RS65389B1 - Smanjenje proizvodnje acetata kod kvasaca koji prekomerno eksprimiraju pab1 - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetne kompozicije i postupci se odnose na modifikovani kvasac koji prekomerno eksprimira poliadenilat vezujući protein (PAB1). Kvasac proizvodi smanjenu količinu acetata u poređenju sa njegovim matičnim ćelijama. Takav kvasac je naročito koristan za proizvodnju etanola u velikom obimu od supstrata skroba, u kojoj acetat predstavlja neželjeni nusproizvod.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Pri proizvodnji etanola na bazi kvasca prve generacije šećeri se konvertuju u etanol za gorivo. Godišnja proizvodnja etanola za gorivo pomoću kvasaca iznosi oko 90 milijardi litara širom sveta (Gombert, A.K. i van Maris. A.J. (2015) Curr. Opin. Biotechnol.33:81-86). Procenjeno je da oko 70% troškova proizvodnje etanola predstavljaju sirovine. Usled izuzetno velikog obima proizvodnje, čak i mala poboljšanja prinosa imaju značajan ekonomski učinak u celoj industriji.

[0003] Put fosfoketolaze (PKL) genetskim putem je konstruisan u kvascu kako bi se povećala proizvodnja etanola, kao što je opisano u WO2015148272 (Miasnikov et al.). Nažalost, konstruisani sojevi takođe proizvode više acetata nego matični kvasci. Acetat nije poželjan nusproizvod, pošto ima negativno dejstvo na rast i fermentaciju kvasca. Pored toga, acetat smanjuje pH vrednost vode koja preostaje nakon fermentacije i destilacije, koja se naziva ostatak od destilacije, i koja se obično ponovo koristi za sledeću šaržu supstrata. Usled toga, proizvođači etanola moraju da podese pH vrednost ostatka od destilacije (ili likvefakta) ili da povećaju količinu sveže vode koja se koristi za likvefakciju.

[0004] US2014/273144A1 se odnosi na korišćenje fosfoketolaze i fosfotransacetilaze za proizvodnju jedinjenja dobijenih od acetil koenzima A.

[0005] Postoji potreba za kontrolisanjem količine acetata koju proizvodi kvasac, naročito konstruisani kvasac koji obično proizvodi veću količinu acetata.

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Predmetni pronalazak je definisan putem priloženih zahteva. Predmetne kompozicije i postupci se odnose na modifikovani kvasac koji prekomerno eksprimira polipeptid PAB1, kao što je definisano u priloženim zahtevima.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

I. Definicije

[0007] Pre detaljnog opisivanja predmetnog kvasca i postupaka, sledeći termini su definisani radi lakšeg razumevanja. Termine koji nisu definisani treba tumačiti u skladu sa uobičajenim značenjem koje se koristi u relevantnoj struci.

[0008] Kao što se ovde koristi, termin „alkohol“ označava organsko jedinjenje u kome je hidroksilna funkcionalna grupa (-OH) vezana za zasićeni atom ugljenika.

[0009] Kao što se ovde koriste, termini „ćelije kvasca“, „sojevi kvasca“ ili prosto „kvasac“ označavaju organizme razdela Ascomycota i Basidiomycota. Primer za kvasac je kvasac koji se razmnožava pupljenjem iz reda Saccharomycetales. Konkretni primeri za kvasac su Saccharomyces spp., uključujući, bez ograničenja, S. cerevisiae. Kvasci uključuju organizme koji se koriste za proizvodnju alkohola za gorivo, kao i organizme koji se koriste za proizvodnju alkohola za piće, uključujući posebne i vlasničke sojeve kvasca koji se koriste za proizvodnju piva, vina i drugih fermentisanih pića specifičnog ukusa.

[0010] Kao što se ovde koristi, fraza „konstruisane ćelije kvasca“, „varijante ćelija kvasca“, „modifikovane ćelije kvasca“, ili slične fraze, označavaju kvasac koji ima genetske modifikacije i osobine koje su ovde opisane. Varijanta kvasca/modifikovani kvasac ne uključuje kvasce koji se javljaju u prirodi.

[0011] Kao što se ovde koriste, termini „polipeptid“ i „protein“ (i njihovi odgovarajući oblici za množinu) koriste se kao sinonimi da označe polimere bilo koje dužine koji sadrže aminokiselinske ostatke povezane peptidnim vezama. Ovde se koriste uobičajene jednoslovne ili troslovne šifre za aminokiselinske ostatke i sve sekvence su date u smeru od N-terminusa do C-terminusa. Polimer može da sadrži modifikovane aminokiseline, i može biti prekinut neaminokiselinama. Termini takođe obuhvataju aminokiselinski polimer koji je modifikovan prirodnim putem ili intervencijom, na primer, formiranjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilovanjem, fosforilacijom ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugacija sa komponentom za označavanje. Ovom definicijom su takođe obuhvaćeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiselina (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline, itd.), kao i druge modifikacije koje su poznate u struci.

[0012] Kao što se ovde koristi, funkcionalno ili strukturno slični proteini se smatraju „srodnim proteinima“ ili „homolozima“. Takvi proteini mogu biti dobijeni od organizama iz različitih rodova i/ili vrsta, ili različitih klasa organizama (npr. bakterije i gljive), ili su konstruisani veštačkim putem. Srodni proteini takođe obuhvataju homologe na osnovu analize primarne sekvence, na osnovu analize sekundarne ili tercijarne strukture, ili na osnovu imunološke unakrsne reaktivnosti, ili na osnovu njihove funkcije.

[0013] Kao što se ovde koristi, termin „homologni protein“ označava protein koji ima sličnu aktivnost i/ili strukturu kao referentni protein. Nije predviđeno da homolozi nužno budu evolutivno srodni. Tako, predviđeno je da termin obuhvata iste, slične ili odgovarajuće enzime (tj. u pogledu strukture i funkcije) koji su dobijeni od različitih organizama. U nekim otelotvorenjima, poželjno je da se identifikuje homolog koji ima kvaternernu, tercijarnu i/ili primarnu strukturu sličnu referentnom proteinu. U nekim otelotvorenjima, homologni proteini indukuju sličan imunološki odgovor kao referentni protein. U nekim otelotvorenjima, homologni proteini su konstruisani da proizvode enzime sa željenom aktivnošću.

[0014] Stepen homologije između sekvenci može da se utvrdi koristeći bilo koji odgovarajući postupak koji je poznat u struci (vidite, npr. Smith i Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman i Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson i Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; programe, kao što su GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA iz softverskog paketa Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI);

i Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res.12:387-95).

[0015] Na primer, PILEUP predstavlja program koji je koristan za određivanja nivoa homologije sekvenci. PILEUP kreira poravnavanje više sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivno poravnavanje po parovima. Takođe može da iscrta dijagram koji pokazuje odnos grupisanja koji se koristi za stvaranje poravnavanja. PILEUP koristi pojednostavljeni oblik postupka progresivnog poravnavanja čiji su autori Feng i Doolittle, (Feng i Doolittle (1987) J. Mol. Evol.35:351-60). Postupak je sličan postupku koji su opisali Higgins i Sharp ((1989) CABIOS 5:151-53). Korisni parametri za program PILEUP uključuju podrazumevani ponder praznine 3,00, podrazumevani ponder dužine praznine 0,10 i ponderisane krajnje praznine. Još jedan primer korisnog algoritma ja algoritam BLAST, koji su opisali Altschul et al. ((1990) J. Mol. Biol.215:403-10) i Karlin et al. ((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87). Jedan posebno koristan program algoritma BLAST je program WU-BLAST-2 (vidite, npr. Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol.266:460-80). Parametri „W“, „T“ i „X“ određuju osetljivost i brzinu poravnavanja. Program blast kao podrazumevane postavke koristi dužinu reči (W) 11, BLOSUM62 matricu ocenjivanja (vidite, npr. Henikoff i Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) poravnavanja (B) 50, očekivano (E) 10, M'5, N'-4, i poređenje oba lanca.

[0016] Kao što se ovde koriste, fraze „suštinski slično“ i „suštinski identično“, u kontekstu najmanje dve nukleinske kiseline ili polipeptida, obično znače da polinukleotid ili polipeptid ima sekvencu koja ima najmanje oko 70% identičnosti, najmanje oko 75% identičnosti, najmanje oko 80% identičnosti, najmanje oko 85% identičnosti, najmanje oko 90% identičnosti, najmanje oko 91% identičnosti, najmanje oko 92% identičnosti, najmanje oko 93% identičnosti, najmanje oko 94% identičnosti, najmanje oko 95% identičnosti, najmanje oko 96% identičnosti, najmanje oko 97% identičnosti, najmanje oko 98% identičnosti, ili čak najmanje oko 99% identičnosti, ili više, u poređenju sa referentnom sekvencom (tj. divljim tipom). Procenat identičnosti sekvence se izračunava koristeći algoritam CLUSTAL W sa podrazumevanim parametrima. Vidite Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res.22:4673-4680. Podrazumevani parametri za algoritam CLUSTAL W su:

[0017] Još jedan pokazatelj da su dva polipeptida suštinski identična je to što je prvi polipeptid imunološki unakrsno reaktivan sa drugim polipeptidom. Polipeptidi koji se razlikuju po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama su obično imunološki unakrsno reaktivni. Tako, polipeptid je suštinski identičan drugom polipeptidu, na primer, kada se dva peptida razlikuju samo po konzervativnoj supstituciji. Još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinskih kiselina suštinski identične je to što se dva molekula hibridizuju jedan u drugi pod strogim uslovima (npr. u rasponu od srednje do velike strogoće).

[0018] Kao što se ovde koristi, termin „gen“ je sinonim terminu „alel“ i označava nukleinsku kiselinu koja kodira i usmerava ekspresiju proteina ili RNK. Vegetativni oblici filamentoznih gljiva su generalno haploidni, te je jedna kopija naznačenog gena (tj. jedan alel) dovoljna za davanje specifičnog fenotipa. Termin „alel“ je generalno poželjan kada organizam sadrži više od jednog sličnih gena, u kom slučaju se svaki zaseban sličan gen označava kao zasebni „alel“.

[0019] Kao što se ovde koristi, termin „konstitutivna“ ekspresija se odnosi na proizvodnju polipeptida koji kodira određeni gen pod suštinski svim tipičnim uslovima za rast, nasuprot „uslovne“ ekspresije, koja zahteva prisustvo određenog supstrata, temperature, i slično, da bi se indukovala ili aktivirala ekspresija.

[0020] Kao što se ovde koristi, termin „ekspresija polipeptida“ i slični termini označavaju ćelijski proces proizvodnje polipeptida koristeći translacionu aparaturu (npr. ribozome) ćelije.

[0021] Kao što se ovde koristi, termin „prekomerna ekspresija polipeptida“, „povećanje ekspresije polipeptida“ i slični termini označavaju ekspresiju polipeptida na nivou koji je viši od uobičajenog u poređenju sa nivoom uočenim kod matičnih ćelija ili ćelija divljeg tipa koje nemaju navedenu genetsku modifikaciju.

[0022] Kao što se ovde koristi, termin „ekspresiona kaseta“ označava fragment DNK koji sadrži promoter, i region za kodiranje aminokiseline i terminator (tj. promoter: :region za kodiranje aminokiselina: :terminator) i druge sekvence nukleinskih kiselina koje su neophodne da se proizvodnja kodiranog polipeptida omogući u ćeliji. Ekspresione kasete mogu biti egzogene (tj. uvedene u ćeliju) ili endogene (tj. već postoje u ćeliji).

[0023] Kao što se ovde koriste, termini „fuzionisano“ i „fuzija“, kada se odnose na dva fragmenta DNK, kao što je promoter i region za kodiranje polipeptida, označavaju fizičko vezivanje koje dovodi do toga da dva fragmenta DNK postanu jedan molekul.

[0024] Kao što se ovde koriste, termini „divlji tip“ i „nativni“ se koriste kao sinonimi i označavaju gene, proteini ili sojeve koji se nalaze u prirodi, ili koji nisu namenski modifikovani u svrhe predmetno opisanog kvasca.

[0025] Kao što se ovde koristi, termin „protein od interesa“ označava polipeptid čija ekspresija je željena u modifikovanom kvascu. Takav protein može biti enzim, protein koji vezuje supstrat, površinski aktivan protein, strukturni protein, selektabilni marker, transduktor signala, receptor, transporter, faktor transkripcije, faktor translacije, kofaktor, i slično, i on može biti eksprimiran. Protein od interesa je kodiran od strane endogenog gena ili heterolognog gena (tj. „gena od interesa“) u odnosu na matični soj. Protein od interesa može da se eksprimira intracelularno ili kao izlučeni protein.

[0026] Kao što se ovde koristi, termin „disrupcija gena“ u širem smislu se odnosi na bilo koju genetsku ili hemijsku manipulaciju, tj. mutaciju, koja suštinski sprečava ćeliju da proizvodi funkcionalni genski proizvod, npr. protein, u ćeliji domaćinu. Primeri za postupke disrupcije uključuju potpunu ili delimičnu deleciju bilo kog dela gena, uključujući sekvencu koja kodira polipeptid, promoter, pojačivač, ili drugi regulatorni element, ili mutagenezu prethodnog, pri čemu mutageneza obuhvata supstitucije, insercije, delecije, inverzije i njihove kombinacije i varijacije, pri čemu bilo koja od tih mutacija suštinski sprečava proizvodnju funkcionalnog genskog proizvoda. Gen takođe može biti ometan koristeći CRISPR, RNKi, antisens ili bilo koji drugi postupak koji eliminiše ekspresiju gena. Gen može da se ometa putem delecije ili genetske manipulacije nesusednih kontrolnih elemenata. Kao što se ovde koristi, „delecija gena“ označava njegovo uklanjanje iz genoma ćelije domaćina. Kada gen sadrži kontrolne elemente (npr. elemente pojačivača) koji se ne nalaze odmah pored kodirajuće sekvence gena, delecija gena označava deleciju kodirajuće sekvence i, opciono, susednih elemenata pojačivača, uključujući, bez ograničenja, na primer, sekvence promotera i/ili terminatora, ali ne zahteva deleciju nesusednih kontrolnih elemenata. Delecija gena takođe označava deleciju dela kodirajuće sekvence, ili dela promotera koji je neposredno susedan ili nije neposredno susedan kodirajućoj sekvenci, kada funkcionalna aktivnost gena od interesa ne postoji u konstruisanim ćelijama.

[0027] Kao što se ovde koriste, termini „genetska manipulacija“ i „genetska izmena“ koriste se kao sinonimi i označavaju izmenu/promenu sekvence nukleinskih kiselina. Izmena može da uključuje, bez ograničenja, supstituciju, deleciju, inserciju ili hemijsku modifikaciju najmanje jedne nukleinske kiseline u sekvenci nukleinskih kiselina.

[0028] Kao što se ovde koristi, termin „funkcionalni polipeptid/protein“ je protein koji ima određenu aktivnost, kao što je enzimska aktivnost, vezujuća aktivnost, površinski aktivno svojstvo, transduktor signala, receptor, transporter, faktor transkripcije, faktor translacije, kofaktor i slično, i koji nije mutagenizovan, skraćen ili na drugi način izmenjen tako da se ta aktivnost eliminiše ili smanji. Funkcionalni polipeptidi mogu biti termostabilni ili termolabilni, kao što je naznačeno.

[0029] Kao što se ovde koristi, termin „funkcionalni gen“ je gen koji ćelijske komponente mogu da koriste za proizvodnju aktivnog genskog proizvoda, obično proteina. Funkcionalni geni su suprotnost poremećenih gena, koji su modifikovani tako da ćelijske komponente ne mogu da ih koriste za proizvodnju aktivnog genskog proizvoda, ili imaju smanjenu sposobnost da ih ćelijske komponente koriste za proizvodnju aktivnog genskog proizvoda.

[0030] Kao što se ovde koristi, ćelije kvasca su „modifikovane da se spreči proizvodnja navedenog proteina“ ako su genetski ili hemijski izmenjene da se spreči proizvodnja funkcionalnog proteina/polipeptida koji pokazuje aktivnost karakterističnu za protein divljeg tipa. Takve modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, deleciju ili ometanje gena koji kodira protein (kao što je ovde opisano), modifikaciju gena tako da kodirani polipeptid nema prethodno pomenutu aktivnost, modifikaciju gena da utiče na posttranslacionu obradu ili stabilnost, i kombinacije prethodnog.

[0031] Kao što se ovde koristi, termin „prigušivanje puta“ ili „prigušivanje protoka kroz put“, tj. biohemijski put, odnosi se uopšteno na svaku genetsku ili hemijsku manipulaciju koja smanjuje ili u potpunosti prekida tok biohemijskih supstrata ili intermedijera kroz metabolički put. Prigušivanje puta može da se postigne brojnim dobro poznatim postupcima. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na: potpunu ili delimičnu deleciju jednog ili više gena, zamenu alela divljeg tipa ovih gena mutantnim oblicima koji kodiraju enzime sa smanjenom katalitičkom aktivnošću ili povećanim vrednostima Km, modifikovanje promotera ili drugih regulatornih elemenata koji kontrolišu ekspresiju jednog ili više gena, konstruisanje enzima ili iRNK koja kodira ove enzime za smanjenu stabilnost, preusmeravanje enzima u odeljke ćelija u kojima je manje verovatno da će interagovati sa supstratom i intermedijerima, upotreba interferirajuće RNK, i slično.

[0032] Kao što se ovde koristi, termin „aerobna fermentacija“ označava rast u prisustvu kiseonika.

[0033] Kao što se ovde koristi, termin „anaerobna fermentacija“ označava rast u odsustvu kiseonika.

[0034] Kao što se ovde koristi, izraz „kraj fermentacije“ označava stadijum fermentacije u kome je ekonomska korist od nastavka fermentacije za proizvodnju male dodatne količine alkohola premašena troškovima nastavka fermentacije koji se odnose na fiksne i varijabilne troškove. Uopštenije, termin „kraj fermentacije“ označava tačku kada se fermentacijom više ne proizvodi značajna količina dodatnog alkohola, tj. najviše oko 1% dodatnog alkohola, ili nije preostalo više supstrata za dalju proizvodnju alkohola.

[0035] Kao što se ovde koristi, izraz „protok ugljenika“ označava brzinu prolaska molekula ugljenika kroz metabolički put. Protok ugljenika je regulisan enzimima koji učestvuju u metaboličkim putevima, kao što je put za metabolizam glukoze i put za metabolizam maltoze.

[0036] Kao što se ovde koriste, oblici za jedninu obuhvataju ukazivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Sledeće skraćenice/akronimi imaju sledeće značenje, osim ako nije drugačije navedeno:

EC

enzimska komisija

PKL

fosfoketolaza

PTA

fosfotransacetilaza

AADH

acetaldehid dehidrogenaze

ADH

alkohol dehidrogenaza

EtOH

etanol

AA

α-amilaza

GA

glukoamilaza

°C

stepeni Celzijusa

bp

bazni parovi

DNK

dezoksiribonukleinska kiselina

ds ili DS

suve čvrste supstance

g

gram

g/l

grama po litru

H2O

voda

HPLC

tečna hromatografija visokih performansi h

sat

kg

kilogram

M

molarni

mg

miligram

ml

mililitar

min

minut

mM

milimolarni

N

normalni

nm

nanometar

PAB1

poliadenilat vezujući protein

PCR

lančana reakcija polimeraze

ppm

delovi na milion

Δ

odnosi se na deleciju

µg

mikrogram

µl

mikrolitar

µM

mikromolarni

II. Modifikovane ćelije kvasca koje imaju povećanu ekspresiju PAB1

[0037] Opisani su modifikovani kvasac i postupci koji imaju genetsku izmenu koja dovodi do proizvodnje povećanih količina polipeptida PAB1 u odnosu na odgovarajuće (tj. osim toga identične) matične ćelije. PAB1 je glavni poli(A) vezujući protein kod kvasca. Dugačak je približno 577 aminokiselinskih ostataka, i multifunkcionalan je protein koji posreduje brojne ćelijske funkcije povezane sa 3'-poli(A)-repom informacionih RNK (vidite, npr. Brune, C. et al. (2005) RNA.11:517-531). Prekomerna ekspresija PAB1 je povećala otpornost konstruisanog kvasca na stres (Martani, F. et al., (2015), Sci. Rep.5: 18318; doi:

10.1038/srep18318). Pre ovoga nije otkrivena veza između ekspresije PAB1 i smanjenja proizvodnje acetata kod konstruisanog kvasca.

[0038] Podnosioci prijave su otkrili da ćelije kvasca koje prekomerno eksprimiraju polipeptide PAB1 proizvode smanjenu količinu acetata u poređenju sa matičnim ćelijama koje su osim toga identične. Smanjenje količine acetata je poželjno pošto acetat nepovoljno utiče na rast i fermentaciju kvasca, i dodatno dovodi do ostatka od destilacije koji ima pH vrednost nižu od poželjne, usled čega je neophodno podešavanje pH ili korišćenje veće količine sveže vode za razblaživanje ostatka od destilacije.

[0039] U nekim otelotvorenjima, povećanje količine polipeptida PAB1 koje proizvode modifikovane ćelije je povećanje od najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 70%, najmanje 100%, najmanje 150%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000% ili više, naročito u kasnijoj fazi fermentacije, u poređenju sa količinom polipeptida PAB1 koju proizvode matične ćelije koje su uzgajane u istim uslovima.

[0040] U nekim otelotvorenjima, povećanje količine polipeptida PAB1 koje proizvode modifikovane ćelije je najmanje 2-struko, najmanje 5-struko, najmanje 10-struko, najmanje 20-struko, najmanje 30-struko ili veće, u poređenju sa količinom polipeptida PAB1 koju proizvode matične ćelije koje su uzgajane pod istim uslovima.

[0041] U nekim otelotvorenjima, povećanje jačine promotera koji se koristi za kontrolisanje ekspresije polipeptida PAB1 koje proizvode modifikovane ćelije je najmanje 2-struko, najmanje 5-struko, najmanje 10-struko, najmanje 13-struko, najmanje 20-struko, najmanje 30-struko ili veće, u poređenju sa jačinom nativnog promotera koji kontroliše ekspresiju PAB1, na osnovu količine proizvedene iRNK. Podaci sekvenciranja RNK (vidite, npr. Wang, Z. et al. (2009) Nature Rev. Gen.10:57-63) pokazuju da je EFB1 promoter koji se koristi za reprezentativnu ekspresionu kasetu PAB1 približno 13 puta jači od uobičajenog promotera PAB1.

[0042] U nekim otelotvorenjima, smanjenje proizvodnje acetata od strane modifikovanih ćelija je smanjenje od najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40% ili najmanje 50%, ili veće, u poređenju sa količinom acetata koju proizvode matične ćelije koje su uzgajane u istim uslovima.

[0043] Poželjno, povećana ekspresija PAB1 se ostvaruje genetskom manipulacijom koristeći tehnike molekularne biologije specifične za sekvencu, nasuprot hemijske mutageneze, koja generalno nije usmerena na specifične sekvence nukleinskih kiselina. Međutim, hemijska mutageneza nije isključena kao postupak za proizvodnju modifikovanih ćelija kvasca.

[0044] U nekim otelotvorenjima, predmetne kompozicije i postupci obuhvataju uvođenje u ćelije kvasca nukleinske kiseline koja može da usmerava prekomernu ekspresiju, ili povećanu ekspresiju, polipeptida PAB1. Konkretni postupci uključuju, ali nisu ograničeni na (i) uvođenje egzogene ekspresione kasete za proizvodnju polipeptida u ćeliju domaćina, opciono pored endogene ekspresione kasete, (ii) supstituciju egzogene ekspresione kasete endogenom kasetom koja omogućava proizvodnju povećane količine polipeptida, (iii) modifikaciju promotera endogene ekspresione kasete kako bi se povećala ekspresija, (iv) povećanje broja kopija iste ili različitih kaseta za prekomernu ekspresiju PAB1, i/ili (v) modifikaciju bilo kog aspekta ćelije domaćina kako bi se produžio poluživot polipeptida u ćeliji domaćinu.

[0045] U nekim otelotvorenjima, matična ćelija koja je modifikovana već sadrži gen od interesa, kao što je gen koji kodira selektabilni marker, enzim za obradu ugljovodonika, ili drugi polipeptid. U nekim otelotvorenjima, gen se naknadno uvodi u modifikovane ćelije.

[0046] U nekim otelotvorenjima, matična ćelija koja je modifikovana već sadrži konstruisani put od interesa, kao što je PKL put za povećanje proizvodnje etanola, ili bilo koji drugi put za povećanje proizvodnje alkohola.

[0047] Aminokiselinska sekvenca za reprezentativni polipeptid PAB1 S. cerevisiae prikazana je ispod kao SEQ ID NO: 1:

[0048] Baza podataka NCBI obuhvata više od 100 unosa za polipeptide PAB1 S. cerevisiae. Ne bi trebalo da prirodne varijacije aminokiselinske sekvence utiču na njenu funkciju. Pored toga, na osnovu takvih podataka iz BLAST i Clustal W, jasno je da reprezentativni polipeptid PAB1 S. cerevisiae deli visok stepen identičnosti sekvence sa polipeptidima iz drugih organizama, i očekuje se da će prekomerna ekspresija funkcionalno i/ili strukturno sličnih proteina, homolognih proteina i/ili suštinski sličnih ili identičnih proteina dati slične korisne rezultate.

[0049] U konkretnim otelotvorenjima predmetnih kompozicija i postupaka, aminokiselinska sekvenca polipeptida PAB 1 koji je prekomerno eksprimiran u modifikovanim ćelijama kvasca ima najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili čak najmanje oko 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 1.

III. Modifikovane ćelije kvasca koje imaju povećanu ekspresiju PAB1 u kombinaciji sa genima egzogenog puta PKL

[0050] Povećana ekspresija PAB 1 može da se kombinuje sa ekspresijom gena u putu PKL kako bi se smanjila proizvodnja povećanih količina acetata koja je povezana sa uvođenjem egzogenog puta PKL u kvasac.

[0051] Konstruisane ćelije koje imaju heterologni put PKL prethodno su opisane

u WO2015148272 (Miasnikov et al.). Te ćelije eksprimiraju heterolognu fosfoketolazu (PKL), fosfotransacetilazu (PTA) i acetilujuću acetil dehidrogenazu (AADH), opciono zajedno sa drugim enzimima, za usmeravanje protoka ugljenika dalje od puta glicerola i ka sintezi acetil-CoA, koja se zatim konvertuje u etanol. Takve modifikovane ćelije mogu da povećaju proizvodnju etanola u procesu fermentacije u poređenju sa matičnim ćelijama koje su osim toga identične.

IV. Kombinacija povećane proizvodnje aktivnog PAB1 sa drugim mutacijama koje utiču na proizvodnju alkohola

[0052] U nekim otelotvorenjima, pored toga što eksprimiraju povećane količine aktivnih polipeptida PAB1, opciono u kombinaciji sa uvođenjem egzogenog puta PKL, modifikovane ćelije kvasca iz predmetnog pronalaska sadrže dodatne modifikacije koje utiču na proizvodnju etanola.

[0053] Modifikovane ćelije mogu dalje da sadrže mutacije koje dovode do prigušivanja prirodnog puta za biosintezu glicerola i/ili ponovnog korišćenja puta glicerola, za koje je poznato da povećavaju proizvodnju alkohola. Postupci za prigušivanje puta za biosintezu glicerola kod kvasca su poznati i uključuju smanjenje ili eliminaciju aktivnosti endogene NAD zavisne glicerol 3-fosfat dehidrogenaze (GPD) ili glicerol fosfat fosfataze (GPP), na primer putem ometanja jednog ili više gena GPD1, GPD2,

GPP1 i/ili GPP2. Vidite, npr. U.S. patente br.9,175,270 (Elke et al.), 8,795,998 (Pronk et al.) i 8,956,851 (Argyros et al.). Postupci za povećanje ponovnog korišćenja puta glicerola putem prekomerne ekspresije glicerol dehidrogenaze (GCY1) i dihidroksiaceton kinaze (DAK1) za konverziju glicerola u dihidroksiaceton fosfat (Zhang et al; J Ind Microbiol Biotechnol (2013) 40:1153-1160).

[0054] Modifikovani kvasac dalje može da ima povećanu aktivnost acetil-CoA sintaze (naziva se i acetil-CoA ligaza) (EC 6.2.1.1) kako bi uklonio (tj. uhvatio) acetat koji je proizveden putem hemijske ili enzimske hidrolize acetil fosfata (ili je prisutan u medijumu za uzgajanje kvasca iz bilo kog razloga) i konvertovao ga u Ac-CoA. Ovo delimično smanjuje neželjeno dejstvo acetata na rast ćelija kvasca i može dalje doprineti poboljšanom prinosu alkohola. Povećanje aktivnosti acetil-CoA sintaze može da se ostvari uvođenjem heterolognog gena acetil-CoA sintaze u ćelije, što povećava ekspresiju endogenog gena acetil-CoA sintaze i slično.

[0055] U nekim otelotvorenjima, modifikovane ćelije dalje mogu da sadrže heterologni gen koji kodira protein sa aktivnošću NAD<+>zavisne acetilujuće acetaldehid dehidrogenaze i/ili heterologni gen koji kodira piruvat-format lijazu. Uvođenje takvih gena u kombinaciji sa prigušivanjem puta glicerola opisano je, npr. u U.S. patentu br.8,795,998 (Pronk et al.). U nekim otelotvorenjima predmetnih kompozicija i postupaka, kvasac izrazito nema heterologne gene koji kodiraju acetilujuću acetaldehid dehidrogenazu, piruvat-format lijazu, ili obe.

[0056] U nekim otelotvorenjima, modifikovane ćelije kvasca iz predmetnog pronalaska dalje mogu prekomerno da eksprimiraju polipeptid nalik transporteru šećera (STL1) kako bi se povećalo preuzimanje glicerola (vidite, npr. Ferreira et al., 2005; Dušková et al., 2015 i WO 2015023989 A1).

[0057] U nekim otelotvorenjima, modifikovane ćelije kvasca iz predmetnog pronalaska dalje imaju biosintetički put butanola. U nekim otelotvorenjima, biosintetički put butanola je biosintetički put izobutanola. U nekim otelotvorenjima, biosintetički put izobutanola sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji katalizuje konverziju supstrata u proizvod odabranu iz grupe koja obuhvata: (a) piruvat u acetolaktat; (b) acetolaktat u 2,3-dihidroksiizovalerat; (c) 2,3-dihidroksiizovalerat u 2-ketoizovalerat; (d) 2-ketoizovalerat u izobutiraldehid; i (e) izobutiraldehid u izobutanol. U nekim otelotvorenjima, biosintetički put izobutanola obuhvata polinukleotide koji kodiraju polipeptide koji imaju aktivnost acetolaktat sintaze, keto kiselinske reduktoizomeraze, dihidroksi kiselinske dehidrataze, ketoizovalerat dekarboksilaze i alkohol dehidrogenaze.

[0058] U nekim otelotvorenjima, modifikovane ćelije kvasca koje obuhvataju biosintetički put butanola dalje imaju modifikaciju polinukleotida koji kodira polipeptid koji ima aktivnost piruvat dekarboksilaze. U nekim otelotvorenjima, ćelije kvasca obuhvataju deleciju, mutaciju i/ili supstituciju u endogenom polinukleotidu koji kodira polipeptid koji ima aktivnost piruvat dekarboksilaze. U nekim otelotvorenjima, polipeptid koji ima aktivnost piruvat dekarboksilaze izabran je iz grupe koja se sastoji od: PDC1, PDC5, PDC6, i njihovih kombinacija. U nekim otelotvorenjima, ćelije kvasca dalje obuhvataju deleciju, mutaciju i/ili supstituciju u jednom ili više endogenih polinukleotida koji kodiraju FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 i YMR226C.

V. Kombinacija povećane ekspresije PAB1 sa drugim korisnim mutacijama

[0059] U nekim otelotvorenjima, pored povećane ekspresije PAB 1 polipeptida, opciono u kombinaciji sa drugim genetskim modifikacijama koje pospešuju proizvodnju alkohola, modifikovane ćelije kvasca iz predmetnog pronalaska dalje uključuju bilo koji broj dodatnih gena od interesa koji kodiraju proteine od interesa. Dodatni geni od interesa mogu da se uvedu pre, tokom ili posle genetskih manipulacija koje dovode do povećane proizvodnje aktivnih polipeptida HAC1. Proteini od interesa uključuju selektabilne markere, enzime za obradu ugljovodonika, i druge komercijalno relevantne polipeptide, uključujući, bez ograničenja, enzim izabran iz grupe koja se sastoji od dehidrogenaze, transketolaze, fosfoketolaze, transaldolaze, epimeraze, fitaze, ksilanaze, β-glukanaze, fosfataze, proteaze, αamilaze, β-amilaze, glukoamilaze, pululanaze, izoamilaze, celulaze, trehalaze, lipaze, pektinaze, poliesteraze, kutinaze, oksidaze, transferaze, reduktaze, hemicelulaze, mananaze, esteraze, izomeraze, pektinaze, laktaze, peroksidaze i lakaze. Proteini od interesa mogu biti sekretovani, glikozilovani i na drugi način modifikovani.

VI. Korišćenje modifikovanog kvasca za povećanu proizvodnju alkohola

[0060] Kompozicije i postupci iz predmetnog pronalaska uključuju postupke za povećanje proizvodnje alkohola i/ili smanjenje proizvodnje glicerola u reakcijama fermentacije. Takvi postupci nisu ograničeni na određeni proces fermentacije. Očekuje se da će konstruisani kvasac iz predmetnog pronalaska biti „trenutna“ zamena za uobičajeni kvasac u bilo kom postrojenju za fermentaciju alkohola. Iako mu je prevashodna namena proizvodnja alkohola za gorivo, kvasac iz predmetnog pronalaska takođe može da se koristi u proizvodnji alkohola za piće, uključujući vino i pivo.

VII. Ćelije kvasca pogodne za modifikaciju

[0061] Kvasci su jednoćelijski eukariotski mikroorganizmi koji se klasifikuju kao članovi carstva gljiva i uključuju organizme iz razdela Ascomycota i Basidiomycota. Kvasac koji može da se koristi za proizvodnju alkohola uključuje, bez ograničenja, Saccharomyces spp., uključujući S. cerevisiae, kao i Kluyveromyces, Lachancea i Schizosaccharomyces spp.

Brojni sojevi kvasca su komercijalno dostupni, i mnogi od njih su izabrani ili genetski konstruisani da imaju željene karakteristike, kao što je velika proizvodnja alkohola, brz rast, i slično. Neki kvasci su genetski konstruisani da proizvode heterologne enzime, kao što je glukoamilaza ili α-amilaza.

VII. Supstrati i proizvodi

[0062] Dobro je poznata proizvodnja alkohola od brojnih ugljovodoničnih supstrata, uključujući, bez ograničenja, kukuruzni skrob, šećernu trsku, manioku i melasu, kao i bezbrojne varijacije i poboljšanja enzimskih i hemijskih uslova i mehaničkih procesa.

Verujemo da su predmetne kompozicije i postupci u potpunosti kompatibilni sa takvim supstratima i stanjima.

[0063] Proizvodi fermentacije alkohola uključuju organsko jedinjenje koje ima hidroksilnu funkcionalnu grupu (-OH) koja je vezana za atom ugljenika. Primeri za alkohole uključuju, ali nisu ograničeni na, metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, n-butanol, izobutanol, npentanol, 2-pentanol, izopentanol, i više alkohole. Alkoholi za gorivo koji se najčešće proizvode su etanol i butanol.

[0064] Ovi i drugi aspekti i otelotvorenja sojeva kvasca i postupaka iz predmetnog pronalaska biće jasni stručnjaku za ovu oblast na osnovu predmetnog opisa. Sledeći primeri treba ilustruju, ali ne ograničavaju, ove kompozicije i postupke.

PRIMERI

Primer 1

Materijali i metode

Priprema likvefakta:

[0065] Likvefakt (suspenzija kukuruzne kaše) pripremljen je dodatkom 600 ppm uree, 0,124 SAPU/g ds FERMGEN<™>2,5x (kisela fungalna proteaza), 0,33 GAU/g ds CS4

(varijanta Trichoderma glukoamilaze) i 1,46 SSCU/g ds AKAA (Aspergillus kawachii αamilaza), a pH vrednost je podešena na 4,8.

Testovi sa serumskim bočicama:

[0066] 2 ml YPD na pločama sa 24 bunarčića je inokulisano ćelijama kvasca i kulture su ostavljene da rastu preko noći do OD vrednosti od 25-30.5 ml likvefakta (5,6 g) prebačeno je u serumske bočice (Chemglass, kataloški br. CG-4904-01) i kvasac je dodat u svaku bočicu do finalne OD vrednosti od oko 0,3. Poklopci su montirani na bočice i probušeni iglom (BD, kataloški br.305111) radi ventilacije (da se oslobodi CO2), zatim su bočice inkubirane na 32 °C uz tresenje na 200 o/min tokom 55 sati.

AnKom testovi:

[0067] 300 µl koncentrovane kulture kvasca koja je odstojala preko noći dodato je u svaku od više ANKOM boca koje su napunjene sa 50 g pripremljenog likvefakta (vidite iznad) do finalne OD vrednosti od 0,3. Boce su zatim inkubirane na 32 °C uz tresenje na 150 o/min tokom 55 sati.

HPLC analiza:

[0068] Uzorci kultura iz serumskih bočica i AnKom testova su sakupljeni u Eppendorf epruvetama putem centrifugiranja tokom 12 minuta na 14.000 o/min. Supernatanti su filtrirani koristeći PTFE filtere od 0,2 µM i zatim su korišćeni za HPLC analizu (Agilent Technologies serija 1200) sa sledećim postavkama: kolona Bio-Rad Aminex HPX-87H, radna temperatura 55 °C.0,6 ml/min izokratski protok 0,01 N H2SO4, injekciona zapremina 2,5 µl. Standardi za kalibraciju su korišćeni za kvantifikaciju acetata, etanola, glicerola, glukoze i drugih molekula. Sve vrednosti su prikazane u g/l.

Primer 2

Priprema PAB1 ekspresione kasete

[0069] Kodon PAB1 gena iz Saccharomyces cerevisiae je optimizovan i sintetisan je za dobijanje veštačkog gena, „PAB1s“. EFB1 promoter (lokus YAL003W; SEQ ID NO: 3) i TPI terminator (lokus YDR050C; SEQ ID NO: 4) operativno su vezani za kodirajuću sekvencu, što je dalo ekspresionu kasetu EFB1Pro::PAB1s::Tpi1Ter. Ekspresiona kaseta je uvedena u ushodnom regionu lokusa AAP1 (YHR047C) (i) FERMAX<™>Gold (Martrex Inc., Minnesota, SAD; ovde skraćeno, „FG“), poznatog kvasca za fermentaciju koji se koristi u proizvodnji etanola od žitarica, ili (ii) FG-PKR, konstruisanog FG kvasca koji ima put heterologne fosfoketolaze (PKL) koji uključuje ekspresiju fosfoketolaze (PKL), fosfotransacetilaze (PTA) i acetilujuće acetil dehidrogenaze (AADH) kao što je opisano u WO2015148272 (Miasnikov et al.) koristeći tehnologiju CRISPR Cas9. Očekivano umetanje ekspresione kasete PAB1 u dva matična soja je potvrđeno putem PCR.

[0070] Aminokiselinska sekvenca polipeptida PAB1 prikazana je ispod kao SEQ ID NO: 1:

[0071] PAB1 kodirajući region PAB1s gena prikazan je ispod kao SEQ ID NO: 2:

[0072] Region EFB1 promotera koji se koristi za prekomernu ekspresiju PAB1s prikazan je ispod kao SEQ ID NO: 3:

[0073] Region Tpi1 terminatora koji se koristi za prekomernu ekspresiju PAB1s prikazan je ispod kao SEQ ID NO: 4:

Primer 3

Proizvodnja alkohola koristeći kvasac koji prekomerno eksprimira PAB1

[0074] Sojevi koji prekomerno eksprimiraju PAB1 testirani su u testu malih bočica koje sadrže 5,6 g likvefakta, a zatim u Ankom testu, koji sadrži 50 g likvefakta, kao što je opisano u primeru 1. Fermentacija je vršena na 32 °C tokom 55 sati. Uzorci sa kraja fermentacije su analizirani pomoću HPLC. Rezultati su rezimirani u tabelama 1 i 2.

Tabela 1. Rezultati HPLC testa sa malim bočicama

Tabela 2. Rezultati HPLC Ankom testa

[0075] Prekomerna ekspresija PAB 1 je dovela do smanjenja proizvodnje acetata od oko 12-17% kod FG kvasca, koji je priznat kao robustan kvasac koji proizvodi veliku količinu etanola u proizvodnji etanola za gorivo, pri čemu nije genetski konstruisan organizam.

Prekomerna ekspresija PAB 1 je dovela do smanjenja koje je skoro dva puta veće kod FG kvasca konstruisanog da ima egzogeni put PKL. Ovi rezultati pokazuju da je prekomerna ekspresija PAB 1 generalno korisna za smanjenje acetata, ali je posebno korisna za smanjenje povećane količine acetata koju proizvodi kvasac koji ima PKL put.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Modifikovane ćelije kvasca dobijene od matičnih ćelija kvasca, pri čemu modifikovane ćelije sadrže genetsku izmenu koja dovodi do toga da modifikovane ćelije proizvode veću količinu polipeptida PAB1 u poređenju sa matičnim ćelijama, pri čemu modifikovane ćelije prilikom fermentacije proizvode manju količinu acetata u poređenju sa količinom acetata koju proizvode matične ćelije pod identičnim uslovima fermentacije i pri čemu modifikovane ćelije dalje sadrže jedan ili više heterolognih gena puta fosfoketolaze, pri čemu genetska izmena obuhvata uvođenje u matične ćelije nukleinske kiseline koja može da usmeri ekspresiju polipeptida PAB1 do nivoa koji je viši nego kod matične ćelije koja je uzgajana pod istim uslovima.

2. Modifikovane ćelije iz zahteva 1, pri čemu genetska izmena obuhvata:

(a) uvođenje egzogene ekspresione kasete za proizvodnju polipeptida PAB1 u ćeliju domaćina;

(b) modifikaciju promotera endogene ekspresione kasete kako bi se povećala ekspresija polipeptida PAB1; ili

(c) povećanje broja kopija istih ili različitih kaseta za prekomernu ekspresiju PAB1.

3. Modifikovane ćelije iz zahteva 1, pri čemu genetska izmena obuhvata uvođenje ekspresione kasete za ekspresiju polipeptida PAB1.

4. Modifikovane ćelije iz zahteva 1, pri čemu su geni puta fosfoketolaze izabrani iz grupe koja se sastoji od fosfoketolaze, fosfotransacetilaze i acetilujuće acetil dehidrogenaze.

5. Modifikovane ćelije iz bilo kog od zahteva 1-4, pri čemu povećanje ekspresije polipeptida PAB1 iznosi najmanje oko 200% u poređenju sa nivoom ekspresije u matičnim ćelijama koje su uzgajane pod istim uslovima.

6. Modifikovane ćelije iz bilo kog od zahteva 1-4, pri čemu povećanje proizvodnje iRNK koja kodira polipeptid PAB1 iznosi najmanje oko 400% u poređenju sa nivoom u matičnim ćelijama koje su uzgajane pod istim uslovima.

7. Modifikovane ćelije iz bilo kog od zahteva 1-6, pri čemu ćelije dalje sadrže egzogeni gen koji kodira enzim za obradu ugljovodonika.

8. Modifikovane ćelije iz bilo kog od zahteva 1-7, koje dalje obuhvataju izmenu puta glicerola i/ili puta acetil-CoA.

9. Modifikovane ćelije iz bilo kog od zahteva 1-8, koje dalje obuhvataju alternativni put za proizvodnju etanola.

10. Modifikovane ćelije iz bilo kog od zahteva 1-9, pri čemu su ćelije poreklom

od Saccharomyces spp.

11. Postupak za smanjenje proizvodnje acetata iz ćelija kvasca koje su uzgajane na ugljovodoničnom supstratu, što obuhvata: uvođenje u matične ćelije kvasca genetske izmene koja povećava proizvodnju polipeptida PAB1 u poređenju sa količinom koja se proizvodi u matičnim ćelijama, pri čemu genetska izmena obuhvata uvođenje u matične ćelije nukleinske kiseline koja može da usmeri ekspresiju polipeptida PAB1 do nivoa koji je viši nego kod matične ćelije koja je uzgajana u istim uslovima.

12. Postupak iz zahteva 11, pri čemu ćelije u koje je uvedena genetska izmena predstavljaju modifikovane ćelije iz bilo kog od zahteva 1-10.

13. Postupak iz zahteva 11 ili 12, pri čemu, smanjenje proizvodnje acetata iznosi najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20% ili najmanje 25%.

14. Postupak iz bilo kog od zahteva 11-13, pri čemu, polipeptidi PAB1su prekomerno eksprimirani za najmanje 200%.

15. Postupak iz bilo kog od zahteva 11-13, pri čemu, PAB 1 polipeptidi su prekomerno eksprimirani najmanje 15-struko.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd

24