RS65414B1

RS65414B1 - Peptidni analog acilovanog oksintomodulina

Info

Publication number: RS65414B1
Application number: RS20240329A
Authority: RS
Inventors: Jae-Sung Yang; Kyung-Seok Lee; Yu-Na Chae; Gye-Rim Baek; Tae-Hyoung Kim; Ill-Hun Jung; Chae-Lim Ryu; Weon-Bin Im
Original assignee: Dong A St Co Ltd
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2024-05-31
Also published as: KR20190019030A; IL272606A; SMT202400097T1; MX2024000276A; CN111094331A; US11713344B2; US11236142B2; JP2020531442A; EP4079757A1; ES2973986T3; IL272606B1; JP2022023179A; CN116854804A; HRP20240371T1; SA522432563B1; EP3670529A4; KR20200037186A; CA3073011C; AU2018318672A1; SA520411366B1

Description

Napomena: Kompletni dokument koji uključuje tabelu referenci i listu sekvenci može se preuzeti sa EPO web sajta.

Opis

[Oblast tehnike]

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na peptidne analoge oksintomodulina i farmaceutsku kompoziciju koja ih sadrži za lečenje ili prevenciju gojaznosti, prekomerne težine, ili dijabetesa koji ne zavisi od insulina koga prate navedena stanja.

[Stanje tehnike]

[0002] Metaboličke bolesti, ili metabolički sindrom su obično izazvane abnormalnostima u metabolizmu glukoze, masti, proteina, i drugih. Termin se odnosi na različite bolesti koje su izazvane abnormalnostima u metabolizmu glukoze i masti, uključujući kancer, dijabetes, poremećaje metabolizma kostiju, masnu jetru, gojaznost, i kardiovaskularne bolesti. Prema izveštaju Nacionalnog programa za obrazovanje o holesterolu (NCEP) Sjedinjenih Država iz 2001. godine i publikacijama Međunarodne federacije za dijabetes (IDF) iz 2012. godine, dijagnoza metaboličkog sindroma zahteva prisustvo 3 ili više od sledećih 5 faktora: (1) abdominalna gojaznost koja ukazuje obim struka od 102 cm (NCEP) ili 94 cm (IDF) za muškarce i 88 cm (NCEP) ili 80 cm (IDF) za žene; (2) hipertrigliceridemija na koju ukazuje nivo triglicerida od 150 mg/dL ili više; (3) nivo HDL holesterola na ili niže od 40 mg/dL (muškarci) ili 50 mg/dL (žene); (4) hipertenzija na koju ukazuje krvni pritisak od 130/85 mmHg ili viši; (5) nivo glukoze bez obroka od 110 mg/dL ili više.

[0003] Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji (SZO), svetska stopa gojaznosti se više nego udvostručila od 1980. do 2014. godine; 39% odraslih starijih od 18 godina (38% muškaraca i 40% žena) bilo je gojazno u 2014. godini. Gojaznost i prekomerna težina su izazvane energetskom neravnotežom između kalorijskog unosa i izlaza, čiji uzroci uključuju povećanu potrošnju hrane sa visokim sadržajem masti i velike gustine energije i smanjene fizičke aktivnosti usled modernog rada i načina života, promene načina prevoza i povećane urbanizacije. Stopa dijabetesa je takođe brzo porasla; 4.7% odraslih starijih od 18 godina imalo je dijabetes 1980. godine, u poređenju sa 8.5% u 2015. godini. Stopa dijabetesa raste brže u srednjoj klasi i nacijama sa niskim prihodima i jedan je od glavnih uzroka slepila, zatajenja bubrega, zastoja srca i moždanog udara.

[0004] Glukagon je hormon koji proizvode alfa ćelije pankreasa. Deluje na podizanje koncentracije glukoze stimulišući glukoneogenezu i pospešujući razgradnju glikogena uskladištenog u jetri. Kada se glikogen uskladišteni u jetri iscrpi, glukagon stimuliše jetru i bubrege da sintetišu novu glukozu. Takođe je poznato da utiče na smanjenje apetita i razlaganje skladištenih triglicerida u masne kiseline, izazivajući povećan metabolizam, čime utiče na gubitak telesne težine (Diabetes.co.uk. globalna zajednica za dijabetes, Anim Sci J.2016;87(9): 1090-1098).

[0005] Glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1), derivat glukagona, je peptidni hormon koji smanjuje glukozu u krvi. GLP-1 se luči u L-ćelijama tankog creva nakon uzimanja hrane. Ima veoma kratak poluživot ne duži od 2 minuta. Prijavljeno je da glukoza povećava lučenje GLP-1, koji indukuje lučenje insulina beta ćelijama pankreasa, na kraju kontrolišu nivo glukoze u krvi i poboljšava funkciju beta ćelija. GLP-1 takođe potiskuje lučenje glukagona, inhibira pražnjenje želuca i smanjuje unos hrane (Physiol Rev.2007;87(4): 1409-1439). Novo Nordisk-ov liraglutid je humani GLP-1 derivat koji je razvijen za lečenje dijabetesa tipa 2 i indikacija gojaznosti i potrebno je da se ubrizgava jednom dnevno. Liraglutid je agonist GLP-1 receptora dugog dejstva koji se vezuje za iste receptore kao i endogeni GLP-1, stimulišući lučenje insulina, modulišući na taj način nivo glukoze u krvi i smanjujući apetit, čime inhibiraju povećanje telesne težine i smanjujući trigliceride. Liraglutid se prodaje u SAD i Evropi kao Victoza za dijabetes tipa II i Saxenda za gojaznost (Expert Rev Cardiovasc Ther.2015;13(7):753-767). Eksenatid, liksisenatid, albiglutid i dulaglutid su takođe razvijeni za lečenje dijabetesa. Međutim, prijavljeno je da takvi agonisti receptora GLP-1 izazivaju neželjena dejstva kao što su mučnina, povraćanje, smanjenje apetita, glavobolja, zatvor, i nadimanje u stomaku (Korean J Med.2014;87(1):9-13).

[0006] Oksintomodulin je peptid izveden iz proglukagona, prekursora glukagona. Oksintomodulin se sastoji od 37 aminokiselinskih peptida, uključujući kompletnih 29 aminokiselina glukagona, i poznato je da je dvostruki agonist koji se vezuje i za GLP-1 i za glukagon receptore. Proizvodi efekat gubitka telesne težine smanjenjem unosa hrane i povećanjem energetskog metabolizma.

[0007] Dokument WO 2016/049190 A1 obelodanjuje insulinske agoniste peptida koji su konjugovani na inkretine pri čemu konjugat inkretin-insulin ima agonističku aktivnost na insulinskom receptoru i odgovarajućem inkretinskom receptoru, i stimuliše gubitak težine kod pojedinca kome je administrirano jedinjenje.

[0008] Dokument US 2015/111817 A1 obelodanjuje peptidne analoge glukagona koji posreduju u njihovom efektu tako što imaju povećanu selektivnost za GLP-1 receptor u poređenju sa ljudskim glukagonom.

[0009] Dokument WO 2010/096052 A1 obelodanjuje peptidne analoge oksintomodulina (OXM, glukagon-37), koji su modifikovani da budu otporni na cepanje i inaktivaciju dipeptidil peptidazom IV (DPP-IV) i da produžavaju poluživot in vivo analoga peptida dok omogućavaju peptidnom analogu da deluje kao agonist dvostrukog receptora GLP-1/glukagon (GCGR). Peptidni analozi su opisani kao korisni za lečenje metaboličkih poremećaja kao što su dijabetes i gojaznost.

[0010] Poznato je da je oksintomodulin efikasniji od selektivnih agonista GLP-1 receptora u smanjenju telesne težine. Prijavljeno je da rizik od hiperglikemije izazvane porastom glukoze usled aktivacije receptora glukagona može biti nadoknađen lučenjem insulina GLP-1 receptora. Prijavljeno je da oksintomodulin smanjuje unos hrane i telesnu težinu i poboljšava potrošnju energije i metabolizam glukoze u nekliničkim ispitivanjima (Diabetes. 2009;58(10):2258-2266). U kliničkoj studiji, oksintomodulin je pokazao efekte gubitka telesne težine u proseku od 2.3 kg kada se administrirao subkutano tokom 4 nedelje, 3 puta dnevno, pacijentima sa prekomernom težinom i gojaznošću (Diabetes. 2005;54:2390-2395). Pokazalo se da proizvodi značajne efekte lučenja insulina i smanjenje glukoze u krvi u odnosu na placebo (Diabetes. 2013;62(Suppl.

1):A48). U drugoj kliničkoj studiji, oksintomodulin je smanjio unos energije bez neželjenih dejstava kao što su povraćanje ili stimulacija apetita usled kontinuirane upotrebe oksintomodulina (J Clin Endocrinol Metab.2003;88:4696-4701). Efikasnost oksintomodulina u kontroli glikemije, smanjenju unosa hrane i unapređenju sitosti, izazvali su interesovanje za njegov potencijal kao novi postupak lečenja gojaznosti i kontrole glikemije (Molecular metabolism. 2014;3:241-251). Međutim, pošto oksintomodulin, poput GLP-1, može da se otcepi dipeptidil peptidazom-IV (DPP-IV), on je nestabilan in vivo i ima veoma kratak poluživot in vivo (J Biol Chem.2002;278: 22418-22423).

[0011] Zbog toga su sprovedene studije o derivatima oksintomodulina koji su otporni na DPP-IV, koji čine farmakološke i terapijske efekte oksintomodulina dugotrajnim vezivanjem za receptore GLP-1 i glukagona na uravnotežen i selektivan način i prevazilaze neželjena dejstva svakog hormonskog peptida (Diabetes. 2009;58(10):2258-2266). Mnogi farmaceutski proizvođači uključujući Merck, Zealand, MedImmune i Hanmi Pharmaceutical rade na razvoju vodećih jedinjenja.

[0012] S obzirom na predmetno stanje tehnike, ovi pronalazači su radili na rešavanju gore opisanog problema, koji je kulminirao predmetnim pronalaskom, koji se odnosi na farmaceutsku kompoziciju za lečenje gojaznosti ili dijabetesa koga prati gojaznost, razvijanjem sintetičkog peptidnog analoga oksintomodulina sa (1) DPP-IV rezistencijom, (2) optimizovanom metaboličkom stabilnošću acilovanja i (3) poboljšanim dejstvom u poređenju sa originalnim oksintomodulinom na receptore GLP-1 i glukagona.

[Detaljan opis pronalaska]

[Tehnički problem]

[0013] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi peptidni analog oksintomodulina sa većom aktivnosti protiv receptora GLP-1 i glukagona od oksintomodulina i dužim poluživotom in vivo zbog poboljšane hemijske stabilnosti (Molecular metabolism 2013;2:468-479), i farmaceutske kompozicije koje sadrže navedeni analog koje će se primeniti u lečenju i prevenciji stanja koja su izazvana ili karakterisana gojaznošću, prekomernom težinom ili dijabetesom koji ne zavisi od insulina.

[Rešenje problema]

[0014] Kao rešenje za gorenavedeni problem, predmetni pronalazak obezbeđuje novi peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu hemijske formule I u nastavku, koja je peptidni analog oksintomodulina.

[0015]

[0016] U formuli iznad,

X1je Aib (aminoizobuterna kiselina);

X2je Asp;

X3je Tyr ili Z;

X4je Ser;

X5je Lys;

X6je Tyr;

X7je Leu;

X8je Asp;

X9je Ser, Aib (aminoizobuterna kiselina) ili Z;

X10je Gln ili Z;

X11je Met ili Leu;

X12je Asn ili Arg;

X13je Thr ili Ala;

X14je Lys;

X15je odsutan;

X16je odsutan;

C-terminalna amino kiselina može opciono biti amidovana, pri čemu;

jedan od X3, X9i X10, je Z;

Z je modifikovana Lys za koju je vezan Z1-Z2sledećih formula gde Z1je formule (1)

pri čemu * formule (1) je direktna veza za bočni lanac Lys, i

pri čemu ** formule (1) je veza između Z1i Z2

i

Z2je formule (3)

pri čemu ** formule (3) je veza između Z1i Z2

[0017] U predmetnom pronalasku, sledeće troslovne i/ili jednoslovne skraćenice se koriste za označavanje specifičnih aminokiselina:

[0018] Ala(A), Lys(K), Asn(N), Asp(D), Cys(C), His(H), Ile(I), Met(M), Ser(S), Val(V), Gly(G), Leu(L), Pro(P), Thr(T), Phe(F), Arg(R), Tyr(Y), Trp(W), Glu(E), Gln(Q), Aib(aminoizobuterna kiselina).

[0019] U predmetnom pronalasku, "oksintomodulin" se odnosi na peptid koji je napravljen od preglukagona, prekursora glukagona. Oksintomodulin koji se javlja u prirodi ima sledeću sekvencu aminokiselina: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEK ID BR.1).

[0020] Iako nije namera da se obim tumačenja određene teorije ograniči, veruje se da mehanizam poboljšanog poluživota in vivo predmetnog pronalaska uključuje vezivanje njegovog lipofilnog lipidnog dela za albumin u krvotoku, sprečavajući jedinjenje predmetnog pronalaska da reaguje kao supstrat za različite liaze u krvotoku.

[0021] U predmetnom pronalasku, jedan ili više bočnih lanaca aminokiselina peptidnog analoga oksintomodulina je vezan za lipofilni lipidni deo preko polimernog dela. Takva hemijska modifikacija može da izazove farmaceutski korisne efekte kao što je povećanje raspoloživosti in vivo i/ili poluživota i/ili povećanje bioraspoloživosti peptidnog analoga oksintomodulina predmetnog ponalaska.

[0022] Novi peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu hemijske fomule I iznad, može se pripremiti uzimanjem prirodnog oksintomodulina i supstituisanjem Ser ostatka na poziciji 2 sa Aib. U ovom primeru predmetnog pronalaska, Aib se uvodi na X1poziciju peptidnog analoga oksintomodulina. Smatra se da je ovo jedinjenje otpornije na dipeptidil peptidazu IV od prirodnog oksintomodulina. Na kraju, peptidni analog oksintomodulina predmetnog pronalaska pokazuje poboljčanu stabilnost in vivo u poređenju sa prirodnim oksintomodulinom.

[0023] Takođe gorenavedeni peptidni analog acilovanog oksintomodulina predmetnog pronalaska može se pripremiti supstitucijom Met ostatka prirodnog oksintomodulina sa Leu na poziciji 27, Asn sa Arg na poziciji 28, i Thr sa Ala na poziciji 29. Na primer, jedinjenje 12 (SEK ID BR.13) primera u nastavku je pripremljeno supstitucijom X11sa Leu, X12sa Arg, i X13sa Ala.

[0024] Primeri tehničkog rešenja koji sadrže peptidne analoge hemijske formule I iznad uključuju, ali nisu ograničeni na jedinjenje 2 (SEK ID BR.3), jedinjenje 3 (SEK ID BR.4), jedinjenje 6 (SEK ID BR.7), jedinjenje 9 (SEK ID BR.10), jedinjenje 10 (SEK ID BR. 11), jedinjenje 12 (SEK ID BR. 13), jedinjenje 15 (SEK ID BR.16), jedinjenje 16 (SEK ID BR. 17), jedinjenje 17 (SEK ID BR. 18), i jedinjenje 18 (SEK ID BR.19).

[0025] Posebno, karboksi-terminus prisutan u strukturi peptidnog analoga oksintomodulina može da podleže reakcijama kao što je amidacija da bi se dobio analog.

[0026] Takođe, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži gorenavedeni peptidni analog kao aktivni sastojak i koja sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens za primenu u prevenciji i lečenju stanja koja su izazvana ili karakterisana gojaznošću ili prekomernom težinom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži gorenavedeni peptidni analog kao aktivni sastojak i koja sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens za primenu u prevenciji i lečenju dijabetesa koji ne zavisi od insulina koga prati gojaznost ili prekomerna težina.

[0027] Termin "prevencija" u predmetnom pronalasku se odnosi na bilo koje i sve radnje za inhibiranje ili odlaganje razvoja ciljanog stanja ili bolesti. Termin "lečenje" u predmetnom pronalasku se odnosi na bilo koje i sve radnje za ublažavanje, poboljšanje ili olakšavanje simptoma stanja ili bolesti koje su se razvile.

[0028] Posebno, pošto je peptidni analog iz predmetnog pronalaska dvostruki agonist i receptora za glukagon i receptora GLP-1, on pokazuje i efekte GLP-1 na unos hrane i efekte glukagona na metabolizam masti i potrošnju energije. Prema tome, farmaceutska kompozicija za lečenje gojaznosti ili prekomerne težine i dijabetesa koji ne zavisi od insulina koji je praćen navedenim stanjima, koja sadrži peptidni analog predmetnog pronalaska može izazvati medicinski korisne efekte na kontrolu telesne težine kombinacijom njegovog prekomernog uklanjanja masti i efekata inhibicije unosa hrane.

[0029] Takođe, peptidni analog iz predmetnog pronalaska i farmaceutska kompozicija koja sadrži pomenuti peptidni analog mogu se primeniti za prevenciju ili lečenje dijabetesa koji ne zavisi od insulina koga prati gojaznost snižavanjem glukoze u krvi. Iako nije predviđeno da se obim tumačenja određene teorije ograniči, farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni analog predmetnog pronalaska je veoma aktivna na GLP-1 receptore koji snižavaju glukozu u krvi, i stoga je na kraju korisna za kontrolu glikemije.

[0030] Prema tome, farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni analog predmetnog pronalaska može se administrirati sama ili u kombinaciji sa drugim srodnim farmaceutskim proizvodima za direktno ili indirektno lečenje bilo kog stanja koje je izazvano ili karakterisano prekomernom težinom, kao što je lečenje i prevencija gojaznosti, morbidne gojaznosti, preoperativne morbidne gojaznosti, inflamacije u vezi sa gojaznošću, bolesti žučne kese u vezi sa gojaznošću, apneje u snu izazvana gojaznošću i dijabetesa koga prati gojaznost. Takođe, farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni analog predmetnog pronalaska može se administrirati sama ili u kombinaciji sa drugim srodnim farmaceutskim proizvodima da bi se prevenirala stanja koja mogu biti rezltat uticaja težine ili mogu biti povezana sa takvim efektom, kao što su metabolički sindrom, hipertenzija, dislipidemija izazvana aterosklerozom, ateroskleroza, arterioskleroza, koronarna bolest srca, ili moždani udar.

[0031] "Administracija" u predmetnom pronalasku se odnosi na uvođenje supstance za lečenje pacijenta odgovarajućim postupkom. Farmaceutska kompozicija koja sadrži analog peptida predmetnog pronalaska može se administrirati na različite načine i u različitim oblicima koji omogućavaju isporuku leka u ciljano tkivo i postizanje predviđene efikasnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na intraperitonealnu administraciju, intravensku administraciju, intramuskularnu administraciju, subkutanu administraciju, intradermalnu administraciju, oralnu administraciju, topikalnu administraciju, intranazalnu administraciju, intrapulmonalnu administraciju, i intrarektalnu administraciju.

[0032] Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni analog oksintomodulina predmetnog pronalaska može da sadrži različite farmaceutski prihvatljive ekscipijense uključujući: veziva, lubrikante, dezintegrante, ekscipijense, solubilizatore, disperzna sredstva, stabilizatore, sredstva za suspendovanje, boje, arome, i slično u slučaju oralne administracije; kombinaciju pufera, konzervanse, analgetike, solubilizatore, izotonična sredstva, stabilizatore, i slično u slučaju injekcije; i baze, ekscipijense, lubrikante, konzervanse, i slično u slučaju topikalne administracije.

[0033] Primeri nosača, ekscipijenasa i razblaživača koji se mogu koristiti u formulaciji peptidnog analoga oksintomodulina predmetnog pronalaska uključuju: laktozu, dekstrozu, saharozu, sorbitol, manitol, ksilitol, eritritol, maltitol, skrob, akaciju, alginat, želatin, kalcijum fosfat, kalcijum silikat, celulozu, metil celulozu, mikrokristalnu celulozu, polivinilpirolidon, vodu, metil hidroksibenzoat, propil hidroksibenzoat, talk, magnezijum stearat ili mineralno ulje.

[0034] Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid oksintomodulina predmetnog pronalaska može se pripremiti na različite načine kombinovanjem sa nosačima koji su gore opisani. Na primer, može se pripremiti u obliku tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafli i slično za oralnu administraciju; ampule jedinične doze ili oblici sa više doza za injekcije; i rastvori, tablete, pilule, kapsule, i preparati sa produženim oslobađanjem.

[0035] Opseg doziranja prema predmetnom pronalasku varira u zavisnosti od faktora kao što su težina pacijenta, starost, pol, zdravstveno stanje, ishrana, brzina izlučivanja i težina stanja. Odgovarajuća doza za odrasle pacijente može biti između 0.001 do 500 mg/kg dnevno.

[Prednosti pronalaska]

[0036] Predmetni pronalazak obezbeđuje novi peptidni analog acilovanog oksintomodulina; peptidni analog predmetnog pronalaska je superiorniji od prirodnog oksintomodulina u aktivnosti i na GLP-1 receptore i na receptore glukagona. Posebno, predmetni pronalazak pokazuje veću biološku aktivnost kao agonist receptora glukagona nego kao agonist GLP-1 receptora.

[0037] Shodno tome, farmaceutska kompozicija koja sadrži novi peptidni analog acilovanog oksintomodulina predmetnog pronalaska može se korisno primeniti u prevenciji ili lečenju stanja koja su izazvana ili karakterisana prvenstveno gojaznošću ili prekomernom težinom. Štaviše, može se primeniti i u svrhu prevencije ili lečenja gojaznosti koja ne zavisi od insulina koja je praćena gojaznošću ili prekomernom težinom.

[Kratak opis crteža]

[0038]

Slika 1 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa jednom injekcijom analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku.

Slika 2 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom jedne nedelje;

Slika 2a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 2b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slika 3 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod pacova ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 5 dana;

Slika 3a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 3b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slika 4 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 10 dana;

Slika 4a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 4b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slika 5 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 10 dana;

Slika 5a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 5b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slike 6 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 1 nedelje;

Slika 6a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 6b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slika 7 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 2 nedelje;

Slike 7a i 7c prikazuju rezultate gubitka telesne težine;

Slika 7b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane peptidnih analoga acilovanog oksintomodulina naznačenih na 7a;

Slika 7d prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane peptidnih analoga acilovanog oksintomodulina naznačenih na 7c.

Slika 8 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 2 nedelje;

Slika 8a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 8b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slika 9 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 5 dana;

Slika 9a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 9b prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slika 10 je grafik koji prikazuje rezultate procene efikasnosti gubitka telesne težine kod miševa ponovljenom injekcijom peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 4 nedelje;

Slika 10a prikazuje rezultate gubitka telesne težine;

Slika 10b prikazuje rezultate gubitka telesne masti;

Slika 10c prikazuje rezultate kumulativnog unosa hrane.

Slika 11 je grafik koji prikazuje rezultate oralnog testa tolerancije na glukozu kod miševa sa peptidnim analogom acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku. Slika 12 je grafik koji prikazuje rezultate efikasnosti kontrole glikemije kod miševa ponovljenom injekcijom petidnim analogom acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 6 nedelja;

Slika 12a prikazuje rezultate glukoze u krvi bez gladovanja;

Slika 12b prikazuje rezultate inhibicije povećanja glikovanog hemoglobina.

Slika 13 je grafik koji prikazuje rezultate efikasnosti kontrole glikemije kod miševa ponovljenom injekcijom petidnih analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku tokom 4 nedelje;

Slika 13a prikazuje nivoe glukoze u krvi bez gladovanja tokom vremena;

Slika 13b prikazuje poboljšanje i inhibiciju povećanja glikovanog hemoglobina.

[Najbolji način za izvođenje pronalaska]

[0039] Predmetni pronalazak je dalje detaljno opisan sa pozivanjem na sledeće primere i eksperimentalne primere. Ovi primeri su dati samo u svrhu ilustracije, kako bi pomogli stručnjaku iz date oblasti tehnike da razume pronalazak, i ni na koji način ne treba ih tumačiti kao ograničavanje obima predmetnog pronalaska.

<Primer 1> Sinteza pep tidnog analoga acilovanog oksintomodulina

[0040] Peptidi koji sadrže deo amino kiselina iz predmetnog pronalaska ili kataloške peptidne sekvence mogu se sintetisati ili nabaviti od komercijalnih kompanija za sintezu peptida kao što su American Peptide Company, Bachem, i Anygen.

[0041] U predmetnom pronalasku, model auto-sintezera Symphony X (skala sinteze: 0.1mmol) kompanije Protein Technologies Inc je primenjen za sintezu peptidnih analoga acilovanog oksintomodulina. U Tabeli 1 i Tabeli 2 su prikazane strukture jedinjenja 1 (SEK ID BR. 2) i jedinjenja 38 (SEK ID BR. 39), koja su peptidni analozi acilovanog oksintomodulina sintetisana prema predmetnom pronalasku. U nastavku je dat detaljan opis postupka sinteze:

[0042] Smeša Fmoc-AA-OH (1mmol), HBTU (1mmol), NMM (n-metilmorfolina)(2mmol) i DMF(7ml) je dodata u smolu iz koje je uklonjen Fmoc i mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dekantovan i ispran dva puta sa 7 ml DMF(N,N-dimetilmetanamid). Reakcija cepanja Fmoc je izvedena dva puta po 5 minuta na sobnoj temperaturi i isprana 6 puta sa DMF (7 ml). Ovaj proces je ponovljen primenom autosintezera za kuplovanje amino kiselina.

[0043] Za sintezu na strani K(Lys) za kuplovanje se koristi Fmoc-K(Dde)-OH. Za poslednji H(His) za kuplovanje se koristi Boc-His(Trt)-OH.2% hidralazin se koristi da se ukloni zaštićeni Dde i zatim se kupluju PEG2, rE, C18, C18 dikiselina, itd. Za sintezu laktamskog prstena, amino kiseline ugrađene u Glu(Oall) i Lys(Alloc) se koriste za kuplovanje. Nakon što je zaštitna grupa uklonjena, višak HBTU i DIPEA se koristi za izvođenje vezivanja laktama. Disulfidni prsten je kuplovan primenom Ser amino kiseline koja je ugrađena u zaštitnu grupu. Nakon što je zaštitna grupa uklonjena, vrši se disulfidno vezivanje. Kuplovanje se izvodi primenom odgovarajućih amino kiselina koje su ugrađene u zaštitnu grupu na poziciji na koju treba da se uvede unakrsni linker. Nakon što je zaštitna grupa uklonjena, vezivanje između unakrsnog linkera i dve amino kiseline se izvodi primenom reagensa za kuplovanje amina.

[0044] U 0.1 mmol prethodno dobijene peptidne smole, dodato je 8 ml rastvora reagensa K (trifluorosirćetna kiselina, voda, tioanizol, 1,2-etanditiol (87.5, 5.0, 5.0, 2.5)) nakon hlađenja na 510°C. Zatim je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2-3 sata. Nakon dekantovanja, smola je isprana sa malom količinom TFA. Zatim su filtrati spojeni i dodati u 100 ml dietil etra radi kristalizacije. Dobijena čvrsta supstanca je filtrirana da bi se dobio sirovi peptid. Dobijeni sirovi peptid je prečišćen preparativnom HPLC da bi se dobilo željeno jedinjenje.

[0045] Shimadzu AXIMA Assurance MALDI-TOF se korisi za analizu molekuleske mase; αcijano-4-hidroksicimetna kiselina (CHCA) se koristi kao matriks.

[Tabela 1]

<SEKVENCE I STRUKTURE PEPTIDNIH ANALOGA ACILOVANOG

<Komparativni primer 1> Sinteza peptidnog analoga oksintomodulina

[0046] Da bi se uporedili sa predmetnim pronalaskom, sintetisani su peptidni analozi oksintomodulina koji imaju sličnu strukturu, postupkom iz primera 1. Jedinjenje 39 u nastavku je peptidni analog neacilovanog oksintomodulina. Jedinjenja 40 i 41 su peptidni analozi oksintomodulina, acilovani na različitim pozicijama. Jedinjenja 42 i 46 su peptidni analozi oksintomodulina sa acilovanjem na različitim terminalnim krajevima. Jedinjenje 47, koje je obelodanjeno u korejskoj patentnoj objavi br. 2012-139579, je peptidni analog neacilovanog oksintomodulina sa prstenastom strukturom. U Tabeli 3 i Tabeli 4 su prikazane strukture sintetisanih peptidnih analoga oksintomodulina gorenavedenih jedinjenja od 39 do 47.

[Tabela 3]

[Tabela 4]

< Eksperimentalni primer 1> Test aktivacije receptora GLP-1 i glukagona

[0047] Humani receptori GLP-1 ili glukagona su prolazno prekomerno eksprimirani u ćelijama tako da analog ovog pronalaska može aktivirati receptore, što dovodi do rasta cikličnog adenozin monofosfata (cAMP), koji sekvencijalno aktivira elemente odgovora cikličnog adenozin monofosfata (CRE). Zatim je dobijena povećana aktivnost luciferaze procenjena kao mera efekta na aktivaciju svakog receptora.

[0048] GLP-1 i glukagon su korišćeni kao pozitivna kontrola u odgovarajućoj proceni. Liraglutid i Semaglutid, koji su GLP-1 agonisti odobreni za lečenje dijabetesa, i MEDI0382, peptidni analog oksintomodulina, koji je u fazi II kliničkih ispitivanja, (Diabetes, Obesity and Metabolism 2016; 18: 1176-1190, Lancet 2018; 391: 2607-2618) kao i gorenavedena jedinjenja od 39 do 47 koja su sintetisana i korišćena kao komparativni primeri.

[0049] Humani GLP-1 ili vektor ekspresije glukagona (u daljem tekstu "OriGene") je prolazno transfektovan u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO-K1), sa plazmidom DNK koje mogu da indukuju ekspresiju luciferaze svica ili Renilla luciferaze (respektivno), primenom reagensa Lipofectamine Plus (Invitrogen). Posle 3 sata transfekcije, medijum je zamenjen u Alfa minimalni esencijalni medijum (α-MEM) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Sledećeg dana, medijum je zamenjen sa α-MEM koji sadrži analog predmetnog pronalaska i 0.1% goveđeg serum albumina (BSA). Posle 6 sati, dodat je reagens za dvostruki test luciferaze u istoj količini kao i medijum u koji su ćelije bile potopljene, i aktivnosti luciferaze svica i Renilla luciferaze su kontinuirano merene. Vrednosti aktivnosti luciferaze svica su korigovane u odnosu na aktivnost Renilla luciferaze da bi se dobila efikasnost transfekcije.

[0050] Da bi se izmerila efikasnost receptorske aktivnosti, izvršen je test više koncentracije na analogu predmetnog pronalaska da bi se dobila relativna aktivacija (%) maksimalnog efekta analoga na GLP-1 ili glukagon, i koncentracija koja pokazuje 50% aktivacija (EC50) je izračunata primenom nelinearne regresione analize. Dobijene vrednosti su prikazane u Tabeli 5.

[Tabela 5]

[0051] Eksperimentalni rezultati pokazuju da jedinjenja analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku imaju značajno niže vrednosti EC50za receptore GLP-1 i glukagona u poređenju sa endogenim hormonom oksintomodulinom, što ukazuje na superiornu aktivnost na receptorima GLP-1 i glukagona. Takođe su pokazali superiornu aktivnost na GLP-1 receptorima u poređenju sa Liraglutidom i Semaglutidom, lekovima za dijabetes koji su trenutno na tržištu. Takođe su pokazali bolju aktivnost na receptorima glukagona i sličnu aktivnost na GLP-1 receptorima u poređenju sa MEDI0382, koji je peptidni analog oksintomodulina koji je trenutno na kliničkom ispitivanju.

[0052] Jedinjenje 3, peptidni analog acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku, pokazalo je mnogo veću aktivnost na receptorima GLP-1 i glukagona nego komparativni primer Jedinjenje 39, peptidni analog neacilovanog oksintomodulina. Tako da, veruje se da acilovanje kod peptidnih analoga oksintomodulina značajno utiče na povećanje aktivnosti.

[0053] Takođe, Jedinjenje 40, komparativni primer sa acilovanjem na X2, i Jedinjenje 41, komparativni primer acilovano na X14, pokazala su mnogo manju aktivnost na receptorima GLP-1 i glukagonu u poređenju sa Jedinjenjima 3, 15, i 16 prema predmetnom pronalasku sa acilovanjem na pozicijama X3, X9, i X10, respektivno. Čini se da ovo ukazuje da položaj acilovanja peptidnih analoga oksintomodulina ima značajan uticaj na njihovu aktivnost.

[0054] Jedinjenja 3, 10, 17, i 18, acilovana prema predmetnom pronalasku, imaju 1, 2, 3, i 4 (respektivno) 2-(2-(2-aminoetoksi)etoksi)acetoil grupe kao polimerni deo Z1. Nije bilo razlike u aktivnosti in vitro na osnovu broja 2-(2-(2-aminoetoksi)etoksi)acetoil grupa. Svi su pokazali izuzetnu aktivnost na receptorima GLP-1 i glukagona.

[0055] Jedinjenja 42, 43 i 44 su acilovani komparativni primeri koji imaju karboksilnu kiselinu na kraju lipofilnog lipidnog dela kao Z2. Ona su pokazala nižu aktivnost na receptorima GLP-1 i glukagonu bez obzira na dužinu lipidnog ugljenika u poređenju sa acilovanim jedinjenjima prema predmetnom pronalasku, kao što je Jedinjenje 3 čiji je lipofilno lipidni terminalni deo ugljovodonik. Komparativni primer Jedinjenja 45 i 46 koji imaju lipofilno lipidni terminalni deo vezan za karboksilnu kiselinu i Gly i Val kao Z2pokazuju nižu aktivnost na receptorima GLP-1 i glukagona u poređenju sa Jedinjenjem 3 i drugima prema predmetnom pronalasku čiji je lipofilno lipidni terminalni deo ugljovodonik, što ukazuje da acilovana jedinjenja sa polarnim supstituentima na terminalnom lipofilno lipidnom delu kao Z2imaju nisku aktivnost in vitro.

[0056] Komparativni primer Jedinjenje 47, ciklični peptidni analog neacilovanog oksintomodulina pokazuje nisku aktivnost na receptorima glukagona u poređenju sa Jedinjenjem 14 prema predmetnom pronalasku koje ima isti tip intramolekularne strukture laktamskog prstena. Može se zaključiti da acilovanje peptidnih analoga oksintomodulina dovodi do povećanja aktivnosti.

[0057] Jedinjenje 28, koje je ciklični peptidni analog acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku, ima intramolekularnu disulfidnu vezu. Pokazalo je nižu aktivnost na receptore GLP-1 i glukagona u poređenju sa Jedinjenjem 22, još jednim cikličnim peptidnim analogom acilovanog oksintomodulina. Može se zaključiti da veličina intramolekularnog prstena cikličnog peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina utiče na njegovu aktivnost.

<Eksperimentalni primeri 2> Procena efikasnosti gubitka telesne težine jednom injekcijom peptida prema predmetnom pronalasku

[0058] Za procenu efikasnosti gubitka telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku, mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi, kod koji je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti, su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenje 3 predmetnog pronalaska je pripremljeno u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg. Ovako pripremljeno je ubrizgano subkutano jednom u miša.

Nakon toga, telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno, u isto vreme svakog dana. Rezultati su prikazani na Slici 1.

[0059] Iako nije bilo značajne razlike u kumulativnom unosu hrane u odnosu na kontrolnu grupu koja je injektirala samo vehikulum, gubitak telesne težine je primećen u grupi kojoj je ubrizgano Jedinjenje 3 u odnosu na kontrolnu grupu; efekat je trajao 4 dana. Ovo ukazuje na to da peptidni analog oksintomodulina iz predmetnog pronalaska može imati efekat gubitka telesne težine koji se održava u određenom vremenskom periodu sa jednom administracijom zahvaljujući poboljšanoj hemijskoj stabilnosti, u poređenju sa oksintomodulinom, koji zahteva najmanje 1 administriranje dnevno da bi bio efikasan zbog njegove in vivo nestabilnosti i veoma kratkog poluživota.

<Eksperimentalni primer 3> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 1 nedelje

[0060] Svrha ovog eksperimenta je da uporedi efikasnost gubitka telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku sa komercijalno dostupnim lečenjima dijabetesa/gojaznosti. Mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi kod kojih je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenje 3, primer prema predmetnom pronalasku je pripremljeno u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg ili 300 nmol/kg. Kao kontrola, Liraglutid, komercijalno dostupno terapija za dijabetes/gojaznost, je pripremljen u istom vehikulumu do doze od 100 nmol/kg. Nakon toga, oba su ubrizgavana subkutano tokom 6 dana, jednom dnevno, kao što je prikazano u Tabeli 6. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno, u isto vreme svakog dana, da bi se uporedila efikasnost gubitka telesne težine analoga acilovanog oksintomodulina sa Liraglutidom. Sedmog dana administracija je prekinuta i provereno je vraćanje telesne težine. Rezultati su prikazani na Slikama 2a i 2b.

[Tabela 6]

[0061] Nije bilo značajne razlike u kumulativnom unosu hrane između grupa sa Jedinjenjem 3 i Liraglutidom koji su ubrizgani u identičnoj dozi od 100 nmol/kg. Pored toga, Liraglutid je pokazao gubitak telesne težine od približno 12.2%, gde je Jedinjenje 3 pokazalo gubitak telesne težine od približno 24.6%. Takođe, ubrizgano Jedinjenja 3 od 300 nmol/kg pokazalo je približno 37.8% gubitka telesne težine. Peptidni analog acilovanog oksintomodulina predmetnog pronalaska pokazao je više nego dvostruko veći efekat gubitka telesne težine koji zavisi od doze u odnosu na Liraglutid i zadržao nižu telesnu težinu u odnosu na kontrolnu grupu sa vehikulum čak i nakon prekida administracije.

<Eksperimentalni primer 4> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 5 dana

[0062] Svrha ovog eksperimenta je da pronađe maksimalni efekat gubitka telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina predmetnog pronalaska. Mužjaci laboratorijskih pacova (Wistar pacov) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Pacovi kod koji je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenje 3 iz predmetnog pronalaska je pripremljeno u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg ili 300 nmol/kg, koje je ubrizgano subkutano jednom dnevno tokom ukupno 4 dana kako je prikazano u Tabeli 7. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno, u isto vreme svakog dana, da bi se izmerila efikasnost gubitka telesne težine tokom vremena u poređenju sa početnom telenom težinom. Petog dana, prekinuta je administracija i provereno je vraćanje telesne težine. Rezultati su prikazani na Slikama 3a i 3b.

[Tabela 7]

[0063] Grupa kojoj je ubrizgano Jedinjenje 3 pokazala je značajnu razliku u kumulativnom unosu hrane u odnosu na grupu sa kontrolnim vehikulumom. Obe doze su pokazale efikasnost gubitka telesne težine od približno 12.5%. Niža telesna težina u odnosu na kontrolni vehikulum je održavana čak i nakon prekida administracije.

<Eksperimntalni primer 5> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 10 dana

[0064] Svrha ovog eksperimenta je da uporedi efikasnost gubitka telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku u odnosu na komercijalno dostupna lečenja dijabetesa. Mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi kod kojih je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenje 3 iz predmetnog pronalaska je pripremljeno u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg ili 300 nmol/kg. Semaglutid, komercijano dostupno lečenje dijabetesa, je pripremljen u istom vehikulumu do doze od 100 nmol/kg. Zatim su subkutano ubrizgani jednom u 3 dana tokom 10 dana kako je navedeno u Tabeli 8. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno u isto vreme svakog dana da bi se uporedila efikasnost gubitka telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina u odnosu na Semaglutid. Rezultati su prikazani na Slikama 4a i 4b.

[Tabela 8]

[0065] Jedinjenje 3 je pokazalo veći kumulativni unos hrane u odnosu na Semaglutid pri istoj dozi (100 nmol/kg), ali je i dalje pokazivalo superiornu efikasnost gubitka telesne težine u odnosu na Semaglutid (Jedinjenje 3: 13.9%, Semaglutid: 9.7%). Takođe, Jedinjenje 3 pri 300 nmol/kg pokazalo je gubitak telesne težine od približno 16.9%. Peptidni analog acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku pokazao je superiornu efikasnost gubitka telesne težine koja zavisi od doze u odnosu na Semaglutid.

< Eksperimntalni primer 6> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 10 dana

[0066] Svrha ovog eksperimenta je da uporedi efikasnost gubitka telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku sa različitim strukturama – brojem polimera i prisustvom ciklične peptidne formacije. Mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi, kod kojih je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti, su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenja 3, 10, i 14 su pripremljena u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg, i zatim su ubrizgana subkutano jednom u 3 dana u trajanju od ukupno 10 dana kako je prikazano u Tabeli 9. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno u isto vreme svakog dana da bi se uporedila efikasnost gubitka telesne težine Jedinjenja 3 u odnosu na Jedinjenja 10 i 14. Rezultati su prikazani na Slikama 5a i 5b.

[Tabela 9]

[0067] Pri istoj dozi, Jedinjenja 10 i 14 su pokazala da je kumulativni unos hrane smanjen za 20%, odnosno 27% u odnosu na kontrolnu grupu sa vehikulumom. Kumulativni unos hrane za Jedinjenje 3 smanjen je za približno 17%. Sva tri jedinjenja pokazala su izuzetnu efikasnost gubitka telesne težine od približno 19-22% od početne telesne težine. Ciklično peptidno Jedinjenje 14 imalo je nešto bolje rezultate nego Jedinjenja 3 i 10.

<Eksperimentalni primer 7> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 1 nedelje

[0068] Svrha ovog eksperimenta je da uporedi efikasnost gubitke telesne težine peptidnih analoga acilovanog oksintomodulina različitih struktura - broj lipofilnog lipidnog dela ili polimera unutar peptida. Mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi, kod kojih je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti, su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta.

[0069] Jedinjenja 3, 13 i 18 prema predmetnom pronalasku su pripremljena u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg i kao što je navedeno u Tabeli 10 ubrizgana su subkutano jednom u 3 dana u trajanju od ukupno 7 dana. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno u isto vreme svakog dana. Efikasnost gubitka telesne težine Jedinjenja 3 je upoređena sa Jedinjenjima 13 i 18. Rezultati su prikazani na Slikama 6a i 6b.

[Tabela 10]

[0070] Pri istoj dozi, Jedinjenje 18 je pokazalo sličnu izuzetnu efikasnost gubitke telesne težine kao Jedinjenje 3, gde Jedinjenje 13 nije imalo značajan efekat na telesnu težinu. Jedinjenje 13 je pokazalo oko 10 puta manju in vitro efikasnost nego Jedinjenje 3 i bilo je dosledno u ispitivanjima na životinjama, potvrđujući efikasnost gubitka telesne težine kao rezultat terminalne strukture lipofilnog lipidnog dela, potvrđujući strukturni značaj.

<Eksperimentalni primer 8> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 2 nedelje

[0071] Svrha ovog eksperimenta je da uporedi efikasnost gubitke telesne težine peptidnih analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku sa različitim cikličnim peptidnim strukturama. Mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi, kod kojih je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti, su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenja 3, 21-25 prema predmetnom pronalasku su pripremljena u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg i kako je naznačeno u Tabeli 11 subktano su ubrizgana jednom u 3 dana u trajanju od ukupno 2 nedelje. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno u isto vreme svakog dana. Upoređena je efikasnost gubitka telesne težine Jedinjenja 3 i Jedinjenja 21-25. Rezultati su prikazani na Slikama 7a do 7d.

[Tabela 11]

[0072] Pri istoj dozi, Jedinjenja 23 i 25 su imala veći kumulativni unos hrane u poređenju sa Jedinjenjem 3. Jedinjenja 21 i 22 su pokazala sličan kumulativni unos hrane kao Jedinjenje 3. Jedinjenje 3 je pokazalo sličan ili bolji gubitak telesne težine u poređenju sa Jedinjenjima 21, 23 i 25. Jedinjenje 25 je potvrđeno da ima bolju efikasnost gubitka telesne težine nego Jedinjenje 3. S druge strane, Jedinjenje 24, koje je pokazalo donekle slabu akciju na receptor glukagona u poređenju sa drugim jedinjenjima u testu in vitro, pokazalo je značajnu efikasnost gubitka telesne težine, oko 13.4% u odnosu na početnu telesnu težinu, pokazujući lošiju efikasnost gubitka telesne težine u poređenju sa Jedinjenjem 3. Jedinjenje 25 je pokazalo sličan nivo efikasnosti gubitka telesne težine kao Jedinjenje 3, ali je imalo manji kumulativni unos hrane. S druge strane, Jedinjenje 22 je pokazalo sličnu efikasnost gubitka telesne težine kao Jedinjenje 3 i sličan kumulativni unos hrane. Peptidni analozi acilovanog oksintomodulina su pokazali različite obrasce efikasnosti gubitka telesne težine u zavisnosti od njihovih struktura.

<Eksperimentalni primer 9> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 2 nedelje

[0073] Nastavljujući od Eksperimentalnog primera 8, ovaj eksperiment je sproveden da se uporede peptidni analozi acilovanog oksintomodulina iz predmetnog pronalaska u malim dozama. Mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi, kod kojih je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti, su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenja 3 i 22 prema predmetnom pronalasku su pripremljena u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 30 nmol/kg ili 100 nmol/kg i kao što je navedeno u Tabeli 12 subkutano su ubrizgana jednom u 3 dana u trajanju od ukupno 2 nedelje. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno u isto vreme svakog dana. Upoređena je efikasnost gubitka telesne težine Jedinjenja 3 i Jedinjenja 22. Rezultati su prikazani na Slikama 8a i 8b.

[Tabela12]

[0074] Pri istoj dozi, Jedinjenje 22 je pokazalo veći kumulativni unos hrane u poređenju sa Jedinjenjem 3. Jedinjenje 22 pri 10 nmol/kg je pokazalo sličan nivo kumulativnog unosa hrane kao grupa sa kontrolnim vehikulumom, ali sa efikasnošću gubitka telesne težine od 7.5%. Štaviše, Jedinjenje 22 pri 30 nmol/kg je imalo veći unos hrane nego Jedinjenje 3 u istoj dozi, ali je imalo slične nivoe efikasnosti gubitka telesne težine. Može sa zaključiti da Jedinjenje 22 više utiče na efikasnost koja je rezultat aktivacije receptora glukagona u poređenju sa Jedinjenjem 3.

<Eksperimentalni primer 10> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 5 dana

[0075] Ovaj eksperiment je sproveden da bi se uporedila efikasnost gubitke telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina iz predmetnog pronalaska sa komercijalno dostupnim lečenjima dijabetesa/gojaznosti i vodećim jedinjenjem koji je peptidni analog oksintomodulina koje je trenutno u razvoj. Mužjaci laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) su dobijali hranu sa visokim sadržajem masti. Miševi, kod kojih je izazvana gojaznost hranom sa visokim sadržajem masti, su raspoređeni u grupe prema telesnoj težini pre početka eksperimenta. Jedinjenje 3 predmetnog pronalaska je pripremljeno u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 30 nmol/kg. Kao komparativni primeri, Liraglutid (komercijalno dostupno lečenje dijabetesa/gojaznosti) i MEDI0382 (u kliničkom ispitivanju) su pripremljeni u istom vehikulumu do doze od 30 nmol/kg. Zatim su subkutano ubrizgana jednom dnevno tokom ukupno 4 dana, kao što je prikazano u Tabeli 13. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno u isto vreme svakog dana. Efikasnost gubitka telesne težine analoga je upoređena sa Liraglutidom i MEDI0382. Rezultati su prikazani na Slikama 9a i 9b.

[Tabela 13]

[0076] Među tri supstance u istoj dozi, grupa sa Jedinjenjem 3 je pokazala najveći gubitak telesne težine u odnosu na početno stanje (Jedinjenje 3: 18.6%, Liraglutid: 12.7%, MEDI0382: 8.0%).

<Eksperimentalni primer 11> Procena efikasnosti gubitka telesne težine ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 4 nedelje

[0077] Ovaj eksperiment je sproveden da bi se uporedila efikasnost gubitke telesne težine peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku sa komercijalno dostupnim lečenjem dijabetesa. Mužjaci gojaznih i dijabetičnih laboratorijskih miševa (FATZO miš) su dobijali ishranu sa visokim sadržajem masti i grupisani su prema telesnoj težini, telesnoj masnoći, glukozi u krvi bez gladovanja, i glikovanom hemoglobinu (HbA1c) pre eksperimenta. Jedinjenja 3 i 22 prema predmetnom pronalasku su pripremljena u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 30 nmol/kg ili 100 nmol/kg. Semaglutide, komercijalno dostupno lečenje dijabetesa, pripremljen je u istom vehikulumu do doze od 100 nmol/kg. Zatim su davana subkutano jednom u 3 dana tokom ukupno 4 nedelje, kao što je prikazano u Tabeli 14. Telesna težina i unos hrane mereni su jednom dnevno, u isto vreme svakog dana. Telesna masnoća je merena 4 nedelje pre autopsije da bi se uporedilo smanjenje efikasnosti telesne težine i telesne masnoće peptidnih analoga oksintomodulina iz predmetnog pronalaska u odnosu na Semaglutid. Rezultati su prikazani na Slikama 10a do 10c.

[Tabela 14]

[0078] Pri istoj i nižoj dozi (100 i 30 nmol/kg respektivno), Jedinjenja 3 i 22 predmetnog pronalaska pokazuju visoko superiornu efikasnost smanjenja telesne težine u odnosu na Semaglutid uprkos većem kumulativnom unosu hrane. Pretpostavlja se da je to rezultat mehanizma delovanja peptidnog analoga oksintomodulina prema predmetnom pronalasku koji je dvostruki agonist receptora GLP-1 i glukagona, dok je semaglutid agonist GLP-1 receptora.

<Eksperimentalni primer 12> Oralni test tolerancije na glukozu kod miševa sa peptidom prema predmetnom pronalasku

[0079] U ovom eksperimentu, efekat poboljšanja tolerancije na glukozu kod mužjaka laboratorijskih miševa (C57BL/6 miš) peptidnih analoga acilovanih oksintomodulina prema predmetnom pronalasku je procenjen kao poboljšanje postprandijalne kontrole glikemije. Laboratorijski miševi nisu imali obrok dan pre eksperimenta. Zatim je Jedinjenje 3 ili 22 ili 25 prema predmetnom pronalasku pripremljeno u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 i subkutano je ubrizgano 30 minuta pre dodavanja glukoze. Rastvor glukoze je oralno administriran 30 minuta nakon injekcije peptidnog analoga oksintomodulina. Glukoza u punoj krvi je merena preko repne vene neposredno pre administriranja leka i glukoze, i 2 sata nakon dodavanja glukoze u određeno vreme. Iz rezultata, izrađena je površina ispod krive (AUC) krive glukoze u krvi tokom vremena da bi se izračunao odnos glukoze u krvi AUC analoga i poređenje sa kontrolom glukoze u procentima da bi se procenila efikasnost poboljšanja tolerancije na glukozu. Eksperimenti su izvedeni posebno za svako jedinjenje. Jedinjenje 3 pri 30 nmol/kg se koristilo kao komparativno za Jedinjenje 22 ili 25. Kombinovani rezultati su prikazani na Slici 11.

[0080] Peptidni analozi su pokazali značajano smanjenje AUC glukoze u krvi u zavisnosti od doze na i iznad 30 nmol/kg. Posebno, Jedinjenje 25 je pokazalo značajno poboljšanje efikasnosti tolerancije na glukozu i tri puta bolju efikasnost poboljšanja tolerancije na glukozu u poređenju sa Jedinjenjenjima 3 i 22 u svim procenjivanim grupama.

<Eksperimentalni primer 13> Procena efikasnosti kontrole glikemije ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 6 nedelja

[0081] Predmetni pronalazak je sproveden da bi se uporedila efikasnost kontrole glikemije peptidnih analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku sa komercijalno dostupnim lečenjem dijabetesa. Muški modeli laboratorijskih miševa za dijabetes (db/db miš) su grupisani prema nivou glukoze bez gladovanja, glikovanom hemoglobinu (HbA1c), i telesnoj težini pre eksperimenta. Jedinjenje 3 prema predmetnom pronalasku je pripremljeno u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 100 nmol/kg. Komercijalno dostupan Semaglutid je pripremljen u istom vehikulumu do doze od 100 nmol/kg. Nakon toga, ubrizgavani su subkutano jednom u 3 dana tokom ukupno 6 nedelja kako je navedeno u Tabeli 15. Glukoza bez gladovanja, telesna težina, i unos hrane su mereni jednom nedeljno, 24 sata nakon administracije leka. Glikovani hemoglobin je meren u 3, 5 i 6 nedelja. Efikasnost kontrole glikemije petidnog analoga oksintomodulina prema predmetnom pronalasku je upoređena sa onom za Semaglutid. Rezultati su prikazani na Slikama 12a i 12b.

[Tabela 15]

[0082] U početku, Jedinjenje 3 predmetnog pronalaska je pokazalo sličnu ili manju efikasnost u poređenju sa Semaglutidom u istoj dozi (100 nmol/kg). Međutim, nakon dugotrajne administracije, Jedinjenje 3 je pokazalo bolju efikasnost kontrole glikemije nego Semaglutid. Grupa sa kontrolnim vehikulumom je imala konačnu glukozu u krvi bez gladovanja od 581 mg/dL, pokazujući veoma teško dijabetsko stanje. S druge strane, Semaglutid je pokazao konačnu glukozu bez gladovanja od 342 mg/dL; Jedinjenje 3 je imalo konačnu glukozu u krvi bez gladovanja od 274 mg/dL, pokazujući značajnu inhibiciju povećanja glukoze. Grupa sa kontrolnim vehikulumom je imala konačni glikovani hemoglobin (HbA1c) od 5.15% poena više od početnog nivoa. Poređenja radi, HbA1c za Semaglutid je povećan za 2.65% poena, i HbA1c Jedinjenja 3 samo 1.73% poena, potvrđujući efikasnost u inhibiciji povećanja glikovanog hemoglobina. Prema tome, peptidni analog acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku je pokazao superiorniju efikasnost u odnosu na Semaglutid u odlaganju početka dijabetesa.

<Eksperimentalni primer 14> Procena efikasnosti kontrole glikemije ponovljenom injekcijom peptida predmetnog pronalaska tokom 4 nedelje

[0083] Ovo je isti eksperiment kao Eksperimentalni primer 11. Sproveden je da se uporedi efikasnost kontrole glikemije peptidnog analoga acilovanog oksintomodulina prema predmetnom pronalasku u poređenju sa komercijalno dostupnim lečenjem dijabetesa. Mužjaci gojaznih i dijabetičnih laboratorijskih miševa (FATZO miš) su dobijali ishranu sa visokim sadržajem masti i grupisani su prema telesnoj težini, telesnoj masnoći, glukozi u krvi bez gladovanja, i glikovanom hemoglobinu (HbA1c) pre eksperimenta. Jedinjenja 3 i 22 prema predmetnom pronalasku su pripremeljena u destilovanoj vodi koja sadrži 0.01% Tween80 do doze od 30 nmol/kg ili 100 nmol/kg. Komercijalno dostupan Semaglutid je pripremljen u istom vehikulumu do doze od 100 nmol/kg. Kao što je navedeno u Tabeli 16, oba su ubrizgana subkutano jednom u 3 dana u trajanju od ukupno 4 nedelje. Telesna težina i unos hrane su mereni jednom dnevno u isto vreme svakog dana. Glukoza bez gladovanja je merena približno svakih 10 dana, 24 nakon administracije. Glikovani hemoglobin je meren pre autopsije na 4 nedelje. Efikasnost kontrole glikemije peptidnog analoga oksintomodulina predmetnog pronalaska je upoređena sa Semaglutidom. Rezultati su prikazani na Slikama 13a i 13b.

Tabela 16

[0084] Grupe kojima su administrirana Jedinjenja 3 i 22 iz predmetnog pronalaska su pokazale izvanrednu efikasnost kontrole glikemije i inhibiciju povećanja glikovanog hemoglobina na sličnim nivoima kao i Semaglutid. Pored efekta gubitka telesne težine prikazanog u Eksperimentalnom primeru 11, peptidni analog oksintomodulina predmetnog pronalaska je takođe pokazao da ima efekat kontrole glikemije.

Claims

Patentni zahtevi 1. Peptidni analog oksintomodulina sledeće formule I:

pri čemu: X1je Aib (aminoizobuterna kiselina); X2je Asp; X3je Tyr ili Z; X4je Ser; X5je Lys; X6je Tyr; X7je Leu; X8je Asp; X9je Ser, Aib (aminoizobuterna kiselina) ili Z; X10je Gin ili Z; X11je Met ili Leu; X12je Asn ili Arg; X13je Thr ili Ala; X14je Lys; X15je odsutan; X16je odsutan; C-terminalna amino kiselina može opciono biti amidovana, pri čemu jedan od X3, X9i X10je Z; Z je modifikovana Lys za koji je vezan Z1-Z2sledećih formula gde Z1je formule (1); i

Z2je formule (3);

pri čemu * formule (1) je direktno vezan za bočni lanac Lys, i pri čemu ** formule (1) i ** formuler (3) je veza između Z1i Z2.
2. Peptidni analog oksintomodulina prema patentnom zahtevu 1, pri čemu X11je Leu, X12je Arg, i X13je Ala.
3. Peptidni analog oksintomodulina prema patentnom zahtevu 1, pri čemu navedeni peptidni analog je Jedinjenje 2 (SEK ID BR. 3), Jedinjenje 3 (SEK ID BR. 4), Jedinjenje 6 (SEK ID BR. 7), Jedinjenje 9 (SEK ID BR. 10), Jedinjenje 10 (SEK ID BR. 11), Jedinjenje 12 (SEK ID BR. 13), Jedinjenje 15 (SEK ID BR. 16), Jedinjenje 16 (SEK ID BR. 17), Jedinjenje 17 (SEK ID BR.18), ili Jedinjenje 18 (SEK ID BR.19).
4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni analog prema jednom od patentnih zahteva 1-3 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens za primenu u prevenciji ili lečenju stanja izazvanih ili karakterisanih gojaznošću ili prekomernom težinom.
5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptidni analog prema jednom od patentnih zahteva 1-3 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens za primenu u prevenciji ili lečenju dijabetesa koji ne zavisi od insulina koga prati gojaznost ili prekomerna težina.