RS65351B1 - Fc-optimizovana anti-cd25 antitela za tumor-specifičnu depleciju ćelija - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak pripada oblasti imunoterapije kancera, i odnosi se na lečenje kancera, uključujući lečenje solidnih tumora, pri čemu lečenje uključuje upotrebu antitela na CD25.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Imunoterapija kancera podrazumeva upotrebu subjektovog sopstvenog imunskog sistema za lečenje ili prevenciju kancera. U imunoterapiji koristi se činjenica da kancerske ćelije na svojoj površini često imaju fino izmenjene molekule koje imunski sistem može da detektuje. Ovi molekuli, ili kancerski antigeni, najčešće su proteini, ali uključuju i molekule kao što su ugljeni hidrati. Imunoterapija, prema tome, podrazumeva provociranje imunskog sistema ovim ciljnim antigenima, kako bi napao tumorske ćelije. Međutim, maligni tumori, tačnije solidni tumori ili hematološki kanceri, mogu izbeći imunski nadzor različitim mehanizmima koji su svojstveni tumorskoj ćeliji i posredovani komponentama tumorskog mikrookruženja. Među ovim drugim, infiltracija tumora regulatornim T ćelijama (regulatory T cells, Treg ćelije ili Treg) i, specifičnije, nepovoljan balans efektorskih T ćelija (effector T cells, Teff) prema Treg (tj. nizak odnos Teff prema Treg), predloženi su kao kritični faktori (Smyth M et al., 2014, Immunol Cell Biol.92, 473-4).

[0003] Otkako su otkrivene, utvrđeno je da su Treg ćelije kritične u posredovanju imunske homeostaze i podržavanju uspostavljanja i održavanja periferne tolerancije. Međutim, u kontekstu kancera, njihova uloga je složenija. Kako kancerske ćelije ispoljavaju i sopstvene i sa tumorom udružene antigene, prisustvo Treg ćelija koje teže da priguše odgovore efektorskih ćelija, može doprineti progresiji tumora. Infiltracija Treg u uspostavljene tumore, prema tome, predstavlja jednu od glavnih prepreka za efikasne antitumorske odgovore i lečenje kancera uopšte. Smatra se da mehanizmi supresije koje koriste Treg značajno doprinose ograničenju ili čak neuspehu trenutno postojećih terapija, posebno imunoterapija koje se oslanjaju na indukciju ili potenciranje antitumorskih odgovora (Onishi H et al, 2012 Anticanc. Res.32, 997-1003).

[0004] Deplecija Treg kao terapijski pristup u lečenju kancera je pristup podržan studijama koje su pokazale doprinos Treg u uspostavljanju i progresiji tumora u mišjim modelima. Štaviše, u nekoliko vrsta humanih kancera infiltracija tumora Treg ćelijama bila je udružena sa lošijom prognozom (Shang B et al., 2015, Sci Rep.5:15179). U mišjim modelima je pokazano da Treg ćelije doprinose uspostavljanju i progresiji tumora i da njihovo odsustvo za rezultat ima odlaganje progresije tumora (Elpek et al., 2007 J Immunol. 178(11):6840-8; Golgher et al., 2002; Eur J Immunol. 32(11):3267-75, Jones et al., 2002 Cancer Immun. 22;2:1; Onizuka et al., 1999 Cancer Res. 59(13):3128-33.; Shimizu et al., 1999, J Immunol.163(10):5211-8). Kod ljudi, visoka infiltracija tumora Treg ćelijama i, važnije, nizak odnos efektorskih T (Teff) ćelija prema Treg ćelijama, udruženi su sa lošim ishodom kod velikog broja kancera kod ljudi (Shang et al., 2015). Nasuprot tome, visok odnos Teff/Treg ćelija udružen je sa povoljnim odgovorima na imunoterapiju kod ljudi i miševa (Hodi et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 3005-3010; Quezada et al., 2006, J Clin Invest.116(7):1935-45. Međutim, deplecija Treg u tumorima je složena i rezultati studija u ovoj oblasti bili su neusaglašeni.

[0005] CD25 je jedan od potencijalnih molekularnih ciljeva za postizanje deplecije Treg. CD25, poznat i kao alfa lanac visokoafinitetnog receptora za interleukin-2 (interleukin-2 high-affinity receptor alpha chain, IL-2Ra), konstitutivno se eksprimira u visokim nivoima na Treg ćelijama, i odsutan je ili se eksprimira u niskim nivoima na T efektorskim ćelijama i, prema tome, obećavajući je cilj za depleciju Treg. Interakcija IL-2/CD25 bila je predmet nekoliko studija u mišjim modelima, najveći broj njih je uključivao upotrebu PC61, antimišjeg antitela na CD25 proizvedenog u pacovu (Setiady Y et al., 2010. EurJ Immunol.40:780-6), Vezivanje za CD25 i funkcionalne aktivnosti ovog antitela upoređivani su sa onim panela monoklonskih antitela proizvedenih od strane različitih autora (Lowenthal J.Wet al., 1985. J. Immunol., 135, 3988-3994; Moreau, J.-L et al., 1987. Eur. J. Immunol. 17,929-935; Volk HD et al., 1989 Clin. exp. Immunol. 76, 121-5; Dantal J et al., 1991, Transplantation 52:110-5). Iako su originalne studije pokazale profilaktičku, ali ne i terapijsku aktivnost PC61, nedavne studije pokazale su da Fcoptimizovana verzija ovog anti-CD25 antitela dovodi do deplecije Treg unutar tumora i nudi značajnu terapijsku korist u nekoliko mišjih modela tumora (Vargas A et al., 2017, Immunity 48(6), 577-586). Raspoloživa anti-CD25 antitela kao što je PC61 blokiraju ili inhibiraju vezivanje IL-2 za CD25, kao što to čine i mnoga druga antimišja CD25 antitela, i većina njih je objavljena kao anti-humana CD25 antitela; vidi na primer WO2004/045512, WO 2006/108670, WO1993/011238, WO1990/007861 i WO2017/174331. Na primer, baziliksimab i daklizumab su antihumana CD25 antitela koja inhibiraju vezivanje IL-2 za CD25 i razvijena su za snižavanje aktivacije T-efektorskih ćelija. Baziliksimab je himerno mišje-humano CD25 antitelo trenutno odobreno za bolesti kalema protiv domaćina i daklizumab je humanizovano CD25 antitelo odobreno za lečenje multiple skleroze. Međutim, druga anti-CD25 antitela i dalje dopuštaju vezivanje IL-2 za CD25, to su na primer klon 7D4 (anti-mišje CD25), klon MA251 (anti-humano CD25) ili 7G7B6 (antihumano CD25) (Rubin et al,1985, Hybridoma 4(2) 91-102, Tanaka et al,1986, Microbiol. Immunol 30(4), 373-388). 7G7B6 korišćeno je kao istraživačko antitelo i predloženo je za ciljajuću komponentu za usmeravanje radionuklida ka CD25-eksprimirajućim limfomima (Zhang et al, 2009, Cancer Biother Radiopharm 24(3), 303-309).

[0006] Na primer, 7D4 je IgM antitelo pacova na CD25 miša, koje se široko koristi za detektovanje CD25-pozitivnih ćelija u prisustvu ili posle tretmana PC61 antitelom ili antitelima koja imaju slične vezujuće osobine (Onizuka S et al., 1999. Canc Res. 59, 3128-3133). Veoma malo dokumenata objavljuje neko funkcionalno svojstvo 7D4-IgM antitela, samog ili u poređenju sa PC61 (Kohm A et al., 2006, J Immunol.176: 3301-5; Hallett Wet al., 2008. Biol Blood Marrow Transplant 14:1088-1099; Fecci P et al., 2006 Clin Cancer Res. 12:4294-4305; McNeill A et al., 2007. Scand J Immunol 65: 63-9; Setiady Y et al., 2010. Eur. J. Immunol.40: 780-6; Couper K et al., 2007. J Immunol. 178: 4136-4146). Zaista, u stanju tehnike ne govori se o mogućnosti da se izotip ili druga strukturna svojstva 7D4 prilagode ili nekako modifikuju u cilju dobijanja poboljšanog antitela koje će se koristiti u terapiji kancera.

[0007] Međutim, sposobnost 7D4-IgM (kao takvog ili kao inženjerisanog antitela) ili bilo kojeg antihumanog CD25, samog ili u kombinaciji sa drugim antitelima ili drugim antikancerskim jedinjenjima, dizajniranog ili okarakterisanog da ima osobine vezivanja za CD25 slične onima koje ima 7D4 za CD25 miša, na primer 7G7B6 ili M-A251, nije detaljno evaluirana u pogledu optimizovane deplecije Treg ćelija unutar tumora. Kao što je gore bilo reči, infiltracija tumora Treg ćelijama, a posebno nizak odnos Teff ćelija prema Treg ćelijama, mogu dovesti do lošeg kliničkog ishoda. CD25 je identifikovan kao marker Treg ćelija i stoga bi mogao biti interesantan cilj za terapijska antitela namenjena depleciji Treg ćelija. Što je važno, CD25 je alfa podjedinica receptora za IL-2, a IL-2 je citokin ključan za Teff odgovore. Anti-CD25 antitela koja su do sada podvrgnuta kliničkim ispitivanjima, iako vrše depleciju Treg ćelija, blokiraju i IL-2 signalizaciju preko CD25.

[0008] U John H. Sampson et al, "A pilot study if IL-2Rα blocked during lymphopenia depletes regulatory T-cells and correlates with enhance immunity in patients with glioblastoma", PLOS ONE, 7(2):e31046 razmatra se randomizovana, placebom kontrolisana pilot-studija za ispitivanje sposobnosti anti-IL-2Rα Mab daklizumaba da vrši bezbednu i selektivnu depleciju Treg ćelija kod pacijenata sa glioblastomom, koji su lečeni sredstvom za depleciju limfocita, temozolomidom (temozolomide, TMZ). WO2014/145907 objavljuje postupke i kompozicije za modulisanje T ćelija, pri čemu modulacija uključuje supresiju ili indukovanje regulatornih T ćelija ili citotoksičnih T ćelija, anti-CD25 antitelima.

[0009] Ovi izumitelji su sada pronašli da takvo blokiranje IL-2 signalizacije ograničava Teff odgovore i da anti-CD25 antitelo koje ne blokira IL2 signalizaciju može vršiti efikasnu depleciju Treg ćelija, dopuštajući da IL-2 i dalje stimuliše Teff ćelije, pri čemu se obezbeđuju antitela koja ispoljavaju snažan antikancerski efekat. Prema tome, u struci postoji potreba za postupkom lečenja kancera, koji uključuje depleciju Treg ćelija, naročito uz omogućavanje da IL-2 stimuliše Teff ćelije, posebno korišćenjem odgovarajućih anti-CD25 antitela.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0010] Predmet za koji se traži zaštita je kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebe anti-CD25 antitela koja se karakterišu strukturnim elementima koji dopuštaju vezivanje sa CD25, bez suštinskog blokiranja IL-2 signalizacije preko CD25, i koja vrše efikasnu depleciju Treg, posebno unutar tumora. Strukturna i funkcionalna svojstva 7D4-lgM (opisana u odnosu na mišji CD25) modifikovana su kako bi se obezbedila antitela koja poseduju iznenađujuće poboljšana svojstva u smislu upotrebe za depleciju Treg i efikasnosti protiv tumora, kada se koriste sama ili u kombinaciji sa drugim antikancerskim sredstvima. Okarakterisana su i strukturna i funkcionalna svojstva drugih anti-CD25 antitela koja ne blokiraju IL2 signalizaciju preko CD25 i vrše efikasnu depleciju Treg. Ovi podaci mogu se upotrebiti za definisanje i generisanje dodatnih antihumanih antitela na CD25, sa uporedivim efektima protiv tumora kod humanih subjekata. U ovom tekstu, pozivanja na "anti-CD25 antitela" i slično, uključuju i njihove antigen-vezujuće fragmente, kao i varijante (uključujući afinitetno zrele varijante), ukoliko kontekst ne kazuje drugačije.

[0012] U prvom aspektu pronalaska, predmetni pronalazak obezbeđuje humano IgG1 anti-CD25 antitelo za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta, pri čemu pomenuti subjekt ima solidni tumor, i pri čemu pomenuto antitelo inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju testom fosforilacije STAT5, gde test fosforilacije STAT5 uključuje:

- kultivisanje PMBC ćelija u prisustvu anti-CD25 antitela u koncentraciji od 10 ug/ml u trajanju od 30 min i zatim dodavanje različitih koncentracija IL2 u trajanju od 10 min - permeabilisanje ćelija; i

- merenje nivoa STAT5 proteina fluorescentno obeleženim antitelom na fosforilisani STAT5 peptid, putem protočne citometrije.

[0013] Kada se u ovom tekstu pominju izrazi "ne blokira", "neblokirajući", "IL-2-neblokirajući", "bez blokiranja" i slična terminologija (u vezi sa odsustvom blokiranja vezivanja IL-2 za CD25 u prisustvu anti-CD25 antitela) oni obuhvataju primere izvođenja u kojima anti-CD25 antitelo ne blokira IL-2 signalizaciju preko CD25. Tačnije, u primerima izvođenja pronalaska, anti-CD25 antitelo upotrebljeno u pronalasku inhibira manje od 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, što se određuju testom fosforilacije STAT5.

[0014] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo specifično se vezuje za epitop humanog CD25, pri čemu epitop sadrži jednu ili više aminokiselinskih rezidua sadržanih u jednom ili više nizova amino-kiselina odabranih od amino-kiselina 150-163 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), amino-kiselina 166-186 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 70-88 iz SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTSSATR). Poželjno, epitop sadrži najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje deset, najmanje jedanaest, najmanje dvanaest, najmanje trinaest, najmanje četrnaest, najmanje petnaest, najmanje šesnaest, najmanje sedamnaest, najmanje osamnaest ili više aminokiselinskih rezidua sadržanih u jednom ili više aminokiselinskih nizova odabranih od amino-kiselina 150-163 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), amino-kiselina 166-186 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i/ili amino-kiselina 70-88 iz SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTSSATR).

[0015] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo specifično se vezuje za epitop humanog CD25, pri čemu epitop sadrži najmanje jednu sekvencu odabranu od: amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA), amino-kiselina 176-180 iz SEQ ID NO:1 (RWTQP), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

[0016] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo specifično se vezuje za epitop humanog CD25, pri čemu epitop sadrži najmanje jednu sekvencu odabranu od amino-kiselina pri čemu epitop sadrži najmanje jednu sekvencu odabranu od: amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA), amino-kiselina 166-180 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP), amino-kiselina 176-186 iz SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

[0017] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo specifično se vezuje za epitop humanog CD25, pri čemu epitop sadrži najmanje jednu sekvencu odabranu od: amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR), amino-kiselina 70 do 84 iz SEQ ID NO: 1 (NSSHSSWDNQCQCTS) i amino-kiselina 150 do 158 iz SEQ ID NO: 1 (YQCVQGYRA [0018] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR). U jednom primeru izvođenja anti-CD25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 150-160 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALH). U drugom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i aminokiselina 74-88 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR). U drugom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 150-163 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), amino-kiselina 166-180 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 74-88 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR).

[0019] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 176-180 iz SEQ ID NO:1 (RWTQP). U jednom primeru izvođenja, anti-CD-25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 166-180 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP). U jednom primeru izvođenja, anti-CD-25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 176-186 iz SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG).

[0020] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se specifično vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) i amino-kiselina 176-180 iz SEQ ID NO:1 (RWTQP). U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se specifično vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) i amino-kiselina 176-186 iz SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG). U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se specifično vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 150-163 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP) i amino-kiselina 166-180 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP).

[0021] U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR). U jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo se vezuje za epitop koji sadrži sekvencu amino-kiselina 70-84 iz SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTS).

[0022] Ovi izumitelji su iznenađujuće pronašli da su antitela koja se vezuju za određene epitope na CD25, uključujući ona koja kompetiraju sa 7G7B6 i/ili MA251 u vezivanju za CD25, korisna u lečenju kancera, posebno solidnih tumora. Takva antitela dopuštaju da se i dalje odvija IL-2 signalizacija preko CD25 za koji je vezano antitelo, i izumitelji su otkrili po prvi put da, pored toga što vrše depleciju Treg ćelija, antitela upotrebljena u predmetnom pronalasku omogućavaju Teff ćelijama da optimalno ispolje svoje antikancerske efekte, bar delom time što omogućavaju vezivanje IL-2 i signalizaciju preko CD25 eksprimiranog na Teff ćelijama.

[0023] Takva antitela poželjno imaju konstantnu disocijacije (Kd) za CD25 manju od 10<-7>M i/ili konstantu disocijacije za najmanje jedan aktivirajući Fcγ receptor manju od oko 10<-6>M. Poželjno, antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) za CD25 u rangu od 10<-8>ili 10<-9>ili 10<-10>ili 10<-11>ili 10<-12>ili 10<-13>ili nižu od toga. Najpoželjnije, anti-CD25 se karakteriše drugim svojstvima u vezi sa Fcγ receptorima, posebno anti-CD25 antitelo koje se vezuje za FcγRI, FcγRllc, i/ili FcγRllla sa višim afinitetom nego što se vezuje za FcγRllb:

[0024] Imajući u vidu upotrebu anti-CD25 antitela u terapijskim postupcima, ono može ispoljavati dodatna poželjna svojstva. Anti-CD25 antitelo je poželjno monoklonsko antitelo, poželjno humano, himerno, ili humanizovano antitelo. Pored toga, u pogledu svoje interakcije sa imunskim ćelijama i/ili drugim komponentama imunskog sistema u obavljanju aktivnosti, anti-CD25 antitelo može dodatno izazvati pojačani CDC, ADCC i/ili ADCP odgovor, po mogućnosti povećani ADCC i/ili ADCP odgovor, poželjnije povećani ADCC odgovor, u poređenju sa postojećim antihumanim CD25 kliničkim antitelima, daklizumabom i baziliksimabom. U nekim primerima izvođenja, anti-CD25 antitelo može izazvati smanjen CDC odgovor u poređenju sa postojećim antihumanim CD25 kliničkim antitelima, daklizumabom i baziliksimabom, poželjnije, anti-CD25 antitelo ne izaziva CDC odgovor.

[0025] Anti-CD25 antitelo upotrebljeno u ovom pronalasku (kako je uopšteno definisano ranije u ovom tekstu i detaljnije u Detaljnom opisu) može se upotrebiti u postupcima lečenja humanog subjekta, pri čemu se pomenuto anti-CD25 antitelo primenjuje kod subjekta. U primerima izvođenja pronalaska, subjekt ima solidni tumor (poželjno u upotrebi koja uključuje još i korak identifikovanja subjekta koji ima solidni tumor). Takve upotrebe mogu uključivati još i primenu dodatnog terapijskog sredstva kod pomenutog subjekta. U jednom primeru izvođenja, dodatno sredstvo može biti inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora pomenutog subjekta, na primer u vidu antitela koje se vezuje i inhibira protein kontrolne tačke imunskog odgovora. Poželjan inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora je PD-1 antagonist, koji može biti anti-PD-1 antitelo ili anti-PD-L1 antitelo. Uopštenije, anti-CD25 antitelo može se upotrebiti u postupcima deplecije regulatornih T ćelija u solidnom tumoru kod subjekta, koji uključuju korak primene pomenutog anti-CD25 antitela kod tog subjekta.

[0026] U još jednom aspektu, anti-CD25 antitelo upotrebljeno u pronalasku može se upotrebiti u lečenju kancera kod humanog subjekta, pri čemu pomenuti subjekt ima solidni tumor. Pomenuto antitelo može se primeniti u kombinaciji sa još jednim terapijskim sredstvom, poželjno još jednim sredstvom za terapiju kancera, na primer sa inhibitorom kontrolne tačke imunskog odgovora, poželjno antagonistom PD-1/PD-L1 puta, kancerskom vakcinom, i/ili se može upotrebiti u kombinaciji sa standardnim terapijama kao što su hemioterapija ili radioterapija.

[0027] U drugom aspektu pronalaska, predmetni pronalazak obezbeđuje kombinaciju anti-CD25 antitela kako je definisano ranije u ovom tekstu prema prvom aspektu pronalaska, i drugog antikancerskog jedinjenja (poželjno inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora ili drugo jedinjenje, kako je navedeno u Detaljnom opisu) za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta, pri čemu pomenuti subjekt ima solidni tumor, i antikancersko jedinjenje (na primer, inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora kao što je PD-1 antagonist ili citokin kao što je interleukin 2) može se primeniti istovremeno, zasebno ili sekvencijalno. Predmetna objava obezbeđuje i kit za upotrebu u lečenju kancera, koji uključuje anti- CD25 antitelo, kako je definisano ranije u ovom tekstu prema prvom aspektu pronalaska, i antikancersko jedinjenje (na primer, inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora kao što je PD-1 antagonist).

[0028] U aspektu predmetne objave, iako nije deo pronalaska prema patentnim zahtevima, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-CD25 antitelo kako je definisano ranije u ovom tesktu, u farmaceutski prihvatljivom medijumu. Takva kompozicija može sadržati antikancersko jedinjenje (na primer, inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora kao što je PD-1 antagonist).

[0029] U aspektu predmetne objave, iako nije deo pronalaska prema patentnim zahtevima, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži:

(a) prvu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za CD25; i

(b) drugu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za drugi antigen;

pri čemu anti-CD25 antitelo ne inhibira vezivanje interleukina-2 (IL-2) za CD25, i poželjno bispecifično antitelo je IgG1 antitelo koje se vezuje za najmanje jedan aktivatorski Fcγ receptor sa visokim afinitetom, i vrši depleciju tumor-infiltrirajućih regulatornih T ćelija. Poželjno, takva druga antigen-vezujuća komponenta vezuje se za antigen odabran od proteina kontrolne tačke imunskog odgovora, ili tumor-asociranog antigena, ili može biti, ili se bazirati na antihumanom antitelu na aktivatorski Fc receptor (anti-FcgRI, anti-FcgRIIa, anti-FcgRIII), ili antagonističkom antihumanom antitelu na FcγRlIb. Kao takva, druga antigen-vezujuća komponenta može da se veže za FcRllb. Alternativno, može s evezati za FcgRI, FcgRlla, i/ili FcgRIII, sa antagonističkom aktivnošću.

[0030] Poželjno, takvo bispecifično antitelo može sadržati drugu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za protein kontrolne tačke imunskog odgovora odabran iz grupe koja se sastoji od PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, VISTA, TIGIT, TIM3, PDL1, B7H3, B7H4, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1, GAL9, GITR, OX40, CD137, i ICOS. Takav protein kontrolne tačke imunskog odgovora se poželjno eksprimira na tumorskoj ćeliji. Poželjno, protein kontrolne tačke imunskog odgovora bira se od PD-1, PDL1, i CTLA-4. Druga antigen-vezujuća komponenta koja se vezuje za protein kontrolne tačke imunskog odgovora može biti sadržana u komercijalno dostupnom antitelu koje deluje kao inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora, na primer:

(a) u slučaju PD-1, anti-PD-1 antitelo može biti nivolumab ili pembrolizumab

(b) u slučaju PD-L1, anti-PD-L1 je atezolizumab;

(c) u slučaju CTLA-4, anti-CTLA-4 je ipilimumab.

[0031] Takvo bispecifično antitelo može biti obezbeđeno u bilo kojem komercijalno raspoloživom formatu, uključujući duotelo, BiTE DART, CrossMab, knobs-in-holes (ispupčenja i udubljenja), triomab, ili bilo koji drugi odgovarajući molekularni format bispecifičnog antitela ili njegovih fragmenata.

[0032] Alternativno, takvo bispecifično antitelo sadrži drugu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za tumor-asocirani antigen. U ovom alternativnom primeru izvođenja. takvi antigeni i odgovarajuća amtitela uključuju, bez ograničavanja CD22 (blinatumomab), CD20 (rituksimab, tositumomab), CD56 (lorvotuzumab), CD66e/CEA (labetuzumab), CD152/CTLA-4 (ipilimumab), CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/Epcam (edrekolomab), CD340/HER2 (trastuzumab, pertuzumab), i EGFR (cetuksimab, panitumumab).

[0033] Drugi predmeti pronalaska, uključujući dodatne definicije antihumanih CD25 antitela upotrebljenih u pronalasku (i antitela objave) i njihove upotrebe u postupcima za lečenje kancera, u farmaceutskim kompozicijama, u kombinacijama sa drugim antikancerskim jedinjenjima, u bispecifičnim antitelima, dati su u Detaljnom opisu i Primerima.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0034] Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebe humanih IgG1 anti-CD25 antitela u postupku lečenja ili prevencije kancera, kod subjekta, kada subjekt ima solidan tumor, koji uključuje korak primene antitela koje se vezuje za CD25 kod pomenutog subjekta, pri čemu se anti-CD25 antitela karakterišu strukturnim elementima koji omogućavaju vezivanje za CD25 bez interferiranja sa vezivanjem interleukina 2 ili signalizacijom preko CD25, i efikasnu depleciju Treg, posebno unutar tumora. Antitelo koje se vezuje za CD25, kako je definisano u predmetnom pronalasku, može se koristiti u lečenju ili prevenciji kancera, specifično solidnog tumora. U svim primerima izvođenja pronalaska, anti-CD25 antitelo inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju testom fosforilacije STAT5 pomenutim ranije u ovom tekstu.

[0035] Ovi izumitelji pronašli su da CD25 može da se cilja upotrebom anti-CD25 antitela koje ne inhibira (ili suštinski ne inhibira) vezivanje interleukina 2 za CD25 ili IL-2 signalizaciju preko CD25, da bi se izvršila deplecija regulatornih T ćelija u terapijskom kontekstu, na primer u uspostavljenom solidnom tumoru. Ovi izumitelji su pronašli da IL-2-neblokirajuća anti-CD25 antitela koja imaju izotip koji pojačava njihovo vezivanje za aktivatorske Fc gama receptore, dovode do efikasne deplecije tumor-infiltrirajućih regulatornih T ćelija, uz omogućavanje optimalnog odgovora Teff, što je terapijski pristup koji bi mogao, na primer, biti udružen (u kombinaciji sa bispecifičnim antitelima ili u okviru njih) sa drugim jedinjenjima koja ciljaju kancer, kao što su ona koja ciljaju protein kontrolne tačke imunskog odgovora, tumor-asocirani antigen, ili inhibitorni Fcγ receptor. Ovi podaci takođe omogućavaju da se upotreba anti-CD25 kombinuje sa interleukinom-2 u odgovarajućim dozama, za lečenje kancera.

[0036] CD25 je alfa lanac receptora za IL-2, i nalazi se na aktiviranim T ćelijama, regulatornim T ćelijama, aktiviranim B ćelijama, nekim NK T ćelijama, nekim timocitima, mijeloidnim prekursorima i oligodendrocitima. CD25 udružuje se sa CD122 i CD132 da bi se formirao heterotrimerni kompleks koji deluje kao visokoafinitetni receptor za IL-2. Konsenzusna sekvenca humanog CD25 prikazana je u nastavku, u SEQ ID NO:1 (Uniprot pristupni broj P01589; vanćelijski domen zrelog humanog CD25 koji odgovara amino-kiselinama 22-240, podvučen je i predstavljen kao SEQ ID NO:2):

[0037] Kako se koritsi u ovom tekstu, "antitelo koje se vezuje za CD25" odnosi se na antitelo koje je sposbno da se vezuje za CD25 podjedinicu receptora za IL-2. Ova podjedinica poznata je i kao alfa podjedinica receptora za IL-2. Takvo antitelo označeno je u ovom tekstu i kao "anti-CD25 antitelo".

[0038] Anti-CD25 antitelo je antitelo koje je sposobno da se specifično vezuje za CD25 podjedinicu (antigen) receptora za IL-2. Podrazumeva se da "specifično vezivanje", "specifično vezuje", i "specifično vezuju" označavaju da antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) za antigen od interesa manju od oko 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili 10<-13>M. U poželjnom primeru izvođenja, konstanta disocijacije je manja od 10<-8>M, na primer u rangu je 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili 10<-13>M.

[0039] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "antitelo" odnosi se na intaktne imunoglobulinske molekule, kao i na njihove fragmente koji sadrže antigen-vezujuće mesto, i uključuje poliklonske, monoklonske, genetički inženjerisane i na drugi način modifikovane forme antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na himerna antitela, humanizovana antitela, heterokonjugatska i/ili multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela, dijatela, trijatela, i tetratela), i antigen-vezujuće fragmente antitela, uključujući npr. Fab’, F(ab’)2, Fab, Fv, rlgG, polipeptid-Fc fuzije, jednolančane varijante (scFv fragmenti, VHH, Trans-bodies<®>, Affibodies<®>, shark jednodomenska antitela, jednolančana ili tandem-dijatela (TandAb<®>), VHH, Anticalins<®>, Nanobodies<®>, minitela, BiTE<®>, biciklični peptidni i drugi alternativni imunoglobulinski proteinski skafoldi). U nekim primerima izvođenja, antitelu može nedostajati kovalentna modifikacija (npr., vezani glikan) koju bi imalo da je proizvedeno prirodno. U nekim primerima izvođenja, antitelo može sadržati kovalentnu modifikaciju (npr., vezani glikan, detektabilna komponenta, terapijska komponenta, katalitička komponenta, ili druga hemijska grupa koja daje poboljšanu stabilnost ili primenjivanje antitela, kao što je polietilen glikol). U nekim primerima izvođenja, antitelo može biti u formi maskiranog antitela (npr. Probodies<®>). Maskirano antitelo može sadržati blokirajući ili "maskirajući" peptid koji se specifično vezuje za antigen-vezujuću površinu antitela i interferira sa vezivanjem antitela sa antigenom. Maskirajući peptid vezan je za antitelo linkerom koji može da se iseče (npr. proteazom). Selektivno sečenje linkera u željenom okruženju, tj. u tumorskom okruženju, omogućava maskirajućem/blokirajućem peptidu da se odvoji, čime se omogućava vezivanje sa antigenom u tumoru i ograničava potencijalna toksičnost. "Antitelo" može se odnositi i na antitela kamelida (antitela koja imaju samo teške lance) i molekule slične antitelima, kao što su natikalini (Skerra (2008) FEBS J 275, 2677-83). U nekim primerima izvođenja, antitelo je poliklonsko ili oligoklonsko, koje je generisano kao panel antitela, svako je udruženo sa jednom sekvencom antitela i vezuje se za manje ili više različite epitope u antigenu (kao što su različiti epitopi u vanćelijskom domenu humanog CD25 udruženi sa različitim referentnim antihumanim CD25 antitelima). Poliklonska ili oligoklonska antitela mogu biti obezbeđena u jednom preparatu za medicinske upotrebe, kako je opisano u literaturi (Kearns JD et al., 2015. Mol Cancer Ther.14:1625-36).

[0040] U jednom aspektu pronalaska, antitelo je monoklonsko. Antitelo može dodatno ili alternativno biti humanizovano ili humano. U još jednom aspektu, antitelo je humano, ili u svakom slučaju, antitelo koje ima format i svojstva koji omogućavaju njegovu upotrebu i primenu kod humanih subjekata. U aspektu pronalaska, antitela mogu biti humanizovane varijante afinitetno zrelih 7G7B6 ili MA251. Afinitetno zrelo antitelo ima najmanje 10% viši afinitet za CD25 i/ili CDR sekvence su najmanje 80% identične, poželjno 90% identične sa CDR roditeljske sekvence (važi za sve sekvence). Afinitetno zrelo antitelo je antitelo sa jednom ili više izmenjenih amino-kiselina u jednom ili više CDR, što rezultuje antitelom sa poboljšanim afinitetom za CD25 u poređenju sa roditeljskom linijom koja nema izmenjene amino-kiseline.

[0041] Antitela (antibody/-ies, Ab) i imunoglobulini (immunoglobulin/-s, Ig) su glikoproteini koji imaju iste strukturne karakteristike. Imunoglobulini mogu biti iz bilo koje klase, na primer IgA, IgD, IgG, IgE ili IgM. Imunoglobulini mogu biti iz bilo koje potklase, na primer IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. U primeru izvođenja pronalaska anti-CD25 antitelo je iz potklase humanog IgG1.

[0042] Fc region IgG antitela interaguje sa nekoliko ćelijskih Fcγ receptora (FcγR) da bi se stimulisali nishodni efektorski mehanizmi. Postoji pet aktivirajućih receptora, to su FcγRl (CD64), FcγRlla (CD32a), FcγRllc (CD32c), FcγRllla (CD16a) i FcγRIIIb (CD16b), i jedan inhibitorni receptor FcγRllb (CD32b). Komunikaciju IgG antitela sa imunskim sistemom kontrolišu i posreduju FcγR koji ka imunskom sistemu prenose informaciju koju su primili i prikupili od antitela, obezbeđujući vezu između urođenog i stečenog imunskog sistema, i posebno u kontekstu bioterapijskih sredstava (Hayes J et al., 2016. J Inflamm Res 9: 209-219).

[0043] Potklase IgG se razlikuju po svojoj sposobnosti da se vezuju za FcγR i ovo diferencijalno vezivanje određuje njihovu sposobnost da izazovu niz funkcionalnih odgovora. Na primer, kod ljudi, FcγRllla je glavni receptor uključen u aktivaciju ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), a IgG3, za kojim odmah sledi IgG1, pokazuju najveće afinitete za ovaj receptor, što odražava njihovu sposobnost da snažno indukuju ADCC. Iako je pokazano da se IgG2 slabo vezuje za ovaj receptor, nađeno je takođe da anti-CD25 antitelo sa humanim IgG2 izotipom vrši efikasnu depleciju Treg.

[0044] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo se vezuje za FcγR sa visokim afinitetom, poželjno za aktivirajući receptor sa visokim afinitetom. Poželjno, antitelo se vezuje za FcγRl i/ili FcγRlla i/ili FcγRllla sa visokim afinitetom. U posebno poželjnom primeru izvođenja, antitelo se vezuje za najmanje jedan aktivatorski Fcγ receptor sa konstantom disocijacije nižom od oko 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M.

[0045] U jednom aspektu, antitelo je IgG1 antitelo, poželjno humano IgG1 antitelo, koje je sposobno da se veže za najmanje jedan Fc aktivirajući receptor. Na primer, antitelo može da se veže za jedan ili više receptora odabranih od FcγRl, FcγRlla, FcγRllc, FcγRllla i FcγRlllb. U jednom aspektu, antitelo može da se veže za FcγRllla. U jednom aspektu, antitelo može da se veže za FcγRllla i FcγRlla i opciono FcγRl. U jednom aspektu, antitelo može da se veže za ove receptore sa visokim afinitetom, na primer sa konstantom disocijacije nižom od oko 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M.

[0046] U jednom aspektu, antitelo se vezuje za inhibitorni receptor, FcyRllb, sa niskim afinitetom. U jednom aspektu, antitelo se vezuje za FcγRllb sa konstantom disocijacije višom od oko 10<-7>M, višom od oko 10<-6>M ili višom od oko 10<-5>M.

[0047] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, anti-CD25 antitelo je iz IgG1 potklase i ima ADCC i/ili ADCP aktivnost, kako je bilo reči u ovom tekstu, posebno u vezi sa ćelijama humanog porekla. Kao što je opisano ranije (Nimmerjahn F et al., 2005. Science, 310:1510-2), mlgG2a izotip (koji odgovara humanom IgG1 izotipu) vezuje se za sve FcγR podtipove sa visokim odnosom aktivatora prema inhibitoru (A/I), koji je u najmanju ruku iznad 1. Nasuprot tome, drugi izotipovi (kao rlgG1 izotip) vezuju se sa sličnim afinitetom samo za jedan aktivatorski FcγR (FcyRIII), kao i za inhibitorni FcγRllb, što rezultuje niskim odnosom A/I (<1). Ovaj niži odnos A/I može biti u korelaciji sa nižom deplecijom unutartumorskih Treg i nižom antitumorskom terapijskom aktivnošću izotipa. Uprkos poznatom profilu vezivanja antitela humanog IgG2 izotipa za FcγR, značajna deplecija Treg može se postići i sa humanim IgG2 izotipom anti-CD25 antitela. Stoga u jednom primeru izvođenja anti-CD25 antitelo je iz IgG2 potklase.

[0048] U poželjnom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo, kako je opisano u ovom tekstu, vezuje se za humani CD25, poželjno sa visokim afinitetom. Poželjno je takođe da se anti-CD25 antitelo vezuje za vanćelijski region humanog CD25, kao što je prikazano ranije u ovom tekstu. Konkretno, Primeri obezbeđuju eksperimentalne podatke dobijene za antitelo koje se sekretuje iz 7D4 hibridoma. Kao što je navedeno u odeljku Osnov pronalaska, ovo antitelo je specifično za mišji CD25 koji se, kao što je pokazano upoređivanjem panela monoklonskih antitela (uključujući PC61), vezuje za jedan od tri epitopa unutar mišjeg CD25, koji je različit od mesta vezivanja IL-2 i ne blokira vezivanje IL-2 za CD25. Na primer, pokazano je da se 7D4 vezuje za mišji CD25 na epitopu koji sadrži amino-kiseline 184 do 194 (REHHRFLASEE) u [Uniprot sekvenci P01590]). Testovi iz literature, koji uključuju 7D4 i mišji CD25 (na primer Setiady Y et al., 2010. Eur. J. Immunol. 40: 780-6; McNeill A et al., 2007. Scand J Immunol. 65:63-9; Teege S et al., 2015, Sci Rep 5: 8959), zajedno sa onima koji su objavljeni u Primerima, koji uključuju rekombinantna antitela koja sadrže CD25-vezujući domen 7D4 ili IL-2-neblokirajuća antihumana CD25 antitela nazvana MA-251 i 7G7B6, mogu se prilagoditi za karakterisanje onih humanih antitela koja prepoznaju humani CD25, koja imaju ista funkcionalna svojstva kao 7D4 na nivou interakcije i sa CD25 (posebno po tome što ne blokiraju vezivanje IL-2) i sa Fcγ receptorima (posebno po preferentnom vezivanju za jedan ili više humanih aktivirajućih Fcy receptora i efikasnoj depleciji Treg), kada se pridruži odgovarajući izotip, kao što je opisano u Primerima.

[0049] U jednom aspektu pronalaska, antitela kompetiraju sa antitelom 7G7B6 u vezivanju za humani CD25; i/ili vezuju se za isti epitop ili epitope koje prepoznaje antitelo 7G7B6.7G7B6 je monoklonsko antitelo koje ima mišji IgG2a izotip, koje prepoznaje humani CD25. 7G7B6 sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima sekvencu:

i varijabilni region lakog lanca koji ima sekvencu

[0050] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži teški lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu GFTLDSYGVS (SEQ ID NO:7) kao CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca; aminokiselinsku sekvencu GVTSSGGSAYYADSV (SEQ ID NO:8) kao CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, aminokiselinsku sekvencu DRYVYTGGYLYHYGMDL (SEQ ID NO:9) kao CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, i sadrži laki lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu RASQSISDYLA (SEQ ID NO:11) kao CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca; aminokiselinsku sekvencu YAASTLPF (SEQ ID NO:12) kao CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, aminokiselinsku sekvencu QGTYDSSDWYWA (SEQ ID NO:13) kao CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca. Antitelo može da kompetira sa 7G7B6 u vezivanju za humani CD25. Poželjno antitelo sadrži teški lanac koji uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu:

i laki lanac koji uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu:

[0051] U drugom primeru izvođenja, antitelo sadrži teški lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SGFSVDIYDMS (SEQ ID NO:15) kao CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca; aminokiselinsku sekvencu YISSSLGATYYADSV (SEQ ID NO:16) kao CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, aminokiselinsku sekvencu ERIYSVYTLDYYAMDL (SEQ ID NO:17) kao CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, i sadrži laki lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu QASQGITNNLN (SEQ ID NO:19) kao CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca; aminokiselinsku sekvencu YAASTLQS (SEQ ID NO:20) kao CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, aminokiselinsku sekvencu QQGYTTSNVDNA (SEQ ID NO:21) kao CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca. Antitelo može da kompetira sa 7G7B6 u vezivanju za humani CD25. Poželjno antitelo sadrži teški lanac koji uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu:

i laki lanac koji uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu:

[0052] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da kompetira sa 7G7B6 u vezivanju sa humanim CD25 sadrži teški lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu:

i sadrži laki lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu:

[0053] U jednom aspektu pronalaska, antitela kompetiraju sa antitelom MA251 u vezivanju za humani CD25; i/ili vezuju se za isti epitop ili epitope koje prepoznaje antitelo MA251. MA251 je monoklonsko antitelo koje ima mišji izotip, koje prepoznaje humani CD25. MA251 sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima sekvencu:

i varijabilni region lakog lanca koji ima sekvencu:

[0054] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da kompetira sa MA251 u vezivanju za humani CD25 sadrži teški lanac koji uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

i sadrži laki lanac koji uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:

[0055] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25. U drugom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26. U drugom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U još jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33.

[0056] U jednom aspektu, antitela kompetiraju sa antitelom 7G7B6 i antitelom MA251 u vezivanju za humani CD25. U jednom aspektu, antitela se vezuju za isti epitop ili epitope koje prepoznaje 7G7B6 i koje prepoznaje MA251.

[0057] Kompeticija između 7G7B6 antitela ili MA251 antitela i još jednog antitela može se meriti, na primer kako se govori u Primerima i kako je poznato u struci. U nekim primerima izvođenja, kompeticija između dva antitela, na primer 7G7B6 ili MA251 i još jednog antitela određuje se dodavanjem još jednog antitiela u test i merenjem interakcije između 7G7B6 ili MA251 antitela i humanog CD25. Jedan takav test je test na bazi Octet sistema u kojem se određuje istovremeno vezivanje 7G7B6 ili MA251 antitela, još jednog antitela i rekombinantnog humanog CD25. Ako se detektuje vezivanje 2 antitela za rekombinantni humani CD25, antitela su nekompetirajuća. Alternativno, jedan takav test je enzimski imunotest (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) u kojem se detektuje vezivanje 7G7B6 ili MA251 antitela za rekombinantni humani CD25. Ako zapaženi signal opada posle dodavanja još jednog antitela (na primer opada za najmanje 75%), drugo antitelo je kompetitor sa 7G7B6 ili MA251 antitelom. Istovremeno vezivanje 7G7B6 ili MA251 antitela i još jednog antitela za ćelije koje eksprimiraju humani CD25 može da se detektuje i protočnom citometrijom.

[0058] U jednom aspektu, u pronalasku se koristi anti-CD25 antitelo koje se specifično vezuje za epitop humanog CD25, pri čemu epitop sadrži jednu ili više aminokiselinskih rezidua iz jednog ili više nizova amino-kiselina odabranih od amino-kiselina 150-163 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), amino-kiselina 166-186 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 70-88 iz SEQ ID NO:1 (NSSHSSWDNQCQCTSSATR). Poželjno, epitop sadrži najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet ili više rezidua iz odabranih nizova amino-kiselina. Poželjnije, epitop sadrži sekvencu odabranu od: amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA), amino-kiselina 176-180 iz SEQ ID NO:1 (RWTQP), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i aminokiselina 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS) i kombinacija istog. Ovi epitopi se razlikuju od mesta vezivanja IL-2 u humanom CD25 i antitela koja se vezuju za takav epitop, kako je opisano u Primerima, ne blokiraju vezivanje IL-2 za CD25.

[0059] U poželjnom primeru izvođenja, upotreba u postupku lečenja humanog subjekta koji ima kancer, uključuje korak primene anti-CD25 antitela upotrebljenog u pronalasku, kod subjekta, pri čemu pomenuti subjekt ima solidni tumor, i pri čemu je anti-CD25 antitelo humano IgG1 antitelo koje inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju testom fosforilacije STAT5 pomenutim ranije u ovom tekstu. i koje se vezuje za najmanje jedan aktivirajući Fcγ receptor odabran od FcγRl (CD64), FcγRllc (CD32c), i FcγRllla (CD16a) sa visokim afinitetom, i vrši depleciju tumorinfiltrirajućih regulatornih T ćelija. Poželjno, anti-CD25 antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) za CD25 manju od 10<-7>M, poželjno manju od 10<-8>M. Poželjnije, anti-CD25 antitelo vezuje se za humani CD25 obezbeđujući efekte na vezivanje IL-2 i depleciju Treg koji su slični onima koje pokazuje 7D4 na mišjem CD25 ili 7G7B6 i MA251 na humanom CD25. U još jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo vezuje se za Fcγ receptore uz odnos aktivatora prema inhibitoru (A/I) koji je viši od 1 i/ili vezuje se za FcγRl (CD64), FcγRllc (CD32c), FcγRllla (CD16a) i/ili FcγRIIa (CD32a) sa višim afinitetom nego što se vezuje za FcγRIIb (CD32b).

[0060] CD25-vezujući domen 7D4 antitela kloniran je i eksprimiran kao rekombinantni protein u fuziji sa odgovarajućim konstantnim regionom. Sekvenca CD25-vezujućeg domena 7D4 antitela, kao i njena specifičnost za određene epitope unutar vanćelijskog domena CD25 i/ili njene druge funkcionalne aktivnosti, mogu se upotrebiti za upoređivanje kandidatskih anti-CD25 antitela koja se generišu i pretražuju nekom od pogodnih tehnika (npr. nastanak panela hibridoma iz CD25-imunizovanih glodara ili stvaranje biblioteka rekombinantnih antitela i zatim pretraživanje ovih repertoara antitela pomoću fragmenata CD25 radi funkcionalne karakterizacije, kako je opisano u ovom tekstu). Anti-CD25 antitela koja se zatim identifikuju mogu se proizvesti i kao rekombinantna antitela, posebno kao cela antitela ili kao fragmenti ili varijante, koji su opisani u ovom tekstu.

[0061] Nativna antitela i imunoglobulini obično su heterotetramerni glikoproteini od oko 150000 daltona, sačinjeni od dva identična laka (light, L) lanca i dva identična teška (heavy, H) lanca. Svaki teški lanac ima na amino-terminusu varijabilni domen (VH) za kojim sledi nekoliko konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na amino-terminusu (VL) i konstantni domen na karboksi-terminusu.

[0062] Varijabilni regioni su sposobni da interaguju sa strukturno komplementarnim antigenskim ciljem i karakterišu se razlikama u aminokiselinskoj sekvenci u odnosu na antitela različite antigenske specifičnosti. Varijabilni regioni H ili L lanaca sadrže aminokiselinske sekvence sposobne da se specifično vezuju za antigenske ciljeve. Unutar ovih sekvenci nalaze se manje sekvence koje se označavaju kao "hipervarijabilne" zbog ekstremne varijabilnosti koja postoji među antitelima različite specifičnosti. Takvi hipervarijabilni regioni nazivaju se i "regioni koje određuju komplementarnost" ili "CDR" regioni (complementarity determining regions).

[0063] Ovi CDR regioni odgovorni su za osnovnu specifičnost antitela prema određenoj strukturi antigenske determinante. CDR predstavljaju nekontinuirane nizove amino-kiselina unutar varijabilnih regiona, ali, bez obzira na vrstu, utvrđeno je da su pozicije ovih kritičnih aminokiselinskih sekvenci u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca slične unutar aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona lanaca. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca svih antitela imaju po 3 CDR regiona, koji nisu u kontinuitetu jedan sa drugim (nazvana L1, L2, L3, H1, H2, H3) za odgovarajući laki (L) i teški (H) lanac. Prihvaćeni CDR regioni opisani su ranije (Kabat et al., 1977. J Biol Chem 252, 6609-6616).

[0064] Antitela upotrebljena u ovom pronalasku mogu funkcionisati preko citotoksičnosti zavisne od komplementa (complement-dependent cytotoxicity, CDC) i/ili ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i/ili ćelijama posredovane fagocitoze zavisne od antitela (antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP), kao i bilo kojeg drugog mehnaizma koji omogućava ciljanje, blokiranje proliferacije, i/ili depleciju Treg ćelija.

[0065] "Citotoksičnost zavisna od komplementa" (CDC) odnosi se na lizu antigeneksprimirajućih ćelija antitelom upotrebljenim u pronalasku, u prisustvu komplementa.

[0066] "Ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" (ADCC) odnosi se na ćelijama posredovanu reakciju u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. ćelije-prirodne ubice, (natural killer, NK ćelije), neutrofili, i makrofagi) prepoznaju antitelo vezano za ciljnu ćeliju i dovode do lize ciljne ćelije.

[0067] "Ćelijama posredovana fagocitoza zavisna od antitela" (ADCP) odnosi se na ćelijama posredovanu reakciju u kojoj fagociti (kao što su makrofagi) koji eksprimiraju Fc receptore (FcR) prepoznaju antitelo vezano za ciljnu ćeliju i dovode do fagocitoze ciljne ćelije.

[0068] CDC, ADCC i ADCP mogu se meriti korišćenjem testova koji su poznati i raspoloživi u struci (Clynes et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-6), i o njima će biti reči u primerima. Konstantni region antitela je važan za sposobnost antitela da fiksira komplement i posreduje u citotoksičnosti i fagocitozi zavisnim od ćelija. Prema tome, kako se razmatra u ovom tekstu, izotip antitela može se odabrati na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje u citotoksičnosti/fagocitozi.

[0069] Kako se razmatra u ovom tekstu, u primeru izvođenja pronalaska, koristi se anti-CD25 antitelo koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 i koje dovodi do deplecije Treg ćelija. Na primer, može se koristiti anti-CD25 antitelo koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25 i koje pobuđuje snažan CDC odgovor i/ili snažan ADCC i/ili snažan ADCP odgovor.

Postupci za povećanje CDC, ADCC i/ili ADCP poznati su u struci. Na primer, CDC odgovor može se povećati mutacijama u antitelu, koje povećavaju afinitet vezivanja sa C1q (Idusogie et al. (2001) J Immunol 166, 2571-5).

[0070] Kada se u ovom tekstu pominje "ne inhibira vezivanje interleukina-2 za CD25" to može alternativno da se iskaže kao da anti-CD25 antitelo nije IL-2-blokirajuće antitelo, ili da je "neblokirajuće" antitelo (u vezi sa neblokiranjem vezivanja IL-2 za CD25 u prisustvu anti-CD25 antitela), tj. antitelo ne blokira vezivanje interleukina-2 za CD-25 i, posebno, ne inhibira interleukin-2 signalizaciju u CD25-eksprimirajućim ćelijama. Pominjanje "neblokiranja", "neblokiranja IL2", "ne blokira", ili "bez blokiranja" i slično (u vezi sa neblokiranjem vezivanja IL-2 za CD25 u prisustvu anti-CD25 antitela) uključuje primere izvođenja u kojima anti-CD25 antitelo upotrebljeno u pronalasku ne blokira signalizaciju IL-2 preko CD25. To znači da anti-CD25 antitelo inhibira manje od 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela. Anti-CD25 IL-2-neblokirajuća antitela omogućavaju vezivanje za CD25 bez interferiranja sa vezivanjem IL-2 za CD25, ili bez suštinskog interferiranja sa vezivanjem IL-2 za CD25. Kada se u ovom tekstu pominje IL-2-neblokirajuće antitelo, to može alternativno da se iskaže kao anti-CD25 antitelo koje "ne inhibira vezivanje interleukina-2 za CD25" ili kao anti-CD25 antitelo koje "ne inhibira signalizaciju IL-2". Međutim, u svim primerima izvođenja pronalaska, antitelo inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju testom fosforilacije STAT5, pri čemu test fosforilacije STAT5 uključuje:

- kultivisanje PMBC ćelija u prisustvu anti-CD25 antitela u koncentraciji od 10 ug/ml u trajanju od 30 min i zatim dodavanje različitih koncentracija IL2 u trajanju od 10 min - permeabilisanje ćelija; i

- merenje fluorescentno obeleženog antitela na fosforilisani STAT5 peptid, protočnom citometrijom. Upotreba drugih anti-CD25 antitela izvan je okvira pronalaska za koji se zahteva zaštita.

[0071] Neka anti-CD25 antitela mogu dopustiti vezivanje IL-2 za CD25, ali i dalje blokirati signalizaciju preko CD25 receptora. Takva anti-CD25 antitela nisu unutar opsega ovog pronalaska. Umesto toga, anti-CD25 antitela koja ne blokiraju IL-2, dopuštaju vezivanje IL-2 za CD25 kako bi se omogućilo najmanje 75% od nivoa signalizacije preko CD25 receptora, u poređenju sa signalizacijom u odsustvu anti-CD25 antitela.

[0072] IL-2 signalizacija preko CD25 može se meriti postupcima koji se razmatraju u Primerima i koji su poznati u struci. Upoređivanje IL-2 signalizacije u prisustvu i odsustvu sredstva koje je anti-CD25 antitelo može se dešavati pod istim ili suštinski istim uslovima.

[0073] IL-2 signalizacija može se odrediti merenjem nivoa fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, uz korišćenje standardnog testa fosforilacije Stat-5. Na primer, test fosforilacije Stat-5 za merenje IL-2 signalizacije može uključivati kultivisanje PMBC ćelija u prisustvu anti-CD25 antitela u koncentraciji od 10 ug/ml u trajanju od 30 min, i zatim dodavanje različitih koncentracija IL-2 (na primer, 10 U/ml ili različite koncentracije od 0.25 U/ml, 0.74 U/ml, 2.22 U/ml, 6.66 U/ml ili 20 U/ml) u trajanju od 10 min. Ćelije zatim mogu da se permeabilišu i nivoi STAT5 proteina mogu da se mere fluorescentno obeleženim antitelom na fosforilisani STAT5 peptid, anlizom protočnom citometrijom. Procenat blokiranja IL-2 signalizacije može da se izračuna na sledeći način: % blokiranja = 100 × [(% Stat5<+>ćelija grupa bez antitela - % Stat5<+>ćelija grupa 10 ug/ml antitela) / (% Stat5<+>ćelija grupa bez Ab)

[0074] ADCC može da se poveća postupcima koji eliminišu fukoznu komponentu sa glikana antitela, na primer proizvodnjom antitela u YB2/0 ćelijskoj liniji, ili uvođenjem specifičnih mutacija u Fc delu humanog IgG1 (npr., S298A/E333A/K334A, S239D/I332E/A330L, G236A/S239D/A330L/I332E) (Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103, 2005-2010; Smith et al. (2012) Proc Natl 25 Acad Sci USA 109, 6181-6). ADCP može da se poveća i uvođenjem specifičnih mutacija u Fc delu humanog IgG1 (Richards et al. (2008) Mol Cancer Ther 7, 2517-27).

[0075] U poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska, antitelo je optimizovano za izazivanje ADCC odgovora, što znači da je ADCC odgovor pojačan, povećan ili poboljšan u odnosu na druga anti-CD25 antitela, uključujući ona koja ne inhibiraju signalizaciju interleukina 2 preko CD25 i, na primer, nemodifikovana anti-CD25 monoklonska antitela.

[0076] U poželjnom primeru izvođenja ovog pronalaska, antitelo je optimizovano za izazivanje ADCP odgovora, što znači da je ADCP odgovor pojačan, povećan ili poboljšan u odnosu na druga anti-CD25 antitela, uključujući ona koja ne inhibiraju signalizaciju interleukina 2 preko CD25 i, na primer, nemodifikovana anti-CD25 monoklonska antitela.

[0077] Kako se koristi u ovom tekstu, "himerno antitelo" može se odnositi na antitelo koje ima varijabilne sekvence izvedene iz imunoglobulina iz jedne vrste, kao što je antitelo pacova ili miša, i konstantne regione imunoglobulina iz druge vrste, na primer iz humanog antitela. U nekim primerima izvođenja, himerno antitelo može imati konstantni region koji je poboljšan u smislu indukovanja ADCC.

[0078] Antitela upotrebljena u pronalasku takođe mogu biti delimično ili potpuno sintetska, pri čemu je bar deo polipeptidnih lanaca antitela sintetisan i, moguće, optimizovan za vezivanje sa antigenom koji prepoznaju. Takva antitela mogu biti himerna ili humanizovana antitela i mogu biti potpuno tetramerne strukture, ili mogu biti dimerna i sadržati samo jedan teški i jedan laki lanac.

[0079] Antitela upotrebljena u predmetnom pronalasku mogu biti i monoklonska antitela. Kako se koristi u ovom tekstu, "monoklonsko antitelo" nije ograničeno na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Izraz "monoklonsko antitelo" odnosi se na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagni klon, a ne na postupak kojim je proizvedeno.

[0080] Antitela upotrebljena u predmetnom pronalasku takođe mogu biti humana antitela. Kako se koristi u ovom tekstu, "humano antitelo" odnosi se na antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR regioni izvedeni iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Pored toga, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz munoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana antitela upotrebljena u pronalasku mogu uključivati aminokiselinske rezidue koje nisu kodirane imunoglobulinskim sekvencama humane germinativne linije (npr. mutacije uvedene nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).

[0081] Anti-CD25 antitelo koje ima karakteristike kao što je opisano u ovom tekstu, predstavlja još jedan predmet objave. Anti-CD25 antitelo može se koristiti u medicini. Pronalazak obezbeđuje anti-CD25 antitelo koje inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju gore pomenutim testom fosforilacije STAT5, za upotrebu u postupku lečenja kancera kod humanog subjekta, pri čemu subjekt ima solidan tumor.

[0082] Predmetna objava obezbeđuje i molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-CD25 antitela kako je definisano u ovom tekstu. Tako obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline mogu sadržati kodon-optimizovane sekvence nukleinske kiseline, i/ili mogu biti uključeni u ekspresione kasete unutar odgovarajućih nukleinskokiselinskih vektora, za ekspresiju u ćelijama-domaćinima kao što su na primer, ćelije bakterija, kvasca, insekata, riba, miša, majmuna, ili čoveka. Predmetna objava obezbeđuje i ćelije-domaćine koje sadrže heterologne molekule nukleinske kiseline (npr. DNK vektore) koji eksprimiraju željeno antitelo.

[0083] Predmetna objava obezbeđuje i postupke za pripremu izolovanog anti-CD25 antitela kako je gore definisano. Takvi postupci mogu uključivati kultivisanje ćelije-domaćina koja sadrži nukleinske kiseline (npr. heterologne nukleinske kiseline koje mogu sadržati i/ili biti dostavljene u ćeliju-domaćina putem vektora). Poželjno, ćelija-domaćin (i/ili heterologne sekvence nukleinske kiseline) aranžiraju se i konstruišu tako da se antitelo ili antigen-vezujući fragment ili varijanta istog sekretuju iz ćelije-domaćina i izoluju iz supernatanata ćelijske kulture.

[0084] Antitela korišćena u predmetnom pronalasku mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. "Multispecifična antitela" mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog antigena ili polipeptida, ili mogu sadržati antigen-vezujuće domene specifične za više od jednog ciljnog antigena ili polipeptida (Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol 22, 238-44).

[0085] U jednom aspektu pronalaska, antitelo je monospecifično antitelo. Kako se razmatra u nastavku ovog teksta, u alternativnom aspektu antitelo je bispecifično antitelo.

[0086] Kako se koristi u ovom tekstu, "bispecifično antitelo" odnosi se na antitelo koje ima kapacitet da se veže za dva različita epitopa na jednom antigenu ili polipeptidu, ili na dva različita antigena ili polipeptida.

[0087] Bispecifična antitela upotrebljena u predmetnom pronalasku, kako se ovde razmatra, mogu se proizvesti biološkim postupcima, kao što je somatska hibridizacija; ili genetičkim postupcima, kao što je ekspresija nenativne DNK sekvence koja kodira željenu strukturu antitela u ćelijskoj liniji ili u organizmu; hemijskim postupcima (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na drugi način, sa jednim ili više molekularnih entiteta kao što je drugo antitelo ili fragment antitela); ili njihovom kombinacijom.

[0088] Tehnologije i proizvodi koji omogućavaju proizvodnju monospecifičnih ili bispecifičnih antitela poznati su u struci, kako je široko prikazano u literaturi, takođe i u vezi sa alternativnim formatima, konjugatima antitelo-lek, postupcima dizajniranja antitela, postupcima skrininga in vitro, konstantnim regionima, posttranslacionim i hemijskim modifikacijama, poboljšanim svojstvima za pokretanje smrti kancerskih ćelija kao što je inženjerisanje Fc (Tiller K and Tessier P, 2015 Annu Rev Biomed Eng. 17: 191-216; Speiss C et al., 2015. Molecular Immunology 67 95-106; Weiner G, 2015. Nat Rev Cancer, 15: 361-370; Fan G et al., 2015. J Hematol Oncol 8:130). Takvo bispecifično antielo može biti obezbeđeno u bilo kojem komercijalno dostupnom formatu, uključujući duotelo, BiTE DART, CrossMab, "knobs-inholes", triomab, ili drugi odgovarajući molekularni format i fragmente istog.

[0089] Kako se koristi u ovom tekstu, "epitop" ili "antigenska determinanta" odnosi se na mesto na antigenu za koje se vezuje antitelo. Kao što je dobro poznato u struci, epitopi se mogu formirati od kontinuiranih amino-kiselina (linearni epitop) ili od nekontinuiranih aminokiselina međusobno približenih tercijarnim savijanjem proteina (konformacioni epitopi). Epitopi formirani od kontinuiranih amino-kiselina tipično ostaju očuvani posle izlaganja denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem tipično gube posle tretmana denaturišućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a češće, najmanje 5 ili 8-10 amino-kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci određivanja prostorne konformacije epitopa dobro su poznati u struci i uključuju na primer, kristalografiju x-zraka i 2-D nuklearnu magnetnu rezonancu. Vidi, na primer, Epitope Mapping Protocols u Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996). Na primer, antitelo upotrebljeno u pronalasku može prepoznati konformacioni epitop za koji se vezuju antitela 7G7B6 ili MA251. U jednom primeru izvođenja, konformacioni epitop sadrži najmanje dve sekvence odabrane od amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA), amino-kiselina 176-180 iz SEQ ID NO:1 (RWTQP), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i aminokiselina 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

[0090] U nekim primerima izvođenja, anti-CD25 antitelo može biti uključeno u sredstvo koje sadrži još i konjugovani korisni "teret" kao što je terapijsko ili dijagnostičko sredstvo, posebno za terapiju ili dijagnozu kancera. Mogu se koristiti konjugati anti-CD25 antitela i radionuklida ili toksina. Primeri često korišćenih radionuklida su na primer,<90>Y,<131>I i<67>Cu, između ostalih, a primeri često korišćenih toksina su doksorubicin i kaliheamicin. U još jednom primeru izvođenja, anti-CD25 antitelo može se modifikovati tako da ima izmenjen poluživot. Postupci za postizanje izmenjenog poluživota poznati su u struci. U nekim primerima izvođenja, anti-CD25 antitelo nije konjugovano sa drugim terapijskim ili dijagnostičkim sredstvom. Posebno, u nekim primerima izvođenja, anti-CD25 antitelo nije konjugovano sa radionuklidom, tj. u nekim primerima izvođenja, anti-CD25 antitelo nije radioaktivno obeleženo.

[0091] U primerima izvođenja predmetnog pronalaska, subjekt je čovek.

[0092] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi "kancer", "kancerozno", ili "maligno" označavaju ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim ćelijskim rastom.

[0093] Primeri kancera uključuju, ali se ne ograničavaju na karcinom, limfom, leukemiju, blastom, i sarkom. Određeniji primeri takvih kancera uključuju karcinom pločastih ćelija, mijelom, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, gliom, hepatocelularni karcinom (hepatocellular carcinoma, HCC), Hodgkin-ov limfom, ne-Hodgkin-ov limfom, akutnu mijeloidnu leukemiju (acute myeloid leukemia, AML), multipli mijelom, gastrointestinalni kancer (kancer gastrointestinalnog trakta), renalni kancer, kancer ovarijuma, kancer jetre, limfoblastnu leukemiju, limfocitnu leukemiju, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer bubrega, kancer prostate, tiroidni kancer, melanom, hondrosarkom, neuroblastom, kancer pankreasa, multiformni glioblastom, kancer cerviksa, kancer mozga, kancer želuca, kancer mokraćne bešike, hepatom, kancer dojke, karcinoma kolona, i kancer glave i vrata.

[0094] U primerima izvođenja pronalaska, kancer uključuje solidni tumor. Primeri solidnih tumora su sarkomi (uključujući kancere koji su nastali od transformisanih ćelija mezenhimskog porekla u tkivima kao što su sunđerasta kost, hrskavičavo, masno, mišićno, vaskularno, hematopoetsko, ili vlaknasto vezivno tkivo), karcinomi (uključujući tumore koji su nastali od epitelnih ćelija), mezoteliom, neuroblastom, retinoblastom, itd. Kanceri koji obuhvataju solidne tumore uključuju, bez ograničavanja, kancer mozga, kancer pluća, kancer želuca, kancer duodenuma, kancer ezofagusa, kancer dojke, kolona i kancer rektuma, renalni kancer, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer ovarijuma, melanom, kancer usta, sarkom, kancer oka, tiroidni kancer, kancer uretre, kancer vagine, kancer vrata, limfom, i slično.

[0095] U jednom aspektu, kanceri uključuju tumore koji eksprimiraju CD25, uključujući, ali ne ograničavajući se na limfom kao što je Hodgkin-ov limfom, i limfocitne leukemije, na primer hroničnu limfocitnu leukemiju (chronic lymphocytic leukemia, CLL).

[0096] U jednom aspektu pronalaska, kancer se identifikuje po prisustvu specifičnih tumorrelevantnih markera i antigena kao što su CD20, HER2, PD-1, PD-L1, SLAM7F, CD47, CD137, CD134, TIM3, CD25, GITR, CD25, EGFR, itd. ili je za kancer utvrđeno da ima biomarker označen kao visoka mikrosatelitska nestabilnost (microsatellite instability-high, MSI-H) ili je deficijentan u reparaciji pogrešnog sparivanja (mismatch repair deficient, dMMR). Pored toga, antitela mogu da se koriste kada se identifikacija specifičnog tumorrelevantnog markera, antigena, ili biomarkera koristi u definisanju prekanceroznih, neinvazivnih stanja gornjih kancera kod pacijenta, kao što su kancer in-situ, tinjajući mijelom, monoklonska gamopatija neodređenog značaja, cervikalna intraepitelna neoplazija, MALTomi/GALTomi i različiti limfoproliferativni poremećaji. Poželjno, u nekim primerima izvođenja, subjekt koji se leči ima solidan tumor.

[0097] U jednom aspektu pronalaska, kancer je odabran od melanoma, nesitnoćelijskog kancera pluća, renalnog kancera, kancera ovarijuma, kancera mokraćne bešike, sarkoma i kancera kolona. U poželjnom aspektu pronalaska, kancer je odabran od melanoma, kancera ovarijuma, nesitnoćelijskog kancera pluća i renalnog kancera. U jednom primeru izvođenja, kancer nije melanom, kancer ovarijuma ili kancer dojke. U poželjnom aspektu pronalaska, kancer je sarkom, kancer kolona, melanom ili kolorektalni kancer, ili uopštenije bilo koji humani kancer za koji 4T1, MCA205, B16, CT26 ili MC38 ćelijska linija može predstavljati preklinički model za validaciju jedinjenja korisnih za njihovu kontrolu pomoću terapije.

[0098] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "tumor" u vezi sa subjektom kojem je dijagnostikovan ili koji je suspektan da ga ima, kancer se odnosi na malignu ili potencijalno malignu neoplazmu ili tkivnu masu bilo koje veličine, i uključuje primarne tumore i sekundarne neoplazme. Izrazi "kancer", "malignitet", "neoplazma", "tumor", i "karcinom" mogu se koristiti i naizmenično u ovom tekstu za označavanje tumora i tumorskih ćelija, koji ispoljavaju relativno abnormalan, nekontrolisan, i/ili autonoman rast, tako da pokazuju aberantan fenotip rasta koji se karakteriše značajnim gubitkom kontrole proliferacije ćelija. Uopšteno, ćelije od interesa za detekciju ili lečenje uključuju prekancerozne (tj., benigne), maligne, premetastatske, metastatske, i nemetastatske ćelije. Učenja predmetne objave mogu biti relevantna za bilo koji i sve kancere.

[0099] Kako se koristi u ovom tekstu, "solidni tumori" su abnormalni izraštaji ili mase tkiva, koji obično ne sadrži ciste ili tečne oblasti, tačnije, tumori i/ili metastaze (bilo gde da se nalazi) različiti od leukemije ili nesolidnih limfoidnih kancera. Solidni tumori mogu biti benigni ili maligni. Različiti tipovi solidnih tumora nazvani su prema tipu ćelija koje ih formiraju i/ili tkivu ili organu u kojem se nalaze. Primeri solidnih tumora su sarkomi (uključujući kancere nastale od transformisanih ćelija mezenhimskog porekla u tkivima kao što su sunđerasta kost, hrskavica, masno, mišićno, vaskularno, hematopoetsko ili vlaknasto vezivno tkivo), karcinomi (uključujući tumore nastale od epitelnih ćelija), melanome, limfome, mezoteliom, neuroblastom, i retinoblastom.

[0100] Kanceri prema predmetnom pronalasku su oni koji se karakterišu prisustvom solidnog tumora, to jest subjekt nema nesolidni tumor. U svim aspektima pronalaska, kako se razmatra u ovom tekstu, potrebno je da kancer bude solidan tumor, tj. da subjekt ima solidan tumor (i da nema nesolidan tumor).

[0101] Upućivanjem na "lečiti" ili "lečenje" kancera, kako se koristi u ovom tekstu, definiše se postizanje najmanje jednog pozitivnog terapijskog efekta kao što je, na primer, smanjenje broja kancerskih ćelija, smanjenje veličine tumora, smanjenje stope infiltracije kancerskih ćelija u periferne organe, ili smanjenje stope matestaze tumora ili rasta tumora.

[0102] Pozitivni terapijski efekti u kanceru mogu se meriti na veliki broj načina (npr. Weber (2009) J Nucl Med 50, 1S-10S). Kao primer, u vezi sa inhibicijom rasta tumora, prema standardima Nacionalnog instituta za kancer (National Cancer Institute, NCI), T/C ≤ 42% je najmanji nivo antitumorske aktivnosti. T/C < 10% smatra se za visok nivo antitumorske aktivnosti, pri čemu T/C (%) = Medijana zapremine lečenog tumora / Medijana zapremine kontrolnog tumora × 100. U nekim primerima izvođenja, lečenje postignuto terapijski efikasnom količinom je bilo koja dužina preživljavanja bez progresije tumora (progression free survival, PFS), preživljavanja bez bolesti (disease free survival, DFS) ili ukupnog preživljavanja (overall survival, OS). PFS, označeno i kao "vreme do progresije tumora" označava dužinu vremena tokom i posle lečenja kada kancer ne raste, i uključuje dužinu vremena tokom kojeg pacijenti imaju kompletan odgovor ili parcijalan odgovor, kao i dužinu vremena tokom kojeg pacijenti imaju stabilnu bolest. DFS označava dužinu vremena tokom i posle lečenja kada pacijent nema bolest. OS označava produženje očekivane dužine života u poređenju sa "naivnim" ili nelečenim osobama ili pacijentima.

[0103] Pominjanje "prevencije" (ili profilakse), kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na odlaganje ili preveniranje pojave simptoma kancera. Prevencija može biti apsolutna (tako da do bolesti ne dolazi) ili može biti efikasna samo kod nekih osoba ili tokom ograničenog vremena.

[0104] U poželjnom aspektu pronalaska, subjekt ima uspostavljen tumor, to jest subjekt već ima tumor, npr. koji je klasifikovan kao solidni tumor. Kao takav, pronalazak kako je opisan u ovom tekstu može se koristiti kada subjekt već ima solidan tumor. Kao takav, pronalazak obezbeđuje terapijsku opciju koja se može koristiti za lečenje postojećeg tumora. U jednom aspektu pronalaska subjekt ima postojeći solidan tumor. Pronalazak moože da se koristi kao prevencija, ili poželjno kao lečenje kod subjekta koji već ima solidan tumor. U jednom aspektu, pronalazak se ne koristi preventivno ili profilaktički.

[0105] U jednom aspektu, korišćenjem pronalaska opisanog u ovom tekstu može se pojačati regresija tumora, može se narušiti ili smanjiti rast tumora, i/ili može se produžiti vreme preživljavanja, na primer u poređenju sa drugim načinima lečenja kancera (na primer standardni načini lečenja datog kancera).

[0106] U jednom aspektu pronalaska, postupci lečenja ili prevencije kancera opisani u ovom tekstu, u kojima se koriste anti-CD25 antitela, uključuju još i korak identifikovanja subjekta koji ima kancer, poželjno identifikovanje subjekta koji ima tumor kao što je solidan tumor.

[0107] Dozni režim terapije opisane u ovom tekstu, efikasan u lečenju pacijenta sa kancerom, može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, i težina pacijenta i sposobnost terapije da izazove antikancerski odgovor kod subjekta. Izbor odgovarajuće doze u okvirima je obučenosti stručnjaka u oblasti. Na primer 0.01, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, ili 50 mg/kg. U nekim primerima izvođenja, takva količina je jedinična dozna količina (ili njena cela frakcija) pogodna za primenu u skladu sa režimom doziranja za koji je određeno da je u korelaciji sa željenim ili korisnim ishodom kada se primeni na relevantnu populaciju (tj., po terapijskom doznom režimu).

[0108] Antitelo upotrebljeno u skladu sa bilo kojim aspektom pronalaska, kako je opisano u ovom tekstu, može biti u formi farmaceutske kompozicije koja dodatno sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijent. Ove kompozicije uključuju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne formulacije, na primer tečne rastvore (npr., injektabilne i infuzibilne rastvore), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, ili lipozome. U nekim primerima izvođenja, poželjna forma može zavisiti od nameravanog načina primene i/ili terapijske primene. Farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo mogu se primeniti bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u struci, uključujući, bez ograničavanja, oralnu, mukoznu, putem inhalacije, lokalnu, bukalnu, nazalnu, rektalnu, ili parenteralnu (npr. intravensku, putem infuzije, intratumoursku, intranodalnu, supkutanu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intradermalnu, transdermalnu, ili drugu vrstu primene koja uključuje fizičko narušavanje integriteta tkiva subjekta i primenu farmaceutske kompozicije preko mesta prekida tkiva). Takva formulacija može, na primer, biti u formi injektabilnog ili infuzibilnog rastvora koji je pogodan za intradermalnu, intratumorsku ili supkutanu primenu, ili za intravensku infuziju. Primena može uključiti intermitentno doziranje. Alternativno, primena može uključiti kontinuirano doziranje (npr., perfuziju) tokom najmanje odabranog perioda vremena, istovremeno ili između primene drugih jedinjenja.

[0109] U nekim primerima izvođenja, antitelo može da se pripremi sa nosačima koji ga štite od brzog oslobađanja i/ili razgradnje, na primer u formulacijama sa kontrolisanim oslobađanjem, kao što su implanti, transdermalni flasteri, i mikroinkapsulirani dostavni sitemi. Mogu se koristiti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri.

[0110] Stručnjaci u oblasti će razumeti, na primer, da put dostave (npr., oralni u odnosu na intravenski u odnosu na supkutani u odnosu na intratumorski, itd.) može uticati na količinu doze i/ili potrebna dozna količina može uticati na put dostave. Na primer, kada je od interesa postizanje posebno visoke koncentracije sredstva na posebnom mestu ili lokaciji (npr., unutar tumora), fokusirana dostava (npr., u ovom primeru, intratumorska dostava) može biti poželjna i/ili korisna. Drugi faktori koje treba razmotriti prilikom optimizovanja puteva i/ili rasporeda doziranja za dati terapijski režim mogu uključiti, na primer, određeni kancer koji se leči (npr., tip, stadijum, lokaciju, itd.), kliničko stanje subjekta (npr., starost, opšte zdravstveno stanje, itd.), prisustvo ili odsustvo kombinovane terapije, i druge lekarima poznate faktore.

[0111] Farmaceutske kompozicije tipično treba da su sterilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoko koncentrisanje leka. Sterilni injektabilni rastvori mogu se pripremiti tako što se antitela u željenoj količini inkorporišu u pogodni rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih gore, po potrebi, što je praćeno sterilizacijom filtriranjem. Formulacije za parenteralnu primenu uključuju, ali se ne ograničavaju na suspenzije, rastvore, emulzije u uljanim ili vodenim prenosnicima, paste, i implantabilne formulacije sa produženim oslobađanjem ili biodegradabilne formulacije, kako se razmatra u ovom tekstu. Sterilne injektabilne formulacije mogu se pripremiti korišćenjem netoksičnog parenteralno prihvatljivog razblaživača ili rastvarača. Svaka farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom može uključiti farmaceutski prihvatljiva dispergujuća sredstva, sredstva za vlaženje, suspendujuća sredstva, izotonična sredstva, sredstva za oblaganje, antibakterijska i antigljivična sredstva, nosače, ekscipijente, soli, ili stabilizere koji su u upotrebljenim dozama i koncentracijama netoksični za subjekta. Poželjno, takva kompozicija može sadržati još i farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijent za upotrebu u lečenju kancera, koji je kompatibilan sa datim postupkom i/ili mestom primene, na primer za parenteralnu (npr. supkutanu, intradermalnu, ili intravensku injekciju), intratumorsku, ili peritumorsku primenu.

[0112] Iako primer izvođenja postupka lečenja ili kompozicija za upotrebu prema predmetnom pronalasku ne mora biti efikasan u postizanju pozitivnog terapijskog efekta kod svakog subjekta, korišćenjem farmaceutskih kompozicija i režima doziranja konzistentnih sa dobrom medicinskom praksom to bi trebalo da se postigne kod statistički značajnog broja subjekata, što se utvrđuje bilo kojim statističkim testom poznatim u struci kao na primer Student-ov t-test, χ2-test, U-test prema Mann-u i Whitney-ju, Kruskal-Wallis-ov test (H-test), Jonckheere-Terpstra test i Wilcoxon-ov test.

[0113] Kada se u ovom tekstu ranije i u nastavku pominje tumor, tumorska bolest, karcinom ili kancer, takođe se podrazumevaju metastaze u originalnom organu ili tkivu i/ili na bilo kojem drugom mestu alternativno ili dodatno, bez obzira na to gde se tumor i/ili metastaza nalaze.

[0114] Kako se razmatra u ovom tekstu, predmetni pronalazak se odnosi na depleciju regulatornih T ćelija (Treg). Prema tome, u jednom aspektu pronalaska, anti-CD25 antitelo koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25, vrši i depleciju ili smanjuje tumorsku infiltraciju regulatornim T ćelijama. U jednom aspektu, deplecija se izvodi preko ADCC. U drugom aspektu, deplecija se izvodi preko ADCP.

[0115] Objava obezbeđuje postupak deplecije regulatornih T ćelija u tumoru kod subjekta, koji uključuje primenu, kod pomenutog subjekta, anti-CD25 antitela koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25. Deplecija Treg može da se vrši u solidnom tumoru. Pod "deplecija" misli se na to da je broj, odnos ili procenat Treg smanjen u odnosu na stanje kada se anti-CD25 antitelo koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25, ne primenjuje. Preciznije, može biti izvršena deplecija više od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 99% tumor-infiltrirajućih regulatornih T ćelija.

[0116] Kako se koristi u ovom tekstu, "regulatorne T ćelije" ("Treg", "Treg ćelije", ili "Treg") odnosi se na liniju CD4+ T limfocita specijalizovanih za kontrolu autoimunosti, alergije i infekcije. Tipično, oni regulišu aktivnosti populacija T ćelija, ali mogu uticati i na određene tipove ćelija urođenog imunskog sistema. Treg se obično identifikuju po ekspresiji biomarkera CD4, CD25 i Foxp3. Prirodne Treg ćelije normalno čine oko 5-10% perifernih CD4+ T limfocita. Međutim, u tumorskom mikrookruženju (tj. tumor-infiltrirajuće Treg ćelije), mogu predstavljati čak 20-30% od ukupne populacije CD4+ T limfocita.

[0117] Aktivirane humane Treg ćelije mogu direktno ubiti ciljne ćelije kao što su efektorske T ćelije i APC, preko perforin- ili granzim-B-zavisnih puteva; T-regulatorne ćelije pozitivne na antigen 4 udružen sa citotoksičnim T limfocitima (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4, CTLA4+) imdukuju ekspresiju indolamin 2,3-dioksigenaze (indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) u APC, a one zatim snižavanjem triptofana suprimiraju aktivaciju T ćelija; Treg ćelije mogu oslobađati interleukin-10 (IL-10) i transformišući faktor rasta (transforming growth factor, TGFβ) in vivo, i tako direktno inhibirati aktivaciju T ćelija i suprimirati funkciju APC inhibiranjem ekspresije MHC molekula, CD80, CD86 i IL-12. Treg ćelije mogu takođe suprimirati imunitet eksprimiranjem visokih nivoa CTLA4 koji može da se veže za CD80 i CD86 na antigen-prezentujućim ćelijama i prevenira odgovarajuću aktivaciju efektorskih T ćelija.

[0118] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, odnos efektorskih ćelija prema regulatornim T ćelijama u solidnom tumoru je povišen. U nekim primerima izvođenja, odnos efektorskih T ćelija prema regulatornim T ćelijama u solidnom tumoru je povišen na preko 5, 10, 15, 20, 40 ili 80.

[0119] Imunska efektorska ćelija označava imunsku ćeliju koja je uključena u efektorsku fazu imunskog odgovora. Primeri imunskih ćelija uključuju ćeliju mijeloidnog ili limfoidnog porekla, npr., limfociti (npr., B ćelije i T ćelije, uključujući citolitičke T ćelije (cytolytic T cells, CTL)), ćelije ubice, ćelije prirodne ubice, makrofage, monocite, eozinofile, neutrofile, polimorfonuklearne ćelije, granulocite, mastocite i bazofile.

[0120] Imunske efektorske ćelije uključene u efektorsku fazu imunskog odgovora eksprimiraju specifične Fc receptore i obavljaju specifične imunske funkcije. Efektorska ćelija može da indukuje ćelijama posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), npr. neutrofil koji može da indukuje ADCC. Na primer, monociti, makrofagi, neutrofili, eozinofili i limfociti koji eksprimiraju FcαR, uključeni su u specifično ubijanje ciljnih ćelija i prezentovanje antigena drugim komponentama imunskog sistema, ili vezivanje za ćelije koje prezentuju antigene. Efektorska ćelija može i da fagocituje ciljni antigen, ciljnu ćeliju ili mikroorganizam. Kao što se ovde razmatra, antitela upotrebljena u ovom pronalasku mogu da se optimizuju u pogledu sposobnosti indukovanja ADCC.

[0121] U nekim primerima izvođenja, drugo sredstvo protiv kancera može da se primeni u kombinaciji sa antitelom, istim ili različitim putevima dostave i/ili prema različitim rasporedima. Alternativno ili dodatno, u nekim primerima izvođenja, jedna ili više doza prvog aktivnog sredstva primenjuju se suštinski istovremeno i, u nekim primerima izvođenja, zajedničkim putem i/ili kao deo jedne kompozicije sa jednim ili više drugih aktivnih sredstava. Stručnjaci u oblasti će razumeti da neki primeri izvođenja kombinovanih terapija obezbeđenih prema predmetnom pronalasku postižu sinergističke efekte; u nekim takvim primerima izvođenja, doza jednog ili više sredstava koja se koriste u kombinaciji može biti značajno različita (npr. niža) i/ili se isporuka može vršiti putem različitim od standardnog, poželjnog ili neophodnog kada se to sredstvo koristi u drugačijem terapijskom režimu (npr. kao monoterapija i/ili kao deo druge kombinovane terapije).

[0122] U nekim primerima izvođenja, kada se koriste dva ili više aktivnih sredstava prema predmetnom pronalasku, takva sredstva mogu da se primene istovremeno ili sekvencijalno. U nekim primerima izvođenja, primena jednog sredstva je specifično vremenski određena u odnosu na primenu drugog sredstva. Na primer, u nekim primerima izvođenja, prvo sredstvo se primenjuje tako da se opaža određeni efekat (ili se očekuje da će biti opažen, na primer na osnovu populacionih studija koje pokazuju korelaciju između datog režima doziranja i određenog efekta od interesa). U nekim primerima izvođenja, željeni relativni režimi doziranja za sredstva koja se primenjuju u kombinaciji, mogu se proceniti ili odrediti empirijski, na primer korišćenjem ex vivo, in vivo i/ili in vitro modela; u nekim primerima izvođenja, takva procena ili empirijsko određivanje vrše se in vivo, u populaciji pacijenata (npr., tako da se uspostavi korelacija), ili alternativno u određenom pacijentu od interesa.

[0123] U drugom aspektu pronalaska, anti-CD25 antitelo koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25 ima poboljšane terapijske efekte kada se kombinuje sa inhibitorom kontrolne tačke imunskog odgovora. Kombinovana terapija anti-CD25 antitelom koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25 i inhibitorom kontrolne tačke imunskog odgovora može imati sinergističke efekte u lečenju uspostavljenih tumora. Podaci koji se odnose na PD-1/PD-L1 u predmetnim Primerima, odnose se na interferiranje sa interakcijom PD-1/PD-L1. Kao takva, interakcija između PD-1 receptora i PD-L1 liganda može biti blokirana, što rezultuje "PD-1 blokadom". U jednom aspektu, kombinacija može dovesti do pojačane regresije tumora, pojačanog ometanja ili smanjenja rasta tumora, i/ili vreme preživljavanja se može produžiti korišćenjem pronalaska kako je opisano u ovom tekstu, na primer u poređenju sa korišćenjem samo anti-CD25 antitela ili samo blokade PD-1/PD-L1 (direktno, korišćenjem anti-PD1 antitela, ili indirektno, korišćenjem anti-PD-L1 antitela). Imajući u vidu da anti-CD25 antitelo ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25, kombinovana terapija anti-CD25 antitelom i inhibitorom kontrolne tačke imunskog odgovora može dodatno uključivati primenu interleukina-2 u dozi koja je odgovarajuća za lečenje kancera.

[0124] Kako se koristi u ovom tekstu, "kontrolna tačka imunskog odgovora" ili "protein kontrolne tačke imunskog odgovora" odnosi se na proteine koji pripadaju inhibitornim putevima u imunskom sistemu, posebno za modulaciju odgovora T-ćelija. U normalnim fiziološkim uslovima, kontrolne tačke imunskog odgovora ključne su za sprečavanje autoimunosti, posebno tokom odgovora na patogen. Kancerske ćelije mogu da izmene regulaciju ekspresije proteina kontrolne tačke imunskog odgovora kako bi izbegle imunski nadzor.

[0125] Primeri proteina kontrolne tačke imunskog odgovora uključuju, ali se ne ograničavaju na PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIGIT, CD155, B7H3, B7H4, VISTA i TIM3, i takođe OX40, GITR, ICOS, 4-1BB i HVEM. Proteini kontrolne tačke imunskog odgovora mogu podrazumevati i proteine koji se vezuju za druge proteine kontrolne tačke imunskog odgovora. Takvi proteini uključuju PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, HVEM, LLT1, i GAL9.

[0126] "Inhibitori proteina kontrolne tačke imunskog odgovora" odnosi se na bilo koji protein koji može da interferira sa signalizacijom i/ili protein-protein interakcijama posredovanim proteinom kontrolne tačke imunskog odgovora. U jednom aspektu pronalaska, protein kontrolne tačke imunskog dgovora je PD-1 ili PD-L1. U poželjnom aspektu pronalaska, kako je opisano u ovom tekstu, inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora interferira sa PD-1/PD-L1 interakcijama preko anti-PD-1 ili anti PD-L1 antitela.

[0127] Kao takav, predmetni pronalazak obezbeđuje i određena anti-CD25 antitela za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta, pri čemu pomenuti subjekt ima solidan tumor, što uključuje primenu anti-CD25 antitela koje inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju gore pomenutim testom fosforilacije STAT5, i još jednog terapijskog sredstva, poželjno inhibitora kontrolne tačke imunskog odgovora, kod subjekta.

[0128] Primena anti-CD25 antitela koje ne inhibira signalizaciju interleukina-2 preko CD25, i još jednog terapijskog sredstva kao što je inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora, može biti istovremena, razdvojena ili sekvencijalna.

[0129] Predmetni pronalazak obezbeđuje kombinaciju anti-CD25 koje inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju gore pomenutim testom fosforilacije STAT5, i još jednog terapijskog sredstva, poželjno inhibitora kontrolne tačke imunskog odgovora, za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta, pri čemu pomenuti subjekt ima solidan tumor, pri čemu se anti-CD25 antitelo i još jedno terapijsko sredstvo kao što je inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora primenjuju istovremeno, zasebno ili sekvencijalno. Takvo anti-humano CD25 antitelo koje ne inhibira signalizaciju interleukinom-2 preko CD25 i predstavlja humani IgG1 izotip, može se koristiti specifično u kombinaciji sa antitelima koja ciljaju kontrolne tačke imunskog odgovora, ali nemaju sekvence koje omogućavaju ADCC, ADCP i/ili CDC.

[0130] U alternativnom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-CD25 antitelo koje inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju gore pomenutim testom fosforilacije STAT5, za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta koji ima solidan tumor, pri čemu je pomenuto antitelo namenjeno primeni u kombinaciji sa još jednim terapijskim sredstvom, poželjno inhibitorom kontrolne tačke iminskog odgovora.

[0131] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-CD25 antitelo koje ne inhibira signalizaciju interleukina 2 preko CD25, i opciono još jedno terapijsko sredstvo, poželjno inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora, u farmaceutski prihvatljivom medijumu. Kao što je razmatrano ranije u ovom tekstu, inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora može biti inhibitor PD-1, tj. antagonist PD-1.

[0132] PD-1 (programmed cell death protein 1, protein 1 programirane ćelijske smrti), poznat i kao CD279, je ćelijski površinski receptor koji se eksprimira na aktiviranim T ćelijama i B ćelijama. Pokazano je da interakcija sa njegovim ligandima atenuiše odgovore T-ćelija in vitro i in vivo. PD-1 se vezuje sa dva liganda, PD-L1 i PD-L2. PD-1 pripada superfamiliji imunoglobulina. PD-1 signalizacija zahteva vezivanje za PD-1 ligand u blizini peptidnog antigena prezentovanog pomoću glavnog kompleksa histokompatibilnosti (major histocompatibility complex, MHC) (Freeman (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 10275-6). Prema tome, proteini, antitela ili mali molekuli koji preveniraju istovremeno vezivanje PD-1 i TCR na membrani T ćelija korisni su kao PD-1 antagonisti.

[0133] U jednom primeru izvođenja, antagonist PD-1 receptora je anti-PD-1 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuju za PD-1 i blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1. Anti-PD-1 antitelo može biti monoklonsko antitelo. Anti-PD-1 antitelo može biti humano ili humanizovano antitelo. Anti-PD-1 antitelo je antitelo sposobno za specifično vezivanje sa PD-1 receptorom. Anti-PD-1 antitela poznata u struci uključuju nivolumab i pembrolizumab.

[0134] PD-1 antagonisti upotrebljeni u predmetnom pronalasku uključuju i jedinjenja ili sredstva koja se vezuju i/ili blokiraju PD-1 ligand, da bi interferirali ili inhibirali vezivanje liganda za PD-1 receptor, ili se vezuju direktno i blokiraju PD-1 receptor, bez indukovanja transdukcije inhibitornog signala preko PD-1 receptora. Posebno, PD-1 antagonisti uključuju male molekule inhibitore PD-1/PD-L1 signalnog puta. Alternativno, antagonist PD-1 receptora može direktno da se veže za PD-1 receptor bez pokretanja transdukcije inhibitornog signala i takođe da se veže za ligand PD-1 receptora kako bi smanjio ili inhibirao ligand u pokretanju transdukcije signala preko PD-1 receptora. Smanjenjem broja i/ili količine liganda koji se vezuju za PD-1 receptor i pokreću transdukciju inhibitornog signala, manje ćelija se atenuiše negativnim signalom dostavljenim putem PD-1 signalne transdukcije i omogućava se postizanje snažnijeg imunskog odgovora.

[0135] U jednom primeru izvođenja, antagonist PD-1 receptora je anti-PD-L1 antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuju za PD-L1 i blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1. Anti-PD-L1 antitelo može biti monoklonsko antitelo. Anti-PD-L1 antitelo može biti humano ili humanizovano antitelo, kao što je atezolizumab (MPDL3280A).

[0136] Predmetni pronalazak obezbeđuje i anti-CD25 antitelo koje inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforiliranog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju testom fosforilacije STAT5, za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta koji ima solidni tumor, i antitelo koje je agonist kostimulatornog puta koji aktivira T-ćelije, kod subjketa. Agonistička antitela kostimulatornog puta koji aktivira T-ćelije uključuju, bez ograničavanja, agonistička antitela protiv ICOS, GITR, OX40, CD40, LIGHT i 4-1 BB.

[0137] Još jedna upotreba u lečenju kancera uključuje primenu anti-CD25 antitela koje inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2-signalizacija meri nivoima fosforiliranog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju gore pomenutim testom fosforilacije STAT5, i jedinjenja koje smanjuje, blokira, inhibira i/ili antagonizuje FcγRllb (CD32b). Mali molekul koji interferira sa FcγRIIbindukovanom unutarćelijskom signalizacijom, modifikovana antitela koja ne angažuju inhibitorni FcγRllb receptor ili anti-humano FcγRllb (anti-CD32b antitelo, mogu biti takvi FcγRllb antagonisti. Na primer, antagonistička antihumana FcγRIIb antitela okarakterisana su i u pogledu svojih antitumorskiha svojstava (Roghanian A et al., 2015, Cancer Cell. 27, 473-488; Rozan C et al., 2013, Mol Cancer Ther.12:1481-91; WO2015173384; WO2008002933).

[0138] Predmetna objava obezbeđuje i bispecifično antitelo koje sadrži:

(a) prvu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za CD25; i

(b) drugu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za protein kontrolne tačke imunskog odgovora, tumor-asocirani antigen, antihumano antitelo na aktivatorski Fc receptor (FcgRI, FcgRlla, FcgRIII), ili antagonističko antihumano FcγRllb antitelo;

pri čemu anti-CD25 antitelo ne inhibira vezivanje interleukina-2 (IL-2) za CD25, i poželjno je IgG1 bispecifično antitelo koje se vezuje za bar jedan aktivatorski Fcγ receptor sa visokim afinitetom, i vrši depleciju tumor-infiltrajućih regulatornih T ćelija. U poželjnom primeru izvođenja, druga antigen-vezujuća komponenta vezuje se za PD-L1.

[0139] Kako se koristi u ovom tekstu, "tumor-asocirani antigen" odnosi se na antigene koji se eksprimiraju na tumorskim ćelijama, čineći da se one razlikuju od nekancerskih ćelija koje se nalaze uz njih, i koji uključuju, bez ograničavanja, CD20, CD38, PD-L1, EGFR, EGFRV3, CEA, TYRP1 i HER2. Objavljeni su različiti pregledni članci u kojima se opisuju relevantni tumor-asocirani antigeni i odgovarajuća terapijski korisna sredstva u vidu antitumorskih antitela (vidi, na primer, Sliwkowski & Mellman (2013) Science 341, 192-8). Takvi antigeni i odgovarajuća antitela uključuju, bez ograničavanja, CD22 (blinatumomab), CD20 (rituksimab, tositumomab), CD56 (lorvotuzumab), CD66e/CEA (labetuzumab), CD152/CTLA-4 (ipilimumab), CD221/IGF1R (MK-0646), CD326/epkam (edrekolomab), CD340/HER2 (trastuzumab, pertuzumab), i EGFR (cetuksimab, panitumumab).

[0140] Bispecifično antitelo prema objavi, kako je opisano u ovom tekstu, dovodi do ADCC, ili, u jednom aspektu, pojačane ADCC.

[0141] Bispecifično antitelo može da se veže za specifičan epitop na CD25, koji ne utiče na vezivanje IL-2 za CD25, i specifičan epitop na proteinu kontrolne tačke imunskog odgovora ili tumor-asociranom antigenu, kako je definisano u ovom tekstu. Druga antigen-vezujuća komponenta može da se veže za PD-L1. Predmetna objava obezbeđuje i bispecifično antitelo koje sadrži:

(a) prvu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za CD25 i koja ne utiče na vezivanje IL-2 za CD25; i

(b) drugu antigen-vezujuću komponentu koja se vezuje za protein kontrolne tačke imunskog odgovora eksprimiran na tumorskoj ćeliji.

[0142] Protein kontrolne tačke imunskog odgovora eksprimiran na tumorskoj ćeliji može biti PD-L1, VISTA, GAL9, B7H3 ili B7H4. Poželjnije, anti-CD25 antitelo je IgG1 antitelo koje ne utiče na vezivanje IL-2 za CD25 i koje se vezuje za najmanje jedan aktivatorski Fcγ receptor sa visokim afinitetom, i vrši depleciju tumor-infiltrajućih regulatornih T ćelija. Alternativno, anti-CD25 antitelo je humano IgG2 antitelo koje vrši depleciju tumor-infiltrirajućih regulatornih T ćelija. Anti-CD25 antitelo može biti humano IgG2 antitelo koje se vezuje za najmanje jedan aktivatorski Fcγ receptor sa visokim afinitetom, poželjno za FcγRlla.

[0143] Stručnjak u oblasti mogao bi da proizvede bispecifična antitela korišćenjem poznatih postupaka. Bispecifično antitelo prema objavi može se koristiti u bilo kojem aspektu pronalaska kako je opisano u ovom tekstu. Poželjno, druga antigen-vezujuća komponenta unutar bispecifičnog antitela prema objavi vezuje se za humani PD-1, humani PD-L1 ili humani CTLA-4.

[0144] U jednom aspektu bispecifično antitelo može da se veže za CD25 i za imunomodulatorne receptore koji se u visokim nivoima eksprimiraju na tumor-infiltrirajućim Treg, na primer CTLA4, ICOS, GITR, 4-1BB ili OX40.

[0145] Predmetna objava obezbeđuje i kit koji sadrži anti-CD25 antitelo kako je opisano u ovom tekstu, i još jedno terapijsko sredstvo, poželjno inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora, poželjno PD-1 antagonist (direktno, koristeći anti-PD1 antitelo, ili indirektno, koristeći anti-PD-L1 antitelo) kako se razmatra u ovom tekstu. Inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora može biti anti-PD-L1. Kit može sadržati anti-CD25 antitelo kako je opisano u ovom tekstu, i antitelo koje je agonist kostimulatornog puta za aktivaciju T ćelija. Kit može sadržati uputstvo za upotrebu.

[0146] Bilo koji aspekt pronalaska opisanog u ovom tekstu može se izvesti u kombinaciji sa dodatnim terapijskim sredstvima, posebno dodatnim sredstvima za terapiju kancera. Konkretno, anti-CD25 antitelo i, opciono, inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora koji se koristi u predmetnom pronalasku mogu se primeniti u kombinaciji sa kostimulatornim antitelima, hemioterapijom i/ili radioterapijom (primenom zračenja spolja na telo ili davanjem radio-konjugovanih jedinjenja), terapijom na bazi citokina, ciljanom terapijom, terapijom monoklonskim antitelima, vakcinom ili adjuvansom, ili bilo kojom njihovom kombinacijom.

[0147] Hemioterapijski entitet, kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na entitet koji je destruktivan za ćeliju, to jest entitet koji smanjuje vijabilnost ćelije. Hemioterapijski entitet može biti citotoksični lek. Hemioterapijska sredstva koja se razmatraju uključuju, bez ograničavanja, alkilirajuća sredstva, antracikline, epotilone, nitrozouree, etilenimine/metilmelamin, alkil sulfonate, alkilirajuća sredstva, antimetabolite, pirimidinske analoge, epipodofilotoksine, enzime kao što je L-asparaginaza; modifikatore biološkog odgovora kao što su IFNα, IFN-γ, IL-2, IL-12, G-CSF i GM-CSF; koordinacione komplekse platine kao cisplatin, oksaliplatin i karboplatin, antracendione, supstituisanu ureu kao hidroksiurea, metilhidrazinske derivate uključujući N-metilhidrazin (N-methylhydrazine, MIH) i prokarbazin, adrenokortikalne supresore kao mitotan (o,p’-DDD) i aminoglutetimid; hormone i antagoniste uključujući adrenokortikosteroidne antagoniste kao što su prednizon i ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; progestin kao hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron acetat i megestrol acetat; estrogen kao dietilstilbestrol i etinil estradiolske ekvivalente; antiestrogen kao tamoksifen; androgene uključujući testosteron propionat i fluoksimesteron/ekvivalente; antiandrogene kao flutamid, analoge gonadotropin-oslobađajućeg hormona i leuprolid; i nesteroidne antiandrogene kao flutamid.

[0148] Dodatna terapija kancera može uključivati i primenu vakcine protiv kancera. "Kancerske vakcine", kako se koristi u ovom tekstu, odnose se na terapijske kancerske vakcine koje se daju pacijentima obolelim od kancera i koje su dizajnirane za iskorenjivanje kancerskih ćelija jačanjem pacijentovog sopstvenog imunskog odgovora. Kancerske vakcine uključuju vakcine tumorskih ćelija (autologne i alogene), vakcine dendritskih ćelija (generisane ex vivo i aktivirane peptidima), kancerske vakcine na bazi proteina/peptida i genetičke vakcine (vakcine na bazi DNK, RNK i virusa). Prema tome, terapijske kancerske vakcine, u principu, mogu se koristiti za inhibiciju daljeg rasta uznapredovalih karcinoma i/ili relapsnih tumora koji su otporni na konvencionalne terapije, na primer operaciju, terapiju zračenjem i hemioterapiju. Vakcine bazirane na tumorskim ćelijama (autologne i alogene) uključuju one koje su genetički modifikovane za sekreciju rastvorljivih imunostimulatornih sredstava kao što su citokini (IL-2, IFN-g, IL12, GMCSF, FLT3L), jednolančanih Fv antitela protiv imunomodulatornih receptora (PD-1, CTLA-4, GITR, ICOS, OX40, 4-1 BB) i/ili za ekspresiju, na svojoj membrani, liganda za imunostimulatorne receptore kao što su, između ostalih, ICOS-ligand, 4-1BB ligand, GITR-ligand i/ili OX40 ligand. U jednom primeru izvođenja, kancerska vakcina može biti GVAX antitumorska vakcina.

[0149] Dodatnu kancersku terapiju mogu činiti druga antitela ili reagensi sa malim molekulima, koji smanjuju imunsku regulaciju na periferiji i unutar tumorskog mikrookruženja, na primer molekuli koji ciljaju TGFbeta puteve, IDO (indolamin deoksigenaza), arginaza i/ili CSF1R.

[0150] "U kombinaciji" može označavati primenu dodatne terapije pre, istovremeno ili posle primene bilo kojeg aspekta prema predmetnom pronalasku.

[0151] Pronalazak će sada dodatno biti opisan Primerima koji slede, koji treba da služe da pomognu stručnjaku prosečno obučenom u oblasti da izvede pronalazak i nisu ni na koji način namenjeni ograničavanju obima pronalaska, uz pozivanje na crteže.

KRATAK OPIS SLIKA

[0152]

Slika 1 – prikazuje karakterizaciju 7D4 i PC61 antimišjih CD25 antitela korišćenih u Primerima. Efekat na vezivanje IL-2 ispitan je korišćenjem testa unakrsnog blokiranja u tandem-formatu. Biotinisani mišji CD25 nanese se na SA senzore. Senzori se zatim izlože 100 nM mišjem IL-2, posle čega sledi dodavanje jednog od antimišjih CD25 antitela, u 150. sec. Dodatno vezivanje antitela posle asocijacije IL-2 ukazuje na to da antimišje CD25 antitelo ne blokira vezivanje IL-2, dok izostanak dodatnog vezivanja ukazuje na blokiranje liganda. PC-61 mlgG2a pokazuje interferenciju sa interakcijom mišji IL-2-mišji CD25, nasuprot 7D4 (A). Interakcija mišji IL-2/mišji CD25 u prisustvu rekombinantnog antimišjeg CD25 7D4(mlgG1) procenjivana je korišćenjem standardnog testa unakrsnog blokiranja u "sendvič" formatu.7D4(mlgG1) nanese se na AHQ senzore i nezauzeta Fc-vezujuća mesta na senzoru blokiraju se irelevantnim humanim IgG1 antitelom. Senzori se zatim izlože 100 nM rekombinantnom mišjem CD25 (R&D Systems; kat. br. 2438-RM- 050) što je praćeno rekombinantnim mišjim IL-2 (Peprotech; kat. br. 212-12). Dodatno vezivanje sa mišjim IL-2 posle asocijacije 7D4(mlgG1)-mišji CD25 ukazuje na nezauzeti epitop, pri čemu 7D4(mlgG1) i mišji IL-2 ne kompetiraju za epitop u mišjem CD25 jer je vezivanje za mišji CD25 istovremeno (B). Vezivanje za mišji CD25, uz korišćenje CHO ćelija koje eksprimiraju mišji CD25, određivano je za antihumana CD25-vezujuća antitela daklizumab (DAC), PC61(mlgG2a) antitelo (originalno anti-CD25 dobijeno iz klona PC-61 sa mišjim IgG2a i κ konstantnim regionima koji su udrženi sa ADCC) i a7D4(mlgG1) antitelo (anti- D25 dobijeno iz klona 7D4 sa mišjim IgG1 i κ konstantnim regionima). Antimišji CD25 IgG vezuju se za mCD25 eksprimiran na ćelijama. CHO-mCD25 se alikvotiraju u testnim pločama sa 96 bunarčića (50000 ćelija/bunarčiću) i inkubiraju sa 0.1 mL rastvora koji sadrži antitelo (antitelo u koncentraciji od 100 nM u PBS 0.1% goveđi serum albumin) na 25°C, 15 minuta. Ćelije se isperu u tri promene ledenohladnog PBS 0.1% goveđi serum albumin i zatim obeleže kozjim antihumanim IgG (specifičan za γ lanac) R-PE (Southern Biotech, kataloški broj 2040-09) i analiziraju korišćenjem protočne citometrije (propidijum jodid se koristi za razlikovanje mrtvih ćelija). Nije detektovano vezivanje DAC, dok su PC61 (mlgG2a) i 7D4(mlgG1) pokazali jasno vezivanje za takve ćelije (C).

Slika 2 – prikazuje efekat antimišjih CD25 antitela na indukovanje ekspresije granzima B u CD4 T ćelijama posle stimulacije pomoću anti-CD3 i anti-CD28. Ukupne CD4-pozitivne T ćelije izolovane su iz mišjih limfnih čvorova i slezine, korišćenjem CD4-mikroperlica i obeležene korišćenjem CellTrace™ Violet boja (ThermoFisher) za merenje ćelijske proliferacije. Obeležene T ćelije (10<5>) zaseju se sa ćelijama hraniteljicama (10<5>; CD90.2negativna frakcija, uz korišćenje mišjeg pan-T Dynabeads kita) na ploči sa 96 bunarčića. Anti-CD3 (klon 145-2C11, BioXcell kat. br. BE0001-1; 1 µg/ml) i anti-CD28 (klon 37.51 kat. br. BioXcell BE0015-1; 0.5 µg/ml) dodaju se u bunarčiće (uz izuzeće kontrolnog uzorka nestimulisanih, obeleženih T ćelija) da bi se aktivirale CD4 T ćelije i indukovala proliferacija i proizvodnja granzima B. Sledeća antitela su zatim dodavana (u koncentraciji od 25 µg/mL) u bunarčiće koji su sadržali obeležene CD4 T ćelije i anti-CD3 i anti-CD28 antitela (bunarčići koji sadrže samo obeležene T ćelije i anti-CD3 i anti-CD28 antitela korišćeni su kao negativna kontrola): PC61(mlgG2a), 7D4(mlgG1), ili neutrališuće antimišje IL-2 antitelo (klon Jes6-1A12, BioXcell 6032988564) upotrebljeno kao pozitivna kontrola, da se pokaže uticaj blokiranja interakcije između IL-2 i njegovog receptora na aktivaciju T ćelija. Uzorci obeleženih T ćelija su zatim inkubirani pribl. 84 h. Ćelije su zatim fiksirane i permeabilisane pre bojenja antimišjim granzim B antitelom (klon GB11, Invitrogen). Ćelije su zatim analizirane protočnom citometrijom u pogledu ekspresije granzima B i razblaživanja CellTrace violet boja (BV450). Procenat obeleženih T ćelija koje su proliferisale i eksprimirale granzim B (GnzB) prikazan je u gornjem levom kvadrantu svakog od grafikona specifičnog za tretman (Q9), dok je procenat obeleženih T ćelija koje su proliferisale, ali nisu eksprimirale GnzB prikazan u donjem levom kvadrantu svakog grafikona specifičnog za tretman (Q12).

Slika 3 - prikazuje in vivo efekat anti-mišjih CD25 antitela koja imaju isti izotip (mišji IgG2a), koja ili blokiraju ili ne blokiraju interakciju CD25 i IL-2, kada se primene u prisustvu ili odsustvu anti-mišjeg PD1 (aPD1; klon RMP1-14), na imunske ćelije. Nultog dana, miševima raspoređenim u šest grupa injektiraju se supkutano MCA205 tumorske ćelije (5 ×10<5>15) i životinje se dalje tretiraju zasebno, kako je navedeno na grafikonima. U četiri grupe, antimišje CD25 antitelo (aPC61 mlgG2a ili a7D4 mlgG2a; 200 µg) injektira se intraperitonealno na Dan 5. U tri grupe, PD1 (100 µg) injektira se intraperitonealno na Dan 6 i Dan 9. Tumori i limfni čvorovi se sakupe na Dan 12 i zatim obrade za bojenje ćelija u skladu sa željenim tipom i analiziraju protočnom citometrijom kako je naznačeno na svakom grafikonu, uz korišćenje sledećih antitela: anti-CD3 (klon 17A2, Biolegend), anti-CD4 (klon RM4-5, BD biosciences), anti-CD8 (klon 53-6.7, Biolegend) i anti-FoxP3 (klon FJK-16s, eBiosciences). Unutarnukleusno bojenje FoxP3 izvodi se korišćenjem puferskog seta za bojenje FoxP3 transkripcionog faktora (FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set, eBioscience). Prikazan je procenat CD4-pozitivnih/Foxp3-pozitivnih regulatornih T ćelija i CD4-pozitivnih/FoxP3-negativnih efektorskih CD4 T ćelija (CD4 Teff) u LN i TIL, kao i odnos efektorskih CD8-pozitivnih T ćelija/Treg ćelija i CD4 Teff/Treg ćelija. Analiza podataka izvedena je u Flowjo, verzija 10.0.8 (Tree Star Inc.). Statističke analize izvedene su u Prism 6 (GraphPad Software, Inc.); p vrednosti izračunate su korišćenjem Kruskall-Wallis analize varijanse i Dunn-ovog post-hoc testa (ns = p > 0.05; **** = p < 0.0001).

Slika 4 – prikazuje efekat antimišjih CD25 antitela koja imaju isti izotip (IgG2a), koja ili blokiraju ili ne blokiraju interakciju CD25 i IL-2, u prisustvu ili odsustvu antimišjeg PD1 (aPD1; klon RMP1-14) na proizvodnju granzima B u proliferišućim T ćelijama in vivo. Uzorci ćelija generisani su korišćenjem modela na bazi MCA205, u šest grupa tretmana, kako je naznačeno na Slici 3. Tumorske ćelije su obojene prema željenom tipu i analizirane protočnom citometrijom kako je naznačeno na svakom grafikonu, uz korišćenje sledećih antitela: anti-CD3 (PeCy7, klon 145-2C11, Ebioscience, 25003182), anti-CD4 (V500, klon RM4-5, BD biosciences, 560782), anti-CD8 (BV785, klon 53-6.7, Biolegend, 100750), anti-granzim B (APC, klon GB11; Invitrogen, grb05) i Ki67 (V450, klon SolA15; eBiosciences, 48569882). Unutarnukleusno bojenje na Ki67 i granzim B izvedeno je korišćenjem puferskog seta za bojenje FoxP3 transkripcionog faktora (eBioscience, 00-5523-00). Upoređen je procenat GnzB-pozitivnih bunarčića i ukupnog broja GnzB-pozitivnih proliferišućih (naznačeno Ki67 pozitivnošću) CD4pozitivnih ili CD8-pozitivnih T ćelija. Statističke analize izvedene su kao za Sliku 3 (ns = p > 0.05; * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001; **** = p < 0.0001).

Slika 5 – prikazuje efekat antimišjeg CD25 (IgG2a izotip) datog u kombinaciji ili ne sa anti-PD-1 (klon RMP1-14), na iskorenjivanje uspostavljenih tumora u CT26 mišjem modelu. I 7D4m2a i PC61m2a su antimišja CD25 antitela koja vrše depleciju Treg, ne blokiraju IL-2 (7D4m2a) ili blokiraju IL-2 (PC61m2). Krive rasta tokom vremena za pojedinačne miševe utvrđene su za svaku tretiranu grupu. Na svakom grafikonu prikazan je broj preživelih bez tumora, posle 50 dana. CT26 ćelije korišćene za implantaciju, sakupljene su tokom log faze rasta i resuspendovane u hladnom PBS. Prvog dana (D1) studije, svakom mišu je supkutano u desni bok ubrizgano 3 × 10<5>ćelija (0,1 mL ćelijske suspenzije). Antimišji CD25 injektiran je i.p. (10 mg/kg) 6. dana (kada su detektovani palpabilni tumori). Anti-mišji PD1 ubrizgan je i.p. (100 µg/injekciji) 7. dana, 10. dana, 14. dana i 17. dana. Tumori su mereni kaliperom u dve dimenzije, dva puta nedeljno, kako bi se prato rast. Veličina tumora u mm<3>izračunata je iz: Zapremina tumora = (w2 × l)/2 gde je w = širina i l = dužina tumora, u mm. Završna tačka studije bio je tumor zapremine 4000 mm<3>ili 50. dan studije, šta god nastupi pre (prestanak unosa podataka na različitim, ranijim danima posledica je smrti miševa; broj životinja koje su preživele na kraju eksperimenta naznačen je unutar svakog grafikona).

Slika 6 - prikazuje krive rasta CT26 tumora pojedinačnih miševa koji nisu tretirani (PBS, samo prenosnik) ili su tretirani antimišjim CD25 IgG2a antitelima koja vrše depleciju Treg, ali ili ne blokiraju IL-2 (7D4m2a) ili blokiraju IL-2 (PC61m2), i dodatno se kombinuju ili ne, sa antimišjim PD-L1 klonom 10F.9G2 (aPDL1; klonom 10F.9G2). Model, režim i analiza podataka isti su kao za Sliku 5.

Slika 7 – prikazuje efekat antimišjeg CD25 (IgG2a izotip) datog u kombinaciji ili ne, sa anti-PD-1 (klon RMP1-14), na iskorenjivanje uspostavljenih tumora u mišjem modelu MC38. Testirana antitela su ona koja su opisana na Slici 5. Krive rasta za pojedinačne miševe utvrđene su za svaku tretiranu grupu, tokom vremena. Broj preživelih bez tumora posle 35 dana prikazan je na svakom grafikonu. MC38 ćelije karcinoma kolona korišćene za implantaciju, sakupljene su tokom log faze rasta i resuspendovane u hladnom PBS. Svakom mišu injektirano je supkutano u desni bok 5 × 10<5>tumorskih ćelija (0,1 mL ćelijske suspenzije). Tumori su praćeni kako su se njihove zapremine bližile ciljnom opsegu od 100 do 150 mm<3>. Dvadeset i dva dana posle implantacije tumora, na Dan 1 studije, životinje sa zapreminama pojedinačnih tumora u rasponu od 75 do 126 mm<3>, raspoređene su u devet grupa (n = 10) sa srednjom zapreminom tumora za grupu od oko 106 mm<3>. Kod miševa koji su nosili uspostavljeni MC38 tumor, tretmani su započeli na Dan 1. Efekti svakog tretmana upoređivani su sa kontrolnom grupom tretiranom prenosnikom, koja je primala PBS intraperitonealno (i.p.) 1. dana, 2. dana, 5. dana, 9. dana i 12. dana. Anti-PD1 je primenjen i.p. u dozi100 µg/životinji, dva puta nedeljno tokom dve nedelje (biwk × 2) počevši od Dana 2. 7D4m2a i PC61m2a primenjeni su i.p. jednom 1. dana u dozi od 200 µg/životinji. Merenja tumora vršena su dva puta nedeljno. Završna tačka studije bila je zapremina tumora od 4000 mm<3>ili 35. dan, šta god nastupi pre (prestanak unosa podataka na različitim, ranijim danima posledica je smrti miševa; broj životinja koje su preživele na kraju eksperimenta naznačen je unutar svakog grafikona).

Slika 8 – prikazuje krive rasta MC38 tumora pojedinačnih miševa koji nisu tretirani (PBS, samo prenosnik), ili su tretirani antimišjim CD25 IgG2a antitelima koja vrše depleciju Treg, ali ne blokiraju IL-2 (7D4m2a) ili blokiraju IL-2 (PC61m2), i dodatno se kombinuju ili ne, sa anti-mišjim PD-L1 klon 10F.9G2 (aPDL1; klon 10F.9G2). Model, režim i analiza podataka isti su kao na Slici 7.

Slika 9: Evaluacija terapijske aktivnosti 7D4 mlgG2a, antimišjeg CD25 IL-2-neblokirajućeg, antitela koje vrši depleciju Treg, samog (D) i u kombinaciji sa IL-2 neutrališućim antitelom (ThermoFisher; JES6-1A12) (E), ili IL-2-blokirajućim antimišjim CD25 antitelom mišjeg IgG1 izotipa (PC61 mišji IgG1) koje ne vrši depleciju, (F), u ženkama BALB/c miševa, koje nose CT26 singene tumore kolona. Radi poređenja, testirana je aktivnost kontrolnog mišjeg IgG2a (A), IL-2 neutrališućeg antitela samog (B) i IL-2-blokirajućeg anti-CD25 antitela samog (C).

Slika 10: prikazuje konsenzusnu sekvencu humanog CD25 (Uniprot kod P01589), koja se u ovom tekstu označava kao SEQ ID NO:1. Podvučen je vanćelijski domen zrelog CD25, koji odgovara amino-kiselinama 22-240. Položaj epitopa iz IL-neblokirajućih anti-CD25 antitela kako je preliminarno identifikovano: naznačeni su epitopi 1 (ceo i kratki epitopi), epitop 2 (ceo i kratki epitopi), epitop 3 i epitop 4 (ceo i kratki epitopi). Položaji epitopa za baziliksimab i daklizumab (označen kao DAC) takođe je identifikovan.

Slika 11: Karakterizacija vezivanja (A) 7D4, (B) PC61 i (C) 2E4 za CD25 eksprimiran na CD25-eksprimirajućim CHO ćelijama pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa mišjim IgG2a kao izotipskom kontrolom.

Slika 12: Analiza na bazi SPR prečišćenih antitela (mlgG2a) na his-označen rmCD25, na Biacore 2000, (A) 7D4, (B) 2E4.

Slika 13: Analiza kompeticije anti-mCD25 antitela na his-označeni rmCD25, na Octet96 sistemu. Prikazuje se vezivanje drugog antitela, posle koraka zadržavanja 7D4 na senzoru i udruživanja sa antigenom. Kompetitivno vezivanje za mCD25 zapaženo je između 7D4 i 2E4 (A), ali ne između 7D4 i PC61 (B)

Slika 14: Karakterizacija 7D4, PC61 i 2E4 u poređenju sa mišjim IgG2a kao izotipskom kontrolom ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije, u testu fosforilacije STAT5 uz korišćenje T ćelija izolovanih iz C57BL/6 splenocita. Ćelije su inkubirane sa 50 µg/ml antitela, posle čega sledi 50 U/ml IL-2. Analiza je bila ograničena na procenat Treg ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 15: In vivo deplecija Treg u balb/c miševima koji nose 4T1 tumor, posle doziranja miševa anti-mišjim CD25 (7D4) antitelom. (A)-(C): % ne-CD4, CD4+ i CD25+FoxP3+ ćelija, respektivno, u punoj krvi na dan 3 posle doziranja. (D)-(F): % ne-CD4, CD4+ i CD25+FoxP3+ ćelija, respektivno, u tumoru na dan 3 posle doziranja. (G)-(I): % ne-CD4, CD4+ i CD25+FoxP3+ ćelija, respektivno, u punoj krvi na dan 9 posle doziranja. (J)-(L): % ne-CD4, CD4+ i CD25+FoxP3+ ćelija, respektivno, u tumoru na dan 9 posle doziranja.

Slika 16: Karakterizacija vezivanja mišjeg (B) ili himernog (A, C i D) antihumanog CD25 klon 7G7B6 za CD25 eksprimiran na Karpas 299 ćelijama (A), humanim in vitro diferenciranim Treg ćelijama (B), SU-DHL-1 ćelijama ( C), ili SR-786 ćelijama (D) pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 17: Karakterizacija 7G7B6 u poređenju sa mišjim IgG2a kao izotipskom kontrolom, humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije, u testu fosforilacije STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, posle čega su sledile rastuće koncentracije IL-2 (kao što je prikazano na slikama). Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 18: Funkcionalna karakterizacija himernog 7G7B6 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom ili komercijalno dostupnim mišjim antihumanim IL-2-neutrališućim antitelom kao pozitivnom kontrolom (klon: AB12-3G4), uz korišćenje pan-T ćelija. Ćelije su inkubirane sa 10 ug/ml antitela, zatim aktivirane CD3/CD28 perlicama tokom 72 sata, pre analize protočnom citometrijom. Rezultati pokazuju procenat granzim B pozitivnih proliferišućih CD4 T ćelija.

Slika 19: Funkcionalna karakterizacija himernog 7G7B6 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom u pogledu ubijanja CD25-pozitivnih ćelijskih linija, u ADCC testu. CD25-visoko- ili niskoeksprimirajuće ćelije, SU-DHL-1 (A) ili SR-786 ćelije (B) respektivno, bile su kokultivisane sa prečišćenim NK ćelijama u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Liza ciljnih ćelija merena je oslobađanjem kalceina u supernatant, četiri sata posle dodavanja NK ćelijama. Podaci su normalizovani prema kontrolama tretiranim saponinom.

Slika 20: Funkcionalna karakterizacija himernog 7G7B6 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija, u ADCP testu. Treg su kokultivisane sa MCSF-diferenciranim makrofagima, u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Dvobojna protočnocitometrijska analiza izvedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+>/CD14-. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) prikazuju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ]

Slika 21: Karakterizacija vezivanja MA-251 za CD25 eksprimiran na Karpas 299 ćelijama, pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa mišjom IgG1 izotipskom kontrolom.

Slika 22: Karakterizacija MA-251 u poređenju sa mišjim IgG1 kao izotipskom kontrolom, humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom, ili u odsustvu primarnog antitela. Blokiranje IL-2 signalizacije u testu fosforilacije STAT5 procenjeno je uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, što je praćeno rastućim koncentracijama IL-2 (kako je prikazano na Slikama). Analliza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 23: Karakterizacija vezivanja MA-251 i IL2 za CD25. Interferencija sa vezivanjem IL2 za CD25 obavljena je na Forte Bio Octet Red384 sistemu (Pall Forte Bio Corp., USA), uz korišćenje standardnog "sendvič" testa grupisanja. MA251 antitelo nanese se na AHQ senzore i nezauzeta Fc-vezujuća mesta na senzoru se zatim blokiraju nerelevantnim humanim IgG1 antitelom. Senzori se izlože 100 nM humanom CD25 i zatim 100 nM humanom IL-2. Podaci se obrađuju korišćenjem Forte Bio Data Analysis softvera 7.0. Dodatno vezivanje sa humanim IL2 posle asocijacije antigena, ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Slika 24: Analiza kompeticije anti-CD25 antitela pomoću Octet sistema. Vezivanje prvog Ab za imobilisani rhCD25, posle čega sledi ili ponovo prvo Ab (kao kontrola) ili drugo Ab. mAb koja ne blokiraju IL-2 signalizaciju kompetiraju međusobno ili sa 7G7B6 i MA251, i ne kompetiraju sa istraživačkim daklizumabom ili istraživačkim baziliksimabom (Slike 24 (A) do (N)). (A) do (C) analiza kompeticije 7G7B6; (D)-(F) analiza kompeticije MA251; (G) do (I) i (N) analiza kompeticije Antitela 3; (J) do (M) analiza kompeticije Antitela 1. mAb koja su blokatori IL-2 signalizacije (TSK031) kompetiraju sa istraživačkim daklizumabom i istraživačkim baziliksimabom, i ne kompetiraju sa 7G7B6 (Slike 24 (O) do (Q).

Slika 25: In vivo model koji pokazuje supresiju rasta tumora posle doziranja: prenosnikom (A) i (C); ili Antitelom 1 (B), (D) i (E).

Slika 26: Određivanje afiniteta analizom na bazi SPR, prečišćenih antitela (lgG1) na his-obeleženi rhCD25, na Biacore 2000. A) 7g7B6ch, B) MA251ch, C) Antitelo 1, D) Antitelo 3 i E) daklizumab (kontrola) ili bioslojnom interferometrijom, na Octet Red 96 uređaju (F).

Slika 27: Karakterizacija vezivanja Antitela 1 za CD25 eksprimiran na humanim in vitro diferenciranim Treg ćelijama (A), SU-DHL-1 ćelijama (B), ili SR-786 ćelijama (C) pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 28: Karakterizacija vezivanja Antitela 1 za CD25 eksprimiran na CD3/CD28 perlicama aktiviranim humanim (A) i (B) pan-T ćelijama, zatim ograda na CD4<+>i CD8<+>T ćelije, pri rastućoj koncentraciji antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 29: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 1 i IL-2 (A) i kompetitivno vezivanje IL-2-kompetirajućeg antitela za IL-2 (B), pomoću bioslojne interferometrije na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Antihumano CD25 antitelo, Antitelo 1, naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim bili izloženi 100 nM humanom CD25, a zatim humanom IL-2. Dodatno vezivanje humanog IL2 posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Slika 30: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 1 i daklizumaba za CD25, pomoću bioslojne interferometrije na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Referentno monoklonsko antihumano CD25 antitelo daklizumab naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim bili izloženi 100 nM humanom CD25 antigenu, a zatim antihumanom CD25 antitelu (Antitelo 1). Dodatno vezivanje drugog antitela posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Slika 31: Karakterizacija Antitela 1 u poređenju sa humanimm IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom, ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije u testu fosforilacije STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, posle čega su sledile rastuće koncentracije IL-2 (kao što je prikazano na Slikama). Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 32: Funkcionalna karakterizacija Antitela 1 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom, ili komercijalno dostupnim mišjim antihumanim IL-2 neutrališućim antitelom kao pozitivnom kontrolom (klon: AB12-3G4), uz korišćenje pan-T ćelija. Ćelije su inkubirane sa 10 ug/ml antitela zatim aktivirane CD3/CD28 perlicama tokom 72 sata, pre analize protočnom citometrijom. Rezultati prikazuju procenat granzim B-pozitivnih proliferišućih CD4 (A) ili CD8 (B) T ćelija.

Slika 33: Funkcionalna karakterizacija Antitela 1 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu ubijanja CD25-pozitivnih ćelijskih linija u testu ADCC. Ćelije sa visokom ili niskom ekspresijom CD25, SU-DHL-1 (A) odnosno SR-786 ćelije (B), kokultivisane su sa prečišćenim NK ćelijama, u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Liza ciljne ćelije merena je oslobađanjem kalceina u supernatant, četiri sata posle dodavanja NK ćelijama. Podaci su normalizovani prema kontrolama tretiranim saponinom.

Slika 34: Funkcionalna karakterizacija Antitela 1 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija u testu ADCP. Treg su kokultivisane sa MCSF-diferenciranim makrofagima, u prisustvu različitih koncentracija antitela (kako je prikazano na Slikama). Analiza dvobojnom protočnom citometrijom izvedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+>/CD14-. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) prikazuju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ].

Slika 35: Karakterizacija vezivanja Antitela 3 za CD25 eksprimiran na humanim in vitro diferenciranim Treg ćelijama (A), SU-DHL-1 ćelijama (B) ili SR-786 ćelijama (C) pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotpiskom kontrolom.

Slika 36: Karakterizacija vezivanja Antitela 3 za CD25 eksprimiran na CD3/CD28 perlicama aktiviranim pan-T ćelijama čoveka (A) i (B) ili majmuna cinomolgusa (C) i (D), zatim ograda na CD4<+>i CD8<+>T ćelije, pri rastućoj koncentraciji antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 37: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 3 i IL-2 pomoću bioslojne interferometrije, na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grrupisanja u "sendvič" formatu. Anti-humano CD25 antitelo, Antitelo 3, naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim bili izloženi 100 nM humanom CD25, a zatim humanom IL-2. Dodatno vezivanje humanog IL2 posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor).

Slika 38: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 3 i daklizumaba za CD25, pomoću bioslojne interferometrije, na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Referentno monoklonsko antihumano CD25 antitelo daklizumab naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim bili izloženi 100 nM humanom CD25 antigenu, a zatim antihumanom CD25 antitelu (Antitelo 3). Dodatno vezivanje drugog antitela posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Slika 39: Karakterizacija Antitela 3 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom, ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije, u testu fosforilacije STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, posle čega su sledile rastuće koncentracije IL-2 (kao što je prikazano na Slikama). Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 40: Funkcionalna karakterizacija Antitela 3 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom ili komercijalno dostupnim mišjim anti-humanim IL-2 neutrališućim antitelom kao pozitivnom kontrolom (klon: AB12-3G4), uz korišćenje pan-T ćelija. Ćelije su inkubirane sa 10 ug/ml antitela, zatim aktivirane CD3/CD28 perlicama tokom 72 sata, pre analize protočnom citometrijom. Rezultati pokazuju procenat granzim B-pozitivnih proliferišućih CD4 (A) ili CD8 (B) T ćelija.

Slika 41: Funkcionalna karakterizacija Antitela 3 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu ubijanja CD25-pozitivnih ćelijskih linija, u testu ADCC. Ćelije sa visokom ili niskom ekspresijom CD25, SU-DHL-1 (A) odnosno SR-786 ćelije (B), kokultivisane su zajedno sa prečišćenim NK ćelijama u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Liza ciljnih ćelija merena je oslobađanjem kalceina u supernatant, četiri sata poale dodavanja NK ćelijama. Podaci su normalizovani prema kontrolama tretiranim saponinom.

Slika 42: Funkcionalna karakterizacija Antitela 3 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija, u testu ADCP. Treg su kokultivisane zajedno sa MCSF-diferenciranim makrofagima, u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Analiza dvobojnom protočnom citometrijom izvedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+>/CD14-. Smatra se da dvostruko označene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ].

Slika 43: Karakterizacija vezivanja Antitela 4 za CD25 eksprimiran na humanim in vitro diferenciranim Treg ćelijama (A), SU-DHL-1 ćelijama (B) ili SR-786 ćelijama (C), pri rastućim koncentracijama antitela, u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 44: Karakterizacija vezivanja Antitela 4 za nemodifikovane CHO-S ćelije, (negativna kontrola) (A), ili cino-CD25-CHO-S ćelije (B), pri koncentraciji od 100 nM antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 45: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 4 i IL-2 pomoću bioslojne interferometrije, na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Antihumano CD25 antitelo, Antitelo 4, naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim bili izloženi 100 nM humanom CD25, a zatim humanom IL-2. Dodatno vezivanje humanog IL2 posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor).

Slika 46: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 4 i daklizumaba za CD25 pomoću bioslojne interferometrije, na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Referentno monoklonsko antihumano CD25 antitelo daklizumab naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim bili izloženi 100 nM humanom CD25 antigenu, a zatim antihumanom CD25 antitelu (Antitelo 4). Dodatno vezivanje drugog antitela posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Slika 47: Karakterizacija Antitela 4 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom, ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije, u testu fosforilacije STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, posle čega su sledile rastuće koncentracije IL-2 (kao što je prikazano na Slikama). Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 48: Funkcionalna karakterizacija Antitela 4 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom ili komercijalno dostupnim mišjim antihumanim IL-2 neutrališućim antitelom kao pozitivnom kontrolom (klon: AB12-3G4), uz korišćenje pan-T ćelija. Ćelije su inkubirane sa 10 ug/ml antitela, zatim aktivirane CD3/CD28 perlicama tokom 72 sata, pre analize protočnom citometrijom. Rezultati pokazuju procenat granzim B-pozitivnih proliferišućih CD4 (A) ili CD8 (B) T ćelija.

Slika 49: Funkcionalna karakterizacija Antitela 4 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu ubijanja CD25-pozitivnih ćelijskih linija, u testu ADCC. Ćelije sa visokom ili niskom ekspresijom CD25, SU-DHL-1 (A) odnosno SR-786 ćelije (B), kokultivisane su zajedno sa prečišćenim NK ćelijama u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Liza ciljnih ćelija merena je otpuštanjem kalceina u supernatant, četiri sata posle dodavanja NK ćelijama. Podaci su normalizovani prema kontrolama tretiranim saponinom.

Slika 50: Funkcionalna karakterizacija Antitela 4 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom kontrolom, u pogledu indukovanja ADCP u reporterskom biotestu (Reporter Bioassay). CD25-eksprimirajuće SU-DHL-1 ćelije kokultivisane su zajedno sa Jurkat T ćelijama genetički inženjerisanim da eksprimiraju FcγRlla i NFAT-odgovorni element koji pokreće ekspresiju luciferaze (NFAT-RE-luc2), u prisustvu različitih koncentracija antitela (kako je prikazano na Slikama).

Slika 51: Karakterizacija vezivanja Antitela 2 za CD25 eksprimiran na humanim in vitro diferenciranim Treg ćelijama (A), SU-DHL-1 ćelijama (B) ili SR-786 ćelijama (C) pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 52: Karakterizacija vezivanja Antitela 2 za CD25 eksprimiran na CD3/CD28 perlicama aktiviranim pan-T ćelijama čoveka (A) i (B) ili majmuna cinomolgusa (C) i (D), zatim ograda na CD4<+>i CD8<+>T ćelije, pri rastućoj koncentraciji antitela i upoređivanje sa humanom IgG1 izotipskom kontrolom.

Slika 53: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 2 i IL-2 (A) i kompetitivno vezivanje IL-2-kompetirajućeg antitela sa IL-2 (B), pomoću bioslojne interferometrije, na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Antihumano CD25 antitelo, Antitelo 2, naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim izloženi 100 nM humanom CD25, a zatim humanom IL-2. Dodatno vezivanje humanog IL2 posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor).

Slika 54: Prikazuje nekompetitivno vezivanje Antitela 2 i daklizumaba za CD25, pomoću bioslojne interferometrije, na Octet Red384, uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Referentno monoklonsko antihumano CD25 antitelo daklizumab naneto je na AHQ senzore. Senzori su zatim bili izloženi 100 nM humanom CD25 antigenu, a zatim antihumanom CD25 antitelu (Antitelo 2). Dodatno vezivanje drugog antitela posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Slika 55: Karakterizacija Antitela 2 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije, u testu fosforilisanja STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, posle čega su sledile rastuće koncentracije IL-2 (kao što je prikazano na Slikama). Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 56: Funkcionalna karakterizacija Antitela 2 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu ubijanja CD25-pozitivnih ćelijskih linija u testu ADCC. Ćelije sa visokom ili niskom ekspresijom CD25, SU-DHL-1 (A) odnosno SR-786 ćelije (B), kokultivisane su zajedno sa prečišćenim NK ćelijama u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Liza ciljnih ćelija merena je otpuštanjem kalceina u supernatant, četiri sata posle dodavanja NK ćelijama. Podaci su normalizovani prema kontrolama tretiranim saponinom.

Slika 57: Funkcionalna karakterizacija Antitela 2 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija, u testu ADCP. Treg su kokultivisane zajedno sa MCSF-diferenciranim makrofagima u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Dvobojna protočn-citometrijska analiza izvedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+>/CD14-. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ].

Slika 58: Karakterizacija vezivanja Antitela 5 za CD25 eksprimiran na Karpas 299 ćelijama, pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 59: Karakterizacija Antitela 5 u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije u testu fosforilacije STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Mišje antihumano antitelo MA-251 korišćeno je kao neblokirajuća kontrola, dok je klinički Daclizumab High Yield Process (DAC HYP, daklizumab-proces sa visokim prinosom) korišćen kao blokirajuća kontrola u poređenju sa mišjim IgG1 kao izotipskom kontrolom, humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom ili u odsustvu primarnog antitela, respektivno. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, posle čega je sledilo 10 U/ml IL-2. Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 60: Testovi kompeticije, pomoću Octet sistema. Vezivanje Antitela 1 za imobilisani rhCD25, posle čega sledi ili ponovo prvo Ab (Antitelo 1 kao kontrola) ili drugo Ab, IL-2 kompetitor, npr. istraživački daklizumab i baziliksimab ili IL-2 nekompetitor, npr. 7G7B6). Antitelo 1 ne kompetira sa blokatorima IL-2 signala istraživačkim baziliksimabom (A), daklizumabom (B), dok kompetira sa 7G7B6 (ne blokira IL-2) (C).

Slika 61: Karakterizacija Antitela 5 u poređenju sa antihumanim CD25 Fc-utišanim kontrolnim antitelom, u pogledu indukovanja ADCC u reporterskom biotestu (Reporter Bioassay). Ćelije SR-786 koje eksprimiraju CD25, kokultivišu se sa Jurkat T ćelijama koje su genetički modifikovane za ekspresiju FcγRllla i NFAT-odgovornog elementa koji pokreće ekspresiju luciferaze (NFATRE-luc2) u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama).

Slika 62: Funkcionalna karakterizacija Antitela 5 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija, u testu ADCP. Treg su kokultivisane zajedno sa MCSF-diferenciranim makrofagima u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Dvobojna protočno-citometrijska analiza izvedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+>/CD14-. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ].

Slika 63: Karakterizacija Antitela 6, Antitela 7, Antitela 8 i Antitela 9, vezivanje za CD25 eksprimiran na Karpas 299 ćelijama pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 64: Testovi kompeticije pomoću Octet sistema. Vezivanje prvog Ab (Antitelo 7) za imobilisani rhCD25, posle čega sledi ili ponovo prvo Ab (kao kontrola) ili drugo Ab daklizumab (A) ili baziliksimab (B).

Slika 65: Karakterizacija Antitela 7 u poređenju sa humanim IgG1 kao izotpiskom kontrolom, daklizumabom-Hyp, ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije, u testu fosforilacije STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije se inkubiraju sa 10 µg/ml antitela, posle čega sledi 10 U/ml IL-2. Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 66: Funkcionalna karakterizacija Antitela 7 u poređenju sa antihumanim CD25 Fc-utišanim kontrolnim antitelom, u pogledu indukovanja ADCC u reporterskom biotestu. Ćelije SR-786 koje eksprimiraju CD25, kokultivisane su sa Jurkat T ćelijama koje su genetički modifikovane za ekspresiju FcγRllla i NFAT-odgovornog elementa koji pokreće ekspresiju luciferaze (NFAT-RE-luc2) u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama).

Slika 67: Funkcionalna karakterizacija Antitela 7 u poređenju sa antihumanim CD25 Fc-utišanim kontrolnim antitelom, u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija, u testu ADCP. Treg su kokultivisane sa MCSF-diferenciranim makrofagima u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Dvobojna protočno-citometrijska analiza sprovedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+>/CD14-. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ].

Slika 68: Karakterizacija Antitela 10, Antitela 11, Antitela 12, Antitela 12, Antitela 13, Antitela 14, Antitela 15, Antitela 16, Antitela 17, Antitela 18, Antitela 19, Antitela 20 i Antitela 21, koja se vezuju za CD25 eksprimiran na Karpas 299 ćelijama pri rastućim koncentracijama antitela i upoređivanje sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom.

Slika 69: Test kompeticije pomoću Octet sistema. Vezivanje prvog Ab (Antitelo 19) za imobilisani rhCD25, posle čega sledi ili ponovo prvo Ab (kao kontrola) ili drugo Ab daklizumab (A) ili baziliksimab (B).

Slika 70: Karakterizacija Antitela 10, Antitela 11, Antitela 12, Antitela 12, Antitela 13, Antitela 14, Antitela 15, Antitela 16, Antitela 17, Antitela 18, Antitela 19, Antitela 20 i Antitela 21, u poređenju sa humanim IgG1 kao izotipskom kontrolom, daklizumabom-Hyp, ili u odsustvu primarnog antitela, u pogledu blokiranja IL-2 signalizacije, u testu fosforilacije STAT5, uz korišćenje PBMC humanog porekla. Ćelije su inkubirane sa 10 µg/ml antitela, posle čega sledi 10 U/ml IL-2. Analiza je bila ograničena na procenat CD3-pozitivnih ćelija koje fosforilišu STAT5.

Slika 71: Funkcionalna karakterizacija Antitela 19 u poređenju sa antihumanim CD25 Fc-utišanim kontrolnim antitelom, u pogledu indukovanja ADCC u reporterskom biotestu. CD25-eksprimirajuće SR-786 ćelije kokultivisane su sa Jurkat T ćelijama koje su genetički inženjerisane da eksprimiraju FcγRllla i NFAT-odgovorni element koji pokreće ekspresiju luciferaze (NFAT-RE-luc2) u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama).

Slika 72: Funkcionalna karakterizacija Antitela 19 u poređenju sa antihumanim CD25 Fc-utišanim kontrolnim antitelom, u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija, u testu ADCP. Treg su kokultivisane sa MCSF-diferenciranim makrofagima, u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Dvobojna protočno-citometrijska analiza izvedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+/>CD14-. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ].

Slika 73: Funkcionalna karakterizacija Antitela 19, Antitela 12 i Antitela 20 u poređenju sa antihumanim CD25 Fc-utišanim kontrolnim antitelom u pogledu fagocitoze in vitro diferenciranih Treg ćelija, u testu ADCP. Treg su kokultivisane sa MCSF-diferenciranim makrofagima, u prisustvu različitih koncentracija antitela (kao što je prikazano na Slikama). Dvobojna protočno-citometrijska analiza izvedena je sa CD14+ obojenim makrofagima i Treg ćelijama koje su obeležene eFluor450-bojom. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+/>CD14-. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini:

% fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva) ].

Slika 74: Terapijska aktivnost IL-2 neblokirajućeg anti-CD25 antitela, 7D4 mišjeg IgG2a, u kombinaciji sa GVAX u B16BI6 modelu rezistentnom na imunsku terapiju. Pojedinačni miševi su tretirani samo primenom Gvax ili u kombinaciji sa 7D4.

Slika 75: Terapijska aktivnost IL-2 neblokirajućih anti-CD25 antitela (7D4 i 2E4) u poređenju sa IL-2 blokirajućim antitelom (PC61), u modelu CT26 tumora, uz korišćenje ženki BALB/c miševa. Anti-CD25 neblokirajuća antitela 7D4 i 2E4 pokazuju snažnu terapijsku aktivnost protiv solidnih tumora. I 7D4 i 2E4 su snažniji od IL-2-blokirajućeg antitela, PC61

Slika 76: Evaluacija terapijske aktivnosti IL-2 neblokirajućeg anti-CD25 antitela 7D4 mlgG2a u MCA205 modelu, pri jednoj i ponavljanim injekcijama, u kombinaciji sa antimišjim PD-L1. * označava miševe koji su bili živi na kraju eksperimenta.

Primeri

Primer 1 - In vitro karakterizacija i pripremanje rekombinantnih antimišjih CD25 antitela koja vrše depleciju Treg, koja ne blokiraju IL-2 ili blokiraju IL-2. Materijali i postupci

Poreklo antitela i njihova rekombinantna proizvodnja

[0153] Sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antimišjeg CD25 pacova - PC61 izvedene su iz PC-61.5.3 hibridoma (ATCC kat. br. TIB-222) brzom amplifikacijom cDNK krajeva (rapid amplification of cDNA ends, RACE) i zatim klonirane u konstantne regione mišjih IgG2a i κ lanaca (ili odgovarajuće sekvence mišjeg IgG1 izolovane iz komercijalnih plazmida (Invivogen).

[0154] Svaki lanac antitela je zatim subkloniran u retrovirusni vektor izveden iz virusa mišje leukemije (murine leukemia virus, MLV). Za preliminarne eksperimente, antitelo je proizvedeno korišćenjem K562 ćelija transdukovanih vektorima koji kodiraju teške i lake lance. Antitelo je prečišćeno iz supernatanata korišćenjem protein-G HiTrap MabSelect kolone (GE Healthcare), dijalizovano u fosfatom puferisanom slanom rastvoru (phosphate-buffered saline, PBS), koncentrovano i sterilisano filtriranjem.

[0155] Reklonirana DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antimišjeg CD 25 antitela PC-61.5.3 (mišji lgG2a) kodira sledeću proteinsku sekvencu:

[0156] Reklonirana DNK sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antimišjeg CD25 antitela PC-61.5.3 (mišji lgG2a) kodira sledeću proteinsku sekvencu:

[0157] Sekvenciranje 7D4-lgM izvršeno je na 7D4 hibridomu (ECACC, 88111402). Ekstrahovana je ukupna RNK ili mRNK i izvedena je reverzna transkripcija da bi se dobila cDNK za teške i lake lance antitela. Varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca amplifikovani su korišćenjem degenerisanih uzvodnih prajmera koji se vezuju u regionu signalnog peptida ili u regionu rama 1, i nizvodnog prajmera koji se vezuje u konstantnom regionu antitela. Amplifikovani geni se kloniraju i sekvenciraju praćenjem standardnog pristupa. cDNK se generiše reverznom transkripcijom i homopolimerni rep se dodaje na 3’ kraj cDNK. Geni varijabilnog domena antitela se zatim amplifikuju korišćenjem genski specifičnih prajmera, posle čega sledi standardno kloniranje i sekvenciranje. DNK se sekvencira konvencionalnim Sanger-ovim sekvenciranjem i podaci se analiziraju korišćenjem DNASTAR Lasergene softvera. Sekvence signalnog peptida i varijabilnog domena identifikuju se upoređivanjem sa poznatim sekvencama u IMGT bazi podataka.

[0158] Geni koji kodiraju varijabilne domene teškog i varijabilne domene lakog lanca su kodonoptimizovani za ekspresiju u humanoj ćelijskoj liniji i sintetisani sa restrikcionim mestima za NheI i AvaI, 5' i 3' od gena. Kloniranje restrikcionom digestijom izvedeno je da bi se gen varijabilnog domena teškog lanca 7D4 insertovao u zasebne ekspresione vektore koji sadrže konstantne domene mišjeg IgG1 i IgG2a. Kloniranje restrikcionom digestijom izvedeno je da bi se gen varijabilnog domena lakog lanca 7F4 insertovao u ekspresioni vektor koji sadrži mišji kapa konstantni domen. HEK293 ćelije kultivisane u suspenziji, u medijumu koji ne sadrži serum, hemijski su kotransfektovane ekspresionim vektorom za teški i laki lanac i kultivisane još 6 dana, na 37°C, u sredini sa 5% CO2i na šejkeru, pri 140 obrtaja u minutu. Kulture su sakupljene centrifugiranjem na 4000 obrtaja u minutu i dodatno prečišćene filtracijom kroz 0.22 µM filter. Supernatant je nanet na Protein A kolonu, prethodno ekvilibrisanu pomoću PBS, pH 7.2, eluiranu natrijum citratom pH 3.5 i ekvilibrisanu pomoću 10% (v/v) 0.5 M Tris pH 9.0. Neutralisanom rastvoru antitela pufer se zameni za PBS, pH 7.2 korišćenjem desalinizujuće kolone i koncentruje prema potrebi centrifugalnim koncentratorom sa graničnom vrednošću molekulske težine od 30 kDa. Koncentracija proteina određena je merenjem apsorbancije na 280 nm, a čistoća je određena korišćenjem SDS-PAGE.

[0159] Reklonirana DNK sekvenca teškog lanca antimišjeg CD25 antitela 7D4 (mišji lgG1) kodira sledeću proteinsku sekvencu:

[0160] Reklonirana DNK sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antimišjeg CD25 antitela 7D4 (mišji lgG1) kodira sledeću proteinsku sekvencu:

[0161] Reklonirana DNK sekvenca kapa-lakog lanca antimišjeg CD25 antitela za 7D4 (mlg1) i 7D4(mlg2a) (mišji IgG2a) kodira sledeću proteinsku sekvencu:

[0162] 2E4 je generisano iz 2E4 hibridoma (poklon od Dr Ethan M. Shevach, National Institute of Health). Sekvenciranje hibridoma izvedeno je vlasničkom tehnologijom sekvenciranja sledeće generacije (next generation sequencing, NGS). Uzorci RNK upotrebljeni su za generisanje biblioteke cDNK. Biblioteke su sekvencirane na Illumina platformi. De novo sklapanje upotrebljeno je za rekonstruisanje uzoračkog transkriptoma, iz sirovih podataka. Sekvence varijabilnog domena identifikovane su upoređivanjem sa poznatim sekvencama.

[0163] Proteinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca antimišjeg CD25 antitela 2E4 (mišji IgG1) je sledeća:

[0164] Proteinska sekvenca varijabilnog domena lakog lanca antimišjeg CD25 antitela 2E4 (mlg1) je sledeća:

Procenjivanje afiniteta rekombinantnih antitela za mišji CD25

[0165] ForteBio merenja afiniteta izvedena su na Octet RED384, uglavnom kako je ranije opisano (vidi, npr., Estep P et al., 2013. Mabs.5(2), 270-8). Ukratko, ForteBio merenja afiniteta izvedena su nanošenjem IgG "on-line" na AHQ senzore. Senzori se ekvilibrišu "off-line" u testnom puferu, 30 min, i zatim se prate "on-line" 60 sekundi da bi se uspostavila bazalna vrednost. Senzori sa nanetim IgG izlože se 100 nM antigenu 3 minuta, i posle toga prenesu u testni pufer, 3 min, da bi se izmerila disocijacija ("off-rate"). Svi kinetički podaci se analiziraju korišćenjem modela vezivanja 1:1.

Rezultati

[0166] Dva mišja hibridoma odabrana su kao referentno antitelo za evaluiranje osobina vezivanja za CD25 i deplecije Treg, antimišjih CD25 antitela, koja ili ne blokiraju IL-2 ili blokiraju IL-2: 7D4 (mišji IgM izotip), odnosno PC61 (mišji IgG1 izotip). Osobine koje se tiču vezivanja IL-2, koje su opisane u literaturi, preliminarno su bile potvrđene korišćenjem originalnih, nerekombinantnih antitela i rekombinantnog mišjeg IL-2 (Sl.1A). Rekombinantne varijante takvih antitela proizvedene su za testiranje antitela gde je izotip aktivniji i relevantan za funkcionalne studije (na primer deplecija Treg ili efekti na druge imunske ćelije). Pored toga, u slučaju 7D4, promena izotipa je potrebna jer osobine IgM antitela da agregiraju mogu uticati na rezultate testova. Rekombinantno 7D4(mlgG1), kao i originalno nerekombinantno IgM izotipsko antitelo, i dalje omogućava vezivanje mišjeg IL-2 za mišji CD25 (Sl. 1B).

7D4(mlgG1) vezuje se i za mišji CD25 na površini ćelije, slično rekombinantnom PC61(IgG2a) dok se referentno antihumano CD25 antitelo ne vezuje (Sl.1C).

[0167] DNK sekvenca koja kodira varijabilni domen teškog lanca 7D4 (kao i PC61) takođe je klonirana u vektor koji omogućava ekspresiju mišjeg CD25-vezujućeg domena sa mišjim IgG2a izotipom (funkcionalno odgovara humanom IgG1). Na ovaj način, moguće je uporediti dva rekombinantna antimišja CD25 antitela sa optimizovanom ADCC aktivnošću, koja mogu vršiti efikasnu depleciju unutartumorskih Treg, ali imaju različite osobine u pogledu vezivanja mišjeg IL-2 za mišji CD25. Rezultujuća rekombinantna antimišja CD25 antitela testirana su u pogledu afiniteta za CD25. Različiti izotip (mišji IgG2a ili mišji IgG1) ne utiče na ovu osobinu jer je Kd slična među rekombinantnim antitelima na bazi 7D4 (oko 1 nM) i uporediva sa jednim od PC61(mlgG2a), za koje je izmereno 4.6 nM.

[0168] Funkcionalne osobine ovih rekombinantnih antitela upoređivane su i u in vitro testu za određivanje njihovog efekta na proizvodnju granzima B u odgovoru na anti-CD3 i anti-CD28 stimulaciju (Sl. 2). Granzim B (GnzB) je serin-proteinaza koju eksprimiraju memorijske T ćelije i NK ćelije, kao i aktivirane CD4 i CD8 T ćelije, koje snažno eksprimiraju i sekretuju GnzB tokom imunskih reakcija. Ovaj enzim je važan medijator ćelijske smrti, patologije tkiva i oboljenja. Na in vitro stimulaciju i proliferaciju T ćelija anti-CD3 i anti-CD28 antitelima (pri čemu >80% CD4 T ćelija i proliferišu i eksprimiraju GnzB) mogu uticati citokini i antitela. Kada se ova stimulacija izvodi u kombinaciji sa neutrališućim anti-IL-2 antitelom, inhibirana je proizvodnja granzima B, ali ne i proliferacija: učestalost ćelija koje i proliferišu i proizvode GnzB opada sa >80% na <1%, dok učestalost proliferišućih ćelija ostaje >90%. Ovo ukazuje na to da proizvodnja granzima B, ali ne i proliferacija ćelija, zavisi od IL-2 signalizacije. Sličan pad granzim B-produkujućih T ćelija zapažen je kada se PC61 (mlgG1) doda stimulisanim T ćelijama. Međutim, 7D4 (mlgG1) uglavnom održava sposobnost CD4 T ćelija da odgovore na anti-CD3 i anti-CD28 stimulaciju proizvodnjom GnzB (>65% ćelija koje još uvek proizvode GnzB i proliferišu). Ovi rezultati potvrđuju da antitela na bazi PC61 blokiraju IL-2 signalizaciju, dok 7D4 ima samo mali efekat na ovu signalizaciju i stoga se može koristiti kao surogatsko antitelo za evaluaciju terapijskog potencijala antihumanog CD25 antitela, posebno u pogledu deplecije Treg i tumor-specifičnih svojstava, koje ne bi uticalo na IL-2 signalizaciju.

PRIMER 2 – Svojstva deplecije Treg i antikancerskog delovanja rekombinantnih antimišjih CD25 antitela koja vrše depleciju Treg i koja su ili IL-2-neblokirajuća ili IL-2-blokirajuća. Materijali i postupci

Miševi

[0169] Studije in vivo izvedene su u Charles River službi za otkrivanje lekova, Severna Karolina (CR Discovery Services, North Carolina). Ženke BALB/c miševa (BALB/c AnNcr1, Charles River) i ženke C57BL/6 miševa (C57BL/6Ncr1, Charles River) na početku studije bile su stare između sedam i devet nedelja. U CR službi za otkrivanje lekova posebno se pridržavaju preporuka Vodiča za negu i korišćenje laboratorijskih životinja (Guide for Care and Use of Laboratory Animals) u pogledu smeštaja, uzgoja, hirurških postupaka, regulacije unosa hrane i tečnosti i veterinarske nege. Program nege i korišćenja životinja pri CR službi za otkrivanje lekova akreditovan je od strane Međunarodnog udruženja za procenu i akreditaciju nege laboratorijskih životinja (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International), što garantuje usaglašenost sa prihvaćenim standardima nege i korišćenja laboratorijskih životinja.

Ćelijske linije i kultura tkiva

[0170] Tumorske ćelije MCA205 (ćelije 3-metilholantrenom indukovanog slabo imunogenog fibrosarkoma; od G. Kroemera, Gustave Roussy institut za kancer) kultivisane su u Eagle-ovom medijumu modifikovanom po Dulbecco-u (Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, Sigma) sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma (fetal calf serum, FCS, Sigma), 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina i 2 mM L-glutamina (sve od Gibco). Ćelije karcinoma kolona miša MC38 (CR služba za otkrivanje lekova) rasle su do mid-log faze u Eagle-ovom medijumu modifikovanom po Dulbecco-u (DMEM) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM glutamin, 100 jedinica/mL, penicilina G, 100 µg/mL streptomicin sulfata i 25 µg/mL gentamicina. Ćelije karcinoma kolona miša CT26 (CR služba za otkrivanje lekova) rasle su u RPMI-1640 medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM glutamin, 100 U/mL penicilin G natrijuma, 100 µg/mL streptomicin sulfata i 25 µg/mL gentamicina. Sve tumorske ćelije kultivisane su u flakonima za kulturu tkiva, u humidifikovanom inkubatoru na 37 °C, u atmosferi od 5% CO2i 95% vazduha. K562 ćelije korišćene za proizvodnju antitela kultivisane su u Dulbecco-vom medijumu modifikovanom po Iscove-u (Iscove modified Dulbecco medium, IMDM) bez fenol crvenog, dopunjenom 10% FCS bez IgG (Life Technologies).

Eksperimenti sa tumorima in vivo

[0171] Kultivisane tumorske ćelije su tripsinizovane (MCA205) ili nisu (MC38 i CT26), isprane i resuspendovane u PBS i injektirane supkutano (s.c.) u bok (5 × 10<5>ćelija u modelima MCA205 i MC38 u C57BL/6 miševe; 3 × 10<5>15 ćelija u modelu CT26 u BALB/c miševe). Antitela su injektirana intraperitonealno (i.p.) u vreme opisano u legendama slika. Za funkcionalne eksperimente, 12 dana posle implantacije, tumori i drenažni limfni čvorovi su izolovani i obrađeni za analizu protočnom citometrijom, kako je opisano (Simpson et al. (2013) J Exp Med 210, 1695-710). Za terapijske eksperimente, tumori su mereni dva puta nedeljeno i zapremina je izračunavana kao proizvod tri ortogonalna dijametra.

Protočna citometrija

[0172] Akvizicija je izvedena pomoću BD LSR II Fortessa analizatora (BD Biosciences). Korišćena su sledeća antitela: anti-CD3 (klon 145-2C11, ebioscience,25003182), anti-CD4 (klon RM4-5, BD biosciences, 560782), anti-CD8 (klon 53-6.7, Biolegend, 100750), antigranzim B (klon GB11, Invitrogen), anti-FoxP3 (klon FJK-16s, eBiosciences) i Ki67 (klon SolA15, eBiosciences, 48569882). Limfni čvorovi (ingvinalni, aksilarni i brahijalni) i tumori iz miševa disekovani su u RPMI koji ne sadrži serum. Limfni čvorovi su dispergovani kroz 70 µm filter, dok su tumori mehanički usitnjeni korišćenjem gentleMACS (Miltenyl Biotech) i digestirani smešom 0.33 mg/ml DNaze (Sigma-Aldrich) i 0.27 mg/ml liberaze TL (Roche) u RPMI koji ne sadrži serum, 30 min na 37 °C. Tumori su filtrirani kroz 70 µm filter i dobijene suspenzije pojedinačnih tumorskih ćelija obogate se leukocitima, pasažom kroz Ficollpaque (GE Healthcare) gradijent. Tumouri i LN se isperu u kompletnom RPMI, resuspenduju u FACS puferu (500 mL PBS, 2% FCS, 2 mM EDTA) i stave u ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Mastermešavina površinskih antitela pripremi se u razblaženjima prema preporuci proizvođača: anti-CD3 (klon 145-2C11, ebioscience, 25003182), anti-CD4 (klon RM4-5, BD biosciences, 560782), anti-CD8 (klon 53-6.7, Biolegend, 100750). Fiksna vitalna boja (eFlour780, eBioscience) takođe je uključena u površinsku mastermešavinu. Posle permeabilizacije u trajanju od 20 minuta uz upotrebu unutarćelijskog puferskog seta za fiksaciju i permeabilizaciju (eBioscience), primeni se panel za unutarćelijsko bojenje, koji se sastoji od sledećih antitela upotrebljenih u razblaženjima prema preporuci proizvođača: anti-granzim B (klon GB11, Invitrogen), anti-FoxP3 (klon FJK-16s, eBiosciences) i Ki67 (klon SolA15, eBiosciences, 48569882).

Rezultati

[0173] Mišji model MCA205 sarkoma dopušta generisanje miševa u kojima se imunski odgovor i ukupna efikasnost protiv solidnog tumora mogu evaluirati panelom imunomodulatornih jedinjenja, u kratkom vremenskom roku. Preciznije, rekombinantna, antimišja CD25 antitela na bazi mišjeg IgG2a, testirana su u pogledu evaluacije promena u potpopulacijama T ćelija predstavljenih tumor-infiltrirajućim limfocitima, ili u perifernim limfnim čvorovima, kao i rasta i vijabilnosti tumora miševa izloženih MCA205 tumorskim ćelijama. Dodatno antitelo (antimišji PD1) uključeno je u studiju kao negativna kontrola za imunološke efekte na Treg.

[0174] Imunološka analiza pokazuje da 7D4 antitelo, kada se klonira u osovinu mišjeg IgG2a, pokazuje sličnu sposobnost kao PC61 (mišji lgG2a) u depleciji Treg i posledično povišenju odnosa Teff prema Treg u tumoru i na periferiji, dok je anti-PD1, samo ili u kombinaciji, neefikasno (Sl.3) Prema tome, svaki dodatni efekat koji se meri korišćenjem 7D4(mlgG2a) kao surogatskog antitela za IL-2 neblokirajuće, antihumano CD25 antitelo ne izgleda udružen sa promenama osobina deplecije Treg.

[0175] Miševi u MCA205 modelu, koji su tretirani korišćenjem 7D4, pokazuju i viši procenat GnzB-pozitivnih ćelija, na primer proliferišućih CD4-pozitivnih i CD8-pozitivnih T ćelija, u odnosu ne samo na anti-PD1 tretman, već i na II-2 blokirajuće PC61 (mlg2a ). U tako tretiranim miševima, ne samo da 7D4(mlg2a), kao i PC61 (mlg2a), ne utiče na Teff ćelije, nego i povećava učestalost Teff ćelija u poređenju sa PC61 (mlg2a), što ukazuje na još veću antitumorsku aktivnost antihumanog CD25 antitela koje ne bi blokiralo interakciju IL-2/CD25 (Sl.4).

[0176] Upotreba antihumanog CD25 funkcionalno ekvivalentnog 7D4(mlg2a) za imunoterapiju kancera, posebno za solidne tumore, može se testirati u MCA205 mišjem modelu, ali i na drugim modelima kao što su modeli CT26 i MC38 (karcinom kolona) ili B16 (melanom). Oba IgG2a, antimišja CD25 antitela, pokazuju terapijsku aktivnost protiv uspostavljenih CT26 tumora kada se primenjuju u kombinaciji sa anti-PD1 antitelima. Zanimljivo, prilikom korišćenja u vidu monoterapije, IL-2-neblokirajuće antitelo 7D4(mlg2a) pokazuje jasno višu terapijsku aktivnost od antitela na bazi PC61, koje ima isti izotip. Na kraju eksperimenta, svi miševi tretirani korišćenjem samo 7D4(mlg2a) pokazuju kontrolu rasta tumora do zapremine niže od 50 mm<3>, dok nijedan od miševa tretiranih korišćenjem PC61 (mlg2a) ne pokazuje tumor manji od 50 mm<3>, pri čemu su tumori kod 8 od 10 miševa dostigli krajnju tačku od 2000 mm<3>. Ovo je ilustrovano i razlikom u preživljavanju, pri čemu su svi miševi tretirani korišćenjem 7D4(mlg2a) još uvek živi 50. dana, u odnosu na samo 2 od 10 miševa tretiranih korišćenjem PC61(mlg2a). Zaista, ako je efikasnost PC61 (mlg2a) rezultovala velikim poboljšanjem u kombinaciji sa anti-PD1, efikasnost 7D4(mlg2a) nije dodatno poboljšana, bar kada se ovo antitelo koristi u ovoj koncentraciji.

[0177] Pošto ova antitela na bazi 7D4 i PC61 pokazuju sličnu sposobnost deplecije Treg (vidi Sl. 3), takva razlika u efikasnosti mogla bi se objasniti, bar delimično, manjim uticajem 7D4(mlg2a) na interakciju IL-2 i njegovog receptora. Ovo pokazuje da ne samo da odsustvo aktivnosti blokiranja IL-2/IL-2 receptora nije štetno za terapijsku aktivnost, već bi mogla da obezbedi i terapijsku prednost. Ovi podaci, prema tome, podržavaju izbor IL-2/IL-2 receptorneblokirajućeg CD25 ciljajućeg antitela za upotrebu u terapiji kancera. Ova povoljna svojstva 7D4(mlg2a) antitela potvrđena su i kada se anti-mišji PD-L1 koristi u istom CT26 mišjem modelu (Sl.6) ili kada se MC38 mišji model koristi sa istim kombinacijama antitela (Sl.7 i Sl.

8).

[0178] Ovi podaci pokazuju da se osobine CD25-vezujućih antitela koja vrše depleciju Treg baziraju na osobinama 7D4 i da se sa odgovarajućim izotipom mogu koristiti u kombinaciji sa drugim antikancerskim jedinjenjima kao što su antitela koja ciljaju proteine kontrolne tačke imunskog odgovora (npr. protiv PD-1 i anti-PD- L1) ili druge ciljeve relevantne za kancer. Ovaj pristup se može nastaviti proizvodnjom i primenom dva proizvoda kao nove smeše monospecifičnih antitela ili kao novih bispecifičnih antitela. Ovaj pristup koji uključuje konstrukciju bispecifičnih antitela u kojima se kombinuju dva antigen-vezujuća svojstva i terapijski relevantan izotip (npr. humani IgG1) može se validirati upotrebom tehnologije duotela, koja omogućava efikasno povezivanje jednog teškog i lakog lanca iz dva različita monospecifična antitela, koji su proizvedeni zasebno i sadrže pojedinačne podudarne tačkaste mutacije u CH3 domenu, čime se omogućava Fab razmena unutar jednog heteromernog proteina (Labrijn AF et al., Nat Protoc. 2014, 9:2450-63). Funkcionalne osobine takvih proizvoda u vidu duotela na bazi 7D4 (na primer, koji uključuju anti-PD1 ili anti-PD-L1) mogu se evaluirati upotrebom modela ćelijske interakcije i deplecije korišćenih za validaciju antitela i kombinacija antitela na bazi 7D4, kako je opisano ranije u ovom tekstu.

[0179] Ovi rezultati ukazuju i da se vezujuća svojstva 7D4 koja se tiču mišjeg CD25, bez interferiranja sa interakcijom IL-2 i njegovog receptora i IL-2 signalizacijom u ćelijama koje eksprimiraju CD25, mogu iskoristiti u anti-humanom CD25 u kojem je izotip odabran konzistentno sa ovim mehanizmom delovanja (npr. humani IgG1). Zaista, nekoliko drugih svojstava može se uzeti u obzir za skrining kandidata za antihumana CD25 antitela sa dodatno poboljšanim osobinama u pogledu njihove pripreme, upotrebe i/ili primene za lečenje kancera, i posebno solidnih tumora.

[0180] Ove osobine se mogu definisati i u odnosu na osobine poznatih antihumanih CD25 kao što su Humax-TAC, baziliksimab ili daklizumab, koji svi imaju Kd za humani CD25 koji je u nanomolarnom opsegu, ali svi blokiraju vezivanje humanog IL-2 za humani CD25 (uz korišćenje klona M-A251 kao potencijalnih referentnih IL-2-neblokirajućih, anti-humanih CD25 koja će biti uključena u odabir antihumanog CD25 korišćenog u pronalasku).

[0181] Ove osobine mogu biti jedna ili više od sledećih:

- Afinitet za rekombinantni, izolovani monomerni humani CD25 sa KDispod 25 nM, poželjno ispod 10 nM i još poželjnije ispod 1 nM (kako je utvrđeno korišćenjem tehnologija kao što su Octet, Kinexa, ELISA ili druge);

- unakrsna reaktivnost sa rekombinantnim, izolovanim monomernim CD25 cinomolgusa sa KDispod 75 nM, poželjno ispod 30 nM i još poželjnije ispod 3 nM (kako je utvrđeno korišćenjem tehnologija kao što su Octet, Kinexa, ELISA ili druge);

- Afinitet za rekombinantni, monomerni humani CD25 na površini CHO ili MJ ćelija sa KDispod 100 nM, poželjno ispod 10 nM i još poželjnije ispod 1 nM (kako je utvrđeno korišćenjem tehnologija kao što su protočna citometrija, ELISA zasnovana na ćelijama ili druge);

- Afinitet za rekombinantni, monomerni CD25 rezusa na površini CHO ćelija sa KDispod 300 nM, poželjno ispod 30 nM i još poželjnije ispod 3 nM (kako je utvrđeno korišćenjem tehnologija kao što su protočna citometrija, ELISA zasnovana na ćelijama ili druge) - Vezivanje za humane Treg ćelije sa KDispod 100 nM, poželjno ispod 10 nM i još poželjnije ispod 1 nM (kako je utvrđeno korišćenjem tehnologija kao što su protočna citometrija, ELISA zasnovana na ćelijama ili druge);

- Vezivanje za Treg ćelije cinomolgusa sa KDispod 300 nM, poželjno ispod 30 nM i još poželjnije ispod 3 nM (kako je utvrđeno korišćenjem tehnologija kao što su protočna citometrija, ELISA zasnovana na ćelijama ili druge);

- Izostanak inhibicije interakcije humanog rekombinantnog IL-2 i humanog rekombinantnog CD25 u biohemijskom testu (u skriningu je blokirano manje od 25% vezivanja IL-2 za CD25, kako je opisano u Primeru 1);

- Odsustvo IL-2-indukovane signalizacije, u testu na bazi ćelija, kao što je test fosforilacije STAT5, u aktiviranim CD8-pozitivnim ili CD4-pozitivnim T ćelijama ili CD25- eksprimirajućoj ćelijskoj liniji, ili pozitivna regulacija granzima B u testu aktivacije CD4-pozitivnih T ćelija (inhibirano je manje od 25% bazalnog signala, kako je opisano u Primeru 1); i/ili

- Evaluacija relevantne snage u testovima na bazi ćelija kao što su testovi ADCC, ADCP, i/ili CDC u ćelijskim linijama koje eksprimiraju humani CD25 ili primarnim Treg ćelijama (sa EC50 ispod 10 nM, poželjno ispod 1 nM i još poželjnije ispod 0.1 nM).

Primer 3 - Dodatni in vivo eksperimenti na mišjem modelu sa Il2-neblokirajućim antimišjim CD25 antitelima

Materijali i postupci

[0182] Terapijska aktivnost IL-2-neblokirajućeg antitela: Ženkama BALB/c miševa dobijenim od Charles River injektirane su 33105 CT26 tumorske ćelije u 0% matrigelu supkutano u bok, n=15 po grupi. Životinje su nasumično raspoređene u grupe tretmana na osnovu telesne težine na Dan 1 eksperimenta. Tretman je počeo na Dan 6 i miševi su tretirani jednom injekcijom svakog od antitela (mišji IgG2a izotip, IL-2 neutrališuće antitelo, PC61 mlgG1, antimišje CD25 koje blokira IL-2 signalizaciju, mišji IgG1 izotip, i 7D4 mlgG2a, antimišje CD25 koje ne blokira IL-2 signalizaciju, mišji IgG2a izotip) u dozi od 200 µg/životinji. Životinje su primile monoterapijske tretmane, jedna grupa po antitelu, ili kombinovani tretman 7D4 mlgG2a i IL-2 neutrališuće antitelo ili 7D4 mlgG2a i PC61 mlgG1 antitelo. Miševi su žrtvovani kada je zapremina tumora dostigla 2000 mm<3>ili posle 50 dana, šta god nastupi pre.

Terapijska aktivnost IL-2-neblokirajućih antitela u poređenju sa blokirajućim antitelom

[0183] 3 × 10<5>CT26 ćelija implantira se supkutano u bok. Formiranje parova je izvršeno na dan 0 kada su tumori dostigli 30-60 mm<3>i kada se počelo sa tretmanom. Na Dan 1 i posle toga svake dve nedelje, tretman u dozi od 10 mg/kg davan je i.p. Životinje po grupama su tretirane IL-2-neutrališućim antitelom PC61-m2a, IL-2-neblokirajućim antitelom 7D4, IL-2-neblokirajućim antitelom 2E4 ili nisu bile tretirane.

Terapijska aktivnost IL-2-neblokirajućeg antitela u kombinaciji sa aPDL1 terapijom

[0184] Miševima je supkutano injektirano 50000 MCA205 tumorskih ćelija, n = 10 po grupi ili n= 5, kako je naznačeno na slikama. Životinje su nasumično raspoređene u grupe tretmana. Životinje su primale 7D4 mlgG2a ili aPD-L1 (klon 10F.9G2) kao monoterapijski tretman, 7D4 mlgG2a sa aPD-L1 (klon 10F.9G2) kao kombinovani tretman, ili nisu bile tretirane. Grupe su primale: samo a7D4 mlgG2a - dan 10 (200 ug), aPD-L1 rlgG2b (10F.9G2) - dan 6, 9 i 12 (200 ug), aPD-L1 a7D4 komb. (aPDL-1 na dan 6, 9 i 12 i a7D4 na dan 10), ili aPD-L1 a7D4 komb. (aPDL-1 na dan 6, 9 i 12 i a7D4 na dan 10), - dodatna injekcija a7D4 dan 15 aPD-L1 dan 18 (samo 5 miševa).

Rezultati

[0185] Anti-CD25 IL-2-neblokirajuće antitelo 7D4 mlgG2a koje vrši depleciju indukovalo je odbacivanje tumora kod tretiranih miševa, dok druga antitela kao monoterapija nisu pokazala efekat u poređenju sa mišjim IgG2a kao izotipskom kontrolom. Kombinacija sa IL2-blokirajućim antitelima, PC61 mlgG1 ili IL2 nAb, poništava terapijsku aktivnost IL-2-neblokirajućeg antitela 7D4 mlgG2a (Slika 13). Ovo pokazuje da je IL-2-neblokirajuće svojstvo 7D4 mlgG2a ključno za terapijsku aktivnost. Ovo takođe sugeriše da se terapijska aktivnost ovog antitela oslanja na antitumorski imunski odgovor posredovan T efektorskim ćelijama čija optimalna aktivnost zavisi od IL-2 signalizacije. Ovi rezultati pokazuju da je odsustvo IL-2/CD25-blokirajuće aktivnosti potrebno za optimalnu terapijsku aktivnost antitela koje cilja CD25 i podržavaju upotrebu anti-CD25 IL-2-neblokirajućeg antitela, kako je ovde opisano, u terapiji kancera.

[0186] Ovi rezultati pokazuju još i to da odsustvo IL-2/CD25-blokirajuće aktivnosti nije štetno za terapijsku aktivnost antitela i podržavaju upotrebu anti-CD25 IL-2-neblokirajućeg antitela kako je ovde opisano u terapiji kancera.

[0187] Ovi rezultati pokazuju još i to da su IL-2-neblokirajuća antitela, 7D4 i 2E4, moćnija od IL-2-blokirajućeg antitela, PC61. Anti-CD25 neblokirajuća antitela 7D4 i 2E4 ispoljavaju snažnu terapijsku aktivnost protiv solidnih tumora (Slika 75).

[0188] Rezultati su pokazali da pojedinačna ili ponovljene injekcije IL2-neblokirajućeg aCD25 antitela 7D4 posle početka terapije sa aPDL1 pojačavaju antitumorske odgovore. Teff ćelije aktivirane posle tretmana korišćenjem aPDL1 su pošteđene i njihova aktivnost je pojačana antitelom aCD25 (Slika 76).

Primer 4 – Karakterizacija epitopa anti-CD25 IL-2-neblokirajućih antitela.

Grupisanje epitopa

[0189] Grupisanje epitopa antitela izvedeno je na Forte Bio Octet Red384 sistemu (Pall Forte Bio Corporation, Menlo Park, CA) uz korišćenje standardnog testa grupisanja u "sendvič" formatu. Antimišje CD25 PC61 antitelo naneto je na AMC senzore i nezauzeta Fc-vezujuća mesta na senzoru blokirana su nerelevantnim mišjim IgG1 antitelom. Senzori su zatim izloženi prisustvu 15 nM ciljnog antigena, što je praćeno antitelom 7D4. Podaci su obrađeni korišćenjem ForteBio Data Analysis softvera 7.0. Dodatno vezivanje sa drugim antitelom posle priključivanja antigena ukazuje na nezauzeti epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Mapiranje epitopa anti-CD25 IL-2-neblokirajućih antitela

[0190] Različiti setovi linearnih, jednopetljastih, β-okret-mimetika, mimetika disulfidnog mosta, diskontinuiranih disulfidnih mostova, peptidnih mimetika diskontinuiranih epitopa, koji predstavljaju sekvencu humanog CD25 (Uniprot pristupni br. P01589) sintetisani su uz korišćenje Fmoc-sinteze na čvrstoj fazi (Pepscan BV, The Netherlands; Timmermann P et al., 2007 J. Mol. Recognit., 20, 283-99; Langedijk JP et al., 2011, Analytical Biochemistry.

417:149-155). Vezivanje antitela za svaki od sintetisanih peptida testirano je pomoću ELISA (Pepscan, The Netherlands). Peptidni mikročipovi se inkubiraju sa rastvorom primarnog antitela (preko noći na 4°C). Posle ispiranja, peptidni mikročipovi se inkubiraju sa 1/1000 razblaženjem odgovarajućeg konjugata antitelo-peroksidaza (2010-05; Southern Biotech) jedan sat na 25°C. Posle ispiranja, dodaju se supstrat za peroksidazu, 2,2’-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat (2,2’-azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate, ABTS) i 20 µl/ml 3-procentnog H2O2. Posle jednog sata, meri se razvijanje boje. Razvijanje boje kvantifikuje se CCD kamerom (charge coupled device, CCD, uređaj koji koristi vezana naelektrisanja) i sistemom za obradu slike. Vrednosti dobijene sa CCD kamere u rasponu su od 0 do 3000 mAU, slično standardnom čitaču ELISA ploča sa 96 bunarčića. Da bi se verifikovao kvalitet sintetisanih peptida, paralelno je sintetisan zaseban set pozitivnih i negativnih kontrolnih peptida i pretražen je irelevantnim, kontrolnim antitelima.

Rezultati

[0191] Grupisanje epitopa izvedeno je da bi se odredilo da li se antitela vezuju za epitope koji se preklapaju sa epitopima za komercijalno dostupno mišje antihumano IL-2-neblokirajuće CD25 antitelo, 7G7B6. Antitela se dodatno karakterišu da bi se odredili epitopi za IL-2-neblokirajuća antitela. Epitop antimišjeg CD25-blokirajućeg antitela, PC61, određen je za uporednu kontrolu. Rezultati mapiranja epitopa prikazani su u Tabeli 1 za antihumana CD25 antitela i Tabeli 2 za antimišja CD25 antitela:

Tabela 1 - antihumana CD25 antitela

[0192] Numerisanje aminokiselinske (aa) sekvence bazirano je na humanom CD25 uzetom iz sekvence objavljene pod Uniprot pristupnim brojem P01589.

Tabela 2 - antimišja CD25 antitela

[0193] Numerisanje aminokiselinske (aa) sekvence bazirano je na mišjem CD25 uzetom iz sekvence objavljene pod Uniprot pristupnim brojem P01590.

[0194] Studija mapiranja epitopa koja je sprovedena korišćenjem Pepscan tehnologije pokazuje da se antihumana antela vezuju za humani CD25 na epitopu koji se ne preklapa sa IL-2-vezujućim mestom na CD25. Antihumana antitela vezuju se za različiti epitop od baziliksimaba i daklizumaba. Epitop za baziliksimab i daklizumab sadrži rezidue u regionu amino-kiselina 137-143 (iz SEQ ID NO: 1), koje se preklapaju sa stranom interakcije CD25 sa IL-2 (Binder M et al, Cancer Res 2007 vol 67(8): 3518-23). Antimišja CD25-neblokirajuća antitela, 2E4 i 7D4, prepoznaju epitop različit od onog koji prepoznaje PC61.

Primer 5: Karakterizacija mišjih anti-CD25 antitela

Vezivanje antitela za CHO ćelije koje eksprimiraju mišji CD25

[0195] Vezivanje za CHO ćelije koje eksprimiraju CD25 ispitano je bojenjem testnih artikala (anti-CD25 primarna antitela, 7D1, PC61 i 2E4) koncentracijom antitela od 30 mg/ml, što je praćeno semilogaritamskom serijom razblaženja (7 tačaka) tokom 30 minuta na ledu. Posle toga je usledilo bojenje sekundarnim antitelima (Alexa Fluor 647-AffiniPure Fab fragment kozji antihumani IgG (H+L) - (Jackson ImmunoResearch)) koncentracije od 1 mg/ml tokom 30 minuta na ledu. Svi uzorci su obojeni u duplikatu. Žive ćelije su ograđivane korišćenjem FSC naspram SSC parametara protočnom citometrijom tokom akvizicije uzorka. Srednji intenzitet fluorescencije (mean fluorescence intensity, MFI) obojenih ćelija unosi se na XY dijagram koji grafički prikazuje MFI u odnosu na log koncentracije, i podaci se podešavaju prema nelinearnoj regresionoj krivoj, odakle se izračunava EC50. Rezultati prikazani na Slici 11 potvrdili su da se antimišja CD25 antitela vezuju za CHO ćelije koje eksprimiraju mišji CD25.

Merenja afiniteta anti-mCD25 antitela.

[0196] Afinitet antimišjih CD25 antitela, 7D4, PC61 i 2E4, demonstriran je merenjem njihove KDputem SPR u Biacore 2000, uz korišćenje CM-5 senzorskog čipa, na ambijentalnoj temperaturi eksperimenta od 25°C. Antimišje antitelo je na početku imobilisano u svim ćelijama za protok, u puferu za analizu (pH 7.4, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Tween 20) pri RU od 16000-18000 tokom 10 minuta. Ligand (antitela koja su testni artikli) se posle toga nanesu do nivoa kapture između 119-163 RU. Analit (rekombinantni mišji his-označeni CD25) se zatim priključi u puferu za analizu u dvostrukim razblaženjima počevši od 800 nM, sa najnižom koncentracijom od 3.13 nM, tokom 6 minuta. Disocijacija se izvodi u puferu za analizu tokom 10 minuta. Koraci regeneracije između koncentracija uzorka izvode se u 10 mM glicinu pH1.7 tokom 10 minuta. Stopa protoka od 25 µl/min održava se tokom procesa. Kinetički podaci se podešavaju korišćenjem softvera za globalnu analizu modela bivalentnog analita koji je obezbedio Biacore, uz odbitak referentne vrednosti. Analiza na bazi SPR prikazana je na Slici 12. Kd vrednosti koje su uspostavljene u ovom testu za antimišja CD25 antitela su sledeće: za 7D4, 2.6 × 10<-9>M; za 2E4114 × 10<-9>M, i za PC61 3.6 × 10<-9>M (rezultati nisu prikazani).

Kompeticija antimišjeg antitela u Octet sistemu

[0197] Kompeticije antitela izvedene su na Forte Bio Octet Red96 sistemu (Pall Forte Bio Corp., USA) uz korišćenje standardnog "sendvič" testa grupisanja. 10 nM antimišje CD25 antitelo se nanese na AMC senzore u trajanju od 900 s i nezauzeta Fc-vezujuća mesta na senzoru se blokiraju nerelevantnim mišjim IgG2a antitelom. Senzori se izlože 15 nM ciljnom antigenu (mišji his-označeni CD25) u trajanju od 600 s, posle čega sledi drugo anti-CD25 antitelo (takođe 10 nM). Podaci se obrade korišćenjem Forte Bio Data Analysis softvera 9.0. Dodatno vezivanje sa drugim antitelom posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzeti epitop, dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa.

[0198] Kompetitivno vezivanje za mCD25 zapaženo je između 7D4 i 2E4 (Slika 13(A)), ali ne između 7D4 i PC61 (Slika 13(B).

In vitro IL-2 signalizacija merena u testu fosforilacije STAT5:

[0199] Pan-T ćelije se izoluju iz splenocita korišćenjem Dynabeads<®>FlowComp™ kita za mišje pan-T ćelije (CD90.2), Invitrogen (kat. br: 11465D).200000 ćelija zaseje se i ostavi 2 sata na 37°C. Antitela se dodaju u koncentraciji od 50 ug/ml i inkubiraju sa ćelijama tokom 30 min na 37°C, posle čega se ćelije stimulišu IL2 (50 U/ml) tokom 10 min na 37°C.

[0200] IL-2-indukovana fosforilacija STAT5 zaustavlja se kada se ćelije fiksiraju i permeabilišu korišćenjem eBioscience™ puferskog seta za bojenja Foxp3 / transkripcionih faktora) (Invitrogen) i tretiraju korišćenjem BD Phosflow Perm pufera III (BD Biosciences). Ćelije se zatim istovremeno boje površinskim i unutarćelijskim antitelima obeleženim fluorohromom (STAT5-Alexa Fluor 647 klon 47/stat5/pY694 BD Bioscience, CD3-PerCP-Cy5.5 klon 17A2 Biolegend, CD4-PE klon RM4-5 Biolegend, FoxP3-AF488 klon FJK-16s Ebioscience) i uzorci se prikupljaju na Fortessa LSR X20 protočnom citometru (BD Bioscience) i analiziraju korišćenjem BD FACSDIVA softvera. Dubleti se isključuju korišćenjem FCS-H naspram FCS-A, i limfociti se definišu korišćenjem SSC-A naspram FCS-A parametara. CD3<+>T ćelije definišu se korišćenjem grafikona CD3 PerCP-Cy5.5-A prema FCS-A i ograda se unosi na histogram koji prikazuje broj u odnosu na STAT5 Alexa Fluor 647-A, da bi se odredila populacija STAT5<+>CD3<+>T ćelija. Procenat blokiranja IL-2 signalizacije izračunava se na sledeći način: % blokiranja = 100 × [(% Stat5<+>ćelija grupa bez Ab - % Stat5<+>ćelija grupa 50 ug/ml Ab) / (% Stat5<+>ćelija grupa bez Ab)]. Dodatna analiza fosforilacije STAT5 različitim podsetovima T ćelija (CD4<+>, CD8<+>, CD4<+>FoxP3-) takođe se procenjuje ograđivanjem na respektivne podsetove i analizira kao gore. Grafikoni i statistička analiza izvode se korišćenjem GraphPad Prism v7 (rezultati nisu prikazani). Rezultati su prikazani na Slici 14.

Rezultati:

[0201] Antimišja antitela, 7D4 i 2E4, evaluirana su i u pogledu sposobnosti da se vezuju sa CD25 i da ne interferiraju sa IL-2 signalizacijom ciljnih ćelija koje eksprimiraju CD25.7D4 i 2E4, koji ne blokiraju IL-2, kompetiraju u vezivanju sa CD25, dok PC61 (blokator IL-2 signalizacije) ne kompetira sa 2E4 ili 7D4 u vezivanju sa CD25 (Slika 12).

[0202] STAT5 test potvrdio je da 7D4 i 2E4 nisu blokirali IL-2 signalizaciju dok je IL-2 signalizacija bila blokirana "blokirajućim" antitelom PC61 (Slika 14).

Primer 6: In vivo deplecija Treg

[0203] 1 ×10<5>4T1 ćelija u 200 µl RPMI 1640 medijumu implantira se u 2. torakalno jastuče masnog tkiva kod Balb/c miševa. Kada tumori dostignu 50-100 mm<3>miševi se nasumično rasporede i svaki miš primi intraperitonealno jednu ravnu dozu od 2 µg, 20 µg ili 200 µg mišjeg antimišjeg CD25 (7D4) antitela. Na dan 3 i dan 9, tumorska tkiva i cela krv izoluju se za imunofenotipizaciju.

Rezultati:

[0204] Antitelo 7D4 pokazalo je aktivnost deplecije Treg u celoj krvi i tumorskom tkivu, bazirano na analizi imunofenotipizacijom posle doziranja na dan 3 i dan 9 (Slika 15).

Primer 7: Karakterizacija anti-CD25 antitela 7G76B

Vezivanje anti-CD25 antitela za humane CD25-eksprimirajuće ćelije:

[0205] 7G76B se evaluira vezivanjem za ćelijske linije humanog limfoma, Karpas 299, SU-DHL-1 i SR-786 i in vitro diferencirane Treg ćelije. Vezivanje za CD25-eksprimirajuće humane ćelijske linije (SU-DHL-1 i SR-786) ispitivano je tako što su ćelije prvo blokirane rastvorom Trustain (Biolegend) i zatim inkubirane sa anti-CD25 antitelima titrovanim u semilogaritamskim serijskim razblaženjima od najviše koncentracije od 20 µg/ml, 30 minuta na 4°C, pre ispiranja i inkubacije sa PE-konjugovanim antihumanim IgG Fc antitelom (Biolegend). Ćelije su ponovo isprane i resuspendovane u FACS puferu koji sadrži DAPI i prikupljene na Intellicyt iQue. Žive ćelije su ograđivane korišćenjem FSC naspram SSC parametara, protočnom citometrijom, tokom akvizicije uzorka. Geometrijski srednji intenzitet obojenih ćelija unet je na XY dijagram, čime se grafički prikazuje geometrijski srednji intenzitet u odnosu na logaritam koncentracije, a podaci se podešavaju prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje se izračunava EC50.

[0206] Vezivanje za CD25-eksprimirajuće Karpas 299 ćelije i in vitro diferencirane Treg ispitivano je bojenjem testnih artikala (primarna anti-CD25 antitela) korišćenjem 30 mg/ml antitela, posle čega su sledila semilogaritamska serijska razblaženja (7 tačaka) u trajanju od 30 minuta, na ledu. Ovo je praćeno bojenjem sekundarnim antitelima (Alexa Fluor 647-AffiniPure Fab fragment kozji antihumani IgG (H+L) - (Jackson ImmunoResearch)), u koncentraciji od 1 mg/ml, tokom 30 minuta, na ledu. Svi uzorci su obojeni u duplikatu. Žive čelije su ograđivane korišćenjem FSC naspram SSC parametara, protočnom citometrijom, tokom akvizicije uzorka. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) obojenih ćelija unet je na XY dijagram, čime se grafički prikazuje MFI u odnosu na log koncentracije, a podaci se podešavaju prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje se izračunava EC50. Rezultati prikazani na Slici 16 i Slici 21 potvrdili su da se anti-CD25 antitela vezuju za CD25-eksprimirajuće ćelije.

In vitro IL-2 signalizacija merena u testu fosforilacije STAT5:

[0207] IL-2-blokiranje okarakterisano je korišćenjem testa fosforilacije STAT5 u kojem je ispitivana IL-2 signalizacija. Prethodno zamrznute PBMC (Stemcell Technologies) kultivisane su u pločama sa 96 bunarčića sa U-dnom, u prisustvu 10 µg/ml anti-CD25 antitela, u trajanju od 30 minuta, pre dodavanja IL-2 (Peprotech) u različitim koncentracijama od 0,1 U/ml, 1U/ ml ili 10 U/ml, u trajanju od 10 minuta, u RPMI 1640 (Life Technologies) koji sadrži 10% FBS (Sigma), 2 mM L-glutamin (Life Technologies) i 10000 U/ml Pen-Strep (Sigma). IL-2-indukovana fosforilacija STAT5 se zaustavlja kada se ćelije fiksiraju i permeabilišu eBioscience™ puferskim setom za bojenje Foxp3 / transkripcionih faktora (Invitrogen) i tretiraju BD Phosflow Perm puferom III (BD Biosciences). Ćelije su zatim simultano obojene površinskim i unutarćelijskim antitelima obeleženim fluorohromom (STAT5-Alexa Fluor 647 klon 47/stat5/pY694 BD Bioscience, CD3-PerCPCy5.5 klon UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 klon SK3 BD Bioscience, CD8-Alexa Fluor 700 klon RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 klon HI100 Invitrogen, FoxP3-Alexa Fluor 488 klon 236A/E7 Invitrogen) i uzorci se prikupljaju na Fortessa LSR X20 protočnom citometru (BD Bioscience) i analiziraju korišćenjem BD FACSDIVA softvera. Dubleti se isključuju korišćenjem FCS-H prema FCS-A, i limfociti se definišu korišćenjem SSC-A prema FCS-A parametara. CD3<+>T ćelije su definisane korišćenjem CD3 PerCP-Cy5.5-A prema FCS-A dijagrama i ograda je uneta na histogram koji pokazuje broj u odnosu na STAT5 Alexa Fluor 647-A, da bi se odredila populacija STAT5<+>CD3<+>T ćelija. Procenat blokiranja IL-2 signalizacije izračunava se na sledeći način: % blokiranja = 100 × [(% Stat5<+>ćelije grupa bez Ab - % Stat5<+>ćelije grupa 10 ug/ml Ab) / (% Stat5<+>ćelije grupa bez Ab)]. Dodatna analiza fosforilacije STAT5 različitim podgrupama T ćelija (CD4<+>, CD8<+>, CD4<+>FoxP3<+>, naivne i memorijske T ćelije) vršena je ograđivanjem na odgovarajuće podgrupe i tumačenjem kako je opisano gore. Grafikoni i statistička analiza izvedeni su korišćenjem GraphPad Prism v7 (rezultati nisu prikazani). Rezultati su prikazani na Slici 17 i Slici 22.

In vitro test aktivacije T ćelija:

[0208] Uticaj IL-2 signalizacije na Teff odgovore okarakterisan je u testu aktivacije T ćelija, u kojem su ispitivane pozitivna regulacija unutarćelijskog granzima B (GrB) i proliferacija. Prethodno zamrznute primarne humane pan-T ćelije (Stemcell Technologies) obeležene su bojom za proliferaciju ćelija eFluor450 (Invitrogen) prema preporuci proizvođača i dodate u ploče sa 96 bunarčića sa U-dnom u količini od 1 ×10<5>ćelija/bunarčiću, u RPMI 1640 (Life Technologies) koji sadrži 10 % FBS (Sigma), 2 mM L-glutamin (Life Technologies) i 10000 U/ml Pen-Strep (Sigma). Ćelije su zatim tretirane sa 10 µg/ml anti-CD25 antitela ili kontrolnim antitelima, a zatim humanim T-aktivatorskim CD3/CD28 perlicama (odnos ćelija prema perlicama 20:1; Gibco) i inkubirane 72 sata na 37°C, u humidifikovanom inkubatoru sa 5% CO2. Za procenu aktivacije T ćelija, ćelije se boje eBioscience bojom za trajno bojenje živih ćelija, efluor780 (Invitrogen), posle čega slede fluorohromom obeležena antitela na površinske markere T ćelija (CD3-PerCP-Cy5.5 klon UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 klon SK3 BD Bioscience, CD8-Alexa Fluor 700 klon RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 klon HI100 Invitrogen, CD25-BUV737 klon 2A3 BD Bioscience) i zatim se ćelije fiksiraju i permeabilišu korišćenjem eBioscience™ puferskog seta za bojenje Foxp3 / transkripcionih faktora (Invitrogen), pre bojenja na unutarćelijski GrB i unutarnukleusni FoxP3 (granzim B-PE klon GB11 BD Bioscience, FoxP3-APC klon 236A/E7). Uzorci se prikupe na Fortessa LSR X20 protočnom citometru (BD Bioscience) i analiziraju BD FACSDIVA softverom. Dubleti se isključujui korišćenjem FCS-H prema FCS-A, i limfociti se definišui korišćenjem SSC-A prema FCS-A parametara. Podgrupe CD4<+>i CD8<+>T ćelija ograđenih od živih CD3<+>limfocita procenjuju se korišćenjem dijagrama GrB-PE-A prema proliferaciji sa eFluor450-A. Rezultati su prikazani kao procenat proliferišućih GrB-pozitivnih ćelija u odnosu na celu populaciju CD4<+>T ćelija. Grafikoni i statistička analiza izvedeni su korišćenjem GraphPad Prism v7. Rezultati su prikazani na Slici 18.

In vitro test ADCC:

[0209] Testovi ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (testovi ADCC) izvedeni su da bi se okarakterisala antihumana CD25 antitela, uz korišćenje SU-DHL-1 ili SR-786 (CD25 pozitivnih) humanih ćelijskih linija kao ciljnih ćelija, sa humanim NK ćelijama kao izvorom efektorskih ćelija. NK ćelije su izolovane iz PBMC zdravih donora, korišćenjem kita za negativnu selekciju i izolaciju NK ćelija (NK cell negative isolation kit, Stemcell Technologies). NK ćelije se kultivišu preko noći u prisustvu 2 ng/mL IL-2 (Peprotech). SU-DHL-1 ili SR-786 ciljne ćelije se napune kalceinom-AM (Thermofisher) i zaseju, 4 ponovka po uslovu, u prisustvu anti-CD25 ili izotipskih antitela, 30 min na 37°C, 5% CO2. Posle inkubacije, NK ćelije se dodaju u bunarčiće u odnosu cilj:efektor (T:E) 1:10 (10000 ciljnih ćelija i 100000 efektorskih ćelija) i inkubiraju 4 h, na 37°C, 5% CO2. Očitavanje fluorescencije kalceina u supernatantu izvodi se na BMG Fluostar čitaču ploča. Procenat specifične lize izračunava se u odnosu na samo ciljne ćelije (0% liza) i ciljne ćelije tretirane 0.1% saponinom (100% liza). Grafikoni sa sirovim podacima konstruišu se korišćenjem Graphpad Prism v7 da bi se generisale dozno-zavisne krive. Procenat lize ciljnih ćelija nanosi se na XY dijagram koji grafički prikazuje normalizovani procenta oslobađanja kalceina AM u odnosu na log koncentracije, a podaci se podešavaju prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje se izračunava EC50. Rezultati su prikazani na Slici 19.

In vitro test ADCP:

[0210] Testovi ćelijama posredovane fagocitoze zavisne od antitela (ADCP) izvedeni su korišćenjem in vitro diferenciranih Treg kao ciljnih ćelija i makrofaga poreklom od monocita kao efektorskih ćelija. PBMC su izolovane iz leukocitnih konusa pomoću centrifugiranja na fikolnom gradijentu. Monociti (CD14+ ćelije) izolovani su korišćenjem CD14 mikroperlica (Miltenyi Biotec). Monociti su kultivisani 5 dana u prisustvu 50 ng/ml M-CSF u RPMI 1640 (Life Technologies) koji sadrži 10% FBS (Sigma), 2 mM L-glutamin (Life Technologies) i 10000 U/ml Pen-Strep (Sigma), sveži medijum koji sadrži M-CSF dodaje se posle 3 dana. Regulatorne T ćelije (Treg) izoluju se korišćenjem kita za diferencijaciju humanih Treg ćelija (R&D Systems). Ove ćelije se inkubiraju u humidifikovanom inkubatoru na 37°C, sa 5% CO2, 5 dana i obeleže eFluor450-bojom (Invitrogen), po preporuci proizvođača. Na dan 5, makrofagi i Treg obeleženi eFluor450-bojom se kokultivišu 4 sati pri odnosu efektora prema cilju od 10 prema 1, u prisusutvu anti-CD25 antitela ili kontrola, kako je opisano u nastavku. Ciljne ćelije (Treg) dodaju se u količini od 1 ×10<4>ćelija/bunarčiću dok se efektorske ćelije (makrofagi) dodaju u količini od 1 ×10<5>ćelija/bunarčiću, da bi se postigao odnos efektora prema cilju od 10 prema 1. Anti-CD25 antitela se zatim dodaju u najvišoj koncentraciji od 1 µg/ml, što je praćeno log serijom (7 tačaka) u duplikatima. Ćelije i antela se inkubiraju 4 sata na 37°C, 5% CO2. Da bi se procenila ADCP, ćelije se stave na led, oboje ćelijskim površinskim markerom CD14 (CD14-PerCP-Cy5.5 klon MfP9 BD Biosciences) i fiksiraju eBioscience puferom za fiksaciju. Dvobojna protočno-citometrijska analiza sprovedena je pomoću Fortessa LSR X20. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja<+>/CD14-. Makrofagi su definisani kao CD14<+>. Smatra se da dvostruko obeležene ćelije (eFluor450-boja<+>/CD14<+>) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini: % fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva)]. Rezultati su prikazani na Slici 20.

Statistika:

[0211] Prism softver (GraphPad) upotrebljen je za izvođenje podešavanja krive da bi se odredile EC50 vrednosti i maksimalna aktivnost.

Humana antitela ne blokiraju interakciju IL2-CD25

[0212] Interferencija sa vezivanjem IL2 liganda za CD25 izvedena je na Forte Bio Octet Red384 sistemu (Pall Forte Bio Corp., SAD) uz korišćenje standardnog "sendvič" testa grupisanja. MA251 antitelo se nanese na AHQ senzore i nezauzeta Fc-vezujuća mesta na senzoru se blokiraju nerelevantnim humanim IgG1 antitelom. Senzori se izlože 100 nM humanom CD25, a zatim 100 nM humanom IL-2. Podaci se obrađuju Forte Bio Data Analysis softverom 7.0. Dodatno vezivanje humanog IL2 posle asocijacije antigena ukazuje na nezauzet epitop (nekompetitor), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor).

Rezultati:

[0213] Antitelo 7G7B6 evaluirano je još i u pogledu svoje sposobnosti da ne interferira sa IL-2 signalizacijom i kapaciteta za ubijanje CD25-eksprimirajućih ciljnih ćelija. U testu STAT5, 7G7B6 nije blokiralo IL-2 signalizaciju bez obzira na testirane koncentracije IL-2, dok je IL-2 signalizacija bila u potpunosti blokirana referentnim antitelom daklizumabom (Slika 17). Daklizumab, za koji je pokazano da blokira interakciju CD25 sa IL-2 putem takozvanog "Tac" epitopa (Queen C et al, 1989, PNAS. 86(24):10029-10033, i Bielekova B, 2013, Neurotherapeutics, 10(1):55-67), vezuje se za epitop različit od onog za koji se vezuje 7G7B6 (Slika 10 i Slika 24B), što može objasniti zašto daklizumab blokira IL-2 signalizaciju, a 7G7B6 ne blokira IL-2 signalizaciju u testu fosforilacije STAT5 (Slika 17). Pored toga, daklizumab smanjuje efektorske odgovore aktiviranih T ćelija, verovatno zbog blokiranja IL-2 signalizacije, dok 7G7B6, koji ne blokira IL-2 signalizaciju, nema negativan uticaj na odgovore T ćelija (Slika 18). Konačno, himerno antitelo 7G7B6 ubija CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije, putem ADCC (Slika 19) i ADCP (Slika 20), u poređenju sa IgG1 kao izotipskim antitelom.

[0214] U zaključku, 7G7B6 kao himerno antitelo je okarakterisano i pokazuje snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili kancerske ćelijske linije) i ne interferira sa IL-2 signalizacijom, i posledično ne inhibira T efektorske odgovore. 7G7B6 je stoga antitelo koje vrši depleciju Treg i koje bi se moglo primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

[0215] Antitelo MA-251 evaluirano je još i u pogledu svoje sposobnosti da ne interferira sa IL-2 signalizacijom. Antitelo MA251 procenjivano je u testu IL2-CD25 kompeticije na Octet sistemu. Zapaženo je istovremeno vezivanje IL2 i MA251 za CD25 (Slika 23), što pokazuje da se MA251 vezuje na nekompetitivan način. U testu STAT5, MA-251 nije blokiralo IL-2 signalizaciju bez obzira na testirane koncentracije IL-2, dok je IL-2 signalizacija potpuno blokirana referentnim antitelom daklizumabom (Slika 22). Daklizumab, za koji je pokazano da blokira interakciju CD25 sa IL-2 putem takozvanog "Tac" epitopa (Queen C et al, 1989. i Bielekova B, 2013.) vezuje se za epitop različit od onog za koji se vezuje MA-251 (Slika 10 i Slika 24 (E)), što može objasniti zašto daklizumab blokira IL-2 signalizaciju, a MA-251 ne blokira IL-2 signalizaciju, u testu fosforilacije STAT5 (Slika 22).

Primer 8: Test kompeticije antihumanog CD25 Ab

[0216] Kompeticije antitela izvedene su na sistemu Forte Bio Octet Red96 (Pall Forte Bio Corp., SAD) uz korišćenje standardnog testa sekvencijalnog vezivanja.26.8 nM rekombinantni humani his-obeleženi CD25 nanese se na Ni-NTA biosenzore, u trajanju od 200 s. Posle početnog koraka na kinetičkom puferu, senzori se izlože 66.6 nM prvom antitelu u trajanju od 600 s ili 1800 s, posle čega sledi drugo anti-CD25 antitelo (takođe u koncentraciji od 66.6 nM, u trajanju od 600 s ili 1800 s). Podaci se obrađuju pomoću Forte Bio Data Analysis softvera 9.0. Dodatno vezivanje drugog antitela ukazuje na nezauzet epitop (nema kompeticije za epitop), dok izostanak vezivanja ukazuje na blokiranje epitopa (kompeticija za epitop).

Rezultati

[0217] mAb koja nisu blokatori IL-2 signala (Antitelo 1 i Antitelo 3) kompetiraju jedan sa drugim ili sa 7G7B6 i MA251, dok ne kompetiraju sa istraživačkim daklizumabom ili istraživačkim baziliksimabom (primeri (A) do (N), Slika 24). Blokatori IL-2 signalizacije (tj. TSK031) kompetiraju sa istraživačkim daklizumabom i istraživačkim baziliksimabom i ne kompetiraju sa 7G7B6 (primeri (O) do (Q), Slika 24).

Primer 9: Terapijska analiza neblokirajućeg antitela

[0218] Na dan 0, 1 × 10<7>SU-DHL-1 ćelija u 200 µl RPMI 1640, implantira se u desni bok. Na dan 12, miševi sa palpabilnim tumorima nasumično se rasporede u grupe tretmana prenosnikom ili Antitelom 1 u dozi od 2 mg/kg, dva puta nedeljno. Na dan 15, miševi sa tumorom veličine 100-200 mm<3>nasumično se rasporede i doziraju prenosnikom, Antitelom 1 u dozi od 2 mg/kg, dva puta nedeljno ili jednom dozom antitela 1 u dozi od 10 mg/kg.

Rezultati

[0219] Antitelo 1 sprečilo je rast kod 9/10 miševa sa palpabilnim tumorima, pri dozi od 2 mg/kg, dva puta nedeljno (Slika 25 (A)-(B)). Kod miševa sa tumorom veličine 100-200 mm<3>, Antitelo 1 takođe je sprečilo rast tumora u dozama od 2 mg/kg, dva puta nedeljno i jednoj dozi od 10 mg/kg (Slika 25 (C)-(E)).

Primer 10: Merenja afiniteta antihumanih CD25 antitela

[0220] Afinitet antihumanih CD25 antitela određivan je merenjem njihove KDpomoću SPR u Biacore 2000, uz korišćenje CM-5 senzorskog čipa, na ambijentalnoj temperaturi eksperimenta od 25°C. Antihumano antitelo se na početku imobiliše u svim ćelijama za protok, u analitičkom puferu (pH 7.4, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Tween 20) na RU između 12000-14000, u trajanju od 10 minuta. Ligand (antitela kao testni artikli) se redom nanesu do nivoa kapture između 145-190 RU. Analit (rekombinantni humani his-označeni CD25) se zatim priključi u puferu za analizu u dvostrukim razblaženjima počevši od 400 nM, sa najnižom koncentracijom od 3.13 nM, tokom 6 minuta. Disocijacija se izvodi u puferu za analizu tokom 10 minuta. Koraci regeneracije između koncentracija uzorka izvode se u 10 mM glicinu pH1.7 tokom 10 minuta. Stopa protoka od 25 µl/min održava se tokom procesa. Kinetički podaci se podešavaju korišćenjem softvera za globalnu analizu konformacionih promena u 2 stanja, obezbeđenog od strane Biacore, sa referentnim odbitkom, za Sliku 26 (C) i Sliku 26(D). Langmuir-ov model 1:1 sa referentnim odbitkom upotrebljen je za Sliku 26 (A), Sliku 26 (B) i Sliku 26 (E).

[0221] ForteBio merenja afiniteta izvedena su na Octet RED384, uglavnom kako je ranije opisano (vidi npr., Estep P et al., 2013. Mabs.5(2), 270-8).

[0222] Alternativno, afinitet antihumanih CD25 antitela određen je merenjem njihove KDbioslojnom interferometrijom na sistemuOctet Red 96 (Pall Forte Bio Corp., USA). Senzori se ekvilibrišu off-line u kinetičkom puferu, 10 minuta, a zatim se prate on-line, 60 sekundi, da bi se uspostavila bazalna vrednost. Na AHC biosenzor nanese se 13.32 nM antitelo, u trajanju od 200 s, posle čega slede različite koncentracije his-obeleženog rhCD25 (1:3 serijska razblaženja, od 50 nM do 0.54 nM) u trajanju od 600 s, i ostavljanje da dođe do disocijacije u kinetičkom puferu, u trajanju od 400 s. Kinetički podaci podešavaju se korišćenjem softvera za globalnu analizu 1:1, obezbeđenog od strane Pall Forte Bio, sa referentnim odbitkom. Rezultati su prikazani na Slici 26 (F).

Rezultati:

[0223] Rezultati su prikazani na Slici 26. Kd vrednosti koje su utvrđene u ovom testu za anti-CD25 antitela su sledeće: za Antitelo 1, 3.2 ×10<-9>M; za Antitelo 3, 3.8 ×10<-9>M, i za daklizumab 0.61 ×10<-9>M.

Primer 11: Karakterizacija anti-CD25 antitela – od Antitela 1 do Antitela 21 Vezivanje anti-CD25 antitela za čelije koje eksprimiraju CD25:

[0224] Odabrani kandidati evaluiraju se vezivanjem za humane ćelijske linije limfoma kao što su Karpas 299, SU-DHL-1 i SR-786 ćelije, in vitro diferencirane Treg ćelije, aktivirane humane ili cino PBMC, HSC-F T ćelijske linije majmuna cinomolgusa i CHO ćelije.

[0225] Ispitivano je vezivanje za humane CD25-eksprimirajuće ćelijske linije (SU-DHL-1 i SR-786) tako što su ćelije prvo blokirane pomoću Trustain (Biolegend), zatim inkubirane sa anti-CD25 antitelima titrirovanim u semi-log serijskim razblaženjima od najviše koncentracije od 20 µg/ml, 30 minuta na 4°C, pre ispiranja i inkubacije sa PE-konjugovanim antihumanim IgG Fc antitelom (Biolegend). Ćelije su ponovo isprane i resuspendovane u FACS puferu koji sadrži DAPI i prikupljene na Intellicyt iQue. Žive ćelije su ograđivane korišćenjem FSC naspram SSC parametara, protočnom citometrijom tokom akvizicije uzoraka. Geometrijski srednji intenzitet obojenih ćelija unese se na XY dijagram, koji grafički prikazuje geometrijski srednji intenzitet u odnosu na log koncentracije, i podaci se podešavaju prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje se izračunava EC50.

[0226] Vezivanje za CD25-eksprimirajuće Karpas 299 ćelije i in vitro diferencirane Treg ispitivano je bojenjem testnih artikala (anti-CD25 primarna antitela) sa 30 mg/ml antitela, posle čega su sledila semi-log serijska razblaženja (7 tačaka) tokom 30 minuta, na ledu. Posle toga je usledilo bojenje sekundarnim antitelom (Alexa Fluor 647-AffiniPure Fab fragment kozji antihumani IgG (H+L) ili Alexa Fluor 647-AffiniPure F(ab')2fragment zečji anti-human IgG Fcγ fragment - (Jackson ImmunoResearch)) u koncentraciji od 1 mg/ml, 30 minuta, na ledu. Svi uzorci su obojeni u duplikatima. Žive ćelije su ograđivane korišćenjem FSC naspram SSC parametara, protočnom citometrijom tokom akvizicije uzoraka. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) obojenih ćelija unet je na XY dijagram koji grafički prikazuje MFI u odnosu na log koncentracije, a podaci su podešeni prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje se izračunava EC50.

[0227] Vezivanje za CD25-eksprimirajuće aktivirane PMBC čoveka i majmuna cinomolgusa ispitivano je bojenjem testnih artikala (primarna anti-CD25 antitela) sa 20 mg/ml antitela, što je praćeno serijskim semi-log razblaženjima (7 tačaka) tokom 30 minuta, na ledu. Ovo je praćeno bojenjem sekundarnim antitelom (zečji antihumani Fcg F(ab’)2- (Jackson ImmunoResearch)) u koncentraciji od 5 mg/ml, tokom 30 minuta, na ledu. Svi uzorci su bojeni u triplikatima. Da bi se minimizirala unakrsnim povezivanjem indukovana ćelijska smrt posredovana vezivanjem sekundarnog antitela, ćelijske linije su ispitane u kohortima bojenja od 4 testna artikla odjednom. Živi limfociti su ograđeni korišćenjem FSC naspram SSC parametara, protočnom citometrijom tokom akvizicije uzoraka. Srednji intenziteti fluorescencije (MFI) ograđenih podgrupa CD4<+>i CD8<+>T ćelija naneti su na XY dijagram koji grafički prikazuje MFI u odnosu na log koncentracije, a podaci su podešeni prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje se izračunava EC50.

[0228] Vezivanje za CD25-eksprimirajuće HSC-F T ćelijske linije majmuna cinomolgusa ispitivano je bojenjem testnih artikala (anti-CD25 primarna antitela) sa 20 mg/ml antitela, što je praćeno serijskim semi-log razblaženjima (7 tačaka) tokom 30 minuta, na ledu. Ovo je praćeno bojenjem sekundarnim antitelom (zečji antihumani Fcg F(ab’)2- (Jackson ImmunoResearch)) u koncentraciji od 5 mg/ml, tokom 30 minuta, na ledu. Svi uzorci su bojeni u triplikatima. Da bi se minimizirala unakrsnim povezivanjem indukovana ćelijska smrt posredovana vezivanjem sekundarnog antitela, ćelijske linije su ispitane u kohortima bojenja od 4 testna artikla odjednom. Živi limfociti su ograđeni korišćenjem FSC naspram SSC parametara, protočnom citometrijom tokom akvizicije uzoraka. Srednji intenziteti fluorescencije (MFI) živih ćelija nanet je na XY dijagram koji grafički prikazuje MFI u odnosu na log koncentracije, a podaci su podešeni prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje se izračunava EC50.

[0229] Ispitivano je i vezivanje za CD25-eksprimirajuće CHO ćelije. Približno 100000 ćelija koje prekomerno eksprimiraju antigen isprano je puferom za ispiranje i inkubirano sa 100 µl 100 nM IgG tokom 15 minuta, na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim dva puta isprane u puferu za ispiranje i inkubirane sa 100 µl 1:100 humanog-PE tokom 15 minuta, na ledu. Ćelije su zatim dva puta isprane puferom za ispiranje i analizirane na FACS Canto II analizatoru (BD Biosciences). Nemodifikovana CHO ćelijska linija korišćena je i kao negativna kontrola.

In vitro IL-2 signalizacija merena u testu fosforilacije STAT5:

[0230] IL-2-blokiranje okarakterisano je korišćenjem testa fosforilacije STAT5, u kojem se ispituje IL-2 signalizacija. Prethodno zamrznute PBMC (Stemcell Technologies) kultivišu se u ćelijskim pločama sa 96 bunarčića sa U-dnom u prisustvu 10 µg/ml anti-CD25 antitela, tokom 30 minuta, pre dodavanja IL-2 (Peprotech) u različitim koncentracijama od 10 U/ml ili 0.25 U/ml, 0.74 U/ml, 2.22 U/ml, 6.66 U/ml ili 20 U/ml, tokom 10 minuta, u RPMI 1640 (Life Technologies) koji sadrži 10% FBS (Sigma), 2 mM L-glutamin (Life Technologies) i 10000 U/ml Pen-Strep (Sigma). IL-2-indukovana fosforilacija STAT5 zaustavljena je kada su ćelije fiksirane i permeabilisane korišćenjem eBioscience™ puferskog seta za bojenje Foxp3 / transkripcionih faktora (Invitrogen) i tretirane BD Phosflow Perm puferom III (BD Biosciences). Ćelije su zatim simultano bojene površinskim i unutarćelijskim antitelima obeleženim fluorohromom (STAT5-Alexa Fluor 647 klon 47/stat5/pY694 BD Bioscience, CD3-PerCP-Cy5.5 klon UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 klon SK3 BD Bioscience, CD8-Alexa Fluor 700 klon RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 klon HI100 Invitrogen, FoxP3-Alexa Fluor 488 klon 236A/E7 Invitrogen) i uzorci su prikupljeni na Fortessa LSR X20 protočnom citometru (BD Bioscience) i analizirani BD FACSDIVA softverom. Dubleti su isključeni korišćenjem FCS-H naspram FCS-A, i limfociti su definisani korišćenjem SSC-A naspram FCS-A parametara. CD3+ T ćelije definisane su korišćenjem CD3 PerCP-Cy5.5-A naspram FCS-A dijagrama i ograda je ucrtana na histogram pokazujući broj u odnosu na STAT5 Alexa Fluor 647-A, da bi se odredila populacija STAT5+CD3+ T ćelija. Procenat blokiranja IL-2 signalizacije izračunat je na sledeći način: % blokiranja = 100 × [(% Stat5+ ćelija grupa bez Ab - % Stat5+ ćelija grupa 10 ug/ml Ab) / (% Stat5+ ćelija grupa bez Ab)]. Dodatna analiza fosforilacije STAT5 različitim podgrupama T ćelija (CD4+, CD8+, CD4+FoxP3+, naivne i memorijske T ćelije) takođe je vršena ograđivanjem na odgovarajuće podgrupe i izvedena kao što je opisano gore. Grafikoni i statističa analiza izvedeni su korišćenjem GraphPad Prism v7.

In vitro test aktivacije T ćelija:

[0231] Uticaj IL-2 signalizacije na odgovore Teff okarakterisan je u testu aktivacije T ćelija, u kojem su ispitivane unutarćelijska pozitivna regulacija granzima B (GrB) i proliferacija. Prethodno zamrznute primarne humane pan-T ćelije (Stemcell Technologies) obeležene su bojom za proliferaciju ćelija eFluor450 (Invitrogen) u skladu sa preporukom proizvođača i dodate u ploče sa 96 bunarčića sa U-dnom u količini od 1 ×10<5>ćelija/bunarčiću, u RPMI 1640 (Life Technologies) koji sadrži 10% FBS (Sigma), 2 mM L-glutamin (Life Technologies) i 10000 U/ml Pen-Strep (Sigma). Ćelije su zatim tretirane sa 10 µg/ml anti-CD25 antitela ili kontrolnim antitelima, a zatim CD3/CD28 perlicama koje aktiviraju humane T ćelije (20:1 odnos ćelija i perlica; Gibco) i inkubirane 72 sata, na 37°C, u humidifikovanom inkubatoru sa 5% CO2. Da bi se procenila aktivacija T ćelija, ćelije su obojene eBioscience trajnom bojom za žive ćelije efluor780 (Invitrogen), a zatim antitelima obeleženim fluorohromom za površinske markere T ćelija (CD3-PerCP-Cy5.5 klon UCHT1 Biolegend, CD4-BV510 klon SK3 BD Bioscience, CD8-Alexa Fluor 700 klon RPA-T8 Invitrogen, CD45RA-PE-Cy7 klon HI100 Invitrogen, CD25-BUV737 klon 2A3 BD Bioscience), i zatim fiksirane i permeabilisane sa eBioscience™ puferskim setom za bojenje Foxp3 / transkripcionih faktora (Invitrogen), pre bojenja za unutarćelijski GrB i unutarnukleusni FoxP3 (Granzyme B-PE klon GB11 BD Bioscience, FoxP3-APC klon 236A/E7). Uzorci su prikupljeni na protočnom citometru Fortessa LSR X20 (BD Bioscience) i analizirani BD FACSDIVA softverom. Dubleti su isključeni pomoću FCS-H naspram FCS-A, a limfociti definisani korišćenjem SSC-A naspram FCS-A parametara. Podgrupe CD4+ i CD8+ T ćelija ograđene od živih CD3+ limfocita procenjivane su korišćenjem dijagrama GrB-PE-A u odnosu na proliferaciju eFluor450-A. Rezultati su prikazani kao procenat proliferišućih GrB pozitivnih ćelija iz ukupnih populacija CD4+ ili CD8+ T ćelija. Grafikoni i statistička analiza izvedeni su korišćenjem GraphPad Prism v7.

In vitro ADCC test:

[0232] Testovi ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) izvedeni su da bi se okarakterisala antihumana CD25 antitela, uz korišćenje SU-DHL-1, ili SR-786 (CD25 pozitivnih) humanih ćelijskih linija kao ciljnih ćelija, sa humanim NK ćelijama kao izvorima efektorskih ćelija. NK ćelije su izolovane iz PBMC zdravih donora pomoću kita za negativnu izolaciju NK ćelija (Stemcell Technologies). NK ćelije su kultivisane preko noći u prisustvu 2 ng/mL IL-2 (Peprotech). Ciljne ćelije SU-DHL-1 ili SR-786 napunjene su Calcein-AM (Thermofisher) i zasejane, 4 ponovka po uslovu, u prisustvu anti-CD25 ili izotipskih antitela, tokom 30 minuta na 37°C, 5% CO2. Posle inkubacije, NK ćelije su dodate u bunarčiće u razmeri cilj:efektor (T:E) od 1:10 (10000 ciljnih ćelija i 100000 efektorskih ćelija) i inkubirane 4 sata na 37°C, 5% CO2. Očitavanje fluorescencije kalceina u supernatantu izvedeno je na čitaču ploča BMG Fluostar. Procenat specifične lize izračunat je u odnosu na same ciljne ćelije (0% lize) i ciljne ćelije tretirane 0,1% saponinom (100% lize). Grafikoni sirovih podataka proizvedeni su korišćenjem Graphpad Prism v7 za generisanje krivih odgovora na dozu. Procenat lize ciljnih ćelija unet je na XY dijagram koji grafički prikazuje normalizovani procenat oslobađanja Calcein AM u odnosu na log koncentracije, i podaci su podešeni prema nelinearnoj regresionoj krivoj iz koje je izračunat EC50.

[0233] ADDC je određivana i u testu luciferaznog reporterskog sistema. SR786 ćelije koje eksprimiraju CD25, ovde nazvane ciljne (T) ćelije, inkubiraju se 20 minuta na 37°C sa različitim koncentracijama mAb na CD25 (ili kontrolnim IgG) u medijumu koji je dopunjen sa FBS sa niskim sadržajem IgG (4% FBS u RPMI). ADCC efektorske (E) ćelije se zatim dodaju u smešu ćelije-mAb pri odnosu E:T od 1:1. Efektorske ćelije su Jurkat ćelije stabilno transfektovane luciferaznim reporterskim sistemom i sa prekomernom ekspresijom CD16/FcgammaRIIIA (Promega). Posle inkubacije preko noći na 37°C, ćelije se liziraju i aktivnost luciferaze se meri preko oslobađanja luminiscencije iz hidrolize specifičnog luciferaznog supstrata, prema uputstvima proizvođača (Promega Bio-Glow protokol).

In vitro ADCP test uz korišćenje in vitro diferenciranih makrofaga i Treg ćelija:

[0234] Testovi ćelijama posredovane fagocitoze zavisne od antitela (ADCP) izvedeni su korišćenjem in vitro diferenciranih Treg kao ciljnih ćelija i makrofaga poreklom od monocita kao efektorskih ćelija. PBMC su izolovane iz leukocitnih konusa centrifugiranjem na Ficoll gradijentu. Monociti (CD14+ ćelije) su izolovani pomoću CD14 mikroperlica (Miltenyi Biotec). Monociti su kultivisani 5 dana u prisustvu 50 ng/ml M-CSF u RPMI 1640 (Life Technologies) koji sadrži 10% FBS (Sigma), 2 mM L-glutamin (Life Technologies) i 10000 U/ml Pen-Strep (Sigma), sveži medijum koji sadrži M-CSF dodaje se posle 3 dana. Regulatorne T ćelije (Treg) izolovane su pomoću kita za diferenciranje humanih Treg ćelija (R&D Systems). Ove ćelije su inkubirane na 37°C, u humidifikovanom inkubatoru sa 5% CO2, tokom 5 dana i označene eFluor450-bojom (Invitrogen), prema preporukama proizvođača. Na dan 5, makrofagi i eFluor450-bojom obeležene Treg su kultivisane 4 sata pri odnosu efektora i cilja 10 prema 1, u prisustvu anti-CD25 antitela ili kontrola, kao što će biti opisano kasnije. Ciljne ćelije (Treg) su dodate u količini od 1 ×10<4>ćelija/bunarčiću, dok su efektorske ćelije (makrofagi) dodate u količini od 1 ×10<5>ćelija/bunarčiću, da bi se postigao odnos efektora i cilja od 10 prema 1. Zatim su dodata anti-CD25 antitela u najvišoj koncentraciji od 1 µg/ml, posle čega je sledila log serija (7 tačaka) u duplikatima. Ćelije i antitela su inkubirani 4 sata na 37°C, 5% CO2. Kako bi se procenila ADCP, ćelije su stavljene na led, obojene ćelijskim površinskim markerom CD14 (CD14-PerCP-Cy5.5 klon MfP9 BD Biosciences) i fiksirane puferom za fiksaciju eBioscience. Dvobojna protočno-citometrijska analiza sprovedena je pomoću Fortessa LSR X20. Rezidualne ciljne ćelije definisane su kao ćelije koje su bile eFluor450-boja+/CD14-. Makrofagi su definisani kao CD14+. Smatra se da dvostruko označene ćelije (eFluor450-boja+/CD14+) predstavljaju fagocitozu ciljeva makrofagima. Fagocitoza ciljnih ćelija izračunata je prema sledećoj jednačini: % fagocitoze = 100 × [(procenat dvostruko pozitivnih) / (procenat dvostruko pozitivnih procenat rezidualnih ciljeva)].

In vitro ADCP test uz korišćenje FcyRIIa-H reporterskog testa

[0235] Efektorske ćelije za ADCP biotest (FcyRlla-H) dobijene su od Promega (kat. # G9881/5; lot# 0000261099). SUDHL-1 ciljne ćelije zaseju se u količini od 5000 ćelija/bunarčiću (25 µl/bunarčiću), uz korišćenje bele polistirenske ploče sa 96 bunarčića (Costar; kat# 3917). Testna antitela se razblaže u trostrukim serijskim razblaženjima i ćelijama se doda po 25 µl. Po bunarčiću se doda 50000 efektorskih ćelija u 25 µl zapremine da se dobije odnos efektorskih i ciljnih ćelija od 10:1. Sve ciljne ćelije, antitela i efektorske ćelije zasejane su korišćenjem medijuma za kulturu ćelija. Ploča se inkubira 18 sati na 37°C. Ploče se zatim iznesu iz inkubatora i drže na sobnoj temperaturi 20 minuta. U svaki bunarčić doda se po 60 µl Bio-Glo supstratnog pufera za luciferazni test, posle čega sledi 30 minuta inkubacije i lumuniscencija se meri korišćenjem GloMax multidetekcionog sistema (Promega).

Statistika:

[0236] Prism softver (GraphPad) upotrebljen je za podešavanje krive kako bi se odredile EC50 vrednosti i maksimalna aktivnost.

Rezultati

[0237] Antitelo označeno kao Antitelo 1 evaluirano je u pogledu svoje sposobnosti da ne interferira sa IL-2 signalizacijom, i svoje sposobnosti ubijanja CD25-eksprimirajućih ciljnih ćelija. Rezultati vezivanja za rhCD25 i analize kompetitivnog vezivanja IL-2 prikazani su na Slikama 27 i 28. Test vezivanja liganda uz upotrebu Octet sistema pokazao je da Antitelo 1 ne utiče na vezivanje IL-2 za CD25 (Slika 29). Ovo je potvrđeno u STAT5 testu u kojem Antitelo 1 nije blokiralo IL-2 signalizaciju bez obzira na testirane koncentracije IL-2, dok je IL-2 signalizacija bila potpuno blokirana referentnim antitelom daklizumabom (Slika 31). Daklizumab, za koji je pokazano da blokira interakciju CD25 sa IL-2 putem takozvanog "Tac" epitopa (Queen C et al, 1989 i Bielekova B, 2013) vezuje se za epitop različit od onoga za koji se vezuje Antitelo 1 (Slika 30), čime se može objasniti zašto daklizumab blokira IL-2 signalizaciju, a Antitelo 1 ne blokira IL-2 signalizaciju u testu fosforilacije STAT5 (Slika 31). Pored toga, daklizumab smanjuje efektorske odgovore aktiviranih T ćelija, verovatno zbog blokiranja IL-2 signalizacije, dok Antitelo 1 koje ne blokira IL-2 signalizaciju, nema negativan efekat na odgovore T ćelija (Slika 32). Konačno, Antitelo 1 ubija CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije, putem ADCC (Slika 33) i ADCP (Slika 34) u poređenju sa IgG1 izotipskim antitelom.

[0238] U zaključku, Antitelo 1 je okarakterisano i pokazuje snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili kancerskih ćelijskih linija) i ne interferira sa IL-2 signalizacijom i posledično, ne inhibira T efektorske odgovore. Antitelo 1 je, prema tome, antitelo koje vrši depleciju Treg i koje se može primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

[0239] Antitelo označeno kao Antitelo 3 evaluirano je u pogledu svoje sposobnosti da ne interferira sa IL-2 signalizacijom i svoje sposobnosti da ubija CD25-eksprimirajuće ciljne ćelije. Rezultati vezivanja za rhCD25 i analiza kompetitivnog vezivanja IL-2 prikazani su na Slikama 35 i 36. Test vezivanja liganda upotrebom Octet sistema pokazao je da Antitelo 3 ne utiče na vezivanje IL-2 za CD25 (Slika 37). Ovo je potvrđeno u STAT5 testu u kojem Antitelo 3 nije blokiralo IL-2 signalizaciju bez obzira na testirane koncentracije IL-2, dok je IL-2 signalizacija bila potpuno blokirana referentnim antitelom daklizumabom (Slika 39). Daklizumab, za koji je pokazano da blokira interakciju CD25 sa IL-2 preko takozvanog "Tac" epitopa, vezuje se za epitop različit od onog za koji se vezuje Antitelo 3 (Slika 38), čime se može objasniti zašto daklizumab blokira IL-2 signalizaciju, a Antitelo 3 ne blokira IL-2 signalizaciju, u testu fosforilacije STAT5 (Slika 39). Pored toga, daklizumab smanjuje efektorske odgovore aktiviranih T ćelija, verovatno zbog blokiranja IL-2 signalizacije, dok Antitelo 3, koje ne blokira IL-2 signalizaciju, ima samo minimalan uticaj, ako ga uopšte ima, na odgovore T ćelija u poređenju sa stanjem bez antitela ili uz kontrolni izotip (Slika 40). Konačno, Antitelo 3 ubija CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije, putem ADCC (Slika 41) i ADCP (Slika 42) u opoređenju sa IgG1 izotipskim antitelom.

[0240] U zaključku, Antitelo 3 je okarakterisano i pokazuje snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili ćelijske linije kancera) i ne interferira sa IL-2 signalizacijom i posledično ne inhibira T efektorske odgovore. Antitelo 3 je, prema tome, antitelo koje vrši depleciju Treg i koje bi se moglo primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

[0241] Antitelo označeno kao Antitelo 4 evaluirano je u pogledu svoje sposobnosti da ne interferira sa IL-2 signalizacijom i svoje sposobnosti da ubije CD25-eksprimirajuće ciljne ćelije. Rezultati vezivanja za rhCD25 i analiza kompetitivnog vezivanja IL-2 prikazani su na Slikama 43 i 44. Test vezivanja liganda uz korišćenje Octet sistema pokazao je da Antitelo 4 ne utiče na vezivanje IL-2 za CD25 (Slika 45). Ovo je potvrđeno u STAT5 testu u kojem Antitelo 4 nije blokiralo IL-2 signalizaciju bez obzira na testirane koncentracije IL-2, dok je IL-2 signalizacija bila potpuno blokirana referentnim antitelom daklizumabom (Slika 47). Daklizumab, za koji je pokazano da blokira interakciju CD25 sa IL-2 preko takozvanog "Tac" epitopa, vezuje se za epitop koji je različit od onog za koji se vezuje Antitelo 4 (Slika 46), što može objasniti zašto daklizumab blokira IL-2 signalizaciju, a Antitelo 4 ne blokira IL-2 signalizaciju, u testu fosforilacije STAT5 (Slika 47). Pored toga, daklizumab smanjuje efektorske odgovore aktiviranih T ćelija, verovatno zbog blokiranja IL-2 signalizacije, dok Antitelo 4, koje ne blokira IL-2 signalizaciju, nema negativan efekat na na odgovore T ćelija (Slika 48). Konačno, Antitelo 4 ubija CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije, putem ADCC (Slika 49) i ADCP (Slika 50) u poređenju sa IgG1 izotipskim antitelom.

[0242] U zaključku, Antitelo 4 je okarakterisano i pokazuje snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili ćelijske linije kancera) i ne interferira sa IL-2 signalizacijom i posledično ne inhibira T efektorske odgovore. Antitelo 4 je stoga antitelo koje vrši depleciju Treg i koje bi se moglo primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

[0243] Antitelo označeno kao Antitelo 2 evaluirano je u pogledu svoje sposobnosti da ne interferira sa IL-2 signalizacijom i svoje sposobnosti da ubije CD25-eksprimirajuće ciljne ćelije. Rezultati vezivanja za rhCD25 i analiza kompetitivnog vezivanja IL-2 prikazani su na Slikama 51 i 52. Test vezivanja liganda uz korišćenje Octet sistema pokazao je da Antitelo 2 ne utiče na vezivanje IL-2 za CD25 (Slika 53). Ovo je potvrđeno u STAT5 testu u kojem Antitelo 2 nije blokiralo IL-2 signalizaciju bez obzira na testirane koncentracije IL-2, dok je IL-2 signalizacija bila potpuno blokirana referentnim antitelom daklizumabom (Slika 55). Daklizumab, za koji je pokazano da blokira interakciju CD25 sa IL-2 putem takozvanog "Tac" epitopa, vezuje se za epitop koji je različit od onog za koji se vezuje Antitelo 2 (Slika 54), što može objasniti zašto daklizumab blokira IL-2 signalizaciju, a Antitelo 2 ne blokira IL-2 signalizaciju, u testu fosforilacije STAT5 (Slika 55). Konačno, Antitelo 2 ubija CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije, putem ADCC (Slika 56) i ADCP (Slika 57) u poređenju sa IgG1 izotipskim antitelom.

[0244] U zaključku, Antitelo 2 je okarakterisano i pokazuje snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili ćelijske linije kancera) i ne interferira sa IL-2 signalizacijom i posledično ne inhibira T efektorske odgovore. Antitelo 2 je stoga antitelo koje vrši depleciju Treg i koje bi se moglo primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

[0245] Antitelo označeno kao Antitelo 5 okarakterisano je da sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje sekvencu:

i varijabilni region lakog lanca koji uključuje sekvencu:

[0246] Sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR; tj., CDR1, CDR2, i CDR3), kako je naznačeno ranije u ovom tekstu, i regioni okvira (FR) definisani su prema šemi numerisanja po Kabat-u.

[0247] Antitelo 5 evaluirano je u pogledu svoje sposobnosti da ne interferira sa IL-2 signalizacijom i svog kapaciteta da ubija CD25-eksprimirajuće ciljne ćelije. Rezultati vezivanja za rhCD25 prikazani su na Slici 58. STAT5 test pokazao je da Antitelo 5 nije blokiralo testiranu IL-2 signalizaciju dok je IL-2 signalizacija bilo potpuno blokirana antitelom daklizumabom (Slika 59). Test kompeticije pokazao je da Antitelo 5 ne kompetira sa blokatorima IL-2 signala daklizumabom ili baziliksimabom (Slika 60 (A) i (B), dok kompetira sa 7G7B6 (IL-2 neblokirajuće) (Slika 60(C)). Konačno, Antitelo 5 ubija CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije putem ADCC (Slika 61) i ADCP (Slika 61), kada se uporedi sa antihumanim CD25 Fc utišanim kontrolnim antitelom.

[0248] U zaključku, Antitelo 5 je okarakterisano i pokazuje snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili ćelijske linije kancera) i ne interferira sa IL-2 signalizacijom i posledično ne inhibira T efektorske odgovore. Antitelo 5 je stoga antitelo koje vrši depleciju Treg i koje bi se moglo primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

[0249] Antitela označena kao Antitelo 6, Antitelo 7, Antitelo 8 i Antitelo 9 okarakterisana su da sadrže sledeće sekvence:

[0250] Antitelo 6 sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje sekvencu:

i varijabilni region lakog lanca koji uključuje sekvencu:

[0251] Antitelo 7 sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje sekvencu:

i varijabilni region lakog lanca koji uključuje sekvencu:

[0252] Antitelo 8 sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje sekvencu:

i varijabilni region lakog lanca koji uključuje sekvencu:

[0253] Antitelo 9 sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje sekvencu:

i varijabilni region lakog lanca koji uključuje sekvencu:

[0254] Sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR; tj., CDR1, CDR2, i CDR3), kako je naznačeno ranije u ovom tekstu, i regioni okvira (FR) definisani su prema šemi numerisanja po Kabat-u.

[0255] Rezultati mapiranja epitopa pokazali su da se Antitelo 6, Antitelo 7, Antitelo 8 i Antitelo 9 vezuju za humani CD25 u regionu od amino-kiselina 150 do 163 (YQCVQGYRALHRGP) i amino-kiselina 166 do 180 (SVCKMTHGKTRWTQP) SEQ ID NO: 1, i da se vezuju za vanćelijske proteinske sekvence humanog CD25 sa Kd vrednošću u rasponu od 10<-8>M do 10<-10>M.

[0256] Antitelo 6, Antitelo 7, Antitelo 8 i Antitelo 9 evaluirana su u pogledu svoje sposobnosti da ne interferiraju sa IL-2 signalizacijom i svog kapaciteta za ubijanje CD25-eksprimirajućih ciljnih ćelija. Rezultati vezivanja za rhCD25, prikazani su na Slici 63. STAT5 test pokazao je da antitela ne blokiraju testiranu IL-2 signalizaciju, dok je IL-2 signalizacija potpuno blokirana antitelom daklizimabom (Slika 65). Test kompeticije pokazao je da Antitelo 7 ne kompetira sa blokatorima IL-2 signala daklizumabom ili baziliksimabom Slika 64 (A) i (B). Konačno, Antitelo 7 ubija CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije, putem ADCC (Slika 66) i ADCP (Slika 67) kada se uporedi sa antihumanim CD25 Fc utišanim kontrolnim antitelom.

[0257] U zaključku, Antitelo 6, Antitelo 7, Antitelo 8 i Antitelo 9 okarakterisana su i pokazuju snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili ćelijske linije kancera) i ne interferiraju sa IL-2 signalizacijom i posledično ne inhibiraju T efektorske odgovore. Antitela su stoga antitela koja vrše depleciju Treg i koja bi se mogla primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

[0258] Antitela označena kao Antitelo 10, Antitelo 11, Antitelo 12, Antitelo 12, Antitelo 13, Antitelo 14, Antitelo 15, Antitelo 16, Antitelo 17, Antitelo 18, Antitelo 19, Antitelo 20, Antitelo 21, okarakterisana su da sadrže varijabilni region teškog lanca koji uključuje sekvencu:

(nastavak)

(nastavak)

(nastavak)

[0259] Sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR; tj., CDR1, CDR2, i CDR3), kako je naznačeno ranije u ovom tekstu, i regioni okvira (FR) definisani su prema šemi numerisanja po Kabat-u.

[0260] Rezultati mapiranja epitopa pokazali su da se Antitelo 10, Antitelo 11, Antitelo 12, Antitelo 13, Antitelo 14, Antitelo 15, Antitelo 16, Antitelo 17, Antitelo 18, Antitelo 19, Antitelo 20, Antitelo 21 vezuju za humani CD25 u regionu od amino-kiselina 150 do 163 (YQCVQGYRALHRGP) i amino-kiselina 166 do 180 (SVCKMTHGKTRWTQP) SEQ ID NO: 1, i da se vezuju za vanćelijske proteinske sekvence humanog CD25 sa Kd vrednošću u rasponu od 10<-8>M do 10<-10>M.

[0261] Antitela su evaluirana u pogledu svoje sposobnosti da ne interferiraju sa IL-2 signalizacijom i svog kapaciteta za ubijanje CD25-eksprimirajućih ciljnih ćelija. Rezultati vezivanja za rhCD25, prikazani su na Slici 68. STAT5 test pokazao je da Antitela ne blokiraju testiranu IL-2 signalizaciju, dok je IL-2 signalizacija potpuno blokirana antitelom daklizimabom (Slika 70). Test kompeticije pokazao je da Antitelo 19 ne kompetira sa blokatorima IL-2 signala daklizumabom ili baziliksimabom Slika 69 (A) i (B). Konačno, Antitelo 12, Antitelo 19 i Antitelo 20 ubijaju CD25-eksprimirajuće ćelije, tumorske ćelije ili regulatorne T ćelije, putem ADCC (Slika 71) i ADCP (Slike 72 i 73) kada se uporede sa antihumanim CD25 Fc utišanim kontrolnim antitelom.

[0262] U zaključku, Antitelo 10, Antitelo 11, Antitelo 12, Antitelo 13, Antitelo 14, Antitelo 15, Antitelo 16, Antitelo 17, Antitelo 18, Antitelo 19, Antitelo 20, Antitelo 21 okarakterisana su i pokazala su snažnu aktivnost ubijanja CD25-pozitivnih ćelija (Treg ili ćelijske linije kancera) i ne interferiraju sa IL-2 signalizacijom i posledično ne inhibiraju T efektorske odgovore. Antitela su stoga antitela koja vrše depleciju Treg i koja bi se mogla primeniti za lečenje kancera, kao monoterapija ili u kombinaciji.

Primer 12: Terapijska analiza u kombinaciji sa kancerskom vakcinom

[0263] Određivana je terapijska aktivnost IL-2 neblokirajućeg anti-CD25 antitela, 7D4 mišjeg IgG2a, u kombinaciji sa GVAX u B16BI6 mišjem modelu rezistentnom na imunsku terapiju. Na dan 0, 50 × 10<3>B16BI6 ćelija implantira se i.d. Na dan 5, 200 µg IL-2-neblokirajućeg anti-CD25 antitela dozira se i.p, ili ne. Na dane 6, 9 i 12 miševi se tretiraju, ili ne, sa 1 ×10<6>ozračenih (150 Gy) B16BI6 ćelija, u prisustvu adjuvansa GM-CSF (GVAX). Rast tumora i preživljavanje miševa prate se do dana 33. Rezultati su prikazani na Slici 74.

[0264] Zapažen je sinergistički efekat kombinacije GVAX i 7D4 neblokirajućeg anti-CD25 antitela u B16BI6 modelu. Prema tome, primena 7D4 sa kancerskom vakcinom pojačava antitumorski odgovor indukovan vakcinom. Ovi rezultati pokazuju da IL2-neblokirajuće anti-CD25 antitelo koje vrši depleciju može da se koristi u kombinaciji sa kancerskim vakcinama za lečenje kancera kod čoveka. Pored toga, ovaj podatak pokazuje da je IL2-neblokirajuće antitelo koje vrši depleciju sposobno da pojača imunske odgovore indukovane vakcinom, sa mogućnošću šire primene nego što je kancer.

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Humano IgG1 anti-CD25 antitelo za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta, naznačeno time, što pomenuti subjekt ima solidni tumor, i pri čemu pomenuto antitelo inhibira manje od oko 25% IL-2 signalizacije u poređenju sa IL-2 signalizacijom u odsustvu antitela, pri čemu se IL2 signalizacija meri nivoima fosforilisanog STAT5 proteina u ćelijama, koji se određuju testom fosforilacije STAT5, pri čemu test fosforilacije STAT5 uključuje:

- kultivisanje PMBC ćelija u prisustvu anti-CD25 antitela u koncentraciji od 10 ug/ml tokom 30 min i zatim dodavanje različitih koncentracija IL2 tokom 10 min

- permeabilisanje ćelija; i

- merenje nivoa STAT5 proteina fluorescentno obeleženim antitelom na fosforilisani STAT5 peptid, protočnom citometrijom.

2. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što se anti-CD25 antitelo specifično vezuje za epitop humanog CD25, pri čemu epitop sadrži najmanje jednu sekvencu odabranu od:

(i) aminokiselinske sekvence 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA); (ii) aminokiselinske sekvence 176-180 iz SEQ ID NO:1 (RWTQP);

(iii) aminokiselinske sekvence 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR); i

(iv) aminokiselinske sekvence 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTS).

3. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što se anti-CD25 antitelo specifično vezuje za epitop humanog CD25 pri čemu epitop sadrži najmanje jednu sekvencu odabranu od:

(i) aminokiselinske sekvence 166-180 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP),

(ii) aminokiselinske sekvence 176-186 iz SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG), i (iii) aminokiselinske sekvence 70 do 84 iz SEQ ID NO: 1 (NSSHSSWDNQCQCTS).

4. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što se anti-CD25 antitelo specifično vezuje za epitop humanog CD25 pri čemu epitop sadrži:

(i) sekvencu amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 150-160 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALH);

(ii) sekvencu amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR);

(iii) sekvencu amino-kiselina 150-163 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP), amino-kiselina 166-180 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP), amino-kiselina 42-56 iz SEQ ID NO:1 (KEGTMLNCECKRGFR) i amino-kiselina 74-84 iz SEQ ID NO:1 (SSWDNQCQCTSSATR);

(iv) sekvencu amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) i amino-kiselina 176-180 iz SEQ ID NO:1 (RWTQP);

(v) sekvencu amino-kiselina 150-158 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRA) i amino-kiselina 176-186 iz SEQ ID NO:1 (RWTQPQLICTG); ili (vi) sekvencu amino-kiselina 150-163 iz SEQ ID NO:1 (YQCVQGYRALHRGP) i amino-kiselina 166-180 iz SEQ ID NO:1 (SVCKMTHGKTRWTQP).

5. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time, što je anti-CD25 antitelo anti-CD25 antitelo koje se vezuje za FcyRI, FcyRllc, i/ili FcγRllla sa višim afinitetom nego što se vezuje za FcyRllb.

6. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time, što se antitelo bira iz grupe koja se sastoji od:

(a) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4;

(b) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6;

(c) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14; (d) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; (e) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; (f) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; (g) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; (h) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; (i) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30; (j) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31; (k) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32; (l) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33; (m) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30; (n) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31; (o) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32; (p) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33; (q) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30; (r) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31; (s) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32; i (t) antitela koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33.

7. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time, što je anti-CD25 antitelo:

(i) monoklonsko antitelo;

(ii) humano, himerno, ili humanizovano antitelo; i/ili

(iii) afinitetno zrela varijanta istog.

8. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time, što anti-CD25 antitelo izaziva CDC, ADCC i/ili ADCP odgovor, poželjno ADCC i/ili ADCP odgovor, poželjnije ADCC odgovor.

9. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time, što je anti-CD25 antitelo za primenu kod subjekta koji ima uspostavljen tumor.

10. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 9, naznačeno time, što je antitelo za primenu u kombinaciji sa još jednim terapijskim sredstvom.

11. Anti-CD25 antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time, što je pomenuto još jedno terapijsko sredstvo:

(i) inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora, opciono PD-1 antagonist, poželjnije anti-PD-1 antitelo ili anti-PDL1 antitelo; ili

(ii) kancerska vakcina, opciono GVAX kancerska vakcina.

12. Kombinacija anti-CD25 antitela, kako je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 8, i još jedno terapijsko sredstvo za upotrebu u lečenju kancera kod humanog subjekta, naznačena time, što subjekt ima solidni tumor i anti-CD25 antitelo i još jedno terapijsko sredstvo se primenjuju istovremeno, zasebno ili jedno za drugim.

13. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačena time, što je dodatno terapijsko sredstvo:

(i) inhibitor kontrolne tačke imunskog odgovora, opciono PD-1 antagonist; ili (ii) kancerska vakcina, opciono GVAX kancerska vakcina.