RS65372B1 - Sve-u-jednom aav vektori za lečenje koronavirus-indukovanih bolesti - Google Patents

Sve-u-jednom aav vektori za lečenje koronavirus-indukovanih bolesti

Info

Publication number
RS65372B1
RS65372B1 RS20231159A RSP20231159A RS65372B1 RS 65372 B1 RS65372 B1 RS 65372B1 RS 20231159 A RS20231159 A RS 20231159A RS P20231159 A RSP20231159 A RS P20231159A RS 65372 B1 RS65372 B1 RS 65372B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
cov
cas13d
guide rna
sars
Prior art date
Application number
RS20231159A
Other languages
English (en)
Inventor
Elisabeth Zeisberg
Xingbo Xu
Michael Zeisberg
Gerd Hasenfuss
Xiaoying Tan
Original Assignee
Elisabeth Zeisberg
Michael Zeisberg
Gerd Hasenfuss
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Elisabeth Zeisberg, Michael Zeisberg, Gerd Hasenfuss filed Critical Elisabeth Zeisberg
Publication of RS65372B1 publication Critical patent/RS65372B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast biomedicine. Specifično, pronalazak obezbeđuje AAV vektore koji sadrže sekvence koje kodiraju Cas13d i vodeće RNK za isecanje jednolančane virusne RNK, uključujući obezbeđivanje takvih vodećih RNK.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Nedavno i tekuće izbijanje novog koronavirusa SARS-CoV-2 rezultovalo je dramatično visokom incidencom infekcija i smrtnih slučajeva širom sveta. Osnovni reproduktivni broj (R0) virusa (približno 3) neminovno će rezultovati još većim povećanjem broja slučajeva koronavirusa. Poznato je da je soj virusa SARS-CoV-2 izuzetno infektivan i prvenstveno se širi preko respiratornog trakta, kapljicama ili respiratornim sekretima. Infekcija SARS-CoV-2 često dovodi do izraženih povreda pluća i do teškog akutnog respiratornog sindroma. SARS-CoV-2 je član porodice koronavirusa (Coronaviridae), koja je obimna porodica jednolančanih RNK virusa, za koje se često smatra da uzrokuju različita humana oboljenja i bolesti u opsegu od obične prehlade do akutnih bolesti kao što je MERS (MERS-CoV) i SARS (SARS-CoV) [1]. Iako postoji hitna potreba za efikasnom strategijom kliničkog lečenja, trenutno ne postoje dostupne kurativne ili preventivne terapije ili obećavajući lek kandidat za lečenje SARS-CoV-2.
[0003] CRISPR/Cas sistemi koji mogu efikasno ciljati i isecati jednolančane RNK (ssRNA) mogu potencijalno ponuditi terapijski pristup protiv SARS-CoV-2. Uzimajući u obzir različite Cas proteine, čini se da je Cas13, posebno varijanta Cas13d, obećavajući kandidat za takav pristup pošto su nedavne studije istakle sposobnost Cas13 da efikasno i specifično cilja i iseca ssRNA u nekoliko model sistema, uključujući ćelije sisara [2]. Nedavno su objavljena prva razmatranja za ciljanje SARS-CoV-2 upotrebom Cas13d umesto Cas9 [12].
[0004] Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje novi lek kandidat i terapijski režim za lečenje infekcija koje su uzrokovane virusima porodice Coronaviridae, posebno infekcija koje proizilaze iz SARS-CoV, MERS-CoV, i nedavno identifikovanog SARS-CoV-2, inicijacijom Cas13-posredovanog isecanja jednolančanih RNK do inficiranih ćelija sisara. U skladu sa tim, pronalazak obezbeđuje vodeće RNK koje navode Cas13 protein, poželjno Cas13d protein, do njihovih odgovarajućih ciljnih mesta u genomu virusa koji su poreklom iz porodice Coronaviridae, posebno članova porodice SARS-CoV, MERS-CoV i SARS-CoV-2. Pronalazak dodatno obezbeđuje AAV vektore koji sadrže Cas13 vodeće RNK za introdukovanje Cas13, poželjno Cas13d, u humane ćelije.
SAŽETAK PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak opisuje upotrebu Cas13 ciljnog delovanja i isecanja jednolančane RNK za ciljanje i isecanje genoma jednolančanog RNK virusa iz porodice Coronaviridae, posebno članova porodice MERS-CoV, SARS-CoV i SARS-CoV-2. Vodeće RNK povezane sa Cas13, poželjno Cas13d, mogu imati svoje ciljno mesto pozicionirano u regionima konzerviranim između članova porodice Coronaviridae, ORF1ab, S, E, M i N. AAV vektori koji sadrže Cas13d, kao i ekspresionu kasetu vodeće RNK upotrebljavaju se kao vehikulum za transport Cas13d u ćeliju koja je inficirana virusom.
[0006] Stoga, obezbeđena je vodeća RNK za upotrebu sa Cas13 koja ima manje od 1000 amino-kiselina, poželjno za upotrebu sa Cas13d, pri čemu je ciljno mesto vodeće RNK sekvenca koja je sačinjena od SARS-CoV-2 virusa.
[0007] Ciljno mesto vodeće RNK može biti sekvenca koja je konzervirana između genoma humano-povezanih virusa iz porodice Coronaviridae.
[0008] Ciljno mesto vodeće RNK može biti sekvenca koja je konzervirana između genoma SARS-CoV-2, MERS-CoV i SARS-CoV.
[0009] Ciljno mesto vodeće RNK može biti sekvenca koja je sačinjena od jednog ili više od Orflab, S, E, M i N regiona u odgovarajućim genomima SARS-CoV-2, MERS-CoV i SARS-CoV.
[0010] Sekvenca vodeće RNK može da sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:39.
[0011] Specifično, pronalazak je usmeren na vodeću RNK za upotrebu sa Cas13 proteinom, pri čemu je ciljno mesto vodeće RNK sekvenca koja je sačinjena od SARS-CoV-2 genoma, pri čemu sekvenca vodeće RNK sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31.
[0012] Posebno pogodne vodeće RNK uključuju spejser sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 4, 7, 15, 23, 27, i 31.
[0013] Pronalazak dalje obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira Cas13d protein i ekspresionu kasetu vodeće RNK koja kodira Cas13 vodeću RNK, pri čemu je sekvenca vodeće RNK odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31 i koja sadrži U6 promotor.
[0014] U sledećem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira više od jedne vodeće RNK.
[0015] U sledećem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira vodeće RNK koje sadrže sekvence SEQ ID NO: 4, 7, i 15; SEQ ID NO: 15, 23, i 31; SEQ ID NO: 15, 27, i 31; SEQ ID NO: 23, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 15, 23, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 7, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 23, i 31; SEQ ID NO: 7, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 7, 15, 23, 27, i 31.
[0016] U sledećem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira vodeće RNK koje sadrže sekvence SEQ ID NO: 4, 7, i 15; SEQ ID NO: 4, 15, 23, 27, i 31; i SEQ ID NO: 4, 7, 27, i 31.
[0017] U sledećem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline je plazmid.
[0018] U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline je jedan plazmid.
[0019] U sledećem primeru izvođenja, Cas13d protein kodiran navedenom sekvencom ne sadrži nukleus-lokalizujući signal (NLS).
[0020] U sledećem primeru izvođenja, Cas13d protein kodiran navedenom sekvencom je fuzioni protein koji sadrži N-terminusni vezujući domen (N-NTD) nukleokapsidnog proteina SARS-CoV-2.
[0021] U sledećem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline može se dobiti insertovanjem spejser sekvence vodeće RNK u plazmid pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d SEQ ID NO:40; ili insertovanjem najmanje jedne spejser sekvence najmanje vodeće RNK u plazmid pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-array triguide SEQ ID NO:41, plazmid pAAV-U6-gRNA-quadguide-CMV-Cas13d-V3-basic SEQ ID NO:42, plazmid pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-Sapl SEQ ID NO:43, ili plazmid pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-NTO-Aarl SEQ ID NO:44.
[0022] Pronalazak dodatno obezbeđuje AAV vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline.
[0023] U poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor je odabran iz grupe AAV1, AAV2, AAV5, AAV6 i AAV9, poželjno je AAV2 vektor.
[0024] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor je AAV9 vektor.
[0025] U sledećem primeru izvođenja, okosnica AAV vektora je redukovane veličine u poređenju sa transkriptom pune dužine.
[0026] Pronalazak dodatno obezbeđuje adenovirusni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline.
[0027] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži AAV vektor ili adenovirusni vektor.
[0028] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jednu vodeću RNK kao što je prethodno opisano i najmanje jednu iRNK koja kodira Cas13 protein.
[0029] U jednom primeru izvođenja, Cas13 protein je Cas13d protein ili Cas13a protein.
[0030] U sledećem primeru izvođenja, Cas13d protein koji je kodiran navedenom iRNK ne sadrži nukleus-lokalizujući signal (NLS).
[0031] U sledećem primeru izvođenja, Cas13d protein koji je kodiran navedenom iRNK je fuzioni protein koji sadrži N-terminusni vezujući domen (N-NTD) nukleokapsidnog proteina SARS-CoV-2.
[0032] U dodatnom aspektu, pronalazak takođe obezbeđuje AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutsku kompoziciju kao što je prethodno opisano za upotrebu u lečenju humanopovezanim virusom uzrokovanih bolesti ili sindroma.
[0033] U jednom primeru izvođenja, bolest ili sindrom je rezultat infekcije koronavirusom koji je genetički srodan sa grupom koja se sastoji od MERS-CoV, SARS-CoV i SARS-CoV-2.
[0034] U poželjnom primeru izvođenja, bolest je COVID-19.
[0035] U sledećem primeru izvođenja, nakon ekspresije, Cas13d protein iseca humanopovezani virus.
[0036] U poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija treba da se primeni putem gornjeg respiratornog trakta, poželjno intranazalnom ili intratrahealnom primenom ili u aerosolnoj kompoziciji, na primer, pomoću inhalatora ili nebulizatora.
[0037] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija treba da se primeni pacijentu pomoću respiratora.
[0038] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija treba da se primeni u miokard pacijenta.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0039]
Slika 1 pokazuje šemu filogenetskog stabla sedam trenutno poznatih Cas13 proteina, na primer, kao što je objavljeno u [3].
Slika 2 je šematski prikaz koji ilustruje poravnanje genoma poreklom od SARS-CoV-2, SARS-CoV, i MERS-CoV. Kratke crtice ispod poravnanja ukazuju na lokaciju Cas13d vodećih RNK koje su dizajnirane tako da ciljaju regione konzervirane sekvence između genoma SARS-CoV-2, SARS-CoV i MERS-CoV.
Slika 3 pokazuje mapu vektora AAV2 plazmida koji sadrži Cas13d kodirajuću sekvencu kao i ekspresionu kasetu Cas13d vodeće RNK pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d. Slika 3A: Mapa vektora koja predstavlja jednu vodeću RNK (videti SEQ ID NO:40). Slika 3B: Mapa vektora koja ilustruje tri mesta insercije za spejser sekvence vodeće RNK (videti SEQ ID NO:41).
Slika 4 ilustruje poravnanje sekvenci odgovarajućih genoma poreklom od SARS-CoV-2, SARS-CoV i MERS-CoV, kao i sekvence koje se upotrebljavaju za poravnanje.
Slika 5 pokazuje inhibitornu efikasnost konstrukata sa jednom vodećom RNK iz pronalaska u testu sa reporterom luciferazom.
Slika 6A pokazuje prvi eksperimentalni dizajn za testiranje konstrukata vodeće RNK iz pronalaska u SARS-CoV-2-inficiranim humanim epitelnim ćelijama pluća. Slika 6B pokazuje inhibitornu efikasnost nekoliko kombinacija konstrukata vodeće RNK u eksperimentalnom dizajnu sa Slike 6A.
Slika 7A pokazuje drugi eksperimentalni dizajn za testiranje konstrukata vodeće RNK iz pronalaska u SARS-CoV-2-inficiranim humanim epitelnim ćelijama pluća. Slika 7B pokazuje inhibitornu efikasnost nekoliko kombinacija konstrukata vodeće RNK u eksperimentalnom dizajnu sa Slike 7A.
Slika 8 pokazuje inhibitornu efikasnost nekoliko kombinacija konstrukata vodeće RNK i konstrukata sa više vodećih RNK u eksperimentalnom dizajnu sa Slike 7A.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0040] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
Definicije
[0041] AAV vektor: Termin "AAV vektor" kao što se ovde upotrebljava označava adenopovezani virus (AAV) koji je sposoban da introdukuje sekvencu nukleinske kiseline u ciljne ćelije. Vektor može da sadrži sekvencu koja kodira Cas13d i/ili ekspresionu kasetu vodeće RNK koja kodira vodeću RNK i koja sadrži U6 promotor.
[0042] Okosnica vektora: Termin "okosnica vektora" označava nativne sekvence nukleinske kiseline AAV vektora.
[0043] Cas13d: Kao što se ovde upotrebljava, termin "Cas13d" označava Cas endonukleazu CRISPR/Cas13d sistema, uključujući RfxCas13d endonukleazu.
[0044] Konzervirano: Termin "konzervirano" ovde označava sekvence ili delove sekvence unutar virusnih genoma određenih članova porodice Coronaviridae koje dele najmanje dva druga člana porodice Coronaviridae.
[0045] Koronavirus: Termin "koronavirus" kao što se ovde upotrebljava označava bilo koji virus iz porodice Coronaviridae. Koronavirus koji je sposoban da inficira humane ćelije ovde se takođe označava kao humano-povezani koronavirus.
[0046] COVID-19: Termin "COVID-19" kao što se ovde upotrebljava označava bolest poznatu kao koronavirusna bolest 2019, koja je uzrokovana infekcijom SARS-CoV-2, tipom koronavirusa.
[0047] Derivat: Termin "derivat" kao što se ovde upotrebljava označava virus koji je blisko srodan sa virusom kao što je ovde opisano. Posebno, virus je derivat drugog virusa ukoliko njihovi odgovarajući genomi pokazuju sličnost sekvence od najmanje 50%.
[0048] Vodeća RNK: Termin "vodeća RNK" se ovde upotrebljava da označi komponentu CRISPR/Cas sistema. U predmetnom slučaju, "vodeća RNK" označava vodeću RNK CRISPR/Cas13 sistema, na primer, Cas13d proteina. Vodeća RNK je nekodirajuća kratka RNK sekvenca koja "navodi" Cas protein do njegovog cilja i mesta isecanja. Vodeća RNK sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja se vezuje za komplementarno ciljno mesto u sekvenci ciljne nukleinske kiseline. Putem primera, ciljna nukleinska kiselina Cas13d je jednolančana RNK sekvenca.
[0049] Humano-povezani virus: Termin "humano-povezani virus" označava bilo koji virus koji je sposoban da inficira humanu ćeliju.
[0050] Infekcija: Termin "infekcija" kao što se ovde upotrebljava označava invaziju telesnih tkiva organizma od strane patogenih agenasa, multiplikaciju takvih agenasa, kao i reakciju tkiva domaćina na patogene agense i toksine koje oni proizvode. Kao što se ovde upotrebljava, termin "infekcija" označava virusnu infekciju ćelije.
[0051] Donji respiratorni trakt: Kao što se ovde upotrebljava, ovaj termin označava deo larinksa ispod glasnih žica, traheju, bronhije, bronhiole i pluća, uključujući respiratorne bronhiole, alveolarne kanale, alveolarne kesice, i alveole.
[0052] MERS: Termin "MERS" označava bolest bliskoistočni respiratorni sindrom, koja je bolest ili sindrom uzrokovan infekcijom MERS-CoV, tipom koronavirusa.
[0053] SARS: Termin "SARS" označava bolest poznatu kao teški akutni respiratorni sindrom, koju uzrokuje infekcija SARS-CoV, tip koronavirusa.
[0054] Transdukcija: Termin "transdukcija" kao što se ovde upotrebljava označava namerno introdukovanje nukleinskih kiselina u ćeliju pomoću virusnog vehikuluma. Posebno, "transdukcija" označava introdukovanje AAV vektora u ćeliju.
[0055] Gornji respiratorni trakt: Kao što se ovde upotrebljava, ovaj termin označava nos i nazalne prolaze, paranazalne sinuse, ždrelo, i deo larinksa iznad glasnih žica.
Primeri prednosti pronalaska
[0056] Trenutno objavljeni pronalazak se odnosi na ciljno delovanje i isecanje virusnog genoma upotrebom Cas13 proteina, poželjno Cas13d proteina, kako bi se na taj način inhibirao ili eliminisao kapacitet replikacije virusa.
[0057] Pronalazak prema tome obezbeđuje vodeću RNK za navođenje Cas13 proteina, poželjno Cas13d proteina, do odgovarajućeg cilja i mesta isecanja u virusnom genomu. Pronalazači su dizajnirali trenutne vodeće RNK na osnovu zapažanja da koronavirusi koji se prenose sa životinja na ljude imaju jedan ili više zajedničkih konzerviranih regiona, i da ovi konzervirani regioni mogu biti odgovorni za visoko infektivni kapacitet koji se može pripisati takvim humano-povezanim koronavirusima. Specifično, predmetni pronalazači su identifikovali i okarakterisali 31 različitu sekvencu vodeće RNK koje ciljno deluju na te visoko konzervirane regione odgovarajućih virusnih sekvenci (SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:31).
[0058] U trenutno poznatim porodicama Cas proteina, klasa II, tip VI Cas13 je endonukleaza koja ciljno deluje na RNK koja ima najmanju veličinu, od približno 930 amino-kiselina. Pokazano je da Cas13d poseduje visok nivo katalitičke aktivnosti i specifičnosti u ćelijama sisara. Stoga se čini da je Cas13d posebno pogodna za efikasnu transdukciju i specifično ciljno delovanje i degradaciju jednolančanih RNK virusa, kao što su koronavirusi.
[0059] Pronalazak dodatno obezbeđuje AAV vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvence koje kodiraju najmanje jednu vodeću RNK, pri čemu je sekvenca vodeće RNK odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31, kao i sekvencu koja kodira Cas13d i koja sadrži U6 promotor. AAV vektori se široko upotrebljavaju za pristupe isporuke gena. Međutim, za razliku od uobičajenih AAV transdukcionih sistema, nukleinske kiseline AAV vektora koje se upotrebljavaju u predmetnom pronalasku su jednokomponentni sistemi. Shodno tome, svi elementi potrebni za transdukciju ciljnih ćelija i ekspresiju relevantnih proteina sadržani su u jednom vektoru nukleinske kiseline, čime se olakšava procedura transdukcije. Kako bi se dodatno ubrzala transdukcija i povećala efikasnost transdukcije, vektor nukleinske kiseline je takođe smanjen na minimalnu veličinu. Takvi sve-u-jednom AAV-Cas13-gRNA konstrukti pokazuju superiornu efikasnost i manje neželjenih efekata u poređenju sa konvencionalnim sistemima sa dva vektora nukleinske kiseline. Pošto su AAV2 vektori pokazali visok kapacitet transdukcije u plućima tokom faze III kliničkog ispitivanja, AAV vektori koji su ovde objavljeni poželjno su zasnovani na AAV2 vektorima.
[0060] Predmetni AAV vektori mogu da sadrže bilo kodirajuće sekvence za jednu Cas13, poželjno Cas13d, vodeću RNK, ili kombinaciju dve ili više Cas13, poželjno Cas13d, vodeće RNK kao što je ovde opisano. Upotreba više od jedne vodeće RNK može dodatno povećati efikasnost u ciljnom delovanju i isecanju virusa. Pored toga, kombinacija nekoliko vodećih RNK takođe može povećati efikasnost i specifičnost u ciljnom delovanju na dodatno mutirane viruse, na primer, derivate virusa koji su ovde opisani.
[0061] Odgovarajuće spejser sekvence vodeće RNK dizajnirane su na osnovu poravnanja sekvenci nekoliko humano-povezanih Coronaviridae sojeva (SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:31). Naročito uzimajući u obzir MERS-CoV za dizajn vodećih RNK, koji pokazuje manje sličnosti sekvence sa druga dva blisko srodna koronavirusa SARS-CoV i SARS-CoV-2, omogućava se identifikacija onih regiona virusnog genoma koji omogućavaju virusu da cilja humane ćelije. Ove spejser sekvence vodeće RNK, kao i druge spejser sekvence dizajnirane u skladu sa tim, omogućavaju takođe specifično ciljno delovanje i isecanje Coronaviridae sojeva koji bi mogli postati klinički relevantni tek u budućnosti.
Primeri izvođenja pronalaska
[0062] Trenutno izbijanje COVID-19 uzrokovano infekcijom novoidentifikovanim SARS-CoV-2 već je dovelo do skoro 1.000.000 infekcija i 50.000 smrtnih slučajeva širom sveta za samo nekoliko meseci. Iako očigledno postoji hitna potreba, efikasan lek za sada nije dostupan i procenjuje se da će razvoj vakcine trajati oko 12-18 meseci. Stoga su veoma traženi obećavajući novi terapijski pristupi.
[0063] Novoidentifikovani SARS-CoV-2 pripada porodici Coronaviridae, velikoj porodici jednolančanih RNK virusa pozitivnog sensa. Virusi iz porodice Coronaviridae tipično inficiraju respiratorni sistem i smatraju se odgovornim za brojna humana oboljenja i bolesti u opsegu od obične prehlade do težih bolesti kao što su MERS (MERS-CoV) i SARS (SARS-CoV) [1]. Objavljeno je da SARS-CoV-2 sadrži 10 različitih proteina (ORF1ab, S, ORF3a, E, M, ORF6, ORF7a, ORF8, N, ORF10) (GenBank unos MN908947.3). Poravnanje sekvenci između genoma koji su poreklom iz MERS-CoV, SARS-CoV i SARS-CoV-2 pokazano je na Slici 4.
[0064] Nedavno identifikovani i evoluirani CRISPR/Cas sistemi napravili su revoluciju u uređivanju gena tako što su obezbedili veoma efikasan, specifičan i jednostavan sistem za modifikaciju gena u eukariotskim ćelijama. Kaspaza (Cas) kao efektorski protein, i vodeća RNK za navođenje Cas proteina do specifične ciljne sekvence unutar nukleinske kiseline predstavljaju jedine potrebne komponente sistema koji omogućava precizno isecanje nukleinskih kiselina i/ili genetičku modifikaciju ćelija ili čak celih organizama [4].
[0065] Unutar poznatih porodica Cas proteina, klasa II, tip VI Cas13 je nedavno otkrivena i klasifikovana kao četiri različita podtipa: Cas13a, Cas13b, Cas13c i Cas13d [5]. Cas13d je male veličine, pokazuje visoku katalitičku aktivnost i specifičnost u ćelijama sisara, i cilja i iseca jednolančanu RNK. Dakle, Cas13d nudi uzbudljiv novi pristup za borbu protiv virusne invazije degradacijom jednolančane virusne RNK.
[0066] Međutim, glavna prepreka u upotrebi Cas13d za borbu protiv virusnih infekcija je isporuka Cas proteina i njegove vodeće RNK u (inficirane) ćelije.
[0067] Adeno-povezani virusi su jednolančani DNK virusi bez omotača iz porodice Parvoviridae. Identifikovano je nekoliko serotipova, među kojima je AAV2 verovatno najpoznatiji. Adeno-povezani virusi pokazuju određene karakteristike koje ih čine efikasnim alatom za isporuku gena, kao što su niska patogenost i niska imunogenost, dok su uglavnom široko tropični [6].
[0068] Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje novi terapijski pristup za lečenje humanopovezani koronavirus-indukovanih bolesti i/ili sindroma, posebno COVID-19, primenom pacijentu AAV vektora koji sadrži sekvencu koja kodira Cas13d protein, kao i Cas13 vodeću RNK za ciljno delovanje na specifična ciljna mesta unutar virusnog genoma u cilju isecanja ciljne sekvence i degradacije virusa, pri čemu sekvenca vodeće RNK sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31.
[0069] Pronalazak dodatno obezbeđuje takve vodeće RNK koje su projektovane da interaguju sa visokoobećavajućim ciljnim mestima unutar virusnog genoma.
Vodeće RNK
[0070] Cas13 vodeće RNK, poželjno Cas13d vodeće RNK, iz predmetnog pronalaska usmerene su na ciljne sekvence jednolančane RNK unutar genoma humano-povezanih koronavirusa ili njihovih derivata. Ciljno mesto vodećih RNK koje su ovde objavljene specifično je usmereno na konzervirane sekvence i/ili delove sekvence nekoliko članova porodice Coronaviridae, poželjno između MERS-CoV, SARS-CoV i SARS-CoV-2.
[0071] Tipične Cas13d vodeće RNK ciljaju ciljnu sekvencu od 22-30 nt (spejser) [2]. Stoga, vodeća RNK može biti usmerena na bilo koju ciljnu sekvencu od 22-30 nt unutar genoma koronavirusa. Tipične vodeće RNK koje se ovde upotrebljavaju razmatrane su u Konermann et al. [3].
[0072] Sekvence vodeće RNK mogu biti dizajnirane u skladu sa jednim od sledećih pristupa dizajna:
(1) Proizvedeno je poravnanje sekvence sekvenci genoma različitih sojeva koronavirusa, poželjno SARS-CoV-2, SARS-CoV i MERS-CoV. Spejser sekvence od 22-30 nt dizajnirane su tako da se region semena (seed region) savršeno podudara sa regionima sa 100% preklapanjem između poravnatih sekvenci virusnog genoma. Ostatak spejser sekvence je identičan najmanje jednoj od virusnih sekvenci, poželjno SARS-CoV2, ali može samo delimično da se podudara sa preostalim sekvencama. Stoga, u skladu sa ovim pristupom, efikasnost sečenja je posebno visoka prema sva tri koronavirusa, dok je afinitet vodeće RNK maksimalizovan za virus sa kojim se spejser sekvenca savršeno podudara.
(2) Proizvedeno je poravnanje sekvence sekvenci genoma različitih sojeva koronavirusa, poželjno SARS-CoV-2, SARS-CoV i MERS-CoV. Spejser sekvence od 22-30 nt dizajnirane su tako da se region semena savršeno podudara sa najmanje jednom od virusnih sekvenci, poželjno SARS-CoV-2. Za razliku od prvog pristupa, tolerišu se nepodudaranja u regionu semena spejser sekvence sa odgovarajućim ciljnim sekvencama unutar neke od virusnih sekvenci. Spejser sekvence vodeće RNK koje su dizajnirane ovim pristupom imaju veoma visoke afinitete vezivanja, ali imaju redukovanu efikasnost sečenja prema onim virusima sa kojima se spejser sekvenca ne podudara savršeno.
(3) Proizvedeno je poravnanje sekvence sekvenci genoma različitih sojeva koronavirusa, poželjno SARS-CoV-2, SARS-CoV i MERS-CoV. Spejser sekvence od 22-30 nt dizajnirane su tako da spejser sekvence vodeće RNK najbolje odgovaraju svim članovima porodice Coronaviridae koji su bili podvrgnuti poravnanju sekvenci. Zasnovano na zahtevu da spejser sekvence vodeće RNK imaju 100% sličnost sekvence sa odgovarajućim ciljnim sekvencama svih poravnatih članova koronavirusa u regionu semena, dostižna je ukupna sličnost spejser sekvenci vodeće RNK sa odgovarajućim sekvencama u poravnatim članovima koronavirusa i do 95%. Ovaj pristup omogućava najveću verovatnoću da vodeće RNK takođe ciljaju buduće varijante koronavirusa.
[0073] Stoga, vodeća RNK može biti usmerena na ciljnu sekvencu unutar konzerviranih regiona genoma virusa iz porodice Coronaviridae, poželjno onih od humano-povezanih koronavirusa.
[0074] Vodeća RNK može biti usmerena na ciljnu sekvencu unutar konzerviranih regiona genoma MERS-CoV, SARS-CoV i SARS-CoV-2 ili njihovih derivata.
[0075] Vodeća RNK može biti usmerena na ciljnu sekvencu unutar SARS-CoV-2 genoma ili njegovih derivata.
[0076] Vodeća RNK može da sadrži spejser sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1 - 39 ili njihove kombinacije, kao što je pokazano u Tabeli 1 ovde.
[0077] Vodeća RNK može, na primer, da sadrži spejser sekvencu SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 ili SEQ ID NO:39, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0078] Vodeća RNK može da sadrži spejser sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-31, ili njihove kombinacije.
[0079] Spejser sekvenca vodeće RNK može, na primer, da sadrži spejser sekvencu SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 ili SEQ ID NO:31, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0080] Vodeća RNK može dodatno da sadrži spejser sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 3, 4, 11-20, 22, 29 ili 31, ili njihove kombinacije.
[0081] Spejser sekvenca vodeće RNK može na primer da sadrži spejser sekvencu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:29 ili SEQ ID NO:31, ili njihove kombinacije.
[0082] Vodeća RNK može da sadrži spejser sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 19, 20, 22 ili 29, ili njihove kombinacije.
[0083] Spejser sekvenca vodeće RNK može na primer da sadrži spejser sekvencu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22 ili SEQ ID NO:29, ili njihove kombinacije.
[0084] Vodeća RNK takođe može da sadrži spejser sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 13-18 ili 31.
[0085] Vodeća RNK može da sadrži spejser sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 4, 6, 11-16, i 31.
[0086] Posebno pogodne vodeće RNK uključuju spejser sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 4, 7, 15, 23, 27, i 31.
[0087] Spejser sekvenca vodeće RNK može, na primer, da sadrži spejser sekvencu SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, ili SEQ ID NO:31, ili njihove kombinacije.
Tabela 1: Spejser sekvence vodeće RNK kao što je ovde objavljeno
[0088] Od prethodno nabrojanih spejser sekvenci, one koje su označene kao gRNA_XX-O-1 do gRNA_XX-O-18 ciljaju ORF1ab gen, gRNA_XX-S-1 do gRNA_XX-S-4 sekvence ciljaju gen "S" spajk proteina, gRNA_XX-E-1 do gRNA_XX-E-4 sekvence ciljaju gen proteina omotača, gRNA_XX-M-1 do gRNA_XX-M-2 sekvence ciljaju gen proteina membrane, i gRNA_XX-N-1 do gRNA_XX-N-3 ciljaju gen nukleokapsidnog proteina.
Cas13d
[0089] U skladu sa predmetnim pronalaskom, Cas13, poželjno Cas13d, je odabrana kao endonukleaza za isecanje i ciljno delovanje na genome koronavirusa. Zbog svoje male veličine i visoke efikasnosti i specifičnosti ciljnog delovanja i isecanja u ćelijama sisara, čini se da je ovaj član CRISPR/Cas posebno pogodan za antivirusni pristup.
[0090] Cas13d, kao i drugi enzimi iz porodice Cas13, ima svojstvo da samostalno obrađuje sopstvene CRISPR nizove u zrele vodeće RNK koje sadrže 30 baznih parova 5' direktnog ponovka praćeno varijabilnim 3' spejserom koji je u opsegu dužine od 22 do 30 bp.
[0091] Do danas, identifikovano je sedam različitih Cas13d proteina (Slika 1): EsCas13d, RffCas13d, UrCas13d, RaCas13d, P1E0 Cas13d, Adm Cas13d i RfxCas13d. Među ovim Cas13d varijantama, objavljeno je da RfxCas13d pokazuje visoku efikasnost obaranja RNK uz minimalnu nespecifičnu aktivnost [2].
[0092] Stoga, u nekim primerima izvođenja, može se upotrebljavati bilo koja Cas13d endonukleaza.
[0093] U poželjnim primerima izvođenja, upotrebljava se RfxCas13d endonukleaza.
AAV vektor koji sadrži sekvencu koja kodira Cas13d i koji sadrži ekspresionu kasetu vodeće RNK
[0094] AAV vektor iz predmetnog pronalaska sadrži molekul nukleinske kiseline koji sadrži ekspresionu kasetu Cas13d vodeće RNK koja kodira za najmanje jednu vodeću RNK, pri čemu je sekvenca vodeće RNK odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31 i sekvencu koja kodira Cas13d protein i koja sadrži U6 promotor. AAV vektor služi kao vehikulum za transport CRISPR/Cas13d sistema u ćeliju, uključujući i one inficirane virusom.
[0095] AAV vektori predstavljaju dobro poznat alat za isporuku gena koji je pogodan za različite primene. U zavisnosti od odgovarajućeg AAV serotipa, AAV vektori pokazuju izuzetan tropizam i stoga omogućavaju usmerenu transdukciju ciljnih ćelija. Na primer, dokazano je da AAV9 pokazuje tropizam za ćelije miokarda i stoga, vektori zasnovani na AAV9 smatraju se pogodnim za isporuku gena u ove ćelije (videti, npr. EP patent br. 3 132 041 od Kupatt et al.). Slično, vektori zasnovani na AAV2 pokazali su potencijal za lečenje cistične fibroze kod ljudi, kao što su razmatrali Guggino et al. [7] (videti takođe [8]).
[0096] AAV vektori imaju ograničenje pakovanja od samo oko 4,7 kb, što, za većinu pristupa transdukcije, podrazumeva upotrebu više od jednog vektora kako bi se omogućio transfer svih potrebnih genetičkih elemenata.
[0097] Međutim, odabirom relativno male Cas13d i, gde je potrebno, dopunskim uklanjanjem neobaveznih elemenata iz AAV vektora, predmetni pronalazak obezbeđuje jedan AAV vektor koji sadrži sve elemente koji su potrebni za ekspresiju Cas13d i njene vodeće RNK u transdukovanoj ćeliji.
[0098] Slično, mogu se upotrebljavati i drugi Cas13 proteini koji ne premašuju veličinu pakovanja AAV vektora. Stoga, Cas13 proteini koji imaju manje od 1000 amino-kiselina posebno su pogodni za vektore u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0099] Primer šematske mape plazmidnog AAV2 vektora koji kodira Cas13d i vodeću RNK prikazan je na Slici 3A i Slici 3B.
[0100] AAV vektor iz predmetnog pronalaska može biti zasnovan na brojnim AAV serotipovima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, ili AAV9.
[0101] U poželjnim primerima izvođenja, AAV vektor je zasnovan na AAV1, AAV2, AAV5 ili AAV9.
[0102] U još poželjnijim primerima izvođenja, AAV vektor je zasnovan na AAV2.
[0103] U sledećem još poželjnijem primeru izvođenja, AAV vektor je zasnovan na AAV9.
[0104] U najpoželjnijim primerima izvođenja, plazmidni AAV vektor je pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d (videti SEQ ID NO:40).
[0105] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, plazmidni AAV vektor je pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d-array-triguide (videti SEQ ID NO:41) koji omogućava insertovanje tri sekvence gRNA.
[0106] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, plazmidni AAV vektor je pAAV-U6-gRNA-quadguide-CMV-Cas13d-V3-basic (videti SEQ ID NO:42) koji omogućava insertovanje četiri vodeće RNK sekvence. Generisanje AAV vektora upotrebom plazmidnog vektora SEQ ID NO:42 dovešće do pakovanja 5064 bp DNK, koja ima sekvencu SEQ ID NO:45 u AAV vektor.
[0107] Moguće je smanjiti veličinu tovara AAV vektora tako što se ne uključuju nukleuslokalizujuće sekvence (NLS) u kodiranu sekvencu Cas13d proteina. Proliferacija SARS-CoV-2 se događa u citosolu. Stoga, upotrebom Cas13d proteina bez NLS, akumulacija Cas13d u citosolu može biti poboljšana, dok se u isto vreme redukuje veličina proteina i konstrukta koji ga kodira. Pogodan plazmidni vektor koji kodira Cas13d protein bez NLS je pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-Sapl (videti SEQ ID NO:43). Generisanje AAV vektora upotrebom plazmidnog vektora SEQ ID NO:43 dovešće do pakovanja 4833 bp DNK, koja ima sekvencu SEQ ID NO:46 u AAV vektor.
[0108] Poželjno, AAV vektor sadrži manje od 5 kb DNK. Efikasnost pakovanja i ekspresija u ćelijama značajno opadaju pri veličinama većim od 5 kb [11].
[0109] Kako bi se dodatno promovisalo vezivanje Cas13d proteina za SARS-CoV-2 genom, N-terminusni RNK vezujući domen (N-NTD) može se fuzionisati za Cas13d protein. N-NTD je RNK-vezujući domen nukleokapsidnog (N) proteina SARS-CoV-2. Glavna funkcija nukleokapsidnog proteina tokom infekcije je da vezuje virusnu RNK i formira spiralni ribonukleoproteinski (RNP) kompleks, kako bi zaštitio virusni genom i održao pouzdanu replikaciju virusa. N-terminusni vezujući domen (N-NTD) nukleokapsidnog proteina hvata virusni RNK genom i C-terminusni domen usidrava RNP kompleks za virusnu membranu putem njegove interakcije sa M proteinom. Stoga, očekuje se da će fuzija N-NTD za Cas13d protein promovisati formiranje kompleksa koji uključuje Cas13d i virusni genom, i na taj način navoditi Cas13d u prostornu blizinu virusnog genoma. Pogodan plazmidni vektor koji kodira Cas13d protein sa N-NTD koji je fuzionisan za njegov C-terminus je pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-NTD-Aarl (videti SEQ ID NO:44). Generisanje AAV vektora upotrebom plazmidnog vektora SEQ ID NO:44 dovešće do pakovanja 5238 bp DNK, koja ima sekvencu SEQ ID NO:47 u AAV vektor.
[0110] U zavisnosti od toga na kom se odgovarajućem serotipu zasniva AAV vektor iz trenutnog pronalaska, AAV vektor može pokazati tropizam za određene tipove ćelija, tkiva i organe koji sadrže ove tipove ćelija.
[0111] Stoga, AAV vektor iz predmetnog pronalaska može biti usmeren na različite tipove ćelija i organe u ljudskom telu odabirom specifičnog serotipa AAV vektora.
[0112] U poželjnim primerima izvođenja, AAV vektor pokazuje tropizam za ćelije humanog respiratornog sistema, i usmeren je na njih.
[0113] U još poželjnijim primerima izvođenja, AAV vektor je AAV2 vektor usmeren na ćelije humanog respiratornog sistema.
[0114] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor je usmeren na ćelije humanog miokarda.
[0115] U još poželjnijim primerima izvođenja, AAV vektor je AAV9 vektor usmeren na ćelije humanog miokarda.
[0116] AAV vektori iz predmetnog pronalaska mogu da kodiraju jednu Cas13d vodeću RNK ili kombinaciju nekoliko vodećih RNK. Stoga, AAV vektor može da kodira 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ili 39 vodećih RNK.
[0117] U poželjnim primerima izvođenja, AAV vektor kodira jednu vodeću RNK.
[0118] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor kodira dve vodeće RNK.
[0119] U najpoželjnijim primerima izvođenja, AAV vektor kodira tri, četiri, ili pet vodećih RNK. Poželjno, spejser sekvence vodećih RNK ciljaju različite gene SARS-CoV-2 genoma.
[0120] Pogodne kombinacije vodećih RNK za upotrebu u predmetnom pronalasku imaju spejser sekvence SEQ ID NO: 4, 7, i 15; SEQ ID NO: 15, 23, i 31; SEQ ID NO: 15, 27, i 31; SEQ ID NO: 23, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 15, 23, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 7, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 23, i 31; SEQ ID NO: 7, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 7, 15, 23, 27, i 31.
[0121] Posebno poželjne vodeće RNK za upotrebu u predmetnom pronalasku imaju spejser sekvence SEQ ID NO: 4, 7, i 15; SEQ ID NO: 4, 15, 23, 27, i 31; i SEQ ID NO: 4, 7, 27, i 31.
[0122] U poželjnim primerima izvođenja, AAV vektor kodira kombinaciju vodećih RNK pod istim promotorom.
AAV vektori koji kodiraju Cas13d i Cas13d vodeću RNK za lečenje virusnih infekcija
[0123] Predmetni pronalazak obezbeđuje novi terapijski pristup za lečenje humano-povezanih koronavirus infekcija. Introdukovanjem AAV vektora u ćelije, i nakon ekspresije Cas13, Cas13 se navodi pomoću vodeće RNK do ciljne sekvence unutar virusnog genoma, radi isecanja i stoga prekida genomske sekvence. U ćelijama koje su već inficirane koronavirusom, virusna sekvenca se iseca što dovodi do virusne degradacije i inhibicije bilo kakvog dopunskog širenja virusne kontaminacije. U ćelijama koje još nisu inficirane, ekspresija sistema Cas13 vodeća RNK nudi zaštitni mehanizam takvim ćelijama tako što odmah degradira virusni genetički materijal po ulasku u ćeliju.
[0124] Kako bi stigao do ciljne ćelije, AAV vektor se isporučuje u tkiva i organe koji sadrže ciljne ćelije.
[0125] U skladu sa trenutnim izveštajima, koronavirusom uzrokovane bolesti uglavnom se manifestuju u respiratornom sistemu inficiranih subjekata, što dovodi do blagih do teških respiratornih simptoma i reakcija. Posebno, MERS, SARS, i COVID-19 varijante korone uobičajeno dovode do inflamacije pluća, pulmonarnog distresa, i akutnog respiratornog sindroma, koji su često uzrokovani ili vođeni citokinskim olujama preterano snažnog imunskog sistema. Druge naučne publikacije objavljuju nalaze koji sugerišu da barem COVID-19 varijanta takođe može negativno uticati na miokard kod nekih pacijenata. Shodno tome, tokom lečenja pacijenta, AAV vektor se isporučuje u respiratorni sistem, posebno u pluća, i/ili miokard kao što je naznačeno.
[0126] Stoga, u jednom primeru izvođenja, AAV vektor za lečenje humano-povezani koronavirus-indukovane bolesti primenjuje se u respiratorni sistem pacijenta.
[0127] U sledećem primeru izvođenja, AAV vektor se primenjuje u donji respiratorni trakt pacijenta.
[0128] U poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor se primenjuje u gornji respiratorni trakt pomoću inhalacije.
[0129] AAV vektor se može primeniti direktno u tkivo traheje.
[0130] U primeru izvođenja specifičnog lečenja MERS, SARS, i/ili COVID-19, AAV vektor se može primeniti u gornji respiratorni trakt pacijenta.
[0131] U sledećem primeru izvođenja lečenja MERS, SARS, i/ili COVID-19, AAV vektor se može primeniti u donji respiratorni trakt pacijenta.
[0132] AAV vektor koji sadrži ekspresionu kasetu vodeće RNK i sekvencu koja kodira Cas13d može biti sadržan u kompoziciji.
[0133] U primeru izvođenja, kompozicija može biti u obliku tablete, kapsule, sirupa, filma, tečnosti, rastvora, praška, paste, aerosola, injekcije, kreme, gela, losiona ili kapi.
[0134] U sledećem primeru izvođenja, kompozicija je u obliku aerosola i primenjuje se kroz inhalator, nebulizator ili isparivač.
[0135] U poželjnim primerima izvođenja, kompozicija je u obliku aerosola i primenjuje se kroz inhalator.
[0136] U još poželjnijem primeru izvođenja, kompozicija je u obliku aerosola i primenjuje se kroz inhalator u gornji respiratorni trakt.
[0137] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, AAV vektor ili kompozicija koja ga sadrži primenjuje se pacijentu kroz respirator.
Adenovirusni vektori
[0138] Svi aspekti iz predmetnog pronalaska takođe se mogu praktikovati sa adenovirusnim vektorima umesto AAV vektora. Adenovirusni vektori imaju prednost većeg ograničenja veličine pakovanja.
[0139] U skladu sa tim, adenovirusni vektor može da sadrži sekvencu koja kodira Cas13d i ekspresionu kasetu vodeće RNK. Adenovirusni vektor može biti isporučen u ciljne ćelije i može biti upotrebljen za lečenje humano-povezanih koronavirusnih infekcija, kao što je SARS-CoV-2 infekcija.
Isporuka vodećih RNK i Cas13d proteina nezavisno od virusnih vektora
[0140] Vodeće RNK iz predmetnog pronalaska takođe mogu biti isporučene u ciljne ćelije bez upotrebe virusnih vektora. Na primer, može se upotrebljavati postupak koji je opisan u referenci [10], koji uključuje isporuku Cas13 iRNK generisane pomoću in vitro transkripcije istovremeno sa sintetičkim vodećim RNK. Može se upotrebljavati molski odnos vodeće RNK prema iRNK od 50:1. iRNK i vodeće RNK mogu se isporučiti pomoću vezikula.
[0141] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje AAV vektor, adenovirusni vektor ili kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u lečenju humano-povezanih koronavirusnih infekcija, kao što je SARS-CoV-2 infekcija, isporukom sintetičkih vodećih RNK i iRNK koja kodira Cas13 protein u respiratorni trakt pacijenta kome je to potrebno. Detalji ovog postupka opisani su u referenci [10]. Cas13 protein može biti Cas13a protein. Cas13 protein može biti Cas13d protein. iRNK i vodeće RNK mogu se isporučiti pomoću vezikula.
PRIMERI
Primer 1
[0142] Upotreba AAV vektora koji su ovde objavljeni predstavlja obećavajući novi terapijski pristup za prevenciju i/ili lečenje koronavirus-indukovanih bolesti i sindroma. Zbog toga su trenutno u toku brojna klinička ispitivanja kako bi se testirala pogodnost ovih vektorskih vehikuluma za lečenje različitih bolesti. Klinička ispitivanja kao i odgovarajući testirani AAV vektori navedeni su u Tabeli 2 u nastavku.
Tabela 2: AAV vektori koji su uključeni u klinička ispitivanja
Primer 2 – Dizajn sekvenci vodeće RNK
[0143] Kako bi se kreirao AAV vektor koji kodira Cas13d i vodeću RNK za lečenje humanopovezani koronavirus-indukovane bolesti, dizajnirane su spejser sekvence vodeće RNK.
[0144] Slično slučajevima koji uključuju SARS-CoV i MERS-CoV, SARS-CoV-2, patogen koji uzrokuje COVID-19, uspešno je preživeo transmisiju sa životinje na čoveka. Na osnovu ovog zapažanja, pronalazači su smatrali da između genoma SARS-CoV, MERS-CoV i SARS-CoV-2 treba da postoje visoko konzervirani regioni koji su odgovorni za visoku patogenost i infektivna svojstva ovih virusa kod ljudi. Pronalazači su takođe zaključili da takvi konzervirani genomski regioni nude obećavajuće ciljno mesto za CRISPR/Cas-posredovano isecanje, koje uključuje vodeću RNK koja navodi Cas13 protein, poželjno Cas13d protein, do njegovog cilja i mesta isecanja kako bi time isekao i degradirao virusnu nukleinsku kiselinu.
[0145] Stoga, kreirano je poravnanje sekvence sekvenci nukleinskih kiselina poreklom iz SARS-CoV, MERS-CoV i SARS-CoV-2 varijanti koronavirusa i identifikovano je pet visoko konzerviranih regiona: ORF1ab, S, E, M i N (videti Sliku 4). Identifikovana je trideset i jedna spejser sekvenca vodeće RNK koje ciljno deluju na konzervirane regione i predstavljaju veoma obećavajuće ciljeve za isecanje i degradaciju patogena (SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:31).
[0146] Kako bi se identifikovale slične sekvence između sve tri SARS-CoV-2, SARS-CoV i MERS-CoV varijante, upotrebljavaju se tri glavna pristupa:
(1) U prvom pristupu, identifikuju se spejser sekvence koje sadrže sekvencu semena koja sadrži region od 7 baznih parova koji se precizno preklapa između sekvenci sva tri genoma virusa. Ova sekvenca je uključena kao region semena (15-21. baza spejser sekvence vodeće RNK; [2]) spejser sekvence vodeće RNK. Ostatak ove spejser sekvence savršeno se podudara sa SARS-CoV-2 sekvencom, ali se samo delimično podudara sa MERS-CoV i SARS-CoV varijantama. Region semena se smatra kritičnom sekvencom za specifičnost ciljnog delovanja vodeće RNK Cas13d. Shodno tome, u slučaju nepodudaranja kritične sekvence semena sa ciljnom sekvencom, Cas13d ne može da iseče ciljnu sekvencu. Stoga, ovim pristupom se postiže najbolja efikasnost sečenja prema sva tri koronavirusa, dok je afinitet vodeće RNK maksimalizovan za SARS-CoV-2.
(2) U drugom pristupu, povećanjem sličnosti sekvence između spejser sekvence vodeće RNK i odgovarajuće ciljne sekvence po celoj dužini spejser sekvence, povećava se afinitet vezivanja spejser sekvence za virusnu RNK. Za razliku od prvog pristupa, tolerišu se nepodudaranja u regionu semena spejser sekvence sa odgovarajućim ciljnim sekvencama unutar SARS-CoV i MERS-CoV. Međutim, data je 100% sličnost sekvence između sekvence regiona semena i odgovarajuće ciljne sekvence u SARS-CoV-2. Spejser sekvence vodeće RNK koje su dizajnirane ovim pristupom imaju veoma visoke afinitete vezivanja, ali pokazuju redukovanu efikasnost sečenja prema MERS-CoV i SARS-CoV.
(3) U trećem pristupu, identifikuju se vodeće RNK koje najbolje odgovaraju za sva tri člana koronavirus porodice. Na osnovu zahteva da spejser sekvence vodeće RNK imaju 100% sličnost sekvence sa odgovarajućim ciljnim sekvencama sva tri člana koronavirusa u regionu semena, postignuta je ukupna sličnost sekvence spejser sekvenci vodeće RNK sa odgovarajućim sekvencama u tri člana koronavirusa i do 95%. Ovaj pristup omogućava najveću verovatnoću da vodeće RNK takođe ciljaju buduće varijante koronavirusa.
[0147] Prethodno identifikovane spejser sekvence vodeće RNK poravnate su sa svim do sada poznatim humano-povezanim virusnim transkriptima SARS-CoV-2. Odatle su odabrane spejser sekvence koje pokazuju visoku specifičnost za ciljnu sekvencu, i stoga redukuju rizik od potencijalnih terapijom indukovanih neželjenih efekata, i svaka je insertovana u pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d plazmid koji između ostalog sadrži U6 promotor za ekspresionu kasetu vodeće RNK kao i sekvencu koja kodira Cas13d protein (videti takođe SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:40).
Primer 3 - Procena efikasnosti pojedinačnih sekvenci vodeće RNK
[0148] Inhibitorna potentnost 39 gRNA iz Tabele 1 procenjena je u testu sa luciferazom kotransfekcijom pMir-reportera i sve-u-jednom Cas13 vodećih konstrukata. Kao negativna kontrola upotrebljena je vodeća RNK koja ciljno deluje na LacZ.
[0149] Prvi eksperimenti pregledanja izvedeni su sa neinfektivnim materijalima. Trideset devet vodećih RNK (gRNA) ciljaju 6 različitih regiona: gRNA_XX-O-1 do gRNA_XX-O-18 ciljaju ORF1ab gen, gRNA_XX-S-1 do gRNA_XX-S-4 sekvence ciljaju gen "S" spajk proteina, gRNA_XX-E-1 do gRNA_XX-E-4 sekvence ciljaju gen proteina omotača, gRNA_XX-M-1 do gRNA_XX-M-2 sekvence ciljaju gen proteina membrane, i gRNA_XX-N-1 do gRNA_XX-N-3 ciljaju gen nukleokapsidnog proteina. Stoga smo klonirali 6 regiona pomoću PCR i insertovali ih u pMIR vektor (3'-UTR vektor luciferaze). Ovim je dobijeno 6 konstrukata luciferaze označenih kao pMIR-report-SARS-COV-2-fragment 1-6. Kako bi se procenila inhibitorna potentnost svake gRNA, ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK293) su ko-transfektovane sa sve-u-jednom Cas13 vodećim konstruktom i njegovim odgovarajućim pMIR reporterskim konstruktom. LacZ vodeća je upotrebljena kao negativna kontrola. Od 39 gRNA, na kraju je odabrano 7 vodećih za dodatne eksperimente (naglašeno crvenom bojom na Sl.5).
Primer 4 - Testiranje sistema Cas13-vodeća RNK u SARS-CoV-2-inficiranim humanim epitelnim ćelijama pluća
Eksperimentalni dizajn 1
[0150] Kako bismo procenili inhibitorni efekat našeg sistema, prvo smo upakovali svaki od nekoliko konstrukata vodeće RNK u AAV2 viruse. Svaki AAV je primenjen sa titrom od 10.000 vg/ćeliji (virusni genomi po ćeliji) za transdukciju Calu-3 ćelija humanog bronhijalnog epitela (40.000 ćelija/bunariću), što je tipična ćelijska linija za studije o koronavirusu in vitro, sa različitim kombinacijama konstrukata vodeće RNK. Posle 72 sata, ćelije koje su AAVtransdukovane dodatno su inficirane SARS-CoV-2 virusom sa MOI (višestrukost infekcije -odnosi se na broj virusnih čestica po ćeliji) od 0,01. Jedan sat posle inkubacije na 37 °C, infektivni medijum je uklonjen i ćelije su isprane 2x sa DPBS. Posle toga, medijum za kulturu je sakupljen u vremenskim tačkama od 24 hpi (sati nakon infekcije) i 48 hpi. Eksperimentalni raspored je pokazan na Sl. 6A.
[0151] Infektivnost SARS-CoV-2 izmerena je pomoću testa plaka. Rezultati su pokazani na Sl. 6B. Test plaka pokazuje da u većini slučajeva kombinacija efikasnih pojedinačnih vodećih RNK rezultuje povećanom sposobnošću inhibicije replikacije virusa. Ispostavilo se da su sve vodeće RNK koje su identifikovane kao efikasne u testu sa luciferazom (Primer 3) i testirane u testu kombinovanog pristupa visoko efikasne u suzbijanju replikacije virusa u živim humanim epitelnim ćelijama pluća. Stoga, u principu sve kombinacije vodećih RNK koje su pokazale efikasnost degradacije blizu 50% i niže mogu se upotrebljavati za kombinovani pristup.
Eksperimentalni dizajn 2
[0152] Razvijen je novi eksperimentalni dizajn (videti Sl. 7A), koji uključuje veći titar AAV (100.000 vg/ćeliji po konstruktu) za transdukciju Calu-3 ćelija (30.000 ćelija/bunariću). Posle 48 sati, AAV-transdukovane ćelije dodatno su inficirane SARS-CoV-2 virusom, i medijum za kulturu je sakupljen u vremenskim tačkama od 24 hpi i 48 hpi.
[0153] Infektivnost SARS-CoV-2 izmerena je pomoću testa plaka. Rezultati su pokazani na Sl. 7B. Sva tri uzorka (D-F) koja su tretirana sa različitim kombinacijama gRNA pokazala su značajne efekte u poređenju sa netretiranim kontrolnim uzorkom. Kombinacija D od 3 vodeće RNK pokazala je 93% redukciju SARS-CoV2 titra unutar 24 sata i 94% redukciju unutar 48 sati. Kombinacija F od 4 vodeće RNK pokazala je 98% redukciju unutar 24 sata i 95% redukciju unutar 48 sati. Kombinacija E od 5 vodećih RNK pokazala je 94% redukciju unutar 24 sata i 100% redukciju unutar 48 sati.
[0154] Eksperiment je ponovljen takođe uključivanjem konstrukata sa više vodećih RNK koji bi mogli da isporuče nekoliko vodećih RNK u jednom AAV. Ovo uključuje četvorovodeći konstrukt SEQ ID NO:42 i konstrukt SEQ ID NO:44 koji kodira Cas13d sa NTD fuzionisanim za svoj C-terminus. Rezultati su pokazani na Sl.8.
REFERENCE
[1] Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses, "The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2", Nature Microbiology (5): 536-544, 2020.
[2] Wessels H-H et al., "Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design", Nature Biotechnology, 2020.
[3] Konermann S et al., "Transcriptome engineering with RNA-targeting Type VI-D CRISPR effectors", Cell (173(3)): 665-676, 2018
[4] Cong L, "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems", Science (339(6121)):819-23, 2013.
[5] Shmakov S et al., "Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems", Molecular Cell (69):385-397, 2015.
[6] Colella P et al., "Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy", Molecular Therapy: Methods & Clinical Development (8):87-104, 2018.
[7] Guggino WB et al., "AAV gene therapy for cystic fibrosis: current barriers and recent developments", Expert Opinion on Biological Therapy (17(10)):1265-1273, 2017.
[8] Moss RB et al., "Repeated Adeno-Associated Virus serotype 2 aerosol-mediated cystic fibrosis transmembrane regulator gene transfer to the lungs of patients with cystic fibrosis", CHEST (125(2)):509-521, 2004.
[9] Abbott TR et al., "Development of CRISPR as a prophylactic strategy to combat novel coronavirus and influenza", bioRxiv, 2020.
[10] Blanchard EL et al., "Treatment of influenza and SARS-CoV-2 infections via mRNA-encoded Cas13a in rodents", Nature Biotechnology, doi: 10.1038/s41587-021-00822-w, 2021.
[11] Grieger CJ & Samulski RJ, "Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: Impact of larger genomes on infectivity and postentry steps", Journal of Virology 79(15):9933-9944, 2005.
[12] Nguyen TM et al., "Virus against virus: a potential treatment for 2019-nCov (SARS-CoV-2) and other RNA viruses", Cell Research 30(3):189-190, 2020

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Vodeća RNK za upotrebu sa Cas13 proteinom, naznačeno time što je ciljno mesto vodeće RNK sekvenca koja je sačinjena od SARS-CoV-2 genoma, pri čemu sekvenca vodeće RNK sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31.
2. Molekul nukleinske kiseline naznačen time što sadrži sekvencu koja kodira Cas13d protein i ekspresionu kasetu vodeće RNK koja kodira vodeću RNK u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili više od jedne vodeće RNK u skladu sa patentnim zahtevom 1 i koja sadrži U6 promotor.
3. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa patentnim zahtevom 2, koji kodira vodeće RNK naznačen time što sadrži sekvence SEQ ID NO: 4, 7, i 15; SEQ ID NO: 15, 23, i 31; SEQ ID NO: 15, 27, i 31; SEQ ID NO: 23, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 15, 23, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 7, 27, i 31; SEQ ID NO: 4, 23, i 31; SEQ ID NO: 7, 27, i 31; ili SEQ ID NO: 4, 7, 15, 23, 27, i 31, poželjno SEQ ID NO: 4, 7, 27, i 31.
4. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 2 ili 3, naznačen time što je molekul nukleinske kiseline plazmid, poželjno jedan plazmid.
5. Molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od patentnih zahteva 2-4, naznačeno time što navedeni Cas13d protein kodiran navedenom sekvencom ne sadrži nukleuslokalizujući signal (NLS) i/ili je fuzioni protein koji sadrži N-terminusni vezujući domen (N-NTD) nukleokapsidnog proteina SARS-CoV-2.
6. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 4-5, naznačen time što se molekul nukleinske kiseline može dobiti insertovanjem spejser sekvence vodeće RNK u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-2 u plazmid pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d SEQ ID NO:40; ili insertovanjem najmanje jedne spejser sekvence najmanje jedne vodeće RNK u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-2 u plazmid pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d-array-triguide SEQ ID NO:41, plazmid pAAV-U6-gRNA-quadguide-CMV-Cas13d-V3-basic SEQ ID NO:42, plazmid pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-Sapl SEQ ID NO:43, ili plazmid pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-NTD-Aarl SEQ ID NO:44.
7. AAV vektor naznačen time što sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od patentnih zahteva 2-6, poželjno pri čemu je AAV vektor AAV2 ili AAV9 vektor i/ili pri čemu je okosnica AAV vektora redukovane veličine.
8. Adenovirusni vektor naznačen time što sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od patentnih zahteva 2-6.
9. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži AAV vektor prema patentnom zahtevu 7 ili adenovirusni vektor prema patentnom zahtevu 8.
10. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži najmanje jednu vodeću RNK prema patentnom zahtevu 1 i najmanje jednu iRNK koja kodira Cas13 protein, poželjno pri čemu navedeni Cas13 protein kodiran navedenom iRNK je Cas13d i ne sadrži nukleus-lokalizujući signal (NLS).
11. Farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 9-10, naznačena time što je navedeni Cas13d protein kodiran navedenom iRNK fuzioni protein koji sadrži N-terminusni vezujući domen (N-NTD) nukleokapsidnog proteina SARS-CoV-2.
12. AAV vektor u skladu sa patentnim zahtevom 7, adenovirusni vektor u skladu sa patentnim zahtevom 8, ili farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 9-11 za upotrebu u lečenju humano-povezanim virusom uzrokovane bolesti ili sindroma kod pacijenta kome je to potrebno.
13. AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačeno time što je bolest ili sindrom rezultat infekcije koronavirusom koji je genetički srodan sa grupom koja se sastoji od MERS-CoV, SARS-CoV i SARS-CoV-2, poželjno pri čemu je bolest COVID-19.
14. AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 12-13, naznačeno time što Cas13 nakon ekspresije iseca humano-povezani virus.
15. AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 12-14, naznačeno time što se AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija primenjuju putem gornjeg raspiratornog trakta, poželjno intranazalno ili intratrahealno ili u aerosolnoj kompoziciji kroz inhalator ili nebulizator, poželjno kroz respirator.
16. AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 12-15, naznačeno time što se AAV vektor, adenovirusni vektor, ili farmaceutska kompozicija primenjuju u miokard.
RS20231159A 2020-04-08 2021-03-11 Sve-u-jednom aav vektori za lečenje koronavirus-indukovanih bolesti RS65372B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063006996P 2020-04-08 2020-04-08
EP21715779.1A EP4034661B1 (en) 2020-04-08 2021-03-11 All-in-one aav vectors for treating coronavirus-induced diseases
PCT/EP2021/056221 WO2021204492A1 (en) 2020-04-08 2021-03-11 All-in-one aav vectors for treating coronavirus-induced diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65372B1 true RS65372B1 (sr) 2024-04-30

Family

ID=75339666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20231159A RS65372B1 (sr) 2020-04-08 2021-03-11 Sve-u-jednom aav vektori za lečenje koronavirus-indukovanih bolesti

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230242914A1 (sr)
EP (1) EP4034661B1 (sr)
JP (1) JP7756284B2 (sr)
CN (1) CN115667512A (sr)
AU (1) AU2021253344B2 (sr)
ES (1) ES2967509T3 (sr)
HR (1) HRP20240099T8 (sr)
HU (1) HUE065161T2 (sr)
PL (1) PL4034661T3 (sr)
RS (1) RS65372B1 (sr)
WO (1) WO2021204492A1 (sr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022086914A1 (en) * 2020-10-19 2022-04-28 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Genetic approach to suppress coronaviruses
EP4479544A2 (en) * 2022-02-16 2024-12-25 Agency for Science, Technology and Research Methods of preventing or treating an rna viral infection in a subject

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014207153A1 (de) 2014-04-14 2015-10-15 Rabea Hinkel AAV-Vektoren für vaskuläre Gentherapie in koronarer Herzerkrankung und peripherer Ischämie
US11739308B2 (en) * 2017-03-15 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Cas13b orthologues CRISPR enzymes and systems
US10476825B2 (en) 2017-08-22 2019-11-12 Salk Institue for Biological Studies RNA targeting methods and compositions
WO2021183887A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods for viral genome targeting

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20240099T1 (hr) 2024-05-24
EP4034661B1 (en) 2023-09-06
PL4034661T3 (pl) 2024-03-18
CN115667512A (zh) 2023-01-31
ES2967509T3 (es) 2024-04-30
EP4034661C0 (en) 2023-09-06
AU2021253344A1 (en) 2022-12-01
HUE065161T2 (hu) 2024-05-28
US20230242914A1 (en) 2023-08-03
WO2021204492A1 (en) 2021-10-14
CA3174832A1 (en) 2021-10-14
AU2021253344B2 (en) 2025-08-28
HRP20240099T8 (hr) 2024-06-21
EP4034661A1 (en) 2022-08-03
JP2023520814A (ja) 2023-05-19
JP7756284B2 (ja) 2025-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105431170B (zh) 嵌合腺相关病毒/博卡病毒细小病毒载体
Flotte et al. Stable in vivo expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an adeno-associated virus vector.
JP2022530457A (ja) 遺伝子操作ａａｖ
KR20190117571A (ko) 혈관계를 통한 유전자 전달 방법 및 조성물
Yu et al. Roles of the polymerase-associated protein genes in Newcastle disease virus virulence
JP2022529457A (ja) 嚢胞性線維症の治療のための組成物及び方法
SG11202111353QA (en) Methods and compositions for transgene expression
RS65372B1 (sr) Sve-u-jednom aav vektori za lečenje koronavirus-indukovanih bolesti
EP4277641A1 (en) Compositions for and methods of improving gene therapy
CA3174832C (en) All-in-one aav vectors for treating coronavirus-induced diseases
US20220389450A1 (en) Vector system
EP4715058A1 (en) Gene therapy for rett syndrome
CA3216495A1 (en) Methods and compositions for treatment of cystic fibrosis
Oliveira An investigation into persistent transgene expression from plasmid vectors in the lung
CN121293372A (zh) 融合蛋白及编码其的mRNA和在抑制结核分枝杆菌中的应用
HK1217916B (zh) 嵌合腺相關病毒/博卡病毒細小病毒載體