RS65448B1 - Restimulacija krioprezerviranih tumor-infiltrirajućih limfocita - Google Patents

Restimulacija krioprezerviranih tumor-infiltrirajućih limfocita

Info

Publication number
RS65448B1
RS65448B1 RS20240474A RSP20240474A RS65448B1 RS 65448 B1 RS65448 B1 RS 65448B1 RS 20240474 A RS20240474 A RS 20240474A RS P20240474 A RSP20240474 A RS P20240474A RS 65448 B1 RS65448 B1 RS 65448B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
tils
til
population
days
Prior art date
Application number
RS20240474A
Other languages
English (en)
Inventor
Ian Frank
Michael T Lotze
Original Assignee
Iovance Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iovance Biotherapeutics Inc filed Critical Iovance Biotherapeutics Inc
Publication of RS65448B1 publication Critical patent/RS65448B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/16—Physical preservation processes
    • A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4271—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/04—Immunosuppressors, e.g. cyclosporin, tacrolimus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1157—Monocytes, macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Description

Opis
POZADINA PRONALASKA
[0001] Lečenje masivnih, refraktornih kancera upotrebom adoptivnog transfera tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) predstavlja moćan pristup terapiji za pacijente sa lošom prognozom. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Za uspešnu imunoterapiju potreban je veliki broj TIL, i za komercijalizaciju je potreban snažan i pouzdan proces. Ovo je bilo izazovno za postizanje zbog tehničkih, logističkih, i regulatornih problema sa umnožavanjem ćelija. IL-2-zasnovano umnožavanje TIL nakon čega sledi "proces brzog umnožavanja" (rapid expansion process - REP) postao je poželjan postupak za umnožavanje TIL zbog svoje brzine i efikasnosti. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. REP može rezultovati 1.000-strukim umnožavanjem TIL tokom perioda od 14 dana, iako zahteva veliki višak (npr. 200-struko) ozračenih alogenih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC), često od višestrukih davalaca, kao hraniteljskih (feeder) ćelija, kao i anti-CD3 antitela (OKT3) i visoke doze IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42.
[0002] TIL koji su podvrgnuti REP proceduri proizveli su uspešnu adoptivnu ćelijsku terapiju nakon imunosupresije domaćina kod pacijenata sa melanomom. Trenutni parametri prihvatanja infuzije oslanjaju se na očitavanje kompozicije TIL (npr. CD28, CD8, ili CD4 pozitivnost) i na višestrukost umnožavanja i vijabilnost REP proizvoda.
[0003] Međutim, trenutni REP protokoli, kao i trenutni protokoli umnožavanja TIL generalno, daju malo uvida u zdravlje TIL koji će biti infuzijom uvedeni u pacijenta. T ćelije podležu dubokoj metaboličkoj promeni tokom svoje maturacije od naivnih do efektorskih T ćelija (videti Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364, ovim izričito inkorporisano u celini, i posebno za diskusiju i markere anaerobnog i aerobnog metabolizma). Na primer, naivne T ćelije se oslanjaju na mitohondrijalnu respiraciju kako bi proizvele ATP, dok su zrele, zdrave efektorske T ćelije kao što su TIL visoko glikolitičke, oslanjajući se na aerobnu glikolizu kako bi obezbedile bioenergetske supstrate koji su im potrebni za proliferaciju, migraciju, aktivaciju, i antitumorsku efikasnost.
[0004] Pored toga, ove umnožene populacije ćelija mogu se krioprezervirati, što dovodi do lakoće upotrebe, dugotrajnog skladištenja za višestruke reinfuzije u pacijente sa rekurentnom bolešću, i drugih razmatranja. Međutim, trenutni parametri prihvatanja infuzije oslanjaju se na očitavanje kompozicije TIL i na višestrukost umnožavanja i vijabilnost umnoženog proizvoda koji je zasnovan na TIL. Ove mere daju malo uvida u zdravlje TIL koji će biti infuzijom uvedeni u pacijenta, i malo se zna o efektima krioprezervacije na populacije TIL.
[0005] U skladu sa tim, predmetni pronalazak je usmeren na postupke za umnožavanje i restimulaciju populacija TIL koji dovode do poboljšanog fenotipa i povećanog metaboličkog zdravlja TIL i usmeren je prema postupcima testiranja za populacije TIL kako bi se odredila pogodnost za efikasniju infuziju posle restimulacije.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za umnožavanje TIL u veće, ponekad terapijske, populacije u kombinaciji sa opcionom krioprezervacijom.
[0007] U skladu sa predmetnom objavom, obezbeđen je postupak za umnožavanje tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji sadrži sledeće korake:
(i) dobijanje prve populacije TIL iz tumora koji je prethodno reseciran iz pacijenta;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; i
(iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL.
[0008] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži:
(iv) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije TIL sa dopunskim IL-2, dopunskim OKT-3, i dopunskim APC, pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila veća terapijska populacija TIL nego što je dobijena u koraku (iii), pri čemu veća terapijska populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL.
[0009] U nekim primerima izvođenja, posle koraka (iii), ćelije se uklanjaju iz ćelijske kulture i krioprezerviraju u medijumu za skladištenje pre izvođenja koraka (iv).
[0010] U nekim primerima izvođenja, ćelije se odmrzavaju pre izvođenja koraka (iv).
[0011] U nekim primerima izvođenja, korak (iv) se ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
[0012] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar oko 44 dana.
[0013] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz koraka (iii) ili (iv) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama.
[0014] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U nekim primerima izvođenja, PBMC se dodaju u ćelijsku kulturu na bilo koji od dana 9 do 17 u koraku (iii).
[0015] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL u koraku (iv) pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0016] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0017] U nekim primerima izvođenja, APC su veštačke APC (aAPC).
[0018] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0019] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitelo fuzionisano sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0020] U nekim primerima izvođenja, terapijska populacija TIL se infuzijom uvodi u pacijenta.
[0021] U nekim primerima izvođenja, korak (iii) dodatno sadrži korak uklanjanja ćelija iz medijuma za ćelijsku kulturu.
[0022] U nekim primerima izvođenja, korak (iii) se ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
[0023] U nekim primerima izvođenja, broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu je od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
[0024] Predmetna objava takođe obezbeđuje populaciju umnoženih TIL koja je napravljena u skladu sa postupkom iz patentnog zahteva 1.
[0025] Predmetna objava takođe obezbeđuje populaciju umnoženih TIL koja je napravljena u skladu sa postupkom iz patentnog zahteva 1, pri čemu umnoženi TIL imaju najmanje dvostruko povećanje bazalne glikolize u poređenju sa odmrznutim krioprezerviranim TIL.
[0026] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupke za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koja je napravljena u skladu sa postupcima koji su ovde opisani, koji sadrže merenje bazalne glikolize ćelija.
[0027] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupke za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koja je napravljena u skladu sa postupcima koji su ovde opisani, koji sadrže merenje bazalne respiracije ćelija.
[0028] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupke za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koja je napravljena u skladu sa postupcima koji su ovde opisani, koji sadrže merenje rezervnog respiratornog kapaciteta (SRC) ćelija.
[0029] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupke za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koja je napravljena u skladu sa postupcima koji su ovde opisani, koji sadrže merenje glikolitičke rezerve ćelija.
[0030] Predmetna objava takođe obezbeđuje postupak za umnožavanje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL koji sadrži:
(i) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL iz tumora koji je reseciran iz pacijenta u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se dobila druga populacija TIL; i
(ii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC) kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL.
[0031] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži:
(iii) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja treće populacije TIL suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije TIL sa dopunskim IL-2, dopunskim OKT-3, i dopunskim APC, pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila veća terapijska populacija TIL nego što je dobijena u koraku (ii), pri čemu veća terapijska populacija TIL pokazuje povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL.
[0032] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz medijuma za ćelijsku kulturu u koraku (ii) uklanjaju se i krioprezerviraju u medijumu za skladištenje pre koraka (iii).
[0033] U nekim primerima izvođenja, ćelije se odmrzavaju pre koraka (iii).
[0034] U nekim primerima izvođenja, korak (ii) se ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
[0035] U nekim primerima izvođenja, broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu je od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
[0036] U nekim primerima izvođenja, APC su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0037] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0038] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0039] Ovde je objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak za lečenje subjekta sa kancerom koji sadrži primenu umnoženih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji sadrži: (i) dobijanje prve populacije TIL iz tumora koji je reseciran iz pacijenta;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL;
(iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50-struko ili 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL; i
(iv) primenu terapijski efikasne doze treće populacije TIL pacijentu.
[0040] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak dodatno sadrži pre koraka (iv) korak izvođenja dopunskog drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije TIL sa dopunskim IL-2, dopunskim OKT-3, i dopunskim APC, pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila veća terapijska populacija TIL nego što je dobijena u koraku (iii), pri čemu veća terapijska populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL.
[0041] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, posle koraka (ii) ćelije se uklanjaju iz medijuma za ćelijsku kulturu i krioprezerviraju u medijumu za skladištenje pre dopunskog drugog umnožavanja u skladu sa postupcima koji su ovde opisani.
[0042] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, ćelije se odmrzavaju pre dopunskog drugog umnožavanja u skladu sa postupcima koji su ovde opisani.
[0043] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, korak (iii) se ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
[0044] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu je od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
[0045] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, APC su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0046] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0047] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0048] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kancera grlića materice, kancera glave i vrata, glioblastoma, kancera jajnika, sarkoma, kancera pankreasa, kancera mokraćne bešike, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, i nesitnoćelijskog karcinoma pluća.
[0049] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak za lečenje subjekta sa kancerom koji sadrži primenu umnoženih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji sadrži:
(i) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL iz tumora koji je reseciran iz pacijenta u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se dobila druga populacija TIL;
(ii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC) kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50-struko ili 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL; i
(iii) primenu terapijski efikasne doze terapijske populacije TIL pacijentu.
[0050] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak dodatno sadrži pre koraka (iii) korak izvođenja dopunskog drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije TIL sa dopunskim IL-2, dopunskim OKT-3, i dopunskim APC, pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila veća terapijska populacija TIL nego što je dobijena u koraku (ii), pri čemu veća terapijska populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL.
[0051] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, ćelije iz medijuma za ćelijsku kulturu u koraku (ii) uklanjaju se i krioprezerviraju u medijumu za skladištenje pre dopunskog drugog umnožavanja kao što je ovde opisano.
[0052] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, ćelije se odmrzavaju pre dopunskog drugog umnožavanja kao što je ovde opisano.
[0053] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, korak (ii) se ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
[0054] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu je od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
[0055] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, APC su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0056] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0057] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0058] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kancera grlića materice, kancera glave i vrata, glioblastoma, kancera jajnika, sarkoma, kancera pankreasa, kancera mokraćne bešike, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, i nesitnoćelijskog karcinoma pluća.
[0059] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje test postupke za određivanje vijabilnosti TIL. Predmetna objava obezbeđuje postupke za testiranje TIL za vijabilnost umnožavanjem tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u veću populaciju TIL koji sadrže:
(i) dobijanje prve populacije TIL koja je prethodno umnožena;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; i
(iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50-struko ili 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu treća populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno testira za vijabilnost.
[0060] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži:
(iv) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije TIL sa dopunskim IL-2, dopunskim OKT-3, i dopunskim APC, pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila veća populacija TIL nego što je dobijena u koraku (iii), pri čemu veća populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno testira za vijabilnost.
[0061] U nekim primerima izvođenja, pre koraka (i), ćelije se krioprezerviraju.
[0062] U nekim primerima izvođenja, ćelije se odmrzavaju pre izvođenja koraka (i).
[0063] U nekim primerima izvođenja, korak (iv) se ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL za analizu.
[0064] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana.
[0065] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana.
[0066] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana.
[0067] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar oko 44 dana.
[0068] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz koraka (iii) ili (iv) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama.
[0069] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0070] U nekim primerima izvođenja, PBMC se dodaju u ćelijsku kulturu na bilo koji od dana 9 do 17 u koraku (iii).
[0071] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koraku (iv) pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0072] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0073] U nekim primerima izvođenja, APC su veštačke APC (aAPC).
[0074] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0075] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0076] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitelo fuzionisano sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0077] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0078] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost.
[0079] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost posle krioprezervacije.
[0080] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost posle krioprezervacije i posle koraka (iv).
[0081] U skladu sa predmetnom objavom, postupak za testiranje TIL za vijabilnost i/ili dodatnu upotrebu u primeni subjektu. U nekim primerima izvođenja, postupak za testiranje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) sadrži:
(i) dobijanje prve populacije TIL;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; i
(iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50-struko veća po broju od druge populacije TIL;
(iv) sakupljanje, ispiranje, i krioprezerviranje treće populacije TIL;
(v) skladištenje krioprezerviranih TIL na kriogenoj temperaturi;
(vi) odmrzavanje treće populacije TIL kako bi se obezbedila odmrznuta treća populacija TIL; i
(vii) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja dela odmrznute treće populacije TIL suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije sa IL-2, OKT-3, i APC tokom perioda reREP od najmanje 3 dana, pri čemu se treće umnožavanje izvodi kako bi se dobila četvrta populacija TIL, pri čemu se broj TIL u četvrtoj populaciji TIL upoređuje sa brojem TIL u trećoj populaciji TIL kako bi se dobio odnos;
(viii) određivanje na osnovu odnosa u koraku (vii) da li je odmrznuta populacija TIL pogodna za primenu pacijentu.
[0082] U nekim primerima izvođenja, period reREP izvodi se sve dok odnos broja TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji TIL ne bude veći od 50:1.
[0083] U nekim primerima izvođenja, broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu je od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
[0084] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar oko 44 dana.
[0085] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz koraka (iii) ili (vii) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama. U nekim primerima izvođenja ćelije su TIL.
[0086] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U nekim primerima izvođenja, PBMC se dodaju u ćelijsku kulturu na bilo koji od dana 9 do 17 u koraku (iii).
[0087] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koracima (iii) ili (vii) pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0088] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0089] U nekim primerima izvođenja, APC su veštačke APC (aAPC).
[0090] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0091] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0092] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitelo fuzionisano sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0093] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0094] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost posle koraka (vii).
[0095] Predmetna objava takođe obezbeđuje dodatne postupke za testiranje TIL. U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje postupak za testiranje TIL koji sadrži:
(i) dobijanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(ii) odmrzavanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(iii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem dela prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije (APC) tokom perioda reREP od najmanje 3 dana, kako bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se deo iz prve populacije TIL upoređuje sa drugom populacijom TIL kako bi se dobio odnos broja TIL, pri čemu je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći od 5:1;
(iv) određivanje na osnovu odnosa u koraku (iii) da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni pacijentu;
(v) određivanje da je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni kada se odredi da je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u prvoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (iv).
[0096] U nekim primerima izvođenja, odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći je od 50:1.
[0097] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži izvođenje umnožavanja celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) u skladu sa postupcima kao što je opisano u bilo kom od primera izvođenja koji su ovde obezbeđeni.
[0098] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak dodatno sadrži primenu celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) pacijentu.
[0099] Predmetna objava takođe obezbeđuje dodatne postupke za testiranje TIL. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak za testiranje TIL koji sadrži:
(i) dobijanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(ii) odmrzavanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(iii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem dela prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije (APC) tokom perioda reREP od najmanje 3 dana, kako bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se deo iz prve populacije TIL upoređuje sa drugom populacijom TIL kako bi se dobio odnos broja TIL, pri čemu je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći od 5:1;
(iv) određivanje na osnovu odnosa u koraku (iii) da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni pacijentu; i
(v) terapijsku primenu ostatka prve populacije TIL pacijentu kada se odredi da je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u prvoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (iv).
[0100] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći je od 50:1.
[0101] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži izvođenje umnožavanja celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) u skladu sa postupcima prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
[0102] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak dodatno sadrži primenu celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) pacijentu.
[0103] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak procene metaboličkog zdravlja druge populacije TIL.
[0104] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak procene fenotipa druge populacije TIL.
[0105] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su alogene mononuklearne ćelije periferne krvi.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0106]
Slika 1: Pokazuje rezultate iz Primera 1. Kao što Tabela pokazuje, praćenjem protokola brzog umnožavanja nakon restimulacije antigena ("reREP"), TIL pokazuju znatno poboljšanje svoje glikolitičke respiracije. SRC = rezervni respiratorni kapacitet.
Slika 2: Kompozicija svežih naspram odmrznutih TIL. TIL su obojeni za TCRαβ i CD56 kako bi se definisale populacije T-ćelija i NK ćelija. Pokazani podaci su proseci 6 pojedinačnih TIL.
Slika 3: Memorijski fenotip je definisan ekspresijom CD45RA i CCR7. CD4 i CD8 TIL su uglavnom efektorska memorija (EM). Ovo ostaje isto kod odmrznutih TIL. Svaka tačka je jedan analizirani uzorak. Nije pronađena značajna razlika u Vilkoksonovom (Wilcoxon) testu ekvivalentnih parova, rangova sa znakom.
Slika 4: Pirsonova (Pearsonꞌs) korelacija učestalosti CD4, CD8, CD4+CD28+, i CD8+CD28+ između svežih i odmrznutih TIL. Ćelije su obojene sa prethodno navedenim markerima. Svaka tačka predstavlja jednog pojedinca sa vrednošću svežih na x osi i vrednošću odmrznutih na y osi. Linija fitovanja nacrtana je upotrebom analize linearne regresije.
Slika 5: Uporedivi markeri aktivacije na svežim i odmrznutim TIL. Nije pronađena značajna razlika u statusu aktivacije svežih naspram odmrznutih TIL upotrebom Vilkoksonovog testa rangiranja ekvivalentnih parova. Svaka tačka predstavlja jedan analizirani uzorak i pokazana je kao srednja vrednost /- SEM.
Slika 6: Održavanje LAG-3 bojenja nakon krioprezervacije i odmrzavanja. A: LAG-3 bojenje CD8 TIL. B: % učestalost regulatornih molekula CD4 i CD8 populacija na svežim i odmrznutim TIL. CD8+TIM-3+ i CD8+LAG-3+ odmrznuti TIL imaju niži % od svežih TIL. Man-Vitni (Mann-Whitney) statistički test.
Slika 7: Izuzetno stabilni tumor-infiltrirajući limfociti (TIL) za infuzioni fenotip nakon krioprezervacije.
Slika 8: Dijagram raspršenja koji pokazuje fenotipsku karakterizaciju reREP TIL. Q1 pokazuje 19,0% CD45RA<+>/CCR7-; Q2 pokazuje 0,066% CD45RA<+>/CCR7<+>; Q4 pokazuje 80,6% CD45RA-/CCR7-; i Q3 pokazuje 0,36% CD45RA-/CCR7<+>.
Slika 9: Dijagram i podaci koji pokazuju fenotipsku karakterizaciju reREP TIL, tokom prve i druge faze umnožavanja 0,08% CD45RA<+>/CCR7-; 0,03% CD45RA<+>/CCR7<+>; 73,97% CD45RA-/CCR7-; i 25,91% CD45RA-/CCR7<+>na Dan 14, posle prvog umnožavanja, ali pre drugog umnožavanja. Proliferacija CM ili EM TIL u ponavljanju reREP. Centralni memorijski (CM) TIL i efektorski memorijski (EM) TIL testirani su na kapacitet proliferacije upotrebom ponavljanja reREP. Ukratko, 1,3 × 10<6>TIL nakon REP je kokultivisano sa 1,3 × 10<7>PBMC hraniteljskih (CFSE obeležene), OKT3 (30 ng/nl) i rhIL-2 (3000 IU/ml), kultura je inkubirana tokom 14 dana. Na Dan 14, centralni memorijski TIL i efektorski memorijski TIL su gejtovani za LID Aqua-/CFSE-/TCRα/β /CD45RA-/CCR7+ i LID Aqua/CFSE-/TCRo/P /CD45RA-/CCR7- populaciju respektivno i sortirani protočnom citometrijom. Čistoća populacije ćelija bila je 97%. 1 × 10<4>protočno sortirani CM ili EM ili nesortiranih TIL zatim su kultivisani sa 1 × 10<6>PBMC hraniteljskih, OKT3 (30 ng/nl) i IL-2 (3000 IU/ml) u triplikatu tokom 7 dana. Ćelije su prebrojane i zabeležene. Centralni memorijski TIL su bili proliferativniji u poređenju sa efektorskim memorijskim TIL. Ponavljamo ovaj eksperiment sa više linija TIL nakon REP.
Slika 10A i 10B: Fenotipska karakterizacija TIL tokom reREP. Ćelije su gejtovane na Aqua-/TCRα/β+/CD4+ ili CD8+ kako bi se pokazao memorijski fenotip centralnih memorijskih TIL (CD45RA-CCR7<+>) ili efektorskih memorijskih TIL (CD45RA-CCR7-). Studentov "t" je upotrebljen za izračunavanje statističke značajnosti. *p < 0,05, ns nije značajno.
Slika 11: Primer šeme procesa pripreme TIL, koji se ovde ponekad označava kao proces 1C.
Slika 12: Uspešno umnožavanje TIL iz nemelanomskih tumora. Podaci pokazuju distribuciju TIL (CD4+/CD8+) kod nemelanomskih tumora.
Slika 13: Nemelanomski TIL eksprimiraju CD27 i CD38, što odgovara mladim TIL.
Slika 14: Aktivirani TIL naginju ka populaciji efektorskih memorijih.
Slika 15: Fenotipovi svežih nasuprot reREP TIL.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. Uvod
[0107] Adoptivna ćelijska terapija koja koristi TIL koje su kultivisane ex vivo pomoću protokola brzog umnožavanja (REP) proizvela je uspešnu adoptivnu ćelijsku terapiju nakon imunosupresije domaćina kod pacijenata sa melanomom. Trenutni parametri prihvatanja infuzije oslanjaju se na očitavanje kompozicije TIL (npr. CD28, CD8, ili CD4 pozitivnost) i na numeričko -struko umnožavanje i vijabilnosti proizvoda REP.
[0108] Trenutni REP protokoli daju malo uvida u zdravlje TIL koji će biti infuzijom uvedeni u pacijenta. T ćelije podležu dubokoj metaboličkoj promeni tokom svoje maturacije od naivnih do efektorskih T ćelija (videti Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364, ovim izričito inkorporisano u celini, i posebno za diskusiju i markere anaerobnog i aerobnog metabolizma). Na primer, naivne T ćelije se oslanjaju na mitohondrijalnu respiraciju kako bi proizvele ATP, dok su zrele, zdrave efektorske T ćelije kao što su TIL visoko glikolitičke, oslanjajući se na aerobnu glikolizu kako bi obezbedile bioenergetske supstrate koji su im potrebni za proliferaciju, migraciju, aktivaciju, i antitumorsku efikasnost.
[0109] Prethodni radovi saopštavaju da je ograničavanje glikolize i promovisanje mitohondrijalnog metabolizma u TIL pre transfera poželjno pošto će ćelije koje se u velikoj meri oslanjaju na glikolizu trpeti nedostatak hranljivih materija nakon adoptivnog transfera, što rezultuje umiranjem većine prebačenih ćelija. Stoga, struka uči da promovisanje mitohondrijalnog metabolizma može promovisati in vivo dugovečnost i u stvari sugeriše upotrebu inhibitora glikolize pre indukcije imunskog odgovora. Videti Chang et al. (Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364), 574-582).
[0110] Predmetni pronalazak je u poželjnim aspektima usmeren na nove postupke povećanja REP sa dopunskim protokolom restimulacije, koji se ovde ponekad označava kao "protokol restimulacije i brzog umnožavanja" ili "reREP", što iznenađujuće dovodi do umnoženih podskupova memorijskih T ćelija, uključujući centralne memorijske (CD45RA-CCR7<+>) ili efektorske memorijske (CD45RA-CCR7-) fenotipove, i/ili do znatnog poboljšanja glikolitičke respiracije u poređenju sa sveže sakupljenim TIL ili odmrznutim krioprezerviranim TIL za restimulisane TIL (ponekad se ovde označavaju kao "reTIL"). To jest, upotrebom reREP procedure (tj. procedure koja sadrži prvo umnožavanje i drugo umnožavanje) na krioprezerviranim TIL, pacijenti mogu primiti visoko metabolički aktivne, zdrave TIL, što dovodi do povoljnijih ishoda.
[0111] Predmetni pronalazak je dodatno usmeren u nekim primerima izvođenja na postupke za procenu i kvantifikaciju ovog povećanja metaboličkog zdravlja. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke testiranja relativnog zdravlja populacije TIL upotrebom jedne ili više opštih procena metabolizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, stope i količine glikolize, oksidativnu fosforilaciju, rezervni respiratorni kapacitet (SRC) i glikolitičku rezervu.
[0112] Štaviše, predmetni pronalazak je dodatno usmeren u nekim primerima izvođenja na postupke za procenu i kvantifikaciju ovog povećanja metaboličkog zdravlja. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke testiranja relativnog zdravlja populacije TIL upotrebom jedne ili više opštih procena metabolizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, stope i količine glikolize, oksidativnu fosforilaciju, rezervni respiratorni kapacitet (SRC), i glikolitičku rezervu.
[0113] Pored toga, opcione dopunske procene uključuju, ali nisu ograničene na, proizvodnju ATP, mitohondrijalnu masu i unos glukoze.
[0114] U nekim slučajevima, reREP ćelijska populacija sa povećanim metaboličkim zdravljem se infuzijom uvodi u pacijenta kao što je opšte poznato u struci.
II. Definicije
[0115] Pod "tumor-infiltrirajućim limfocitima" ili "TIL" ovde se misli na populaciju ćelija koje su prvobitno dobijene kao bela krvna zrnca koja su napustila krvotok subjekta i migrirala u tumor. TIL uključuju, ali nisu ograničeni na, CD8+ citotoksične T ćelije (limfocite), Th1 i Th17 CD4+ T ćelije, ćelije prirodne ubice, dendritske ćelije i M1 makrofage. TIL uključuju i primarne i sekundarne TIL. "Primarni TIL" su oni koji se dobijaju iz uzoraka tkiva pacijenta kao što je ovde istaknuto (ponekad se označavaju kao "sveže sakupljeni"), i "sekundarni TIL" su bilo koje ćelijske populacije TIL koje su umnožene ili proliferisane kao što je ovde diskutovano, uključujući, ali ne ograničavajući se na masivne TIL, umnožene TIL ("REP TIL") kao i "reREP TIL" kao što je ovde diskutovano.
[0116] TIL se generalno mogu definisati bilo biohemijski, upotrebom markera ćelijske površine, ili funkcionalno, po svojoj sposobnosti da infiltriraju tumore i utiču na lečenje. TIL se generalno mogu kategorisati pomoću ekspresije jednog ili više od sledećih biomarkera: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1, i CD25. Dopunski, i alternativno, TIL mogu biti funkcionalno definisani po svojoj sposobnosti da infiltriraju čvrste tumore nakon reintrodukcije u pacijenta. TIL se mogu dodatno okarakterisati potentnošću - na primer, TIL se mogu smatrati potentnim ukoliko je, na primer, oslobađanje interferona (IFN) veće od oko 50 pg/ml, veće od oko 100 pg/ml, veće od oko 150 pg/ml, ili veće od oko 200 pg/ml. Interferon može uključivati interferon gama (IFNγ).
[0117] Pod "krioprezerviranim TIL" ovde se misli da se TIL, bilo primarni, masivni, ili umnoženi (REP TIL), tretiraju i skladište u opsegu od oko -150 °C do -60 °C. Opšti postupci za krioprezervaciju su takođe opisani ovde na drugom mestu, uključujući u Primerima. Zarad jasnoće, "krioprezervirani TIL" se razlikuju od uzoraka zamrznutog tkiva koji se mogu upotrebljavati kao izvor primarnih TIL.
[0118] Pod "odmrznutim krioprezerviranim TIL" ovde se misli na populaciju TIL koja je prethodno krioprezervirana i zatim tretirana da se vrati na sobnu temperaturu ili višu, uključujući, ali ne ograničavajući se na temperature ćelijske kulture ili temperature pri kojima TIL mogu biti primenjeni pacijentu.
[0119] Pod "populacijom ćelija" (uključujući TIL) ovde se misli na određeni broj ćelija koje dele zajedničke osobine. Generalno, populacije su uglavnom u opsegu od 1 × 10<6>do 1 × 10<10>ćelija, pri čemu različite populacije TIL sadrže različite brojeve. Na primer, inicijalni rast primarnih TIL u prisustvu IL-2 rezultuje populacijom masivnih TIL od otprilike 1 × 10<8>ćelija. REP umnožavanje generalno se vrši kako bi se obezbedile populacije od 1,5 × 10<9>do 1,5 × 10<10>ćelija za infuziju.
[0120] Generalno, TIL se inicijalno dobijaju iz uzorka tumora pacijenta ("primarni TIL") i zatim se umnožavaju do veće populacije za dodatnu manipulaciju kao što je ovde opisano, opciono krioprezerviraju, restimulišu kao što je ovde istaknuto i opciono procenjuju za fenotip i metaboličke parametre kao indikaciju zdravlja TIL.
[0121] Generalno, suspenzija sakupljenih ćelija naziva se "primarna ćelijska populacija" ili "sveže sakupljena" ćelijska populacija.
[0122] Generalno, kao što je ovde diskutovano, TIL se inicijalno pripremaju dobijanjem primarne populacije TIL iz tumora koji je reseciran iz pacijenta kao što je ovde diskutovano ("primarna ćelijska populacija" ili "prva ćelijska populacija"). Nakon ovoga sledi inicijalno masivno umnožavanje korišćenjem kultivisanja ćelija sa IL-2, formirajući drugu populaciju ćelija (koja se ovde ponekad označava kao "masivna populacija TIL" ili "druga populacija").
[0123] Termin "citotoksični limfocit" uključuje citotoksične T (CTL) ćelije (uključujući CD8<+>citotoksične T limfocite i CD4<+>T-pomoćničke limfocite), T ćelije prirodne ubice (NKT) i ćelije prirodne ubice (NK). Citotoksični limfociti mogu uključivati, na primer, α/βTCR-pozitivne poreklom iz periferne krvi ili α/βTCR-pozitivne T ćelije koje su aktivirane antigenima koji su povezani sa tumorom i/ili transdukovane sa tumor specifičnim himernim antigenskim receptorima ili T-ćelijskim receptorima, i tumor-infiltrirajuće limfocite (TIL).
[0124] Termin "centralna memorijska T ćelija" označava podskup T ćelija koje su kod ljudi CD45RO+ i koje konstitutivno eksprimiraju CCR7 (CCR7 hi) i CD62L (CD62 hi). Površinski fenotip centralnih memorijskih T ćelija takođe uključuje TCR, CD3, CD127 (IL-7R), i IL-15R. Transkripcioni faktori za centralne memorijske T ćelije uključuju BCL-6, BCL-6B, MBD2, i BMII. Centralne memorijske T ćelije prvenstveno sekretuju IL-2 i CD40L kao efektorske molekule posle pokretanja TCR. Centralne memorijske T ćelije su dominantne u CD4 kompartmentu u krvi, i kod ljudi su limfni čvorovi i krajnici proporcionalno obogaćeni njima.
[0125] Termin "efektorska memorijska T ćelija" označava podskup humanih ili sisarskih T ćelija koje su, slično centralnim memorijskim T ćelijama, CD45R0+, ali su izgubile konstitutivnu ekspresiju CCR7 (CCR7lo) i heterogene su ili nisko eksprimiraju CD62L (CD62Llo). Površinski fenotip centralnih memorijskih T ćelija takođe uključuje TCR, CD3, CD127 (IL-7R), i IL-15R. Transkripcioni faktori za centralne memorijske T ćelije uključuju BLIMP1. Efektorske memorijske T ćelije brzo sekretuju visoke nivoe inflamatornih citokina nakon stimulacije antigenom, uključujući interferon-γ, IL-4, i IL-5. Efektorske memorijske T ćelije su dominantne u CD8 kompartmentu u krvi, i kod ljudi su pluća, jetra, i creva proporcionalno obogaćeni nijma. CD8+ efektorske memorijske T ćelije nose velike količine perforina. Termin "zatvoren sistem" označava sistem koji je zatvoren za spoljašnje okruženje. Bilo koji zatvoren sistem pogodan za postupke ćelijske kulture može se koristiti sa postupcima iz predmetnog pronalaska. Zatvoreni sistemi uključuju, na primer, ali nisu ograničeni na zatvorene G-kontejnere. Kada se segment tumora doda u zatvoren sistem, sistem se ne otvara prema spoljašnjem okruženju sve dok TIL nisu spremni da se primene pacijentu.
[0126] Termini "mononuklearne ćelije periferne krvi" i "PBMC" označavaju ćeliju periferne krvi koja ima okrugli nukleus, uključujući limfocite (T ćelije, B ćelije, NK ćelije) i monocite. Poželjno, mononuklearne ćelije periferne krvi su ozračene alogene mononuklearne ćelije periferne krvi.
[0127] Termin "brzo umnožavanje" označava povećanje broja antigen-specifičnih TIL od najmanje oko 3-struko (ili 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, ili 9-struko) tokom perioda od jedne nedelje, poželjnije najmanje oko 10-struko (ili 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, ili 90-struko) tokom perioda od jedne nedelje, ili najpoželjnije najmanje oko 100-struko tokom perioda od jedne nedelje. Ovde su opisani brojni protokoli brzog umnožavanja.
[0128] U nekim primerima izvođenja, postupci iz predmetne objave dodatno uključuju "preREP" fazu u kojoj se tkivo tumora ili ćelije iz tkiva tumora uzgajaju u standardnim laboratorijskim medijumima (uključujući bez ograničavanja RPMI) i tretiraju reagensima kao što su ozračene hraniteljske ćelije i anti-CD3 antitela za postizanje željenog efekta, kao što je povećanje broja TIL i/ili obogaćivanje populacije ćelijema koje sadrže željene markere ćelijske površine ili druga strukturna, biohemijska ili funkcionalna svojstva. Pre-REP faza može da koristi reagense laboratorijskog kvaliteta (pod pretpostavkom da se reagensi laboratorijskog kvaliteta razblaže tokom kasnije REP faze), što olakšava inkorporisanje alternativnih strategija za poboljšanje proizvodnje TIL. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, objavljeni agonist TLR i/ili peptid ili peptidomimetici mogu biti uključeni u medijum kulture tokom pre-REP faze. PreREP kultura može u nekim primerima izvođenja uključivati IL-2.
[0129] Predmetni pronalazak je u poželjnim aspektima usmeren na nove postupke povećanja REP sa dopunskim protokolom restimulacije, koji se ovde ponekad označava kao "protokol restimulacije i brzog umnožavanja" ili "reREP", što iznenađujuće dovodi do umnoženih podskupova memorijskih T ćelija, uključujući podskup efektorskih memorijskih T ćelija, i/ili do znatnog poboljšanja glikolitičke respiracije u poređenju sa sveže sakupljenim TIL ili odmrznutim krioprezerviranim TIL za restimulisane TIL (ponekad se ovde označavaju kao "reTIL"). To jest, upotrebom reREP procedure na krioprezerviranim TIL, pacijenti mogu primiti visoko metabolički aktivne, zdrave TIL, što dovodi do povoljnijih ishoda. Takvi protokoli restimulacije, koji se ovde takođe označavaju kao dopunska "umnožavanja" ćelijskih populacija, ovde su detaljnije opisani.
[0130] Termini "fragmentisanje", "fragment", i "fragmentisano", kao što se ovde upotrebljavaju da opišu procese za narušavanje tumora, uključuju postupke mehaničke fragmentacije kao što su drobljenje, sečenje, deljenje, i razbijanje tkiva tumora, kao i bilo koji drugi postupak za narušavanje fizičke strukture tkiva tumora. Termin "in vivo" označava događaj koji se dešava u telu subjekta.
[0131] Termin "in vitro" označava događaj koji se dešava izvan tela subjekta. In vitro testovi obuhvataju testove zasnovane na ćelijama u kojima se koriste žive ili mrtve ćelije i mogu takođe obuhvatiti test bez ćelija u kome se ne koriste intaktne ćelije.
[0132] Termin "anti-CD3 antitelo" označava antitelo ili njegovu varijantu, npr. monoklonalno antitelo i uključuje humana, humanizovana, himerna ili murinska antitela koja su usmerena prema CD3 receptoru u antigenskom receptoru T ćelija zrelih T ćelija. Anti-CD3 antitela uključuju OKT-3, koji je takođe poznat kao muromonab, i UCHT-1. Druga anti-CD3 antitela uključuju, na primer, oteliksizumab, teplizumab, i visilizumab.
[0133] Termin "OKT-3" (koji se ovde takođe označava kao "OKT3") označava monoklonalno antitelo ili biosimilar ili njegovu varijantu, uključujući humana, humanizovana, himerna, ili murinska antitela, usmerena prema CD3 receptoru u antigenskom receptoru T ćelija zrelih T ćelija, i uključuje komercijalno dostupne oblike kao što su OKT-3 (30 ng/ml, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Dijego, CA, SAD) i muromonab ili varijante, konzervativne amino-kiselinske supstitucije, glikoforme, ili njihove biosimilare. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca muromonaba date su u Tabeli 1 (SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2). Hibridom koji je sposoban da proizvodi OKT-3 deponovan je u Američkoj kolekciji tipova kultura i dodeljen mu je ATCC pristupni broj CRL 8001. Hibridom koji je sposoban da proizvodi OKT-3 takođe je deponovan u Evropskoj kolekciji autentikovanih ćelijskih kultura (ECACC) i dodeljen mu je kataloški br.86022706.
TABELA 1. Amino-kiselinske sekvence muromonaba.
[0134] Termin "IL-2" (koji se ovde takođe označava kao "IL2") označava faktor rasta T ćelija koji je poznat kao interleukin-2, i uključuje sve oblike IL-2 uključujući humane i sisarske oblike, konzervativne amino-kiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare, i njihove varijante. IL-2 je opisan, npr. u Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 i Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. Amino-kiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-2 koji je pogodan za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:3). Na primer, termin IL-2 obuhvata humane, rekombinantne oblike IL-2 kao što je aldesleukin (PROLEUKIN, komercijalno dostupan od više dobavljača u bočicama od 22 miliona IU po jednoj upotrebi), kao i oblik rekombinantnog IL-2 koji komercijalno isporučuje CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, SAD (CELLGRO GMP) ili ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, SAD (kat. br. CYT-209-b) i druge komercijalne ekvivalenate drugih dobavljača. Aldesleukin (desalanil-1, serin-125 humani IL-2) je neglikozilovani humani rekombinantni oblik IL-2 sa molekulskom težinom od približno 15 kDa. Amino-kiselinska sekvenca aldesleukina koji je pogodan za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:4). Termin IL-2 takođe obuhvata pegilovane oblike IL-2, kao što je ovde opisano, uključujući pegilovani IL2 prolek NKTR-214, koji je dostupan od Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, SAD. NKTR-214 i pegilovani IL-2 koji su pogodni za upotrebu u pronalasku opisani su u S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2014/0328791 A1 i međunarodnoj publikaciji patentne prijave br. WO 2012/065086 A1. Alternativni oblici konjugovanog IL-2 koji su pogodni za upotrebu u pronalasku opisani su u S.A.D. patentima br. 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 i 4902,502. Formulacije IL-2 koje su pogodne za upotrebu u pronalasku opisane su u S.A.D. patentu br.6,706,289.
TABELA 2. Amino-kiselinske sekvence interleukina.
[0135] Termin "IL-4" (koji se ovde takođe označava kao "IL4") označava citokin koji je poznat kao interleukin 4, koji proizvode Th2 T ćelije i eozinofili, bazofili, i mastociti. IL-4 reguliše diferencijaciju naivnih pomoćničkih T ćelija (Th0 ćelije) u Th2 T ćelije. Steinke i Borish, Respir. Res.2001, 2, 66-70. Nakon aktivacije od strane IL-4, Th2 T ćelije posledično proizvode dopunski IL-4 u petlji pozitivne povratne sprege. IL-4 takođe stimuliše proliferaciju B ćelija i ekspresiju MHC klase II, i indukuje prebacivanje klase na IgE i IgG1 ekspresiju iz B ćelija. Rekombinantni humani IL-4 koji je pogodan za upotrebu u pronalasku komercijalno je dostupan od više dobavljača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, SAD (kat. br. CYT-211) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. Gibco CTP0043). Amino-kiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-4 koji je pogodan za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:5).
[0136] Termin "IL-7" (koji se ovde takođe označava kao "IL7") označava glikozilovani citokin koji potiče iz tkiva koji je poznat kao interleukin 7, koji se može dobiti iz stromalnih i epitelskih ćelija, kao i iz dendritskih ćelija. Fry i Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 može stimulisati razviće T ćelija. IL-7 se vezuje za IL-7 receptor, heterodimer koji se sastoji od IL-7 receptora alfa i receptora zajedničkog gama lanca, koji je u seriji signala koji su važni za razviće T ćelija unutar timusa i opstanak unutar periferije. Rekombinantni humani IL-4 koji je pogodan za upotrebu u pronalasku komercijalno je dostupan od više dobavljača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, SAD (kat. br. CYT-254) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. Gibco PHC0071). Amino-kiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-7 koji je pogodan za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:6).
[0137] Termin "IL-15" (koji se ovde takođe označava kao "IL15") označava faktor rasta T ćelija koji je poznat kao interleukin-15, i uključuje sve oblike IL-2 uključujući humane i sisarske oblike, konzervativne amino-kiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare, i njihove varijante. IL-15 je opisan, npr. u Fehniger i Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32. IL-15 deli signalne podjedinice receptora β i γ sa IL-2. Rekombinantni humani IL-15 je jedan, neglikozilovani polipeptidni lanac koji sadrži 114 amino-kiselina (i N-terminusni metionin) sa molekulskom masom od 12,8 kDa. Rekombinantni humani IL-15 je komercijalno dostupan od više dobavljača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, SAD (kat. br. CYT-230-b) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD (humani IL-15 rekombinantni protein, kat. br. 34-8159-82). Amino-kiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-15 koji je pogodan za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:7).
[0138] Termin "IL-21" (koji se ovde takođe označava kao "IL21") označava plejotropni protein citokin koji je poznat kao interleukin-21, i uključuje sve oblike IL-21 uključujući humane i sisarske oblike, konzervativne amino-kiselinske supstitucije, glikoforme, biosimilare, i njihove varijante. IL-21 je opisan, npr. u Spolski i Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95. IL-21 prvenstveno proizvode T ćelije prirodne ubice i aktivirane humane CD4+ T ćelije. Rekombinantni humani IL-21 je jedan, neglikozilovani polipeptidni lanac koji sadrži 132 amino-kiseline sa molekulskom masom od 15,4 kDa. Rekombinantni humani IL-21 je komercijalno dostupan od više dobavljača, uključujući ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, SAD (kat. br. CYT-408-b) i ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD (humani IL-21 rekombinantni protein, kat. br.14-8219-80). Aminokiselinska sekvenca rekombinantnog humanog IL-21 koji je pogodan za upotrebu u pronalasku data je u Tabeli 2 (SEQ ID NO:8).
[0139] Kada je naznačena "antitumorska efikasna količina", "tumor-inhibirajuća efikasna količina", ili "terapijska količina", preciznu količinu kompozicija iz predmetnog pronalaska koja će se primeniti može odrediti lekar uzimajući u obzir individualne razlike u starosti, težini, veličini tumora, stepenu infekcije ili metastaze, i stanju pacijenta (subjekta). Generalno se može reći da se farmaceutska kompozicija koja sadrži genetički modifikovane citotoksične limfocite koji su ovde opisani može primeniti u dozi od 10<4>do 10<11>ćelija/kg telesne težine (npr. 10<5>do 10<6>, 10<5>do 10<10>, 10<5>do 10<11>, 10<6>do 10<10>, 10<6>do 10<11>, 10<7>do 10<11>, 10<7>do 10<10>, 10<8>do 10<11>, 10<8>do 10<10>, 10<9>do 10<11>, ili 10<9>do 10<10>ćelija/kg telesne težine), uključujući sve celobrojne vrednosti unutar tih opsega. Kompozicije genetički modifikovanih citotoksičnih limfocita takođe se mogu primeniti više puta u ovim dozama. Genetički modifikovani citotoksični limfociti mogu se primeniti upotrebom tehnika infuzije koje su opšte poznate u imunoterapiji (videti, npr. Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Optimalno doziranje i režim lečenja za određenog pacijenta može lako da odredi neko sa iskustvom u oblasti medicine praćenjem pacijenta za znakove bolesti i prilagođavanjem lečenja u skladu sa tim.
[0140] Termin "hematološki malignitet" označava sisarske kancere i tumore hematopoetskog i limfoidnog tkiva, uključujući ali ne ograničavajući se na tkiva krvi, kostne srži, limfnih čvorova, i limfnog sistema. Hematološki maligniteti se takođe označavaju kao "tečni tumori". Hematološki maligniteti uključuju, ali nisu ograničeni na, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hronični limfocitni limfom (CLL), mali limfocitni limfom (SLL), akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), akutnu monocitnu leukemiju (AMoL), Hočkinov (Hodgkinꞌs) limfom, i ne-Hočkinove limfome. Termin "B ćelijski hematološki malignitet" označava hematološke malignitete koji pogađaju B ćelije.
[0141] Termin "čvrsti tumor" označava abnormalnu masu tkiva koja uobičajeno ne sadrži ciste ili tečne oblasti. Čvrsti tumori mogu biti benigni ili maligni. Termin "čvrsti tumorski kancer" označava maligne, neoplastične, ili kancerozne čvrste tumore. Čvrsti tumorski kanceri uključuju, ali nisu ograničeni na, sarkome, karcinome, i limfome, kao što su kanceri pluća, dojke, prostate, kolona, rektuma, i mokraćne bešike. Struktura tkiva čvrstih tumora uključuje međuzavisne kompartmente tkiva uključujući parenhim (kancerske ćelije) i potporne stromalne ćelije u kojima su kancerske ćelije dispergovane i koje mogu da obezbede podržavajuće mikrookruženje.
[0142] Termin "tečni tumor" označava abnormalnu masu ćelija koja je tečne prirode. Tečni tumorski kanceri uključuju, ali nisu ograničeni na, leukemije, mijelome, i limfome, kao i druge hematološke malignitete. TIL koji su dobijeni iz tečnih tumora ovde se takođe mogu označiti kao srž-infiltrirajući limfociti (MIL).
[0143] Termin "mikrookruženje", kao što se ovde upotrebljava, može označavati mikrookruženje čvrstog ili hematološkog tumora u celini ili pojedinačni podskup ćelija unutar mikrookruženja. Mikrookruženje tumora, kao što se ovde upotrebljava, označava složenu smešu "ćelija, solubilnih faktora, signalnih molekula, vanćelijskih matriksa, i mehaničkih znakova koji promovišu neoplastičnu transformaciju, podržavaju rast i invaziju tumora, štite tumor od imuniteta domaćina, podstiču rezistenciju na terapiju, i obezbeđuju niše za napredovanje dominantnih metastaza", kao što je opisano u Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Iako tumori eksprimiraju antigene koji bi trebalo da budu prepoznati od strane T ćelija, uklanjanje tumora od strane imunskog sistema je retko zbog imunosupresije od strane mikrookruženja.
[0144] Ovde je takođe objavljeno, ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak lečenja kancera sa populacijom rTIL, pri čemu je pacijent prethodno lečen nemijeloablativnom hemioterapijom pre infuzije rTIL u skladu sa pronalaskom. U nekim primerima izvođenja, populacija rTIL može biti obezbeđena sa populacijom eTIL, pri čemu je pacijent prethodno lečen nemijeloablativnom hemioterapijom pre infuzije rTIL i eTIL u skladu sa pronalaskom. Nemijeloablativna hemioterapija može biti ciklofosfamid 60 mg/kg/d tokom 2 dana (dani 27 i 26 pre rTIL infuzije) i fludarabin 25 mg/m<2>/d tokom 5 dana (dani 27 do 23 pre rTIL infuzije). Posle nemijeloablativne hemioterapije i infuzije rTIL (na Dan 0) u skladu sa objavom, pacijent može primiti intravensku infuziju IL-2 intravenski u dozi od 720.000 IU/kg svakih 8 sati do fiziološke tolerancije.
[0145] Eksperimentalni nalazi ukazuju na to da limfodeplecija pre adoptivnog transfera tumor-specifičnih T limfocita igra ključnu ulogu u poboljšanju efikasnosti lečenja eliminisanjem regulatornih T ćelija i kompetitivnih elemenata imunskog sistema ("ponori citokina" - "cytokine sinks"). U skladu sa tim, neki primeri izvođenja pronalaska koriste korak limfodeplecije (ponekad se takođe označava kao "imunosupresivno kondicioniranje") na pacijentu pre introdukcije rTIL iz pronalaska.
[0146] Termini "ko-primena", "ko-primenjivanje", "primenjeno u kombinaciji sa", "primenjivanje u kombinaciji sa", "simultano", i "istovremeno", kao što se ovde upotrebljavaju, obuhvataju primenu dva ili više aktivnih farmaceutskih sastojaka (u poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, na primer, najmanje jedan agonist kalijumovih kanala u kombinaciji sa više TIL) subjektu tako da su oba aktivna farmaceutska sastojka i/ili njihovi metaboliti prisutni u subjektu u isto vreme. Ko-primena uključuje simultanu primenu u odvojenim kompozicijama, primenu u različito vreme u odvojenim kompozicijama, ili primenu u kompoziciji u kojoj su prisutna dva ili više aktivnih farmaceutskih sastojaka. Poželjna je simultana primena u odvojenim kompozicijama i primena u kompoziciji u kojoj su oba agensa prisutna.
[0147] Termin "efikasna količina" ili "terapijski efikasna količina" označava onu količinu jedinjenja ili kombinacije jedinjenja kao što je ovde opisano koja je dovoljna da utiče na namenjenu primenu uključujući, ali ne ograničavajući se na, lečenje bolesti. Terapijski efikasna količina može da varira u zavisnosti od namenjene primene (in vitro ili in vivo), ili subjekta i bolesti koja se leči (npr. težine, starosti i pola subjekta), težine stanja bolesti, ili načina primene. Termin se takođe odnosi na dozu koja će indukovati određeni odgovor u ciljnim ćelijama (npr. smanjenje adhezije krvnih pločica i/ili migracije ćelija). Specifična doza će varirati u zavisnosti od određenog jedinjenja koje je odabrano, režima doziranja koji treba slediti, da li se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa drugim jedinjenjima, vremena primene, tkiva na koje se primenjuje, i fizičkog sistema isporuke u kom se jedinjenje nosi.
[0148] Termini "lečenje", "lečiti", "leči", i slično, označavaju dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu potpune ili delimične prevencije bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapijski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili neželjenog efekta koji se može pripisati bolesti. "Lečenje", kao što se ovde upotrebljava, pokriva bilo koje lečenje bolesti kod sisara, posebno kod ljudi, i uključuje: (a) prevenciju pojave bolesti kod subjekta koji može biti predisponiran za bolest, ali još uvek nije dijagnostikovano da je ima; (b) inhibiranje bolesti, tj. zaustavljanje njenog razvoja ili progresije; i (c) ublažavanje bolesti, tj. uzrokovanje regresije bolesti i/ili ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti. "Lečenje" je takođe namenjeno da obuhvata isporuku agensa kako bi se obezbedio farmakološki efekat, čak i u odsustvu bolesti ili stanja. Na primer, "lečenje" obuhvata isporuku kompozicije koja može izazvati imunski odgovor ili dati imunitet u odsustvu bolesnog stanja, npr. u slučaju vakcine.
[0149] Termin "heterologan" kada se upotrebljava sa pozivanjem na delove nukleinske kiseline ili proteina ukazuje na to da nukleinska kiselina ili protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se ne nalaze u istoj međusobnoj vezi u prirodi. Na primer, nukleinska kiselina se tipično proizvodi rekombinantno, imajući dve ili više sekvenci od nesrodnih gena koje su aranžirane tako da naprave novu funkcionalnu nukleinsku kiselinu, npr. promotor iz jednog izvora i kodirajući region iz drugog izvora, ili kodirajuće regione iz različitih izvora. Slično tome, heterologni protein ukazuje na do da protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se ne nalaze u istoj međusobnoj vezi u prirodi (npr. fuzioni protein).
[0150] Termini "identičnost sekvence", "procenat identičnosti", i "procenat identičnosti sekvence" (ili njihovi sinonimi, npr. "99% identično") u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, označavaju dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju specificirani procenat nukleotida ili amino-kiselinskih ostataka koji su isti, kada se uporede i poravnaju (uvodeći praznine, ukoliko je potrebno) za maksimalnu korespondenciju, ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne amino-kiselinske supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Procenat identičnosti može se izmeriti upotrebom softvera ili algoritama za poređenje sekvenci ili vizuelnom inspekcijom. U struci su poznati različiti algoritmi i softver koji se mogu upotrebljavati za dobijanje poravnanja amino-kiselinskih ili nukleotidnih sekvenci. Pogodni programi za određivanje procentualne identičnosti sekvence uključuju, na primer, BLAST paket programa koji je dostupan na veb lokaciji BLAST Nacionalnog centra za informacije o biotehnologiji Vlade SAD. Poređenja dve sekvence mogu se izvesti upotrebom bilo BLASTN ili BLASTP algoritma. BLASTN se upotrebljava za upoređivanje sekvenci nukleinskih kiselina, dok se BLASTP upotrebljava za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Kalifornija) ili MegAlign, koji su dostupni od DNASTAR, dopunski su javno dostupni softverski programi koji se mogu upotrebljavati za poravnanje sekvenci. Neko sa iskustvom u struci može odrediti odgovarajuće parametre za maksimalno poravnanje pomoću određenog softvera za poravnanje. U određenim primerima izvođenja, upotrebljavaju se podrazumevani parametri softvera za poravnanje.
[0151] Kao što se ovde upotrebljava, termin "varijanta" obuhvata ali nije ograničen na antitela ili fuzione proteine koji sadrže amino-kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence referentnog antitela po jednoj ili više supstitucija, delecija i/ili adicija na određenim pozicijama unutar ili u blizini amino-kiselinske sekvence referentnog antitela. Varijanta može da sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija u svojoj amino-kiselinskoj sekvenci u poređenju sa amino-kiselinskom sekvencom referentnog antitela. Konzervativne supstitucije mogu uključivati, npr. supstituciju slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih amino-kiselina. Varijanta zadržava sposobnost da se specifično vezuje za antigen referentnog antitela. Termin varijanta takođe uključuje pegilovana antitela ili proteine.
[0152] Termin "in vivo" označava događaj koji se dešava u telu subjekta.
[0153] Termin "in vitro" označava događaj koji se dešava izvan tela subjekta. In vitro testovi obuhvataju testove zasnovane na ćelijama u kojima se koriste žive ili mrtve ćelije i mogu takođe obuhvatiti test bez ćelija u kome se ne koriste intaktne ćelije.
[0154] Termin "brzo umnožavanje" označava povećanje broja antigen-specifičnih TIL od najmanje oko 3-struko (ili 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, ili 9-struko) tokom perioda od jedne nedelje, poželjnije najmanje oko 10-struko (ili 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, ili 90-struko) tokom perioda od jedne nedelje, ili najpoželjnije najmanje oko 100-struko tokom perioda od jedne nedelje. Nekoliko protokola brzog umnožavanja istaknuti su u nastavku.
III. Restimulacija krioprezerviranih TIL
[0155] Kao što je ovde diskutovano, predmetni pronalazak se odnosi na restimulaciju krioprezerviranih TIL kako bi se povećala njihova metabolička aktivnost i stoga relativno zdravlje pre transplantacije u pacijenta, i postupke testiranja navedenog metaboličkog zdravlja. Kao što je ovde generalno istaknuto, TIL se generalno uzimaju iz uzorka pacijenta i njima se manipuliše kako bi se uvećao njihov broj pre transplantacije u pacijenta. U nekim primerima izvođenja, TIL mogu biti opciono genetički manipulisani kao što je diskutovano u nastavku, i zatim krioprezervirani. Kada se odmrznu, oni se zatim restimulišu kako bi se povećao njihov metabolizam pre infuzije u pacijenta.
[0156] "Korak" oznake A, B, C, itd. u nastavku odnose se na Sliku 11. Redosled Koraka u nastavku i na Slici 11 dat je kao primer i predmetnom prijavom i postupcima koji su ovde objavljeni predviđena je bilo koja kombinacija ili redosled koraka, kao i dodatni koraci, ponavljanje koraka, i/ili izostavljanje koraka.
A. Korak A: Dobijanje uzorka tumora pacijenta
[0157] Generalno, TIL se inicijalno dobijaju iz uzorka tumora pacijenta ("primarni TIL") i zatim se umnožavaju do veće populacije za dodatnu manipulaciju kao što je ovde opisano, opciono krioprezerviraju, restimulišu kao što je ovde istaknuto i opciono procenjuju za fenotip i metaboličke parametre kao indikaciju zdravlja TIL.
[0158] Uzorak tumora pacijenta može se dobiti upotrebom postupaka koji su poznati u struci, generalno putem hirurške resekcije, biopsije iglom ili drugim sredstvima za dobijanje uzorka koji sadrži smešu tumorskih i TIL ćelija. Generalno, uzorak tumora može biti iz bilo kog čvrstog tumora, uključujući primarne tumore, invazivne tumore ili metastatske tumore. Uzorak tumora takođe može biti tečni tumor, kao što je tumor koji je dobijen iz hematološkog maligniteta. Čvrsti tumor može biti bilo kog tipa kancera, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kancer dojke, pankreasa, prostate, kolorektalni, pluća, mozga, bubrega, želuca, i kože (uključujući ali ne ograničavajući se na karcinom pločastih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, i melanom). U nekim primerima izvođenja, korisni TIL dobijaju se iz malignih melanoma tumora, pošto je za njih saopšteno da imaju posebno visoke nivoe TIL.
[0159] Termin "čvrsti tumor" označava abnormalnu masu tkiva koja uobičajeno ne sadrži ciste ili tečne oblasti. Čvrsti tumori mogu biti benigni ili maligni. Termin "čvrsti tumorski kancer" označava maligne, neoplastične, ili kancerozne čvrste tumore. Čvrsti tumorski kanceri uključuju, ali nisu ograničeni na, sarkome, karcinome, i limfome, kao što su kanceri pluća, dojke, trostruko negativni kancer dojke, prostate, kolona, rektuma, i mokraćne bešike. U nekim primerima izvođenja, kancer je odabran od kancera grlića materice, kancera glave i vrata, glioblastoma, kancera jajnika, sarkoma, kancera pankreasa, kancera mokraćne bešike, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, i nesitnoćelijskog karcinoma pluća. Struktura tkiva čvrstih tumora uključuje međuzavisne kompartmente tkiva uključujući parenhim (kancerske ćelije) i potporne stromalne ćelije u kojima su kancerske ćelije dispergovane i koje mogu da obezbede podržavajuće mikrookruženje.
[0160] Termin "hematološki malignitet" označava sisarske kancere i tumore hematopoetskog i limfoidnog tkiva, uključujući ali ne ograničavajući se na tkiva krvi, kostne srži, limfnih čvorova, i limfnog sistema. Hematološki maligniteti se takođe označavaju kao "tečni tumori". Hematološki maligniteti uključuju, ali nisu ograničeni na, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hronični limfocitni limfom (CLL), mali limfocitni limfom (SLL), akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), akutnu monocitnu leukemiju (AMoL), Hočkinov limfom, i ne-Hočkinove limfome. Termin "B ćelijski hematološki malignitet" označava hematološke malignitete koji pogađaju B ćelije.
[0161] Kada se dobije, uzorak tumora se generalno fragmentiše upotrebom oštre disekcije na male komade od 1 do oko 8 mm<3>, pri čemu su od oko 2-3 mm<3>posebno korisni. TIL se kultivišu iz ovih fragmenata upotrebom proizvoda enzimskih digestija tumora. Takvi proizvodi digestije tumora mogu se proizvesti inkubacijom u enzimskom medijumu (npr. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pufer, 2 mM glutamat, 10 mcg/ml gentamicina, 30 jedinica/ml DNaze i 1,0 mg/ml kolagenaze) nakon čega sledi mehanička disocijacija (npr. upotrebom disocijatora tkiva). Proizvodi digestije tumora mogu se proizvesti stavljanjem tumora u enzimski medijum i mehaničkom disocijacijom tumora tokom približno 1 minuta, nakon čega sledi inkubacija tokom 30 minuta na 37 °C u 5% CO2, nakon čega slede ponovljeni ciklusi mehaničke disocijacije i inkubacije u prethodnim uslovima dok ne budu prisutni samo mali komadi tkiva. Na kraju ovog procesa, ukoliko suspenzija ćelija sadrži veliki broj crvenih krvnih zrnaca ili mrtvih ćelija, može da se izvede odvajanje na gradijentu gustine upotrebom FICOLL razgranatog hidrofilnog polisaharida kako bi se uklonile ove ćelije. Mogu se upotrebljavati alternativni postupci koji su poznati u struci, kao što su oni koji su opisani u S.A.D. publikaciji patentne prijave br.2012/0244133 A1. Bilo koji od prethodnih postupaka može se upotrebljavati u bilo kojim primerima izvođenja koji su ovde opisani za postupke umnožavanja TIL.
[0162] U nekim primerima izvođenja, fragmentacija uključuje fizičku fragmentaciju, uključujući, na primer, disekciju kao i digestiju. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je fizička fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je disekcija. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija je digestijom. U nekim primerima izvođenja, TIL se inicijalno mogu kultivisati iz proizvoda enzimskih digestija tumora i fragmenata tumora koji su dobijeni od pacijenata.
[0163] U nekim primerima izvođenja, gde je tumor čvrsti tumor, tumor se podvrgava fizičkoj fragmentaciji pošto se dobije uzorak tumora, na primer kao u Koraku A sa Slike 11. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava pre krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava posle krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fragmentacija se dešava posle dobijanja tumora i u odsustvu bilo kakve krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 2, 3, ili 4 fragmenta ili komada se stavljaju u svaki kontejner za prvo umnožavanje. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 3 ili 4 fragmenta ili komada se stavljaju u svaki kontejner za prvo umnožavanje. U nekim primerima izvođenja, tumor se fragmentiše i 4 fragmenta ili komada se stavljaju u svaki kontejner za prvo umnožavanje.
[0164] U nekim primerima izvođenja, TIL se dobijaju iz fragmenata tumora. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora se dobija oštrom disekcijom. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je između oko 1 mm<3>i 10 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je između oko 1 mm<3>i 8 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 1 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 2 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 3 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 4 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 5 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 6 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 7 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 8 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 9 mm<3>. U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je oko 10 mm<3>.
[0165] U nekim primerima izvođenja, TIL se dobijaju iz proizvoda digestije tumora. U nekim primerima izvođenja, proizvodi digestije tumora su generisani inkubacijom u enzimskom medijumu, na primer, ali ne ograničavajući se na RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/ml gentamicina, 30 U/ml DNaze, i 1,0 mg/ml kolagenaze, nakon čega sledi mehanička disocijacija (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Posle stavljanja tumora u enzimski medijum, tumor se može mehanički disocirati tokom približno 1 minuta. Rastvor se zatim može inkubirati tokom 30 minuta na 37 °C u 5% CO2i zatim ponovo mehanički narušiti tokom otprilike 1 minuta. Pošto se ponovo inkubira tokom 30 minuta na 37 °C u 5% CO2, tumor se može mehanički narušiti treći put tokom približno 1 minuta. U nekim primerima izvođenja, posle trećeg mehaničkog narušavanja, ukoliko su bili prisutni veliki komadi tkiva, 1 ili 2 dopunske mehaničke disocijacije primenjene su na uzorak, sa ili bez dopunskih 30 minuta inkubacije na 37 °C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, na kraju završne inkubacije, ukoliko je suspenzija ćelija sadržala veliki broj crvenih krvnih zrnaca ili mrtvih ćelija, može da se izvede odvajanje na gradijentu gustine upotrebom Ficoll kako bi se uklonile ove ćelije.
[0166] U nekim primerima izvođenja, sakupljena suspenzija ćelija pre prvog koraka umnožavanja naziva se "primarna ćelijska populacija" ili "sveže sakupljena" ćelijska populacija.
[0167] U nekim primerima izvođenja, ćelije mogu biti opciono zamrznute posle sakupljanja uzorka i uskladištene zamrznute pre ulaska u Korak B, koji je detaljnije opisan u nastavku.
B. Korak B: Prvo umnožavanje
[0168] U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL (koje se takođe označava kao prvo umnožavanje ili prvo umnožavanje TIL) može da se izvede upotrebom inicijalnog koraka masivnog umnožavanja TIL (na primer, Korak B kao što je naznačeno na Slici 11 ili prvi korak umnožavanja; ovo može uključivati korak umnožavanja koji se označava kao preREP) kao što je opisano u nastavku i ovde, nakon čega sledi drugi korak umnožavanja (na primer, Korak D kao što je naznačeno na Slici 11; koji može uključivati kao primer ono što se označava kao korak protokola brzog umnožavanja (REP)) kao što je opisano u nastavku i ovde, nakon čega sledi opciona krioprezervacija (na primer, posle Koraka D kao što je naznačeno na Slici 11), i nakon čega sledi dopunsko drugo umnožavanje (na primer, drugi Korak D, kao što je naznačeno na Slici 11, koji može uključivati ono što se ponekad označava kao korak restimulacije REP) kao što je opisano u nastavku i ovde. TIL koji su dobijeni iz ovog procesa mogu se opciono okarakterisati za fenotipske karakteristike i metaboličke parametre kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, TIL se zamrzavaju (tj. krioprezerviraju) posle prvog umnožavanja (na primer, Korak B kao što je naznačeno na Slici 11) i skladište dok ne budu fenotipizovani za selekciju zatim se odmrzavaju pre nego što se pređe na jedan ili više koraka drugog umnožavanja (na primer, jedno ili više umnožavanja u skladu sa Korakom D kao što je naznačeno na Slici 11).
[0169] U nekim primerima izvođenja, gde su ćelije zamrznute pošto su dobijene iz uzorka tumora (kao što je, na primer, tokom Koraka A kao što je naznačeno na Slici 11), ćelije se odmrzavaju pre prvog umnožavanja (na primer, Korak B kao što je naznačeno na Slici 11).
[0170] U primerima izvođenja gde se kulture TIL iniciraju u pločama sa 24 bunarića, na primer, upotrebom Costar klastera za ćelijske kulture sa 24 bunarića, sa ravnim dnom (Corning Incorporated, Corning, NY), svaki bunarić može biti zasejan sa 1×10<6>ćelija proizvoda digestije tumora ili jednim fragmentom tumora u 2 ml kompletnog medijuma (CM) sa IL-2 (6000 IU/ml; Chiron Corp. Emeryville, CA). U nekim primerima izvođenja, fragment tumora je između oko 1 mm<3>i 10 mm<3>.
[0171] Posle pripreme fragmenata tumora, rezultujuće ćelije (tj. fragmenti) kultivišu se u serumu koji sadrži IL-2 pod uslovima koji favorizuju rast TIL u odnosu na tumorske i druge ćelije. U nekim primerima izvođenja, proizvodi digestije tumora inkubiraju se u bunarićima od 2 ml u medijumu koji sadrži inaktivirani humani AB serum (ili, u nekim slučajevima, kao što je ovde istaknuto, u prisustvu ćelijske populacije aAPC) sa 6000 IU/ml IL-2. Ova primarna ćelijska populacija kultiviše se tokom perioda od nekoliko dana, generalno od 10 do 14 dana, što rezultuje masivnom populacijom TIL, generalno oko 1 × 10<8>masivnih TIL ćelija. U nekim primerima izvođenja, medijum za rast tokom prvog umnožavanja sadrži IL-2 ili njegovu varijantu. U nekim primerima izvođenja, IL je rekombinantni humani IL-2 (rhIL-2). U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 20-30×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 20-×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 25×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 30×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 ima krajnu koncentraciju od 4-8×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 ima krajnu koncentraciju od 5-7×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 ima krajnu koncentraciju od 6×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 priprema se kao što je opisano u Primeru 4. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 10.000 IU/ml IL-2, oko 9.000 IU/ml IL-2, oko 8.000 IU/ml IL-2, oko 7.000 IU/ml IL-2, oko 6.000 IU/ml IL-2 ili oko 5.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 9.000 IU/ml IL-2, do oko 5.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 8.000 IU/ml IL-2, do oko 6.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 7.000 IU/ml IL-2, do oko 6.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 6.000 IU/ml IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu dodatno sadrži IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 3000 IU/ml IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 1000 IU/ml, oko 1500 IU/ml, oko 2000 IU/ml, oko 2500 IU/ml, oko 3000 IU/ml, oko 3500 IU/ml, oko 4000 IU/ml, oko 4500 IU/ml, oko 5000 IU/ml, oko 5500 IU/ml, oko 6000 IU/ml, oko 6500 IU/ml, oko 7000 IU/ml, oko 7500 IU/ml, ili oko 8000 IU/ml IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži između 1000 i 2000 IU/ml, između 2000 i 3000 IU/ml, između 3000 i 4000 IU/ml, između 4000 i 5000 IU/ml, između 5000 i 6000 IU/ml, između 6000 i 7000 IU/ml, između 7000 i 8000 IU/ml, ili između 8000 IU/ml IL-2.
[0172] U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje označen je kao "CM", skraćenica za medijum za kulturu. U nekim primerima izvođenja, on je označen kao CM1 (medijum za kulturu 1). U nekim primerima izvođenja, CM se sastoji od RPMI 1640 sa GlutaMAX, suplementovan sa 10% humanim AB serumom, 25 mM Hepesa, i 10 mg/ml gentamicina. U primerima izvođenja gde se kulture iniciraju u gas-permeabilnim flaskovima sa kapacitetom od 40 ml i gas-permeabilnim silikonskim dnom od 10 cm<2>(na primer, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Sl.1), svaki flask je bio napunjen sa 10-40 × 10<6>vijabilnih ćelija proizvoda digestije tumora ili 5-30 fragmenata tumora u 10-40 ml CM sa IL-2. I G-Rex10 i ploče sa 24 bunarića inkubirane su u inkubatoru sa povećanim procentom vlažnosti na 37 °C u 5% CO2i 5 dana posle inicijacije kulture, polovina medijuma je uklonjena i zamenjena sa svežim CM i IL-2 i posle dana 5, polovina medijuma je menjana svaka 2-3 dana. U nekim primerima izvođenja, CM je CM1 koji je opisan u Primerima, videti Primer 5. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje se dešava u medijumu za inicijalnu ćelijsku kulturu ili u medijumu za prvu ćelijsku kulturu. U nekim primerima izvođenja, medijum za inicijalnu ćelijsku kulturu ili medijum za prvu ćelijsku kulturu sadrži IL-2.
[0173] U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana, 18 dana, 19 dana, 20 dana, ili 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 11 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 12 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 13 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 14 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 15 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 16 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 17 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 18 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 19 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 20 dana do 21 dana. U nekim primerima izvođenja, prvo umnožavanje TIL može da traje tokom 21 dana.
C. KORAK C: Tranzicija prvog umnožavanja u drugo umnožavanje
[0174] U nekim primerima izvođenja, TIL koji su dobijeni iz prvog umnožavanja (na primer, iz Koraka B kao što je naznačeno na Slici 11) skladište se do fenotipizacije za selekciju. U nekim primerima izvođenja, TIL koji su dobijeni iz prvog umnožavanja se krioprezerviraju posle prvog umnožavanja i pre drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju kao deo tranzicije prvog umnožavanja u drugo umnožavanje. Na primer, u nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju posle Koraka B i pre Koraka D kao što je naznačeno na Slici 11. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju i odmrzavaju kao deo tranzicije prvog umnožavanja u drugo umnožavanje. Na primer, u nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju posle Koraka B zatim se odmrzavaju pre nego što se pređe na Korak D (kao što je obezbeđeno na Slici 11). U nekim primerima izvođenja, tranzicija prvog umnožavanja u drugo umnožavanje dešava se oko 22 dana, 23 dana, 24 dana, 25 dana, 26 dana, 27 dana, 28 dana, 29 dana, ili 30 dana od trenutka kada se dešava fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, tranzicija prvog umnožavanja u drugo umnožavanje dešava se oko 22 dana do 30 dana od trenutka kada se dešava fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, tranzicija prvog umnožavanja u drugo umnožavanje dešava se oko 24 dana do 30 dana od trenutka kada se dešava fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, tranzicija prvog umnožavanja u drugo umnožavanje dešava se oko 26 dana do 30 dana od trenutka kada se dešava fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, tranzicija prvog umnožavanja u drugo umnožavanje dešava se oko 28 dana do 30 dana od trenutka kada se dešava fragmentacija. U nekim primerima izvođenja, tranzicija prvog umnožavanja u drugo umnožavanje dešava se oko 30 dana od trenutka kada se dešava fragmentacija.
D. Korak D: Drugo umnožavanje
[0175] U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje ili drugo umnožavanje TIL (koje može uključivati umnožavanja koja se ponekad označavaju kao REP) može da se izvede upotrebom bilo kojih flaskova ili kontejnera za TIL koji su poznati onima sa iskustvom u struci. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje TIL može da traje tokom 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana, 18 dana, 19 dana, 20 dana, 21 dana, ili 22 dana. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje TIL može da traje tokom oko 14 dana do oko 22 dana. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje TIL može da traje tokom oko 14 dana do oko 20 dana. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje TIL može da traje tokom oko 14 dana do oko 18 dana. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje TIL može da traje tokom oko 14 dana do oko 16 dana. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje TIL može da traje tokom oko 14 dana.
[0176] U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje se dešava u suplementovanom medijumu za ćelijsku kulturu. U nekim primerima izvođenja, suplementovani medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće hraniteljske ćelije. U nekim primerima izvođenja, drugi medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i antigenprezentujuće ćelije (APC; takođe se označavaju kao antigen-prezentujuće hraniteljske ćelije).
[0177] U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje (koje može uključivati umnožavanja koja se označavaju kao REP) TIL može da se izvede pomoću T-175 flaskova i gas-permeabilnih kesa kao što je prethodno opisano (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, i Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342) ili gas-permeabilnih G-Rex flaskova. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje se izvodi upotrebom flaskova. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje se izvodi upotrebom gas-permeabilnih G-Rex flaskova. Za drugo umnožavanje TIL u T-175 flaskovima, oko 1 × 10<6>TIL se suspenduje u oko 150 ml medijuma i to se dodaje u svaki T-175 flask. TIL se kultivišu sa ozračenim (50 Gy) alogenim PBMC kao "hraniteljskim" ćelijama u odnosu 1 prema 100 i ćelije se kultivišu u smeši 1 prema 1 CM i AIM-V medijuma (50/50 medijum), koji je suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2 i 30 ng/ml anti-CD3. T-175 flaskovi se inkubiraju na 37 °C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, polovina medijuma se menja 5 dana od početka drugog umnožavanja upotrebom 50/50 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, na Dan 7, ćelije iz 2 T-175 flaska kombinuju se u kesu od 3 l i dodaje se 300 ml AIM-V sa 5% humanim AB serumom i 3000 IU/ml IL-2 u 300 ml suspenzije TIL. Broj ćelija u svakoj kesi može se brojati na svakih dan ili dva i može se dodati svež medijum kako bi se broj ćelija održao između oko 0,5 i oko 2,0 × 10<6>ćelija/ml.
[0178] U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje (koje može uključivati umnožavanja koja se označavaju kao REP) TIL može da se izvede u gas-permeabilnim flaskovima kapaciteta 500 ml sa 100 cm<2>gas-permeabilnim silikonskim dnom (G-Rex 100, komercijalno dostupno od Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, SAD) (Sl. 1), oko 5 × 10<6>ili 10 × 10<6>TIL se kultiviše sa ozračenim alogenim PBMC u odnosu 1 prema 100 u 400 ml 50/50 medijuma, koji je suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2 i 30 ng/ml anti-CD3 (OKT3). G-Rex 100 flaskovi se mogu inkubirati na 37 °C u 5% CO2. U nekim primerima izvođenja, 5 dana od početka drugog umnožavanja, 250 ml supernatanta se uklanja i stavlja u boce za centrifugu i centrifugira na 1500 rpm (491 × g) tokom 10 minuta. TIL peleti se zatim mogu resuspendovati sa 150 ml svežeg medijuma sa 5% humanim AB serumom, 3000 IU po ml IL-2 i dodati nazad u originalne G-Rex 100 flaskove. U primerima izvođenja gde se TIL serijski umnožavaju u G-Rex 100 flaskovima, na Dan 7 TIL u svakom G-Rex 100 suspenduju se u 300 ml medijuma koji je prisutan u svakom flasku i suspenzija ćelija je podeljena na tri alikvota od 100 ml koji se mogu upotrebiti za zasejavanje tri G-Rex 100 flaska. Zatim se 150 ml AIM-V sa 5% humanim AB serumom i 3000 IU po ml IL-2 može dodati u svaki flask. G-Rex 100 flaskovi se mogu inkubirati na 37 °C u 5% CO2i posle 4 dana od početka drugog umnožavanja, 150 ml AIM-V sa 3000 IU po ml IL-2 može se dodati u svaki G-Rex 100 flask. U nekim primerima izvođenja, ćelije se sakupljaju na Dan 14 kulture.
[0179] U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje (koje može uključivati umnožavanja koja se označavaju kao REP) TIL može da se izvede u gas-permeabilnom kontejneru. Na primer, TIL se mogu brzo umnožiti upotrebom nespecifične stimulacije T-ćelijskog receptora u prisustvu interleukina-2 (IL-2) ili interleukina-15 (IL-15). U jednom primeru izvođenja, uvećanje broja TIL upotrebljava oko 1 × 10<9>do oko 1 × 10<11>antigenprezentujućih hraniteljskih ćelija. Nespecifični stimulus T-ćelijskog receptora može uključivati, na primer, oko 30 ng/ml OKT3, mišje monoklonalno anti-CD3 antitelo (komercijalno dostupno od Ortho-McNeil, Raritan, NJ ili Miltenyi Biotech, Auburn, CA). TIL se mogu brzo umnožiti dodatnom stimulacijom TIL in vitro sa jednim ili više antigena, uključujući njihove antigene delove, kao što su epitop(i), kancera, koji se opciono mogu eksprimirati iz vektora, kao što je humani leukocitni antigen A2 (HLA-A2) vezujući peptid, npr. 0,3 μM MART-1:26-35 (27 L) ili gpl 00:209-217 (210M), opciono u prisustvu faktora rasta T-ćelija, kao što je 300 IU/ml IL-2 ili IL-15. Drugi pogodni antigeni mogu uključivati, npr. NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antigen tirozinaze kancera, MAGEA3, SSX-2 i VEGFR2, ili njihove antigene delove. TIL se takođe mogu brzo umnožiti restimulacijom sa istim antigenom(ima) kancera koji se pulsira na HLA-A2-eksprimirajuće antigen-prezentujuće ćelije. Alternativno, TIL se mogu dodatno restimulisati sa, npr. ozračenim autolognim limfocitima ili ozračenim HLA-A2+ alogenim limfocitima i IL-2.
[0180] U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje (koje može uključivati umnožavanja koja se označavaju kao REP) TIL može da se izvede u gas-permeabilnim flaskovima kapaciteta 500 mL sa 100 cm<2>gas-permeabilnim silikonskim dnom (G-Rex 100, komercijalno dostupno od Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, SAD), 5 × 10<6>ili 10 × 10<6>TIL može se kultivisati sa aAPC u odnosu 1 prema 100 u 400 mL 50/50 medijuma, koji je suplementovan sa 5% humanim AB serumom, 3000 IU po ml IL-2 i 30 ng po ml anti-CD3 (OKT3). G-Rex 100 flaskovi se mogu inkubirati na 37 °C u 5% CO2. Na Dan 5, 250 ml supernatanta može se ukloniti i staviti u boce za centrifugu i centrifugirati na 1500 rpm (491 × g) tokom 10 minuta. TIL peleti se mogu resuspendovati sa 150 ml svežeg medijuma sa 5% humanim AB serumom, 3000 IU po ml IL-2 i dodati nazad u originalne G-Rex 100 flaskove. Kada se TIL serijski umnože u G-Rex 100 flaskovima, na Dan 7 TIL u svakom G-Rex 100 mogu se suspendovati u 300 ml medijuma koji je prisutan u svakom flasku i suspenzija ćelija se može podeliti na 3 alikvota od 100 ml koji se mogu upotrebiti za zasejavanje 3 G-Rex 100 flaska. Zatim se 150 ml AIM-V sa 5% humanim AB serumom i 3000 IU po ml IL-2 može dodati u svaki flask. G-Rex 100 flaskovi se mogu inkubirati na 37 °C u 5% CO2i posle 4 dana 150 mL AIM-V sa 3000 IU po ml IL-2 može se dodati u svaki G-Rex 100 flask. Ćelije se mogu sakupiti na Dan 14 kulture.
[0181] U jednom primeru izvođenja, drugo umnožavanje (uključujući umnožavanja koje se označavaju kao REP) izvodi se u flaskovima sa masivnim TIL koji se mešaju sa 100- ili 200-strukim viškom inaktiviranih hraniteljskih ćelija, 30 mg/ml OKT3 anti-CD3 antitela i 3000 IU/ml IL-2 u 150 ml medijuma. Zamena medijuma se vrši (generalno zamena 2/3 medijuma putem respiracije sa svežim medijumom) sve dok se ćelije ne prebace u alternativnu komoru za rast. Alternativne komore za rast uključuju G-Rex flaskove i gas-permeabilne kontejnere kao što je detaljnije diskutovano u nastavku.
[0182] U sledećem primeru izvođenja, drugo umnožavanje (uključujući umnožavanja koja se označavaju kao REP) izvodi se i dodatno sadrži korak u kome su TIL odabrani za superiornu reaktivnost prema tumoru. Može se upotrebljavati bilo koji postupak odabira koji je poznat u struci. Na primer, postupci koji su opisani u S.A.D. publikaciji patentne prijave br.
2016/0010058 A1, čija je objava inkorporisana ovde kao referenca, mogu se upotrebljavati za odabir TIL za superiornu reaktivnost prema tumoru.
[0183] Opciono, test vijabilnosti ćelija može da se izvede posle drugog umnožavanja (uključujući umnožavanja koja se označavaju kao REP umnožavanje), upotrebom standardnih testova koji su poznati u struci. Na primer, test isključenja sa tripan plavim može da se uradi na uzorku masivnih TIL, koji selektivno obeležava mrtve ćelije i omogućava procenu vijabilnosti. U nekim primerima izvođenja, uzorci TIL mogu se prebrojati i vijabilnost se može odrediti upotrebom automatskog brojača ćelija Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). U nekim primerima izvođenja, vijabilnost se određuje u skladu sa protokolom Cellometer K2 Image Cytometer automatskog brojača ćelija koji je opisan, na primer, u Primeru 2.
[0184] U nekim primerima izvođenja, ćelije se uzgajaju tokom 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, ili 11 dana od ukupnog vremena drugog umnožavanja pre nego što se podele u više od jednog kontejnera ili flaska.
[0185] U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za drugo umnožavanje (npr. koji se ponekad označava kao CM2 ili medijum za drugu ćelijsku kulturu), sadrži IL-2, OKT-3, kao i antigen-prezentujuće hraniteljske ćelije (APC), kao što je detaljnije diskutovano u nastavku.
[0186] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće hraniteljske ćelije su PBMC. U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće hraniteljske ćelije su veštačke antigenprezentujuće hraniteljske ćelije. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema antigenprezentujućim hraniteljskim ćelijama u drugom umnožavanju je oko 1 do 25, oko 1 do 50, oko 1 do 100, oko 1 do 125, oko 1 do 150, oko 1 do 175, oko 1 do 200, oko 1 do 225, oko 1 do 250, oko 1 do 275, oko 1 do 300, oko 1 do 325, oko 1 do 350, oko 1 do 375, oko 1 do 400, ili oko 1 do 500. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema antigen-prezentujućim hraniteljskim ćelijama u drugom umnožavanju je između 1 do 50 i 1 do 300. U jednom primeru izvođenja, odnos TIL prema antigen-prezentujućim hraniteljskim ćelijama u drugom umnožavanju je između 1 do 100 i 1 do 200.
[0187] U jednom primeru izvođenja, procedure TIL umnožavanja koje su ovde opisane zahtevaju višak hraniteljskih ćelija tokom drugog umnožavanja (uključujući na primer, umnožavanja koja su označena kao REP TIL umnožavanja). U mnogim primerima izvođenja, hraniteljske ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) koje su dobijene iz standardnih jedinica pune krvi od zdravih davalaca krvi. PBMC se dobijaju upotrebom standardnih postupaka kao što je Ficoll-Paque gradijentno odvajanje. U jednom primeru izvođenja, umesto PBMC upotrebljavaju se veštačke antigen-prezentujuće ćelije (aAPC).
[0188] Generalno, alogene PBMC se inaktiviraju, bilo zračenjem ili toplotnim tretmanom, i upotrebljavaju se u REP procedurama.
[0189] U nekim primerima izvođenja, medijum za rast tokom prvog umnožavanja sadrži IL-2 ili njegovu varijantu. U nekim primerima izvođenja, IL je rekombinantni humani IL-2 (rhIL-2). U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 20-30×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 20×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 25×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja štok rastvor IL-2 ima specifičnu aktivnost od 30×10<6>IU/mg za bočicu od 1 mg. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 ima krajnju koncentraciju od 4-8×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 ima krajnju koncentraciju od 5-7×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 ima krajnju koncentraciju od 6×10<6>IU/mg IL-2. U nekim primerima izvođenja, štok rastvor IL-2 se priprema kao što je opisano u Primeru 4. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 10.000 IU/ml IL-2, oko 9.000 IU/ml IL-2, oko 8.000 IU /ml IL-2, oko 7.000 IU/ml IL-2, oko 6.000 IU/ml IL-2 ili oko 5.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 9.000 IU/ml IL-2, do oko 5.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 8.000 IU/ml IL-2, do oko 6.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 7.000 IU/ml IL-2, do oko 6.000 IU/ml IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za kulturu za prvo umnožavanje sadrži oko 6,000 IU/ml IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu dodatno sadrži IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 3000 IU/ml IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 1000 IU/ml, oko 1500 IU/ml, oko 2000 IU/ml, oko 2500 IU/ml, oko 3000 IU/ml, oko 3500 IU/ml, oko 4000 IU/ml, oko 4500 IU/ml, oko 5000 IU/ml, oko 5500 IU/ml, oko 6000 IU/ml, oko 6500 IU/ml, oko 7000 IU/ml, oko 7500 IU/ml, ili oko 8000 IU/ml IL-2. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži između 1000 i 2000 IU/ml, između 2000 i 3000 IU/ml, između 3000 i 4000 IU/ml, između 4000 i 5000 IU/ml, između 5000 i 6000 IU/ml, između 6000 i 7000 IU/ml, između 7000 i 8000 IU/ml, ili između 8000 IU/ml IL-2.
[0190] U nekim primerima izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu za drugo umnožavanje takođe uključuje anti-CD3 antitelo. U nekom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži OKT3 antitelo. U nekim primerima izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 30 ng/ml OKT3 antitela. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži oko 0,1 ng/ml, oko 0,5 ng/ml, oko 1 ng/ml, oko 2,5 ng/ml, oko 5 ng/ml, oko 7,5 ng/ml, oko 10 ng/ml, oko 15 ng/ml, oko 20 ng/ml, oko 25 ng/ml, oko 30 ng/ml, oko 35 ng/ml, oko 40 ng/ml, oko 50 ng/ml, oko 60 ng/ml, oko 70 ng/ml, oko 80 ng/ml, oko 90 ng/ml, oko 100 ng/ml, oko 200 ng/ml, oko 500 ng/ml, i oko 1 μg/ml OKT3 antitela. U jednom primeru izvođenja, medijum za ćelijsku kulturu sadrži između 0,1 ng/ml i 1 ng/ml, između 1 ng/ml i 5 ng/ml, između 5 ng/ml i 10 ng/ml, između 10 ng/ml i 20 ng /ml, između 20 ng/ml i 30 ng/ml, između 30 ng/ml i 40 ng/ml, između 40 ng/ml i 50 ng/ml, i između 50 ng/ml i 100 ng/ml OKT3 antitela.
[0191] U nekim primerima izvođenja, anti-CD3 antitelo u kombinaciji sa IL-2 indukuje aktivaciju T ćelija i ćelijsku deobu u populaciji TIL. Ovaj efekat se može videti sa antitelima pune dužine, kao i sa Fab i F(abꞌ)2 fragmentima, pri čemu su prva generalno poželjnija; videti, npr. Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719. Kao što će ceniti oni sa iskustvom u struci, postoji niz pogodnih anti-humanih CD3 antitela koja nalaze primenu u pronalasku, uključujući anti-humana CD3 poliklonalna i monoklonalna antitela od različitih sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na, antitela murina, ljudi, primata, pacova, i pasa. U određenim primerima izvođenja, upotrebljava se OKT3 anti-CD3 antitelo (komercijalno dostupno od Ortho-McNeil, Raritan, NJ ili Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
[0192] U nekom primeru izvođenja, ćelije u drugom umnožavanju uzgajaju se u medijumu za kulturu sa visokim dozama citokina, posebno IL-2, kao što je poznato u struci.
[0193] Alternativno, upotrebljavanje kombinacija citokina za drugo umnožavanje TIL je dopunski moguće, sa kombinacijama dva ili više od IL-2, IL-15 i IL-21 kao što je generalno istaknuto u međunarodnoj publikaciji br. WO 2015/189356 i međunarodnoj publikaciji br. WO 2015/189357. Stoga, moguće kombinacije uključuju IL-2 i IL-15, IL-2 i IL-21, IL-15 i IL-21 i IL-2, IL-15 i IL-21, pri čemu se potonja posebno upotrebljava u mnogim primerima izvođenja. Upotreba kombinacija citokina specifično favorizuje generisanje limfocita, i posebno T-ćelija kao što je tamo opisano.
E. Opciona ponavljanja Koraka D: drugo umnožavanje
[0194] U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje se izvodi jednom ili više puta, tj. drugo umnožavanje se ponavlja. Na primer, u nekim primerima izvođenja, Korak D drugo umnožavanje kao što je naznačeno na Slici 11 ponavlja se jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, drugo umnožavanje se označava kao dopunsko drugo umnožavanje. U nekim primerima izvođenja gde se drugo umnožavanje izvodi više od jednom (tj. gde se drugo umnožavanje ponavlja), ovo može uključivati procedure koje se označavaju kao TIL protokol brzog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, ćelijska populacija TIL se uvećava po broju posle sakupljanja i prvog umnožavanja. Ovaj proces se u struci generalno označava kao proces brzog umnožavanja (REP) i ponovljeno drugo umnožavanje može uključivati umnožavanje koja se označava kao reREP. Ovaj sveukupni protokol se generalno može ostvariti upotrebom medijuma za kulturu koji sadrži brojne komponente, uključujući hraniteljske ćelije, izvor citokina, i anti-CD3 antitelo, u gas-permeabilnom kontejneru. U nekim primerima izvođenja, jedno ili više narednih drugih umnožavanja izvode se kao što je prethodno opisano. U nekim primerima izvođenja, jedno ili više narednih drugih umnožavanja izvode se kao što je obezbeđeno u Koraku D na Slici 11 i pre Koraka E kao što je obezbeđeno na Slici 11. U nekim primerima izvođenja, jedno, dva, tri, četiri ili više drugih umnožavanja izvode se kao što je prethodno opisano. U nekim primerima izvođenja, jedno, dva, tri, četiri ili više drugih umnožavanja izvode se kao što je obezbeđeno u Koraku D sa Slike 11 pre Koraka E sa Slike 11. U nekim primerima izvođenja, dva druga umnožavanja izvode se kao što je prethodno opisano. U nekim primerima izvođenja, dva druga umnožavanja izvode se kao što je obezbeđeno u Koraku D sa Slike 11 pre Koraka E sa Slike 11. U nekim primerima izvođenja, tri druga umnožavanja izvode se kao što je prethodno opisano. U nekim primerima izvođenja, tri druga umnožavanja izvode se kao što je obezbeđeno u Koraku D sa Slike 11 pre Koraka E sa Slike 11. U nekim primerima izvođenja, četiri druga umnožavanja izvode se kao što je prethodno opisano. U nekim primerima izvođenja, četiri druga umnožavanja izvode se kao što je obezbeđeno u Koraku D sa Slike 11 pre Koraka E sa Slike 11.
[0195] U nekim primerima izvođenja, ponavljanje drugog umnožavanja TIL (kao što je na primer u Koraku D sa Slike 11) može se označiti kao restimulacija TIL. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje korak restimulacije, tj. ponavljanja drugog umnožavanja (na primer, ponavljanja drugog umnožavanja iz Koraka D sa Slike 11). U nekim primerima izvođenja, ponovljeno drugo umnožavanje (koje može uključivati umnožavanje koje se označava kao korak restimulacije ("reREP")) izvodi se na ćelijama koje su krioprezervirane. U nekim primerima izvođenja, TIL su krioprezervirani posle Koraka D. U nekim primerima izvođenja, posle inicijalnog drugog umnožavanja u Koraku D, ćelije se mogu kultivisati u običnom medijumu, npr. medijumu za "mirovanje", i zatim se izvodi jedan ili više koraka drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, medijum za mirovanje sadrži IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za mirovanje ne sadrži IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za mirovanje je standardni medijum za ćelijsku kulturu koji je poznat u struci. U nekim primerima izvođenja, medijum za mirovanje je AIM-V, DMEM, DMEM/F12, MEM, RPMI, OptiMEM, IMDM, ili bilo koji drugi standardni medijum koji je poznat u struci, uključujući komercijalno dostupne medijume. U nekim primerima izvođenja, medijum za mirovanje je AIM-V.
[0196] Generalno, kao što je ovde diskutovano, TIL se inicijalno pripremaju dobijanjem primarne populacije TIL iz tumora koji je reseciran iz pacijenta kao što je ovde diskutovano ("primarna ćelijska populacija" ili "prva ćelijska populacija"). Ovo je praćeno inicijalnim masivnim umnožavanjem korišćenjem kultivisanja ćelija sa IL-2, formirajući drugu populaciju ćelija (koja se ovde ponekad označva kao "masivna populacija TIL" ili "druga populacija"). U nekim primerima izvođenja, ovo se takođe označava kao inicijalno ili prvo umnožavanje.
[0197] Masivna populacija TIL (na primer, populacija koja je dobijena na primer iz Koraka A na Slici 11) zatim se podvrgava koraku REP, koji se ponekad označava kao prvo umnožavanje (na primer, prvo umnožavanje kao što je opisano u Koraku B na Slici 11) u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće hraniteljske ćelije (APC), pri čemu APC generalno sadrže mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC; ili, alternativno kao što je ovde diskutovano, upotrebom antigen-prezentujućih ćelija), pri čemu se brzo umnožavanje (na primer, drugo umnožavanje kao što je obezbeđeno u Koraku D sa Slike 11) izvodi tokom najmanje 14 dana. Kao što je ovde diskutovano, medijum takođe može da sadrži kombinacije IL-2, IL-15 i/ili IL-23 pre nego sam IL-2. U nekim primerima izvođenja, ovo umnožavanje nakon drugog (na primer, nakon Koraka D sa Slike 11) umnožena populacija TIL je najmanje 50-struko ili 100-struko veća po broju od druge populacije TIL (na primer, populacije TIL koja je dobijena iz Koraka B sa Slike 11). U nekim primerima izvođenja, populacija TIL koja je dobijena posle drugog umnožavanja u Koraku D sa Slike 11 je 100-struko veća po broju od TIL koji su dobijeni iz prvog umnožavanja u Koraku B sa Slike 11. TIL se mere pomoću postupaka brojanja ćelija koji su poznati u struci, uključujući one postupke koji su opisani u Primerima koji su ovde obezbeđeni, uključujući Primere 1, 2, i 3. U nekim primerima izvođenja, za brojanje TIL koristi se K2 brojač ćelija. U nekim primerima izvođenja, za brojanje TIL koristi se Cellometer IC2 Image Cytometer.
[0198] U nekim primerima izvođenja, kao što je ovde diskutovano, populacija TIL koja je dobijena posle drugog umnožavanja (ponekad se označava kao treća populacija TIL ili REP ćelijska populacija) uklanja se iz suplementovanog medijuma za ćelijsku kulturu (na primer, medijuma za kulturu koji se upotrebljava u Koraku D sa Slike 11 ili medijuma koji se u Primerima označava kao CM2) i opciono krioprezervira u medijumu za skladištenje (na primer, medijumu koji sadrži 5% DMSO) pre izvođenja i dopunskog koraka drugog umnožavanja.
[0199] Opciono, TIL se mogu krioprezervirati posle drugog umnožavanja i pre dopunskog drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju posle izvođenja Koraka D sa Slike 11 i pre izvođenja dopunskog Koraka D sa Slike 11. U nekim primerima izvođenja, krioprezervirani TIL se odmrzavaju pre izvođenja dopunskog drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, krioprezervirani TIL se odmrzavaju pre izvođenja dopunskog Koraka D kao što je obezbeđeno na Slici 11. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u 5% DMSO. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u medijumu za ćelijsku kulturu plus 5% DMSO. Alternativno, ćelije se uklanjaju iz suplementovanog medijuma za ćelijsku kulturu (na primer, medijuma za kulturu koji se upotrebljava u Koraku D sa Slike 11) i kultivišu se u medijumu za mirovanje. Takvi medijumi uključuju one koji su opisani u Primerima 1 i 5, kao i u drugim Primerima koji su ovde obezbeđeni. U nekim primerima izvođenja, medijum za mirovanje može uključivati medijum sa IL-2. U nekim primerima izvođenja, medijum za mirovanje može biti medijum koji se u primerima označava kao CM1.
[0200] Dopunsko drugo umnožavanje (uključujući umnožavanja koja se označavaju kao reREP) vrši se bilo na odmrznutim ćelijama ili na mirujućim ćelijama, upotrebom suplementovanog medijuma za ćelijsku kulturu (na primer, medijuma kao što je obezbeđeno u Koraku D sa Slike 11) koji sadrži IL-2, OKT-3, i hraniteljske ćelije (na primer, antigenprezentujuće ćelije), koje generalno sadrže mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC; ili, alternativno kao što je ovde diskutovano, upotrebom antigen-prezentujućih ćelija), pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana. Kao što je ovde diskutovano, medijum takođe može da sadrži kombinacije IL-2, IL-15 i/ili IL-23 pre nego sam IL-2.
[0201] Ovo rezultuje umnoženom populacijom TIL koji se karakterišu time što ovi umnoženi TIL pokazuju povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL (npr. masivni početni TIL). U nekim primerima izvođenja, ovi umnoženi TIL su TIL koji su dobijeni iz Koraka D sa Slike 11.
[0202] U nekim primerima izvođenja memorijske T ćelije su one ćelije koje konstitutivno eksprimiraju CCR7 i CD62L. Videti, Sallusto, et al., Annu. Rev. Immunol., 2004, 22:745-763.
[0203] Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za restimulaciju krioprezerviranih TIL nakon odmrzavanja, zasnovane na postupcima nakon odmrzavanja koji rezultuju povećanjem metaboličkog zdravlja kao što su glikoliza i respiracija. U nekim primerima izvođenja, postupak sadrži obezbeđivanje populacije odmrznutih krioprezerviranih TIL koji se zatim tretiraju kako bi se povećalo njihovo metaboličko zdravlje kako bi se omogućilo optimalno lečenje nakon infuzije u pacijente.
F. KORAK E: Sakupljanje TIL iz Koraka D
[0204] Posle koraka drugog umnožavanja, ćelije se mogu sakupiti. U nekim primerima izvođenja TIL se sakupljaju posle jednog, dva, tri, četiri ili više koraka drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se sakupljaju posle jednog, dva, tri, četiri ili više koraka drugog umnožavanja u skladu sa Korakom D kao što je obezbeđeno na Slici 11.
[0205] TIL se mogu sakupiti na bilo koji odgovarajući i sterilan način, uključujući na primer centrifugiranjem. Postupci za TIL sakupljanje su dobro poznati u struci i bilo koji takav poznati postupak može se koristiti u predmetnom procesu.
G. KORAK F: Krajnja formulacija i/ili prebacivanje u kesu za infuziju
[0206] Pošto su završeni Koraci A do E, kao što je obezbeđeno u primernom redosledu na Slici 11 i kao što je detaljno istaknuto prethodno i ovde, ćelije se prebacuju u kontejner za upotrebu u primeni pacijentu. U nekim primerima izvođenja, kada se dobije terapijski dovoljan broj TIL upotrebom postupaka umnožavanja koji su prethodno opisani, oni se prebacuju u kontejner za upotrebu u primeni pacijentu.
[0207] U jednom primeru izvođenja, TIL koji su umnoženi upotrebom APC iz predmetne objave primenjuju se pacijentu kao farmaceutska kompozicija. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je suspenzija TIL u sterilnom puferu. TIL koji su umnoženi upotrebom PBMC iz predmetne objave mogu se primenjivati bilo kojim pogodnim putem kao što je poznato u struci. U nekim primerima izvođenja, T-ćelije se primenjuju kao pojedinačna intraarterijska ili intravenska infuzija, koja poželjno traje približno 30 do 60 minuta. Drugi pogodni putevi primene uključuju intraperitonealni, intratekalni, i intralimfatički.
1. Farmaceutske kompozicije, doze, i dozni režimi
[0208] U jednom primeru izvođenja, TIL koji su umnoženi upotrebom APC iz predmetne objave primenjuju se pacijentu kao farmaceutska kompozicija. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je suspenzija TIL u sterilnom puferu. TIL koji su umnoženi upotrebom PBMC iz predmetne objave mogu se primenjivati bilo kojim pogodnim putem kao što je poznato u struci. U nekim primerima izvođenja, T-ćelije se primenjuju kao pojedinačna intraarterijska ili intravenska infuzija, koja poželjno traje približno 30 do 60 minuta. Drugi pogodni putevi primene uključuju intraperitonealnu, intratekalnu, i intralimfatičku primenu.
[0209] Može se primeniti bilo koja pogodna doza TIL. U nekim primerima izvođenja, potreban je terapijski dovoljan broj TIL za odgovarajuću dozu. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>TIL, sa prosečno oko 7,8×10<10>TIL, posebno ukoliko je kancer melanom. U jednom primeru izvođenja, primenjuje se oko 1,2×10<10>do oko 4,3×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 3×10<10>do oko 12×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 4×10<10>do oko 10×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 5×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 6×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, primenjuje se oko 7×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 7,8×10<10>TIL, posebno ukoliko je kancer melanom. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 1,2×10<10>do oko 4,3×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 3×10<10>do oko 12×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 4×10<10>do oko 10×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 5×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 6×10<10>do oko 8×10<10>TIL. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 7×10<10>do oko 8×10<10>TIL.
[0210] U nekim primerima izvođenja, broj TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska je oko 1×10<6>, 2×10<6>, 3×10<6>, 4×10<6>, 5×10<6>, 6×10<6>, 7×10<6>, 8×10<6>, 9×10<6>, 1×10<7>, 2×10<7>, 3×10<7>, 4×10<7>, 5×10<7>, 6×10<7>, 7×10<7>, 8×10<7>, 9×10<7>, 1×10<8>, 2×10<8>, 3×10<8>, 4×10<8>, 5×10<8>, 6×10<8>, 7×10<8>, 8×10<8>, 9×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>, 6×10<9>, 7×10<9>, 8×10<9>, 9×10<9>, 1×10<10>, 2×10<10>, 3×10<10>, 4×10<10>, 5×10<10>, 6×10<10>, 7×10<10>, 8×10<10>, 9×10<10>, 1×10<11>, 2×10<11>, 3×10<11>, 4×10<11>, 5×10<11>, 6×10<11>, 7×10<11>, 8×10<11>, 9×10<11>, 1×10<12>, 2×10<12>, 3×10<12>, 4×10<12>, 5×10<12>, 6×10<12>, 7×10<12>, 8×10<12>, 9×10<12>, 1×10<13>, 2×10<13>, 3×10<13>, 4×10<13>, 5×10<13>, 6×10<13>, 7×10<13>, 8×10<13>, i 9×10<13>. U jednom primeru izvođenja, broj TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska u opsegu je od 1×10<6>do 5×10<6>, 5×10<6>do 1×10<7>, 1×10<7>do 5×10<7>, 5×10<7>do 1×10<8>, 1×10<8>do 5×10<8>, 5×10<8>do 1×10<9>, 1×10<9>do 5×10<9>, 5×10<9>do 1×10<10>, 1×10<10>do 5×10<10>, 5×10<10>do 1×10<11>, 5×10<11>do 1×10<12>, 1×10<12>do 5×10<12>, i 5×10<12>do 1×10<13>. U nekim primerima izvođenja, terapijski efikasna doza je oko 1×10<6>, 2×10<6>, 3×10<6>, 4×10<6>, 5×10<6>, 6×10<6>, 7×10<6>, 8×10<6>, 9×10<6>, 1×10<7>, 2×10<7>, 3×10<7>, 4×10<7>, 5×10<7>, 6×10<7>, 7×10<7>, 8×10<7>, 9×10<7>, 1×10<8>, 2×10<8>, 3×10<8>, 4×10<8>, 5×10<8>, 6×10<8>, 7×10<8>, 8×10<8>, 9×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>, 6×10<9>, 7×10<9>, 8×10<9>, 9×10<9>, 1×10<10>, 2×10<10>, 3×10<10>, 4×10<10>, 5×10<10>, 6×10<10>, 7×10<10>, 8×10<10>, 9×10<10>, 1×10<11>, 2×10<11>, 3×10<11>, 4×10<11>, 5×10<11>, 6×10<11>, 7×10<11>, 8×10<11>, 9×10<11>, 1×10<12>, 2×10<12>, 3×10<12>, 4×10<12>, 5×10<12>, 6×10<12>, 7×10<12>, 8×10<12>, 9×10<12>, 1×10<13>, 2×10<13>, 3×10<13>, 4×10<13>, 5×10<13>, 6×10<13>, 7×10<13>, 8×10<13>, i 9×10<13>.
[0211] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska manja je od, npr. 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% ili 0,0001% tež./tež., tež./zapr. ili zapr./zapr. farmaceutske kompozicije.
[0212] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska veća je od, npr. 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19,75%, 19,50%, 19,25% 19%, 18,75%, 18,50%, 18,25% 18%, 17,75%, 17,50%, 17,25% 17%, 16,75%, 16,50%, 16,25% 16%, 15,75%, 15,50%, 15,25% 15%, 14,75%, 14,50%, 14,25% 14%, 13,75%, 13,50%, 13,25% 13%, 12,75%, 12,50%, 12,25% 12%, 11,75%, 11,50%, 11,25% 11%, 10,75%, 10,50%, 10,25% 10%, 9,75%, 9,50%, 9,25% 9%, 8,75%, 8,50%, 8,25% 8%, 7,75%, 7,50%, 7,25% 7%, 6,75%, 6,50%, 6,25% 6%, 5,75%, 5,50%, 5,25%, 5%, 4,75%, 4,50%, 4,25%, 4%, 3,75%, 3,50%, 3,25%, 3%, 2,75%, 2,50%, 2,25%, 2%, 1,75%, 1,50%, 1,25%, 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% ili 0,0001% tež./tež., tež./zapr. ili zapr./zapr. farmaceutske kompozicije.
[0213] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska u opsegu je od oko 0,0001% do oko 50%, oko 0,001% do oko 40%, oko 0,01% do oko 30%, oko 0,02% do oko 29%, oko 0,03% do oko 28%, oko 0,04% do oko 27%, oko 0,05% do oko 26%, oko 0,06% do oko 25%, oko 0,07% do oko 24%, oko 0,08% do oko 23%, oko 0,09% do oko 22%, oko 0,1% do oko 21%, oko 0,2% do oko 20%, oko 0,3% do oko 19%, oko 0,4% do oko 18%, oko 0,5% do oko 17%, oko 0,6% do oko 16%, oko 0,7% do oko 15%, oko 0,8% do oko 14%, oko 0,9% do oko 12% ili oko 1% do oko 10% tež./tež., tež./zapr. ili zapr./zapr. farmaceutske kompozicije.
[0214] U nekim primerima izvođenja, koncentracija TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska u opsegu je od oko 0,001% do oko 10%, oko 0,01% do oko 5%, oko 0,02% do oko 4,5%, oko 0,03% do oko 4%, oko 0,04% do oko 3,5%, oko 0,05% do oko 3%, oko 0,06% do oko 2,5%, oko 0,07% do oko 2%, oko 0,08% do oko 1,5%, oko 0,09% do oko 1 %, oko 0,1% do oko 0,9% tež./tež., tež./zapr. ili zapr./zapr. farmaceutske kompozicije.
[0215] U nekim primerima izvođenja, količina TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska jednaka je ili manja od 10 g, 9,5 g, 9,0 g, 8,5 g, 8,0 g, 7,5 g, 7,0 g, 6,5 g, 6,0 g, 5,5 g, 5,0 g, 4,5 g, 4,0 g, 3,5 g, 3,0 g, 2,5 g, 2,0 g, 1,5 g, 1,0 g, 0,95 g, 0,9 g, 0,85 g, 0,8 g, 0,75 g, 0,7 g, 0,65 g, 0,6 g, 0,55 g, 0,5 g, 0,45 g, 0,4 g, 0,35 g, 0,3 g, 0,25 g, 0,2 g, 0,15 g, 0,1 g, 0,09 g, 0,08 g, 0,07 g, 0,06 g, 0,05 g, 0,04 g, 0,03 g, 0,02 g, 0,01 g, 0,009 g, 0,008 g, 0,007 g, 0,006 g, 0,005 g, 0,004 g, 0,003 g, 0,002 g, 0,001 g, 0,0009 g, 0,0008 g, 0,0007 g, 0,0006 g, 0,0005 g, 0,0004 g, 0,0003 g, 0,0002 g, ili 0,0001 g.
[0216] U nekim primerima izvođenja, količina TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska veća je od 0,0001 g, 0,0002 g, 0,0003 g, 0,0004 g, 0,0005 g, 0,0006 g, 0,0007 g, 0,0008 g, 0,0009 g, 0,001 g, 0,0015 g, 0,002 g, 0,0025 g, 0,003 g, 0,0035 g, 0,004 g, 0,0045 g, 0,005 g, 0,0055 g, 0,006 g, 0,0065 g, 0,007 g, 0,0075 g, 0,008 g, 0,0085 g, 0,009 g, 0,0095 g, 0,01 g, 0,015 g, 0,02 g, 0,025 g, 0,03 g, 0,035 g, 0,04 g, 0,045 g, 0,05 g, 0,055 g, 0,06 g, 0,065 g, 0,07 g, 0,075 g, 0,08 g, 0,085 g, 0,09 g, 0,095 g, 0,1 g, 0,15 g, 0,2 g, 0,25 g, 0,3 g, 0,35 g, 0,4 g, 0,45 g, 0,5 g, 0,55 g, 0,6 g, 0,65 g, 0,7 g, 0,75 g, 0,8 g, 0,85 g, 0,9 g, 0,95 g, 1 g, 1,5 g, 2 g, 2,5, 3 g, 3,5, 4 g, 4,5 g, 5 g, 5,5 g, 6 g, 6,5 g, 7 g, 7,5 g, 8 g, 8,5 g, 9 g, 9,5 g, ili 10 g.
[0217] TIL koji su obezbeđeni u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska efikasni su u širokom opsegu doza. Tačna doza zavisiće od puta primene, oblika u kome se jedinjenje primenjuje, pola i starosti subjekta koji se leči, telesne težine subjekta koji se leči, i preferencija i iskustva postupajućeg lekara. Klinički ustanovljene doze TIL se takođe mogu upotrebljavati ukoliko je prikladno. Količine farmaceutskih kompozicija koje se primenjuju upotrebom postupaka ovde, kao što su doze TIL, zavisiće od čoveka ili sisara koji se leči, ozbiljnosti poremećaja ili stanja, stope primene, dispozicije aktivnih farmaceutskih sastojaka i diskrecionog prava lekara koji propisuje lek.
[0218] U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu primeniti u jednoj dozi. Takva primena može biti injekcijom, npr. intravenskom injekcijom. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu primenjivati u više doza. Doziranje može biti jednom, dvaput, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, ili više od šest puta godišnje. Doziranje može biti jednom mesečno, jednom u dve nedelje, jednom nedeljno ili jednom svakog drugog dana. Primena TIL može se nastaviti koliko god je potrebno.
[0219] U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL je oko 1×10<6>, 2×10<6>, 3×10<6>, 4×10<6>, 5×10<6>, 6×10<6>, 7×10<6>, 8×10<6>, 9×10<6>, 1×10<7>, 2×10<7>, 3×10<7>, 4×10<7>, 5×10<7>, 6×10<7>, 7×10<7>, 8×10<7>, 9×10<7>, 1×10<8>, 2×10<8>, 3×10<8>, 4×10<8>, 5×10<8>, 6×10<8>, 7×10<8>, 8×10<8>, 9×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>, 6×10<9>, 7×10<9>, 8×10<9>, 9×10<9>, 1×10<10>, 2×10<10>, 3×10<10>, 4×10<10>, 5×10<10>, 6×10<10>, 7×10<10>, 8×10<10>, 9×10<10>, 1×10<11>, 2×10<11>, 3×10<11>, 4×10<11>, 5×10<11>, 6×10<11>, 7×10<11>, 8×10<11>, 9×10<11>, 1×10<12>, 2×10<12>, 3×10<12>, 4×10<12>, 5×10<12>, 6×10<12>, 7×10<12>, 8×10<12>, 9×10<12>, 1×10<13>, 2×10<13>, 3×10<13>, 4×10<13>, 5×10<13>, 6×10<13>, 7×10<13>, 8×10<13>, i 9×10<13>. U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL je u opsegu od 1×10<6>do 5×10<6>, 5×10<6>do 1×10<7>, 1×10<7>do 5×10<7>, 5×10<7>do 1×10<8>, 1×10<8>do 5×10<8>, 5×10<8>do 1×10<9>, 1×10<9>do 5×10<9>, 5×10<9>do 1×10<10>, 1×10<10>do 5×10<10>, 5×10<10>do 1×10<11>, 5×10<11>do 1×10<12>, 1×10<12>do 5×10<12>, i 5×10<12>do 1×10<13>.
[0220] U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL je u opsegu od oko 0,01 mg/kg do oko 4,3 mg/kg, oko 0,15 mg/kg do oko 3,6 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 3,2 mg/kg, oko 0,35 mg/kg do oko 2,85 mg/kg, oko 0,15 mg/kg do oko 2,85 mg/kg, oko 0,3 mg do oko 2,15 mg/kg, oko 0,45 mg/kg do oko 1,7 mg/kg, oko 0,15 mg/kg do oko 1,3 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 1,15 mg/kg, oko 0,45 mg/kg do oko 1 mg/kg, oko 0,55 mg/kg do oko 0,85 mg/kg, oko 0,65 mg/kg do oko 0,8 mg/kg, oko 0,7 mg/kg do oko 0,75 mg/kg, oko 0,7 mg/kg do oko 2,15 mg/kg, oko 0,85 mg/kg do oko 2 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 1,85 mg/kg, oko 1,15 mg/kg do oko 1,7 mg/kg, oko 1,3 mg/kg do oko 1,6 mg/kg, oko 1,35 mg/kg do oko 1,5 mg/kg, oko 2,15 mg/kg do oko 3,6 mg/kg, oko 2,3 mg/kg do oko 3,4 mg/kg, oko 2,4 mg/kg do oko 3,3 mg/kg, oko 2,6 mg/kg do oko 3,15 mg/kg, oko 2,7 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 2,8 mg/kg do oko 3 mg/kg, ili oko 2,85 mg/kg do oko 2,95 mg/kg.
[0221] U nekim primerima izvođenja, efikasna doza TIL je u opsegu od oko 1 mg do oko 500 mg, oko 10 mg do oko 300 mg, oko 20 mg do oko 250 mg, oko 25 mg do oko 200 mg, oko 1 mg do oko 50 mg, oko 5 mg do oko 45 mg, oko 10 mg do oko 40 mg, oko 15 mg do oko 35 mg, oko 20 mg do oko 30 mg, oko 23 mg do oko 28 mg, oko 50 mg do oko 150 mg, oko 60 mg do oko 140 mg, oko 70 mg do oko 130 mg, oko 80 mg do oko 120 mg, oko 90 mg do oko 110 mg, ili oko 95 mg do oko 105 mg, oko 98 mg do oko 102 mg, oko 150 mg do oko 250 mg, oko 160 mg do oko 240 mg, oko 170 mg do oko 230 mg, oko 180 mg do oko 220 mg, oko 190 mg do oko 210 mg, oko 195 mg do oko 205 mg, ili oko 198 do oko 207 mg.
[0222] Efikasna količina TIL može se primenjivati bilo u pojedinačnim ili višestrukim dozama bilo kojim od prihvaćenih načina primene agenasa koji imaju slična upotrebna sredstva, uključujući intranazalne i transdermalne puteve, intraarterijskom injekcijom, intravenski, intraperitonealno, parenteralno, intramuskularno, subkutano, topikalno, transplantacijom, ili inhalacijom.
H. Opcione analize vijabilnosti ćelija
[0223] Opciono, test vijabilnosti ćelija može da se izvede posle Koraka B prvog umnožavanja, upotrebom standardnih testova koji su poznati u struci. Na primer, test isključenja sa tripan plavim može da se uradi na uzorku masivnih TIL, koji selektivno obeležava mrtve ćelije i omogućava procenu vijabilnosti. Drugi testovi za upotrebu u testiranju vijabilnosti mogu uključivati, ali nisu ograničeni na test sa alamar plavim; i MTT test.
1. Broj ćelija, vijabilnost, protočna citometrija
[0224] U nekim primerima izvođenja mere se broj ćelija i/ili vijabilnost. Ekspresija markera kao što su ali ne ograničavajući se na CD3, CD4, CD8, i CD56, kao i bilo koje druge koji su ovde objavljeni ili opisani, može se meriti pomoću protočne citometrije sa antitelima, na primer ali ne ograničavajući se na ona koja su komercijalno dostupna od BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) upotrebom FACSCanto<™>protočnog citometra (BD Biosciences). Ćelije se mogu ručno prebrojati upotrebom c-chip hemocitometra za jednokratnu upotrebu (VWR, Batavia, IL) i vijabilnost se može proceniti upotrebom bilo kog postupka koji je poznat u struci, uključujući ali ne ograničavajući se na, tripan plavo bojenje.
[0225] U nekim slučajevima, masivna populacija TIL može se odmah krioprezervirati, upotrebom protokola o kojima se diskutuje u nastavku. Alternativno, masivna populacija TIL može biti podvrgnuta REP i zatim krioprezervirana kao što se diskutuje u nastavku. Slično, u slučaju gde će se genetički modifikovani TIL upotrebljavati u terapiji, populacije masivnih ili REP TIL mogu biti podvrgnute genetičkim modifikacijama za pogodna lečenja.
2. Ćelijske kulture
[0226] U jednom primeru izvođenja, postupak za umnožavanje TIL može uključivati upotrebu oko 5.000 ml do oko 25.000 ml ćelijskog medijuma, oko 5.000 ml do oko 10.000 ml ćelijskog medijuma, ili oko 5.800 ml do oko 8.700 ml ćelijskog medijuma. U jednom primeru izvođenja, uvećanje broja TIL ne upotrebljava više od jednog tipa medijuma za ćelijsku kulturu. Može se upotrebiti bilo koji pogodni medijum za ćelijsku kulturu, npr. ćelijski medijum AIM-V (L-glutamin, 50 μM streptomicin sulfat, i 10 μM gentamicin sulfat) medijum za ćelijsku kulturu (Invitrogen, Carlsbad CA). U tom pogledu, inventivni postupci povoljno redukuju količinu medijuma i broj tipova medijuma koji su potrebni za uvećanje broja TIL. U jednom primeru izvođenja, uvećanje broja TIL može da sadrži dodavanje svežeg medijuma za kulturu ćelija ćelijama (što se takođe označava kao hranjenje ćelija) ne češće od svakog trećeg ili četvrtog dana. Uvećanje broja ćelija u gas-permeabilnom kontejneru pojednostavljuje procedure koje su neophodne za uvećanje broja ćelija redukovanjem učestalosti hranjenja koje je neophodno za umnožavanje ćelija.
[0227] U jednom primeru izvođenja, ćelijski medijum u prvom i/ili drugom gaspermeabilnom kontejneru je nefiltriran. Upotreba nefiltriranog ćelijskog medijuma može da pojednostavi procedure koje su neophodne za uvećanje broja ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelijskom medijumu u prvom i/ili drugom gas-permeabilnom kontejneru nedostaje beta-merkaptoetanol (BME).
[0228] U jednom primeru izvođenja, trajanje postupka sadrži dobijanje uzorka tkiva tumora od sisara; kultivisanje uzorka tkiva tumora u prvom gas-permeabilnom kontejneru koji sadrži ćelijski medijum; dobijanje TIL iz uzorka tkiva tumora; uvećanje broja TIL u drugom gaspermeabilnom kontejneru koji sadrži ćelijski medijum upotrebom aAPC tokom trajanja od oko 14 do oko 42 dana, npr. oko 28 dana.
[0229] U jednom primeru izvođenja, TIL se umnožavaju u gas-permeabilnim kontejnerima. Gas-permeabilni kontejneri se upotrebljavaju za umnožavanje TIL upotrebom postupaka koji upotrebljavaju PBMC, kompozicija, i uređaja koji su poznati u struci, uključujući one koji su opisani u S.A.D. publikaciji patentne prijave br. 2005/0106717 A1, čije su objave ovde uključene kao referenca. U jednom primeru izvođenja, TIL se umnožavaju u gaspermeabilnim kesama. U jednom primeru izvođenja, TIL se umnožavaju upotrebom sistema za umnožavanje ćelija koji umnožava TIL u gas-permeabilnim kesama, kao što je Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, TIL se umnožavaju upotrebom sistema za umnožavanje ćelija koji umnožava TIL u gas-permeabilnim kesama, kao što je WAVE Bioreactor System, takođe poznat kao Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). U jednom primeru izvođenja, sistem za umnožavanje ćelija uključuje gaspermeabilnu ćelijsku kesu sa zapreminom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od oko 100 ml, oko 200 ml, oko 300 ml, oko 400 ml, oko 500 ml, oko 600 ml, oko 700 ml, oko 800 ml, oko 900 ml, oko 1 l, oko 2 l, oko 3 l, oko 4 l, oko 5 l, oko 6 l, oko 7 l, oko 8 l, oko 9 l, i oko 10 l. U jednom primeru izvođenja, TIL se mogu umnožiti u G-Rex flaskovima (komercijalno dostupno od Wilson Wolf Manufacturing). Takvi primeri izvođenja dozvoljavaju da se ćelijske populacije uvećaju sa oko 5×10<5>ćelija/cm<2>na između 10×10<6>i 30×10<6>ćelija/cm<2>. U jednom primeru izvođenja, ovo umnožavanje sprovodi se bez dodavanja svežeg medijuma za ćelijsku kulturu ćelijama (što se takođe označava kao hranjenje ćelija). U jednom primeru izvođenja, ovo je bez hranjenja sve dok se medijum nalazi na visini od oko 10 cm u GRex flasku. U jednom primeru izvođenja ovo je bez hranjenja, ali sa dodavanjem jednog ili više citokina. U jednom primeru izvođenja, citokin se može dodati kao bolus bez potrebe za mešanjem citokina sa medijumom. Takvi kontejneri, uređaji, i postupci poznati su u struci i upotrebljavaju se za umnožavanje TIL, i uključuju one opisane u S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2014/0377739A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2014/210036 A1, S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2013/0115617 A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/188427 A1, S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2011/0136228 A1, S.A.D. patentu br. US 8,809,050 B2, međunarodnoj publikaciji br. WO 2011/072088 A2, S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2016/0208216 A1, S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2012/0244133 A1, međunarodnoj publikaciji br. WO 2012/129201 A1, S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2013/0102075 A1, S.A.D. patentu br. US 8,956,860 B2, međunarodnoj publikaciji br. WO 2013/173835 A1, S.A.D. publikaciji patentne prijave br. US 2015/0175966 A1, čije su objave ovde uključene kao referenca. Takvi procesi su takođe opisani u Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. Opciono genetičko projektovanje TIL
[0230] U nekim primerima izvođenja, TIL se opciono genetički projektuju tako da uključuju dopunske funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, visokoafinitetni T ćelijski receptor (TCR), npr. TCR koji je usmeren na antigen koji je povezan sa tumorom kao što su MAGE-1, HER2, ili NY-ESO-1, ili himerni antigenski receptor (CAR) koji se vezuje za molekul na površini ćelije koji je povezan sa tumorom (npr. mezotelin) ili molekul na površini ćelije koji je ograničen na lozu (npr. CD19).
I. Opciona krioprezervacija TIL
[0231] Kao što je prethodno diskutovano u Koracima A do E, krioprezervacija se može desiti u brojnim tačkama tokom procesa umnožavanja TIL. U nekim primerima izvođenja, masivna populacija TIL posle prvog umnožavanja u skladu sa Korakom B ili umnožena populacija TIL posle jednog ili više drugih umnožavanja u skladu sa Korakom D može biti krioprezervirana. Krioprezervacija se generalno može postići stavljanjem populacije TIL u rastvor za zamrzavanje, npr. 85% komplement inaktiviranog AB seruma i 15% dimetil sulfoksida (DMSO). Ćelije u rastvoru se stavljaju u kriogene bočice i skladište tokom 24 sata na -80 °C, sa opcionim prenošenjem u zamrzivače sa gasovitim azotom radi krioprezervacije. Videti, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u 5% DMSO. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u medijumu ćelijske kulture plus 5% DMSO. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju u skladu sa postupcima koji su obezbeđeni u Primerima 8 i 9.
[0232] Kada je prikladno, ćelije se uklanjaju iz zamrzivača i odmrzavaju u vodenom kupatilu na 37 °C dok se približno 4/5 rastvora ne odmrzne. Ćelije se generalno resuspenduju u kompletnom medijumu i opciono se isperu jednom ili više puta. U nekim primerima izvođenja, odmrznuti TIL se mogu prebrojati i proceniti za vijabilnost kao što je poznato u struci.
J. Fenotipske karakteristike umnoženih TIL
[0233] U nekom primeru izvođenja, TIL se analiziraju za ekspresiju brojnih fenotipskih markera posle umnožavanja, uključujući one koji su opisani ovde i u Primerima. U jednom primeru izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više fenotipskih markera. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle prvog umnožavanja u Koraku B. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se tokom tranzicije u Koraku C. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se tokom tranzicije u skladu sa Korakom C i posle krioprezervacije. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle drugog umnožavanja u skladu sa Korakom D. U nekim primerima izvođenja, fenotipske karakteristike TIL analiziraju se posle dva ili više umnožavanja u skladu sa Korakom D. U nekim primerima izvođenja, marker je odabran iz grupe koja se sastoji od TCRab, CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, marker je odabran iz grupe koja se sastoji od TCRab, CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, i CD8a. U jednom primeru izvođenja, marker je odabran iz grupe koja se sastoji od CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38, i HLA-DR. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, ili četrnaest markera. U nekim primerima izvođenja, ispituje se ekspresija jednog ili više markera iz svake grupe. U nekim primerima izvođenja, održava se ekspresija jednog ili više od HLA-DR, CD38, i CD69 (tj. ne pokazuje statistički značajnu razliku) u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL. U nekim primerima izvođenja, status aktivacije TIL održava se u odmrznutim TIL.
[0234] U jednom primeru izvođenja, meri se ekspresija jednog ili više regulatornih markera. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je odabran iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je odabran iz grupe koja se sastoji od CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, i TIM-3. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je odabran iz grupe koja se sastoji od CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1, i CD154. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornog molekula je smanjena u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, ekspresija regulatornih molekula LAG-3 i TIM-3 je smanjena u odmrznutim TIL u poređenju sa svežim TIL. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ. U nekim primerima izvođenja, nema značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ, i/ili memorijskim markerima u svežim TIL u poređenju sa odmrznutim TIL.
U nekim primerima izvođenja memorijski marker je odabran iz grupe koja se sastoji od CCR7 i CD62L
[0235] U nekim primerima izvođenja, vijabilnost svežih TIL u poređenju sa odmrznutim TIL je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost i svežih i odmrznutih TIL je veća od 70%, veća od 75%, veća od 80%, veća od 85%, veća od 90%, veća od 95%, ili veća od 98%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost i svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 80%, veća od 81%, veća od 82%, veća od 83%, veća od 84%, veća od 85%, veća od 86%, veća od 87%, veća od 88%, veća od 89%, ili veća od 90%. U nekim primerima izvođenja, vijabilnost i svežeg i odmrznutog proizvoda je veća od 86%.
[0236] U jednom primeru izvođenja, restimulisani TIL se takođe mogu proceniti za oslobađanje citokina, upotrebom testova oslobađanja citokina. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu proceniti za sekreciju interferona-7 (IFN-7) kao odgovor na stimulaciju bilo sa OKT3 ili kokulturom sa proizvodom digestije autolognog tumora. Na primer, u primerima izvođenja koji koriste OKT3 stimulaciju, TIL se intenzivno ispiraju, i duplikat bunarići se pripremaju sa 1 × 10<5>ćelija u 0,2 ml CM u pločama sa 96 bunarća sa ravnim dnom koji su prethodno obloženi sa 0,1 ili 1,0 μg/ml OKT3 koji je razblažen u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru. Posle inkubacije preko noći, supernatanti se sakupljaju i IFN-7 u supernatantu se meri pomoću ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Za test kokulture, 1 × 10<5>ćelija TIL se stavlja u ploču sa 96 bunarića sa autolognim ćelijama tumora (odnos 1:1). Posle 24-časovne inkubacije, supernatanti se sakupljaju i oslobađanje IFN-7 se može kvantifikovati, na primer pomoću ELISA.
[0237] Analiza protočnom citometrijom biomarkera ćelijske površine: Uzorci TIL su alikvotirani za analizu protočnom citometrijom markera ćelijske površine, videti, za Primer videti Primere 7, 8, i 9.
[0238] U nekim primerima izvođenja, TIL se procenjuju za različite regulatorne markere. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je odabran iz grupe koja se sastoji od TCR α/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R-, CCR7, CD62L, KLRG1, i CD122. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je TCR α/β. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD56. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD27. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD28. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD57. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD45RA. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD45RO. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD25. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD127. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD95. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je IL-2R-. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CCR7. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD62L. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je KLRG1. U nekim primerima izvođenja, regulatorni marker je CD122.
K. Metaboličko zdravlje umnoženih TIL
[0239] Restimulisani TIL se karakterišu značajnim poboljšanjem bazalne glikolize u poređenju bilo sa sveže sakupljenim TIL i/ili TIL nakon odmrzavanja.
[0240] Rezervni respiratorni kapacitet (SRC) i glikolitička rezerva mogu se proceniti za TIL koji su umnoženi sa aEM3 aAPC u poređenju sa PBMC hraniteljskim. Seahorse XF Cell Mito Stress Test meri mitohondrijalnu funkciju direktnim merenjem stope potrošnje kiseonika (OCR) ćelija, upotrebom modulatora respiracije koji ciljaju komponente elektrontransportnog lanca u mitohondrijima. Test jedinjenja (oligomicin, FCCP, i smeša rotenona i antimicina A, opisani u nastavku) serijski se injektiraju kako bi se izmerila proizvodnja ATP, maksimalna respiracija, i nemitohondrijska respiracija, respektivno. Curenje protona i rezervni respiratorni kapacitet se zatim izračunavaju upotrebom ovih parametara i bazalne respiracije. Svaki modulator cilja specifičnu komponentu elektron-transportnog lanca. Oligomicin inhibira ATP sintazu (kompleks V) i smanjenje OCR nakon injekcije oligomicina je u korelaciji sa mitohondrijalnom respiracijom koja je povezana sa ćelijskom proizvodnjom ATP. Karbonil cijanid-4 (trifluorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) je dekuplujući agens koji urušava protonski gradijent i remeti potencijal mitohondrijalne membrane. Kao rezultat toga, protok elektrona duž elektron-transportnog lanca nije inhibiran i kiseonik se maksimalno troši od strane kompleksa IV. FCCP-stimulisana OCR se zatim može upotrebiti za izračunavanje rezervnog respiratornog kapaciteta, definisanog kao razlika između maksimalne respiracije i bazalne respiracije. Rezervni respiratorni kapacitet (SRC) je mera sposobnosti ćelije da odgovori na povećanu potražnju za energijom. Treća injekcija je smeša rotenona, inhibitora kompleksa I, i antimicina A, inhibitora kompleksa III. Ova kombinacija isključuje mitohondrijalnu respiraciju i omogućava izračunavanje nemitohondrijalne respiracije koju pokreću procesi izvan mitohondrija.
[0241] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je bazalna respiracija. Generalno, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju stopu bazalne respiracije koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije je od oko 50% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije je od oko 60% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije je od oko 70% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije je od oko 80% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije je od oko 90% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, stopa bazalne respiracije je od oko 95% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju stopu bazalne respiracije koja nije statistički značajno različita od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL.
[0242] Generalno, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući, na primer, TIL koji se označavaju kao reREP TIL koji su prošli dopunsko drugo umnožavanje) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet je od oko 50% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet je od oko 50% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet je od oko 60% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet je od oko 70% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet je od oko 80% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet je od oko 90% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, rezervni respiratorni kapacitet je od oko 95% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji nije statistički značajno različit od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL.
[0243] Generalno, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% , najmanje 98%, ili najmanje 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, izmereni metabolički test je glikolitička rezerva. U nekim primerima izvođenja, metabolički test je glikolitička rezerva. U nekim primerima izvođenja, metabolički test je rezervni respiratorni kapacitet. Za merenje ćelijskog (respiratornog) metabolizma ćelije su tretirane sa inhibitorima mitohondrijalne respiracije i glikolize kako bi se odredio metabolički profil za TIL koji se sastoji od sledećih mera: osnovna oksidativna fosforilacija (kao što je izmereno pomoću OCR), rezervni respiratorni kapacitet, početna glikolitička aktivnost (kao što je izmereno pomoću ECAR), i glikolitička rezerva. Metabolički profili su izvedeni upotrebom Seahorse Combination Mitochondrial/Glycolisis Stress Test testa (uključujući komplet koji je komercijalno dostupan od Agilent<®>), koji omogućava određivanje kapaciteta ćelija da izvode glikolizu nakon blokade proizvodnje mitohondrijalnog ATP. U nekim primerima izvođenja, ćelijama se ukida glukoza, zatim se glukoza injektira, nakon čega sledi stres agens. U nekim primerima izvođenja, stres agens je odabran iz grupe koja se sastoji od oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A i/ili 2-dezoksiglukoze (2-DG), kao i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, oligomicin se dodaje u količini od 10 mM. U nekim primerima izvođenja, FCCP se dodaje u količini od 10 mM. U nekim primerima izvođenja, rotenon se dodaje u količini od 2,5 mM. U nekim primerima izvođenja, antimicin A se dodaje u količini od 2,5 mM. U nekim primerima izvođenja, 2-dezoksiglukoza (2-DG) se dodaje u količini od 500 mM. U nekim primerima izvođenja mere se glikolitički kapacitet, glikolitička rezerva, i/ili neglikolitička acidifikacija. Generalno, TIL imaju glikolitičku rezervu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 50% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 60% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 70% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 80% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 90% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 95% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL.
[0244] U nekim primerima izvođenja, metabolički test je bazalna glikoliza. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući, na primer, TIL koji se označavaju kao reREP koji su prošli dopunsko drugo umnožavanje) imaju povećanje bazalne glikolize za najmanje dvostruko, najmanje trostruko, najmanje četvorostruko, najmanje petostruko, najmanje šestostruko, najmanje 7-struko, najmanje osmostruko, najmanje devetostruko, ili najmanje desetostruko. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju povećanje bazalne glikolize od oko dvostruko do oko desetostruko. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju povećanje bazalne glikolize od oko dvostruko do oko osmostruko. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju povećanje bazalne glikolize od oko trostruko do oko sedmostruko. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju povećanje bazalne glikolize od oko dvostruko do oko četvorostruko. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju povećanje bazalne glikolize od oko dvostruko do oko trostruko.
[0245] Generalno, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja, kao što su oni u Koraku D (uključujući, na primer, TIL koji se označavaju kao reREP koji su prošli dopunsko drugo umnožavanje) imaju glikolitičku rezervu koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 50% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 60% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 70% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 80% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 90% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, glikolitička rezerva je od oko 95% do oko 99% stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju rezervni respiratorni kapacitet koji nije statistički značajno različit od stope bazalne respiracije sveže sakupljenih TIL.
[0246] Proizvodnja granzima B: Granzim B je sledeća mera sposobnosti TIL da ubiju ciljne ćelije. Supernatanti medijuma restimulisani kao što je prethodno opisano upotrebom antitela na CD3, CD28, i CD137/4-1BB takođe su procenjeni za nivoe granzima B upotrebom Human Granzyme B DuoSet ELISA kompleta (R & D Systems, Minneapolis, MN) u skladu sa uputstvima proizvođača. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju povećanu proizvodnju granzima B. U nekim primerima izvođenja, TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) imaju povećanu citotoksičnu aktivnost.
[0247] U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci uključuju test za procenu vijabilnosti TIL, upotrebom postupaka kao što je prethodno opisano. U nekim primerima izvođenja, TIL su umnoženi kao što je prethodno diskutovano, uključujući na primer kao što je obezbeđeno na Slici 11. U nekim primerima izvođenja, TIL se krioprezerviraju pre nego što se procenjuju za vijabilnost. U nekim primerima izvođenja, procena vijabilnosti uključuje odmrzavanje TIL pre izvođenja prvog umnožavanja, drugog umnožavanja, i dopunskog drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu ćelijske proliferacije, ćelijske toksičnosti, ćelijske smrti, i/ili drugih termina koji se odnose na vijabilnost populacije TIL. Vijabilnost se može izmeriti bilo kojim od metaboličkih testova TIL koji su prethodno opisani, kao i bilo kojim poznatim postupcima za procenu vijabilnosti ćelija koji su poznati u struci. U nekim primerima izvođenja, predmetni postupci obezbeđuju test za procenu ćelijske proliferacije, ćelijske toksičnosti, ćelijske smrti, i/ili drugih termina koji se odnose na vijabilnost TIL koji su umnoženi upotrebom postupaka koji su ovde opisani, uključujući one koji su pokazani kao primer na Slici 11.
[0248] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje test postupke za određivanje vijabilnosti TIL. Predmetna objava obezbeđuje postupke za testiranje TIL za vijabilnost umnožavanjem tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u veću populaciju TIL koji sadrže:
(i) dobijanje prve populacije TIL koja je prethodno umnožena;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; i
(iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu treća populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno testira za vijabilnost.
[0249] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži:
(iv) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije TIL sa dopunskim IL-2, dopunskim OKT-3, i dopunskim APC, pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila veća populacija TIL nego što je dobijena u koraku (iii), pri čemu veća populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL, i pri čemu se treća populacija dodatno testira za vijabilnost.
[0250] U nekim primerima izvođenja, pre koraka (i), ćelije se krioprezerviraju.
[0251] U nekim primerima izvođenja, ćelije se odmrzavaju pre izvođenja koraka (i).
[0252] U nekim primerima izvođenja, korak (iv) se ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL za analizu.
[0253] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana.
[0254] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana.
[0255] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana.
[0256] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode se unutar oko 44 dana.
[0257] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz koraka (iii) ili (iv) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama.
[0258] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0259] U nekim primerima izvođenja, PBMC se dodaju u ćelijsku kulturu na bilo koji od dana 9 do 17 u koraku (iii).
[0260] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koraku (iv) pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0261] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0262] U nekim primerima izvođenja, APC su veštačke APC (aAPC).
[0263] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0264] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0265] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitelo fuzionisano sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0266] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0267] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost.
[0268] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost posle krioprezervacije.
[0269] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost posle krioprezervacije i posle koraka (iv).
[0270] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak za testiranje TIL za vijabilnost i/ili dodatnu upotrebu u primeni subjektu. Postupak za testiranje tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) može da sadrži:
(i) dobijanje prve populacije TIL;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; i
(iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50-struko veća po broju od druge populacije TIL;
(iv) sakupljanje, ispiranje, i krioprezerviranje treće populacije TIL;
(v) skladištenje krioprezerviranih TIL na kriogenoj temperaturi;
(vi) odmrzavanje treće populacije TIL kako bi se obezbedila odmrznuta treća populacija TIL; i
(vii) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja dela odmrznute treće populacije TIL suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije sa IL-2, OKT-3, i APC tokom perioda reREP od najmanje 3 dana, pri čemu se treće umnožavanje izvodi kako bi se dobila četvrta populacija TIL, pri čemu se broj TIL u četvrtoj populaciji TIL upoređuje sa brojem TIL u trećoj populaciji TIL kako bi se dobio odnos;
(viii) određivanje na osnovu odnosa u koraku (vii) da li je odmrznuta populacija TIL pogodna za primenu pacijentu.
(ix) primenu terapijski efikasne doze odmrznute treće populacije TIL pacijentu kada se odredi da je odnos broja TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (viii).
[0271] U nekim primerima izvođenja, period reREP izvodi se sve dok odnos broja TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji TIL ne bude veći od 50:1.
[0272] U nekim primerima izvođenja, broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu je od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
[0273] U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana. U nekim primerima izvođenja, koraci (i) do (vii) izvode se unutar oko 44 dana.
[0274] U nekim primerima izvođenja, ćelije iz koraka (iii) ili (vii) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama. U nekim primerima izvođenja ćelije su TIL.
[0275] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). U nekim primerima izvođenja, PBMC se dodaju u ćelijsku kulturu na bilo koji od dana 9 do 17 u koraku (iii).
[0276] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koracima (iii) ili (vii) pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija.
[0277] U nekim primerima izvođenja, efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
[0278] U nekim primerima izvođenja, APC su veštačke APC (aAPC).
[0279] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0280] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0281] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitelo fuzionisano sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0282] U nekim primerima izvođenja, korak transdukcije se događa pre koraka (i).
[0283] U nekim primerima izvođenja, TIL se testiraju za vijabilnost posle koraka (vii).
[0284] Predmetna objava takođe obezbeđuje dodatne postupke za testiranje TIL. U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje postupak za testiranje TIL koji sadrži:
(i) dobijanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(ii) odmrzavanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(iii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem dela prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije (APC) tokom perioda reREP od najmanje 3 dana, kako bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se deo iz prve populacije TIL upoređuje sa drugom populacijom TIL kako bi se dobio odnos broja TIL, pri čemu je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći od 5:1;
(iv) određivanje na osnovu odnosa u koraku (iii) da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni pacijentu;
(v) određivanje da je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni kada se odredi da je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u prvoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (iv).
[0285] U nekim primerima izvođenja, odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći je od 50:1.
[0286] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži izvođenje umnožavanja celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) u skladu sa postupcima kao što je opisano u bilo kom od primera izvođenja koji su ovde obezbeđeni.
[0287] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak dodatno sadrži primenu celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) pacijentu.
[0288] U nekim primerima izvođenja, krioprezervirani TIL se odmrzavaju i izvodi se drugo umnožavanje kako bi se odredilo da li se ćelije dovoljno umnožavaju. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 5:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 10:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 15:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 20:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 25:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 30:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 35:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 40:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 45:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu. Ukoliko se ćelije umnože do odnosa od najmanje 5:1, TIL su dovoljno vijabilni za primenu pacijentu.
[0289] Predmetna objava takođe obezbeđuje dodatne postupke za testiranje TIL. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, objava obezbeđuje postupak za testiranje TIL koji sadrži:
(i) dobijanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(ii) odmrzavanje dela prve populacije krioprezerviranih TIL;
(iii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem dela prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujuće ćelije (APC) tokom perioda reREP od najmanje 3 dana, kako bi se proizvela druga populacija TIL, pri čemu se deo iz prve populacije TIL upoređuje sa drugom populacijom TIL kako bi se dobio odnos broja TIL, pri čemu je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći od 5:1;
(iv) određivanje na osnovu odnosa u koraku (iii) da li je prva populacija TIL pogodna za upotrebu u terapijskoj primeni pacijentu; i
(v) terapijsku primenu ostatka prve populacije TIL pacijentu kada se odredi da je odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u prvoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (iv).
[0290] U nekim primerima izvođenja, odnos broja TIL u drugoj populaciji TIL prema broju TIL u delu prve populacije TIL veći je od 50:1.
[0291] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži izvođenje umnožavanja celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) u skladu sa postupcima prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
[0292] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, postupak dodatno sadrži primenu celokupne prve populacije krioprezerviranih TIL iz koraka (i) pacijentu.
[0293] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak procene metaboličkog zdravlja druge populacije TIL.
[0294] U nekim primerima izvođenja, postupak dodatno sadrži korak procene fenotipa druge populacije TIL.
[0295] U nekim primerima izvođenja, antigen-prezentujuće ćelije su alogene mononuklearne ćelije periferne krvi.
L. Postupci lečenja pacijenata
[0296] Postupci lečenja počinju sa inicijalnim sakupljanjem TIL i kulturom TIL. Takvi postupci opisani su i u struci od strane, na primer, Jin et al. (J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292), i kao što su opisani u odeljku Primeri u nastavku.
[0297] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove postupke za generisanje TIL koji nisu prethodno opisani, npr. TIL koji su proizvedeni u skladu sa Koracima A do F. Umnoženi TIL koji su proizvedeni u skladu sa prethodno navedenim Koracima od A do F ili su na drugi način proizvedeni kao što je ovde opisano nalaze posebnu primenu u lečenju pacijenata sa kancerom. Opšti postupci upotrebe TIL za lečenje kancera opisani su u Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, i kao suplementarni sadržaj.) Slično, TIL koji su proizvedeni u skladu sa predmetnim pronalaskom takođe se mogu upotrebljavati za lečenje kancera. U nekim primerima izvođenja, TIL su uzgajane iz reseciranih depozita metastatskog melanoma kao što je prethodno opisano (videti, Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342). Svež tumor se može disekovati u sterilnim uslovima. Reprezentativni uzorak se može sakupiti za formalnu patološku analizu. Pojedinačni fragmenti od 2 mm<3>do 3 mm<3>. U nekim primerima izvođenja dobija se 5, 10, 15, 20, 25 ili 30 uzoraka po pacijentu. U nekim primerima izvođenja dobija se 20, 25, ili 30 uzoraka po pacijentu. U nekim primerima izvođenja dobija se 20, 22, 24, 26, ili 28 uzoraka po pacijentu. U nekim primerima izvođenja dobija se 24 uzorka po pacijentu. Uzorci se mogu staviti u pojedinačne bunariće u ploči sa 24 bunarića, održavati u medijumu za rast sa visokom dozom IL-2 (6.000 IU/ml), i pratiti za destrukciju tumora i/ili proliferaciju TIL. Svaki tumor sa vijabilnim ćelijama koje su preostale posle obrade može se enzimski digestovati u jednu suspenziju ćelija i krioprezervirati, kao što je ovde opisano.
[0298] U nekim primerima izvođenja, umnoženi TIL se mogu uzorkovati za analizu fenotipa (CD3, CD4, CD8, i CD56) i testirati prema autolognom tumoru kada je dostupan. TIL se mogu smatrati reaktivnim ukoliko je kokultura preko noći dala nivoe interferona-gama (IFN-γ) > 200 pg/ml i dvostruku pozadinu. (Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847). U nekim primerima izvođenja, kulture sa dokazom autologne reaktivnosti ili dovoljnim obrascima rasta mogu biti odabrane za drugo umnožavanje (na primer, drugo umnožavanje kao što je obezbeđeno u skladu sa Korakom D sa Slike 11), uključujući druga umnožavanja koja se ponekad označavaju kao brzo umnožavanje (REP). U nekim primerima izvođenja, umnoženi TIL sa visokom autolognom reaktivnošću (na primer, visokom proliferacijom tokom drugog umnožavanja), biraju se za dopunsko drugo umnožavanje. U nekim primerima izvođenja, TIL sa visokom autolognom reaktivnošću (na primer, visokom proliferacijom tokom drugog umnožavanja kao što je obezbeđeno u Koraku D sa Slike 11), biraju se za dopunsko drugo umnožavanje u skladu sa Korakom D sa Slike 11.
[0299] U nekim primerima izvođenja, pacijent se ne premešta direktno na ACT (adoptivni ćelijski transfer), na primer, u nekim primerima izvođenja, posle sakupljanja tumora i/ili prvog umnožavanja, ćelije se ne koriste odmah. U takvim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti 2 dana pre koraka drugog umnožavanja (na primer, u nekim primerima izvođenja, 2 dana pre koraka koji se označava kao REP korak). U takvim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti 2 dana pre koraka drugog umnožavanja (na primer, u nekim primerima izvođenja, 2 dana pre Koraka D kao što je obezbeđeno na Slici 11). Kao što je opisano u različitim primerima izvođenja u predmetnoj prijavi, drugo umnožavanje (uključujući procese koji se označavaju kao REP) upotrebom OKT3 (anti-CD3) antitela (Miltenyi Biotech, San Diego, CA) i IL-2 (3.000 IU/ml; Prometheus, San Diego, CA) u prisustvu ozračenih hraniteljskih ćelija, autolognih kada je to moguće, u odnosu 100:1 (videti, Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342). U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti 5 dana pre koraka drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti 4 dana pre koraka drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti 3 dana pre koraka drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti 2 dana pre koraka drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti 1 dan pre koraka drugog umnožavanja. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu krioprezervirati i odmrznuti neposredno pre koraka drugog umnožavanja.
[0300] Ćelijski fenotipovi krioprezerviranih uzoraka iz infuzione kese sa TIL mogu se analizirati protočnom citometrijom (FlowJo) za površinske markere CD3, CD4, CD8, CCR7, i CD45RA (BD BioSciences), kao i bilo kojim od postupaka koji su ovde opisani. Serumski citokini su izmereni upotrebom standardnih tehnika enzimskog imunosorbent testa. Porast serumskog IFN-g definisan je kao >100 pg/ml i veći od 43 početnog nivoa.
1. Opciono prekondicioniranje pacijenata limfodeplecijom
[0301] Eksperimentalni nalazi ukazuju na to da limfodeplecija pre adoptivnog transfera tumor-specifičnih T limfocita igra ključnu ulogu u poboljšanju efikasnosti lečenja eliminisanjem regulatornih T ćelija i kompetitivnih elemenata imunskog sistema ("ponori citokina"). U skladu sa tim, neki primeri izvođenja pronalaska koriste korak limfodeplecije (ponekad se takođe označava kao "imunosupresivno kondicioniranje") na pacijentu pre introdukcije TIL drugog umnožavanja ili TIL dopunskog drugog umnožavanja (kao što su, na primer, oni koji su opisani u Koraku D sa Slike 11, uključujući TIL koji se označavaju kao reREP TIL) iz pronalaska.
[0302] Generalno, limfodeplecija se vrši upotrebom fludarabina i/ili ciklofosfamida (aktivni oblik se označava kao mafosfamid) i njihovih kombinacija. Takvi postupci su opisani u Gassner et al. (Cancer Immunol Immunother. 2011, 60(1):75-85, Muranski, et al., Nat Clin Pract Oncol., 20063(12):668-681, Dudley, et al., J Clin Oncol 2008, 26:5233-5239, i Dudley, et al., J Clin Oncol.2005, 23(10):2346-2357.
[0303] U nekim primerima izvođenja, fludarabin je u koncentraciji od 0,5 μg/ml -10 μg/ml fludarabina (Sigma-Aldrich, MO, SAD). U nekim primerima izvođenja, fludarabin je u koncentraciji od 1 μg/ml fludarabina (Sigma-Aldrich, MO, SAD). Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje fludarabinom može trajati 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, ili 7 dana ili više. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, fludarabin se može primenjivati u dozi od 10 mg/kg/danu, 15 mg/kg/danu, 20 mg/kg/danu, 25 mg/kg/danu, 30 mg/kg/danu, 35 mg/kg/danu, 40 mg/kg/danu, ili 45 mg/kg/danu. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje fludarabinom može trajati 2-7 dana u dozi od 35 mg/kg/danu. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje fludarabinom može trajati 4-5 dana u dozi od 35 mg/kg/danu. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje fludarabinom može trajati 4-5 dana u dozi od 25 mg/kg/danu.
[0304] U nekim primerima izvođenja, mafosfamid, aktivni oblik ciklofosfamida, je u koncentraciji od 0,5 μg/ml -10 μg/ml. U nekim primerima izvođenja, mafosfamid, aktivni oblik ciklofosfamida, je u koncentraciji od 1 μg/ml. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje ciklofosfamidom može trajati 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, ili 7 dana ili više. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, ciklofosfamid se može primenjivati u dozi od 100 mg/m<2>/danu, 150 mg/m<2>/danu, 175 mg/m<2>/danu, 200 mg/m<2>/danu, 225 mg/m<2>/danu, 250 mg/m<2>/danu, 275 mg/m<2>/danu, ili 300 mg/m<2>/danu. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, ciklofosfamid se može primeniti intravenski (tj. i.v.). Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje ciklofosfamidom može trajati tokom 2-7 dana u dozi od 35 mg/kg/danu. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje ciklofosfamidom može trajati tokom 4-5 dana u dozi od 250 mg/m<2>/danu i.v. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, lečenje ciklofosfamidom može trajati tokom 4 dana u dozi od 250 mg/m<2>/danu i.v.
[0305] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, fludarabin i ciklofosfamid se mogu primenjivati zajedno pacijentu. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, fludarabin se može primenjivati u dozi od 25 mg/m<2>/danu i.v. i ciklofosfamid se može primenjivati u dozi od 250 mg/m<2>/danu i.v. tokom 4 dana.
[0306] Ovaj protokol uključuje primenu fludarabina (25 mg/m<2>/danu i.v.) i ciklofosfamida (250 mg/m<2>/danu i.v.) tokom 4 dana.
2. Primeri izvođenja lečenja koji služe kao primer
[0307] Ovde je objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja kancera sa populacijom tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji sadrži korake (a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora koji je reseciran iz pacijenta; (b) izvođenje inicijalnog umnožavanja prve populacije TIL u prvom medijumu za ćelijsku kulturu kako bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu je druga populacija TIL najmanje 5-struko veća po broju od prve populacije TIL, i pri čemu prvi medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2; (c) izvođenje brzog umnožavanja druge populacije TIL upotrebom populacije mijeloidnih veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (mijeloidne aAPC) u drugom medijumu za ćelijsku kulturu kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50-struko veća po broju od druge populacije TIL posle 7 dana od početka brzog umnožavanja; i pri čemu drugi medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2 i OKT-3; (d) prrimenu terapijski efikasnog dela treće populacije TIL pacijentu sa kancerom, IL-2 može biti prisutan u inicijalnoj koncentraciji od oko 3000 IU/ml i OKT-3 antitelo može biti prisutno u inicijalnoj koncentraciji od oko 30 ng/ml u drugom medijumu za ćelijsku kulturu. Prvo umnožavanje može da se izvede tokom perioda ne dužeg od 14 dana. Prvo umnožavanje može da se izvede upotrebom gas-permeabilnog kontejnera. Drugo umnožavanja može da se izvede upotrebom gas-permeabilnog kontejnera. Odnos druge populacije TIL prema populaciji aAPC u brzom umnožavanju može biti između 1 do 80 i 1 do 400. Odnos druge populacije TIL prema populaciji aAPC u brzom umnožavanju može biti oko 1 do 300. Kancer za lečenje može biti odabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kancera jajnika, kancera grlića materice, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera pluća, kancera mokraćne bešike, kancera dojke, kancera koji je uzrokovan humanim papiloma virusom, kancera glave i vrata, kancera bubrega, i karcinoma bubrežnih ćelija. Kancer za lečenje može biti odabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, kancera jajnika, i kancera grlića materice. Kancer za lečenje može biti melanom. Kancer za lečenje može biti kancer jajnika. Kancer za lečenje može biti kancer grlića materice. Postupak lečenja kancera dodatno sadrži korak lečenja pacijenta režimom nemijeloablativne limfodeplecije pre primene treće populacije TIL pacijentu. Režim nemijeloablativne limfodeplecije sadrži korake primene ciklofosfamida u dozi od 60 mg/m<2>/danu tokom dva dana, nakon čega sledi primena fludarabina u dozi od 25 mg/m<2>/danu tokom pet dana. Režim visoke doze IL-2 sadrži 600.000 ili 720.000 IU/kg aldesleukina, ili njegovog biosimilara ili varijante, koji se primenjuje kao 15-minutna bolusna intravenska infuzija svakih osam sati do tolerancije.
3. Postupci ko-primene
[0308] U nekim primerima izvođenja, TIL koji su proizvedeni kao što je ovde opisano u Koracima od A do F mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim ili više regulatora imunskih kontrolnih tačaka, kao što su antitela koja su opisana u nastavku. Na primer, antitela koja ciljaju PD-1 i koja se mogu ko-primenjivati sa TIL iz predmetnog pronalaska uključuju, npr. ali nisu ograničena na nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo<®>), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 ili MK-3475, Merck; Keytruda<®>), humanizovano anti-PD-1 antitelo JS001 (ShangHai JunShi), monoklonalno anti-PD-1 antitelo TSR-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anti-PD-1 monoklonalno antitelo BGB-A317 (BeiGene), i/ili anti-PD-1 antitelo SHR-1210 (ShangHai HengRui), humano monoklonalno antitelo REGN2810 (Regeneron), humano monoklonalno antitelo MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), i/ili humanizovano anti-PD-1 IgG4 antitelo PDR001 (Novartis). U nekim primerima izvođenja, PD-1 antitelo je iz klona: RMP1-14 (pacovski IgG) - BioXcell kat# BP0146. Druga pogodna antitela koja su pogodna za upotrebu u postupcima ko-primene sa TIL koji su proizvedeni u skladu sa Koracima A do F kao što je ovde opisano su anti-PD-1 antitela koja su objavljena u S.A.D. patentu br. 8,008,449. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo vezuje se specifično za PD-L1 i inhibira njegovu interakciju sa PD-1, čime se povećava imunska aktivnost. Bilo koja antitela koja su poznata u struci koja se vezuju za PD-L1 i ometaju interakciju između PD-1 i PD-L1, i stimulišu antitumorski imunski odgovor, pogodna su za upotrebu u postupcima ko-primene sa TIL koji su proizvedeni u skladu sa Koracima A do F kao što je ovde opisano. Na primer, antitela koja ciljaju PD-L1 i koja su u kliničkim ispitivanjima, uključuju BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) i MPDL3280A (Genentech). Druga pogodna antitela koja ciljaju PD-L1 objavljena su u S.A.D. patentu br. 7,943,743. Neko sa prosečnim iskustvom razumeće da je bilo koje antitelo koje se vezuje za PD-1 ili PD-L1, ometa interakciju PD-1/PD-L1, i stimuliše antitumorski imunski odgovor, pogodno za upotrebu u postupcima ko-primene sa TIL koji su proizvedeni u skladu sa Koracima A do F kao što je ovde opisano. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, subjektu kome je primenjena kombinacija TIL koji su proizvedeni u skladu sa Koracima od A do F može se ko-primeniti i anti-PD-1 antitelo kada pacijent ima tip kancera koji je referektoran na primenu samo anti-PD-1 antitela. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, pacijentu se mogu primenjivati TIL u kombinaciji i sa anti-PD-1 kada pacijent ima refaktorni melanom. Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, pacijentu se mogu primenjivati TIL u kombinaciji i sa anti-PD-1 kada pacijent ima nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC).
4. Adoptivni ćelijski transfer
[0309] Adoptivni ćelijski transfer (ACT) je veoma efikasan oblik imunoterapije i uključuje transfer imunskih ćelija sa antitumorskom aktivnošću u pacijente sa kancerom. ACT je pristup lečenja koji uključuje identifikaciju, in vitro, limfocita sa antitumorskom aktivnošću, in vitro umnožavanje ovih ćelija do velikog broja i njihovu infuziju u domaćina koji ima kancer. Limfociti koji se upotrebljavaju za adoptivni transfer mogu biti poreklom iz strome reseciranih tumora (tumor-infiltrirajući limfociti ili TIL). TIL za ACT se mogu pripremiti kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, TIL se pripremaju, na primer, u skladu sa postupkom koji je opisan na Slici 11. Oni takođe mogu biti poreklom ili iz krvi ukoliko su genetički projektovani da eksprimiraju antitumorske T-ćelijske receptore (TCR) ili himerne antigenske receptore (CAR), obogaćeni mešovitim ćelijskim kulturama limfocita iz tumora (MLTC), ili klonirani upotrebom autolognih antigen-prezentujućih ćelija i peptida koji su poreklom iz tumora. ACT u kome limfociti vode poreklo od domaćina koji ima kancer koji treba da se infuzijom uvede naziva se autologni ACT. S.A.D. publikacija br. 2011/0052530 odnosi se na postupak za izvođenje adoptivne ćelijske terapije za promovisanje regresije kancera, prvenstveno za lečenje pacijenata koji pate od metastatskog melanoma.
[0310] U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu primenjivati kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, TIL se mogu primeniti u jednoj dozi. Takva primena može biti pomoću injekcije, npr. intravenske injekcije. U nekim primerima izvođenja, TIL i/ili citotoksični limfociti mogu se primeniti u više doza. Doziranje može biti jednom, dvaput, tri puta, četiri puta, pet puta, šest puta, ili više od šest puta godišnje. Doziranje može biti jednom mesečno, jednom u dve nedelje, jednom nedeljno, ili jednom svakog drugog dana. Primena TIL-a i/ili citotoksičnih limfocita može se nastaviti koliko god je potrebno.
I. Primeri izvođenja koji služe kao primer
[0311] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za umnožavanje tumorinfiltrirajućih limfocita (TIL) koji sadrži:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora koji je prethodno reseciran iz pacijenta;
(b) izvođenje inicajalnog umnožavanja prve populacije TIL u prvom medijumu za ćelijsku kulturu kako bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu prvi medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2;
(c) izvođenje brzog umnožavanja druge populacije TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100-struko veća po broju od druge populacije TIL; i pri čemu drugi medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se brzo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana;
(d) uklanjanje ćelija iz drugog medijuma za ćelijsku kulturu i opciono krioprezerviranje ćelija u medijumu za skladištenje kako bi se dobila treća populacija ćelija;
(e) opciono odmrzavanje treće populacije ćelija; i
(f) izvođenje drugog brzog umnožavanja treće populacije TIL u trećem medijumu za ćelijsku kulturu, pri čemu treći medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se drugo brzo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana, kako bi se dobila četvrta populacija TIL, pri čemu četvrta populacija ćelija pokazuje povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL; i
(g) opciono, ponavljanje koraka (f) jedan ili više puta.
[0312] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da navedene restimulisane ćelije eksprimiraju CD4, CD8 i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama.
[0313] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da navedeni reREP medijum sadrži mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0314] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da se navedene PBMC dodaju u TIL na bilo koji od dana 9 do 17. U nekim primerima izvođanja, pronalazak obezbeđuje da se navedene PBMC dodaju u TIL na dane 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, i/ili 17.
[0315] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da navedeni reREP medijum sadrži aAPC.
[0316] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da su krioprezervirani TIL transdukovani sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor.
[0317] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da su krioprezervirani TIL transdukovani sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži laki lanac imunoglobulina fuzionisan sa endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
[0318] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, objava obezbeđuje da se restimulisani TIL infuzijom uvode u pacijenta.
[0319] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da korak d) dodatno sadrži uklanjanje ćelija iz drugog medijuma za ćelijsku kulturu.
[0320] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da se korak f) ponavlja dovoljan broj puta kako bi se dobilo dovoljno TIL za terapijsku dozu navedenih TIL.
[0321] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje populaciju restimulisanih TIL koji su napravljeni u skladu sa postupcima koji su prethodno i ovde opisani.
[0322] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje populaciju restimulisanih TIL koji su napravljeni u skladu sa postupkom iz patentnog zahteva 1, pri čemu navedeni restimulisani TIL imaju najmanje dvostruko povećanje bazalne glikolize u poređenju sa navedenim odmrznutim krioprezerviranim TIL.
[0323] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koji sadrži merenje bazalne glikolize navedenih ćelija.
[0324] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koji sadrži merenje bazalne respiracije navedenih ćelija.
[0325] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koji sadrži merenje rezervnog respiratornog kapaciteta (SRC) navedenih ćelija.
[0326] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koji sadrži merenje glikolitičke rezerve navedenih ćelija.
[0327] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, objava obezbeđuje postupak lečenja kancera kod pacijenta sa populacijom tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji sadrži korake:
a) dobijanje primarne populacije TIL od navedenog pacijenta;
b) brzo umnožavanje navedene primarne populacije TIL kako bi se formirala umnožena populacija TIL;
c) krioprezerviranje navedene umnožene populacije kako bi se formirala krioprezervirana populacija TIL;
d) odmrzavanje navedene krioprezervirane populacije TIL;
e) kultivisanje navedene krioprezervirane populacije TIL u medijumu koji sadrži IL-2 i anti-CD3 antitelo kako bi se formirala reREP populacija TIL; i
f) primenu terapijski efikasne količine reREP TIL ćelija navedenom pacijentu.
[0328] Takođe je ovde objavljeno ali se ne zahteva patentna zaštita, objava obezbeđuje postupak za umnožavanje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji sadrži:
(a) dobijanje prve populacije TIL iz tumora koji je reseciran iz pacijenta;
(b) izvođenje inicajalnog umnožavanja prve populacije TIL u prvom medijumu za ćelijsku kulturu kako bi se dobila druga populacija TIL, pri čemu prvi medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2;
(c) izvođenje brzog umnožavanja druge populacije TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100-struko veća po broju od druge populacije TIL; i pri čemu drugi medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se brzo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana;
(d) uklanjanje ćelija iz drugog medijuma za ćelijsku kulturu i opciono krioprezerviranje ćelija u medijumu za skladištenje kako bi se dobila treća populacija ćelija;
(e) opciono odmrzavanje treće populacije ćelija;
(f) izvođenje drugog brzog umnožavanja treće populacije TIL u trećem medijumu za ćelijsku kulturu, pri čemu treći medijum za ćelijsku kulturu sadrži IL-2, OKT-3, i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), pri čemu se drugo brzo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana, kako bi se dobila četvrta populacija TIL, pri čemu četvrta populacija ćelija pokazuje povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL; i
(g) primenu terapijski efikasne količine reREP TIL ćelija navedenom pacijentu.
[0329] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da korak d) dodatno sadrži uklanjanje ćelija iz drugog medijuma za ćelijsku kulturu.
[0330] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje da se korak f) ponavlja dovoljan broj puta kako bi se dobilo dovoljno TIL za terapijsku dozu navedenih TIL.
PRIMERI
PRIMER 1: PROTOKOL RESTIMULACIJE
[0331] Kao što je ovde diskutovano, protokol i test restimulacije razvijeni su korišćenjem restimulacije svežeg antigena nakon sakupljanja ili odmrzavanja TIL koje su uzgajane u REP.
[0332] Svrha ovog primera bila je da se testira proliferacija/umnožavanje tumor-infiltrirajućih limfocita nakon REP u testu restimulacije. TIL nakon REP (TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) restimulisani su sa alogenim PBMC hraniteljskim ćelijama, anti-CD3 (klon OKT3) antitelom, i interleukinom-2 (IL-2). Vijabilne ćelije su izbrojane na Dan 7 i rezultat brojanja je zabeležen.
[0333] TIL nakon REP (TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) infuzijom su uvedeni u pacijente koji su prethodno bili limfodepletirani kako bi se olakšalo preživljavanje i umnožavanje TIL in vivo. Kada su TIL infuzijom ponovo uvedeni u pacijenta, naišli su na antigen, što je rezultovalo aktivacijom TIL, ali su TIL na kraju bili kratkoživeći. Restimulacija TIL preko kontakta antigena zajedno sa izlaganjem IL-2 tokom ACT može rezultovati proliferacijom TIL i kontrolom tumora ili može dovesti do delecije putem apoptoze (aktivacijom indukovane ćelijske smrti) ili indukcije neproliferativnog (anergičnog) stanja usled nedostatka odgovarajuće kostimulacije. Bez vezivanja teorijom, restimulacija TIL nakon REP (restimulacija, na primer TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) sa alogenim PBMC hraniteljskim ćelijama može da oponaša in vivo proces obezbeđivanjem stimulacije antigena i neophodnih citokina za umnožavanje TIL. TIL nakon REP (TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) aktivirani su preko membranskih receptora na hraniteljskim MNC koji se vezuju za anti-CD3 (klon OKT3) antitela i unakrsno povezuju sa TIL u REP flasku, stimulišući TIL da se umnože.
Proliferacija/umnožavanje tumor-infiltrirajućih limfocita nakon REP u testu restimulacije
[0334] TIL nakon REP (TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) restimulisane su sa alogenim PBMC hraniteljskim ćelijama, anti-CD3 (klon OKT3) antitelom, i interleukinom-2 (IL-2). Vijabilne ćelije su izbrojane na Dan 7 i rezultat brojanja je zabeležen.
[0335] U nekim primerima izvođenja, ova procedura se takođe može primeniti za testiranje ili validaciju trenutnog REP protokola.
Tabela 3: DEFINICIJE I SKRAĆENICE
Tabela 4: Materijali
Tabela 5: UZORCI
[0336] TIL nakon REP (TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) infuzijom su uvedeni u pacijente koji su prethodno bili limfodepletirani kako bi se olakšalo preživljavanje i umnožavanje TIL in vivo. Kada su TIL ponovo infuzijom uvedeni u pacijenta, naišli su na antigen, što je rezultovalo aktivacijom TIL, ali su TIL na kraju bili kratkoživeći. Restimulacija TIL preko kontakta antigena zajedno sa izlaganjem IL-2 tokom ACT može rezultovati proliferacijom TIL i kontrolom tumora ili može dovesti do delecije putem apoptoze (aktivacijom indukovane ćelijske smrti) ili indukcije neproliferativnog (anergičnog) stanja usled nedostatka odgovarajuće kostimulacije. Naša hipoteza je bila da je restimulacija TIL nakon REP sa alogenim PBMC hraniteljskim ćelijama oponašala in vivo proces obezbeđivanjem stimulacije antigena i neophodnih citokina za umnožavanje TIL. TIL nakon REP aktivirani su preko membranskih receptora na hraniteljskim MNC koji se vezuju za anti-CD3 (klon OKT3) antitela i unakrsno povezuju sa TIL u REP flasku, stimulišući TIL da se umnože.
PROCEDURA
[0337] Bilo sveži TIL nakon REP (TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) ili zamrznuti TIL nakon REP (TIL nakon Koraka D u skladu sa Slikom 11) koji su odmrznuti, isprani su jednom u CM1 medijumu. Re-REP (ponavljanje Koraka D u skladu sa Slikom 11) postavljeno je u ploču za kulturu tkiva sa 24 bunarića sa 2 × 10<6>MNC hraniteljskih ćelija, 30 ng/ml OKT3, 1 × 10<4>TIL nakon REP plus 3.000 IU/ml rhIL-2 u CM2. Kulture su inkubirane tokom sedam dana u inkubatoru sa povećanim procentom vlažnosti sa 5% CO2, 37 °C u kom trenutku su izdvojene vijabilne ćelije i određena je vijabilnost. Višestrukost umnožavanja TIL izračunata je na osnovu broja vijabilnih ćelija.
ReREP - Dan 0
Priprema TIL
[0338] TIL su dobijeni od svežih nakon REP ili zamrznutih nakon REP. Kulture TIL su uklonjene iz inkubatora i prebačene u BSC. Zatim je uklonjeno 200 μl radi brojanja ćelija upotrebom Cellometer K2. Rezultati brojanja su zabeleženi.
Priprema hraniteljskih ćelija
[0339] Za ovaj protokol bilo je potrebno minimum 20 × 10<6>hraniteljskih ćelija. Svaka bočica od 1 ml zamrznuta od strane SDBB imala je 100 × 10<6>vijabilnih ćelija nakon zamrzavanja. Pod pretpostavkom oporavka od 50% nakon odmrzavanja iz LN2 skladišta, preporučeno je da se odmrznu najmanje dve bočice hraniteljskih ćelija po seriji dajući procenjenih 100 × 10<6>vijabilnih ćelija za svaki REP. Pre odmrzavanja hraniteljskih ćelija, prethodno je zagrejano približno 50 ml CM2 bez rhIL-2 za svaku hraniteljsku seriju koja je testirana. Označene bočice sa hraniteljskim serijama izvađene su iz LN2 skladišta i stavljene na led. Bočice su prebačene u prostoriju za kulturu tkiva. Bočice su odmrznute u vodenom kupatilu na 37 °C. Bočice su prebačene u BSC i poprskane ili obrisane sa 70% EtOH ili IPA. Upotrebom pipete za prebacivanje, sadržaj hraniteljskih bočica je odmah prebačen u 50 ml toplog CM2 u konusnoj epruveti od 50 ml. Uklonjeno je 200 μl radi brojanja ćelija upotrebom Cellometer K2. Rezultati brojanja su zabeleženi. Ćelije su centrifugirane na 350 × g tokom 10 minuta. Supernatant i resuspendovane ćelije su aspirirane u željenoj zapremini pri 2 × 10<6>ćelija/ml u toplom CM2 plus 3000 IU/ml rhIL-2.
Priprema CM2 3000 IU/ml radnog rastvora
[0340] Pripremljena je dovoljna količina CM2 za potrebne uslove. Svaki bunarić je sadržao 2 ml CM2. Svaki bunarić je suplementovan CM2 sa 3000 IU/ml rhIL-2. Od štoka od 6 × 10<6>IU/ml, bilo je potrebno 50 μl za svakih 100 ml CM2.
Priprema MACS<®>GMP CD3 čistog (OKT3) radnog rastvora
[0341] Štok rastvor OKT3 (1 mg/ml) izvađen je iz frižidera koji je podešen na 4 °C. Krajnja koncentracija od 30 ng/ml OKT3 upotrebljena je u REP.60 ng OKT3 bilo je potrebno za 2 ml CM2 medijuma u svakom od 24 bunarića. TIL Hraniteljske, TIL sami i Hraniteljske same uslovi su kultivisani u triplikatu. Za svaku testiranu hraniteljsku seriju, napravljeno je 1000 μl 1:1000 razblaženja od 1 mg/ml OKT3 za radnu koncentraciju od 1 μg/ml (1000 ng/ml). Za 9 bunarića, 1000 μl 1:1000 razblaženja od 1 mg/ml OKT3. Napravljeno je 1 μl 1 mg/ml OKT3 999 μl CM2 sa 3000 IU/ml IL-2.
Priprema ploče sa 24 bunarića i kokultura
[0342] Svaki reREP koji je testiran zahtevao je 9 bunarića ploče sa 24 bunarića.
[0343] Svaka ploča je obeležena nazivom eksperimenta, brojem hraniteljske serije, oznakom TIL nakon REP, datumom, i inicijalima operatera. Svaka ploča je napunjena sa komponentama kao što je nabrojano u Tabeli 8. Svaka komponenta je dodata i svaki bunarić je napunjen sa ukupno 2 ml i ploče su stavljene u inkubator na 37 °C. Ploče su pažljivo mešane 3 puta upotrebom pipete od 1 ml.
Tabela 6: Postavka REP u ploči sa 24 bunarića
Zamena medijuma - Dan 5
[0344] CM2 je pripremljen sa 3000 IU/ml rhIL-2. Bilo je potrebno 10 ml. 1 ml medijuma je uklonjen iz svakog bunarića i odbačen. Sa pipetom od 1 ml, 1 ml toplog CM2 sa 3000 IU/ml rhIL-2 prebačen je u svaki bunarić. Ploče su vraćene u inkubator.
Sakupljanje - Dan 7
[0345] Upotrebom serološke pipete od 1 ml, svaki bunarić je promešan kako bi se razbile nakupine ćelija. Posle temeljnog mešanja suspenzije ćelija pipetiranjem, uklonjeno je 200 μl radi brojanja ćelija upotrebom Cellometer K2. Svi uslovi su prebrojani i rezultati brojanja su zabeleženi za TIL Hraniteljske OKT3, TIL OKT3, i HRANITELJSKE OKT3.
[0346] Pored reREP sa 24 bunarića, odvojeni reREP su postavljeni u 4 uspravna flaska za kulturu tkiva T25 sa 1,3 × 10<7>MNC hraniteljskih ćelija, 30 ng/ml OKT3, 0,65 × 10<5>pre-REP TIL plus 3,000 IU/ml rhIL-2 u CM2. Napomena: Molimo pogledati Procenu ozračenih alogenih hraniteljskih ćelija za protokol brzog umnožavanja LN-144 (Primer 6).
[0347] Alokacija ćelija za funkcionalne testove:
Tabela 7: Test
PROCENA/KRITERIJUMI ZA PRIHVATANJE
[0348]
Tabela 8: Upotrebljeni kriterijumi za prihvatanje
Referentne procedure - Uključene u Primere u nastavku
[0349]
Tabela 9: Referentne procedure
PRIMER 2: ODREĐIVANJE BROJA ĆELIJA I VIJABILNOSTI KULTURA TIL UPOTREBOM CELLOMETER K2 BROJAČA ĆELIJA
[0350] Ovaj Primer obezbeđuje primere uputstava o tome kako je sproveden rad Cellometer K2 Image Cytometer automatskog brojača ćelija.
[0351] Obim: Određivanje ukupnog broja ćelija i vijabilnosti ćelijskih kultura.
Tabela 10. Definicije
PROCEDURA
Priprema suspenzije ćelija
Priprema tripan plavog
[0352] Krajnja koncentracija tripan plavog bila je 0,1%. Proizvođač je preporučio pripremu štok rastvora od 0,2%. Kada se upotrebljava tripan plavo na Cellometer K2, štok (0,4%) je razblažen sa PBS na 0,2%. Tripan plavo je filtrirano pomoću filtera od 0,2-0,4 mikrona i alikvotirano u malim zapreminama u obeležene epruvete sa poklopcem. Suspenzija ćelija je pomešana u odnosu 1:1 sa 0,2% tripan plavog.
Priprema AOPI
[0353] Kada se upotrebljava AOPI na Cellometer K2, dobijen je rastvor AOPI. Uzorci ćelija su obojeni pri 1:1 sa rastvorom AOPI. NAPOMENA: Prilikom brojanja visoke koncentracije kultura, uzorci ćelija su razblaženi u medijumu za ćelijsku kulturu pre krajnjeg razblaženja 1:1 sa tripan plavim ili AOPI. Opseg brojanja koji je predložio proizvođač upotrebljen je za određivanje najboljeg razblaženja za upotrebu.
Podešavanje Cellometer K2
[0354] Oprema Cellometer K2 je uključena. Ikona Cellometer Image Cytometer je odabrana na povezanom monitoru računara. Na glavnom ekranu softvera odabran je jedan od testova koji su navedeni u padajućem meniju. Prilikom odabira odgovarajućeg testa, tip ćelije i režim snimka se sami popunjavaju. U odeljku "Uzorak" kliknuto je na Podesi korisnika/ID uzorka (Set User/Sample ID) kako bi se otvorio drugi ekran za unos operaterovih informacija za uzorak. Unet je "ID korisnika". Ovo se sastojalo od troslovnog inicijala korisnika. Unet je "ID uzorka". ID uzorka je izveden iz dolaznih informacija o uzorku.
Podešavanje parametara razblaženja
[0355] Kada nije napravljeno nijedno drugo razblaženje pored 1:1 smeše, faktor razblaženja bio je 2. Kada je razblaženje napravljeno pre konačne 1:1 smeše, faktor razblaženja bio je 2 puta veći od prethodnog razblaženja. Faktor razblaženja je ažuriran u skladu sa smešom koja je upotrebljena.
Brojanje ćelija
[0356] Plastična podloga je uklonjena sa obe strane Cellometer pločice sa komorama za brojanje (SD100) i stavljena je na čistu maramicu bez dlačica. Pošto je pripremljena suspenzije ćelija, mali alikvot uzorka je uklonjen i prebačen u bunarić ploče za kulturu ćelija sa više bunarića ili epruvetu. Prilikom razblaživanja uzorka, razblaživanje je izvedeno upotrebom medijuma za ćelijsku kulturu. 20 μl suspenzije ćelija dodato je u bunarić ploče za kulturu ćelija sa više bunarića ili epruvetu.20 μl 0,2% rastvora tripan plavog ili AOPI dodato je u 20 μl suspenzije ćelija i uzorak je temeljno promešan. Izmereno je 20 μl 1:1 rastvora i prebačeno u jednu stranu komore za brojanje. NAPOMENA: Izbegnuto je dodirivanje prozirnog dela pločice. Po potrebi, uzorci su ponovljeni na drugoj strani pločice. Komora je insertovana u prorez na prednjoj strani Cellometer. Za brojanje AOPI ćelija, "Pregled (Preview) F1" je odabran na glavnom ekranu za pregled zelenog fluorescentnog snimka (žive ćelije). Za tripan plavo brojanje, odabrano je "Pregled svetlih polja". Zavrtanj za fokusiranje je upotrebljen za dovođenje slike u optimalan fokus. Ćelije su imale svetao centar i jasno definisanu ivicu. "Brojanje" je odabrano da se započne proces brojanja. Rezultati su bili prikazani u iskačućem prozoru sa rezultatima brojanja na ekranu računara koji je pokazao rezultate procesa brojanja.
PRIMER 3: CELLOMETER IC2 IMAGE CYTOMETER AUTOMATSKI BROJAČ ĆELIJA
[0357] Ovaj Primer opisuje proceduru za rad Cellometer K2 Image Cytometer automatskog brojača ćelija.
1. Definicije
[0358]
μl Mikrolitar
AOPI Akridin oranž propidijum jodid
BSC Laminarna komora
DPBS Dulbekov fosfatom puferisani fiziološki rastvor
ml Mililitar
MNC Mononuklearne ćelije krvi
NA Nije primenljivo
PBMC Mononuklearne ćelije periferne krvi
PPE Lična zaštitna oprema
Pre-REP Inicijalne kulture TIL pre protokola brzog umnožavanja kulture
REP Protokol brzog umnožavanja
TIL Tumor-infiltrirajući limfociti
7. Procedura
[0359]
7.1 Priprema suspenzije ćelija
7.1.1 Priprema tripan plavog
Krajnja koncentracija tripan plavog bila je 0,1%. Proizvođač je preporučio pripremu štok rastvora od 0,2%.
7.1.1.1 Kada se upotrebljava tripan plavo na Cellometer K2, štok (0,4%) je razblažen sa PBS do 0,2%.
7.1.1.2 Tripan plavo je filtrirano pomoću filtera od 0,2-0,4 mikrona i alikvotirano u malim zapreminama u obeležene epruvete sa poklopcem. 7.1.1.3 Suspenzija ćelija je pomešana na 1:1 sa 0,2% tripan plavog.
7.1.2 Priprema AOPI
7.1.2.1 Kada se upotrebljava AOPI na Cellometer K2, dobijen je rastvor AOPI.
7.1.2.2 Uzorak ćelija je obojen pri 1:1 sa rastvorom AOPI.
NAPOMENA: Kada su brojane visoke koncentracije kultura, uzorci ćelija su razblaženi u medijumu za ćelijsku kulturu pre krajnjeg razblaženja 1:1 sa tripan plavim ili AOPI.
Opseg brojanja koji je predložio proizvođač upotrebljen je za određivanje najboljeg razblaženja za upotrebu.
dešavanje Cellometer K2
7.2.1 Oprema Cellometer K2 je uključena.
7.2.2 Ikona Cellometer Image Cytometer je odabrana na povezanom monitoru računara.
7.2.3 Na glavnom ekranu softvera odabran je jedan od testova koji su navedeni u padajućem meniju.
7.2.3.1 Kada je odabran odgovarajući test, tip ćelije i režim snimka sami su se popunili.
7.2.3.2 U odeljku "Uzorak" odabran je Podesi korisnika/ID uzorka kako bi se otvorio drugi ekran za unos operaterovih informacija za uzorak.
7.2.3.2.1 Unet je "ID korisnika".
7.2.3.2.2 Unet je "ID uzorka". ID uzorka je izveden iz dolaznih informacija o uzorku.
7.2.3.3 Podešeni su parametri razblaženja.
7.2.3.3.1 Kada nije napravljeno nijedno drugo razblaženje pored 1:1 smeše, faktor razblaženja bio je 2.
7.2.3.3.2 Kada je razblaženje napravljeno pre konačne 1:1 smeše, faktor razblaženja bio je 2 puta veći od prethodnog razblaženja.
7.2.3.3.3 Faktor razblaženja je ažuriran u skladu sa smešom koja je upotrebljena u odeljku razblaženje na ekranu. Odabrana je ikona olovke kako bi se podigli ekrani za dijalog.
7.2.3.3.4 Verifikovano je da su odeljci F1 snimka i F2 snimka međusobno identični.
7.2.3.3.5 Dugme "Sačuvaj" je odabrano pošto je podešavanje završeno.
ojanje ćelija
7.3.1 Plastična podloga je uklonjena sa obe strane Cellometer pločice sa komorama za brojanje (SD100) i stavljena je na čistu maramicu bez dlačica.
7.3.2 Pošto je pripremljena suspenzija ćelija, mali alikvot uzorka je uklonjen i prebačen u bunarić ploče za kulturu ćelija sa više bunarića ili epruvetu.
7.3.3 Kada je uzorak razblažen, razblaživanje je izvedeno upotrebom medijuma za ćelijsku kulturu.
7.3.4 20 μl suspenzije ćelija dodato je u bunarić ploče za kulturu ćelija sa više bunarića ili epruvetu.
7.3.5 20 μ1 0,2% rastvora tripan plavog ili AOPI dodato je u 20 μl suspenzije ćelija i uzorak je temeljno promešan.
7.3.6 Izmereno je 20 μl 1:1 rastvora i prebačeno u jednu stranu komore za brojanje.
NAPOMENA: Izbegnuto je dodirivanje prozirnog dela pločice.
7.3.7 Po potrebi, uzorci su ponovljeni na drugoj strani pločice 7.3.8. Komora je insertovana u prorez na prednjoj strani Cellometer.
7.3.8 Za brojanje AOPI ćelija, "Pregled F1" je odabran na glavnom ekranu za pregled zelenog fluorescentnog snimka (žive ćelije). Za tripan plavo brojanje, odabrano je "Pregled svetlih polja".
7.3.9 Zavrtanj za fokusiranje je upotrebljen za dovođenje slike u optimalan fokus. Ćelije su imale svetao centar i jasno definisanu ivicu.
7.3.10 "Brojanje" je odabrano da se započne proces brojanja.
7.3.11 Rezultati su bili prikazani u iskačućem prozoru sa rezultatima brojanja na ekranu računara koji je pokazao rezultate procesa brojanja.
PRIMER 4: PRIPREMA ŠTOK RASTVORA IL-2 (CELLGENIX)
[0360] Ovaj Primer opisuje primer procedure pripreme štok rastvora IL-2. Definicije/Skraćenice
[0361]
μl: mikrolitar ili μl
BSC: Laminarna komora
BSL2: Biološka bezbednost nivo 2
D-PBS: Dulbekov fosfatom puferisani fiziološki rastvor
G: Veličina igle
GMP: Dobra proizvodna obrada
HAc: Sirćetna kiselina
HSA: Humani serumski albumin
ml: Mililitar
NA: Nije primenljivo
PPE: Lična zaštitna oprema
rhIL-2; IL-2: Rekombinantni humani interleukin-2
COA: Sertifikat analize
6. Procedura
6.1 Pripremljen je 0,2% rastvor sirćetne kiseline (HAc).
6.1.1 Prebačeno je 29 ml sterilne vode u konusnu epruvetu od 50 ml.
6.1.2 Dodat je 1 ml 1 N sirćetne kiseline u konusnu epruvetu od 50 ml.
6.1.3 Dobro je promešano izvrtanjem epruvete 2-3 puta.
6.1.4 Rastvor HAc je sterilisan pomoću filtracije upotrebom Steriflip filtera.
6.1.5 Rastvor je zatvoren, datiran i obeležen kao "Sterilni 0,2% rastvor sirćetne kiseline".
6.1.6 Rok upotrebe rastvora ističe posle 2 meseca. Skladišten je na sobnoj temperaturi.
6.2 Pripremljen je 1% HSA u PBS.
6.2.1 Dodato je 4 ml 25% štok rastvora HSA u 96 ml PBS u sterilnoj filterskoj jedinici od 150 ml.
6.2.2 Rastvor je filtriran.
6.2.3 Rastvor je zatvoren, datiran i obeležen kao "1% HSA u PBS".
6.2.4 Rok upotrebe rastvora ističe posle 2 meseca. Skladišten je na 4 °C.
6.3 Dokumentovana je svaka bočica rhIL-2 koja je pripremljena.
6.4 Pripremljen je štok rastvor rhIL-2 (krajnja koncentracija 6×10<6>IU/ml)
6.4.1 Svaka serija rhIL-2 je bila drugačija i potrebne informacije se nalaze u proizvođačkom sertifikatu analize (COA), kao što su:
6.4.1.1 Masa rhIL-2 po bočici (mg)
6.4.1.2 Specifična aktivnost rhIL-2 (IU/mg)
6.4.1.3 Preporučena zapremina 0,2% HAc za rekonstituciju (ml)
6.4.2 Izračunata je zapremina 1% HSA koja je potrebna za seriju rhIL-2 upotrebom jednačine u nastavku:
6.4.2.1 Na primer, u skladu sa CellGenix serijom rhIL-2 10200121 COA, specifična aktivnost za bočicu od 1 mg bila je 25×10<6>IU/mg. To preporučuje rekonstituisanje rhIL-2 u 2 ml 0,2% HAc.
6.4.3 Gumeni čep bočice sa IL-2 obrisan je alkoholnom maramicom.
6.4.4 Upotrebom 16G igle pričvršćene za špric od 3 ml, injektirana je preporučena zapremina 0,2% HAc u bočicu. Vodilo se računa da se čep ne pomeri dok je igla izvlačena.
6.4.5 Bočica je izvrnuta 3 puta i kovitlana dok se sav prah nije rastvorio. 6.4.6 Čep je pažljivo uklonjen i ostavljen na alkoholnu maramicu.
6.4.7 Dodata je izračunata zapremina 1% HSA u bočicu.
6.4.8 Bočica je zatvorena gumenim čepom.
6.5 Skladištenje rastvora rhIL-2
6.5.1 Za kratkotrajno skladištenje (<72 sata), bočice su skladištene na 4 °C.
6.5.2 Za dugotrajno skladištenje (>72 sata), bočica je alikvotirana u manje zapremine i skladištena u kriobočicama na -20 °C dok nije bila spremna za upotrebu. Izbegnuti su ciklusi zamrzavanja/odmrzavanja. Rok upotrebe ističe 6 meseci posle datuma pripreme.
6.5.3 Rh-IL-2 etikete su uključivale prodavca i kataloški broj, broj serije, rok trajanja, inicijale operatera, koncentraciju i zapreminu alikvota.
PRIMER 5: PRIPREMA MEDIJUMA ZA PRE-REP I REP PROCESE
[0363] Ovaj Primer opisuje proceduru za pripremu medijuma za kulturu tkiva za upotrebu u protokolima koji uključuju kulturu tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) koji su poreklom iz različitih tipova tumora uključujući, ali ne ograničavajući se na, metastatski melanom, karcinom pločastih ćelija glave i vrata, karcinom jajnika, trostruko negativni karcinom dojke, i adenokarcinom pluća. U mnogim slučajevima, ovaj medijum je upotrebljen za pripremu bilo kojih od TIL koji su opisani u predmetnoj prijavi i Primerima.
[0364] Definicije
μg mikrogram
μm mikrometar
μM mikromolarni
AIM-V<®>medijum za kulturu tkiva bez seruma (Thermo Fisher Scientific)
BSC Laminarna komora
CM1 Kompletni medijum #1
CM2 Kompletni medijum #2
CM3 Kompletni medijum #3
CM4 Kompletni medijum #4
IU ili U Međunarodne jedinice
ml mililitar
mM milimolarni
NA nije primenljivo
PPE lična zaštitna oprema
Pre-REP Pre procesa brzog umnožavanja
REP Proces brzog umnožavanja
rhIL-2, IL-2 rekombinantni humani interleukin-2
RPMI1640 Medijum Roswell Park Memorial Institute, formulacija 1640
SOP Standardna operativna procedura
TIL tumor-infiltrirajući limfociti
7. Procedura
[0365]
7.1 Sve procedure su urađene upotrebom sterilne tehnike u BSC (Klasa II, Tip A2).
7.1.1 Površina laminara je poprskana sa 70% etanolom pre upotrebe.
7.1.2 Svi predmeti i reagensi su poprskani sa 70% etanolom pre nego što su stavljeni u laminar za kulturu tkiva.
7.2 Alikvotiranje 200 mM L-glutamina
7.2.1 L-glutamin je isporučen u većim zapreminama nego što je potrebno za pripremu seruma (npr. 100 ml ili 500 ml zapremine).
7.2.2 Boca L-glutamina je odmrznuta u vodenom kupatilu na 37 °C.
7.2.3 L-glutamin je dobro promešan posle odmrzavanja, pošto se taloži posle odmrzavanja. Uverite se da su svi precipitati vraćeni u rastvor pre alikvotiranja.
7.2.4 Alikvoti od 5-10 ml L-glutamina stavljeni su u sterilne konusne epruvete od 15 ml.
7.2.5 epruvete su obeležene sa koncentracijom, prodavcem, brojem serije, datumom alikvotiranja, i rokom trajanja.
7.2.6 epruvete su skladištene na -20 °C i izvučene po potrebi za pripremu medijuma.
7.3 Priprema CM1
7.3.1 Sledeći reagensi su izvađeni iz hladnog skladišta i zagrejani u vodenom kupatilu na 37 °C:
7.3.1.1 RPMI1640
7.3.1.2 Humani AB serum
7.3.1.3 200 mM L-glutamin
7.3.2 BME je izvađen iz skladišta na 4 °C i stavljen u laminar za kulturu tkiva.
7.3.3 Štok rastvor gentamicina izvađen je iz skladišta na sobnoj temperaturi i stavljen u laminar za kulturu tkiva.
7.3.4 CM1 medijum je pripremljen u skladu sa Tabelom 1 u nastavku dodavanjem svakog od sastojaka u gornji deo filterske jedinice od 0,2 μm koja je prikladna za zapreminu koja je filtrirana.
Tabela 11. Priprema CM1
7.3.5 Boca sa CM1 medijumom je obeležena svojim nazivom, inicijalima onoga ko je medijum pripremio, datumom kada je filtriran/pripremljen, rokom trajanja od dve nedelje i skladišten je na 4 °C dok nije bio potreban za kulturu tkiva. Medijumi su alikvotirani u boce manje zapremine prema potrebi.
7.3.6 Bilo koji preostali RPMI1640, humani AB serum, ili L-glutamin skladišteni su na 4 °C do sledeće pripreme medijuma.
7.3.7 Štok boca sa BME vraćena je u skladište na 4 °C.
7.3.8 Štok boca gentamicina vraćena je na odgovarajuću lokaciju za skladištenje na RT.
7.3.9 Zbog ograničenog kapaciteta puferisanja medijuma, CM1 je odbačen ne više od dve nedelje posle pripreme, ili pošto je fenol crveno pH indikator pokazao ekstremni pomak pH (svetlocrvena do ružičaste boje).
7.3.10 Na dan upotrebe, potrebna količina CM1 je zagrejana u vodenom kupatilu na 37 °C i dodato je 6000 IU/ml IL-2.
7.3.11 Dopunska suplementacija - po potrebi
7.3.11.1 CM1 je suplementovan sa GlutaMAX<®>
7.3.11.1.1 CM1 je pripremljen supstituisanjem 2 mM GlutaMAXTM za 2 mM glutamin (krajnja koncentracija, videti Tabelu 2). Kada je ovo urađeno, boca sa medijom je obeležena dodavanjem "2 mM GlutaMAX" kako bi se sprečila zabuna sa standardnom formulacijom CM1.
7.3.11.2 CM1 je suplementovan dodatnim antibiotikom/antimikotikom
7.3.11.2.1 Neke formulacije CM1 zahtevale su dopunske antibiotike ili antimikotike kako bi se sprečila kontaminacija pre-REP TIL koji su uzgajani iz određenih tipova tumora.
7.3.11.2.2 Antibiotik/antimikotik je dodat u krajnje koncentracije koje su pokazane u Tabeli 2 u nastavku.
7.3.11.2.3 Kada je završeno, boca sa medijumom je obeležena dodavanjem jednog ili više naziva dopunskog antibiotika/antimikotika kako bi se sprečila zabuna sa standardnom formulacijom CM1.
Tabela 12. Dopunska suplementacija CM1, kao što je bilo potrebno
.1 Priprema CM2
8.1.1 Pripremljeni CM1 je izvađen iz frižidera ili je pripremljen svež CM1 kao u prethodnom Primeru.
8.1.2 AIM-V<®>je izvađen iz frižidera.
8.1.3 Potrebna količina CM2 je pripremljena mešanjem pripremljenog CM1 sa jednakom zapreminom AIM-V<®>u sterilnoj boci za medijum.
8.1.4 Dodato je 3000 IU/ml IL-2 u CM2 medijum na dan upotrebe.
8.1.5 Napravljena je dovoljna količina CM2 sa 3000 IU/ml IL-2 na dan upotrebe.
8.1.6 Boca sa CM2 medijumom je obeležena svojim nazivom, inicijalima onoga ko je medijum pripremio, datumom kada je filtriran/pripremljen, rokom trajanja od dve nedelje i skladišten je na 4 °C dok nije bio potreban za kulturu tkiva. Medijumi su alikvotirani u boce manje zapremine prema potrebi.
8.1.7 Bilo koji CM2 bez IL-2 vraćen je u frižider gde je bio skladišten do dve nedelje, ili dok fenol crveno pH indikator nije pokazao ekstremni pomak pH (svetlocrvena do ružičaste boje).
iprema CM3
8.2.1 CM3 je pripremljen na dan kada je bio potreban za upotrebu.
8.2.2 CM3 je bio isti kao AIM-V<®>medijum, suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2 na dan upotrebe.
8.2.3 Pripremljena je količina CM3 koja je dovoljna za eksperimentalne potrebe dodavanjem štok rastvora IL-2 direktno u bocu ili kesu AIM-V. Dobro je promešano blagim trešenjem. Boca je obeležena sa "3000 IU/ml IL-2" odmah posle dodavanja u AIM-V. Kada je bilo viška CM3, skladišten je u bocama na 4 °C koje su obeležene nazivom medijuma, inicijalima onoga ko je medijum pripremio, datumom pripreme medijuma, i rokom trajanja (7 dana posle pripreme).
8.2.4 Medijum koji je suplementovan sa IL-2 odbačen je posle 7 dana skladištenja na 4 °C.
iprema CM4
8.3.1 CM4 je bio isti kao CM3, sa dopunskim suplementovanjem sa 2 mM GlutaMAXTM (krajnja koncentracija).
8.3.1.1 Za svaki 1 l CM3, dodato je 10 ml 200 mM GlutaMAX<™>.
8.3.2 Pripremljena je količina CM4 koja je dovoljna za eksperimentalne potrebe dodavanjem štok rastvora IL-2 i štok rastvora GlutaMAX<™>direktno u bocu ili kesu AIM-V. Dobro je promešano blagim trešenjem.
8.3.3 Boca je obeležena sa "3000 IL/ml IL-2 i GlutaMAX" odmah posle dodavanja u AIM-V.
8.3.4 Ukoliko je bilo viška CM4, skladišten je u bocama na 4 °C koje su obeležene nazivom medijuma, "GlutaMAX", inicijalima onoga ko je medijum pripremio, datumom pripreme medijuma, i rokom trajanja (7 dana posle pripreme).
8.3.5 Medijum koji je suplementovan sa IL-2 odbačen je posle 7 dana skladištenja na 4 °C.
PRIMER 6: PROCENA OZRAČENIH ALOGENIH HRANITELJSKIH ĆELIJA ZA PROTOKOL BRZOG UMNOŽAVANJA LN-144
[0366] Ovaj Primer opisuje novu skraćenu proceduru za kvalifikovanje pojedinačnih serija gama-ozračenih perifernih mononuklearnih ćelija (PBMC, takođe poznate kao MNC) za upotrebu kao alogenih hraniteljskih ćelija u primerima postupaka koji su ovde opisani.
[0367] Svaka ozračena MNC hraniteljska serija pripremljena je od pojedinačnog davaoca. Svaka serija ili davalac je pregledan pojedinačno na svoju sposobnost da umnoži TIL u REP u prisustvu prečišćenog anti-CD3 (klon OKT3) antitela i interleukina-2 (IL-2). Pored toga, svaka serija hraniteljskih ćelija je testirana bez dodavanja TIL kako bi se potvrdilo da je primljena doza gama zračenja bila dovoljna da ih učini nesposobnim za replikaciju.
Definicije
[0368]
• AOPI - Akridin oranž/Propidijum jodid
• BSC - Laminarna komora
• CD3 - Klaster diferencijacije 3; površinski marker protein za T-limfocite
• CF - Centrifugalna sila
• CM1 - Kompletni medijum za TIL, #1
• CM2 - Kompletni medijum za TIL, # 2
• CMO - Organizacija za ugovornu proizvodnju
• CO2- Ugljen dioksid
• EtOH - Etil alkohol
• GMP - Dobre proizvodne prakse
• Gy - Grej
• IL-2 - Interleukin 2
• IU - Internacionalne jedinice
• LN2- Tečni azot
• Mini-REP - Mini-protokol brzog umnožavanja
• ml - Mililitar
• MNC - Mononuklearne ćelije
• NA - Nije primenljivo
• OKT3 - MACS GMP CD3 čisto (klon OKT3) antitelo
• PPE - Lična zaštitna oprema
• Pre-REP - Pre protokola brzog umnožavanja
• QS - Quantum Satis; napuniti do ove količine
• REP - Protokol brzog umnožavanja
• TIL - Tumor-infiltrirajući limfociti
• T25 - Flask za kulturu tkiva od 25 cm<2>
• μg - Mikrogram
• μl - Mikrolitar
Oprema, softver, materijali
[0369] Oprema
• BSC (Laminarna komora)
• Zamrzivač sa tečnim azotom
• Vodeno kupatilo sa kontrolisanom temperaturom
• Centrifuga sa rotorom sa okretnim kofama
• Inkubator za kulturu tkiva sa povećanim procentom vlažnosti • Kontroler za pipetu
• Automatska pipeta od 2-20 μl
• Automatska pipeta od 20-200 μl
• Automatska pipeta od 100-1000 μl
• Automatski brojač ćelija
[0370] Materijal
• konusne epruvete za centrifugiranje od 15 ml, sterilne
• konusne epruvete za centrifugiranje od 50 ml, sterilne
• CM1
• CM2
• AIM V medijum CTS (terapijskog kvaliteta)
• Rastvor za bojenje za brojač ćelija
• IL-2
• MACS GMP CD3 čisto (klon OKT3) antitelo
• Sterilne serološke pipete za jednokratnu upotrebu
• Sterilne pipete za prebacivanje za jednokratnu upotrebu
• Sterilni vrhovi za pipete
• Ploča za kulturu tkiva sa 24 bunarića
• T25 flaskovi (Greiner #690175)
• 5.3.14. Kese za skladištenje sa patent zatvaračem
PROCEDURA
Pozadina
[0371] Gama-ozračene, zaustavljene u rastu MNC hraniteljske ćelije bile su potrebne za REP (Korak D) umnožavanja TIL. Membranski receptori na hraniteljskim MNC vezuju se za anti-CD3 (klon OKT3) antitela i unakrsno se povezuju sa TIL u REP (Korak D) flasku, stimulišući TIL da se umnože. Hraniteljske serije su pripremljene iz leukafereze pune krvi koja je uzeta od pojedinačnih davalaca. Proizvod leukafereze je podvrgnut centrifugiranju preko Ficoll-Hipaque, ispran, ozračen, i krioprezerviran u uslovima GMP.
[0372] Bilo je važno da se pacijentima koji su primali TIL terapiju ne uvode infuzijom vijabilne hraniteljske ćelije, pošto to može rezultovati bolešću kalem-protiv-domaćina (GVHD). Hraniteljske ćelije su prema tome zaustavljene u rastu doziranjem ćelija gamaozračivanjem, što je rezultovalo dvolančanim prekidima DNK i gubitkom ćelijske vijabilnost MNC ćelija nakon rekulture.
Kriterijumi za procenu i eksperimentalna postavka
[0373] Hraniteljske serije su procenjene na osnovu dva kriterijuma: 1) njihove sposobnosti da umnože TIL u kokulturi >100-struko i 2) njihove nesposobnosti za replikaciju.
[0374] Hraniteljske serije su testirane u mini-REP formatu korišćenjem dve primarne pre-REP linije TIL koje su uzgajane u uspravnim T25 flaskovima za kulturu tkiva. Hraniteljske serije su testirane prema dve različite linije TIL, pošto je svaka linija TIL bila jedinstvena po svojoj sposobnosti da proliferiše u odgovor na aktivaciju u REP. Kao kontrola, serija ozračenih MNC hraniteljskih ćelija za koje se istorijski pokazalo da ispunjavaju kriterijume 1) i 2): (1) sposobnost da umnože TIL u kokulturi >100-struko i (2) nesposobnost za replikaciju, sprovedena je zajedno sa test serijama.
[0375] Da bi se osiguralo da sve serije testirane u jednom eksperimentu dobiju ekvivalentno testiranje, upotrebljeni su dovoljni štokovi istih pre-REP linija TIL za testiranje svih uslova i svih hraniteljskih serija. Za svaku testiranu seriju hraniteljskih ćelija, bilo je ukupno šest T25 flaskova:
• Pre-REP linija TIL #1 (2 flaska)
• Pre-REP linija TIL #2 (2 flaska)
• Hraniteljska kontrola (2 flaska)
• NAPOMENA: Flaskovi koji sadrže linije TIL #1 i #2 procenili su sposobnost hraniteljske serije da umnoži TIL. Flaskovi sa hraniteljskom kontrolom procenili su nesposobnost za replikaciju hraniteljske serije.
Eksperimentalni protokol
Dan -2/3, odmrzavanje linija TIL
[0376] Pripremljen je CM2 medijum prema Primeru 5, Priprema medijuma za pre-REP i REP. CM2 je zagrejan u vodenom kupatilu na 37 °C. Pripremljeno je 40 ml CM2 koji je suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2. Čuvano je na toplom do upotrebe. Stavljeno je 20 ml prethodno zagrejanog CM2 bez IL-2 u svaku od dve konusne epruvete od 50 ml obeležene nazivima linija TIL koje su upotrebljene. Izvađene su dve označene pre-REP linije TIL iz LN2 skladišta i bočice su prebačene u prostoriju za kulturu tkiva. Popunjen je obrazac za identifikaciju linije TIL. Bočice su odmrznute tako što su stavljene unutar zatvorene kese za skladištenje sa patent zatvaračem u vodeno kupatilo na 37 °C dok nije ostala mala količina leda. Odmrznute bočice su isprskane ili obrisane sa 70% etanolom i prebačene u BSC. Upotrebljena je sterilna pipeta za prebacivanje kako bi se odmah prebacio sadržaj bočice u 20 ml CM2 u pripremljenu, obeleženu konusnu epruvetu od 50 ml. QS (napunjeno do ove količine) do 40 ml upotrebom CM2 bez IL-2 za ispiranje ćelija. Centrifugirano je na 400 x CF tokom 5 minuta. Supernatant je aspiriran i resuspendovan u 5 ml toplog CM2 koji je suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2. Uklonjen je mali alikvot (20 μl) u duplikatu radi brojanja ćelija upotrebom automatskog brojača ćelija. Rezultati brojanja su zabeleženi. Tokom brojanja, konusna epruveta od 50 ml sa TIL ćelijama stavljena je u inkubator sa povećanim procentom vlažnosti na 37 °C, 5% CO2, sa olabavljenim poklopcem kako bi se omogućila razmena gasova. Određena je koncentracija ćelija i TIL su razblažene do 1 × 10<6>ćelija/ml u CM2 koji je suplementovan sa IL-2 na 3000 IU/ml. Kultivisano je u 2 ml/bunariću ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarića u onoliko bunarića koliko je bilo potrebno u inkubatoru sa povećanim procentom vlažnosti na 37 °C do Dana 0 mini-REP. Kultivisane su različite linije TIL u odvojenim pločama za kulturu tkiva sa 24 bunarića kako bi se izbegla zabuna i potencijalna unakrsna kontaminacija.
Dan 0, iniciran je mini-REP
[0377] Pripremljeno je dovoljno CM2 medijuma za broj hraniteljskih serija koje su testirane. (npr. za testiranje 4 hraniteljske serije odjednom, treba pripremiti 800 ml CM2 medijuma). Alikvotiran je deo CM2 koji je pripremljen u Primeru 5 i suplementovan je sa 3000 IU/ml IL-2 za kultivisanje ćelija (npr. za testiranje 4 hraniteljske serije odjednom, treba pripremiti 500 ml CM2 medijuma sa 3000 IU/ml IL-2). Ostatak CM2 bez IL-2 upotrebljen je za ispiranje ćelija kao što je opisano u nastavku.
Priprema TIL
[0378]
7.3.2.4. Rađeno je sa svakom linijom TIL odvojeno kako bi se sprečila unakrsna kontaminacija, ploča sa 24 bunarića sa kulturom TIL izvađena je iz inkubatora i prebačena u BSC.
7.3.2.5. Upotrebom sterilne pipete za prebacivanje ili automatske pipete i vrha od 100-1000 μl, uklonjeno je oko 1 ml medijuma iz svakog bunarića TIL koji će se upotrebljavati i stavljeno je u neiskorišćeni bunarić ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarića. Ovo je upotrebljeno za ispiranje bunarića.
7.3.2.6. Upotrebom nove sterilne pipete za prebacivanje ili automatske pipete i vrha od 100-1000 μl, pomešan je preostali medijum sa TIL u bunarićima kako bi se ćelije resuspendovale, i zatim je suspenzija ćelija prebačena u konusnu epruvetu od 50 ml koja je obeležena nazivom TIL i zabeležena je zapremina.
7.3.2.7. Bunarići su isprani sa rezervnim medijumom i ta zapremina je prebačena u istu konusnu epruvetu od 50 ml.
7.3.2.8. Ćelije su centrifugirane na 400 × CF kako bi se sakupio ćelijski pelet.
7.3.2.9. Supernatant medijuma je aspiriran i ćelijski pelet je resuspendovan u 2-5 ml CM2 medijuma koji sadrži 3000 IU/ml IL-2; upotrebljena zapremina je zasnovana na broju sakupljenih bunarića i veličine peleta - zapremina je bila dovoljna da obezbedi koncentraciju od >1,3 × 10<6>ćelija/ml.
7.3.2.10. Upotrebom serološke pipete, temeljno je promešana suspenzija ćelijaa i zabeležena je zapremina.
7.3.2.11. Uklonjeno je 200 μl radi brojanja ćelija upotrebom automatskog brojača ćelija.
7.3.2.12. Tokom brojanja, konusna epruveta od 50 ml sa TIL ćelijama stavljena je u inkubator sa povećanim procentom vlažnosti sa 5% CO2, na 37 °C, sa olabavljenim poklopcem kako bi se omogućila razmena gasova.
7.3.2.13. Rezultati brojanja su zabeleženi.
7.3.2.14. Iz inkubatora je izvađena konusna epruveta od 50 ml koja sadrži TIL ćelije i ćelije su resuspendovane u koncentraciji od 1,3 × 10<6>ćelija/ml u toplom CM2 koji je suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2. Konusna epruveta od 50 ml je vraćena u inkubator sa olabavljenim poklopcem.
7.3.2.15 Kada je bilo potrebno, originalna ploča sa 24 bunarića je ostavljena da se rekultivišu bilo koji preostali TIL.
7.3.2.16. Ponovljeni su koraci 7.3.2.4 - 7.3.2.15 za drugu liniju TIL.
7.3.2.17. Neposredno pre zasejavanja TIL u T25 flaskove za eksperiment, TIL su razblaženi 1:10 za krajnju koncentraciju od 1,3 × 10<5>ćelija/ml kao prema koraku 7.3.2.35 u nastavku.
Priprema MACS GMP CD3 čistog (OKT3) radnog rastvora
7.3.2.18. Štok rastvor OKT3 (1mg/ml) je izvađen iz frižidera na 4 °C i stavljen u BSC.
7.3.2.19. Krajnja koncentracija od 30 ng/ml OKT3 je upotrebljena u medijumu za mini-REP.
7.3.2.20. 600 ng OKT3 je bilo potrebno za 20 ml u svakom T25 flasku eksperimenta; ovo je ekvivalent 60 μl rastvora od 10 μg/ml za svakih 20 ml, ili 360 μl za svih 6 flaskova koji su testirani za svaku hraniteljsku seriju.
7.3.2.21. Za svaku testiranu hraniteljsku seriju napravljeno je 400 μl 1:100 razblaženja 1 mg/ml OKT3 za radnu koncentraciju od 10 μg/ml (npr. za testiranje 4 hraniteljske serije odjednom, napravljeno je 1600 μl 1:100 razblaženja 1 mg/ml OKT3: 16 μl 1 mg/ml OKT3 1,584 ml CM2 medijuma sa 3000IU/ml IL-2.)
Priprema T25 flaskova
[0380]
7.3.2.22. Svaki flask je obeležen nazivom linije TIL koja je testirana, brojem replikata flaska, brojem hraniteljske serije, datumom, i inicijalima analitičara.
7.3.2.23. Flask je napunjen sa CM2 medijumom pre pripreme hraniteljskih ćelija.
7.3.2.24. Flaskovi su stavljeni u inkubator sa povećanim procentom vlažnosti 5% CO2, na 37 °C kako bi medijum ostao topao dok čeka dodavanje preostalih komponenti. 7.3.2.25. Kada su hraniteljske ćelije pripremljene, komponente su dodate u CM2 u svakom flasku kao što je pokazano u Tabeli 14, Postavka flaska, u nastavku.
Tabela 13: Postavka flaska
Priprema hraniteljskih ćelija
[0381]
7.3.2.26. Bilo je potrebno minimum 78 × 10<6>hraniteljskih ćelija po seriji koja je testirana za ovaj protokol. Svaka bočica od 1 ml zamrznuta od strane SDBB imala je 100 × 10<6>vijabilnih ćelija nakon zamrzavanja. Pod pretpostavkom oporavka od 50% nakon odmrzavanja iz LN2 skladišta, preporučeno je da se odmrznu najmanje dve bočice od 1 ml hraniteljskih ćelija po seriji dajući procenjenih 100 × 10<6>vijabilnih ćelija za svaki REP. Alternativno, ukoliko se isporučuje u bočicama od 1,8 ml, samo jedna bočica bi obezbedila dovoljno hraniteljskih ćelija.
7.3.2.27. Pre odmrzavanja hraniteljskih ćelija, prethodno je zagrejano približno 50 ml CM2 bez IL-2 za svaku hraniteljsku seriju koja je testirana.
7.3.2.28. Označene bočice sa hraniteljskim serijama izvađene su iz LN2 skladišta, stavljene u kesu za skladištenje sa patent zatvaračem, i stavljene na led. Bočice su prebačene u prostoriju za kulturu tkiva.
7.3.2.29. Bočice su odmrznute u zatvorenoj kesi za skladištenje sa patent zatvaračem potapanjem u vodeno kupatilo na 37 °C.
7.3.2.30. Bočice su izvađene iz kese sa patent zatvaračem, poprskane ili obrisane sa 70% EtOH i bočice su prebačene u BSC.
7.3.2.31. Upotrebom pipete za prebacivanje, sadržaj hraniteljskih bočica je odmah prebačen u 30 ml toplog CM2 u konusnoj epruveti od 50 ml. Bočica je isprana sa malom zapreminom CM2 kako bi se uklonile sve zaostale ćelije u bočici.
7.3.2.32. Centrifugirano je na 400 × CF tokom 5 minuta.
7.3.2.33. Supernatant je aspiriran i resuspendovan u 4 ml toplog CM2 plus 3000 IU/ml IL-2.
7.3.2.34. Uklonjeno je 200 μl radi brojanja ćelija upotrebom automatskog brojača ćelija. Rezultati brojanja su zabeleženi.
7.3.2.35. Ćelije su resuspendovane na 1,3 × 10<7>ćelija/ml u toplom CM2 plus 3000 IU/ml IL-2.
Postavka kokulture
[0382]
7.3.2.36. TIL ćelije su razblažene sa 1,3 × 10<6>ćelija/ml na 1,3 × 10<5>ćelija/ml. Sa svakom linijom TIL radilo se nezavisno kako bi se sprečila unakrsna kontaminacija.
7.3.2.36.1. Dodato je 4,5 ml CM2 medijuma u konusnu epruvetu od 15 ml.
7.3.2.36.2. TIL ćelije su izvađene iz inkubatora i dobro resuspendovane upotrebom serološke pipete od 10 ml.
7.3.2.36.3. Uklonjeno je 0,5 ml ćelija iz 1,3 × 10<6>ćelija/ml suspenzije TIL i dodato u 4,5 ml medijuma u konusnoj epruveti od 15 ml. Bočica sa štokom TIL vraćena je u inkubator.
7.3.2.36.4. Dobro je promešano.
7.3.2.36.5. Ponovljeni su koraci 7.3.2.36.1 - 7.3.2.36.4 za drugu liniju TIL.
7.3.2.36.6. Kada se testira više od jedne hraniteljske serije odjednom, TIL se razblažava na nižu koncentraciju za svaku hraniteljsku seriju neposredno pre zasejavanja TIL.
7.3.2.37. Flaskovi sa prethodno zagrejanim medijumom za jednu hraniteljsku seriju prebačeni su iz inkubatora u BSC.
7.3.2.38. Hraniteljske ćelije su promešane pipetiranjem gore-dole nekoliko puta vrhom pipete od 1 ml i prebačen je 1 ml (1,3 × 10<7>ćelija) u svaki flask za tu hraniteljsku seriju.
7.3.2.39. Dodato je 60 μl OKT3 radnog štoka (10 μg/ml) u svaki flask.
7.3.2.40. Dva kontrolna flaska su vraćena u inkubator.
7.3.2.41. Prebačen je 1 ml (1,3 × 10<5>) svake serije TIL u odgovarajuće obeleženi T25 flask.
7.3.2.42. Flaskovi su vraćeni u inkubator i inkubirani uspravno. Nije uznemiravano do Dana 5.
7.3.2.43. Ponovljeno je 7.3.2.36 - 7.3.2.42 za sve testirane hraniteljske serije.
7.3.3. Dan 5, Promena medijuma
[0383]
7.3.3.1. Pripremljen je CM2 sa 3000 IU/ml IL-2. Za svaki flask bilo je potrebno 10 ml.
7.3.3.2. Kako bi se sprečila unakrsna kontaminacija, rukovano je flaskovima za po jednu hraniteljsku seriju u jednom momentu. Flaskovi su izvađeni iz inkubatora i prebačeni u BSC, i pazilo se da se ne poremeti ćelijski sloj na dnu flaska.
7.3.3.3. Nežno je uklonjeno 10 ml medijuma iz flaska i odbačeno.
7.3.3.4. Ponovljeno je za sve flaskove uključujući kontrolni flask.
7.3.3.5. Pipetom od 10 ml prebačeno je 10 ml toplog CM2 sa 3000 IU/ml IL-2 u svaki flask.
7.3.3.6. Flaskovi su vraćeni u inkubator i inkubirano je uspravno do Dana 7.
7.3.3.7. Ponovljeno je 7.3.3.1 - 7.3.3.6 za sve testirane hraniteljske serije.
7.3.4. Dan 7, Sakupljanje
[0384]
7.3.4.1. Kako bi se sprečila unakrsna kontaminacija, rukovano je flaskovima za po jednu hraniteljsku seriju u jednom momentu.
7.3.4.2. Flaskovi su izvađeni iz inkubatora i prebačeni u BSC, i pazilo se da se ne poremeti ćelijski sloj na dnu flaska.
7.3.4.3. Bez ometanja ćelija koje rastu na dnu flaskova, uklonjeno je 10 ml medijuma iz svakog test flaska i 15 ml medijuma iz svakog kontrolnog flaska.
7.3.4.4. Upotrebom serološke pipete od 10 ml, resuspendovane su ćelije u preostalom medijumu i dobro promešane kako bi se razbile nakupine ćelija.
7.3.4.5. Zapremine su zabeležene za svaki flask za Dan 7.
7.3.4.6. Pošto su suspenzije ćelija temeljno promešane pipetiranjem, uklonjeno je 200 μl radi brojanja ćelija.
7.3.4.7. TIL su izbrojane upotrebom odgovarajuće standardne operativne procedure u kombinaciji sa opremom za automatsko brojanje ćelija.
7.3.4.8. Rezultati brojanja su zabeleženi za Dan 7.
7.3.4.9. Ponovljeno je 7.3.4.1 - 7.3.4.8 za sve testirane hraniteljske serije.
7.3.4.10. Kontrolni hraniteljski flaskovi su procenjeni za nesposobnost za replikaciju, i flaskovi koji sadrže TIL su procenjeni za višestrukost umnožavanja od Dana 0 u skladu sa kriterijumima koji su nabrojani na Slici 2.
7.3.5. Dan 7, Nastavak kontrolnih hraniteljskih flaskova do Dana 14
[0385]
7.3.5.1. Posle završetka brojanja na Dan 7 kontrolnih hraniteljskih flaskova, dodato je 15 ml svežeg CM2 medijuma koji sadrži 3000 IU/ml IL-2 u svaki od kontrolnih flaskova.
7.3.5.2. Kontrolni flaskovi su vraćeni u inkubator i inkubirani su u uspravnom položaju do Dana 14.
7.3.6. Dan 14, Produžena neproliferacija kontrolnih hraniteljskih flaskova
[0386]
7.3.6.1 Kako bi se sprečila unakrsna kontaminacija, rukovano je flaskovima za po jednu hraniteljsku seriju u jednom momentu.
7.3.6.2 Flaskovi su izvađeni iz inkubatora i prebačeni u BSC, i pazilo se da se ne poremeti ćelijski sloj na dnu flaska.
7.3.6.3. Bez ometanja ćelija koje rastu na dnu flaskova, uklonjeno je približno 17 ml medijuma iz svakog kontrolnog flaska.
7.3.6.4. Upotrebom serološke pipete od 5 ml, resuspendovane su ćelije u preostalom medijumu i dobro promešane kako bi se razbile nakupine ćelija.
7.3.6.5. Zapremine su zabeležene za svaki flask.
7.3.6.6. Pošto su suspenzije ćelija temeljno promešane pipetiranjem, uklonjeno je 200 μl radi brojanja ćelija.
7.3.6.7. TIL su izbrojane upotrebom odgovarajuće standardne operativne procedure u kombinaciji sa opremom za automatsko brojanje ćelija.
7.3.6.8. Rezultati brojanja su zabeleženi za Dan 14.
7.3.6.9. Ponovljeno je 7.3.4.1 - 7.3.4.8 za sve testirane hraniteljske serije.
Očekivani rezultati i kriterijumi za prihvatanje
Očekivani rezultati
[0387] Doza gama ozračivanja bila je dovoljna da učini hraniteljske ćelije nesposobnim za replikaciju. Očekivalo se da sve serije ispune kriterijume za procenu i da takođe demonstiraju redukciju ukupnog broja vijabilnih hraniteljskih ćelija koje su preostale na Dan 7 REP kulture u poređenju sa Danom 0.
[0388] Očekivalo se da će sve hraniteljske serije ispuniti kriterijume za procenu 100-strukog umnožavanja rasta TIL do Dana 7 REP kulture.
[0389] Očekivalo se da će rezultati brojanja na Dan 14 u kontrolnim hraniteljskim flaskovima nastaviti neproliferativni trend koji je viđen na Dan 7.
Kreterijumi za prihvatanje
[0390] Sledeći kriterijumi za prihvatanje su morali da budu ispunjeni za svaki replikat TIL linije koja je testirana za svaku seriju hraniteljskih ćelija.
Prihvatanje je bilo dvostruko, kao što sledi (istaknuto na Slici 2, Kriterijumi za prihvatanje):
[0391] Procenjeno je da li je doza zračenja bila dovoljna da učini MNC hraniteljske ćelije nesposobnim za replikaciju kada se kultivišu u prisustvu 30 ng/ml OKT3 antitela i 3000 IU/ml IL-2.
[0392] Nesposobnost za replikaciju je procenjena pomoću ukupnog broja vijabilnih ćelija (TVC) kao što je određeno pomoću automatskog brojanja ćelija na Dan 7 i Dan 14 REP.
[0393] Kriterijum za prihvatanje je "Nema rasta", što znači da se ukupan broj vijabilnih ćelija nije povećao na Dan 7 i Dan 14 u odnosu na inicijalni broj vijabilnih ćelija koji je stavljen u kulturu na Dan 0 REP.
Procena sposobnosti hraniteljskih ćelija da podrže umnožavanje TIL
[0394] Rast TIL je meren u smislu višestrukosti umnožavanja vijabilnih ćelija od početka kulture na Dan 0 REP do Dana 7 REP.
[0395] Na Dan 7, kulture TIL su postigle minimalno 100-struko umnožavanje (tj. više od 100 puta veći broj ukupnih vijabilnih ćelija TIL koje su stavljene u kulturu na Dan 0 REP), što je procenjeno pomoću automatskog brojanja ćelija.
[0396] MNC hraniteljske serije koje nisu ispunile ova dva prethodno navedena kriterijuma tipično su isključene.
[0397] Bilo koje MNC hraniteljske serije koje su ispunile kriterijume za prihvatanje, ali se procenjuje da imaju loše performanse u pogledu sposobnosti umnožavanja TIL u odnosu na druge prethodne hraniteljske serije koje su testirane paralelno sa istim pre-REP linijama TIL, prema proceni nekoga sa iskustvom iz struke mogle su biti isključene. Videti Tabelu 15 u nastavku za kriterijume za prihvatanje koji su upotrebljeni.
Tabela 14: Kriterijumi za prihvatanje
[0398] Procenjeno je da li je doza zračenja bila dovoljna da učini MNC hraniteljske ćelije nesposobnim za replikaciju kada se kultivišu u prisustvu 30 ng/ml OKT3 antitela i 3000 IU/ml IL-2.
10.2.2.1.1 Nesposobnost za replikaciju procenjena je ukupnim brojem vijabilnih ćelija (TVC) kao što je određeno pomoću automatskog brojanja ćelija na Dan 7 i Dan 14 REP.
10.2.2.1.2 Kriterijum za prihvatanje bio je da "Nema rasta", što znači da se ukupan broj vijabilnih ćelija nije povećao na Dan 7 i Dan 14, u odnosu na inicijalni broj vijabilnih ćelija koji je stavljen u kulturu na Dan 0 REP.
10.2.2.2 Procenjena je sposobnost hraniteljskih ćelija da podrže umnožavanje TIL.
10.2.2.2.1 Rast TIL je meren u smislu višestrukosti umnožavanja vijabilnih ćelija od početka kulture na Dan 0 REP do Dana 7 REP.
10.2.2.2.1 Na Dan 7, kulture TIL su postigle minimalno 100-struko umnožavanje (tj. više od 100 puta veći broj ukupnih vijabilnih ćelija TIL koje su stavljene u kulturu na Dan 0 REP), što je procenjeno pomoću automatskog brojanja ćelija.
10.2.2.3 Kada serija nije ispunila dva prethodno navedena kriterijuma, serija je ponovo testirana u skladu sa planom za nepredviđene situacije koji je istaknut u Odeljku 10.3 u nastavku.
10.2.2.4 Nakon ponovnog testiranja neuspešne serije, isključena je svaka MNC hraniteljska serija koja nije ispunila dva kriterijuma za prihvatanje ni u prvobitnoj proceni ni u testiranju u slučaju nepredviđenih okolnosti.
10.2.2.5 Bilo koje MNC hraniteljske serije koje su ispunile kriterijume za prihvatanje, ali za koje je procenjeno da imaju loše performanse u pogledu sposobnosti umnožavanja TIL u odnosu na druge prethodne hraniteljske serije koje su testirane paralelno sa istim pre-REP linijama TIL, isključene su prema potrebi.
[0399] Testiranje u slučaju nepredviđenih situacija MNC hraniteljskih serija koje ne ispunjavaju kriterijume za prihvatanje
10.3.1 U slučaju da je MNC hraniteljska serija ispunila bilo koji od kriterijuma za prihvatanje koji su istaknuti u prethodnom Odeljku 10.2, preduzeti su sledeći koraci za ponovno testiranje serije kako bi se isključila jednostavna greška onoga ko je eksperiment izveo kao njen uzrok.
10.3.2 Ukoliko su iz serije preostale dve ili više bočica za satelitsko testiranje, onda se serija mogla ponovo testirati. Ukoliko je iz serije preostala jedna ili nijedna bočica za satelitsko testiranje, onda je serija bila neuspešna u skladu sa kriterijumima za prihvatanje koji su nabrojani u prethodnom Odeljku 10.2.
10.3.3 Dva člana osoblja koji su obučeni, uključujući i osobu koja je prvobitno procenila dotičnu seriju, morala su da testiraju seriju u isto vreme.
10.3.4 Ponavljanje Odeljaka 7.2 - 7.3 urađeno je kako bi se ponovo procenila dotična serija.
10.3.5 Svaka osoba bi testirala dotičnu seriju kao i kontrolnu seriju (kao što je definisano u prethodnom Odeljku 7.2.4).
10.3.6 Kako bi se kvalifikovale, dotična i kontrolna serija morale su da postignu kriterijume za prihvatanje iz Odeljka 10.2 kod oba člana osoblja koji vrše testiranje u slučaju nepredviđenih okolnosti.
10.3.7 Nakon ispunjavanja ovih kriterijuma, serija je tada mogla biti puštena za upotrebu u CMO kao što je istaknuto u prethodnom Odeljku 10.2.
PRIMER 7: PROCEDURA ZA KVALIFIKOVANJE POJEDINAČNIH SERIJA GAMA-OZRAČENIH MONONUKLEARNIH ĆELIJA PERIFERNE KRVI
[0400] Ovaj Primer opisuje novu skraćenu proceduru za kvalifikovanje pojedinačnih serija gama-ozračenih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) za upotrebu kao alogenih hraniteljskih ćelija u primerima postupaka koji su ovde opisani. Ovaj primer obezbeđuje protokol za procenu ozračenih PBMC serija ćelija za upotrebu u proizvodnji kliničkih serija TIL. Svaka ozračena PBMC serija pripremljena je od pojedinačnog davaoca. Tokom više od 100 kvalifikacionih protokola, pokazano je da, u svim slučajevima, ozračene PBMC serije iz SDBB (Banka krvi San Dijega) mogu umnožavati TIL>100-struko na Dan 7 REP. Ovaj modifikovani kvalifikacioni protokol namenjen je za primenu na ozračene serije donorskih PBMC iz SDBB koje još uvek moraju da se testiraju kako bi se potvrdilo da je primljena doza gama zračenja bila dovoljna da ih učini nesposobnim za replikaciju. Jednom kada je pokazano da održavaju nesposobnost za replikaciju tokom 14 dana, serije donorskih PBMC su smatrane "kvalifikovanim" za upotrebu za proizvodnju kliničkih serija TIL.
Ključni termini i definicije
[0401]
μg - Mikrogram
μl - Mikrolitar
AIM-V - komercijalno dostupan medijum za ćelijsku kulturu
BSC - Laminarna komora
CD - Klaster diferencijacije
CM2 - Kompletni medijum za TIL #2
CM2IL2 - CM2 suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2
CMO - Organizacija za ugovornu proizvodnju
CO2– Ugljen dioksid
EtOH - Etanol
GMP - Dobre proizvodne prakse
Gy - Grej
IL - Interleukin
IU - Međunarodne jedinice
LN2 - Tečni azot
ml - Mililitar
NA - Nije primenljivo
OKT3 – Oznaka anti-CD3 monoklonalnog antitela
P20 - Automatska pipeta od 2-20 μl
P200 - Automatska pipeta od 20-200 μl
PBMC - Mononuklearne ćelije periferne krvi
P1000 - Automatska pipeta od 100-1000 μl
PPE - Lična zaštitna oprema
REP - Protokol brzog umnožavanja
SDBB - Banka krvi San Dijega
TIL - Tumor-infiltrirajući limfociti
T25 - Flask za kulturu tkiva od 25 cm<2>
x g - "puta gravitacija" - mera relativne centrifugalne sile
Uzorci su uključivali ozračene donorske PBMC (SDBB).
Procedura
Pozadina
[0402] 7.1.1 Gama-ozračene, zaustavljene u rastu PBMC bile su potrebne za trenutni standardni REP TIL. Membranski receptori na PBMC vezuju se za anti-CD3 (klon OKT3) antitela i unakrsno se povezuju sa TIL u kulturi, stimulišući TIL da se umnože. PBMC serije su pripremljene iz leukafereze pune krvi koja je uzeta od pojedinačnih davalaca. Proizvod leukafereze je podvrgnut centrifugiranju preko Ficoll-Hipaque, ispran, ozračen, i krioprezerviran u uslovima GMP.
Važno je da se pacijentima koji primaju TIL terapiju ne uvode infuzijom vijabilne PBMC pošto to može rezultovati bolešću kalem-protiv-domaćina (GVHD). Donorske PBMC su prema tome zaustavljene u rastu doziranjem ćelija sa gama-ozračivanjem, što je rezultovalo dvolančanim prekidima DNK i gubitkom ćelijske vijabilnosti PBMC nakon rekulture.
Kriterijumi za procenu
[0403] 7.2.1 Kriterijumi za procenu ozračenih PBMC serija bila je njihova nesposobnost za replikaciju.
Eksperimentalna postavka
[0404]
7.3.1 Hraniteljske serije su testirane u mini-REP formatu kao da će se kokultivisati sa TIL, upotrebom uspravnih T25 flaskova za kulturu tkiva.
7.3.1.1 Kontrolna serija: Jedna serija ozračenih PBMC, za koje je istorijski pokazano da ispunjavaju kriterijume iz 7.2.1, rađena je zajedno sa eksperimentalnim serijama kao kontrola.
7.3.2 Za svaku seriju ozračenih donorskih PBMC koja je testiran, rađeni su flaskovi u duplikatu.
Eksperimentalni protokol
[0405] Sav rad na kulturi tkiva u ovom protokolu obavljen je upotrebom sterilne tehnike u BSC.
Dan 0
[0406]
7.4.1 Pripremljeno je ~90 ml CM2 medijuma za svaku seriju donorskih PBMC koja je testirana. CM2 je održavan toplim u vodenom kupatilu na 37 °C.
7.4.2 Odmrznut je alikvot od 6 × 10<6>IU/ml IL-2.
7.4.3 CM2 medijum je vraćen u BSC, obrisan je sa 70% EtOH pre stavljanja u laminar. Za svaku seriju PBMC koja je testirana, oko 60 ml CM2 je uklonjeno u posebnu sterilnu bocu. U ovaj medijum je dodat IL-2 iz odmrznutog 6 × 10<6>IU/ml štok rastvora za krajnju koncentraciju od 3000 IU/ml. Ova boca je obeležena kao "CM2/IL2" (ili slično) kako bi se razlikovala od nesuplementovanog CM2.
7.4.4 Dva T25 flaska su obeležena za svaku seriju PBMC koja je testirana. Etiketa je minimalno uključivala:
7.4.4.1 Broj serije
7.4.4.2 Broj flaska (1 ili 2)
7.4.4.3 Datum inicijacije kulture (Dan 0)
Priprema OKT3
7.4.5 Štok rastvor anti-CD3 (OKT3) izvađen je iz frižidera na 4 °C i stavljen u BSC.
7.4.6 Krajnja koncentracija od 30 ng/ml OKT3 upotrebljena je u medijumu za mini-REP.
7.4.7 Pripremljen je radni rastvor anti-CD3 (OKT3) od 10 μg/ml iz štok rastvora od 1 mg/ml. Stavljen je u frižider dok nije bio potreban.
7.4.7.1 Za svaku PBMC seriju koja je testirana, pripremljeno je 150 μl 1:100 razblaženja anti-CD3 (OKT3) štoka.
Na primer, za testiranje 4 PBMC serije odjednom, pripremljeno je 600 μl 10 pg/ml anti-CD3 (OKT3) dodavanjem 6 μl 1 mg/ml štok rastvora u 594 μl CM2 koji je suplementovan sa 3000 IU/ml IL-2.
Priprema flaskova
[0408] 7.4.8 Dodato je 19 ml po flasku CM2/IL-2 u obeležene T25 flaskove i flaskovi su stavljeni u inkubator sa povećanim procentom vlažnosti na 37 °C, 5% CO2dok su pripremane ćelije.
Priprema ozračenih PBMC
[0409]
7.4.9 Rađeno je sa svakom serijom donoroskih PBMC pojedinačno kako bi se izbegla potencijalna unakrsna kontaminacija serija.
7.4.10 Bočice sa PBMC serijama za testiranje preuzete su iz LN2 skladišta. One su stavljene na -80 °C ili su držane na suvom ledu pre odmrzavanja.
7.4.11 Stavljeno je 30 ml CM2 (bez IL-2 suplementa) u konusne epruvete od 50 ml za svaku seriju koju treba odmrznuti. Svaka epruveta je obeležena različitim brojevima serije PBMC koje treba da se odmrznu. epruvete su dobro zatvorene i stavljene u vodeno kupatilo na 37 °C pre upotrebe. Po potrebi, konusne epruvete od 50 ml vraćene su u BSC, obrisane sa 70% EtOH pre stavljanja u laminar.
7.4.12 Izvađena je bočica sa PBMC iz hladnog skladišta i stavljena je u plutajući nosač za epruvete u vodenom kupatilu na 37 °C da se odmrzne. Omogućeno je da se odmrzava sve dok mala količina leda nije ostala u bočici.
7.4.13 Odmrznuta bočicu je poprskana ili obrisana sa 70% EtOH i prebačena u BSC.
7.4.14 Upotrebom sterilne pipete za prebacivanje, sadržaj bočice je odmah prebačen u 30 ml CM2 u konusnoj epruveti od 50 ml. Uklonjeno je oko 1 ml medijuma iz epruvete kako bi se bočica isprala; rezultat ispiranja je vraćen u konusnu epruvetu od 50 ml. Čvrsto je zatvoreno i nežno mućkano da se isperu ćelije.
7.4.15 Centrifugirano je na 400 x g tokom 5 min na sobnoj temperaturi.
7.4.16 Supernatant je aspiriran i ćelijski pelet je resuspendovan u 1 ml toplog CM2/IL-2 upotrebom vrha pipete od 1000 μl. Alternativno, pre dodavanja medijuma, ćelijski pelet je resuspendovan povlačenjem zatvorene epruvete duž praznog nosača za epruvete. Posle resuspendovanja ćelijskih peleta, zapremina je dovedena na 4 ml upotrebom CM2/IL-2 medijuma. Zapremina je zabeležena.
7.4.17 Mali alikvot (npr.100 μl) je uklonjen radi brojanja ćelija upotrebom automatskog brojača ćelija.
7.4.17.1 Izvedeno je brojanje u duplikatu u skladu sa određenom SOP automatskog brojača ćelija. Često je bilo potrebno izvesti razblaživanje PBMC pre izvođenja brojanja ćelija. Preporučeno početno razblaženje bilo je 1:10, ali to može da varira u zavisnosti od tipa brojača ćelija koji se koristi.
7.4.17.2 Rezultati brojanja su zabeleženi.
7.4.18 Podešena je koncentracija PBMC na 1,3 × 10<7>ćelija/ml kao prema koraku 7.4.15.2 upotrebom CM2/IL-2 medijuma. Dobro je promešano nežnim mućkanjem ili nežnim aspiriranjem gore-dole upotrebom serološke pipete.
Postavka flaskova za kulturu
[0410]
7.4.19 Dva obeležena T25 flaska vraćena su u BSC iz inkubatora za kulturu tkiva.
7.4.20 Bočica sa 10 pg/ml anti-CD3/OKT3 vraćena je u BSC.
7.4.21 Dodato je 1 ml 1,3 × 10<7>suspenzije ćelija PBMC u svaki flask.
7.4.22 Dodato je 60 μl 10 pg/ml anti-CD3/OKT3 u svaki flask.
7.4.23 Zatvoreni flaskovi vraćeni su u inkubatore za kulturu tkiva na 14 dana rasta bez ometanja.
7.4.24 Bočica sa anti-CD3/OKT3 stavljena je natrag u frižider dok nije bila potrebna za sledeću seriju.
7.4.25 Ponovljeni su koraci 7.4.9 - 7.4.24 za svaku seriju PBMC koja treba da se proceni.
Dan 14, Merenje neproliferacije PBMC
[0411]
7.4.26 Radeći sa svakom serijom nezavisno, duplikati T25 flaskova pažljivo su vraćeni u BSC.
7.4.27 Za svaki flask, upotrebom nove serološke pipete od 10 ml, uklonjeno je ~17 ml iz svakog flaska, i zatim pažljivo uvučen preostali medijum kako bi se izmerila preostala zapremina u flaskovima. Zapremina je zabeležena.
7.4.28 Uzorak je dobro promešan pipetiranjem gore-dole upotrebom iste serološke pipete.
7.4.29 Uklonjen je uzorak od 200 μl iz svakog flaska radi brojanja.
7.4.30 Ćelije su brojane upotrebom automatskog brojača ćelija.
7.4.31 Ponovljeni su koraci 7.4.26 - 7.4.31 za svaku seriju PBMC koja se procenjuje.
REZULTATI I KRITERIJUM ZA PRIHVATANJE
Rezultati
[0412] 10.1.1 Doza gama ozračivanja bila je dovoljna da učini hraniteljske ćelije nesposobnim za replikaciju. Očekivalo se da sve serije ispune kriterijum za procenu i da demonstiraju redukciju ukupnog broja vijabilnih hraniteljskih ćelija koje su preostale na Dan 14 REP kulture u poređenju sa Danom 0.
Kriterijum za prihvatanje
[0413]
10.2.1 Sledeći kriterijum za prihvatanje je ispunjen za svaku seriju ozračenih donorskih PBMC koja je testirana:
10.2.2 "Nema rasta" - što znači da je ukupan broj vijabilnih ćelija na Dan 14 bio manji od inicijalnog broja vijabilnih ćelija koji je stavljen u kulturu na Dan 0 REP.
10.2.3 Ukoliko serija ne ispuni prethodno navedeni kriterijum, serija je ponovo testirana u skladu sa Procedurom testiranja u slučaju nepredviđenih okolnosti koja je istaknuta u odeljku 10.4.
10.2.4 Nakon ponovnog testiranja neuspešne serije, isključena je svaka MNC hraniteljska serija koja nije ispunila kriterijum za prihvatanje ni u prvobitnoj proceni ni u testiranju u slučaju nepredviđenih okolnosti.
Testiranje u slučaju nepredviđenih okolnosti PBMC serija koje nisu ispunile kriterijum za prihvatanje
[0414]
10.4.1 U slučaju da ozračena serija donorskih PBMC nije ispunila prethodno navedeni kriterijum za prihvatanje, preduzeti su sledeći koraci za ponovno testiranje serije kako bi se isključila jednostavna greška onoga ko je eksperiment izveo kao uzrok neuspešnosti.
10.4.2 Ukoliko su iz serije preostale dve ili više satelitskih bočica, onda je serija ponovo testirana. Ukoliko je iz serije preostala jedna ili nijedna satelitska bočica, onda je serija bila neuspešna u skladu sa kriterijumom za prihvatanje iz prethodnog odeljka 10.2.
10.4.3 Kad god je to moguće, dva člana osoblja koji su obučeni (po mogućnosti uključujući i osobu koja je prvobitno procenila dotičnu seriju) nezavisno su testirala dve odvojene bočice. Ovo je bio poželjan postupak testiranja u slučaju nepredviđenih okolnosti. Osim odvojenih bočica sa PBMC, oba člana osoblja mogu upotrebljavati iste reagense.
10.4.3.1. Ukoliko nisu bila dostupna dva člana osoblja, jedna osoba je testirala dve PBMC bočice za neuspešnu seriju, radeći sa svakom bočicom nezavisno.
10.4.4 Ponavljanje odeljka 7.4 "Eksperimentalni protokol" urađeno je kako bi se ponovo procenila dotična serija.
10.4.5 Pored dotične serije, svaka osoba koja je izvodila testiranje u slučaju nepredviđenih okolnosti testirala je i kontrolnu seriju.
10.4.5.1 Ukoliko dva člana osoblja vrše testiranje u slučaju nepredviđenih okolnosti, oba člana osoblja su nezavisno testirala kontrolnu seriju.
10.4.5.2 Ukoliko je samo jedna osoba bila na raspolaganju da izvrši testiranje u slučaju nepredviđenih okolnosti, nije bilo neophodno da se kontrolna serija radi u duplikatu.
10.4.5.3 Kako bi bila kvalifikovana, PBMC serija koja prolazi kroz testiranje u slučaju nepredviđenih okolnosti mora da ima i kontrolnu seriju i, za prolaz, oba replikata dotične serije postižu kriterijum za prihvatanje iz Odeljka 10.2.
10.4.5.4 Nakon ispunjavanja ovog kriterijuma, serija je tada puštena za upotrebu u CMO kao što je istaknuto u odeljku 10.2.
PRIMER 8: POREĐENJE TIL PRE I NAKON KRIOPREZERVACIJE
[0415] Kokteli antitela za uzorke i FMO kontrole napravljeni su pre početka pripreme uzorka i procedure bojenja. Kokteli su skladišteni na 4 °C u mraku tokom do 60 dana. Videti odeljak Priprema koktela u nastavku.
Tabela 15: Procedura bojenja:
Kompenzacione kontrole
[0416]
1. Dodata je jedna kap BD Comp perli u 11 epruveta.
2. Epruvete koje su obeležene sa 1 do 7 sa hromoforama iz DF1.
3. Epruvete koje su obeležene sa 8 do deset sa APCy7, BV421, i Ax647. 4. Epruveta 11 je bila za neobeležene perle.
5. Dodato je 5 μl antitela u svaku epruvetu.
6. Inkubirano je 10 do 30 minuta u mraku, na sobnoj temperaturi.
7. Isprano je sa 3 ml FACS pufera.
8. Resuspendovano je sa 500 μl 1% PFA.
9. Dodata je jedna kap BD Comp negativnih perli u svaku epruvetu.
10. Skladišteno je na 4 °C u mraku. Može se upotrebiti tokom jedne nedelje.
Aqua kontrola:
[0417]
1. Dodata je jedna kap Arc pozitivne kontrole u epruvetu koja je obeležena sa Aqua. 2. Dodato je 3 μl odmrznutog aqua rastvora u epruvetu.
3. Ponovljeni su koraci 6 - 10 kao što je prethodno navedeno. Osim što su za korak 9 upotrebljene negativne Arc perle.
Tabela 20: Postavka
PRIMER 9: IZUZETNO STABILNI TUMOR-INFILTRIRAJUĆI LIMFOCITI (TIL) ZA INFUZIONI FENOTIP NAKON KRIOPREZERVACIJE
Pozadina apstrakta:
[0418] Ovaj Primer diskutuje o razvoju imunoterapija za kancer koje su zasnovane na tumorinfiltrirajućim limfocitima (TIL) sa krajnjim ciljem razvoja terapijskih populacija TIL. Krioprezervacija TIL omogućava da se krajnji ćelijski proizvod otpremi na bezbedan način sa manje vremenskih ograničenja (Axelsson S, Faresjo M, Hedman M, Ludvigsson J, Casas R: Cryopreserved peripheral blood mononuclear cells are suitable for the assessment of immunological markers in type 1 diabetic children. Cryobiology 2008, 57:201-8.)
[0419] Ovde, procenjeni su uzorci svežih naspram zamrznutih/odmrznutih TIL za ekspresiju pojedinačnih fenotipskih markera kako bi se procenilo da li se fenotipske promene dešavaju sa krioprezerviranim TIL. (Videti, na primer, Sadeghi A, Ullenhag G, Wagenius G, Tötterman TH, Eriksson F: Rapid expansion of T cells: Effects of culture and cryopreservation and importance of short-term cell recovery. Acta Oncol. 2013,52:978-86.)
Rezultati:
[0420] Nisu uočene značajne razlike u ekspresiji CD4, CD8, NK, TCRαβ, ili memorijskim markerima poređenjem svežih naspram odmrznutih TIL. Status aktivacije TIL kao što je definisan ekspresijom HLA-DR, CD38, i CD69 održan je dok su regulatorni molekuli LAG-3 i TIM-3 demonstrirali blagi pad ekspresije. Pored toga, vijabilnost i svežeg i odmrznutog proizvoda bila je veća od 86%.
Postupci:
[0421] PreREP TIL su dobijeni kultivisanjem fragmenata tumora melanoma u IL-2 (6000 IU/ml).
[0422] Ćelije protokola brzog umnožavanja (REP) inicirane su upotrebom ozračenih alogenih PBMC hraniteljskih ćelija sa OKT3 i IL-2 u GREX-100 flasku tokom 11-14 dana.
[0423] Kultivisane ćelije su krioprezervirane u 5% DMSO.
[0424] Procena protočnom citometrijom svežih i odmrznutih TIL nakon mirovanja tokom 1 do 2 sata u IL-2 izvedena je upotrebom četiri panela koji se sastoje od markera loze, diferencijacije, aktivacije, i regulatornih markera.
Zaključak:
[0425] Krioprezervacija nije uticala na izmerene fenotipske karakteristike TIL, sa izuzetkom skromnih promena nekih regulatornih molekulima. Istražujemo mogućnost upotrebe krioprezerviranih TIL u kliničkoj postavci.
PRIMER 10: PODSKUPOVI MEMORIJSKIH ĆELIJA U POPULACIJAMA SVEŽIH NASPRAM REREP TIL
[0426] U prethodnim eksperimentima, nije primećen centralni memorijski podskup sa svežim populacijama TIL (videti, Sliku 8). Međutim, posle reREP skoro 60% centralnih memorijskih ćelija, kao što je obezbeđeno u Tabeli 22 u nastavku.
[0427] Na osnovu sirovih brojeva, mirujuće ćelije su imale nešto veću CD4 populaciju od onih koje nisu mirovale. Sve u svemu, procenat CD8 je bio visok kao što se očekivalo. To je grubo 60/40 odnos za CM (centralne memorijske-Q3)/EM (efektorske memorijske-Q4) među CD8. Ekspresija CD8+CD28+ izgleda zanimljivo. Mirujuće ćelije imaju veću količinu. Videti takođe, Sliku 9 i 10A-10B. Videti takođe, Sliku 15.
PRIMER 11: PRIMENA AUTOLOGNIH TUMOR-INFILTRIRAJUĆIH LIMFOCITA (TIL) KOD PACIJENATA SA MELANOMOM
[0428] Primena autolognih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) kod pacijenata sa melanomom pokazala je ukupan odgovor od 55% u NCI, 38% u Moffitt Cancer Center, 48% u MD Anderson Cancer Center, i 40% u Sheba na Ella Cancer Institute, Izrael. Trajni odgovori uočeni kod pacijenata sa melanomom koji upotrebljavaju ACT mogu dozvoliti širu primenu na druge čvrste tumore. Kao što je ovde pokazano, demonstrirana je izvodljivost uzgajanja TIL i razvoja terapija sa TIL za druge čvrste tumore. Primer obezbeđuje podatke koji pokazuju "Uspešno umnožavanje i karakterizaciju tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) iz nemelanomskih tumora", videti, Slike 12-14.
[0429] Fenotipska karakterizacija TIL iz kancera mokraćne bešike, grlića materice, i pluća bila je više od 60-70% CD8+ T-ćelija dok su TIL iz glave i vrata demonstrirali promenljivu distribuciju CD8+ i CD4+ T-ćelija. TIL koji su propagirani iz TNBC bili su više od 80% CD4+ T-ćelije. Bez obzira na tumore, većina kultura je imala manje od 20% CD56+NK ćelija.
[0430] TIL su pripremljeni pomoću:
a. Ispiranja dobijenog tumora u HBSS;
b. Sečenja tumora na fragmente (npr. fragmenti od 2-3 mm<3>);
c. Stavljanja fragmenata tumora u G-REX 10 flaskove za kulturu ćelija sa medijumom koji sadrži serum i IL-2;
d. Promene medijuma na Dan 7 i svakih 4-5 dana od Dana 11 do Dana 21; i
e. Procene broja ćelija, vijabilnosti, i fenotipizacije nakon krioprezervacije za buduće svrhe uključujući, ali ne ograničavajući se na, buduću isporuku pacijentima za lečenje tumora, kao što je ovde opisano.
[0431] Kao što je ovde demonstrirano, TIL su uzgajani iz tumora pacijenata koji su imali tumore pluća, mokraćne bešike, glave i vrata, grlića materice, i TNBC.
[0432] Štaviše, kao što je ovde demonstrirano, tumori pluća, mokraćne bešike, i grlića materice pokazali su veći udeo CD8+ TIL. Tumori glave i vrata i TNBC su uglavnom imali CD4+ TIL. Pored toga, dodatna karakterizacija CD4+ i CD8+ TIL demonstrirala je efektorske memorijske fenotipske ćelije koje su takođe bile CD27+ i CD28+.
[0433] Primeri koji su prethodno izneti obezbeđeni su da onima sa uobičajenim iskustvom u struci daju kompletnu objavu i opis kako da naprave i upotrebljavaju primere izvođenja kompozicija, sistema i postupaka iz pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Modifikacije prethodno opisanih načina sprovođenja pronalaska koje su očigledne osobama sa iskustvom u struci namenjene su da budu unutar obima sledećih patentnih zahteva. Svi patenti i publikacije koje su pomenute u specifikaciji indikativne su za nivoe iskustva onih sa iskustvom u struci na koju se pronalazak odnosi.
[0434] Svi naslovi i oznake odeljaka upotrebljavaju se samo u svrhu jasnoće i pozivanja i ne treba ih smatrati ograničavajućim na bilo koji način. Na primer, oni sa iskustvom u struci će ceniti korisnost kombinovanja različitih aspekata iz različitih naslova i odeljaka kao što je prikladno u skladu sa obimom pronalaska koji je ovde opisan.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Postupak za umnožavanje tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u terapijsku populaciju TIL naznačen time što sadrži:
(i) dobijanje prve populacije TIL iz tumora koji je prethodno reseciran iz pacijenta;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; i (iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL.
2. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što postupak dodatno sadrži:
(iv) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije TIL sa dopunskim IL-2, dopunskim OKT-3, i dopunskim APC, pri čemu se dopunsko drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila veća terapijska populacija TIL nego što je dobijena u koraku (iii), pri čemu veća terapijska populacija TIL sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na treću populaciju TIL,
i opciono pri čemu se posle koraka (iii), ćelije uklanjaju iz ćelijske kulture i krioprezerviraju u medijumu za skladištenje pre izvođenja koraka (iv), pri čemu se opciono ćelije odmrzavaju pre izvođenja koraka (iv) i dodatno opciono pri čemu se korak (iv) ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL.
3. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačen time što se koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana, ili pri čemu se koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana, ili pri čemu se koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana, ili pri čemu se koraci (i) do (iii) ili (iv) izvode unutar oko 44 dana, pri čemu opciono ćelije iz koraka (iii) ili (iv) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama.
4. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što su antigen-prezentujuće ćelije mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) ili pri čemu su APC veštačke APC (aAPC), opciono pri čemu se PBMC dodaju u ćelijsku kulturu na bilo koji od dana 9 do 17 u koraku (iii).
5. Postupak u skladu sa patentnim zahtevima 2 ili 3, naznačen time što efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u terapijskoj populaciji TIL u koraku (iv) pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija, pri čemu opciono efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
6. Postupak u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor,
i opciono postupak dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitelo fuzionisano sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula.
7. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što korak (iii) dodatno sadrži korak uklanjanja ćelija iz medijuma za ćelijsku kulturu, opciono pri čemu se korak (iii) ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL, opcono pri čemu je broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
8. Postupak za procenu metaboličke aktivnosti ćelijske populacije TIL koja je napravljena u skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što sadrži:
(i) dobijanje prve populacije TIL iz tumora koji je prethodno reseciran iz pacijenta;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; (iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 100-struko veća po broju od druge populacije TIL, i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih T ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL;
(iv) merenje bazalne glikolize ćelija;
(v) merenje bazalne respiracije ćelija;
(vi) merenje rezervnog respiratornog kapaciteta (SRC) ćelija; i/ili
(vii) merenje glikolitičke rezerve ćelija.
9. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačen time što se ćelije iz medijuma za ćelijsku kulturu u koraku (iii) uklanjaju i krioprezerviraju u medijumu za skladištenje pre koraka (iv), pri čemu se opciono ćelije odmrzavaju pre koraka (iv) i/ili pri čemu se korak (iii) ponavlja jedan do četiri puta kako bi se dobilo dovoljno TIL u terapijskoj populaciji TIL za terapijski efikasnu dozu TIL, opciono pri čemu je broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>.
10. Postupak za testiranje TIL naznačen time što sadrži:
(i) dobijanje prve populacije TIL;
(ii) izvođenje prvog umnožavanja kultivisanjem prve populacije TIL u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži IL-2 kako bi se proizvela druga populacija TIL; i (iii) izvođenje drugog umnožavanja suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu druge populacije TIL sa dopunskim IL-2, OKT-3, i antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kako bi se proizvela treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL najmanje 50-struko veća po broju od druge populacije TIL; i pri čemu se drugo umnožavanje izvodi tokom najmanje 14 dana kako bi se dobila treća populacija TIL, pri čemu je treća populacija TIL terapijska populacija TIL koja sadrži povećanu subpopulaciju efektorskih ćelija i/ili centralnih memorijskih T ćelija u odnosu na drugu populaciju TIL;
(iv) sakupljanje, ispiranje, i krioprezerviranje treće populacije TIL;
(v) skladištenje krioprezerviranih TIL na kriogenoj temperaturi;
(vi) odmrzavanje treće populacije TIL kako bi se obezbedila odmrznuta treća populacija TIL; i
(vii) izvođenje dopunskog drugog umnožavanja dela odmrznute treće populacije TIL suplementovanjem medijuma za ćelijsku kulturu treće populacije sa IL-2, OKT-3, i APC tokom perioda reREP od najmanje 3 dana, pri čemu se treće umnožavanje izvodi kako bi se dobila četvrta populacija TIL, pri čemu se broj TIL u četvrtoj populaciji TIL upoređuje sa brojem TIL u trećoj populaciji TIL kako bi se dobio odnos;
(viii) određivanje na osnovu odnosa u koraku (vii) da li je odmrznuta populacija TIL pogodna za primenu pacijentu;
pri čemu je terapijski efikasna doza odmrznute treće populacije TIL za primenu pacijentu kada se odredi da je odnos broja TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji TIL veći od 5:1 u koraku (viii), pri čemu se opciono period reREP izvodi sve dok odnos broja TIL u četvrtoj populaciji TIL prema broju TIL u trećoj populaciji TIL ne bude veći od 50:1, opciono pri čemu je broj TIL koji je dovoljan za terapijski efikasnu dozu od oko 2,3×10<10>do oko 13,7×10<10>, i/ili pri čemu se koraci (i) do (vii) izvode unutar perioda od oko 40 dana do oko 50 dana, ili pri čemu se koraci (i) do (vii) izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 48 dana, ili pri čemu se koraci (i) do (vii) izvode unutar perioda od oko 42 dana do oko 45 dana, ili pri čemu se koraci (i) do (vii) izvode unutar oko 44 dana.
11. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačen time što ćelije iz koraka (iii) ili (vii) eksprimiraju CD4, CD8, i TCR α β na nivoima sličnim sveže sakupljenim ćelijama, pri čemu su antigen-prezentujuće ćelije mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) ili veštačke APC (aAPC), pri čemu se opciono PBMC dodaju u ćelijsku kulturu na bilo koji od dana 9 do 17 u koraku (iii), opciono pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u većoj populaciji TIL u koracima (iii) ili (vii) pokazuju jednu ili više karakteristika koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od ekspresije CD27, ekspresije CD28, dužih telomera, povećane ekspresije CD57, i smanjene ekspresije CD56, u odnosu na efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije u trećoj populaciji ćelija i/ili pri čemu efektorske T ćelije i/ili centralne memorijske T ćelije pokazuju povećanu ekspresiju CD57 i smanjenu ekspresiju CD56.
12. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili 11, naznačen time što dodatno sadrži korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira visokoafinitetni T ćelijski receptor, ili pri čemu korak transdukcije prve populacije TIL sa ekspresionim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži jednolančani varijabilni fragment antitelo fuzionisano sa najmanje jednim endodomenom T-ćelijskog signalnog molekula, opciono pri čemu se korak transdukcije događa pre koraka (i), opciono pri čemu se TIL testiraju za vijabilnost posle koraka (vii).
RS20240474A 2016-10-26 2017-10-26 Restimulacija krioprezerviranih tumor-infiltrirajućih limfocita RS65448B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662413387P 2016-10-26 2016-10-26
US201662413283P 2016-10-26 2016-10-26
US201662415452P 2016-10-31 2016-10-31
EP17798045.5A EP3532607B1 (en) 2016-10-26 2017-10-26 Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes
PCT/US2017/058610 WO2018081473A1 (en) 2016-10-26 2017-10-26 Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65448B1 true RS65448B1 (sr) 2024-05-31

Family

ID=60327390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240474A RS65448B1 (sr) 2016-10-26 2017-10-26 Restimulacija krioprezerviranih tumor-infiltrirajućih limfocita

Country Status (24)

Country Link
US (22) US11026974B2 (sr)
EP (2) EP3532607B1 (sr)
JP (3) JP2019532652A (sr)
KR (2) KR20240150531A (sr)
CN (1) CN110099998A (sr)
AU (1) AU2017347851B2 (sr)
BR (1) BR112019008305A2 (sr)
CA (1) CA3041678A1 (sr)
DK (1) DK3532607T3 (sr)
ES (1) ES2977118T3 (sr)
FI (1) FI3532607T3 (sr)
HR (1) HRP20240436T1 (sr)
HU (1) HUE066460T2 (sr)
IL (1) IL266209B2 (sr)
LT (1) LT3532607T (sr)
MD (1) MD3532607T2 (sr)
MX (2) MX2019004707A (sr)
PL (1) PL3532607T3 (sr)
PT (1) PT3532607T (sr)
RS (1) RS65448B1 (sr)
SG (1) SG11201903331QA (sr)
SI (1) SI3532607T1 (sr)
SM (1) SMT202400133T1 (sr)
WO (1) WO2018081473A1 (sr)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015157636A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced expansion of tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
MA45595A (fr) 2016-07-07 2019-05-15 Iovance Biotherapeutics Inc Protéines de liaison au ligand (1) de mort programmée (1) (pd-l1) et leurs procédés d'utilisation
HUE066460T2 (hu) 2016-10-26 2024-08-28 Iovance Biotherapeutics Inc A kriokonzervált tumor infiltráló limfociták restimulációja
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
KR102618948B1 (ko) 2016-11-17 2023-12-27 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 잔유 종양 침윤 림프구 및 그의 제조 및 사용 방법
CA3049165A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
MY206158A (en) 2017-05-24 2024-12-02 Novartis Ag Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer
AR112072A1 (es) 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
CR20200251A (es) * 2017-11-17 2020-07-17 Iovance Biotherapeutics Inc Expansión de til de aspirados con aguja fina y biopsias por punción
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
EP3737743A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US20190284553A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
WO2019210131A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2019217753A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
TW202031273A (zh) * 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
IL281423B2 (en) * 2018-09-20 2024-08-01 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion of TILS from cryopreserved tumor samples
MX2021004191A (es) 2018-10-15 2021-05-27 Nurix Therapeutics Inc Compuestos bifuncionales para degradar la tirosina cinasa de bruton (btk) mediante la trayectoria de ubiquitina proteosoma.
JP7854297B2 (ja) * 2018-11-05 2026-05-01 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
MY210603A (en) * 2018-11-05 2025-10-01 Iovance Biotherapeutics Inc Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
WO2020096927A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
US12611427B2 (en) 2018-11-05 2026-04-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of NSCLC patients refractory for anti-PD-1 antibody
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
US12582722B2 (en) 2019-02-13 2026-03-24 Nurix Therapeutics, Inc. Bifunctional compounds for degrading BTK via ubiquitin proteosome pathway
WO2020180733A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
WO2021113557A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Nurix Therapeutics, Inc. Bifunctional compounds for degrading btk via ubiquitin proteosome pathway
US12516291B2 (en) 2019-12-11 2026-01-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and methods of using the same
BR112022011795A2 (pt) 2019-12-20 2022-08-30 Instil Bio Uk Ltd Métodos para preparar e isolar uma população terapêutica de linfócitos e para tratar câncer em um indivíduo, população terapêutica de linfócitos, bolsa criopreservada, recipiente flexível, e, sistema para extração de linfócitos
KR20220141299A (ko) 2020-01-14 2022-10-19 신테카인, 인크. Il2 오르토로그 및 사용 방법
EP4512828A3 (en) * 2020-02-27 2025-05-14 Turnstone Biologics Corp. Methods for ex vivo enrichment and expansion of tumor reactive t cells and related compositions thereof
EP3892720A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Presenting cell and use thereof in cell therapy
CN115997008A (zh) 2020-04-22 2023-04-21 艾欧凡斯生物治疗公司 协调用于患者特异性免疫疗法的细胞的制造的系统和方法
CA3158133A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
CN115461062A (zh) 2020-04-28 2022-12-09 阿基里斯治疗英国有限公司 T细胞疗法
CN116018158A (zh) * 2020-04-30 2023-04-25 转化基因组学研究所 新抗原知情的肿瘤浸润性淋巴细胞癌免疫疗法
CA3177413A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Michelle SIMPSON-ABELSON Selection of improved tumor reactive t-cells
CA3176826A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP4159843A4 (en) 2020-05-29 2024-07-31 Shanghai Juncell Therapeutics Co., Ltd. MEDIUM FOR SEEDING CELLS OF TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES AND ITS APPLICATION
KR20230074758A (ko) * 2020-09-24 2023-05-31 더 잭슨 래보라토리 면역 세포 요법을 평가하기 위한 인간화 마우스 모델
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
EP4239059A4 (en) 2020-11-19 2024-05-15 Suzhou Grit Biotechnology Co., Ltd. METHOD FOR CULTIVATION OF TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES AND USE THEREOF
EP4259164A1 (en) 2020-12-11 2023-10-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
AU2021401302A1 (en) 2020-12-17 2023-07-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
CN114686430A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 上海赛比曼生物科技有限公司 一种制备til的方法
WO2022165260A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
CA3207359A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Cecile Chartier-Courtaud Adjuvant therapy for cancer
US20240191191A1 (en) 2021-03-19 2024-06-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
JP2024512029A (ja) 2021-03-25 2024-03-18 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｔ細胞共培養効力アッセイのための方法及び組成物、ならびに細胞療法製品との使用
GB202109886D0 (en) 2021-07-08 2021-08-25 Achilles Therapeutics Uk Ltd Assay
EP4320435A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Achilles Therapeutics UK Limited Batch release assay for pharmaceutical products relating to t cell therapies
CA3215830A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Rafael CUBAS Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
JP2024519029A (ja) 2021-05-17 2024-05-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用
US20240287456A1 (en) 2021-06-22 2024-08-29 Achilles Therapeutics Uk Limited A method for producing antigen-specific t cells
WO2022271847A1 (en) * 2021-06-24 2022-12-29 Instil Bio, Inc. Processing of tumor infiltrating lymphocytes
EP4373270A2 (en) 2021-07-22 2024-05-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
JP2024527961A (ja) 2021-07-28 2024-07-26 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｋｒａｓ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法によるがん患者の治療
US20240358835A1 (en) * 2021-08-17 2024-10-31 Orgenesis Inc. Tumor infiltrating lymphocytes with increased metabolic activity
WO2023039488A1 (en) 2021-09-09 2023-03-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1 talen knockdown
CA3236073A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Robert J. Brown Piperidinylpyrazine-carboxamide compounds for treating and preventing cancer and for degrading btk
WO2023077015A2 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
CA3237410A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Friedrich Graf Finck VON FINCKENSTEIN Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4469065A1 (en) 2022-01-28 2024-12-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
CA3243416A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. TUMOR INFILTRATION LYMPHOCYTES MODIFIED TO EXPRESS PAYLOADS
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
JP2025512401A (ja) 2022-04-15 2025-04-17 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 特定のサイトカインの組み合わせ及び／またはＡＫＴｉ処理を使用したＴＩＬ拡張プロセス
CA3251533A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. TREATMENT OF CANCER PATIENTS WITH TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTE THERAPIES IN COMBINATION WITH AN IL-15R AGONIST
US20260021181A1 (en) 2022-08-01 2026-01-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
EP4583889A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
EP4583890A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
EP4612277A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
JP2025539816A (ja) 2022-11-21 2025-12-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の増幅のための２次元プロセス及びそれからの治療法
JP2025539712A (ja) 2022-11-21 2025-12-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 遺伝子編集されたｔ細胞の増殖能を評価するための方法
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2025054540A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of gene-editing using programmable nucleases
WO2025101484A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of endometrial cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
WO1988000970A2 (en) 1986-08-08 1988-02-11 Regents Of The University Of Minnesota Method of culturing leukocytes
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5126132A (en) 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
CN1507357A (zh) 2000-10-31 2004-06-23 PRҩƷ���޹�˾ 提高生物活性分子传递的方法和组合物
ES2422193T3 (es) 2002-06-28 2013-09-09 Life Technologies Corp Métodos para restaurar el repertorio inmune en pacientes con defectos inmunológicos relacionados con la autoinmunidad y trasplante de órganos o de células madre hematopoyéticas
US20050084967A1 (en) 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
US8034334B2 (en) 2002-09-06 2011-10-11 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after non-myeloablative lymphodepleting chemotherapy
ITMI20022118A1 (it) 2002-10-04 2004-04-05 Abiogen Pharma Spa Procedimento per la coltura su larga scala di t-linfociti in un sistema omogeneo.
CN101120083B (zh) 2003-10-08 2013-03-27 威尔森沃尔夫制造公司 利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
US8211425B2 (en) 2005-12-21 2012-07-03 Sentoclone International Ab Method for treating disseminated cancer
CA2634167C (en) 2005-12-21 2015-06-16 Sentoclone Ab Improved method for expansion of tumour-reactive t-lymphocytes for immunotherapy of patients with cancer
US8007785B2 (en) 2005-12-21 2011-08-30 Sentoclone International Ab Method for treating colon cancer with tumour-reactive T-lymphocytes
AU2006328945B2 (en) 2005-12-21 2011-06-30 Sentoclone International Ab Method for treating malignant melanoma
US7951365B2 (en) 2007-06-27 2011-05-31 Deifiera Falun Ab Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with specific cancer types
EP2203746B1 (en) 2007-09-24 2013-03-06 Technion Research & Development Foundation Ltd. T cell subpopulations capable of treating cancer
US20150320798A1 (en) 2012-11-27 2015-11-12 The Johns Hopkins University Use of Post-Transplant Cyclophosphamide Treated Allogeneic Marrow Infiltrating Lymphocytes to Augment Anti-Tumor Immunity
WO2014085437A2 (en) 2012-11-27 2014-06-05 The Johns Hopkins University Use of post-transplant cyclophosphamide treated allogeneic marrow infiltrating lymphocytes to augment anti-tumor immunity
US8383099B2 (en) 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
EP2510086A4 (en) 2009-12-08 2013-05-22 Wolf Wilson Mfg Corp IMPROVED METHODS FOR CELL CULTURES FOR ADOPTIVE CELL THERAPIES
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
WO2012065086A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-2 moiety and a polymer
US20120244133A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
CN103502439B (zh) 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
PL2768939T3 (pl) 2011-10-21 2017-02-28 Cell Medica Limited Urządzenie do aseptycznego rozwoju komórek
GB201121308D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
CN102816734A (zh) 2012-05-09 2012-12-12 阮润生 一种肿瘤抗原特异性t细胞的获取方法
EP2850175B1 (en) 2012-05-18 2020-12-16 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
EP2859093A4 (en) 2012-06-11 2016-08-17 Wolf Wilson Mfg Corp IMPROVED METHODS FOR CELL CULTURES FOR ADOPTIVE CELL THERAPIES
EP2961415B1 (en) 2013-03-01 2021-01-06 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods of producing enriched populations of tumor-reactive t cells from tumor
EP3628322A1 (en) 2013-03-01 2020-04-01 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Cd8+ t cells that also express pd-1 and/or tim-3 for the treatment of cancer
CN103396991A (zh) * 2013-05-02 2013-11-20 陈晚华 一种快速高效扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法
CN118562610A (zh) 2013-06-24 2024-08-30 威尔逊沃夫制造公司 用于透气性细胞培养过程的封闭系统装置和方法
ES2932429T3 (es) 2013-07-15 2023-01-19 Us Health Métodos de preparación de células T anti-antígeno de virus del papiloma humano
US10233425B2 (en) 2013-09-16 2019-03-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD137 enrichment for efficient tumor infiltrating lymphocyte selection
AU2015231041B2 (en) 2014-03-20 2020-07-16 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
WO2015157636A1 (en) * 2014-04-10 2015-10-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced expansion of tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
RU2739770C2 (ru) 2014-06-11 2020-12-28 полибайосепт ГмбХ Экспансия лимфоцитов с использованием композиции цитокинов для активной клеточной иммунотерапии
WO2015188839A2 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Immudex Aps General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
WO2016037054A1 (en) 2014-09-04 2016-03-10 The Johns Hopkins University Activation of marrow infiltrating lymphocytes in hypoxic alternating with normoxic conditions
AU2014407539B2 (en) 2014-10-02 2020-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating T cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation
EP3034092A1 (en) * 2014-12-17 2016-06-22 Université de Lausanne Adoptive immunotherapy for treating cancer
WO2016179006A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating t cells and t cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation from peripheral blood
FR3038324B1 (fr) 2015-06-30 2020-10-30 Lab Francais Du Fractionnement Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique
FR3040396A1 (fr) 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
WO2017048614A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of isolating tumor-reactive t cell receptors from tumor or peripheral blood
AU2016341529B2 (en) 2015-10-22 2023-03-30 Juno Therapeutics Gmbh Methods for culturing cells and kits and apparatus for same
IL258935B2 (en) 2015-10-28 2024-08-01 Life Tech As Selective expansion of different subpopulations of t cells by the alteration of cell surfacing signals and signal ratio
CN105602901B (zh) * 2016-03-11 2020-01-31 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 生物反应器及其搅拌桨和使用其培养til细胞的方法
MX2019000180A (es) 2016-06-28 2019-11-05 Geneius Biotechnology Inc Composiciones de células t para la inmunoterapia.
CN106244538A (zh) 2016-08-04 2016-12-21 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种恶性腹水来源的til细胞的分离培养方法
MY192158A (en) 2016-09-14 2022-08-03 Abbvie Biotherapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies and their uses
HUE066460T2 (hu) * 2016-10-26 2024-08-28 Iovance Biotherapeutics Inc A kriokonzervált tumor infiltráló limfociták restimulációja
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
KR102618948B1 (ko) * 2016-11-17 2023-12-27 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 잔유 종양 침윤 림프구 및 그의 제조 및 사용 방법
US20200095547A1 (en) 2016-12-02 2020-03-26 Darya ALIZADEH Methods for manufacturing t cells expressing of chimeric antigen receptors and other receptors
CN106591232A (zh) 2017-01-04 2017-04-26 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种高效的pd‑1‑cd8+t细胞的培养方法
MX2019007963A (es) 2017-01-06 2019-10-21 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos infiltrantes de tumor (til) con agonistas de la superfamilia de recptor de factor de necrosis tumoral (tnfrsf) y combinaciones terapeuticas de til- y agonistas de tnfrsf.
CA3049165A1 (en) * 2017-01-06 2018-07-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof
MX2019010906A (es) 2017-03-14 2020-02-12 Juno Therapeutics Inc Metodos para almacenamiento criogenico.
JOP20190224A1 (ar) * 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
US11254913B1 (en) * 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
KR20200003913A (ko) 2017-05-10 2020-01-10 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 액상 종양으로부터의 종양 침윤 림프구의 확장 및 그의 치료 용도
AR112072A1 (es) * 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
CN107384867B (zh) 2017-08-04 2020-09-11 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种肿瘤组织til细胞制备方法及专用培养基
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
CN115997008A (zh) * 2020-04-22 2023-04-21 艾欧凡斯生物治疗公司 协调用于患者特异性免疫疗法的细胞的制造的系统和方法
US11918517B2 (en) * 2021-10-07 2024-03-05 Stryker Corporation Cover systems for blocking apertures of patient support apparatuses

Also Published As

Publication number Publication date
US11179419B2 (en) 2021-11-23
US11141438B2 (en) 2021-10-12
US20220378837A1 (en) 2022-12-01
US20220096555A1 (en) 2022-03-31
AU2017347851A1 (en) 2019-05-02
CN110099998A (zh) 2019-08-06
JP2019532652A (ja) 2019-11-14
SMT202400133T1 (it) 2024-05-14
US11311578B2 (en) 2022-04-26
US20210252062A1 (en) 2021-08-19
US11351199B2 (en) 2022-06-07
EP3532607A1 (en) 2019-09-04
US20220088080A1 (en) 2022-03-24
US20220008470A1 (en) 2022-01-13
US11975028B2 (en) 2024-05-07
KR20190066073A (ko) 2019-06-12
US11344581B2 (en) 2022-05-31
WO2018081473A1 (en) 2018-05-03
US11026974B2 (en) 2021-06-08
US20220000927A1 (en) 2022-01-06
FI3532607T3 (fi) 2024-03-15
US11058728B1 (en) 2021-07-13
JP2026012189A (ja) 2026-01-23
DK3532607T3 (da) 2024-04-02
US11304980B2 (en) 2022-04-19
US10517894B2 (en) 2019-12-31
MX2024004500A (es) 2024-05-06
HUE066460T2 (hu) 2024-08-28
AU2017347851B2 (en) 2024-03-07
US12188048B2 (en) 2025-01-07
EP4180520A1 (en) 2023-05-17
PT3532607T (pt) 2024-05-02
US20210260121A1 (en) 2021-08-26
US11344580B2 (en) 2022-05-31
US11857573B2 (en) 2024-01-02
SI3532607T1 (sl) 2024-06-28
BR112019008305A2 (pt) 2019-08-06
US20220000928A1 (en) 2022-01-06
US20220088081A1 (en) 2022-03-24
EP3532607B1 (en) 2024-01-31
US20180228841A1 (en) 2018-08-16
US20220387500A1 (en) 2022-12-08
US20220000929A1 (en) 2022-01-06
JP2023126265A (ja) 2023-09-07
IL266209B1 (en) 2024-10-01
US11351197B2 (en) 2022-06-07
US20220378834A1 (en) 2022-12-01
US20220395534A1 (en) 2022-12-15
US11865140B2 (en) 2024-01-09
ES2977118T3 (es) 2024-08-21
MX2019004707A (es) 2019-08-12
US11266694B2 (en) 2022-03-08
PL3532607T3 (pl) 2024-07-01
LT3532607T (lt) 2024-05-10
US20200299644A1 (en) 2020-09-24
US11969444B2 (en) 2024-04-30
US20220387501A1 (en) 2022-12-08
MD3532607T2 (ro) 2024-07-31
US11369637B2 (en) 2022-06-28
US20220133798A1 (en) 2022-05-05
US20230030883A1 (en) 2023-02-02
IL266209A (en) 2019-06-30
HRP20240436T1 (hr) 2024-06-21
KR20240150531A (ko) 2024-10-15
US20210401889A1 (en) 2021-12-30
US11123371B2 (en) 2021-09-21
CA3041678A1 (en) 2018-05-03
US20210252063A1 (en) 2021-08-19
US11364266B2 (en) 2022-06-21
US11351198B2 (en) 2022-06-07
US20220000926A1 (en) 2022-01-06
SG11201903331QA (en) 2019-05-30
IL266209B2 (en) 2025-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11975028B2 (en) Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes
HK40093229A (en) Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes
HK40013565A (en) Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes
HK40013565B (en) Restimulation of cryopreserved tumor infiltrating lymphocytes