bilo koji odgovarajući način kao što je parenteralni (uključujući subkutani, intramuskularni ili intravenski), enteralni (uključujući oralni ili rektalni), inhalacioni ili intranazalni način. Takve kompozicije se mogu pripremiti bilo kojim postupkom poznatim u farmaciji, na primer mešanjem aktivnog sastojka sa nosačem(ima) ili ekscipijentom(ima) u sterilnim uslovima.

[0063] Doze supstanci prema ovom pronalasku mogu da variraju u širokim granicama, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji se leči (kao što je kancer, virusna infekcija ili autoimuna bolest), starosti i stanja pojedinca koji se leči, itd. Na primer, odgovarajući opseg doze za reagens koji sadrži rastvorljivi TCR fuzionisan sa anti-CD3 domenom može biti između 25 ng/kg i 50 µg/kg. Lekar će na kraju odrediti odgovarajuće doze koje će se koristiti.

[0064] Peptid prema pronalasku može biti obezbeđen u obliku kompozicije vakcine. Kompozicija vakcine može biti korisna za lečenje ili prevenciju kancera. Sve takve kompozicije su obuhvaćene ovim pronalaskom. Kao što se podrazumeva, vakcine mogu imati nekoliko oblika (Schlom, J Natl Cancer Inst.2012 Apr 18;104(8):599-613). Na primer, peptid prema pronalasku se može koristiti direktno za imunizaciju pacijenata (Salgaller, Cancer Res.

1996 Oct 15;56(20):4749-57 and Marchand, Int J Cancer. 1999 Jan 18;80(2):219-30). Kompozicija vakcine može uključivati dodatne peptide tako da je peptid prema pronalasku jedan od smeše peptida. Adjuvansi se mogu dodati kompoziciji vakcine da bi se pojačao imuni odgovor

[0065] Alternativno, kompozicija vakcine može imati oblik ćelije koja ima antigen i prikazujući peptid prema pronalasku u kompleksu sa MHC. Poželjno, ćelija koja ima antigen je imunska ćelija, poželjnije dendritična ćelija. Peptid se može modelirati na površinu ćelije (Thurner, J Exp Med. 1999 Dec 6;190(11):1669-78), ili nukleinska kiselina koja kodira peptid prema pronalasku može biti uvedena u dendritične ćelije (za primer elektroporacijom. Van Tendeloo, Blood.2001 Jul 1;98(1):49-56).

[0066] Peptidi, kompleksi, molekuli nukleinske kiseline, vektori, ćelije i delovi za vezivanje prema pronalasku mogu biti neprirodni i/ili prečišćeni i/ili konstruisani i/ili rekombinantni i/ili izolovani i/ili sintetički.

[0067] U devetom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak identifikacije dela za vezivanje koji vezuje kompleks prema pronalasku, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt dela za vezivanje kandidata sa kompleksom i određivanje da li se deo za vezivanje kandidata vezuje za kompleks, pri čemu je deo za vezivanje TCR ili antitelo. Postupci za određivanje vezivanja za komplekse peptid-MHC su dobro poznate u tehnici. Poželjni postupci uključuju, ali se ne ograničavaju na, površinsku plazmonsku rezonancu, ili bilo koju drugu tehniku biosenzora, ELISA, protočnu citometriju, hromatografiju, mikroskopiju. Alternativno, ili dodatno, vezivanje se može odrediti funkcionalnim analizama u kojima se biološki odgovor detektuje nakon vezivanja, na primer, oslobađanjem citokina ili apoptozom ćelije.

[0068] Kandidat dela za vezivanje može biti tip dela za vezivanje koji je već opisan, kao što je TCR ili antitelo. Navedeni deo za vezivanje se može dobiti korišćenjem postupaka koji su poznate u tehnici. Na primer, T ćelije koje se vezuju za antigen i TCRs se tradicionalno izoluju iz sveže krvi dobijene od pacijenata ili zdravih donora. Takav postupak uključuje stimulaciju T ćelija korišćenjem autolognih DCs, praćenih autolognim B ćelijama, modeliranim sa peptidom prema pronalasku. Može se izvesti nekoliko krugova stimulacije, na primer tri ili četiri kruga. Aktivirane T ćelije se zatim mogu testirati na specifičnost merenjem oslobađanja citokina u prisustvu T2 ćelija modeliranih sa peptidom prema pronalasku (na primer korišćenjem IFN γ ELISpot analize). Aktivirane ćelije se zatim mogu sortirati fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) korišćenjem obeleženih antitela da bi se otkrila unutarćelijska proizvodnja citokina (npr. IFN γ) ili ekspresija ćelijskog površinskog markera (kao što je CD137). Sortirane ćelije mogu biti proširene i dalje validirane, na primer, ELISpot analizom i/ili citotoksičnošću nasuprot ciljanih ćelija i/ili bojenjem peptid-MHC tetramerom. TCR lanci iz validiranih klonova se zatim mogu amplifikovati brzom amplifikacijom cDNK krajeva (RACE) i sekvencirati.

[0069] Alternativno, TCRs i antitela mogu da se dobiju iz prikaznih biblioteka u kojima se peptid MHC kompleks prema pronalasku koristi za pretraživanje biblioteke. Proizvodnja biblioteka antitela korišćenjem prikaza faga je dobro poznata u tehnici, na primer videti Aitken, Antibody phage display: Methods and Protocols (2009, Humana, New York). TCRs se mogu prikazati na površini čestica faga i čestica kvasca, na primer, i takve biblioteke su korišćene za izolaciju varijanti TCR visokog afiniteta dobijenih iz klonova T ćelija (kao što je opisano u WO04044004 and Li et al. Nat Biotechnol. 2005 Mar;23(3):349-54 and WO9936569). Nedavno je pokazano da se biblioteke TCR faga mogu koristiti za izolovanje TCRs sa novom specifičnošću antigena. Takve biblioteke se obično konstruišu sa sekvencama alfa i beta lanaca koje odgovaraju onima koje se nalaze u prirodi. Međutim, nasumična kombinacija ovih sekvenci alfa i beta lanca, koja se javlja tokom kreiranja biblioteke, proizvodi repertoar TCRs koji nisu prisutni u prirodi (kao što je opisano u WO2015/136072, WO2017046198, WO2017046201, WP2017046202, WO2017046205, WO2017046207, WO2017046208, WO2017046211 i WO2017046212).

[0070] Kompleks peptid-MHC prema pronalasku može se poželjno koristiti za skrining biblioteke različitih TCRs prikazanih na površini čestica faga. TCRs koje prikazuje navedena biblioteka možda ne odgovaraju onima koje postoje u prirodi, na primer, mogu sadržati uparivanje alfa i beta lanaca koji ne bi bili prisutni in vivo, i ili TCRs mogu sadržati neprirodne mutacije i/ili TCRs mogu biti u rastvorljivom obliku. Skrining može uključiti pretraživanje biblioteke faga sa kompleksima peptid-MHC prema pronalasku i naknadno izolovanje vezanog faga. U tu svrhu peptid-MHC kompleksi mogu biti vezani za čvrstu podlogu, kao što je magnetna kuglica, ili matrica kolone i izolovani peptid MHC kompleksi vezani za fag, magnetom, ili hromatografijom, respektivno. Koraci pretraživanja se mogu ponoviti nekoliko puta, na primer tri ili četiri puta. Izolovani fag se može dalje proširiti u ćelijama E. coli. Izolovane čestice faga mogu biti testirane na specifično vezivanje kompleksa peptid-MHC prema pronalasku. Vezivanje se može detektovati korišćenjem tehnika koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, ELISA ili SPR, na primer korišćenjem BiaCore instrumenta. DNK sekvenca receptora T ćelija prikazana fagom koji se vezuje za peptid-MHC može se dalje identifikovati standardnim PCR postupcima.

[0071] Poželjne ili izborne karakteristike svakog aspekta pronalaska su kao za svaki drugi aspekt mutatis mutandis.

[0072] Ovaj pronalazak će biti dalje ilustrovan sledećim primerima i slikama koji su dati samo u svrhu ilustracije i nisu namenjeni da ograniče pronalazak na bilo koji način.

Kratak opis slika

[0073]

Slike 1 do 17 prikazuju odgovarajuće spektre fragmentacije za peptide SEQ ID NOS: 1 do 17, eluirane iz ćelija. U nastavku svakog spektra prikazana je tabela koja ističe odgovarajuće jone.

Slika 18(A-C) prikazuje ELISA ploče koje prikazuju specifičnost TCRs za kompleks peptida SEQ ID NOs: 1, 3 i 5 respektivno i HLA-A*02, upoređivanjem vezivanja sa drugim kompleksima peptid-HLA-A*02.

Slika 19 prikazuje sekvence aminokiselina odgovarajućih varijabilnih lanaca alfa lanca i beta lanca TCRs na slici 18 (A-C).

Primeri

Primer 1 - Identifikacija dobijenih peptida sa ciljanim delovanjem pomoću masene spektrometrije

[0074] Prisustvo HLA-restriktivnih peptida izvedenih iz PIWIL1 na površini tumorskih ćelijskih linija je ispitano primenom masene spektrometrije.

Postupak

[0075] Ovekovečene ćelijske linije dobijene iz komercijalnih izvora su održavane i proširene pod standardnim uslovima.

[0076] HLA kompleksi klase I su prečišćeni imunoafinitetom korišćenjem komercijalno dostupnih anti-HLA antitela BB7.1 (anti-HLA-B*07), BB7.2 (anti-HLA-A*02) i W6/32 (anti-Klasa 1) . Ukratko, ćelije su lizirane u puferu koji sadrži ne-jonski deterdžent NP-40 (0,5% zapr./ zapr.) pri 5 × 10<7>ćelija po ml i inkubirane na 4°C tokom 1 h uz agitaciju/mešanje. Ćelijski ostaci su uklonjeni centrifugiranjem i supernatant je prethodno očišćen korišćenjem proteinA-Sefaroze. Supernatant je propušten preko 5 ml smole koja sadrži 8 mg anti-HLA antitela imobilisanog na skeletni proteinA-Sefarozu. Kolone su isprane puferima sa malo soli i puferima sa visokim sadržajem soli i kompleksima eluiranim kiselinom. Eluirani peptidi su odvojeni od HLA kompleksa hromatografijom reverzne faze korišćenjem kartridža za ekstrakciju čvrste faze (Phenomenex). Vezani materijal je eluiran iz kolone i smanjen u zapremini korišćenjem vakuum centrifuge.

[0077] Peptidi su razdvojeni tečnom hromatografijom visokog pritiska (HPLC) na Dionex Ultimate 3000 sistemu korišćenjem C18 kolone (Phenomenex). Peptidi su stavljeni u 98% pufer A (0,1% vodeni rastvor trifluorosirćetne kiseline (TFA)) i 2% pufer B (0,1% TFA u acetonitrilu). Peptidi su eluirani korišćenjem stepenastog gradijenta B (2-60%) tokom 20 min. Frakcije su sakupljene u intervalima od jednog minuta i liofilizovane.

[0078] Peptidi su analizirani pomoću nanoLCMS/MS pomoću Dionex Ultimate 3000 nanoLC kuplovanog na AB Sciex Triple TOF 5600 ili Thermo Orbitrap Fusion masene spektrometre. Obe mašine su opremljene izvorima jonizacije nanoelektrospreja. Peptidi su stavljeni na Acclaim PepMap 100 trap kolonu (Dionex) i razdvojeni pomoću Acclaim PepMap RSLC kolone (Dionex). Peptidi su stavljeni u mobilnu fazu A (0,5% mravlje kiseline:voda) i eluirani korišćenjem gradijenta pufera B (acetonitril:0,5% mravlja kiselina) direktno u izvor jonizacije nanospreja.

[0079] Za identifikaciju peptida, maseni spektrometar je funkcionisao korišćenjem toka rada zavisnog od informacija (IDA). Informacije dobijene u ovim eksperimentima korišćene su za pretragu Uniprot baze podataka humanih proteina za peptide u skladu sa uočenim obrascima fragmentacije, korišćenjem Protein pilot softvera (Ab Sciex) i softvera PEAKS (Bioinformatics solutions). Identifikovani peptidi dobijaju ocenu od strane softvera, na osnovu podudaranja između posmatranih i očekivanih obrazaca fragmentacije.

Rezultati

[0080] Peptidi navedeni u tabeli 1, koji odgovaraju SEQ ID NOs: 1-17, detektovani su masenim spektrometrom nakon ekstrakcije iz kancerogenih ćelijskih linija. Primer ćelijske linije iz koje je detektovan peptid je naznačen u tabeli zajedno sa HLA antitelom koje se koristi za prečišćavanje imunoafiniteta.

[0081] Slike 1-17 prikazuju reprezentativne obrasce fragmentacije za peptide SEQ ID NOS: 1-17 respektivno. U nastavku svakog spektra prikazana je tabela koja ističe odgovarajuće jone.

Primer 2 - Priprema rekombinantnih peptid-HLA kompleksa

[0082] U nastavku je opisan pogodan postupak za pripremu rastvorljivog rekombinantnog HLA stavljenog sa TAA peptidom.

[0083] Molekuli HLA klase I (HLA-teški lanac i HLA laki lanac (ß2m)) su odvojeno eksprimirani u E. coli kao inkluziona tela, korišćenjem odgovarajućih konstrukta. HLA-teški lanac dodatno je sadržao C-terminalni obeleživač biotinilacije koja zamenjuje transmembranske i citoplazmatske domene (O’Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Ćelije E. coli su lizirane i inkluziona tela su obrađena do približno 80% čistoće.

[0084] Inkluziona tela od ß2m i teški lanac su denaturisani odvojeno u puferu za denaturaciju (6 M guanidin, 50 mM Tris pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 10 mM EDTA) tokom 30 minuta na 37°C. Pripremljen je pufer za ponovno savijanje koji sadrži 0,4 M L-arginina, 100 mM Tris pH 8,1, 2 mM EDTA, 3,1 mM cistamin dihidrohlorida, 7,2 mM cisteamin hidrohlorida. Sintetički peptid je rastvoren u DMSO do konačne koncentracije od 4 mg/ml i dodat je puferu za ponovno savijanje u 4 mg/litru (konačna koncentracija). Zatim se dodaje 30 mg/litar ß2m, a zatim 60 mg/litar teškog lanca (konačne koncentracije). Ostavljeno je da se završi ponovno savijanje na sobnoj temperaturi najmanje 1 sat.

[0085] Smeša za ponovno savijanje je zatim dijalizovana nasuprot 20 L dejonizovane vode na 4°C tokom 16 h, a zatim sa 10 mM Tris pH 8,1 narednih 16 h. Rastvor proteina je zatim filtriran kroz 0,45 µm filter od celuloze acetata od i stavljen na kolonu za anjonsku razmenu POROS HQ (zapremina sloja od 8 ml) ekvilibrisanu sa 20 mM Tris pH 8,1. Protein je eluiran linearnim gradijentom 0-500 mM NaCl korišćenjem AKTA prečistača (GE Healthcare). Kompleks HLA-peptid je eluiran sa približno 250 mM NaCl, a pikovi frakcija su sakupljeni, dodat je koktel inhibitora proteaze (Calbiochem) i frakcije su ohlađene na ledu.

[0086] Biotinilizovano obeleženi pHLA molekuli su zamenjeni puferom u 10 mM Tris pH 8,1, 5 mM NaCl korišćenjem GE Healthcare kolone za brzo odsoljavanje ekvilibrisane u istom puferu. Odmah nakon eluiranja, frakcije koje sadrže protein su ohlađene na ledu i dodat je koktel inhibitora proteaze (Calbiochem). Zatim su dodati biotinilacioni reagensi: 1 mM biotin, 5 mM ATP (puferovan do pH 8), 7,5 mM MgCl2i 5 µg/ml BirA enzima (prečišćen prema O’Callaghan et al., (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Smeša je zatim ostavljena da se inkubira na sobnoj temperaturi preko noći.

[0087] Biotinilovani pHLA molekuli su dalje prečišćeni gel filtracionom hromatografijom korišćenjem AKTA prečistača sa kolonom GE Healthcare Superdex 75 HR 10/30 koja je prethodno ekvilibrisana sa filtriranim PBS. Biotinilovana pHLA smeša je koncentrovana do krajnje zapremine od 1 ml dodata na kolonu i razvijena je sa PBS na 0,5 ml/min. Biotinilovani pHLA molekuli su eluirani kao jedan pik na približno 15 ml. Frakcije koje sadrže protein su sakupljene, ohlađene na ledu i dodat je koktel inhibitora proteaze. Koncentracija proteina je određena korišćenjem analize vezivanja Coomassie (PerBio) i alikvoti biotinilovanih pHLA molekula su čuvani zamrznuti na -20 °C.

[0088] Takvi peptid-MHC kompleksi mogu se koristiti u rastvorljivom obliku ili mogu biti imobilisani preko svog C terminalnog biotinskog dela na čvrstu podlogu, koja će se koristiti za detekciju T ćelija i receptora T ćelija koji vezuju pomenuti kompleks. Na primer, takvi kompleksi se mogu koristiti u pretraživanju biblioteka faga, izvođenju ELISA analize i pripremanju senzorskih čipova za Biacore merenja.

Primer 3 - identifikacija TCRs koji vezuju peptid-MHC kompleks prema pronalasku

Postupak

[0089] TCRs koji se vezuju za antigen su dobijeni korišćenjem peptida prema pronalasku da bi se pretražili TCR biblioteke faga. Biblioteka je konstruisana korišćenjem sekvenci alfa i beta lanaca dobijenih iz prirode (kao što je opisano u WO2015/136072, WO2017046198, WO2017046201, WP2017046202, WO2017046205, WO2017046207, WO2017046208, WO2017046211 i WO2017046212). Nasumična kombinacija sekvenci ovih alfa i beta lanaca, koja se javlja tokom kreiranja biblioteke, proizvodi neprirodne kombinacije alfa beta lanaca.

[0090] TCRs dobijeni iz biblioteke su procenjeni ELISA analizom da bi se potvrdilo specifično prepoznavanje antigena. ELISA analize su izvedene kako je opisano u WO2015/136072.. Ukratko, MaxiSorp ELISA ploče sa 96 udubljenja su obložene streptavidinom i inkubirane sa biotinilovanim peptid-HLA kompleksom prema pronalasku. Klonovi faga koji nose TCR su dodati u svako udubljenje i detekcija je sprovedena korišćenjem konjugata anti-M13-HRP antitela. Vezano antitelo je detektovano korišćenjem KPL labs TMB Microwell peroxidase Substrate System. Pojava plave boje u udubljenju ukazuje na vezivanje TCR za antigen. Odsustvo vezivanja za alternativne komplekse peptid-HLA ukazuje da TCR nije visoko reaktivan.

[0091] Dalja potvrda da su TCRs sposobni da vežu kompleks koji sadrži peptid HLA kompleks prema pronalasku može se dobiti površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) korišćenjem izolovanih TCRs. U ovom slučaju sekvence alfa i beta lanca su eksprimirane u E. coli kao rastvorljivi TCRs, (WO2003020763; Boulter, et al., Protein Eng, 2003.16: 707-711). Vezivanje rastvorljivih TCRs za komplekse je analizirano površinskom plazmonskom rezonancom korišćenjem BiaCore 3000 instrumenta. Biotinilovani peptid-HLA monomeri se pripremaju kao što je prethodno opisano (Primer 2) i imobilišu se na streptavidin kuplovanom CM-5 senzorskom čipu. Sva merenja su izvedena na 25°C u PBS puferu sa dodatkom 0,005% Tween uz konstantnu brzinu protoka. Da bi se izmerio afinitet, serijska razblaženja rastvorljivih TCRs se pretoče preko imobilizovanih peptid-MHCs i vrednosti odgovora u ravnoteži su određene za svaku koncentraciju. Podaci se analiziraju dijagramom specifičnog ravnotežnog vezivanja nasuprot koncentracije proteina praćenog najmanjim kvadratima koji odgovaraju Langmuir-ovoj jednačini vezivanja, uz pretpostavku interakcije 1:1.

Rezultati

[0092] TCRs koji specifično prepoznaju peptid-HLA komplekse prema pronalasku su dobijeni iz biblioteke. Slika 18 (A-C) prikazuje ELISA podatke za tri takva TCRs, po peptidu.

[0093] Sekvence aminokiselina TCR varijabilnih regiona alfa i beta TCRs identifikovanih na Slici 18 (A-C) su date na Slici 19.

[0094] Ovi podaci potvrđuju da antigen specifični TCRs mogu biti izolovani.

Claims

Patentni zahtevi

1. Peptid koji se sastoji od bilo koje od sekvenci aminokiselina SEQ ID NOS: 1, 3 i 5, naznačeno time da peptid formira kompleks sa molekulom glavnog kompleksa histokomplatibilnosti (MHC).

2. Kompleks peptida prema patentnom zahtevu 1 i molekula glavnog kompleksa histokomplatibilnosti (MHC).

3. Kompleks prema patentnom zahtevu 2, naznačen time da molekul MHC pripada klasi I MHC.

4. Molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid kao što je definisan u patentnom zahtevu 1.

5. Vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kao što je definisana u patentnom zahtevu 4.

6. Ćelija koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 5.

7. Deo za vezivanje koji vezuje peptid prema patentnom zahtevu 1 kada je u kompleksu sa MHC, naznačen time što deo za vezivanje je receptor T ćelije (TCR) ili antitelo.

8. Deo za vezivanje prema patentnom zahtevu 7, naznačen time da je TCR na površini ćelije.

9. Peptid prema patentnom zahtevu 1, kompleks prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3, molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 4, vektor prema patentnom zahtevu 5, ćelija prema patentnom zahtevu 6 ili deo za vezivanje prema bilo kom od patentnih zahteva 7 ili 8 za upotrebu u medicini.

10. Peptid, kompleks, nukleinska kiselina, vektor, ćelija ili deo za vezivanje za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera.

11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid prema patentnom zahtevu 1, kompleks prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3, molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 4, vektor prema patentnom zahtevu 5, ćeliju prema patentnom zahtevu 6 ili deo za vezivanje prema patentnim zahtevima 7 ili 8 zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

12. In vitro postupak za identifikaciju dela za vezivanje koji vezuje kompleks prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3, pri čemu postupak sadrži dovođenje u kontakt kandidata dela za vezivanje sa kompleksom i određivanja da li se kandidat dela za vezivanje vezuje za kompleks, pri čemu deo za vezivanje je TCR ili antitelo.