RS65513B1 - Kompozicije za upotrebu u lečenju hanterovog sindroma - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovaj pronalazak je usmeren na poboljšane kompozicije za upotrebu u lečenju Hanterovog sindroma.

Stanje tehnike

[0002] Mukopolisaharidoza tipa II (MPS II, Hanterov sindrom) je X-vezani recesivni nasledni poremećaj lizozomalnog skladištenja, uzrokovan nedostatkom iduronat-2-sulfataze, čija je funkcija razgradnja mukopolisaharida [1]. Nedostatak iduronat-2-sulfataze dovodi do akumulacije nerazgrađenih glikozaminoglikana (GAG) u ćelijama i dovodi do progresivnog oštećenja više organa [2]. Među različitim tipovima GAG, dermatan sulfat (DS) i heparan sulfat (HS) su glavni GAG koji se akumuliraju kod MPS II [2].

[0003] Klinički fenotip MPS II je klasifikovan na oslabljene i teške oblike. Pacijenti sa oslabljenim oblikom pokazuju somatske manifestacije, uključujući grubo lice, hepatosplenomegaliju, dysostosis multiplex i ukočenost zglobova bez neurološke povezanosti, dok pacijenti sa teškim oblikom pored somatskih simptoma imaju neurološko oštećenje i progresivnu neurodegeneraciju. Nedovoljan nivo endogenog IDS izaziva patološko nakupljanje heparan sulfata i dermatan sulfata u npr. srcu, jetri, centralnom nervnom sistemu (CNS), itd. Simptomi koji uključuju neurodegeneraciju i mentalnu retardaciju pojavljuju se tokom detinjstva; a prerana smrt može da nastupi zbog organskog oštećenja mozga.

[0004] Enzimska supstituciona terapija (ERT) uključuje sistemsku primenu prirodnih ili rekombinantno dobijenih proteina i/ili enzima kod subjekta. Odobrene terapije se obično daju subjektima intravenski i generalno su efikasne u lečenju somatskih simptoma osnovnog nedostatka enzima.

[0005] Kao rezultat ograničene distribucije intravenski primenjenih proteina i/ili enzima u ćelije i tkiva centralnog nervnog sistema (CNS), lečenje bolesti koje imaju CNS etiologiju je posebno izazovno jer intravenski primenjeni proteini i/ili enzimi ne prolaze na adekvatan način kroz krvnomoždanu barijeru (BBB).

[0006] Krvno-moždana barijera (BBB) je strukturni sistem sačinjen od endotelnih ćelija koje štite centralni nervni sistem (CNS) od štetnih supstanci u krvotoku, kao što su bakterije, makromolekuli (npr. proteini) i drugi hidrofilni molekuli, ograničavanjem difuzije takvih supstanci kroz BBB u cerebrospinalnu tečnost koja se nalazi ispod nje (CSF) i u CNS.

[0007] Postoji mišljenje da su barijera za difuziju na površini mozga, kao i nedostatak efikasnih i pogodnih postupaka za isporuku, prevelika prepreka za postizanje adekvatnog terapijskog efekta u mozgu za bilo koju bolest.

[0008] Hanterov sindrom utiče na nervni sistem i zbog toga predstavlja jedinstveni izazov u lečenju ovih bolesti tradicionalnim terapijama. Često postoji veliko nakupljanje glikozaminoglikana (GAG) u neuronima i moždanim ovojnicama obolelih osoba, što dovodi do različitih oblika simptoma u CNS.

[0009] Dakle, ostaje velika potreba za efikasnom isporukom terapijskih agenasa u mozak. Tačnije, postoji velika potreba za efikasnijom isporukom aktivnih agenasa u centralni nervni sistem za lečenje lizozomalnih poremećaja skladištenja kao što je Hanterov sindrom. US 2014/271598 A1 i WO 2011/163649 A2 opisuju kompozicije koje sadrže idursulfazu-beta za upotrebu u lečenju Hanterovog sindroma.

[0010] U smislu prevazilaženja BBB, direktna isporuka leka putem intratekalnih ili intraventrikularnih injekcija rekombinantnog enzima pokazala je obećavajuće rezultate u nekoliko tipova životinjskih modela MPS [3-7]. Štaviše, u kliničkom ispitivanju faze I/II pokazalo se da intratekalna (IT) injekcija idursulfaze (IDS) smanjuje koncentracije GAG u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) za približno 8090% kod dece sa teškim oblikom MPS II. Ali, u kliničkom ispitivanju je prijavljen veliki broj neželjenih događaja, većina neželjenih događaja je bila povezana sa lošim funkcionisanjem uređaja za IT isporuku leka [8].

[0011] Iako ćelijski mehanizam neurodegeneracije u teškom obliku MPS II nije u potpunosti shvaćen, nekoliko nedavnih studija je pokazalo korelaciju između disaharida poreklom iz HS i mentalne retardacije u velikim grupama pacijenata sa MPS [9, 10]. Pored toga, studije na životinjama su pokazale da HS može dovesti do neuroloških poremećaja povezanih sa mišjim modelom MPS III aktiviranjem fokalne adhezije zasnovane na integrinu u astrocitima ili nervnim matičnim ćelijama [11, 12]. Akiyama et al. [13] je izvestio da je „patološki GAG“ meren testom Sensi-Pro Non-Reducing End HS [14] imao veću osetljivost i specifičnost od ukupnih GAG u moždanom tkivu miševa sa MPS II [13]. Na osnovu ovih podataka, količina akumuliranog HS bi mogla da bude osetljiviji biomarker koji reprezentuje moždanu patologiju i neurološke funkcije MPS II, nego što je to količina ukupnih GAG. Međutim, merenje HS moždanog tkiva nije moguće u kliničkom okruženju. Stoga, treba otkriti koristan klinički biomarker koji predstavlja HS moždanog tkiva. Autori ovog dokumenta su pretpostavili da bi koncentracija HS u CSF mogla biti jedan od kliničkih biomarkera ako je u korelaciji sa količinom GAG u moždanom tkivu, posebno sa HS.

[0012] Jedna ICV (intracerebroventrikularna) injekcija IDS-β prema ovom pronalasku se dobro podnosi i proizvodi značajno smanjenje HS i GAG u mozgu i drugim somatskim tkivima. Autori ovog dokumenta su takođe otkrili da značajna pozitivna korelacija sadržaja HS u CSF sa HS u mozgu i GAG u mozgu sugeriše da bi koncentracija HS u CSF mogla da bude koristan biomarker koji reprezentuje patologiju mozga kod pacijenata sa MPS kod kojih je zahvaćen CNS.

[0013] Ovaj pronalazak obezbeđuje efikasan pristup za direktnu isporuku terapijskih agenasa u centralni nervni sistem (CNS). Ovaj pronalazak je zasnovan na otkriću da se idursulfaza-beta (IDS-β), humani rekombinantni protein iduronat-2-sulfataze razvijen kao efikasan supstitucioni enzim za Hanterov sindrom, može direktno uneti u moždane komore subjekta putem intracerebroventrikularne (ICV) primene, tako da enzim efikasno i ekstenzivno difunduje preko različitih površina i prodire u različite regione u mozgu, uključujući duboke regione mozga. Pronalazači ovog pronalaska su pokazali da takva isporuka proteina može da se postigne korišćenjem jednostavnih formulacija na bazi fiziološkog rastvora i bez izazivanja značajnih neželjenih efekata, kao što je ozbiljan imuni odgovor, kod subjekta. Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje pristup za direktnu isporuku u CNS za lečenje Hanterovog sindroma koji je visoko efikasan, klinički poželjan i pogodan za pacijenta.

Otkrivanje pronalaska

Tehnički problem

[0014] Za lečenje Hanterovog sindroma, ostaje velika potreba za efikasnom isporukom terapijskih agenasa u mozak. Pri lečenju pacijenata sa Hanterovim sindromom nedavno je pokušana primena intratekalne (IT) injekcije, ili primena terapijskih proteina u cerebrospinalnu tečnost (CSF), ali je u kliničkom ispitivanju prijavljen veliki broj neželjenih događaja [8]. Iako je većina neželjenih događaja bila povezana sa lošim funkcionisanjem uređaja za IT isporuku lekova, potreban je drugi pristup, kao što je intracerebroventrikularna (ICV) primena, za lečenje pacijenata sa Hanterovim sindromom. ICV primena bi bila efikasan pristup za direktnu isporuku terapijskih agenasa u moždane komore pacijenata, međutim, trenutno ne postoje odobreni proizvodi i/ili proizvodi u razvoju za lečenje Hanterovog sindroma ICV primenom.

Pogodni efekti pronalaska

[0015] Intracerebroventrikularno primenjen IDS-β prema ovom pronalasku smanjio je nivoe heparan sulfata (HS) i glikozaminoglikana (GAG) u mozgu i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) kod miševa sa MPS II.

[0016] Intracerebroventrikularno primenjen IDS-β prema ovom pronalasku smanjio je nivoe heparan sulfata (HS) i glikozaminoglikana (GAG) u somatskim (perifernim) tkivima, uključujući srce, pluća, jetru, slezinu i bubreg, kod miševa sa MPS II.

[0017] Prema ovom pronalasku, tendencija koju pokazuje koncentracija GAG u mozgu može da se predvidi na osnovu nivoa heparan sulfata u CSF, što može da omogući sigurniju i lakšu dijagnozu težine akumulacije GAG u mozgu.

Kratak opis crteža

[0018]

Slika 1 prikazuje nivoe GAG u moždanim tkivima IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 2 prikazuje nivoe HS u CSF i moždanim tkivima IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 3 prikazuje korelaciju između nivoa HS u CSF i nivoa HS u moždanim tkivima IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 4 prikazuje nivoe GAG u somatskim tkivima IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 5 prikazuje moždana tkiva sakupljena u različitim vremenskim tačkama nakon injekcije i vizuelizacije tripan plavim.

Slika 6 prikazuje nivoe GAG u tkivima srca IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 7 prikazuje nivoe GAG u tkivima pluća IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 8 prikazuje nivoe GAG u tkivima jetre IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 9 prikazuje nivoe GAG-a u tkivima slezine IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Slika 10 prikazuje nivoe GAG u tkivima bubrega IDS KO miševa nakon jedne ICV injekcije IDS-β.

Najbolji način izvođenja pronalaska

[0019] Kao što je detaljno opisano u nastavku, pronalazači ovog pronalaska su uspešno razvili stabilne formulacije za efikasnu intracerebroventrikularnu (ICV) primenu proteina idursulfazebeta (IDS-β). Obim pronalaska je definisan priloženim zahtevima.

[0020] Ovaj pronalazak obuhvata stabilnu formulaciju za direktnu intracerebroventrikularnu (ICV) primenu koja sadrži protein idursulfazu-beta (IDS-β), so i polisorbatni surfaktant. Protein IDS-β je prisutan u ICV formulaciji u koncentraciji od 15 mg/ml.

[0021] U različitim primerima izvođenja, ovaj pronalazak uključuje stabilnu formulaciju bilo kog od ovde opisanih primera izvođenja. U nekim primerima izvođenja, IDS-β sadrži proteine koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim primerima izvođenja, IDS-β dalje sadrži proteine koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:1 je rekombinantni humani protein iduronat-2-sulfataze. SEQ ID NO:2 je rekombinantni humani protein iduronat-2-sulfataze čiji je 59. cistein zamenjen formil-glicinom (G*). ;[0022] U nekim primerima izvođenja, IDS-β sadrži približno 35% (molski procenat) ili manje proteina koji imaju SEQ ID NO:1 i približno 65% (molski procenat) ili više proteina koji imaju SEQ ID NO:2. U nekim primerima izvođenja, IDS-β sadrži približno 20-35% (molski procenat) proteina koji imaju SEQ ID NO:1 i približno 65-80% (molski procenat) proteina koji imaju SEQ ID NO:2. ;[0023] U nekim primerima izvođenja, IDS-β sadrži proteine koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identična sekvenci SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, IDS-β sadrži proteine koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identična sekvenci SEQ ID NO: 2. ;[0024] Prema pronalasku, NaCl je prisutan u koncentraciji od 150 mM. ;[0025] Prema pronalasku, formulacija sadrži polisorbat 20 (Tween 20) u koncentraciji od 0.005% tj. 0.05 mg/ml. U različitim primerima izvođenja, dodatni polisorbatni surfaktant se bira iz grupe koja se sastoji od polisorbata 40, polisorbata 60, polisorbata 80 i njihove kombinacije. ;[0026] U različitim primerima izvođenja, ovaj pronalazak uključuje stabilnu formulaciju bilo kog od ovde opisanih primera izvođenja, pri čemu formulacija dalje sadrži puferski agens. U nekim primerima izvođenja, puferski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od fosfata u koncentraciji ne većoj od 5 mM, acetata, histidina, sukcinata, Tris i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, puferski agens je fosfat, ali u koncentraciji ne većoj od 5 mM. Fosfat je prisutan u koncentraciji koja nije veća od 5 mM (npr. nije veća od 0.25 mM ili 0.12 mM). ;[0027] Formulacija prema pronalasku ima pH vrednost 6.0. ;[0028] U različitim primerima izvođenja, ovaj pronalazak uključuje stabilne formulacije bilo kog od ovde opisanih primera izvođenja, pri čemu je formulacija tečna formulacija. U različitim primerima izvođenja, ovaj pronalazak uključuje stabilnu formulaciju bilo kog od ovde opisanih primera izvođenja, pri čemu je formulacija formulisana kao liofilizovani suvi prah. ;[0029] Prema pronalasku, formulacija za ICV primenu sadrži protein IDS-β u koncentraciji od 15 mg/ml, NaCl u koncentraciji od 150 mM, polisorbat 20 u koncentraciji od 0.005% (0.05 mg/ml) i ima pH vrednost 6.0. ;[0030] U različitim aspektima, ovaj pronalazak uključuje posudu koja sadrži jedinični dozni oblik stabilne formulacije u različitim ovde opisanim primerima izvođenja. U nekim primerima izvođenja, posuda se bira između ampule, bočice, boce, kertridža, rezervoara, uređaja Lyo-Ject ili napunjenog šprica. U nekim primerima izvođenja, posuda je napunjeni špric. U nekim primerima izvođenja, napunjeni špric je izabran između špriceva od borosilikatnog stakla sa premazom od pečenog silikona, špriceva od borosilikatnog stakla sa prskanim silikonom ili špriceva od plastične smole bez silikona. U nekim primerima izvođenja, stabilna formulacija je data u zapremini manjoj od oko 50 mL (npr. manje od oko 45 ml, 40 ml, 35 ml, 30 ml, 25 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2.5 ml, 2.0 ml, 1.5 ml, 1.0 ml ili 0.5 ml). U nekim primerima izvođenja, stabilna formulacija je data u zapremini od oko 6.0 ml. U nekim primerima izvođenja, stabilna formulacija je data u zapremini od oko 3.0 ml. U nekim primerima izvođenja, 2.0 ml stabilne formulacije se nalazi u bočici od 6.0 ml. U nekim primerima izvođenja, 1.5 ml stabilne formulacije se nalazi u bočici od 5.0 ml. U nekim primerima izvođenja, 1.0 ml stabilne formulacije se nalazi u bočici od 3.0 ml. ;[0031] Ovaj pronalazak se odnosi na kompozicije za upotrebu u lečenju Hantersovog sindroma uključujući korak intracerebroventrikularne primene formulacije kod subjekta kome je potrebno lečenje, prema zahtevu 1. ;[0032] Prema pronalasku, subjektu kome je potrebno lečenje je sistem intraventrikularnog katetera koji ima rezervoar i kateter, kao što je rezervoar Ommaya, implantiran za ICV primenu. U nekim primerima izvođenja, ICV primena se izvodi ubrizgavanjem gore navedenih ICV formulacija pri brzini protoka od 0.1-60 ml/minutu, u rezervoar. U nekim primerima izvođenja, cerebrospinalna tečnost (CSF) subjekta se izvlači pri brzini protoka od 0.1-60 ml/minutu, iz rezervoara pre ICV primene formulacija, tako da kod subjekta nakon ICV primene ne dolazi do neto povećanja zapremine CSF, kako bi se sprečilo povećanje pritiska u mozgu. U nekim primerima izvođenja, formulacija ubrizgana u rezervoar se pokreće kroz kateter u moždanu komoru subjekta pažljivim pritiskanjem i otpuštanjem rezervoara. ;[0033] U nekim primerima izvođenja, ICV primena ne dovodi do značajnih neželjenih efekata (npr. ozbiljni imuni odgovor) kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, ICV primena ne dovodi do značajnog adaptivnog imunog odgovora posredovanog T ćelijama kod subjekta. ;[0034] U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije dovodi do isporuke proteina IDS-β u različita ciljna tkiva u mozgu, kičmenoj moždini i perifernim organima. U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije dovodi do isporuke proteina IDS-β u ciljna tkiva mozga. U nekim primerima izvođenja, ciljna tkiva mozga sadrže belu masu i/ili neurone u sivoj masi. U nekim primerima izvođenja, protein IDS -β se isporučuje u neurone, glijalne ćelije, perivaskularne ćelije i/ili meningealne ćelije. U nekim primerima izvođenja, protein IDS-β se dalje isporučuje neuronima u kičmenoj moždini. ;[0035] U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije dalje dovodi do sistemske isporuke proteina IDS-β u periferna ciljna tkiva. U nekim primerima izvođenja, periferna ciljna tkiva su odabrana od, ali bez ograničenja, srca, jetre, slezine, pluća i/ili bubrega. ;[0036] U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije rezultuje ćelijskom lizozomalnom lokalizacijom u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije dovodi do smanjenja skladištenja GAG u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U nekim primerima izvođenja, skladištenje GAG se smanjuje za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 put, 1.5 put ili 2 puta u poređenju sa negativnom kontrolom (npr. skladištenje GAG kod subjekta pre tretmana ili posle primene samo vehikuluma). U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije dovodi do smanjene vakuolizacije u neuronima (npr. za najmanje 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1 put, 1.5 put ili 2 puta u poređenju sa negativnom kontrolom). U nekim primerima izvođenja, neuroni obuhvataju Purkinje ćelije. ;[0037] U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije rezultuje povećanom enzimskom aktivnošću IDS-β u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U nekim primerima izvođenja, enzimska aktivnost IDS-β je povećana najmanje 1 put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta u poređenju sa negativnom kontrolom (npr., endogena enzimska aktivnost kod subjekta pre tretmana ili posle primene samo vehikuluma). U nekim primerima izvođenja, povećana enzimska aktivnost IDS-β je najmanje približno 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg ili 600 nmol/h/mg. ;[0038] U nekim primerima izvođenja, ICV primena formulacije dovodi do smanjenog intenziteta, ozbiljnosti ili učestalosti, ili odloženog početka najmanje jednog simptoma ili karakteristike Hanterovog sindroma. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan simptom ili karakteristika Hantersovog sindroma je kognitivno oštećenje; lezije bele mase; prošireni perivaskularni prostori u moždanom parenhimu, ganglijima, corpus callosum i/ili moždanom stablu; atrofija; i/ili ventrikulomegalija. ;[0039] U nekim primerima izvođenja, ICV primena se odvija jednom na svake dve nedelje. U nekim primerima izvođenja, ICV primena se odvija jednom na svake tri nedelje. U nekim primerima izvođenja, ICV primena se odvija jednom mesečno. U nekim primerima izvođenja, ICV primena se odvija jednom na svaka dva meseca. U nekim primerima izvođenja, primena je kontinuirana, na primer putem pumpe za kontinuiranu perfuziju. U nekim primerima izvođenja, ICV primena se koristi zajedno sa intravenskom (IV) primenom. U nekim primerima izvođenja, IV primena se odvija jednom nedeljno. U nekim primerima izvođenja, IV primena se odvija jednom na svake dve nedelje. U nekim primerima izvođenja, IV primena se odvija jednom mesečno. U nekim primerima izvođenja, IV primena se odvija jednom na svaka dva meseca. ;[0040] U nekim primerima izvođenja, IV i ICV primena se izvode istog dana. U nekim primerima izvođenja, IV i ICV primena se ne sprovode u određenom vremenskom periodu jedna u odnosu na drugu, na primer ne u roku od najmanje 2 dana, u roku od najmanje 3 dana, u roku od najmanje 4 dana, u roku od najmanje 5 dana, u roku od najmanje 6 dana, u roku od najmanje 7 dana ili u roku od najmanje jedne nedelje. U nekim primerima izvođenja, IV i ICV primena se izvode naizmeničnim rasporedom, kao što su naizmenične primene jednom nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mesečno ili jednom mesečno. U nekim primerima izvođenja, ICV primena zamenjuje IV primenu u rasporedu primene, na primer u rasporedu IV primene jednom nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mesečno ili jednom mesečno, svaka treća ili četvrta ili peta primena u tom rasporedu može da bude zamenjena ICV primenom umesto IV primene. ;[0041] U nekim primerima izvođenja, IV i ICV primena se izvode uzastopno, kao što je prvo izvođenje IV primene (npr. doziranje jednom nedeljno, svake druge nedelje, jednom na svake tri nedelje, dva puta mesečno ili jednom mesečno tokom dve nedelje, jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili duže), praćeno ICV primenom (npr. doziranje jednom nedeljno, svake druge nedelje, jednom na svake tri nedelje, dva puta mesečno ili jednom mesečno tokom duže od dve nedelje, jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili duže). U nekim primerima izvođenja, prvo se obavljaju ICV primene (npr. doziranje jednom nedeljno, svake druge nedelje, jednom na svake tri nedelje, dva puta mesečno, jednom mesečno, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca tokom dve nedelje, jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili duže), a zatim IV primene (npr. doziranje jednom nedeljno, svake druge nedelje, jednom na svake tri nedelje, dva puta mesečno ili jednom mesečno tokom duže od dve nedelje, jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu dana ili duže). ;[0042] U nekim primerima izvođenja, ICV primena se koristi u odsustvu IV primene. ;[0043] U nekim primerima izvođenja, ICV primena se koristi u odsustvu istovremene imunosupresivne terapije. ;;PRIMERI ;;[0044] U daljem tekstu, predmetni pronalazak će biti opisan detaljnije uz pozivanje na primere. Stručnjacima u ovoj oblasti biće očigledno da ovi primeri imaju samo ilustrativnu svrhu i da se ne mogu tumačiti kao ograničavajući za obim ovog pronalaska. ;;Primer 1 ;;1-1: Pregled ;;[0045] Ova studija je sprovedena da bi se istražio farmakološki efekat i odnos doza-odgovor pojedinačne intracerebroventrikularne (ICV) injekcije idursulfaze beta (IDS-β) kod miševa sa MPS II. Pored toga, merene su koncentraciju HS u CSF i istražena korelaciju između HS u CSF i HS i GAG u moždanom tkivu miševa sa MPS II. ;[0046] Primenjene su tri doze ICV injekcija IDS-β (3, 10 i 30 µg), a GAG u tkivu (mozak, srce, pluća, jetra, slezina i bubreg) su izmereni 7, 14 i 28 dana nakon injekcije. HS je meren korišćenjem LC/MS-MS u CSF i mozgovima miševa. Ukupni GAG u mozgu i drugim somatskim tkivima svih grupa tretiranih sa IDS-β bili su značajno smanjeni. Značajno smanjenje je održano 28 dana u grupi koja je primala injekciju od 30 µg. Takođe je pokazano da je sadržaj HS smanjen i u CSF i u moždanom tkivu svih grupa tretiranih sa IDS-β. Štaviše, pokazano je da je koncentracija HS u CSF u značajnoj korelaciji sa HS u mozgu i GAG u moždanom tkivu. ;[0047] Jedna ICV injekcija IDS-β prema ovom pronalasku je dobro tolerisana i proizvela je značajno smanjenje HS i GAG u mozgu i drugim somatskim tkivima. Autori ovog pronalaska su takođe otkrili da značajna pozitivna korelacija sadržaja HS u CSF sa HS u mozgu i GAG u mozgu sugeriše da bi koncentracija HS u CSF mogla da bude koristan biomarker koji reprezentuje patologiju mozga kod pacijenata sa MPS II kod kojih je zahvaćen CNS. ;1-2: METODE ;;Životinje ;;[0048] Korišćeni su ranije opisani miševi sa inaktivacijom (eng. - knockout, KO) IDS. Ukratko, gen Ids je deletiran iz egzona 2 u egzon 3 [15]. IDS KO miševi su uzgajani iz ishodnog soja C57BL/6.129S i oni su imali mutaciju null u genu Ids. Kontrolni miševi divljeg tipa (WT) su uzgajani iz soja C57BL/B6.129S. Genotip svih miševa je potvrđen polimeraznom lančanom reakcijom DNK dobijene iz isečka repa. Ovu studiju je odobrio Komitet za institucionalnu negu i upotrebu životinja (odobrenje br. 20140925005) i sprovedena je u skladu sa politikom dobrobiti životinja Instituta za biomedicinska istraživanja Samsung, Seul, Koreja. ;;Dizajn studije ;;[0049] Životinje stare 6 nedelja su raspoređene u pet grupa (po 12 životinja u svakoj grupi) stratifikovanom randomizacijom. IDS KO miševi su raspoređeni u četiri grupe: IDS KO miševi kojima se injektuje vehikulum i IDS KO miševi kojima se injektuje IDS-β (Green Cross Corp., Yongin, Koreja) u tri različite doze (3 µg, 10 µg i 30 µg). Četiri životinje u svakoj grupi su žrtvovane svakih 7, 14 i 28 dana nakon ICV injekcije. Analizirane su koncentracije GAG u različitim tkivima (mozak, srce, pluća, jetra, slezina i bubreg), a koncentracije HS iz CSF i mozga su merene 7, 14 i 28 dana nakon injekcije. ;;Priprema IDS-β za ICV injekciju ;;[0050] Rastvor vehikuluma je bio rastvor 150 mM natrijum hlorida i 0.05 mg/mL Tween 20 (Merck Millipore, Darmstadt, Nemačka). Koncentrovani rastvori leka IDS-β (50 mg/mL) su razblaženi vehikulumom da bi se dobile koncentracije od 0.6, 2 i 6 mg/mL. ;;ICV injekcija ;;[0051] Miševi koji su primili pojedinačnu ICV injekciju bili su stari 6 nedelja. Svaki rastvor leka ili vehikulum je davan miševima ICV primenom u ukupnoj zapremini od 5 µL. Na dan doziranja, miševi su anestezirani inhalacijom izoflurana (Hana Pharm., Koreja) i stavljeni u stereotaktički instrument. Nakon što je napravljen mali rez, lobanja je otkrivena i očišćena. ICV injekcija je izvedena prema modifikovanim metodama koje su prethodno objavljene [16, 17]. IDS-β ili vehikulum je ubrizgan u desnu lateralnu moždanu komoru iglom od 31 gejdža brzinom od 10 mL/minutu koju kontroliše špric-pumpa (Harvard Apparatus, Holliston, MA, SAD) uz korišćenje koordinata (Benchmark, Neurolab, St. Louis, MO): 0.58 mm kaudalno od bregme, 1.25 mm lateralno od sagitalne suture i 1.77 mm u dubinu. Na mestu ubrizgavanja praćena je eventualna pojava pucanja krvnih sudova ili otoka facijalnog regiona. Zatim je igla uklonjena 15 sekundi nakon prestanka kretanja klipa da bi se sprečio povratni tok. Rez je zatvoren štipaljkama za rane, a miševi su stavljeni na izotermnu podlogu na 37 °C i posmatrani nakon operacije do oporavka. Ceo protokol je trajao 10-15 minuta za jednu životinju. Da bi se demonstrirala uspešna tehnika ICV injekcije, rastvor boje je ubrizgan ICV putem. Mozak je sakupljen u različitim vremenskim tačkama nakon injekcije i vizualizovan. Pravilno injektovanje u jednu od moždanih komora omogućava distribuciju tripan plavog (0.05%) na injektovanoj strani mozga otprilike 10-15 minuta nakon injekcije. Široka distribucija tripan plavog u hemisferi mozga bila je vidljiva otprilike 1 sat nakon injekcije. Nepravilno injektovanje može da se razlikuje po nedostatku plave boje u hemisferi mozga (Sl.5). ;;CSF i sakupljanje tkiva ;;[0052] Nakon 7, 14 i 28 dana od injektiranja, miševi su eutanazirani ubrizgavanjem prekomernih količina rastvora alfaksalona (Jurox/naziv: Alfaxan) (15 mg/kg). CSF je sakupljen iz cisterne magne borosilikatnim staklom (O.D.: 10 mm, I.D.: 0.75 mm) i zamrznut za merenje koncentracije HS. Krv u moždanom tkivu miševa je očišćena transkardijalnom perfuzijom fosfatno puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS) tokom 1520 min. Tkivo mozga je sakupljeno i zamrznuto na suvom ledu. Zatim su uzorci homogenizovani i podeljeni na četvrtine (polovina je korišćena za merenje GAG, a polovina za merenje HS). Ostala somatska tkiva (srce, pluća, jetra, slezina i bubreg) su takođe sakupljena i homogenizovana u PBS. ;;Merenje ukupne koncentracije GAG u tkivima ;;[0053] Homogenizovani uzorci tkiva su mućkani preko noći na 4 °C i centrifugirani 15 minuta na 12 000 × g, a zatim su sakupljeni supernatanti. Ukupni nivoi GAG su mereni korišćenjem kompleta sGAG Assay kit (Kamiya Biochemicals, Japan). Prvo, 50 µL homogenizovanih uzoraka je inkubirano sa 50 µL 8 mol/L guanidin-HCl na sobnoj temperaturi (RT) tokom 15 minuta. Zatim je dodato 50 µl rastvora STA (0.3% H2SO4, 0.75% Triton X-100) tokom 15 minuta na RT, a rastvor alcijan plavog je dodat u rastvor tokom 15 minuta. Uzorci su zatim centrifugirani 15 minuta na 12 000 o/min. i isprani rastvorom DMSO (40% DMSO, 0.05 mol/L MgCl2). Na kraju je talozima dodato 500 µL rastvora Gu-prop (4 mol/L guanidin-HCl, 33% 1-propanol, 0.25% Triton X-100) i smeša je ostavljena da se potpuno rastvori. Alternativno, apsorbanca je očitana u X-Mark (Bio-Rad, Hercules, CA) na 600 nm. Koncentracija GAG je normalizovana na koncentraciju proteina, koja je merena pomoću kompleta BCA Protein Assay kit (ThermoFisher, Waltham, MA). Koncentracija GAG je izražena kao g GAG/mg proteina, kao što je izračunato preko standardne krive GAG supstrata, hondroitin sulfata-6. Podaci za svaki uzorak bili su prosek merenja u duplikatu. ;;Merenje HS u CSF i moždanom tkivu ;;[0054] Nivoi HS u uzorcima CSF i moždanog tkiva miša su određeni korišćenjem LC-MS/MS. Rastvaranjem natrijumove soli HS ili DS u vodi pripremljeno je 5 mg/mL štok rastvora svakog kalibracionog standarda (STD). Štok rastvori STD su razblaženi odgovarajućom zapreminom vode da bi se pripremilo 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10 i 20 µg/mL STD i 0.2, 2 i 15 µg/mL uzoraka za kontrolu kvaliteta (QC). Takođe, 5 mg/mL štok rastvora STD je obeleženo deuterijumom da bi se napravili HS-d6 i DS-d6 kao interni standard (IS). U staklenu epruvetu je dodato 20 µL STD rastvora i upareno pod azotom. Ostatak je podvrgnut metanolizi mešanjem sa 200 µL metanol-d4-acetil hlorida (400:64, zapr./zapr.) i zagrevanjem 90 min. na 65 °C. Posle metanolize, rastvarač je uparen pod azotom. Ostatak je rekonstituisan u 1 mL vode, razblažen vodom-metanolommravljom kiselinom (950:50:1, zapr./zapr./zapr: pufer A) i pripremljeni rastvor je korišćen kao štok rastvor IS. Uzorak CSF miša je centrifugiran na 2100 × g na 4 °C tokom 5 minuta i supernatant je razblažen jednakom zapreminom PBS. Moždano tkivo miša je homogenizovano sa 0.01 mol/L natrijum hidroksida (50 ili 100 puta zapremine u odnosu na težinu mozga). Homogenat je inkubiran 24 sata na sobnoj temperaturi i 20 µL homogenata je dodato u 180 µL vode-hloroforma (4:5, zapr./zapr.). Posle mešanja, uzorak je centrifugiran na 10000 × g na 4 °C tokom 5 minuta i supernatant je razblažen jednakom zapreminom PBS. Ovi uzorci pripremljeni iz CSF i mozga korišćeni su kao test uzorci za analizu LC-MS/MS. 4 µL test uzorka iz CSF (20 µL iz mozga), STD ili QC u epruveti je upareno pod azotom. Ostatku je dodato 50 µL 3M HCl-MeOH i 5 µL 2,2-dimetoksi propana i on je sonifikovan 3 minuta, zagrevan 90 minuta na 65 °C, i uparen. Ostatak je rekonstituisan sa 200 µL štok rastvora IS, sonifikovan 3 min i prebačen u centrifugalni filter, centrifugiran na 10000 × g na 4 °C tokom 3 min, i dobijeni filtrat je analiziran.5 µL svakog uzorka je ubrizgano u trostruki kvadrupolni maseni spektrometar API5000 (AB/MDS Sciex) opremljen ACQUITY UPLC sistemom (Waters). Test uzorak i IS su razdvojeni na ACQUITY UPLC HSS T3 koloni (100 A 1.8 µm, 2.1 mm sa 100 mm) zagrejanoj na 40 °C. Početna mobilna faza se sastojala od 100:0 (zapr./zapr.) pufera A:pufera B [voda-metanol-mravlja kiselina (500:500:1, zapr./zapr./zapr.)] sa gradijentom eluiranja pri brzini protoka od 0.4 mL/ min. Elucija je izvedena u linearnom gradijentu, pri čemu je pufer B povećavan sa 0% na 45% između 0.5 i 4 minuta, zatim je povećan na 60% na 4.01 min, održavan na 60% tokom 1 min, zatim je smanjen na 0% na 5.01 min, a zatim održavan na 0% tokom 1 min. Maseni spektrometar je radio sa podešavanjima koja su za metod jonizacije birala elektrosprej jonizaciju, a za polaritet jona pozitivan. Azot je korišćen kao gas-zavesa (40 psi), a vazduh je korišćen kao nebulizatorski gas (50 psi) i gas za zagrevanje (40 psi). Uslovi praćenja jona definisani su kao napon jonskog spreja od 4.5 kV i temperatura turbo sonde od 600 °C. Ova podešavanja za potencijal deklasterovanja, ulazni potencijal i energiju sudara bila su 110 V, 8V, odnosno 22 eV. Podaci su dobijeni praćenjem višestrukih reakcija (MRM) korišćenjem odnosa mase i naelektrisanja (m/z) 384→162 za HS, m/z 426→236 za DS, m/z 390→162 za HS-d6 i m/z 432→162 za DS-d6. Površine pikova, STD kriva i izmerene koncentracije su izračunate pomoću Analyst verz.1.5.1 (AB Scix). ;;Statistička analiza ;;[0055] Statistička analiza je izvršena pomoću GraphPad Prism 6. Mann Whitney U test je korišćen za upoređivanje razlika između svake grupe tretirane lekom i grupe tretirane vehikulumom kod KO miševa. Razlike sa P vrednostima manjim od 0.05 smatrane su statistički značajnim. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti i SEM. Za određivanje odnosa između HS u CSF i HS mozga i između HS u CSF i GAG mozga, procenjena su 73 uzorka CSF i moždanog tkiva miševa, a podaci su analizirani korišćenjem Spearmanove rho analize i linearne regresije. Izračunati su koeficijenti korelacije unutar klase (ICC) i 95% intervali poverenja. ;;1-3: REZULTATI ;;Telesne težine ;;[0056] Telesne težine ni jedne od eksperimentalnih grupa nisu se značajno promenile tokom perioda ispitivanja. Nije bilo značajnih razlika u težini miševa u ICV ERT grupama u poređenju sa onima u kontrolnim grupama (WT i netretirani IDS KO miševi). Takođe nisu nađeni nikakvi abnormalni klinički znaci tokom eksperimenata ni u jednoj od ERT grupa. ;;Jedna ICV injekcija IDS-β smanjila je GAG u moždanom tkivu IDS KO miševa ;;[0057] Ukupni GAG u moždanom tkivu KO miševa u grupi sa injekcijom vehikuluma bili su značajno viši u poređenju sa onima kod WT miševa (Sl.1). Ukupne količine GAG u moždanom tkivu svih grupa tretiranih IDS-β su značajno smanjene u poređenju sa onima kod kontrolnih obolelih miševa nakon 7 dana od doziranja (Sl.1). Međutim, reakumulacija GAG je primećena 14 dana nakon injekcije u grupama kojima su injektovane doze od 3 i 10 µg. Značajno smanjenje GAG se održava 28 dana nakon injekcije u grupi koja je primila injekciju od 30 µg, uprkos tome što je ukupan nivo GAG bio blago ponovo povećan u poređenju sa onim 7. i 14. dana (Sl.1). ;Jedna ICV injekcija IDS-β smanjila je HS u CSF i moždanom tkivu IDS KO miševa ;[0058] Nivo HS je bio značajno povećan u CSF i moždanom tkivu IDS KO miševa u poređenju sa WT kontrolnim miševima (Sl.2). Sedam dana nakon ICV injekcije, sadržaj HS u CSF i moždanom tkivu je značajno smanjen u sve tri grupe tretirane IDS-β. Značajna smanjenja HS u moždanom tkivu održavana su tokom 28 dana (Sl.2). Sadržaj HS u CSF ostao je smanjen 14 i 28 dana nakon ICV injekcije. Međutim, statistička značajnost je pronađena samo u grupi tretiranoj sa 30 µg IDS-β 28 dana nakon ICV injekcije (Sl.2). ;;Sadržaj HS u CSF je bio u pozitivnoj korelaciji sa HS i GAG moždanog tkiva ;;[0059] Utvrđena je značajna pozitivna korelacija između sadržaja HS u CSF i koncentracije HS u uzorcima moždanog tkiva miševa (r = 0.785, P<0.0001) (Sl. 3A). Štaviše, sadržaj HS u CSF je takođe imao značajnu pozitivnu korelaciju sa koncentracijom GAG u moždanom tkivu (r = 0.703, P<0.0001) (Sl.3B). ;;Jedna ICV injekcija IDS-β smanjila je GAG somatskih tkiva IDS KO miševa ;;[0060] Izmerena je ukupna koncentracija GAG nakon jedne ICV injekcije u moždanom tkivu i drugim somatskim tkivima (srce, pluća, jetra, slezina i bubreg). Akumulacija GAG je pronađena u svim analiziranim tkivima IDS KO miševa koji su primili injekciju vehikuluma u poređenju sa WT miševima (Sl.4). ICV primena 30 µg IDS-β je održala značajno smanjenje ukupnih GAG u svim ispitivanim tkivima 28 dana nakon ICV injekcije (Sl.4). Koncentracije GAG u somatskim tkivima 7 i 14 dana nakon ICV injekcije prikazane su na sl.6-10. ;;1-4: DISKUSIJA ;;[0061] MPS II je najčešći tip MPS u Aziji, a oko 70% pacijenata sa MPS II ima teški oblik [18, 19]. Stoga je korekcija moždane patologije jedno od najvažnijih i najizazovnijih pitanja u lečenju pacijenata sa MPS II. Intratekalna ili intraventrikularna injekcija rekombinantnog enzima je predložena kao strategija za isporuku terapijskog leka u mozak. U ovoj studiji, primenjene su pojedinačne ICV injekcije tri različite doze IDS-β kod 6 nedelja starih IDS KO miševa kako bi se procenio odnos doze-odgovora i vremenski tok farmakološkog efekta. ;[0062] Ukupni GAG u moždanom tkivu svih grupa tretiranih IDS-β su značajno smanjeni, a značajno smanjenje GAG je održano 28 dana u grupi koja je primila injekciju od 30 µg (Sl. 1). Značajno smanjenje koncentracije HS u CSF je takođe dosledno primećeno u grupi tretiranoj sa 30 µg 28 dana nakon ICV injekcije (Sl.2). Stoga autori predlažu da bi injekcija od 30 µg IDS-β u lateralnu moždanu komoru jednom na svake četiri nedelje mogla biti efikasna u smanjenju i održavanju nivoa GAG akumuliranih u mozgu kod miševa sa MPS II. Osim toga, ovi rezultati mogu da posluže kao osnovni dokaz za odlučivanje o dozi i učestalosti injekcija u kliničkoj upotrebi ICV injekcija rekombinantnog enzima, iako treba uzeti u obzir razlike u veličini mozga i brzini metabolizma kod miševa i ljudi. Međutim, za dalje razjašnjenje efikasnosti ICV primene enzima u poboljšanju patologije CNS kod MPS II, studija mora da se proširi u smislu ponovljenih primena injekcija i sprovođenja funkcionalnih procena, uključujući testove ponašanja i histološke analize mozga. ;[0063] Među različitim tipovima MPS, zahvaćenost CNS je prisutna u teškom obliku MPS I (Hurlerova bolest), teškom obliku MPS II, MPS III i MPS VII. Nasuprot tome, pacijenti sa MPS IV, MPS VI, oslabljenim tipom MPS I (Scheie sindrom) i oslabljenim tipom MPS II nemaju kognitivna oštećenja [2]. HS je jedan od glavnih GAG koji se akumuliraju kod MPS I, II, III i VII [10]. Nekoliko izveštaja je pokazalo da je akumulirani HS u moždanom tkivu odgovoran za neurološke manifestacije MPS [9-12]. Nadalje, pokazano je da je koncentracija HS osetljiviji i specifičniji biomarker u moždanom tkivu miševa sa MPS II [13, 20]. Međutim, direktno merenje količine HS u moždanom tkivu je nemoguće u kliničkom okruženju. Zbog toga su ovde analizirane koncentracije HS u CSF u pokušaju pronalaženja korelacije između nivoa HS u CSF i moždanom tkivu. Autori ovog dokumenta su pokazali da je sadržaj HS značajno povećan i u CSF i moždanom tkivu IDS KO miševa u poređenju sa WT miševima i smanjen u svim grupama tretiranim IDS-β (Sl. 2). Štaviše, ovo je prva studija koja je pokazala da je koncentracija HS u CSF značajno korelisana sa HS moždanog tkiva i GAG moždanog tkiva (Sl. 3). Stoga autori predlažu da bi sadržaj HS u CSF mogao da bude jedan od potencijalnih biomarkera za procenu nivoa HS ili GAG u moždanom tkivu. Međutim, da bi se pokazalo da sadržaj HS u CSF zaista može da reprezentuje patologiju CNS, potrebna je dodatna studija koja uključuje patološki pregled moždanog tkiva jer je patologija CNS kod MPS II rezultat ne samo količine akumulacije GAG, već i sekundarne akumulacije supstrata, upale i degenerativnih promena CNS [12, 21, 22]. Ako se korelacija pokaže, sadržaj HS u CSF bi mogao da bude koristan parametar za procenu patologije CNS u mogućim budućim kliničkim ispitivanjima pacijenata sa MPS II kod kojih je zahvaćen CNS. ;[0064] Pored toga, autori ovog dokumenta su pokazali da ICV primena IDS-β takođe značajno smanjuje akumulaciju GAG u somatskim tkivima (jetra, slezina, bubreg, srce i pluća) kao i moždanom tkivu na dozno-zavisan način, iako se efekat razlikuje među tkivima (Sl.4 i Sl.6-10). Primećeno je da stepen smanjenja GAG zavisi od doze, i primećeno je da primena 30 µg IDS-β može značajno da smanji i održava nivo akumuliranih GAG u somatskim tkivima tokom 28 dana, isto kao i u moždanom tkivu. Ukupno uzevši, ovi podaci pokazuju fiziološki transport terapijskog proteina iz CSF do sistemskih organa nakon ICV primene, sugerišući klinički izvodljiv put za isporuku terapijskog enzima i u mozak i u sistemske organe. Pored toga, CSF bi mogao da posluži kao intermedijarni rezervoar za ubrizgani enzim iz kojeg se neke količine postepeno prenose u sistemsku cirkulaciju nakon ICV injekcije. Iako mehanizam isporuke enzima iz CSF u sistemsku cirkulaciju nije jasan, sugerisano je da bi CSF koji sadrži iduronat-2-sulfatazu mogao da komunicira sa sistemskom venskom cirkulacijom preko subarahnoidalnog prostora [6, 23-25]. ;[0065] U zaključku, jedna ICV injekcija IDS-β je imala dobru podnošljivost i proizvela je značajno smanjenje HS i GAG u moždanom tkivu i GAG u somatskim tkivima IDS KO miševa. Štaviše, efekat je održan 28 dana nakon ICV injekcije, posebno pri dozi od 30 µg. Pored toga, koncentracija HS u CSF bi mogla da bude koristan biomarker koji reprezentuje patologiju mozga, jer je koncentracija HS u CSF u pozitivnoj korelaciji sa HS i GAG moždanog tkiva. ;;1-5: LISTA SEKVENCI ;;[0066] ;;SEQ ID NO:1 ;Dužina: 525 ;Tip: PRT ;;; ;; SEQ ID NO:2 ;;Dužina: 525 ;Tip: PRT ; ;; (59. aminokiselina "G*" sekvence SEQ ID NO:2 označava formil-glicin.)

1-6: REFERENCE

[0067]

[1] Bach G, Eisenberg F, Jr., Cantz M, Neufeld EF: The defect in the Hunter syndrome: deficiency of sulfoiduronate sulfatase. Proc Natl Acad Sci USA 1973, 70:2134-2138.

[2] Neufeld EF, Muenzer J. The mucopolysaccharidoses. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds). The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,vol. III. McGraw-Hill: New York, 2001:34213452.

[3] Kakkis E, McEntee M, Vogler C, Le S, Levy B, Belichenko P, Mobley W, Dickson P, Hanson S, Passage M: Intrathecal enzyme replacement therapy reduces lysosomal storage in the brain and meninges of the canine model of MPS I. Mol Genet Metab 2004, 83:163-174.

[4] Auclair D, Finnie J, White J, Nielsen T, Fuller M, Kakkis E, Cheng A, O'Neill CA, Hopwood JJ: Repeated intrathecal injections of recombinant human 4-sulphatase remove dural storage in mature mucopolysaccharidosis VI cats primed with a short-course tolerisation regimen. Mol Genet Metab 2010, 99:132-141.

[5] Hemsley KM, Hopwood JJ: Delivery of recombinant proteins via the cerebrospinal fluid as a therapy option for neurodegenerative lysosomal storage diseases. Int J Clin Pharmacol Ther 2009, 47 Suppl ES118-123.

[6] Higuchi T, Shimizu H, Fukuda T, Kawagoe S, Matsumoto J, Shimada Y, Kobayashi H, Ida H, Ohashi T, Morimoto H et al: Enzyme replacement therapy (ERT) procedure for mucopolysaccharidosis type II (MPS II) by intraventricular administration (IVA) in murine MPS II. Mol Genet Metab 2012, 107:122-128.

[7] Calias P, Papisov M, Pan J, Savioli N, Belov V, Huang Y, Lotterhand J, Alessandrini M, Liu N, Fischman AJ et al: CNS penetration of intrathecal-lumbar idursulfase in the monkey, dog and mouse: implications for neurological outcomes of lysosomal storage disorder. PLoS One 2012, 7:e30341.

[8] Muenzer J, Hendriksz CJ, Fan Z, Vijayaraghavan S, Perry V, Santra S, Solanki GA, Mascelli MA, Pan L, Wang N et al: A phase I/II study of intrathecal idursulfase-IT in children with severe mucopolysaccharidosis II. Genet Med 2015.

[9] de Ruijter J, Ijlst L, Kulik W, van Lenthe H, Wagemans T, van Vlies N, Wijburg FA: Heparan sulfate derived disaccharides in plasma and total urinary excretion of glycosaminoglycans correlate with disease severity in Sanfilippo disease. J Inherit Metab Dis 2013, 36:271-279.

[10] Coppa GV, Gabrielli O, Zampini L, Maccari F, Mantovani V, Galeazzi T, Santoro L, Padella L, Marchesiello RL, Galeotti F et al: Mental retardation in mucopolysaccharidoses correlates with high molecular weight urinary heparan sulphate derived glucosamine. Metab Brain Dis 2015, 30:1343-1348.

[11] Bruyere J, Roy E, Ausseil J, Lemonnier T, Teyre G, Bohl D, Etienne-Manneville S, Lortat-Jacob H, Heard JM, Vitry S: Heparan sulfate saccharides modify focal adhesions: implication in mucopolysaccharidosis neuropathophysiology. J Mol Biol 2015, 427:775-791.

[12] Wilkinson FL, Holley RJ, Langford-Smith KJ, Badrinath S, Liao A, Langford-Smith A, Cooper JD, Jones SA, Wraith JE, Wynn RF et al: Neuropathology in mouse models of mucopolysaccharidosis type I, IIIA and IIIB. PLoS One 2012, 7:e35787.

[13] Akiyama K, Shimada Y, Higuchi T, Ohtsu M, Nakauchi H, Kobayashi H, Fukuda T, Ida H, Eto Y, Crawford BE et al: Enzyme augmentation therapy enhances the therapeutic efficacy of bone marrow transplantation in mucopolysaccharidosis type II mice. Mol Genet Metab 2014, 111:139-146.

[14] Lawrence R, Brown JR, Al-Mafraji K, Lamanna WC, Beitel JR, Boons GJ, Esko JD, Crawford BE: Disease-specific non-reducing end carbohydrate biomarkers for mucopolysaccharidoses. Nat Chem Biol 2012, 8:197-204.

[15] Jung SC, Park ES, Choi EN, Kim CH, Kim SJ, Jin DK: Characterization of a novel mucopolysaccharidosis type II mouse model and recombinant AAV2/8 vector-mediated gene therapy. Mol Cells 2010, 30:13-18.

[16] Lee WC, Tsoi YK, Troendle FJ, DeLucia MW, Ahmed Z, Dicky CA, Dickson DW, Eckman CB: Single-dose intracerebroventricular administration of galactocere-brosidase improves survival in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. Faseb j 2007, 21:2520-2527.

[17] Glascock JJ, Osman EY, Coady TH, Rose FF, Shababi M, Lorson CL: Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp 2011.

[18] Lin HY, Lin SP, Chuang CK, Niu DM, Chen MR, Tsai FJ, Chao MC, Chiu PC, Lin SJ, Tsai LP et al: Incidence of the mucopolysaccharidoses in Taiwan, 1984-2004. Am J Med Genet A 2009, 149A:960-964.

[19] Sohn YB, Choi EW, Kim SJ, Park SW, Kim SH, Cho SY, Jeong SI, Huh J, Kang IS, Lee HJ et al: Retrospective analysis of the clinical manifestations and survival of Korean patients with mucopolysaccharidosis type II: emphasis on the cardiovascular complication and mortality cases. Am J Med Genet A 2012, 158A:90-96.

[20] Shimada Y, Wakabayashi T, Akiyama K, Hoshina H, Higuchi T, Kobayashi H, Eto Y, Ida H, Ohashi T: A method for measuring disease-specific iduronic acid from the nonreducing end of glycosaminoglycan in mucopolysaccharidosis type II mice. Mol Genet Metab 2015.

[21] Hamano K, Hayashi M, Shioda K, Fukatsu R, Mizutani S: Mechanisms of neurodegeneration in mucopolysaccharidoses II and IIIB: analysis of human brain tissue. Acta Neuropathol 2008, 115:547-559.

[22] Archer LD, Langford-Smith KJ, Bigger BW, Fildes JE: Mucopolysaccharide diseases: a complex interplay between neuroinflammation, microglial activation and adaptive immunity. J Inherit Metab Dis 2014, 37:1-12.

[23] Chen L, Elias G, Yostos MP, Stimec B, Fasel J, Murphy K: Pathways of cerebrospinal fluid outflow: a deeper understanding of resorption. Neuroradiology 2015, 57:139-147.

[24] Hladky SB, Barrand MA: Mechanisms of fluid movement into, through and out of the brain: evaluation of the evidence. Fluids Barriers CNS 2014, 11:26.

[25] Glimcher SA, Holman DW, Lubow M, Grzybowski DM: Ex vivo model of cerebrospinal fluid outflow across human arachnoid granulations. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008, 49:4721-4728.

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. ICV formulacija za upotrebu u lečenju Hanterovog sindroma, koja sadrži protein idursulfazubeta (IDS-β) u koncentraciji od 15 mg/ml, natrijum hlorid u koncentraciji od 150 mM, polisorbat 20 u koncentraciji od 0.05 mg/ml, fosfat u koncentraciji ne većoj od 5 mM, i ima pH vrednost 6, naznačena time što se navedena formulacija primenjuje intracerebroventrikularno (ICV primena) kod subjekta kome je potrebno lečenje u terapijski efikasnoj dozi, pri čemu se navedena ICV primena obavlja preko sistema intraventrikularnog katetera koji sadrži rezervoar i kateter povezan sa navedenim rezervoarom.

2. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što je navedena terapijski efikasna doza u rasponu od 1 mg do 30 mg, pri čemu je poželjno pomenuta terapijski efikasna doza 10 mg.

3. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi jednom na svake tri nedelje ili jednom mesečno.

4. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 1, koja dalje sadrži korake

hirurškog implantiranja navedenog sistema intraventrikularnog katetera, pri čemu se navedeni rezervoar postavlja između skalpa i mozga subjekta kome je potrebno lečenje, a kraj navedenog katetera se postavlja unutar moždane komore navedenog subjekta, tako da je unutrašnji prostor navedenog rezervoara povezan sa unutrašnjim prostorom navedene moždane komore preko unutrašnjeg prostora navedenog katetera, tako da cerebrospinalna tečnost teče iz navedene moždane komore u navedeni rezervoar da bi ispunila navedeni rezervoar;

izvlačenja 0.1-5 ml cerebrospinalne tečnosti iz navedenog rezervoara pri brzini protoka od 0.1-60 ml/minutu;

ubrizgavanja 0.1-5 ml navedene ICV formulacije u navedeni rezervoar pri brzini protoka od 0.1-60 ml/minutu; i

omogućavanja pomenutoj ICV formulaciji da teče iz navedenog rezervoara kroz navedeni kateter u navedenu moždanu komoru.

5. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim oblikom enzimske supstitucione terapije za Hanterov sindrom.

6. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 5, naznačena time što je navedeni dodatni oblik enzimske supstitucione terapije za Hanterov sindrom izabran iz grupe koja se sastoji od intravenske primene i supkutane primene.

7. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi jednom mesečno, a navedena intravenska primena se izvodi jednom nedeljno, ili gde se navedena ICV primena izvodi jednom na svake tri nedelje, a navedena intravenska primena se izvodi jednom nedeljno, ili gde se pomenuta ICV primena izvodi jednom mesečno, a navedena supkutana primena se izvodi jednom nedeljno.

8. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi jednom na svake tri nedelje, a navedena supkutana primena se izvodi jednom nedeljno.

9. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi jednom mesečno, a navedena supkutana primena se izvodi dva puta nedeljno.

10. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi jednom na svake tri nedelje, a navedena supkutana primena se izvodi dva puta nedeljno.

11. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi jednom mesečno, a navedena intravenska primena i navedena supkutana primena se izvode alternativno u intervalu od jedne nedelje.

12. ICV formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što se navedena ICV primena izvodi jednom na svake tri nedelje, a navedena intravenska primena i navedena supkutana primena se izvode alternativno u intervalu od jedne nedelje.