RS65304B1

RS65304B1 - Derivati pirido[2,3-d]pirimidina kao inhibitori replikacije humanog imunodeficijentnog virusa

Info

Publication number: RS65304B1
Application number: RS20240309A
Authority: RS
Inventors: Eric P Gillis; Christiana Iwuagwu
Original assignee: Viiv Healthcare Uk No 5 Ltd
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2024-04-30
Also published as: DK3986561T3; KR102932817B1; PH12021553180A1; FI3986561T3; UY38755A; CL2021003388A1; EP3986561B1; MA56526A; US12129255B2; KR20220024608A; UA128967C2; HRP20240501T1; BR112021025655A2; SI3986561T1; TW202115055A; US20210323967A1; MD3986561T2; AR119174A1; JP2022537047A; PL3986561T3

Description

Opis

POLJE PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na jedinjenja, kompozicije i jedinjenja za upotrebu u postupcima tretmana infekcije humanim imunodeficijentnim virusom (HIV). Još preciznije, pronalazak obezbeđuje nove inhibitore HIV, farmaceutske kompozicije koje sadrže ova jedinjenja i jedinjenja za upotrebu u postupcima upotrebe ovih jedinjenja u tretmanu HIV infekcije.

Pronalazak se takođe odnosi na postupke za izradu jedinjenja koja su ovde opisana.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS) je rezultat infekcije sa HIV. HIV nastavlja da bude glavni globalni problem javnog zdravlja. U 2015., je procenjeno da 36.7 miliona ljudi živi sa HIV (uključujući 1.8 miliona dece) – globalna HIV prevalenca od 0.8%. Ogromna većina od ovog broja živi u slabo- ili srednje-razvijenim zemljama. U istoj godini, 1.1 milion ljudi je umrlo od bolesti povezanih sa AIDS-om.

[0003] Savremena terapija za HIV-inficirane pojedince se sastoji od kombinacije odobrenih anti-retrovirusnih agenasa. U ovom trenutku je skoro 50 lekova odobreno za HIV infekciju, ili kao pojedinačna sredstva, kombinacije fiksnih doza ili režimi pojedinačnih tableta; od kojih ove druge dve sadrže 2-4 odobrena sredstva. Ova sredstva pripadaju brojnim različitim grupama, usmerenim ili na enzim virusa ili na funkciju proteina virusa u toku ciklusa replikacije virusa. Prema tome, sredstva su klasifikovana ili kao inhibitori nukleotidne reverzne transkriptaze (NRTIi), inhibitori ne-nukleotidne reverzne transkriptaze (NNRTIi), inhibitori proteaze (PIi), inhibitori transfera lanca integraze (INSTIi), ili inhibitori ulaska (jedan, maravirok, usmeren je na CCR5 protein domaćina, dok je drugi, enfuvirtid, peptid koji je usmeren na gp41 region gp160 proteina virusa). Pored toga, mogu da se koriste farmakokinetički pojačivači (kobocistat ili ritonavir) u kombinaciji sa antiretrovirusnim sredstvima (ARVi) koja zahtevaju pojačavanje.

[0004] Uprkos arsenalu sredstava i kombinacija lekova, ostaje medicinska potreba za novim anti-retrovirusnim sredstvima. Velika heterogenost virusa, toksičnost povezana sa lekovima, problemi sa tolerancijom i slabo prihvatanje leka mogu svi da dovedu do neuspeha tretmana i mogu da dovedu do selekcije virusa mutacijama koje pružaju otpor jednom ili više antiretrovirusnih sredstava ili čak više lekova iz cele klase (Beyrer, C., Pozniak A. HIV drug resistance - an emerging threat to epidemic control. N. Engl. J. Med.2017, 377, 1605-1607; Gupta, R. K., Gregson J., i saradnici, HIV-1 drug resistance before initiation or re-initiation of first-line antiretroviral therapy in low-income and middle-income countries: systematic review and meta-regression analysis. Lancet Infect. Dis.2017, 18, 346-355; Zazzi, M., Hu, H., Prosperi, M. The global burden of HIV-1 drug resistance in past 20 years. PeerJ.2018, DOI 10.7717/peerj.4848). Kao rezultat toga, potrebni su novi lekovi koji su lakši za primenu, koji imaju veće genetske barijere za razvoj rezistencije i koji imaju poboljšanu bezbednost u odnosu na postojeća sredstva. U ovom mnoštvu izbora, novi mehanizmi delovanja (MOAi) koji mogu da se koriste kao deo antiretrovirusne terapije (ART), mogu i dalje da imaju važnu ulogu jer bi trebalo da budu efikasni protiv virusa rezistentnih na postojeća sredstva.

Poboljšanja koja bi učinila lekove lakšim za primenu u toku dužeg vremenskog perioda ili čak do kraja života mogu da uključe sve ili nešto od sledećeg: smanjene sporedne efekte, smanjene lek-lek interakcije, povećan period između doziranja, ili alternativne načine primene koji zadovoljavaju pojedinačne zahteve pacijenata. Ciljevi pobojšanja bezbednosti treba definitivno da uključe visoke terapeutske indekse prema bilo kojoj toksičnosti koja može da dovede do prekida doziranja a takođe može da uključi smanjenje neželjenih efekata ili smanjenje lek-lek interakcija. Mogućnost da se koristi ukupno manje lekova u kombinovanom režimu bi izgleda takođe doveo do poboljšane usklađenosti i bezbednosti. Povećanje potencije protiv antivirusnog cilja, posebno ukoliko se održava u prisustvu albumina humane plazme i seruma, takođe bi dovela do smanjene doze i mogla bi direktno i pozitivno da utiče na trajanje doziranja i terapeutski indeks u odnosu na neželjene efekte i toksičnost. Kao zaključak, maksimalna korist za HIV inficirane pacijente bi bila dostignuta ukoliko bi bili otkriveni anti-HIV lekovi sa novim mehanizmima delovanja a koji takođe imaju druge prethodno opisane koristi da se omogući dugotrajna usklađenost i bezbednost.

[0005] Neka potencijalna terapeutska jedinjenja su opisana u tehnici i navedena su u Blair, Wade S. i saradnici, Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2009), 53(12), 5080-5087, Blair, Wade S. i saradnici PLoS Pathogens (2010), 6(12), e1001220, Thenin-Houssier, Suzie; Valente, Susana T. Current HIV Research, 2016, 14, 270-282 i PCT Patentnim prijavama sa sledećim brojevima: WO 2012065062, WO 2013006738, WO 2013006792, WO 2014110296, WO 2014110297, WO 2014110298, WO 2014134566, WO 2015130964, WO2015130966, WO 2016033243, WO2018035359 i WO2018203235.

[0006] Sada su u tehnici potrebna dodatna jedinjenja koja su nova i korisna u tretmanu HIV. Pored toga, ova jedinjenja treba da obezbede prednosti za farmaceutsku upotrebu, na primer, u vezi sa jednim ili više mehanizama njihovog delovanja, vezivanja, efikasnosti inhibicije, selektivnosti cilja, rastvorljivosti, profila bezbednosti, bioraspoloživosti i/ili smanjene učestalosti doziranja. Sada su takođe potrebne nove formulacije i jedinjenja za upotrebu u postupcima tretmana u kojima se koriste ova jedinjenja.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0007] Ukratko, u jednom aspektu, ovaj pronalazak otkriva jedinjenja koja su niže opisana

i njihove farmaceutski prihvatljive soli (u daljem tekstu "jedinjenja i soli iz pronalaska").

[0008] U narednom aspektu, ovaj pronalazak otkriva farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje ili so iz pronalaska.

[0009] U narednom aspektu, ovaj pronalazak otkriva jedinjenje ili so iz pronalaska za upotrebu u terapiji.

[0010] U narednom aspektu, ovaj pronalazak otkriva jedinjenje ili so iz pronalaska za upotrebu u lečenju HIV infekcije kod ljudi.

[0011] U narednom aspektu, ovaj pronalazak otkriva upotrebu jedinjenja ili soli iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za tretman HIV infekcije kod ljudi.

KRATAK OPIS SLIKA

[0012] Slika 1 je zbir profila srednje vrednosti koncentracija u plazmi u odnosu na vreme kod pacova u niže opisanoj studiji.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0013] Kao prednost, jedinjenja i soli iz pronalaska imaju niže opisanu stereohemiju

[0014] U narednom aspektu, jedinjenja i soli iz pronalaska imaju niže opisanu stereohemiju

[0015] Soli iz pronalaska su farmaceutski prihvatljive. Ove soli mogu da budu soli nastale dodavanjem kiseline ili soli nastale dodavanjem baze. Za pregled pogodnih farmaceutskih soli videti, Berge i saradnici, J. Pharm, Sci., 66, 1-19, 1977.

[0016] Reprezentativne farmaceutski prihvatljive soli nastale dodavanjem kiseline uključuju, ali se ne ograničavaju samo na, 4-acetamido-benzoat, acetat, adipat, alginat, askorbat, aspartat, benzensulfonat (besilat), benzoat, bisulfat, bitartarat, butirat, kalcijum edetat, kamforat, kamforsulfonat (kamsilat), kaprat (dekanoat), kaproat (heksanoat), kaprilat (oktanoat), cinamat, citrat, ciklamat, diglukonat, 2,5-dihidroksibenzoat, disukcinat, dodecilsulfat (estolat), edetat (etilendiamintetraacetat), estolat (lauril sulfat), etan-1,2-disulfonat (edisilat), etansulfonat (esilat), format, fumarat, galakturat (mukat), gentisat (2,5-dihidroksibenzoat), glukoheptonat (gluceptat), glukonat, glukuronat, glutamat, glutarat, glicerofosforat, glukolat, heksilrezorcinat, hipurat, hidrabamin (N,N-di(dehidroabietil)-etilendiamin), hidrobromid, hidrohlorid, hidrojodid, hidroksinaftoat, izobutirat, laktat, laktobionat, laurat, malat, maleat, malonat, mandelat, metansulfonat (mesilat), metilsulfat, mukat, naftalen-1,5-disulfonat (napadisilat), naftalen-2-sulfonat (napsilat), nikotinat, nitrat, oleat, palmitat, p-aminobenzensulfonat, p-aminosaliciklat, pamoat (embonat), pantotenat, pektinat, persulfat, fenilacetat, feniletilbarbiturat, fosfat, poligalakturonat, propionat, ptoluensulfonat (tosilat), piroglutamat, piruvijat, salicilat, sebakat, stearat, subacetat, sukcinat, sulfamat, sulfat, tanat, tartarat, teoklat (8-hlorteofilinat), tiocijanat, trietjodid, undekanoat, undecilenat i valerat.

[0017] Reprezentativne farmaceutski prihvatljive soli nastale dodavanjem baze uključuju, ali se ne ograničavaju samo na, soli aluminijuma, 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiola (TRIS, trometamin), arginina, benetamina (N-benzilfenetilamin), benzatina (N,N’-dibenziletilendiamin), bis-(2-hidroksietil)amina, bizmuta, kalcijuma, hlorprokaina, holina, klemizola (1-p hlorbenzil-2-pirolidin-1’-ilmetilbenzimidazol), cikloheksilamina, dibenziletilendiamina, dietilamina, dietiltriamina, dimetilamina, dimetiletanolamina, dopamina, etanolamina, etilendiamina, L-histidina, gvožđa, izohinolina, lepidina, litijuma, lizina, magnezijuma, meglumina (N-metilglukamin), piperazina, piperidina, kalijuma, prokaina, kinina, hinolina, natrijuma, stroncijuma, t-butilamina i cinka.

[0018] U jednom ostvarenju, soli nastale dodavanjem kiseline su izabrane od hidrohlorida, hidrobromida, hidrojodida, sulfata, bisulfata, nitrata, fosfata, hidrogen fosfata, acetata, benzoata, sukcinata, saharata, fumarata, maleata, laktata, citrata, tartarata, glukonata, kamsilata, metansulfonata, etansulfonata, benzensulfonata, p-toluensulfonata i pamoata. U jednom ostvarenju, soli nastale dodavanjem baze uključuju soli metala (kao što su natrijum, kalijum, aluminijum, kalcijum, magnezijum i cink) i soli amonijuma (kao što su izopropilamin, dietilamin, dietanolamin soli). Druge soli (kao što su trifluoroacetati i oksalati) mogu da se koriste u proizvodnji jedinjenja i soli iz pronalaska i uključene su u okvir pronalaska.

[0019] Svi mogući stehiometrijski i ne-stehiometrijski oblici soli iz pronalaska su uključeni u okvir pronalaska. Soli nastale dodavanjem kiseline i baze može da izradi hemičar sa iskustom u praksi, tretmanom jedinjenja iz pronalaska sa odgovarajućom kiselinom ili bazom, u pogodnom rastvaraču, a nakon toga kristalizacijom i filtracijom.

[0020] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska dalje uključuju farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijent i/ili razblaživač. U jednom ostvarenju, farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska dalje uključuju farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

[0021] U postupku ovog opisa, prednost ima primena oralno ili injekcijom koja se daje subkutano ili intramuskularno. Prema tome, preferirane farmaceutske kompozicije uključuju kompozicije pogodne za oralnu primenu (na primer tablete) i kompozicije pogodne za injekciju, sukubatne ili intramuskularne injekcije.

[0022] U narednom aspektu ovaj pronalazak otkriva jedinjenje za upotrebu u postupcima prevencije HIV infekcije kod ljudi ili smanjenja rizika od infekcije, uključujući primenu jedinjenja ili soli iz pronalaska. Profilaksa pre izlaganja (ili PrEP) je kada ljudi zbog rizika od HIV infekcije svakoga dana uzimaju lek da smanje svoje šanse od dobijanja HIV infekcije. Pokazano je da je PrEP efikasna u smanjenju rizika od infekcije. Kako se ovde koristi, "HIV" ili "virus humane imunodeficijencije" se odnosi na HIV-1 i/ili na HIV-2.

[0023] Veruje se da je biološki cilj jedinjenja i soli iz pronalaska HIV kapsid i prema tome njihov mehanizam delovanja je da modifikuju jedan ili više načina funkcionisanja HIV kapsida. Na primer, jedinjenja i soli iz promalaska mogu da deluju kao inhibitori kapsida.

[0024] Jedinjenja i soli iz pronalaska mogu da se koriste sama ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima. Kombinovana terapija u skladu sa ovim pronalaskom prema tome uključuje primenu najmanje jednog jedinjenja ili soli iz pronalaska i primenu najmanje jednog drugog sredstva koje može da bude korisno u tretmanu HIV infekcije. Jedinjenja i soli iz pronalaska i bilo koje drugo farmaceutski aktivno sredstvo(a) mogu da se primene zajedno ili odvojeno a, kada se primene odvojeno, primena može da bude istovremeno ili po redu, po bilo kom redosledu. Na primer, jedinjenje ili so iz pronalaska i drugo sredstvo mogu da budu formulisani i primenjeni zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji ili mogu da budu formulisani i primenjeni odvojeno.

[0025] Količine jedinjenja i soli iz ovog pronalaska i drugo farmaceutski aktivnog sredstva(ava) i relativna vremena primene će da budu izabrani tako da se postigne željeni kombinovani terapeutski efekat. Primena jedinjenja iz ovog pronalaska i soli, solvata ili njihovih drugih farmaceutski prihvatljvih derivata u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima može da bude primenom istovremeno u: (1) jedinstvenoj farmaceutskoj kompoziciji koja uključuje više jedinjenja; ili (2) odvojenim farmaceutskim kompozicijama od kojih svaka uključuje jedno od jedinjenja. Alternativno, kombinacija može da se primeni odvojeno po redu pri čemu se jedno sredstvo za tretman primenjuje prvo a drugo drugo ili vice versa a različita sredstva mogu da se primene po različitom rasporedu ukoliko je to potrebno. Ovakva primena po redu može da bude u bliskom vremenskom razmaku ili dužem vremenskom razmaku. Izbor količine jedinjenja iz pronalaska ili njihovih soli i drugog farmaceutski aktivnog sredstva(a) i relativni raspored primene će da bude takav da se dostigne željeni terapeutski efekat kombinacije.

[0026] Kao takva, jedinjenja i soli iz ovog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim iil više sredstava korisnih u prevenciji ili tretmanu HIV. U ovakva sredstva spadaju, na primer, inhibitori nukleozid HIV reverzne transkriptaze, inhibitori ne-nukleozid HIV reverzne transkriptaze, inhibitori HIV proteaze, inhibitori HIV fuzije, inhibitori HIV vezivanja, CCR5 inhibitori, CXCR4 inhibitori, inhibitori HIV razvoja ili sazrevanja i inhibitori HIV integraze. Pogodna druga sredstva uključuju, na primer, abakavir, atazanavir, biktegravir, kabotegravir, darunavir, delavirdin, didanozin, dideoksiinozin, dolutegravir, doravirin, efavirenz, elvitegravir, emtricitabin, etavirin, fosamprenavir, fostemsavir, GSK3640254, indinavir, slatravir, lamivudin, lopinavir, maravirok, nelfinavir, nevirapin, raltegravir, rilpiverin, ritonavir, sakvinavir, slatravir, stavudin, tipranavir, tenofovir, tenofovir alafenamid, tenofovir dizoproksil fumarat, zalcitabin, zidovudin, antitelo N6LS, GSK3739937/VH3739937 i S-648414. Dodatna pogodna druga sredstva uključuju dolutegravir, lamivudin, fostemsavir, kabotegravir, maravirok, rilpiverin, Reyataz, tenofovir, afenamid, EfDA, doravirin i Preziata. Naredna pogodna druga sredstva uključuju dolutegravir, lamivudin, fostemsavir i kabotegravir. Preferirana sredstva uključuju, na primer, biktegravir, kabotegravir, dolutegravir, fostemsavir, islatravir i lamivudin. Sredstva koja imaju posebnu prednost uključuju, na primer, biktegravir, kabotegravir, dolutegravir, fostemsavir i lamivudin.

PRIMERI

Izrada biciklo[3.1.0]heksan-3-ola

[0027]

[0028] U izmešani rastvor ciklopent-3-enola (130 g, 1545 mmol) u DCM (1200 mL) u atmosferi N2se na 0-5 °C u toku 3 h u kapima dodaje rastvor dietil cinka u heksanu (1.0 M, 3091 mL, 3091 mmol). U rastvor se na 0 °C u kapima dodaje rastvor dijodmetana (249 mL, 3091 mmol) u DCM (300 mL) u toku 1h. Reaktivna smeša se ostavi da se zagreje na 27 °C pri čemu se uočava formiranje bele precipitacije. Smeša se meša 16 h. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 20% EtOAc/pet, Rf = 0.3, UV-neaktivni, PMA-aktivni). Reaktivna smeša se neutrališe pažljivim dodavanjem zasićenog vodenog rastvora NH4Cl (1.5 L). Smeša se filtrira kroz Celite ploču. Vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM (2 x 1L). Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i nakon toga koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije sirovi biciklo[3.1.0]heksan-3-ol kao crvena tečnost, 180 g.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 4.41 - 4.35 (m, 1H), 2.18 - 2.05 (m, 2H), 1.73 (d, J= 13.9 Hz, 2H), 1.35 - 1.25 (m, 2H), 1.21 - 1.14 (m, 1H), 0.57 - 0.43 (m, 2H). GCMS: m/z = 98.1).

Izrada biciklo[3.1.0]heksan-3-ona

[0029]

[0030] U izmešani rastvor biciklo[3.1.0]heksan-3-ola (210 g, 2054 mmol) u DCM (5000 mL) se u atmosferi N2na 0 °C u porcijama dodaje Dess-Martin perjodinan (954 g, 225 mmol). Smeša se ostavi da se zagreje na 27 °C i nakon toga meša 16 h. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 20% aceton/Hex, Rf = 0.3, UV neaktivni, PMA-aktivni). Reaktivna smeša se filtrira kroz Celite ploču i filtrat se ispere sa vodenim rastvorom NaOH (1N, 8x 1 L). Kombinovane vodene faze se ekstrahuju sa DCM (5 x 1 L). Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i nakon toga koncentruju pod sniženim pritiskom (temperatura kupatila: 20 °C) da se dobije sirovi biciklo[3.1.0]heksan-3-on kao braon tečnost. Tečnost se dalje prečisti opadajućom destilacijom na 70 °C da se dobije biciklo[3.1.0]heksan-3-on kao bledo žuta viskozna tečnost, 125 g (62%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 2.61 -2.54 (m, 2H), 2.17 - 2.12 (m, 2H), 1.54 - 1.46 (m, 2H), 0.92 - 0.86 (m, 1H), -0.01 - -0.08 (m, 1H); GCMS: M/Z = 96.1.

Izrada 2-(2,2-difluoroacetil)biciklo[3.1.0]heksan-3-ona

[0031]

[0032] U izmešani rastvor biciklo[3.1.0]heksan-3-ona (125 g, 1274 mmol) u THF (1500 mL) se u atmosferi N2na -78 °C dodaje LDA (2.0 M u THF, 0.701 L, 1402 mmol). Rastvor se meša 1 h na -78 °C. U rastvor se polako u toku 30 minuta dodaje rastvor etildifluoroacetata (174 g, 1402 mmol) u THF (300 mL), održavajući temperaturu na -78 °C. Reaktivna smeša se ostavi da se zagreje na 27 °C i nakon toga meša 1 h. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 20% aceton/heksan, Rf = 0.3, UV -aktivni). Reaktivna smeša se neutrališe dodavanjem vodenog rastvora HCl (1N, 2000 mL). Smeša se meša 30 min i nakon toga se ekstrahuje sa EtOAc (3 x 1000 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu sa slanim rastvorom (1000 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4i filtriraju. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije 2-(2,2-difluoroacetil)biciklo[3.1.0]heksan-3-on kao bledo žuta viskozna tečnost, 180 g (71%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 6.18 (t, J= 54.8 Hz, 1H), 2.70 - 2.62 (m, 1H), 2.35 (d, J= 19.4 Hz, 1H), 2.14 (br s, 1H), 1.26 - 1.21 (m, 1H), 1.04-1.03 (m, 1H), 0.22-0.21 (m, 1H), LCMS: M/Z = 173.17).

Izrada etil 2-(3-(ditluorometil)-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetata.

[0033]

1

[0034] U izmešani rastvor 2-(2,2-difluoroacetil)biciklo[3.1.0]heksan-3-ona (180 g, 910 mmol) u etanolu (2 L) se u atmosferi N2na 27 °C doda etil 2-hidrazinilacetat hidrohlorid (422 g, 2729 mmol) a nakon toga sumporna kiselina (20 mL, 375 mmol). Smeša se meša 30 min i nakon toga se zagreje na 100 °C i meša 16 h. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 20% aceton/heksan, Rf = 0.3, UV-aktivni). Reaktivna smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se rastvori u EtOAc (2000 mL) i ispere sa vodom (2 x 1 L), slanim rastvorom (1.0 L), suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i nakon toga koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se podvrgne hromatografiji na koloni silika gela (pet.:aceton 100:0→98:2) da se dobije etil 2-(3-(difluorometil)-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetat kao beličasta čvrsta supstanca, 110 g (46%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 6.86 (t, J= 54.8 Hz, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.14 (q, J= 7.2 Hz, 2H), 2.88 - 2.79 (m, 1H), 2.76 - 2.68 (m, 1H), 2.14 - 2.04 (m, 2H), 1.19 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 1.10 - 1.03 (m, 1H), 0.14 (q, J= 4.3 Hz, 1H).

Izrada etil 2-(3-(difiuorometil)-5-okso-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetata.

[0035]

[0036] U izmešani rastvor etil 2-(3-(difluorometil)-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetata (110 g, 422 mmol) i Celite (395 g) u cikloheksanu (3.5 L) se na 0 °C u porcijama dodaje piridin dihromat (794 g, 2110 mmol). U smešu se u kapima u atmosferi azota dodaje terc-butil hidroperoksid (355 mL, 2130 mmol) u toku 10 min. Reaktivna smeša se zagreje na 27 °C i nakon toga meša 48 h na toj temperaturi. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 30% aceton/pet, Rf = 0.4, UV -aktivni). Reaktivna smeša se filtrira i filter pogača se ekstrahuje sa EtOAc (1000 mL). Filtrat se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom Na2S4O6(2x500 mL); zasićenim vodenim rastvorom FeSO4(300 mL); a nakon toga sa slanim rastvorom (500 mL). Organski sloj se suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje (150 g).

Izrada etil 2-(3-(difluorometil)-4,4a-dihidrospiro[ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-5,2’-[1,3]ditiolan]-1(3bH)-il)acetata.

[0037]

[0038] U izmešani rastvor etil 2-(3-(difluorometil)-5-okso-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetata (75 g, 269 mmol) u DCM (1500 mL) na 27 °C se u atmosferi azota dodaje etan-1,2-ditiol (43.0 mL, 511 mmol) a nakon toga se dodaje bor trifluorid sirćetna kiselina (72.6 mL, 511 mmol). Rastvor se meša 16 h. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 20% aceton/Pet, Rf = 0.35, UV -aktivni). Po završetku reakcije, reaktivna smeša se ohladi na 0 °C i neutrališe dodavanjem zasićenog vodenog rastvora NaHCO3(500 mL). Smeša se ekstrahuje sa DCM (2 x 1000 mL). Kombinovane organske supstance se isperu sa slanim rastvorom (1000 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije braon tečnost. Ovaj materijal se podvrgne hromatografiji na koloni silika gela (Pet.:EtOAc 95:5→90:10) da se dobije etil 2-(3-(difluorometil)-4,4a-dihidrospiro[ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-5,2’-[1,3]ditiolan]-1(3bH)-il)acetat kao beličasta čvrsta supstanca, 80 g (74%).<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 6.61 (t, J= 55.2 Hz, 1H), 5.00 - 4.85 (m, 2H), 4.29 - 4.19 (m, 2H), 3.55 -3.46 (m, 4H), 2.63 - 2.53 (m, 1H), 2.49 - 2.38 (m, 1H), 1.30 - 1.24 (m, 4H), 0.65 - 0.60 (m, 1H). LCMS M+H = 346.9.

Izrada etil 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[l,2-c]pirazol-1-il)acetata

[0039]

[0040] U izmešani rastvor 1,3-dibromo-5,5-dimetilimidazolidin-2,4-diona (26.3 g, 92 mmol) u DCM (20 mL) se na -70 °C u atmosferi N2dodaje HF-piridin (2.460 g, 24.83 mmol).

Rastvor se meša 30 min. U rastvor se doda rastvor etil 2-(3-(difluorometil)-4,4adihidrospiro[ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-5,2’-1,3]ditiolan]-1(3bH)-il)acetata (10 g, 25 mmol) u DCM (20 mL). Reaktivna smeša se ostavi da se zagreje na -40 °C i nakon toga se meša 1 h na toj temperaturi. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 30% EtOAc/Pet, Rf = 0.3, UV neaktivni). Reaktivna smeša se neutrališe dodavanjem zasićenog vodenog rastvora NaHCO3(200 mL). Smeša se zagreje na sobnu temperaturu i nakon toga ekstrahuje sa EtOAc (2 x 100 mL). Kombinovane organske supstance se isperu sa slanim rastvorom (50 mL); suše preko anhidrovanog Na2SO4; filtriraju; i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije braon čvrsta supstanca. Ovaj materijal se podvrgne hromatografiji na koloni silika gela (Pet.:EtOAc 100:0→75-25) da se dobije etil 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetat kao bledo-žuta čvrsta supstanca, 8.5 g (91%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 6.62 (t, J = 55.2 Hz, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.30 - 4.18 (m, 2H), 2.51 - 2.37 (m, 2H), 1.42 - 1.35 (m, 1H), 1.31 -1.23 (m, 3H), 1.14 - 1.08 (m, 1H). LCMS M+H = 293.07.

Izrada 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazolil)sirćetne kiseline

[0041]

[0042] U izmešani rastvor etil 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetata (15 g, 50 mmol) u THF (17 mL) i MeOH

1

(66 mL) na 0 °C u atmosferi N2doda rastvor LiOH (1.788 g, 74.7 mmol) u vodi (66 mL). Reaktivna smeša se ostavi da se zagreje na 27 °C i nakon toga meša 3 h na toj temperaturi. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 5% MeOH/DCM, Rf = 0.2, UV aktivni). Po završetku reakcije, reaktivna smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom; razblaži sa vodom (50 mL); i ispere sa EtOAc (2 x 250 mL) da se uklone nečistoće. Vodeni sloj se podesi na pH 2-3 koristeći vodeni rastvor HCl (1M), nakon toga se ekstrahuje sa EtOAc (3 x 1000 mL). Kombinovane organske supstance se suše preko anhidrovanog Na2SO4; filtriraju; i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetna kiselina kao beličasta čvrsta supstanca, 14 g (98%). LCMS M+H = 265.15.

Razdvajanje da se dobije 2-((3b5,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetna kiselina i 2-((3bR,4aS)3-(difluorometil)-5,5-olifluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklo-propa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetna kiselina

[0043]

[0044] 2-(3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetna kiselina (5.5 g) se rastvori u izopropanolu (20 mL). Rastvor se u porcijama podvrgne SFC asimetričnom razdvajanju kako sledi: Instrument = Thar 80; kolona = Chiralpak IC 30x250mm, 5 mikrona; rastvarač A = super kritični CO2; rastvarač B = izopropanol sa 0.5% izopropilamina (v/v); kompozicija eluenta = 70%A:30%B; brzina protoka = 65 g/min; pozadinski pritisak = 100 bara; temperatura = 30 °C; zapremina ubrizgavanja = 2.5 mL; detekcija = 220 nm.2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetna kiselina se sakupi kao pik koji eluira od 7.5 min do 14 min; 2-((3bR,4aS)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetna kiselina se sakupi kao pik koji eluira od 2.7 min. do 5.8 min. Za svaki enantiomer, dobijeni rastvor se koncentruje pod sniženim pritiskom a dobijene čvrste supstance se rastvore u EtOAc, nakon toga dva puta isperu sa vodenim rastvorom limunske kiseline (1M), nakon toga sa vodom a nakon toga sa slanim rastvorom. Organski rastvor se suši preko Na2SO4; filtrira; nakon toga koncentruje pod vakuumom da se dobije odvojeni enantiomer u 80-90% obnavljanja.

Izrada 3-bromo-6-hlor-2-fluorobenzonitrila

[0045]

[0046] U izmešani rastvor 3-bromo-6-hlor-2-fluorobenzaldehida (210.0 g, 0.89 mol, 1.0 equiv.) u vodi (2.1 L) se na sobnoj temperaturi doda hidroksilamin-O-sulfonska kiselina (175.15 g, 1.55 mol, 1.75 equiv.). Reaktivna smeša se zagreje na 50 °C i meša 18 h. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu i meša 1-1.5 h. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem a nakon toga isperu sa vodom. Vlažna čvrsta supstanca se suši pod vakuumom 12-15 h na 50 °C da se dobije 3-bromo-6-hlor-2-fluorobenzaldehid, 190.0 g (91%).

Izrada 7-bromo-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-amina

[0047]

[0048] U rastvor 3-bromo-6-hlor-2-fluorobenzonitrila (360.0 g, 1.55 mol, 1.0 equiv.) u etanolu (1.08 L) se doda metilhidrazin sulfat (1.11 kg, 7.73 mol, 5.0 equiv.) a nakon toga se na 25-35 °C doda trietilamin (1.3 L, 9.3 mol, 6.0 equiv.). Reaktivna smeša se zagreje na 110 °C i temperatura održava 15 h (reakcija se prati pomoću TLC). Po završetku reakcije smeša se ohladi na sobnu temperaturu. Doda se voda (3.0 L) i smeša se meša 1 h na sobnoj temperaturi.

1

Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i isperu sa vodom. Vlažna čvrsta supstanca se suši pod vakuumom 12-15 sati na 50 °C. Sirova čvrsta supstanca se prečisti hromatografijom na koloni (10% EA/heksani do 40% EA/heksani) da se dobije produkt kao bledo-žuta čvrsta supstanca. Prinos: 185.0 g (46.0 %).

Izrada N-(7-bromo-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)metansulfonamida

[0049]

[0050] U rastvor 7-bromo-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-amina (1.40 g, 5.37 mmol) u DCM (30 mL) se dodaje Huningova baza (3.75 mL, 21.5 mmol) a nakon toga se reakcija ohladi u ledenom kupatilui doda se metansulfonil hlorid (1.26 mL, 16.1 mmol). Reaktivna smeša se meša 1h na toj temperaturi (formira se precipitat). Smeša se nakon toga razblaži sa dihlormetanom (100 mL) i ispere sa vodom, 1 M HCl i slanim rastvorom, suši (Na2SO4), filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prenese u EtOH (30 ml) i 10 ml 20% vodenog rastvora NaOH. Dobijena smeša se zagreva sa toplotnim pištoljem dok ne postane homogeni rastvor i meša 30 min na rt. Smeša se razblaži sa vodom (80 mL) i zakiseli sa 1 N HCl (60 mL). Precipitat se filtrira, ispere sa vodom i suši pod vakuumom da se dobije naslovljeni produkt (1.5 g) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.48 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.24 (br s, 1H), 6.95 (d, J=7.9 Hz, 1H), 4.38 (s, 3H), 3.42 (s, 3H). LC/MS (M+H)<+>= 337.80.

Izrada N-(7-bromo-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamida

[0051]

1

[0052] U smešu N-(7-bromo-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)metansulfonamida (1.3 g, 3.84 mmol) i 1-(hlormetil)-4-metoksibenzena (0.625 mL, 4.61 mmol) u DMF (30 mL) se doda cezijum karbonat (1.626 g, 4.99 mmol) i smeša se zagreva 2 h na 80 °C. Smeša se sipa u vodu (100 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (50 ml, 2x). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom, suši preko MgSO4, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti sa Biotage (0~35% EtOAc-heksani) da se dobije naslovljeni produkt (1.5 g) kao bela pena.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.44 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.31 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.84 (d, J=8.5 Hz, 2H), 4.99 (br s, 1H), 4.76 (br s, 1H), 4.40 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.01 (s, 3H).

Izrada N-(7-amino-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamida

[0053]

[0054] Po referenci: Andersen, Jacob i saradnici, Synlett 2005 (14), 2209-2213. U smešu N-(7-bromo-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metan sulfonamida (600.0 mg, 1.308 mmol), bakar(I) jodida (49.8 mg, 0.262 mmol), natrijum askorbata (518 mg, 2.62 mmol) i (1R,2R)-N1,N2-dimetilcikloheksan-1,2-diamina (46.5 mg, 0.327 mmol) u NMP (10 mL) se doda rastvor natrijum azida (255 mg, 3.92 mmol) u vodi (2.0 mL). Smeša se nakon toga zatvori i zagreva 2.5 h u mikrotalasnom sistemu na 120 °C. Smeša se nakon toga filtrira kroz Celite ploču i ploča se ispere sa EtOAc. Filtrat se sipa u vodu (100 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (50 ml, 2x). Kombinovani organski sloj se ispere sa slanim rastvorom, suši preko MgSO4, filtrira i upari pod vakuumom. Ostatak se prečisti pomoću Biotage (5-100%

1

EtOAc/heksani) da se dobije naslovljeni produkt (400 mg) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 - 7.29 (m, 2H), 6.89 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.85 - 6.79 (m, 2H), 6.48 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.11 (br.s, 1H), 4.81 (br.s, 1H), 4.30 (s, 3H), 3.80 (br s, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.99 (s, 3H). LC/MS (M+H)<+>= 395.00.

Izrada 2-amino-6-(benziloksi)nikotinske kiseline

[0055]

[0056] Rastvor 2-amino-6-hlornikotinske kiseline (5 g, 29 mmol) i kalijum tercbutoksida (9.75 g, 87 mmol) u benzil alkoholu (97 mL) se zagreva 3 h na 120 °C. Nakon hlađenja na temperaturu sredine, u vodu se doda veoma tamna reaktivna smeša i ispere sa etrom (x3). Vodeni sloj se nakon toga zakiseli sa 0.5 M rastvorom limunske kiseline. Žutomrki precipitat se filtrira da se dobije produkt (4.4 g, 62%) koji se koristi u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.40 (br s, 1H), 7.94 (d, J=8.55 Hz, 1H), 7.06-7.52 (m, 5H), 6.04 (d, J=8.24 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H). LC/MS: m/z = 245.15 [M+1]<+>.

Izrada N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-amino-2-(3,5-difiuorofenil)etil]-7-hidroksi-4-okso-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-3-il}-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il]-N-[(4-metoksifenil)metil]metansulfonamida

[0057]

1

Faza 1:

[0058] U suspenziju (S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3,5-difluorofenil)propanoatne kiseline (5.49 g, 18.23 mmol) i 2-amino-6-(benziloksi)nikotinske kiseline (4.45 g, 18.23 mmol) u acetonitrilu (92 mL) (žuti rastvor) se na -25 °C doda piridin (9.83 mL, 122 mmol) a nakon toga 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioksatrifosfinan 2,4,6-trioksid ("T3P", 45.2 ml, 76 mmol). Reaktivna smeša (rastvor postaje bistar nakon dodavanja T3P) se meša od -25 °C do 10 °C u toku 4.5 h, nakon toga se dodaje N-(7-amino-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamid (6 g, 15.19 mmol) i smeša se meša 18 h uz zagrevanje na rt. Reaktivna smeša se razblaži sa etil acetatom, ispere sa 1N rastvorom NaOH, nakon toga vodom, nakon toga sa 0.5 M rastvorom limunske kiseline, nakon toga vodom, nakon toga suši preko Na2SO4i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se prečisti na silika gelu (330 g RediSep Gold kolona) koristeći 0-60 % etil acetat u heksanu za 15 CV, nakon toga ostavi 60% EtOAc za 10 CV. Željene frakcije se spoje i koncentruju da se dobije bledo žuta čvrsta supstanca (8.1 g, 9.14 mmol, 60.1 % prinos), smeša terc-butil N-[(1S)-1-[(3P,3P)-7-(benziloksi)-3-(4-hlor-3-{N-[(4-metoksifenil)metil]metansulfonamido}-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-okso-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-2-il]-2-(3,5-difluorofenil)etil]karbamata (glavno) i terc-butil N-[(1S)-1-[(3M,3M)-7-(benziloksi)-3-(4-hlor-3-{N-[(4-metoksifenil)metil]metansulfonamido}-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-okso-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-2-il]-2-(3,5-difluorofenil)etil]karbamata (sporedno). LC/MS: m/z = 886.25 [M+1]<+>.

Faza 2:

[0059] TFA (21.1 mL, 274 mmol) se doda u rastvor terc-butil (S)-(1-(7-(benziloksi)-3-(4-hlor-3-(N-(4-metoksibenzil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-okso-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)karbamata (produkt iz Faze 1, 8.1 g, 9.14 mmol) u dihlormetanu (45.7 mL). Smeša se meša 2 h na rt. Dobijeni bledo-žuti rastvor se koncentruje. Ostatak se prenese u etil acetat, nakon toga ispere tri puta sa 1 N rastvorom NaOH, nakon toga suši preko Na2SO4i nakon toga koncentruje pod vakuumom da se dobije uljani ostatak. Ostatak se prečisti na silika gelu (330 g RediSep Gold kolona) postupkom gradijenta Rastvarač A:Rastvarač B 65:35→0:100 (2 CV), nakon toga 0:100 (9 CV);

1

Rastvarač A = heksani; Rastvarač B = 9:9:2 heksani:etil acetat:MeOH. Prvi eluirani izomer (glavni) se sakupi i koncentruje pod vakuumom da se dobije N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil]-7- hidroksi-4-okso-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-3-il}-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il]-N-[(4-metoksifenil)metil]metansulfonamid (4.1 g, 5.89 mmol, 64.5 % prinos).<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.86 - 7.98 (m, 1 H) 7.15 - 7.37 (m, 4 H) 6.97 -7.06 (m, 1 H) 6.70 - 6.89 (m, 4 H) 6.40 - 6.48 (m, 1 H) 4.70 - 4.88 (m, 2 H) 3.41 - 3.81 (m, 7 H) 3.20 - 3.28 (m, 1 H) 3.08 - 3.12 (m, 3 H) 2.71 - 2.79 (m, 1 H) 1.69 - 2.00 (m, 2 H).

LC/MS: m/z = 696.20 [M+1]<+>.

Izrada N-((S)-1-((3P)-3-(4-hlor-3-(N-(4-metoksibenzil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-7-hidroksi-4-okso-3,4-dihidropirido[2,3-d],pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5- difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida

[0060]

[0061] U izmešani rastvor N-[(6P)-7-{2-[(1S)-1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil]-7-hidroksi-4-okso-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-3-il}-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il]-N-[(4-metoksifenil)metil]metansulfonamida (0.926 g, 1.330 mmol) u DMF (13 ml) se dodaju 2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetna kiselina (0.351 g, 1.330 mmol), 2-(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-il)- 1,1,3,3-tetrametilizouronijum heksafluorofosfat(V) ("HATU", 0.531 g, 1.397 mmol) i DIPEA (0.581 ml, 3.33 mmol). Reaktivna smeša se meša 2 h nakon čega se reaktivna smeša razblaži sa vodom i ekstrahuje sa etil acetatom.

Kombinovani EtOAc ekstrakti se isperu sa slanim rastvorom, suše preko Na2SO4i koncentruju pod vakuumom. Sirovi produkt se prečisti fleš hromatografijom na silika gelu koristeći 10-100% etil acetat u heksanima da se dobije N-((S)-1-((3P)-3-(4-hlor-3-(N-(4-

2

metoksibenzil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-7-hidroksi-4-okso-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamid (1.1 g, 88%) kao beličasta penasta čvrsta supstanca. LC/MS: m/z = 942.25 [M+1]<+>.

Izrada Primera 1: N-((S)-1-((3P)-3-(4-hlor-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamid

[0062]

[0063] Rastvor diizopropil (E)-diazen-1,2-dikarboksilata ("DIAD", 0.125 ml, 0.637 mmol) u THF (0.2 mL) se u kapima na rt dodaje u smešu N-(1-((3P)-3-(4-hlor-3-(N-(4-metoksibenzil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-7-hidroksi-4-okso-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida (0.2 g, 0.212 mmol)), 3,3,3-trifluoropropan-1-ola (0.073 g, 0.637 mmol) i trifenilfosfina (0.178 g, 0.679 mmol) u tetrahidrofuranu (2.1 mL). Reaktivna smeša se meša 18 h na rt i nakon toga koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti na silika gelu (24 g RediSep Gold kolona) koristeći kao gradijent 0-60 % etil acetat u heksanima za 15 CV i nakon toga zadržavanje na 60 % etil acetata u heksanima za 15 CV. Frakcije koje sadrže čist produkt se spoje i nakon toga koncentruju da se dobije žuta čvrsta supstanca. Ova čvrsta supstanca se prenese u smešu DCM (1 mL):TFA (0.5 mL); rastvor se ohladi na 0 °C; i u rastvor se doda trifluorometansulfonska kiselina (0.057 mL, 0.637 mmol). Smeša se meša 1 h i nakon toga koncentruju pod vakuumom. Ostatak se prenese u etil acetat; ispere sa 1 N rastvorom NaOH; ispere sa 0.5M rastvorom limunske kiseline; suši preko Na2SO4; filtrira; i nakon toga se koncentruje pod vakuumom. Ostatak se podvrgne hromatografiji na silika gelu (24 g RediSep Gold kolona) koristeći 0-60 % etil acetat u heksanima za 20 CV, nakon toga sa 60 % etil acetata za 10 CV. Frakcije koje sadrže čist produkt se spoje i nakon toga koncentruju pod vakuumom da se dobije N-(1-((6P)-3-(4-hlor-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamid (0.078 g, 0.081 mmol, 38.0 % prinos) kao braon čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, METANOL-d4) δ ppm 8.46 - 8.53 (m, 1 H) 7.28 - 7.34 (m, 1 H) 7.19 - 7.24 (m, 1 H) 7.03 - 7.09 (m, 1 H) 6.53 - 6.81 (m, 4 H) 4.80 (dd, J=5.96, 2.98 Hz, 3 H) 4.49 - 4.62 (m, 2 H) 3.58 - 3.62 (m, 3 H) 3.40 - 3.49 (m, 1 H) 3.22 -3.24 (m, 3 H) 3.06 - 3.14 (m, 1 H) 2.80 - 2.89 (m, 2 H) 2.37 - 2.44 (m, 2 H) 1.32 - 1.37 (m, 1 H) 0.96 - 1.01 (m, 1 H). LCMS postupak analize: kolona = Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 100 mm, 1.7 µm partikule; zapremina ubrizgavanja = 5.00 µL; brzina protoka = 0.80 mL/min; Rastvarač A = 95:5 voda:MeCN m/ 0.1% v/v mravlja kiselina; Rastvarač B = 5:95 voda:MeCN m/ 0.1% v/v mravlja kiselina; profil eluacije = početak %B: 0, kraj %B: 100, vreme gradijenta: 3.5 min. nakon toga zadržavanje na 100% B za 1 min.; talasna dužina detekcije 1 = 220 nm, talasna dužina 2 = 254 nm. LCMS vreme zadržavanja = 3.097 min; m/z = 918.05 [M+1]<+>.

Alternativna izrada N-(7-amino-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamida

[0064]

Šema sinteze:

[0065]

Faza 1: Izrada 2,6-dihlor-3-nitrobenzaldehida

[0066]

[0067] U rastvor sumporne kiseline (H2SO4) (5.63 L, 4.5 V) u bociu okruglog dna se na 0-5 °C u porcijama na ispod 15 °C dodaje 2,6-dihlorbenzaldehid (1.25 kg, 7.10 mol, 1.0 equiv.). Reaktivna smeša se meša 30 min na 0-5 °C. Rastvor sveže pripremljene nitracione smeše [dobijena od koncentrovane H2SO4(0.425 L, 0.34 V) i 70% HNO3(0.85 kg, 13.49 mol, 1.30 equiv.) na 0 °C] se dodaje u prethodno navedenu reaktivnu smešu na ispod 10 °C [Napomena: reakcija je blago egzotermna (3-6 °C); pa je poželjno da se dodavanje izodi na nižoj temperaturi]. Reaktivna smeša se meša 2-3 h na 5-10 °C. Po završetku reakcije (praćeno pomoću TLC), ista se neutrališe sa ledeno hladnom vodom (18.75 L, 15 V) na temperaturi nižoj od 25 °C. Nakon toga se reaktivna masa ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša 2 h. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i nakon toga se isperu sa vodom (2.5 L, 2.0 V). Preostala voda se iz čvrstih supstanci uglavnom ukloni zadržavajući filtriranje pod

2

vakuumom u toku 60-90 min. Sirovi vlažni čvrsti produkt se prvo suši u atmosferi vazduha; nakon toga u peći sa vrućim vazduhom od 50-55 °C u toku 10-12 h (sve dok sadržaj vlage ne bude manji od 5.0 %) da se dobije suvi naslovljeni produkt, 2,6-dihlor-3-nitrobenzaldehid (1.44 kg, 92% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.44 (s, 1H), 7.88 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J= 8.8 Hz, 1H).

Faza 2: Izrada 2,6-dihlor-3-nitrobenzonitrila

[0068]

[0069] (Faza-2a) U rastvor DMSO (5.9 L, 5.0 V)) u bocu okruglog dna se na na sobnoj temperaturi doda 2,6-dihlor-3-nitrobenzaldehid (1.17 kg, 5.31 mol, 1.0 equiv.). Nakon 30 min mešanja na sobnoj temperaturi, doda se hidroksilamin hidrohlorid (0.63 kg, 9.04 mol, 1.70 equiv.) i reaktivna smeša se meša 3 h na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije (praćeno pomoću TLC), reaktivna smeša se neutrališe dodavanjem vode sa ledom (18.0 L, 15.0 V) takvom brzinom da se temperatura održava na ispod 30 °C (uočeno je: nakon dodavanja vode formiraju se čvrste supstance). Reaktivna smeša se meša 60-90 min na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem; isperu sa vodom (2.5 L, 2.0 V); a nakon toga isperu sa smešom acetona i heksana (6.0 L, 1:1 odnos). Količina rezidualne zaostale vode se iz čvrstih supstanci ukloni zadržavajući filtriranje pod vakuumom u toku 60-90 min. Vlažna čvrsta supstanca se prvo suši na vazduhu a nakon toga suši 10-12 h u peći sa vrućim vazduhom na 50-55 °C (sve dok sadržaj vlage ne bude manji od 1.0 %) da se dobije suvi ciljani produkt, 2,6-dihlor-3-nitrobenzaldehid oksim (1.22 kg, 92% prinos) kao beličasta čvrsta supstanca. Sirovi produkt (koji sadrži 10-20% 2,6-dihlor-3-nitrobenzonitrila) se koristi direktno u sledećoj fazi bez daljeg prečišćavanja.

[0070] (Faza-2b) U izmešani rastvor sirovog oksima (izrada je prethodno opisana, 1.13 kg, 4.80 mol, 1.0 equiv.) u DCM (9.04 L, 8.0 V) se na 0-5 °C doda trietilamin ("TEA", 1.02 kg, 10.09 mol, 2.1 equiv.). Nakon 5 min mešanja, polako se na 15 °C dodaje metansulfonil hlorid (0.60 kg, 5.29 mol, 1.1 equiv.) (uočeno je: tokom dodavanja dolazi do egzotermne reakcije).

Nakaon toga se reaktivna smeša meša 30-45 min na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije (napredak reakcije se prati pomoću TLC; mobilna faza: 20% etil acetat u heksanima), reaktivna smeša se razblaži sa vodom (6.78 L, 6.0 V); organski sloj se izdvoji; i vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM (3.4 L, 3.0 V). Kombinovani organski slojevi se isperu sa slanim rastvorom (5.65 L, 5.0 V); suše preko Na2SO4; i koncentruju pod vakuumom. Dobijene sirove čvrste supstance se trituriraju sa heksanima (4.50 L, 4.0 V) na sobnoj temperaturi. Vlažni materijal se suši 5- 6 h u peći sa vrućim vazduhom na 50-55 °C da se dobije osušeni produkt, 2,6-dihlor-3-nitrobenzonitril (0.95 kg, 91% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.8 Hz, 1H).

Faza 3: Izrada 4-hlor-7-nitro-1H-indazol-3-amina

[0071]

[0072] U izmešani rastvor 2,6-dihlor-3-nitrobenzonitrila (750.0 g, 3.45 mol, 1.0 equiv.) u etanolu (7.5 L, 10.0 V) se na 15-20 °C polako dodaje hidrazin hidrat (519.0 g, 10.36 mol, 3.0 equiv.) uz održavanje temperature reaktivne smeše na ispod 25 °C (Primedba: dodavanje je blago egzotermno i nakon dodavanja će početi formiranje čvrste supstance). Temperatura reaktivne smeše polako raste do sobne temperature i nakon toga se smeša meša 3 h (napomena: količina čvrstih supstanci će se povećati tokom ovoga vremena). Po završetku reakcije (praćeno pomoću TLC), smeša se razblaži sa vodom (7.5 L, 10.0 V) i mešanje nastavi 1 h na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i nakon toga isperu sa vodom (2.25 L, 3.0 V). Vlažna čvrsta supstanca se ispere sa smešom aceton (1.875 L, 2.5 V) i heksani (1.875 L, 2.5 V) u odnosu 1:1. Količina zaostale vode se iz čvrstih supstanci ukloni zadržavanjem filtriranja pod vakuumom u toku 60-90 min. Vlažna čvrsta supstanca se na kraju suši u peći sa vrućim vazduhom 7-8 h na 50 °C (sve dok sadržaj vlage ne bude ispod 1.5%) da se dobije suvi produkt, 4-hlor-7-nitro-1H-indazol-3-amin (549.0 g, 75% prinos) kao čvrsta supstanca boje cigle.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.36 (bs, 1H), 8.20 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J= 8.40 Hz, 1H), 4.73 (bs, 2H).

2

Faza 4: Izrada 4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-amina

[0073]

[0074] U izmešani rastvor 4-hlor-7-nitro-1H-indazol-3-amina (500 g, 0.42 mol, 1.0 equiv.) u DMF (5.0 L, 10.0 V) se na 5-10 °C polako dodaje cezijum karbonat (Cs2CO3) (1.91 kg, 5.88 mol, 2.5 equiv.) uz održavanje temperature reaktivne smeše na ispod 10 °C. Nakon 5-10 minuta mešanja, doda se dimetil sulfat (326.3 g, 2.59 mol, 1.1 equiv.) uz održavanje temperature reaktivne smeše na ispod 10 °C (napomena: poželjno je sporo dodavanje da se dobije povoljnija regio selektivnost). Nakon toga se temperatura reakcije polako podiže do sobne temperature i mešanje se nastavi još 2 h na istoj temperaturi. Po završetku reakcije (praćeno pomoću TLC), reaktivna smeša se neutrališe dodavanjem ledeno hladne vode (15.0 L, 30.0 V) i dobijena smeša se nakon toga meša 6-8 h na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i nakon toga isperu sa vodom (1.5 L, 3.0 V). Vlažna čvrsta supstanca se ispere sa IPA (1.5 L, 3.0 V) a nakon toga sa heksanima (1.0 L, 2.0 V). Količina zaostale vode se iz čvrstih supstanci ukloni zadržavajući filtriranje pod vakuumom u toku 60-90 min.

Vlažna čvrsta supstanca se suši 7-8 h u peći sa vrućim vazduhom na 50 °C (dok sadržaj vlage ne bude ispod 1.0%). Izdvojeni materijal, 4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-amin (319.0 g, 60% prinos), se koristi u sledećoj fazi bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.97 (d, J= 8.32 Hz, 1H), 6.97 (d, J= 8.24 Hz, 1H), 4.63 (bs, 2H), 3.96 (s, 3H).

Faza 5: Izrada N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)metansulfonamida

[0075]

2

[0076] (Faza 5a) U rastvor 4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-amina (625.0 g, 2.76 mol, 1.0 equiv.) u DCM (6.25 L, 10.0 V) se na 0-5 °C doda trietilamin (TEA) (837.0 g, 8.27 mol, 3.0 equiv.); a nakon toga se doda 4-dimetilaminopiridin (DMAP) (20.60 g, 0.165 mol, 0.06 equiv.). Reaktivna smeša se meša 5-10 min, nakon toga se polako dodaje metansulfonil hlorid (MsCl) (790.0 g, 6.89 mol, 2.5 equiv.) uz održavanje temperature reaktivne smeše na ispod 10 °C. Reaktivna smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i nakon toga meša 1.5-2.0 h. Po završetku reakcije (praćeno pomoću TLC), smeša se razblaži sa vodom (6.25 L, 10.0 V) i nakon toga meša 15 min na sobnoj temperaturi. Organski sloj se izdvoji a vodeni sloj se ekstrahuje sa DCM (6.25 L, 10.0 V). Kombinovani organski slojevi se isperu sa slanim rastvorom (1.25 L, 2.0 V), suše preko Na2SO4i koncentruju da se dobiju sirove čvrste susptance. Čvrste supstance se trituriraju sa heksanima (1.25 L, 2.0 V) na sobnoj temperaturi da se dobije međuproizvod, N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(metilsulfonil)metansulfonamid, koji se direktno koristi u sledećoj fazi.

[0077] (ii) U izmešani rastvor N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(metilsulfonil)metansulfonamida (prethodno izrađen) u etanolu (10.5 L, 20.0 V) se na sobnoj temperaturi polako dodaje 5% vodeni rastvor NaOH (4.38 L, 7.0 V) [napomena: poželjno je sporo dodavanje levkom za ukapavanje]. Reaktivna smeša se meša na istoj temperaturi u toku 3 h. Po završetku reakcije (praćeno pomoću TLC) [izrada uzorka za TLC analizu: ~1.0 ml uzorka se zakiseli sa 2.0 N vodenim rastvorom HCl da se dostigne pH: 2-3, ekstrahuje se sa etil acetatom i organski sloj analizira pomoću TLC], reaktivna smeša se ohladi na 0-5 °C i pH se podesi na 2-3 dodavanjem 2.0 N vodenog rastvora HCl (3.13 L, 5.0 V) uz održavanje temperature reakcije na ispod 10 °C [napomena: do taloženja je došlo nakon dodavanja HCl i povećalo se uz mešanje]. Reaktivna smeša se zagreje na sobnu temperaturu i nakon toga meša 1.5-2.0 h. Dobijene čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i nakon toga isperu sa vodom (1.25 L, 2.0 V); a nakon toga isperu sa heksanima (1.25 L, 2.0 V). Količina zaostale vode se iz čvrstih supstanci ukloni zadržavajući filtriranje pod vakuumom u toku 60-90 min. Vlažni materijal se suši 6-7 h u peći sa vrućim vazduhom na 50 °C (dok sadržaj vlage ne bude ispod 1.0%) da se dobije suvi produkt, N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)metansulfonamid (640.0 g, 76%) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.05 (d, J= 8.32 Hz, 1H), 7.32 (bs, 1H), 7.17 (d, J= 8.28 Hz, 1H), 4.15 (s, 3H), 3.45 (s, 3H).

2

Faza 6: Izrada N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamida

[0078]

[0079] U smešu N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)metansulfonamida (635.0 g, 2.08 mol, 1.0 equiv.) i 1-(hlormetil)-4-metoksibenzena (359.0 g, 2.30 mol, 1.1 equiv.) u DMF (6.35 L, 10.0 V) se na sobnoj temperaturi doda kalijum karbonat (374.7 g, 2.70 mol, 1.3 equiv.). Reaktivna smeša se zagreje na 80-90 °C i održava 3 h na toj temperaturi. Po završetku reakcije (praćeno pomoću TLC), smeša se sipa u vodu sa ledom (19.05 L, 30.0 V) [napomena: bolje je sporo neutralisanje uz energično mešanje da se izbegne zgrudnjavanje jer produkt precipitira]. Dobijene čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i isperu sa vodom (1.90 L, 3.0 V); nakon toga se čvrste supstance isperu sa heksanima (1.27 L, 2.0 V). Količina zaostale vode se iz čvrstih supstanci ukloni zadržavajući filtriranje pod vakuumom u toku 60-90 min. Izdvojena čvrsta supstanca se rastvori u etil acetatu (12.7 L, 20.0 V) i doda se drveni ugalj (63.5 g). Smeša se zagreje na 60-70 °C i nakon toga meša 30-45 min na toj temperaturi.

Smeša se filtrira dok je još vruća (40-50 °C) kroz Celite ploču i Celite ploča se nakon toga ekstrahuje sa etil acetatom (3.17 L, 5.0 V). Kombinovani filtrati se koncentruju do sušenja pod sniženim pritiskom na temperaturi nižoj od 50 °C. U čvrste supstance se doda etil acetat (0.635 L, 1.0 V) na sobnoj temperaturi. Dobijena suspenzija čvrstog produkta se meša 30 min. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i nakon toga isperu sa heksanima (1.27 L, 2.0 V). Preostala voda se iz čvrstih supstanci ukloni zadržavajući filtriranje pod vakuumom u toku 45-60 min da se dobije produkt N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil) metan sulfonamid (705.0 g, 80% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.99 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.68 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.24 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 8.44 Hz, 2H), 4.95-4.76 (m, 2H), 4.17 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.01 (s, 3H).

Faza 7: Izrada N-(7-Amino-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamida

2

[0081] U izmešanu suspenziju cink praška (540.0 g, 8.23 mol, 10.0 equiv.) u smeši THF (3.50 L, 10.0 V) i vode (7.0 L, 20.0 V) se na sobnoj temperaturi doda amonijum hlorid (NH4Cl) (449.0 g, 8.23 mol, 10.0 equiv.). U smešu se doda N-(4-hlor-1-metil-7-nitro-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamid (350g, 0.823 mol, 1.0 equiv.) u THF (7.0 L, 20.0 V). Reaktivna smeša se meša 3-4 h na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije (praćeno pomoću procesa TLC/HPLC), smeša se razblaži sa etil acetatom (3.5 L, 10.0 V) i vodom (1.12 L, 2.5 V). Smeša se meša 15 min. Reaktivna smeša se filtrira kroz ploču Celite perlica sa etil acetatom (1.75 L, 5.0 V). Dvofazni filtrat se sakupi i faze se razdvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa etil acetatom (3.50 L, 10.0 V). Kombinovani organski slojevi se isperu sa slanim rastvorom (3.50 L, 10 V), suše preko Na2SO4i nakon toga koncentruju pod vakuumom da se dobije sirova čvrsta supstanca. U sirovi produkt se doda MTBE (3.25 L, 10 V) i suspenzija se meša 30 min na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem. Količina zaostale vode se iz čvrstih supstanci ukloni zadržavajući filtriranje pod vakuumom u toku 30-45 min. Vlažni produkt se 2 h suši u peći sa vrućim vazduhom (50 °C) da se dobije naslovljeni produkt, N-(7-amino-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamid (276.0 g, 85% prinos) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.29-7.26 (m, 2H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.42 (d, J = 7.80 Hz, 1H), 4.99-4.70 (m, 2H), 4.25 (s, 3H), 3.77 (s, 5H), 2.98 (s, 3H).

Izrada 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinske kiseline

[0082]

2

Šema sinteze:

[0083]

Faza 1: Izrada 2-amino-6-(benziloksi) nikotinske kiseline [0084]

[0085] U izmešani rastvor 2-amino-6-hlornikotinske kiseline (200 g, 1159 mmol) u benzil alkoholu (1400 mL, 13464 mmol) se na 26 °C u atmosferi N2doda kalijum tercbutoksid (390 g, 3477 mmol). Reaktivna smeša se zagreje na 120 °C i meša 16 h na toj temperaturi.

Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 10% MeOH u DCM, Rf = 0.5). Po završetku, reaktivna smeša se razblaži sa vodom (3 L) i ekstrahuje sa dietil etrom (2 x 1000 mL). Organski sloj se izdvoji i vodeni sloj se zakiseli do pH 4 koristeći vodeni rastvor limunske kiseline (0.5 M). Precipitirana čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem i nakon toga suši pod sniženim pritiskom da se dobije 2-amino-6-(benziloksi) nikotinska kiselina kao beličasta čvrsta supstanca (220 g, prinos = 72%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12.56 -12.32 (m, 1H), 7.97 - 7.91 (m, 1H), 7.52 - 7.41 (m, 2H), 7.38 - 7.11 (m, 5H), 6.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.39 - 5.31 (m, 2H). LCMS čistoća = 93%; m/z = 245.29 (M+H).

Faza 2: Izrada metil 2-amino-6-(benziloksi)nikotinata

[0086]

[0087] U izmešani rastvor 2-amino-6-(benziloksi)nikotinske kiseline (220 g, 901 mmol) u DMF (2.5 L) se na 26 °C u atmosferi N2polako dodaju kalijum karbonat (373 g, 2702 mmol) i jodmetan (0.282 L, 4504 mmol). Reaktivna smeša se meša 16 h na 27 °C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 40% EtOAc/Pet., Rf = 0.6). Po završetku, reaktivna smeša se razblaži sa vodom (5 L). Precipitirana čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem i nakon toga suši pod vakuumom da se dobije metil 2-amino-6-(benziloksi)nikotinat kao beličasta čvrsta supstanca (220 g, prinos= 92 %).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.42-7.40 (m, 2H), 7.39-7.35 (m, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 6.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 3.84 (s, 3H). LCMS čistoća = 97%, m/z = 259.30 (M+H).

1

Faza 3: Izrada metil 2-amino-6-hidroksinikotinata

[0088]

[0089] U izmešani rastvor metil 2-amino-6-(benziloksi)nikotinata (50 g, 190 mmol) u DCM (500 mL) se na 26 °C u atmosferi N2polako dodaju TFA (800 mL) i triflatna kiselina (25 mL, 282 mmol). Reaktivna smeša se meša 16 h na 26 °C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, EtOAc, Rf = 0.2). Po završetku, isparljive supstance se uklone pod vakuumom da se dobije sirovi produkt. Ovaj materijal se triturira sa dietil etrom (3 x 1000 mL) a precipitirana čvrsta susptanca se nakon toga izdvoji filtriranjem. U čvrstu supstancu se doda voda (2 L) i smeša se nakon toga meša 5 h. Čvrsta susptanca se sakupi filtriranjem i ispere sa vodom. Čvrsta susptanca se suši pod vakuumom da se dobije metil 2-amino-6-hidroksinikotinat kao beličasta čvrsta supstanca (25 g, prinos = 78%).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ = 10.92-10.76 (m, 1H), 7.65 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.43-6.87 (m, 2H), 5.51 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 3.69 (s, 3H). LCMS čistoća = 99.32%; m/z = 169.32 (M+H). Odsustvo TFA i triflatne kiseline u produktu je potvrđeno pomoću<19>F-NMR. Produkt se koristi direktno u sledećoj fazi bez dodatnog prečišćavanja.

Faza 4: Izrada metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata

[0090]

[0091] U izmešani rastvor metil 2-amino-6-hidroksinikotinata (50 g, 297 mmol) u THF (1000 mL) se na 27 °C u atmosferi azota doda trifenilfosfin (156 g, 595 mmol). Reaktivna smeša se

2

ohladi na 0 °C i u reaktivnu smešu se u kapima dodaje diizopropil azodikarboksilat ("DIAD" 116 mL, 595 mmol). Rastvor se meša 30 min. U rastvor se na 0 °C doda rastvor 3,3,3-trifluoropropan-1-ola (52.4 mL, 595 mmol) u THF (200 mL). Reaktivna smeša se nakon toga ostavi da se polako zagreje na 27 °C i nakon toga meša 16 h na toj temperaturi. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 10% EtOAc/Pet. Rf = 0.5). Po završetku, reaktivna smeša se razblaži sa vodom (500 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (2 x 500 mL). Kombinovane organske supstance se isperu sa vodom (500 mL) i nakon toga slanim rastvorom (500 mL). Organski sloj se suši preko anhidrovanog Na2SO4, filtrira i nakon toga koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije sirovi produkt kao žuta polu-čvrsta susptanca (100 g). Ovaj materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 5-10% EtOAc u pet.

Frakcije koje sadrže traženi produkt se spoje i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinat kao žuta tečnost (50 g, 60% prinos).

<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.21-6.85 (brs, 1H), 6.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.63-2.55 (m, 2H). Postupak LCMS analize: kolona = Acquity BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); Mobilna faza A = 0.05% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B = 0.05% mravlja kiselina u CAN; gradijent = vreme (min.) / %B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; temperatura kolone = 35 °C; brzina protoka = 0.6 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 2.03 minuta; uočeni jon = 265.15 (M+H); LCMS čistoća = 93%.

Faza 5: Izrada 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinske kiseline

[0092]

[0093] U izmešani rastvor metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata (50 g, 189 mmol) u tetrahidrofuranu (THF) (500 mL), metanolu (150 mL) i vodi (80 mL) se na 0 °C u atmosferi azota doda litijum hidroksid monohidrat (22.66 g, 946 mmol). Reaktivna smeša se meša 16 h na 50°C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 50% EtOAc/Pet. Rf = 0.3). Po završetku, reaktivna smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije vodeni ostatak. Ostatak se nakon toga zakiseli do pH 4 dodavanjem 1N rastvora HCl.

Dobijeni precipitat se sakupi filtriranjem i ispere sa vodom (500 mL), nakon toga sa nheksanom (400 mL) i nakon toga suši da se dobije 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinska kiselina kao beličasta čvrsta supstanca (45 g, 90% prinos).<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.47 (brs, 1H), 7.93 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.35 (brs, 2H), 5.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.44 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.84-2.73 (m, 2H). Produkt se koristi direktno u sledećoj fazi bez daljeg prečišćavanja.

Alternativna izrada 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinske kiseline

[0094]

Šema sinteze:

[0095]

4

Faza 1: Izrada 2-amino-6-fluoronikotinske kiseline

[0096]

[0097] Smeša NH3u vodi ("25% NH3u H2O ", 1 L, 4V) i izopropanolu (6.5 L, 26V) se na 0 °C prska amonijum gasom u toku 1 h. U smešu u autoklavu (25 L) se doda 2,6-difluoronikotinska kiselina (250 g, 1571 mmol). Nakon toga se reaktivna smeša meša 20 h na 105 °C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 80% EtOAc/Pet. Rf = 0.3). Po završetku, reaktivna smeša se ostavi da se ohladi na 20 °C i nakon toga koncentruje pod sniženim pritiskom na temperaturi ispod 20 °C do zapremine od 4-6V (1.5 L). Ostatak se rastvori u vodi (5 L) i zakiseli do pH 2-3 dodavanjem 2N rastvora HCl (700 mL) i nakon toga meša 2 h. Dobijeni precipitat se sakupi filtriranjem i ispere sa vodom (4000 mL), nakon toga sa n-heksanom (5000 mL) i nakon toga suši u vakuum pećnici na 50 °C da se dobije 2-amino-6-fluoronikotinska kiselina kao beličasta čvrsta supstanca (250 g, 92% prinos). Ovaj produkt se meša sa produktom drugih serija izrađenih po istom postupku da se dobije 2000 g kombinovanog produkta. Preostali rastvarač se iz čvrstih supstanci ukloni suspendovanjem čvrstih supstanci u toluenu (10 L) i nakon toga uklanjanjem toluena destilacijom. Dobijene čvrste supstance se suše 7 dana u vakuum pećnici na 60 °C da se dobije 2-amino-6-fluoronikotinska kiselina kao beličasta čvrsta supstanca (1.6 kg, 77% prinos).<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.94 (brs, 1H), 8.17 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.56 (brs, 2H), 6.25 (dd, J = 8.2, 2.8 Hz, 1H). LCMS postupak: kolona = Acquity BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um);

Mobilna faza A = 0.05% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B = 0.05% mravlja kiselina u acetonitrilu; gradijent = vreme (min) /%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; temperatura kolone = 35 °C; brzina protoka= 0.6 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 1.24 minuta; uočeni jon = 157.04 (M+H); LCMS čistoća = 96%.

Faza 2: Izrada metil 2-amino-6-fluoronikotinata

[0098]

[0099] U izmešani rastvor 2-amino-6-fluoronikotinske kiseline (150 g, 961 mmol) i kalijum karbonata (398 g, 2882 mmol) u DMF (1500 mL) se doda jodmetan (300 mL, 4804 mmol). Reaktivna smeša se meša 16 h na 27 °C u atmosferi azota. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 30% EtOAc/Pet. Rf = 0.7). Po završetku, reaktivna smeša se neutrališe dodavanjem ledeno hladne vode (5000 mL). Dobijeni precipitat se sakupi filtriranjem i ispere sa vodom (2000 mL), nakon toga sa n-heksanom (1000 mL) i nakon toga suši da se dobije metil 2-amino-6-fluoronikotinat kao braon čvrsta supstanca (120 g, 70% prinos).<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.20 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.54 (brs, 2H), 6.29 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 1H), 3.82 (m, 3H). LCMS postupak: kolona = Acquity BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); Mobilna faza A = 0.05% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B = 0.05% mravlja kiselina u acetonitrilu; gradijent = vreme (min) /%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; temperatura kolone = 35 °C; brzina protoka = 0.6 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 1.55 minuta; uočeni jon = 171.07 (M+H); LCMS čistoća = 96%. Produkt se koristi direktno u sledećoj fazi bez daljeg prečišćavanja.

Faza 3: Izrada metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinat i 3,3,3-trifluoropropil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata

[0100]

[0101] U izmešani rastvor metil 2-amino-6-fluoronikotinata (25 g, 147 mmol) i 3,3,3-trifluoropropan-1-ola (15.54 mL, 176 mmol) u THF (500 mL) se na 0 °C u atmosferi azota u porcijama dodaje natrijum hidrid (60% disperzija u ulju, 8.82 g, 220 mmol). Reaktivna smeša se meša 30 min na 0 °C i nakon toga ostavi da se polako zagreje na 27 °C i meša 16 h na toj temperaturi. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 10% EtOAc/Pet. Rf = 0.5). Po završetku, reaktivna smeša se ohladi na 0 °C i neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (300 mL). Smeša se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 500 mL). Kombinovane organske supstance se isperu sa slanim rastvorom (200 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i nakon toga koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinat kao žuta tečnost (40 g). U reakciji je takođe uočeno formiranje sporednog produkta transesterifikacije 3,3,3-trifluoropropil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata. LCMS postupak: kolona = Acquity BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); Mobilna faza A = 0.05% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B = 0.05% mravlja kiselina u acetonitrilu; gradijent = vreme (min)/%B: 0/97, 0.4/97, 2.5/2, 3.4/2, 3.5/97, 4.0/97; temperatura kolone = 35 °C; brzina protoka = 0.6 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 2.04 & 2.22 minuta; uočeni jon = 265.18 & 347.29 (M+H); LCMS čistoća = 57% metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata i 15% 3,3,3-trifluoropropil 2-amino- 6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinat. Ova smeša sirovog produkta se meša sa dve druge serije sirovog produkta izrađene na isti način (40 g i 50 g). Kombinovani materijal (130 g) se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 10-20% EtOAc u pet. Frakcije koje sadrže traženi produkt se spoje i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije 6:1 smeša metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata i 3,3,3-trifluoropropil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata kao bledo žuta tečnost (100 g, 90% prinos).<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.02-7.97 (m, 1H), 7.04-6.48 (m, 1H), 6.08-6.03 (m, 1H), 4.52-4.47 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 2.64-2.54 (m, 2H). LCMS postupak: kolona = Acquity BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); Mobilna faza A = 0.05% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B = 0.05% mravlja kiselina u acetonitrilu; gradijent = vreme (min)/%B: 0/97, 0.4/97, 2.5/2, 3.4/2, 3.5/97, 4.0/97; temperatura kolone = 35 °C; brzina protoka = 0.6 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 2.02 & 2.21 minuta; uočeni jon = 264.97 & 346.97 (M+H); LCMS čistoća = 66% metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata i 11% 3,3,3-trifluoropropil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata.

Faza 4: Izrada 2-Amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinske kiseline

[0102]

[0103] U izmešani rastvor metil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata i 3,3,3-trifluoropropil 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinata (6:1, 100 g, 310 mmol) u tetrahidrofuranu (THF) (800 mL), metanolu (300 mL) i vodi (200 mL) se na 27 °C u atmosferi azota doda litijum hidroksid monohidrat (37.2 g, 1552 mmol). Reaktivna smeša se meša 8 h na 50 °C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 50% EtOAc/Pet. Rf = 0.3). Po završetku, reaktivna smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom i dobijeni vodeni ostatak se nakon toga zakiseli do pH 4 dodavanjem 1N rastvora HCl. Dobijeni precipitat se sakupi filtriranjem i ispere sa vodom (2000 mL), nakon toga sa n-heksanom (1000 mL) i nakona toga suši da se dobije 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinska kiselina kao beličasta čvrsta supstanca (80 g, 97% prinos).<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.47 (brs, 1H), 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.33 (brs, 2H), 5.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.45 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.83-2.74 (m, 2H). LCMS postupak: kolona = Acquity BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); Mobilna faza A = 0.05% mravlja kiselina u vodi; Mobilna faza B = 0.05% mravlja kiselina u acetonitrilu; gradijent = vreme (min.)/%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; temperatura kolone = 35 °C; brzina protoka = 0.6 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 1.73 minuta; uočeni jon = 251.17 (M+H); LCMS čistoća = 94%. Produkt se koristi direktno u sledećoj fazi bez daljeg prečišćavanja.

Alternativna izrada Primera 1: N-((S)-1-((3P)-3-(4-hlor-1-metil-3-(metilsulfonamldo)-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamid

Faza 1: Izrada terc-Butil (S)-(1-(3-(4-hlor-3-(N-(4-metoksibenzil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)karbamata

[0107] U izmešani rastvor (S)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3,5-difluorofenil)propanoatne kiseline (62.3 g, 207 mmol) i 2-amino-6-(3,3,3-trifluoropropoksi)nikotinske kiseline (55 g, 207 mmol) u acetonitrilu (600 mL) se u atmosferi azota na -25 °C doda piridin (41.8 mL, 517 mmol). U dobijenu smešu se u kapima u toku 15 min dodaje 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioksatrifosfinan 2,4,6-trioksid ("T3P", 50% mt u EtOAc, 609 mL, 1033 mmol). Rastvor se meša 1 h na -25 °C, nakon toga se ostavi da se polako zagreje na 13 °C i meša 5 h. U rastvor se na 13 °C doda N-(7-amino-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)-N-(4-metoksibenzil)metansulfonamid (82 g, 207 mmol). Reaktivna smeša se nakon toga ostavi da se polako zagreje na 27 °C i nakon toga meša 16 h na toj temperaturi. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 40% EtOAc/Pet. Rf = 0.4). Po završetku, reaktivna smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se rastvori u EtOAc (500 mL) i nakon toga ispere sa vodenim rastvorom limunske kiseline (0.5M, 23 500 mL) a nakon toga sa vodenim rastvorom NaOH (1N, 3 x 500 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i nakon toga koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije sirovi produkt (180 g) koji se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 40-50% EtOAc u pet. Frakcije koje sadrže traženi produkt se spoje i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije tercbutil (S)-(1-(3-(4-hlor-3-(N-(4-metoksibenzil)metilsulfonamido)-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)karbamat kao beličasta čvrsta supstanca (85 g, 39% prinos). Produkt je smeša homosimetričnih atropizomera (diastereomera). LCMS postupak: kolona = Acquity BEH C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.7 um); Mobilna faza A = 0.05% mravlja kiselina u vodi;

Mobilna faza B = 0.05% mravlja kiselina u acetonitrilu; gradijent = vreme (min)/%B: 0/3, 0.4/3, 2.5/98, 3.4/98, 3.5/3, 4/3; temperatura kolone = 35 °C; brzina protoka = 0.6 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 2.46 minuta; uočeni jon = 892.53 (M+H); LCMS čistoća = 85%.

4

Faza 2: Izrada (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)metansulfonamida

[0108]

[0109] U izmešani rastvor terc-butil (S)-(1-(3-(4-hlor-3-(N-(4-metoksibenzil)metilsulfonamido)-1-metil-1H- indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)karbamata (85 g, 95 mmol) u DCM (300 mL) se na 0 °C doda trifluorosirćetna kiselina (TFA, 294 mL, 3810 mmol) a nakon toga triflatna kiselina (25.4 mL, 286 mmol). Rastvor se ostavi da se zagreje na 27 °C i meša 1 h u atmosferi azota. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (SiO2, 80% EtOAc/Pet. Rf = 0.3). Po završetku, isparljive supstance se uklone uz blago strujanje gasa azota. Ostatak se rastvori u EtOAc (1000 mL) i ispere sa 2N rastvorom NaOH (2 x 500 mL) i nakon toga slanim rastvorom (500 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i nakon toga koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije sirovi produkt koji se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 50-99% EtOAc u pet. Frakcije koje sadrže traženi produkt se spoje i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije (S)-N-(7-(2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)metansulfonamid kao bledo-žuta čvrsta supstanca (63 g). Materijal je smeša homoasimetričnih atropizomera (diastereomera) u odnosu 64:26 kako je utvrđeno sa LCMS. Ovaj produkt se meša sa tri dodatne serije produkata izrađenih po istom postupku. Kombinovani produkt (195 g) se rastvori u smeši metanol:acetonitril (80:20, 1300 mL) i ovaj rastvor se prečisti preparativnom-SFC koristeći naredni postupak: kolona = (R,R) Whelk-01 (250 x 30 x 5µ); eluent = CO2:MeOH (65:35); Brzina protoka = 90 g/min; pozadinski pritisak = 120 bara; Detekcija = 214 nm (UV); Vreme zadržavanja = 14 min; Zapremina injektovanja = 430 mg. Čist glavni pik se sakupi i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije pojedinačni stereoizomer (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)metansulfonamid kao beličasta čvrsta supstanca (113 g, 63% prinos).

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.42 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H) 7.03-6.97 (m, 1H), 6.75-6.70 (m, 2H), 4.73-4.69 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.58-3.52 (m, 1H), 3.28-3.24 (m, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.97-2.83 (m, 3H). LCMS postupak: kolona =XBridge C18 (75 mm x 4.6 mm, 3.5 µm); Mobilna faza A = 5 mM amonijum bikarbonat u vodi; Mobilna faza B= acetonitril; gradijent = vreme (min)/%B: 0/5, 0.5/5, 1.0/15, 4.0/98, 7.0/98, 7.5/5, 8.0/5; temperatura kolone =35 °C; brzina protoka = 1.3 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 4.03 minuta; uočeni jon = 672.07 (M+H); LCMS čistoća = 98%; HPLC čistoća = 98%; Asimetrična HPLC čistoća = 98%.

Faza 3: Izrada N-((S)-1-((3P)-3-(4-hlor-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamida

[0110]

[0111] U izmešani rastvor (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)metansulfonamida (55 g, 82 mmol) i 2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)sirćetne kiseline (22.70 g, 86 mmol) u etil acetatu (818 ml) se doda 2,6-lutidin (23.83 ml, 205 mmol). U smešu se u kapima dodaje 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioksatrifosfinan 2,4,6-trioksid ("T3P", 50% mt. u etil acetatu) (97 mL, 164 mmol) pri čemu unutrašnja temperatura raste od 17 °C do 24 °C. Smeša se meša 2 h na sobnoj temperaturi. Reakcija se neutrališe dodavanjem vode (500 mL). Faze se podele i organska faza se ispere sa vodom (500 mL), a nakon toga suši preko Na2SO4. Smeša se filtrira i filtrat se koncentruje do 1/4 originalne zapremine da se dobije sirovi produkt kao rastvor u etil acetatu.

[0112] Druga serija produkta se izradi po narednom postuku koji je modifikovan kako sledi: reakcija se izvodi koristeći (S)-N-((6P)-7-((3P)-2-(1-amino-2-(3,5-difluorofenil)etil)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)pirido[2,3-d]pirimidin-3(4H)-il)-4-hlor-1-metil-1H-indazol-3-il)metansulfonamid (53.4 g, 79 mmol) a količine svih drugih reagenasa su odgovarajuće prilagođene. Postupak se završava ispiranjem sa slanim rastvorom (300 mL) a nakon toga sušenjem preko MgSO4.

[0113] Sirovi produkti se kombinuju i nakon toga adsorbuju na Celite. Dobijeni prašak se podvrgne hromatografiji na siklika gelu (3 kg RediSep Gold kolona) uz eluiranje sa 30-85% etil acetata u heksanima. Frakcije koje sadrže traženi produkt se spoje i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije žuta pena. Materijal se podvrgne visokom vakuumu u toku 18h. Materijal se prevede u fini prašak koristeći tarionik i pistil i čvrste supstance se stave u vakuumsku pećnicu na 50 °C u toku 48 h da se dobije N-((S)-1-((3P)-3-(4-hlor-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamid kao žuti prašak (134.1 g, 90% prinos).<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 9.84 - 9.91 (1 H, m) 9.49 (1 H, d, J=8.34 Hz) 8.47 (1 H, d, J=8.35 Hz) 7.79 (1 H, d, J=7.75 Hz) 7.49 (1 H, d, J=8.05 Hz) 7.11 (1 H, d, J=8.64 Hz) 6.80 - 7.09 (2 H, m) 6.66 (2 H, dd, J=8. 20, 2.24 Hz) 4.69 - 4.75 (3 H, m) 4.57 (1 H, d, J=16.39 Hz) 4.48 (1 H, ddd, J=11.03, 8.35, 2.68 Hz) 3.51 (3 H, s) 3.42 (1 H, dd, J=14.01, 2.38 Hz) 3.20 (3 H, s) 3.05 (1 H, dd, J=14.01, 11.03 Hz) 2.89 - 2.99 (2 H, m) 2.42 -2.48 (2 H, m) 1.32 - 1.40 (1 H, m) 0.81 - 0.86 (1 H, m). LCMS postupak: kolona = Acquity UPLC BEH C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 um partikule); Rastvarač A = voda:MeCN (95:5) sa 0.1% v/v mravlja kiselina; Rastvarač B = MeCN:voda (95:5) sa 0.1% v/v mravlja kiselina; gradijent = vreme (min)/%B: 0/0, 3.5/100, 4.5/100; Brzina protoka = 0.8 mL/min. LCMS rezultat: vreme zadržavanja = 3.173 min; uočena masa = 917.95 (M+H). UPLC čistoća = 99.8%.

4

Imenovanje Primera 1:

[0114] Jedinjenje iz Primera 1 kako je prethodno izrađeno je homoasimetrični materijal koji sadrži aksijalnu asimetričnost. Aksijalna asimetričnost može da se opiše koristeći P/M nomenklaturu kako je detaljno dato u IUPAC Gold Book (doi:10.1351/goldbook.A00547). Međutim, u ovom vreme je raspoloživ samo ograničeni broj softverskog alata koji su sposobni da generišu hemijska imena koja sadrže P/M nomenklaturu i čak je raspoloživ samo mali broj opcija za konverziju hemijskih imena uz korišćenje ove nomenklature u strukturne prezentacije molekula. Prema tome, zbog jasnoće i pogodnosti niže je dato nekoliko naziva za Primer 1:

Naziv Primera 1 kako je generisano sa ChemDraw Ultra 12 (bez P/M nomenklature) je: N-((S)-1-(3-(4-hlor- 1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamid

Hemijski naziv Primera 1 kako je generisano sa JChem for Excel (uključujući P/M nomenklaturu) je:

N-[(1S)-1-[(3P,3P)-3-(4-hlor-3-metansulfonamido-1-metil-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3H,4H-pirido[2,3-d]pirimidin-2-il]-2-(3,5-difluorofenil)etil]-2-[(2S,4R)-9-(difluorometil)-5,5-difluoro-7,8-dia- zatriciklo[4.3.0.02,4]nona-1(6),8-dien-7-il]acetamid

Hemijski nazi generisan sa ChemDraw Ultra 12 sa ručnim dodavanjem P/M nomenklature je: N-((S)-1-((3P)-3-(4-hlor-1-metil-3-(metilsulfonamido)-1H-indazol-7-il)-4-okso-7-(3,3,3-trifluoropropoksi)-3,4-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-2-il)-2-(3,5-difluorofenil)etil)-2-((3bS,4aR)-3-(difluorometil)-5,5-difluoro-3b,4,4a,5-tetrahidro-1H-ciklopropa[3,4]ciklopenta[1,2-c]pirazol-1-il)acetamid

Uporedni testovi:

[0115] Jedinjenje iz Primera 1 je upoređivano sa jedinjenjem iz Primera 60.2 opisano u WO2018203235 (Šema 1) u brojnim testovima. U svrhu ovih poređenja izabrali smo da koristimo homoasimetrični materijal svakog jedinjenja zato što je ovaj nivo čistoće najreprezentativniji od svih koji bi se koristili u kliničkim ispitivanjima na ljudima. Posebno, ograničena rotacija oko navedene C-N veze imidazola dovodi do porasta atropizomera (diastereomera) i u Primeru 1 i u Primeru 60.2 koji mogu da se razdvoje hromatografijom i koji nisu interkonvertujući na sobnoj temperaturi. Prema tome, koristeći hromatografiju izolovali smo čist oblik stereoizomera opisanih u Šemi 2.

Šema 1

Primer 60.2 kako je opisano u WO

2018203235

Šema 2

Primer 60.2 opisuje stereohemiju Primer 1 iz ovog patenta opisuje homoasimetričnog materijala stereohemiju

korišćenog u opisu komparativnih homoasimetričnog materijala

testova korišćenog u opisu komparativnih

testova

4

Opšta procedura za kvantifikaciju jedinjenja preko LC-MS/MS:

[0116] Svi in vitro uzorci su ubrizgani na Exion LC 4500 Triple Quad™ LC-MS/MS sistem. Korišćena je analitička kolona Phenomenex C18 (C18, 4.6 mm x 50 mm, 5 µm) i održavana na sobnoj temperaturi. Mobilna faza A se sastoji od 0.1% (v/v) mravlje kiseline u MilliQ vode. Mobilna faza B se sastoji od 100% metanola. Brzina protoka je 1 mL/min. Gradijent je sledeći: Mobilna faza B je linerno rasla od 5% do 90% u toku 0.7 min, zadržavana sa 90% u toku 1.4 min i zadržavana sa 5% u toku 0.7 min.

[0117] Svi in vivo uzorci su ubrizgani na Triple Quad™ 6500 LC-MS/MS sistemu sa kolonama održavanim na 60°C. Mobilna faza A se sastoji od H2O, 1 mM NH4OAc, 0.025% mravlje kiseline. Mobilna faza B se sastoji od MeOH, 5mM NH4OAc. Brzina protoka je 0.6 mL/min. Kolona i gradijent eluacije su izabrani od jednog od niže opisanih opštih postupaka analize.

Opšta analiza postupak A:

[0118] Kolona = Waters X-Bridge BEH C18 (2.1 x 50 mm, 1.7 µm čestice); gradijent: vreme(min.)/%B = 0.0/10, 0.2/10, 0.8/90, 1.3/90, 1.31/10, 2.0/10.

Opšta analiza postupak B:

[0119] Kolona = Waters BEH C18 (2.1 x 50mm, 2.5 µm čestice); gradijent: vreme(min.)/%B = 0.0/10, 0.2/10, 0.8/90, 1.3/90, 1.31/10, 2.0/10.

Opšta analiza postupak C:

[0120] Kolona = Waters BEH C18 (2.1 x 50mm, 1.7 µm čestice); gradijent: vreme(min.)/%B = 0.0/2, 0.40/2, 0.7/65, 1.3/90, 1.9/90, 1.91/2, 2.5/2.

Procedura za merenje potencije i citotoksičnosti:

[0121] MT-2 ćelije, 293T ćelije i proviralni DNK klon NL4-3 virusa su dobijeni od NIH

4

AIDS Research i Reference Reagent Programa. MT-2 ćelije su prenete u RPMI 1640 medijum obogaćen sa 10% toplotom inaktiviranog seruma fetusa govečeta (FBS), 100 mg/ml penicilina G i do 100 jedinica/ml streptomicina.293T ćelije su prenete u DMEM medijum obogaćen sa 10% toplotom inaktiviranog FBS, 100 mg/mL penicilina G i 100 mg/mL streptomicina. Rekombinantni NL4-3 proviralni klon, u kome je deo nef gena zamenjen sa Renilla luciferaze genom, se koristi za dobijanje referentnog virusa korišćenog u ovom studijama. Rekombinantni virus je izrađen transfekcijom rekombinantnog NL4-3 proviralnog klona u 293T ćelije koristeći Transit-293 reagens transfekcije od Mirus Bio LLC (Madizon, WI). Supernatant se pokupi nakon 2-3 dana a količna prisutnog virusa se titrira u MT-2 ćelijama koristeći aktivnost enzima luciferaze kao marker merenja aktivnosti enzima luciferaze. Luciferaza se kvantifikuje korišćenjem substrata živih ćelija EnduRen od Promega (Madizon, WI). Antivirusne aktivnosti jedinjenja na rekombinantni virus se kvantifikuju merenjem aktivnosti luciferaze u MT-2 ćelijama inficiranih u toku 4-5 dana sa rekombinantnim virusom, u prisustvu serijskih razblaženja jedinjenja.

[0122] 50% efektivna koncentracija (EC50) se izračunava korišćenjem eksponencijalnog oblika jednačine srednjeg efekta (Fa) = 1/[1+ (EC50/koncentracija leka)m] (Johnson VA, Byington RT. Infectivity Assay. In Techniques in HIV Research, ed. Aldovini A, Walker BD.

71-76. New York: Stockton Press.1990).50% inhibitorna koncentracija (EC50) se izračunava korišćenjem eksponencijalnog oblika jednačine srednjeg efekta gde je procenat inhibicije = 1/[1 (EC50/koncentracija leka)m], gde je m parametar koji odražava nagib u krivoj koncentracija-odgovor.

[0123] Citotoksičnost jedinjenja i odgovarajuće CC50su određene korišćenjem istog protokola kako je opisano u antivirusnom ispitivanju izuzev što se koriste neinficirane ćelije.

Citotoksičnost se procenjuje na dan 4 u neinficiranim MT2 ćelijama koristeći XTT (2,3-bis[2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolijum-5-karboksianilid unutrašnja sot)-na bazi kolorimetrijske analize (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo).

Rezultati:

[0124] Potencije Primera 1 i Primera 60.2 su unutar greške inicijalnog anti-HIV virološkog testa (EC50Primer 1 = 25 ± 8 pM, EC50Primer 60.2= 18 ± 13 pM). Zabeleženo je da je EC50Primera 10.034 nM kada je inicijalno testiran, međutim, rezultati daljih testiranja su u proseku od 25 ± 8 pM. Izmerena CC50citotoksičnosti je >0.5 µM i > 10 µM za Primer 1 i

4

Primer 60.2, tim redom.

Procedura za merenje metabolizma u mikrozomima jetre:

[0125] Mikrozomi jetre od ljudi, pacova, pasa i majmuna se otope i razblaže do finalne koncentracije od 1 mg/mL u 100 mM puferu kalijum fosfata (pH 7.4). Test jedinjenja i kontrole se izrade kao 100x finalna koncentracija od 1 µM u 1:1 acetonitril:voda (v/v) i podele u mikrozomalnu smešu. Smeša se prethodno uz mućkanje inkubira 10 minuta na 37°C u vodenom kupatilu. Inkubacije se izvode u duplikatu. U inkubacije su uključene tri kontrole; varfarin, henacetin i verapamil. Nakon preinkubacije, reakcija se započinje sa NADPH za finalnu koncentraciju od 1 mM. Na 0, 5, 15, 30, 45 i 60 minuta, uzme se 25 µM uzorka i neutrališe sa 300 µM acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard (Telmisartan). Uzorci se vrtlože 5 minuta pri 1200 opm a nakon toga centrifugiraju 10 minuta pri 4000 opm. Alikvot od 100 µL supernatanta se trostruko razblaži sa vodom i ubrizga na Exion LC 4500 Triple Quad LC-MS/MS sistem. Rezultati se izražavaju kao procenat preostalog osnovnog uzorka i izračunava se iz odnosa oblasti pika test jedinjenja preostalog nakon svake vremenske tačke i poredi sa vremenom nula inkubacije.

Rezultati:

[0126] Primer 1 je šest puta stabilniji u mikrozomima jetre psa nego Primer 60.2 a Primer 1 je najmanje dva puta stabilniji u mikrozomima jetre majmuna nego Primer 60.2. Ovaj rezultat pokazuje da bi Primer 1 trebalo da bude značajno stabilniji nego Primer 60.2 na in vivo metabolizam psa i majmuna.

Tabela 1.

Procedura za merenje metabolizma u humanim hepatocitima:

4

[0127] Kriokonzervisani hepatociti u suspenziji od ljudi, majmuna, pasa, pacova i miševa se otope i razblaže u prethodno zagrejanom William-sovom medijumu E (pH 7.4). Alikvote suspenzije hepatocita se dodaju u radne rastvore test jedinjenja izrađene u prethodno zagrejanom William-sovom medijumu E (pH 7.4) da se dobiju finalne koncentracije od 0.5 µM u 0.5 x 106 ćelija po mililitru i ≤ 0.25% DMSO. Ovi uzorci se inkubiraju na 37°C sa 5% ugljen dioksida i mućkaju pri 200 opm. Inkubacije se izvode pojedinačno. U vremenskim tačkama 0, 10, 30, 60, 120 i 240 minuta, 50 µL alikvota inkubirane smeše se izdvoji i doda u 100 µL rastvora acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard i smeša se zavrtloži a nakon toga centrifugira na 4°C 15 minuta pri 3500 opm. Po završetku eksperimenta, uzorci se analiziraju pomoću LC-MS/MS. Rezultati metaboličke stabilnosti se izražavaju kao procenat preostalog osnovnog test jedinjenja. Ovaj procenat se izračunava deljenjem odnosa oblasti pika test jedinjenja nakon inkubacije (tx) sa odnosom oblasti pika test jedinjenja u vreme 0 (t0) neposredno pre inkubacije.

[0128] Konstanta brzine eliminacije (k, min<-1>) se izračunava preko nelinearne regresije dobijene preko sledeće jednačine:

gde:

C0je početna koncentracija predstavljena kao odnos oblasti pika (oblast pika test jedinjenja/oblast pika internog standarda);

Ctje koncentracija za t predstavljena kao odnos oblasti (oblast pika test jedinjenja / oblast pika internog standarda);

e je osnova prirodnog logaritma;

t je vreme (min);

k je konstanta brzine eliminacije (min<-1>).

[0129] Polu-život (t1/2, min) se izračunava po sledećoj jednačini:

4

gde:

k je konstanta brzine eliminacije (min<-1>).

[0130] In vitro unutrašnji klirens (CLint, mL/min/milion ćelija) se izračunava po sledećoj jednačini:

gde:

t1/2je poluživot;

n je broj ćelija po mL.

Rezultati:

[0131] Izračunato je da je polu-život Primera 1 u humanim hepatocitima >480 minuta dok je izračunato da je polu-život Primera 60.2 u humanim hepatocitima 350 minuta. Unutrašnji klirens Primera 60.2 u humanim hepatocitima je 0.465 mL/min/g jetre što je 1.5 puta brže od 0.312 mL/min/g jetre klirensa nađenog za Primer 1.

Procedura za merenje farmakokinetičkih parametara (PK) in vivo:

[0132] PK je ispitivan kod mužjaka CD1 miševa, Wistar Han pacova, Cynomolgus majmuna i bigl pasa. Dve grupe životinja (N = 3 po grupi) su primile test jedinjenje ili kao intravenoznu (IV) dozu (1 mg/kg) ili kao oralnu gavažu (5 mg/kg rastvor i suspenzija). Lek je formulisan u 90% PEG 400, 10% etanolu za IV primenu i u 90% PEG400, 5% etanolu za PO primenu. Uzorci krvi su uzimani u 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72 i 96 h nakon doze za IV; 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72 i 96 h nakon doze za oralnu primenu. Uzorci krvi su uzimani u K3EDTA epruvete i centrifugirani pri 1500 do 2000 x g da se dobije plazma.

Uzorci plazme su ostavljeni na -20°C do analize sa LC-MS/MS. Svi in vivo uzorci su ubrizgani na Exion LC 4500 Triple Quad™ LC-MS/MS sistem u kome se kolona održava na 60 °C a brzina protoka je 0.6 mL/min. Svi parametri LC-MS/MS analiza su snimljeni elektronskim putem u datotekama neobrađenih podataka. PK uzorci pacova IV, pasa IV, majmuna IV i majmuna PO su analizirani po postupku A opštih analiza. PK uzorci miševa IV, miševa PO i pasa PO su analizirani po postupku B opštih analiza. Uzorci pacova PO su analizirani po postupku C opštih analiza.

[0133] PK parameteti su dobijeni preko rezultata ne-kompartmentalnih analiza koncentracija u plazmi u odnosu na vreme (Phoenix WinNonlin v8.1). Pik koncentracije (Cmax) i vreme za Cmax(Tmax) su zabeleženi direktno iz eksperimentalnih posmatranja. Oblasti ispod krive za vreme nula do vremena poslednjeg uzorka [AUC0-T] i oblast ispod krive od vremena nula do beskonačno [AUCINF] su izračunate koristeći linearno-log trapezoidalno pravilo. Ukupan klirens plazme (CLTp), stacionarna zapremina distribucije (Vss), vidljiv polu-život eliminacije (T-HALF) i srednje vreme zadržavanja (MRT) su procenjeni nakon IV primene. Procene za AUC i T-HALF su izvršene pomoću minimum tri vremenske tačke sa koncentracijama koje mogu da se kvantifikuju. Apsolutna oralna bioraspoloživost (F) je procenjena kao odnos dozanormalizovaneAUC vrednosti nakon oralnih i IV doza.

Rezultati:

[0134] IV farmakokinetički (PK) parameteri Primera 1 i Primera 60.2 su izmereni kod četiri pre-kliničke vrste: miševa, pacova, pasa i majmuna. Primer 1 ispoljava poboljšani klirens kod sve četiri vrste u odnosu na Primer 60.2. Konzistentno sa rezultatima ispitivanja mikrozoma jetre koji su prethodno dobijeni, razlike u klirensu su mnogo značajnije za pse i majmune kod kojih je klirens povećan 4.9 puta i 2.6 puta, tim redom. Isto tako, polu-život Primera 1 u cirkulaciji kod pasa i majmuna je 3.4 puta i dva puta veći neko Primera 60.2, tim redom.

Tabela 2.

1

Tabela 3.

[0135] Pre nego što buduća medicina može da uđe u klinička ispitivanja na ljudima, bezbednost jedinjenja obično treba da se proceni na dve pretkliničke vrste: jedan glodar i jedan neglodar. Ove vrste su obično pacov i/ili pas ili majmun. Jedan cilj in vivo studije bezbednosti je da se dostignu koncentracije leka u cirkulaciji koje su mnogo puta veće nego što bi moglo da se očekuje ukoliko je ljudima data efikasna doza leka. Preklapanje između koncentracija leka postignutih u sudiji bezbednosti u odnosu na koncentracije leka koje bi bile očekivane kod osobe koja je uzela efikasnu dozu leka se naziva "margina". Dostizanje visokih margina u studiji bezbednosti je važno jer kako se margine povećavaju tako raste i poverenje da bi neželjeni događaj povezan sa lekom bio moguć, on bi bio primećen tokom pretkliničke procene bezbednosti.

[0136] Poboljšanje PK parametara kod pacova, pasa ili majmuna znači da bi bile potrebne manje doze jedinjenja da se dostigne visoka koncentracija leka u cirkulaciji za ove prekliničke vrste. Prema tome, doza Primera 1 data majmunu ili psu bi dostigla veće margine nego ukoliko im je data ista doza Primera 60.2. Zbog praktičnih ograničenja veličine doze, margina (i samim tim poverenje) koja bi mogla da se dostigne sa Primerom 1 u studiji procene bezbednosti kod ne-glodara je veća nego margina koja bi mogla da se postigne sa Primerom 60.2.

Procedure za alometrijsko skaliranje pre-kliničkih PK parametara da se dobije predviđanje doze za ljude:

[0137] Predviđanja doze za ljude su izvedena korišćenjem Phoenix WinNonlin (v 8.0) softvera i Microsoft Excela upotrebom ModelRisk dodatka za modeliranje populacije.

Procene za ljude za CLTp svakog jedinjenja su dobijene na osnovu prosečnog alometrijskog skaliranja rezultata miša, pacova, majmuna i psa IV (faktor skaliranja telesne težine od 0,75) i proseka (faktor skaliranja telesne težine od 1,0) od svih vrsta za Vss. Humani IV parametri (Vc, Ka, K12, K21, Kel) su određeni korišćenjem prosečnog vremena zadržavanja (MRT)

2

skaliranja od pretkliničkih vrsta (miš, pacov, pas i cino) korišćenjem procene Vss i CLTp kod ljudi. Absorpcija (Ka) je utvrđena dekonvulcijom (PO) ili iz polu-života (SC) kod predkliničkih vrsta (Ka = LN(2)/t1/2). Predviđena doza za ljude za PO i SC je izračunata sagledavanjem različitosti kod ljudi i izračunato je da pokriva 95% humane populacije.

Rezultati:

[0138] PK parametri pre-kliničkih vrsta se obično koriste za predviđanje PK parametara kod ljudi pre kliničkih ispitivanja na ljudima. Postupci korišćeni za ovo predviđanje su takozvana "alometrijska skaliranja" i generalno su razmatrana i primenjena u literaturi. Po alometrijskom skaliranju, predviđena oralna doza jedanput dnevno potrebna za održavanje efikasne koncentracije leka u plazmi kod ljudi je 7 puta manja za Primer 1 nego za Primer 60.2.

Posebno, predviđena QD PO doza Primera 1 za ljude je manja od 10 mg dok je predviđena QD PO doza Primera 60.2 za ljude veća od 30 mg.

[0139] Mada su unutrašnje reakcije leka (to jest, hipersenzitivne reakcije) nepredvidive i ozbiljne u prirodi i stoga predstavljaju značajan klinički problem, utvrđeno je da su lekovi dati u dnevnoj dozi od 10 mg ili manjoj retko kada ili nisu nikada povezani sa visokom incidencom unutrašnjih reakcija leka (Uetrecht, J. P. New Concepts in Immunology Relevant to Idiosyncratic Drug Reactions: The "Danger Hypothesis" i Innate Immune System. Chem. Res. Toxicol. 1999, 12(5), 387-395, DOI:10.1021/tx980249i).

Procedure za merenje farmakokinetičkih parametara u subkutanom in vivo eksperimentu:

[0140] Lek je formulisan u 1% Kolliphor P188/1% PEG3350/3.5% Mannitol/94.5% vode i nakon toga primenjen na Wistar Han pacovima kao subkutana injekcija u dozi od 20 mg/kg. Uzorci krvi su uzeti za 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 5, 7, 24, 48, 72, 96 h i nakon toga svaka 3 dana sve do 122 dana. Uzorci krvi su uzimani u K3EDTA epruvete i centrifugirani pri 1500 do 2000 x g da se dobije plazma. Uzorci plazme su ostavljeni na -20°C sve do analize pomoću LC-MS/MS.

Rezultati:

[0141] Pogodnost svakog jedinjenja za subkutanu (SC) primenu je procenjena u eksperimentu na pacovima u SC PK eksperimentu. Kako je određeno ovim eksperimentom, evidentni poluživot jedinjenja u plazmi je 13 dana za Primer 1 a 11.5 dana za Primer 60.2. AUC0-infinitiyza Primer 1 je 4,941 dana*ng/mL (2.89% AUC ekstrapolirane). AUC0-infinitiyza Primer 60.2 je 609 dana*ng/mL (12.8% of AUC ekstrapolirane). Bioraspoloživost je 93% za Primer 1 i 25% za Primer 60.2. Koncentracije leka su održavane ispod 7 ng/mL za sve životinje u toku 73 dana sa Primerom 1 a 24 dana sa Primerom 60.2 (Slika 1). Predviđene jednomesečne subkutane (Q1M SC) doze za ljude su izračunate koristeći evidentne polu-živote i bioraspoloživost dobijene od SC pacova PK u konjukciji sa predviđenim vrednostima klirensa kod ljudi dobijenih iz alometrijskog skaliranja. Predviđena Q1M SC doza potrebna za održavanje efikasne koncentracije leka u plazmi kod ljudi je 15 puta manja za Primer 1 nego za Primer 60.2.

Procedura za merenje indukcije citohroma P450 u kriokonzerviranim humanim hepatocitima:

[0142] Po uputstvima FDA ("In Vitro Metabolism- and Transporter- Mediated Drug-Drug Interaction Studies Guidance for Industry"), potencijal Primera 1 i Primera 60.2 da indukuju ekspresiju CYP2B6 je testiran koristeći hepatocite od ista tri pojedinačna donora (pre nego udruženih donora) a promene u vrednostima enzima mRNK su procenjene koristeći "postupak višestruke promene". U ovom testu, višestruka promena u mRNK vrednostima manjim od 2 puta se smatra negativnim rezultatom, dok se promena ≥ od 2 puta smatra pozitivnim rezultatom.

[0143] Jedinjenja su testirana u ispitivanju CYP indukcije koristeći indukcibilne kriokonzervisane humane primarne hepatocite od tri donora za određivanje potencijala da izazovu indukciju (kako je mereno povećanjem u transkripciji mRNK) CYP2B6. Test jedinjenja (0.12 do 30 µM finalne koncentracije) su inkubirana 48 sati sa primarnim humanim hepatocitima koji se prirodno ekspresuju u svim nuklearnim receptorima uključenim u regulaciju vrednosti ekspresije različitih CYP enzima. Sveži rastvori test jedinjenja i kontrola su razblaženi sa medijumom za analizu i dodavani svaka 24 sata u toku dva uzastopna dana, sa finalnom koncentracijom DMSO od 0.1%. Po završetku inkubacije, procenjeni su integritet monoslojeva ćelija, gustina ćelija i viabilnost da bi se ocenili efekti citotoksičnosti. Ćelije se nakon toga solubilizuju u puferu za lizu ćelija a ukupna RNK se prečisti iz svakog testiranog uzorka. Uzorci se nakon toga koriste u reverznoj transkripciji lančanih reakcija polimeraze (RT-PCR) za kvantifikaciju količine specifičnih mRNK vrsta koje enkodiraju humani

4

CYP2B6 gen.

[0144] Potencijal indukcije test jedinjenja i kontrola je upoređen sa poznatim CYP2B6 inducerom Phenobarbital (1000 µM). Rezultati ovog ispitivanja su ispoljeni kao višestruka indukcija. Višestruka indukcija se izračunava kao odnos nivoa mRNK u ćelijama tretiranim sa test jedinjenje u odnosu na ćelije tretirane samo sa DMSO (rastvarač kontrole), bazalnim nivoom mRNK i na taj način predstavlja indukcioni potencijal test jedinjenja. Vrednosti indukcije preklopa su korišćene za izračunavanje procenta vrednosti kontrolne aktivnosti, koje su nakon toga uklopljene u 4-parametarski logistički regresioni model da bi se odredile vrednosti EC50i Emax(ako je primećena indukcija). Paralelno je takođe procenjivana citotoksičnost da se izbegne lažno pozitivna CYP indukcija nastala zbog citotoksičnosti. Treba izbegavati procenu i tumačenje indukcionog potencijala CIP pri citotoksičnim koncentracijama..

Rezultati:

[0145] Nikakva citotoksičnost nije uočena sa bilo kojim jedinjenjem u bilo kojoj testiranoj koncentraciji (do 30 µM). Za Primer 1, negativni nalaz (nema indukcije) je nađen za sva tri donora. Za Primer 60.2, pozitivni nalaz (indukcija) je nađen sa 2 od 3 donora (EC50vrednosti od 1.5 µM i 1.8 µM).

[0146] Indukcija ekspresije CYP enzima je prepoznata kao osnovni uzrok interakcija lek-lek, što dovodi do povećanog klirensa leka žrtve čiji metabolizam zavisi od indukovanog CYP izooblika. Između CYP izooblika, CYP2B6 je posebno važan u kontekstu tretmana HIV zato što se efavirenz (EFV), lek široko korišćen za lečenje HIV (2019. godine uključen na listu osnovnih lekova Svetske zdravstvene organizacije) primarno metaboliše od strane CYP2B6 (Ward, B. A., Gorski, J. C., Jones, D. R., Hall, S. D., Flockhard, D. A., Desta, Z. The Cytochrome P4502B6 (CYP2B6) Is Main Catalyst of Efavirenz Primary i Secondary Metabolism: Implication for HIV/AIDS Therapy i Utility of Efavirenz as Substrate Marker of CYP2B6 Catalytic Activity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 287-300, DOI:

10.1124/jpet.103.049601

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje:
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što ima niže opisanu stereohemiju
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što ima niže opisanu stereohemiju
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je kako je niže opisano:
5. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa bilo kojim od patentih zahteva 1-3, naznačeno time što je to natrijumova so. .
6. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje ili farmaceutski prihvatljivu so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5..
7. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačena time što dalje uključuje farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. .
8. Kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili patentnim zahtevomm 7, naznačena time što je za oralnu primenu, za intramuskularnu injekciju ili za subkutanu injekciju.
9. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time što je za upotrebu u lečenju ili prevenciji ili smanjenju rizika od HIV infekcije kod ljudi.
10. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačeno time što se jedinjenje primenjuje oralno.
11. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačeno time što se jedinjenje primenjuje kao intramuskularna injekcija ili subkutana injekcija.
12. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačeno time što upotreba dalje uključuje primenu najmanje jednog drugog sredstva korišćenog za tretman HIV infekcije kod ljudi.
13. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačeno time što je najmanje jedno drugo sredstvo izabrano iz grupe koja sadrži abakavir, atazanavir, biktegravir, kabotegravir, dolutegravir, darunavir, doravirin, fostemsavir, lamivudin, maraviroc, rilpiverin, tenofovir dizoproksil, tenofovir, tenofovir afenamid, 5-648414, GSK3640254, antitelo N6LS i GSK3739937/VH3739937.
14. Jedinjenje ili farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je najmanje jedno drugo sredstvo izabrano iz grupe koja sadrži dolutegravir, lamivudin, fostemsavir, kabotegravir, antitelo N6LS i GSK3739937/VH3739937.
15. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je najmanje jedno drugo sredstvo kabotegravir.
16. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je najmanje jedno drugo sredstvo dolutegravir.
17. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
18. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time što je za upotrebu u lečenju HIV infekcije.