RS65480B1

RS65480B1 - Bispecifična antitela protiv ceacam5 i cd3

Info

Publication number: RS65480B1
Application number: RS20240512A
Authority: RS
Inventors: Sara Majocchi; Klaus Strein
Original assignee: Lamkap Bio Alpha AG
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2024-05-31
Also published as: US20260109779A1; IL291482A; CO2022004685A2; AU2020350205A1; JP7701911B2; CN114786776B; KR20220113353A; CA3150265A1; CN114786776A; EP4013512C0; JP2022548947A; US20230136228A1; BR112022004995A2; EP4013512A1; CL2022000663A1; EP4013512B1; HRP20240626T1; HUE067160T2; WO2021053587A1; PE20221045A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na bispecifična antitela koja se vezuju za humani karcinoembrionalni antigen CEACAM5 (CEA) i humani CD3ε (CEAxCD3 bispecifično antitelo). Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju takva bispecifična antitela i vektore i ćelije domaćine koje sadrže takve polinukleotide. Pronalazak se dalje odnosi na postupke za selekciju i proizvodnju takvih antitela i na postupke uotrebe takvih antitela za upotrebu u lečenju bolesti.

STANJE TEHNIKE

[0002] Uspešno lečenje uznapredovalog/metastatskog solidnog kancera kao što je npr. kancer pankreasa, kolorektalni kancer želuca, kancer pluća itd. je i dalje izazov. Savremena imunoterapija kancera uvela je postupke/tehnike koje pomažu imunološkim ćelijama tela da bolje napadaju i ubijaju ćelije kancera. Na primer, razvijeno je nekoliko tehnika/postupaka za povećanje napada tumorskih ćelija T-ćelijama. Primeri su inhibitori imunih kontrolnih tačaka kao npr. PD-1/PD-L1 koji inhibiraju monoklonska antitela, T-ćelijska bispecifična antitela koja se vezuju za antigen povezan sa tumorom (TAA) i CD3 na T-ćelijama ili CAR-T-ćelijama. CAR-T-ćelije i bispecifična antitela su efikasna kod hematoloških maligniteta i odobrena za npr. lečenje maligniteta B-ćelija ili akutne limfocitne leukemije ALL, ali do sada nije bilo pravog proboja ovih postupaka u terapiji uznapredovalog/metastatskog solidnog kancera. Monoklonska antitela, kao i bispecifična antitela koja se koriste u terapiji, mogu izazvati različite neželjene efekte. Važan problem toksičnosti je sindrom oslobađanja citokina (CRS), koji je na primer pronađen u terapiji alemtuzumabom, muromonabom-CD3, rituksimabom, tosituzumabom i CD19xCD3 bispecifičnim antitelom Blinatumomabom.

[0003] Tabernero et.al. (J Clin Oncol 35, 2017 (suppl. abstr. 3002)) predstavljeni na ASCO 2017, faza 1 kliničkih podataka kod pacijenata sa uznapredovalim/metastatskim kolorektalnim kancerom sa CEAxCD3 bispecifičnim antitelom (RO 6958688, cibisatamab, videti dole) u monoterapiji i u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom atezolizumabom. Cibisatamab ima takozvani 2+1 format, sa jednim Fab fragmentom koji se vezuje za CD3 i sa dva Fab fragmenta koji se vezuju za CEA. Takva antitela su npr. opisana u US20140242079 (WO2014131712) i US20140242080 (WO2014131711).

[0004] Kako se ovde koristi, "TCB2014" se odnosi na bispecifično antitelo koje se vezuje za CEA i CD3 u formatu 2+1 kao što je opisano u US20140242080, koji kao CDR sadrži CDR kao što je prikazano u SEQ ID NOs: 270-276 i 290-296 od US20140242080 (videti takođe CDR regione SEQ ID NO: 4-10 i 24-30 od US20140242079.

[0005] Kako se ovde koristi, „TCB2017“ se odnosi na molekul B u „2+1 IgG CrossFab, obrnutom“ formatu sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivu, modifikacija naelektrisanja u CEA vezivu, humanizovano CEA vezivo) kao što je opisano u WO2017055389 sadrži kao CDR regione, CDR regione kao što su prikazani u SEQ ID NOs: 4-6, 8-10 i 14-19 od WO2017055389.

[0006] Struktura 2+1 se prilično razlikuje od nativnih IgG antitela. Struktura takođe sadrži veštačke aminokiselinske (aa) mostove i dva različita teška lanca spojena pomoću tehnologije ispupčenje u udubljenje/aa sekvence u Fc delu (videti npr. US6737056, WO2013055958). Takva bispecifična antitela (npr. RO6958688, cibisatamab) su imunogena i stoga uzrokuju stvaranje antitela na lek (ADA) i gubitak izloženosti leku usled neutralizacije leka pomoću ADA. Melero et al su prijavili pri dozama od 60-200 mg 50 ili više% pacijenata sa ADA i kod 45% pacijenata gubitak izloženosti (Melero et al., ASCO 2017, Abstract 2549 and Poster No.

41, Abstract videti Journal of Clinical Oncology 35, no.15_suppl (May 20, 2017) 2549-2549). Gubitak izloženosti otežava kontrolisanje praktične terapije i značajno smanjuje verovatnoću za uspeh. Da bi se minimiziralo formiranje ADA, cibisatamab, odnosno kombinacija cibisatamaba i atezolizumaba, se klinički testira u kombinaciji nakon prethodnog tretmana sa obinutuzumabom na anti-CD20 antitelo (videti ClinicalTrials.gov Trial NCT03866239). Predtretman se daje da bi se izvršila deplecija B-ćelija pacijenata sa metastatskim kolorektalnim karcinomima. Deplecija B-ćelija dovodi do pada imunoglobulina pacijenta, a samim tim i potencijalnih ADA, ali u isto vreme dovodi do slabljenja imunog sistema.

[0007] MEDI-565 (AMG211), još jedno bispecifično CEAxCD3 antitelo, jednolančano antitelo, je u kliničkom razvoju, rezultati su objavljeni (videti npr. M. Pishvaian et al. Clin Colorectal Cancer. 2016 DEC; 15(4) 345-351). Studija NCT01284231 (ClinicalTrials.gov) je prijavljena kao završena, nijedno novo ispitivanje nije započeto poslednjih godina. Ovo jednolančano bispecifično antitelo (dva scFv povezana aa linkerom) ima izuzetno nisko poluvreme eliminacije između 2.2 i 6.5 sati (Pishvaian et al.; Clin. Colorectal Cancer, 2016 DEC; 15(4) 345-351).

[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje manje imunogeno CEAxCD3 bispecifično antitelo sa visokom efikasnošću. Takvo antitelo sadrži uobičajeni teški lanac i u jednom primeru izvođenja kapa laki lanac u delu koji se vezuje za CEA i lambda laki lanac u delu koji se vezuje za CD3.

[0009] Koncept upotrebe uobičajenog teškog lanca za dobijanje bispecifičnih antitela pominje se u Fischer et al., Nature Communications 6 (2015): 6113. https://doi.org/10.1038/ncomms7113 i Magistrelli G. et al., MABS 9 (2017) 231-239. Kapa lambda bispecifična antitela su opisana u npr. WO2014087248 (ovde uključeno referencom u celosti). Njihova struktura se gotovo ne razlikuje od strukture nativnog IgG sa posledicom da nema ili ima minimalno formiranje ADA i samim tim sa niskim ili minimalnim gubitkom izloženosti. Sekvenca varijabilnog regiona uobičajenog teškog lanca VH i sekvenca huCD3 VL 1A4 pronalaska su opisane u WO2019175658 (US2019/0284297).

[0010] Što je gore pomenuto, WO2017055389 opisuje bispecifična CEAxCD3 antitela sa 2+1 formatom, ali se vezuju za drugi domen kao cibisatamab. Jedno od ovih antitela (RO7172508 ili RG 6123) je testirano u kliničkom ispitivanju kod pacijenata sa lokalno uznapredovalim i/ili metastatskim CEA pozitivnim solidnim tumorima (ClinicalTrials.gov; potražiti RO7172508), takođe sa obinutuzumabom pre tretmana i u kombinaciji sa atezolizumabom. Prema opisu kliničkog ispitivanja na ClinicalTrials.gov, za neke kohorte nivoa serumskog CEA (izlučeni rastvorljiv CEACAM5, sCEA) ispod određenog praga su bili potrebni kod pacijenata koji su bili lečeni da bi bili podobni za lečenje, što sugeriše da viši nivoi izlučenog rastvorljivog CEACAM5 mogu smanjiti efikasnost ovog CEAxCD3 bispecifičnog antitela. Antitela predmetnog pronalaska pokazuju minimalan uticaj izlučenog rastvorljivog CEA na njihovu efikasnost ubijanja tumorskih ćelija.

[0011] Izlučeni rastvorljivi CEACAM5 je ustanovljeni tumor marker. Nivoi sCEA u plazmi pacijenata sa kancerom mogu ići preko 1000 ng/ml, dok su koncentracije u plazmi kod zdravih osoba ispod 10 ng/ml (npr. Sandler B. et al Anticancer Res 1999, 19(5B), 4229-33). Izlučeni rastvorljivi CEACAM5 stoga može da je u kompeticiji sa CEA vezanim za membranu prisutnim na tumorskim ćelijama za vezivanje terapeutskih anti-CEA antitela i anti-CEA bispecifičnih antitela, potencijalno izazivajući smanjenu efikasnost anti-CEA antitela ili CEAxCD3 antitela. TCB2017 i TCB2014 (videti gore) su pronalazači testirali in vitro u testu na lizu CEA pozitivnih tuorskih ćelija posredovanu preko T-ćelija u prisustvu rastvorljive CEA. Utvrđeno je da dodavanje sCEA testu pomera krivu lize i stoga EC50 vrednost TCB2014 i TCB2017 na veće koncentracije, što sugeriše da se i TCB2014 i TCB2017 značajno vezuju za sCEA.

[0012] Humana porodica CEA sadrži 29 gena, od kojih je 18 eksprimiranih: 7 pripada podgrupi CEA i 11 podgrupi glikoproteina specifičnih za trudnoću. Smatra se da nekoliko članova CEA podgrupe poseduju svojstva ćelijske adhezije. CEACAM5 se ne eksprimira od strane ćelija kolorektalnog kancera, već i kancera pankreasa, kancera želuca, kancera pluća i drugim tipovima kancera. Smatra se da CEACAM5 ima ulogu u urođenom imunitetu (Hammarström S., Semin. Cancer Biol.9(2):67-81 (1999)). Karcinoembrionalni antigen 5 (CEA, CEACAM5 ili CD66e; UniProtKB - P06731) je član ćelijskog adhezionog molekula srodnog sa karcinoembrionalnim antigenom (CEACAM familije) i antigena povezanog sa tumorom (Gold and Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N.L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Više monoklonskih antitela je pripremljeno protiv CEACAM5 u istraživačke svrhe, kao dijagnostički alat i u terapeutske svrhe (videti npr. WO2012117002). Članovi porodice karcinoembrionalnih antigena (CEACAM) su široko eksprimirani i, u zavisnosti od tkiva, sposobni su da regulišu različite funkcije uključujući stimulaciju tumora, supresiju tumora, angiogenezu i aktivaciju neutrofila. Četiri člana ove porodice, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM6 i CEACAM8 su eksprimirani i obogaćeni na humanim neutrofilima (http://www.proteinatlas.org). S obzirom na mehanizam delovanja CEAxCD3 bispecifičnih antitela, unakrsna reaktivnost sa drugim CEACAM može dovesti do deplecije važnih cirkulišućih zdravih ćelijskih populacija. Na primer, unakrsna reaktivnost sa CEACAM8, koja je eksprimirana od strane neutrofila ili hematopoetskih matičnih ćelija, mogla bi dovesti do deplecije takvih populacija ćelija. Pronalazak obezbeđuje CEAxCD3 bispecifično antitelo sa niskom unakrsnom reaktivnošću za jednog ili više članova porodice CEACAM, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM16, CEACAM18, CEACAM 19, CEACAM20 i CEACAM21.

[0013] Mišje monoklonsko anti-CEACAM5 antitelo PR1A3 je pripremljeno fuzijom NS1 (P3/NS l/I-Ag-4-l) ćelija mijeloma sa ćelijama slezine miševa imunizovanih normalnim kolorektalnim epitelom. Richman P. I. and Bodmer W. F., Int. J. Cancer, 39:317-328, 1987 opisuju mišje monoklonsko antitelo PR1A3. Epitopsko mapiranje PRl A3 pokazuje da antitelo ciljno deluje na B3 domen i GPI sidro molekula CEA (Durbin H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4313-4317, 1994). Epitop vezan za PR1 A3 je konformacioni epitop, a ne linearni epitop (Stewart et al., Cancer Immunol. Immunother., 47 (1999) 299-06). Humanizovana PRlA3 (hPRlA3) antitela su opisana npr. od strane Conaghhan P.J., et al., Br. J. Cancer, 98 (2008) 1217-1225 i WO2012117002. CEA vezivo koje se koristi u TCB2014 (nazvano CH1A1A) je humanizovana, afinitetno sazrela i stabilno konstruisana verzija izvedena iz antitela PR1A3. M. Bacac et.al., Clin. Cancer Research 22(13);3286-97 (2016), Conaghan P, et al., Br J Cancer 2008;98:1217-25, i Durbin H, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:4313-7).

[0014] Postupak za lečenje kancera kombinacijom antagonista humane PD-1 ose i bispecifičnog anti-CEAxCD3 antitela pominje se u WO2017118657, a klinički rezultati su objavljeni na ASCO konferenciji 2017 (Tabernero et al, J Clin Oncol 35, 2017 (suppl. abstr.

3002)). Postupak lečenja tumora primenom antagonista imunih kontrolnih tačaka koji vezuju dva ili više različitih ciljnih mesta na putu imunološke kontrolne tačke, i agensa za preusmeravanje T ćelija koji se vezuje za CEA i antigena na površini T ćelije pominje se u WO2015112534. Konjugat koji se sastoji od anti-CEACAM6 antitela sa jednim domenom i ureaze je trenutno u kliničkim ispitivanjima (NCT02309892; WO2016116907). Antitelo klase I koje se vezuje za CEACAM5, CEACAM6 i granulocite pominje se u US20110064653. Bispecifična antitela koja sadrže prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, kovalentno vezana jedno za drugo, pominju se u WO2018053328.

[0015] Anti-CD3ε antitelo opisano u stanju tehnike je SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reaguje i sa CD3 primata i čoveka. SP34 je dostupan od BD Biosciences. Još jedno anti-CD3 antitelo opisano u stanju tehnike je UCHT-1 (videti WO2000041474). Još jedno anti CD3 antitelo opisano u stanju tehnike je BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; used in Phase I/II trials of GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 se razlikuje od UCHT-1 i BC-3 po tome što SP-34 prepoznaje epitop prisutan samo na ε lancu CD3 (videti Salmeron et al., (1991) J. Immunol.

147: 3047), dok UCHT-1 i BC-3 prepoznaju epitop kome doprinose i ε i γ lanci. Anti CD3 antitela su takođe opisana u WO2007042261, WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837, WO2010037838, i US8236308. Bispecifična antitela koja sadrže vezujući deo specifičan za CEA i vezujući deo specifičan za CD3ε su npr. opisana u US20140242079, WO2007071426, WO2013012414, WO2015112534, WO2017118675, i WO2017055389. Antitelo protiv CD3 koje sadrži sekvence drugog vezujućeg dela antitela prema pronalasku pomenuto je u US62/643,095 i PCT/US2019/000232.

[0016] US2012321626 pominje multispecifični Fab fuzioni protein koji sadrži Fab fragment koji se vezuje za N-terminus CD3 epsilona. WO2018199593 pominje bispecifična antitela koja se vezuju za HER3 i CD3.

[0017] Kao što je već pomenuto, rezultati prvih kliničkih ispitivanja sa T-ćelijskim bispecifičnim antitelima TAA x CD3 (TAA = antogen povezan za tumorom) kod pacijenata sa uznapredovalim solidnim tumorima su bili razočaravajući, ali su nedavno objavljeni preliminarni rezultati prve faze za CEAxCD3 bispecifično antitelo cibisatamab. (RO6958688, videti na primer Bacac et al Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016); i US20140242079) pokazuje kod pacijenata sa uznapredovalim kolorektalnim kancerom u monoterapiji i u kombinaciji sa delimičnim odgovorima inhibicije PD-L1 i stabilnom bolešću (J.Tabernero et.al., J. Clin. Oncol.35, 2017 (suppl. Abstr.3002)). Drugi pristup za postizanje boljih rezultata mogao bi biti dodavanje bispecifičnim antitelima T-ćelija ne samo inhibitora ose kontrolne tačke PD-1, već i dodavanje dodatnih inhibitora ili agonista kontrolne tačke. Ali do sada se veruje da nema dostupnih kliničkih podataka koji su obećavajući za takav kombinovani pristup.

[0018] Ograničena dostupnost T-ćelija u uznapredovalim solidnim tumorima je svakako važan mehanizam koji ograničava efikasnost koja se može postići sa bispecifičnim antitelima T-ćelija plus inhibitorima PD-1 ose.

[0019] Umesto dodavanja u kombinaciju bispecifičnog antitela T-ćelija i inhibitora PD-1 ose drugog terapeutskog agensa koji ima za cilj da preusmeri T-ćelije protiv tumorskih ćelija uznapredovalih solidnih tumora, možda bi bilo uspešnije dodati terapeutsko sredstvo koje preusmerava druge imune ćelije ka tumorskim ćelijama, posebno makrofage ili makrofage i prirodne ćelije ubice (NK).

[0020] Predmetni pronalazak obezbeđuje nova CEAxCD3 bispecifična antitela koja su dizajnirana na način da se mogu primenjivati paralelno sa CEAxCD47 bispecifičnim antitelima koja preusmeravaju makrofage i takođe NK-ćelije protiv CEA koje eksprimiraju solidne tumore. Kombinovani napad T-ćelija i makrofaga i NK-ćelija usmerenih na tumore koji eksprimiraju CEA nudi značajnu priliku za bolju efikasnost/ubijanje i fagocitozu tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEA.

[0021] Dosadašnji razočaravajući rezultati sa CAR T-ćelijama u solidnim tumorima mogu imati jednostavno objašnjenje - broj CAR T-ćelija koje prodiru u solidni tumor i distribuiraju se u njemu jednostavno nije dovoljan. Ovo je svakako drugačije kod većine hematoloških maligniteta; CAR T-ćelije mogu dobro pristupiti tumorskim ćelijama, objašnjavajući razliku visoke efikasnosti kod ovih maligniteta u poređenju sa razočaravajućom efikasnošću kod solidnih tumora. Pored toga, CAR T-ćelije mogu biti u velikoj meri potisnute tumorskim mikrookruženjem (TME) solidnih tumora koje je uglavnom snažno imunosupresivno.

[0022] Ovaj pronalazak obezbeđuje nova bispecifična anti-CEAxCD3 antitela sa visokom efikasnošću, malim uticajem sCEA na efikasnost, malom ili nikakvom unakrsnom reaktivnošću na druge CEACAM osim CEACAM5 (= CEA) i stoga smanjenu toksičnost, nisku imunogenost, mogućnost paralelne kombinovane terapije sa CEAxCD47 antitela i sa vrednim farmakokinetičkim svojstvima.

SUŠTINA PRONALASKA

[0023] Sve reference u opisu na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu)

• Pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo (dalje nazvano i kao "bsAb CEAxCD3" ili "CEAxCD3 bispecifično antitelo") koje sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 (dalje nazvan i kao "CEA") i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε (dalje nazvan i kao "CD3").

[0024] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je okarakterisano time što je pomenuto antitelo monovalentno za prvi vezujući deo i monovalentno za drugi vezujući deo.

[0025] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je okarakterisano time što su sekvence konstantnog i varijabilnog okvirnog regiona humane.

[0026] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je okarakterisano time što svaki od prvog i drugog vezujućeg dela sadrži teški lanac imunoglobulina i laki lanac imunoglobulina.

[0027] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo ima prvi vezujući deo koji sadrži teški lanac i drugi vezujući deo koji sadrži teški lanac, pri čemu je teški lanac u svakom vezujućem delu isti (tj. uobičajeni teški lanac). U jednom primeru izvođenja, uobičajeni varijabilni region teškog lanca kao CDRH1 sadrži CDRH1 SEQ ID NO: 2, CDRH2 SEQ ID NO: 3, i CDRH3 SEQ ID NO: 4. U jednom primeru izvođenja, uobičajeni varijabilni region teškog lanca je SEQ ID NO: NO: 1. U jednom primeru izvođenja uobičajeni teški lanac je SEQ ID NO: 30. U jednom primeru izvođenja uobičajeni teški lanac je SEQ ID NO: 43. U primeru izvođenja uobičajeni teški lanac je SEQ ID NO: 44. U jednom primeru izvođenja uobičajeni teški lanac je SEQ ID NO: 45.

[0028] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo je okarakterisano time što u prvom vezujućem delu i drugom vezujućem delu kao teški lanac sadrži uobičajeni teški lanac, koji sadrži u prvom vezujućem delu kao laki lanac sadrži kapa laki lanac, i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrži lambda laki lanac. U jednom primeru izvođenja laki lanac drugog vezujućeg dela je SEQ ID NO: 28, a teški lanac drugog vezujućeg dela je SEQ ID NO: 45 (npr. AB1 i AB-1L3-1/N izvedena bispecifična antitela kao što je AB17L3 -1/N,

AB54L3-1/N, AB60L3-1/N, AB66L3-1N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N i

AB73L3-1/N; za CDR i VL sekvence videti spisak sekvenci).

[0029] AB13,14,15 itd. označavaju prvi vezujući deo (kraci anti-CEACAM5 antitela) i L3-1 označava drugi vezujući deo (krak anti-CD3 antitela, takođe označen kao 1A4) bispecifičnih antitela ovog pronalaska. Bilo koji ABXX anti CEA krak se može kombinovati sa L3-1 anti CD3 krakom da bi se formiralo bispecifično antitelo: npr. ABXXL3-1 označava CEAxCD3 bispecifično antitelo prema pronalasku, koje sadrži WT hIgG1 Fc deo; ABXXL3-1/D označava CEAxCD3 bispecifično antitelo prema pronalasku, koje sadrži hIgG1 Fc deo koji nosi L234A L235A mutacije; ABXXL3-1/N označava CEAxCD3 bispecifično antitelo prema pronalasku, koje sadrži hIgG1 Fc deo koji nosi mutacije L234A L235A P329A.

[0030] U jednom primeru izvođenja korisnom za razumevanje pronalaska, bispecifično antitelo u prvom vezujućem delu i drugom vezujućem delu kao težak lanac sadrži uobičajeni teški lanac, koji u prvom vezujućem delu kao varijabilni region lakog lanca sadrži region tipa lambda i kao konstantni region lakog lanca sadrži region kapa tipa („laki lanac hibridnog formata“) i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrži lambda laki lanac (npr. L3-1AB8 H-CK5 /D, koji nije obuhvaćen zahtevima, videti sliku 2 i opis slike 2).

[0031] U jednom primeru izvođenja korisnom za razumevanje pronalaska, bispecifično antitelo sadrži i prvi vezujući deo i drugi vezujući deo kao teški lanac uobičajeni teški lanac, koji u prvom vezujućem delu kao varijabilni region lakog lanca sadrži region lambda tipa i kao konstantni region lakog lanca sadrži region tipa lambda, i u drugom vezujućem delu kao varijabilni region lakog lanca sadrži region tipa lambda i kao konstantni region lakog lanca sadrži region tipa kapa ("laki lanac hibridnog formata"); na primer. AB8L3-1 H-CK5/D, koji nije obuhvaćen patentnim zahtevima.

[0032] Bispecifična antitela prema pronalasku pokazuju nisko vezivanje/unakrsnu reaktivnost sa članovima porodice CEACAM koji nisu CEACAM5. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo pokazuje da MFI vrednost za vezivanje za PEAKrapid ćelije (ATCC<®>CRL-2828<™>) koje eksprimiraju CEACAM izabranog iz grupe koja se sastoji od CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM16, CEACAM18, CEACAM19, CEACAM20 i CEACAM21 nije više od 2 puta veća u poređenju sa MFI vrednošću za vezivanje za WT PEAK-T ćelije (to jest, netransfektovane PEAK ćelije) pod istim eksperimentalnim uslovima. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo pokazuje MFI vrednost za vezivanje za

[0033] PEAKrapid ćelije koje eksprimiraju CEACAM izabran iz grupe koja se sastoji od CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6 i CEACAM8 koja nije više od 2 puta veća u poređenju sa MFI vrednošću za vezivanje za WT PEAK ćelije pod istim eksperimentalnim uslovima. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo pokazuje MFI vrednost za vezivanje za

[0034] PEAKrapid ćelije koje eksprimiraju CEACAM8 koja nije više od 2 puta veća u poređenju sa MFI vrednošću za vezivanje za WT PEAK ćelije pod istim eksperimentalnim uslovima. Eksperimentalni postupak za transfekciju PEAK ćelija i merenje vezivanja antitela za ove PEAK ćelije je opisan u Primerima 1 i 5.

[0035] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo se vezuje za ćelije MKN-45 (DSMZ br: ACC 409) sa EC50 vrednošću od 0.5 nM do 50 nM. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo se vezuje za MKN-45 ćelije sa EC50 vrednošću od 0.5 nM do 30 nM. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo pokazuje MFI vrednost za vezivanje za MKN-45 ćelije na

[0036] 200 nM, 1000 nM i 5000 nM koja je najmanje dvostruko veća od vrednosti MFI dobijene sa TCB2014. Test vezivanja je opisan u Primeru 7a. U jednom primeru izvođenja, EC50 za ubijanje ćelijske linije tumora MKN-45 izmeren u testu koji sadrži humane PBMC je za bispecifična antitela ovog pronalaska 40% ili niži od EC50 izmerenog za TCB2014. U jednom primeru izvođenja, EC50 za ubijanje ćelijske linije tumora LS-174T izmerenu u testu koji sadrži humane PBMC je za bispecifična antitela ovog pronalaska 40% ili niži od EC50 izmerenog za TCB2014.

[0037] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo ubija ćelije LS174T u testu koji sadrži humane PBMC na način zavisan od koncentracije sa vrednošću EC50 od 0.01 do 10 nM. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo ubija LS174T ćelije u testu koji sadrži humane PBMC na način zavisan od koncentracije sa vrednošću EC50 od 0.01 do 1 nM.

[0038] Test za merenje lize/ubijanja CEA-pozitivnih ćelija sa ponovnim ciljnim delovanjem T-ćelija je opisan u Primeru 8.

[0039] U jednom primeru izvođenja, vrednost EC50 za bispecifično antitelo u istom testu (ubijanje CEA pozitivnih LS 174T tumorskih ćelija) nije povećana za više od faktora 20, u jednom primeru izvođenja ne više od 15, a u jednom primeru izvođenja ne više od 10, u prisustvu 5 µg/ml rastvorljivog CEACAM5, u poređenju sa vrednošću EC50 za lizu bez rastvorljivog CEACAM5 pod istim eksperimentalnim uslovima.

[0040] U sledećem primeru izvođenja, vrednost EC50 za bispecifično antitelo u istom testu nije povećana za više od faktora 10, u jednom primeru izvođenja ne više od 5, u prisustvu 1 µg/ml rastvorljivog CEACAM5, u poređenju sa EC50 vrednošću za lizu bez rastvorljivog CEACAM5 pod istim eksperimentalnim uslovima.

[0041] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo inhibira rast zapremine tumora u modelu HPAF-II do 18. dana za 25% ili više, u poređenju sa rastom zapremine tumora u grupi vehikuluma pod istim eksperimentalnim uslovima. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo inhibira rast zapremine tumora u modelu HPAF-II do 18. dana slično, a ne različito na statistički značajan način, u poređenju sa TCB2014 pod istim eksperimentalnim uslovima. Model mišjeg tumora je opisan u Primeru 9a.

[0042] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži u svakoj podjedinici Fc domena aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za aktivirajući Fc receptor i/ili smanjuju efektorsku funkciju, pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A i L235A i/ili supstitucija P329, izabrana iz grupe koja se sastoji od P329A, P329G i P329R (Numeracija Kabat EU indeksa). U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži u svakoj podjedinici Fc domena aminokiselinske supstitucije L234A i L235A i P329A (Numeracija Kabat EU indeksa). L234A i L235A (LALA) znače da je aminokiselina leucin na poziciji 234/235 zamenjena alaninom. P329A (PA) znači da je aminokiselina prolin na poziciji 329 zamenjena alaninom.

[0043] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži uobičajeni teški lanac. U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži uobičajeni teški lanac koji kao CDR regione sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, kao CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i kao CDRH3 od SEQ ID NO: 4. U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo u drugom vezujućem delu sadrži region lakog lanca koji kao CDR regione sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20.

[0044] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo u prvom vezujućem delu kao konstantni region lakog lanca sadrži region SEQ ID NO: 39. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo u prvom vezujućem delu kao konstantni region lakog lanca sadrži region SEQ ID NO: 41. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo u prvom vezujućem delu kao konstantni region lakog lanca sadrži region SEQ ID NO: 58. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 43 ili uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 44 ili uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 45. U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo u prvom vezujućem delu kao konstantni region lakog lanca sadrži region SEQ ID NO: 39 i uobičajeni teški lanac SEQ ID od SEQ ID NO: 45.

[0045] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25, 26, 27 i 29 ili iz lakog lanca hibridnog formata (LC) grupe SEQ ID NO.: 67, 68, 69 i 71.

[0046] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo u prvom vezujućem delu kao konstantni region lakog lanca sadrži region SEQ ID NO: 39, uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 45, a u drugom vezujućem delu laki lanac SEQ ID NO: 28.

[0047] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je u kompeticiji sa anti-CEA antitelom, koje sadrži VL i VH domene VL i VH sekvenci SEQ ID NO: 48 i 49 (anti-CEA antitelo MEDI).

[0048] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, antitelo je u kompeticiji sa anti-CEA antitelom koje sasdrži VL i VH domene VL i VH sekvenci SEQ ID NO: 46 i 47 (antitelo SM3E), koje sadrži VL i VH domene VL i VH sekvenci SEQ ID NOs: 56 i 57 (Labetuzumab (Lab)), koje sadrži VL i VH domene VL i VH sekvenci SEQ ID NOs: 50 i 51 (SAR), koje sadrži VL i VH domene VL i VH sekvenci SEQ ID NOs: 54 i 55 (T86.66), i sadrži VL i VH domene VL i VH sekvenci SEQ ID NOs: 52 i 53 (CH1A1A). Videti takođe sliku 1 i primer 5c).

[0049] Primeri antitela korisnih kao CEA VL ili CL regioni koji su u kompeticiji sa MEDI za vezivanje za rekombinantnu CEA su anti-CEA antitelo AB1 i antitela dobijena optimizacijom „lead“ jedinjenja AB1 (videti Primer 11 za eksperimentalni postupak). Anti-CEA antitela AB13, 14, 15, 17, 20, 54, 60, 66, 71, 72, 73 i odgovarajuća bispecifična anti CEAxCD3 antitela AB13L3-1, AB14L3-1, AB15L3-1, AB17L3-1, AB20L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB66L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1 i AB73L3-1 su u kompeticiji na isti način kao antitelo AB1 rsp. AB1L3-1. Primeri antitela korisnih kao CEA VL ili CL regioni u bispecifičnim antitelima van patentnih zahteva i koja su u kompeticiji sa SM3E za vezivanje za rekombinantnu CEA su anti-CEA antitelo AB8 i antitela dobijena mutagenezom usmerenom na oligonukleotide AB8, upotrebom degenerisanih oligonukleotida. Primeri antitela korisnih kao CEA VL ili CL regioni u bispecifičnim antitelima van patentnih zahteva i koja su u kompeticiji sa T84.66 za vezivanje za rekombinantnu CEA su anti-CEA antitelo 1B4 i antitela dobijena oligonukleotidnom mutagenezom 1B4, korišćenjem degenerisanih oligonukleotida.

[0050] Primeri antitela korisnih kao CEA VL ili CL regioni u bispecifičnim antitelima van patentnih zahteva, ali koja nisu u kompeticiji ni sa jednim od referentnih antitela za vezivanje za rekombinantnu CEA su anti-CEA antitelo C11 i antitela dobijena oligonukleotidnom mutagenezom C11, upotrebom degenerisanih oligonukleotida.

[0051] AB1 je anti-CEA antitelo sa HC SEQ ID NO: 43 i kapa LC SEQ ID NO: 40, kodirano sekvencama nukleinskih kiselina prikazanim u SEQ ID NO: 80 i 78, respektivno.

[0052] AB8 je anti-CEA antitelo sa HC SEQ ID NO: 43 i lambda LC SEQ ID NO: 42, kodirano sekvencama nukleinskih kiselina prikazanim u SEQ ID NO: 80 i 79, respektivno.

[0053] 1B4 je anti-CEA antitelo sa HC SEQ ID NO: 43 i lambda LC SEQ ID NO: 74, kodirano sekvencama nukleinskih kiselina prikazanim u SEQ ID NO: 80 i 77, respektivno.

[0054] C11 je anti-CEA antitelo sa HC SEQ ID NO: 43 i kapa LC SEQ ID NO: 73, kodirano sekvencama nukleinskih kiselina prikazanim u SEQ ID NO: 80 i 76, respektivno.

[0055] CEA laki lanac koristan kao kapa laki lanac je SEQ ID NO: 40. CEA lak lanac koristan kao kapa lak lanac je SEQ ID NO: 73. CEA laki lanac koristan kao lambda laki lanac je SEQ ID NO: 74. CEA laki lanac koristan kao hibridni kapa lak lanac je SEQ ID NO: 75.

[0056] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži u svakoj podjedinici Fc domena do tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za aktivirajući Fc receptor i/ili efektorsku funkciju pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i supstitucija P329, izabrane iz grupe koja se sastoji od P329A, P329G i P329R (Numeracija Kabat EU indeksa). U jednom primeru izvođenja uobičajeni teški lanac antitela prema pronalasku je SEQ ID NO: 43, 44 ili 45. U jednom primeru izvođenja uobičajeni teški lanac antitela prema pronalasku je SEQ ID NO: 45 (L234A, L235A i P329A).

[0057] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo pokazuje jedno ili više svojstava izabranih iz grupe a) vezivanja za MKN-45 ćelije sa EC50 vrednošću od 0.5 nM do 50 nM, b1) kompeticije sa anti-CEA antitelom, koje sadrži VL i VH domene VL i VH sekvenci SEQ ID NOs: 48 i 49 (MEDI)

c) da sadrži u svakoj podjedinici Fc domena aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za aktivirajući Fc receptor i/ili efektorsku funkciju pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A i L235A i supstitucija P329, izabrane iz grupe koja se sastoji od P329A, P329G i P329R (Numeracija Kabat EU indeksa), d) ubijanja ćelija MKN-45, HPAF-II i/ili LS174T u testu koji sadrži humane PBMC na način zavisan od koncentracije sa vrednošću EC50 od 0.01 do 10 nM.

[0058] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo pokazuje jedno ili više svojstava izabranih iz grupe

a) vezivanja za ćelije MKN-45 sa EC50 vrednošću od 0.5 nM do 50 nM,

b) ubijanja ćelija MKN-45, HPAF-II ili LS174T u testu koji sadrži humane PBMC na način zavisan od koncentracije sa EC50 vrednošću od 0.01 do 10 nM,

c) vezivanja za PEAK ćelije koje eksprimiraju CEACAM5, ali ne i unakrsnu reakciju sa PEAK ćelijama koje eksprimiraju CEACAM8,

d) ubijanja EC50 u TDCC testu (Primer 8) kada se tumorske ćelije LS174T koriste kao ciljne ćelije nije povećano za više od faktora 5 u prisustvu 1 µg/mL sCEA,

e) inhibiranja rasta tumora u HPAF-II modelu za 25% ili više u poređenju sa kontrolnom grupom (samo vehikulum),

f) kompeticije sa anti-CEA antitelom, koje sadrži VL i VH domene VL i VH sekvence SEQ ID NO: 48 i 49 (MEDI), i

g) koji sadrži u svakoj podjedinici Fc domena aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329A (Numeracija Kabat EU indeksa).

[0059] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo pokazuje svojstva od a) do d). U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo pokazuje sva svojstva od a) do f). U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo pokazuje svojstva od a) do d) i g). U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo pokazuje svojstva od a) do d) i f) i g). U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo pokazuje sva svojstva od a) do g).

[0060] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva bispecifično antitelo sadrži [0061] U jednom aspektu van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, koji je okarkaterisan time što

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo, svaki kao teški lanac sadrže uobičajeni teški lanac (cHC) i kao varijabilni region sadrže varijabilni region koji sadrži CDRH1, CDRH2 i CDRH3, CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo sadrži

i) konstantni region kapa lakog lanca (CL) i varijabilni region lakog lanca (VL), koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3, sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 32, CDRL2 od SEQ ID NO: 33 i CDRL3 od SEQ ID NO: 34 ili varijabilni region lakog lanca izveden iz SEQ ID NO: 31 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida, c) drugi vezujući deo sadrži varijabilni region lakog lanca, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži grupu CDR regiona izabranih iz grupe koja se sastoji od

I) CDRL1 od SEQ ID NO: 6, CDRL2 od SEQ ID NO: 7 i CDRL3 od SEQ ID NO: 8,

II) CDRL1 od SEQ ID NO: 10, CDRL2 od SEQ ID NO: 11 i CDRL3 od SEQ ID NO: 12, III) CDRL1 od SEQ ID NO: 14, CDRL2 od SEQ ID NO: 15 i CDRL3 od SEQ ID NO: 16, IV) CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20, i V) CDRL1 od SEQ ID NO: 22, CDRL2 od SEQ ID NO: 23 i CDRL3 od SEQ ID NO: 24. d) drugi vezujući deo sadrži konstantni region lambda lakog lanca.

[0062] U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo u c) sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 i 29

[0063] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, okarakterisan time što

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo svaki kao teški lanac sadrže teški lanac koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4,

b) prvi vezujući deo sadrži varijabilni region lakog lanca (VL), koji kao CDR sadrži CDRL1 izveden iz SEQ ID NO: 32 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida i koji sadrži do četiri aminokiselinske supstitucije, CDRL2 izveden iz SEQ ID NO: 33 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida i koji sadrži do četiri aminokiselinske supstitucije, CDRL3 izveden iz SEQ ID NO: 34 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida i koji sadrži do četiri aminokiselinske supstitucije,

c) drugi vezujući deo sadrži varijabilni region lakog lanca, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20.

[0064] Takva bispecifična antitela su, ali nisu ograničena na, bispecifična anti CEAxCD3 antitela AB13L3-1, AB14L3-1, AB15L3-1, AB17L3-1, AB20L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB61L3-1, AB66ABL3-7-1 i AB73L3-1.

[0065] U jednom aspektu izvan patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo,

koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, okarakterisan tome što:

a) prvi vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca VH, koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4,

b) prvi vezujući deo kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL set izabran iz grupe koja se sastoji od

b1) CDRL1 od SEQ ID NO: 32, CDRL2 od SEQ ID NO: 33 i CDRL3 od SEQ ID NO: 34, b2) CDRL1 od SEQ ID NO: 81, CDRL2 od SEQ ID NO: 82 i CDRL3 od SEQ ID NO: 83, b3) CDRL1 od SEQ ID NO: 84, CDRL2 od SEQ ID NO: 85 i CDRL3 od SEQ ID NO: 86, b4) CDRL1 od SEQ ID NO: 87, CDRL2 od SEQ ID NO: 88 i CDRL3 od SEQ ID NO: 89, b5) CDRL1 od SEQ ID NO: 93, CDRL2 od SEQ ID NO: 94 i CDRL3 od SEQ ID NO: 95, i c) drugi vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca VH koji sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4 i varijabilni region lakog lanca VL koji sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20.

[0066] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je okarakterisano time što sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, okarakterisan time što:

b1) CDRL1 od SEQ ID NO: 90, CDRL2 od SEQ ID NO: 91 i CDRL3 od SEQ ID NO: 92,

b2) CDRL1 od SEQ ID NO: 96, CDRL2 od SEQ ID NO: 97 i CDRL3 od SEQ ID NO: 98,

b3) CDRL1 od SEQ ID NO: 99, CDRL2 od SEQ ID NO: 100 i CDRL3 od SEQ ID NO: 101, b4) CDRL1 od SEQ ID NO: 102, CDRL2 od SEQ ID NO: 103 i CDRL3 od SEQ ID NO: 104, b5) CDRL1 od SEQ ID NO: 105, CDRL2 od SEQ ID NO: 106 i CDRL3 od SEQ ID NO: 107, i

b6) CDRL1 od SEQ ID NO: 111, CDRL2 od SEQ ID NO: 112 i CDRL3 od SEQ ID NO: 113, i

c) drugi vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca VH koji sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4 i varijabilni region lakog lanca VL koji sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20.

[0067] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je okarakterisano time što sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, koji je okarakterisan time što:

b1) CDRL1 od SEQ ID NO: 90, CDRL2 od SEQ ID NO: 91 i CDRL3 od SEQ ID NO: 92, b2) CDRL1 od SEQ ID NO: 105, CDRL2 od SEQ ID NO: 106 i CDRL3 od SEQ ID NO: 107, i

b3) CDRL1 od SEQ ID NO: 111, CDRL2 od SEQ ID NO: 112 i CDRL3 od SEQ ID NO: 113, i

[0068] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva bispecifično antitelo sadrži a) u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH koji ima 97%, 98%, 99% ili 100% aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO: 1, koji sadrži CDR1 od SEQ ID NO: 2, CDR2 od SEQ ID NO: 3 i CDR3 od SEQ ID NO: 4, i

b) varijabilni region lakog lanca VL izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

b1) varijabilni region lakog lanca VL koji ima 97%, 98%, 99% ili 100% aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO: 31 i koji sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 32, CDRL2 od SEQ ID NO: 33, i CDRL3 od SEQ ID NO: 34,

b2) varijabilni region lakog lanca VL koji ima 97%, 98%, 99% ili 100% aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO: 114 i koji sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 81, CDRL2 od SEQ ID NO: 82, i CDRL3 od SEQ ID NO: 83,

b3) varijabilni region lakog lanca VL koji ima 97%, 98%, 99% ili 100% aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO: 115 i CDRL1 od SEQ ID NO: 84, CDRL2 od SEQ ID NO: 85 i CDRL3 od SEQ ID NO: 86,

b4) varijabilni region lakog lanca VL koji ima 97%, 98%, 99% ili 100% aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO: 116 i CDRL1 od SEQ ID NO: 87, CDRL2 od SEQ ID NO: 88 i CDRL3 od SEQ ID NO: 89,

c) drugi vezujući deo varijabilnog regiona teškog lanca VH koji ima 97%, 98%, 99% ili 100% aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO: 1, koji sadrži CDR1 od SEQ ID NO: 2, CDR2 od SEQ ID NO: NO: 3 i CDR3 od SEQ ID NO: 4, i varijabilni region lakog lanca VL koji ima 97%, 98%, 99% ili 100% aminokiselinske identičnosti sa SEQ ID NO: 17, koji sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20.

[0069] U jednom aspektu van patentnih zahteva bispecifično antitelo sadrži

a) u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH SEQ ID NO: 1, i

b1) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 31,

b2) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 114,

b3) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 115,

b4) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 116,

b5) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 118,

b6) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 119,

c) u drugom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 17.

[0070] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je okarakterisano time što sadrži

a) u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH SEQ ID NO: 1, i

b1) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 117,

b2) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 119,

b3) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 120,

b4) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 121,

b5) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 122, i

b6) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 124, i

b7) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 123, i -c) u drugom vezujućem delu, varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 17.

[0071] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je okarakterisano time što sadrži

a) u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH SEQ ID NO: 1, i

b1) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 117,

b2) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 122, i

b3) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 124, i

c) u drugom vezujućem delu, varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 17.

[0072] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži u prvom vezujućem delu

a) varijabilni region teškog lanca VH SEQ ID NO: 1, i

b) laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

b1) laki lanac od SEQ ID NO: 40

b2) laki lanac od SEQ ID NO: 125,

b3) laki lanac od SEQ ID NO: 126,

b4) laki lanac od SEQ ID NO: 127,

b5) laki lanac od SEQ ID NO:129 i u drugom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:1 i laki lanac SEQ ID NO:28. U jednom primeru izvođenja pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo, koje sadrži u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1 i b) laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

b5) laki lanac od SEQ ID NO: 128,

b2) laki lanac od SEQ ID NO: 129,

b3) laki lanac od SEQ ID NO: 130,

b4) laki lanac od SEQ ID NO: 131

b5) laki lanac od SEQ ID NO: 132,

b6) laki lanac od SEQ ID NO: 133, i

b7) laki lanac od SEQ ID NO: 134, i

b8) laki lanac od SEQ ID NO: 135, i

c) u drugom vezujućem delu, varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1 i laki lanac SEQ ID NO: 28.

[0073] U jednom aspektu van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži u prvom vezujućem delu

a) uobičajeni teški lanac izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

a1) teški lanac od SEQ ID NO: 43,

a2) teški lanac od SEQ ID NO: 44, ili

a3) teški lanac od SEQ ID NO: 45, i

b) laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od:

b1) laki lanac od SEQ ID NO: 128,

b2) laki lanac od SEQ ID NO: 130,

b3) laki lanac od SEQ ID NO: 131,

b4) laki lanac od SEQ ID NO: 132,

b5) laki lanac od SEQ ID NO: 133

b6) laki lanac od SEQ ID NO: 134, ili

b7) laki lanac od SEQ ID NO: 135, i

c) u drugom vezujućem delu laki lanac od SEQ ID NO: 28.

[0074] U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku (AB17L3-1/N) sadrži uobičajeni teški lanac od SEQ ID NO: 45 (/N), i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrži laki lanac od SEQ ID NO: 28 (1A4 LC, odnosno L3-1) i u prvom vezujućem delu kao laki lanac sadrži laki lanac od SEQ ID NO: 128 (AB17). U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku (AB71L3-1/N) sadrži uobičajeni teški lanac od SEQ ID NO: 45 (/N), i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrži laki lanac od SEQ ID NO: 28 (L3-1) i u prvom vezujućem delu kao laki lanac sadrži laki lanac od SEQ ID NO: 133 (AB71). U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku (AB73L3-1/N) sadrži uobičajeni teški lanac od SEQ ID NO: 45 (/N), i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrži laki lanac SEQ ID NO: 28 (L3-1) i u prvom vezujućem delu kao laki lanac sadrži laki lanac SEQ ID NO: 135 (AB73).

[0075] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, i

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo sadrže svaki kao teški lanac uobičajeni teški lanac i kao varijabilni region sadrže varijabilni region koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo sadrži

i) konstantni region lambda lakog lanca (CL) i

ii) varijabilni region lakog lanca (VL), koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3, sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 36, CDRL2 od SEQ ID NO: 37 i CDRL3 od SEQ ID NO: 38 ili varijabilni region lakog lanca od SEQ ID NO: 35 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida,

c) drugi vezujući deo sadrži varijabilni region lakog lanca, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži grupu CDR regiona izabranih iz grupe koja se sastoji od

I) CDRL1 od SEQ ID NO: 6, CDRL2 od SEQ ID NO: 7 i CDRL3 od SEQ ID NO: 8,

II) CDRL1 od SEQ ID NO: 10, CDRL2 od SEQ ID NO: 11 i CDRL3 od SEQ ID NO: 12, III) CDRL1 od SEQ ID NO: 14, CDRL2 od SEQ ID NO: 15 i CDRL3 od SEQ ID NO: 16, IV) CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20, i V) CDRL1 od SEQ ID NO: 22, CDRL2 od SEQ ID NO: 23 i CDRL3 od SEQ ID NO: 24. d) drugi vezujući deo sadrži konstantni region hibridnog-kapa lanca.

[0076] U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo u c) sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70 i 71.

[0077] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, drugi vezujući deo kao konstantni region lakog lanca sadrži konstantni region lambda lakog lanca SEQ ID NO: 41; u tom slučaju, prvi vezujući deo u jednom primeru izvođenja kao konstantni region lakog lanca sadrži region lakog lanca hibrid-kapa SEQ ID NO: 58.

[0078] U jednom primeru izvođenja, krak koji nosi konstantni region hibridnog lakog lanca zasniva se na ukupnim osobinama bsAb, uključujući, ali ne ograničavajući se na stabilnost i produktivnost.

[0079] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva

varijabilni region lakog lanca prvog vezujućeg dela je izveden iz SEQ ID NO: 35 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida, uobičajeni teški lanac je SEQ ID NO: 45, a varijabilni region uobičajenog teškog lanca je od SEQ ID NO: 1.

[0080] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, i

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo svaki kao teški lanac sadrže uobičajeni teški lanac i kao varijabilni region sadrže varijabilni region koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo sadrži

i) konstantni region kapa lakog lanca (CL), i

ii) varijabilni region lakog lanca (VL), koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 64, CDRL2 od SEQ ID NO: 65 i CDRL3 od SEQ ID NO: 66 ili varijabilni region lakog lanca izveden iz SEQ ID NO: 63 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide, c) drugi vezujući deo sadrži varijabilni region lakog lanca, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži grupu CDR regiona izabranih iz grupe koja se sastoji od sledećih:

I) CDRL1 od SEQ ID NO: 6, CDRL2 od SEQ ID NO: 7 i CDRL3 od SEQ ID NO: 8,

[0081] U jednom primeru izvođenja, drugi vezujući deo u c) sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 i 29.

[0082] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, varijabilni region lakog lanca prvog vezujućeg dela je izveden iz SEQ ID NO: 63 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida, uobičajeni teški lanac je SEQ ID NO: 45.

[0083] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, i

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo svaki kao teški lanac sadrže uobičajeni teški lanac i kao varijabilni region sadrže varijabilni region koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo konstantnog regiona lambda lakog lanca (CL) i varijabilni region lakog lanca (VL), koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 60, CDRL2 od SEQ ID NO: 61 i CDRL3 od SEQ ID NO: 62 ili varijabilni region lakog lanca izveden iz SEQ ID NO: 59 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida,

I) CDRL1 od SEQ ID NO: 6, CDRL2 od SEQ ID NO: 7 i CDRL3 od SEQ ID NO: 8, II) CDRL1 od SEQ ID NO: 10, CDRL2 od SEQ ID NO: 11 i CDRL3 od SEQ ID NO: 12, III) CDRL1 od SEQ ID NO: 14, CDRL2 od SEQ ID NO: 15 i CDRL3 od SEQ ID NO: 16, IV) CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20, i V) CDRL1 od SEQ ID NO: 22, CDRL2 od SEQ ID NO: 23 i CDRL3 od SEQ ID NO: 24. d) drugi vezujući deo sadrži konstantni region hibridnog-kapa lanca.

[0084] U dodatnom aspektu van patentnih zahteva, drugi vezujući deo kao konstantni region lakog lanca sadrži lambda region konstantnog lakog lanca SEQ ID NO: 41; u tom slučaju, prvi vezujući deo u jednom primeru izvođenja kao konstantni region lakog lanca sadrži konstantni region hibridnog lakog lanca SEQ ID NO: 58. Izbor kraka koji nosi konstantni region hibridnog lakog lanca zasniva se na ukupnim svojstvima konačnog bsAb, uključujući, ali ne ograničavajući se na stabilnost i produktivnost.

[0085] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, varijabilni region lakog lanca prvog vezujućeg dela je izveden iz SEQ ID NO: 59 mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida.

[0086] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, i

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo svaki kao teški lanac sadrže uobičajeni teški lanac) i kao varijabilni region sadrže varijabilni region koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo sadrži konstantni region lakog lanca humanog kapa tipa i varijabilni region lakog lanca humanog kapa tipa, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 32 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline, CDRL2 od SEQ ID NO: 33 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline i CDRL3 od SEQ ID NO: 34 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina,

c) drugi vezujući deo sadrži konstantni region lakog lanca humanog lambda tipa i varijabilni region lakog lanca humanog lambda tipa, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži grupu CDR regiona izabranih iz grupe koja se sastoji od sledećih:

I) CDRL1 od SEQ ID NO: 6, CDRL2 od SEQ ID NO: 7 i CDRL3 od SEQ ID NO: 8, II) CDRL1 od SEQ ID NO: 10, CDRL2 od SEQ ID NO: 11 i CDRL3 od SEQ ID NO: 12, III) CDRL1 od SEQ ID NO: 14, CDRL2 od SEQ ID NO: 15 i CDRL3 od SEQ ID NO: 16, IV) CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20, i V) CDRL1 od SEQ ID NO: 22, CDRL2 od SEQ ID NO: 23 i CDRL3 od SEQ ID NO: 24.

[0087] U tom slučaju, drugi vezujući deo u c) sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 i 29.

[0088] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, i

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo svaki kao teški lanac sadrže uobičajeni teški lanac i kao varijabilni region sadrže varijabilni region koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo sadrži konstantni region lakog lanca humanog lambda tipa i varijabilni region lakog lanca humanog lambda tipa, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži CDRL seta izabranog iz grupe koja se sastoji od CDRL1 od SEQ ID NO: 36 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina, CDRL2 od SEQ ID NO: 37 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina i CDRL3 od SEQ ID NO: 38, sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina, c) drugi vezujući deo sadrži hibridni kapa konstantni region lakog lanca i varijabilni region lakog lanca humanog lambda tipa, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži grupu CDR regiona izabranih iz grupe koja se sastoji od

I) CDRL1 od SEQ ID NO: 6, CDRL2 od SEQ ID NO: 7 i CDRL3 od SEQ ID NO: 8,

II) CDRL1 od SEQ ID NO: 10, CDRL2 od SEQ ID NO: 11 i CDRL3 od SEQ ID NO: 12, III) CDRL1 od SEQ ID NO: 14, CDRL2 od SEQ ID NO: 15 i CDRL3 od SEQ ID NO: 16, IV) CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20, i V) CDRL1 od SEQ ID NO: 22, CDRL2 od SEQ ID NO: 23 i CDRL3 od SEQ ID NO: 24.

[0089] U tom slučaju, drugi vezujući deo u c) sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70 i 71.

[0090] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, i

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo svaki kao teški lanac sadrže uobičajeni teški lanac i kao varijabilni region sadrže varijabilni region koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo sadrži konstantni region lakog lanca humanog lambda tipa i varijabilni region lakog lanca humanog lambda tipa, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži CDRL seta izabranog iz grupe koja se sastoji od CDRL1 od SEQ ID NO : 60 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline, CDRL2 od SEQ ID NO: 61 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline i CDRL3 od SEQ ID NO: 62 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina, i

c) drugi vezujući deo sadrži konstantni region lakog lanca humanog kapa tipa i varijabilni region lakog lanca humanog lambda tipa, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sadrži grupu CDR regiona izabranih iz grupe koja se sastoji od sledećih:

I) CDRL1 od SEQ ID NO: 6, CDRL2 od SEQ ID NO: 7 i CDRL3 od SEQ ID NO: 8,

[0091] U tom slučaju, drugi vezujući deo u c) sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70 i 71.

[0092] U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, bispecifično antitelo sadrži prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, i

a) prvi vezujući deo i drugi vezujući deo svaki kao teški lanac a sadrže uobičajeni teški lanac i kao varijabilni region sadrži varijabilni region koji kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3 sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, b) prvi vezujući deo sadrži konstantni region lakog lanca humanog kapa tipa i varijabilni region lakog lanca humanog kapa tipa, koji kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3, sadrži CDRL set izabran iz grupe koja se sastoji od CDRL1 od SEQ ID NO: 64 sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina, CDRL2 od SEQ ID NO: 65 sa supstitucijom 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina i CDRL3 od SEQ ID NO: 66, i sa supstitucijom od 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina

[0093] U tom slučaju, drugi vezujući deo u c) sadrži laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 i 29.

[0094] U jednom primeru izvođenja, prvi vezujući deo kao varijabilnu okvirnu sekvencu lakog lanca sadrži okvirnu sekvencu SEQ ID NO: 31. U aspektu van patentnih zahteva, prvi vezujući deo kao varijabilnu okvirnu sekvencu lakog lanca sadrži okvirnu sekvencu SEQ ID NO: 35. U jednom primeru izvođenja van patentnih zahteva, prvi vezujući deo kao varijabilnu okvirnu sekvencu lakog lanca sadrži okvirnu sekvencu SEQ ID NO: 59. U jednom primeru izvođenja izvan patentnih zahteva, prvi vezujući deo kao varijabilnu okvirnu sekvencu lakog lanca sadrži okvirnu sekvencu SEQ ID NO: 63.

[0095] U jednom primeru izvođenja, prvi vezujući deo koji se specifično vezuje za CEA, kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca aminokiselinske sekvence koja je 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 31 ili SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 59 ili SEQ ID NO: 63, i drugi vezujući deo koji se specifično vezuje za CD3, kao varijabilni region teškog lanca sadrži varijabilni region teškog lanca aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1 i kao varijabilni region lakog lanca sadrži varijabilni region lakog lanca aminokiselinske sekvence izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 21.

[0096] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži

prvi vezujući deo specifičan za CEA, koji sadrži varijabilni domen kapa lakog lanca i konstantni domen kapa lakog lanca i drugi vezujući deo specifičan za CD3ε, koji sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca i konstantni domen lambda lakog lanca.

[0097] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži

prvi vezujući deo specifičan za CEA, koji sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca i konstantni domen kapa lakog lanca i drugi vezujući deo specifičan za CD3ε, koji sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca i konstantni domen lambda lakog lanca.

[0098] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži

prvi vezujući deo specifičan za CEA, koji sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca i konstantni domen lambda lakog lanca i drugi vezujući deo specifičan za CD3ε, koji sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca i konstantni domen kapa lakog lanca.

[0099] U jednom primeru izvođenja, Fc domen pokazuje smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa nativnim/divljim tipom IgG1 Fc domena. U primerima izvođenja, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa ne-proizvedenim Fc domenom. U jednom primeru izvođenja, Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za jedan ili više Fc receptora i/ili smanjuju efektorske funkcije. U jednom primeru izvođenja takva jedna ili više supstitucija su izabrane iz grupe koja se sastoji od Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (gubitak Fc ugljenih hidrata), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 i His435 (Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem.276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J.9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). U jednom primeru izvođenja antitelo se odnosi na FcR vezivanje podklase IgG4 ili podklase IgG1 ili IgG2 sa mutacijom u S228, L234, L235 i/ili D265, i/ili sadrži mutaciju PVA236. U jednom primeru izvođenja, mutacije u Fc domenu su S228P, L234A, L235A, L235E i/ili PVA236. U sledećem primeru izvođenja, mutacije u Fc domenu su u IgG4 S228P i u IgG1 L234A i L235A. U jednom primeru izvođenja, supstitucija jedne ili više aminokiselina u Fc domenu koja smanjuje vezivanje za jedan ili više Fc receptora i/ili smanjuje efektorske funkcije je na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe L234, L235 i P329 (Numeracija Kabat EU indeksa). U primerima izvođenja, svaka podjedinica Fc domena sadrži dve aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili redukuju efektorsku funkciju pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A i L235A (Numeracija Kabat EU indeksa). U primerima izvođenja, svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili redukuju efektorsku funkciju pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329A (Numeracija Kabat EU indeksa). U jednom takvom izvođenju, Fc domen je IgG1Fc domen, posebno humani IgG1Fc domen (Numeracija Kabat EU indeksa). U jednom primeru izvođenja, Fc domen je iz podklase IgG4, i u jednom primeru izvođenja iz podklase IgG4 sa mutacijom S228P.

[0100] U jednom primeru izvođenja, Fc receptor je Fcy receptor. U jednom primeru izvođenja, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom primeru izvođenja, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U jednom primeru izvođenja, Fc receptor je humani FcyRIIIA, FcyRI i/ili FcyRIIIA. U jednom primeru izvođenja, efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) zavisna od antitela, ali nije ograničena samo na ADCC.

[0101] U jednom izvođenju kapa CL region SEQ ID NO: 58 fis koji se koristi u drugom vezujućem delu kao CL region u konstrukciji bispecifičnog antitela koje sadrži uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 43, 44 ili 45 i lambda CL region SEQ ID NO: 41 kao CL region u prvom vezujućem delu.

[0102] U jednom primeru izvođenja kapa CL region SEQ ID NO: 58 se koristi u drugom vezujućem delu, specifično vezujući se za CD3 kao CL region u konstrukciji bispecifičnog antitela, koje sadrži uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 43, 44, ili 45, i lambda CL region SEQ ID NO: 41 kao CL region u prvom vezujućem delu, koji se specifično vezuje za CEACAM5.

[0103] U jednom primeru izvođenja kapa CL region SEQ ID NO: 58 se koristi u drugom vezujućem delu, koji se specifično vezuje za CD3 kao CL region u konstrukciji bispecifičnog antitela, koje sadrži uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 43, 44, ili 45, varijabilni laki lanac SEQ ID NO: 5, 9, 13, 17 ili 21, i lambda CL region SEQ ID NO: 41 kao CL region u prvom vezujućem delu, koji se specifično vezuje za CEACAM5.

[0104] Korisno za dalje razumevanje pronalaska, oligonukleotid, izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 76, 77, 78 i 79, koristi se u sazrevanju afiniteta antitela mutagenezom usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida odgovarajućeg varijabilnog regiona lakog lanca. SEQ ID NO.: 31, 35, 59 i 63.

[0105] U sledećem aspektu obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog pronalaska, koji sadrži korake a) kultivisanja ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antitela i b) izolaciju bispecifičnog antitela. Pronalazak takođe obuhvata bispecifično antitelo proizvedeno postupkom pronalaska.

[0106] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Pronalaskom su takođe obuhvaćeni postupci za korišćenje bispecifičnog antitela i farmaceutske kompozicije pronalaska. U jednom primeru izvođenja pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu kao lek. U jednom primeru izvođenja je obezbeđeno bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti kod individue kojoj je to potrebno. U specifičnom primeru izvođenja, bolest je kancer.

[0107] Takođe je obezbeđeno bispecifično antitelo pronalaska za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje bolesti kod individue kome je to potrebno; kao i postupak lečenja bolesti kod individue, koji sadrži primenu na pomenutu osobu terapeutski efikasne količine kompozicije koja sadrži bispecifično antitelo prema pronalasku u farmaceutski prihvatljivom obliku. U specifičnom primeru izvođenja, bolest je kancer. U bilo kom od gornjih primera izvođenja, individua je poželjno sisar, posebno čovek.

[0108] Bispecifična antitela su korisna u indukovanju lize ciljne ćelije, posebno tumorske ćelije, što sadrži dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa bispecifičnim antitelom pronalaska u prisustvu T ćelije, posebno citotoksične T ćelije.

[0109] Sledeći primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEA.

[0110] Sledeći primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka prema pronalasku, naznačeno time što je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera jednjaka, kancera spoja želuca/jednjaka, kancera pankreasa i kancera dojke.

[0111] Sledeći primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji sa anti-CD47 antitelom. U jednom primeru izvođenja anti-CD47 antitelo je magrolimab, ALX148 ili TTI-621 i/ili TTI-622.

[0112] Sledeći primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku, za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji sa drugim bispecifičnim antitelom koje sadrži treći vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CEACAM5, i četvrti vezujući deo koji se specifično vezuje za humani CD47 u lečenju subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEA.

[0113] Takva druga bispecifična CEAxCD47 antitela su opisana u PCT/IB2019/054559 i US16/428,359.

[0114] Sledeći primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu prema pronalasku, okarakterisano time što se bispecifično antitelo prema pronalasku i drugo bispecifično CEAxCD47 antitelo primenjuju na pomenutog subjekta naizmenično u intervalima od 6 do 15 dana, ali ne ograničavajući se na takve intervale.

[0115] Sledeći primer izvođenja pronalaska je prvo bispecifično antitelo prema pronalasku, koje sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5 i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3 prema pronalasku, i drugo bispecifično antitelo CEAxCD47 za upotrebu u lečenju kancera prema pronalasku, okarakterisano time što navedeni kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa i kancer dojke.

[0116] Sledeći primer izvođenja pronalaska je kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo prema pronalasku, okarakterisano time što nije u kompeticiji sa navedenim drugim CEAxCD47 bispecifičnim antitelom kao što je gore definisano za upotrebu u lečenju subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEA.

[0117] Bispecifična antitela su korisna u postupku za lečenje humanih pacijenata kod kojih je dijagnostikovan tumor (kancer), posebno solidni tumor, posebno solidni kancer koji eksprimira CEA, posebno kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa i kancer dojke, koji sadrži primenu efikasne količine bispecifičnog antitela prema pronalasku i drugog bispecifičnog antitela kao što je opisano u PCT/IB2019/054559 i US16/428,359, protiv CEA i CD47, na humanog pacijenta, pri čemu postupak zatim sadrži:

primenu na pacijenta doze od 0.1 do 30 mg/kg, u sledećem primeru izvođenja od 0.5 do 10 mg/kg, u sledećem primeru izvođenja od 1 do 10 mg/kg navedenog drugog anti CEAxCD47 antitela, npr. nedeljno tokom 4 do 12 nedelja,

primena na pacijenta navedenog drugog antitela q1, q2w, q3w ili izborno q4w,

primena nakon ovih 4 do 12 nedelja i nakon dodatnih 2 ili 3 ili 4 poluvremena eliminacije pomenutog anti CEAxCD47 antitela na pacijenta doze od 0.1 do 10 mg/kg antitela prema pronalasku,

primena na pacijenta navedenog antitela prema pronalasku q1, q2w, q3w ili izborno q4w, čekanje 2 ili 3 ili 4 poluživota eliminacije pomenutog antitela prema pronalasku i zatim izborno ponavljanje pomenutog ciklusa primene CEA × CD47 bispecifičnog antitela nakon čega sledi primena CEA × CD3 bispecifičnog antitela i izborno ponovo ponavljanje tog ciklusa.

[0118] Ovaj "naizmenični" postupak se primenjuje ako su antitelo pronalaska i drugo bispecifično antitelo kompetitivni u pogledu vezivanja za CEA.

[0119] U slučaju da pomenuto CEA × CD47 bispecifično antitelo i CEA × CD3 bispecifično antitelo prema ovom pronalasku nisu kompetitivni, dva bispecifična antitela se takođe mogu primeniti na način („istovremeni način“) da pacijent doživi terapeutski efikasne koncentracije u plazmi i tkivu oba bispecifična antitela paralelno, npr. primenom na pacijenta u oko isto vreme doze od 0.1 do 30 mg/kg, u daljoj upotrebi od 0.5 do 10 mg/kg, u daljoj upotrebi 1 do 10 mg/kg bispecifičnog antitela CEA × CD47 i 0.1 do 10 mg/kg CEA × CD3 bispecifičnog antitela ovog pronalaska, nakon čega sledi jedna ili više ovih kombinovanih primena sa učestalošću od q1w ili q2w ili q3w ili izborno q4w.

[0120] Termin "q1w" označava primenu jednom nedeljno; q2w znači primenu svake dve nedelje itd.

[0121] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač.

[0122] Sledeći poželjan primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0123] Sledeći poželjan primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju solidnih tumorskih poremećaja koji eksprimiraju CEA.

[0124] Sledeći poželjan primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju kolorektalnog kancera, NSCLC (nesitnoćelijskog kancera pluća), kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa ili kancera dojke.

[0125] Sledeći primer izvođenja pronalaska je kompozicija prema pronalasku, okarakterisana time što kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa ili kancer dojke.

[0126] Sledeći primer izvođenja pronalaska je antitelo prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji farmaceutske kompozicije.

[0127] Sledeći primer izvođenja pronalaska je antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač za upotrebu u proizvodnji farmaceutske kompozicije.

[0128] Sledeći primer izvođenja pronalaska je antitelo prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka u lečenju solidnih tumorskih poremećaja.

[0129] Sledeći primer izvođenja pronalaska je antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju kolorektalnog kancera, NSCLC (nesitnoćelijskog kancera pluća), kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa ili kancera dojke.

[0130] Bispecifična antitela su korisna u postupku indukovanja ćelijske lize tumorske ćelije koji sadrži dovođenje u kontakt tumorske ćelije sa bispecifičnim antitelom bilo kog od gore opisanih primera izvođenja. U nekim upotrebama, tumorska ćelija je ćelija kolorektalnog kancera, NSCLC (nesitnoćelijskog kancera pluća), ćelija kancera želuca, ćelija kancera jednjaka, ćelija kancera pankreasa ili ćelija kancera dojke.

[0131] U jednoj upotrebi, ćelijska liza je indukovana ćelijskom citotoksičnošću usmerenom na T ćelije (TDCC).

[0132] Bispecifična antitela su korisna u postupku lečenja subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEA, a postupak sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja.

[0133] Bispecifična antitela su korisna u postupku lečenja subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEA, pri čemu postupak sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom koje se vezuje za humani CEA i humani CD47. Ako su CEAxCD47 antitelo i CEAxCD3 antitelo u kompeticiji, oni će biti u kompeticiji za CEA receptore na površini tumorske ćelije i zauzetost i efikasnost receptora za svakog partnera u kombinaciji zavise od njihovog afiniteta vezivanja i njihovih koncentracija u plazmi i stoga je teško predvideti i takođe varijabilno tokom vremena da li koncentracije dva leka imaju različito poluvreme eliminacije, odnosno klirens iz tela. Prema tome, konkurentna CEAxCD3 i CEAxCD47 bispecifična antitela treba davati uzastopno (naizmenično). Ako CEAxCD3 i CEAxCD47 bispecifična antitela nisu ili su samo minimalno kompetitivna, mogu se davati ne samo uzastopno, već i paralelno (istovremeno), što može biti prednost jer ubijanje tumorskih ćelija angažovanjem T-ćelija od strane CEAxCD3 bispecifičnog antitela i u isto vreme angažovanjem makrofaga od strane CEAxCD47 bispecifičnog antitela očekuje se da će biti aditivno ili čak može biti sinergističko, što znači da se efikasnost povećava ako se oba leka daju paralelno.

[0134] Bispecifična antitela su korisna u postupku povećanja preživljavanja bez progresije i/ili ukupnog vremena preživljavanja kod subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEA, pri čemu navedeni postupak sadrži primenu na navedenog subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih primera izvođenja. U jednoj upotrebi, kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer dojke, karcinom glave i vrata, kancer materice, kancer bešike ili drugi kancer koji eksprimira CEA.

[0135] U određenim upotrebama ovih postupaka, bispecifično antitelo se primenjuje u kombinaciji sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem. U jednoj upotrebi, subjekat je pacijent koji boluje od kolorektalnog kancera ili kancera pluća ili kancera želuca, kancera jednjaka, ili kancera pankreasa ili kancera dojke ili drugog kancera koji eksprimira CEA.

[0136] U određenim upotrebama ovih postupaka, bispecifično antitelo pronalaska se primenjuje na pacijenta u dozama u opsegu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom. U određenim upotrebama, bispecifično antitelo pronalaska se primenjuje na pacijenta u dozama u rasponu od 1 do 20 mg/kg.

[0137] Bispecifična antitela su korisna u postupku lečenja subjekta koji ima kancer koji eksprimira CEA, pri čemu postupak koji sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo kog od gore opisanih oblika u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom protiv humanog CEA i humanog CD47. U određenim upotrebama ovih postupaka, bispecifično antitelo se primenjuje u kombinaciji sa bispecifičnim anti-CEAxCD47 antitelom u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. U određenim upotrebama ovih postupaka, bispecifično anti-CEAxCD47 antitelo se primenjuje naizmenično sa antitelom pronalaska, sa intervalima od 6 do 15 dana između primena antitela pronalaska i bispecifičnog anti-CEAxCD47 antitela. U određenim upotrebama, anti-CEAxCD47 antitelo se primenjuje na pacijenta u dozama u rasponu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom.

[0138] U određenim upotrebama ovih postupaka, bispecifično antitelo se primenjuje u kombinaciji sa antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. U određenim upotrebama ovih postupaka, nespecifično antitelo se primenjuje u kombinaciji sa bispecifičnim anti-CEAxCD47 antitelom i antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. U određenim upotrebama, antagonist PD-1 ose se primenjuje na pacijenta u dozama u opsegu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom.

[0139] Bispecifična antitela su korisna u postupku povećanja vremena preživljavanja bez progresije i/ili ukupnog vremena preživljavanja kod subjekta koji ima kancer koji abnormalno eksprimira CEA, pri čemu pomenuti postupak sadrži primenu na navedenog subjekta terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela bilo koje od gore navedenih opisanih upotreba. U jednom primeru izvođenja, kancer je kolorektalni kancer, nesitnoćeliski kancer pluća (NSCLC), kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa ili kancer dojke.

[0140] U određenim upotrebama ovih postupaka, bispecifično antitelo se primenjuje u kombinaciji sa hemoterapijom ili terapijom zračenjem. U jednoj upotrebi, subjekat je pacijent sa kancerom sa kolorektalnim kancerom ili kancerom pluća ili kancerom želuca, kancerom jednjaka, ili kancerom pankreasa ili kancerom dojke ili drugim kancerom koji eksprimira CEA.

[0141] Sledeći primer izvođenja pronalaska obezbeđuje bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu u bilo kom od gore opisanih postupaka lečenja. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa i kancera dojke.

[0142] Sledeći primer izvođenja pronalaska obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju bispecifična antitela koja su ovde otkrivena ili njihov domen (npr., varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca) koji se imunospecifično vezuje za CEACAM5 ili CD3ε. U određenim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira laki ili teški lanac ovde opisanog antitela. Polinukleotidi mogu da sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju teški lanac koji sadrži VH ili CDR teškog lanca antitela opisanih ovde. Polinukleotidi mogu da sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju laki lanac koji sadrži VL ili CDR regione lakog lanca antitela opisanih ovde.

[0143] Određeni primeri izvođenja su vektori koji sadrže izolovane polinukleotide koji su ovde otkriveni. Određeni drugi primeri izvođenja su ćelije koje sadrže izolovane polinukleotide ili vektore koji kodiraju bispecifična antitela koja su ovde otkrivena. U nekim primerima izvođenja, ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od Streptomyces, kvasca, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 ćelija, biljnih ćelija, ćelija insekata i humane ćelije u kulturi tkiva.

[0144] Određeni primeri izvođenja su postupci za pripremu ovde otkrivenih antitela. U nekim primerima izvođenja, postupak pripreme antitela sadrži ekspresiju antitela upotrebom ćelija koje sadrže izolovane polinukleotide ili vektore koji kodiraju bispecifična antitela koja su ovde otkrivena. U nekim primerima izvođenja, postupak pripreme antitela sadrži kultivisanje ćelije koja sadrži izolovani polinukleotid ili vektor koji kodira bispecifična antitela koja su ovde otkrivena i izolovanje antitela eksprimiranog u njemu.

Opis crteža

Slika 1: Spajanje epitopa novih CEA veziva koja se koriste u kapa/lambda (KL) CEAxCD3 bispecifičnim antitelima (detalji u Primeru 5c)

Za karakterizaciju novih CEA vezujućih antitela iz ovog pronalaska koristi se kompetitivni imunotest. Kompetitivni profil blokiranja je kreiran protiv antitela koja se sva vezuju za CEACAM5 (CEA) i za koja je epitop vezivanja već objavljen. SM3E, MEDI (=MEDI-565), SAR, T84.66, Labetuzumab i CH1A1A su takva antitela, za detalje o ovim antitelima i testu videti Primer 5c.

Sl. 2 Agilent profil prečišćenih bispecifičnih antitela

U Primeru 6 je opisana ekspresija, prečišćavanje i analize novih kapa lambda bispecifičnih CEAxCD3 antitela. Prečišćena bispecifična antitela se analiziraju elektroforezom u uslovima denaturacije i redukcije. Koristi se bioanalizator Agilent 2100, na slici je prikazan tipičan rezultat dobijen za kapa lambda antitela ovog pronalaska AB1 L3-1/D (KL CEAxCD3 bispecifično antitelo sa lambda CD3 LC SEQ ID NO: 28 i kapa CEA LC SEQ ID NO: 40 i uobičajeni HC SEQ ID NO: 44) i L3-1AB8 H-CK5/D (Hibrid KL CEAxCD3 bispecifično antitelo sa hibrid-kapa CD3 LC SEQ ID NO: 70 i lambda CEA LC SEQ ID NO: 42 i uobičajeni HC SEQ ID NO: 44). I4 L3-1/D je bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom kao AB1 L3-1/D i L3-1AB8 H-CK5/D, ali drugi krak koji se ne vezuje za CEA, ovo antitelo se često koristi u farmakološkim testovima kao kontrolno antitelo.

Sl. 3 Vezivanje za CD3<POS>Jurkat ćelije (i CD3<NEG>TIB-153 ćelije)

Vezivanje KL bispecifičnih antitela pronalaska AB1 L3-1/D i L3-1AB8 H-CK5/D zavisno od koncentracije za CD3 eksprimirajuće Jurkat ćelije. Oba KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. Y4L3-1/D je KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA. Slika sa desne strane pokazuje da nema vezivanja za CD3 negativnu ćelijsku liniju TIB-153 čak i pri koncentraciji bispecifičnih antitela od 100 nM.

Sl. 4 Vezivanje za CEA<POS>MKN-45 ćelije (i CEA<NEG>MKN-45 hCEA<KO>ćelije) Vezivanje KL bispecifičnih antitela pronalaska AB1 L3-1/D i L3-1AB8 H-CK5/D u zavisnosti od koncentracije za ćelije koje eksprimiraju MKN-45 CEA. Oba KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. Y4L3-1/D, KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA, ne vezuje se za MKN-45 ćelije. Slika sa desne strane pokazuje da nema vezivanja za ćelijsku liniju MKN-45 nakon „knockout“ CEACAM5 čak i pri koncentraciji od 100 nM.

Sl. 5 Vezivanje za CEA<POS>LS174T ćelije

Vezivanje KL bispecifičnih antitela pronalaska AB1 L3-1/D i L3-1AB8 H-CK5/D u zavisnosti od koncentracije za CEA koje eksprimiraju LS 174T ćelije. Oba KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. Y4L3-1/D, KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA, ne vezuje se za ćelije LS 174T.

Sl. 6 Ubijanje CEA<POS>MKN-45 ćelije (i CEA<NEG>MKN-45_hCEA<KO>ćelije)

T-ćelijski preusmereno ubijanje/liza MKN-45 ćelija zavisno od koncentracije od strane KL bispecifičnih antitela pronalaska AB1 L3-1/D i L3-1AB8 H-CK5/D (test opisan u Primeru 8 a). Oba KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. Oba KL bispecifična antitela pokazuju istu potenciju ubijanja. Ovo je iznenađujuće/neočekivano jer je vezivanje AB1 L3-1/D za MKN-45 mnogo slabije od vezivanja L3-1AB8 H-CK5/D (videti sliku 4).

Y4L3-1/D, KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA, pokazuje samo veoma nisku potenciju ubijanja/lize pri približno 100 puta većim koncentracijama.

Desna slika: Samo veoma malo nespecifično ubijanje/liza CEA je „knocked out“ MKN-45 ćelije sa sva 3 bispecifična antitela.

Sl. 7 Ubijanje CEA<POS>LS-174T

T-ćelijski preusmereno ubijanje/liza LS-174T ćelija zavisno od koncentracije pomoću KL bispecifičnih antitela pronalaska AB1 L3-1/D i L3-1AB8 H-CK5/D (test opisan u Primeru 8 a). Oba KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. L3-1AB8 H-CK5/D pokazuje jaču potenciju ubijanja od AB1 L3-1/D. Vezivanje L3-1AB8 H-CK5/D za LS-174T ćelije je snažnije od vezivanja AB1 L3-1/D (videti sliku 5).

Y4L3-1/D, KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA, pokazuje samo veoma nisku potenciju ubijanja/lize pri više od 100 puta većim koncentracijama.

Sl. 8 Vezivanje monoklonskog anti CEA mAb 1B4 za različite rekombinantne proteine (ELISA). CEA ECD = Ekstracelularni domen CEA; CEA A3B3 je A3 B3 domen CEA.

Rekombinantni mezotelin MSLN se koristi kao kontrola za merenje nespecifičnog vezivanja (vezivanje nije specifično za ECD CEA, odnosno A3B3 domen CEA).

Sl. 9 Vezivanje monoklonskog anti CEA mAb C11 za različite rekombinantne proteine (ELISA). CEA ECD = Ekstracelularni domen CEA; CEA A3B3 je A3 B3 domen CEA. Rekombinantni mezotelin MSLN se koristi kao kontrola za merenje nespecifičnog vezivanja (vezivanje nije specifično za ECD CEA, odnosno A3B3 domen CEA).

Sl. 10 Vezivanje antitela lead optimizacionog talasa 1 za CD3<POS>Jurkat ćelije (i CD3<NEG>TIB-153 ćelije)

Vezivanje KL bispecifičnih antitela pronalaska AB13L3-1/N, AB14L3-1/N, AB15L3-1/N, AB17L3-1/N i AB20L3-1/N zavisno od koncentracije za CD3 ćelije koje eksprimiraju HUT-78. Sva KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. AB1L3-1/N je roditeljsko KL bispecifično antitelo iz kojeg su dobijena gore pomenuta bsAb antitela“lead“ optimizacijom. Y4L3-1/N je KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA. TCB 2014 odgovara drugom CEAxCD3 T-ćelijskom bispecifičnom antitelu opisanom u US20140242079 koje je uključeno kao referentno antitelo. hIgG1 odgovara nevezujućem humanom IgG1 antitelu koje se koristi kao kontrola izotipa. Slika sa desne strane pokazuje da nema vezivanja za CD3 negativnu ćelijsku liniju JKTβ-del čak i pri koncentraciji od 100 nM bispecifičnih antitela. Postupak je opisan u Primeru 7b.

Sl. 11 Vezivanje antitela „lead“ optimizacionog talasa 1 za CEA<POS>MKN-45 ćelije, HPAF-II ćelije i LS174T (ATCC<®>CL-188<™>) ćelije (i CEA<NEG>MKN-45__hCEA<KO>ćelije)

Vezivanje KL bispecifičnih antitela pronalaska AB13L3-1/N, AB14L3-1/N, AB15L3-1/N, AB17L3-1/N i AB20L3-1/N zavisno od koncentracije za CEA pozitivne MKN-45 (A); HPAF-II (C) i LS174T (D) ili CEA negativne MKN-45_hCEA<KO>(B) ćelije. Sva KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. AB1L3-1/N je roditeljsko KL bispecifično antitelo iz kojeg su prethodno pomenuta bsAb antitela dobijena sazrevanjem afiniteta. Y4L3-1/N je KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA. TCB 2014 odgovara drugom CEAxCD3 T-ćelijskom bispecifičnom antitelu opisanom u US20140242079 koje je uključeno kao referentno antitelo. hIgG1 odgovara nevezujućem humanom IgG1 antitelu koje se koristi kao kontrola izotipa. Slika 10B pokazuje da nema vezivanja za MKN-45_hCEA<KO>ćelije CEA negativne ćelijske linije čak i pri koncentraciji od 100 nM bispecifičnih antitela. Vezivanje antitela ovog pronalaska za ćelije MKN-45 i/ili HPAF-II pri koncentraciji od 100 nM je 40% ili više veće od vezivanja TCB2014. Postupak opisan u Primeru 7a.

Sl. 12 Ubijanje CEA<POS>MKN-45, HPAF-II i LS174T ćelija (i CEA<NEG>MKN-45_hCEA<KO>ćelije) antitelima „lead“ optimizacionog talasa 1

Ubijanje/liza CEA pozitivnih MKN-45 (A); HPAF-II (C) i LS174T (D) ili CEA negativnih MKN-45_hCEA<KO>(B) ćelija pomoću KL bispecifičnih antitela pronalaska AB13L3-1/N, AB14L3-1/N, AB15L3-1/N, AB17L3-1/N i AB20L3-1/N (test opisan u Primeru 8a). Sva KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. Sva KL bispecifična antitela pokazuju poboljšano ubijanje u poređenju sa roditeljskim AB1L3-1/N antitelom, iz kojeg su dobijena „lead“ optimizacijom, kada su korišćene CEA-pozitivne ćelije (A, C, D), ali samo veoma nisko nespecifično ubijanje /liza CEA je „knock out“ ćelije MKN-45 (B). Y4L3-1/N, KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA, pokazuje samo veoma nisku potenciju ubijanja/lize pri najvišim testiranim koncentracijama. TCB 2014 odgovara drugom CEAxCD3 T-ćelijskom bispecifičnom antitelu opisanom u US20140242079 koje je uključeno kao referentno antitelo. EC50 bispecifičnih antitela ovog pronalaska je niži od EC50 TCB2014, što pokazuje poboljšanu potenciju za ubijanje tumorskih ćelija. Postupak opisan u Primeru 8a.

Sl. 13 Vezivanje antitela „lead“ optimizacionog talasa 2 za CD3<POS>primarne T-ćelije (CD4+ i CD8+) i CD3<NEG>B-ćelije i monocite

Vezivanje KL bispecifičnih antitela pronalaska AB54L3-1/N, AB60L3-1/N, AB66L3-1/N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N i AB73L3-1/N zavisno od koncentracije KL bispecifičnih antitela pronalaska za CD3 pozitivne primarne CD4+ T-ćelije (A) i primarne CD8+ T-ćelije (B) ili za CD3 negativne B-ćelije (C) i Monocite (D). Sva KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak i vezuju se slično za CD3-pozitivnu populaciju T-ćelija. Y4L3-1/N, KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA, vezuje se podjednako dobro za CD3 pozitivne T-ćelije. TCB 2014 odgovara drugom CEAxCD3 T-ćelijskom bispecifičnom antitelu opisanom u US20140242079 koje je uključeno kao referentno antitelo. Anti-humano CD47 antitelo B6H12 (aCD47 mAb) je korišćeno kao pozitivna kontrola (T-ćelije, B-ćelije i monociti eksprimiraju CD47). Sekundarni Ab odgovara samo stanju gde je samo detekciono antitelo dodato ćelijama i služi za određivanje pozadinskog signala (negativna kontrola). Sva testirana antitela ne pokazuju vezivanje za CD3 negativne ćelijske populacije čak i pri koncentraciji od 200 nM.

Sl. 14 Vezivanje antitela „lead“ optimizacionog talasa 2 za CEA<POS>MKN-45 ćelije, HPAF-II ćelije i LS174T ćelije (i CEA<NEG>MKN-45_hCEA<KO>ćelije)

Vezivanje KL bispecifičnih antitela pronalaska AB54L3-1/N, AB60L3-1/N, AB66L3-1/N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N i AB73L3-1/N zavisno od koncentracije KL bispecifičnih antitela pronalaska za CEA pozitivne MKN-45 (A); HPAF-II (C) i LS174T (D) ili CEA negativne MKN-45_hCEA<KO>(B) ćelije. Sva KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. Y4L3-1/N je KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA. TCB 2014 odgovara drugom CEAxCD3 T-ćelijskom bispecifičnom antitelu opisanom u US20140242079 koje je uključeno kao referentno antitelo. Slika 14B pokazuje da nema vezivanja za CEA negativnu ćelijsku liniju MKN-45_hCEA<KO>ćelije čak i pri koncentraciji od 200 nM bispecifičnih antitela. Za sliku 14A, vrednosti EC50 su prikazane u tabeli 4. Vezivanje bispecifičnih antitela pronalaska pri koncentraciji od 200 nM je 40% ili više veće od vezivanja TCB2014.

Sl. 15 Ubijanje CEA<POS>MKN-45, HPAF-II i LS174T ćelije (i CEA<NEG>MKN-45 hCEA<KO>ćelije) antitelima „lead“ optimizacionog talasa 2

Ubijanje/liza CEA pozitivnih MKN-45 (A); HPAF-II (C) i LS174T (D) ili CEA negativnih MKN-45_hCEA<KO>(B) ćelija pomoću KL bispecifičnih antitela pronalaska AB54L3-1/N, AB60L3-1/N, AB66L3-1/N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N i AB73L3-1/N (opisan test u primeru 8a). Sva KL bispecifična antitela nose isti CD3 krak. Y4L3-1/N, KL bispecifično antitelo sa istim CD3 krakom, ali sa drugim krakom koji se ne vezuje za CEA, pokazuje samo veoma nisku potenciju ubijanja/lize pri najvišim testiranim koncentracijama. TCB 2014 odgovara drugom CEAxCD3 T-ćelijskom bispecifičnom antitelu opisanom u US20140242079 koje je uključeno kao referentno antitelo. U poređenju sa ovim referentnim antitelom TCB2014, KL bispecifična antitela pronalaska AB54L3-1/N, AB60L3-1/N, AB66L3-1/N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N i AB73L3-1/N sva pokazuju niže vrednosti EC50, respektivno jače ubijanje CEA pozitivnih ciljnih ćelija (A, C, D), ali ekvivalentno nisko nespecifično ubijanje/liza CEA „knock out“ MKN-45 ćelija (B). Za sliku 15A, C i D, vrednosti EC50 su prikazane u tabeli 5.

Sl. 16 Izlučivanje citokina nakon ubijanja tumorskih ćelija MKN45 posredovano T ćelijama Izlučivanje perforina (B); Granzima B (C); IFN-γ (D); TNF-α (E); IL-2 (F); IL-6 (G); IL-10 (H) posredovano KL bispecifičnim antitelima pronalaska AB17L3-1/N, AB72L3-1/N i AB73L3-1/N nakon ubijanja MKN45 tumorskih ćelija posredovanog T ćelijama (E:T (humane PBMC: tumorske ćelije) = 10:1, 48 h inkubacije, specifična liza je prikazana u (A). Postupak opisan u Primeru 8e.

Sl. 17 Aktivacija T-ćelija nakon ubijanja tumorskih ćelija MKN-45 posredovanog T ćelijama Ushodna rregulacija humanih CD4+ i CD8+ T-ćelija CD25 (A i B) i CD69 (C i D) posredovana KL bispecifičnim antitelima pronalaska AB17L3-1/N, AB72L3-1/N i AB73L3-1/N 2 dana nakon T ćelijski posredovanog ubijanja CEA-pozitivnih MKN-45 tumorskih ćelija (ubijanje/liza tumorskih ćelija prikazanih na slici 16A).

Uprkos statistički nerazličitoj lizi tumorskih ćelija na 100 nM, manja aktivacija T-ćelija antitela prema pronalasku u poređenju sa TCB2014 sugeriše niže neželjene efekte pri istoj lizi tumora, Postupak opisan u Primeru 8c.

Sl. 18 In vivo antitumorska efikasnost u modelu HPAF-II kod NOG miševa sa prenosom huPBMC In vivo antitumorska efikasnost KL bispecifičnih antitela pronalaska AB17L3-1/N, AB72L3-1/N i AB73L3-1/N i TCB2014 (sve pojedinačne injekcije od 10 mg/kg) u modelu HPAF-II tumorske ćelijske linije kod NOG miševa sa huPBMC transferom. Miševi su randomizovani 11. dana, kada je prosečna zapremina tumora bila blizu 150 mm<3>. Rezultati pokazuju srednju vrednost i SEM od 8 miševa zapremine tumora izmerene kaliperom u različitim studijskim grupama. Nije pronađena statistička razlika između AB73L3-1/N i TCB2014. Postupak opisan u Primeru 9a.

Definicije

[0146] Termini se ovde koriste kao što se generalno koriste u tehnici, osim ako nisu drugačije definisani u sledećem tekstu.

[0147] Kako se ovde koristi, termin "deo koji se vezuje za antigen, vezujući deo" se u svom najširem smislu odnosi na deo antitela koji specifično vezuje antigensku determinantu kao što su CEA, CD47 i CD3.

[0148] Tačnije, kako se ovde koristi, vezujući deo koji se vezuje za membranski vezan humani karcinoembrionalni antigen (CEA, isto kao CEACAM5) ili za CD3 specifično se vezuje za CEA ili CD3, tačnije za ćelijsku površinu ili za membranu vezan CEA ili CD3. Pod "specifično vezivanje, specifično za, vezivanje za" podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i da se može razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. U nekim primerima izvođenja, stepen vezivanja anti-ciljnog antitela za nepovezani, neciljani protein je oko 10 puta, poželjno >100 puta manji od vezivanja antitela za pomenuto ciljno mesto mereno, npr., površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) npr. Biacore<®>, enzimskim imunosorbent (ELISA) ili protočnom citometrijom (FACS). Ciljna mesta su proteini o kojima se ovde govori - npr. CEA, CD47 i CD3ε.

[0149] "Specifično vezivanje za CEA, CD3, vezivanje za CEA, CD3" se u jednom primeru izvođenja odnosi na antitelo koje je sposobno da se veže za ciljne CEA odn. CD3 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao terapeutski agens u preusmeravanju T-ćelija na tumorske ćelije preko vezivanja CD3, tj. CEA.

[0150] Poželjno, bispecifično antitelo prema pronalasku se vezuje za epitop CD3 koji je sačuvan od različitih vrsta, poželjno među ljudima i makakijima.

[0151] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. U jednom primeru izvođenja antitelo je antitelo pune dužine. Kako se ovde koristi, termin "teški lanac antitela" se odnosi na teški lanac antitela, koji se sastoji od varijabilnog regiona (varijabilnog domena) i konstantnog regiona (konstantnog domena) kako je definisano za antitelo pune dužine. Kako se ovde koristi, termin "laki lanac antitela" se odnosi na laki lanac antitela, koji se sastoji od varijabilnog regiona i konstantnog regiona kako je definisano za antitelo pune dužine. Konstantni laki lanci, korisni za ovaj pronalazak, sadržani su u lakim lancima kako je otkriveno u ovom pronalasku.

[0152] Termin "antitelo pune dužine" označava antitelo koje se sastoji od dva "teška lanca antitela pune dužine" i dva "laka lanca antitela pune dužine". "Teški lanac antitela pune dužine" je polipeptid koji se sastoji u pravcu od N-terminusa do C-terminusa od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 teškog lanca antitela (CH1), zglobnog regiona antitela (HR), konstantnog domena 2 teškog lanca antitela (CH2) i konstantnog domena 3 teškog lanca antitela (CH3), skraćeno kao VH-CH1-HR-CH2-CH3. "Laki lanac antitela pune dužine" je polipeptid koji se sastoji u pravcu od N-terminusa do C-terminusa od varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL) i konstantnog domena lakog lanca antitela (CL), skraćeno kao VL-CL. Konstantni domen lakog lanca antitela (CL) može biti κ (kapa) ili λ (lambda). Dva domena antitela pune dužine povezana su zajedno preko inter-polipeptidnih disulfidnih veza između CL domena i CH1 domena i između zglobnih regiona teških lanaca antitela pune dužine. Primeri tipičnih antitela pune dužine su prirodna antitela kao što su IgG (npr. IgG 1 i IgG2), IgM, IgA, IgD i IgE. Antitelo pune dužine prema pronalasku je u jednom primeru izvođenja humanog tipa IgG1, u jednom dodatnom primeru izvođenja koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u delu Fc kao što je definisano u nastavku. Antitelo pune dužine prema pronalasku sadrži dva vezujuća dela, od kojih je svaki formiran pomoću para VH i VL, od kojih se jedan vezuje za CEA, a drugi za CD3.

[0153] Kako se ovde koristi, termin "Fc region; Fc domen" se odnosi na C-terminalni region teškog lanca IgG; u slučaju IgG1 antitela, C-terminalni region sadrži -CH2-CH3 (videti gore). Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu neznatno da variraju, Fc region teškog lanca IgG obično se definiše tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na poziciji Cys226 do karboksil-terminusa.

[0154] Konstantni regioni su dobro poznati u stanju tehnike i npr. opisani od strane Kabat, E.A., (videti npr., Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785- 2788).

[0155] Termin "epitop" uključuje bilo koju polipeptidnu determinantu sposobnu da se specifično veže za antitelo. U određenim aspektima, determinante epitopa uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i, u određenim aspektima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region ciljnog mesta koji je vezan antitelom.

[0156] Kako se ovde koristi, termin "uobičajeni teški lanac (cHC)" odnosi se na polipeptid koji se sastoji u smeru od N-terminusa do C-terminusa od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 teškog lanca antitela (CH1), zglobnog regiona antitela (HR), konstantnog domena 2 teškog lanca antitela (CH2) i konstantnog domena 3 teškog lanca antitela (CH3), skraćeno kao VH-CH1-HR-CH2-CH3. Uobičajeni teški lanci pogodni za bispecifična antitela prema pronalasku su teški lanci kao što su opisani u WO2012023053, WO2013088259, WO2014087248, WO2019175658, i WO2016156537.

[0157] U jednom primeru izvođenja cHC bispecifičnog antitela prema pronalasku kao CDR regione teškog lanca sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 2, CDRL2 od SEQ ID NO: 3 i CDRL3 od SEQ ID NO: 4. U jednom primeru izvođenja, cHC bispecifičnog antitela prema pronalasku kao varijabilni region teškog lanca sadrži VH region SEQ ID NO: 1. U jednom primeru izvođenja cHC bispecifičnog antitela prema pronalasku ima SEQ ID NO: 43, 44 ili 45.

[0158] Format bispecifičnih antitela prema pronalasku i koji sadrži uobičajeni teški lanac, omogućava afinitetno prečišćavanje bispecifičnih antitela koja se ne razlikuju od standardnog IgG molekula i sa karakteristikama koje se ne razlikuju od standardnog monoklonskog antitela (videti npr. WO2013088259, WO2012023053), obećavajući nikakav ili nizak potencijal imunogenosti kod pacijenata.

[0159] Kako se ovde koristi "AB1L3-1, AB17L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB66L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1, AB73L3-1 i slično" odnosi se na bispecifična CEAxCD3 antitela prema pronalasku, koja sadrže uobičajeni teški lanac koji kao CDR regione teškog lanca sadrži CDR regione od SEQ ID NO: 2, 3 i 4 i u drugom vezujućem delu laki lanac koji kao CDR regione lakog lanca sadrži CDR regione SEQ ID NO: 18, 19 i 20. AB1 itd. stoga označava prvi vezujući deo (anti-CEACAM5 vezujući deo), a L3-1 označava drugi vezujući deo (anti-CD3 vezujući deo).

[0160] U jednom primeru izvođenja AB1L3-1, AB17L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB66L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1, AB73L3-1 i slično sadrže uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 43 (WT hIgG 1) i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrže laki lanac SEQ ID NO: 28. Takva bispecifična antitela pronalaska su u primerima označena i kao AB1L3-1, AB17L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1, AB73L3-1.

[0161] U jednom primeru izvođenja AB1L3-1, AB17L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB66L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1, AB73L3-1 i slično sadrže uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 44 (hIgG1 sa L234A L235A mutacijama) i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrže laki lanac SEQ ID NO: 28 Takva bispecifična antitela pronalaska su označena u primerima kao AB1L3-1/D, AB17L3-1/D, AB71L3- 1/D, AB72L3-1/D, AB73L3-1/D i slično.

[0162] U jednom primeru izvođenja AB1L3-1, AB17L3-1, AB54L3-1, AB60L3-1, AB66L3-1, AB71L3-1, AB72L3-1, AB73L3-1 i slično sadrže uobičajeni teški lanac SEQ ID NO: 45 (IgG1 sa L234A L235A P329A mutacijama) i u drugom vezujućem delu kao laki lanac sadrže laki lanac SEQ ID NO: 28 Takva bispecifična antitela pronalaska su označena u primerima kao AB1L3-1/N, AB17L3-1/N, AB54L3-1/N, AB60L3-1/N, AB66L3-1/N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N, AB73L3-1/N i slično.

[0163] Bispecifična antitela prema pronalasku, koja sadrže uobičajeni teški lanac, mogu se napraviti na primer prema WO2012023053. Postupci opisani u WO2012023053 stvaraju bispecifična antitela koja su po strukturi identična humanom imunoglobulinu. Ovaj tip molekula se sastoji od dve kopije jedinstvenog polipeptida teškog lanca, prvog varijabilnog regiona lakog lanca fuzionisanog sa Kapa konstantnim domenom i drugog varijabilnog regiona lakog lanca fuzionisanog sa Lambda konstantnim domenom.

[0164] U bispecifičnim antitelima prema pronalasku jedno vezujuće mesto pokazuje specifičnost za CEA, a drugo mesto pokazuje specifičnost za CD3, pri čemu svakom doprinose teški i odgovarajući laki lanci. Varijabilni regioni lakog lanca mogu biti iz porodice Lambda ili Kapa i poželjno su fuzionisani za Lambda i Kapa konstantne domene, respektivno. Ovo je poželjno da bi se izbeglo stvaranje ne-prirodnih polipeptidnih spojeva. Međutim, takođe je moguće dobiti krak antitela koji se može koristiti za generisanje bispecifičnih antitela iz pronalaska fuzijom varijabilnog domena lakog lanca sa konstantnim domenom Lambda za bilo koju od dve specifičnosti ili fuzijom varijabilnog domena Lambda lakog lanca sa Kapa konstantnim domenom, takođe za bilo koju od dve specifičnosti. Bispecifična antitela opisana u WO 2012023053 su „κλ tela“. Ovaj format κλ-tela omogućava afinitetno prečišćavanje bispecifičnog antitela koje se ne razlikuje od standardnog IgG molekula sa karakteristikama koje se ne razlikuju od standardnog monoklonskog antitela i, stoga, povoljnije je u poređenju sa prethodnim formatima uključujući npr. aminokiselinske mostove ili druge neprirodne elemente.

[0165] Suštinski korak postupka je identifikacija dva Fv regiona antitela (svaki sastavljen od varijabilnog lakog domena i varijabilnog teškog domena) koji imaju različite specifičnosti antigena koji dele isti varijabilni domen teškog lanca. Brojni postupci su opisani za stvaranje monoklonskih antitela i njihovih fragmenata. (videti, npr. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Potpuno humana antitela su molekuli antitela u kojima sekvenca i lakog i teškog lanca, uključujući CDR 1 i 2, potiče od humanih gena. CDR3 region može biti humanog porekla ili dizajniran sintetičkim putem. Takva antitela se nazivaju "humana antitela" ili "potpuno humana antitela". Humana monoklonska antitela se mogu pripremiti korišćenjem trioma tehnike; tehnika humanog hibridoma B-ćelija (videti Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); i tehnika EBV hibridoma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (videti Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Humana monoklonska antitela se mogu koristiti i mogu se proizvesti korišćenjem humanih hibridoma (videti Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) ili transformacijom humanih B-ćelija sa Epstein Barr virusom in vitro (videti Cole, et al., supra).

[0166] Termin "CD3ε ili CD3" kako se ovde koristi odnosi se na humani CD3ε opisan pod UniProt P07766 (CD3E _HUMAN). Termin "antitelo protiv CD3, anti CD3 antitelo" odnosi se na antitelo koje se vezuje za CD3ε.

[0167] Kako se ovde koristi, termin "CEA, CEACAM5" se odnosi na humani karcinoembrionalni antigen (CEA, CEACAM-5 ili CD66e; UniProtKB - P06731) koji je glikoprotein ćelijske površine i antigen povezan sa tumorom (Gold and Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein NL, J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Kako se ovde koristi, termin "CEACAM6" se odnosi na humani CEACAM6 (CD66c; UniProtKB - P40199), koji je takođe član porodice molekula adhezije ćelija povezanih sa karcinoembrionalnim antigenom (CEACAM). Kako se ovde koristi, termin "CEACAM1" se odnosi na humani CEACAM1 (UniProtKB - P13688 (CEAM1_HUMAN) koji je takođe član porodice molekula adhezije ćelija povezanih sa karcinoembrionalnim antigenom (CEACAM). Kako se ovde koristi, termin "CEACAM8" se odnosi na humani CEACAM8 (UniProtKB - P31997 (CEAM8 _HUMAN) koji je takođe član porodice molekula adhezije ćelija povezanih sa karcinoembrionalnim antigenom (CEACAM). Dodatne informacije i informacije o drugim članovima CEA porodice mogu se naći na http://www.uniprot.org.

[0168] Kako se ovde koriste, termini "specifično vezivanje za CEA, vezivanje za CEA, CEA vezujući deo" odnose se u kontekstu bispecifičnih antitela prema pronalasku na specifičnost za CEACAM5 na površini ćelije. Vezivanje za CEA na ćelijama može se meriti pomoću ćelija MKN-45 adenokarcinoma želuca koje sadrže 100 000 do 400 000 kopija CEA po ćeliji. Koncentracija antitela prema pronalasku varira u odgovarajućem opsegu u pogledu rezultujuće vrednosti EC50 za vezivanje za MKN-45 ćelije kao što je gore definisano. Bispecifična antitela prema pronalasku se specifično vezuju za takav CEACAM5 vezan za ćelijsku membranu.

[0169] Kako se ovde koristi, termin "humani CEA vezan za membranu" odnosi se na humani karcinoembrionalni antigen (CEA) koji je vezan za deo ćelije ili za površinu ćelije, posebno, za površinu tumorske ćelije. Termin "humani CEA vezan za membranu" može se, u određenim okolnostima, odnositi na CEA koji nije vezan za membranu ćelije, ali koji je konstruisan tako da sačuva membranski vezan epitop CEA za koji je antitelo prema pronalasku vezano.

[0170] Kako se ovde koriste, termini "bez unakrsne reaktivnosti protiv CEACAM8" odnose se u kontekstu bispecifičnih antitela prema pronalasku da je vezivanje bispecifičnog antitela prema pronalasku testirano na PEAK ćelijama koje eksprimiraju CEACAM8 u poređenju sa vezivanjem za WT PEAK ćelije (za detalje videti Primere 1 i 5) i bez unakrsne reaktivnosti znači da MFI izmeren za PEAK ćelije koje eksprimiraju CEACAM8 nije više od dva puta MFI izmerenog za WT PEAK ćelije. Kako se ovde koriste, termini "bez unakrsne reaktivnosti protiv određenog CEACAM" odnose se u kontekstu bispecifičnih antitela prema pronalasku na pomenutu unakrsnu reaktivnost pod istim eksperimentalnim postupkom i definicijom kao što je opisano za CEACAM8.

[0171] Kako se ovde koristi, termin "bispecifično antitelo koje se vezuje za humani CEA i humani CD3, CEAxCD3 bsAb" označava bispecifično antitelo koje se vezuje za humani CEACAM5 i CD3ε.

[0172] Kako se ovde koristi, termin "region koji određuje komplementarnost" ("CDR") opisuje nesusedna mesta za kombinovanje antigena (takođe poznata kao regioni vezivanja antigena) koja se nalaze unutar varijabilnog regiona kako teškog tako i lakog lanca polipeptida. CDR regioni se takođe nazivaju "hipervarijabilni regioni" i taj termin se ovde koristi naizmenično sa terminom "CDR" u odnosu na delove varijabilnog regiona koji formiraju regione za vezivanje antigena. Ovaj konkretan region je Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i Chothia et al., J. Mol. Biol.

196:901-917 (1987). Kabat et al. takođe definiše sistem numerisanja za sekvence varijabilnog domena koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Stručnjak u ovoj oblasti može nedvosmisleno da dodeli ovaj sistem "Kabat numeracije" bilo kojoj sekvenci varijabilnog domena, bez oslanjanja na bilo kakve eksperimentalne podatke izvan same sekvence. Kako se ovde koristi, "Kabat numeracija" se odnosi na sistem numerisanja koji je postavljen od Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Osim ako nije drugačije naznačeno, pozivanje na numerisanje pozicija specifičnih aminokiselinskih ostataka u bispecifičnom antitelu prema pronalasku (npr. CDR sekvence), su prema Kabat sistemu numerisanja.

[0173] Kako se ovde koristi, termin "mutageneza usmerena na oligonukleotide" odnosi se na takav postupak koji koristi degenerisane oligonukleotide. Za mutagenezu svakog CDR koristi se kombinacija različitih degenerisanih oligonukleotida. Oni sadrže (ali nisu ograničeni na) degenerisane kodone NNS, HMT, DMT, NHT.

[0174] Kako se ovde koristi, termin "ekspresioni vektor" se odnosi na jedan ili više vektora koji sadrže teške i lake lance antitela prema pronalasku na odgovarajući način poznat iz stanja tehnike. Kako se ovde koristi, termin "ćelija domaćin" pokriva bilo koju vrstu ćelijskog sistema koji se može konstruisati da generiše bispecifična antitela ovog pronalaska. U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin je konstruisana da omogući proizvodnju molekula koji vezuje antigen.

[0175] Kako se ovde koristi termin "supstitucija aminokiseline" odnosi se na supstituciju jedne aminokiseline drugom aminokiselinom iz grupe od 20 proteinogenih standardnih aminokiselina.

Terapeutske primene i postupci upotrebe anti-CEAxCD3 antitela prema pronalasku

[0176] CEACAM x CD3 bispecifična antitela prema pronalasku su optimizovana za lečenje solidnih tumora, bilo u monoterapiji ili u kombinovanoj terapiji, posebno zajedno sa anti CD47 antitelom, anti-CEAxCD47 antitelom i/ili antagonistom PD-1 ose. Antitelo prema pronalasku i CD47 antitelo ili CEAxCD47 antitelo se mogu primeniti kao što je opisano u nastavku.

[0177] Bolest odn. solidni tumor je posebno kancer koji eksprimira ili čak prekomerno eksprimira CEA, uključujući, ali ne ograničavajući se na grupu kolorektalnog tumora, nesitnoćelijskogn tumora pluća, tumora želuca, kancera jednjaka, tumora pankreasa i tumora dojke. Tumor je posebno kolorektalni tumor. Sve terapeutske primene postupaka upotrebe, upotrebe, kombinacije, itd. ovde opisane su maročito za lečenje ovih tumora/bolesti.

[0178] Pronalazači prepoznaju da antitela prema pronalasku pokazuju nizak ili nikakav potencijal formiranja ADA, odnosno gubitak izloženosti usled neutralisanja ADA, odnosno gubitak efikasnosti.

[0179] Jedan primer izvođenja se odnosi na upotrebu u postupku lečenja karcinoma (kancera, tumora, na primer humanih karcinoma), posebno tumora koji eksprimiraju CEA, in vivo. Ovaj postupak sadrži primenu na subjekta farmaceutski efikasne količine kompozicije koja sadrži bispecifično antitelo pronalaska. Pod "subjekat" se podrazumeva humani subjekat, u jednom primeru izvođenja pacijent koji pati od kancera/tumora/karcinoma.

[0180] Ekspresija CEA u različitim tumorskim entitetima je generalno veoma visoka, posebno kod kolorektalnog karcinoma, kancera jednjaka, adenokarcinoma pankreasa, kancera želuca, nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera dojke, karcinoma glave i vrata, kancera materice i bešike, između ostalih. U zdravom, normalnom žlezdanom epitelu u gastrointestinalnom traktu, CEA se uglavnom eksprimira u polarizovanom uzorku na apikalnoj površini ćelija. Ovaj polarizovan obrazac ekspresije ograničava dostupnost anti-CEA mono ili bispecifičnih antitela koja se primenjuju sistemski i stoga potencijalnu toksičnost. Ovaj polarizovani obrazac ekspresije se gubi u ćelijama gastrointestinalnih malignih tumora. CEA se podjednako eksprimira na celoj ćelijskoj površini ćelija kancera, što znači da su ćelije kancera mnogo bolje dostupne antitelu prema pronalasku od normalnih, zdravih ćelija i da se mogu selektivno ubiti bispecifičnim antitelima CEAxCD3 prema pronalasku, odnosno pomenutim kombinacijama iznad.

[0181] U jednom primeru izvođenja bispecifična antitela iz ovog pronalaska mogu da se koriste u monoterapiji za lečenje uznapredovalih solidnih tumora, u jednom primeru izvođenja tumora koji eksprimiraju CEA. U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo prema pronalasku se koristi u kombinaciji sa CEAxCD47 bsAb u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo prema pronalasku se koristi u kombinaciji sa CEAxCD47 bsAb i/ili antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo prema pronalasku se koristi u kombinaciji sa antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji. Takvi antagonisti PD-1 ose su opisani npr. u WO2017118675. Takve kombinacije napadaju solidni kancer pomoću makrofaga i T-ćelija. CD47 antitela su npr. opisana u WO2009091601, WO2009091547, WO2011143624, WO2009131453, WO2013119714, WO2015105995, WO2017181033, WO2018026600, WO2019157432, i WO2013032948 i bispecifična antitela protiv CEA i CD47 opisana su u PCT/IB2019/054559 i US16/428,539.

[0182] Kako se ovde koriste, termini „kombinacija, istovremena, odvojena ili uzastopna kombinacija“ antitela prema pronalasku i drugog antitela, koji se vezuje za humani CD47 ili za humani CEA i humani CD47 odnose se na bilo koju primenu dva antitela (ili tri antitela u slučaju kombinacije antitela iz pronalaska, CD47 mAb ili CEAxCD47 bsAb i antagonista PD-1 ose), bilo odvojeno ili zajedno, gde se dva ili tri antitela primenjuju kao deo odgovarajućeg režima doze dizajnirani da dobiju korist od kombinovane terapije, na primer u odvojenoj, uzastopnoj, istovremenoj, konkurentnoj, hronološki raspoređenoj ili naizmeničnoj primeni. Dakle, dva ili tri antitela mogu da se primenjuju ili kao deo iste farmaceutske kompozicije ili u odvojenim farmaceutskim kompozicijama. Antitelo prema pronalasku se može primeniti pre, u isto vreme ili posle primene drugog bispecifičnog antitela, ili u nekoj njihovoj kombinaciji. Kada se antitelo prema pronalasku primenjuje na pacijenta u ponovljenim intervalima, na primer, tokom standardnog toka lečenja, drugo bispecifično antitelo se može primeniti pre, u isto vreme ili posle svake primene antitela pronalaska ili neke njihove kombinacije, ili u različitim intervalima u odnosu na tretman antitelom iz pronalaska, ili u jednoj dozi pre, u bilo kom trenutku tokom ili posle toka lečenja antitelom pronalaska. U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku i drugo bispecifično antitelo se primenjuju naizmenično, u jednom primeru izvođenja u intervalima od 6 do 15 dana između primene antitela pronalaska i drugog antitela. U takvoj naizmeničnoj primeni prva doza može biti antitelo pronalaska ili drugo antitelo.

[0183] Termin "antagonist PD-1 ose" se odnosi na anti-PD-1 antitelo ili anti-PD-Ll antitelo. Anti-PD-1 antitela su npr. pembrolizumab (Keytruda<®>, MK-3475), nivolumab, pidilizumab, lambrolizumab, MEDI-0680, PDR001 i REGN2810. Anti-PD-1 antitela su opisana npr. u WO200815671, WO2013173223, WO2015026634, US7521051, US8008449, US8354509, WO20091/14335, WO2015026634, WO2008156712, WO2015026634, WO2003099196, WO2009101611, WO2010/027423, WO2010/027827, WO2010/027828, WO2008/156712, i WO2008/156712. Anti-PD-Ll antitela su npr. atezolizumab, MDX-1 105, durvalumab i avelumab. Anti-PD-Ll antitela su npr. opisana u WO2015026634, WO2013/019906, WO2010077634, US8383796, WO2010077634, WO2007005874, i WO2016007235.

[0184] Što se tiče kombinovane primene antitela prema pronalasku i drugog bispecifičnog antitela, oba jedinjenja mogu biti prisutna u jednom pojedinačnom doznom obliku ili u odvojenim oblicima doze, na primer u dva različita ili identična dozna oblika.

[0185] Ako antitelo pronalaska i drugo antitelo nisu u kompeticiji u pogledu CEACAM5, u jednom primeru izvođenja oba antitela se primenjuju istovremeno. Ako su antitelo pronalaska i drugo antitelo u kompeticiji u pogledu CEACAM5, u jednom primeru izvođenja antitela se primenjuju naizmenično.

[0186] Antitelo pronalaska će se tipično primenjivati na pacijenta u režimu doze koji obezbeđuje najefikasniji tretman kancera (i iz perspektive efikasnosti i iz perspektive bezbednosti) za koji se pacijent leči, kao što je poznato u tehnici. Poželjno je da tumorske ćelije istovremeno napadaju T-ćelije i makrofagi, da bi se postigao puni terapeutski potencijal ovog pristupa, bispecifična antitela CEAxCD3 i CEAxCD47 bi trebalo da budu nekonkurentna u pogledu vezivanja za CEA na površini ćelije.

[0187] Kao što je gore objašnjeno, količina primenjenog antitela i vreme primene antitela prema pronalasku mogu zavisiti od tipa (npr. pol, starost, težina) i stanja pacijenta koji se leči, težine bolesti ili stanja koji se leče i od puta primene. Na primer, antitelo pronalaska i drugo antitelo mogu da se primenjuju na pacijenta u dozama u opsegu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom. U jednom primeru izvođenja, svako od antitela pronalaska i drugo antitelo se primenjuju na pacijenta u dozama u opsegu od 1 do 20 mg/kg. U nekim slučajevima, nivoi doze ispod donje granice gore pomenutog opsega mogu biti adekvatni, dok u drugim slučajevima mogu se primeniti još veće doze bez izazivanja bilo kakvog štetnog neželjenog efekta.

[0188] Kako se ovde koristi, termin "polu-život antitela" se odnosi na polu-život pomenutog antitela mereno uobičajenim farmakokinetičkim testom. Antitelo prema pronalasku i drugo bispecifično antitelo protiv CEA i CD47 imaju poluvreme eliminacije od 3-14 dana.

[0189] U sledećem aspektu, pronalazak je takođe usmeren na upotrebu bispecifičnog antitela prema pronalasku u lečenju bolesti, posebno poremećaja ćelijske proliferacije gde je eksprimiran CEA, posebno gde je CEA abnormalno eksprimiran (npr. prekomerno eksprimiran ili eksprimiran na drugačiji način na površini ćelije) u poređenju sa normalnim tkivom istog tipa ćelije. Takvi poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na kolorektalni kancer, NSCLC (nesitnoćelijski kancer pluća), kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa i kancer dojke. Nivoi ekspresije CEA mogu se odrediti postupcima poznatim u tehnici (npr., imunohistohemijskim testom, imunofluorescentnim testom, imunoenzimskim testom, ELISA, protočnom citometrijom, radioimunološkim testom itd.).

[0190] U jednom primeru izvođenja, bispecifična antitela ovog pronalaska mogu se koristiti za ciljno delovanje na ćelije in vivo ili in vitro koje eksprimiraju CEA. Bispecifična antitela pronalaska su posebno korisna u prevenciji formiranja tumora, iskorenjivanju tumora i inhibiciji rasta tumora ili metastaza putem indukcije TDCC tumorskih ćelija. Bispecifična antitela pronalaska mogu se koristiti za lečenje bilo kog tumora koji eksprimira CEA. Određeni maligniteti koji se mogu lečiti sa bispecifičnim antitelima prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, kolorektalni kancer, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa i kancer dojke.

[0191] Bispecifična antitela prema pronalasku se primenjuju na sisara, poželjno čoveka, u farmaceutski prihvatljivom doznom obliku kao što su oni o kojima se govori u nastavku, uključujući ona koja se mogu primenjivati na čoveka intravenski kao bolus ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerebrospinalnim, subkutanim, intraartikularnim, intrasinovijalnim, intratekalnim, oralnim, lokalnim ili inhalacionim putevima. Bispecifična antitela prema pronalasku se takođe prikladno primenjuju intratumoralnim, peritumoralnim, intralezijskim ili perilezijskim putevima, da bi se ispoljili lokalni kao i sistemski terapeutski efekti.

[0192] Za lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnih antitela prema pronalasku će zavisiti od vrste bolesti koja se leči, težine i toka bolesti, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i mišljenja nadležnog lekara. Bispecifično antitelo pronalaska se prikladno primenjuje na pacijenta u jednom trenutku ili tokom serije tretmana. Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za selektivno ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEA.

[0193] Ovaj postupak sadrži interakciju bispecifičnih antitela pronalaska sa navedenim tumorskim ćelijama. Ove tumorske ćelije mogu biti iz humanog karcinoma, uključujući kolorektalni karcinom, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), karcinom želuca, kancer jednjaka, karcinom pankreasa i karcinom dojke.

[0194] U sledećem aspektu, pronalazak je usmeren na bispecifična antitela pronalaska za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje bolesti povezane sa abnormalnom ekspresijom CEA. U posebnom primeru izvođenja, bolest je kancer koji eksprimira ili čak prekomerno eksprimira CEA, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kolorektalni tumor, nesitnoćelijski tumor pluća, tumor želuca, kancer jednjaka, tumor pankreasa i tumor dojke. U posebnom primeru izvođenja, tumor je kolorektalni tumor.

Kompozicije, formulacije, doze i putevi primene

[0195] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak je usmeren na farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifična antitela iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj pronalazak je dalje usmeren na takve farmaceutske kompozicije za upotrebu u postupku lečenja bolesti, kao što je kancer, ili u proizvodnji leka za lečenje bolesti, kao što je kancer. Konkretno, ovaj pronalazak je usmeren na postupak za lečenje bolesti, a tačnije, za lečenje kancera, postupak koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije pronalaska.

[0196] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak sadrži farmaceutske kompozicije, kombinacije i postupke za lečenje humanih karcinoma, tumora, kako su gore definisani. Na primer, pronalazak sadrži farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski efikasnu količinu antitela iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju humanih karcinoma.

[0197] Kompozicije bispecifičnih antitela prema pronalasku mogu se primenjivati u potrebom konvencionalnih načina primene uključujući, ali bez ograničenja, intravensku, intraperitonealnu, oralnu, intralimfatičnu ili direktnu intratumoralnu primenu. Poželjna je intravenska ili subkutana primena.

[0198] U jednom primeru izvođenja pronalaska, terapeutske formulacije koje sadrže bispecifična antitela pronalaska se pripremaju za skladištenje mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa izbornim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili tečnih formulacija. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama. Formulacije koje se koriste za primenu in vivo moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Najefikasniji način primene i režim doziranja za farmaceutske kompozicije ovog pronalaska zavise od težine i toka bolesti, stanja pacijenta i odgovora na lečenje i od procene nadležnog lekara. Shodno tome, doze kompozicija mogu biti ravne doze ili mogu biti prilagođene individualnom pacijentu, npr. telesnoj težini. Ipak, efikasna doza kompozicija ovog pronalaska će generalno biti u opsegu od 0.1 do 20 mg/kg.

[0199] Bispecifična antitela ovog pronalaska imaju molekulsku težinu u veličini od 150 kD po molu. Oni nose u jednom primeru izvođenja Fc deo. Poluvreme eliminacije kod pacijenata je u rasponu od 3 do 14 dana. Ovaj poluživot dozvoljava, ali nije ograničen na primenu jednom dnevno, jednom nedeljno ili jednom u dve nedelje.

[0200] Bispecifična antitela ovog pronalaska i njihove odgovarajuće kompozicije mogu biti u različitim doznim oblicima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, tečne rastvore ili suspenzije, tablete, pilule, prahove, supozitorije, polimerne mikrokapsule ili mikrovezikule, lipozome i injektabilne. ili infuzibilne rastvore. Poželjni oblik zavisi od načina primene i terapeutske primene.

[0201] Kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo ovog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određenu bolest ili poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok bolesti ili poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, režim primene i druge faktore poznate lekarima.

Proizvodni artikli

[0202] U sledećem aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu gore opisanih poremećaja. Proizvodni artikal sadrži kontejner i etiketu ili umetak pakovanja na ili u vezi sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Kontejneri mogu biti formirani od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner sadrži kompoziciju koja je sama ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probiti iglom za hipodermičku injekciju). Jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je bispecifično antitelo prema pronalasku. Etiketa ili umetak pakovanja označava da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvodni artikal može da sadrži (a) prvi kontejner sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži bispecifično antitelo pronalaska; i (b) drugi kontejner sa kompozicijom koja se nalazi u njoj, pri čemu kompozicija sadrži još jedan citotoksični ili na drugi način terapeutski agens. Proizvodni predmet u ovom primeru izvođenja pronalaska može dalje da sadrži umetak pakovanja koji ukazuje da se kompozicije mogu koristiti za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor puferovan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može uključivati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Tabela 1

PRIMERI

Primer 1 Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje članova porodice humanog CEACAM

Kloniranje

[0203] Sekvenca koja odgovara kompletnom ekstracelularnom domenu (ECD) i A3-B3 domenima CEACAM5 je sintesana i subklonirana u pEAK8 ekspresioni vektor sisara (Edge Biosystems, Gaithersburg, Md.). Vektori su modifikovani da bi se uveo Avitag<™>(Avidity, Denver Colo.) i jedan od heksa-histidinske oznake, humanog FC regiona ili FC regiona miša na C-terminusu. Konstrukti su verifikovani sekvenciranjem DNK. Prečišćavanje rekombinantnog rastvorljivog proteina je sprovedeno pomoću IMAC (hromatografija imobilizovanih metalnih jona), FcXL ili CaptureSelect<™>IgG-Fc (ms) Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific).

[0204] Vektori koji kodiraju za verziju pune dužine humanog CEACAM 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 18, 19, 20, 21 i makaki CEACAM5 i CEACAM6 takođe su generisani za ekspresiju na površini ćelije PEAK i/ili CHO ćelije. Rastvorljivi humani CEACAM16 pune dužine je takođe kloniran na sličan način.

[0205] Pored toga, vektori koji kodiraju sledeće skraćene verzije humanog CEACAM5 su takođe generisani za ekspresiju na površini ćelije PEAK i/ili CHO ćelija: A1-B1-A2-B2-A3-B3; B1-A2-B2-A3-B3; A2-B2-A3-B3; B2-A3-B3; A3-B3. B3 pod-domen se eksprimira kao fuzioni protein za prvih 140 aa humanog CD86 proteina.

Ekspresija

[0206] Gore pomenuti plazmid se zatim transfektuje u ćelije sisara upotrebom reagensa za transfekciju zasnovanog na lipozomima kao što je Lipofectamine2000 (Thermo Fisher Scientific). Korak transfekcije zahteva samo male količine DNK i ćelija, tipično 4×10<5>ćelija i 2 µg plazmidne DNK po bunarčiću i transfekcija je izvedena u ploči sa 6 bunarčića. Iako se mogu koristiti različite ćelijske linije sisara, u primerima datim u nastavku, transformisane monoslojne epitelne ćelije bubrega humanog embriona (PEAK ćelije) su transfektovane. Ove ćelije stabilno eksprimiraju EBNA-1 gen, dodatno podržavajući proces epizomalne replikacije, polu-adherentne su i mogu se uzgajati u standardnim uslovima ćelijske kulture (5% CO2; 37°C u medijumu DMEM sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma). Posle 24 h, ćelije se stavljaju u selektivne uslove dodavanjem medijuma koji sadrži 0.5-2 µg/mL puromicina: ćelije koje nose epizomalni vektor su otporne na ovaj antibiotik.

[0207] Dve do tri nedelje nakon transfekcije, pojačane i selekcionisane ćelije su injektirane u CELLline<™>bioreaktore za jednokratnu upotrebu (Sigma Aldrich) za korak proizvodnje. CELLine<™>je bioreaktor sa dva odeljka koji se može koristiti u standardnom inkubatoru ćelijske kulture. Manji odeljak (15 ml) sadrži ćelije i odvojen je od većeg (jedan litar) medijuma koji sadrži odeljak polupropusnom membranom sa graničnom veličinom od 10 kDa (Bruce et al.

2002, McDonald et al. 2005). Ovaj sistem omogućava difuziju hranljivih materija, gasova i metaboličkih otpadnih proizvoda, dok zadržava ćelije i izlučene proteine u manjem odeljku. Kultura se održava 7-10 dana pre sakupljanja supernatanta. Pošto medijum sadrži serum, ćelije održavaju dobru vijabilnost i nekoliko proizvodnih serija se može generisati upotrebom istih ćelija i kontejnera.

Prečišćavanje

[0208] Nakon sakupljanja, supernatanti ćelijske kulture se bistre centrifugiranjem. Supernatant je zatim dopunjen sa 100 mM imidazola i sipan na smolu za afinitetnu hromatografiju Ni-NTA (Qiagen). Relativno visoka koncentracija imidazola minimizira vezivanje zagađivača za smolu. Posle ispiranja kolone, proteini su eluirani brzinom protoka od 2 mL/min upotrebom gradijenta imidazola od 30 mL (20-400 mM imidazola) na AKTA Prime hromatografskom sistemu (Cytiva). Gradijent eluiranja dodatno poboljšava čistoću rekombinantnog proteina, ali se može zameniti pristupom stepenastog eluiranja ako hromatografski sistem nije dostupan. Eluirane frakcije se mogu analizirati pomoću SDS-PAGE ili ELISA da bi se odredio njihov sadržaj u rekombinantnom proteinu. Frakcije od interesa su objedinjene i odsoljene na Amicon<®>10 kDa kolonama (Millipore) ekvilibrisanim sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom ili drugim odgovarajućim puferom. Odsoljeni proteini se zatim mogu kvantitativno odrediti korišćenjem različitih tehnika i njihova čistoća se analizira pomoću SDS-PAGE. Rekombinantni proteini su biotinilovani in vitro upotrebom biotin ligaze (Avidity, Denver Colo.) prema uputstvima proizvođača. Nakon odsoljavanja, nivo biotinilacije se procenjuje pomoću testova koji se povlače na dole upotrebom magnetnih kuglica streptavidina i SDS-PAGE analize.

Primer 2 Izbor fagnog prikaza CEACAM5 Fvs upotrebom humanih scFv biblioteka koje sadrže fiksni varijabilni teški domen

[0209] Opšti postupci za konstrukciju i rukovanje humanim scFv bibliotekama prikazanim na M13 bakteriofagu su opisane u Vaughan et al., (Nat. Biotech.1996, 14:309-314).

[0210] Biblioteke za selekciju i skrining kodiraju scFv koje sve dele isti VH domen i koje su isključivo raznovrsne u VL domenu. Postupci za generisanje fiksnih VH biblioteka i njihova upotreba za identifikaciju i sastavljanje bispecifičnih antitela opisani su u US 2012/0184716 i WO 2012/023053.

[0211] Postupci za identifikaciju vezivanja scFv za humani CEACAM5 su opisani u nastavku.

Selekcije proteina

[0212] Alikvote biblioteka scFv faga (10<12>Pfu) se blokiraju sa PBS koji sadrži 3% (tež./v) obranog mleka tokom jednog sata na sobnoj temperaturi na rotacionom mikseru. Blokirani fagi se deselektuju na magnetnim kuglicama streptavidina (Dynabeads<™>M-280) jedan sat na sobnoj temperaturi na rotacionom mikseru. Poništeni fagi se inkubiraju sa 100 nM ili biotinilovanog humanog CEACAM5 ili A3-B3 domena uhvaćenog na streptavidin magnetnim kuglicama dva sata na sobnoj temperaturi na rotacionom mikseru. Kuglice se hvataju pomoću magnetnog postolja nakon čega sledi pet ispiranja sa PBS/0.1% Tween<®>20 i dva ispiranja sa PBS. Fagi su eluirani sa 100 nM TEA tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi na rotacionom mikseru. Eluirani fagi i kuglice se neutrališu sa Tris-HCl 1M pH 7.4 i direktno se dodaju u 10 ml eksponencijalno rastuće TG1 ćelije (sojevi E. coli koji se obično koriste u prikazu faga) i inkubiraju jedan sat na 37°C uz sporo mućkanje (90 rpm). Alikvot inficiranog TG1 se serijski razblaži da bi se titrirao izlaz selekcije. Preostali inficirani TG1 se centrifugiraju na 3800 rpm tokom 10 minuta i resuspenduju u 2 ml 2xTY i šire na 2xTYAG (2xTY medijum koji sadrži 100 µg/ml ampicilina i 2% glukoze) agar ploče za biotest. Posle inkubacije preko noći na 30°C, 10 ml 2xTY je dodato na ploče i ćelije su ostrugane sa površine i prenete u polipropilensku epruvetu od 50 ml.50% rastvor glicerola se dodaje ćelijskoj suspenziji da bi se dobila konačna koncentracija od 17% glicerola. Alikvoti selekcionih rundi se drže na -80°C.

Spašavanje faga

[0213] 50 µl ćelijske suspenzije dobijene iz prethodnih rundi selekcije se dodaje u 50 ml 2xTYAG i uzgaja na 37°C uz mešanje (240 rpm) do OD600dostiže se od 0.3 do 0.5. Kultura je zatim super-inficirana sa 1.2×10<11>M13K07 pomoćniih faga i inkubirana jedan sat na 37°C (90 rpm). Medijum se menja centrifugiranjem ćelija na 3800 rpm tokom 10 minuta, uklanjanjem medijuma i resuspendovanjem taloga u 50 ml 2xTYAK (2xTY medijum koji sadrži 100 µg/ml ampicilina; 50 µg/ml kanamicina). Kultura se zatim uzgaja preko noći na 30°C (240 rpm). Sledećeg dana, supernatant koji sadrži fag se koristi za sledeću rundu selekcije.

Selekcije ćelijske površine

[0214] Supernatanti koji sadrže fag su blokirani sa PBS koji sadrži 3% (tež./v) obranog mleka tokom jednog sata na sobnoj temperaturi na rotacionom mikseru. Blokirani fagi se zatim deselektuju na jedan sat na MKN-45 CEACAM5<KO>ćelijama koje ne eksprimiraju humani CEACAM5. Deselektovani fagi se inkubiraju sa 2×10<7>MKN-45 ćelija koje eksprimiraju CEACAM5 (blokirano u PBS, 3% BSA 0.1% NaN3) dva sata na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje. Ćelije su peletirane i isprane šest puta sa PBS. Vezani fagi se eluiraju sa 76 mM limunske kiseline i mućkaju 10 minuta. Posle neutralizacije sa Tris-HCl 1M pH 8, ćelije se dodaju direktno u 10 ml eksponencijalno rastućeg TG1 i inkubiraju jedan sat na 37°C uz sporo mućkanje. Alikvot inficiranog TG1 se serijski razblaži da bi se titrirao izlaz selekcije. Inficirani TG1 se centrifugiraju na 3800 rpm tokom 10 minuta i resuspenduju u 2 ml 2xTY medijuma i šire na 2xTYAG agar ploči za biotest. Posle inkubacije preko noći na 30°C 10 ml 2xTY je dodato na ploču i ćelije su ostrugane sa površine i prenete u polipropilensku epruvetu od 50 ml.

50% rastvor glicerola se dodaje ćelijskoj suspenziji da bi se dobila konačna koncentracija od 17% glicerola. Alikvoti selekcionih rundi se drže na -80°C.

Primer 3 Skrining za vezivanje/nevezivanje scFv za rastvorljive CEACAM5, CEACAM6 i CEACAM1

Periplazmatsia preparat scFv za testove vezivanja i funkcije

[0215] Pojedinačni transformisani TG1 klonovi iz izlaznih rezultata selekcije se inokuliraju u mikrotitarsku ploču sa dubokim bunarčićima koja sadrži 0.9 ml po bunarčiću 2xTYAG medijuma (2xTY medijum koji sadrži 100 µg/ml ampicilina 0.1% glukoze) i uzgajaju na 37°C tokom 5-6 sati (240 rpm). Zatim je dodato 100 µl po bunarčiću 0.2 mM IPTG u 2xTY medijumu da bi se dobila konačna koncentracija od 0.02 mM IPTG. Ploča je inkubirana preko noći na 30°C uz mućkanje na 240 rpm. Ploča sa dubokim bunarčićima se centrifugira na 3200 rpm tokom 10 minuta na 4°C i supernatant se pažljivo uklanja. Peleti su resuspendovani u 150 µl TES pufera (50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA (pH 8), 20% saharoze, dopunjeno potpunim inhibitorom proteaze, Roche). Hipotonični šok se proizvodi dodavanjem 150 µl razblaženog TES pufera (1:5 TES:razblažen vodom) i inkubacijom na ledu 30 minuta. Ploča je centrifugirana na 4000 rpm tokom 10 minuta na 4°C da bi se ćelije i ostaci peletirali. Supernatanti se pažljivo prebacuju u drugu mikrotitarsku ploču i drže na ledu za trenutno testiranje u funkcionalnim testovima ili testovima vezivanja.

Vezivanje

[0216] Skrining scFv za vezivanje za CEACAM5 je testiran homogenim testom korišćenjem CellInsight<™>tehnologije. Sledeći reagensi su pomešani u svakom bunarčiću ploče sa 384 bunarčića i sa providnim dnom (Corning): 30 µl suspenzije streptavidin polistirenskih kuglica (Polisciences; 3000 kuglica/bunariću) obložene ili biotinilovanim CEACAM5, biotinilovanim domenom A3-B3 ili biotinilovanim NusA za kontrolni protein; 60 µl blokiranog scFv periplazmatskog preparata; 10 µl pufera za detekciju (PBS koji sadrži mišje anti-c-myc antitelo od 5 µg/ml; anti-mišje Fc AlexaFluor<®>647 razblaženo 1:200). Nakon mešanja na 600 rpm tokom 5 minuta, ploča sa 384 bunarčića je inkubirana na sobnoj temperaturi i očitana nakon 2 sata na CellInsight<™>CXS High-Content Screening platformi (ThermoFisher Scientific). Klonovi koji eksprimiraju scFv dajući specifičan signal za CEACAM5, a ne NusA se biraju za dalju analizu ili sekvenciranje.

[0217] Vezivanje za CEACAM1, CEACAM6 i druge CEACAM može se meriti na isti način.

Sekvenciranje klona

[0218] Pojedinačni klonovi su inokulisani u mikrotitarsku ploču sa 96 dubokih bunarčića koja sadrži 1 ml LBAG medijuma (LB medijum sa 100 µg/ml ampicilina i 2% glukoze) po bunarčiću i uzgajani preko noći na 37°C, 300 rpm. DNK se ekstrahuje korišćenjem Zyppy-96 Plasmid Miniprep kompleta (Zymo Research) i sekvencira.

Primer 4 Fiksni VH kandidati koji se preformatiraju u IgG i prolazna ekspresija u ćelijama sisara

[0219] Nakon skrininga i sekvenciranja, scFv kandidati sa željenim svojstvima vezivanja se reformatiraju u IgG i eksprimiraju prolaznom transfekcijom u PEAK ćelije. VH i VL sekvence odabranog scFv su amplifikovane sa specifičnim oligonukleotidima i klonirane u ekspresioni vektor koji sadrži konstantne regione teškog i lakog lanca, a konstrukcije su verifikovane sekvenciranjem. Ekspresioni vektori se transfektuju u ćelije sisara korišćenjem Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, 4×10<6>PEAK ćelije su kultivisane u T75 posudama u medijumu za kulturu od 25 ml koji sadrži fetalni goveđi serum. Transfektovane ćelije se kultivišu 5-6 dana na 37°C, proizvodnja IgG se kvantitativno određuje korišćenjem instrumenta Octet RED96. Supernatant se sakuplja za prečišćavanje IgG na FcXL afinitetnoj smoli (Thermo Fisher Scientific) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, supernatanti iz transfektovanih ćelija se inkubiraju preko noći na 4°C sa odgovarajućom količinom FcXL smole. Nakon ispiranja smole sa PBS, uzorci se stavljaju na Amicon Pro kolonu i IgG se eluira u 50 mM glicina pH 3.5. Eluirana IgG frakcija se zatim dijalizuje pomoću Amicon 50kDa protiv Histidin NaCl pH6.0 pufera i sadržaj IgG se kvantitativno određuje apsorpcijom na 280 nm. Čistoća i integritet IgG se verifikuje elektroforezom korišćenjem Agilent Bioanalyzer 2100 prema uputstvima proizvođača (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD).

Primer 5 Karakterizacija CEACAM5 monoklonskih antitela

a) Vezivanje anti-CEACAM krakova za ćelije transfektovane sa različitim članovima porodice CEACAM

[0220] Specifičnost krakova anti-CEACAM5 antitela (testirana kao bivalentna mAb antitela ili monovalentna bsAb antitela je prikazana protočnom citometrijom upotrebom PEAK i/ili CHO ćelija transfektovanih sa različitim članovima porodice CEACAM.

[0221] Vektori koji kodiraju verziju pune dužine humanog CEACAM 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 18, 19, 20 i 21 i 20 se koriste za ekspresiju ovih proteina na površini PEAK i/ili CHO ćelija kao što je opisano u Primeru 1. Slično, vektori koji kodiraju verziju pune dužine makaki CEACAM 5 i 6 se takođe koriste za ekspresiju ovih proteina na površini PEAK i/ili CHO ćelija. Netransfektovane PEAK i/ili CHO ćelije se koriste kao negativna kontrola. Ćelije se sakupljaju, broje, proveravaju za vijabilitet i resuspenduju na 3×10<6>ćelija/ml u FACS puferu (PBS 2% BSA, 0.1% NaN3).100 µl ćelijske suspenzije se raspoređuje u ploče sa 96 bunarčića sa V-dnom (3×10<5>ćelije/bunar). Supernatant je uklonjen centrifugiranjem 3 minuta na 4°C, 1300 rpm i ćelije su inkubirane 15 minuta na 4°C sa povećanjem koncentracije antitela prema pronalasku. Antitela koja nose anti-CEACAMS krakove za testiranje su razblažena u FACS puferu i opseg koncentracije je 30 pM-500 nM. Ćelije su dva puta isprane hladnim FACS puferom i ponovo inkubirane narednih 15 minuta na 4°C sa kompatibilnim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom. Ćelije su dva puta isprane hladnim FACS puferom i resuspendovane u 300 µl FACS pufera sa 1:1500 razblaženim TOPRO-3 (Invitrogen). Fluorescencija se meri korišćenjem FACSCalibura<™>(BD Biosciences) ili Cytoflex platforme (Beckman Coulter). Krive vezivanja doza-odgovor su postavljene korišćenjem softvera GraphPad Prism8. Na isti način se mogu okarakterisati CEACAM1, CEACAM6 i drugi CEACAM.

[0222] Rezultati dobijeni korišćenjem eksperimentalnih postupaka opisanih u Primerima 1 i 5a prikazani su u tabeli 2 i 3 (na 10 mcg/ml testiranih antitela pune veličine; BiTE MEDI-565 je testiran u ekvimolarnoj koncentraciji). Za bispecifična antitela AB17L3-1/N, AB71L3-1/N, AB72L3-1/N, AB73L3-1/N MFI izmeren za vezivanje za CEACAM5 transfektovane ćelije pronađen je između 29000 i 41000 (Tabela 2). Nasuprot tome, MFI pronađen korišćenjem PEAK ćelija transficiranih sa CEACAM 1,3,4,6,8 pronađeni su ispod 1000 sa jedinim izuzetkom jakog signala za AB72L3-1/N na CEACAM8 transfektovanim ćelijama. Kada se vrednosti MFI dobijene na transfektovanim ćelijama koje eksprimiraju bilo koji dati CEACAM podele sa vrednostima dobijenim na WT PEAK ćelijama, mogu se izračunati "faktori do PEAK WT" (Tabela 3). Sa izuzetkom AB72L3-1/N, sva antitela prema pronalasku su specifična za CEACAM5, pošto su sve vrednosti "faktora do PEAK WT" ispod 2.0. Nasuprot tome, MEDI-565 BiTE pokazuje „faktor do PEAK WT“ veći od 2 za CEACAM8, što sugeriše unakrsnu reaktivnost za takvog člana CEACAM porodice. Ovo bi moglo da izazove ubijanje npr. neutrofila jer kao što je već pomenuto, humani neutrofili eksprimiraju CEACAM8 na površini.

TABELA 2 Vezivanje za CEACAMx prolazno eksprimiranog na PEAK ćelijama [MFI]

TABELA 3 Vezivanje za CEACAMx prolazno eksprimiranog na PEAK ćelijama [faktor do

b) Vezivanje CEACAM5 monoklonskih antitela za rekombinantne proteine u enzimskom imunosorbentnom testu (ELISA)

[0223] Biotinilovani rekombinantni humani CEACAM5 protein je sakupljen u količini od 0.5 µg/mL u mikroploči sa 96 bunarčića obloženoj streptavidinom. Ploča se ispere i dodaju se monoklonska anti-TAA bivalentna antitela iz ovog pronalaska u širokom opsegu koncentracije (npr. od 5×10<-4>do 1 µg/mL) i inkubira tokom 1 sata. Ploča se ispere i vezana antitela se detektuju pomoću anti-humanog IgG(Fc)-HRP (Jackson ImmunoResearch). Nakon ispiranja, ploča se otkriva sa Amplex Red<®>reagensom (Molecular Probes). Signal fluorescencije se meri na Synergy HT uređaju za očitavanje ploča (Biotek).

[0224] Vezanje za druge članove rekombinantne CEACAM porodice kao što su CEACAM1 i CEACAM6 može se proceniti na sličan način. Rezultati vezivanja su prikazani na slikama 8 i 9, za 1B4 mAb i C11 mAb, respektivno.

c) Sortiranje epitopa antitela pronalaska kompeticijom sa referentnim antitelima

[0225] Sortiranje epitopa je kompetitivni imunološki test koji se koristi za, na primer, karakterizaciju vezivanja novih monoklonskih antitela protiv ciljnog proteina. Kompetitivni blokirajući profil novog antitela koji se vezuje za ciljni protein stvara se protiv antitela koja se takođe vezuju za ovaj ciljni protein i za koja je epitop vezivanja već utvrđen/objavljen. Kompeticija sa jednim od ovih referentnih antitela ukazuje na to da novo antitelo ima isti ili blisko lociran epitop i da su "vezani" zajedno.

[0226] Sposobnost CEACAM5 mAb ovog pronalaska da su u kompeticiji sa CEACAM5 referentnim antitelima je testirana pomoću ELISA na rekombinantnom humanom CEACAM5 sa sledećim referentnim antitelima koja nose Fc region miša: SM3E, mAb izvedeno iz sm3E opisano u patentu US20050147614A1; MEDI, mAb izvedeno iz MEDI-565 opisano u patentu WO2016036678A1; SAR, mAb izvedeno iz Mab2_VLg5VHg2 opisano u patentu EP3199552A1; CH1A1A, mAb izvedeno iz CH1A1A-2F1 opisano u patentu US20120251529 i prema Klein et al in Oncoimmunology, 2017 Jan 11;6(3); humanizovano T84.66, mAb izvedeno iz varijante 1 opisane u patentu WO2017055389; LAB, mAb izvedeno iz hMN14 opisano u patentu US 2002/0165360 A1.

[0227] SM3E se vezuje npr. više na N-terminus, ćelijska membrana distalni deo CEA, MEDI na srednji deo i CH1A1A se vezuje blizu membrane.

[0228] Biotinilovani humani CEACAM5 je obložen sa 0.5 µg/ml u ploči sa 96 bunarčića obloženom streptavidinom i inkubiran sa 10 µg/ml referentnih mAb ili irelevantnih mAb koji nose Fc region miša tokom 1 sata. CEACAM5 mAb antitela ovog pronalaska (to znači dvovalentna monoklonska anti-CEA antitela) se dodaju u količini od 0.2 µg/ml tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana i vezana CEACAM5 mAb antitela su otkrivena pomoću anti-humanog IgG(Fc)-HRP (Jackson ImmunoResearch). Nakon ispiranja, ploča se otkriva sa Amplex<®>crvenim reagensom. Signal fluorescencije se meri na Synergy HT uređaju za očitavanje ploča (Biotek).

[0229] Na osnovu rezultata pronađenih sa CEACAM5 mAb antitela, izvedena CEAxCD3 bsAb antitela prema pronalasku smatraju se kompetitivnim sa referentnim antitelom u slučaju da je vezivanje za CEACAM5 smanjeno za više od 80% ako se upoređuju rezultati sa i bez dodavanja antitela alata. CEAxCD3 antitelo je identifikovano kao nekompetitivno sa antitelom alata u slučaju da je vezivanje za CEACAM5 smanjeno za manje od 20% ako se uporede rezultati sa i bez dodavanja antitela alata. Slika 1 prikazuje na šematski način vezujuće regione referentnih antitela korišćenih u Primerima 5c.

d) Određivanje CEACAM5 domena vezanog za antitela pronalaska upotrebom skraćenog oblika CEACAM5

[0230] Upotrebom skraćenih oblika CEACAM5 kojima nedostaje jedan ili više njegovih vanćelijskih pod-domena, mogao bi se odrediti pod-domen za koji se vezuju antitela pronalaska.

[0231] Vektori koji kodiraju verziju pune dužine humanog CEACAM5 (koji sadrži sve njegove vanćelijske domene, odnosno N-A1-B1-A2-B2-A3-B3) kao i vektori koji kodiraju samo za podskup ekstracelularnih domena CEACAM5 (A1-B1-A2-B2-A3-B3; B1-A2-B2-A3-B3; A2-B2-A3-B3; B2-A3-B3; A3-B3 i B3) se koriste za ekspresiju ovih proteina na površini PEAK i/ili CHO ćelija kao što je opisano u Primeru 1. Netransfektovane PEAK i/ili CHO ćelije se koriste kao negativna kontrola. Bojenje i akvizicija protočnom citometrijom se izvodi kao što je opisano u primeru 5, pododeljak a).

[0232] Antitelo prema pronalasku je pronađeno kao vezujuće za dati skraćeni CEACAM5 protein, ako je vezano antitelo detektovano PE-konjugovanim anti-humanim IgG Fc sekundarnim antitelom.

Primer 6 Ekspresija i prečišćavanje bispecifičnih antitela koja nose lambda i kapa laki lanac

[0233] Istovremena ekspresija jednog teškog i dva laka lanca u istoj ćeliji može dovesti do sklapanja tri različita antitela. Istovremena ekspresija se može postići na različite načine, kao što je transfekcija više vektora koji eksprimiraju jedan od lanaca koji se ko-ekspresuju ili korišćenjem vektora koji pokreću višestruku ekspresiju gena. Vektor koji kodira različita anti-CEACAM5 antitela se ko-transfektuje sa drugim vektorom koji eksprimira teški i laki lanac anti-CD3 antitela. Alternativno, dva laka lanca se kloniraju u vektor pNovi κHλ koji je prethodno generisan kako bi se omogućila koekspresija jednog teškog lanca, jednog lakog lanca Kapa i jednog lakog lambda lanca kao što je opisano u US 2012/0184716 i WO 2012/023053.

[0234] Ekspresiju tri gena pokreću promotori humanog citomegalovirusa (hCMV), a vektor takođe sadrži gen glutamin sintetaze (GS) koji omogućava selekciju i uspostavljanje stabilnih ćelijskih linija. Uobičajeni VH i VL geni anti-CEACAM5 IgG i anti-CD3 IgG su klonirani u vektor pNovi κHλ, za prolaznu ekspresiju u ćelijama sisara. Expi293 ćelije su kultivisane u suspenziji u odgovarajućoj erlenmajerskoj tikvici sa odgovarajućim brojem ćelija i zapreminom medijuma za kulturu. Plazmidna DNK se konačno transfektuje u Expi293 ćelije pomoću PEI. Koncentracija antitela u supernatantu transfektovanih ćelija se meri tokom proizvodnje pomoću Octet RED96. Prema koncentraciji antitela, supernatanti se sakupljaju 5 do 7 dana nakon transfekcije i bistre se centrifugiranjem na 1300 g tokom 10 minuta. Prečišćavanje se zasniva na postupku prečišćavanja u tri koraka. Prvo, CaptureSelect<™>FcXL afinitetni matriks (Thermo Fisher Scientific) je ispran sa PBS i zatim dodat u izbistreni supernatant. Posle inkubacije preko noći na 4°C i 20 rpm, supernatanti su centrifugirani na 2000 g tokom 10 min, protok se čuva i smola se dva puta ispere sa PBS. Zatim se smola prenosi na Amicon Pro kolone i za eluiranje se koristi rastvor koji sadrži 50 mM glicina na pH 3.0. Generiše se nekoliko elucionih frakcija, neutrališe se sa Tris-HCl pH7.4 i sakupi. Grupa koja sadrži ukupne humane IgG (bispecifična i dva monospecifična antitela) je kvantitativno određena korišćenjem Nanodrop spektrofotometra (NanoDrop Technologies, Wilmington, Del.) i zatim inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi i 20 rpm sa odgovarajućom zapreminom CaptureSelect<™>KappaXL afinitetnih matrica (Thermo Fisher Scientific).GE Healthcare). Koraci obnavljanja smole i ispiranja, eluiranja i neutralizacije se izvode kao što je prethodno opisano. Poslednji korak afinitetnog prečišćavanja se izvodi pomoću CaptureSelect<™>lambda Fab matrica afiniteta (Thermo Fisher Scientific) primenjujući isti postupak kao i za korak prečišćavanja kapa. Sve elucione frakcije su objedinjene i odsoljene u odnosu na pufer formulacije His-NaCl pH6 upotrebom 50kDa Amicon Ultra centrifugalnih filterskih jedinica (Merck Millipore). Konačni proizvod je kvantitativno određen upotrebom Nanodrop.

[0235] Prečišćena bispecifična antitela se analiziraju elektroforezom u uslovima denaturacije i redukcije korišćenjem The Agilent 2100 Bioanalyzer sa Protein 80 kompletom kako je opisano od strane proizvođača (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD).4 µL prečišćenih uzoraka se pomeša sa puferom za uzorke sa dodatkom ditiotreitola (DTT; Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.). Uzorci se zagrevaju na 95°C tokom 5 minuta, a zatim se stavljaju na čip. Svi uzorci su testirani na kontaminaciju endotoksinom pomoću testa Limulus Amebocyte Lysate (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.).

Primer 7: In vitro karakterizacija monovalentnih i bispecifičnih antitela

a) Vezivanje monovalentnih i bispecifičnih antitela za ćelije koje eksprimiraju CEACAM5 i ćelije koje ne eksprimiraju CEACAM5

[0236] Da bi se pokazalo vezivanje CD3 x CEACAM5 κλ antitela za ciljne ćelije, može se izvesti serija eksperimenata zasnovanih na protočnoj citometriji upoređujući vezivanje CD3xCEACAM5 κλ antitela za njihove monovalentne parnjake. Primeri ćelija koje se mogu koristiti uključuju CEACAM5-pozitivne ćelijske linije kao što je ćelijska linija adenokarcinoma želuca MKN45 (koja eksprimira 155’000 CEACAM5 molekula po ćeliji) ili ćelijska linija adenokarcinoma pankreasa HPAF-II (koja eksprimira 108'00 CEACAM50 molekula po ćeliji) ili ćelijska linija kolorektalnog adenokarcinoma LS174T (koja eksprimira 26’000 CEACAM5 molekula po ćeliji) i CEACAM5-negativne ćelijske linije, kao što je ćelijska linija karcinoma pluća A549 i MKN45 CEACAM5-„knock out“ ćelijska linija generisana postupkom CRISPR-S9CA. Bojenje ćelija i procena vezivanja se mogu izvesti kao što je gore opisano. Dobijene krive vezivanja su prikazane na slikama 4, 5, 11 i 14. EC50 vrednosti se mogu izračunati korišćenjem GraphPad Prism8 za vezivanje za MKN45 ćelije; podaci su prikazani u tabeli 4. Vezivanje bsAb pronalaska na 200 nM, 1000 nM i 5000 nM je 40% i više u poređenju sa vezivanjem TCB2014 (videti tabelu 4 i takođe slike 11 i 14).

TABELA 4: EC50 vezivanja za MKN-45 ćelije. N/A: nije primenljivo

b) Vezivanje monovalentnih i bispecifičnih antitela za ćelije koje eksprimiraju CD3 i ćelije koje ne eksprimiraju CD3

[0237] Da bi se demonstriralo vezivanje CD3 x CEACAM5 κλ antitela za efektorske T-ćelije, može se izvesti serija eksperimenata zasnovanih na protočnoj citometriji upoređujući vezivanje CD3xCEACAM5 κλ antitela za njihove monovalentne parnjake. Primeri ćelija koje se mogu koristiti uključuju humane primarne T-ćelije, kao i CD3-pozitivne (Jurkat i/ili HuT 78) ili CD3-negativne (TIB-153 i/ili JKT-beta-del) ćelijske linije. Bojenje ćelija i procena vezivanja se mogu izvesti kao što je gore opisano. Rezultati su prikazani na slikama 3 i 10.

c) Sortiranje epitopa CEACAM5 antitela kompeticijom sa referentnim antitelima

[0238] Sortiranje epitopa je kompetitivni imunološki test koji se koristi za karakterizaciju vezivanja antitela prema pronalasku ili npr. vezivanje srodnih anti-CEA (ciljni protein) antitela prvog vezujućeg dela. Kompetitivni blokirajući profil antitela koji se vezuje za ciljni protein stvara se protiv antitela koja se takođe vezuju za ovaj ciljni protein i za koja je epitop vezivanja već utvrđen/objavljen. Kompeticija sa jednim od ovih referentnih antitela ukazuje na to da antitelo ima isti ili blisko lociran epitop i da su "vezani" zajedno. Sposobnost anti CEACAM5 krakova, koji su deo bispecifičnih antitela ovog pronalaska da su u kompeticiji sa anti CEACAM5 referentnim antitelima, testirana je pomoću ELISA sa rekombinantnim humanim CEACAM5 i sledećim referentnim antitelima koja nose Fc region miša: SM3E, sekvence izvedene mAb iz SM3E opisanog u patentu US20050147614A1, mAb proizvedeno korišćenjem standardnih postupaka; MEDI, mAb izvedeno iz MEDI-565 opisano u patentu WO2016036678A1; CH1A1A, mAb izvedeno iz CH1A1A-2F1 opisano u patentu US20120251529 i prema Klein et al u Oncoimmunology, 2017 Jan 11;6(3). SM3E se više vezuje za N-terminus, distalni deo ćelijske membrane CEA, MEDI za srednji deo i CH1A1A se vezuje blizu membrane.

[0239] κλ tela, korišćena u količini od 1 µg/ml, hvataju se kozjim anti-humanim IgG(Fci) (Jackson ImmunoResearch) obloženim sa 10 µg/ml na crnoj mikroploči sa 96 bunarčića i blokiraju puferom za blokiranje (PBS 2% BSA, 0.05 % Tween 20). Kompetitivni IgG (0.03 do 20 µg/ml) su prethodno inkubirani 1 sat sa 0.1 µg/ml biotinilovanog humanog CEACAM5 u puferu za blokiranje. Ploča za κλ telo je isprana i inkubirana sa prethodno inkubiranom smešom konkurentskog IgG/CEACAM5 1 sat. Nakon ispiranja, CEACAM5 je detektovan sa Streptavidin-HRP (Jackson ImmunoResearch). Ploča se otkriva sa Amplex<™>crvenim reagensom (Molecular Probes) i signal fluorescencije se meri na Synergy HT uređaju za očitavanje ploča (Biotek).

[0240] Ako je vezivanje CEACAM5 za κλ tela smanjeno odgovarajućim antitelom alata za 80% ili više, može se zaključiti da je CEAxCD3 bispecifično antitelo klasifikovano da se kompetitivno vezuje sa antitelom alata. CEAxCD3 antitelo je stoga identifikovano kao nekompetitivno sa antitelom alata u slučaju da je vezivanje CEACAM5 za odgovarajuće κλ telo smanjeno za 20% ili manje ako se uporede rezultati sa i bez dodavanja antitela alata.

d) Vezivanje bispecifičnih antitela za primarne humane krvne ćelije

[0241] Da bi se pokazalo vezivanje CD3 x CEACAM5 κλ antitela za primarne T-ćelije i nedostatak vezivanja za primarne B-ćelije i monocite (CEA-negativne populacije), može se izvesti serija eksperimenata zasnovanih na protočnoj citometriji. Bojenje ćelija i procena vezivanja se mogu izvesti kao što je opisano u Primeru 7a. Podaci su prikazani na slici 13.

Primer 8: Ćelijska citotoksičnost zavisna od T-ćelija (TDCC) posredovana bispecifičnim antitelima

a) TDCC od CEACAM5 pozitivnih i CEACAM5 negativnih ćelijskih linija

[0242] Ćelijska citotoksičnost zavisna od T-ćelija (TDCC) različitih CEACAM5 pozitivnih i CEACAM5 negativnih tumorskih ćelijskih linija indukovanih CEAxCD3 bispecifičnim antitelima iz ovog pronalaska je procenjena upotrebom humanih PBMC ili prečišćenih primarnih T-ćelija kao efektorskih ćelija.

[0243] Ciljne ćelije se odvajaju tripsinom ili rastvorom za disocijaciju ćelija nakon dva ispiranja sa PBS. Posle koraka centrifugiranja, ćelije su resuspendovane u medijumu za ispitivanje, podešene na potrebnu koncentraciju i postavljene na ploče sa 96 bunarčića.

[0244] Efektorske ćelije mogu biti ili mononuklearne ćelije ljudske periferne krvi (PBMC) ili prečišćene T-ćelije. PBMC su izolovane iz „buffy coats“ dobijenih od zdravih humanih davaoca pomoću SepMate<™>epruveta (Stemcell Technologies) sa Lymphoprep<™>puferom (Stemcell Technologies). Ako se prečišćene T-ćelije koriste kao efektorske ćelije, vrši se dodatni korak prečišćavanja, gde se T-ćelije negativno izoluju iz PBMC uz upotrebu kompleta za imunomagnetnu negativnu selekciju T-ćelija (STEMCELL Technologies).

[0245] Za TDCC test, kada se PBMC koriste kao efektorske ćelije, one se dodaju ciljnim ćelijama u konačnom E:T odnosu od 10:1; kada se koriste prečišćene T-ćelije, koristi se konačni E:T odnos 5:1. CEAxCD3 antitela pronalaska i relevantna kontrolna antitela se zatim dodaju u koncentraciji u opsegu doze (do 100 nM u duplikatima) u prethodno postavljene ciljne i efektorske ćelije. Ubijanje ciljnih ćelija se procenjuje nakon 24h, 48h ili 72h inkubacije na 37°C, 5% CO2, kvantitativnijm određivanjem LDH oslobođenog u medijum od strane apoptotičkih/nekrotičnih ćelija (Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH), Roche). Maksimalno oslobađanje LDH (= 100% liza) je dobijeno inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100. Spontano oslobađanje LDH (= 0% lize) se odnosi na ciljne ćelije ko-inkubirane sa efektorskim ćelijama bez dodavanja antitela. TDCC krive (Slike 6, 7, 12 i 15) i EC50 vrednosti (Tabela 5) mogu se izračunati korišćenjem GraphPad Prism8 za MKN-45 i LS174T ćelijske linije, EC50 pronađen sa bsAb pronalaska prikazanim u tabeli 5 je značajno niži od EC50 izmeren sa TCB2014, pokazujući veću potenciju za in vitro ubijanje tumorskih ćelija ovih bsAb pronalaska.

TABELA 5 EC50 ubijanja tri CEA+ ćelijske linije

b) Test ubijanja kombinacijom CEAxCD3 i CEAxCD47 bispecifičnih antitela

[0246] Kombinacije bispecifičnog antitela ovog pronalaska sa anti CD47 mAb (kao što je opisano u US20140140989 i u WO2017196793) ili sa CEAxCD47 bispecifičnim antitelom (opisano u PCT/IB2019/054559), mogu se testirati u gore opisanim modelima. Dodatni uslovi testa su dodati eksperimentalnom dizajnu, gde se takvo antitelo koje ciljno deluje na CD47 (mono- ili bispecifično) koristi bilo samostalno ili u kombinaciji sa CEAxCD3 antitelom iz ovog pronalaska, u različitim dozama.

c) Povećana regulacija markera aktivacije T-ćelija nakon ubijanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEA indukovanih sa CEAxCD3 bsAb antitelima

[0247] Ubijanje CEA-pozitivnih tumorskih ćelija indukovanih CEAxCD3 bsAb antitelima zahteva aktivaciju T-ćelija, koja se može kvantitativno odrediti protočnom citometrijom upotrebom antitela koja prepoznaju specifične markere aktivacije T-ćelija kao što su CD69 (marker rane aktivacije) ili CD25 (marker kasne aktivacije).

[0248] Da bi se procenilo stanje aktivacije T-ćelija na kraju testa ubijanja (opisan gore, primer 8a), sledi sledeći postupak: plutajuće ćelije (koje uključuju i CD4+ i CD8+ T-ćelije) se prenose u nove ploče sa 96 bunarčića sa dnom oblika slova V. Supernatant je uklonjen centrifugiranjem (3 minuta na 4°C, 1300 rpm) i ćelije su isprane dva puta hladnim FACS puferom (PBS 2% BSA, 0.1% NaN3) pre nego što su inkubirane 15 minuta na 4°C sa Fc-blokom reagensom (BD Biosciences). Posle dva ispiranja sa FACS puferom, ćelije se inkubiraju 15 minuta na 4°C sa sledećim antitelima (koriste se prema preporukama proizvođača): Anti CD45 (V500-konjugovan, BD Biosciences), CD69 (FITC-konjugovan, Biolegend), CD8 (PerCP-Cy5.5-konjugovan, Biolegend), CD25 (PE-konjugovan, Biolegend), CD4 (APC-konjugovan, ThermoFisher), CD3 (APC-R700-konjugovan, BD Biosciences).

[0249] Ćelije su dva puta isprane hladnim FACS puferom i resuspendovane u 200 µl FACS pufera. Fluorescencija se meri korišćenjem Cytoflex platforme (Beckman Coulter) i podaci se analiziraju pomoću FlowJo<™>v10 softvera (BD Life Sciences). Rezultati su prikazani na slici 17.

d) Proliferacija T ćelija indukovana molekulima CEAxCD3 bsAb antitela

[0250] CEAxCD3 bsAb antitela se analiziraju na njihovu sposobnost da indukuju proliferaciju T ćelija nakon unakrsnog vezivanja u prisustvu CEA pozitivnih tumorskih ciljnih ćelija. Kao negativna kontrola koriste se i CEA negativne maligne ćelije. Sveže izolovane humane PBMC su podešene na 1 milion ćelija po mL u toplom PBS i obojene sa 0.2 µM karboksilfluorescein diacetat sukcinimidil estra (CFSE, ThermoFisher Scientific) u PBS tokom 15 minuta na 37°C, isprane nekoliko puta sa kompletnim RPMI medijumom (koji sadrži 10% FCS, 2 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 10 mM HEPES, 50 µM 2-merkaptoetanola i 25 µg/mL gentamicina) i prenete u ploče sa 96 bunarčića pri 2×10<6>ćelija po ml.0.02×10<6>ciljnih ćelija je postavljeno na po bunarčiću ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom i dodaju se različita CEAxCD3 bsAb antitela u naznačenim koncentracijama. PBMC obeleženi sa CFSE se dodaju da bi se dobio konačni E:T odnos od 10:1 i test ploče su inkubirane pet dana u vlažnom inkubatoru na 37°C. Petog dana, efektorske ćelije su sakupljene, isprane dva puta FACS puferom (PBS, 2% BSA, 0.1% NaN3), ćelije su zatim obojene sa BD Horizon 620 (BD Biosciences, 564996) da bi se isključile mrtve ćelije i sa anti CD45 (V500-konjugovan, BD Biosciences), anti-CD4-APC (ThermoFischer, 17-0049-41) i anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (Biolegend, 301032). CFSE bojenje se analizira na živim CD4<+>ili CD8<+>ćelijama protočnom citometrijom upotrebom CytoFLEX (Beckman Coulter) i rezultati se procenjuju pomoću softvera FlowJo.

e) Citokin oslobođen u supernatantu nakon ubijanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEA indukovane sa CEAxCD3 bsAb antitelima

[0251] Ubijanje CEA-pozitivnih tumorskih ćelija indukovanih sa CEAxCD3 bsAb antitelima zahteva aktivaciju T-ćelija. Nakon aktivacije, T-ćelije mogu osloboditi više citokina koji mogu dalje delovati kao imunomodulatorni agensi. Kapacitet bispecifičnih antitela ovog pronalaska da indukuju oslobađanje citokina od strane T-ćelija nakon ubijanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEA je procenjen kvantitativnim određivanjem izabranih citokina u supernatantu na kraju TDCC testova opisanih u Primeru 8a. Posle 2 dana ko-kulture CEA-pozitivnih ciljnih ćelija i CD3-pozitivnih efektorskih T-ćelija, supernatanti kulture su sakupljeni centrifugiranjem i čuvani zamrznuti na -80° do dalje analize. Citokini/enzimi kao što su granzim B, IL2, IL6, IL10, TNFα i IFNγ su kvantitativno određeni upotrebom Mesoscale Discovery platforme upotrebom multipleks kompleta i rezultati su prikazani na slici 16.

f) TDCC od CEACAM5 pozitivnih ćelija u prisustvu izlučenog CEA

[0252] Poznato je da CEA pozitivni tumori oslobađaju CEA. Takav izlučeni CEA bi mogao negativno da utiče na antitumorsku efikasnost CEA ciljnih antitela koja se ne vezuju prvenstveno za CEA vezan za membranu. Da bi se procenilo da li su bispecifična antitela iz ovog pronalaska pod uticajem izlučenog CEA (sCEA), test ćelijske citotoksičnosti zavisne od T-ćelija (TDCC) opisan u Primeru 8a je sproveden u prisustvu različite koncentracije dodatog sCEA (BioRad# PHP282). Vrednosti EC50 u prisustvu sCEA se zatim upoređuju sa EC50 dobijenim u odsustvu sCEA (Tabela 6). EC50 izračunat za datu koncentraciju sCEA (0.2, 1 ili 1 µg/mL) se zatim upoređuje sa onim dobijenim u odsustvu sCEA (0 µg/mL) i izražava se kao EC50 puta promena u poređenju sa stanjem bez izlučivanja CEA. Takve vrednosti su prikazane u tabeli 7.

TABELA 7 Višestruka promena EC50 u poređenju sa stanjem bez izlučivanja CEA (0 µg/mL)

[0253] Nađene su značajne veće promene EC50 za ubijanje tumorskih ćelija ako je sCEA dodat za TCB2014 i TCB2017 u poređenju sa bispecifičnim antitelima pronalaska pri 1 i 5 µg/mL sCEA. Koncentracije sCEA od 1 µg/mL i više nalaze se kod pacijenata sa CEA pozitivnim tumorima. Niže pomeranje zbog sCEA krive ubijanja bsAb pronalaska sugeriše manji inhibirajući uticaj visokih nivoa sCEA na efikasnost bsAb pronalaska u poređenju sa TCB2014 i TCB2017.

g) TDCC od CEACAM5-negativnih primarnih populacija krvnih ćelija.

[0254] S obzirom na mehanizam delovanja CEAxCD3 bispecifičnih antitela, unakrsna reaktivnost sa drugim CEACAM može dovesti do deplecije važnih cirkulišućih zdravih ćelijskih populacija. Na primer, unakrsna reaktivnost sa CEACAM8, koji eksprimiraju neutrofili, mogla bi dovesti do deplecije takvih ćelijskih populacija. Da bi se potvrdilo odsustvo vezivanja, a samim tim i ubijanja takvih CEA-negativnih cirkulišućih zdravih ćelijskih populacija, prečišćene primarne ćelije kao što su neutrofili se koriste kao "ciljne ćelije" umesto CEA-pozitivnih ćelijskih linija u eksperimentalnom postupku opisanom u Primeru 8a.

Primer 9: Procena anti-tumorske aktivnosti molekula koji ponovo ciljno deluje na CEAxCD3 T-ćelije kao pojedinačnog agensa ili u kombinovanoj terapiji sa antitelima koja ciljno deluju na CD47, u humanizovanim modelima tumora miša

[0255]

a) Antitumorska aktivnost molekula CEAxCD3 u PBMC-humanizovanom mišjem modelu tumora NOG miševa (NOD/Shi-scid/OL-2Rγ<nula>miševi, Taconic Biosciences), starosti od 8-10 nedelja, implantiraju se subkutano (s.c.) sa 1 do 5×10<6>CEA-pozitivnih tumorskih ćelija (izvedene iz ćelijske linije ili izvedene iz pacijenta) i randomizovane u nekoliko grupa za lečenje. Četiri do sedam dana kasnije, svim miševima se injektira i.p. ili i.v. 10 ili 20×10<6>humanih PBMC (mononuklearnih ćelija periferne krvi) za postupak humanizacije. CD3xCEA molekuli ili kontrole se zatim primenjuju i.v. počevši od 3-6 dana nakon injekcije PBMC, jednom ili dva puta nedeljno, u različitim dozama. Miševi se prate za razvoj tumora 3 puta nedeljno i tumori se mere digitalnim kaliperom do krajnje tačke eksperimenta (zapremina tumora = 1500 mm<3>ili početak simptoma GvHD). Zapremina tumora se izračunava pomoću formule (dužina × širina<2>) × 0.5. Statistička analiza se vrši korišćenjem jednosmerne ANOVA komparativne analize na kraju studije. Rezultati eksperimenta u kome je 1 milion HPAF-II ćelija usađeno subkutano u NOG miševe sa naknadnom injekcijom 10 miliona humanih PBMC prikazani su na slici 19.

b) Antitumorska aktivnost CEAxCD3 molekula u CD34<+>-humanizovanom modelu mišjeg tumora potpuno humanizovanih CD34<+>-huNOG miševa (CD34<+>usađen NOD/Shi-scid/OL-2Rγ<nula>miševi, Taconic Biosciences), starosti od 14 nedelja i sa humanim CD45<+>ćelijama >25% u krvi, implantiraju se subkutano (s.c.) sa 1 do 5×10<6>CEA-pozitivnih tumorskih ćelija (poreklom iz ćelijske linije ili poreklom od pacijenata) i randomizovane su u nekoliko grupa za lečenje. Kada srednja zapremina tumora dostigne unapred definisanu vrednost (u opsegu od 100 do 200 mm<3>), CD3xCEA molekuli ili kontrole se primenjuju i.v., jednom ili dva puta nedeljno, u različitim dozama. Miševi se prate za rast tumora 3 puta nedeljno, a tumori se mere digitalnim kaliperom do krajnje tačke eksperimenta (zapremina tumora = 1500 mm<3>). Zapremina tumora se izračunava pomoću formule (dužina × širina<2>) × 0.5. Statistička analiza se vrši korišćenjem jednosmerne ANOVA komparativne analize na kraju studije.

c) Antitumorska aktivnost CEAxCD3 molekula u kombinaciji sa antitelima koja ciljno deluju na CD47 (monospecifična ili bispecifična) u modelu humanizovanog mišjeg tumora. Kombinacije bispecifičnog antitela ovog pronalaska sa anti CD47 mAb (kao što je opisano u US20140140989 i u WO2017196793) ili sa CEAxCD47 bispecifičnim antitelom (opisanim u PCT/IB2019/054559) mogu se testirati na modelima opisanim iznad. Dodatne grupe se dodaju eksperimentalnom dizajnu, uključujući grupe za tretman gde se antitelo koje ciljno deluje na CD47 (monospecifično ili bispecifično) primenjuje i.v. bilo samostalno ili u kombinaciji sa CEAxCD3 antitelom iz ovog pronalaska, jednom ili dva puta nedeljno, u različitim dozama. d) Antitumorska aktivnost CEAxCD3 molekula u kombinaciji sa antitelima koja ciljno deluju na CD47 (monospecifična ili bispecifična) u modelima transgenog tumora miša. Kombinacije bispecifičnog antitela ovog pronalaska sa anti CD47 mAb (kao što je opisano u US20140140989 i u WO2017196793) ili sa CEAxCD47 bispecifičnim antitelom (opisano u PCT/IB2019/054559) može se testirati na transgenim miševima koji su konstruisani da eksprimiraju humani CD3, humani CD47 i humani SIRPα, koji se implantiraju subkutano (s.c.) sa 0.5 do 5×10<6>tumorskih ćelija miša konstruisanih da eksprimiraju humani CEA i humani CD47. Kada srednja zapremina tumora dostigne unapred definisanu vrednost (u opsegu od 100 do 200 mm<3>), miševi su randomizovani. Tretmani se primenjuju i.v., jednom ili dva puta nedeljno, u različitim dozama. Miševi se prate za rast tumora 3 puta nedeljno, a tumori se mere digitalnim kaliperom do krajnje tačke eksperimenta (zapremina tumora = 1500 mm<3>). Zapremina tumora se izračunava pomoću formule (dužina × širina<2>) × 0.5. Statistička analiza se vrši upotrebom jednosmerne ANOVA komparativne analize na kraju studije.

Primer 10: Oslobađanje citokina testirano u punoj krvi i PBMC od zdravih humanih donatora krvi

[0256] In vitro test oslobađanja citokina se izvodi upotrebom pune krvi (WB CRA) sa minimalnim razblaženjem test antitelima (95% v/v krvi) u vodenoj prezentaciji. Smatra se da ovaj format testa blisko oponaša in vivo okruženje, koje sadrži faktore u fiziološkim koncentracijama koji mogu uticati na mehanizme oslobađanja citokina. Međutim, smatra se da ovaj format slabo predviđa oslobađanje citokina posredovano T ćelijama (npr. anti-CD28).

[0257] Alternativno, test oslobađanja citokina se može izvesti korišćenjem mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od zdravih humanih donora i sa antitelima u vodenoj prezentaciji (vodena faza, AP), da bi se procenilo oslobađanje citokina posredovano T ćelijama (PBMC AP CRA). Ovaj format ograničava unakrsno povezivanje mAb antitela da bi se izbeglo veliko oslobađanje citokina koje se primećuje kod anti-CD3 antitela nakon unakrsnog povezivanja.

[0258] Negativne kontrole (anti-EGFR mAb i PBS) kao i specifične pozitivne kontrole (anti-CD52 mAb, CEA × CD3 BiTE i/ili anti-CD28 mAb) za svaki format testa se testiraju paralelno sa CEA × CD3 bispecifičnim antitelima. Posle 24 h za WB CRA i 48 h za PBMC AP CRA, supernatanti su testirani na citokine u multipleksnom testu upotrebom elektrohemiluminiscencije kao očitavanja (Mesoscale Discovery, Sector 600). IFNγ, TNFα i IL-6 se mere za WB CRA, a IFNγ, IL-2, IL-10 i TNFα se mere za PBMC AP CRA. Rezultati su prikazani na grafikonu po citokinu sa svakim donorom prikazanim kao jedna tačka podataka.

Primer 11 Sazrevanje afiniteta CEA antitela mutagenezom usmerenom na oligonukleotide upotrebom degenerisanih oligonukleotida („Lead“ optimizacija; LO)

[0259] Antitela identifikovana tokom postupka skrininga opisanog u Primeru 3 se biraju za sazrevanje afiniteta u cilju povećanja njihovog afiniteta i potencije. Sva ova antitela dele isti varijabilni teški lanac, ali imaju različite varijabilne lake lance. AB1 i C11 sadrže kapa laki lanac (IGKV3-11 i IGKV1-5, prema IMGT nomenklaturi), dok AB8 i 1B4 sadrže lambda laki lanac (IGLV2-14 i IGLV3-21, respektivno). Nekoliko biblioteka faga koje prikazuju scFv varijante se generiše uvođenjem diverziteta u CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, dok se varijabilni region teškog lanca održava nemodifikovanim. Različite strategije diverzifikacije se koriste za generisanje biblioteka za svakog kandidata, gde su ili CDRL1+CDRL2; ili samo CDRL3, ili su sva tri CDRL diverzifikovana (CDRL1+CDRL2+CDRL3) mutagenezom roditeljske sekvence usmerenom na oligonukleotide korišćenjem degenerisanih oligonukleotida. CDRL1 je diverzifikovan na 1 do 5 pozicija aminokiselina; CDRL2 na 1 do 4 aminokiselinske pozicije dok CDRL3 na 1 do 5 aminokiselinskih pozicija. Ukupno do 5×10<9>transformanata koji delimično pokrivaju teorijski diverzitet do 10<14>generišu se za svakog kandidata.

[0260] Za kandidate AB1 i 1B4, dodatne biblioteke diverzifikovane na do 17 pozicija aminokiselina u svim CDRL se generišu sa do 5×10<9>transformanata koji delimično pokrivaju teorijski diverzitet do 10<21>.

[0261] Ove biblioteke se koriste za selekcije prikaza faga kao što je opisano u Primeru 2, osim što se strogost selekcije može povećati između rundi smanjenjem koncentracije rekombinantnog hCEACAMS sa 100 nM postepeno na 0.01 nM između različitih rundi selekcije ili korišćenjem ćelija koje eksprimiraju niže nivoe hCEACAMS poput SNUC-1 ćelijske linije. Selekcionisane varijante su testirane na kapacitet vezivanja za CEACAM5 upotrebom testa opisanog u Primeru 3. Pozitivni klonovi su ponovo formatirani kao IgG i okarakterisani kao što je opisano u Primerima 4 i 5, respektivno.

[0262] Anti-CEA krak AB1 (SEQ ID NOs: 31 do 34) je optimizovan u dva uzastopna talasa „lead“ optimizacije. Talas 1 je rezultirao anti-CEA kracima AB13, AB14, AB15, AB17 i AB20. Talas 2 je rezultirao anti-CEA kracima AB54, AB60, AB66, AB71, AB72 i AB73.

Primer 12: TDCC (ćelijska citotoksičnost zavisna od T ćelija) i/ili TDCC plus ADCP organoida poreklom iz tumora

[0263] Organoidi poreklom iz tumorskih ćelija su napredni translacioni model za testiranje jedinjenja za ponovno ciljno delovanje na T-ćelije i/ili jedinjenja za ponovno ciljno delovanje na makrofage i NK ćelije.

[0264] Organoidi se pripremaju prema standardnim postupcima (Schütte et al., Nature Communications 2017; DOI:10.1038/ncomms14262) i inkubiraju se sa jedinjenjima do 8 dana u ko-kulturi sa PBMC i in vitro generisanim makrofagima. Podloga se menja svaka 4 dana i zamenjuje svežom podlogom.

[0265] Organoidi su sakupljeni i enzimski disocirani u pojedinačne ćelije na 37°C tokom 5 minuta korišćenjem Accutase. Ćelije su peletirane, resuspendovane u FACS puferu (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) i filtrirane kroz ćelijsku cediljku od 400 µm. Suspenzije ekvivalentnog broja ćelija su inkubirane sa antitelima protiv CD45, CD4, CD8, CEA i CD14 (sve od Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Nemačka) tokom 30 minuta na ledu. Za gejting živih ćelija, propidijum jodid se koristi, meri i analizira korišćenjem softvera FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland, OR, SAD).

[0266] Supernatant iz svakog bunarčića je zamrznut na -80°C za analizu aktivnosti T-ćelija korišćenjem ELISA.

Primer 13: TDCC i/ili TDCC plus ADCP isečaka tumorskog tkiva dobijenih od pacijenta

[0267] Sveži isečci tumorskog tkiva dobijeni od pacijenata su još jedan napredni translacioni model za testiranje jedinjenja koja ponovo ciljno deluju na T-ćelije i/ili makrofage i/ili NK ćelije.

[0268] Sveži uzorci tumorskog tkiva biće isečeni u skladu sa standardnim postupcima koji su ranije objavljeni (Sönnichsen et al., Clinical Colorectal Cancer, 17 (2018) e189-e199). Ukratko, odmah nakon hirurške resekcije i prve makroskopske patološke procene, uzorci tumora se seku na isečke od 350 µm pomoću seckalice tkiva McIlwain TC752; Campden Instruments, Leicestershire, England). Prečnik isečka tkiva se zatim standardizuje korišćenjem 3-mm alata za jezgrovanje (kai Europe, Solingen, Nemačka). Tri isečka tkiva su nasumično spojena, postavljena na membranske umetke i kultivisana u pločama sa 6 bunarčića. Isečci se inkubiraju pod standardizovanim uslovima od 37°C i 5% CO2. Medijum se menja 2 sata i 24 sata nakon pripreme pre tretmana.

[0269] Posle 24 sata pre-kultivacije u standardnom medijumu za ćelijsku kulturu, tri kopije isečaka mogu biti izložene bispecifičnim antitelima prema pronalasku pojedinačno ili u kombinaciji do 120 sati. Ako je potrebno, vreme inkubacije se smanjuje na 72 sata. Medijum će biti promenjen nakon 72 sata.

[0270] Nakon izlaganja jedinjenju, isečci tumora su fiksirani preko noći korišćenjem 4% paraformaldehida. Supernatant iz svakog bunarčića će biti zamrznut na -80°C radi analize aktivnosti T-ćelija korišćenjem ELISA.

[0271] Paraformaldehidom fiksirani isečci se kalupe u parafin i obrađuju u isečke od 5 µm. Bojenje hematoksilinom i eozinom (HE) se vrši da bi se procenili histopatološki aspekti i proporcija tumorskih ćelija. Ukupan broj ćelija, broj tumorskih ćelija i proliferacija se analiziraju imunofluorescentnim bojenjem. Ukratko, parafinski delovi su deparafinizovani. Nakon uzimanja antigena, isečci se isperu sa 0.3% PBS/TritonX i blokiraju sa 5% normalnog kozjeg seruma (Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK) tokom 30 minuta. Primarna antitela protiv citokeratina (AE1 3), Ki67, i odcepljeni-PARP, respektivno, razblaženi su u 0.5% albuminu goveđeg seruma i inkubirani na 4°C preko noći. Isečci su isprani sa 0.3% fosfatno puferisanim fiziološkim rastvorom/TritonX i obeleženi sekundarnim antitelima. Jedra su obojena sa Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Za dalju analizu, uključena su antitela protiv CEA (tumorske ćelije), CD163 (makrofagi) i CD3, CD4, CD8, PD-L1 kao i FoxP3 (sve T-ćelije) u zavisnosti od dostupnosti isečaka tumora.

[0272] Područje koje sadrži tumorske ćelije se analizira u HE isečcima pomoću skeniranja slajdova (Pannoramic SCAN i Pannoramic Viewer, 3D Histech, Budimpešta, Mađarska) da bi se istražile različite frakcije tumorskih ćelija. Iz analize su isključeni isečci koji su sadržali više benignih epitelnih ćelija nego neoplastičnih epitelnih ćelija. Isečci koji nisu sadržali tumorske ćelije isključeni su iz analize proliferirajuće frakcije tumorskih ćelija, ali su uključeni u analizu tumorskih ćelija po stanju. Za dalju analizu, 5 slika (20x) po isečku tkiva je uzeto iz fluorescentno obojenih isečaka upotrebom fluorescentnog mikroskopa Olympus BX51 (Olympus Deutschland, Hamburg, Germany). Pozitivan broj piksela je određen za bojenja sa Hoechst 33342, citokeratinom, Ki67 i odcepljenim-PARP sa algoritmima segmentacije specifičnim za bojenje za sliku J. Proliferirajuća/apoptotička površina tumora se izračunava analizom piksela jedara pozitivnih na Ki67/odcepljeni PARP okruženih pikselima pozitivnim na citokeratin.

[0273] Za svaku sliku izračunava se ukupan broj ćelija (Hoechst-pozitivan), broj tumorskih ćelija (pozitivnih na Hoechst i citokeratin) i broj proliferirajućih tumorskih ćelija (pozitivnih na Hoechst, citokeratin i Ki67/odcepljeni PARP). Broj tumorskih ćelija se normalizuje na ukupan broj ćelija, a broj proliferirajućih tumorskih ćelija se normalizuje na broj tumorskih ćelija da bi se razmotrile različite frakcije tumorskih ćelija po slici. Srednje vrednosti preseka se zatim izračunavaju iz vrednosti pojedinačne slike. Srednje vrednosti za uslove se izračunavaju upotrebom srednjih vrednosti isečka.

Claims

Patentni zahtevi

1. Bispecifično antitelo koje sadrži prvi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CEACAM5, i drugi vezujući deo, koji se specifično vezuje za humani CD3ε, pri čemu:

a) prvi vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), koji sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4,

b) prvi vezujući deo sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDRL set izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

b1) CDRL1 od SEQ ID NO: 90, CDRL2 od SEQ ID NO: 91 i CDRL3 od SEQ ID NO: 92, b2) CDRL1 od SEQ ID NO: 96, CDRL2 od SEQ ID NO: 97 i CDRL3 od SEQ ID NO: 98, b3) CDRL1 od SEQ ID NO: 99, CDRL2 od SEQ ID NO: 100 i CDRL3 od SEQ ID NO: 101, b4) CDRL1 od SEQ ID NO: 102, CDRL2 od SEQ ID NO: 103 i CDRL3 od SEQ ID NO: 104, b5) CDRL1 od SEQ ID NO: 105, CDRL2 od SEQ ID NO: 106 i CDRL3 od SEQ ID NO: 107, b6) CDRL1 od SEQ ID NO: 108, CDRL2 od SEQ ID NO: 109 i CDRL3 od SEQ ID NO: 110, i

b7) CDRL1 od SEQ ID NO: 111, CDRL2 od SEQ ID NO: 112 i CDRL3 od SEQ ID NO: 113, c) drugi vezujući deo sadrži VH koji sadrži CDRH1 od SEQ ID NO: 2, CDRH2 od SEQ ID NO: 3 i CDRH3 od SEQ ID NO: 4, i

d) drugi vezujući deo sadrži VL koji sadrži CDRL1 od SEQ ID NO: 18, CDRL2 od SEQ ID NO: 19 i CDRL3 od SEQ ID NO: 20.

2. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži

a) u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1,

b) u prvom vezujućem delu varijabilni region lakog lanca VL izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

b1) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 117,

b2) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 119,

b3) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 120,

b4) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 121,

b5) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 122,

b6) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 123, i

b7) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 124, i

3. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 2, koje sadrži

a) u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1,

b1) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 117,

b2) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 122, i

b3) varijabilni region lakog lanca VL od SEQ ID NO: 124, i

4. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži

a) u prvom vezujućem delu varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1,

b) u prvom vezujućem delu laki lanac izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

b1) laki lanac od SEQ ID NO: 128,

b2) laki lanac od SEQ ID NO: 130,

b3) laki lanac od SEQ ID NO: 131,

b4) laki lanac od SEQ ID NO: 132,

b5) laki lanac od SEQ ID NO: 133,

b6) laki lanac od SEQ ID NO: 134, i

b7) laki lanac od SEQ ID NO: 135, i

c) u drugom vezujućem delu, varijabilni region teškog lanca VH od SEQ ID NO: 1 i laki lanac od SEQ ID NO: 28.

5. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što sadrži uobičajeni teški lanac izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih:

a) teški lanac od SEQ ID NO: 43,

b) teški lanac od SEQ ID NO: 44, i

c) teški lanac od SEQ ID NO: 45.

6. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži uobičajeni teški lanac od SEQ ID NO: 45 i u drugom vezujućem delu laki lanac od SEQ ID NO: 28 i u prvom vezujućem delu laki lanac od SEQ ID NO: 128.

7. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži uobičajeni teški lanac od SEQ ID NO: 45 i u drugom vezujućem delu laki lanac od SEQ ID NO: 28 i u prvom vezujućem delu laki lanac od SEQ ID NO: 133.

8. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži uobičajeni teški lanac od SEQ ID NO: 45 i u drugom vezujućem delu laki lanac od SEQ ID NO: 28 i u prvom vezujućem delu laki lanac od SEQ ID NO: 135.

9. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što sadrži Fc domen pri čemu svaka podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329A (numeracija Kabat EU indeksa).

10. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u lečenju karcinoma in vivo.

11. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u lečenju kancera primenom na humanog subjekta koji pati od kancera farmaceutski efikasne količine kompozicije koja sadrži pomenuto bispecifično antitelo.

12. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u lečenju kolorektalnog karcinoma, kancera jednjaka, adenokarcinoma pankreasa, kancera želuca, nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera dojke, karcinoma glave i vrata, kancera materice i bešike.

13. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u monoterapiji za lečenje solidnih tumora koji eksprimiraju CEA.

14. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u lečenju kancera u kombinaciji sa bispecifičnim anti-CEAxCD47 antitelom u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji.

15. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u lečenju kancera u kombinaciji sa bispecifičnim anti-CEAxCD47 antitelom i/ili antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji.

16. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu u lečenju kancera u kombinaciji sa antagonistom PD-1 ose u istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj kombinaciji.

17. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 i bispecifično anti-CEAxCD47 antitelo za upotrebu u primeni u naizmeničnoj primeni, u intervalima od 6 do 15 dana između primene antitela pronalaska i bispecifičnog anti-CEAxCD47 antitela u lečenju kancera.

18. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 17, pri čemu se antitelo primenjuje na pacijenta u dozama u opsegu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom.

19. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, naznačeno time što antitelo pronalaska se primenjuje na pacijenta u dozama u opsegu od 1 do 20 mg/kg.

20. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14, 15 ili 17, naznačeno time što anti-CEAxCD47 antitelo se primenjuje na pacijenta u dozama u opsegu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom.

21. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, pri čemu se antagonist PD-1 ose primenjuje na pacijenta u dozama u opsegu od 0.1 do 100 mg/kg telesne težine dnevno ili nedeljno u pojedinačnim ili podeljenim dozama, ili kontinuiranom infuzijom.

22. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

23. Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

24. Vektor koji sadrži izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 23.

25. Ćelija koja sadrži izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 23 ili vektor prema patentnom zahtevu 24.