RS65485B1 - Kompozicija za kontrolisanu stimulaciju jajnika - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na kompozicije i farmaceutske proizvode za lečenje neplodnosti.

[0002] Tehnike medicinski asistirane reprodukcije (MAR) kao što je in vitro oplodnja (in vitro fertilisation, IVF) dobro su poznate. Ove tehnike MAR uopšteno zahtevaju korak kontrolisane stimulacije jajnika (controlled ovarian stimulation, COS), kada se kohorta folikula stimuliše do pune zrelosti. Standardni režimi COS uključuju primenu gonadotropina, kao što je folikulostimulišući hormon (FSH) samostalno ili u kombinaciji sa aktivnošću luteinizirajućeg hormona (LH) kako bi se stimulisao folikularni razvoj, uobičajeno uz primenu GnRH analoga pre i/ili tokom stimulacije radi prevencije preranog skoka LH. Farmaceutske kompozicije koje se obično koriste za COS uključuju rekombinantni folikulostimulišući hormon (rFSH), urinarno dobijeni FSH, preparate rekombinantnog FSH LH, urinarno dobijeni menotrofin [humani menopauzalni gonadotropin (hMG)] i visoko prečišćeni humani menopauzalni gonadotropin (HP-hMG). IVF može biti povezan sa rizikom od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS), koji može biti opasan po život u teškim slučajevima.

[0003] Sposobnost da se predvidi potencijal odgovora žena na kontrolisanu stimulaciju jajnika (COS) može da omogući razvoj individualizovanih protokola COS. Ovo bi moglo, na primer, da smanji rizik od OHSS kod žena za koje se predviđa da će imati prekomeran odgovor na stimulaciju, i/ili da poboljša ishode trudnoće kod žena za koje je ocenjeno da imaju loš odgovor. Koncentracija anti-Milerovog hormona (AMH) u serumu sada je uspostavljena kao pouzdan marker rezerve jajnika. Opadajući nivoi AMH su povezani sa smanjenim odgovorom jajnika na gonadotropine tokom COS. Nadalje, visoki nivoi AMH su dobar prediktor prekomernog odgovora jajnika, i indikator rizika od OHSS.

[0004] U preliminarnoj studiji žena mlađih od 35 godina koje su podvrgnute MAR-u, korišćen je algoritam doziranja CONSORT (koji obuhvata bazni FSH, BMI (indeks telesne mase), starost i AFC (broj antralnih folikula)) da se predvidi optimalna početna doza FSH za COS kod žena kod kojih postoji rizik od javljanja OHSS (Olivennes et. al., 2009). Individualizacija doze je dovela do odgovarajućeg prinosa oocita i dobre stope trudnoće. Međutim, u grupi sa malom dozom (75 i.j. FSH) postojala je visoka stopa neuspeha usled neodgovarajućeg odgovora, i OHSS se javio kod značajnog udela pacijentkinja.

[0005] Stoga postoji potreba za individualizovanim protokolima COS koji obezbeđuju odgovarajući odgovor na stimulaciju i/ili smanjeni rizik od OHSS.

[0006] Kao što je prethodno naznačeno, standardni protokoli COS mogu da obuhvataju primenu FSH. FSH se prirodno luči iz anteriorne hipofize i podržava folikularni razvoj i ovulaciju. FSH sadrži alfa podjedinicu od 92 aminokiseline, koja je takođe prisutna kod drugih glikoproteinskih hormona LH i CG, i beta podjedinicu od 111 aminokiselina koja je jedinstvena za FSH i daje biološku specifičnost hormonu (Pierce i Parsons, 1981). Svaka podjedinica je posttranslaciono modifikovana dodatkom složenih ugljovodoničnih ostataka. Obe podjedinice imaju 2 mesta za vezivanje N-vezanog glikana, alfa podjedinica na aminokiselinama 52 i 78, a beta podjedinica na aminokiselinskim ostacima 7 i 24 (Rathnam i Saxena, 1975, Saxena i Rathnam, 1976). FSH je tako glikolizovan do oko 30% masenih (Dias i Van Roey.2001. Fox et al.2001).

[0007] FSH prečišćen iz postmenopauzalnog humanog urina se dugi niz godina koristi u lečenju neplodnosti, kako za pospešivanje ovulacije kod prirodne reprodukcije tako i za obezbeđivanje oocita za tehnologiju medicinski asistirane reprodukcije. Trenutno odobreni proizvodi rekombinantnog FSH (rFSH) za stimulaciju jajnika, kao što su folitropin alfa (GONAL-F, Merck Serono / EMD Serono) i folitropin beta (PUREGON / FOLLISTIM, MSD / Schering-Plough), dobijaju se iz ćelijskih linija jajnika kineskog hrčka (CHO). Trenutno, nijedan rFSH proizvod iz humane ćelijske linije nije komercijalno dostupan.

[0008] Postoji značajna heterogenost povezana sa FSH preparatima koja je povezana sa razlikama u količinama različitih izooblika koje su prisutne. Pojedinačni izooblici FSH pokazuju identične aminokiselinske sekvence, ali se razlikuju u meri u kojoj su posttranslaciono modifikovane. Pojedine izooblike karakteriše heterogenost razgranatih struktura ugljovodonika i različite količine inkorporacije sijalinske kiseline (terminalni šećer), i čini se da oba utiču na biološku aktivnost specifičnog izooblika.

[0009] Glikozilacija prirodnog FSH je veoma složena. Glikani u prirodno dobijenom hipofiznom FSH mogu da sadrže širok raspon struktura koje mogu da uključuju kombinacije mono-, bi-, tri- i tetraantenarnih glikana (Pierce i Parsons, 1981. Ryan et a/., 1987. Baenziger i Green, 1988). Glikani mogu imati dalje modifikacije: fukozilaciju jezgra, bisekcioni glukozamin, lance produžene acetil laktozaminom, delimičnu ili potpunu sijalilaciju, sijalilaciju sa α2,3 i α2,6 vezama i sulfatisani galaktozamin koji zamenjuje galaktozu (Dalpathado et al., 2006). Nadalje, postoje razlike u raspodeli glikanskih struktura na pojedinačnim mestima glikozilacije. Uporedivi nivo složenosti glikana je otkriven kod FSH dobijenog iz seruma pojedinaca i iz urina postmenopauzalnih žena (Wide et al., 2007).

[0010] Glikozilacija proizvoda rekombinantnog FSH odražava raspon glikozil-transferaza koje su prisutne u ćelijskoj liniji domaćina. Komercijalno dostupni proizvodi rFSH se dobijaju od konstruisanih ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije). Raspon modifikacija glikana u rFSH dobijenom iz ćelija jajnika kineskog hrčka je više ograničen od onih koji se nalaze na prirodnim proizvodima. Primeri za smanjenu heterogenost glikana koja se može videti kod rFSH dobijenog od ćelija CHO uključuju nedostatak bisekcionog glukozamina i smanjen sadržaj fukozilacije jezgra i ekstenzija acetil laktozamina (Hard et al., 1990). Pored toga, ćelije CHO mogu da dodaju sijalinsku kiselinu samo pomoću α2,3 veze (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). rFSH dobijen od ćelija CHO uključuje samo α2,3-vezanu sijalinsku kiselinu, i ne uključuje α2,6-vezanu sijalinsku kiselinu.

[0011] Dakle, FSH dobijen od ćelija CHO razlikuje se od prirodno proizvedenog FSH (npr. humanog hipofiznog / serumskog / urinarno dobijenog FSH) koji sadrži glikane sa smešom α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline, gde prva preovlađuje.

[0012] Pored toga, takođe je pokazano da se komercijalno dostupan rekombinantni FSH preparat razlikuje u količinama FSH sa izoelektričnom tačkom (pl) ispod 4 (smatra se kiselim izooblicima) u poređenju sa hipofiznim, serumskim FSH ili FSH urina u postmenopauzi (Ulloa-Aguirre et al.1995). Količina kiselih izooblika u urinarnim preparatima bila je mnogo veća u poređenju sa rekombinantnim proizvodima dobijenim iz ćelija CHO, Gonal-f (Merck Serono) i Puregon (Schering Plough) (Andersen et al. 2004). Ovo mora da odražava niži molarni sadržaj sijalinske kiseline u rekombinantnom FSH, pošto je sadržaj negativno naelektrisanog glikana modifikovanog sulfatom nizak u rekombinantnom FSH. Niži sadržaj sijalinske kiseline, u poređenju sa prirodnim FSH, je karakteristika oba komercijalno dostupna proizvoda rekombinantnog FSH i može da odražava ograničenje u proizvodnom procesu.

[0013] Životni vek FSH u cirkulaciji je dokumentovan za materijale iz različitih izvora.

Neki od ovih materijala su frakcionisani na osnovu ukupnog molekularnog naboja, što je karakterisano njihovim pl (izoelektričnim tačkama), u kojem više kiseline odgovara većem negativnom naelektrisanju. Kao što je ranije navedeno, glavni doprinos ukupnom molekularnom naboju je ukupan sijalinski sadržaj u svakom molekulu FSH. Na primer, rFSH (Organon) ima sadržaj sijalinske kiseline od oko 8 mol/mol, dok FSH dobijen iz urina ima veći sadržaj sijalinske kiseline (de Leeuw et al. 1996). Odgovarajuće stope klirensa plazme kod pacova su 0,34 i 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al.2003). U drugom primeru gde je uzorak rekombinantnog FSH podeljen na frakcije sa visokim i niskim pl, in vivo potencija frakcije sa visokim pi (niži sadržaj sijalinske kiseline) je smanjena i imala je kraći poluživot u plazmi (D'Antonio et al. 1999). Takođe je objavljeno da je uzrok osnovnijeg FSH koji cirkuliše tokom kasnijih faza ciklusa ovulacije smanjena regulacija α2,3 sijalil-transferaze u prednjem režnju hipofize što je posledica povećanog nivoa estradiola (Damian-Matsumara et. al.1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). Rezultati za α2,6 sijalil-transferazu nisu prijavljeni.

[0014] Stoga će se rekombinantni proteini eksprimirani pomoću sistema CHO razlikovati od svojih prirodnih parnjaka po svojoj vrsti terminalnih veza sijalinske kiseline. Ovo je važno pitanje u proizvodnji bioloških preparata za farmaceutsku upotrebu jer ugljenohidratne komponente mogu doprineti farmakološkim osobinama molekula. Podnosioci predmetne prijave su razvili rekombinantni humani FSH koji je predmet međunarodne prijave patenta br. PCT/GB2009/000978, koja je objavljena kao WO2009/127826A. Rekombinantni FSH sa smešom α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline je napravljen konstruisanjem humane ćelijske linije koja eksprimira i rFSH i α2,3 sijaliltransferazu. Eksprimirani proizvod je veoma kiseo, i ima smešu i α2,3- i α2,6-vezanih sijalinskih kiselina; ova druga je obezbeđena putem aktivnosti endogene sijalil transferaze. Otkriveno je da vrsta veze sijalinske kiseline, α2,3- ili α2,6-, može imati izuzetan uticaj na biološki klirens FSH. Rekombinantni FSH sa smešom i α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline ima dve prednosti u odnosu na rFSH eksprimiran u konvencionalnim CHO ćelijama: prvo, supstanca je u većoj meri sijalilovana usled kombinovanog dejstva dve sijaliltransferaze, a drugo, supstanca je u većoj meri slična prirodnom FSH. To će verovatno u većoj meri biti biološki pogodno u poređenju sa rekombinantnim proizvodima dobijenim od CHO ćelija koje su proizvele samo α2,3 vezanu sijalinsku kiselinu (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) i imaju smanjeni sadržaj sijalinske kiseline (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al.2004).

[0015] Proizvod rFSH otkriven u međunarodnoj prijavi patenta br. PCT/GB2009/000978 sadrži razgranate glikanske delove. FSH sadrži glikane (vezane za FSH glikoproteine) i ovi glikani mogu da sadrže širok spektar struktura. Kao što je dobro poznato u tehnici, grananje (glikana) može nastati sa rezultatom da glikan može imati 1, 2, 3, 4 ili više terminalnih ostataka šećera ili „antena“; glikani sa 1, 2, 3 ili 4 terminalna ostatka šećera ili „antene“ se nazivaju, datim redosledom, monoantenarne, diantenarne, triantenarne ili tetraantenarne strukture. Glikani mogu imati prisustvo sijalicije na monoantenarnim i/ili diantenarnim i/ili triantenarnim i/ili tetraantenarnim strukturama. Primer rFSH obelodanjen u međunarodnoj prijavi patenta br. PCT/GB2009/000978 uključuje monosijalirirane, disijalirirane, trisijalirirane i tetrasijalirirane glikanske strukture sa relativnim količinama kao što sledi:

9-15% monosijalirirane; 27 - 30% disijalirirane; 30 - 36% trisijalirirane i 25 - 29 % tetrasijalirirane. Kao što je dobro poznato, monosijalirirana glikanska struktura nosi jedan ostatak sijalinske kiseline; disijalirirana glikanska struktura nosi dva ostatka sijalinske kiseline; trisijalirirana glikanska struktura nosi tri ostatka sijalinske kiseline; a tetrasijalirirana glikanska struktura nosi četiri ostatka sijalinske kiseline. Ovde, terminologija kao što je „X% monosijaliriran“, „X% disijaliriran“, „X% trisijaliriran“ ili „X% tetrasijaliriran“ odnosi se na broj glikanskih struktura na FSH koje su mono-, di, tri ili tetra sijalirirane (tim redosledom), izražene kao procenat (X%) od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje su sijalirirane na bilo koji način (nose sijalinsku kiselinu). Dakle, izraz „30 - 36% trisijaliriranih glikanskih struktura“ znači da, od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje nose ostatke sijalinske kiseline (to jest, sijalirirane su), 30 do 36% ovih glikanskih struktura je tri sijalirirana (nosi tri ostatka sijalinske kiseline).

Podnosioci predmetnih prijava su, na opšte iznenađenje, utvrdili da je FSH koji ima specifičnu količinu tetrasijaliriranih glikanskih struktura (koja je različita od one u primeru proizvoda rFSH obelodanjenog u PCT/GB2009/000978 koji je gore pomenut) značajno potentniji od proizvoda rekombinantnog FSH koji su trenutno na tržištu. Aminokiselinska sekvenca proizvoda podnosioca predmetne prijave je nativna sekvenca i identična je prirodnom humanom FSH i postojećim proizvodima rFSH dobijenim iz CHO. Međutim, podnosioci predmetne prijave su utvrdili da humano dobijeni proizvodi rekombinantnog FSH (tj. rekombinantni FSH proizveden ili eksprimiran u humanoj ćelijskoj liniji, npr. napravljen konstruisanjem humane ćelijske linije) koji imaju smešu i α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline mogu biti naročito delotvorni kada se koriste u protokolima COS (npr. individualizovanim).

[0016] Prema pronalasku, u prvom aspektu, obezbeđen je proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) koji sadrži humani folikulostimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijenata koji imaju nivo AMH u serumu <15 pmol/l (npr. 0,05 pmol/l do 14,9 pmol/l), pri čemu proizvod sadrži (npr. dnevnu) dozu ili dozu ekvivalentnu 11 do 13 µg, na primer 12 µg humanog rekombinantnog FSH dnevno, humanog rekombinantnog FSH uključujući mono-, di-, tri- i tetrasijalirirane strukture, pri čemu su 15 do 24% sijaliriranih glikanskih struktura tetrasijalirirane strukture. Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH („rFSH“ ili „recFSH“). Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH dobijen iz humane ćelijske linije. Doza pruža delotvoran odgovor uz minimiziranje rizika od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS). Poželjno je da se lečenje neplodnosti sastoji od koraka određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu kod pacijentkinje i davanja doze pacijentkinja koji ima nivo AMH u serumu <15 pmol/l (npr.0,05 pmol/l do 14,9 pmol/l ).

[0017] Gorenavedene doze mogu biti za lečenje neplodnosti u prvom protokolu stimulacije pacijentkinje (ispitanice). Jasno je da u daljim ciklusima stimulacije doze mogu biti prilagođene u skladu sa stvarnim odgovorom jajnika u prvom ciklusu.

[0018] Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je obično potrebno da se dobije oko devet oocita kako bi se omogućio odabir dva visoko kvalitetna oocita za transfer.

[0019] Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je kod ispitanica koje imaju nizak AMH (AMH < 15 pmol/l po litru) potrebna prilično velika doza rekombinantnog FSH (na primer, 12 µg) kako bi se to postiglo. Sa tom dozom, biće dobijeno 8 do 14 oocita od 60% ispitanica sa niskim AMH. To je neočekivano i značajno poboljšanje u odnosu na lečenje ispitanica sa niskim AMH koje se leče sa 150 i.j. Gonal-f, gde je 8 do 14 oocita dobijeno samo od oko 33% ispitanica. Podnosioci predmetne prijave su otkrili da nema potrebe da se ova doza prilagođava prema telesnoj težini pacijentkinje.

[0020] Međutim, 60% populacije (i 80% žena mlađih od 30 godina koje se leče od neplodnosti) ima visok AMH (to jest, AMH ≥15 pmol/l). Za ove ispitanice, obično je relativno jednostavno da se dobije u proseku 9 do 11 oocita. Problem kod protokola stimulacije je rizik od OHSS.

Podnosioci predmetne prijave su otkrili da kod pacijentkinja kojima su davane male doze humanog rekombinantnog FSH postoji odnos između dobijenih oocita i telesne težine ispitanica. To znači da može postojati rizik povezan sa lečenjem fiksnom dozom FSH (koje je uobičajeno u tehnici). Podnosioci predmetne prijave su utvrdili odnos između doze FSH i nivoa AMH i težine ispitanice koji obezbeđuje poboljšan bezbednosni profil (smanjen rizik od OHSS) sa prihvatljivim ili poboljšanim dobijanjem oocita u poređenju sa poznatim protokolima lečenja (vidi primer 10).

[0021] Prema pronalasku, u dodatnom aspektu, obezbeđen je proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) koji sadrži humani folikulostimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinja koje imaju nivo AMH u serumu ≥15 pmol/l, pri čemu proizvod je za davanje (npr. dnevne) doze ili doze ekvivalentne 0,09 do 0,19 µg (na primer 0,09 do 0,17 µg) humanog rekombinantnog FSH po kilogramu telesne težine pacijenta dnevno, humanog rekombinantnog FSH uključujući mono-, di-, tri- i tetrasijalirirane strukture, pri čemu su 15 do 24% sijaliriranih glikanskih struktura tetrasijalirirane strukture. Poželjno je da se lečenje neplodnosti sastoji od koraka određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu kod pacijentkinje i davanja doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu ≥15 pmol/l. U jednom otelotvorenju, proizvod je za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinja koje imaju nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/l, a proizvod je za primenu u (npr. dnevnoj) dozi od, ili dozi koja je ekvivalentna, 0,14 do 0,19 µg humanog rekombinantnog FSH (poželjno 0,15 do 0,16 µg humanog rekombinantnog FSH) po kilogramu telesne težine pacijentkinje. U ovom otelotvorenju, lečenje neplodnosti može da sadrži korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu kod pacijentkinje i davanja doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/l. U drugom otelotvorenju, proizvod je za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinja koje imaju nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/l, a proizvod je za primenu u (npr. dnevnoj) dozi od, ili dozi koja je ekvivalentna, 0,11 do 0,14 µg humanog rekombinantnog FSH (poželjno 0,12 do 0,13 µg humanog rekombinantnog FSH) po kilogramu telesne težine pacijentkinje. U ovom otelotvorenju, lečenje neplodnosti može da sadrži korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu kod pacijentkinje i davanja doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/l. U daljem otelotvorenju, proizvod je za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinja koje imaju nivo AMH u serumu ≥ 35 pmol/l, a proizvod je za primenu u (npr. dnevnoj) dozi od, ili dozi koja je ekvivalentna, 0,10 do 0,11 µg humanog rekombinantnog FSH po kilogramu telesne težine pacijentkinje. U ovom otelotvorenju, lečenje neplodnosti može da sadrži korak određivanja (npr. merenja) nivoa AMH u serumu kod pacijentkinje i davanja doze pacijentkinji koja ima nivo AMH u serumu ≥ 35 pmol/l. Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH („rFSH“ ili „recFSH“). Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH dobijen iz humane ćelijske linije. Doze pružaju delotvoran odgovor uz minimiziranje rizika od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS).

[0022] Humani rekombinantni FSH može biti rekombinantni FSH dobijen iz PER C6 ćelijske linije.

[0023] Proizvod može da se koristi u lečenju neplodnosti pri čemu lečenje neplodnosti uključuje korak određivanja nivoa AMH u serumu pacijentkinje, i korak primene doze kod pacijentkinje koja ima definisani nivo AMH u serumu.

[0024] Gorenavedene doze mogu biti za lečenje neplodnosti u prvom protokolu stimulacije pacijentkinje (ispitanice). Jasno je da u daljim ciklusima stimulacije doze mogu biti prilagođene u skladu sa stvarnim odgovorom jajnika u prvom ciklusu.

[0025] Proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) može da se koristi u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu od 5,0-14,9 pmol/l, pri čemu proizvod sadrži dozu ili dozu koja je ekvivalentna, 6 do 18 µg, npr. 8 do 11 µg, na primer 8,5 do 10,2 µg humanog rekombinantnog FSH. Proizvod može da se koristi u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu od 15,0-29,9 pmol/l, pri čemu proizvod sadrži dozu ili dozu koja je ekvivalentna, 4,8 do 15 µg, npr.6 do 9 µg, na primer 6,8 do 8,5 µg humanog rekombinantnog FSH. Proizvod može da se koristi u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu od 30-44,9 pmol/l, pri čemu proizvod sadrži dozu ili dozu koja je ekvivalentna, 3,6 do 12 µg, npr.4 do 7 µg, na primer 5,1 do 6,8 µg humanog rekombinantnog FSH. Proizvod može da se koristi u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu 45 pmol/l ili veći, pri čemu proizvod sadrži dozu ili dozu koja je ekvivalentna, 2 do 9 µg, npr. 2,4 do 9 µg (na primer 3,4 do 5,1 µg) ili 2 do 5 µg humanog rekombinantnog FSH. Proizvod može da sadrži folikulostimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu od 5 pmol/l ili manji, pri čemu proizvod sadrži dozu ili dozu koja je ekvivalentna, 7,2 do 24 µg, npr. 10 do 15 µg, na primer 10,2 do 13,6 µg humanog rekombinantnog FSH. Proizvod može da se koristi u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje pri čemu proizvod sadrži dozu ili dozu koja je ekvivalentna, 4,8 do 18 µg, npr. 6 do 11 µg, na primer 6,8 do 10,2 µg humanog rekombinantnog FSH. Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH („rFSH“ ili „recFSH“). Poželjno je da FSH bude rekombinantni FSH dobijen iz humane ćelijske linije.

[0026] Poželjno je da rFSH (npr. rekombinantni FSH dobijen iz humane ćelijske linije) uključuje α2,3- i α2,6- sijalilaciju. U FSH (rFSH) za upotrebu prema pronalasku, 1% do 99% ukupne sijalilacije može biti α2,3-sijalilacija. U FSH (rFSH) prema pronalasku, 1% do 99% ukupne sijalilacije može biti α2,6-sijalilacija. Poželjno, 50 do 70%, na primer, 60 do 69%, na primer, oko 65%, ukupne sijalilacije je α2,3-sijalilacija. Poželjno, 25 do 50%, na primer, 30 do 50%, na primer, 31 do 38%, na primer oko 35%, ukupne sijalilacije je α2,6-sijalilacija.

[0027] Poželjno, rFSH (npr. rekombinantni FSH dobijen od humane ćelijske linije) uključuje mono-, di-, tri- i tetra-sijalirirane glikanske strukture, pri čemu 15-24%, na primer 17-23% sijaliriranih glikanskih struktura su tetrasijalirirane glikanske strukture ( na primer, kao što je prikazano analizom razmene slabih anjona (WAX analiza) naelektrisanih glikana, kao što je navedeno u Primerima ispod). FSH sadrži glikane (vezane za glikoproteine FSH ). Dobro je poznato da glikani u FSH mogu da sadrže širok spektar struktura. Oni mogu uključivati kombinacije mono, bi, tri i tetraantenarnih glikana. Ovde, terminologija kao što je „X% sijaliriranih glikanskih struktura su tetrasijalirirane glikanske strukture“ odnosi se na broj glikanskih struktura na FSH koje su tetra sijalirirane, to jest, nose četiri ostatka sijalinske kiseline, izražene kao procenat (X%) od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje su sijalirirane na bilo koji način (nose sijalinsku kiselinu). Dakle, izraz „15 - 24% sijaliriranih glikanskih struktura su tetrasijalirirane glikanske strukture“ znači da, od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje nose ostatke sijalinske kiseline (to jest, sijalirirane su), 15 do 24% ovih glikanskih struktura je tetra sijalirirana (nosi četiri ostatka sijalinske kiseline).

[0028] rFSH može biti prisutan kao jedan izooblik, ili kao smeša izooblika.

[0029] Podnosioci predmetne prijave su osmislili „individualizovane“ protokole COS u kojima se specifične doze rekombinantnog FSH sa specifičnim karakteristikama koriste za lečenje pacijentkinja na osnovu njihovih specifičnih nivoa AMH, čime se povećava verovatnoća adekvatnog odgovora na stimulaciju (npr. kod pacijentkinja sa malim potencijalom za odgovor) i/ili smanjuje rizik od OHSS (npr. kod pacijentkinja za koje je ocenjeno da imaju veliki ili prekomeran odgovor).

[0030] Nivo AMH u serumu može da se utvrdi (npr. izmeri) bilo kojim postupkom koji je poznat u tehnici. Poželjno je da se nivo AMH u serumu izmeri koristeći AMH Gen-ll test sa imunosorbentom vezanim za enzim, koji je komplet (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može da otkrije koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/l sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/l. Mogu da se koriste i drugi testovi.

[0031] U ovom tekstu, vrednosti AMH u serumu se obično navode kao pmol/l. To može da se konvertuje u ng/ml koristeći jednačinu za konverziju 1 ng/ml AMH = 7,1 pmol/l AMH.

[0032] U ovom tekstu, termini „pacijentkinja“ i „ispitanica“ se koriste naizmenično.

[0033] Proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) poželjno sadrži dnevnu dozu ili dnevnu dozu koja je ekvivalentna količinama humanog rFSH koje su definisane gore, ovde i u patentnim zahtevima. (Dnevna) doza može biti početna doza (tj. može se smanjiti, povećati ili održavati tokom lečenja).

[0034] Proizvod (to jest, farmaceutska kompozicija) može biti za (dnevnu) primenu FSH počevši od prvog dana lečenja, i nastavlja se tokom sedam do trinaest dana, na primer, devet do trinaest dana, na primer, 10 do 13 dana, na primer, 10 do 11 dana. Proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) može biti za primenu 12 do 16, npr.13 do 15, npr.14 dana nakon primene (npr. nakon početka primene, npr. nakon početka dnevne primene) agonista GnRH (npr. Synarel, Lupron, Decapeptyl). Proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) može biti za primenu sa agonistom GnRH. Proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) može biti za primenu pre primene antagonista GnRH (npr. ganireliks, cetroreliks), na primer za primenu pet ili šest dana pre primene antagonista GnRH. Proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) može biti za primenu sa antagonistom GnRH. Poželjno je da je proizvod (npr. farmaceutska kompozicija) za primenu pre primene velike (ovulatorne) doze hCG (na primer, 4000 do 11.000 i.j. hCG, npr. 5000 i.j. hCG, 10.000 i.j. hCG, itd., ili 150 do 350 mikrograma rekombinantnog hCG, na primer, 250 mikrograma rekombinantnog hCG) za indukciju finalnog folikularnog sazrevanja.

[0035] Jasno je da proizvod može biti za doziranje sa učestalošću većom (ili manjom) od dnevne, u kom slučaju će relevantne doze biti ekvivalentne (dnevnim) dozama navedenim ovde.

[0036] U ovom tekstu, termin „lečenje neplodnosti“ obuhvata lečenje neplodnosti kontrolisanom stimulacijom jajnika (COS) ili postupcima koji uključuju korak ili fazu kontrolisane stimulacije jajnika (COS), na primer, intrauterinom inseminacijom (IUI), in vitro oplodnjom (IVF) ili intracitoplazmatičnom injekcijom sperme (ICSI). Termin „lečenje neplodnosti“ obuhvata lečenje neplodnosti indukcijom ovulacije (OI) ili postupcima koji uključuju korak ili fazu indukcije ovulacije (OI). Termin „lečenje neplodnosti“ obuhvata lečenje neplodnosti kod ispitanice sa tubarnom ili neobjašnjenom neplodnošću, uključujući lečenje neplodnosti kod ispitanice sa endometriozom, na primer, endometriozom I ili II stadijuma, i/ili kod ispitanice sa anovulatornom neplodnošću, na primer, anovulatornom neplodnošću SZO tipa II i/ili kod ispitanice čiji partner ima muški faktor neplodnosti. Proizvod (ili kompozicija) mogu biti za (upotrebu za) lečenje neplodnosti (i/ili kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanice sa endometriozom, na primer, kod ispitanice koja ima endometriozu stadijuma I ili II, definisanu prema sistemu klasifikacije Američkog društva za reproduktivnu medicinu (The American Society for Reproductive Medicine, ASRM) za različite stadijume endometrioze (stadijum IV najteža, stadijum I najmanje teška) [Američko društvo za reproduktivnu medicinu. Revidirana klasifikacija endometrioze od strane Američkog društva za reproduktivnu medicinu: 1996. Fertil Steril 1997; 67,817821.].

[0037] Proizvod (kompozicija) može biti za (upotrebu za) lečenje neplodnosti (i/ili kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanice koja ima normalan nivo FSH u serumu od 1 do 16 i.j./l, na primer, 1 do 12 i.j./l, u ranoj folikularnoj fazi.

[0038] Proizvod (kompozicija) može biti za (upotrebu za) lečenje neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanice stare 18 do 42 godine, na primer, 25 do 37 godina. Proizvod može biti za (upotrebu za) lečenje neplodnosti (i/ili za kontrolisanu stimulaciju jajnika) kod ispitanice koja ima BMI >1 i BMI < 35 kg/m<2>, na primer, ispitanice sa BMI >18 i BMI < 25 kg/m<2>, na primer, ispitanice sa BMI >20 i BMI < 25 kg/m<2>.

[0039] rFSH može poželjno da uključuje 27 - 33%, na primer 30 - 32%, tri-sijalirirane glikanske strukture. rFSH može poželjno da uključuje 24 - 33%, na primer 26 - 30%, disijalirirane glikanske strukture. rFSH može poželjno da uključuje 12 - 21%, na primer 15 -17%, mono-sijalirirane glikanske strukture. rFSH je poželjno da uključuje mono-sijalirirane, di-sijalirirane, tri-sijalirirane i tetra-sijalirirane glikanske strukture sa relativnim količinama kao što sledi: 15 - 17% mono-sijalirirane; 26 - 30% di-sijalirirane; 27 - 33% (npr.29 do 32%, npr. 30-32%, npr. 30 do 31%) tri-sijalirirane i 17 - 23 % tetra-sijalirirane (npr. kao što je prikazano analizom razmene slabih anjona (WAX analiza) naelektrisanih glikana, kao što je navedeno u Primerima). rFSH može da uključuje od 0 do 7%, na primer 0,1 do 7%, na primer 3 do 6%, na primer 5 do 6%, neutralnih sijaliriranih struktura. FSH sadrži glikane (vezane za glikoproteine FSH ). Ovde, terminologija kao što je „X% monosijaliriran“, „X% disijaliriran“, „X% trisijaliriran“ ili „X% tetrasijaliriran“ odnosi se na broj glikanskih struktura na FSH koje su mono-, di, tri ili tetra sijalirirane (tim redosledom), izražene kao procenat (X%) od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje su sijalirirane na bilo koji način (nose sijalinsku kiselinu). Dakle, izraz „27 - 33% trisijaliriranih glikanskih struktura“ znači da, od ukupnog broja glikanskih struktura na FSH koje nose ostatke sijalinske kiseline (to jest, sijalirirane su), 27 do 33% ovih glikanskih struktura je tri sijalirirana (nosi tri ostatka sijalinske kiseline).

[0040] rFSH može imati sadržaj sijalinske kiseline [izražen u vidu odnosa molova sijalinske kiseline prema molovima proteina] od 6 mol/mol ili više, na primer između 6 mol/mol i 15 mol/mol, npr. između 8 mol/mol i 14 mol/mol, na primer između 10 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 11 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 12 mol/mol i 14 mol/mol, npr. između 12 mol/mol i 13 mol/mol. rFSH može da se proizvede ili eksprimira u humanoj ćelijskoj liniji.

[0041] U FSH (rFSH) za upotrebu prema pronalasku, 1% do 99% ukupne sijalilacije može biti α2,3-sijalilacija. U rFSH, 10% ili više ukupne sijalilacije može biti α2,3-sijalilacija. Na primer, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90% ili više od ukupne sijalilacije može biti α2,3-sijalilacija. rFSH može poželjno da uključuje α2,3-sijalilaciju u količini koja iznosi od 50 do 70% ukupne sijalilacije, na primer od 60 do 69% ukupne sijalilacije, na primer od 63 do 67%, na primer oko 65% ukupne sijalilacije. U FSH (rFSH) za upotrebu prema pronalasku, 1% do 99% ukupne sijalilacije može biti α2,6-sijalilacija. U FSH (ili rFSH preparatu) pronalaska, 5% ili više, na primer, 5% do 99% ukupne sijalilacije može biti α2,6-sijalilacija. U rFSH, 50% ili manje ukupne sijalilacije može biti α2,6-sijalilacija. rFSH može poželjno da uključuje α2,6-sijalilaciju u količini koja iznosi od 25 do 50% ukupne sijalilacije, na primer od 30 do 50% ukupne sijalilacije, na primer od 31 do 38%, na primer oko 35% ukupne sijalilacije. Pod sijalilacijom se podrazumeva količina sijalinskih ostataka koji su prisutni na FSH ugljovodoničnim strukturama. α2,3-sijalilacija označava sijalilaciju na poziciji 2,3 (kao što je dobro poznato u tehnici), a α2,6 sijalilacija na poziciji 2,6 (takođe dobro poznato u tehnici). Tako, „% ukupne sijalilacije može biti α 2,3 sijalilacija“ odnosi se na % ukupnog broja ostataka sijalinske kiseline prisutnih u FSH koji su sijalilirani na poziciji 2,3. Termin „% ukupne sijalilacije koja je α2,6sijalilacija“ odnosi se na % ukupnog broja ostataka sijalinske kiseline prisutnih u FSH koji su sijalilirani na poziciji 2,6.

[0042] rFSH može da ima sadržaj sijalinske kiseline (količina sijalilacije po molekulu FSH) od (na osnovu mase proteina, a ne mase proteina plus ugljeni hidrati) od 6% ili više (npr. između 6% i 15%, npr. 7% i 13%, npr. između 8% i 12%, na primer između 11% i 15%, na primer između 12% i 14%) po masi.

[0043] rFSH može biti rFSH ili rFSH preparat u kome 16% ili manje (npr.0,1 do 16%) glikana sadrži (npr. nosi) bisekcioni N-acetilglukozamin (bisekcioni GlcNAc ili bisGlcNAc). Poželjno, rFSH (ili rFSH preparat) je rFSH ili rFSH preparat u kome 8 do 14,5% glikana sadrži (npr. nosi) bisekcioni N-acetilglukozamin (bisekcioni GicNAc ili bisGicNAc).

[0044] Podrazumeva se da FSH sadrži glikane vezane za glikoproteine FSH. Takođe se podrazumeva da se 100% glikana odnosi ili označava sve glikane vezane za glikoproteine FSH. Dakle, u ovom tekstu, terminologija „8 do 14,5% glikana sadrži (nosi) bisekcioni N-acetilglukozamin“ znači da 8 do 14,5% ukupnog broja glikana vezanih za glikoproteine FSH uključuje/nosi bisekcioni N-acetilglukozamin; „16% ili manje glikana sadrži (nosi) bisekcioni N-acetilglukozamin“ znači da 16% ili manje od ukupnog broja glikana vezanih za glikoproteine FSH uključuje/nosi bisekcioni N-acetilglukozamin, i tako dalje.

[0045] Podnosioci predmetne prijave su otkrili da rekombinantni FSH (rFSH preparati; rFSH kompozicije) u kojima 16% ili manje (npr. 8 do 14,5%) glikana sadržanih u glikoproteinima FSH nose bisekcioni GlcNac može imati povoljna farmakokinetička svojstva. Smatra se da se povoljna svojstva mogu javiti zato što je količina glikana koji nose bisekcioni GlcNac slična onoj u proizvodu Bravelle dobijenom iz humanog urina, što je prilično manje nego kod drugih rekombinantnih preparata FSH kao što su oni opisani u WO2012/017058.

[0046] rFSH (ili preparat rFSH ) može biti rFSH ili preparat rFSH u kojem 20% ili više glikana sadrži (npr. nosi) N-acetilgalaktozamin (GaINAc), na primer u kojem 20% ili više glikana sadrži (npr. ) terminalni GaINAc. Poželjno je da je rFSH (ili preparat rFSH ) FSH ili preparat FSH u kojem 40 do 55%, na primer 42% do 52%, glikana sadrži (npr. nose) GaINAc. Poželjno je da je rFSH (ili preparat rFSH ) FSH ili preparat FSH u kojem 40 do 55%, na primer 42% do 52%, glikana sadrži (npr. nose) GaINAc.

[0047] Podrazumeva se da FSH sadrži glikane vezane za glikoproteine FSH. Takođe se podrazumeva da se 100% glikana odnosi ili označava sve glikane vezane za glikoproteine FSH. Dakle, u ovom tekstu, terminologija „pri čemu 20% ili više glikana sadrži (nosi) GaINAc“ znači da 20% ili više ukupnog broja glikana vezanih za glikoproteine FSH uključuje/nosi N-acetilgalaktozamin (GaINAc); „40 do 55%, na primer, 42% do 52% glikana sadrži (nosi) terminalni GaINAc“ znači da 40 do 55%, na primer 42% do 52% od ukupnog broja glikana vezanih za glikoproteine FSH uključuje/nosi terminalni GaINAc, i tako dalje.

[0048] Čini se da dostupnost α2,6- veze povećava broj tetrasijaliriranih struktura, u poređenju sa proizvodima dobijenim iz ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) koji imaju na raspolaganju samo α2,3- vezu. Podnosioci prijave su takođe otkrili da se njihov rFSH razlikuje od drugih odobrenih proizvoda zbog sastava šećera: uključuje, ili može da uključuje, određenu količinu GalNac. Ovo može biti povezano sa tetrasijalilacijom i potencijom jer je 2,6-sijalilacija povezana sa GalNac. Drugim rečima, podnosioci predmetne prijave su razvili proizvod rFSH koji uključuje specifične karakteristike (2,6-lokacija linkera, GalNac) koje obezbeđuju rFSH-u visok stepen sijalilacije što izgleda da dovodi do poboljšane potencije in vivo.

[0049] rFSH (ili preparat rFSH ) može da ima 16 do 24% glikana koji sadrže (npr. terminalnu) Luisovu 1 fukozu, na primer 16,5 do 18% glikana koji sadrže (npr. terminalni) 1 fukoza-luis. rFSH (ili preparat rFSH ) može da ima 1,5 do 4,5%, na primer 2 do 4%, na primer 3,7% glikana koji sadrže (npr. terminalne) 2 Luisove fukoze. Sadržaj Luisove fukoze može da utiče na potenciju.

[0050] rFSH može biti proizveden ili eksprimiran u humanoj ćelijskoj liniji, na primer, ćelijskoj liniji Per.C6, ćelijskoj liniji HEK293, ćelijskoj liniji HT1080, itd. To može da pojednostavi (i učini delotvornijim) postupak proizvodnje, pošto obrada i kontrola, npr. medijuma za ćelijski rast radi održavanja sijalilacije mogu biti manje ključni nego kod poznatih procesa. Postupak takođe može biti delotvorniji pošto se proizvodi malo baznog rFSH u poređenju sa proizvodnjom poznatih proizvoda rFSH; proizvodi se više kiselog rFSH, i odvajanje/uklanjanje baznog FSH je manje problematično. rFSH može biti proizveden ili eksprimiran u ćelijskoj liniji PER.C6<®>, ćelijskoj liniji dobijenoj od PER.C6<®>ili modifikovanoj ćelijskoj liniji PER.C6<®>. rFSH koji je proizveden ili eksprimiran u humanoj ćelijskoj liniji (npr. ćelijskoj liniji PER.C6<®>, ćelijskoj liniji HEK293, ćelijskoj liniji HT1080, itd.) uključivaće neke α2,6-vezane sijalinske kiseline (α2,6 sijalilacija) dobijene putem aktivnosti endogene sijalil transferaze [ćelijske linije] i uključivaće neke α2,3-vezane sijalinske kiseline (α2,3 sijalilacija) obezbeđene putem aktivnosti endogene sijalil transferaze. Ćelijska linija može da se modifikuje koristeći α2,3-sijalil transferazu. Ćelijska linija može da se modifikuje koristeći α2,6-sijalil transferazu. Alternativno ili dodatno, rFSH može da uključuje α2,6-vezane sijalinske kiseline (α2,6 sijalilacija) obezbeđene putem aktivnosti endogene sijalil transferaze [ćelijske linije]. U ovom tekstu, termin „humano dobijeni rekombinantni FSH“ znači rekombinantni FSH koji je proizveden ili eksprimiran u humanoj ćelijskoj liniji (npr. rekombinantni FSH napravljen konstruisanjem humane ćelijske linije).

[0051] rFSH može da se proizvede koristeći α2,3- i/ili α2,6-sijalil transferazu. U jednom primeru, rFSH je proizveden koristeći α2,3- sijalil transferazu. rFSH može da uključuje α2,6-vezane sijalinske kiseline (α2,6 sijalilacija) obezbeđene putem aktivnosti endogene sijalil transferaze.

[0052] Proizvod može da bude farmaceutska kompozicija. Farmaceutska kompozicija je namenjena lečenju neplodnosti. Lečenje neplodnosti može da obuhvata tehnologije medicinski asistirane reprodukcije (MAR), indukciju ovulacije i intrauterinu inseminaciju (IUI). Farmaceutske kompozicije mogu da se koriste, na primer, u medicinskim indikacijama kada se koriste poznati FSH preparati.

[0053] Proizvod ili kompozicija mogu biti formulisani u dobro poznate kompozicije za bilo koji način primene leka, npr. oralno, rektalno, parenteralno, transdermalno (npr. tehnologija flastera), intravenski, intramuskularno, supkutano, intrasusternalno, intravaginalno, intraperitonealno, lokalno (praškovi, melemi ili kapi) ili kao bukalni ili nazalni sprej. Uobičajena kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je vodeni rastvor, netoksične ekscipijense, uključujući soli i konzervanse, pufere i slično, kao što je, između ostalog, opisano u Remington's Pharmaceutical Sciences, petnaesto izdanje (Matt Publishing Company, 1975), na stranama 1405 do 1412 i 1461- 87, i u National formulary XIV, četrnaesto izdanje (American Pharmaceutical Association, 1975), između ostalog.

[0054] Primeri za odgovarajuće vodene i nevodene farmaceutske nosače, razblaživače, rastvarače ili vehikulume uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), karboksimetilcelulozu i njene odgovarajuće smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje) i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Kompozicije iz predmetnog pronalaska takođe mogu da sadrže aditive kao što su, bez ograničenja, konzervansi, kvašljivci, emulgatori, surfaktanti i agensi za disperziju. Antibakterijski i antifungalni agensi mogu biti uključeni radi sprečavanja rasta mikroba i uključuju, na primer, m-krezol, benzil alkohol, paraben, hlorbutanol, fenol, sorbinsku kiselinu, i slično. Ako je uključen konzervans, poželjni su benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol. Međutim, konzervans ni u kom slučaju nije ograničen na ove primere. Nadalje, može biti poželjno da se uključe izotonični agensi kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično. Proizvod ili kompozicija mogu dalje da sadrže so koja sadrži katjon farmaceutski prihvatljivog alkalnog metala, izabranu iz grupe koja se sastoji od Na<+>- ili K<+>-soli, ili njihove kombinacije. So je poželjno so Na+, na primer, NaCl ili Na2SO4.

[0055] Proizvod ili kompozicija poželjno sadrže rekombinantni FSH i jedno ili više od Polisorbata 20, L-metionina, fenola, dinatrijum sulfata i natrijum fosfatnog pufera.

[0056] U nekim slučajevima, kako bi se dobilo produženo dejstvo, poželjno je usporiti apsorpciju FSH (i drugih aktivnih sastojaka, ako su prisutni) iz supkutane ili intramuskularne injekcije. To može da se postigne korišćenjem tečne suspenzije kristalne ili amorfne supstance sa lošom rastvorljivošću u vodi. Brzina apsorpcije FSH onda zavisi od njegove brzine rastvaranja, koja zauzvrat može da zavisi od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog kombinovanog oblika FSH se postiže rastvaranjem ili suspendovanjem kombinacije FSH u uljanom vehikulumu. Injektabilni depo oblici mogu da se naprave formiranjem mikroenkapsuliranih matrica FSH (i drugih agensa, ako su prisutni) u biorazgradivim polimerima, kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa FSH i polimera i od prirode konkretnog polimera koji se koristi, može da se kontroliše brzina otpuštanja FSH. Primeri za druge biorazgradive polimere uključuju polivinilpirolidon, poli(ortoestre), poli(anhidride), itd. Depo injektabilne formulacije se takođe pripremaju ubacivanjem FSH u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa tkivima tela.

[0057] Injektabilne formulacije mogu biti sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, ili inkorporacijom sterilišućih agensa u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje mogu da se rastvore ili disperguju u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu neposredno pre upotrebe. Injektabilne formulacije mogu da se dostave u bilo kojoj odgovarajućoj ambalaži, npr. bočici, prethodno napunjenom špricu, ulošku za injekciju, i slično.

[0058] Proizvod ili kompozicija mogu biti formulisani za jednokratnu upotrebu ili za višekratnu upotrebu (više doza). Ako su proizvod ili kompozicija formulisani za višekratnu upotrebu, poželjno je da bude uključen konzervans. Ako je uključen konzervans, poželjni su benzil alkohol, fenol i/ili m-krezol. Međutim, konzervans ni u kom slučaju nije ograničen na ove primere. Proizvod ili kompozicija formulisani za jednokratnu upotrebu ili višekratnu upotrebu mogu dalje da sadrže so koja sadrži katjon farmaceutski prihvatljivog alkalnog metala, izabranu iz grupe koja se sastoji od Na<+>- ili K<+>-soli, ili njihove kombinacije. So je poželjno so Na+, na primer, NaCl ili Na2SO4.

[0059] Proizvod ili kompozicija mogu biti dati u ambalaži kao što je bočica, prethodno napunjeni uložak (npr. za jednokratnu primenu ili za višekratnu upotrebu) ili sredstvo za ubrizgavanje kao što je „pen“, npr. za primenu višekratnih doza.

[0060] Proizvod ili kompozicija mogu biti formulacija (npr. injektabilna formulacija) koja sadrži FSH (opciono sa hCG, LH, aktivnošću LH, itd.). Aktivnost LH, ako je prisutna, može nastati od LH ili humanog horionskog gonadotropina, hCG. Ako je prisutno više od jednog aktivnog sastojka (tj. FSH i, npr. hCG ili LH) oni mogu biti pogodni za primenu odvojeno ili zajedno. Ako se primenjuju odvojeno, primena može biti sekvencijalna. Proizvod može da se isporuči u bilo kom odgovarajućem pakovanju. Na primer, proizvod može da uključi više ambalaža (npr. prethodno napunjeni špricevi ili bočice) koje sadrže FSH ili hCG, ili kombinaciju (ili kombinaciju) i FSH i hCG. hCG može biti rekombinantni hCG ili urinarni hCG. Ako proizvod uključuje više ambalaža (npr. prethodno napunjeni špricevi ili bočice) koje sadrže FSH, npr. rekombinantni FSH, svaka ambalaža može da sadrži istu količinu FSH. Jedna ili više ambalaža može da sadrži različite količine FSH. Špricevi ili bočice mogu biti zapakovani u blister pakovanje ili druga sredstva za očuvanje sterilnosti. Svaki proizvod može opciono da sadrži uputstvo za upotrebu formulacije FSH (i, npr. hCG ako je prisutan). pH i tačna koncentracija različitih komponenti farmaceutske kompozicije su prilagođeni u skladu sa rutinskom praksom u ovoj oblasti. Vidite GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th ed. U poželjnom otelotvorenju, kompozicije iz pronalaska se isporučuju kao kompozicije za parenteralnu primenu. Opšti postupci za pripremu parenteralnih formulacija su poznati u tehnici i opisani su u REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, gore, na stranama 780-820. Parenteralne kompozicije mogu biti isporučene u tečnoj formulaciji ili kao čvrsta supstanca koja će se pomešati sa sterilnim injektabilnim medijumom neposredno pre primene. U naročito poželjnom otelotvorenju, parenteralne kompozicije su isporučene u jediničnom doznom obliku radi lakoće primene i uniformnosti doze.

Detaljan opis pronalaska

[0061] Predmetni pronalazak će sada biti detaljnije opisan u vezi sa priloženim crtežima na kojima:

Slika 1 prikazuje plazmidnu mapu ekspresionog vektora pFSHalfa/beta;

Slika 2 prikazuje ekspresioni vektor α2,3-sijaliltransferaze (ST3GAL4);

Slika 3 prikazuje ekspresioni vektor α2,6-sijaliltransferaze (ST6GAL1);

Slika 4 prikazuje % zastupljenosti distribucije sijalinske kiseline u primerima rekombinantnog FSH proizvedenog od strane ćelija PER.C6<®>koje stabilno eksprimiraju FSH nakon konstruisanja sa α2,3-sijaliltransferazom.

Slika 5 prikazuje % zastupljenosti distribucije naelektrisanja glikana u primerima rekombinantnog FSH proizvedenog od strane ćelija PER.C6<®>koje stabilno eksprimiraju FSH nakon konstruisanja sa α2,3-sijaliltransferazom.

Slika 6 prikazuje poređenje koncentracije inhibina-B nakon primene 225 i.j. Gonal f (donja linija, tačkasta linija) i 225 i.j. Primera (gornja linija, puna linija) pronalaska;

Slika 7 prikazuje dejstvo telesne težine na oocite dobijene u terapijskoj grupi sa niskim AMH (Primer 10, 10A); i

Slika 8 prikazuje dejstvo Telesne težine na oocite dobijene u terapijskoj grupi sa visokim AMH

Izbor sekvenci

Humani FSH

[0062] Kodirajući region gena za alfa polipeptid FSH je korišćen prema Fidesu i Gudmanu. (1981). Sekvenca je sačuvana kao AH007338 i u vreme izgradnje nije bilo drugih varijanti ove sekvence proteina. Sekvenca je ovde nazvana SEQ ID NO:1.

[0063] Kodirajući region gena za beta polipeptid FSH je korišćen prema Kinu i saradnicima (1989). Sekvenca je sačuvana kao NM_000510 i u vreme izgradnje nije bilo drugih varijanti ove sekvence proteina. Sekvenca je ovde nazvana SEQ ID NO: 2

Sijaliltransferaza

[0064] α2,3-sijaliltransferaza – Kodirajući region gena za beta-galaktozamid alfa-2,3-sijaliltransferazu 4 (α2,3-sijaliltransferaza, ST3GAL4) je korišćen prema Kitagavi i Polsonu (1994). Sekvenca je ovde sačuvana kao L23767 i nazvana u ovom tekstu SEQ ID NO: 3.

[0065] α2,6-sijaliltransferaza – Kodirajući region gena za beta-galaktozamid alfa-2,6-sijaliltransferazu 1 (α2,6-sijaliltransferaza, ST6GAL1) je korišćen prema delu čiji su autori Grundmann et al. (1990). Sekvenca je ovde označena kao NM_003032 i nazvana u ovom tekstu SEQ ID NO: 4.

PRIMERI

Primer 1 Konstrukcija ekspresionog vektora FSH

[0066] Kodirajuća sekvenca alfa polipeptida FSH (AH007338, SEQ ID NO: 1) i beta polipeptid FSH (NM_003032, SEQ ID NO: 2) su amplifikovani pomoću PCR-a korišćenjem kombinacija prajmera FSHa-fw i FSHa-rev i FSHb-fw i FSHb-rec tim redosledom.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' (SEQ ID NO:9)

FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (SEQ ID NO:10)

FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (SEQ ID NO: 11)

FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 12)

[0067] Dobijena amplifikovana DNK sa FSH beta je digestirana sa restrikcijskim enzimima AscI i HpaI i umetnuta u AscI i HpaI lokacije na ekspresionom vektoru sisara koji pokreće CMV koji nosi marker za selekciju neomicina. Slično, DNK sa FSH alfa je digestirana sa BamHI i NheI i umetnuta u mesta BamHI i NheI na ekspresionom vektoru koji već sadrži DNK beta polipeptida FSH.

[0068] DNK vektora je korišćena za transformaciju soja DH5α E.coli. Kolonije su odabrane za amplifikaciju. Kolonije koje sadrže vektor koji sadrži i FSH alfa i beta su odabrane za sekvenciranje i sve su sadržale ispravne sekvence prema SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Plasmid pFSH A+B#17 je odabran za transfekciju (Slika 1).

Primer 2 Konstrukcija ekspresionog vektora ST3

[0069] Kodirajuća sekvenca alfa-2,3-sijaliltransferaze 4 beta-galaktozamida (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) je amplifikovana lančanom reakcijom polimeraze (PCR) korišćenjem kombinacije prajmera 2,3STfw i 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 13)

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 14)

[0070] Dobijena amplifikovana DNK sa ST3 je digestirana sa restrikcijskim enzimima BamHI i AflII i umetnuta u BamHI i AflII mesta na ekspresionom vektoru sisara koji pokreće CMV koji nosi marker otpornosti na higromicin. Vektor je amplifikovan kao što je prethodno opisano i sekvencioniran. Klon pST3#1 (Slika 2) je sadržao ispravnu sekvencu prema SEQ ID NO: 3 i izabran je za transfekciju.

Primer 3 Konstrukcija ekspresionog vektora ST6

[0071] Kodirajuća sekvenca alfa-2,6-sijaliltransferaze 1 beta-galaktozamida (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) je amplifikovana lančanom reakcijom polimeraze (PCR) korišćenjem kombinacije prajmera 2,6STfw i 2,6STrev.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' (SEQ ID NO: 15)

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' (SEQ ID NO: 16)

[0072] Dobijena amplifikovana DNK sa ST6 je digestirana sa restrikcijskim enzimima BamHI i AflII i umetnuta u BamHI i AflII mesta na ekspresionom vektoru sisara koji pokreće CMV koji nosi marker otpornosti na higromicin. Vektor je amplifikovan kao što je prethodno opisano i sekvencioniran. Klon pST6#11 (Slika 3) je sadržao ispravnu sekvencu prema SEQ ID NO: 4 i izabran je za transfekciju.

Primer 4 Stabilna ekspresija pFSH α+β u ćelijama PER.C6<®>. Izolacija transfekcije i skrining klonova.

[0073] Klonovi PERC6<®>koji proizvode FSH su generisani eksprimiranjem oba polipeptidna lanca FSH iz jednog plazmida (videti Primer 1).

[0074] Da bi se dobili stabilni klonovi, agens za transfekciju na bazi lipozoma sa pFSH α+β konstruktom. Stabilni klonovi su odabrani u VPRO sa dodatkom 10% FCS i koji sadrže G418. Tri nedelje nakon transfekcije izrasli su klonovi otporni na G418. Klonovi su odabrani za izolovanje. Izolovani klonovi su kultivisani u medijumu za selekciju do 70-80% konfluenta. Supernatanti su ispitani na sadržaj proteina FSH korišćenjem ELISA testa selektivneog na FSH i farmakološke aktivnosti na receptoru FSH u kloniranoj ćelijskoj liniji, korišćenjem testa akumulacije cAMP. Klonovi koji eksprimiraju funkcionalni protein su napredovali za ekspanziju kulture do 24 bunarčića, 6 bunarčića i tikvica T80.

[0075] Studije za određivanje produktivnosti i kvaliteta materijala od sedam klonova su započete u bocama T80 da bi se dobilo dovoljno materijala. Ćelije su kultivisane u medijumu sa dodatkom kao što je prethodno opisano tokom 7 dana i supernatant je sakupljen. Produktivnost je određena korišćenjem ELISA testa selektivnog na FSH. Izoelektrični profil materijala određen je izoelektričnim fokusiranjem (IEF), metodama poznatim u struci. Klonovi sa dovoljnom produktivnošću i kvalitetom odabrani su za konstruisanje sijaliltransferaze.

Primer 5 Nivo sijalilacije je povećan u ćelijama koje prekomerno eksprimiraju α2,3-sijaliltransferazu. Stabilna ekspresija pST3 u ćelijama FSH koje eksprimiraju PER.C6@; Izolacija transfekcije i skrining klonova.

[0076] Klonovi PER.C6<®>koji proizvode visoko sijaliliran FSH su generisani eksprimiranjem α2,3 sijaliltransferaze iz odvojenih plazmida (Primer 2) u ćelijama PER.C6<®>koje već eksprimiraju oba polipeptidna lanca FSH (iz Primera 4). Klonovi proizvedeni od ćelija PER.C6<®>kao što je navedeno u Primeru 4 odabrani su zbog njihovih karakteristika uključujući produktivnost, dobar profil rasta, proizvodnju funkcionalnog proteina i proizvedeni FSH koji je uključivao izvesnu sijalilaciju. Stabilni klonovi su generisani kao što je prethodno opisano u Primeru 4. Klonovi su izolovani, prošireni i analizirani. Klonovi α2,3-sijaliltransferaze su prilagođeni medijumu bez seruma i uslovima suspenzije.

[0077] Kao i ranije, klonovi su analizirani korišćenjem ELISA testa selektivnog na FSH, funkcionalnog odgovora u ćelijskoj liniji receptora FSH, IEF-a, metaboličkog klirensa i Steelman Pohley analize. Rezultati su upoređeni sa komercijalno dostupnim rekombinantnim FSH (Gonal-f, Serono) i roditeljskim FSH u ćelijskim linijama PER.C6<®>. FSH koji je proizvela većina klonova značajno je poboljšao sijalilaciju (tj. u proseku više izoformi FSH sa velikim brojem sijalinskih kiselina) u poređenju sa FSH eksprimiranim bez α2,3-sijaliltransferaze. U zaključku, ekspresija FSH zajedno sa sijaliltransferazom u ćelijama PERC6<®>je rezultirala povećanim nivoima sijaliriranog FSH u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju samo FSH.

Primer 6 Pregled proizvodnje i prečišćavanja

[0078] Razvijen je postupak za proizvodnju FSH u ćelijama PER.C6<®>koje su kultivisane u suspenziji u medijumu bez seruma. Postupak je opisan u nastavku i primenjen je na nekoliko ćelijskih linija PER.C6<®>koje proizvode FSH.

[0079] FSH iz α2,3-klona (Primer 5) je pripremljen korišćenjem modifikacije metode koju su opisali Louri i saradnici. (1976).

[0080] Za proizvodnju FSH kod PER.C6<®>, ćelijske linije su prilagođene na medijum bez seruma, tj. Excell 525 (JRH Biosciences). Ćelije su prvo kultivisane da bi se formirao 70%-90% konfluentni monosloj u boci za kulturu T80. Nakon prolaska ćelije su ponovo suspendovane u medijumu bez seruma, Excell 525 4 mM L-glutamin, do gustine ćelija od 0,3×10<6>ćelija/ml. Suspenzija ćelija od 25 ml je stavljena u šejker od 250 ml i promućkana na 100 o/min na 37°C na 5% CO2. Nakon dostizanja gustine ćelija od > I×I0<6>ćelija/ml, ćelije su subkulturisane do gustine ćelija od 0,2 ili 0,3×10<6>ćelija/ml i dalje kultivisane u šejkeru za mućkanje na 37°C, 5% CO2 i 100 o/min.

[0081] Za proizvodnju FSH, ćelije su prebačene u proizvodni medijum bez seruma, tj. VPRO (JRH Biosciences), koji podržava rast PER.C6<®>ćelija do veoma visoke gustine ćelija (obično > 10<7>ćelija/ml u šaržnoj kulturi). Ćelije su prvo kultivisane do > 1×I0<6>ćelija/ml u Excell 525, zatim centrifugirane 5 minuta na 1000 o/min i zatim suspendovane u VPRO medijumu 6 mM L-glutamina do gustine od 1×10<6>ćelija/ml. Ćelije su zatim kultivisane u šejkeru za mućkanje tokom 7-10 dana na 37°C, 5% CO2i 100 o/min. Tokom ovog perioda, ćelije su porasle do gustine > 10<7>ćelija/ml. Medijum za kulturu je sakupljen nakon što je vitalnost ćelija počela da opada. Ćelije su centrifugirane 5 minuta na 1000 o/min, a supernatant je korišćen za kvantifikaciju i prečišćavanje FSH. Koncentracija FSH je određena korišćenjem ELISA testa (DRG EIA 1288).

[0082] Nakon toga, prečišćavanje FSH je izvršeno korišćenjem modifikacije metode koju su opisali Lowry et al. (1976). Prečišćavanje korišćenjem hromatografije koja selektuje na osnovu naelektrisanja izvršeno je da bi se obogatili visoko sijalilirani oblici metodama dobro poznatim u tehnici.

[0083] Tokom svih hromatografskih procedura, RIA (DRG EIA 1288) i/ili IEF potvrdio je obogaćivanje sijaliliranih oblika FSH kako se navodi u zahtevima u ovom tekstu.

Primer 7 Kvantifikacija relativnih količina α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline

[0084] Relativne procentualne količine α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline na prečišćenom rFSH (Primer 6) merene su korišćenjem poznatih tehnika.

[0085] N-glikani su oslobođeni iz uzoraka korišćenjem PNGase F pod denaturativnim uslovima i zatim obeleženi 2-aminobenzamidom. Oslobođeni oblici glikana su zatim razdvojeni i analizirani pomoću kolone za analizu razmene slabih anjona (WAX) za određivanje raspodele naelektrisanja. Obeleženi glikani tretirani 2,3,6,8 sijalidazom za određivanje ukupne sijalinske kiseline i 2,3 sijalidazom za određivanje 2,3 sijalinske kiseline, dalje su analizirani pomoću kolone WAX.

[0086] Relativni procenti naelektrisanih glikana su izračunati iz struktura prisutnih u bazenima nedigestiranih i digestiranih glikana i prikazani su na slici 4 (za 8 uzoraka). Utvrđeno je da su oni u rasponu od 50% - 70% (npr. oko 60% ili 65%) za α2,3 sijalilaciju i 28 do 50%, generalno 30 do 35% (npr. oko 31% ili 35%), za α2,6 sijalilaciju.

Primer 8 Kvantifikacija relativnih količina mono, di, tri i tetrasijaliriranih glikanskih struktura

[0087] Relativne procentualne količine mono, di, tri i tetrasijaliriranih struktura na glikanima ekstrahovane iz prečišćenog rFSH (Primer 6) merene su korišćenjem poznatih tehnika.

[0088] N glikani su oslobođeni iz uzoraka korišćenjem PNGase F pod denaturativnim uslovima, a zatim su obeleženi 2-aminobenzamidom. Glikani su oslobođeni iz uzoraka korišćenjem PNGase F pod denaturativnim uslovima i zatim obeleženi 2-aminobenzamidom. Oslobođeni oblici glikana su zatim razdvojeni i analizirani pomoću kolone za analizu razmene slabih anjona (WAX) za određivanje distribucije sijalilacije. Relativna količina neutralnih, monosijaliriranih, disijaliriranih, trisijaliriranih i tetrasijaliriranih struktura prikazana je na slici 5 (za 8 uzoraka prikazanih na slici 4).

[0089] rFSH uključuje neutralne, monosijalirirane, disijalirirane, trisijalirirane i tetrasijalirirane glikanske strukture sa relativnim količinama kao što sledi: neutralno 5-6%; 15-17% monosijalirirane; 26-30% disijalirirane; 30-32% trisijalirirane i 17-23% tetrasijalirirane.

Primer 8a

[0090] Relativne procentualne količine α2,6 sijalinske kiseline na prečišćenom rFSH ekstrahovanom iz devet uzoraka prečišćenog rFSH (proizvedenog metodama iz Primera 6) merene su korišćenjem poznatih tehnika.

[0091] N-glikani su oslobođeni iz uzoraka korišćenjem PNGase F pod denaturativnim uslovima i zatim obeleženi 2-aminobenzamidom. Oslobođeni oblici glikana su zatim razdvojeni i analizirani pomoću kolone za analizu razmene slabih anjona (WAX) za određivanje raspodele naelektrisanja. Obeleženi glikani tretirani 2,3,6,8 sijalidazom za određivanje ukupne sijalinske kiseline i 2,3 sijalidazom za određivanje 2,3 sijalinske kiseline, dalje su analizirani pomoću kolone WAX (videti Primer 8). Analiza omogućava izračunavanje α2,6 sijalinske kiseline.

[0092] Relativni procenti naelektrisanih glikana su izračunati iz struktura prisutnih u bazenima nedigestiranih i digestiranih glikana i prikazani su u sledećoj Tabeli. Utvrđeno je da su oni u opsegu od 25 do 50%, generalno 30 do 35% za α2,6 sijalilaciju.

[0093] Relativne procentualne količine bisekcionog GIcNac, GalNac i 1-Fucose Lewis na glikanima ekstrahovanim iz devet uzoraka prečišćenog rFSH (proizvedenog metodama iz Primera 6) merene su korišćenjem poznatih tehnika. Glikani su oslobođeni iz glikoproteina korišćenjem PNGase F i obeleženi 2-aminobenzamidom (2AB). Analiza je urađena dvodimenzionalnom (2D) HPLC analizom u kombinaciji sa enzimskom degradacijom glikana. Za verifikaciju, glikani su analizirani pomoću MALDI-MS. Relativne količine alfa 2,6-sijalinske kiseline i terminalnih ostataka su prikazane u sledećoj tabeli, zajedno sa onima za Gonal F (rekombinantni FSH dobijen iz ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO ) i Bravelle (FSH iz humanog urina).

[0094] Može se uočiti da količina GalNac u FSH pronalaska varira između oko 44,9 i 51%, u proseku oko 47,1%.

[0095] Može se uočiti da količina bisekcionog GIcNac u FSH pronalaska varira između 8,7 i 13,9%, u proseku približno 10,9%.

[0096] Može se uočiti da količina 1 Luisove fukoze u FSH pronalaska varira između oko 16,1 i 23,3%, u proseku oko 19%.

[0097] Može se uočiti da količina 2 Luisove fukoze u FSH pronalaska varira između oko 1,9 i 4,4%, u proseku oko 3,7%.

Primer 9 - Studija višestrukih doza koja ispituje bezbednost, podnošljivost, farmakokinetiku, farmakodinamiku i imunogenost FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

Studijska populacija

[0098] Ukupno 48 (24 na svakom leku) zdravih žena je primalo dnevne doze od 14,6 µg FE 999049 (kompozicija prema pronalasku, proizvedena prema Primeru 6) ili 16,5 µg Gonal-F tokom sedam dana.

Bezbednosni rezultati

[0099] Primena više doza FE 999049 i GONAL-F bila je bezbedna i generalno su je žene dobro podnosile prema proceni neželjenih događaja (AE), vitalnih znakova, EKG-a, kliničkih laboratorijskih merenja i fizičkog pregleda. Tokom studije nije došlo do ozbiljnih neželjenih događaja ili smrti.

Farmakokinetički rezultati

[0100] Nakon primene FE 999049 i GONAL-F tokom 7 dana, vrednosti koncentracije FSH procenjene neposredno pre sledeće injekcije su se povećale i činilo se da su dostigle stabilan nivo nakon 6-7 dana. Međutim, izloženost (površina ispod krive (AUC) i maksimalna izloženost (Cmax)) FE 999049 bila je 60% veća u poređenju sa Gonal-F.

Farmakodinamički rezultati

[0101] Koncentracije inhibina-B (pogledajte sliku 6), estradiola i progesterona su se povećale nakon primene FE 999049 i GONAL-F, međutim, u većoj meri nakon primene FE 999049 u poređenju sa GONAL-F. I broj i veličina folikula su pokazali veći odgovor na FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

[0102] Primer 9 pokazuje da FSH koji ima specifičnu količinu (17-23%) tetrasijaliriranih glikanskih struktura i npr. specifične količine α2,3 sijalilacije i α2,6 sijalilacije je znatno snažniji od rekombinantnih proizvoda FSH koji su trenutno na tržištu.

Primer 10 - Studija višestrukih doza koja istražuje FE 999049 u poređenju sa GONAL-F.

[0103] Sledeće je opisano randomizovano, kontrolisano, slepo za procenjivača, sa paralelnim grupama, multinacionalno, multicentrično ispitivanje koje procenjuje odnos doza-odgovor FE 999049 kod pacijentkinja koje su podvrgnute kontrolisanoj stimulaciji jajnika za in vitro oplodnju (IVF) / intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI). Populacija pacijenata je bila 265 pacijentkinja za in vitro oplodnju starosti od 18 do 37 godina, sa indeksom telesne mase (BMI) od 18,5 do 32,0 kg/m<2>.

Ispitivanje je osmišljeno kao ispitivanje doze-odgovora sa brojem oocita koji su dobijeni kao primarna krajnja tačka. Sekundarne krajnje tačke će istražiti kvalitativni i kvantitativni uticaj različitih doza FE 999049 u pogledu endokrinog profila, razvoja folikula, oplodnje oocita, kvaliteta embriona i efikasnosti lečenja (tj. ukupna potrošnja gonadotropina i trajanje stimulacije). Ispitivanje je osmišljeno da proceni efikasnost FE 999049 za utvrđivanje trudnoće kada se koristi u kontrolisanoj stimulaciji jajnika za cikluse IVF/ICSI.

[0104] Subjekti su procenjivani u periodu od 3 meseca pre randomizacije u pogledu usklađenosti sa kriterijumima za uključivanje i isključenje, uključujući procenu antimilerovog hormona (AMH) kako bi se povećala homogenost ispitivane populacije u odnosu na odgovor jajnika i minimizirao broj pacijentkinja koje su potencijalno u maloj meri reaktivne i hiperreaktivne na doze FE 999049 i dozu GONAL-F koje se koriste u ispitivanju. Poželjno je da se nivo AMH u serumu izmeri korišćenjem kompleta za imunosorbentnu analizu AMH Gen-II enzimak (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može da otkrije koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/l sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/l.

[0105] Na 2-3 dan menstrualnog ciklusa, ispitanice su randomizirane na način 1:1:1:1:1:1 za tretman sa 90 i.j., 120 i.j., 150 i.j., 180 i.j. ili 210 i.j. FE 999049 ili 150 i.j. GONAL-F, i započeta je stimulacija jajnika. Randomizacija je stratifikovana prema nivou AMH na skriningu [5,0-14,9 pmol/l (nizak AMH) i 15,0 do 44,9 pmol/l (visok AMH)).

[0106] Gonal-F se puni po masi (FbM) na zahtev FDA; pozivanje na doze u µg je stoga prikladno. Oznaka Gonal -F označava 600 i.j./44 µg, što znači da 150 i.j. iznosi 11 µg. Međutim, postoje neke varijacije i sertifikat serije za ovo ispitivanje je pokazao da je 11,3 µg Gonal-F ekvivalentno 150 i.j. Doze FE999049 su predstavljene sadržajem proteina (µg), a ne biološkom aktivnošću. Tako su doze FE999049 bile 5,2 µg (90 i.j.), 6,9 µg (120 i.j.), 8,6 µg (150 i.j.), 10,3 µg (180 i.j.) ili 12,1 µg (210 i.j.).

[0107] Ispitanik i distribucija doze su navedeni na sledeći način (podaci su broj ispitanika): Tabela 1.

[0108] Količina dnevne doze FE 999049 ili GONAL-F je fiksna tokom celog perioda stimulacije. Tokom stimulacije, ispitanice se prate 1, 4. i 6. dana stimulacije, a nakon toga najmanje svaki drugi dan. Kada se uoče 3 folikula od ≥15 mm, vizite se obavljaju svakodnevno. Ispitanice se leče sa FE 999049 ili GONAL-F maksimalno 16 dana.

[0109] Kako bi se sprečio prerani skok luteinizirajućeg hormona (LH), antagonist GnRH (ganireliks acetat, ORGALUTRAN, MSD / Schering-Plough) može biti uveden 6. dana stimulacije sa dnevnom dozom od 0,25 mg i primena će se nastaviti tokom perioda stimulacije. Aktiviranje finalnog sazrevanja folikula će se obaviti na dan kada se uoče ≥3 folikula prečnika ≥17 mm. Ako ima <25 folikula prečnika ≥12 mm, primenjuje se 250 µg rekombinantnog hCG (horiogonadotropin alfa, OVITRELLE, Merck Serono / EMD Serono). Ako ima 25-35 folikula prečnika ≥12 mm, primenjuje se 0,2 mg GnRH agonista (triptorelin acetat, DECAPEPTYL / GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals). U slučaju prekomernog odgovora jajnika, definisanog kao >35 folikula prečnika ≥12 mm, tretman se otkazuje. U slučaju slabog odgovora jajnika, koji se definiše kao <3 folikula prečnika ≥10 mm, primećenih na 10. dan stimulacije, ciklus bi mogao da se prekine.

[0110] Dobijanje oocita se odvija 36 h (± 2 h) nakon započinjanja finalnog sazrevanja folikula, i oociti mogu da se inseminiraju putem IVF ili ICSI. Oplodnja i razvoj embriona se procenjuju od dobijanja oocita do dana prenosa. Kod ispitanica koje su bile podvrgnute aktiviranju konačnog sazrevanja folikula sa hCG, jedna blastocista najboljeg dostupnog kvaliteta se prenosi 5. dana nakon dobijanja oocita, dok se preostale blastociste zamrzavaju. Kod ispitanica koje se podvrgavaju aktiviranju finalnog sazrevanja folikula agonistom GnRH, neće doći do transfera embriona u svežem ciklusu, i blastociste se umesto toga zamrzavaju 5. dana. Tri puta dnevno su obezbeđene vaginalne tablete progesterona (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) od 100 mg za podršku lutealnoj fazi od dana nakon dobijanja oocita do dana kliničke posete za trudnoću. βhCG test se radi 13-15 dana nakon transfera embriona, a klinička trudnoća će biti potvrđena transvaginalnim ultrazvukom (TVU) 5-6 nedelja nakon transfera embriona.

Rezultati

[0111] Broj dobijenih oocita (primarna krajnja tačka) prikazan je u sledećoj tabeli.

Table 2

[0112] Primarni cilj je ispunjen: uspostavljen je značajan odnos doza-odgovor za FE 999049 u odnosu na broj dobijenih oocita.

Ovaj nalaz je posmatran ne samo za ukupnu populaciju ispitivanja, već i za svaki od dva sloja AMH korišćena pri randomizaciji.

[0113] Pokazan je značajan odnos doza-odgovor za FE 999049 za sve ključne objektivne farmakodinamičke parametre, npr. estradiol, inhibin B i inhibin A. Na sličnom nivou doze u mikrogramima, farmakodinamički odgovori sa FE 999049 bili su veći nego sa GONAL-F (ovi rezultati nisu prikazani).

[0114] Koncentracije FSH u serumu nakon izlaganja FE 999049 bile su značajno veće nego za GONAL-F. Rezultati potvrđuju da se PK profil FE 999049 razlikuje od GONAL-F. Stope oplodnje, razvoj blastocista i stope trudnoće kod pacijenata IVF/ICSI lečenih pomoću FE 999049 bili su u granicama očekivanja.

[0115] Nisu postojali razlozi za zabriinutost u pogledu bezbednosti pri upotrebi FE 999049. Dokumentovana je dobra lokalna podnošljivost.

Dodatna analiza

[0116] Podnosioci predmetne prijave su dalje analizirali podatke kako bi identifikovali dozu(e) FE 999049 koje ispunjavaju sledeće kriterijume u pogledu broja dobijenih oocita:

• Oociti dobijeni u opsegu 8-14

• Minimizirati udeo pacijentkinja sa <8 oocita

• Minimizirati udeo pacijentkinja sa ≥20 oocita

[0117] Podnosioci prijave su takođe istraživali uticaj telesne težine. Ako je relevantno, doza se pretvara u µg/kg za prosečnu ispitanicu. Ova vrednost od µg/kg i ±0,01 µg/kg se procenjuje u modelu u odnosu na distribuciju dobijenih oocita, kao i na bezbednosni profil, i definiše se optimalna doza.

Nizak sloj AMH

[0118] Kao što se vidi u tabeli 2, doza FE999049 koja je ispunila prvi kriterijum (oociti dobijeni u opsegu 8-14) bila je 12,1 µg (prosečno 9,4 dobijenih oocita). Distribucija oocita je prikazana u tabeli 3 ispod.

Table 3

[0119] Kao što je prikazano u rubrici i strelicom, doza od 12,1 µg FE999049 obezbeđuje dobijanje najpoželjnijeg broja oocita kod 60% ispitanica u grupi sa niskim AMH. Ovo je značajno poboljšanje u odnosu na Gonal-F (najpoželjniji broj oocita kod samo 33% ispitanica).

[0120] Tabela 4 u nastavku prikazuje analizu znakova prekomernog odgovora kod niskog sloja AMH (podaci su broj ispitanika). Može se videti da nije bilo indikacija ranog OHSS-a umerene ili teške prirode i da nije bilo slučajeva da je potrebno preventivno delovanje; nema zabrinutosti u vezi sa dozom od 12,1 µg FE999049 kod pacijentkinje koja ima nizak AMH.

Table 4

[0121] Slika 7 pokazuje dejstvo telesne težine na dobijene oocite (za niske slojeve AMH), za različite doze. Strelice pokazuju broj oocita dobijenih od ispitanica čija je telesna težina između 45 kg i 90 kg lečenih dozom od 12,1 µg. Kao što se može videti (uokvireni tekst) varijacija između pacijentkinja telesne težine 45 kg i onih od 90 kg je manja od oko 0,5 oocita; drugim rečima, doziranje prema telesnoj težini nije potrebno kod pacijentkinja sa niskim AMH kada je doza FE999049 najmanje 12 µg, jer ne postoji značajna varijacija u oocitima dobijenim sa telesnom težinom, pri ovoj dozi.

[0122] Tako su podnosioci predmetne prijave otkrili da je doza ili doza ekvivalentna 6 do 18 µg, na primer 9 do 14 µg, na primer 12 µg, humano dobijenog rekombinantnog FSH-a pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima serumski AMH <15 pmol/l, na primer 0,05-14,9 pmol/l, na primer 5,0-14,9 pmol/l. Doza pruža delotvoran odgovor uz minimiziranje rizika od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS).

Visok sloj AMH

[0123] Kao što se vidi u tabeli 2, tri doze FE999049 ispunile su prvi kriterijum (oociti dobijeni u opsegu 8-14): 6,9 µg (prosečno dobijeno 9,1 oocita), 8,6 µg (prosečno dobijeno 10,6 oocita) i 10,3 µg (prosečno dobijeno 13,6 oocita).

[0124] Slika 8 pokazuje dejstvo telesne težine na dobijene oocite (za visoke slojeve AMH), za različite doze. Strelice pokazuju broj oocita dobijenih od ispitanica čija je telesna težina između 45 kg i 90 kg lečenih dozama od 6,9 µg, 8,6 µg i 10,3 µg. Kao što se može videti (uokvireni tekst) varijacija je značajna: za dozu od 6,9 µg, 6 dodatnih oocita će biti dobijeno od pacijentkinje od 45 kg u poređenju sa pacijentkinjom od 90 kg; za dozu od 8,6 µg, 4 dodatne jajne ćelije će biti dobijene od pacijentkinje od 45 kg u poređenju sa pacijentkinjom od 90 kg; a za dozu od 10,1 µg 2,5 dodatnih jajnih ćelija biće dobijeno od pacijentkinje od 45 kg u poređenju sa pacijentkinjom od 90 kg. Drugim rečima, doziranje prema telesnoj težini ima uticaja kod pacijentkinja sa visokim nivoom AMH kada je doza FE999049 manja od 12 µg, jer postoji značajna varijacija u oocitima dobijenim sa telesnom težinom, pri ovim dozama.

[0125] Tabela 5a ispod prikazuje dalju analizu oocita dobijenih (iz tabele 2) pomoću AMH. Ovo pokazuje doze koje su ispunile prvi kriterijum (oociti dobijeni u opsegu 8-14) za svaki podsloj AMH (polja).

Tabela 5a

[0126] Tabela 5b u nastavku prikazuje analizu pacijentkinja kod kojih je lečenje otkazano ili zbog prekomernog odgovora ili zbog aktiviranja agonista, za ove podgrupe. Na primer, jedna pacijentkinja sa slojem AMH od 25-34 pmol/l je otkazala zbog prekomernog odgovora nakon doze od 10,3 µg i jedna pacijentkinja sa slojem AMH od 25-34 pmol/l AMH je otkazala zbog prekomernog odgovora nakon doze od 12,1 µg ; jedna pacijentkinja sa nivoom AMH od 35-45 pmol/l je otkazala nakon aktiviranja agonista nakon doze od 10,3 µg; i jedna pacijentkinja sa slojem AMH od 35-45 pmol/l je otkazala nakon aktiviranja agonista nakon doze od 6,9 µg.

Tabela 5b

[0127] Može se videti da bi prilagođavanje doze prema telesnoj težini (Slika 8) i nivou AMH bilo korisno u slojevima sa visokim AMH, kako bi se minimiziralo otkazivanje i maksimiziralo dobijanje oocita.

[0128] Podnosioci predmetne prijave su otkrili da sledeće doze obezbeđuju efikasan odgovor dok minimiziraju rizik od OHSS-a (kg je kg telesne težine pacijentkinje).

[0129] Sledeće je prikladno ako doziranje prema telesnoj težini nije poželjno.

AMH u serumu doza (maksimalna doza)

[0130] Sledeće je prikladno ako je potrebno manje kategorija AMH.

[0131] Sledeće je prikladno ako doziranje prema telesnoj težini nije poželjno.

4 kategorije 3 kategorije 2 kategorije Jedna doza

[0132] Tako su podnosioci predmetne prijave otkrili da je doza ili doza koja je ekvivalentna 9 do 14 µg, na primer 12 µg, humano dobijenog rekombinantnog FSH pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu <15 pmol/l, na primer 0,05-14,9 pmol/l, na primer 5,0-14,9 pmol/l. Doza pruža delotvoran odgovor uz minimiziranje rizika od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS).

[0133] Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je doza ili doza koja je ekvivalentna 5 do 12,5 µg, na primer 6 do 10,5 µg, humano dobijenog rekombinantnog FSH pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima AMH u serumu ≥15 pmol/l. Doza pruža delotvoran odgovor uz minimiziranje rizika od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS).

[0134] Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je (npr. dnevna) doza ili doza koja je ekvivalentna 0,09 do 0,19 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH po kilogramu telesne težine pacijentkinje pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu ≥15 pmol/l. Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je (npr. dnevna) doza ili doza koja je ekvivalentna 0,14 do 0,19 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH (poželjno 0,15 do 0,16 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH) po kilogramu telesne težine pacijentkinje pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 15 do 24,9 pmol/l. Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je (npr. dnevna) doza ili doza koja je ekvivalentna 0,11 do 0,14 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH (poželjno 0,12 do 0,13 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH) po kilogramu telesne težine pacijentkinje pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu od 25 do 34,9 pmol/l. Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je (npr. dnevna) doza ili doza koja je ekvivalentna 0,10 do 0,11 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH po kilogramu telesne težine pacijentkinje pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu ≥35 pmol/l. Ove doze pružaju delotvoran odgovor uz minimiziranje rizika od sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS).

[0135] Podnosioci predmetne prijave su otkrili da je (npr. dnevna) doza ili doza koja je ekvivalentna 0,15 do 0,21 µg (npr. 0,16 µg) humano dobijenog rekombinantnog FSH po kilogramu telesne težine pacijentkinje pogodna za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinje koja ima nivo AMH u serumu <15 pmol/l, na primer, za prvi ciklus stimulacije pomoću humano dobijenog rekombinantnog FSH. Međutim, nije potrebno da se pacijentima određuje doza prema telesnoj težini na ovom nivou AMH.

Primer 10 A - Individualizovani protokol kontrolisane stimulacije jajnika (COS) (nizak AMH)

[0136] Odabrani pacijenti će biti podvrgnuti protokolu COS za in vitro oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI) metodama poznatim u tehnici. Protokol pre tretmana uključuje procenu/skrining pacijentkinjinog AMH u serumu korišćenjem kompleta za imunosorbentnu analizu AMH Gen-II enzima (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može da otkrije koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/l sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/l. AMH se može meriti korišćenjem drugih kompleta za analizu (npr. dostupnih od Roche-a).

[0137] Protokol COS se odvija na uobičajen način osim davanja početne doze FE 999049 prema nivou AMH tokom skrininga. Pacijentkinji sa nivoom AMH od <14,9 pmol/l bi se dala početna dnevna doza od približno 12 µg FE 999049, humano dobijenog rekombinantnog proizvoda FSH proizvedenog u skladu sa metodom iz Primera 6. Pacijentkinja sa nivoom AMH od 15 do 24,9 pmol/l bi primila početnu dnevnu dozu od 0,15 do 0,19 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH po kg telesne težine pacijentkinje. Pacijentkinja sa nivoom AMH od 25 do 34,9 pmol/l bi primila početnu dnevnu dozu od 0,11 do 0,13 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH po kg telesne težine pacijentkinje. Pacijentkinja sa nivoom AMH od ≥ 35 pmol/l primila bi početnu dnevnu dozu od 0,10 do 0,11 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH po kg telesne težine pacijentkinje.

Primer 11 - Individualizovani protokol kontrolisane stimulacije jajnika (COS)

[0138] Doze u ovom protokolu su manje poželjne od Primera 10A.

[0139] Odabrane pacijentkinje će biti podvrgnute protokolu COS za in vitro oplodnju (IVF)/intracitoplazmatsku injekciju sperme (ICSI) metodama poznatim u struci. Protokol pre tretmana uključuje procenu/skrining pacijentkinjinog AMH u serumu korišćenjem kompleta za imunosorbentnu analizu AMH Gen-II enzima (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Ovaj test može da otkrije koncentracije AMH veće od 0,57 pmol/l sa minimalnom granicom kvantifikacije od 1,1 pmol/l.

[0140] Protokol COS se odvija na uobičajen način osim davanja početne doze FE 999049 prema nivou AMH tokom skrininga u skladu sa sledećom tabelom. Dakle, pacijentkinji sa nivoom AMH od 5-14,8 pmol/l bi se dalo 180 i.j. FSH u obliku od približno 8-11 µg FE 999049, humano dobijenog rekombinantnog proizvoda FSH proizvedenog u skladu sa metodom iz Primera 6. Pacijentkinji sa nivoom AMH od 30-44,9 pmol/l bi se dalo 120 i.j. FSH u obliku od približno 4-7 µg FE 999049, humano dobijenog rekombinantnog proizvoda FSH proizvedenog u skladu sa metodom iz Primera 6. Ako nivo AMH nije dostupan, pacijentkinji bi se dalo 120-180 i.j. FSH u obliku od približno 6-11 µg FE 999049, humano dobijenog rekombinantnog proizvoda FSH proizvedenog u skladu sa metodom iz Primera 6.

Reference

[0141]

Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online.

9(2), 231-236.

Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, and Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol. 11(5), 517-526 Baenziger JU and Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta.947(2), 287-306.

Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online.10(2), 169-177.

Damián-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez-Hernández C, Timossi C, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Oestrogens regulate pituitary alpha2,3-sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol.23(2), 153-165

D'Antonio M., Borrelli F., Datola A., Bucci R., Mascia M., Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167

Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, and Desaire H. (2006). Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 45(28), 8665-8673 No copy

Dias JA, Van Roey P. (2001). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6), 510-519

Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN and Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79, 756-760

Fox KM, Dias JA, and Van Roey P. (2001). Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 378-89

Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, and Conradt HS. (1995). Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GIcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6-linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GIcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), 718-25

Green ED and Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), 36-44.

Grundmann,U., Nerlich,C., Rein,T. and Zettlmeissl, G. (1990). Complete cDNA sequence encoding human beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18(3), 667

Howles, C.M. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2,172-191.

Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem.263(33), 17508-17515.

Keene, J.L., Matzuk, M.M., Otani, T., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. and Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264(9), 4769-4775.

Kitagawa,H. and Paulson,J.C (1994) Cloning of a novel alpha 2,3-sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem. 269(2), 1394-1401.

Lee EU, Roth J, and Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of betagalactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), 13848-13855.

de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Damm, J. and Kloosterboer, L. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod., 2, 361-369.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem.193(1), 265-75.

Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol).7, 16-21.

Olivennes F, Howles CM, Borini A, Germond M, Trew G, Wikland M, Zegers-Hochschild F, Saunders H (2009) Individualizing FSH dose for assisted reproduction using a novel algorithm: the CONSORT study. Reprod Biomed Online. 2009 Feb;18(2):195-204.

Pierce JG, and Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem. 50, 465-495.

Pricer WE Jr, and Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol Chem. 246(15), 4825-33.

Rathnam P, and Saxena BB. (1975). Primary amino acid sequence of folliclestimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit. J Biol Chem.;250(17):6735-6746.

Regoeczi E, Debanne MT, Hatton MC, and Koj A. (1978) Elimination of asialofetuin and asialoorosomucoid by the intact rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta.541(3), 372-84.

Royle L, Raddiffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO and Vutyavanich T. (1987). Structure-function relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res.;43,:383-429.

Saxena BB and Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of folliclestimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem.251(4), 993-1005

Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology.53(6), 604-616.

Steer CJ, and Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rat hepatocytes. J Biol Chem. 255(7), 3008-13.

Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem.265(34), 20863-20868.

Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem.263(8), 3657-3663.

Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, González R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissue-type plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology.67(3), 153-163.

Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, González-Suárez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, and Ulloa-Aguirre A. (2000). Differential effects of the charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol.165(2), 193-205.

Ulloa-Aguirre, A., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. and Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod.3, 491-501.

Ulloa-Aguirre, A., Cravioto, A., Damiàn-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, E and Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurring analogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod. 7, 23-30.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Folliclestimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Damián-Matsumura P, and Timossi C (2001). Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res.32(6), 520-532.

Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod.69(2), 379-389.

Van Lenten L, and Ashwell G. (1972) The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. Development of a quantitative inhibition assay. J Biol Chem. 247(14), 4633-40.

Wide, L. and Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility of human follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropinreleasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab.70, 271-276.

Wide, L. and Bakos, O. (1993). More basic forms of both human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab., 76, 885-889.

Wide L, Naessén T, Sundström-Poromaa I, Eriksson K. (2007) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol Metab.;92(11), 4410-4417.

Zambrano E, Zariñán T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure-function relationship of the FSH variants. Endocrine.10(2), 113-121.

Zhang X, Lok SH, and Kon OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta.1425(3), 441-452.

SEQ ID NO: 1

Folikulostimulišući hormon alfa polipeptid

Pristupni broj AH007338

Nukleotidna sekvenca FSH alfa

SEQ ID NO: 2

Folikulostimulišući hormon beta polipeptid Pristupni broj NM_000510

Nukleotidna sekvenca FSH beta

SEQ ID NO: 3

Beta-galaktozamid alfa-2,3-sijaliltransferaza 4

Pristupni broj L23767

Nukleotidna sekvenca ST3GAL4

SEQ ID NO: 4

Beta-galaktozamid alfa-2,6-sijaliltransferaza 1 Pristupni broj NM_003032

Nukleotidna sekvenca ST6GAL1

Sekvenca proteina ST6GAL1 (SEQ ID NO: 8)

Claims (4)

Patentni zahtevi

1. Proizvod koji sadrži humano dobijeni folikulostimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinja koje imaju nivo AMH u serumu <15 pmol/l, naznačeno time što se proizvod daje u dozi od ili koja je ekvivalentna 11 do 13 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH dnevno, humano dobijenog rekombinantnog FSH uključujući mono-, di-, tri- i tetrasijalirirane strukture, pri čemu je 15 do 24% sijaliriranih glikanskih struktura tetrasijalirirane strukture.

2. Proizvod koji sadrži humano dobijeni folikulostimulišući hormon (FSH) za upotrebu u lečenju neplodnosti kod pacijentkinja koje imaju nivo AMH u serumu ≥15 pmol/l, pri čemu proizvod se daje u dozi od ili koja je ekvivalentna 0,09 do 0,19 µg humano dobijenog rekombinantnog FSH po kilogramu telesne težine pacijentakinje dnevno, humano dobijenog rekombinantnog FSH uključujući mono-, di-, tri- i tetrasijalirirane strukture, pri čemu su 15 do 24% sijaliriranih glikanskih struktura tetrasijalirirane strukture.

3. Proizvod je u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačen time, što humano dobijeni rekombinantni FSH jeste rekombinantni FSH dobijen iz ćelijske linije PER C6.

4. Proizvod je u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time, što lečenje neplodnosti uključuje korak određivanja nivoa AMH u serumu pacijentkinje, i korak primene doze kod pacijentkinje koja ima definisani nivo AMH u serumu.