RS65493B1 - Formulacije - Google Patents

Formulacije

Info

Publication number
RS65493B1
RS65493B1 RS20240516A RSP20240516A RS65493B1 RS 65493 B1 RS65493 B1 RS 65493B1 RS 20240516 A RS20240516 A RS 20240516A RS P20240516 A RSP20240516 A RS P20240516A RS 65493 B1 RS65493 B1 RS 65493B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cases
lipid
mol
rna
lnp
Prior art date
Application number
RS20240516A
Other languages
English (en)
Inventor
Kristy M Wood
Noah Paul Gardner
Ruchi Rudraprasad Shah
Stephen S Scully
Ramsey Majzoub
Original Assignee
Intellia Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intellia Therapeutics Inc filed Critical Intellia Therapeutics Inc
Publication of RS65493B1 publication Critical patent/RS65493B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] U ovom dokumentu su obezbeđene kompozicije lipidnih nanočestica („LNP“) sa poboljšanim svojstvima za isporuku biološki aktivnih agenasa, posebno molekula RNK, iRNK i vodič RNK (eng. – guide RNA). Kompozicije LNP olakšavaju isporuku RNK agenasa kroz ćelijske membrane, a u određenim slučajevima, one uvode komponente i kompozicije za editovanje gena u žive ćelije.
[0002] Biološki aktivni agensi koji se posebno teško isporučuju u ćelije uključuju proteine, lekove na bazi nukleinskih kiselina i njihove derivate. Kompozicije za isporuku obećavajućih tehnologija za editovanje gena u ćelije, na primer, za isporuku komponenti sistema CRISPR/Cas9, su od posebnog interesa.
[0003] Trenutno postoje bojne komponente i sistemi za editovanje gena u ćelijama in vivo, koji pružaju ogroman potencijal za lečenje bolesti. Sistemi za editovanje gena CRISPR/Cas su aktivni kao ribonukleoproteinski kompleksi u ćeliji. RNK-usmerena nukleaza se vezuje za DNK sekvencu u ćeliji i usmerava njeno isecanje. Ova aktivnost nukleaze specifična za mesto olakšava editovanje gena kroz sopstvene prirodne procese ćelije. Na primer, ćelija reaguje na dvolančane prekide DNK (DSB) procesom popravke koji je sklon greškama poznatim kao nehomologno spajanje krajeva („NHEJ“). Tokom procesa NHEJ, ćelija može da dodaje ili uklanja nukleotide sa krajeva DNK, što rezultuje sekvencom koja je izmenjena od isečene sekvence. U drugim okolnostima, ćelije popravljaju DSB pomoću mehanizama popravke usmerene homologijom („HDR“) ili homologne rekombinacije („HR“), u kojima za usmeravanje popravke prekida mogu da se koriste endogena ili egzogena matrica. Nekoliko ovih tehnologija za editovanje koristi prednosti ćelijskih mehanizama za popravku jednolančanih prekida (SSB) ili DSB. WO 2017/127750 se bavi iRNK za proizvodnju intracelularnih vezujućih polipeptida i postupcima za njihovu upotrebu. WO 2017/049074 se bavi formulacijama polinukleotida za upotrebu u lečenju bubrežnih bolesti. Jingtao Zhang et al, Molecular Pharmaceutics, vol.10, no.1, 4 December 2012, pp397-405, bavi se procenom nivoa heterogenosti u lipidnim nanočesticama za isporuku siRNK. WO 2015/006747 se bavi kompozicijama koje sadrže polinukleotide koji kodiraju proteine srodne CRISPR i sintetičke gRNK i postupcima za njihovu upotrebu. WO 2015/095340 se bavi lipidima i lipidnim kompozicijama za isporuku aktivnih agenasa.
[0004] Postoji potreba za kompozicijama za isporuku proteinskih i nukleinsko-kiselinskih komponenti CRISPR/Cas u ćeliju, kao što je ćelija u pacijentu. Posebno, od naročitog interesa su kompozicije za isporuku iRNK koja kodira proteinsku komponentu CRISPR i za isporuku vodič RNK sistema CRISPR. Kompozicije sa korisnim svojstvima za in vitro i in vivo isporuku koje mogu da stabilizuju i isporuče RNK komponente su takođe od posebnog interesa.
[0005] U ovom dokumentu su obezbeđene kompozicije zasnovane na lipidnim nanočesticama sa korisnim svojstvima, posebno za isporuku komponenti za editovanje gena CRISPR/Cas.
[0006] Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju LNP koja sadrži:
RNK komponentu pri čemu RNK komponenta sadrži (i) iRNK koja kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens i (ii) gRNK nukleinsku kiselinu; i
lipidnu komponentu, pri čemu lipidna komponenta sadrži: (1) 50-60 mol% aminolipida; (2) 8-10 mol% neutralnog lipida; i (3) 2.5-4 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, odnos N/P u kompoziciji LNP je 6, i gde je aminolipid lipid A ili acetalni analog lipida A, pri čemu je lipid A predstavljen sledećom strukturnom formulom
Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu kompozicije LNP pronalaska za (a) editovanje gena in vitro; ili (b) in vitro proizvodnju genetski modifikovane ćelije. Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju LNP pronalaska za upotrebu u terapiji. Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju LNP pronalaska za upotrebu u terapiji, gde terapija obuhvata (a) editovanje gena u subjektu; ili (b) proizvodnju genetski modifikovane ćelije u subjektu. Dodatni aspekti pronalaska su navedeni u zahtevima.
Ovde su takođe opisane, ali se za njih ne traži zaštita, kompozicije LNP koje sadrže (1) komponentu RNK; (2) oko 50-60 mol% aminolipida; (3) oko 27-39.5 mol% pomoćnog lipida; (4) oko 8-10 mol% neutralnog lipida; i (5) oko 2.5-4 mol% PEG lipida, pri čemu je odnos N/P u kompoziciji LNP oko 5-7.
[0007] Ovde su takođe opisane, ali se za njih ne traži zaštita, kompozicije LNP koje sadrže RNK komponentu i lipidnu komponentu, pri čemu lipidna komponenta sadrži: (1) oko 50-60 mol% aminolipida; (2) oko 5-15 mol% neutralnog lipida; i (3) oko 2.5-4 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, i gde je odnos N/P u kompoziciji LNP oko 3-10. Ovde su dalje opisane kompozicije LNP koje sadrže lipidnu komponentu koja uključuje (1) oko 40-60 mol% aminolipida; (2) oko 5-15 mol% neutralnog lipida; i (3) oko 2.5-4 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, i gde odnos N/P u kompoziciji LNP iznosi oko 6. Ovde su takođe opisane kompozicije LNP koje sadrže lipidnu komponentu koja uključuje (1) oko 50-60 mol% aminolipida; (2) oko 5-15 mol% neutralnog lipida; i (3) oko 1.5-10 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, i gde odnos N/P u kompoziciji LNP iznosi oko 6.
[0008] Ovde su dalje opisane, ali se za njih ne traži zaštita, kompozicije LNP koje sadrže RNK komponentu i lipidnu komponentu, pri čemu lipidna komponenta sadrži: (1) oko 40-60 mol% aminolipida; (2) oko 0-5 mol% neutralnog lipida, npr. fosfolipida; i (3) oko 1.5-10 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, i gde odnos N/P u kompoziciji LNP iznosi oko 3-10. Takođe su opisane kompozicije LNP koje sadrže RNK komponentu i lipidnu komponentu, pri čemu lipidna komponenta sadrži: (1) oko 40-60 mol% aminolipida; (2) manje od oko 1 mol% neutralnog lipida, npr. fosfolipida; i (3) oko 1.5-10 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, i gde odnos N/P u kompoziciji LNP iznosi oko 3-10. U određenim slučajevima, kompozicija LNP je suštinski bez neutralnog lipida. Ovde su takođe opisane kompozicije LNP koje sadrže RNK komponentu i lipidnu komponentu, pri čemu lipidna komponenta sadrži: (1) oko 40-60 mol% aminolipida; i (2) oko 1.5-10 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, gde odnos N/P u kompoziciji LNP iznosi oko 3-10, i gde je LNP kompozicija bez neutralnog lipida, npr. fosfolipida. U određenim slučajevima, kompozicija LNP je suštinski bez, ili je bez neutralnog fosfolipida. U određenim slučajevima, kompozicija LNP je suštinski bez, ili je bez neutralnog lipida, npr. fosfolipida.
[0009] Komponenta RNK koja je ovde opisana sadrži iRNK, kao što je RNK-vođeni DNK-vezujući agens (npr. Cas nukleaza ili Cas nukleaza klase 2). Ovde opisana RNK komponenta takođe sadrži gRNK.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0010]
Sl. 1 pokazuje procenat editovanja gena TTR postignut u jetri miša nakon isporuke komponenti iRNK Cas9 i gRNK za editovanje gena CRISPR/Cas u kompozicijama LNP kao što je naznačeno, u jednoj dozi od 1 mg/kg (Sl.1A) ili 0.5 mg/kg (Sl.1B).
Sl. 2 prikazuje podatke o raspodeli čestica za kompozicije LNP koje sadrže iRNK Cas9 i gRNK.
Sl. 3 prikazuje fizičko-hemijska svojstva kompozicija LNP, poredeći logaritamsku diferencijalnu molarnu masu (Sl. 3A) i merenja prosečne molekulske težine (Sl. 3B) za kompozicije.
Sl. 4 prikazuje proračune polidisperznosti na sl.4A i Burchard-Stockmeyer analizu na sl.
4B, analizirajući kompozicije LNP sa sl.3.
Sl. 5 daje rezultate eksperimenta koji procenjuje efekat kompozicija LNP sa povećanim koncentracijama PEG lipida na snižavanje TTR u serumu, editovanje gena u jetri i nivoe citokina MCP-1 posle primene jedne doze kod pacova. Sl. 5A prikazuje nivoe TTR u serumu; sl. 5B predstavlja grafikone procenta editovanja u uzorcima jetre; a sl. 5C daje nivoe MCP-1 u pg/mL.
Sl. 6 pokazuje da kompozicije LNP održavaju potentnost za editovanje gena sa različitim PEG lipidima (mereno nivoima TTR u serumu (Sl. 6A i 6B) i procentom editovanja (Sl.
6C).
Sl. 7 pokazuje da analozi lipida A efikasno isporučuju kargo za editovanje gena u kompozicijama LNP mereno procentom editovanja u jetri nakon davanja jedne doze kod miša.
Sl. 8 prikazuje krivu odgovora na dozu za procenat editovanja sa različitim kompozicijama LNP u primarnim hepatocitima majmuna makaki.
Sl. 9A i sl. 9B pokazuju rezultate TTR u serumu i procenta editovanja kada odnos gRNK prema iRNK varira, a sl.9C i sl.9D pokazuju rezultate TTR u serumu i procenta editovanja u jetri kada se količina iRNK Cas9 održava konstantnom a gRNK varira nakon primene jedne doze kod miša.
Sl. 10A i sl. 10B prikazuju rezultate TTR u serumu i procenta editovanja u jetri nakon primene kompozicija LNP sa i bez neutralnog lipida.
DETALJAN OPIS
[0011] Ovo otkriće opisuje primere kompozicija RNK na bazi lipidnih nanočestica (LNP), uključujući RNK komponente CRISPR/Cas („kargo“) za isporuku u ćeliju, i postupke za njihovu upotrebu. Kompozicije LNP mogu da ispolje poboljšana svojstva u poređenju sa prethodnim tehnologijama isporuke. Kompozicija LNP može da sadrži RNK komponentu i lipidnu komponentu, kao što je ovde definisano. U određenim slučajevima, RNK komponenta uključuje Cas nukleazu, kao što je Cas nukleaza klase 2. U određenim slučajevima, kargo ili RNK komponenta uključuje iRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2 i vodič RNK ili nukleinske kiseline koje kodiraju vodič RNK. Takođe su opisani postupci za editovanje gena i postupci za proizvodnju genetski modifikovanih ćelija.
Kargo CRISPR /Cas
[0012] Kargo CRISPR/Cas isporučen preko formulacije LNP može da uključuje molekul iRNK koji kodira protein od interesa. Na primer, uključena je iRNK za ekspresiju proteina, kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP), i RNK-vođeni DNK-vezujući agens ili Cas nukleaza.
Otkrivene su kompozicije LNP koje uključuju iRNK Cas nukleaze, na primer iRNK Cas nukleaze klase 2 koja omogućava ekspresiju proteina Cas9 u ćeliji. Dalje, kargo može da sadrži jednu ili više vodič RNK ili nukleinskih kiselina koje kodiraju vodič RNK. Matrična nukleinska kiselina, npr. za popravku ili rekombinaciju, takođe može da bude uključena u kompoziciju ili matrična nukleinska kiselina može da se koristi u ovde opisanim postupcima.
[0013] „iRNK“ se odnosi na polinukleotid koji sadrži otvoreni okvir čitanja koji može da se translatira u polipeptid (tj. može da služi kao supstrat za translaciju putem ribozoma i aminoacilovanih tRNK). iRNK može da sadrži fosfatno-šećerni osnovni lanac koji uključuje ostatke riboze ili njenih analoga, npr. ostatke 2'-metoksi riboze. U nekim slučajevima, šećeri fosfatnošećernog osnovnog lanca iRNK se suštinski sastoje od ostataka riboze, ostataka 2'-metoksi riboze ili njihove kombinacije. Generalno, iRNK ne sadrži značajnu količinu ostataka timidina (npr. 0 ostataka ili manje od 30, 20, 10, 5, 4, 3 ili 2 ostatka timidina; ili manje od 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% ili 0.1% sadržaja timidina). iRNK može da sadrži modifikovane uridine na nekim ili na svim svojim pozicijama uridina.
Nukleazni sistemi CRISPR/Cas
[0014] Jedna komponenta otkrivenih formulacija je iRNK koja kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens, kao što je Cas nukleaza.
[0015] Kako se ovde koristi, „RNK-vođeni DNK-vezujući agens“ označava polipeptid ili kompleks polipeptida koji imaju aktivnost vezivanja RNK i DNK, ili DNK-vezujuću subjedinicu takvog kompleksa, pri čemu je aktivnost vezivanja DNK specifična za sekvencu i zavisi od sekvence RNK. Primeri RNK-vođenih DNK-vezujućih agenasa uključuju Cas klivaze/nikaze i njihove inaktivisane oblike („DNK-vezujući agensi dCas“). „Cas nukleaza“, kako se ovde koristi, obuhvata Cas klivaze, Cas nikaze i DNK-vezujuće agense dCas. Cas klivaze/nikaze i DNK-vezujući agensi dCas uključuju kompleks Csm ili Cmr CRISPR sistema tipa III, njegovu subjedinicu Cas 10, Csm1 ili Cmr2, kompleks Cascade CRISPR sistema tipa I, njegovu subjedinicu Cas3 i Cas nukleaze klase 2. Kako se ovde koristi, „Cas nukleaza klase 2“ je jednolančani polipeptid sa RNK-vođenom DNK-vezujućom aktivnošću. Cas nukleaze klase 2 uključuju Cas klivaze/nikaze klase 2 (npr. varijante H840A, D10A ili N863A), koje dalje imaju RNK-vođenu aktivnost klivaze ili nikaze DNK i DNK-vezujuće agense dCas klase 2, u kojima je aktivnost klivaze/nikaze inaktivisana. Cas nukleaze klase 2 uključuju, na primer, proteine Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (npr. varijante N497A, R661A, Q695A, Q926A), HypaCas9 (npr. varijante N692A, M694A, Q695A, H698A), eSPCas9(1.0) (npr. varijante K810A, K1003A, R1060A) i eSPCas9(1.1) (npr. varijante K848A, K1003A, R1060A) i njihove modifikacije.
Protein Cpf1, Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015), je homologan Cas9 i sadrži nukleazni domen sličan RuvC. Sekvence Cpf1 su opisane u npr. Zetsche, tabele S1 i S3. Videti, npr. Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015).
[0016] U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens je Cas nukleaza klase 2. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens ima aktivnost klivaze, koja takođe može da se nazove endonukleaznom aktivnošću prema dvolančanom molekulu. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži Cas nukleazu, kao što je Cas nukleaza klase 2 (koja može biti, npr. Cas nukleaza tipa II, V ili VI). Cas nukleaze klase 2 uključuju, na primer, proteine Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2 i C2c3 i njihove modifikacije. Primeri Cas9 nukleaza uključuju sisteme CRISPR tipa II S. pyogenes, S. aureus i drugih prokariota (videti, npr. listu u sledećem paragrafu), i njihove modifikovane (npr. genetski modifikovane ili mutantne) verzije. Videti, npr. U.S.2016/0312198 A1; U.S.2016/0312199 A1. Drugi primeri Cas nukleaza uključuju Csm ili Cmr kompleks sistema CRISPR tipa III ili njegovu subjedinicu Cas10, Csm1 ili Cmr2; i kompleks Cascade sistema CRISPR tipa I, ili njegovu subjedinicu Cas3. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da bude iz sistema tipa-IIA, tipa-IIB ili tipa-IIC. Za diskusiju o različitim CRISPR sistemima i Cas nukleazama videti, npr. Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol.9:467-477 (2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015).
[0017] Neograničavajući primeri vrsta iz kojih može da potiče Cas nukleaza uključuju Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Listeria innocua, Lactobacillus gasseri, Francisella novicida, Wolinella succinogenes, Sutterella wadsworthensis, Gammaproteobacterium, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Fibrobacter succinogene, Rhodospirillum rubrum, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus buchneri, Treponema denticola, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Streptococcus pasteurianus, Neisseria cinerea, Campylobacter lari, Parvibaculum lavamentivorans, Corynebacterium diphtheria, Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium ND2006 i Acaryochloris marina.
[0018] U nekim slučajevima, Cas nukleaza je Cas9 nukleaza iz Streptococcus pyogenes. U nekim slučajevima, Cas nukleaza je Cas9 nukleaza iz Streptococcus thermophilus. U nekim slučajevima, Cas nukleaza je Cas9 nukleaza iz Neisseria meningitidis. U nekim slučajevima, Cas nukleaza je Cas9 nukleaza iz Staphylococcus aureus. U nekim slučajevima, Cas nukleaza je Cpf1 nukleaza iz Francisella novicida. U nekim slučajevima, Cas nukleaza je Cpf1 nukleaza iz Acidaminococcus sp. U nekim slučajevima, Cas nukleaza je Cpf1 nukleaza iz bakterije Lachnospiraceae ND2006. U daljim slučajevima, Cas nukleaza je Cpf1 nukleaza iz Francisella tularensis, Lachnospiraceae bacterium, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium, Parcubacteria bacterium, Smithella, Acidaminococcus, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, ili Porphyromonas macacae. U određenim slučajevima, Cas nukleaza je Cpf1 nukleaza iz Acidaminococcus ili Lachnospiraceae.
[0019] Divlji tip Cas9 ima dva nukleazna domena: RuvC i HNH. Domen RuvC iseca DNK lanac koji nije ciljni, a domen HNH iseca ciljni lanac DNK. U nekim slučajevima, Cas9 nukleaza sadrži više od jednog domena RuvC i/ili više od jednog domena HNH. U nekim slučajevima, Cas9 nukleaza je divlji tip Cas9. U nekim slučajevima, Cas9 je sposobna da izazove dvolančani prekid u ciljnoj DNK. U određenim slučajevima, Cas nukleaza može da iseče dsDNK, može da iseče jedan lanac dsDNK, ili može da nema aktivnost klivaze ili nikaze DNK. Primer aminokiselinske sekvence Cas9 je otkriven kao SEQ ID NO: 3. Primer sekvence ORF iRNK Cas9, koja uključuje startne i stop kodone, je otkriven kao SEQ ID NO: 4. Primer kodirajuće sekvence iRNK Cas9, pogodne za uključivanje u fuzioni protein, otkriven je kao SEQ ID NO: 10.
[0020] U nekim slučajevima se koriste himerne Cas nukleaze, gde je jedan domen ili region proteina zamenjen delom drugog proteina. U nekim slučajevima, domen Cas nukleaze može da bude zamenjen domenom iz druge nukleaze kao što je Fok1. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da bude modifikovana nukleaza.
[0021] U drugim slučajevima, Cas nukleaza može da bude iz sistema CRISPR/Cas tipa I. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da bude komponenta kompleksa Cascade sistema CRISPR/Cas tipa I. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da bude protein Cas3. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da bude iz sistema CRISPR/Cas tipa III. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da ima aktivnost isecanja RNK.
[0022] U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens ispoljava aktivnost nikaze prema jednolančanom molekulu, tj. može da preseče jedan lanac DNK da bi proizveo jednolančani prekid na engleskom označen kao „nick“. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži Cas nikazu. Nikaza je enzim koji stvara jednolančani prekid u dsDNK, tj. preseca jedan, ali ne i drugi lanac u dvostrukoj spirali DNK. U nekim slučajevima, Cas nikaza je verzija Cas nukleaze (npr. Cas nukleaze o kojoj je gore diskutovano) u kojoj je endonukleolitičko aktivno mesto inaktivisano, npr. pomoću jedne ili više izmena (npr. tačkaste mutacije) u katalitičkom domenu. Videti, npr. SAD pat. br. 8,889,356 za diskusiju o Cas nikazama i primere izmena katalitičkih domena. U nekim slučajevima, Cas nikaza kao što je Cas9 nikaza ima inaktivisan domen RuvC ili HNH. Primer aminokiselinske sekvence Cas9 nikaze je otkriven kao SEQ ID NO: 6. Primer sekvence ORF iRNK Cas9 nikaze, koja uključuje startne i stop kodone, otkriven je kao SEQ ID NO: 7. Primer kodirajuće sekvence iRNK Cas9 nikaze, pogodne za uključivanje u fuzioni protein, otkriven je kao SEQ ID NO: 11.
[0023] U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens je modifikovan tako da sadrži samo jedan funkcionalni domen nukleaze. Na primer, protein agensa može da bude modifikovan tako da jedan od nukleaznih domena bude mutiran, ili potpuno ili delimično deletiran da bi se smanjila njegova aktivnost isecanja nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, koristi se nikaza sa domenom RuvC sa smanjenom aktivnošću. U nekim slučajevima, koristi se nikaza sa neaktivnim domenom RuvC. U nekim slučajevima, koristi se nikaza sa domenom HNH sa smanjenom aktivnošću. U nekim slučajevima, koristi se nikaza sa neaktivnim domenom HNH.
[0024] U nekim slučajevima, konzervisana aminokiselina unutar nukleaznog domena proteina Cas je supstituisana da bi se smanjila ili izmenila aktivnost nukleaze. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da sadrži aminokiselinsku supstituciju u nukleaznom domenu RuvC ili nukleaznom domenu sličnom RuvC. Primeri aminokiselinskih supstitucija u nukleaznom domenu RuvC ili nukleaznom domenu sličnom RuvC uključuju D10A (na bazi Cas9 proteina S. pyogenes). Videti, npr. Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22: 163(3): 759-771. U nekim slučajevima, Cas nukleaza može da sadrži aminokiselinsku supstituciju u nukleaznom domenu HNH ili nukleaznom domenu sličnom HNH. Primeri aminokiselinskih supstitucija u nukleaznom domenu HNH ili nukleaznom domenu sličnom HNH uključuju E762A, H840A, N863A, H983A i D986A (na bazi Cas9 proteina S. pyogenes). Videti, npr. Zetsche et al. (2015). Dalji primeri aminokiselinskih supstitucija uključuju D917A, E1006A i D1255A (na bazi sekvence Cpf1 Francisella novicida U112 (FnCpf1) (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)).
[0025] U nekim slučajevima, iRNK koja kodira nikazu je otkrivena u kombinaciji sa parom molekula vodič RNK koji su komplementarni smisaonom, odnosno antismisaonom lancu ciljne sekvence. U ovom slučaju, molekuli vodič RNK usmeravaju nikazu na ciljnu sekvencu i uvode DSB tako što generišu jednolančani prekid na suprotnim lancima ciljne sekvence (tj. dvostruki jednolančani prekid). U nekim slučajevima, primena stvaranja dvostrukog jednolančanog prekida može da poboljša specifičnost i smanji delovanje van cilja. U nekim slučajevima, nikaza se koristi zajedno sa dva odvojena molekula vodič RNK koji su usmereni na suprotne lance DNK da bi se proizveo dvostruki jednolančani prekid u ciljnoj DNK. U nekim slučajevima, nikaza se koristi zajedno sa dva odvojena molekula vodič RNK koji su odabrani tako da budu u neposrednoj blizini, kako bi se proizveo dvostruki jednolančani prekid u ciljnoj DNK.
[0026] U nekim slučajevima, RNK-vođenom DNK-vezujućem agensu nedostaje aktivnost klivaze i nikaze. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži DNK-vezujući polipeptid dCas. Polipeptid dCas ima DNK-vezujuću aktivnost, dok mu suštinski nedostaje katalitička enzimska aktivnost (klivaze/nikaze). U nekim slučajevima, polipeptid dCas je polipeptid dCas9. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens kome nedostaje aktivnost klivaze i nikaze ili DNK-vezujući polipeptid dCas je verzija Cas nukleaze (npr. Cas nukleaze o kojoj je gore diskutovano) u kojoj su njena endonukleolitička aktivna mesta inaktivisana, npr. pomoću jedne ili više izmena (npr. tačkaste mutacije) u njenim katalitičkim domenima. Videti, npr. U.S.
2014/0186958 A1; U.S. 2015/0166980 A1. Primer aminokiselinske sekvence dCas9 je otkriven kao SEQ ID NO: 8. Primer sekvence ORF iRNK Cas9, koja uključuje startne i stop kodone, je otkriven kao SEQ ID NO: 9. Primer kodirajuće sekvence iRNK Cas9, pogodne za uključivanje u fuzioni protein, otkriven je kao SEQ ID NO: 12.
[0027] U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži jedan ili više heterolognih funkcionalnih domena (npr. predstavlja ili sadrži fuzioni polipeptid).
[0028] U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da olakša transport RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa u jedro ćelije. Na primer, heterologni funkcionalni domen može da bude signal nukleusne lokalizacije (NLS). U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da bude spojen sa 1-10 NLS. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da bude spojen sa 1-5 NLS. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da bude spojen sa jednim NLS. Kada se koristi jedan NLS, NLS može da bude vezan na N-terminusu ili C-terminusu sekvence RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa. Takođe se može umetnuti u sekvencu RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa. U drugim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da bude spojen sa više nego jednim NLS. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da bude spojen sa 2, 3, 4 ili 5 NLS. U nekim slučajevima, RNKvođeni DNK-vezujući agens može da bude spojen sa dva NLS. U određenim okolnostima, dva NLS mogu da budu ista (npr. dva NLS SV40) ili različita. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens je fuzionisan sa dve NLS sekvence SV40 povezane na karboksi terminusu. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da bude spojen sa dva NLS, jednim povezanim na N-terminusu i jednim na C-terminusu. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da se spoji sa 3 NLS. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da ne bude spojen sa NLS. U nekim slučajevima, NLS može da bude jednodelna sekvenca, kao što je, npr. NLS SV40, PKKKRKV ili PKKKRRV. U nekim slučajevima, NLS može da bude dvodelna sekvenca, kao što je NLS nukleoplazmina, KRPAATKKAGQAKKKK. U specifičnom slučaju, jedan NLS PKKKRKV može da bude povezan na C-terminusu RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa. Jedan ili više linkera su opciono uključeni na mestu fuzije.
[0029] U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da ima sposobnost modifikovanja intracelularnog poluživota RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa. U nekim slučajevima, poluživot RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa može da bude produžen. U nekim slučajevima, poluživot RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa može da bude skraćen. U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da ima sposobnost povećanja stabilnosti RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa. U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da ima sposobnost smanjenja stabilnosti RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa. U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da deluje kao signalni peptid za degradaciju proteina. U nekim slučajevima, degradacija proteina može da bude posredovana proteolitičkim enzimima, kao što su, na primer, proteazomi, lizozomalne proteaze ili kalpain proteaze. U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da sadrži PEST sekvencu. U nekim slučajevima, RNK-vođeni DNK-vezujući agens može da bude modifikovan dodavanjem ubikvitina ili poliubikvitinskog lanca. U nekim slučajevima, ubikvitin može da bude protein sličan ubikvitinu (UBL). Neograničavajući primeri proteina sličnih ubikvitinu uključuju mali modifikator sličan ubikvitinu (SUMO), ubikvitin unakrsno reaktivni protein (UCRP, takođe poznat kao interferonom stimulisani gen-15 (ISG15)), modifikator-1 povezan sa ubikvitinom (URM1), razvojno nishodno regulisani protein-8 eksprimiran u neuronskim prekursorskim ćelijama (NEDD8, takođe nazvan Rub 1 u S. cerevisiae), protein povezan sa humanim leukocitnim antigenom F (FAT10), protein autofagije-8 (ATG8) i -12 (ATG12), Fau protein sličan ubikvitinu (FUB 1), membranski usidreni UBL (MUB), modifikator-1 savijanja ubikvitina (UFM1) i ubikvitinu sličan protein-5 (UBL5).
[0030] U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može biti domen markera. Neograničavajući primeri domena markera uključuju fluorescentne proteine, oznake za prečišćavanje, oznake epitopa i sekvence reporterskih gena. U nekim slučajevima, domen markera može biti fluorescentni protein. Neograničavajući primeri pogodnih fluorescentnih proteina uključuju zelene fluorescentne proteine (npr. GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), žute fluorescentne proteine (npr. YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), plave fluorescentne proteine (npr. EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), cijan fluorescentne proteine (npr. ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), crvene fluorescentne proteine (npr. mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) i narandžaste fluorescentne proteine (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) ili bilo koje druge odgovarajuće fluorescentne proteine. U drugim slučajevima, domen markera može biti oznaka za prečišćavanje i/ili oznaka epitopa. Neograničavajući primeri oznaka uključuju glutation-S-transferazu (GST), protein koji vezuje hitin (CBP), protein koji vezuje maltozu (MBP), tioredoksin (TRX), poli(NANP), oznaku za tandemsko afinitetno prečišćavanje (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, biotin-karboksilni proteinski nosač (BCCP), poli-His i kalmodulin. Neograničavajući primeri reporterskih gena uključuju glutation-S-transferazu (GST), peroksidazu rena (HRP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), beta-galaktozidazu, beta-glukuronidazu, luciferazu ili fluorescentne proteine.
[0031] U dodatnim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da usmeri RNK-vođeni DNK-vezujući agens na specifičnu organelu, tip ćelije, tkivo ili organ. U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da usmeri RNK-vođeni DNK-vezujući agens na mitohondrije.
[0032] U daljim slučajevima, heterologni funkcionalni domen može da bude efektorski domen. Kada je RNK-vođeni DNK-vezujući agens usmeren na svoju ciljnu sekvencu, npr. kada je Cas nukleaza usmerena na ciljnu sekvencu pomoću gRNK, efektorski domen može da modifikuje ili utiče na ciljnu sekvencu. U nekim slučajevima, efektorski domen može da bude izabran između domena za vezivanje nukleinske kiseline, domena nukleaze (npr. domena nukleaze različitog od Cas), domena epigenetičke modifikacije, domena aktivacije transkripcije ili domena represora transkripcije. U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen je nukleaza, kao što je FokI nukleaza. Videti, npr. SAD pat. br. 9,023,649. U nekim slučajevima, heterologni funkcionalni domen je aktivator ili represor transkripcije. Videti, npr. Qi et al., „Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression,“ Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera et al., „RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,“ Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., „CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,“ Nat. Biotechnol.
31:833-8 (2013); Gilbert et al., „CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,“ Cell 154:442-51 (2013). Kao takav, RNK-vođeni DNK-vezujući agens u suštini postaje transkripcioni faktor koji može da se usmeri da vezuje željenu ciljnu sekvencu korišćenjem vodič RNK. U određenim slučajevima, domen modifikacije DNK je metilacioni domen, kao što je demetilacioni ili metiltransferazni domen. U određenim slučajevima, efektorski domen je domen modifikacije DNK, kao što je domen za editovanje baza. U posebnim slučajevima, domen modifikacije DNK je domen za editovanje nukleinske kiseline koji uvodi specifičnu modifikaciju u DNK, kao što je deaminazni domen. Videti, npr. WO 2015/089406; U.S.
2016/0304846.
[0033] Nukleaza može da sadrži najmanje jedan domen koji je u interakciji sa molekulom vodič RNK („gRNK“). Dodatno, nukleaza može da bude usmerena na ciljnu sekvencu pomoću gRNK. U sistemima Cas nukleaze klase 2, gRNK stupa u interakciju sa nukleazom kao i sa ciljnom sekvencom, tako da usmerava vezivanje za ciljnu sekvencu. U nekim slučajevima, gRNK obezbeđuje specifičnost za ciljano isecanje, a nukleaza može da bude univerzalna i uparena sa različitim gRNK za isecanje različitih ciljnih sekvenci. Cas nukleaza klase 2 može da se upari sa strukturom skafolda gRNK gore navedenih tipova, ortologa i ilustrativnih vrsta.
Vodič RNK (gRNK)
[0034] U nekim slučajevima ovog otkrića, kargo za formulaciju LNP uključuje najmanje jednu gRNK. gRNK može da vodi Cas nukleazu ili Cas nukleazu klase 2 do ciljne sekvence na ciljnom molekulu nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, gRNK se vezuje i obezbeđuje specifičnost isecanja pomoću Cas nukleaze klase 2. U nekim slučajevima, gRNK i Cas nukleaza mogu da formiraju ribonukleoprotein (RNP), npr. kompleks CRISPR/Cas kao što je kompleks CRISPR/Cas9 koji može da bude isporučen pomoću kompozicije LNP. U nekim slučajevima, kompleks CRISPR/Cas može da bude kompleks CRISPR/Cas9 tipa II. U nekim slučajevima, kompleks CRISPR/Cas može da bude kompleks CRISPR/Cas tipa V, kao što je kompleks Cpf1/vodič RNK. Cas nukleaze i srodne gRNK mogu da budu uparene. Strukture skafolda gRNK koje se uparuju sa svakom Cas nukleazom klase 2 variraju u zavisnosti od specifičnog sistema CRISPR/Cas.
[0035] „Vodič RNK“, „gRNK“ i jednostavno „vodič“ se ovde koriste naizmenično da označe crRNK (takođe poznatu kao CRISPR RNK), ili kombinaciju crRNK i trRNK (takođe poznatu kao tracrRNK). crRNK i trRNK mogu da budu spojene u jedan molekul RNK (jedinstvena vodič RNK, sgRNK) ili da predstavljaju dva odvojena molekula RNK (dvojna vodič RNK, dgRNK). „Vodič RNK“ ili „gRNK“ se odnosi na oba tipa. trRNK može da bude prirodna sekvenca ili trRNK sekvenca sa modifikacijama ili varijacijama u poređenju sa prirodnim sekvencama.
[0036] Kako se ovde koristi, „sekvenca vodiča“ se odnosi na sekvencu unutar vodič RNK koja je komplementarna ciljnoj sekvenci i funkcioniše tako što usmerava vodič RNK ka ciljnoj sekvenci zbog vezivanja ili modifikacije (npr. isecanja) pomoću RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa. „Sekvenca vodiča“ se takođe može nazvati „usmeravajuća sekvenca“ ili „sekvenca spejsera“. Sekvenca vodiča može da ima dužinu od 20 parova baza, npr. u slučaju Streptococcus pyogenes (tj. Spy Cas9) i srodnih homologa/ortologa Cas9. Kraće ili duže sekvence se takođe mogu koristiti kao vodiči, npr. dužine 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleotida. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca je u genu ili na hromozomu, na primer, i komplementarna je sekvenci vodiča. U nekim slučajevima, stepen komplementarnosti ili identičnosti između sekvence vodiča i njene odgovarajuće ciljne sekvence može da bude oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, sekvenca vodiča i ciljni region mogu da budu 100% komplementarni ili identični. U drugim slučajevima, sekvenca vodiča i ciljni region mogu da sadrže najmanje jedno nepodudaranje. Na primer, sekvenca vodiča i ciljna sekvenca mogu da sadrže 1, 2, 3 ili 4 nepodudaranja, pri čemu je ukupna dužina ciljne sekvence najmanje 17, 18, 19, 20 ili više baznih parova. U nekim slučajevima, sekvenca vodiča i ciljni region mogu da sadrže 1-4 nepodudaranja pri čemu sekvenca vodiča sadrži najmanje 17, 18, 19, 20 ili više nukleotida. U nekim slučajevima, sekvenca vodiča i ciljni region mogu da sadrže 1, 2, 3 ili 4 nepodudaranja pri čemu sekvenca vodiča sadrži 20 nukleotida.
[0037] Ciljne sekvence za Cas proteine uključuju i pozitivne i negativne lance genomske DNK (tj. datu sekvencu i reverzni komplement sekvence), budući da je nukleinsko-kiselinski supstrat za Cas protein dvolančana nukleinska kiselina. Shodno tome, kada se kaže da je sekvenca vodiča „komplementarna ciljnoj sekvenci“, to znači da sekvenca vodiča može da usmeri vodič RNK da se veže za reverzni komplement ciljne sekvence. Prema tome, u nekim slučajevima, kada se sekvenca vodiča vezuje za reverzni komplement ciljne sekvence, sekvenca vodiča je identična određenim nukleotidima ciljne sekvence (npr. ciljna sekvenca koja ne uključuje PAM) osim zamene U za T u sekvenci vodiča.
[0038] Dužina usmeravajuće sekvence može da zavisi od sistema CRISPR/Cas i korišćenih komponenti. Na primer, različite Cas nukleaze klase 2 iz različitih bakterijskih vrsta imaju različite optimalne dužine usmeravajućih sekvenci. Shodno tome, usmeravajuća sekvenca može da sadrži 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, ili više od 50 nukleotida u dužini. U nekim slučajevima, dužina usmeravajuće sekvence je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida duža ili kraća od sekvenci vodiča prirodnog sistema CRISPR/Cas. U određenim slučajevima, Cas nukleaza i skafold gRNK će poticati iz istog sistema CRISPR/Cas. U nekim slučajevima, usmeravajuća sekvenca može da sadrži ili da se sastoji od 18-24 nukleotida. U nekim slučajevima, usmeravajuća sekvenca može da sadrži ili da se sastoji od 19-21 nukleotida. U nekim slučajevima, usmeravajuća sekvenca može da sadrži ili da se sastoji od 20 nukleotida.
[0039] U nekim slučajevima, sgRNK je „sgRNK Cas9“ koja ima sposobnost da posreduje u RNK-vođenom isecanju DNK pomoću Cas9 proteina. U nekim slučajevima, sgRNK je „sgRNK Cpf1“ koja ima sposobnost da posreduje u RNK-vođenom isecanju DNK pomoću Cpf1 proteina. U određenim slučajevima, gRNK sadrži crRNK i tracr RNK dovoljne za formiranje aktivnog kompleksa sa Cas9 proteinom i posredovanje u RNK-vođenom isecanju DNK. U određenim slučajevima, gRNK sadrži crRNK dovoljnu za formiranje aktivnog kompleksa sa Cpf1 proteinom i posredovanje u RNK-vođenom isecanju DNK. Videti Zetsche 2015.
[0040] Određeni primeri otkrića takođe opisuju nukleinske kiseline, npr. ekspresione kasete, koje kodiraju ovde opisanu gRNK. Ovde se „nukleinska kiselina vodič RNK“ koristi za označavanje vodič RNK (npr. sgRNK ili dgRNK) i ekspresione kasete za vodič RNK, koja je nukleinska kiselina koja kodira jedan ili više molekula vodič RNK.
[0041] U nekim slučajevima, nukleinska kiselina može da bude molekul DNK. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira crRNK. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira crRNK sadrži usmeravajući sekvencu oivičenu celom, ili delom ponovljene sekvence iz prirodnog sistema CRISPR/Cas. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira tracr RNK. U nekim slučajevima, crRNK i tracr RNK mogu da budu kodirane sa dve odvojene nukleinske kiseline. U drugim slučajevima, crRNK i tracr RNK mogu da budu kodirane jednom nukleinskom kiselinom. U nekim slučajevima, crRNK i tracr RNK mogu da budu kodirane suprotnim lancima jedne nukleinske kiseline. U drugim slučajevima, crRNK i tracr RNK mogu da budu kodirane istim lancem jedne nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK kodira sgRNK. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK kodira sgRNK Cas9 nukleaze. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK kodira sgRNK Cpf1 nukleaze.
[0042] Nukleotidna sekvenca koja kodira vodič RNK može da bude funkcionalno povezana sa najmanje jednom transkripcionom ili regulatornom kontrolnom sekvencom, kao što je promotor, 3' UTR ili 5' UTR. U jednom primeru, promotor može da bude promotor tRNK, npr. tRNK<Lys3>, ili himerna tRNK. Videti Mefferd et al., RNA. 2015 21: 1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res.
2007 35: 2620-2628. U određenim slučajevima, promotor može da prepozna RNK polimeraza III (Pol III). Neograničavajući primeri promotora Pol III takođe uključuju promotore U6 i H1. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira vodič RNK može da bude funkcionalno povezana sa promotorom U6 miša ili čoveka. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK je modifikovana nukleinska kiselina. U određenim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK uključuje modifikovani nukleozid ili nukleotid. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK uključuje modifikaciju 5' kraja, na primer nukleozid ili nukleotid modifikovan tako da stabilizuje i sprečava integraciju nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK sadrži dvolančanu DNK koja ima modifikaciju 5' kraja na svakom lancu. U određenim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK uključuje invertovani dideoksi-T ili invertovani abazni nukleozid ili nukleotid kao modifikaciju 5' kraja. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina gRNK uključuje oznaku kao što su biotin, destiobioten-TEG, digoksigenin i fluorescentni markeri, uključujući, na primer, FAM, ROX, TAMRA i AlexaFluor.
[0043] U određenim slučajevima, više od jedne nukleinske kiseline gRNK, kao što je gRNK, može da se koristi sa sistemom CRISPR/Cas nukleaza. Svaka nukleinska kiselina gRNK može da sadrži drugačiju usmeravajuću sekvencu, tako da sistem CRISPR/Cas iseca više od jedne ciljne sekvence. U nekim slučajevima, jedna ili više gRNK mogu imati ista ili različita svojstva kao što su aktivnost ili stabilnost unutar kompleksa CRISPR/Cas. Kada se koristi više od jedne gRNK, svaka gRNK može da bude kodirana na istoj ili na različitim nukleinskim kiselinama gRNK. Promotori koji se koriste za pokretanje ekspresije više od jedne gRNK mogu da budu isti ili različiti.
Modifikovane RNK
[0044] U određenim slučajevima, kompozicije LNP sadrže modifikovane RNK.
[0045] Modifikovani nukleozidi ili nukleotidi mogu da budu prisutni u RNK, na primer gRNK ili iRNK. gRNK ili iRNK koja sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida, na primer, naziva se „modifikovana“ RNK da bi se opisalo prisustvo jedne ili više neprirodnih i/ili prirodnih komponenti ili konfiguracija koje se koriste umesto, ili kao dodatak kanonskim ostacima A, G, C i U. U nekim slučajevima, modifikovana RNK se sintetiše sa nekanonskim nukleozidom ili nukleotidom, koji se ovde naziva „modifikovanim“.
[0046] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi mogu da uključuju jedno ili više od: (i) izmene, npr. zamene jednog ili oba nevezujuća fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezujućih fosfatnih kiseonika u fosfodiestarskoj vezi osnovnog lanca (ilustrativna modifikacija osnovnog lanca); (ii) izmene, npr. zamene komponente riboznog šećera, npr. 2' hidroksila na riboznom šećeru (ilustrativna modifikacija šećera); (iii) potpune zamene fosfatnog fragmenta „defosfo“ linkerima (ilustrativna modifikacija osnovnog lanca); (iv) modifikacije ili zamene prirodne nukleobaze, uključujući nekanonskom nukleobazom (ilustrativna modifikacija baze); (v) zamene ili modifikacije ribozno-fosfatnog osnovnog lanca (ilustrativna modifikacija osnovnog lanca); (vi) modifikacije 3' kraja ili 5' kraja oligonukleotida, npr. uklanjanje, modifikacija ili zamena terminalne fosfatne grupe ili konjugacija fragmenta, kape ili linkera (takve 3' ili 5' modifikacije kape mogu da sadrže modifikaciju šećera i/ili osnovnog lanca); i (vii) modifikacije ili zamene šećera (ilustrativna modifikacija šećera). Određeni slučajevi uključuju modifikaciju 5' kraja iRNK, gRNK ili nukleinske kiseline. Određeni slučajevi obuhvataju modifikaciju 3' kraja iRNK, gRNK ili nukleinske kiseline. Modifikovana RNK može da sadrži modifikacije 5' kraja i 3' kraja. Modifikovana RNK može da sadrži jedan ili više modifikovanih ostataka na neterminalnim lokacijama. U određenim slučajevima, gRNK uključuje najmanje jedan modifikovani ostatak. U određenim slučajevima, iRNK uključuje najmanje jedan modifikovani ostatak.
[0047] Kako se ovde koristi, smatra se da prva sekvenca „sadrži sekvencu sa najmanje X% identičnosti sa“ drugom sekvencom ako poravnanje prve sekvence sa drugom sekvencom pokazuje da X% ili više pozicija druge sekvence u celoj sekvenci odgovara prvoj sekvenci. Na primer, sekvenca AAGA sadrži sekvencu sa 100% identičnosti sa sekvencom AAG jer bi poravnanje dalo 100% identičnosti u tom smislu što postoje podudaranja sa sve tri pozicije druge sekvence. Razlike između RNK i DNK (uglavnom zamena uridina za timidin ili obrnuto) i prisustvo analoga nukleozida kao što su modifikovani uridini ne doprinose razlikama u identičnosti ili komplementarnosti između polinukleotida, sve dok relevantni nukleotidi (kao što su timidin, uridin, ili modifikovani uridin) imaju isti komplement (npr. adenozin za svaki od timidina, uridina ili modifikovanog uridina; drugi primer su citozin i 5-metilcitozin, od kojih oba imaju guanozin ili modifikovani guanozin kao komplement). Tako, na primer, smatra se da je sekvenca 5'-AXG, gde je X bilo koji modifikovani uridin, kao što je pseudouridin, N1-metil pseudouridin ili 5-metoksiuridin, 100% identična sa AUG u tom smislu što su obe savršeno komplementarne istoj sekvenci (5'-CAU). Primeri algoritama za poravnanje su algoritmi Smith-Waterman i Needleman-Wunsch, koji su dobro poznati u tehnici. Stručnjak u ovoj oblasti će znati koji izbor algoritma i podešavanje parametara su odgovarajući za dati par sekvenci koje treba poravnati; za sekvence generalno slične dužine i očekivane identičnosti >50%, za aminokiseline, ili >75%, za nukleotide, uglavnom je prikladan algoritam Needleman-Wunsch sa podrazumevanim postavkama interfejsa algoritma Needleman-Wunsch datom na internet serveru EBI www.ebi.ac.uk.
iRNK
[0048] U nekim slučajevima, kompozicija ili formulacija koja je ovde otkrivena sadrži iRNK koja obuhvata otvoreni okvir čitanja (ORF) koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens, kao što je Cas nukleaza ili Cas nukleaza klase 2, kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens, kao što je Cas nukleaza ili Cas nukleaza klase 2, se otkriva, koristi ili primenjuje. U nekim slučajevima, ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens je „modifikovani ORF RNK-vođenog DNK-vezujućeg agensa“ ili jednostavno „modifikovani ORF“, što se koristi kao skraćenica da ukaže na to da je ORF modifikovan na jedan ili više od sledećih načina: (1) modifikovani ORF ima sadržaj uridina u rasponu od svog minimalnog sadržaja uridina do 150% minimalnog sadržaja uridina; (2) modifikovani ORF ima sadržaj uridin dinukleotida u rasponu od svog minimalnog sadržaja uridin dinukleotida do 150% minimalnog sadržaja uridin dinukleotida; (3) modifikovani ORF ima najmanje 90% identičnosti sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, ili 66; (4) modifikovani ORF se sastoji od skupa kodona od kojih najmanje 75% kodona predstavljaju kodon(e) sa minimalnim sadržajem uridina za datu aminokiselinu, npr. kodon(e) sa najmanje uridina (obično 0 ili 1 osim kodona za fenilalanin, gde kodon sa minimalnim sadržajem uridina ima 2 uridina); ili (5) modifikovani ORF sadrži najmanje jedan modifikovani uridin. U nekim slučajevima, modifikovani ORF se modifikuje na najmanje dva, tri ili četiri prethodna načina. U nekim slučajevima, modifikovani ORF sadrži najmanje jedan modifikovani uridin i modifikovan je na najmanje jedan, dva, tri ili sve od gore navedenih načina (1)-(4).
[0049] „Modifikovani uridin“ se ovde koristi da označi nukleozid koji nije timidin sa istim akceptorima vodonične veze kao uridin i jednom ili više strukturnih razlika u odnosu na uridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je supstituisani uridin, tj. uridin u kome jedan ili više neprotonskih supstituenata (npr. alkoksi, kao što je metoksi) zauzima mesto protona. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je pseudouridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je supstituisani pseudouridin, tj. pseudouridin u kome jedan ili više ne-protonskih supstituenata (npr. alkil, kao što je metil) zauzima mesto protona. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je bilo koji od supstituisanog uridina, pseudouridina ili supstituisanog pseudouridina.
[0050] „Pozicija uridina“ kako se ovde koristi odnosi se na poziciju u polinukleotidu koju zauzima uridin ili modifikovani uridin. Tako, na primer, polinukleotid u kome su „100% pozicija uridina modifikovani uridini“ sadrži modifikovani uridin na svakoj poziciji koja bi bila uridin u konvencionalnoj RNK (gde su sve baze standardne A, U, C ili G baze) iste sekvence. Osim ako nije drugačije naznačeno, U u polinukleotidnoj sekvenci u tabeli sekvenci ili listi sekvenci koje se nalaze u okviru, ili prate ovo otkriće, može da bude uridin ili modifikovani uridin.
Tabela 1. Kodoni sa minimalnim sadržajem uridina
[0051] U bilo kom od prethodnih slučajeva, modifikovani ORF se može sastojati od skupa kodona od kojih su najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% kodona kodoni navedeni u tabeli kodona sa minimalnim sadržajem uridina. U bilo kom od prethodnih slučajeva, modifikovani ORF može da sadrži sekvencu sa najmanje 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, ili 66.
[0052] U bilo kom od prethodnih slučajeva, modifikovani ORF može da sadrži sekvencu sa najmanje 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, ili 66.
[0053] U bilo kom od prethodnih slučajeva, modifikovani ORF može imati sadržaj urina u rasponu od svog minimalnog sadržaja uridina do 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% ili 101% minimalnog sadržaja uridina.
[0054] U bilo kom od prethodnih slučajeva, modifikovani ORF može imati sadržaj uridin dinukleotida u rasponu od svog minimalnog sadržaja uridin dinukleotida do 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% ili 101% minimalnog sadržaja uridin dinukleotida.
[0055] U bilo kom od prethodnih slučajeva, modifikovani ORF može da sadrži modifikovani uridin najmanje na jednom, većem broju ili na svim pozicijama uridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je uridin modifikovan na poziciji 5, npr. halogenom, metilom ili etilom. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je pseudouridin modifikovan na poziciji 1, npr. halogenom, metilom ili etilom. Modifikovani uridin može da bude, na primer, pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 5-metoksiuridin, 5-joduridin ili njihova kombinacija. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je 5-metoksiuridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je 5-jodouridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je pseudouridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je N1-metil-pseudouridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija pseudouridina i N1-metil-pseudouridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija pseudouridina i 5-metoksiuridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija N1-metil pseudouridina i 5-metoksiuridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija 5-joduridina i N1-metil-pseudouridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija pseudouridina i 5-jodouridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija 5-jodouridina i 5-metoksiuridina.
[0056] U nekim slučajevima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% pozicija uridina u iRNK prema otkriću su modifikovani uridini. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u iRNK prema otkriću su modifikovani uridini, npr. 5-metoksiuridin, 5-joduridin, N1-metil pseudouridin, pseudouridin ili njihova kombinacija. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u iRNK prema otkriću su 5-metoksiuridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u iRNK prema otkriću su pseudouridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 8595%, ili 90-100% pozicija uridina u iRNK prema otkriću su N1-metil pseudouridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u iRNK prema otkriću su 5-joduridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u iRNK prema otkriću su 5-metoksiuridin, a ostatak je N1-metil pseudouridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u iRNK prema pronalasku su 5-joduridin, a ostatak je N1-metil pseudouridin.
[0057] U bilo kom od prethodnih slučajeva, modifikovani ORF može da sadrži smanjeni sadržaj uridin dinukleotida, kao što je najniži mogući sadržaj uridin dinukleotida (UU), npr. ORF koji (a) koristi kodon sa minimalnim sadržajem uridina (kao što je diskutovano gore) na svakoj poziciji i (b) kodira istu aminokiselinsku sekvencu kao dati ORF. Sadržaj uridin dinukleotida (UU) može se izraziti u apsolutnim jedinicama kao broj UU dinukleotida u ORF ili na bazi stope kao procenat pozicija koje zauzimaju uridini u uridin dinukleotidima (na primer, AUUAU bi imao sadržaj uridin dinukleotida od 40% jer 2 od 5 pozicija zauzimaju uridini u uridin dinukleotidima). Modifikovani ostaci uridina se smatraju ekvivalentnim uridinima u svrhu procene minimalnog sadržaja uridin dinukleotida.
[0058] U nekim slučajevima, iRNK sadrži najmanje jedan UTR iz eksprimirane iRNK sisara, kao što je konstitutivno eksprimirana iRNK. Smatra se da je iRNK konstitutivno eksprimirana kod sisara ako se kontinuirano transkribuje u najmanje jednom tkivu zdravog odraslog sisara. U nekim slučajevima, iRNK sadrži 5' UTR, 3' UTR ili 5' i 3' UTR iz eksprimirane RNK sisara, kao što je konstitutivno eksprimirana iRNK sisara. Primer konstitutivno eksprimirane iRNK predstavlja iRNK aktina.
[0059] U nekim slučajevima, iRNK sadrži najmanje jedan UTR iz hidroksisteroid 17-beta dehidrogenaze 4 (HSD17B4 ili HSD), na primer, 5' UTR iz HSD. U nekim slučajevima, iRNK sadrži najmanje jedan UTR iz iRNK globina, na primer, iRNK humanog alfa globina (HBA), iRNK humanog beta globina (HBB) ili iRNK beta globina Xenopus laevis (XBG). U nekim slučajevima, iRNK sadrži 5' UTR, 3' UTR ili 5' i 3' UTR iz iRNK globina, kao što su HBA, HBB ili XBG. U nekim slučajevima, iRNK sadrži 5' UTR iz goveđeg hormona rasta, citomegalovirusa (CMV), mišjeg Hba-a1, HSD, gena za albumin, HBA, HBB ili XBG. U nekim slučajevima, iRNK sadrži 3' UTR iz goveđeg hormona rasta, citomegalovirusa, mišjeg Hba-a1, HSD, gena za albumin, HBA, HBB ili XBG. U nekim slučajevima, iRNK sadrži 5' i 3' UTR iz goveđeg hormona rasta, citomegalovirusa, mišjeg Hba-a1, HSD, gena za albumin, HBA, HBB, XBG, proteina toplotnog šoka 90 (Hsp90), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), beta-aktina, alfa-tubulina, tumorskog proteina (p53) ili receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR).
[0060] U nekim slučajevima, iRNK sadrži 5' i 3' UTR koji su iz istog izvora, na primer, konstitutivno eksprimirane iRNK kao što je aktin, albumin ili globin kao što su HBA, HBB ili XBG.
[0061] U nekim slučajevima, iRNK ne sadrži 5' UTR, npr. nema dodatnih nukleotida između 5' kape i startnog kodona. U nekim slučajevima, iRNK sadrži Kozak sekvencu (opisanu u nastavku) između 5' kape i startnog kodona, ali nema nikakav dodatni 5' UTR. U nekim slučajevima, iRNK ne sadrži 3' UTR, npr. nema dodatnih nukleotida između stop kodona i poli-A repa.
[0062] U nekim slučajevima, iRNK sadrži Kozak sekvencu. Kozak sekvenca može da utiče na inicijaciju translacije i na ukupan prinos polipeptida translatiranog sa iRNK. Kozak sekvenca uključuje kodon metionina koji može da funkcioniše kao startni kodon. Minimalna Kozak sekvenca je NNNRUGN pri čemu je najmanje jedno od sledećeg tačno: prvi N je A ili G, a drugi N je G. U kontekstu nukleotidne sekvence, R označava purin (A ili G). U nekim slučajevima, Kozak sekvenca je RNNRUGN, NNNRUGG, RNNRUGG, RNNAUGN, NNNAUGG ili RNNAUGG. U nekim slučajevima, Kozak sekvenca je rccRUGg sa nula nepodudaranja ili sa do jednim ili dva nepodudaranja sa pozicijama označenim malim slovima. U nekim slučajevima, Kozak sekvenca je rccAUGg sa nula nepodudaranja ili sa do jednim ili dva nepodudaranja sa pozicijama označenim malim slovima. U nekim slučajevima, Kozak sekvenca je gccRccAUGG sa nula nepodudaranja ili sa do jednim, dva ili tri nepodudaranja sa pozicijama označenim malim slovima. U nekim slučajevima, Kozak sekvenca je gccAccAUG sa nula nepodudaranja ili sa do jednim, dva, tri ili četiri nepodudaranja sa pozicijama označenim malim slovima. U nekim slučajevima, Kozak sekvenca je GCCACCAUG. U nekim slučajevima, Kozak sekvenca je gccgccRccAUGG sa nula nepodudaranja ili sa do jednim, dva, tri ili četiri nepodudaranja sa pozicijama označenim malim slovima.
[0063] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 43, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 43 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, ili 66.
[0064] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 44, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 44 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0065] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 56, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 56 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0066] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 57, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 57 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0067] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO:, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 58 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0068] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 59, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 59 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0069] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 60, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 60 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0070] U nekim slučajevima, iRNK koja sadrži ORF koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 61, pri čemu je opciono ORF sekvence SEQ ID NO: 61 (tj. SEQ ID NO: 4) supstituisan alternativnim ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0071] U nekim slučajevima, iRNK sadrži alternativni ORF bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ili 66.
[0072] U nekim slučajevima, stepen identičnosti sa opciono supstituisanim sekvencama SEQ ID NO 43, 44 ili 56-61 je 95%. U nekim slučajevima, stepen identičnosti sa opciono supstituisanim sekvencama SEQ ID NO 43, 44 ili 56-61 je 98%. U nekim slučajevima, stepen identičnosti sa opciono supstituisanim sekvencama SEQ ID NO 43, 44 ili 56-61 je 99%. U nekim slučajevima, stepen identičnosti sa opciono supstituisanim sekvencama SEQ ID NO 43, 44 ili 56-61 je 100%.
[0073] U nekim slučajevima, iRNK koja je ovde otkrivena sadrži 5' kapu, kao što je Cap0, Cap1 ili Cap2.5' kapa je generalno 7-metilguanin ribonukleotid (koji se može dalje modifikovati, kao što je diskutovano u nastavku, npr. u pogledu ARCA) vezan preko 5'-trifosfata za 5' poziciju prvog nukleotida 5'-ka- 3' lanca iRNK, tj. prvog nukleotida proksimalno kapi. U Cap0, obe riboze prvog i drugog nukleotida proksimalno kapi u iRNK sadrže 2'-hidroksil. U Cap1, riboze prvog i drugog transkribovanog nukleotida u iRNK sadrže 2'-metoksi, odnosno 2'-hidroksil. U Cap2, obe riboze prvog i drugog nukleotida proksimalno kapi u iRNK sadrže 2'-metoksi. Videti, npr. Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115. Većina endogenih iRNK viših eukariota, uključujući iRNK sisara, kao što su humane iRNK, sadrži Cap1 ili Cap2. Cap0 i druge strukture kape koje se razlikuju od Cap1 i Cap2 mogu da budu imunogene kod sisara, kao što su ljudi, zbog prepoznavanja kao „nesopstvenog“ od strane komponenti urođenog imunog sistema kao što su IFIT-1 i IFIT-5, što može dovesti do povišenih nivoa citokina uključujući interferon tipa I. Komponente urođenog imunog sistema kao što su IFIT-1 i IFIT-5 takođe mogu da kompetiraju sa eIF4E za vezivanje iRNK sa kapom koja nije Cap1 ili Cap2, potencijalno inhibirajući translaciju iRNK.
[0074] Kapa može da se dodaje istovremeno sa transkripcijom. Na primer, ARCA (antireverzni analog kape; Thermo Fisher Scientific kat. br. AM8045) je analog kape koji sadrži 7-metilguanin 3'-metoksi-5'-trifosfat vezan za 5' poziciju guaninskog ribonukleotida koji može da bude ugrađen in vitro u transkript pri inicijaciji. ARCA rezultuje kapom Cap0 u kojoj je 2' pozicija prvog nukleotida proksimalno kapi hidroksil. Videti, npr. Stepinski et al., (2001) „Synthesis and properties of mRNAs containing the novel ’anti-reverse’ cap analogs 7-methyl(3’-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3’deoxy)GpppG,“ RNA 7: 1486-1495. Struktura ARCA je prikazana ispod.
[0075] Za ko-transkripciono dodavanje strukture Cap1 mogu da se koriste CleanCap<™>AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies kat. br. N-7113) ili CleanCap<™>GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies kat. br. N-7133).3'-O-metilovane verzije CleanCap<™>AG i CleanCap<™>GG su takođe dostupne kod TriLink Biotechnologies kao kat. br. N-7413, odnosno N-7433. Struktura CleanCap<™>AG je prikazana ispod.
[0076] Alternativno, kapa može da se doda na RNK nakon transkripcije. Na primer, enzim vakcinije za dodavanje kape je komercijalno dostupan (New England Biolabs kat. br. M2080S) i ima aktivnost RNK trifosfataze i guanililtransferaze, koje obezbeđuje njegova D1 subjedinica, i guanin metiltransferaze, koju obezbeđuje njegova D12 subjedinica. Kao takav, on može da doda 7-metilguanin na RNK, tako da se dobije Cap0, u prisustvu S-adenozil metionina i GTP. Videti, npr. Guo, P. and Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. and Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem.269, 24472-24479.
[0077] U nekim slučajevima, iRNK dalje sadrži poli-adenilovani (poli-A) rep. U nekim slučajevima, poli-A rep sadrži najmanje 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 adenina, opciono do 300 adenina. U nekim slučajevima, poli-A rep sadrži 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 adeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, poli-A rep je „prekinut“ jednim ili većim brojem neadeninskih nukleotidnih „sidara“ na jednoj ili više lokacija unutar poli-A repa. Poli-A repovi mogu da sadrže najmanje 8 uzastopnih adeninskih nukleotida, ali takođe sadrže jedan ili više neadeninskih nukleotida. Kako se ovde koristi, termin „neadeninski nukleotidi“ se odnosi na bilo koje prirodne ili neprirodne nukleotide koji ne sadrže adenin. Guaninski, timinski i citozinski nukleotidi su primeri neadeninskih nukleotida. Prema tome, poli-A repovi na iRNK opisanoj ovde mogu da sadrže uzastopne adeninske nukleotide koji se nalaze 3' do nukleotida koji kodiraju RNK-vođeni DNK-vezujući agens ili sekvencu od interesa. U nekim slučajevima, poli-A repovi na iRNK sadrže neuzastopne adeninske nukleotide koji se nalaze 3' od nukleotida koji kodiraju RNK-vođeni DNK-vezujući agens ili sekvencu od interesa, pri čemu neadeninski nukleotidi prekidaju adeninske nukleotide na ravnomerno ili neravnomerno razmaknutim intervalima.
[0078] U nekim slučajevima, iRNK dalje sadrži poli-adenilovani (poli-A) rep. U nekim slučajevima, poli-A rep sadrži najmanje 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 adenina, opciono do 300 adenina. U nekim slučajevima, poli-A rep sadrži 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 adeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, poli-A rep je „prekinut“ jednim ili većim brojem neadeninskih nukleotidnih „sidara“ na jednoj ili više lokacija unutar poli-A repa. Poli-A repovi mogu da sadrže najmanje 8 uzastopnih adeninskih nukleotida, ali takođe sadrže jedan ili više neadeninskih nukleotida. Kako se ovde koristi, termin „neadeninski nukleotidi“ se odnosi na bilo koje prirodne ili neprirodne nukleotide koji ne sadrže adenin. Guaninski, timinski i citozinski nukleotidi su primeri neadeninskih nukleotida. Prema tome, poli-A repovi na iRNK opisanoj ovde mogu da sadrže uzastopne adeninske nukleotide koji se nalaze 3' do nukleotida koji kodiraju RNK-vođeni DNK-vezujući agens ili sekvencu od interesa. U nekim slučajevima, poli-A repovi na iRNK sadrže neuzastopne adeninske nukleotide koji se nalaze 3' od nukleotida koji kodiraju RNK-vođeni DNK-vezujući agens ili sekvencu od interesa, pri čemu neadeninski nukleotidi prekidaju adeninske nukleotide na ravnomerno ili neravnomerno razmaknutim intervalima.
[0079] U nekim slučajevima, jedan ili više neadeninskih nukleotida su postavljeni tako da prekidaju uzastopne adeninske nukleotide tako da poli(A) vezujući protein može da se veže za niz uzastopnih adeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, jedan ili više neadeninskih nukleotida se nalazi posle najmanje 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih adeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, jedan ili više neadeninskih nukleotida se nalazi posle najmanje 8-50 uzastopnih adenin nukleotida. U nekim slučajevima, jedan ili više neadeninskih nukleotida se nalazi posle najmanje 8-100 uzastopnih adeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, neadeninski nukleotid je smešten posle jednog, dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam adeninskih nukleotida, a prati ga najmanje 8 uzastopnih adeninskih nukleotida.
[0080] Poli-A rep može da sadrži jednu sekvencu uzastopnih adeninskih nukleotida praćenih jednim ili većim brojem neadeninskih nukleotida, opciono praćenim dodatnim adeninskim nukleotidima.
[0081] U nekim slučajevima, poli-A rep sadrži ili uključuje jedan neadeninski nukleotid ili jedan uzastopni niz od 2-10 neadeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, neadeninski nukleotid(i) se nalaze posle najmanje 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih adeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, jedan ili više neadeninskih nukleotida se nalaze posle najmanje 8-50 uzastopnih adeninskih nukleotida. U nekim slučajevima, jedan ili više neadeninskih nukleotida se nalaze posle najmanje 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50 uzastopnih adeninskih nukleotida.
[0082] U nekim slučajevima, neadeninski nukleotid je guanin, citozin ili timin. U nekim slučajevima, neadeninski nukleotid je guaninski nukleotid. U nekim slučajevima, neadeninski nukleotid je citozinski nukleotid. U nekim slučajevima, neadeninski nukleotid je timinski nukleotid. U nekim slučajevima, gde je prisutno više od jednog neadeninskog nukleotida, neadeninski nukleotid se može izabrati između: a) nukleotida guanina i timina; b) nukleotida guanina i citozina; v) nukleotida timina i citozina; ili d) nukleotida guanina, timina i citozina. Primer poli-A repa koji sadrži neadeninske nukleotide je otkriven kao SEQ ID NO: 62.
[0083] U nekim slučajevima, iRNK je prečišćena. U nekim slučajevima, iRNK se prečišćava metodom precipitacije (npr. precipitacija pomoću LiCl, alkoholna precipitacija ili ekvivalentna metoda, npr. kao što je ovde opisano). U nekim slučajevima, iRNK se prečišćava metodom zasnovanom na hromatografiji, kao što je metoda zasnovana na HPLC ili ekvivalentna metoda (npr. kao što je ovde opisano). U nekim slučajevima, iRNK se prečišćava korišćenjem obe, metode precipitacije (npr. precipitacija pomoću LiCl) i metode zasnovane na HPLC.
[0084] U nekim slučajevima, najmanje jedna gRNK je obezbeđena u kombinaciji sa iRNK koja je ovde otkrivena. U nekim slučajevima, gRNK je obezbeđena kao molekul odvojen od iRNK. U nekim slučajevima, gRNK je obezbeđena kao deo, kao što je deo UTR, iRNK koja je ovde otkrivena.
Hemijski modifikovana gRNK
[0085] U nekim slučajevima, gRNK je hemijski modifikovana. gRNK koja sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida naziva se „modifikovana“ gRNK ili „hemijski modifikovana“ gRNK, da bi se opisalo prisustvo jedne ili više neprirodnih i/ili prirodnih komponenti ili konfiguracija koje se koriste umesto ili pored kanonskih ostataka A, G, C i U. U nekim slučajevima, modifikovana gRNK koja se sintetiše sa nekanonskim nukleozidom ili nukleotidom, ovde se naziva „modifikovanom“. Modifikovani nukleozidi i nukleotidi mogu da uključuju jedno ili više od: (i) izmene, npr. zamene jednog ili oba nevezujuća fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezujućih fosfatnih kiseonika u fosfodiestarskoj vezi osnovnog lanca (ilustrativna modifikacija osnovnog lanca); (ii) izmene, npr. zamene komponente riboznog šećera, npr. 2' hidroksila na riboznom šećeru (ilustrativna modifikacija šećera); (iii) potpune zamene fosfatnog fragmenta „defosfo“ linkerima (ilustrativna modifikacija osnovnog lanca); (iv) modifikacije ili zamene prirodne nukleobaze, uključujući nekanonsku nukleobazu (ilustrativna modifikacija baze); (v) zamene ili modifikacije ribozno-fosfatnog osnovnog lanca (ilustrativna modifikacija osnovnog lanca); (vi) modifikacije 3' kraja ili 5' kraja oligonukleotida, npr. uklanjanje, modifikacija ili zamena terminalne fosfatne grupe ili konjugacija fragmenta, kape ili linkera (takve 3' ili 5' modifikacije kape mogu da sadrže modifikaciju šećera i/ili osnovnog lanca); i (vii) modifikacije ili zamene šećera (ilustrativna modifikacija šećera).
[0086] U nekim slučajevima, gRNK sadrži modifikovani uridin na nekim ili svim pozicijama uridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je uridin modifikovan na poziciji 5, npr. halogenom ili C1-C6 alkoksi. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je pseudouridin modifikovan na poziciji 1, npr. C1-C6 alkilom. Modifikovani uridin može da bude, na primer, pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 5-metoksiuridin, 5-joduridin ili njihova kombinacija. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je 5-metoksiuridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je 5-jodouridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je pseudouridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je N1-metil-pseudouridin. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija pseudouridina i N1-metil-pseudouridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija pseudouridina i 5-metoksiuridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija N1-metil pseudouridina i 5-metoksiuridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija 5-joduridina i N1-metil-pseudouridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija pseudouridina i 5-jodouridina. U nekim slučajevima, modifikovani uridin je kombinacija 5-jodouridina i 5-metoksiuridina.
[0087] U nekim slučajevima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su modifikovani uridini. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su modifikovani uridini, npr., 5-metoksiuridin, 5-joduridin, N1-metil pseudouridin, pseudouridin ili njihova kombinacija. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su 5-metoksiuridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su pseudouridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su N1-metil pseudouridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su 5-jodouridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su 5-metoksiuridin, a ostatak je N1-metil pseudouridin. U nekim slučajevima, 10%-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ili 90-100% pozicija uridina u gRNK prema otkriću su 5-joduridin, a ostatak je N1-metil pseudouridin.
[0088] Hemijske modifikacije kao što su one gore navedene mogu da se kombinuju da bi se dobile modifikovane gRNK koje sadrže nukleozide i nukleotide (zajednički nazvane „ostaci“) koji mogu da imaju dve, tri, četiri ili više modifikacija. Na primer, modifikovani ostatak može da ima modifikovani šećer i modifikovanu nukleobazu. U nekim slučajevima, svaka baza gRNK je modifikovana, npr. sve baze imaju modifikovanu fosfatnu grupu, kao što je fosforotioatna grupa. U određenim slučajevima, sve, ili suštinski sve, fosfatne grupe molekula gRNK su zamenjene fosforotioatnim grupama. U nekim slučajevima, modifikovane gRNK sadrže najmanje jedan modifikovani ostatak na, ili blizu 5' kraja RNK. U nekim slučajevima, modifikovane gRNK sadrže najmanje jedan modifikovani ostatak na, ili blizu 3' kraja RNK.
[0089] U nekim slučajevima, gRNK sadrži jedan, dva, tri ili više modifikovanih ostataka. U nekim slučajevima, najmanje 5% (npr. najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili 100%) pozicija u modifikovanoj gRNK su modifikovani nukleozidi ili nukleotidi.
[0090] Nemodifikovane nukleinske kiseline mogu da budu sklone degradaciji, npr. intracelularne nukleaze ili one koje se nalaze u serumu. Na primer, nukleaze mogu da hidrolizuju fosfodiestarske veze nukleinske kiseline. Shodno tome, u jednom aspektu gRNK opisane ovde mogu da sadrže jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida, npr. da bi se uvela stabilnost prema intracelularnim ili serumskim nukleazama. U nekim slučajevima, ovde opisani modifikovani molekuli gRNK mogu da ispolje smanjeni urođeni imuni odgovor kada se unesu u populaciju ćelija, i in vivo i ex vivo. Termin „urođeni imuni odgovor“ uključuje ćelijski odgovor na egzogene nukleinske kiseline, uključujući jednolančane nukleinske kiseline, što uključuje indukciju ekspresije i oslobađanja citokina, posebno interferona, i ćelijsku smrt.
[0091] U nekim slučajevima modifikacije osnovnog lanca, fosfatna grupa modifikovanog ostatka može da bude modifikovana zamenom jednog ili više kiseonika različitim supstituentom. Dalje, modifikovani ostatak, npr. modifikovani ostatak prisutan u modifikovanoj nukleinskoj kiselini, može da uključuje potpunu zamenu nemodifikovanog fosfatnog fragmenta modifikovanom fosfatnom grupom kao što je ovde opisano. U nekim slučajevima, modifikacija osnovnog lanca fosfatnog osnovnog lanca može da uključuje izmene koje rezultuju ili nenaelektrisanim linkerom ili naelektrisanim linkerom sa nesimetričnom raspodelom naelektrisanja.
[0092] Primeri modifikovanih fosfatnih grupa uključuju fosforotioat, fosforoselenate, borano fosfate, borano fosfatne estre, hidrogen fosfonate, fosforoamidate, alkil ili aril fosfonate i fosfotriestre. Atom fosfora u nemodifikovanoj fosfatnoj grupi je ahiralan. Međutim, zamena jednog od nepremošćujućih kiseonika jednim od gore navedenih atoma ili grupa atoma može učiniti atom fosfora hiralnim. Stereogeni atom fosfora može imati ili „R“ konfiguraciju (ovde Rp) ili „S“ konfiguraciju (ovde Sp). Osnovni lanac takođe može da se modifikuje zamenom premošćujućeg kiseonika, (tj. kiseonika koji povezuje fosfat sa nukleozidom), azotom (premošćeni fosforoamidati), sumporom (premošćeni fosforotioati) i ugljenikom (premošćeni metilenfosfonati). Zamena se može desiti bilo na vezujućem kiseoniku ili na oba vezujuća kiseonika.
[0093] Fosfatna grupa može da bude zamenjena konektorima koji ne sadrže fosfor u određenim modifikacijama osnovnog lanca. U nekim slučajevima, naelektrisana fosfatna grupa može da bude zamenjena neutralnim fragmentom. Primeri fragmenata koji mogu zameniti fosfatnu grupu mogu da uključuju, bez ograničenja, npr. metil fosfonat, hidroksilamino, siloksan, karbonat, karboksimetil, karbamat, amid, tioetar, etilen oksidni linker, sulfonat, sulfonamid, tioformacetal, formacetal, oksim, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo i metilenoksimetilimino.
Matrična nukleinska kiselina
[0094] Kompozicije i postupci koji su ovde otkriveni mogu da uključuju matričnu nukleinsku kiselinu. Matrica može da se koristi za izmenu ili inserciju sekvence nukleinske kiseline na, ili blizu ciljnog mesta za Cas nukleazu. U nekim slučajevima, postupci uključuju uvođenje matrice u ćeliju. U nekim slučajevima može da bude obezbeđena jedna matrica. U drugim slučajevima, mogu da se obezbede dve ili više matrica, tako da editovanje može da se odvija na dve ili više ciljnih lokacija. Na primer, mogu se obezbediti različite matrice za editovanje jednog gena u ćeliji ili dva različita gena u ćeliji.
[0095] U nekim slučajevima, matrica može da se koristi u homolognoj rekombinaciji. U nekim slučajevima, homologna rekombinacija može dovesti do integracije sekvence matrice ili dela sekvence matrice u ciljni molekul nukleinske kiseline. U drugim slučajevima, matrica može da se koristi za popravku usmerenu homologijom, koja uključuje uvođenje DNK lanca na mestu isecanja u nukleinskoj kiselini. U nekim slučajevima, popravka usmerena homologijom može da rezultuje uključivanjem sekvence matrice u uređeni ciljni molekul nukleinske kiseline. U drugim slučajevima, matrica može da se koristi u editovanju gena posredovanom nehomolognim spajanjem krajeva. U nekim slučajevima, sekvenca matrice nema sličnosti sa sekvencom nukleinske kiseline blizu mesta isecanja. U nekim slučajevima, matrica ili deo sekvence matrice je ugrađen. U nekim slučajevima, matrica uključuje sekvence bočnog invertovanog terminalnog ponovka (ITR).
[0096] U nekim slučajevima, matrica može da sadrži prvi krak homologije i drugi krak homologije (koji se takođe naziva prva i druga nukleotidna sekvenca) koji su komplementarni sekvencama koje se nalaze uzvodno, odnosno nizvodno od mesta isecanja. Kada matrica sadrži dva kraka homologije, svaki krak može da bude iste dužine ili različite dužine, a sekvenca između krakova homologije može da bude suštinski slična ili identična ciljnoj sekvenci između krakova homologije, ili može da bude potpuno nepovezana. U nekim slučajevima, stepen komplementarnosti ili procenat identičnosti između prve nukleotidne sekvence na matrici i sekvence uzvodno od mesta isecanja, i između druge nukleotidne sekvence na matrici i sekvence nizvodno od mesta isecanja, može dozvoliti homolognu rekombinaciju, kao što je, npr. homologna rekombinacija visoke vernosti, između matrice i ciljnog molekula nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, stepen komplementarnosti može da bude oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100%. U nekim slučajevima, stepen komplementarnosti može da bude oko 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, stepen komplementarnosti može da bude najmanje 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, stepen komplementarnosti može da bude 100%. U nekim slučajevima, procenat identičnosti može da bude oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, procenat identičnosti može da bude oko 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, procenat identičnosti može da bude najmanje 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, procenat identičnosti može da bude 100%.
[0097] U nekim slučajevima, sekvenca matrice može da odgovara, sadrži ili se sastoji od endogene sekvence ciljne ćelije. Takođe, ili alternativno, može da odgovara, sadrži ili se sastoji od egzogene sekvence ciljne ćelije. Kako se ovde koristi, termin „endogena sekvenca“ se odnosi na sekvencu koja je nativna za ćeliju. Termin „egzogena sekvenca“ odnosi se na sekvencu koja nije nativna za ćeliju, ili na sekvencu čija je nativna lokacija u genomu ćelije na drugoj lokaciji. U nekim slučajevima, endogena sekvenca može da bude genomska sekvenca ćelije. U nekim slučajevima, endogena sekvenca može da bude hromozomska ili ekstrahromozomska sekvenca. U nekim slučajevima, endogena sekvenca može da bude plazmidna sekvenca ćelije. U nekim slučajevima, sekvenca matrice može da bude suštinski identična delu endogene sekvence u ćeliji na, ili blizu mesta isecanja, ali da sadrži najmanje jednu promenu nukleotida. U nekim slučajevima, editovanje isečenog ciljnog molekula nukleinske kiseline pomoću matrice može dovesti do mutacije koja obuhvata inserciju, deleciju ili supstituciju jednog ili više nukleotida ciljnog molekula nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, mutacija može dovesti do promene jedne ili više aminokiselina u proteinu koji se eksprimira sa gena koji sadrži ciljnu sekvencu. U nekim slučajevima, mutacija može dovesti do jedne ili više nukleotidnih promena u RNK koja se eksprimira sa ciljnog gena. U nekim slučajevima, mutacija može da promeni nivo ekspresije ciljnog gena. U nekim slučajevima, mutacija može dovesti do povećane ili smanjene ekspresije ciljnog gena. U nekim slučajevima, mutacija može dovesti do utišavanja (eng. – knock-down) gena. U nekim slučajevima, mutacija može dovesti do inaktivacije (eng. – knock-out) gena. U nekim slučajevima, mutacija može dovesti do obnavljanja funkcije gena. U nekim slučajevima, editovanje isečenog ciljnog molekula nukleinske kiseline pomoću matrice može dovesti do promene sekvence egzona, sekvence introna, regulatorne sekvence, sekvence za kontrolu transkripcije, sekvence za kontrolu translacije, mesta splajsovanja ili nekodirajuće sekvence ciljnog molekula nukleinske kiseline, kao što je DNK.
[0098] U drugim slučajevima, sekvenca matrice može da sadrži egzogenu sekvencu. U nekim slučajevima, egzogena sekvenca može da sadrži sekvencu koja kodira protein ili RNK funkcionalno povezanu sa egzogenom promotorskom sekvencom tako da, nakon integracije egzogene sekvence u ciljni molekul nukleinske kiseline, ćelija može da eksprimira protein ili RNK koju kodira integrisana sekvenca. U drugim slučajevima, nakon integracije egzogene sekvence u ciljni molekul nukleinske kiseline, ekspresija integrisane sekvence može da bude regulisana endogenom promotorskom sekvencom. U nekim slučajevima, egzogena sekvenca može da obezbedi cDNK sekvencu koja kodira protein ili deo proteina. U sledećim slučajevima, egzogena sekvenca može da sadrži ili da se sastoji od sekvence egzona, sekvence introna, regulatorne sekvence, sekvence za kontrolu transkripcije, sekvence za kontrolu translacije, mesta splajsovanja ili nekodirajuće sekvence. U nekim slučajevima, integracija egzogene sekvence može dovesti do obnavljanja funkcije gena. U nekim slučajevima, integracija egzogene sekvence može dovesti do uvođenja (eng. – knock-in) gena. U nekim slučajevima, integracija egzogene sekvence može dovesti do inaktivacije gena.
[0099] Matrica može da bude bilo koje odgovarajuće dužine. U nekim slučajevima, matrica može da sadrži 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 ili više nukleotida u dužini. Matrica može da bude jednolančana nukleinska kiselina. Matrica može da bude dvolančana ili delimično dvolančana nukleinska kiselina. U određenim slučajevima, jednolančana matrica je dugačka 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ili 200 nukleotida. U nekim slučajevima, matrica može da sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna delu ciljnog molekula nukleinske kiseline koji sadrži ciljnu sekvencu (tj. „krak homologije“). U nekim slučajevima, matrica može da sadrži krak homologije koji je komplementaran sekvenci koja se nalazi uzvodno ili nizvodno od mesta isecanja na ciljnom molekulu nukleinske kiseline.
[0100] U nekim slučajevima, matrica sadrži ssDNK ili dsDNK koja sadrži sekvence bočnog invertovanog terminalnog ponovka (ITR). U nekim slučajevima, matrica je obezbeđena kao vektor, plazmid, mini-krug, nano-krug ili proizvod PCR.
Prečišćavanje nukleinskih kiselina
[0101] U nekim slučajevima, nukleinska kiselina se prečišćava. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina se prečišćava metodom precipitacije (npr. precipitacija pomoću LiCl, alkoholna precipitacija ili ekvivalentna metoda, npr. kao što je ovde opisano). U nekim slučajevima, nukleinska kiselina se prečišćava metodom zasnovanom na hromatografiji, kao što je metoda zasnovana na HPLC ili ekvivalentna metoda (npr. kao što je ovde opisano). U nekim slučajevima, nukleinska kiselina se prečišćava korišćenjem i metode precipitacije (npr. precipitacija pomoću LiCl) i metode zasnovane na HPLC.
Ciljne sekvence
[0102] U nekim slučajevima, sistem CRISPR/Cas prema ovom otkriću može da bude usmeren na i da iseca ciljnu sekvencu na ciljnom molekulu nukleinske kiseline. Na primer, ciljna sekvenca može da se prepozna i iseče pomoću Cas nukleaze. U određenim slučajevima, ciljna sekvenca za Cas nukleazu se nalazi blizu PAM sekvence srodne nukleazi. U nekim slučajevima, Cas nukleaza klase 2 može da bude usmerena pomoću gRNK na ciljnu sekvencu ciljnog molekula nukleinske kiseline, pri čemu gRNK hibridizuje sa ciljnom sekvencom, a Cas protein klase 2 je iseca. U nekim slučajevima, vodič RNK hibridizuje, a Cas nukleaza klase 2 iseca ciljnu sekvencu koja se nalazi pored srodne PAM, ili koja je sadrži. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude komplementarna usmeravajućoj sekvenci vodič RNK. U nekim slučajevima, stepen komplementarnosti između usmeravajuće sekvence vodič RNK i dela odgovarajuće ciljne sekvence koji hibridizuje sa molekulom vodič RNK može da bude oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, procenat identičnosti između usmeravajuće sekvence vodič RNK i dela odgovarajuće ciljne sekvence koji hibridizuje sa molekulom vodič RNK može da bude oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, region homologije ciljne sekvence je u blizini srodne PAM sekvence. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži sekvencu koja je 100% komplementarna sa usmeravajućom sekvencom vodič RNK. U drugim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži najmanje jedno nepodudaranje, deleciju ili inserciju, u poređenju sa usmeravajućom sekvencom vodič RNK.
[0103] Dužina ciljne sekvence može da zavisi od korišćenog nukleaznog sistema. Na primer, usmeravajuća sekvenca vodič RNK za sistem CRISPR/Cas može da sadrži 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ili više od 50 nukleotida u dužini i ciljna sekvenca je odgovarajuće dužine, opciono pored PAM sekvence. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži 15-24 nukleotida u dužini. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži 17-21 nukleotid u dužini. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži 20 nukleotida u dužini. Kada se koriste nikaze, ciljna sekvenca može da sadrži par ciljnih sekvenci koje prepoznaje par nikaza koje isecaju suprotne lance molekula DNK. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži par ciljnih sekvenci koje prepoznaje par nikaza koje isecaju iste lance molekula DNK. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži deo ciljnih sekvenci koje prepoznaje jedna ili više Cas nukleaza.
[0104] Ciljni molekul nukleinske kiseline može da bude bilo koji molekul DNK ili RNK koji je endogen ili egzogen za ćeliju. U nekim slučajevima, ciljni molekul nukleinske kiseline može da bude epizomalna DNK, plazmid, genomska DNK, virusni genom, mitohondrijalna DNK ili hromozomska DNK iz ćelije ili u ćeliji. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca ciljnog molekula nukleinske kiseline može da bude genomska sekvenca iz ćelije ili u ćeliji, uključujući humanu ćeliju.
[0105] U sledećim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude virusna sekvenca. U sledećim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude sekvenca patogena. U drugim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude sintetizovana sekvenca. U sledećim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude hromozomska sekvenca. U određenim slučajevima, ciljna sekvenca može da sadrži translokacioni spoj, npr. translokaciju povezanu sa kancerom. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude na eukariotskom hromozomu, kao što je humani hromozom. U određenim slučajevima, ciljna sekvenca je sekvenca specifična za jetru, u tom smislu što se eksprimira u ćelijama jetre.
[0106] U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude locirana u kodirajućoj sekvenci gena, intronskoj sekvenci gena, regulatornoj sekvenci, sekvenci za kontrolu transkripcije gena, sekvenci za kontrolu translacije gena, mestu splajsovanja ili nekodirajućoj sekvenci između gena. U nekim slučajevima, gen može da bude gen koji kodira protein. U drugim slučajevima, gen može da bude gen za nekodirajuću RNK. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da obuhvata ceo ili deo gena povezanog sa bolešću. U nekim slučajevima, ciljna sekvenca može da bude locirana na negenskoj funkcionalnoj lokaciji u genomu, na primer na lokaciji koja kontroliše aspekte organizacije hromatina, kao što je lokacija skafolda ili region za kontrolu lokusa.
[0107] U slučajevima koji uključuju Cas nukleazu, kao što je Cas nukleaza klase 2, ciljna sekvenca može da bude pored motiva koji se nalazi uz protospejser („PAM“). U nekim slučajevima, PAM može da bude pored ili unutar 1, 2, 3 ili 4 nukleotida od 3' kraja ciljne sekvence. Dužina i sekvenca PAM mogu da zavise od korišćenog Cas proteina. Na primer, PAM se može izabrati iz konsenzusne ili određene PAM sekvence za specifični Cas9 protein ili Cas9 ortolog, uključujući one prikazane na slici 1 autora Ran et al., Nature, 520: 186-191 (2015) i slici S5 autora Zetsche 2015. U nekim slučajevima, PAM može da ima 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleotida. Neograničavajući primeri PAM sekvenci uključuju NGG, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, TTN i NNNNGATT (gde je N definisan kao bilo koji nukleotid, a W je definisan kao A ili T). U nekim slučajevima, PAM sekvenca može da bude NGG. U nekim slučajevima, PAM sekvenca može da bude NGGNG. U nekim slučajevima, PAM sekvenca može da bude TTN. U nekim slučajevima, PAM sekvenca može da bude NNAAAAW.
Lipidna formulacija
[0108] Ovde su otkriveni različiti primeri formulacija LNP za RNK, uključujući kargo CRISPR/Cas. Takve formulacije LNP uključuju „aminolipid“, zajedno sa pomoćnim lipidom, neutralnim lipidom i PEG lipidom. U nekim slučajevima, takve formulacije LNP uključuju „aminolipid“, zajedno sa pomoćnim lipidom i PEG lipidom. U nekim slučajevima, formulacije LNP uključuju manje od 1 procenta neutralnog fosfolipida. U nekim slučajevima, formulacije LNP uključuju manje od 0.5 procenata neutralnog fosfolipida. Pod „lipidnom nanočesticom“ se podrazumeva čestica koja sadrži mnoštvo (tj. više od jednog) molekula lipida koji su međusobno fizički povezani međumolekulskim silama.
Aminolipidi
[0109] Kompozicije LNP za isporuku biološki aktivnih agenasa sadrže „aminolipid“, koji je definisan kao lipid A ili njegovi ekvivalenti, uključujući acetalne analoge lipida A.
[0110] U nekim slučajevima, aminolipid je lipid A, koji je (9Z,12Z)-3-((4,4-bis(oktiloksi)butanoil)oksi)-2-((((3-(dietilamino)propoksi)karbonil)oksi)metil) propil oktadeka-9,12-dienoat, takođe nazvan 3-((4,4-bis(oktiloksi)butanoil)oksi)-2-((((3-(dietilamino)propoksi)karbonil)oksi)metil)propil (9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoat. Lipid A se može prikazati kao:
[0111] Lipid A može da se sintetizuje prema WO2015/095340 (npr. str. 84-86). U određenim slučajevima, aminolipid je ekvivalentan lipidu A.
[0112] U određenim slučajevima, aminolipid je analog lipida A. U određenim slučajevima, analog lipida A je acetalni analog lipida A. U određenim kompozicijama LNP, acetalni analog je acetalni analog C4-C12. U nekim slučajevima, acetalni analog je acetalni analog C5-C12. U dodatnim slučajevima, acetalni analog je acetalni analog C5-C10. U daljim slučajevima, acetalni analog se bira između acetalnog analoga C4, C5, C6, C7, C9, C10, C11 i C12.
[0113] Aminolipidi pogodni za upotrebu u LNP opisanim ovde su biorazgradivi in vivo i pogodni za isporuku biološki aktivnog agensa, kao što je RNK u ćeliju. Aminolipidi imaju nisku toksičnost (npr. u životinjskom modelu se podnose bez štetnih efekata u količinama većim ili jednakim 10 mg/kg RNK karga). U određenim slučajevima, LNP koji sadrže aminolipid uključuju one kod kojih se najmanje 75% aminolipida uklanja iz plazme u roku od 8, 10, 12, 24 ili 48 sati, ili 3, 4, 5, 6, 7 ili 10 dana. U određenim slučajevima, LNP koji sadrže aminolipid uključuju one kod kojih se najmanje 50% iRNK ili gRNK uklanja iz plazme u roku od 8, 10, 12, 24 ili 48 sati, ili 3, 4, 5, 6, 7, ili 10 dana. U određenim slučajevima, LNP koji sadrže aminolipid uključuju one kod kojih se najmanje 50% LNP uklanja iz plazme u roku od 8, 10, 12, 24 ili 48 sati, ili 3, 4, 5, 6, 7 ili 10 dana, na primer putem merenja lipida (npr. aminolipida), RNK (npr. iRNK) ili druge komponente. U određenim slučajevima, meri se lipidno-inkapsulirana naspram slobodne lipidne, RNK ili nukleinsko-kiselinske komponente LNP.
[0114] Klirens lipida se može meriti kako je opisano u literaturi. Videti Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther.2013, 21(8), 1570-78 („Maier“). Na primer, u delu autora Maier, sistemi LNP-siRNK koji sadrže siRNK usmerenu na luciferazu davani su mužjacima miševa C57B1/6 starim šest do osam nedelja u dozi od 0.3 mg/kg intravenskom bolus injekcijom preko lateralne repne vene. Uzorci krvi, jetre i slezine su sakupljeni na 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 i 168 sati nakon primene doze. Pre sakupljanja tkiva nad miševima je sprovedena perfuzija fiziološkim rastvorom i uzorci krvi su obrađeni da bi se dobila plazma. Svi uzorci su obrađeni i analizirani pomoću LC-MS. Dalje, Maier opisuje proceduru za procenu toksičnosti nakon primene formulacija LNP-siRNK. Na primer, siRNK usmerena na luciferazu davana je u dozama od 0, 1, 3, 5 i 10 mg/kg (5 životinja/grupi) putem jedne intravenske bolus injekcije u zapremini doze od 5 mL/kg mužjacima Sprague-Dawley pacova. Posle 24 sata, oko 1 mL krvi je uzet iz jugularne vene životinja pri svesti i serum je izolovan. Sve životinje su eutanazirane radi obdukcije 72 sata nakon primene doze. Urađene su procene kliničkih znakova, telesne težine, hemije seruma, težine organa i histopatologije. Mada Maier opisuje postupke za procenu formulacija siRNK-LNP, ovi postupci mogu da se primene za procenu klirensa, farmakokinetike i toksičnosti primene kompozicija LNP prema ovom pronalasku.
[0115] Aminolipidi mogu dovesti do povećane stope klirensa. U nekim slučajevima, stopa klirensa je stopa klirensa lipida, na primer stopa kojom se lipid uklanja iz krvi, seruma ili plazme. U nekim slučajevima, stopa klirensa je stopa klirensa RNK, na primer stopa kojom se iRNK ili gRNK uklanja iz krvi, seruma ili plazme. U nekim slučajevima, stopa klirensa je stopa kojom se LNP uklanja iz krvi, seruma ili plazme. U nekim slučajevima, stopa klirensa je stopa kojom se LNP uklanja iz tkiva, kao što je tkivo jetre ili tkivo slezine. U određenim slučajevima, visoka stopa klirensa dovodi do bezbednosnog profila koji nema suštinski štetne efekte. Aminolipidi mogu da smanje akumulaciju LNP u cirkulaciji i tkivima. U nekim slučajevima, smanjenje akumulacije LNP u cirkulaciji i tkivima dovodi do bezbednosnog profila koji nema suštinski štetne efekte.
[0116] Aminolipidi prema ovom pronalasku mogu da se jonizuju (npr. mogu da formiraju so) u zavisnosti od pH medijuma u kome se nalaze. Na primer, u blago kiseloj sredini, aminolipidi mogu da budu protonovani i da time nose pozitivno naelektrisanje. Suprotno tome, u blago baznom medijumu, kao što je, na primer, krv, gde je pH približno 7.35, aminolipidi mogu da ne budu protonovani i da stoga ne nose naelektrisanje. U nekim slučajevima, aminolipidi iz ovog otkrića mogu da budu protonovani na pH od najmanje oko 9. U nekim slučajevima, aminolipidi iz ovog otkrića mogu da budu protonovani na pH od najmanje oko 9. U nekim slučajevima, aminolipidi prema ovom otkriću mogu da budu protonovani na pH od najmanje oko 10.
[0117] Vrednost pH na kojoj je aminolipid pretežno protonovan je povezana sa njegovim intrinzičkim pKa. U nekim slučajevima, aminolipidi prema ovom otkriću mogu, svaki nezavisno, da imaju pKa u opsegu od oko 5.1 do oko 7.4. U nekim slučajevima, aminolipidi ovog otkrića mogu, svaki nezavisno, da imaju pKa u opsegu od oko 5.5 do oko 6.6. U nekim slučajevima, aminolipidi prema ovom otkriću mogu, svaki nezavisno, da imaju pKa u opsegu od oko 5.6 do oko 6.4. U nekim slučajevima, aminolipidi ovog otkrića mogu, svaki nezavisno, da imaju pKa u opsegu od oko 5.8 do oko 6.2. Na primer, aminolipidi ovog otkrića mogu, svaki nezavisno, da imaju pKa u opsegu od oko 5.8 do oko 6.5. pKa aminolipida može da bude važan faktor u formulisanju LNP jer je nađeno da su katjonski lipidi sa pKa u opsegu od oko 5.1 do oko 7.4 efikasni za isporuku karga in vivo, npr. u jetru. Pored toga, nađeno je da su katjonski lipidi sa pKa u opsegu od oko 5.3 do oko 6.4 efikasni za isporuku in vivo, npr. u tumore. Videti, npr. WO 2014/136086.
Dodatni lipidi
[0118] „Neutralni lipidi“ pogodni za upotrebu u lipidnoj kompoziciji prema otkriću uključuju, na primer, niz neutralnih, nenaelektrisanih ili cviterjonskih lipida. Primeri neutralnih fosfolipida pogodnih za upotrebu u ovom otkriću obuhvataju, ali nisu ograničeni na, 5-heptadecilbenzen-1,3-diol (rezorcinol), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), distearoilfosfatidilholin (DSPC), fosfoholin (DOPC), dimiristoilfosfatidilholin (DMPC), fosfatidilholin (PLPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DAPC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilholin jajeta (EPC), dilauriloilfosfatidilholin (DLPC), dimiristoilfosfatidilholin (DMPC), 1-miristoil-2-palmitoil fosfatidilholin (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoil fosfatidilholin (PMPC), 1-palmitoil-2-stearoil fosfatidilholin (PSPC), 1,2-diarahidoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DBPC), 1-stearoil-2-palmitoil fosfatidilholin (SPPC), 1,2-dieikozenoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DEPC), palmitoiloleoil fosfatidilholin (POPC), lizofosfatidil holin, dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE), dilinoleoilfosfatidilholin distearoilfosfatidiletanolamin (DSPE), dimiristoil fosfatidiletanolamin (DMPE), dipalmitoil fosfatidiletanolamin (DPPE), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamin (POPE), lizofosfatidiletanolamin i njihove kombinacije. U jednom slučaju, neutralni fosfolipid može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od distearoilfosfatidilholina (DSPC) i dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPE). U drugom slučaju, neutralni fosfolipid može da bude distearoilfosfatidilholin (DSPC). U drugom slučaju, neutralni fosfolipid može da bude dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC).
[0119] „Pomoćni lipidi“ uključuju steroide, sterole i alkil rezorcinole. Pomoćni lipidi pogodni za upotrebu u ovom otkriću uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, 5-heptadecilrezorcinol i holesterol hemisukcinat. U jednom slučaju, pomoćni lipid može da bude holesterol. U jednom slučaju, pomoćni lipid može da bude holesterol hemisukcinat.
[0120] PEG lipidi su nevidljivi lipidi koji menjaju trajanje vremena tokom koga nanočestice mogu da postoje in vivo (npr. u krvi). PEG lipidi mogu da pomognu u postupku formulacije, na primer, smanjenjem agregacije čestica i kontrolom veličine čestica. PEG lipidi koji se ovde koriste mogu da moduliraju farmakokinetička svojstva LNP. Tipično, PEG lipid sadrži lipidni fragment i polimerni fragment na bazi PEG.
[0121] U nekim slučajevima, lipidni fragment može da potiče iz diacilglicerola ili diacilglikamida, uključujući one koji sadrže dialkilglicerolsku ili dialkilglikamidnu grupu koja ima dužinu alkilnog lanca koja nezavisno sadrži od oko C4 do oko C40 zasićenih ili nezasićenih atoma ugljenika, pri čemu lanac može da sadrži jednu ili više funkcionalnih grupa kao što su, na primer, amid ili estar. U nekim slučajevima, dužina alkil lanca obuhvata oko C10 do C20. Dialkilglicerolska ili dialkilglikamidna grupa može dalje da sadrži jednu ili više supstituisanih alkil grupa. Dužine lanaca mogu da budu simetrične ili asimetrične.
[0122] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin „PEG“ kako se ovde koristi označava bilo koji polietilen glikol ili drugi polimer polialkilen etra. U jednom slučaju, fragment PEG je opciono supstituisani linearni ili razgranati polimer etilen glikola ili etilen oksida. U određenim slučajevima, fragment PEG je alternativno, fragment PEG može da bude supstituisan, npr. sa jednom ili više alkil, alkoksi, acil, hidroksi ili aril grupa. U jednom slučaju, fragment PEG uključuje PEG kopolimer kao što je PEG-poliuretan ili PEG-polipropilen (videti, npr. J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)); alternativno, fragment PEG ne uključuje PEG kopolimere, npr. može da bude monopolimer PEG. U jednom slučaju, PEG ima molekulsku težinu od oko 130 do oko 50000, u podvarijanti, oko 150 do oko 30000, u podvarijanti, oko 150 do oko 20000, u podvarijanti od oko 150 do oko 15000, u podvarijanti, oko 150 do oko 10000, u podvarijanti, oko 150 do oko 6000, u podvarijanti, oko 150 do oko 5000, u podvarijanti, oko 150 do oko 4000, u podvarijanti, oko 150 do oko 3000, u podvarijanti, oko 300 do oko 3000, u podvarijanti, oko 1000 do oko 3000, i u podvarijanti, oko 1500 do oko 2500.
[0123] U određenim slučajevima, PEG (npr. konjugovan sa lipidnim fragmentom ili lipidom, kao što je nevidljivi lipid), je „PEG-2K“, takođe nazvan „PEG 2000“, koji ima prosečnu molekulsku težinu od oko 2000 daltona. PEG-2K je ovde predstavljen sledećom formulom (I), gde je n 45, što znači da brojno uprosečeni stepen polimerizacije obuhvata oko 45 subjedinica
.
Međutim, mogu da se koriste i drugi primeri PEG poznati u struci, uključujući, npr. one kod kojih brojno uprosečeni stepen polimerizacije obuhvata oko 23 subjedinice (n = 23) i/ili 68 subjedinica (n = 68). U nekim slučajevima, n može da bude u rasponu od oko 30 do oko 60. U nekim slučajevima, n može da bude u rasponu od oko 35 do oko 55. U nekim slučajevima, n može da bude u rasponu od oko 40 do oko 50. U nekim slučajevima, n može da bude u rasponu od oko 42 do oko 48. U nekim slučajevima, n može da bude 45. U nekim slučajevima, R može da bude izabran između H, supstituisanog alkila i nesupstituisanog alkila. U nekim slučajevima, R može da bude nesupstituisani alkil. U nekim slučajevima, R može da bude metil.
[0124] U bilo kom od ovde opisanih slučajeva, PEG lipid može da se izabere od jedinjenja PEG-dilauroilglicerol, PEG-dimiristoilglicerol (PEG-DMG) (kataloški br. GM-020 kompanije NOF, Tokyo, Japan), PEG-dipalmitoilglicerol, PEG-distearoilglicerol (PEG-DSPE) (kataloški br. DSPE-020CN, NOF, Tokijo, Japan), PEG-dilaurilglikamid, PEG-dimiristilglikamid, PEG-dipalmitoilglikamid i PEG-distearoilglikamid, PEG-holesterol (1-[8’-(holest-5-en-3 [beta]-oksi)karboksamido-3’,6’-dioksaoktanil]karbamoil-[omega]-metil-poli(etilen glikol), PEG-DMB (3,4-ditetradekoksilbenzil-[omega]-metil-poli(etilen glikol)etar), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000] (PEG2k-DMG) (kat. br.880150P kompanije Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, SAD), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000] (PEG2k-DSPE) (kat. br. 880120C kompanije Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, SAD), 1,2-distearoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol (PEG2k-DSG; GS-020, NOF Tokijo, Japan), poli(etilen glikol)-2000-dimetakrilat (PEG2k-DMA) i 1,2-disteariloksipropil-3-amin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000] (PEG2k-DSA). U jednom slučaju, PEG lipid može da bude PEG2k-DMG. U nekim slučajevima, PEG lipid može da bude PEG2k-DSG. U jednom slučaju, PEG lipid može da bude PEG2k-DSPE. U jednom slučaju, PEG lipid može da bude PEG2k-DMA. U jednom slučaju, PEG lipid može da bude PEG2k-C-DMA. U jednom slučaju, PEG lipid može da bude jedinjenje S027, otkriveno u WO2016/010840 u paragrafima [00240] do [00244]. U jednom slučaju, PEG lipid može da bude PEG2k-DSA. U jednom slučaju, PEG lipid može da bude PEG2k-C11. U nekim slučajevima, PEG lipid može da bude PEG2k-C14. U nekim slučajevima, PEG lipid može da bude PEG2k-C16. U nekim slučajevima, PEG lipid može da bude PEG2k-C18.
Formulacije LNP
[0125] Primeri ovog otkrića opisuju lipidne kompozicije opisane prema odgovarajućim molarnim odnosima komponenti lipida u formulaciji. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude od oko 30 mol% do oko 60 mol%. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude od oko 40 mol% do oko 60 mol%. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude od oko 45 mol% do oko 60 mol%. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude od oko 50 mol% do oko 60 mol%. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude od oko 55 mol% do oko 60 mol%. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude od oko 50 mol% do oko 55 mol%. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude oko 50 mol%. U jednom slučaju, mol% aminolipida može da bude oko 55 mol%. U nekim slučajevima, mol% amina lipida u šarži LNP će biti ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5% ili ± 2.5% ciljnog mol%. U nekim slučajevima, mol% amina lipida u šarži LNP biće ± 4 mol%, ± 3 mol%, ± 2 mol%, ± 1.5 mol%, ± 1 mol%, ± 0.5 mol%, ili ± 0.25 mol% ciljnog mol%. Svi mol% brojevi su dati kao frakcija lipidne komponente kompozicija LNP. U određenim slučajevima, varijabilnost mol% aminolipida među serijama LNP biće manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.
[0126] U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude od oko 5 mol% do oko 15 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude od oko 7 mol% do oko 12 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude od oko 0 mol% do oko 5 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude od oko 0 mol% do oko 10 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude od oko 5 mol% do oko 10 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude od oko 8 mol% do oko 10 mol%.
[0127] U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude oko 5 mol%, oko 6 mol%, oko 7 mol%, oko 8 mol%, oko 9 mol%, oko 10 mol%, oko 11 mol%, oko 12 mol%, oko 13 mol%, oko 14 mol%, ili oko 15 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude oko 9 mol%.
[0128] U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude od oko 1 mol% do oko 5 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida može da bude od oko 0.1 mol% do oko 1 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida kao što je neutralni fosfolipid može da bude oko 0.1 mol%, oko 0.2 mol%, oko 0.5 mol%, 1 mol%, oko 1.5 mol%, oko 2 mol%, oko 2.5 mol%, oko 3 mol%, oko 3.5 mol%, oko 4 mol%, oko 4.5 mol%, ili oko 5 mol%.
[0129] U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude manji od oko 1 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude manji od oko 0.5 mol%. U jednom slučaju, mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida, može da bude oko 0 mol%, oko 0.1 mol%, oko 0.2 mol%, oko 0.3 mol%, oko 0.4 mol%, oko 0.5 mol%, oko 0.6 mol%, oko 0.7 mol%, oko 0.8 mol%, oko 0.9 mol%, ili oko 1 mol%. U nekim slučajevima, formulacije koje su ovde otkrivene su bez neutralnog lipida (tj. 0 mol% neutralnog lipida). U nekim slučajevima, formulacije koje su ovde otkrivene su u suštini bez neutralnog lipida (tj. oko 0 mol% neutralnog lipida). U nekim slučajevima, formulacije koje su ovde otkrivene su bez neutralnog fosfolipida (tj. 0 mol% neutralnog fosfolipida). U nekim slučajevima, formulacije koje su ovde otkrivene su u suštini bez neutralnog fosfolipida (tj. oko 0 mol% neutralnog fosfolipida).
[0130] U nekim slučajevima, mol% neutralnog lipida šarže LNP će biti ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5% ili ± 2.5% ciljanog mol% neutralnog lipida. U određenim slučajevima, varijabilnost LNP među šaržama će biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.
[0131] U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida može da bude od oko 20 mol% do oko 60 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida može da bude od oko 25 mol% do oko 55 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida može da bude od oko 25 mol% do oko 50 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida može da bude od oko 25 mol% do oko 40 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida može da bude od oko 30 mol% do oko 50 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida može da bude od oko 30 mol% do oko 40 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida se podešava na osnovu koncentracija aminolipida, neutralnog lipida i PEG lipida da bi se lipidna komponenta dovela na 100 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida se podešava na osnovu koncentracija aminolipida i PEG lipida da bi se lipidna komponenta dovela do 100 mol%. U jednom slučaju, mol% pomoćnog lipida se podešava na osnovu koncentracija aminolipida i PEG lipida da bi se lipidna komponenta dovela na najmanje 99 mol%. U nekim slučajevima, mol% pomoćnog lipida šarže LNP će biti ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5% ili ± 2.5% ciljanog mol%. U određenim slučajevima, varijabilnost LNP među šaržama će biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.
[0132] U jednom slučaju, mol% PEG lipida može da bude od oko 1 mol% do oko 10 mol%. U jednom slučaju, mol% PEG lipida može da bude od oko 2 mol% do oko 10 mol%. U jednom slučaju, mol% PEG lipida može da bude od oko 2 mol% do oko 8 mol%. U jednom slučaju, mol% PEG lipida može da bude od oko 2 mol% do oko 4 mol%. U jednom slučaju, mol% PEG lipida može da bude od oko 2.5 mol% do oko 4 mol%. U jednom slučaju, mol% PEG lipida može da bude oko 3 mol%. U jednom slučaju, mol% PEG lipida može da bude oko 2.5 mol%. U nekim slučajevima, mol% PEG lipida šarže LNP biće ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5% ili ± 2.5% ciljnog mol% PEG lipida. U određenim slučajevima, varijabilnost LNP među šaržama će biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.
[0133] U određenim slučajevima, kargo uključuje iRNK koja kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens (npr. Cas nukleaza, Cas nukleaza klase 2 ili Cas9), i gRNK ili nukleinsku kiselinu koja kodira gRNK, ili kombinaciju iRNK i gRNK. U jednom slučaju, kompozicija LNP može da sadrži lipid A ili njegove ekvivalente. U nekim aspektima, aminolipid je lipid A. U nekim aspektima, aminolipid je ekvivalent lipida A, npr. analog lipida A. U određenim aspektima, aminolipid je acetalni analog lipida A. U različitim slučajevima, kompozicija LNP sadrži aminolipid, neutralni lipid, pomoćni lipid i PEG lipid. U određenim slučajevima, pomoćni lipid je holesterol. U određenim slučajevima, neutralni lipid je DSPC. U specifičnim primerima izvođenja, PEG lipid je PEG2k-DMG. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži lipid A, pomoćni lipid, neutralni lipid i PEG lipid. U nekim slučajevima, kompozicija LNP sadrži aminolipid, DSPC, holesterol i PEG lipid. U nekim slučajevima, kompozicija LNP sadrži PEG lipid koji sadrži DMG. U određenim slučajevima, aminolipid je odabran od lipida A i ekvivalenta lipida A, uključujući acetalni analog lipida A. U dodatnim slučajevima, kompozicija LNP sadrži lipid A, holesterol, DSPC i PEG2k-DMG.
[0134] U različitim slučajevima, kompozicija LNP sadrži aminolipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i PEG lipid. U različitim slučajevima, kompozicija LNP sadrži aminolipid, pomoćni lipid, neutralni fosfolipid i PEG lipid. U različitim slučajevima, kompozicija LNP sadrži lipidnu komponentu koja se sastoji od aminolipida, pomoćnog lipida, neutralnog lipida i PEG lipida. U različitim slučajevima, kompozicija LNP sadrži aminolipid, pomoćni lipid i PEG lipid. U određenim slučajevima, kompozicija LNP ne sadrži neutralni lipid, kao što je neutralni fosfolipid. U različitim slučajevima, kompozicija LNP sadrži lipidnu komponentu koja se sastoji od aminolipida, pomoćnog lipida i PEG lipida. U određenim slučajevima, neutralni lipid se bira između jednog ili više od DSPC, DPPC, DAPC, DMPC, DOPC, DOPE i DSPE. U određenim slučajevima, neutralni lipid je DSPC. U određenim slučajevima, neutralni lipid je DPPC. U određenim primerima izvođenja, neutralni lipid je DAPC. U određenim slučajevima, neutralni lipid je DMPC. U određenim slučajevima, neutralni lipid je DOPC. U određenim slučajevima, neutralni lipid je DOPE. U određenim slučajevima, neutralni lipid je DSPE. U određenim slučajevima, pomoćni lipid je holesterol. U specifičnim slučajevima, PEG lipid je PEG2k-DMG. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži lipid A, pomoćni lipid i PEG lipid. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži lipidnu komponentu koja se sastoji od lipida A, pomoćnog lipida i PEG lipida. U nekim slučajevima, kompozicija LNP sadrži aminolipid, holesterol i PEG lipid. U nekim slučajevima, kompozicija LNP sadrži lipidnu komponentu koja se sastoji od aminolipida, holesterola i PEG lipida. U nekim slučajevima, kompozicija LNP sadrži PEG lipid koji sadrži DMG. U određenim slučajevima, aminolipid se bira između lipida A i ekvivalenta lipida A, uključujući acetalni analog lipida A. U određenim slučajevima, aminolipid je C5-C12 ili C4-C12 acetalni analog lipida A. U dodatnim slučajevima, kompozicija LNP sadrži lipid A, holesterol i PEG2k-DMG.
[0135] Primeri ovog otkrića takođe opisuju lipidne kompozicije opisane prema molarnom odnosu između pozitivno naelektrisanih amino grupa aminolipida (N) i negativno naelektrisanih fosfatnih grupa (P) nukleinske kiseline koja se inkapsulira. Ovo se može matematički predstaviti jednačinom N/P. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži lipidnu komponentu koja sadrži aminolipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i PEG lipid; i komponentu nukleinske kiseline, pri čemu je odnos N/P oko 3 do 10. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži lipidnu komponentu koja sadrži aminolipid, pomoćni lipid i PEG lipid; i komponentu nukleinske kiseline, pri čemu je odnos N/P oko 3 do 10. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži lipidnu komponentu koja sadrži aminolipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i pomoćni lipid; i RNK komponentu, pri čemu je odnos N/P oko 3 do 10. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži lipidnu komponentu koja sadrži aminolipid, pomoćni lipid i PEG lipid; i RNK komponentu, pri čemu je odnos N/P oko 3 do 10. U jednom slučaju, odnos N/P može da bude oko 5 do 7. U jednom slučaju, odnos N/P može da bude oko 3 do 7. U jednom slučaju, odnos N/P može da bude oko 4.5 do 8. U jednom slučaju, odnos N/P može da bude oko 6. U jednom slučaju, odnos N/P može da bude 6 ± 1. U jednom slučaju, odnos N/P može da bude 6 ± 0.5. U nekim slučajevima, odnos N/P će biti ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5% ili ± 2.5% ciljnog odnosa N/P. U određenim slučajevima, varijabilnost LNP među šaržama će biti manja od 15%, manja od 10% ili manja od 5%.
[0136] U nekim slučajevima, komponenta nukleinske kiseline, na primer, RNK komponenta, može da sadrži iRNK, kao što je iRNK koja kodira Cas nukleazu. Komponenta RNK uključuje RNK, opciono sa dodatnom nukleinskom kiselinom i/ili proteinom, npr. RNP kargo. U jednom slučaju, RNK sadrži iRNK Cas9. U nekim kompozicijama koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu, LNP dalje sadrži nukleinsku kiselinu gRNK, kao što je gRNK. U nekim slučajevima, RNK komponenta sadrži iRNK Cas nukleaze i gRNK. U nekim slučajevima, RNK komponenta sadrži iRNK Cas nukleaze klase 2 i gRNK.
[0137] U određenim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2, aminolipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i PEG lipid.
U određenim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2, aminolipid, pomoćni lipid i PEG lipid. U određenim kompozicijama LNP koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2, pomoćni lipid je holesterol. U drugim kompozicijama koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2, neutralni lipid je DSPC. U dodatnim slučajevima koji sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2, PEG lipid je PEG2k-DMG ili PEG2k-C11. U specifičnim kompozicijama koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2, aminolipid se bira između lipida A i njegovih ekvivalenata, kao što je acetalni analog lipida A.
[0138] U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži gRNK. U određenim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži aminolipid, gRNK, pomoćni lipid, neutralni lipid i PEG lipid. U određenim slučajevima, kompozicija LNP može da sadrži aminolipid, gRNK, pomoćni lipid i PEG lipid. U određenim kompozicijama LNP koje sadrže gRNK, pomoćni lipid je holesterol. U nekim kompozicijama koje sadrže gRNK, neutralni lipid je DSPC. U dodatnim slučajevima koji sadrže gRNK, PEG lipid je PEG2k-DMG ili PEG2k-C11. U određenim slučajevima, aminolipid se bira između lipida A i njegovih ekvivalenata, kao što je acetalni analog lipida A.
[0139] U jednom slučaju, kompozicija LNP može da sadrži sgRNK. U jednom slučaju, kompozicija LNP može da sadrži Cas9 sgRNK. U jednom slučaju, kompozicija LNP može da sadrži Cpf1 sgRNK. U nekim kompozicijama koje sadrže sgRNK, LNP uključuje aminolipid, pomoćni lipid, neutralni lipid i PEG lipid. U nekim kompozicijama koje sadrže sgRNK, LNP uključuje aminolipid, pomoćni lipid i PEG lipid. U određenim kompozicijama koje sadrže sgRNK, pomoćni lipid je holesterol. U drugim kompozicijama koje sadrže sgRNK, neutralni lipid je DSPC. U dodatnim slučajevima koji sadrže sgRNK, PEG lipid je PEG2k-DMG ili PEG2k-C11. U određenim slučajevima, aminolipid se bira između lipida A i njegovih ekvivalenata, kao što su acetalni analozi lipida A.
[0140] U određenim slučajevima, kompozicija LNP sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK, koja može da bude sgRNK. U jednom slučaju, kompozicija LNP može da sadrži aminolipid, iRNK koja kodira Cas nukleazu, gRNK, pomoćni lipid, neutralni lipid i PEG lipid. U jednom slučaju, kompozicija LNP može da sadrži lipidnu komponentu koja se sastoji od aminolipida, pomoćnog lipida, neutralnog lipida i PEG lipida; i komponentu nukleinske kiseline koja se sastoji od iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK. U jednom slučaju, kompozicija LNP može da sadrži lipidnu komponentu koja se sastoji od aminolipida, pomoćnog lipida i PEG lipida; i komponentu nukleinske kiseline koja se sastoji od iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK. U određenim kompozicijama koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK, pomoćni lipid je holesterol. U nekim kompozicijama koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK, neutralni lipid je DSPC. Određene kompozicije koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK sadrže manje od oko 1 mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida. Određene kompozicije koje sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK sadrže manje od oko 0.5 mol% neutralnog lipida, npr. neutralnog fosfolipida. U određenim kompozicijama, LNP ne sadrži neutralni lipid, npr. neutralni fosfolipid. U dodatnim slučajevima koji sadrže iRNK koja kodira Cas nukleazu i gRNK, PEG lipid je PEG2k-DMG ili PEG2k-C11. U određenim slučajevima, aminolipid se bira između lipida A i njegovih ekvivalenata, kao što su acetalni analozi lipida A.
[0141] U određenim slučajevima, kompozicije LNP uključuju iRNK Cas nukleaze, kao što je iRNK Cas klase 2 i najmanje jednu gRNK. U određenim slučajevima, kompozicija LNP uključuje odnos gRNK prema iRNK Cas nukleaze, kao što je iRNK Cas nukleaze klase 2 od oko 25:1 do oko 1:25. U određenim slučajevima, formulacija LNP uključuje odnos gRNK prema iRNK Cas nukleaze, kao što je iRNK Cas nukleaze klase 2 od oko 10:1 do oko 1:10. U određenim slučajevima, formulacija LNP uključuje odnos gRNK prema iRNK Cas nukleaze, kao što je iRNK Cas nukleaze klase 2 od oko 8:1 do oko 1:8. Ovde mereni odnosi su težinski. U nekim slučajevima, formulacija LNP uključuje odnos gRNK prema iRNK Cas nukleaze, kao što je iRNK Cas klase 2 od oko 5:1 do oko 1:5. U nekim slučajevima, opseg odnosa je oko 3:1 do 1:3, oko 2:1 do 1:2, oko 5:1 do 1:2, oko 5:1 do 1:1, oko 3:1 do 1:2, oko 3:1 do 1:1, oko 3:1, oko 2:1 do 1:1. U nekim slučajevima, odnos gRNK prema iRNK je oko 3:1 ili oko 2:1. U nekim slučajevima je odnos gRNK prema iRNK Cas nukleaze, kao što je Cas nukleaza klase 2, oko 1:1. Odnos može da bude oko 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 ili 1:25.
[0142] Kompozicije LNP koje su ovde otkrivene mogu da uključuju matričnu nukleinsku kiselinu. Matična nukleinska kiselina može da bude ko-formulisana sa iRNK koja kodira Cas nukleazu, kao što je iRNK Cas nukleaze klase 2. U nekim slučajevima, matrična nukleinska kiselina može da bude ko-formulisana sa molekulom vodič RNK. U nekim slučajevima, matrična nukleinska kiselina može da bude ko-formulisana i sa iRNK koja kodira Cas nukleazu i sa molekulom vodič RNK. U nekim slučajevima, matrična nukleinska kiselina može da bude formulisana odvojeno od iRNK koja kodira Cas nukleazu ili vodič RNK. Matična nukleinska kiselina može da bude isporučena sa, ili odvojeno od kompozicija LNP. U nekim slučajevima, matrična nukleinska kiselina može da bude jednolančana ili dvolančana, u zavisnosti od željenog mehanizma popravke. Matrica može da ima regione homologije sa ciljnom DNK, ili sa sekvencama koje su susedne ciljnoj DNK.
[0143] U nekim slučajevima, LNP se formiraju mešanjem vodenog rastvora RNK sa rastvorom lipida na bazi organskog rastvarača, na primer, 100% etanola. Pogodni rastvori ili rastvarači uključuju ili mogu da sadrže: vodu, PBS, Tris pufer, NaCl, citratni pufer, etanol, hloroform, dietiletar, cikloheksan, tetrahidrofuran, metanol, izopropanol. Može da se koristi farmaceutski prihvatljiv pufer, npr. za in vivo primenu LNP. U određenim slučajevima, pufer se koristi za održavanje pH kompozicije koja sadrži LNP na ili iznad pH 6.5. U određenim slučajevima, pufer se koristi za održavanje pH kompozicije koja sadrži LNP na ili iznad pH 7.0. U određenim slučajevima, kompozicija ima pH u rasponu od oko 7.2 do oko 7.7. U dodatnim slučajevima, kompozicija ima pH u rasponu od oko 7.3 do oko 7.7 ili u rasponu od oko 7.4 do oko 7.6. U daljim slučajevima, kompozicija ima pH od oko 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, ili 7.7. pH kompozicije može da se meri mikrosondom za pH. U određenim slučajevima, krioprotektant je uključen u kompoziciju. Neograničavajući primeri krioprotektanata uključuju saharozu, trehalozu, glicerol, DMSO i etilen glikol. Primeri kompozicija mogu da sadrže do 10% krioprotektanta, kao što je, na primer, saharoza. U određenim slučajevima, kompozicija LNP može da uključuje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10% krioprotektanta. U određenim slučajevima, kompozicija LNP može da uključuje oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10% saharoze. U nekim slučajevima, kompozicija LNP može da uključuje pufer. U nekim slučajevima, pufer može da sadrži fosfatni pufer (PBS), Tris pufer, citratni pufer ili njihove smeše. U određenim primerima, pufer sadrži NaCl. U određenim slučajevima, NaCl je izostavljen. Primeri količine NaCl mogu da budu u rasponu od oko 20 mM do oko 45 mM. Primeri količine NaCl mogu da budu u rasponu od oko 40 mM do oko 50 mM. U nekim slučajevima, količina NaCl je oko 45 mM. U nekim slučajevima, pufer je Tris pufer. Primeri količine Tris mogu da se kreću od oko 20 mM do oko 60 mM. Primeri količine Tris mogu da se kreću od oko 40 mM do oko 60 mM. U nekim slučajevima, količina Tris je oko 50 mM. U nekim slučajevima, pufer sadrži NaCl i Tris. Određeni primeri kompozicija LNP sadrže 5% saharoze i 45 mM NaCl u Tris puferu. U drugim primerima, kompozicije sadrže saharozu u količini od oko 5% tež./zapr., oko 45 mM NaCl i oko 50 mM Tris na pH 7.5. Količina soli, pufera i krioprotektanta može varirati tako da se održava osmolalnost celokupne formulacije. Na primer, finalna osmolalnost može da se održava na manje od 450 mOsm/L. U sledećim slučajevima, osmolalnost je između 350 i 250 mOsm/L. Određeni primeri imaju finalnu osmolalnost od 300 /- 20 mOsm/L.
[0144] U nekim slučajevima se koristi mikrofluidno mešanje, T-mešanje ili unakrsno mešanje. U određenim aspektima, brzine protoka, veličina spoja, geometrija spoja, oblik spoja, prečnik cevi, rastvori i/ili koncentracije RNK i lipida mogu da variraju. LNP ili kompozicije LNP mogu da budu koncentrisane ili prečišćene, npr. putem dijalize, filtracije tangencijalnog protoka ili hromatografije. LNP mogu da se skladište kao suspenzija, emulzija ili liofilizovani prah, na primer. U nekim slučajevima, kompozicija LNP se skladišti na 2-8 °C, u određenim aspektima, kompozicije LNP se skladište na sobnoj temperaturi. U dodatnim slučajevima, kompozicija LNP se skladišti zamrznuta, na primer na -20 °C ili -80 °C. U drugim slučajevima, kompozicija LNP se skladišti na temperaturi u rasponu od oko 0 °C do oko -80 °C. Zamrznute kompozicije LNP mogu da se odmrznu pre upotrebe, na primer na ledu, na sobnoj temperaturi ili na 25 °C.
[0145] LNP mogu da budu, npr. mikrosfere (uključujući jednolamelarne i višelamelarne vezikule, npr. „lipozomi“ - lipidni dvosloji sa lamelarnom fazom koji su, u nekim slučajevima, suštinski sferni - i, u konkretnijim slučajevima, mogu da sadrže vodeno jezgro, npr. koje sadrži značajan deo molekula RNK), dispergovana faza u emulziji, micele ili unutrašnja fazu u suspenziji.
[0146] Štaviše, kompozicije LNP su biorazgradive, jer se ne akumuliraju do citotoksičnih nivoa in vivo u terapeutski efikasnoj dozi. U nekim slučajevima, kompozicije LNP ne izazivaju urođeni imuni odgovor koji dovodi do značajnih štetnih efekata na nivou terapeutske doze. U nekim slučajevima, kompozicije LNP koje su ovde otkrivene ne izazivaju toksičnost na nivou terapeutske doze.
[0147] U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko 0.005 do oko 0.75. U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko 0.01 do oko 0.5. U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko nule do oko 0.4. U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko nule do oko 0.35. U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko nule do oko 0.35. U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko nule do oko 0.3. U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko nule do oko 0.25. U nekim slučajevima, pdi može da se kreće od oko nule do oko 0.2. U nekim slučajevima, pdi može da bude manji od oko 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, ili 0.4.
[0148] Ovde otkriveni LNP imaju veličinu (npr. Z-uprosečeni prečnik) od oko 1 do oko 250 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 10 do oko 200 nm. U daljim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 20 do oko 150 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 50 do oko 150 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 50 do oko 100 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 50 do oko 120 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 60 do oko 100 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 75 do oko 150 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 75 do oko 120 nm. U nekim slučajevima, LNP imaju veličinu od oko 75 do oko 100 nm. Osim ako nije drugačije naznačeno, sve veličine koje se ovde pominju su prosečne veličine (prečnici) potpuno formiranih nanočestica, merene dinamičkim rasipanjem svetlosti na uređaju Malvern Zetasizer. Uzorak nanočestica je razblažen u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) tako da je brzina brojanja približno 200-400 hiljada impulsa u sekundi (eng. - kilocounts per second, kcps). Podaci su predstavljeni kao ponderisana prosečna mera intenziteta (Z-uprosečeni prečnik).
[0149] U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom efikasnošću inkapsulacije koja se kreće od oko 50% do oko 100%. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom efikasnošću inkapsulacije koja se kreće od oko 50% do oko 70%. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom efikasnošću inkapsulacije koja se kreće od oko 70% do oko 90%. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom efikasnošću inkapsulacije koja se kreće od oko 90% do oko 100%. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom efikasnošću inkapsulacije koja se kreće od oko 75% do oko 95%.
[0150] U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom molekulskom težinom u rasponu od oko 1.00E+05 g/mol do oko 1.00E+10 g/mol. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom molekulskom težinom u rasponu od oko 5.00E+05 g/mol do oko 7.00E+07 g/mol. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom molekulskom težinom u rasponu od oko 1.00E+06 g/mol do oko 1.00E+10 g/mol. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom molekulskom težinom u rasponu od oko 1.00E+07 g/mol do oko 1.00E+09 g/mol. U nekim slučajevima, LNP se formiraju sa prosečnom molekulskom težinom u rasponu od oko 5.00E+06 g/mol do oko 5.00E+09 g/mol.
[0151] U nekim slučajevima, polidisperznost (Mw/Mn; odnos težinski uprosečene molarne mase (Mw) i brojno uprosečene molarne mase (Mn)) može da se kreće od oko 1.000 do oko 2.000. U nekim slučajevima, Mw/Mn može da se kreće od oko 1.00 do oko 1.500. U nekim slučajevima, Mw/Mn može da se kreće od oko 1.020 do oko 1.400. U nekim slučajevima, Mw/Mn može da se kreće od oko 1.010 do oko 1.100. U nekim slučajevima, Mw/Mn može da se kreće od oko 1.100 do oko 1.350.
Postupci za genetsko modifikovanje ćelija; genetski modifikovane ćelije
[0152] Kompozicije LNP koje su ovde otkrivene mogu da se koriste u postupcima za genetsko modifikovanje ćelija kroz editovanje gena, i in vivo i in vitro. U nekim slučajevima, postupci uključuju dovođenje u kontakt ćelije sa kompozicijom LNP koja je ovde opisana.
[0153] U nekim slučajevima, postupci uključuju dovođenje u kontakt ćelije u subjektu, kao što je sisar, kao što je čovek. U nekim slučajevima, ćelija se nalazi u organu, kao što je jetra, kao što je jetra sisara, kao što je jetra čoveka. U nekim slučajevima, ćelija je ćelija jetre, kao što je ćelija jetre sisara, kao što je ćelija jetre čoveka. U nekim slučajevima, ćelija je hepatocit, kao što je hepatocit sisara, kao što je hepatocit čoveka. U nekim slučajevima, ćelija jetre je matična ćelija. U nekim slučajevima, ćelija jetre čoveka može da bude sinusoidna endotelna ćelija jetre (LSEC). U nekim slučajevima, ćelija jetre čoveka može da bude Kupferova ćelija. U nekim slučajevima, ćelija jetre čoveka može da bude stelatna ćelija jetre. U nekim slučajevima, ćelija jetre čoveka može da bude tumorska ćelija. U nekim slučajevima, ćelija jetre čoveka može da bude matična ćelija jetre. U dodatnim slučajevima, ćelija sadrži receptore koji vezuju ApoE. U nekim slučajevima, ćelija jetre kao što je hepatocit je in situ. U nekim slučajevima, ćelija jetre kao što je hepatocit je izolovana, na primer, u kulturi, na primer u primarnoj kulturi. Takođe su otkriveni postupci koji odgovaraju upotrebama koje su ovde otkrivene, koji obuhvataju davanje kompozicija LNP koje su ovde otkrivene subjektu, ili dovođenje u kontakt ćelija, kao što su one gore opisane, sa kompozicijama LNP koje su ovde otkrivene.
[0154] U nekim slučajevima se otkrivaju genetski modifikovane ćelije, na primer genetski modifikovana ćelija koja potiče iz bilo kog tipa ćelija u prethodnom paragrafu. Takve genetski modifikovane ćelije se proizvode prema postupcima koji su ovde opisani. U nekim slučajevima, genetski modifikovana ćelija se nalazi u tkivu ili organu, na primer, u jetri unutar subjekta.
[0155] U nekim od ovde opisanih postupaka i ćelija, ćelija sadrži modifikaciju, na primer inserciju ili deleciju („indel“) ili supstituciju nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata inserciju 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više nukleotida u ciljnu sekvencu. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata inserciju 1 ili 2 nukleotida u ciljnu sekvencu. U drugim slučajevima, modifikacija obuhvata deleciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata deleciju 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija sadrži indel koji rezultuje mutacijom koja pomera okvir čitanja u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata supstituciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata supstituciju ili 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija sadrži jednu ili više insercija, delecija ili supstitucija nukleotida kao rezultat inkorporacije matrične nukleinske kiseline, na primer bilo koje od matričnih nukleinskih kiselina opisanih ovde.
[0156] U nekim slučajevima, otkrivena je populacija ćelija koja sadrži genetski modifikovane ćelije, na primer, populacija ćelija koja sadrži genetski modifikovane ćelije prema ovde opisanim postupcima. U nekim slučajevima, populacija sadrži genetski modifikovane ćelije koje su kultivisane in vitro. U nekim slučajevima, populacija se nalazi u tkivu ili organu, na primer, u jetri unutar subjekta. U nekim slučajevima, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, na najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% ili više ćelija unutar populacije je genetski modifikovano. U određenim slučajevima, postupak koji je ovde otkriven rezultuje u najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% efikasnosti editovanja (ili „procenta editovanja“), definisano delecijom indela. U drugim slučajevima, postupak koji je ovde otkriven rezultuje u najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% efikasnosti modifikacije DNK, definisane detektovanjem promene u sekvenci, bilo insercijom, delecijom, supstitucijom ili na neki drugi način. U određenim slučajevima, postupak koji je ovde otkriven rezultuje nivoom efikasnosti editovanja ili stepenom efikasnosti modifikacije DNK između oko 5% do oko 100%, oko 10% do oko 50%, oko 20 do oko 100%, oko 20 do oko 80%, oko 40 do oko 100%, ili oko 40 do oko 80% u ćelijskoj populaciji.
[0157] U nekim od ovde opisanih postupaka i ćelija, ćelije unutar populacije sadrže modifikaciju, npr. indel ili supstituciju na ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata inserciju 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više nukleotida u ciljnu sekvencu. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata inserciju 1 ili 2 nukleotida u ciljnu sekvencu. U drugim slučajevima, modifikacija obuhvata deleciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata deleciju 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija rezultuje mutacijom koja pomera okvir čitanja u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija sadrži indel koji rezultuje mutacijom koja pomera okvir čitanja u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% ili više genetski modifikovanih ćelija u populaciji sadrži mutaciju koja pomera okvir čitanja. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata supstituciju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ili više nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija obuhvata supstituciju ili 1 ili 2 nukleotida u ciljnoj sekvenci. U nekim slučajevima, modifikacija sadrži jednu ili više insercija, delecija ili supstitucija nukleotida kao rezultat inkorporacije matrične nukleinske kiseline, na primer bilo koje od matričnih nukleinskih kiselina opisanih ovde.
Postupci za editovanje gena
[0158] Kompozicije LNP koje su ovde otkrivene mogu se koristiti za editovanje gena in vivo i in vitro. U jednom slučaju, jedna ili više kompozicija LNP opisanih ovde mogu da se daju subjektu kome je to potrebno. U jednom slučaju, jedna ili više kompozicija LNP opisanih ovde može doći u kontakt sa ćelijom. U jednom slučaju, terapeutski efikasna količina kompozicije koja je ovde opisana može doći u kontakt sa ćelijom subjekta kome je to potrebno. U jednom slučaju, genetski modifikovana ćelija može da bude proizvedena dovođenjem u kontakt ćelije sa kompozicijom LNP koja je ovde opisana. U različitim slučajevima, postupci obuhvataju uvođenje matrične nukleinske kiseline u ćeliju ili subjekt, kao što je gore navedeno.
[0159] U nekim slučajevima, postupci uključuju primenu kompozicije LNP na ćeliji koja je povezana sa poremećajem jetre. U nekim slučajevima, postupci uključuju lečenje poremećaja jetre. U određenim slučajevima, postupci uključuju dovođenje u kontakt ćelije jetre sa kompozicijom LNP. U određenim slučajevima, postupci uključuju dovođenje u kontakt hepatocita sa kompozicijom LNP. U nekim slučajevima, postupci uključuju dovođenje u kontakt ApoE-vezujuće ćelije sa kompozicijom LNP.
[0160] U jednom slučaju, kompozicija LNP koja sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2 i gRNK može da se primeni na ćeliju, kao što je ApoE-vezujuća ćelija. U dodatnim slučajevima, matrična nukleinska kiselina se takođe uvodi u ćeliju. U određenim slučajevima, kompozicija LNP koja sadrži Cas nukleazu klase 2 i sgRNK može da se primeni na ćeliju, kao što je ApoE-vezujuća ćelija. U jednom slučaju, kompozicija LNP koja sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu klase 2, gRNK i matricu može da se primeni na ćeliju. U određenim slučajevima, kompozicija LNP koja sadrži Cas nukleazu i sgRNK može da se primeni na ćeliju jetre. U nekim slučajevima, ćelija jetre je u subjektu.
[0161] U određenim slučajevima, subjekt može da primi jednu dozu kompozicije LNP. U drugim primerima, subjekt može da primi višestruke doze kompozicije LNP. U nekim slučajevima, kompozicija LNP se primenjuje 2-5 puta. Kada se primenjuje više od jedne doze, doze se mogu primeniti u razmaku od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 ili 28 dana; oko 2, 3, 4, 5 ili 6 meseci; ili u razmaku od 1, 2, 3, 4 ili 5 godina. U određenim slučajevima, editovanje se poboljšava nakon ponovne primene kompozicije LNP.
[0162] U jednom slučaju, kompozicija LNP koja sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2, može da se primeni na ćeliju, odvojeno od primene kompozicije koja sadrži gRNK. U jednom slučaju, kompozicija LNP koja sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu kao što je Cas nukleaza klase 2 i gRNK može da se primeni na ćeliju, odvojeno od primene matrične nukleinske kiseline na ćeliju. U jednom slučaju, kompozicija LNP koja sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu, kao što je Cas nukleaza klase 2, može da se primeni na ćeliju, nakon čega sledi sekvencijalna primena kompozicije LNP koja sadrži gRNK, a zatim matrice, na ćeliju. U slučajevima kada se kompozicija LNP koja sadrži iRNK koja kodira Cas nukleazu daje pre kompozicije LNP koja sadrži gRNK, primene mogu da budu razdvojene oko 4, 6, 8, 12 ili 24 sata; ili 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana.
[0163] U jednom slučaju, kompozicije LNP se mogu koristiti za editovanje gena što dovodi do inaktivacije gena. Na primer, kompozicije LNP mogu da se koriste za editovanje gena koje rezultuje utišavanjem gena u populaciji ćelija. U drugom slučaju, kompozicije LNP mogu da se koriste za editovanje gena koje rezultuje korekcijom gena. U daljem slučaju, kompozicije LNP mogu da se koriste za editovanje ćelije koje rezultuje insercijom gena.
[0164] U jednom slučaju, primena kompozicija LNP može da rezultuje editovanjem gena koje dovodi do perzistentnog odgovora. Na primer, primena može da dovede do trajanja odgovora od jednog dana, meseca, godine ili duže. Kako se ovde koristi, „trajanje odgovora“ znači da, nakon što su ćelije uređene korišćenjem kompozicije LNP koja je ovde otkrivena, rezultujuća modifikacija je i dalje prisutna tokom određenog vremenskog perioda nakon primene kompozicije LNP. Modifikacija se može otkriti merenjem nivoa ciljnog proteina. Modifikacija se može otkriti detekcijom ciljne DNK. U nekim slučajevima, trajanje odgovora može da bude najmanje 1 nedelju. U drugim slučajevima, trajanje odgovora može da bude najmanje 2 nedelje. U jednom slučaju, trajanje odgovora može da bude najmanje 1 mesec. U nekim slučajevima, trajanje odgovora može da bude najmanje 2 meseca. U jednom slučaju, trajanje odgovora može da bude najmanje 4 meseca. U jednom slučaju, trajanje odgovora može da bude najmanje 6 meseci. U određenim slučajevima, trajanje odgovora može da bude oko 26 nedelja. U nekim slučajevima, trajanje odgovora može da bude najmanje 1 godinu. U nekim slučajevima, trajanje odgovora može da bude najmanje 5 godina. U nekim slučajevima, trajanje odgovora može da bude najmanje 10 godina. U nekim slučajevima, perzistentni odgovor je detektabilan nakon najmanje 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21, ili 24 meseca, bilo merenjem nivoa ciljnog proteina ili detekcijom ciljne DNK. U nekim slučajevima, perzistentni odgovor je detektabilan nakon najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ili 20 godina, bilo merenjem nivoa ciljnog proteina ili detekcijom ciljne DNK.
[0165] Kompozicije LNP mogu da se primene parenteralno. Kompozicije LNP mogu da se primene direktno u krvotok, u tkivo, u mišić ili u unutrašnji organ. Primena može da bude sistemska, npr. injekcijom ili infuzijom. Primena može da bude lokalna. Pogodni načini za primenu uključuju intravensku, intraarterijsku, intratekalnu, intraventrikularnu, intrauretralnu, intrasternalnu, intrakranijalnu, subretinalnu, intravitrealnu, u prednju komoru, intramuskularnu, intrasinovijalnu, intradermalnu i subkutanu primenu. Pogodni uređaji za primenu uključuju iglu (uključujući mikro iglu) injektore, injektore bez igle, osmotske pumpe i tehnike infuzije.
[0166] Kompozicije LNP će generalno, ali ne nužno, biti primenjene kao formulacija zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Izraz „ekscipijens“ uključuje bilo koji sastojak različit od jednog ili više jedinjenja otkrića, druge/drugih lipidnih komponenti i biološki aktivnog agensa. Ekscipijens može formulacijama dati ili funkcionalnu (npr. kontrola brzine oslobađanja leka) i/ili nefunkcionalnu (npr. pomoćno sredstvo za obradu ili razblaživač) karakteristiku. Izbor ekscipijensa će u velikoj meri zavisiti od faktora kao što su konkretan način primene, efekat ekscipijensa na rastvorljivost i stabilnost i priroda doznog oblika.
[0167] Parenteralne formulacije su tipično vodeni ili uljani rastvori ili suspenzije. Kada je formulacija vodena, koriste se ekscipijensi kao što su šećeri (uključujući, ali ne ograničavajući se na glukozu, manitol, sorbitol, itd.) soli, ugljeni hidrati i puferski agensi (poželjno do pH od 3 do 9), ali, za neke primene, one mogu da budu pogodnije formulisane sa sterilnim nevodenim rastvorom ili kao osušeni oblik koji se koristi u kombinaciji sa odgovarajućim vehikulumom, kao što je sterilna voda bez pirogena (WFI).
[0168] I prethodni opšti opis i detaljni opis, kao i sledeći primeri, su samo primeri i objašnjenja i ne ograničavaju navode. Naslovi odeljaka koji se ovde koriste služe samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje željene teme na bilo koji način. U slučaju da je bilo koja literatura citirana ovde u suprotnosti sa bilo kojim terminom definisanim u ovoj specifikaciji, prevagu ima ova specifikacija. Svi opsezi dati u aplikaciji obuhvataju krajnje tačke, osim ako nije drugačije navedeno.
[0169] Treba napomenuti da, kako se koriste u ovoj prijavi, oblici pojma u jednini uključuju pozivanje na pojam u množini, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na „kompoziciju“ uključuje mnoštvo kompozicija, a pozivanje na „ćeliju“ uključuje mnoštvo ćelija i slično. Upotreba „ili“ je inkluzivna i znači „i/ili“, osim ako nije drugačije navedeno.
[0170] Numerički opsezi uključuju brojeve koji definišu opseg. Izmerene i merljive vrednosti se smatraju približnim, uzimajući u obzir značajne cifre i grešku povezanu sa merenjem. Izraz „oko“ ili „približno“ označava prihvatljivu grešku za određenu vrednost, kako je odredio stručnjak u ovoj oblasti, što delimično zavisi od toga kako se vrednost meri ili određuje. Korišćenje modifikatora kao što je „oko“ ispred opsega ili pre liste vrednosti, menja svaku krajnju tačku opsega ili svaku vrednost na listi. „Oko“ takođe uključuje vrednost ili krajnju tačku. Na primer, „oko 50-55“ obuhvata „oko 50 do oko 55“. Takođe, upotreba reči „sadrže“, „sadrži“, „koji sadrži“, „obuhvataju“, „obuhvata“, „koji obuhvata“, „uključuju“, „uključuje“ i „uključujući“ nije ograničavajuća.
[0171] Osim ako nije posebno navedeno u gornjoj specifikaciji, u slučajevima ili primerima izvođenja u specifikaciji u kojima se navodi da određeni pojam „sadrži“ različite komponente, takođe se smatra da se taj pojam „sastoji od“ ili „suštinski sastoji od“ navedenih komponenti; u slučajevima ili primerima izvođenja u specifikaciji koji navode da se određeni pojam „sastoji od“ različitih komponenti, takođe se smatra da taj pojam „sadrži“ ili „se suštinski sastoji od“ navedenih komponenti; slučajeve ili primere izvođenja u specifikaciji koji navode „oko“ različitih komponenti takođe treba razmatrati kao „pri“ navedenim komponentama; i u slučajevima ili primerima izvođenja u specifikaciji u kojima se navodi da se određeni pojam „suštinski sastoji od“ različitih komponenti, takođe se smatra da se taj pojam „sastoji od“ ili „sadrži“ navedene komponente (ova zamenljivost se ne primenjuje na upotrebu ovih termina u patentnim zahtevima).
[0172] Sledeći primeri su namenjeni da ilustruju pronalazak, ali ne spadaju svi u obim patentnih zahteva.
PRIMERI
Primer 1 – Kompozicije LNP za in vivo editovanje kod miševa
[0173] Pripremljeni su preparati različitih kompozicija LNP malog obima da bi se ispitala njihova svojstva. U testovima za procentualno editovanje u jetri miševa, iRNK Cas9 i hemijski modifikovana sgRNK usmerena na TTR sekvencu miša su formulisane u LNP sa različitim mol% PEG, mol% lipida A i odnosima N:P, kao što je opisano u tabeli 2, ispod.
Tabela 2. Kompozicije LNP.
[0174] Na sl. 1, formulacije LNP su identifikovane na X-osi na osnovu mol% lipida A i odnosa N:P, označenih sa „% CL; N:P“. Kao što je naznačeno u legendi na sl.1, koncentracije PEG-2k-DMG od 2, 2.5, 3, 4 ili 5 mol% su formulisane sa (1) 45 mol% lipida A; 4.5 N:P („45; 4.5“); (2) 45 mol% lipida A; 6 N:P („45; 6“); (3) 50 mol% lipida A; 4.5 N:P („50; 4.5“); (4) 50 mol% lipida A; 6 N:P („50; 6“); (5) 55 mol% lipida A; 4.5 N:P („55; 4.5“); i (6) 55 mol% lipida A; 6 N:P („55; 6“). mol% DSPC je održavan konstantnim na 9 mol% i mol% holesterola je dodat kako bi se lipidna komponenta svake formulacije dovela do 100 mol%. Svaka od 30 formulacija je formulisana kao što je opisano u nastavku i primenjena kao pojedinačna doza u dozama od 1 mg po kg ili 0.5 mg po kg ukupne RNK, (Sl.1A, odnosno Sl.1B).
Formulacija LNP - NanoAssemblr
[0175] Komponente lipidnih nanočestica su rastvorene u 100% etanolu sa molarnim odnosima lipidnih komponenti koji su gore navedeni. Kargo RNK su rastvorene u 25 mM citrata, 100 mM NaCl, pH 5.0, što je rezultovalo koncentracijom karga RNK od približno 0.45 mg/mL. LNP su formulisane sa molarnim odnosom aminolipida prema RNK fosfatu (N:P) od oko 4.5 ili oko 6, sa odnosom iRNK prema gRNK od 1:1 po težini.
[0176] LNP su formirane mikrofluidnim mešanjem rastvora lipida i RNK pomoću stonog instrumenta Precision Nanosystems NanoAssemblr<™>, prema protokolu proizvođača. Odnos vodenog i organskog rastvarača od 2:1 je održavan tokom mešanja korišćenjem diferencijalnih brzina protoka. Posle mešanja, LNP su sakupljene, razblažene u vodi (približno 1:1 zapr./zapr.), držane 1 sat na sobnoj temperaturi i dodatno razblažene vodom (približno 1:1 zapr./zapr.) pre finalne izmene pufera. Finalna izmena pufera u 50 mM Tris, 45 mM NaCl, 5% (tež./zapr.) saharoze, pH 7.5 (TSS) je obavljena pomoću kolone za odsoljavanje PD-10 (GE). Po potrebi, formulacije su koncentrovane centrifugiranjem sa centrifugalnim filterima Amicon od 100 kDa (Millipore). Dobijena smeša je zatim filtrirana korišćenjem sterilnog filtera od 0.2 μm. Finalne LNP su čuvane na -80 °C do dalje upotrebe.
Analitika formulacije
[0177] Dinamičko rasejanje svetlosti („DLS“) se koristi za karakterizaciju indeksa polidisperznosti („pdi“) i veličine LNP ovog otkrića. DLS meri rasipanje svetlosti koje je rezultat izlaganja uzorka izvoru svetlosti. PDI, određen pomoću DLS merenja, predstavlja raspodelu veličine čestica (oko srednje veličine čestica) u populaciji, gde savršeno uniformna populacija ima PDI od nula.
[0178] Elektroferetsko rasejanje svetlosti se koristi za karakterizaciju površinskog naelektrisanja LNP na određenom pH. Površinsko naelektrisanje, ili zeta potencijal, je mera veličine elektrostatičkog odbijanja/privlačenja između čestica u suspenziji LNP.
[0179] Frakcionisanje strujanja u polju sa asimetričnim protokom – višeugaono rasejanje svetlosti (AF4-MALS) se koristi za razdvajanje čestica u formulaciji hidrodinamičkim radijusom i zatim merenje molekulskih težina, hidrodinamičkih radijusa i srednje kvadratne vrednosti radijusa frakcionisanih čestica. Ovo pruža mogućnost procene raspodela molekulskih težina i veličina, kao i sekundarnih karakteristika kao što je Burchard-Stockmeyer grafikon (odnos srednje kvadratne vrednosti („rms“) poluprečnika prema hidrodinamičkom radijusu tokom vremena koji ukazuje na unutrašnju gustinu jezgra čestice) i dijagram rms konformacije (log rms radijusa u odnosu na log molekulske težine gde nagib rezultujuće linearne aproksimacije daje stepen kompaktnosti u odnosu na elongaciju).
[0180] Analiza putanje nanočestica (NTA, Malvern Nanosight) se može koristiti za određivanje raspodele veličine čestica formulacije kao i koncentracije čestica. Uzorci LNP se razblažuju na odgovarajući način i nanose na mikropreparat. Kamera snima rasejanu svetlost dok čestice polako difunduju kroz vidno polje. Nakon što je zabeležen, video zapis se obrađuje pomoću analize putanje nanočestica praćenjem piksela i izračunavanjem koeficijenta difuzije. Ovaj koeficijent difuzije se može prevesti u hidrodinamički radijus čestice. Instrument takođe određuje broj pojedinačnih čestica prebrojanih u analizi za određivanje koncentracije čestica.
[0181] Krioelektronska mikroskopija („krio-EM“) se može koristiti za određivanje veličine čestica, morfologije i strukturnih karakteristika LNP.
[0182] Analiza sastava lipida LNP može se odrediti tečnom hromatografijom praćenom detekcijom naelektrisanog aerosola (LC-CAD). Ova analiza može da obezbedi poređenje stvarnog sadržaja lipida sa teorijskim sadržajem lipida.
[0183] U formulacijama LNP analizirana je prosečna veličina čestica, indeks polidisperznosti (pdi), ukupan sadržaj RNK, efikasnost inkapsulacije RNK i zeta potencijal. Formulacije LNP se mogu dalje okarakterisati analizom lipida, AF4-MALS, NTA i/ili krio-EM. Prosečna veličina čestica i polidisperznost se mere dinamičkim rasejanjem svetlosti (DLS) korišćenjem instrumenta za određivanje DLS Malvern Zetasizer. Uzorci LNP su razblaženi 30X u PBS pre merenja pomoću DLS. Uporedo sa brojno uprosečenim prečnikom i pdi prikazan je Z-uprosečeni prečnik koji predstavlja meru prosečne veličine čestica zasnovanu na intenzitetu. Instrument Malvern Zetasizer se takođe koristi za merenje zeta potencijala LNP. Uzorci su razblaženi 1:17 (50 µL u 800 µL) u 0.1X PBS, pH 7.4 pre merenja.
[0184] Test zasnovan na fluorescenciji (Ribogreen<®>, ThermoFisher Scientific) se koristi za određivanje koncentracije ukupne RNK i slobodne RNK. Efikasnost inkapsulacije se izračunava kao (Ukupna RNK - Slobodna RNK)/Ukupna RNK. Uzorci LNP se razblažuju na odgovarajući način 1x TE puferom koji sadrži 0.2% Triton-X 100 za određivanje ukupne RNK, ili 1x TE puferom za određivanje slobodne RNK. Standardne krive se prave korišćenjem početnog rastvora RNK, korišćenog za pravljenje formulacija, i razblaženog u 1x TE puferu /- 0.2% Triton-X 100, zatim se svakom standardu i uzorku dodaje razblažena RiboGreen<®>boja (prema uputstvima proizvođača) i ostavlja da se inkubira približno 10 minuta na sobnoj temperaturi, u odsustvu svetlosti. Čitač mikroploča SpectraMak M5 (Molecular Devices) se koristi za očitavanje uzoraka sa talasnim dužinama ekscitacije, automatskog prekidanja i emisije podešenim redom na 488 nm, 515 nm i 525 nm. Ukupna RNK i slobodna RNK se određuju iz odgovarajućih standardnih krivih.
[0185] Efikasnost inkapsulacije se izračunava kao (Ukupna RNK - Slobodna RNK)/Ukupna RNK. Isti postupak može da se koristi za određivanje efikasnosti inkapsulacije komponente na bazi DNK ili karga koji sadrži nukleinsku kiselinu. Za jednolančanu DNK može da se koristi boja Oligreen, a za dvolančanu DNK boja Picogreen.
[0186] AF4-MALS se koristi za određivanje raspodela molekulske težine i veličine, kao i sekundarnih statističkih podataka iz tih proračuna. LNP se razblažuju prema potrebi i ubrizgavaju u kanal za odvajanje AF4 pomoću HPLC autosemplera gde se fokusiraju, a zatim eluiraju eksponencijalnim gradijentom u poprečnom toku kroz kanal. Svu tečnost pokreće HPLC pumpa i instrument Wyatt Eclipse. Čestice koje eluiraju iz AF4 kanala teku kroz UV detektor, detektor višeugaonog rasejanja svetlosti, detektor kvazielastičnog rasejanja svetlosti i diferencijalni refraktometrijski detektor. Neobrađeni podaci se obrađuju korišćenjem Debeye modela za određivanje molekulske težine i rms radijusa iz signala detektora.
[0187] Lipidne komponente u LNP se kvantitativno analiziraju pomoću HPLC spojene sa detektorom naelektrisanog aerosola (CAD). Hromatografsko razdvajanje 4 lipidne komponente se postiže pomoću reverzno-fazne HPLC. CAD je destruktivni maseni detektor koji detektuje sva neisparljiva jedinjenja i signal je konzistentan bez obzira na strukturu analita.
Kargo iRNK Cas9 i gRNK
[0188] Kargo iRNK Cas9 je pripremljen in vitro transkripcijom. Poliadenilovana iRNK Cas9 sa kapom koja sadrži 1X NLS (SEQ ID NO:48) je generisana in vitro transkripcijom korišćenjem linearizovane plazmidne DNK matrice i RNK polimeraze T7. Plazmidna DNK koja sadrži promotor T7 i poli(A/T) region od 100 nt je linearizovana inkubacijom na 37 °C tokom 2 sata sa XbaI pod sledećim uslovima: 200 ng/µL plazmida, 2 U/µL XbaI (NEB) i 1x reakcioni pufer. XbaI je inaktivisan zagrevanjem reakcije na 65 °C tokom 20 min. Linearizovani plazmid je prečišćen od enzima i puferskih soli korišćenjem silika kolone Maxi Spin (Epoch Life Sciences) i analiziran na agaroznom gelu da bi se potvrdila linearizacija. Reakciona smeša IVT za dobijanje modifikovane iRNK Cas9 je inkubirana na 37 °C tokom 4 sata u sledećim uslovima: 50 ng/µL linearizovanog plazmida; po 2 mM GTP, ATP, CTP i N1-metil pseudo-UTP (Trilink); 10 mM ARCA (Trilink); 5 U/µL RNK polimeraze T7 (NEB); 1 U/µL inhibitora mišje RNAze (NEB); 0.004 U/µL neorganske pirofosfataze E. coli (NEB); i 1x reakcionog pufera. Posle inkubacije od 4 sata, dodata je DNaza TURBO (ThermoFisher) do konačne koncentracije od 0.01 U/µL, i reakcija je inkubirana dodatnih 30 minuta da bi se uklonila DNK matrica. iRNK Cas9 je prečišćena od enzima i nukleotida korišćenjem kompleta MegaClear Transcription Clean-up prema protokolu proizvođača (ThermoFisher). Alternativno, iRNK Cas9 je prečišćena metodom precipitacije pomoću LiCl.
[0189] U ovom primeru, sgRNK je hemijski sintetizovana i dobijena od komercijalnog dobavljača.
Sekvenca sg282 je data ispod, sa modifikacijama 2'-O-metil i fosforotioatnim vezama kao što je prikazano u nastavku (m = 2'-OMe; * = fosforotioat):
LNP
[0190] Finalne čestice LNP su okarakterisane da bi se odredila efikasnost inkapsulacije, indeks polidisperznosti i prosečna veličina čestica prema gore navedenim analitičkim metodama.
[0191] LNP su date miševima (jedna doza od 1 mg/kg ili 0.5 mg/kg) i genomska DNK je izolovana za NGS analizu kao što je opisano u nastavku.
Isporuka LNP in vivo
[0192] U svakoj studiji korišćene su ženke CD-1 miševa starosti od 6 do 10 nedelja. Životinje su merene i grupisane prema telesnoj težini za pripremu rastvora za doziranje na osnovu prosečne težine grupe. LNP su primenjene preko lateralne repne vene u zapremini od 0.2 mL po životinji (približno 10 mL po kilogramu telesne težine). Životinje su posmatrane oko 6 sati nakon primene doze zbog neželjenih efekata. Telesna težina je merena dvadeset četiri sata nakon primene, a životinje su eutanazirane u različitim vremenskim tačkama iskrvavljenjem putem punkcije srca pod izofluranskom anestezijom. Krv je sakupljena u epruvete za odvajanje seruma ili u epruvete koje sadrže puferovani natrijum citrat za plazmu kao što je ovde opisano. Za studije koje uključuju in vivo editovanje, tkivo jetre je sakupljeno iz medijalnog režnja ili iz tri nezavisna režnja (npr. desni medijalni, levi medijalni i levi lateralni režanj) od svake životinje za ekstrakciju i analizu DNK.
[0193] Kohorte miševa su merene za editovanje u jetri pomoću sekvenciranja sledeće generacije (NGS) i nivoa TTR u serumu (podaci nisu prikazani).
Analiza transtiretina (TTR) ELISA metodom
[0194] Krv je sakupljena i serum je izolovan kako je naznačeno. Ukupni nivoi TTR u serumu miševa su određeni korišćenjem ELISA kompleta za prealbumin miša (transtiretin) (Aviva Systems Biology, kat. OKIA00 111). Nivoi TTR u serumu pacova mereni su korišćenjem ELISA kompleta specifičnog za pacove (Aviva Systems Biology kataloški broj OKIA00159) u skladu sa protokolom proizvođača. Ukratko, serumi su serijski razblaženi sa razblaživačem za uzorak iz kompleta do finalnog razblaženja od 10000 puta. Ovaj razblaženi uzorak je zatim dodat na ploče za ELISA test i analiza je nakon toga sprovedena prema uputstvima.
Sekvenciranje NGS
[0195] Ukratko, da bi se kvantitativno odredila efikasnost editovanja na ciljnoj lokaciji u genomu, izolovana je genomska DNK i korišćeno je duboko sekvenciranje da se identifikuje prisustvo insercija i delecija uvedenih editovanjem gena.
[0196] Prajmeri za PCR su dizajnirani oko ciljnog mesta (npr. TTR), i genomsko područje od interesa je amplifikovano. Sekvence prajmera su date u nastavku. Dodatni PCR je izveden u skladu sa protokolima proizvođača (Illumina) da bi se dodale neophodne hemijske komponente za sekvenciranje. Amplikoni su sekvencionirani na instrumentu Illumina MiSeq. Očitavanja su usklađena sa referentnim genomom čoveka (npr. hg38) nakon eliminisanja onih koji imaju niske ocene kvaliteta. Dobijene datoteke koje sadrže očitavanja su mapirane u referentni genom (BAM datoteke), gde su izabrana očitavanja koja se preklapaju sa ciljnim regionom od interesa, i izračunat je broj očitavanja divljeg tipa naspram broja očitavanja koja sadrže inserciju, supstituciju i deleciju.
[0197] Procenat editovanja (npr. „efikasnost editovanja“ ili „procenat editovanja“) je definisan kao ukupan broj očitavanja sekvence sa insercijama ili delecijama u odnosu na ukupan broj očitavanja sekvenci koje uključuju divlji tip.
[0198] Sl.1 prikazuje procente editovanja u jetri miša, merene pomoću NGS. Kao što je prikazano na sl. 1A, kada se dozira 1 mg po kg RNK, procenti editovanja in vivo se kreću od oko 20% do preko 60% editovanja u jetri. Pri dozi od 0.5 mg po kg, sl. 1B, primećeno je oko 10% do 60% editovanja u jetri. U ovom in vivo testiranju na miševima, sve kompozicije su efikasno isporučivale iRNK Cas9 i gRNK ćelijama jetre, što dokazuje visoku aktivnost nukleaze CRISPR/Cas na ciljnom mestu izmerenu pomoću NGS za svaku kompoziciju LNP. LNP koje sadrže 5% PEG lipida imale su nižu inkapsulaciju (podaci nisu prikazani) i donekle smanjenu potentnost.
Primer 2 - Analitika kompozicija LNP
[0199] Analitička karakterizacija LNP pokazuje poboljšanje fizičko-hemijskih parametra LNP formulisanih sa rastućim količinama lipida A i PEG-lipida. Kompozicije koje sadrže 2 mol% ili 3 mol% PEG lipida (PEG2k-DMG) su date u tabeli 3 ispod.
Tabela 3.
Formulacija LNP - poprečni protok
[0200] LNP su formirane mešanjem sa udarnim mlazom lipida u etanolu sa dve zapremine rastvora RNK i jednom zapreminom vode. Lipid u etanolu se meša kroz krstasti element za mešanje sa dve zapremine rastvora RNK. Četvrti mlaz vode se meša sa izlaznom strujom krstastog elementa kroz ulazni T-element. (Videti WO2016010840 na sl.2.) LNP su držane 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim su dodatno razblažene vodom (približno 1:1 zapr./zapr.). Razblažene LNP su koncentrovane korišćenjem filtracije tangencijalnog protoka na kertridžu sa ravnim listom (Sartorius, granična vrednost molekulske težine, MWCO od 100 kD), a zatim je pufer zamenjen dijafiltracijom u 50 mM Tris, 45 mM NaCl, 5% (tež./zapr.) saharoze, pH 7.5 (TSS). Alternativno, konačna zamena pufera u TSS je obavljena pomoću kolona za odsoljavanje PD-10 (GE). Po potrebi, formulacije su koncentrovane centrifugiranjem sa centrifugalnim filterima Amicon od 100 kDa (Millipore). Dobijena smeša je zatim filtrirana korišćenjem sterilnog filtera od 0.2 μm. Finalne LNP su čuvane na 4 °C ili -80 °C do dalje upotrebe.
[0201] iRNK Cas9 i sgRNK su pripremljene kao u primeru 1, osim što poliadenilovana U-osiromašena iRNK Cas9 (Cas9 Udep) sa kapom sadrži SEQ ID N:43. Sg282 je opisana u primeru 1, a sekvenca za sg534 („G534“) je data u nastavku:
[0202] U formulacijama LNP je analizirana prosečna veličina čestica, polidisperznost (pdi), ukupan sadržaj RNK i efikasnost inkapsulacije RNK, kao što je opisano u primeru 1.
[0203] Analiza prosečne veličine čestica, polidisperznosti (PDI), sadržaja ukupne RNK i efikasnosti inkapsulacije RNK prikazana je u tabeli 4. Pored teorijske koncentracije lipida u kompozicijama LNP, analiza lipida je pokazala stvarne nivoe mol% lipida, kao što je naznačeno u tabeli 5 ispod.
Tabela 4.
[0204] Da bi se dalje analizirale fizičko-hemijske osobine, LNP897, LNP898, LNP966 i LNP969 su podvrgnuti analizi frakcionisanja strujanja u polju sa asimetričnim protokom – višeugaonog rasejanja svetlosti (AF4-MALS). Instrument AF4-MALS meri raspodele veličine čestica i molekulskih težina i pruža informacije o konformaciji i gustini čestica.
[0205] LNP se ubrizgavaju u kanal za odvajanje AF4 pomoću HPLC autosemplera gde se fokusiraju, a zatim eluiraju eksponencijalnim gradijentom u poprečnom toku kroz kanal. Svu tečnost pokreće HPLC pumpa i instrument Wyatt Eclipse. Čestice koje eluiraju iz AF4 kanala teku kroz UV detektor, detektor višeugaonog rasejanja svetlosti Wyatt Heleos II, detektor kvazielastičnog rasejanja svetlosti i diferencijalni refraktometrijski detektor Wyatt Optilab T-rEX. Neobrađeni podaci se obrađuju softverom Wyatt Astra 7 korišćenjem Debeye modela za određivanje molekulske težine i rms radijusa iz signala detektora.
[0206] Dijagram logaritamske diferencijalne molarne mase za LNP je dat na sl.2A. Ukratko, na X-osi je data molarna masa (g/mol), a na Y-osi je dat diferencijalni numerički razlomak. Dijagram logaritamske diferencijalne molarne mase pokazuje raspodelu različitih molekulskih težina izmerenih za specifičnu formulaciju. Ovo daje podatke o modu molekulskih težina, kao i o ukupnoj raspodeli molekulskih težina unutar formulacije, što daje bolju sliku heterogenosti čestica nego prosečna molekulska težina.
[0207] Heterogenost različitih formulacija LNP se određuje merenjem različitih momenata molarne mase i izračunavanjem odnosa težinski uprosečene molarne mase (Mw) i brojno uprosečene molarne mase (Mn) da bi se dobila polidisperznost Mw/Mn. Grafikon polidisperznosti za ove različite formulacije je dat na sl.2B.
[0208] Podaci ukazuju na užu raspodelu čestica sa 3 mol% PEG, i sa 50 i 55 mol% lipida A pri N/P 6.0 kao što je prikazano na sl.2A. Ovo se ogleda u uskoj polidisperznosti kao što je prikazano na sl.2B.
Primer 3 – Podaci AF4 MALS - Dodatne formulacije
[0209] Analitička karakterizacija LNP pokazuje poboljšanje fizičko-hemijskih parametara LNP formulisanih sa rastućim količinama lipida A. Kompozicije koje sadrže 45 mol%, 50 mol%, ili 55 mol% lipida A sa dve različite gRNK su date u tabeli 6 ispod.
Tabela 6.
[0210] Čestice LNP su formirane kao što je opisano u primeru 2.
[0211] iRNK Cas9 i sgRNK su pripremljene kao što je gore opisano.
[0212] Kompozicije LNP su okarakterisane da bi se odredila efikasnost inkapsulacije, indeks polidisperznosti i prosečna veličina čestica kao što je opisano u primeru 1.
[0213] Analiza prosečne veličine čestica, polidisperznosti (PDI), ukupnog sadržaja RNK i efikasnosti inkapsulacije RNK prikazana je u tabeli 7. Pored teorijske koncentracije lipida u kompozicijama LNP, analiza lipida je pokazala stvarne nivoe mol% lipida, kao što je naznačeno u tabeli 8 ispod.
Tabela 7.
Tabela 8.
LNP ID br. Lipidni odnos (Lipid Lipid A Hol. DSPC PEG
[0214] Da bi se dalje analizirale fizičko-hemijske osobine, LNP1021, LNP1022, LNP1023, LNP1024 i LNP1025 su podvrgnuti analizi frakcionisanja strujanja u polju sa asimetričnim protokom – višeugaonog rasejanja svetlosti (AF4-MALS). Instrument AF4-MALS meri raspodele veličine čestica i molekulskih težina i pruža informacije o konformaciji i gustini čestica.
[0215] LNP su ispitani na AF4-MALS kao što je opisano u primeru 1.
[0216] Dijagram logaritamske diferencijalne molarne mase za LNP je dat na sl.3A. Ukratko, na X-osi je data molarna masa (g/mol), a na Y-osi je dat diferencijalni numerički razlomak. Dijagram logaritamske diferencijalne molarne mase pokazuje raspodelu različitih molekulskih težina izračunatih za specifičnu formulaciju. Ovo daje podatke o modu molekulskih težina, kao i o ukupnoj raspodeli molekulskih težina unutar formulacije, što daje bolju sliku heterogenosti čestica nego prosečna molekulska težina.
[0217] Prosečna molekulska težina je grafički prikazana na sl.3B. Prosečna molekulska težina je prosek cele raspodele, ali ne daje informacije o obliku te raspodele. LNP1022 i LNP 1025 imaju istu prosečnu molekulsku težinu, ali LNP1022 ima nešto širu raspodelu.
[0218] Heterogenost različitih formulacija LNP se izračunava merenjem različitih momenata molarne mase i izračunavanjem odnosa težinski uprosečene molarne mase (Mw) i brojno uprosečene molarne mase (Mn) da bi se dobila polidisperznost Mw/Mn. Grafikon polidisperznosti za ove različite formulacije je dat na sl.4A.
[0219] Dodatno, grafikon Burchard-Stockmeyer LNP formulacija je dat kao sl. 4B. Grafikon Burchard-Stockmeyer pokazuje odnos rms radijusa prema hidrodinamičkom radijusu tokom eluiranja formulacije iz AF4 kanala. Ovo daje informacije o unutrašnjoj gustini lipidnih nanočestica. Slika 4B pokazuje da LNP 1021, LNP 1022 i LNP 1023 imaju različite profile u ovom merenju.
Primer 4 - Povišeni PEG lipid održava potentnost uz smanjeni odgovor citokina
[0220] U drugoj studiji, PEG DMG lipid je upoređen u LNP formulacijama koje sadrže 2 mol% ili 3 mol% PEG lipida. Kompozicije koje sadrže ili 2 mol%, ili 3 mol%, PEG DMG su date u tabeli 9 ispod.
Tabela 9.
[0221] Čestice LNP su formirane postupkom opisanim u primeru 2.
[0222] iRNK Cas9 i sgRNK su pripremljene kao u primeru 1, sa sekvencom sg390 („G390“) datom u nastavku:
[0223] U formulacijama LNP je analizirana prosečna veličina čestica, polidisperznost (pdi), ukupan sadržaj RNK i efikasnost inkapsulacije RNK kao što je opisano u primeru 1.
[0224] Analiza prosečne veličine čestica, polidisperznosti (PDI), ukupnog sadržaja RNK i efikasnosti inkapsulacije RNK prikazana je u tabeli 10. Pored teorijske koncentracije lipida u kompozicijama LNP, analiza lipida je pokazala stvarne nivoe mol% lipida, kao što je naznačeno u tabeli 11: ispod.
Tabela 10.
Tabela 11.
[0225] Citokini u serumu pacova su procenjeni korišćenjem Luminex multipleksnog testa sa magnetnim perlama (analiza magnetnih perli Milliplex MAP kompanije Millipore Sigma, kataloški broj RECYTMAG-65K) analizom MCP-1, IL-6, TNF-alfa i IFN-gama. Perle za analizu su očitane na BioRad BioPlex-200 i koncentracije citokina su izračunate na osnovu standardne krive korišćenjem 4-parametarskog logističkog fitovanja pomoću softvera BioPlex Manager verzije 6.1. Podaci su grafički prikazani na sl.5. Videti sl.5A (TTR u serumu), sl.5B (editovanje u jetri) i sl.5C (citokin p MCP1).
[0226] Nivoi TTR u serumu pacova mereni su korišćenjem ELISA kompleta specifičnog za pacove (Aviva Systems Biology kataloški broj OKIA00159) u skladu sa protokolom proizvođača. Ukratko, serumi su serijski razblaženi sa razblaživačem za uzorak iz kompleta do konačnog razblaženja od 10000 puta. Ovaj razblaženi uzorak je zatim dodat na ploče za ELISA test i analiza je nakon toga sprovedena prema uputstvima.
[0227] Genomska DNK je izolovana iz približno 10 mg tkiva jetre i analizirana korišćenjem NGS, kao što je gore opisano. Sekvence prajmera za PCR amplifikaciju su opisane u nastavku.
[0228] Sl. 5A i 5B pokazuju da su snižavanje TTR u serumu i editovanje u jetri bili dovoljni u formulacijama od 2 mol% i 3 mol% PEG. Sl. 5C pokazuje da je odgovor MCP-1 smanjen pri korišćenju formulacija PEG od 3 mol%.
Primer 5 - Isporuka LNP kod primata koji nisu ljudi
[0229] Na formulacijama LNP pripremljenim kao što je opisano u primeru 1 sprovedene su tri studije. Konkretne molarne količine i kargo su dati u tabelama 12-26. Svaka formulacija koja sadrži iRNK Cas9 i vodič RNK (gRNK) imala je odnos iRNK:gRNK od 1:1 po težini. Doze LNP (u mg/kg, ukupni sadržaj RNK), način primene i podatak o tome da li su životinje dobile predtretman deksametazonom navedeni su u tabelama. Kod životinja koje su primale predtretman deksametazonom (deks.), deks. je primenjen u dozi od 2 mg/kg IV bolus injekcijom, 1 sat pre primene LNP ili vehikuluma.
[0230] Za hemijsku analizu krvi, krv je uzimana od životinja u vremenskim terminima navedenim u tabelama ispod svakog faktora koji je meren. Indukcija citokina je merena kod NHP pre i posle tretmana. Najmanje 0.5 mL pune krvi sakupljeno je iz periferne vene sputanih, svesnih životinja u epruvetu za odvajanje seruma od 4 mL. Krv je ostavljena da se zgruša najmanje 30 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledilo centrifugiranje na 2000 xg tokom 15 minuta. Serum je alikvotiran u 2 polipropilenske mikroepruvete od po 120 uL i čuvan na -60 do -86 °C do analize. Za analizu je korišćen prilagođeni komplet U-Plex Cytokine za primate izuzev čoveka kompanije Meso Scale Discovery (MSD). U analizu su uključeni sledeći parametri INF-g, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, MCP-1 i TNF-a, sa fokusom na IL-6 i MCP-1. Reagensi i standardi kompleta su pripremljeni prema uputstvima u protokolu proizvođača. Serum NHP je korišćen u čistom obliku. Ploče su očitane na uređaju MSD Sector Imager 6000 uz analizu obavljenu programom MSD Discovery work bench, verzija 4012.
[0231] Nivoi komplementa su mereni kod životinja pre i posle tretmana pomoću enzimskog imunoeseja. Puna krv (0.5 mL) je sakupljena iz periferne vene sputanih, svesnih životinja u epruvetu koja sadrži 0.5 mL k2EDTA. Krv je centrifugirana na 2000 xg 15 minuta. Plazma je alikvotirana u 2 polipropilenske mikroepruvete od po 120 uL i čuvana na -60 do -86 °C do analize. Za analizu je korišćen komplet Quidel MicroVue Complement Plus EIA (C3a - kat br. A031) ili (Bb-kat br. A027). Reagensi i standardi kompleta su pripremljeni prema uputstvima u protokolu proizvođača. Ploče su očitane na uređaju MSD Sector Imager 6000 pri optičkoj gustini na 450 nm. Rezultati su analizirani korišćenjem 4-parametarskog fitovanja krive.
[0232] Podaci za indukciju citokina i aktivaciju komplementa dati su u tabelama ispod. „BLQ“ se u nastavku teksta odnosi na granice kvantifikacije.
Tabela 12. Studija 1.
Tabela 14. Studija 3.
Terapijska Molarni odnosi N:P Kargo veličina Način Nivo Deks.
Terapijska Molarni odnosi N:P Kargo veličina Način Nivo Deks.
Tabela 16. Merenja MCP-1 iz studije 1.
Tabela 17. Merenja komplementa C3a iz studije 1.
Tabela 18. Merenja komplementa bb iz studije 1.
Tabela 19. Merenja IL-6 iz studije 2.
T
Tabela 24. Merenja MCP-1 iz studije 2.
Tabela 25. Merenja komplementa C3a iz studije 3.
Primer 6 – Skrining PEG lipida
[0233] U drugoj studiji, upoređeni su alternativni PEG lipidi u formulacijama LNP koje sadrže 2 mol% ili 3 mol% PEG lipida.
[0234] U studiji su korišćena tri PEG lipida: Lipid 1 (DMG-PEG2k; Nof), prikazan je kao:
[0235] Lipid 2, sintetizovan kako je opisano u Heyes, et al., J. Controlled Release, 107 (2005), pp.
278-279 (Videti „Synthesis of PEG2000-C-DMA“), može se prikazati kao:
i Lipid 3, otkriven u WO2016/010840 (videti jedinjenje S027, paragrafi [00240] do [00244]) i WO2011/076807, može se prikazati kao:
[0236] Lipid A je formulisan sa svakim PEG lipidom u količini od 2 mol% i 3 mol%. Komponente lipidnih nanočestica su rastvorene u 100% etanolu sa molarnim odnosima lipidnih komponenti koji su gore navedeni. Ukratko, RNK kargo su pripremljeni u 25 mM citrata, 100 mM NaCl, pH 5.0, što je rezultovalo koncentracijom RNK karga od približno 0.45 mg/mL. Čestice LNP su formulisane sa molarnim odnosom aminolipida prema RNK fosfatu (N: P) od oko 4.5 sa odnosom iRNK prema gRNK od 1:1 po težini.
Tabela 27.
[0237] iRNK Cas9, sg282 i LNP su pripremljeni kao što je opisano u primeru 1.
[0238] Kompozicije LNP sa lipidom 1, lipidom 2 ili lipidom 3 date su ženkama miševa CD-1 i procenjene kao što je opisano u primeru 1 u dozi od 1 mg/kg i 0.5 mg/kg telesne težine. U kohortama miševa mereno je editovanje u jetri pomoću sekvenciranja sledeće generacije (NOS) i nivoa TTR u serumu prema postupcima iz primera 1.
[0239] Sl. 6A i 6B upoređuju nivoe TTR u serumu među formulacijama PEG lipida. Sl. 6A prikazuje serumski TTR u µg/mL, a sl.6B prikazuje podatke kao procenat snižavanja (%TSS). Sl.
6C prikazuje procenat editovanja postignut u jetri. Podaci ukazuju na to da je u kompozicijama LNP sa svakim od testiranih PEG lipida kod kojih je ispitivana potentnost na 2 mol% i 3 mol%, lipid 1 dosledno delovao nešto bolje od lipida 2 i lipida 3.
Primer 7 - Analozi lipida A
[0240] Određeni broj strukturnih analoga lipida A je sintetizovan i ispitan u kompozicijama LNP koje su ovde opisane.
[0241] Sinteza: Lipid A se dobija reakcijom 4,4-bis(oktiloksi)butanske kiseline („intermedijer 13b“ u primeru 13 u WO2015/095340) sa (9Z,J2Z)-3-hidroksi-2-(hidroksimetil)propil oktadeka-9,12-dienoatom („intermedijer 13c“), pre dodavanja glavne grupe reakcijom proizvoda intermedijara 13b i intermedijera 13c sa 3-dietilamino-1-propanolom. (Videti str. 84-86 u WO2015/095340.)
[0242] Intermedijer 13b iz WO2015/095340 (4,4 bis(oktiloksi)butanska kiselina) je sintetizovan preko 4,4-bis(oktiloksi)butannitrila na sledeći način:
Intermedijer 13a: 4,4-bis(oktiloksi)butannitril
[0243] U smešu 4,4-dietoksibutannitrila (9.4 g, 60 mmol) i oktan-1-ola (23.1 g, 178 mmol) dodat je piridinijum p-toluensulfonat (748 mg, 3.0 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana na 105 °C i mešana tokom 18 sati sa reakcionom posudom otvorenom za vazduh i bez postavljenog kondenzatora za refluksovanje. Reakciona smeša je zatim ohlađena do sobne temperature i prečišćena na silika gelu (0-5% gradijent etil acetata u heksanima) da bi se dobilo 10.1 g (31.0 mmol) intermedijera 13a u vidu bistrog ulja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.55 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.60 (dt, J = 9.2, 6.6 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 9.2, 6.6 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.94 (td, J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.63 - 1.50 (m, 4H), 1.38 - 1.19 (m, 20H), 0.93 - 0.82 (m, 6H) ppm.
[0244] Zatim, u rastvor intermedijera 13a (8.42 g, 31 mmol) u etanolu (30 mL) dodato je 31 mL vodenog rastvora kalijum hidroksida (2.5 M, 30.9 mL, 77.3 mmol) na sobnoj temperaturi. Nakon postavljanja posude sa refluks kondenzatorom, smeša je zagrejana na 110 °C i mešana 24 sata. Smeša je zatim ohlađena do sobne temperature, zakišeljena vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (1N) do pH 5, i ekstrahovana u heksane tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom (dva puta) i slanim rastvorom, osušeni preko anhidrovanog magnezijum sulfata i koncentrovani u vakuumu da bi se dobilo 8.15 g (23.6 mmol) intermedijera 13b kao bistro ulje, koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) & 4.50 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.57 (dt, J = 9.4, 6.7 Hz, 2H), 3.41 (dt, J = 9.3, 6.7 Hz, 2H), 2.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.92 (td,J = 7.4, 5.3 Hz, 2H), 1.56 (m, 4H), 1.37 - 1.21 (m, 20H), 0.92 - 0.83 (m, 6H) ppm (struktura ispod). Intermedijer 13b
[0245]
[0246] Korišćenjem gore opisanih postupaka, intermedijeri C(5, 6, 7, 9 i 10)-acetalne kiseline, nazvani intermedijeri B3-F3 i prikazani u nastavku, pripremljeni su korišćenjem odgovarajućih alkan-1-ol reagenasa.
[0247] Intermedijer B34,4-bis(pentiloksi)butanska kiselina
[0256]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.48 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.55 (m, 2H), 3.42 (m, 2H), 2.29 (dd, J = 10.8, 7.5 Hz, 2H), 1.90 - 1.82 (m, 2H), 1.55 (m, 4H), 1.27 (m, 28H), 0.88 (t,J = 6.7 Hz, 6H) ppm.
[0257] Acetalni analozi lipida A (C(8)) sintetizovani su reakcijom intermedijera C(5, 6, 7, 9 ili 10)-acetalne kiseline (B3-F3) sa intermedijerom 13c, pre reagovanja proizvoda iz tog koraka sa 3dietilamino-1-propanolom. (Videti str. 84-86 u WO2015/095340.) Svaki analog je sintetizovan i okarakterisan pomoću<1>H NMR (podaci nisu prikazani).
[0258] Analozi C7, C9 i C10 su formulisani sa 45 mol% analoga lipida A, 2 mol% DMG-PEG2k, 9 mol% DSPC i 44 mol% holesterola, sa odnosom N:P od 4.5. Svaki analog je takođe formulisan sa 55 mol% analoga lipida A, 2.5 mol% DMG-PEG2k, 9 mol% DSPC i 38.5 mol% holesterola, sa odnosom N:P od 6. Komponente lipidnih nanočestica su rastvorene u 100% etanolu sa molarnim odnosima lipidnih komponenti koji su gore navedeni. RNK kargo su pripremljeni u 25 mM citrata, 100 mM NaCl, pH 5.0, što je rezultovalo koncentracijom RNK karga od približno 0.45 mg/mL.
[0259] RNK kargo je uključivao iRNK Cas9 koja sadrži SEQ ID NO:43 i sg282, pripremljenu kao što je gore opisano. Čestice LNP su formirane kao što je opisano u primeru 1.
[0260] Prošireni panel acetalnih analoga, uključujući kompozicije LNP koje sadrže C(5) i C(6) analoge lipida A, ispitan je zajedno sa prethodnim panelom. Dva nova analoga su formulisana sa 55 mol% analoga lipida A, 2.5 mol% DMG-PEG2k, 9 mol% DPSC i 33.5 mol% holesterola, sa odnosom N/P od 6, kao što je gore opisano. Analiza je pokazala da su veličine svih LNP ispod 120 nm, PDI je ispod 0.2, a % inkapsulirane RNK je veći od 80%. Analitički rezultati za formulacije su u tabeli 28, ispod.
Tabela 28.
[0261] Procenjena je vrednost pKa analoga korišćenjem 6-(p-toluidino)-6-naftalen sulfonske kiseline („TNS“) rastvorene u vodi. U ovom testu 0.1 M fosfatni pufer je pripremljen na različitim vrednostima pH u rasponu od 4.5 do 10.5. Svaki analog je pojedinačno pripremljen u 100% etanolu. Lipid i TNS su zatim dodati u pufer svakog pojedinačnog pH i preneti na ploču radi analize na talasnoj dužini od 321-488 nm na čitaču ploča SpectraMax. Vrednosti su prikazane grafički da bi se generisala pKa, logIC50je korišćen kao pKa.
[0262] Ženke CD-1 miševa su primile doze kao što je opisano u primeru 1 od 0.3 mg/kg (Sl.7A-Sl. 7E), ili od 0.1 mg po kg (Sl.7F-Sl.7G). Ukratko, ženkama CD-1 miševa iz laboratorija Charles River, n = 5 po grupi, davane su kompozicije LNP u različitim dozama. Na nekropsiji (7 dana nakon davanja doze), serum je sakupljen za TTR analizu, a jetra je sakupljena za analizu editovanja. Testovi za određivanje TTR u serumu i procenta editovanja su izvedeni kao što je opisano u primeru 1. Nivoi TTR u serumu i editovanja u jetri sa Sl.7A -Sl.7E pokazuju da su svi analozi delovali uporedivo sa lipidom A pri 0.3 miligrama po kilogramu telesne težine. Sl.7F-Sl.
7G pokazuju da dok lipid A ima najveću potentnost, svi novosintetisani analozi ispoljavaju odgovarajuće snižavanje TTR i editovanje u jetri.
Primer 8 - Kriva odgovora na dozu - Primarni hepatociti majmuna makaki
[0263] Primarni hepatociti jetre. Primarni hepatociti jetre (PCR) majmuna makaki (Gibco) su odmrznuti i resuspendovani u medijumu za odmrzavanje hepatocita sa suplementima (Gibco, kat. CM7000) nakon čega je usledilo centrifugiranje na 80 g tokom 4 minuta. Supernatant je odbačen i peletirane ćelije su resuspendovane u medijumu za zasejavanje hepatocita sa kompletom suplemenata (Invitrogen, kat. A1217601 i CM3000). Ćelije su prebrojane i zasejane na ploče sa 96 bunarčića obložene Bio-coat kolagenom I (ThermoFisher, kat.877272) pri gustini od 50000 ćelija/bunarčiću. Zasejane ćelije su ostavljene 24 sata u inkubatoru za kulturu tkiva (37 °C i atmosfera sa 5% CO2) da se slegnu i zalepe za podlogu pre primene LNP. Nakon inkubacije, provereno je da li su ćelije formirale monosloj, i medijum je zamenjen medijumom za kulturu hepatocita sa kompletom suplemenata bez seruma (Invitrogen, kat. A1217601 i CM4000).
[0264] Formulacije LNP za ovu studiju (LNP1021, LNP1022, LNP1023, LNP1024, LNP1025 i LNP897) pripremljene su kako je gore opisano.
[0265] Različite doze formulacija lipidnih nanočestica koje sadrže modifikovane sgRNK su ispitane na primarnim hepatocitima majmuna makaki da bi se generisala kriva odgovora na dozu. Posle zasejavanja na ploče i 24 sata u kulturi, čestice LNP su inkubirane u medijumu za održavanje hepatocita koji sadrži 6% seruma majmuna makaki na 37 °C tokom 5 minuta. Nakon inkubacije, LNP su dodate na primarne hepatocite majmuna makaki u vidu krive sa 8 tačaka zavisnosti odgovora od 2-struke doze, počevši od 100 ng iRNK. Ćelije su lizirane 72 sata posle tretmana za analizu NGS kao što je opisano u primeru 1. Procenat editovanja je određen za različite kompozicije LNP i podaci su grafički prikazani na sl.8A. Procenat editovanja sa iRNK Cas9 (SEQ ID NO 48) i U-osiromašenom iRNK Cas9 (SEQ I NO:43) je predstavljen na sl.8B. Kompozicije LNP opisane su u tabeli 2 (LNP 897) i tabeli 5 (LNP 1021, 1022, 1023, 1024 i 1025).
[0266] Rezultati prikazuju kvantitativni test za uporednu procenu potentnosti, koji pokazuje da i iRNK i kompozicija LNP utiču na potentnost.
Primer 9 - RNK kargo: koformulacije iRNK i gRNK
[0267] U ovoj studiji ocenjivana je in vivo efikasnost kod miševa različitih odnosa gRNK prema iRNK. iRNK Cas9 sa kapom dodatom pomoću CleanCap<™>i sa ORF sekvencom SEQ ID NO: 4, HSD 5' UTR, 3' UTR humanog albumina, Kozak sekvencom i poli-A repom su napravljene IVT sintezom kao što je naznačeno u primeru 1 sa N1-metilpseudouridin trifosfatom umesto uridin trifosfata.
[0268] Formulacije LNP su pripremljene od opisane iRNK i sg282 (SEQ ID NO: 42; G282), kao što je opisano u primeru 2, sa lipidom A, holesterolom, DSPC i PEG2k-DMG u molarnom odnosu 50:38:9:3 i sa odnosom N:P od 6. Težinski odnosi gRNK:iRNK Cas9 u formulacijama su prikazani u tabeli 29.
Tabela 29.
[0269] Za in vivo karakterizaciju, gornje LNP su davane miševima u količini od 0.1 mg ukupne RNK (mg vodič RNK mg iRNK) po kg (n = 5 po grupi). Životinje su žrtvovane 7 do 9 dana nakon primene doze, krv i jetra su sakupljene, a TTR u serumu i editovanje u jetri su izmereni kao što je opisano u primeru 1. Serumski TTR i rezultati editovanja u jetri su prikazani na sl.9A i 9B. Miševi koji su bili negativna kontrola su primali vehikulum TSS.
[0270] Pored toga, gornje LNP su davane miševima u konstantnoj dozi iRNK od 0.05 mg iRNK po kg (n = 5 po grupi), dok je doza gRNK varirala od 0.06 mg po kg do 0.4 mg po kg. Životinje su žrtvovane 7 do 9 dana nakon primene doze, krv i jetra su sakupljene, a TTR u serumu i editovanje u jetri su izmereni. Serumski TTR i rezultati editovanja u jetri su prikazani na sl.9C i sl. 9D. Miševi koji su bili negativna kontrola su primali vehikulum TSS.
Primer 10 -Neutralni lipidi
[0271] Za procenu in vivo efikasnosti LNP, formulacije LNP su pripremljene sa iRNK iz primera 2 i sg534 (SEQ ID NO: 72; G534), kao što je opisano u primeru 2. Komponente lipidnih nanočestica su rastvorene u 100% etanolu sa dole navedenim molarnim odnosima lipidnih komponenti. Ukratko, RNK kargo su pripremljeni u puferu od 25 mM citrata i 100 mM NaCl na pH 5.0, što je rezultovalo koncentracijom RNK karga od približno 0.45 mg/mL. LNP su formulisane sa molarnim odnosom aminolipida prema RNK fosfatu (N:P) od oko 6 sa odnosom gRNK prema iRNK od 1:2 po težini.
[0272] Formulacije LNP su analizirane na prosečnu veličinu čestica, polidisperznost (pdi), ukupan sadržaj RNK i efikasnost inkapsulacije RNK kao što je opisano u primeru 1. Analiza prosečne veličine čestica, polidisperznosti (PDI), ukupnog sadržaja RNK i efikasnosti inkapsulacije RNK prikazana je u tabeli 30. Molarni odnosi lipida su dati kao aminolipid (lipid A)/neutralni lipid/pomoćni lipid (holesterol)/PEG lipid (PEG2k-DMG). Neutralni lipid je bio DSP, DPPC ili odsutan, kako je navedeno.
Tabela 30. Kompozicije LNP i podaci. (Molarni odnosi lipida su dati kao aminolipid (lipid A)/neutralni lipid/pomoćni lipid (holesterol)/PEG lipid (PEG2k-DMG).)
ID Neutr- Molarni Konc. %E Z- PDI Brojna % TTR u % uzorka alni odnosi RNK E upros. sr. vr. uređi- serumu TTR
[0273] Za in vivo karakterizaciju, gore navedene čestice LNP su intravenski davane ženkama pacova Sprague Dawley u količini od 0.3 mg ukupne RNK (vodič RNK i iRNK) po kg telesne težine. Bilo je pet pacova po grupi. Sedam dana nakon primene doze, životinje su žrtvovane, krv i jetra su sakupljene, a TTR u serumu i editovanje u jetri su izmereni kao što je opisano u primeru 1. Životinjama koje su bile negativna kontrola je davan vehikulum TSS. Serumski TTR i rezultati editovanja u jetri prikazani su na sl.10A i 10B i u tabeli 30 (gore).
KRATAK OPIS OTKRIVENIH SEKVENCI
[0274]
[0275] Sekvence su date u tabeli sekvenci ispod u tekstu. Sekvence transkripta generalno uključuju GGG kao prva tri nukleotida za upotrebu sa ARCA ili AGG kao prva tri nukleotida za upotrebu sa tehnologijom CleanCap<™>. Shodno tome, prva tri nukleotida se mogu modifikovati za upotrebu sa drugim pristupima za dodavanje kape, kao što je enzim za dodavanje kape virusa vakcinije. Promotori i poli-A sekvence nisu uključeni u sekvence transkripta. Otkrivenim sekvencama transkripta mogu da se dodaju promotor, kao što je promotor T7 (SEQ ID NO: 31), i poli-A sekvenca, kao što je SEQ ID NO: 62 ili 63, na 5', odnosno 3' kraju. Većina nukleotidnih sekvenci je data kao DNK, ali one mogu lako da se prevedu u RNK izmenom nukleotida T u nukleotide U.
Tabela sekvenci
[0276] Sledeća tabela sekvenci daje popis sekvenci koje su ovde otkrivene. Podrazumeva se da ako je sekvenca DNK (koja sadrži T) pomenuta u odnosu na RNK, onda nukleotide T treba zameniti nukleotidima U (koji mogu da budu modifikovani ili nemodifikovani u zavisnosti od konteksta), i obrnuto.
o.
o.

Claims (22)

  1. Patentni zahtevi 1. Kompozicija lipidnih nanočestica („LNP“) koja sadrži: RNK komponentu, gde RNK komponenta sadrži (i) iRNK koja kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens i (ii) nukleinsku kiselinu gRNK; i lipidnu komponentu, gde lipidna komponenta sadrži: 50-60 mol% aminolipida; 8-10 mol% neutralnog lipida; i 2.5-4 mol% PEG lipida, pri čemu je ostatak lipidne komponente pomoćni lipid, odnos N/P u kompoziciji LNP je 6, i pri čemu aminolipid predstavlja lipid A ili acetalni analog lipida A, gde je lipid A predstavljen sledećom strukturnom formulom
  2. 2. Kompozicija prema zahtevu 1, gde je RNK-vođeni DNK-vezujući agens Cas nukleaza.
  3. 3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili 2, gde je RNK-vođeni DNK-vezujući agens Cas nukleaza klase 2, poželjno Cas9 nukleaza.
  4. 4. Kompozicija prema zahtevu 2 ili 3, gde je iRNK modifikovana iRNK.
  5. 5. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu iRNK sadrži: RNK koja sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens, pri čemu otvoreni okvir čitanja ima sadržaj uridina u rasponu od svog minimalnog sadržaja uridina do 150% minimalnog sadržaja uridina, ili iRNK koja sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens, pri čemu otvoreni okvir čitanja ima sadržaj uridin dinukleotida u rasponu od svog minimalnog sadržaja uridin dinukleotida do 150% minimalnog sadržaja uridin dinukleotida.
  6. 6. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-5, gde iRNK sadrži sekvencu sa najmanje 90% identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65, ili 66, pri čemu iRNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira RNK-vođeni DNK-vezujući agens.
  7. 7. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-6, gde nukleinska kiselina gRNK predstavlja gRNK.
  8. 8. Kompozicija prema zahtevu 7, gde je gRNK modifikovana, tako da gRNK sadrži modifikaciju izabranu od 2'-O-metil (2'-O-Me)-modifikovanog nukleotida, fosforotioatne (PS) veze između nukleotida; i 2'-fluoro (2'-F)-modifikovanog nukleotida.
  9. 9. Kompozicija prema zahtevu 8, gde gRNK sadrži 5' kraj i 3' kraj, i gde gRNK sadrži najmanje jednu modifikaciju izabranu od: (a) modifikacije na jednom ili više od prvih pet nukleotida na 5' kraju; (b) modifikacije na jednom ili više od poslednjih pet nukleotida na 3' kraju; (c) PS veza između prva četiri nukleotida na 5' kraju; (d) PS veza između poslednja četiri nukleotida na 3' kraju; (e) 2'-O-Me-modifikovanih nukleotida na prva tri nukleotida na 5' kraju; i (f) 2'-O-Me-modifikovanih nukleotida na poslednja tri nukleotida na 3' kraju.
  10. 10. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 7-9, gde je RNK-vođeni DNK-vezujući agens Cas nukleaza klase 2, i gRNK i iRNK Cas nukleaze klase 2 su prisutne u odnosu u rasponu od 10:1 do 1:10 po težini, kao što je u odnosu od 5:1 do 1:5, od 3:1 do 1:1, ili od 2:1 do 1:1, poželjno u odnosu 2:1, 1:1 ili 1:2.
  11. 11. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-10, koja dalje sadrži najmanje jednu matričnu nukleinsku kiselinu.
  12. 12. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-11, gde mol% PEG lipida iznosi 3.
  13. 13. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-12, gde je mol% aminolipida 50 mol% ili 55 mol%, ili gde je mol% aminolipida od 53 do 57 mol%.
  14. 14. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-13, gde je aminolipid lipid A.
  15. 15. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-13, gde je aminolipid predstavljen sledećom strukturnom formulom
    pri čemu su R<1>i R<2>svaki C4-C12 alkil.
  16. 16. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-15, gde je pomoćni lipid holesterol.
  17. 17. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-16, gde je neutralni lipid fosfolipid, kao što je DSPC ili DPPC.
  18. 18. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-17, gde PEG lipid sadrži dimiristoilglicerol (DMG), PEG-2k ili PEG-DMG, pri čemu je poželjno PEG lipid PEG-DMG, kao što je PEG2k-DMG.
  19. 19. Upotreba kompozicije LNP prema bilo kom od zahteva 1-18 za: (a) editovanje gena in vitro; ili (b) in vitro proizvodnju genetski modifikovane ćelije.
  20. 20. Kompozicija LNP prema bilo kom od zahteva 1-18 za upotrebu u terapiji.
  21. 21. Kompozicija LNP za upotrebu prema zahtevu 20, pri čemu terapija obuhvata: (a) editovanje gena u subjektu; ili (b) proizvodnju genetski modifikovane ćelije u subjektu.
  22. 22. Upotreba prema zahtevu 19, deo (b), ili kompozicija LNP za upotrebu prema zahtevu 21, deo (b), gde proizvodnja genetski modifikovane ćelije obuhvata uvođenje najmanje jedne matrične nukleinske kiseline u ćeliju.
RS20240516A 2017-09-29 2018-09-28 Formulacije RS65493B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762566240P 2017-09-29 2017-09-29
EP18800355.2A EP3688162B1 (en) 2017-09-29 2018-09-28 Formulations
PCT/US2018/053559 WO2019067992A1 (en) 2017-09-29 2018-09-28 Formulations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65493B1 true RS65493B1 (sr) 2024-05-31

Family

ID=64267891

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240516A RS65493B1 (sr) 2017-09-29 2018-09-28 Formulacije

Country Status (30)

Country Link
US (1) US20230140670A1 (sr)
EP (2) EP3688162B1 (sr)
JP (3) JP7284179B2 (sr)
KR (2) KR20250042147A (sr)
CN (1) CN111406108A (sr)
AR (1) AR113031A1 (sr)
AU (2) AU2018338915C1 (sr)
BR (1) BR112020006300A2 (sr)
CA (1) CA3077413A1 (sr)
DK (1) DK3688162T3 (sr)
EA (1) EA202090868A1 (sr)
ES (1) ES2980114T3 (sr)
FI (1) FI3688162T3 (sr)
HR (1) HRP20240627T1 (sr)
HU (1) HUE066630T2 (sr)
IL (2) IL320823A (sr)
LT (1) LT3688162T (sr)
MX (2) MX2020007148A (sr)
MY (1) MY204993A (sr)
PH (1) PH12020552306A1 (sr)
PL (1) PL3688162T3 (sr)
PT (1) PT3688162T (sr)
RS (1) RS65493B1 (sr)
SA (1) SA520411636B1 (sr)
SG (1) SG11202002653UA (sr)
SI (1) SI3688162T1 (sr)
SM (1) SMT202400172T1 (sr)
TW (1) TWI833708B (sr)
UA (1) UA129257C2 (sr)
WO (1) WO2019067992A1 (sr)

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110662556A (zh) 2017-03-09 2020-01-07 哈佛大学的校长及成员们 癌症疫苗
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
JP7578590B2 (ja) 2018-10-18 2024-11-06 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法
AU2019361129A1 (en) 2018-10-18 2021-05-20 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
WO2020154500A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
GB2601618B (en) 2019-03-19 2024-11-06 Broad Inst Inc Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020198706A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
CN113874076A (zh) * 2019-03-28 2021-12-31 因特利亚治疗公司 包括ttr向导rna和对rna引导的dna结合剂进行编码的多核苷酸的组合物和方法
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
WO2020252455A1 (en) 2019-06-13 2020-12-17 The General Hospital Corporation Engineered human-endogenous virus-like particles and methods of use thereof for delivery to cells
WO2021008708A1 (en) * 2019-07-18 2021-01-21 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Method for determining at least one parameter of a sample composition comprising nucleic acid, such as rna, and optionally particles
JP7759311B2 (ja) 2019-07-19 2025-10-23 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー リコンビナーゼ組成物及び使用方法
UA129330C2 (uk) * 2019-08-14 2025-03-19 Акітас Терап'Ютікс, Інк. Поліпшені ліпідні наночастинки для доставляння нуклеїнових кислот
US12521451B2 (en) 2019-11-08 2026-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
MX2022006950A (es) * 2019-12-11 2022-11-07 Intellia Therapeutics Inc Arn guía modificados para edición de genes.
AU2021216451A1 (en) 2020-02-07 2022-09-29 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for kallikrein ( KLKB1) gene editing
CN116209756A (zh) 2020-03-04 2023-06-02 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 调控基因组的方法和组合物
BR112022020428A2 (pt) 2020-04-09 2023-03-07 Verve Therapeutics Inc Edição base do angptl3 e métodos de uso do mesmo para tratamento de doenças
TW202204612A (zh) 2020-04-28 2022-02-01 美商英特利亞醫療公司 活體外細胞遞送之方法
CA3179444A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Avak Kahvejian Immunogenic compositions and uses thereof
MX2022014653A (es) 2020-05-20 2023-02-16 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones de antigeno de coronavirus y sus usos.
WO2021243301A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
US20230203510A1 (en) 2020-05-29 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
AU2021310950A1 (en) 2020-07-24 2023-02-16 President And Fellows Of Harvard College Enhanced virus-like particles and methods of use thereof for delivery to cells
JP2023542492A (ja) 2020-09-03 2023-10-10 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー 免疫原性組成物及びその使用
WO2022060871A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Verve Therapeutics, Inc. Lipid formulations for gene editing
CN117098541A (zh) 2020-11-25 2023-11-21 阿卡格拉医药公司 用于递送核酸的脂质纳米粒及相关使用方法
IL303506A (en) 2020-12-11 2023-08-01 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination
CR20230303A (es) 2020-12-11 2023-09-01 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir el mhc de clase ii en una célula
AU2021409740A1 (en) 2020-12-23 2023-07-06 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
CA3205042A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying ciita in a cell
JP2024500858A (ja) 2020-12-23 2024-01-10 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞中のｈｌａ－ａを低減するための組成物及び方法
IL304069A (en) 2020-12-30 2023-08-01 Intellia Therapeutics Inc Engineered T cells
US20240122865A1 (en) * 2021-02-19 2024-04-18 Pfizer Inc. Methods of Protecting RNA
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
MX2023012236A (es) 2021-04-17 2024-01-23 Intellia Therapeutics Inc Inhibidores de proteína cinasa dependente de acido desoxirribonucleico (and) y composiciones y usos de los mismos.
KR20240032013A (ko) 2021-06-10 2024-03-08 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 유전자 편집을 위한 내부 링커를 포함하는 변형된 가이드 rna
KR20240038705A (ko) 2021-06-22 2024-03-25 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 간 유전자의 생체 내 편집 방법
WO2023009547A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and uses thereof
IL311225A (en) 2021-09-08 2024-05-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Methods and compositions for genome modulation
EP4464783A3 (en) 2021-09-17 2025-01-22 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
TW202322826A (zh) 2021-10-18 2023-06-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法
CN118251491A (zh) 2021-10-28 2024-06-25 瑞泽恩制药公司 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物
KR20240114296A (ko) 2021-11-03 2024-07-23 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 게놈 편집을 위한 폴리뉴클레오타이드, 조성물, 및 방법
KR20240125931A (ko) 2021-11-24 2024-08-20 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 수두-대상포진 바이러스 면역원 조성물 및 이의 용도
WO2023096990A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovation Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
US20250032604A1 (en) 2021-11-24 2025-01-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and their uses
US20250223584A2 (en) 2021-12-03 2025-07-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for efficient in vivo delivery
CN118679254A (zh) 2021-12-22 2024-09-20 旗舰创业创新六公司 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法
MX2024007870A (es) 2021-12-23 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Polirribonucleotidos circulares que codifican polipeptidos antifusogenicos.
US20250032642A1 (en) 2022-02-02 2025-01-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
JP2025512763A (ja) 2022-03-23 2025-04-22 ナノベーション・セラピューティクス・インコーポレイテッド 高ステロール含有脂質ナノ粒子
EP4499829A2 (en) 2022-03-29 2025-02-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
JP2025512806A (ja) 2022-04-01 2025-04-22 ナノベーション・セラピューティクス・インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達方法およびその組成物
EP4504252A2 (en) 2022-04-08 2025-02-12 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Vaccines and related methods
EP4511397A1 (en) 2022-04-19 2025-02-26 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
CN119487200A (zh) 2022-04-29 2025-02-18 瑞泽恩制药公司 用于基因治疗方法的组织特异性基因外安全港的鉴定
CN119604610A (zh) 2022-05-09 2025-03-11 瑞泽恩制药公司 用于体内抗体产生的载体和方法
CA3257006A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc TREM COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR TREATING PROLIFERATIVE DISORDERS
TW202409283A (zh) 2022-05-13 2024-03-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 雙股ｄｎａ組合物及相關方法
CN120303407A (zh) 2022-05-17 2025-07-11 恩维洛普治疗有限责任公司 用于有效体内递送的组合物和方法
AU2023275780B2 (en) 2022-05-25 2026-03-05 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and methods of use thereof
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
CN119421951A (zh) 2022-05-31 2025-02-11 瑞泽恩制药公司 用于c9orf72重复序列扩增疾病的crispr干扰疗法
JP2023181989A (ja) * 2022-06-13 2023-12-25 上海臻上医薬科技有限公司 マイクロニードル注射製剤およびその使用
JP2025520367A (ja) 2022-06-16 2025-07-03 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞を遺伝子改変するための方法及び組成物
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
IL317790A (en) 2022-06-29 2025-02-01 Intellia Therapeutics Inc Engineered T cells
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
JP2025525778A (ja) 2022-08-01 2025-08-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ セブン，エルエルシー 免疫調節タンパク質及び関連方法
EP4569112A1 (en) 2022-08-12 2025-06-18 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024061296A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
CN120513299A (zh) 2022-10-31 2025-08-19 旗舰创业创新第六有限责任公司 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法
KR20250115463A (ko) 2022-11-04 2025-07-30 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 칼슘 전압 개폐 채널 보조 서브유닛 감마 1(cacng1) 결합 단백질 및 골격근으로의 cacng1-매개 전달
AR131008A1 (es) 2022-11-08 2025-02-05 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones y métodos para producir polirribonucleótidos circulares
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
EP4619438A2 (en) 2022-11-14 2025-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
TW202430215A (zh) 2022-12-14 2024-08-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於將治療劑遞送至骨之組成物和方法
CN118236344A (zh) * 2022-12-15 2024-06-25 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种核酸脂质纳米载体及其制备方法与应用
AU2023409835A1 (en) * 2022-12-20 2025-07-03 Seqirus Inc. Lipid nanoparticle composition
EP4638783A2 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for analyzing nucleic acid cargos of lipid nucleic acid assemblies
TW202428878A (zh) 2022-12-23 2024-07-16 美商英特利亞醫療公司 用於基因體編輯之系統及方法
US20240252520A1 (en) 2023-01-09 2024-08-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Therapeutic agents and their use for treating chronic wounds
WO2024151673A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 President And Fellows Of Harvard College Recombinant nucleic acid molecules and their use in wound healing
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
EP4648794A2 (en) 2023-01-09 2025-11-19 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Vaccines and related methods
TW202438515A (zh) 2023-02-06 2024-10-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 免疫調節組合物及相關方法
KR20250151427A (ko) 2023-02-13 2025-10-21 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 치료적 조성물을 위한 절단성 링커 함유 이온화 가능한 지질 및 지질 담체
TW202438089A (zh) 2023-02-17 2024-10-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 包含經修飾的尿嘧啶的ｄｎａ組成物
TW202446956A (zh) 2023-02-17 2024-12-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 包含經修飾的胞嘧啶的ｄｎａ組成物
JP2026509462A (ja) 2023-03-15 2026-03-19 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用
WO2024192422A1 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
CN121219411A (zh) 2023-04-12 2025-12-26 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 用于在错义突变的校正中使用的trem
EP4695393A1 (en) 2023-04-12 2026-02-18 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Modified trems, compositions, and related methods thereof
WO2024220746A2 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Rnai agents targeting fatty acid synthase and related methods
WO2024258829A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2024259135A1 (en) 2023-06-13 2024-12-19 Intellia Therapeutics, Inc. Assays for analysis of ribonucleic acid (rna) molecules
WO2025006684A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
AU2024309884A1 (en) 2023-06-30 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for increasing homology-directed repair
WO2025024486A2 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas endonucleases and related methods
AR133384A1 (es) 2023-07-28 2025-09-24 Regeneron Pharma Anti-tfr:esfingomielinasa ácida para el tratamiento de la deficiencia de esfingomielinasa ácida
WO2025029654A2 (en) 2023-07-28 2025-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bgh-sv40l tandem polya to enhance transgene expression during unidirectional gene insertion
WO2025038646A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Cd70 car-t compositions and methods for cell-based therapy
WO2025038642A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying cd70
WO2025038637A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2)
TW202515992A (zh) 2023-08-14 2025-04-16 美商英特利亞醫療公司 用於對轉形生長因子β受體２型（ＴＧＦβＲ２）進行基因修飾之組合物及方法
WO2025042786A1 (en) 2023-08-18 2025-02-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
WO2025049481A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Intellia Therapeutics, Inc. Methods of editing an hla-a gene in vitro
WO2025045247A1 (en) * 2023-08-31 2025-03-06 Geneditbio Limited Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
WO2025054236A2 (en) 2023-09-06 2025-03-13 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025064396A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Intellia Therapeutics, Inc. Nuclease resistant double stranded dna product for non-viral delivery to a cell and methods of production thereof
US20250268826A1 (en) 2023-09-18 2025-08-28 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Ionizable lipidoid compositions and therapeutic uses thereof
WO2025064401A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Intellia Therapeutics, Inc. Nuclease resistant single stranded dna product for non-viral delivery to a cell and methods of production thereof
WO2025072331A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025096807A2 (en) 2023-10-31 2025-05-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Novel therapeutic dna forms
US20250162981A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Ionizable lipidoid compositions and therapeutic uses thereof
US20250161347A1 (en) 2023-11-22 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods and compositions for treating non-alcoholic fatty liver disease
WO2025117877A2 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025128871A2 (en) 2023-12-13 2025-06-19 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
WO2025137301A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for rapid engineering of cells
TW202542303A (zh) 2023-12-20 2025-11-01 美商英特利亞醫療公司 經工程改造之ｔ細胞
WO2025160334A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025160340A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025194019A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods for treating liver fibrosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025217275A2 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immune cell targeted compositions and related methods
US20250353881A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025240946A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles and lipid nanoparticle compositions
WO2025245188A2 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods of treating liver steatosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025245111A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor targeting proteins and related methods
WO2025255308A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd8 co-receptor chimeric polypeptides in tcr cell therapy
US20250388890A1 (en) 2024-06-20 2025-12-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ASS1 Gene Insertion For The Treatment Of Citrullinemia Type I
WO2026006577A1 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Therapeutic circular dna forms
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2026055543A1 (en) 2024-09-06 2026-03-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Modified dna compositions and related methods
WO2026055547A1 (en) 2024-09-06 2026-03-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions and related methods

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX348474B (es) 2009-12-23 2017-06-14 Novartis Ag * Lipidos, composiciones de lipido, y metodos de uso de los mismos.
US8691750B2 (en) * 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
RU2699523C2 (ru) 2012-12-17 2019-09-05 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
CN105164102B (zh) 2013-03-08 2017-12-15 诺华股份有限公司 用于传递活性成分的脂质和脂质组合物
US10342760B2 (en) * 2013-03-15 2019-07-09 The University Of British Columbia Lipid nanoparticles for transfection and related methods
RS62529B1 (sr) * 2013-07-11 2021-11-30 Modernatx Inc Kompozicije koje sadrže sintetičke polinukleotide koji kodiraju proteine povezane sa crispr i sintetičke sgrnk i postupci upotrebe
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
AU2014361826A1 (en) * 2013-12-12 2016-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
ES2895651T3 (es) * 2013-12-19 2022-02-22 Novartis Ag Lípidos y composiciones lipídicas para la administración de agentes activos
JP6778175B2 (ja) 2014-07-16 2020-10-28 ノバルティス アーゲー 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
US9944912B2 (en) 2015-03-03 2018-04-17 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificity
CA2980721C (en) * 2015-03-24 2023-10-24 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Nucleic acid-containing lipid nanoparticles
US10626393B2 (en) * 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
WO2017049074A1 (en) * 2015-09-18 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
JP6932698B2 (ja) * 2015-12-01 2021-09-08 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフトＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ アルファ１アンチトリプシン欠乏症の治療のための材料および方法
CA3009308A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Chad Albert COWAN Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration
WO2017127750A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
SI3436077T1 (sl) * 2016-03-30 2025-07-31 Intellia Therapeutics, Inc. Formulacije lipidnih nanodelcev za komponente crispr/cas
KR102551664B1 (ko) * 2016-12-22 2023-07-05 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 알파-1 항트립신 결핍을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20250042147A (ko) 2025-03-26
JP2025084955A (ja) 2025-06-03
EP3688162A1 (en) 2020-08-05
JP2020536125A (ja) 2020-12-10
TWI833708B (zh) 2024-03-01
SA520411636B1 (ar) 2024-06-09
EP3688162B1 (en) 2024-03-06
SG11202002653UA (en) 2020-04-29
IL320823A (en) 2025-07-01
MX2020007148A (es) 2020-10-08
AU2024224004A1 (en) 2024-10-24
DK3688162T3 (da) 2024-05-13
AU2018338915B2 (en) 2024-10-24
AU2018338915C1 (en) 2025-05-08
KR20200079497A (ko) 2020-07-03
SI3688162T1 (sl) 2024-06-28
HRP20240627T1 (hr) 2024-08-02
FI3688162T3 (fi) 2024-05-15
JP7284179B2 (ja) 2023-05-30
SMT202400172T1 (it) 2024-07-09
TW201924724A (zh) 2019-07-01
UA129257C2 (uk) 2025-03-05
PL3688162T3 (pl) 2024-06-10
EP4385514A2 (en) 2024-06-19
PH12020552306A1 (en) 2023-07-17
JP2023103421A (ja) 2023-07-26
EP4385514A3 (en) 2024-10-23
HUE066630T2 (hu) 2024-08-28
CA3077413A1 (en) 2019-04-04
MY204993A (en) 2024-09-26
AU2018338915A1 (en) 2020-04-23
LT3688162T (lt) 2024-05-27
WO2019067992A1 (en) 2019-04-04
MX2024013597A (es) 2024-12-06
PT3688162T (pt) 2024-04-23
US20230140670A1 (en) 2023-05-04
JP7645929B2 (ja) 2025-03-14
IL273541B1 (en) 2025-06-01
EA202090868A1 (ru) 2020-09-16
BR112020006300A2 (pt) 2020-10-20
IL273541B2 (en) 2025-10-01
AR113031A1 (es) 2020-01-15
IL273541A (en) 2020-05-31
ES2980114T3 (es) 2024-09-30
CN111406108A (zh) 2020-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7284179B2 (ja) 製剤
JP7581405B2 (ja) Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ構成成分のための脂質ナノ粒子製剤
EP3688173B1 (en) In vitro method of mrna delivery using lipid nanoparticles
US20240124897A1 (en) Compositions and Methods Comprising a TTR Guide RNA and a Polynucleotide Encoding an RNA-Guided DNA Binding Agent
TW202102529A (zh) 用於多肽表現之多核苷酸、組合物及方法
HK40112168A (en) Formulations
EA047139B1 (ru) Составы
HK40025999B (en) Formulations
HK40025999A (en) Formulations
HK40025136B (en) In vitro method of mrna delivery using lipid nanoparticles
HK40025136A (en) In vitro method of mrna delivery using lipid nanoparticles
HK40033101A (en) Formulations
EA048535B1 (ru) Композиции и способы, содержащие гидовую рнк ttr и полинуклеотид, кодирующий днк-связывающий агент, гидируемый рнк
HK40067192A (zh) 用於多肽表达的多核苷酸、组合物和方法
HK40033100A (en) In vitro method of mrna delivery using lipid nanoparticles
HK40003257A (en) Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
HK40003257B (en) Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components