RS65518B1 - Jedinjenja imidazolonilhinolina i njihova terapijska upotreba - Google Patents

Description

Opis

<OBLAST PRONALASKA>

<Ovaj pronalazak obezbeđuje atropizomere i deuterisane derivate ATM inhibitora 8-(1,3-dimetil-1H->pirazol-4-il)-1-(3-fluoro-5-metoksipiridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]hinolin-2-ona kao i njihove farmaceutski prihvatljive soli i čvrste oblike. Ova jedinjenja su korisna u inhibiciji, regulaciji i/ili modulaciji transdukcije signala pomoću ATM kinaze. Pronalazak takođe<obezbeđuje kompozicije koje sadrže pomenute atropizomere, čvrste oblike, farmaceutski>prihvatljive soli i deuterisane derivate ovog pronalaska, kao i ove kompozicije za upotrebu u lečenju različitih poremećaja koji se odnose na ATM kinazu, posebno kancera.

<POZADINA PRONALASKA>

<Serin/treonin protein kinaza ATM (ataksija teleangiektazija mutirana kinaza) pripada PIKK porodici kinaza sa katalitičkim domenima, koji su homologni fosfo-inozitid-3 kinazama (PI3 kinaza, PI3K).>Ove kinaze su uključene u različite ključne ćelijske funkcije, kao što su rast ćelija, proliferacija ćelija, migracija, diferencijacija, preživljavanje i ćelijska adhezija. Posebno, ove kinaze reaguju na oštećenje DNK aktiviranjem zaustavljanja ćelijskog ciklusa i programa popravke DNK (DDR: odgovor na<oštećenje DNK). ATM je proizvod ATM gena i igra ključnu ulogu u popravljanju oštećenja dvostrukog lanca DNK (DSB: prekidi dvostrukog lanca) homolognom rekombinacijom i nehomolognim spajanjem od kraja do kraja (NHEJ). Ova vrsta dvolančanog oštećenja je posebno citotoksična.>

<Jedna od glavnih karakteristika tumora kod ljudi je njihova genomska nestabilnost, sa specifičnim defektima mehanizma popravke DNK koji još nisu poznati kod većine karcinoma. Ova nestabilnost>predstavlja terapijsko polazište za hemoterapiju, koja se već neko vreme pretežno praktikuje. Pored toga, postoji nekoliko sindroma u kojima je osnovni genetski faktor gubitak funkcije povezane mutacije gena koji modulira odgovor na dvolančano oštećenje DNK. Ovo uključuje ataksiju telangiektaziju, koja je uzrokovana defektnim ATM genom. Zajednička karakteristika svih ovih sindroma je da izazivaju ekstremnu osetljivost na zračenje (Lavin & Shiloh (1997) Annu. Rev.

Immunol. 15: 177; Rotman & Shiloh (1998) Hum. Mol. Genet.7: 1555). Ćelije sa nedostatkom ATM su shodno tome osetljive na agense i druge mere koje izazivaju oštećenje DNK dupleksa, što ATM čini<privlačnom metom za osetljivost na hemo- i zračenje u lečenju kancera.>

Ukratko, ATM (ataksija telangiektazija mutirana kinaza) je ključni regulator popravke dvolančanogprekida DNK, koji je izazvan široko korišćenom radio- i hemoterapijom. ATM prenosi široko<rasprostranjen signal na mnoštvo nizvodnih efektora uključujući p53. Nepopravljeni prekidi dvostrukog lanca dovode do aktivacije odgovora kontrolnih tačaka, zaustavljanja ćelijskog ciklusa i na kraju smrti tumorskih ćelija. Zato je ATM postao atraktivna tačka intervencije za sprečavanje popravke indukovanih prekida dvostrukog lanca.>

<Jedinjenje Wortmanin je bilo među onima koja su prvobitno istraživana u ovom kontekstu i pokazalo>je radiosenzibilizaciju koja se inter alia može pripisati inhibiciji ATM-a. Međutim, nije bio pogodan za terapeutsku upotrebu zbog in vivo toksičnosti. Polazeći od hemijske strukture PI3K inhibitora LY294002, KuDOS Pharmaceuticals je identifikovao ATM inhibitor: KU-55933

(2-morfolino-6-(tiantren-1-il)-4H-piran-4-on). Sa ovim jedinjenjem je postignuta senzibilizacija na<jonizujuće zračenje i hemoterapeutske agense koji oštećuju dvostruke lance DNK (Hickson, I., et al. (2004), Cancer Res 64, 9152-9159). Međutim, utvrđeno je da KU-55933 nije pogodan za in vivo upotrebu, verovatno zbog njegove visoke lipofilnosti. KU-60019 (2-((2S,6R)-2,6-dimetilmorfolino)->N-(5-(6-morfolino-4-okso-4H-piran-2-il)-9H-tioksanten-2-il)-acetamid) i KU-559403 (2-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[5-(6-morfolino-4-oksopiran-2-il)tioksanten-2-il]acetamid) su naknadno razvijeni, i KU-559403 je pozdravljen kao dovoljno obećavajući da uđe u kliničko ispitivanje za<lečenje uznapredovalih solidnih tumora.>

<Postoje dalji ATM inhibitori koji podržavaju gornji pojam u tome što su trenutno u kliničkom razvoju, npr. AZD0156, AZD1390 i M3541, uključujući kliničke studije koje uključuju njihovu>kombinaciju sa radioterapijom.

Iako je napravljen veliki napredak u oblasti ATM inhibitora, ostaje potreba da se obezbedi jedinjenje koje ima visoku inhibiciju ATM kinaze, ali i korisnu selektivnost u odnosu na druge kinaze, korisnu biodostupnost i/ili smanjene efekte van cilja.

SUŠTINA PRONALASKA

Obezbeđivanje malih molekula koji efikasno inhibiraju, regulišu i/ili moduliraju transdukciju signala<pomoću ATM kinaze je poželjno i jedan je cilj ovog pronalaska. Dalje je poželjno obezbediti ATM inhibitore koji su selektivni, tj. nemaju ili imaju značajno nižu aktivnost protiv drugih kinaza. Dalje je poželjno obezbediti ATMi inhibitore koji pokazuju korisna svojstva u pogledu poznatih ciljeva koji izazivaju neželjene sporedne efekte. Zato je jedan cilj da se obezbede jedinjenja koja imaju smanjene efekte van cilja i/ili povezane toksičnosti. Štaviše, cilj ovog pronalaska je da obezbedi ATM inhibitor sa dobrom biodostupnošću. Dalji ili alternativni cilj ovog pronalaska je da obezbedi ATM inhibitor sa povoljnim svojstvima čvrstog oblika, kao što je povoljna niska higroskopnost i/ili druga fizička>svojstva.

Najmanje jedan objekat kao što je gore navedeno i dalji objekti su rešeni atropizomeri i deuterisani derivati ATM inhibitora 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(3-fluoro-5-metoksipiridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]hinolin-2-on (Jedinjenje Y) kao i njihovi čvrsti oblici, farmaceutski prihvatljive soli i kompozicije.

Jedan aspekt pronalaska obezbeđuje dva jedinjenja, koja su atropizomeri jedinjenja Y, i predstavljena su formulama:

<i njihove farmaceutski prihvatljive soli.>

Drugi aspekt ovog pronalaska obezbeđuje čvrste oblike jedinjenja 1:

<Posebno povoljne farmaceutski prihvatljive soli Jedinjenja 1, obuhvataju Jedinjenje 1 fumarat, Jedinjenje 1 edisilat i Jedinjenje 1 napsilat, koji se u daljem tekstu takođe mogu zajednički nazivati>"Jedinjenja 1-a".

Drugi aspekt ovog pronalaska obezbeđuje atropizomere 3-a, 3-b, 4-a, 4-b, 5-a i 5-b deuteriranih jedinjenja 3, 4 i 5:

koji su atropizomeri opisani i ilustrovani dalje u nastavku.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 prikazuje anotirani<1>H NMR spektar Jedinjenja 1.

Slika 2 prikazuje anotirani<13>C NMR spektar Jedinjenja 1.

Slika 3 prikazuje anotirani<19>F NMR spektar Jedinjenja 1.

Slika 4 prikazuje UV-Vis spektar Jedinjenja 1 u metanolu.

Slika 5 prikazuje HPLC hromatogram Jedinjenja 1 i 2.

Slika 6 prikazuje dijagram toka pripreme Jedinjenja 1.

Slika 7 prikazuje kristalnu strukturu Jedinjenja-1-Dibenzoil-D-tartrata (A) i njegovog XRPD (B). Slika 8 prikazuje kristalnu strukturu Jedinjenja-2-Dibenzoil-L-tartrata.

Slika 9 prikazuje dijagram ponašanja non-sink rastvaranja u FaSSIF Jedinjenja 1 i njegovih specifičnih soli.

Slika 10 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika Jedinjenja 1 fumarata.

Slika 11 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika Jedinjenja 1 napsilata.

Slika 12 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika Jedinjenja 1 edizilata.

Slika 13 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika A2 Jedinjenja 1.

Slika 14 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika A1 Jedinjenja 1.

Slika 15 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika A3 Jedinjenja 1.

Slika 16 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika NF9 Jedinjenja 1.

Slika 17 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika H1 hidrata Jedinjenja 1.

Slika 18 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika H2 hidrata Jedinjenja 1

Slika 19 prikazuje uzorak rendgenske difrakcije praha (XRPD) čvrstog oblika NF19 Jedinjenja 1.

Slika 20 prikazuje snažnu inhibiciju rasta tumora izazvanu zračenjem (IR) i istovremenim oralnimdavanjem Jedinjenja 1 (6 x 5 dana, 2 Gy; FaDu SCCHN model tumora).

<Slika 21 prikazuje rezultate in vivo evaluacije anti-tumorske aktivnosti Jedinjenja 1 i komparativni>ATM inhibitor u kombinaciji sa olaparibom, u HBCx-10 modelu ksenografta trostruko negativnogkarcinoma dojke dobijenog od pacijenata.

Slika 22 prikazuje DSC krivu zagrevanja oblika A2 Jedinjenja 1.

Slika 23 prikazuje TGA krivu zagrevanja oblika A2 Jedinjenja 1.

Slika 24 prikazuje DVS izotermu uzimanja vode (25°C) oblika A2 Jedinjenja 1.

Slika 25 prikazuje DSC krivu zagrevanja oblika A1 Jedinjenja 1.

Slika 26 prikazuje TGA krivu zagrevanja oblika A1 Jedinjenja 1.

Slika 27 prikazuje DVS izotermu uzimanja vode (25°C) oblika A3 Jedinjenja 1.

Slika 28 prikazuje DSC krivu zagrevanja oblika H2 Jedinjenja 1 (hidrat).

Slika 29 prikazuje TGA krivu zagrevanja oblika H2 Jedinjenja 1 (hidrat).

Slika 30 prikazuje DVS izotermu uzimanja vode (25°C) oblika H2 Jedinjenja 1 (hidrat).

Slika 31 prikazuje DSC krivu zagrevanja Jedinjenja 1 Fumarata (forma NF6).

Slika 32 prikazuje TGA krivu zagrevanja Jedinjenja 1 Fumarata (forma NF6).

Slika 33 prikazuje DVS izotermu uzimanja vode (25°C) Jedinjenja 1 Fumarata (forma NF6).

Slika 34 prikazuje DSC krivu zagrevanja Jedinjenja 1 Napsilata (NF7).

Slika 35 prikazuje TGA krivu zagrevanja Jedinjenja 1 Napsilata (NF7)

Slika 36 prikazuje DVS izotermu uzimanja vode (25°C) Jedinjenja 1 Napsilata (NF7).

Slika 37 prikazuje DSC krivu zagrevanja Jedinjenja 1 Edizilata (NF8).

Slika 38 prikazuje TGA krivu zagrevanja Jedinjenja 1 Edizilata (NF8).

Slika 39 prikazuje DVS izotermu uzimanja vode (25°C) Jedinjenja 1 Edizilata (NF8).

Slika 40 prikazuje XRPD metanolata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku S1.

Slika 41 prikazuje XRPD mešanog hidrata/metanolata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku S2.

Slika 42 prikazuje XRPD THF solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku S3.

Slika 43 prikazuje XRPD dioksanskog solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF11.

Slika 44 prikazuje XRPD hloroform solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF15.

Slika 45 prikazuje XRPD solvata sirćetne kiseline Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF16.

Slika 46 prikazuje XRPD solvata sirćetne kiseline Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF18.

Slika 47 prikazuje XRPD 1,4-dioksan solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF29.

Slika 48 prikazuje XRPD dihlorometanskog solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF32.

Slika 49 prikazuje XRPD NMP (N-Metil-2-pirolidon) solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF33.

Slika 50 prikazuje XRPD acetonitril solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF35.

Slika 51 prikazuje XRPD 1,4-dioksan solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF36.

Slika 52 prikazuje XRPD dimetilacetamid solvata Jedinjenja 1 u čvrstom obliku NF37.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

<Međunarodna patentna prijava WO2016/155844 opisuje jedinjenja imidazolonil hinolina koja>efikasno inhibiraju, regulišu i/ili moduliraju transdukciju signala pomoću ATM kinaze. Takvajedinjenja uključuju Jedinjenje Y:

<Jedinjenje Y je označeno kao Primer 4 u WO2016/155844 i aktivno je u različitim testovima i>terapeutskim modelima koji pokazuju selektivnu inhibiciju ATM kinaze u odnosu na PI3Kalpha,PI3Kbeta, PI3Kdelta, PI3Kgamma i mTOR (u enzimskim i ćelijskim ogledima).

<Izrazi koji se ovde koriste za definiciju jedinjenja su generalno zasnovani na pravilima IUPAC organizacije za hemijska jedinjenja i posebno organska jedinjenja.>

<Sada je iznenađujuće otkriveno da Jedinjenje Y postoji u obliku dva atropizomera, koji se mogu izolovati i koji su korisno stabilni, i da navedeni atropizomeri pokazuju iznenađujuće i veoma poželjne karakteristike.>

<Prema jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje sledeća dva jedinjenja, koja su atropizomeri Jedinjenja Y:>

• 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (Jedinjenje 1) i

• 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Ra)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (Jedinjenje 2),

kao i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Jedinjenja 1 i 2 su predstavljena sledećim formulama:

pri čemu podebljani i isprekidani delovi jedinjenja 1 i 2 označavaju delimičnu rotaciju piridinskogprstena van ravni u kojoj se nalazi triciklični prsten.

<Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da se izraz "atropizomer", kako se ovde koristi, odnosi na stereoizomer koji nastaje usled ograničene rotacije oko jedne veze koja stvara hiralnu osu. Dalje će se ceniti da barijera rotacije oko pomenute jednostruke veze mora biti dovoljno visoka da omogući izolaciju jednog atropizomera. Navedena barijera rotacije može biti rezultat, na primer, steričnih interakcija sa drugim ostacima istog molekula čime se ograničava pomenuta rotacija oko pomenute>jednostruke veze. I sterički i elektronski faktori dolaze u igru i mogu se pojačati ili suprotstaviti jedan drugom.

Upotreba hiralnih jedinjenja koja sadrže asimetrične atome ugljenika je u principu dobro utvrđena u otkrivanju lekova. Posebno je poznato u stanju tehnike da se racemske smeše dva hiralna jedinjenja<obično sastoje od jednog aktivnijeg i jednog manje aktivnog enantiomera u poređenju sa racemskom>smešom. Prema tome, korišćenje samo jednog od dva enantiomera može biti korisno za poboljšanjeukupne snage jedinjenja.

<Međutim, upotreba atropizomera, koji su stereoizomeri koji nastaju samo zbog ometane rotacije oko jedne veze, generalno se smatra nepoželjnom. Posebno, atropizomeri se obično smatraju odgovornim za otkrivanje lekova, pošto stabilnost ovih izomera zavisi od razlika u energiji koje su rezultat steričnih naprezanja ili drugih faktora koji stvaraju barijeru rotaciji oko pomenute jednostruke veze. Za razliku od hiralnih jedinjenja koja su rezultat asimetričnih atoma ugljenika,>atropizomerizam se ne može lako predvideti. Posebno, generalno nije moguće lako predvideti stabilnost atropizomera. Posebno, visina pomenute energetske barijere određuje vreme interkonverzije dva odgovarajuća atropizomera. Međusobna konverzija biološki aktivnog atropizomera u odgovarajući drugi atropizomer može, na taj način, da smanji njegovu biološku aktivnost i da uvede ne-ciljane ili druge neželjene efekte. Zato, samo stabilni atropizomeri koji poseduju dovoljno visoku energetsku barijeru mogu biti pogodni za otkrivanje lekova.

Iznenađujuće je otkriveno da se atropizomeri Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 ne pretvaraju značajno u<odgovarajući drugi atropizomer, čak i nakon dugih vremenskih perioda od više od deset godina>(rotacioni poluživot > 10 deset godina određen je kompjuterskim simulacijama) i na temperaturama<većim od sobne temperature. Temperatura inverzije atropizomera je procenjena na više od 100°C u rastvoru. Ova veoma dobra stabilnost je eksperimentalno potvrđena. To čini te atropizomere lako pogodnim za farmaceutsku primenu, proizvodnju, formulaciju i obezbeđuje dovoljan vek trajanja.>

Apsolutna struktura Jedinjenja 1 određena je na osnovu soli (2S,3S)-Dibenzoil-D-vinske kiseline, kao i difrakcije rendgenskih zraka čvrstog oblika A2, što će biti detaljnije opisano u nastavku. Struktura Jedinjenja 1 je dokazana rezultatima spektroskopije (NMR, MS, IR i UV), difrakcije rendgenskih zraka, elementarne analize i polarimetrije. 1H-, 13C- i 19F-NMR spektri Jedinjenja 1 su prikazani na<Slikama 1 do 3, UV-Vis-Spectrum je prikazan na Slici 4. XRPD čvrstog oblika A2 Jedinjenja 1 je ilustrovan na Slici 13. Kristalna struktura i XRPD za Jedinjenje-1-Dibenzoil-D-tartrata je prikazana>na Slikama 7A i B, kristalna struktura Jedinjenja-2-Dibenzoil-L-tartrata je ilustrovana na Slici 8.

Jedinjenja 1 i 2 su veoma moćni inhibitori ATM kinaze. Kao što je ilustrovano u Tabeli 1, Jedinjenje 1 ima očigledno superiorne vrednosti inhibicije ATM u svim testovima u poređenju sa Jedinjenjem Y, koje je mešavina Jedinjenja 1 i 2:

Tabela 1

<Štaviše, pomenuta jedinjenja su selektivna u odnosu na srodne kinaze, uključujući mTOR (>30,000>nM), DNK-PK i, najvažnije, ATR. Iznenađujuće, oba Jedinjenja 1 i 2 su manje potentni inhibitori ATRkinaze u poređenju sa Jedinjenjem Y, tj. imaju više prednosti u smislu selektivnosti.

Tabela 2

Dok se Jedinjenje 2 ne razlikuje od Jedinjenja Y što se tiče inhibicije ATM-a (v. Tabela 1), ono ima<značajno bolju selektivnost u odnosu na ATR i DNA-PK od Jedinjenja Y, kao što se vidi iz gornje>Tabele 2.

Jedinjenja iz ovog pronalaska se zato mogu posebno povoljno koristiti za selektivno adresiranjespecifičnih mehanizama popravke DNK, posebno homologne rekombinacije, koja specifično cilja na<oštećenja dvostrukih lanaca DNK.>

<Dalja prednost selektivnih ATM inhibitora Jedinjenja 1 i 2 je smanjenje toksičnosti, posebno u odnosu na efekte van cilja, a time i podnošljivost viših doza jedinjenja. Prema tome, jedinjenja prema>pronalasku otvaraju nove mogućnosti u terapiji kancera, na primer, Jedinjenja 1 i 2, najpoželjnijeJedinjenje 1, mogu se koristiti u ciljanim kombinovanim terapijama, na primer koje sadrže moćan i selektivni ATM inhibitor i moćan i selektivni drugi inhibitor, na primer ATR inhibitor.

Sve u svemu, utvrđeno je da Jedinjenje 1 ima najkorisniju ukupnu kombinaciju svojstava.

<Iznenađujuće, ne samo da ima najbolja svojstva inhibicije ATM, već i najbolje vrednosti mikrozomalnog klirensa i najnižu inhibiciju fosfodiesteraze (PDE) 2A1, kao i PDE4A1A i PDE4D2. Sama inhibicija fosfodiesteraze je povezana sa različitim farmakološkim efektima, a inhibitori PDE su dostupni kao lekovi za lečenje različitih stanja, uključujući depresiju, multiple sklerozu i hroničnu>opstruktivnu bolest pluća, da spomenemo samo neke, od kojih bi svi predstavljali efekte van cilja u ovom slučaju. Takođe je poznato da je inhibicija PDE4 povezana sa rizikom od izazivanja mučnine i da se stoga treba izbegavati. Zbog toga su poželjne visoke vrednosti IC50, tj. slaba inhibicija ovih izvan ciljeva. Kao što se vidi iz sledeće Tabele 3, Jedinjenje 1 ima IC50 vrednosti za inhibiciju PDE4 koje su po faktoru oko 5 veće od onih za Jedinjenje Y.

Tabela 3

<Tabela>

p<4>

ol<i>

o<lu>

ž<s>

iv<tr>

o<u>

s<j>

t<e>

o<d>

d<a>

o<lj>

k<e>

o<p>

8<o>

0<v>

%<oljn>

i p<e>

o<p>

v<a>

o<r>

l<a>

j<metre Jedinjenja 1, uključujući povoljno visoku>bioras na svojstva u vezi sa CYP i hERG (kardijalni jonski kanal), pričemu poslednje ukazuje da bezbednosno relevantne interakcije sa srčanim Kv11.1 hERG jonskimkanalom nisu za očekivati.

Tabela 4

Dalje je iznenađujuće otkriveno da oba Jedinjenja 1 i 2 pokazuju značajno poboljšanu rastvorljivost ubiološkim puferskim rastvorima (videti Tabelu 5 ispod) u poređenju sa Jedinjenjem Y. Predviđeni spori klirens iz ljudske plazme i visoka bioraspoloživost Jedinjenja 1 doprinose odgovarajućim zahtevima za niske doze.

Tabela 5

Predviđeno je da strukture prikazane za Jedinjenja 1 ili 2 uključuju jedinjenja koja se razlikuju samou prisustvu jednog ili više izotopski obogaćenih atoma. Na primer, H, C, N, u svakom slučaju, takođe<uključuju teže izotope ovih atoma. Ovo se posebno odnosi na H, gde se deuterijum ili tricijum mogu povoljno koristiti, i na zamenu ugljenika sa 13C- ili 14C-obogaćenim ugljenikom, što je takođe u okviru ovog pronalaska. U određenim poželjnim realizacijama, ne koriste se izotopski obogaćeni atomi, već se atomi koriste u svojim prirodnim oblicima u smislu distribucije izotopa.>

Pozivanje na jedinjenja ili soli prema sadašnjem pronalasku će se smatrati da takođe obuhvata solvatne oblike, tj. njihove solvate, što znači solvate i slobodnog oblika ili soli. Pod solvatima se podrazumevaju adukti inertnih molekula rastvarača na jedinjenja koja nastaju usled njihove<međusobne privlačne sile. Solvati su, na primer, mono- ili dihidrati ili alkoholati. Primeri izvođenja solvata su detaljnije opisani u nastavku.>

<Kao što je gore navedeno, ovaj pronalazak obezbeđuje dva stabilna atropizomera, Jedinjenja 1 i 2.>Priprema ova dva atropizomera se obično zasniva na tehnikama razdvajanja i prečišćavanja, kao štoće biti detaljnije opisano u nastavku. Stručnjak u ovoj oblasti razume da ovo možda neće dati<savršeno čiste proizvode. Međutim, ovaj pronalazak obezbeđuje Jedinjenje 1 koje je suštinski bez Jedinjenja 2, i Jedinjenje 2 koje je suštinski bez Jedinjenja 1. "U suštini bez" u sadašnjem kontekstu će poželjno značiti da suštinski čisto Jedinjenje 1 može sadržati najviše masenih 20% Jedinjenja 2 ili njegove soli, poželjno najviše masenih 15%, poželjnije najviše masenih 10%, na primer najviše masenih 5%, najviše masenih 2,5%, najviše masenih 1%, najviše masenih 0,5% ili najviše masenih>0,1% po masi Jedinjenja 2 ili njegove soli, ostatak do 100% se sastoji od Jedinjenja 1. U jednomprimeru, suštinski čisto Jedinjenje 1 može se sastojati od masenih 99% Jedinjenja 1 i masenih 1% Jedinjenja 2. Isto važi i obrnuto za Jedinjenje 2, tj. da Jedinjenje 2 u suštini ne sadrži Jedinjenje 1, poželjno će značiti da čisto Jedinjenje 2 može sadržati najviše masenih 20% Jedinjenja 1 ili njegove soli, sa poželjnim rasponima otkrivenim za Jedinjenje 1 je podjednako primenljivim (obrnuto) po analogiji. Takođe, upućivanje na Jedinjenje 1 ili njegovu so, odnosno na Jedinjenje 2 ili njegovu so, će<uključivati sve solvate i čvrste oblike, kao što su oni koji su ovde otkriveni dalje u nastavku, čak i bez posebnog pominjanja, osim ako nije eksplicitno opisano drugačije.>

<U drugim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje Jedinjenje 1 ili 2 u suštini bez nečistoća. Kako se ovde koristi, izraz "u suštini bez nečistoća" znači da jedinjenje ne sadrži nikakvu značajnu količinu stranih materija. Takve strane mat dinjenje 1 ili njegovu so,>rezidualno Jedinjenje 2 ili njegovu<e>

s<r>

o<i>

,<je>

re<m>

zi<o>

d<g>

u<u>

al<u>

n<k>

e<lj>

r<u>

a<č>

s<i>

t<v>

v<a>

a<t>

r<i>

a<r>

č<e>

e<zi>

i<d>

li<u>

b<a>

i<l>

l<n>

o<o>

k<Je>

oje druge nečistoće koje mogu biti rezultat pripreme i/ili izolacije Jedinjenja 1 ili 2. U određenim realizacijama, Jedinjenje 1 može sadržati najviše masenih 30% stranih materija, ostatak do masenih 100% čini Jedinjenje 1, poželjno ne više od masenih 25%, ne više od masenih 20%, ne više od masenih 15%, ne više od masenih 10%, ne više od masenih 7,5%, ne više od masenih 5%, ne više od masenih 1%, ne više od masenih 0,5% ili ne više od masenih 0,1%. Isti primeri izvođenja su validni, po analogiji, za Jedinjenje 2. Takođe, kao i ranije, upućivanje na Jedinjenje 1 ili njegovu so, odnosno na Jedinjenje 2 ili njegovu so, će<uključivati sve solvate i čvrste oblike, kao što su oni koji su ovde otkriveni dalje u nastavku, osim ako nije drugačije opisano.>

<Prema drugom aspektu, Jedinjenje 1 ili 2, respektivno, ne sadrži više od oko 5,0 procenta površine>HPLC ukupnih organskih nečistoća i, u određenim realizacijama, ne više od oko 3,0 procentapovršine HPLC ukupnih organskih nečistoća i, u određenim realizacijama, nema više od oko 1,5 procenta površine HPLC ukupnih organskih nečistoća u odnosu na ukupnu površinu HPLC hromatograma. U drugim realizacijama, Jedinjenje 1 ili 2 ne sadrži više od oko 1,0 procenta površine HPLC bilo koje pojedinačne nečistoće; ne više od oko 0,6 procenta površine HPLC bilo koje<pojedinačne nečistoće, i, u određenim realizacijama, ne više od oko 0,5 procenta površine HPLC bilo koje pojedinačne nečistoće, u odnosu na ukupnu površinu HPLC hromatograma. Na primer, za HPLC>hromatogram, može se koristiti metoda opisana u PRIMERU 3.3 za analizu čistoće odgovarajućih atropizomera. Opet, upućivanje na Jedinjenje 1 ili njegovu so, odnosno na Jedinjenje 2 ili njegovu so,<će uključivati sve solvate i čvrste oblike, kao što su oni koji su ovde otkriveni dalje u nastavku, osim ako nije eksplicitno drugačije opisano.>

<Prema drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu Jedinjenja 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U alternativnoj realizaciji,>farmaceutska kompozicija sadrži efektivnu količinu Jedinjenja 2 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U skladu sa drugom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje metod za pripremu takvih kompozicija opisanih ovde (na primer, kompozicija koja može da uključi efektivnu količinu bilo Jedinjenja 1 ili 2). Pozivanje na Jedinjenje 1 ili 2 će se čitati u sadašnjem kontekstu tako da bilo kojakoličina odgovarajućeg drugog atropizomera može biti samo u skladu sa definicijama "u suštini bez" odgovarajućeg drugog atropizomera, "u suštini bez nečistoća" ili ukupna količina nečistoća, odnosno računala bi se u količinu pomenutog jedinjenja, a ne odvojeno. Isto važi i za odgovarajuće soli. Kao što je prethodno navedeno, upućivanje na jedinjenje 1 ili 2 ili njegovu so će podjednako uključivatibilo koji čvrsti oblik ili solvat, kao što su oni koji su dalje otkriveni u nastavku, osim ako nije<drugačije opisano. U primernim realizacijama, Jedinjenje 1 je sadržano u farmaceutskoj kompoziciji u svom slobodnom, tj. obliku bez soli.>

U skladu sa drugom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja, njegovefarmaceutski prihvatljive soli ili (farmaceutske) kompozicije prema ovom pronalasku u proizvodnji leka za lečenje kancera. U drugoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje ili farmaceutsku kompoziciju, kako je ovde opisano, za upotrebu kao lek, posebno za lečenje kancera. Opet,<upućivanje na jedinjenje ili njegovu so će uključivati bilo koji solvat ili čvrsti oblik tih jedinjenja ili>soli, kao što su oni koji su ovde otkriveni dalje u nastavku, osim ako nije eksplicitno drugačijeopisano.

<Slobodne forme i soli>

<Jedinjenja prema pronalasku se mogu koristiti u svom slobodnom obliku, tj. kako je prikazano gornjim formulama. Na primer, otkriveno je da je slobodni oblik Jedinjenja 1 posebno koristan, a njegovi primeri čvrstih oblika, uključujući poželjni čvrsti oblik, biće detaljnije opisani u nastavku. S druge strane, ovaj pronalazak takođe obuhvata upotrebu ovih jedinjenja u obliku njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, koje mogu biti izvedene iz različitih organskih i neorganskih kiselina postupcima poznatim u stanju tehnike. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja prema pronalasku mogu se dobiti konvencionalnim postupcima. Jedinjenje prema pronalasku može da se>konvertuje u odgovarajuću kiselinsko-adicionu so upotrebom kiseline, na primer reakcijom jedinjenja i ekvivalentne ili viška količine kiseline u odgovarajućem rastvaraču, kao što je, na primer, THF ili aceton kome sledi hlađenje kristalizacije tako formiranog zasićenog rastvora. Alternativno, može se koristiti kristalizacija anti-rastvarača ili kristalizacija isparavanjem.

Primeri pogodnih farmaceutski prihvatljivih soli jedinjenja prema sadašnjem pronalasku, posebno Jedinjenja 1, uključuju HCl so, sulfatnu so, tozilatnu so, besilatnu so, laktatnu so, posebno L-laktatnu so.

Poželjne soli jedinjenja 1 uključuju fumaratnu so, napsilatnu so i edizilatnu so, koje se takođe mogu<zajednički odnositi na Jedinjenja 1a u nastavku.>

<Napsilat Jedinjenja 1 se može pripremiti od Jedinjenja 1 korišćenjem naftalensulfonske kiseline i THF ili acetona kao rastvarača. Dobijena je dobra kristalnost. Poželjni odnos Jedinjenja 1 : napsilata je oko 1:1.>

Edizilat Jedinjenja 1 se može dobiti korišćenjem etandisulfonske kiseline i hlađenjem kristalizacije iz acetona. Poželjni odnos Jedinjenja 1 : napsilata je oko 1:1. Dobijena je dobra kristalnost.

Fumarat Jedinjenja 1 se može dobiti difuzijom pare anti-rastvarača u THF koristeći n-pentan kao<anti-rastvarač i fumarnu kiselinu kao kiselinu. Pokazalo se da je odnos Jedinjenja 1 : fumarat oko 1:0.9. Dobijena so ima veoma povoljna ukupna fizička svojstva i dobru kristalnost. So fumarata je>poželjna realizacija među solima, delimično zbog poželjnog odsustva higroskopnih svojstava.

Detaljni primeri pogodnih metoda za dobijanje soli fumarata, napsilata i edizilata Jedinjenja 1 prema ovom pronalasku su otkriveni u PRIMERU 5.

<Utvrđeno je da ove soli Jedinjenja 1 pokazuju bržu početnu brzinu rastvaranja od parentalnog>Jedinjenja 1. Ponašanje non-sink rastvaranja u FaSSIF pufer rastvoru (pH 6.5) Jedinjenja 1 i njegovih<specifičnih soli je primerno prikazano na Slici 9. Soli sa povoljnim ponašanjem u rastvaranju su>edizilat Jedinjenja 1, fumarat Jedinjenja 1 i napsilat Jedinjenja 1. Parentalno jedinjenje 1 je korišćenou obliku mešavine različitih kristalnih i solvatnih oblika.

<Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u stanju tehnike će razumeti da je anjonski deo iz kiseline i>Jedinjenja 1 jonski vezan da formira Jedinjenje 1-a. Smatra se da Jedinjenje 1-a može postojati u različitim fizičkim oblicima. Na primer, Jedinjenje 1-a može biti u rastvoru, suspenziji ili u čvrstomobliku. U određenim realizacijama, Jedinjenje 1-a je u čvrstom obliku. Kada je Jedinjenje 1-a u<čvrstom obliku, navedeno jedinjenje može biti amorfno, kristalno ili njihova smeša. Kako se ovde koristi, izraz "polimorf" se odnosi na različite kristalne strukture u kojima jedinjenje ili njegova so>mogu da kristališu.

U nekim realizacijama, Jedinjenja 1-a su kristalne čvrste materije u suštini bez amorfnog Jedinjenja1-a. Kako se ovde koristi, izraz "suštinski bez amorfnog Jedinjenja 1-a" znači da so ne sadrži<značajnu količinu amorfnog Jedinjenja 1-a. U određenim realizacijama, prisutno je najmanje oko masenih 90% kristalnog Jedinjenja 1-a, ili je prisutno najmanje oko masenih 95% kristalnog Jedinjenja 1-a. U još drugim realizacijama pronalaska, prisutno je najmanje oko masenih 99% kristalnog Jedinjenja 1-a. Ovi procenti su u odnosu na apsolutnu težinu Jedinjenja 1-a (100 mas.%).>

U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje čvrst oblik fumarata Jedinjenja 1, koji se karakteriše dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici 10 i/ili karakteriše jednim ili više pikova u njegovom dijagramu rendgenske difraktometrije praha odabranom od onih na oko

Fumaratna so Jedinjenja 1 je bezvodna. Njegova čvrsta forma se takođe može nazvati Fumarat-NF6. DSC kriva zagrevanja, TGA kriva zagrevanja i DVS izoterma upijanja vode (25°C) Fumarata-NF6 su prikazani na Slikama 31, 32 i 33. Rezultati merenja non-sink rastvaranja su dati u tabeli ispod (podaci o non-sink rastvaranju u FaSSIF na pH 6.5, metoda opisana u eksperimentalnom delu):

Kako se ovde koristi, izraz "oko", kada se koristi u odnosu na vrednost stepena 2-teta, odnosi se na navedenu vrednost ± 0.3 stepena 2-teta (° 2ϴ). U određenim realizacijama, "oko" se odnosi na ± 0.2 stepena 2-teta ili ± 0.1 stepen 2-teta, najpoželjnije ± 0.2 stepena 2-teta.

Bilo koji čvrsti oblik odnosno polimorf koji je ovde opisan može se okarakterisati sa jedan, dva, tri,<četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest,>sedamnaest, osamnaest, devetnaest, dvadeset ili više XRD ili XRPD pikova (°2ϴ). Bilo koji čvrstioblik, odnosno polimorf koji je ovde opisan, poželjno je okarakterisan sa najmanje šest XRD pikova(°2ϴ, poželjno ± 0,2° 2ϴ). Poželjni pikovi za karakterizaciju čvrstog oblika, odnosno polimorfa,<označeni su podebljanim slovima i zvezdicama u odgovarajućim listama pikova.>

<U sledećoj primernoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje čvrsti oblik napsilata Jedinjenja 1, koji>se karakteriše dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici 11 i/ili se karakteriše jednim ili više pikova u svom dijagramu rendgenske difraktometrije praha izabran od onih na oko

Svojstva termičke i vodene adsorpcije napsilatne soli Jedinjenja 1 su ilustrovana na Slikama 34, 35 i<36. Čvrsti oblik dobijen za napsilatnu so se takođe može nazvati Napsilatom NF7. Štaviše, ponašanje>rastvaranja predstavljeno je sledećim eksperimentalnim podacima o non-sink rastvaranju (FaSSIF,pH 6.5):

U sledećoj primernoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje čvrst oblik edizilatne soli Jedinjenja 1, koji se karakteriše dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici 12 i/ili se karakteriše jednim ili više pikova u svom dijagramu rendgenske difraktometrije praha izabranom od onih na oko

Termička svojstva i podaci o rastvaranju edizilatne soli Jedinjenja 1 ilustrovani su Slikama 37, 38 i 39. Čvrsti oblik edizilatne soli se takođe može nazvati NF8. To je anhidrovana oblik/so. Podaci onon-sink rastvaranju (FaSSIF, pH 6.5) su dati u tabeli ispod:

<U skladu sa onim što je gore navedeno u vezi sa Jedinjenjima 1 i 2, ovaj pronalazak obezbeđuje Jedinjenje 1-a ili druge soli Jedinjenja 1 u suštini bez Jedinjenja 2 ili njegove soli. U daljim>realizacijama, Jedinjenje 1-a ili druga so Jedinjenja 1 je takođe obezbeđeno u suštini bez nečistoća.Prema drugoj realizaciji, Jedinjenje 1-a ili bilo koja druga so Jedinjenja 1 ne sadrži više od oko 5.0 procenata površine HPLC ukupnih organskih nečistoća u odnosu na ukupnu površinu HPLC hromatograma. Primeri i poželjni opsezi otkriveni gore za Jedinjenje 1 u vezi sa "uglavnom bez Jedinjenja 2 ili njegove soli", "bez nečistoća" i procentom površine ukupnih organskih nečistoća su podjednako primenljivi ovde. Isto se, po analogiji, odnosi na bilo koju od soli bilo kog od jedinjenja, a posebno na atropizomerna jedinjenja, prema ovom pronalasku.

U skladu sa drugom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu Jedinjenja 1-a. U skladu sa drugom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje<metod za pripremu takvih kompozicija opisanih ovde (na primer, kompozicija koja može da uključi efektivnu količinu Jedinjenja 1-a). Još jedna realizacija obezbeđuje Jedinjenje 1-a, odnosno njegovu kompoziciju prema ovom pronalasku za upotrebu u lečenju kancera. Prema drugoj realizaciji, ovaj>pronalazak obezbeđuje upotrebu ovde opisane kompozicije u proizvodnji leka za lečenje kancera.Jedinjenje 1-a može biti prisutno u (farmaceutskoj) kompoziciji u istim količinama koje su otkrivene za Jedinjenje 1. U pogledu prisustva drugog atropizomera ili njegove soli u kompoziciji, respektivno, razmatranja navedena gore za Jedinjenje 1 podjednako se primenjuju po analogiji.

<Čvrste forme i solvati>

<Prema drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje čvrste oblike Jedinjenja 1 ili 2, posebno>Jedinjenja 1.

Stručnjak u ovoj oblasti će ceniti da jedinjenja prema ovom pronalasku mogu postojati u različitim<fizičkim oblicima. Na primer, mogu biti u rastvoru, suspenziji ili u čvrstom obliku.>

<U određenim poželjnim realizacijama, Jedinjenje 1 je u čvrstom obliku. Čvrsti oblici su generalno>poželjni ovde jer omogućavaju obezbeđivanje čvrstih farmaceutskih kompozicija. Kada je Jedinjenje1 u čvrstom obliku, navedeno jedinjenje može biti amorfno, kristalno ili njihova smeša. Primeri<čvrstih oblika Jedinjenja 1 su detaljnije opisani u nastavku.>

<Prema jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje Jedinjenje 1 kao amorfnu čvrstu supstancu. Amorfne čvrste materije su dobro poznate prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti i tipično se pripremaju takvim metodama kao što su liofilizacija, sušenje raspršivanjem ili taloženje.>

U drugim realizacijama, Jedinjenje 1 je kristalna čvrsta supstanca. Kako se ovde koristi, izraz "polimorf" se odnosi na različite kristalne strukture u kojima jedinjenje može da kristališe.

U nekim realizacijama, Jedinjenje 1 je kristalna čvrsta supstanca suštinski bez amorfnog Jedinjenja 1. Kako se ovde koristi, izraz "u suštini bez amorfnog Jedinjenja 1" znači da jedinjenje ne sadrži<značajnu količinu amorfnog Jedinjenja 1. U određenim realizacijama, najmanje je prisutno oko>masenih 90% kristalnog Jedinjenja 1, ili je prisutno najmanje oko masenih 95% kristalnog Jedinjenja<1. U još drugim realizacijama pronalaska, prisutno je najmanje oko masenih 99% kristalnog Jedinjenja 1. Ovi procenti su u odnosu na apsolutnu težinu Jedinjenja 1 (100 mas.%). Isto važi, mutatis mutandis, za prihvatljivi amorfni sadržaj u bilo kom kristalnom obliku, odnosno polimorfu svih jedinjenja koja su ovde otkrivena, uključujući ona koja su ovde opisana za soli, anhidrovane>oblike, solvate i druge oblike.

Prema jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje čvrsti oblik Jedinjenja 1, koji je čvrsti oblik anhidrovanog Jedinjenja 1, poželjno kristalno anhidrovano Jedinjenje 1. Ovde je opisano pet<različitih polimorfnih oblika anhidrovanog Jedinjenja 1. U kontekstu specifičnih čvrstih oblika>opisanih u ovom odeljku koji uključuju anhidrovane oblike i solvate, upućivanje na Jedinjenje 1 će se razumeti kao referenca na jedinjenje kao takvo, tj. njegov slobodni (ne-so) oblik.

Prvi anhidrovani kristalni oblik Jedinjenja 1 se u daljem tekstu naziva "Forma A2" i polimorf je okarakterisan dijagramom rendgenske difraktometrije praha (XRPD) koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici 13, i pronađeno je da je veoma povoljan.

<U skladu sa jednom realizacijom, Forma A2 karakteriše jedan ili više pikova u svom dijagramu rendgenske difraktometrije praha koji se bira između onih na oko 7.3, oko 9.6, oko 11.1, oko 12.0, oko 12.7 i oko 16.2 stepena 2-teta. U ne>

svom dijagramu rendgenske difraktome<k>

t<i>

r<m>

ije<re>

p<a>

r<l>

a<iz>

h<a>

a<c>

k<ij>

o<a>

j<m>

i s<a>

e<, F>

b<o>

ir<r>

a<m>

iz<u>

m<A2 karakterišu dva ili više pikova u>eđu onih na oko 7.3, oko 9.6, oko 12.7, oko 16.2, oko 22.6 i oko 25.1 stepeni 2-teta. U određenim realizacijama, Forma A2 se karakteriše sa tri ili više pikova u svom dijagramu rendgenske difraktometrije praha koji se bira<između onih na oko 7.3, oko 9.6, oko 12.7, oko 16.2, oko 22.6 i oko 25.1 stepeni 2-teta. U određenim realizacijama, Forma A2 se karakteriše sa četiri, pet ili uglavnom svih pikova u svom dijagramu>rendgenske difraktometrije praha odabranim od onih na oko 7.3, oko 9.6, oko 12.7, oko 16.2, oko 22.6 i oko 25.1 stepeni 2- teta. U posebnim realizacijama, Formu A2 karakteriše šest ili više ili<značajno svih pikova u svom dijagramu rendgenske difraktometrije praha izabranim od onih na oko 7.3, 9.6, 11.1, 12.0, 12.7, 14.7, 16.2, 17.3, 18.9, 21.0 , 22.6 i 25.1 stepeni 2-teta.>

U jednom primeru izvođenja, Forma A2 se može okarakterisati sa jednim ili više, poželjno šest i dosuštinski svih pikova u svom dijagramu rendgenske difraktometrije praha (XRPD) odabranim od onih na oko:

<Biće poželjno da se gore opisani polimorfni oblik može okarakterisati, na primer, pozivanjem na bilo koji od pikova u njegovom odgovarajućem dijagramu rendgenske difraktometrije praha (XRPD). Kao što je ranije navedeno, boldovano štampanje i zvezdice označavaju pikove koji mogu biti poželjniji za karakterizaciju polimorfa.>

<Forma A2 se može okarakterisati sa jednim, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset,>jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest, dvadeset ili više XRPD-a pikova (°2ϴ) gornje tabele. Bilo koji polimorf koji je ovde opisan je poželjno okarakterisan sa najmanje šest XRD ili XRPD pikova (°2ϴ, poželjno ± 0.2).

Forma A2 može opciono biti okarakterisana time što ima monoklinični kristalni sistem i P21 prostornu grupu. Forma A2 može se dalje okarakterisati jednim ili više od sledećih parametara njegove jedinične ćelije, kao što je navedeno u sledećoj Tabeli:

<Forma A2 Jedinjenja 1 ima povoljna sveukupna svojstva, što je dalje vidljivo iz njenog ponašanja upijanja toplote i vode kao što je ilustrovano DSC krivom zagrevanja (Slika 22), TGA krivom zagrevanja (Slika 23) i DVS izotermom uzimanja vode (na 25 °C) (Slika 24). Forma A2 adsorbuje>veoma malo vode (<2%) čak i do relativne vlažnosti od 100%, i stoga je superiornija od Forme A3, na primer.

Još jedna prednost Forme A2 je njeno povoljno ponašanje u rastvaranju, kao što je ilustrovano u<sledećoj tabeli, koja predstavlja količine Jedinjenja 1 u Formi A2 rastvorenih u različitim>vremenskim periodima (podaci o non-sink rastvaranju u FaSSIF na pH 6.5, metod opisan uEksperimentalnom Odeljku):

<Forma A2 se može dobiti iz Jedinjenja 1 hlađenjem kristalizacije iz alkohola, da spomenemo samo jedan primer. Pogodne metode i uslovi reakcije su detaljno opisani u PRIMERU 7.>

<Na primer, kristali Forme A2 koji imaju povoljna svojstva mogu se reproduktivno pripremiti kontrolisanim procesom kristalizacije koji obuhvata:>

a) Pripremu disperzije Jedinjenja 1, na primer hidrata Jedinjenja 1, kao što je hidrat Jedinjenja 1 oblika H2, u pogodnom rastvaraču, npr. alkoholu,

b) Zagrevanje disperzije da bi se dobio rastvor, poželjno bistri rastvor,

c) Kontrolisano hlađenje rastvora,

d) Dodavanje semenskog kristala Forme A2,

e) Kontrolisano hlađenje rastvora sa semenskim kristalima, na primer brzinom od oko 0.1 °C/min.<Odgovarajući alkoholi i uslovi kristalizacije, kao što su temperature, mogu se izvesti iz PRIMERA 7.1 do 7.3, koji su primenljivi van specifične realizacije. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na anhidrovano, kristalno Jedinjenje 1 u Formi A2, koje se može dobiti gornjim postupkom ili u suštini u skladu sa bilo kojim od procesa opisanih u PRIMERIMA 7.1 do 7.4.>

<Dalji anhidrovani kristalni oblik Jedinjenja 1 se u daljem tekstu naziva "Forma A1" i polimorf je>okarakterisan dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici 14. Pogodne metode za njegovu pripremu su opisane u PRIMERU 7.

Forma A1 može biti okarakterisana sa jednim ili više, poželjno šest, i do suštinski svih pikova u njenom dijagramu rendgenske difraktometrije praha odabranim od onih na oko:

<Termička svojstva Forme A1 jedinjenja 1 su procenjena diferencijalnom skenirajućom>kalorimetrijom (DSC) i termogravimetrijskom analizom (TGA), kao što je ilustrovano na Slikama 25i 26.

<Treći anhidrovani kristalni oblik Jedinjenja 1 se u nastavku naziva "Forma A3" i polimorf je okarakterisan dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim>prikazanim na Slici 15. Opisan je pogodan metod za njegovu pripremu u PRIMERU 7.

Forma A3 se može okarakterisati sa jednim ili više, poželjno šest, i do suštinski svih pikova u njenom dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji se bira između onih na oko:

<Kao što se vidi sa Slike 27, Forma A3 Jedinjenja 1 pokazuje vrlo malu adsorpciju vode do relativne vlažnosti od oko 70%. Forma A3 može opciono biti dodatno okarakterisana kristalnim sistemom i>parametrima jedinične ćelije kao što je dato u Tabeli 7 ispod. Podaci o non-sink rastvaranju u FaSSIF na pH 6.5 Jedinjenja 1 u Formi A3 dati su u tabeli ispod:

<Četvrti anhidrovani kristalni oblik Jedinjenja 1 se u nastavku naziva "Forma NF9" i polimorf je okarakterisan dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim>prikazanim na Slici 16. Opisan je pogodan metod za njegovu pripremu u PRIMERU 7.

Forma NF9 se može okarakterisati sa jednim ili više, poželjno šest, i do suštinski svih pikova u njenom dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji se bira između onih na oko:

<U daljem izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje hidrate Jedinjenja 1, poželjno čvrsti oblik hidrata Jedinjenja 1, poželjno kristalni hidrat Jedinjenja 1. Ovde su opisana dva različita hidrata, odnosno polimorfni oblici hidrata Jedinjenja 1. Kao što je gore pomenuto, u kontekstu ovih specifičnih čvrstih oblika, referenca na Jedinjenje 1 će se razumeti kao referenca na jedinjenje kao takvo, tj. njegov>slobodni (ne-so) oblik.

Prvi kristalni oblik Jedinjenja 1 se u nastavku naziva "Forma H1" i polimorf je okarakterisan dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici<17. Opisani su pogodni metodi za njegovu pripremu u PRIMERU 7.>

<Forma H1 se može okarakterisati sa jednim ili više, poželjno šest, i do suštinski svih pikova u njenom>dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji se bira između onih na oko:

<Drugi kristalni oblik Jedinjenja 1 se u nastavku naziva "Forma H2" i polimorf je okarakterisan>dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici<18. Opisani su pogodni metodi za njegovu pripremu u PRIMERU 7.>

<Forma H2 se može okarakterisati sa jednim ili više, poželjno šest, i do suštinski svih pikova u njenom>dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji se bira između onih na oko:

<Hidrat Jedinjenja 1 u kristalnoj Formi H2 može opciono da se karakteriše time što ima triklinički kristalni sistem i P1 prostornu grupu. Forma H2 se može okarakterisati jednim ili više od sledećih>parametara njegove jedinične ćelije, kao što je navedeno u Tabeli 7 ispod.

Toplotna svojstva i svojstva adsorpcije vode Forme H2 su ilustrovana Slikama 28, 29 i 30. Podaci o non-sink rastvaranju u FaSSIF (ph 6.5) za Formu H2 Jedinjenja 1 su utvrđeni kao sledeći:

Peti kristalni oblik Jedinjenja 1 se u nastavku naziva "Forma NF19" i polimorf je okarakterisan dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji je suštinski u skladu sa onim prikazanim na Slici<19. Opisani su pogodni metodi za njegovu pripremu u PRIMERU 7.>

<Forma NF19 se može okarakterisati sa jednim ili više, poželjno šest, i do suštinski svih pikova u>njenom dijagramom rendgenske difraktometrije praha koji se bira između onih na oko:

<Čvrsti oblici A1, A3, H1 i H2 mogu takođe, ili alternativno, biti okarakterisani time što imaju određeni>kristalni sistem, prostornu grupu i/ili parametar jedinične ćelije koji se bira između a, b, c, α, β, γ i V ,kao što je navedeno u Tabeli 7:

Tabela 7

<Ovaj pronalazak se takođe odnosi na sledeće oblike solvata, koji se mogu lako napraviti kristalizacijom iz odgovarajućih rastvarača, ali je utvrđeno da su znatno manje korisni u pogledu>važnih svojstava u poređenju sa gornjim oblicima: metanolat Jedinjenja 1 (čvrsti oblik koji se naziva S1), mešani hidrat/metanolat Jedinjenja 1 (čvrsti oblik koji se naziva S2), THF solvat Jedinjenja 1(čvrsti oblik koji se naziva S3), 1,4-dioksan solvatni oblici Jedinjenja 1 u brojnim čvrstim oblicima (čvrsti oblici koji se pominju kao NF11 [iz eksperimenta konverzije suspenzije anhidrovanog oblikana ~26 mg / 200 μL u 1,4-dioksanu na RT sobnoj temperaturi], NF29 [iz eksperimenta kristalizacije<hlađenja 50-5 °C u 1,4-dioksanu], NF36 [iz eksperimenta konverzije suspenzije u anhidrovanom>obliku na ~52 mg / 150 μL u 1,4-dioksanu na RT sobnoj temperaturi]), solvat hloroforma Jedinjenja<1 (čvrsti oblik koji se naziva NF15), oblici solvata sirćetne kiseline Jedinjenja 1 u različitim čvrstim oblicima (čvrsti oblici koji se nazivaju NF16 [iz eksperimenta kristalizacije isparavanjem na RT sobnoj temperaturi u sirćetnoj kiselini], NF18 [iz eksperimenta kristalizacije isparavanjem na 50 °C>u sirćetnoj kiselini]), dihlorometan (DCM) solvat Jedinjenja 1 (čvrsti oblik koji se naziva NF32), NMP(N-Metil-2-pirolidon) solvat Jedinjenja 1 (čvrsti oblik koji se naziva NF33), solvat acetonitrila Jedinjenja 1 (čvrsti oblik koji se naziva NF35), dimetilacetamid (DMAA) solvat Jedinjenja 1 (čvrsti oblik koji se naziva NF37). XRPD čvrstih oblika ovih solvata prikazani su na Slikama 40 do 52, aodgovarajući pikovi su navedeni u sledećim tabelama:

Pik #<2 θ>

<U skladu sa drugom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu Jedinjenja 1 u Formi A2, koje je poželjan čvrsti oblik. U skladu sa još jednom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu takvih farmaceutskih kompozicija>opisanih ovde, na primer, farmaceutske kompozicije koja uključuje efektivnu količinu Jedinjenja 1 uFormi A2. Prema drugoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu Jedinjenja 1 u Formi A2 u proizvodnji leka za lečenje kancera. U daljem izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje Formu A2 za upotrebu kao lek, poželjno za lečenje kancera. U skladu sa onim što je gore navedeno, primeri<izvođenja, opsega, čistoće itd. otkriveni za Jedinjenje 1 su podjednako važeći za Formu A2.>

<Prema još jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu Jedinjenja 1 u bilo kom od čvrstih oblika anhidrovanog Jedinjenja 1 ili hidrata Jedinjenja 1 kao što je gore opisano. U skladu sa drugom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje metod za pripremu takvih farmaceutskih kompozicija opisanih ovde, na primer, farmaceutske kompozicije koja uključuje efektivnu količinu Jedinjenja 1 u jednom od tih čvrstih oblika. Prema drugoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu Jedinjenja 1 u čvrstom obliku kako je ovde>opisano u proizvodnji leka za lečenje kancera. U sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje čvrsti oblik Jedinjenja 1 kako je ovde opisano za upotrebu kao lek, poželjno za lečenje kancera. U skladu sa onim što je gore navedeno, primeri izvođenja, opsega, čistoće itd. otkrivenih za Jedinjenje 1 su podjednako validni za čvrste oblike.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na čvrsti oblik anhidrovanog Jedinjenja 1 ili hidrata Jedinjenja 1, kao što je ovde opisano, koji se dobija ili može dobiti prema postupku opisanom u PRIMERU 7.

<Deuterisane realizacije>

<Deuterisani derivati Jedinjenja Y su sledeći:>

<• 8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)-1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-(trideuteriometil)imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (Jedinjenje 3) i>

• 1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-metil-8-[3-metil-(trideuteriometil)pirazol-4-il]imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (Jedinjenje 4).

• 8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)-1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-metilimidazo[4,5-c]hinolin-2-one (Jedinjenje 5),

<kao i njihove soli.>

<Jedinjenja 3, 4 i 5 su predstavljena sledećim formulama i data su kao referentni primeri, respektivno>za dobijanje odgovarajućih atropizomera:

U određenim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje atropizomere 3-a, 3-b, 4-a, 4-b,

5-a i 5-b:

ili njihove soli.

<U skladu sa onim što je gore navedeno u vezi sa Jedinjenjima 1 i 2, ovaj pronalazak obezbeđuje>Jedinjenje 4-a, 5-a, 6-a, 4-b, 5-b, 6-b u suštini bez odgovarajućeg drugog atropizomera uključujućibilo koju njegovu so. U daljim realizacijama, ova jedinjenja su takođe obezbeđena suštinski bez<nečistoća. Prema drugoj realizaciji, ova jedinjenja ne sadrže više od oko 5.0 procenata HPLC površine>ukupnih organskih nečistoća u odnosu na ukupnu površinu HPLC hromatograma. Primeri i poželjniopsezi otkriveni gore za Jedinjenje 1 u vezi sa "suštinski bez Jedinjenja 2 ili njegove soli", "bez<nečistoća" i procentom površine ukupnih organskih nečistoća su, po analogiji, podjednako primenljivi ovde u odnosu na odgovarajuće druge atropizomere odgovarajućeg jedinjenja.>

<Prema drugoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži>efektivnu količinu atropizomera Jedinjenja 3, 4 ili 5 ili njihove farmaceutski prihvatljive soli. Uskladu sa još jednom realizacijom, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu takvih farmaceutskih kompozicija opisanih ovde. Prema drugoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu ovde opisane kompozicije u proizvodnji leka za lečenje kancera. Primeri i poželjne realizacije kao što je prethodno otkriveno za Jedinjenje 1 su podjednako primenljive na ova jedinjenja.

<Priprema>

<Jedinjenja 1 i 2 u skladu sa ovim pronalaskom mogu se dobiti počevši od Jedinjenja Y, koje je>jedinjenje prethodno opisano. Kao što je otkriveno u WO 2016/155884, 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(3-fluoro-5-metoksipiridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]hinolin-2-on (Jedinjenje Y) se može pripremiti prema sledećoj sekvenci reakcije:

<Primeri reakcionih uslova za svaki od tih koraka a - e dati su u PRIMERU 1, kao i metode za dobijanje>polaznih jedinjenja. Drugi pogodni uslovi reakcije će biti očigledni stručnjaku.

Jedinjenja 1 i 2 se zatim mogu dobiti odgovarajućim metodama odvajanja od Jedinjenja Y, čiji su primeri izvođenja dati u PRIMERIMA 1, 2 i 3.

Atropizomeri se mogu razdvojiti počevši od Jedinjenja Y korišćenjem hiralne hromatografije, uključujući superkritičnu tečnu hromatografiju (SFC). Primeri odgovarajućih metoda su detaljnoopisani u PRIMERIMA 1 i 3.

<Odgovarajući neželjeni atropizomeri mogu biti podvrgnuti racemizaciji, npr. termička racemizacija,>da bi se dobilo Jedinjenje Y za upotrebu kao novi početni materijal, kao što je šematski ilustrovano unastavku kao jedan primer.

U alternativnoj realizaciji, Jedinjenja 1 i 2 se mogu dobiti počevši od Jedinjenja Y kristalizacijom korišćenjem optički aktivne kiseline, na primer dibenzoilvinske kiseline. Reakcija Jedinjenja Y sa optički aktivnom kiselinom daje par soli atropizomera. Ove soli Jedinjenja 1 i 2 pokazuju različita<fizičko-hemijska svojstva (npr. rastvorljivost, distribucija faza) i mogu se razdvojiti korišćenjem prednosti ovih razlika.>

<Kao što je ilustrovano donjom šemom, u jednoj realizaciji, Jedinjenje Y reaguje sa optički aktivnom kiselinom, dajući smešu dve soli u matičnom rastvoru, pri čemu se so Jedinjenja 2 (L-so B) prvo>taloži i uklanja filtracijom, pri čemu se odgovarajuća so Jedinjenja 1 (L-so A) sakuplja tek nakon daljekoncentracije matičnog rastvora i precipitacije. So Jedinjenja 1 se zatim prvo pretvara u slobodni oblik i izoluje, a zatim reaguje sa odgovarajućim drugim optički aktivnim oblikom kiseline da bi se dobila odgovarajuća so Jedinjenja 1, koja se, u sledećem koraku, pretvara u slobodnu bazu sa visokom optičkom čistoćom. Jedinjenje 2 može u međuvremenu biti podvrgnuto racemizaciji da bi se dobilo Jedinjenje Y kao svež početni materijal.

<Detaljan primer odgovarajuće šeme pripreme je dat u PRIMERU 2 i Slici 6.>

<Deuterisana Jedinjenja 3, 4 i 5 mogu se dobiti kao što je detaljno opisano u PRIMERU 6 i>atropizomeri, soli, solvati i čvrsti oblici pripremljeni u suštini kao oni od Jedinjenja 1 i 2.

Upotreba

<U nastavku, bilo koja opšta referenca na „jedinjenja prema ovom pronalasku“ će se odnositi na sve realizacije jedinjenja ovog pronalaska, uključujući Jedinjenja 1 ili 2, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili čvrst oblik, i može se čitati kao "Jedinjenje 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili čvrsti oblik". Isto tako, svako upućivanje na deuterisana jedinjenja prema ovom pronalasku će uključivati bilo koji atropizomer Jedinjenja 3, 4 ili 5, ili njihovu so ili čvrsti oblik.>

Pronalazak takođe obuhvata upotrebu sadašnjih atropizomera, farmaceutski prihvatljivih čvrstih oblika, njihovih solvata i soli, kao i deuteriranih ATM inhibitora, atropizomera i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli za inhibiciju, regulaciju i/ili modulaciju signalne kaskade ATM kinaze, i na taj način nudi nove alate za istraživanje i/ili dijagnostiku. Pronalazak se tako dalje odnosi na upotrebu jedinjenja prema ovom pronalasku, uključujući njihove deuterisane oblike za inhibiciju ATM kinaze. Izraz "inhibicija" se odnosi na bilo koje smanjenje aktivnosti koje se zasniva na dejstvu<specifičnih jedinjenja prema pronalasku u tome što su potonja sposobna da stupe u interakciju sa>ciljnim molekulom na takav način da se vrši prepoznavanje, vezivanje i blokiranje. Jedinjenja seodlikuju visokim afinitetom prema ATM kinazi. Štaviše, jedinjenja su visoko selektivna i na taj način<omogućavaju suštinski ekskluzivno i direktno prepoznavanje ATM kinaze. Za upotrebu u istraživanju i/ili dijagnostici, deuterisana jedinjenja, tj. Jedinjenja 3, 4 ili 5, ili njihovi atropizomeri ili so ili čvrsti oblik smatraju se korisnim, na primer za upotrebu u ogledima.>

<Pronalazak generalno obuhvata upotrebu jedinjenja prema pronalasku, uključujući deuterisana>jedinjenja, u lečenju bolesti koje su uzrokovane, posredovane i/ili propagirane aktivnošću ATM kinaze.

Ovaj pronalazak se zato široko odnosi na jedinjenja prema pronalasku, uključujući deuterisana jedinjenja, za upotrebu kao lek.

Ovaj pronalazak se zato takođe odnosi na jedinjenja prema pronalasku, uključujući deuterisana jedinjenja, za upotrebu u lečenju bilo koje bolesti koja je uzrokovana, posredovana i/ili propagiranaaktivnošću ATM kinaze. Ovaj pronalazak se shodno tome takođe odnosi na upotrebu jedinjenja,<uključujući deuterisana jedinjenja, prema pronalasku za pripremu leka za lečenje bilo koje bolesti koja je uzrokovana, posredovana i/ili propagirana aktivnošću ATM kinaze. Drugim rečima, ovaj>pronalazak takođe otkriva jedinjenje prema pronalasku, uključujući deuterisano jedinjenje, za upotrebu u lečenju bolesti na koje utiče inhibicija ATM kinaze.

<Pored toga, jedinjenja ili deuterisana jedinjenja prema pronalasku takođe mogu da se koriste kao reagensi za testiranje signalnih putanja zavisnih od kinaze kod životinja i/ili modela ćelijskih kultura ili kod kliničkih bolesti pomenutih u ovoj prijavi. Kao što je ovde diskutovano, ovi signalni putevi su relevantni za različite bolesti.>

<Ovaj pronalazak se takođe odnosi na jedinjenja prema ovom pronalasku, uključujući njihove>farmaceutski prihvatljive soli, solvate, čvrste i deuterisane oblike, za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora; i na njihovu upotrebu u pripremi leka za lečenje kancera i/ili tumora.

U takvom lečenju kancera i/ili tumora, subjektu koji se leči daje se efektivna količina najmanje jednog jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata, deuterisanog ili čvrstog oblika prema pronalasku. Poželjni subjekti u smislu pronalaska su ljudi ili životinje, posebno poželjno ljudi.

<Kancer/tumor se može posebno izabrati iz grupe karcinoma/tumora skvamoznog epitela, bešike, želuca, bubrega, glave, vrata, jednjaka, grlića materice, štitne žlezde, creva, jetre, mozga, prostate, urogenitalnog trakta, limfnog sistema, larinksa, pluća, kože, krvi i imunog sistema, i/ili kancer se može izabrati iz grupe monocitne leukemije, adenokarcinoma pluća, karcinoma malih ćelija pluća, karcinoma ne-malih ćelija pluća, karcinoma pankreasa, kolorektalnog karcinoma, karcinoma želuca, karcinoma dojke, karcinoma jajnika, akutne mijeloične leukemije, hronične mijeloične leukemije, akutne limfne leukemije, hronične limfne leukemije, Hodgkinovog limfoma i ne-Hodgkinovog limfoma. Podrazumeva se da će senzibilizacija ćelija kancera obuhvatiti ćelije istih kancera i tumora pomenutih gore.>

<Ovaj pronalazak se takođe odnosi na lek koji sadrži jedinjenje prema pronalasku i/ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat, deuterisani ili čvrsti oblik.>

Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapeutski efektivnu količinu jedinjenja prema pronalasku i/ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat, deuterisani ili čvrsti oblik, opciono zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

Pod „lekom“ i „farmaceuskom kompozicijom“ podrazumeva se bilo koja kompozicija koja se može primeniti u lečenju pacijenata koji, barem privremeno, pokazuju patogenu modifikaciju ukupnog stanja ili stanja pojedinih delova pacijentovog organizma, poželjno kao posledica kancera i/ili tumora.

Isporuka jedinjenja, odnosno farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku u ćeliju ili organizam može se izvršiti u skladu sa pronalaskom na bilo koji način koji omogućava da se ATM kinaza dovede u kontakt sa jedinjenjima prisutnim u farmaceutskoj kompoziciji, kao što je posledica<čega se indukuje odgovor. Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska se može primeniti oralno,>transdermalno, transmukozno, transuretralno, vaginalno, rektalno, pulmonalno, enteralno i/iliparenteralno. Odabrana vrsta primene zavisi od indikacije, doze koja se primenjuje, individualno<specifičnih parametara, itd. Posebno, različite vrste primene mogu olakšati terapiju specifičnu za>mesto, koja minimizira neželjene efekte i smanjuje dozu aktivnog jedinjenja. Injekcije mogu bitiintradermalne, subkutane, intramuskularne ili intravenozne. Primena se može izvršiti, na primer, uz<pomoć takozvanih pištolja za vakcinaciju ili pomoću špriceva. Takođe je moguće obezbediti supstancu u obliku aerosola, koji udiše organizam, po mogućnosti pacijent.>

<U poželjnim realizacijama, jedinjenja prema ovom pronalasku (u bilo kom od njihovih oblika) se daju>oralno. Oralna primena je povoljna u smislu usaglašenosti pacijenata. Prema tome, farmaceutske kompozicije su poželjno oralne čvrste farmaceutske kompozicije.

Prednost jedinjenja prema ovom pronalasku, posebno Jedinjenja 1 i 2 i njihovih čvrstih oblika, posebno Jedinjenja 1, odnosno njegovog čvrstog oblika, je to što se lako mogu formulisati u oralničvrsti dozni oblik, zbog dobre stabilnosti i visoke bioraspoloživosti.

<Kompozicije>

Kompozicije, odnosno farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku, mogu se pripremiti<korišćenjem konvencionalnih čvrstih ili tečnih ekscipijenata koji odgovaraju željenom tipu primene u odgovarajućoj dozi i na način poznat per se. Prema tome, farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti>poznati stručnjaku u ovoj oblasti mogu u osnovi činiti deo farmaceutske kompozicije prema pronalasku, pri čemu količina ekscipijenta(a) koji se kombinuje sa aktivnim jedinjenjem da bi se<pripremila pojedinačna doza varira u zavisnosti od doze i vrste primene. Takvi farmaceutski>prihvatljivi ekscipijenti uključuju filere, stabilizatore, sredstva za kompleksiranje, antioksidante, rastvarače, veziva, lubrikante, soli, pufere, konzervanse, sredstva za podešavanje i slično. Primeri<pomoćnih supstanci ovog tipa su voda, biljna ulja, benzil alkoholi, alkilen glikol, polietilen glikol, Kolifor, glicerol triacetat, želatin, ugljeni hidrati, kao što su, na primer, laktoza ili skrob, hidroksipropilmetilceluloza (HPMC), magnezijum stearat, talk i Vazelin.>

<Kao što je gore pomenuto, ova farmaceutska kompozicija je poželjno za oralnu primenu.>

<Farmaceutska kompozicija generalno može biti u obliku tableta, film tableta, dražeja, pastila, kapsula, pilula, praška, granula, sirupa, soka, kapi, rastvora, disperzije, suspenzije, supozitorija,>emulzije, implantata, kreme, gela, masti, paste, losiona, seruma, ulja, spreja, aerosola, adheziva, gipsa ili zavoja. Oblici za oralnu primenu su poželjno tablete, film tablete, dražeje, pastile, kapsule, pilule, praškovi, granule, sirupi, sokovi, kapi, rastvori, disperzije ili suspenzije.

Dalje, mogu se uzeti u obzir parenteralne farmaceutske kompozicije, kao što su, na primer, supozitorije, suspenzije, emulzije, implantati ili rastvori, poželjno uljani ili vodeni rastvori. Za topikalnu primenu, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu biti formulisana na konvencionalan<način sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, kao što je, na primer, mikrokristalna celuloza, i opciono dodatnim pomoćnicima, kao što su, na primer, ovlaživači, da se dobiju kompozicije koje se mogu primeniti na kožu, kao što su, na primer, kreme, gelovi, masti, paste, praškovi ili emulzije, ili da daju tečne formulacije koje se mogu primeniti na kožu, kao što su, na primer, rastvori, suspenzije, losioni, serumi, ulja, sprejevi ili aerosoli.>

Farmaceutska kompozicija takođe može biti u obliku rastvora za injekcije. Za pripremu rastvora za injektiranje može se koristiti vodeni medijum, kao što je, na primer, destilovana voda ili rastvori fizioloških soli. Farmaceutska kompozicija se takođe može obezbediti u obliku čvrste kompozicije, na primer u liofilizovanom stanju, a zatim se može pripremiti za primenu injekcijom dodavanjem agensa za rastvaranje, kao što je, na primer, destilovana voda ili pufer. Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa osnovnim principima pripreme liofilizata.

<Količina jedinjenja prema ovom pronalasku u farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent može biti 0.1 do 100 masenih procenata. Ključno je da farmaceutska kompozicija sadrži efektivnu količinu jedinjenja, opciono zajedno sa jednim ili više>farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Jednostavna farmaceutska kompozicija može biti jedinjenje prema ovom pronalasku u čvrstom obliku, kao što je prah, u tvrdoj želatinskoj kapsuli. Izrazi "efektivna količina" ili "efektivna doza" se ovde koriste naizmenično i označavaju količinu jedinjenja prema ovom pronalasku koja ima terapeutski relevantan efekat na bolest ili patološku promenu u<ćeliji, tkivu, organu ili sisaru, poželjno kancer i/ili tumor.>

<"Terapeutski efektivna količina" jedinjenja prema pronalasku odnosi se na količinu efikasnu, u dozama i u potrebnim vremenskim periodima, koja će, kada se daje pacijentu sa ATMi moduliranim ili zavisnim stanjem, poželjno kancerom, imati željeni terapeutski efekat, npr. ublažavanje, poboljšanje, palijaciju ili eliminaciju jedne ili više manifestacija stanja, odnosno kancera kod>pacijenta, ili bilo kog drugog kliničkog rezultata u toku lečenja pacijenta. Terapeutska efektivnost se ne postiže nužno primenom jedne doze i može se javiti tek nakon primene serije doza. Prema tome, terapeutski efektivna količina može biti primenjena u jednoj ili više primena. Takva terapeutski efektivna količina može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, kao i sposobnost jedinjenja prema pronalasku, samog ili u kombinaciji, da izazove željeni<odgovor kod pojedinca. Terapeutski efektivna količina je takođe ona u kojoj su bilo koji toksični ili štetni efekti jedinjenja prema pronalasku nadmašeni terapeutski korisnim efektima.>

<U jednoj realizaciji pronalaska, jedinjenje prema pronalasku (ili so, solvat, deuterisan ili čvrsta>supstanca) se primenjuje u dozi od 5 mg do 1 g po jedinici doze, na primer između 10 i 750 mg po jedinici doze, kao što je između 20 i 500 mg po jedinici doze, kao što je 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 ili 350 mg po jedinici. Procenjeno je da je biološki efikasna doza za Jedinjenje 1 u opsegu od 25 do 350 mg qd.

Zahvaljujući njihovoj iznenađujuće snažnoj i/ili selektivnoj inhibiciji ATM kinaze, koja reguliše<ćelijske procese popravkom dvolančane DNK, jedinjenja pronalaska mogu se davati u povoljno>niskim dozama, dok postižu sličnu ili čak superiornu biološku efikasnost u poređenju sa sa manje<moćnim ili manje selektivnim inhibitorima. Smanjena doza je obično povezana sa smanjenim medicinskim neželjenim efektima. Pored toga, visoko selektivna inhibicija se generalno takođe odražava smanjenjem neželjenih sporednih efekata.>

<"Tretiranje" ili "tretman" stanja ili pacijenta se odnosi na preduzimanje koraka za postizanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili>željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje, poboljšanje jednog ili više simptoma bolesti koja se leči, najpoželjnije kancera; smanjenje obima bolesti; odlaganje ili usporavanje progresije bolesti; poboljšanje, palijaciju ili stabilizaciju stanja bolesti; ili druge korisne rezultate. Treba imati na umu da reference na "tretiranje" ili "tretman" uključuju profilaksu, kao i ublažavanje utvrđenih simptoma stanja. "Tretiranje" ili "tretman" stanja, poremećaja ili uslova zato<uključuje: (1) sprečavanje ili odlaganje pojave kliničkih simptoma stanja, poremećaja ili uslova koji se razvija kod subjekta koji može biti zahvaćen ili predisponiran za to stanje, poremećaj ili uslov, ali još uvek ne doživljava ili ne pokazuje kliničke ili subkliničke simptome stanja, poremećaja ili uslova, (2) inhibira stanje, poremećaj ili uslov, tj. zaustavlja, smanjuje ili odlaže razvoj bolesti ili njenog relapsa (u slučaju lečenja održavanjem) ili najmanje jednog njegovog kliničkog ili subkliničkog simptoma, ili (3) olakšavanje ili ublažavanje bolesti, odnosno izazivanje regresije stanja, poremećaja>ili uslova ili bar jednog od njegovih kliničkih ili subkliničkih simptoma. U određenim realizacijama, "tretiranje" uključuje (1) i (2).

"Tumor" kako se odnosi na subjekt sa dijagnozom ili sumnjom da ima kancer odnosi se na malignu ili potencijalno malignu neoplazmu ili masu tkiva bilo koje veličine, i uključuje primarne tumore i sekundarne neoplazme. Čvrsti tumor je abnormalni rast ili masa tkiva koja obično ne sadrži ciste ili<tečne oblasti. Različiti tipovi čvrstih tumora su imenovani prema vrsti ćelija koje ih formiraju.>

<Primeri čvrstih tumora su sarkomi, karcinomi i limfomi. Leukemije (kanceri krvi) uglavnom ne formiraju čvrste tumore.>

<„Primena“ ili „davanje“ jedinjenja pacijentu (i gramatički ekvivalenti ove fraze) odnose se na direktnu primenu, koja može biti davanje pacijentu od strane medicinskog stručnjaka, ili može biti>samoprimena i/ili indirektna primena, koja može biti čin prepisivanja leka. Na primer, lekar koji daje uputstva pacijentu da samostalno primenjuje lek ili pacijentu daje recept za lek, smatraće se da daje lek pacijentu u kontekstu ovog pronalaska.

Svi gore navedeni i dalji ekscipijenti ili druge komponente leka ili farmaceutske formulacije su poznati stručnjaku u ovoj oblasti i mogu biti podvrgnuti specijalnoj formulaciji za podučavanje prema pronalasku u rutinskim eksperimentima.

<Kombinovana terapija>

<Lekovi i farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje prema pronalasku, i upotreba ovih jedinjenja za lečenje poremećaja posredovanih kinazom su veoma obećavajući pristup za lečenje>kancera, posebno. Jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom mogu se davati kao monoterapija, ali poželjno, kao što je gore navedeno, u kombinaciji sa drugim terapijama, kao što su, na primer, hemoili radioterapija. Kao što je gore navedeno, upućivanje na jedinjenje će uključivati bilo koju njegovu so, solvat, deuterisane ili čvrste oblike.

Ključno učešće ATM-a u procesima popravke DNK dokazuje da nedostatak ATM kinaze omogućava ćelijama sisara da postanu osetljivije na zračenje omogućava terapeutsku upotrebu inhibitora specifičnih za ATM kao deo lečenja kancera, na primer, solidnih tumora, terapijom zračenjem i/ilihemoterapijom, pri čemu je poželjno da je hemoterapija usmerena na izazivanje dvostrukog<oštećenja DNK. Kao što je ranije objašnjeno, ATM je atraktivna intervencija za inhibiciju popravke DSB-ova izazvanih terapijom. Dakle, jedinjenja prema ovom pronalasku, u bilo kom od njihovih oblika, imaju veliku prednost u kombinaciji sa radioterapijom i/ili hemoterapijom koja oštećuje DNK.>

<U skladu sa time, ovaj pronalazak se odnosi na kombinaciju jedinjenja prema pronalasku i>radioterapije (RT). Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje iz ovog pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili čvrsti oblik, za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora u kombinaciji sa radioterapijom. Drugačije izraženo, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja prema ovom pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili čvrstog oblika, za pripremu leka za lečenje kancera i/ili tumora u kombinaciji sa radioterapijom, a time i metoda lečenja kancera kojiuključuje primenu jedinjenja prema ovom pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili<čvrstog oblika u kombinaciji sa radioterapijom. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na jedinjenje prema>ovom pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili čvrsti oblik za upotrebu u senzibilizaciji<ćelija kancera na jonizujuće zračenje, odnosno radioterapiju (RT).>

Pokazalo se da Jedinjenje 1 dovodi do značajnih antitumorskih odgovora zavisnih od doze in vivo ukombinaciji sa klinički relevantnim šemama zračenja (tj. radioterapija). PRIMER 8 i Slika 20 daju detalje o postignutim rezultatima.

<Odgovarajući režim primene može uključivati, da navedemo samo jedan primer, davanje RT doze od 15 Greja (Gy) date u 5 frakcija (3 Gy dato po danu frakcije) tokom nedelja (tj.5 uzastopnih dana, nakon čega slede 2 dana bez) i istih dana oralno davanje jedinjenja prema pronalasku, koje se može>ponoviti najmanje jednom.

Industrijske metode ozračivanja koje se klinički koriste prvenstveno uključuju fotonsko zračenje<(klasično, elektromagnetno rendgensko/gama zračenje), protonsko zračenje, zračenje teškim jonima (jonizovani ugljenik) i zračenje neutronom, bez ograničenja na to. Ove radioterapije i druge pogodne terapije zračenjem u smislu pronalaska su poznate stručnjaku u ovoj oblasti, kao što su, na primer, Herrmann et al. (2006) Klinische Strahlenbiologie [Klinička biologija zračenja], Elsevier Munich, 4.>izdanje, 67-68; Bhide & Nutting (2010) BMC Medicine 8: 25; Choi & Hung (2010) Current Urology Reports 11(3): 172). Kao najčešća primena, fotonsko zračenje je tehnički poboljšano metodom IMRT (intenzitetski modulirana radioterapija) i metodama snimanja (trodimenzionalna konformna radioterapija) u planiranju zračenja i performansama za najpreciznije moguće fokusiranje.

<Prema daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na kombinaciju jedinjenja prema ovom pronalasku i agensa koji oštećuje DNK; dakle na jedinjenje prema ovom pronalasku za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora u kombinaciji sa agensom koji oštećuje DNK, upotrebu jedinjenja prema pronalasku za pripremu leka za lečenje kancera u kombinaciji sa agensom koji oštećuje DNK. Lečenje kancera može uključivati davanje jedinjenja prema ovom pronalasku i agensa koji oštećuje DNK. Kao>što je ovde generalno objašnjeno, jedinjenje će uključivati farmaceutski prihvatljive soli, čvrste oblike i solvate, posebno u vezi sa kompozicijama i tretmanima.

Primena agensa koji oštećuje DNK i jedinjenja prema ovom pronalasku može biti simultana ili uzastopna.

Kako se ovde koristi, agens koji oštećuje DNK je agens koji je sposoban da izazove oštećenje DNK u<ćeliji, posebno poželjno u ćeliji kancera, sa primerima izvođenja navedenih u nastavku.>

<Kao što je ranije objašnjeno, ATM kinaza je ključni regulator popravke dvostrukog lanca DNK (DSB),>koji je indukovan široko korišćenim terapijskim sredstvima protiv kancera, kao što su jonizujuće<zračenje (IR) i agensi koji oštećuju DNK. Nakon DSB događaja, ATM signalizira mnoštvu nizvodnih efektora uključujući p53. Nepopravljeni DSB-ovi dovode do aktivacije odgovora kontrolnih tačaka, zaustavljanja ćelijskog ciklusa i na kraju smrti tumorskih ćelija.>

<U jednoj realizaciji pronalaska, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapeutski efikasno jedinjenje prema pronalasku i agens koji oštećuje DNK.>

<Sredstvo za oštećenje DNK pogodno za upotrebu u kombinaciji (terapiji), uključujući farmaceutsku kompoziciju ili komplet, poželjno je izabrano iz grupe koju čine:>

<• agensi za alkilovanje, kao što su altretamin, bendamustin, busulfan, karmustin, hloroambucil, hlorometin, ciklofosfamid, dakarbazin, ifosfamid, improsulfan tozilat, lomustin, melfalan, mitobronitol, mitolaktol, nimustin, ranimustin, temozolomid, tiotepa, treosulfan, mehloretamin, karbokvon, apazikvon, fotemustin, glufosfamid, palifosfamid, pipobroman, trofosfamid, uramustin:>• jedinjenja platine, kao što su karboplatin, cisplatin, eptaplatin, miriplatin hidrat, oksaliplatin, lobaplatin, nedaplatin, pikoplatin, satraplatin;

• inhibitori topoizomeraze, na primer irinotekan, SN38, topotekan, kamptotecin, rubitekan, belotekan, etopozid, daunorubicin, doksorubicin, aklarubicin, epirubicin, idarubicin, amrubicin, pirarubicin, valrubicin, zorubicin, amsakrin;

• inhibitori poli-(ADP-riboza)-polimeraze (PARP), na primer olaparib, niraparib, veliparib;

• ATR (ataksija telangiektazija i Rad3 povezani) inhibitori, na primer M6620 (VX-970: 3-[3-(4-Metilaminometil-fenil)-izoksazol-5-il]-5-[4-(propan-2-sulfonil)-fenil]-pirazin-2-ilamin), M4344 (VX-803: 2-Amino-6-fluoro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina [5'-fluoro-4-(4-oksetan-3-ilpiperazin-1-karbonil)-3,4,5,6-tetrahidro-2H-[1,4']bipiridinil-3'-il]-amid); AZD-6738 (4-[4-[1-[[S(R)]-S-metilsulfonimidoil]ciklopropil]-6-[(3R)-3-metil-4-morfolinil]-2-pirimidinil]-1H-pirolo[2,3-b]piridin) i 2-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-4-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-8-(1H-pirazol-5-il)-1,7-naftiridin;

<• Sredstva za modifikaciju DNK, kao što su amrubicin, bizantren, decitabin, mitoksantron, prokarbazin, trabektedin, klofarabin, amsakrin, brostalicin, piksantron, laromustin;>

<• antibiotici protiv raka, kao što su bleomicin, daktinomicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, levamisol, miltefozin, mitomicin C, romidepsin, streptozocin, valrubicin, zinostatin, zorubicin, daunurobicin, plikamicin, aklarubicin, peplomicin, pirarubicin;>

<• alfa emiteri, kao što su alfaradin (223Ra dihlorid, Xofgio), 211At, 213Bi, 225Ac, 227Th;>

<Posebna prednost se daje etopozidu, irinotekanu, razoksanu, sobuzoksanu, topotekanu, kamptotecinu, doksorubicinu, amsakrinu, PARP inhibitorima i ATR inhibitorima.>

Efikasnost Jedinjenja 1 u kombinaciji sa primerom PARP inhibitora olapariba je demonstrirana u HBCx-10 modelu ksenografta trostruko negativnog karcinoma dojke izvedenom od pacijenata, razvijenom na imunodeficijentnim ženkama miševa, čiji su rezultati prikazani na Slici 21. Više detalja o ovom eksperimentu opisani su u PRIMERU 9.

Pronalazak se takođe može primeniti kao komplet, koji sadrži jedinjenje prema pronalasku. Komplet se sastoji od odvojenih pakovanja (a) efektivne količine jedinjenja prema pronalasku i/ili njegove fiziološki soli, sovata ili čvrstog oblika i (b) efektivne količine daljeg aktivnog jedinjenja. Dalje aktivno jedinjenje je poželjno agens koji oštećuje DNK.

Komplet može da sadrži odgovarajuće kontejnere, kao što su, na primer, kutije ili kartoni,<pojedinačne boce, kese ili ampule. Komplet može da sadrži, na primer, odvojene ampule ili bočice, od kojih svaka sadrži efektivnu količinu jedinjenja prema pronalasku i/ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili čvrsti oblik, ili efektivnu količinu daljeg aktivnog jedinjenja, kao što je agens koji oštećuje DNK u rastvorenom ili liofilizovanom obliku. Komplet pronalaska takođe može da sadrži članak koji sadrži pisana uputstva ili upućuje korisnika na pisana uputstva, koja objašnjavaju rukovanje jedinjenjima pronalaska.>

<Ukratko, treba napomenuti da se jedinjenja prema pronalasku mogu koristiti pojedinačno i/ili u kombinaciji sa drugim merama lečenja, kao što su, na primer, hirurške intervencije, imunoterapija,>radioterapija i/ili hemoterapija. Poslednje se odnose na ciljanu terapiju sa bilo kojim željenimaktivnim jedinjenjem (hemijskim ili biološkim, uključujući nME-ove: nove molekularne entitete, NCE-ove: nove hemijske entitete i NBE: nove biološke entitete) kao monoterapiju i/ili kombinovanu terapiju na cilj/izvan cilja.

Podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na specifična jedinjenja, farmaceutske kompozicije, upotrebe i metode kao što je ovde opisano, pošto takve stvari mogu da variraju. Štaviše, podrazumeva se da terminologija koja se ovde koristi služi isključivo u svrhu opisa određenih realizacija i nije namenjena da ograniči obim zaštite pronalaska. Kako se ovde koristi u specifikaciji,<uključujući priložene zahteve, oblike reči u jednini, kao što su, na primer, "jedan" ili "taj", uključuju>ekvivalent u množini, sve dok kontekst posebno ne ukazuje drugačije. Na primer, referenca na"jedinjenje" uključuje jedno jedinjenje ili više jedinjenja, koja zauzvrat mogu biti identična ilirazličita, ili referenca na "metod" uključuje ekvivalentne korake i metode koje su poznate osobi kojaje verzirana u ovoj oblasti. Pozivanje na predmet kao što je "sadrži" određene karakteristiketumačiće se kao da će predmetni pojam uključivati te karakteristike, ali da ne isključuje prisustvodrugih karakteristika, sve dok one ne učine predmetni pojam nefunkcionalnim.

<Eksperimentalno>

Jedinjenja prema pronalasku pokazuju povoljna svojstva, što je pokazano raznim parametrima ieksperimentalnim rezultatima. Eksperimentalne metode koje se koriste za analizu i karakterizaciju jedinjenja prema pronalasku, u svim njihovim oblicima, date su u nastavku.

<Ogledi>

Merenje aktivnosti kinaze je tehnika koja je dobro poznata stručnjaku. Generički test sistemi za<određivanje aktivnosti kinaze korišćenjem supstrata, na primer histona (Alessi et al. (1996) FEBS L i (Campos-González &>G<e>

l<tt. 399(3): 333) ili osnovnog mijelinskog proteina, opisani su u literatur>

enney (1992) JBC 267: 14535). Dostupni su različiti sistemi ispitivanja za identifikaciju inhibitora kinaze. U testu scintilacione blizine (Sorg et al. (2002) J Biomolecular Screening 7: 11) i testu fleš<ploča, radioaktivna fosforilacija proteina ili peptida kao supstrata se meri korišćenjem ATP. U prisustvu inhibitornog jedinjenja, uoćava se smanjen radioaktivni signal ili ga uopšte nema. Štaviše, tehnologije homogenog vremenski razrešenog fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (HTR-FRET) i fluorescentne polarizacije (FP) su korisne kao metode analize (Sills et al. (2002) J>Biomolecular Screening 191). Druge neradioaktivne ELISA metode koriste specifična fosfo-antitela(fosfo-AB-ove). Fosfo-AB vezuje samo fosforilovani supstrat. Ovo vezivanje se može detektovati hemiluminiscencijom korišćenjem drugog anti-ovčijeg antitela konjugovanog sa peroksidazom.

Za potrebe ovog pronalaska, relevantna ciljana svojstva jedinjenja su procenjena korišćenjemsledećih testova:

<Test ATM kinaze - određivanje inhibicije ATM (IC50 ATM):>

<Vrednost IC50 je određena uz pomoć biohemijskog testa ATM kinaze. Test se sastoji od dva koraka: enzimske reakcije i koraka detekcije. Prvo, protein ATM (ataksija telangiektazija mutirana) i>ispitivana supstanca se inkubiraju u različitim koncentracijama uz dodatak supstratnog proteina p53 i ATP. ATM posreduje u fosforilaciji p53 na nekoliko pozicija, uključujući aminokiselinu S15.Količina fosforilisanog p53 se određuje uz pomoć specifičnih antitela i TR-FRET tehnike. EnzimskiATM test se izvodi kao TR-FRET (HTRF™, Cisbio Bioassays) test sa 384 posudica. U prvom koraku,prečišćeni humani rekombinantni ATM (humani ATM, puna dužina, GenBank ID nM_000051, izraženu ćelijskoj liniji sisara) je inkubiran u puferu za ispitivanje 15 minuta sa ATM inhibitorom u<različitim koncentracijama i bez test supstance kao negativne ili neutralne kontrole. Pufer za>ispitivanje sadrži 25 mM HEPES pH 8.0, 10 mM mg(CH3COO)2, 1 mM MnCl2, 0,1% BSA i 0,01% Brij<®>35, 5 mM ditiotreitola (DTT). Rastvori test supstance su raspoređeni u mikrotitarske ploče<korišćenjem ECHO 555 (Labcyte). U drugom koraku, dodaju se prečišćeni humani rekombinantni cmyc-obeležen p53 (humani p53, puna dužina, GenBank ID BC003596, izražen u ćelijama insekata Sf21) i ATP, a reakciona smeša je inkubirana na 22°C tokom 30-35 minuta. Farmakološki relevantna zapremina ta je 5 μl. Konačne koncentracije u testu tokom inkubacije reakcione smeše su 0.3 – 0.4>nM ATM,<tes>

50 - 75 nM p53 i 10 μM ATP. Enzimska reakcija se zaustavlja dodavanjem EDTA.

Formiranje fosforilisanog p53 kao rezultat ATM-posredovane reakcije u prisustvu ATP detektuje se preko specifičnih antitela [obeleženih fluoroforenom europijumom (Eu) kao donorom i d2 kao akceptorom (Cisbio Bioassays)] koji omogućavaju FRET.2 μl stop rastvora koji sadrži antitela (12,5<mM HEPES pH 8.0, 125 mM EDTA, 30 mM natrijum hlorida, 300 mM kalijum fluorida, 0.1006% Tween-20, 0.005% Brij® 35, 0,21 nM anti-fosfo-p53(ser15)-Eu antitela i 15 nM anti-cmyc-d2 antitela) se dodaju u reakcionu smešu. Posle inkubacije, obično tokom 2 sata (između 1.5 i 15h), radi razvoja signala, ploče se analiziraju u čitaču ploča (EnVision, PerkinElmer) korišćenjem TRF moda (i uz lasersku ekscitaciju). Posle ekscitacije donora europijuma na talasnoj dužini od 340 nM, meri se>emitovana fluorescentna svetlost i akceptora d2 na 665 nM i takođe donora Eu na 615 nM. Količina fosforilisanog p53 je direktno proporcionalna količniku količine emitovane svetlosti, odnosno relativnih jedinica fluorescencije (RFU) na 665 nM i 615 nM. Podaci merenja su obrađeni pomoću softvera Genedata Screener. Određivanje IC50 se vrši, posebno, prilagođavanjem krive doza/dejstvo na tačke podataka pomoću nelinearne regresione analize.

<IC50 = polovina maksimalne inhibitorne koncentracije>

<ATP = adenozin trifosfat>

<TR-FRET = vremenski razrešen prenos energije fluorescencije rezonance>

<HTRF® = homogena vremenski razrešena fluorescencija>

<HEPES = 2-(4-(2-hidroksietil)-1-piperazinil)etansulfonska kiselina>Mg(CH3COO)2 = magnezijum acetat

MnCl2 = mangan(II) hlorid

BSA = goveđi serum albumin

EDTA = etilendiamin tetraacetat

TRF = vremenski razrešena fluorescencija

<Skraćenice se primenjuju svuda, osim ako nije naznačeno suprotno.>

<Test za određivanje vrednosti IC50 pri koncentraciji ATP od 1000 μM razlikuje se od prethodnog>testa samo u pomenutoj koncentraciji ATP.

<Ćelijski pCHK2 test:>

Za identifikaciju supstanci koje inhibiraju fosforilaciju protein kinaze CHK2 (kinaza kontrolne tačke2) na aminokiselini treonin 68, u ćelijama HCT116 korišćen je test analize "visokog sadržaja" zasnovan na imunofluorescenciji.

In vitro test imunofluorescencije zasnovan na ćelijama za identifikaciju inhibitora fosforilacije CHK2izazvane bleomicinom (fosfo-Thr68) u ćelijskoj liniji humanog karcinoma debelog creva HCT116:<Ćelije HCT116 su zasejane u definisanoj ćelijskoj gustini u pločama 384-posudica medijumu za>kulturu (DMEM visoka glukoza, 2 mM GlutaMax, 1 mM Na piruvat, 10% FCS) i inkubirane preko noći na 37°C i 10% CO2. Sledećeg dana, ispitivane supstance se dodaju u definisanom opsegukoncentracija (1 nM do 30 μM) u kombinaciji sa 10 μM bleomicina, pri čemu se koncentracija rastvarača DMSO održava konstantnom na 0.5%. Posle četiri sata inkubacije na 37 °C i 10% CO2,<ćelije su fiksirane (5 min, 4% formaldehida u PBS), permeabilizovane (10 min, 0.2% Triton X-100 u PBS) i, nakon blokiranja nespecifičnih mesta vezivanja (10% kozjeg seruma, 1% BSA u PBS), inkubirana preko noći na 4 °C sa specifičnim anti pCHK2 antitelom (ćelijska signalizacija #2661). pCHK2 (Thr68) je određen korišćenjem Alexa488-obeleženog sekundarnog anti-zečjeg IgG antitela. Paralelno bojenje DNK propidijum jodidom omogućava određivanje broja ćelija. Signal pCHK2 se detektuje pomoću uređaja za snimanje visokog sadržaja (Molecular Devices IMX Ultra) i automatske>analize slike pomoću softvera MetaXpress koji pripada instrumentu. Određuje se broj ćelijskih jezgara koje imaju pCHK2 signal iznad definisane pozadine. DMEM: Dulbekov Modifikovani Eagle-ov Medijum; FCS: Fetalni teleći serum, PBS: fiziološki rastvor puferovan fosfatom (skraćenice se primenjuju u celom delu, osim ako nije drugačije naznačeno). Dalje, efekat, posebno inhibicija, drugih kinaza, a time i selektivnost jedinjenja prema pronalasku može se odrediti uz pomoć sledećih ogleda:

<Test ATR/ATRIP kinaze>

<Vrednost IC50 je određena ATR/ATRIP enzimskim testom. Test se sastoji od dva koraka: enzimske reakcije i koraka detekcije. Prvo, mešavina ATR/ATRIP proteina (Ataksija Teleangiektazija i Rad3->povezani protein / protein u interakciji sa ATR), jedinjenje u pitanju u različitim koncentracijama, p53 kao supstratnog proteina i adenozin trifosfat (ATP) se inkubiraju u puferu za ispitivanje. ATR fosforilira p53 na Ser15 i drugim ostacima. Količina fosforilisanog p53 se zatim detektuje<korišćenjem specifičnih antitela i TR-FRET ogledne tehnologije.>

<Detaljno: ATR/ATRIP enzimski test se izvodi kao test na bazi TR-FRET- (HTRF™, Cisbio Bioassays) sa 384 posudica. U prvom koraku, prečišćeni humani rekombinantni ATR/ATRIP (humani ATR, puna dužina, GenBank ID: NM_001184.3, i humani ATRIP, puna dužina, GenBank ID AF451323.1, koeksprimiran u ćelijskoj liniji sisara) se inkubira u puferu za ispitivanje tokom 15 minuta na 22°C sa test j>

p<e>

i<d>

ti<i>

v<n>

a<je>

n<n>

je<je>

s<m>

ad<u>

rž<r>

i<a>

2<zl>

5<ič>

m<iti>

M<m>

H<koncentracijama ili bez test jedinjenja (kao negativna kontrola). Pufer>za is EPES pH 8.0, 10 mM Mg(CH3COO)2, 1 mM MnCl2, 0.1% BSA, 0.01% Brij® 35 i 5 mM ditiotreitola (DTT). Echo 555 (Labcyte) se koristi za doziranje rastvora jedinjenja. Zatim, u drugom koraku, dodaju se prečišćeni humani rekombinantni cmyc-označen p53 (humani p53, puna dužina, GenBank ID: BC003596, izražen u ćelijama insekata Sf21) i ATP i reakciona smeša se inkubira 25 - 35 minuta, tipično 25 minuta, na 22°C. Farmakološki relevantna zapremina testa je 5<μl. Konačne koncentracije u testu tokom inkubacije reakcione smeše su 0.3 – 0.5 nM, tipično 0.3 nM, ATR/ATRIP, 50 nM p53 i 0.5 μM ATP. Enzimska reakcija se zaustavlja dodavanjem EDTA.>

<Generisanje fosforilisanog p53 kao rezultat reakcije posredovane sa ATR u prisustvu ATP detektuje se korišćenjem specifičnih antitela [obeleženih fluoroforima europijuma (Eu) kao donor i d2 kao akceptor (Cisbio Bioassays)] omogućavajući FRET. U tu svrhu, 2 μl stop rastvora koji sadrži antitelo>(12.5 mM HEPES pH 8.0, 125 mM EDTA, 30 mM natrijum hlorida, 300 mM kalijum fluorida, 0.006 %Tween-20, 0.005 % Brij® 35, 0.1 nM anti-fosfo-p53(Ser15)-Eu antitelo, 15 nM anti-cmyc-d2 antitelo) se dodaju u reakcionu smešu. Nakon razvoja signala tokom 2h, ploče se analiziraju u EnVision (PerkinElmer) čitaču mikroploča korišćenjem TRF režima sa laserskom ekscitacijom. Pri ekscitaciji donora europijuma na 340 nm merena je emitovana fluorescentna svetlost akceptora d2 na 665 nm kao i od donora Eu na 615 nm. Količina fosforilisanog p53 je direktno proporcionalna odnosu<količina emitovane svetlosti, odnosno odnosu relativnih jedinica fluorescencije (rfu) na 665 nm i 615>nm. Podaci se obrađuju korišćenjem softvera Genedata Screener. Posebno, vrednosti IC50 seodređuju na uobičajen način uklapanjem krive doza-odgovor na tačke podataka korišćenjemnelinearne regresione analize.

Za skraćenice, pogledati gornju listu.

<pCHK1 ćelijski test>

<Chk1 kinaza deluje nizvodno od ATR i ima ključnu ulogu u kontroli kontrolne tačke oštećenja DNK. Aktivacija Chk1 uključuje fosforilaciju Ser317 i Ser345 (smatra se kao preferencijalni cilj za fosforilaciju/aktivaciju pomoću ATR) i javlja se kao odgovor na blokiranu replikaciju DNK i određene oblike genotoksičnog stresa. Fosforilacija na Ser 345 služi za lokalizaciju Chk1 na nukleus nakon aktivacije kontrolne tačke.>

<Ovaj test meri smanjenje fosforilacije Chk1 (Ser 345) u ćelijama adenokarcinoma debelog creva HT29 nakon tretmana jedinjenjem i hidroksiureom (što promoviše zastoj viljuške zbog iscrpljivanja dNTP) i korišćenja imunocitohemijske procedure i snimanja visokog sadržaja.>

<Za test HT29 ćelije su postavljene u medijum kulture (DMEM visoka Glukoza (bez fenol crvenog),>2mM Glutamax, 1mM Piruvat, 10% FCS u Greiner ploče sa 384 posudica, crne, μclear # 781090 (2500 ćelija/posudica/30μl) i inkubirane tokom najmanje 20 sati na 37°C, 10% CO2 i 90% rH.

Razblažena test jedinjenja (1nM - 30μM finalno) i hidroksiurea (3mM finalno) se dodaju istovremeno i ćelije se inkubiraju tokom 4h na 37°C. Nakon fiksacije/permeabilizacije sa 100% MeOH (-20°C hladno) i permeabilizacije sa 0.2% Triton X-100, kompletna imunocitohemijska procedura se izvodi korišćenjem specifičnog anti-pChk1 antitela (Cell Signaling, #2348BF) i fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela (Alexa Fluor® 488 kozji anti-zečji F(ab')2 fragment, Invitrogen A11070) i paralelno nuklearno bojenje za brojanje ćelija.

Nuklearno lokalizovani pChk1 signal se detektuje na ImageXpress Ultra konfokalnom čitaču visokog sadržaja i prijavljuje se kao % pozitivnih ćelija (nukleusa).

<DNK-PK test>

<Test kinaze je izveden kao HTRF® test sa 384 posudice. U prvom koraku DNK-PK proteinski kompleks je inkubiran sa ili bez test jedinjenja tokom 15 minuta na 22°C. Nakon dodavanja STK-supstrata 1-biotina (Cisbio), Mg-ATP, DNK i staurosporina, reakciona smeša je inkubirana 60-80 minuta (u zavisnosti od aktivnosti DNK-PK proteinskog kompleksa) na 22°C. Za doziranje rastvora jedinjenja korišćen je Echo 555 (Labcyte). Pufer za analizu se sastojao od 25mM HEPES pH 7.4, 11mM MgCl2, 80mM KCI, 0.45mM EDTA i 0.5mM EGTA, i sadržao je 1mM ditiotreitola (DTT), 0.17%>BSA, i 0.01% Tween<®>20. Farmakološki relevantna zapremina bila je 5μl. Konačne koncentracije utestu tokom inkubacije reakcione smeše bile su 50-100ng/posudica DNK-PK proteinski kompleks (u zavisnosti od aktivnosti DNK-PK proteinskog kompleksa), 1μM STK-supstrat 1-biotin, 10μM Mg-ATP, 80ng/posudica DNK iz timusa teleta i 1μM staurosporina. Enzimska reakcija je zaustavljena dodavanjem EDTA. Generisanje fosforilisanog STK-supstrata 1-biotina kao rezultat reakcije posredovane DNK-PK detektovano je preko specifičnog anti-fosfo STK-antitela (Cisbio) označenog europijumom (Eu) kao donora i streptavidina označenog sa XL665 (Cisbio) kao akceptora koji<omogućava FRET. Za ovu svrhu, 4μl stop rastvora koji sadrži antitela i streptavidin (12.5 mM HEPES pH 8.0, 125 mM EDTA, 30 mM natrijum hlorida, 300 mM kalijum fluorida, 0.006 % Tween-20, 0,005>% Brij® 35, 0.179 nM anti-fosfo-STK antitela, 160 nM Streptavidin-XL665) su dodati u reakcionu smešu. Nakon razvoja signala tokom 1h, ploče su analizirane na Rubystar ili Pherastar čitaču<mikroploča (BMG Labtech). Količina fosforilisanog supstrata bila je direktno proporcionalna odnosu>jedinica fluorescencije (talasna dužina ekscitacije 337 nm) na talasnim dužinama emisije 665 nm(talasna dužina osetljiva na fosfopeptide/emisija od XL665) prema jedinicama na 620 (referentna<talasna dužina Europijum). IC50-vrednosti su izračunate korišćenjem softvera Genedata Screener®. (Molecular Cancer Therapeutics 2003, 1257-1264; DNA-dependent protein kinase inhibitors as drug candidates for the treatment of cancer; A. Kashishian, H. Douangpanya, D. Clark, S. T. Schlachter, C. Todd Eary, J. G. Schiro, H. Huang, L. E. Burgess, E. A. Kesicki i J. Halbrook.)>

MgATP = magnezijum 5’-O-[hidroksi({[(hidroksifosfinato)oksi]

fosfinato}oksi)fosforil]adenozin

Tween 20 = polisorbat 20

EGTA = etilen glikol bis(aminoetil etar) N,N,N’,N’-tetrasirćetna kiselina

BSA = Albumin Goveđeg Seruma

EDTA = Etilendiamin Tetraacetat

<pDNA-PK ćelijski test>

<HCT116 ćelije su kultivisane u MEM alfa medijumu sa 10% fetalnog telećeg seruma i 2 mM glutamina na 37 °C i 10% CO2. Ćelije su odvojene od dna posuda za kulturu korišćenjem tripsina / EDTA, centrifugirane u epruvetama za centrifugiranje, stavljene u svež medijum i određena je gustina ćelija. 100,000 ćelija je zasejano u 1 ml medijuma za kulturu po posudici ploče za ćelijsku>kulturu sa 24 posudice i kultivisano preko noći. Sledećeg dana, 10 μM) bleomicina (DNK interkalator i induktor razbijanja dvostrukih lanaca DNK) i ispitivane supstance u svežem medijumu kulture su dodati ćelijama i kultivisani još šest sati. Zatim je izvršena ćelijska liza i ćelijski lizati su uočeni na ELISA ploči sa 96 posudica (Sigma-Aldrich WH0005591M2: ukupni DNK-PK, Abcam ab18192 ili Epitomics EM09912: fosfo-serin 2056 DNK-PK), koji je bio blokiran i prekriven sa DNK-PK<specifičnim antitelom, i inkubiran na 4 °C preko noći. Nakon toga, ELISA ploče sa 96 posudica su tretirane antitelom za detekciju (Abcam ab79444: ukupna DNK-PK) i konjugatom streptavidin-HRP. Razvoj enzimske reakcije je sproveden korišćenjem hemiluminiscentnog reagensa, hemiluminiscencija je merena korišćenjem Mithras LB940. Signali sa fosfo-DNK-PK specifičnim>antitelom su normalizovani na signal sa antitelom nad celim proteinom DNK-PKc. IC50 vrednosti ili procenti su određeni referenciranjem nivoa signala kontrolne grupe vehikuluma tretirane bleomicinom (100% kontrole). DMSO kontrola je korišćena kao blanko.

MEM: Minimalni Esencijalni Medijum; DMSO: dimetilsulfoksid

PDE2A1 Test

<Korišćen je komercijalno dostupan test (Cerep, kataloška ref. 4071, SOP br.1C1054), koji je dizajniran da evaluira efekte jedinjenja na aktivnost humane fosfodiesteraze-2A1 kvantifikovane merenjem formiranja 5'AMP iz cAMP korišćenjem humanog rekombinantnog enzima eksprimiranog u Sf9 ćelijama.>

Test jedinjenje, referentno jedinjenje ili voda (kontrola) se dodaju u pufer koji sadrži 40 mM Tris/HCl (pH 7.4), 8 mM MgCl2 i 1.7 mM EGTA/NaOH, 1.8 μM cAMP i 1 μCi [3H]cAMP.

Nakon toga, reakcija je pokrenuta dodavanjem enzima (oko 2.5U) i smeša je inkubirana tokom 20 minuta na 22°C.

<Za bazalna kontrolna merenja, enzim je izostavljen iz reakcione smeše.>

<Nakon inkubacije dodaju se SPA kapljice.>

<Posle 30 minuta na 22°C uz mućkanje, količina [3H]5'AMP je kvantifikovana scintilacionim brojačem (Topcount, Packard).>

Rezultati su izraženi kao procenat inhibicije aktivnosti kontrolnog enzima.

Standardno inhibitorno referentno jedinjenje je EHNA (eritro-9-(2-hidroksi-3-nonil)adenin), koje se u svakom eksperimentu testira na nekoliko koncentracija da bi se dobila kriva inhibicije iz koje se<izračunava njegova IC50 vrednost.>

<Bibliografske reference: Maurice D.H., Ke H., Ahmad F., Vang Y., Chung J. i Manganiello V. C. (2014),>Advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases, Nat. Rev. Drug Discov., Vol. 13 Sveska 4: str. 290.

PDE4D2 Test

<Korišćen je komercijalno dostupan test Cerep (kataloška ref. 4077; SOP br. 1C1045). Test je dizajniran da proceni efekte testiranih jedinjenja na aktivnost humane fosfodiesteraze-4D2 kvantifikovane merenjem formiranja 5'AMP iz cAMP koristeći humani rekombinantni enzim eksprimiran u Sf9 ćelijama.>

<Test jedinjenje, referentno jedinjenje ili voda (kontrola) se dodaju u pufer koji sadrži 40 mM Tris/HCl (pH 7.4) i 8 mM MgCl2, 450 nM cAMP i 0.0125 μCi [3H]cAMP.>

<Nakon toga, reakcija je pokrenuta dodavanjem enzima (oko 1.5 U) i smeša je inkubirana tokom 20 min na 22°C.>

Za bazalna kontrolna merenja, enzim je izostavljen iz reakcione smeše.

Posle inkubacije dodaju se SPA (test scintilacione blizine) kapljice.

Posle 30 minuta na 22°C uz mućkanje, količina [3H]5'AMP je kvantifikovana scintilacionim brojačem (Topcount, Packard).

Rezultati su izraženi kao procenat inhibicije aktivnosti kontrolnog enzima.

Standardno inhibitorno referentno jedinjenje je Ro 20-1724, koje se u svakom eksperimentu testira na nekoliko koncentracija da bi se dobila kriva inhibicije iz koje se izračunava njegova IC50 vrednost. Bibliografska referenca kao gore.

PDE42A1 Test

<Korišćen je komercijalno dostupan test Cerep (kataloška ref. 4074; SOP br. 1C1056), koji je>dizajniran da proceni efekte jedinjenja na aktivnost humane fosfodiesteraze-4A1A kvantifikovane<merenjem formiranja 5'AMP iz cAMP korišćenjem humanog rekombinantnog enzima eksprimiranog u Sf9 ćelijama.>

<Test jedinjenje, referentno jedinjenje ili voda (kontrola) se dodaju u pufer koji sadrži 40 mM Tris/HCl (pH 7.4) i 8 mM MgCl2, 450 nM cAMP i 0.25 μCi [3H]cAMP.>

<Nakon toga, reakcija je pokrenuta dodavanjem enzima (oko 10U) i smeša je inkubirana tokom 20 min na 22°C.>

<Za bazalna kontrolna merenja, enzim je izostavljen iz reakcione smeše.>

<Nakon inkubacije dodaju se SPA kapljice.>

Posle 30 minuta na 22°C uz mućkanje, količina [3H]5'AMP je kvantifikovana scintilacionim brojačem (Topcount, Packard).

Rezultati su izraženi kao procenat inhibicije aktivnosti kontrolnog enzima.

Standardno inhibitorno referentno jedinjenje je Ro 20-1724, koje se u svakom eksperimentu testira na nekoliko koncentracija da bi se dobila kriva inhibicije iz koje se izračunava njegova IC50 vrednost. Bibliografska referenca kao gore.

Dodatni parametri koji se smatraju važnim određuju se na sledeći način:

<Metoda Testiranja Mikrozomalne Stabilnosti (Intrinzični Klirens)>

<Test mikrozomalne stabilnosti se koristi za merenje klirensa in vitro (Clint). Test uključuje merenje>brzine nestanka jedinjenja zbog njegove unutrašnje sklonosti da se metaboliše („intrinzično“ što<znači da na nestanak ne utiču druga svojstva kao što su permeabilnost, vezivanje itd. koja igraju ulogu pri kvantifikaciji klirensa in vivo). Mikrozomalna stabilnost (intrinzični klirens, Clint) i, prema tome, metabolička stabilnost se generalno daje kao μl/min/mg proteina. Može se vizualizovati kao zapremina rastvora koju je 1 mg mikrozoma u stanju da očisti od jedinjenja za jedan minut.>

<Instrumentacija>

<Za obavljanje mikrozomalnih inkubacija korišćena je Tecan Genesis radna stanica (RSP 150/8). Analiza je sprovedena korišćenjem Waters ACQUITY UPLC sistema spojenog na ABSciex API3000>maseni spektrometar. Analiza podataka je izvršena korišćenjem Assay Explorer (Symyx).

UPLC uslovi

Kolona: Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50mm, 1.7 μm (Waters)

Mobilne faze: A = 0.1 % mravlje kiseline u vodi; B = acetonitril

<Brzina protoka: 0.750 mL/min; Detekcija: ESI, MRM; Injekcija: 10 μL; Temperatura kolone: 50°C Hemikalije>

<• Kalijum fosfatni pufer: 0.05 M kalijum fosfatni pufer pH 7.4 koji sadrži 1 mM MgCl2>

<• NADPH (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat): 22.5 mg NADPH-Na4 u 1.8 ml kalijum fosfatnog>pufera

• Acetonitril: 50 Vol% acetonitrila (1 zapremina acetonitrila, 1 zapremina vode)

• DMSO: 20 Vol% DMSO u vodi

• Osnovni rastvor od 20 mg/ml mikrozoma humane ili mišje jetre (protein)/ml u fosfatnom puferu • Osnovni rastvor 10 mM jedinjenja u 100% DMSO

<Microzomalna Inkubacija>

Razblaživanje test jedinjenja je urađeno u 2 koraka počevši od 10 mM osnovnog rastvora<odgovarajućeg jedinjenja u 100% DMSO. Prvih 4 μl osnovnog rastvora je dodato u 196 μl 20 Vol% DMSO. U drugom koraku, 10 μl prvog razblaženja je dodato u 1590 μl kalijum fosfatnog pufera da bi se postigla konačna koncentracija od 1.25 μM u konačnom razblaženju jedinjenja. Tako je količina organskog rastvarača u ogledu svedena na minimum (<1 %).>

<Rastvor mikrozoma (proteina) humane ili mišje jetre koji se koristi u testu je pripremljen mešanjem 750 μl osnovnog rastvora (20 mg/ml) i 2250 μl kalijum fosfatnog pufera do konačne koncentracije od 5 mg/ml.>

<Inkubacija je izvedena na inkubacionoj ploči sa 96 dubokih posudica. 160 μl po posudici konačnog razblaženja jedinjenja je preneto na inkubacionu ploču. Ispitana su četiri uzorka svakog razblaženja>jedinjenja.20 μl/posudica rastvora mikrozoma jetre je dodato u svaku posudicu i uzorci su zatim preinkubirani 5 minuta na 37°C i agitaciji pri 800 rpm. Dva referentna jedinjenja (verapamil i dekstrometorfan) su korišćena paralelno u svakom eksperimentu i za svaku vrstu (humani ili mišji mikrozomi) da bi se obezbedile performanse sistema i za poređenje.

Na posebnu stop ploču dodato je 160 μl acetonitrila po posudici.

Posle preinkubacije, tj. u vreme t1 = 0 minuta, 18 μl uzoraka inkubiranog rastvora jedinjenja je preneto i dodato po posudici (koja sadrži acetonitril) na stop ploči da bi se sprečila reakcija (0 minuta kontrolni uzorci, 4 uzorka po jedinjenju). Jednako, 18 μl uzoraka inkubiranog referentnog rastvora jedinjenja je prebačeno i dodato po posudici (koja sadrži acetonitril) na stop ploči u vreme<t1 = 0 minuta i ponovo posle 30 minuta (t4), proverene su rastvorljivost i hemijska stabilnost jedinjenja.>

<Za početak reakcije, 26 μl NADPH rastvora (kofaktor) je dodato u sve posudice koje sadrže prethodno inkubirano razblaživanje jedinjenja ili referentni rastvor, sa izuzetkom onih posudica koje sadrže preinkubirano razblaživanje jedinjenja koji su se koristili kao kontrolni uzorci od 30 minuta, gde je umesto toga dodat 26 μl fosfatni pufer. Inkubacija je zatim nastavljena na 37°C i agitaciji na 800 rpm.>

<U konačnim oglednim rastvorima (tj. u svakoj posudici koja sadrži rastvor jedinjenja, mikrozoma (protein) i NADPH, odnosno fosfatnog pufera), konačna koncentracija proteina je bila 0.5 mg/ml i koncentracija jedinjenja 1 mg/ml.>

Nakon t2 = 5 minuta, t3 = 10 minuta i t4 = 20 minuta vremena inkubacije (tj. nakon početka reakcije), 20 μl uzoraka inkubiranog rastvora jedinjenja (4 uzorka po jedinjenju) i referentnog rastvora jedinjenja su prebačeni i dodati po posudici acetonitrila na stop ploči.

Nakon t4= 30 minuta vremena inkubacije, 20 μl uzoraka inkubiranog rastvora jedinjenja (4 uzorka po jedinjenju) i 20 μl uzoraka 30 minutnih kontrolnih uzoraka (koji sadrže pufer umesto NADPH) kao i 20 μl uzoraka inkubiranog referentnog rastvora jedinjenja su preneti i dodati po posudici acetonitrila na stop ploči.

Ugašeni uzorci su centrifugirani na 4000g tokom 1 h na 4 °C. 80 μl supernatanta je prebačeno uploče sa 96 posudica za analizu pomoću LC-MS/MS.

Analiza podataka

<Mikrozomalna/metabolička stabilnost svakog jedinjenja određena je merenjem promene u LCMS/MS oblasti pika tokom vremena. Podaci su postavljeni prema log linearnom modelu u skladu>sa Michaelis/Menten. Clint vrednost se izračunava iz nagiba (k) linearne log transformisane koncentracije po vremenskom dijagramu podeljene sa količinom mikrozoma (0.5 mg/ml): Clint(μl/min/mg protein) = k*1000/koncentracija proteina. Softver Assay Explorer je korišćen zaautomatsko izračunavanje nagiba k opadanja.

<Kv11.1 (hERG) AKTIVNOST IONSKIH KANALA (patch clamp test)>

<Metoda za detekciju i karakterizaciju test supstanci koje ometaju Kv11.1 (hERG) kanal: Kv11.1 (hERG, humani eter a-go-go povezan gen) je kalijumov kanal koji igra centralnu ulogu u repolarizaciji ćelije u ventrikularnim kardiomiocitima.>

Patch-clamp merenje je sprovedeno na sobnoj temperaturi u konfiguraciji cele ćelije na humanim embrionalnim ćelijama bubrega (HEK293) koje su stabilno transfektovane sa hERG genom.

Konfiguracije cele ćelije su izvedene korišćenjem automatizovanog uređaja za spajanje (PatchlinerTM, Nanion Technologies, Munich). Ovo je sistem zasnovan na staklenom čipu sa kojim sumoguća automatska merenja cele ćelije na do 8 ćelija istovremeno. Stakleni čip ima rupu definisane<veličine do koje se ćelija prenosi u Gigaseal primenom smanjenog pritiska i dovodi u konfiguraciju>cele ćelije. Pufer, suspenzija ćelija i test supstance su dodati u mikrokanale čipa pomoću pipeteobložene Teflonom.

<Ćelije su pričvršćene na potencijal zadržavanja od -80 mV. Za merenje inhibicije Kv11.1 kanala>izazvane supstancom, primenjen je sledeći protokol napona u intervalima od 10 sekundi: 51 ms / -80mV, 500 ms / 40 mV, 500 ms / -40 mV, 200 ms / -80 mV. Struja curenja se oduzima metodom P4.<Ćelije su resuspendovane u ekstracelularnom puferu (EC) i postavljene na čip. Nakon što je ćelija sakupljena, zaptivanje je poboljšano dodavanjem pufera za poboljšanje zaptivanja. Čim je postignuta konfiguracija cele ćelije, pufer za poboljšanje zaptivanja je ispran i zamenjen ekstracelularnim puferom. Merenje je počelo u EC tokom 1.5 min. Zatim je primenjen DMSO (kontrola vehikuluma, 0.1% DMSO) i kontrolna struja je zabeležena na 3 min. Ispitivana supstanca je zatim dodata dva puta u istoj koncentraciji, a struja kalijuma je merena 3.5 min u svakom slučaju.>

<Ako je rezultat merenja ispitivane supstance pri početnoj koncentraciji od 10 μM bio manji od (-)50% efekta (granične vrednosti) (na primer (-)60%efekta), ispitivana supstanca je, da bi se odredio odnos doza/delovanje, dodata kumulativno u rastućoj koncentraciji, pri čemu je svaka koncentracija merena 5min.>

Referentna supstanca koja je korišćena je Kv11.1 (hERG) blokator jonskih kanala hinidin. Efekti ispitivanih supstanci i hinidina su standardizovani na odgovarajuću kontrolu vehikuluma. Efekat na aktivnost Kv11.1 (hERG) kanala je procenjen na osnovu struje kalijuma na -40mV. Za proračun, struja je procenjena za odgovarajući konačni trag. Inhibicija Kv11.1 (hERG) kanala izazvana test supstancom je standardizovana za kontrolu nosača (0,1 % od DMSO).

Tokom merenja uzeta je alikvota ispitivane supstance za određivanje koncentracije. Uzorak je odmah izmeren pomoću HPLC, a konačna koncentracija je određena kalibracionom krivom.

Ako je rezultat merenja ispitivane supstance pri početnoj koncentraciji od 10 μM veći ili jednak

(-)50%efekta (granična vrednost) (na primer (-)30%efekta, tj.30% inhibicije pri 10 μM), Ki se<izračunava u skladu sa sledećom formulom: Ki = 1.0E-5 x (100+% efekat)/(-% efekat), [M].>

Rezultat merenja (-)30%efekta pri koncentraciji ispitivane supstance od 10 μM daje Ki od 23 μM.

<Enzimi citohroma P-450 (CYP)>

<U ljudskom organizmu, supstance leka se pretvaraju u jedinjenja rastvorljiva u vodi pomoću enzimskih sistema kako bi se olakšalo njihovo izlučivanje. Ovi enzimski sistemi uključuju mikrozomalne enzime citohroma P-450, skraćeno CYP. Test je dizajniran da identifikuje da li jedinjenje može biti jak inhibitor za definisane CYP izoforme. Ovo uključuje upotrebu>rekombinantnih CYP izoformi i njihove reduktaze dobijene prekomernom ekspresijom u ćelijama insekata inficiranih bakulovirusom. CYP reakcija se izvodi kroz inhibiciju izoforme CYP koja se testira zajedno sa luminometrijskim CYP supstratom u uslovima regeneracije NADPH.

Luminometrijski P450-GloTM supstrati su derivati luciferina bube ((4S)-4,5-dihidro-2-(6-hidroksibenzotiazolil)-4-tiazolkarboksilne kiseline ili D-luciferina), supstrata luciferaze svica iz buba. Luminometrijski P450-GloTM supstrati ne reaguju direktno sa luciferazom, već se konvertuju<odgovarajućom izoformom CYP u produkt luciferina koji je luminiscentan posle reakcije sa reagensom za detekciju luciferina (LDR). Ovo omogućava da se aktivnost enzima brzo kvantifikuje kroz luminoznost. Stepen inhibicije se meri određivanjem IC50 vrednosti (Crespi et al., Methods>Enzymol.357:276-284, 2002). Koriste se sledeći komercijalno dostupni sistemi/testovi za skrining: P450-Glo™ CYP1A2 Screening System (Promega Corporation; V9770); P450-Glo™ CYP2C8 test (Promega Corporation; V8782); P450-Glo™ CYP2C9 Screening System (Promega Corporation;<V9790); P450-Glo™ CYP2C19 Screening System (Promega Corporation; V9880); P450-Glo™ CYP2D6>Screening System (Promega Corporation; V9880); P450-Glo™ CYP3A4 Screening System (Luciferin-PPXE) (Promega Corporation; V9910).

Bioraspoloživost

<Predviđena bioraspoloživost kod ljudi je izvedena iz izmerene bioraspoloživosti u pretkliničkim>vrstama: Miš, pacov i psi (bigl) i izračunata je za predviđenu farmakološki efektivnu dozu kod ljudi(in silico GastroPlus simulacija).

<Metoda Rendgenske Difraktometrije Praha (PXRD):>

<Rendgenski difraktogrami praha (XRPD), kao što su oni prikazani na Slikama 7B i 10 do 19 (i>drugima), dobijeni su korišćenjem sledeće metodologije: Uzorci su pripremljeni u kombinatornoj<ploči sa 96 posudica (koja se sastoji od rendgenske amorfne folije kao dna), ili između rendgenskih amorfnih filmova. Mer>

e<e>

n<nja su izv>

611 difraktometru. Sk i i<sije sa Cu-Kα1 zračenjem na Stoe StadiP>ranja su<r>

b<šen>

a<a>

o<u>

d<g>

0<e>

-<o>

3<metriji transmi>

il 6° 2θ stovremeno (širina koraka od 0.03° 2θ, 30 sekundi po koraku), ili pokrivajući 1-65° 2θ (širina koraka od 0.015° 2θ, 15 sekundi po koraku), respektivno.

<Mono-Kristalna Rendgenska Difraktometrija:>

Podaci o mono-kristalnoj rendgenskoj strukturi su dobijeni korišćenjem difraktometra SuperNovakompanije Agilent, opremljenog CCD Detektorom koji koristi Cu Kα zračenje. Merenja su vršena na 200 K (Forma H2) odnosno na 298 K (Forme A1, A2, A3, H1), respektivno. Podaci o mono-kristalu sukorišćeni za određivanje parametara kristalnog sistema i jedinične ćelije.

<Diferencijalna Skenirajuća Kalorimetrija (DSC):>

<DSC skenovi su dobijeni na Mettler-Toledo Diferencijalnom Skenirajućem Kalorimetru toplotnog>fluksa sa autosamplerom, korišćenjem atmosfere inertnog gasa azota (50 mL/min). Pregledna skeniranja su obavljena u AI posudama od 40 μL sa otvorenim poklopcima od 25-300 °C pri 5 °C/min.

<Termogravimetrijska Analiza (TGA):>

TGA skenovi su dobijeni na Mettler-Toledo termogravimetrijskom analizatoru sa autosamplerom,<korišćenjem atmosfere inertnog gasa azota (50 mL/min). Pregledna skeniranja su obavljena u Al posudama od 100 μL bez poklopca od 25-300 °C pri 5 °C/min. Eksperimenti su korigovani na osnovu>bazne linije sa blanko testom iz prazne AI posude od 100 μL bez poklopca, koristeći isti temperaturni profil.

<Dinamička Sorpcija Pare (DVS):>

<DCS izoterme sorpcije vodene pare su dobijene na DVS instrumentu sa mikrobalansom i>inkubatorom (DVSIntrinsic, Surface Measurement Systems, SMS). Uzorci praha su precizno izmereni u AI posudama za jednokratnu upotrebu i postavljeni na poziciju uzorka DVS instrumenta. Ukupna brzina praćenja azota od 200 mL/min (kombinovani suvi i vlažni tok) je korišćena za humidifikaciju. Izoterme sorpcije vodene pare su dobijene na 25 °C, korišćenjem početnog segmenta desorpcije 1 od<40 %RH (relativne vlažnosti) do 0 %RH (sa 10 % RH koraka), segmenta adsorpcije od 0 %RH do 98>%RH (sa 10 % RH koraka i krajnjeg koraka od 8 %RH, respektivno), i završnog segment desorpcije 2od 98 %RH do 0 %RH (sa početnim korakom od 8 %RH i 10 %RH, respektivno). Za sve RH korake,korišćen je ravnotežni uslov dm/dt ≤0.0005 mas%/min, sa minimalnim vremenom RH koraka od 10minuta i maksimalnim vremenom RH koraka (timeout) od 360 minuta.

<Profili non-sink rastvaranja formi u čvrstom stanju:>

Non-sink profili rastvaranja za forme u čvrstom stanju dobijeni su shaked-flask metodom sa viškom<čvrstog materijala u FaSSIF medijumu (pH 6.5) uz vremenski razrešeno uzorkovanje za određivanje rastvorenih količina API.>

<Pribl. 10-20 mg čvrstog uzorka je izmereno u staklene bočice. Dodato je 7 ml odgovarajućeg medijuma (prethodno zagrejanog na 37 °C) i suspenzija je mućkana na 450 rpm na 37 °C. Posle 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 24 h i 48 h, 1 ml suspenzije je povučeno i filtrirano>kroz filter šprica od 0,2 μm. Čisti filtrat je analiziran pomoću HPLC nakon odgovarajućeg razblaženja da bi se izmerila količina rastvorenog jedinjenja/forme (može se takođe nazvati API).

FaSSIF: 3 mM natrijum tauroholata; 0.75 mM lecitina; 105.9 mM natrijum hlorida; 28.4 mM monobaznog natrijum fosfata i 8.7 mM natrijum hidroksida, pH 6.5

<HPLC metoda za ph-zavisnu rastvorljivost & minijaturizovano non-sink rastvaranje:>

<Nivoi rastvorenog jedinjenja/forme su analizirani sa HPLC, uz sledeće uslove:>

<• Kolona: Hromolit RP-18e 100 - 3 mm>

<• Rastvarač A: voda/mravlja kiselina (999:1; v/v)>

<• Rastvarač B: acetonitril/mravlja kiselina (999:1; v/v)>

• Zapremina injekcije: 5 μL

• Temperatura kolone: 37 °C

• HPLC-Gradijent:

PRIMERI

Sledeći Primeri ilustruju pronalazak opisan gore; oni, međutim, nemaju za cilj da na bilo koji način<ograniče obim pronalaska. Primere treba posebno tumačiti na takav način da nisu ograničeni na karakteristike ili kombinacije karakteristika koje su posebno ilustrovane, već umesto toga ilustrativne karakteristike mogu biti slobodno izmenjene ili kombinovane sve dok se predmet pronalaska, definisan u zahtevima, ostvaruje. Korisni efekti jedinjenja, kombinacija i kompozicija iz ovog pronalaska se takođe mogu odrediti drugim analitičkim metodama i eksperimentalnim>postavkama koje su kao takve poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Slično, modifikacije metoda pripreme, posebno reakcionih uslova, biće lako očigledne stručnjaku.

PRIMER 1: Priprema Jedinjenja 1 i 2

Jedinjenje Y se priprema u skladu sa postupkom otkrivenim u WO 2016/155844, nakon čega sledi odvajanje Jedinjenja 1 i 2 od jedinjenja Y:

<a. Sinteza 6-bromo-N-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-nitro-hinolin-4-amina>

U atmosferi suvog azota, obezbeđen je rastvor 3-fluoro-5-metoksipiridin-4-amina (447 mg, 3.02mmol) rastvorenog u N,N-dimetilformamidu (5 mL). Zatim je u rastvor dodat natrijum hidrid (504 mg, 12.6 mmol, 60%) i mešanje je nastavljeno 5 minuta na sobnoj temperaturi. 6-bromo-4-hloro-7-<metoksi-3-nitro-hinolin (800 mg, 2.52 mmol) je zatim dodat u reakcionu smešu, nakon čega je>usledilo 15 minuta mešanja na sobnoj temperaturi, zatim gašenjem reakcije dodavanjem ledenevode (100 mL). Talog je filtriran, ispran ledenom vodom i osušen da bi se dobilo 1.00 g (94 %) 6-bromo-N-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-nitro-hinolin-4-amina kao žuta čvrsta supstanca.

b. Sinteza 6-bromo-N<4>-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-hinolin-3,4-diamina

<6-Bromo-N-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-nitro-hinolin-4-amin (990 mg, 2.20 mmol) rastvoren u metanolu (100 mL) je obezbeđen pod zaštitnom atmosferom azota. Zatim je u rastvor dodat Raney-Ni (100 mg, 1.17 mmol) i reakciona smeša je mešana 30 minuta u atmosferi vodonika>pod normalnim pritiskom. Posle uvođenja azota, suspenzija je filtrirana i filtrat je osušen pod vakuumom. Filtrat je uparen do suvog pod vakuumom. Ostatak je kristalizovan iz smeše etil acetat/petroleum etra, dajući 0.86 g (99%) 6-bromo-N4-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-<hinolin-3,4-diamina kao žuta čvrsta supstanca.>

c. Sinteza 8-bromo-1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3H-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona

<Obezbeđen je rastvor 6-bromo-N4-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-hinolin-3,4-diamina (0.85 g, 2.20 mmol) rastvorenog u tetrahidrofuranu (20 mL). Zatim su dodati 1,1’-karbonildiimidazol (1.84>g, 11.3 mmol) i Hünigova baza (1.46 g, 11.3 mmol). Reakciona smeša je zagrejana do 40°C i mešana 16 sati. Reakcija je zatim ugašena dodavanjem ledene vode (200 mL). Talog je filtriran, ispran ledenom vodom i osušen da bi se dobilo 0.87 g (94 %) 8-bromo-1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3H-imidazo[4, 5-c]hinolin-2-ona kao svetlo žuta čvrsta supstanca.

d. Sinteza 8-bromo-1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona

U atmosferi suvog zaštitnog gasa azota, 8-bromo-1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3H-<imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (0.86 g 1.94 mmol) rastvorenog u N,N-dimetilformamidu (5 mL). Zatim su dodati natrijum hidrid (388 mg, 9.71 mmol, 60%) i metil jodid (2.76 g, 19.4 mmol). Reakciona smeša>je mešana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je reakcija ugašena dodavanjem ledene vode (100 mL). Dobijeni talog je filtriran i osušen pod vakuumom da bi se dobilo 0.70 g (80%) 8-bromo-1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona kao svetlo žuta čvrstasupstanca.

e. Sinteza 1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)imidazo[4,5-<c]hinolin-2-ona>

U atmosferi inertnog gasa argona u zatvorenoj opremi obezbeđeni su 8-bromo-1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (150 mg, 0.33 mmol), 1-3-dimetil-4-<(tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol (88.4 mg, 0.40 mmol), Pd(PPh3)4 (76.6 mg, 0.07 mmol) i kalijum karbonat (91.6 mg, 0.66 mmol) u 1,4-dioksanu (15 mL) i vodi (5 mL). Reakciona>smeša je zagrevana do 80°C uz mešanje tokom 2 sata. Posle toga je usledilo hlađenje do sobne temperature i redukcija reakcione smeše do suvog pod vakuumom. Ostatak je hromatografski<prečišćen korišćenjem silicijum dioksida (etil acetat/metanol = 97:3, zapreminski delovi). Eluat je>redukovan do suvog i dobijeni sirovi proizvod je prečišćen pomoću ili preparativnom RP-HPLC(voda/acetonitril). Nakon redukcije frakcija proizvoda, 1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (70 mg, 47%) je dobijen kao bezbojna čvrsta supstanca.

f. Separacija 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Ra)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona i 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksipiridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona

<1-(3-fluoro-5-metoksi-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-8-(1,3-metilpirazol-4-il)imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (50.0 mg, 0.11 mmol) kao što je prethodno dobijeno je odvojeno hiralnom HPLC korišćenjem SFC da>bi se dobila Jedinjenja 1 i 2. Supstanca je naneta na hiralnu kolonu Lux Cellulose-2 i odvojena pri protoku od 5 mL/min sa CO2/2-propanol 0.5% dietilamin (75:25) kao rastvaračem i korišćenjem detekcije na talasnoj dužini od 240 nm. Smanjenje frakcija proizvoda pod sniženim pritiskom dalo je8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Ra)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]hinolin-2-on (25.0 mg, 50%) i 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-<metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on) (22.1 mg , 44%), oba>kao bezbojne čvrste supstance.

Polazna jedinjenja se lako mogu dobiti, na primer kao što je prikazano u nastavku:

<PRIMER 2: Izolacija Atropizomera i pročišćavanje Jedinjenja 1>

Jedinjenja 1 i 2 se mogu izolovati iz Jedinjenja Y kao što je prikazano na Šemi 1 i na Slici 6 i kao što jedetaljno razmotreno u nastavku. Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti će ceniti da je proces opisan u nastavku podjednako primenljiv za jedinjenja 3-a i 3-b iz 3, 4-a i 4-b iz 4, kao i za 5-a i 5-b iz 5.

Šema 1: Priprema Hiralnih Soli

<Korak 1:>

<1. U reaktor od 200 L, dodaju se aceton (108 L, 20 vol.), prečišćena voda (8.13 L, 1.5 vol.) i Jedinjenje Y (5.42 Kg, 1.0 ekv.) na 20〜25 °C.>

<2. Napuni se sa dibenzoil-L-vinskom kiselinom (4.33 Kg, 1.0 ekv.).>

<3. Zagreva se na 52-55 °C da se dobije bistar rastvor, meša se 0.5 h na 52-55 °C.>

<4. Ohladi se na 20〜25 °C.>

<5. Filtrira se i ispere filter masa sa acetonom (5.4 L, 1 vol.) jednom.>

<6. Sakupi se masa i osuši da se dobije L-so B (L-so Jedinjenja 2) (svetlo žuta čvrsta supstanca sa 95.9% hiralne čistoće).>

7. Koncentriše se matični rastvor i dobije se L-so A (L-so Jedinjenja 1).

8. U reaktor od 100 L doda se L-so A i DCM (38 L, 7 vol.), pH podešen na 8-9 sa zasićenim rastvorom NaHCOs.

9. Sakupi se sloj dihlormetana (DCM), ekstrahovati zasićeni NaHCO3 sa DCM (16.3 L, 3 vol.), kombinovati DCM slojeve, isprati DCM sloj sa H20 (10.8 L, 2 vol.).

10. Koncentriše se DCM sloj. Zatim se doda aceton (5.4 L, 1 vol.) na 20〜25 °C.

11. Meša se na 20〜25 °C tokom 1 h.

12. Filtrira se, sakupi se masa i osuši da bi se dobilo Jedinjenje 1 (3.50 Kg, bela čvrsta supstanca sa 73.2% hiralne čistoće, Y:64.6%).

<Korak 2:>

1. U laboratorijsku bocu od 50 L doda se L-so B i DCM (16.2 L, 3 vol.), pH podešen na 8-9 sa<zasićenim rastvorom NaHCO3.>

<2. Sakupi se DCM sloj, ekstrahuje se vodeni sloj sa DCM (5.4 L, 1 vol.), kombinuje DCM slojeve, ispere DCM sloj sa H20 (5.4 L, 1 vol.).>

<3. Zameni se DCM sa 2-etoksietanolom (1.8 L, 0.3 vol.) dva puta pod vakuumom na 40〜50 °C.>

4. Podesi se zapremina sa 2-etoksietanolom na 5.4 L (1 vol.).

5. Zagreva se na 128-130 °C da se dobije kaša, meša se 44 h na 128-130 °C.

6. IPC (odnos 49.5:50.5).

<7. Ohladi se na 15-20 °C.>

8. Masa se filtrira i ispere metil-terc.-butil-etrom (2.7 L, 0.5 vol).

9. Sakupi se masa i osuši da bi se dobilo Jedinjenje Y (1.60 kg, beličasta čvrsta supstanca, ukupan prinos: 29.5%).

<Korak 3:>

<1. U reaktor od 100 L doda se aceton (70 L, 20 vol.) na 20〜25 °C, meša se i doda se Jedinjenje 1 (3.5 Kg, 1.0 ekv.), napuni se voda (5.3 L, 1.5 vol.).>

<2. Napuni se sa Dibenzoil-D-vinskom kiselinom (2.8 Kg, 1.0 ekv.) na 35〜40 °C, zagreje se na 52〜55 °C da bi se dobio bistar rastvor, meša se 0.5 h na 52〜55 °C.>

<3. Ohladi se na 20〜25 °C u uljanom kupatilu i meša se 17h na 20〜25 °C.>

<4. Masa se filtrira i ispere acetonom (3.5 L, 1 vol.).>

5. Sakupi se masa da bi se dobila D-so A (D-so Jedinjenja 1) (svetlo žuta čvrsta supstanca sa 98.7% hiralne čistoće).

6. Koncentriše se matični rastvor, zatim se doda zasićeni rastvor NaHO3 (15.5 L, 3.5 vol.) i H20 (15.5 L, 3.5 vol.).

7. Meša se 0.5 h na 20〜25 °C.

8. Masa se filtrira i ispere sa H2O (3.5 L, 1 vol.).

9. Sakupi se filter masa i osuši da bi se dobilo Jedinjenje Y (1.53 Kg, bela čvrsta supstanca sa odnosom od 50.3:49.7, Y:43.7%).

<Korak 4:>

<1. U reaktor od 50 L doda se D-so A (D-so Jedinjenja 1) i aceton (17.5 L, 5 vol.), zagreje na 52〜55>°C da bi se dobio kašasti rastvor, meš se 0.5 h na 52〜55 °C.

2. Ohladi se na 20-25 °C i meša 17 h na 20〜25 °C.

3. Masa se filtrira i ispere acetonom (3.5 L, 1 vol).

<4. Sakupi se filter masa i osušiti da bi se dobila D-so A (3.23 kg, svetlo žuta čvrsta supstanca sa 99.2% hiralne čistoće).>

5. U reaktor od 50 L doda se D-so A, zatim se doda zasićeni rastvor NaHCO3(16 L, 5 vol.) i H20 (16L, 5 vol.).

6. Meša se 0.5 h na 20〜25 °C.

7. Masa se filtrira i ispere sa H2O (16 L, 5 vol.).

<8. Sakupi se masa i osuši da bi se dobilo Jedinjenje 1 (1638 g, bela čvrsta supstanca sa 99.1% hiralne čistoće i 99.9% HPLC, ukupan prinos: 30.2%).>

<PRIMER 3: Hromatografska separacija, pročišćavanje i analiza>

<3.1 Jedinjenja 1 i 2 se mogu izolovati iz Jedinjenja Y korišćenjem hromatografije na hiralnoj stacionarnoj fazi (videti, na primer, Chiral Liquid Chromatography; W. J. Lough, Ed. Chapman and Hall, New York, (1989); Okamoto, "Optical resolution of dihydropyridine enantiomers by highperformance liquid chromatography using phenylcarbamates of polysaccharides as a chiral stationary phase", J. of Chromatogr. 513:375-378, (1990)). Jedinjenja 1 i 2 se mogu izolovati hromatografijom na hiralnoj stacionarnoj fazi, na primer, Chiralpak IC kolona (5 mm, 150 x 4,6mm I.D.), na primer, korišćenjem izokratskog eluiranja sa mobilnom fazom koja sadrži: H2O/ACN 50/50 v/v (ACN: acetonitril; v: zapremina). Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da se isti postupak može>primeniti za jedinjenja 3-a i 3-b, 4-a i 4-b, kao i za 5-a i 5-b.

Ovako dobijeni hromatogram je ilustrovan na Slici 5 (Kolona i elucija kao što je gore pomenuto, protok 1.00 ml/min; UV @ 260nm; Tc i Ts: 25 ± 5°C, Sconc 0.20 mg/ml; ubrizgana zapremina 10 ml) 3.2 Kao alternativa za SFC uslove pomenute gore, može se koristiti preparativna superkritična tečna hromatografija, koja uključuje na primer: Chiralpak AS-H (20 mm x 250 mm, 5 μm) kolonu; izokratsko eluiranje (20:80 etanol:CO2 sa 0.1% v/v NH3), BPR (reg. povratnog pritiska): oko 100 bara iznad atmosferskog pritiska; temperatura kolone od 40°C, brzina protoka od 50 ml/min, zapremina injekcije od 2500 μl (125 mg) i talasna dužina detektora od 265 nm.

3.3 Za analizu čistoće odgovarajućih atropizomera, ponovo se može primeniti SFC, na primer<korišćenjem sledećeg podešavanja: Chiralpak AS-H (4.6 mm x 250 mm, 5 μm) kolona; izokratsko eluiranje (20:80 etanol:CO2 sa 0.1% v/v NH3), BPR (reg. povratnog pritiska): oko 125 bara iznad>atmosferskog pritiska; temperatura kolone od 40°C, brzina protoka od 4 ml/min, zapremina injekcije od 1 μl i talasna dužina detektora od 260 nm.

PRIMER 4: Stabilnost Jedinjenja 1 i 2

<Kvantno mehanički proračuni rotacionih barijera>

<LaPlante et al. (ChemMedChem, 2011, 6(3), 505-513) opisuju kvantno-mehanički radni tok za>procenu energetskih barijera za aksijalnu rotaciju molekula sličnih leku. Sličan pristup je primenjen:<3D strukture svih ulaznih molekula su generisane korišćenjem CORINA (Corina verzija 3.6,>Molecular Networks, Nemačka) i naknadno minimizirane pomoću Macromodel (verzija 11.1,Schrödinger, LLC, New York, NY). Na osnovu ovih ulaznih struktura, rotacione energetske barijere su<izračunate iz relaksiranih skeniranja diedarskog ugla korišćenjem programa Jaguar (verzija 9.1>izdanje 14, Schrödinger, LLC, New York, NY) primenom metode B3LYP/6-31G** sa prirastomtorzionog ugla od 15°. Strukture su optimizovane pre torzionog skeniranja koristeći isti nivo teorije.<Korišćeni su podrazumevani parametri osim što je maksimalni broj koraka minimizacije postavljen na 500 i stop_rxn flag je uvedena da bi se izbegli veštački prekidi veze. Za sve proračune korišćeni su reprezentativni molekularni fragmenti. Diedar dobijen iz minimizirane strukture molekularne mehanike je korišćen za definisanje početne vrednosti za skeniranje diedara, npr. za Jedinjenje 1 ovog pronalaska ili za "LaPlante referentno Jedinjenje 1" vrednosti su postavljene na 47.32° i 35.8°>respektivno. Za svaku torziju oko aksijalne veze QM energetske vrednosti su izračunate u 24 koraka.Torzioni profil je dobijen grafikom vrednosti ugla torzije prema izračunatim energijama. Određena je najniža energetska barijera za svako jedinjenje koja omogućava međukonverziju između oba izomera. Za referentna jedinjenja 1-6 su poznate eksperimentalno određene stope međukonverzije i izvedene energetske barijere. Računarske energetske barijere za referentna jedinjenja 1-6 su između 9.865 i 31.316 kcal/mol. Ove vrednosti su prilagođene eksperimentalno utvrđenim stopamameđukonverzije.

Proračuni za Jedinjenje 1 ovog pronalaska i Jedinjenje 2 ovog pronalaska otkrili su visoku predviđenu rotirajuću barijeru od 29.205 kcal/mol koja se prevodi u visoko stabilan atropizomer sa predviđenim rotacionim poluživotom u rasponu od više godina (> 10 godina). Potrebna temperaturaza početak racemizacije bilo kog enantiomernog atropizomera je > 100°C.

<Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici će razumeti da su ove vrednosti takođe primeri za jedinjenja 3-a i 3-b, 4-a i 4-b, kao i za 5-a i 5-b.>

PRIMER 5: Farmaceutski prihvatljive soli Jedinjenja 1

Soli Jedinjenja 1 (Jedinjenja 1-a), koje su farmaceutski prihvatljive, pripremljene su kako je prikazano i detaljno razmotreno u nastavku.

<Priprema Fumarat-Soli (Forma NF6):>

Pribl.20 mg 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona je rastvoreno u 1 mL THF na 50 °C (p.a. stepen) u staklenoj bočici od 4 mL sa zatvorenim poklopcem, opremljenom magnetnom šipkom za mešanje, i<pomoću magnetne mešalice. Na 50 °C, u vreli rastvor je dodato pribl. 5.7 mg fumarne kiseline (~ 1.1 ekv.) i ohlađeno na 5 °C brzinom hlađenja od 0.1 K/min. Smeša je više puta zagrevana do 50 °C (unutar pribl. 30 min) i ohlađena na 5 °C (na 0.1 K/min) uz mešanje, pre završnog koraka ekvilibracije na 5 °C tokom nekoliko sati. Da bi se povećao prinos formiranja soli u ohlađenom>rastvoru, smeša je dalje izložena sporoj difuziji pare anti-rastvarača n-pentana u zatvorenoj konfiguraciji bočice. Konačno dobijeni čvrsti materijal je odvojen centrifugiranjem i blago osušen pod pročišćavanjem azotom.

<Priprema Napsilat-Soli (Forma NF7) - Alternativa 1:>

<Pribl. 10 mg 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3->metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona je rastvoreno u ~ 250 μL Acetona na 50 °C (p.a.

<stepen) u staklenoj bočici od 4 mL sa zatvorenim poklopcem, opremljenom magnetnom šipkom za mešanje, i pomoću magnetne mešalice. Na 50 °C, u vreli rastvor je dodato pribl. 5.6 mg naftalen-2-sulfonske kiseline (~1.2 ekv.) i ohlađeno na 5 °C pr brzini hlađenja od 0.1 K/min. Smeša je više puta>zagrevana do 50 °C (u okviru pribl.30 min) i ohlađe<i>

na na 5 °C (na 0.1 K/min) uz mešanje, pre završnog koraka ekvilibracije na 5 °C tokom nekoliko sati. Konačno dobijeni čvrsti materijal je odvojen centrifugiranjem i blago osušen pod pročišćavanjem azotom.

<Priprema Napsilat-Soli (Forma NF7) - Alternativa 2:>

<Pribl. 11.5 mg 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona je rastvoreno u ~250 μL THF (tetrahidrofuran) na 50>°C (p.a. stepen) u staklenoj bočici od 4 mL sa zatvorenim poklopcem, opremljenom sa magnetnomšipkom za mešanje i korišćenjem magnetne mešalice. Na 50 °C, pribl. 6.6 mg naftalen-2-sulfonske kiseline (∼1,2 ekv.) je dodato u vreli rastvor i ohlađeno na 5 °C pri brzini hlađenja od 0.1 K/min. Smeša je više puta zagrevana do 50 °C (u okviru pribl. 30 min) i ohlađena na 5 °C (na 0.1 K/min) uz mešanje, pre završnog koraka ekvilibracije na 5 °C tokom nekoliko sati. Konačno dobijeni čvrsti materijal je odvojen centrifugiranjem i blago osušen pod pročišćavanjem azotom.

<Priprema Edizilat-Soli (Forma NF8):>

<Pribl. 12.6 mg 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona je rastvoreno u ~ 250 μL Acetona na 50 °C (p.a. stepen) u staklenoj bočici od 4 mL sa zatvorenim poklopcem, opremljenom magnetnom šipkom za mešanje i korišćenjem magnetne mešalice. Na 50 °C, pribl. 6.1 mg Etandisulfonske kiseline (~1.2 ekv.) je dodato u vreli rastvor i ohlađeno na 5 °C pri brzini hlađenja od 0.1 K/min. Smeša je više puta>zagrevana do 50 °C (u okviru pribl.30 min) i ohlađena na 5 °C (na 0.1 K/min) uz mešanje, pre završnog koraka ekvilibracije na 5 °C tokom nekoliko sati. Konačno dobijeni čvrsti materijal je odvojen centrifugiranjem i blago osušen pod pročišćavanjem azotom.

PRIMER 6: Priprema Jedinjenja 3, 4 i 5 (Referentni primeri)

Sinteza 8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)-1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-metilimidazo[4,5-c]hinolin-2-ona

Korak a:

<U zatvorenu epruvetu stavljeno je: 1-(3,5-difluoropiridin-4-il)-8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-7-metoksi-3-metil-1H,2H,3H-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona (90.0 mg, 0.20 mmol, 95%), kalijum karbonat (85.3 mg, 0.62 mmol), CD3OD (0.30 mL, 6.74 mmol), N,N-dimetilformamid (3 mL). Smeša je mešana 1 h na 100°C. Dodato je 10 mL vode i dobijeni rastvor je ekstrahovan tri puta etil acetatom (10 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirani i filtrat je koncentrovan do suvog pod vakuumom. Sirovi ostatak je prečišćen preparativnom HPLC>(SHIMADZU(HPLC-10): Kolona: Atlantis Prep T3 OBD Kolona, 19*250 mm, 10 μm; mobilna faza: voda (10 mmol/L NH4HCO3) i acetonitril (drži 34% acetonitrila 10 min); Detektor: UV 254nm) da bi se dobilo 35 mg (38%) 8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)-1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-metil-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona kao bela čvrsta supstanca. Tačka topljenja 260-262°C. HPLC/MS (čistoća) 97%. Rt 1.98 min (metod A). [M+H]+ 452.1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.92 (s, 1H), 8.70 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.83 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.60 (s, 3H), 1.75 (s, 3H).

Sinteza 8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)-1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-(trideuteriometil)imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona

<Korak b:>

<U bocu sa okruglim dnom stavljen je 8-bromo-1-(3,5-difluoropiridin-4-il)-7-metoksi-1H,2H,3H-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (3.00 g, 6.96 mmol, 94%) u N,N-dimetilformamidu (50 mL). Natrijum hidrid (1.39 g, 34.8 mmol, 60%) je dodat na 0°C u roku od 5 minuta, a zatim je dodat CD3I (3.18 g,>20.9 mmol, 95%). Dobijeni rastvor je mešan 15 min na sobnoj temperaturi. U smešu je dodato 500 mL ledene vode i čvrste materije su sakupljene filtracijom. Ovo je rezultiralo sa 2.95 g (99%) 8-bromo-1-(3,5-difluoro-4-piridil)-7-metoksi-3-trideuteriometil)imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona kao žutačvrsta supstanca. HPLC/MS (čistoća) 99%. Rt 0.93 min (metod B). [M+H]+ 424, 426.

Korak c:

<U zatvorenu epruvetu pročišćenu i održavanu u inertnoj atmosferi argona stavljen je 8-bromo-1-(3,5-difluoro4-piridil)-7-metoksi-3-trideuteriometil)imidazo-[4,5-c]hinolin-2-on (1.80 g, 4.20 mmol,>99%), 1,3-dimetil-4-(tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol (1.97 g, 8.43 mmol, 95% ), Pd(PPh3)4 (540 mg, 0.42 mmol, 90%), kalijum karbonat (1.22 g, 8.39 mmol, 95%), dioksan (50 mL) i voda (10 mL). Smeša je mešana 2 h na 80°C i koncentrovana pod vakuumom do suvog. Ostatak je<prečišćen hromatografijom na koloni (metanol/etil acetat, 13:87) dajući 1.35 g (71%) 1-(3,5->difluoro-4-piridil)-8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)-7-metoksi-3-(trideuteriometil)imidazo[4,5-c]hinolin-2-on kao žuta čvrsta supstanca. HPLC/MS (čistoća) 97%. Rt 0.91 min (metod C). [M+H]+ 440.

<Korak d:>

<U zatvorenu epruvetu pročišćenu i održavanu u inertnoj atmosferi argona stavljen je 1-(3,5-difluoro-4-piridil)-8-(1,3-dimetilpirazol-4-il)-7-metoksi-3-( trideuteriometil)imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (1.35 g, 2.96 mmol), N,N-dimetilformamid (30 mL), kalijum karbonat (818 mg, 5.92 mmol) i CD3OD (2.76 mL, 2.24 g, 62.2 mmol). Smeša je mešana 2 h na 100°C. Dodato je 100 mL vode i dobijena smeša je ekstrahovana tri puta sa 200 mL etil acetata. Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani sa 100 mL slanog rastvora. Organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata,>koncentrovan do suvog i sirovi proizvod je kristalizovan iz metanol/acetonitrila (1:25) da bi se dobilo 1.50 g (66%) 8-(1,3-dimetilpirazol-4-il-1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-(trideuteriometil)imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona kao beličasta čvrsta supstanca. Tačka topljenja 266-271 °C. HPLC/MS (čistoća) 97%. Rt 2.00 min (metod C). [M+H]+ 455.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.87 (s, 1H), 8.65 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.28 (s, 3H), 1.71 (s, 3H).

Sinteza 1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-metil-8-[3-metil-1-(trideuteriometil)pirazol4-il]imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona

<Korak e:>

<U bocu sa okruglim dnom stavljen je 1-(3,5-difluoropiridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-8-(3-metil-1H-pirazol-4-il)-1H,2H,3H-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (890 mg, 1.89 mmol, 90%) u N,N-dimetilformamidu (30 mL). Natrijum hidrid (377 mg, 9.43 mmol, 60%) je dodat na 0°C u 5, a zatim CD3I (1.44 g, 9.44 mmol, 95%). Dobijena smeša je mešana 8 h na sobnoj temperaturi. Dodato je 200 mL ledene vode i rastvor je ekstrahovan četiri puta ombin vani organski>slojevi su dva puta isprani sa 100 mL slanog rastvor<s>

a<a>

. O<20>

rg<0>

a<m>

ns<L>

k<e>

a<t>

f<i>

a<l>

z<a>

a<ce>

je<ta>

o<ta>

su<. K>

šena pre<o>

ko anhidrovanog natrijum sulfata, koncentrovana do suvog i prečišćena hromatografijom na koloni sa dihlorometan/metanolom (19:1) da bi se dobilo 400 mg (47%) 1-(3,5-difluoro-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-8-[3-metil-1-(trideuteriometil)pirazol-4-il]imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona kao žuta čvrsta supstanca. HPLC/MS (čistoća) 98%. Rt 0.68 min (metod D). [M+H]+ 440.

<Korak f:>

<U zatvorenu epruvetu pročišćenu i održavanu u inertnoj atmosferi argona stavljen je 1-(3,5-difluoro-4-piridil)-7-metoksi-3-metil-8-[3-metil-1-(trideuteriometil)pirazol-4-il]imidazo[4,5-c]hinolin-2-on (380 mg, 0.84 mmol, 98%), N-metil-2-pirolidon (20 mL), kalijum karbonat (368 mg, 2.53 mmol, 95%) i CD3OD (2.45 mL, 53.9 mmol, 98%). Smeša je mešana 4 h na 100°C. Dodato je 100 mL vode i dobijeni rastvor je ekstrahovan 5 puta sa 100 mL etil acetata. Kombinovani organski slojevi su dva>puta isprani sa 100 mL slanog rastvora, osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata, koncentrovani do suvog i prečišćeni hromatografijom na koloni sa dihlorometanom/metanolom (10:1) da bi se dobilo 300 mg (74%) 1-[3-fluoro-5-(trideuteriometoksi)-4-piridil]-7-metoksi-3-metil-8-[3-metil-1-(trideuteriometil)pirazol-4-il]imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona kao narandžasta čvrsta supstanca.

HPLC/MS (čistoća) 95%. Rt 0.65 min (metod D). [M+H]+ 455. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm = 8.87 (s, 1H), 8.65 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.55(s, 3H) 1.71 (s, 3H).

<HPLC metod A:>

Kolona: Shim-pack XR-ODS, 3.0*50 mm, 2.2 μm; mobilna faza A: voda/0.05% TFA, mobilna faza B:acetonitril/0.05% TFA; brzina protoka: 1.0 mL/min; gradijent: 5%B do 100% B za 2.2 min, zadržavanje 1.0 min; 254 nm.

<HPLC metod B:>

Kolona: Shim-pack XR-ODS, 3.0*50 mm, 2.2 μm; mobilna faza A: voda/0.05% TFA, mobilna faza B:acetonitril/0.05% TFA; brzina protoka: 1.2 mL/min; gradijent: 5%B do 100% B za 2.0 min, zadržavanje 0.7 min; 254nm.

<HPLC metod C:>

<Kolona: Poroshell HPH-C18, 3.0*50 mm, 2.7 μm; mobilna faza A: voda/5 mM NH4HC03, mobilna faza>B: acetonitril; brzina protoka: 1.3 mL/min; gradijent: 10% B do 95% B za 2.1 min, zadržavanje 0.6 min; 254nm.

<HPLC metod D:>

<Kolona: Ascentis Express C18, 3.0*50 mm, 2,7 μm; mobilna faza A: voda/0.05% TFA, mobilna faza B:>acetonitril/0.05% TFA; brzina protoka: 1.5 mL/min; gradijent: 5% B do 100% B za 1.2 min, zadržavanje 0.5 min; 254nm.

PRIMER 7: Čvrste Forme i Solvati Jedinjenja 1

A. Priprema Čvrste Forme A2

<Čvrsta Forma A2 Jedinjenja 1 je pripremljena različitim procesima hlađenja kristalizacije iz alkohola:>7.1 Jedinjenje 1 je rastvoreno u 1-propanolu u koncentraciji od pribl.50 mg/mL na 50 °C uz mešanje.Dobijeni bistri rastvor je ohlađen na -20 °C pri brzini hlađenja od 0.1 °C/min., sa konačnim periodom zadržavanja od najmanje 1 h na -20 °C. Odvajanje čvrste materije od tečnosti je izvedeno filtriranjem<preko vakuumskog usisavanja, a filtrirani čvrsti uzorak je sušen pod dinamičkim pročišćavanjem azotom preko noći.>

7.2 Jedinjenje 1 je rastvoreno u izo-butilalkoholu u koncentraciji od pribl.40 mg/mL na 50 °C uzmešanje. Dobijeni bistri rastvor je ohlađen na -20 °C pri brzini hlađenja od 0.1 °C/min, sa konačnim periodom zadržavanja od najmanje 1 h na -20 °C. Odvajanje čvrste materije od tečnosti je izvedeno filtracijom preko vakuumskog usisavanja, a filtrirani čvrsti uzorak je sušen pod dinamičkim<pročišćavanjem azotom preko noći.>

<7.3 Hidrat Jedinjenja 1 u obliku H2 (čija priprema je opisana u nastavku) je dispergovana u 2-PrOH>na nivou koncentracije od 12 % (m/m; u odnosu na suvu masu Jedinjenja 1). Dobijena disperzija je zagrejana na 80 °C uz mešanje da bi se dobio bistar rastvor. Inicijalna rampa hlađenja od 80 do 70 °C je pokrenuta brzinom od 0.5 °C/min, sa naknadnim vremenom zadržavanja na 70 °C. Na 70 °C, dodati su kristali anhidrovanog oblika A2 (osnovne čestice < 50 μm; približno 4.5% u odnosu na<količinu u reaktoru). Kristali semena su pre-dispergovani u pribl. 1 mL 2-PrOH na 100 mg količine semena. Vreme zadržavanja od 10 minuta je primenjeno nakon setve na 70 ° C. Rampa hlađenja od 70 °C do 5 °C je pokrenut pri 0.1°C/min, nakon čega je usledilo vreme zadržavanja od 3 sata na krajnjoj temperaturi (5 °C). Odvajanje čvrste materije od tečnosti je izvedeno filtracijom preko vakuumskog usisavanja, a filtrirani čvrsti uzorak je osušen pod dinamičkim pročišćavanjem azotom na 70 °C preko noći.>

U alternativnoj metodi, Forma A2 je pripremljena kašastom suspenzijom iz različitog polimorfnog oblika na sledeći način:

7.4 Čvrsti materijal, posebno drugačija polimorfna forma Jedinjenja 1, najpoželjnije hidratna forma H2 (čija priprema je opisana u nastavku), dispergovana je u pribl. 5.2 vol.-eq. etilacetata i mešana na RT tokom 21 h. Talog se odfiltrira usisavanjem i suši najmanje 72h na 60°C pod vakuumom.

B. Priprema Čvrste Forme A1

<Čvrsti oblik A1 Jedinjenja 1 je pripremljen pomoću sledeće dve metode:>

<7.5 Pribl. 50 mg 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona (racemska smeša) je podvrgnuta SFC hiralnoj separaciji, korišćenjem kolone Lux Cellulose-2, i smeše rastvarača CO2/2-Propanol 0.5% DEA (75:25) pri brzini protoka od 5 mL/min. Dobijena frakcija je isprana dihlorometanom, i>koncentrovana na temperaturi kupatila od 30 °C da bi se dobila čvrsta supstanca.

7.6 Pribl. 10 mg 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona rastvorenog u 100 μL dihlorometana (DCM) se upari na sobnoj RT (RT: sobna temperatura, pribl. 20-25 °C) da se dobije prah.

<C. Priprema Čvrste Forme A3>

<7.7 Pribl. 12 mg 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi->3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona čvrsti materijal, koji predstavlja alternativnu morfnu formu koja nije A3, najpoželjnije predstavlja formu A2, dispergovan je u pribl.40 μL THF, i mešano na RT (20-25 °C) pribl.4 nedelje. Dobijena čvrsta supstanca je odvojena centrifugiranjem i blago osušena u ambijentalnim uslovima da bi se dobio prah.

D. Priprema Čvrste Forme NF9

<Čvrsta Forma NF9 Jedinjenja 1 je pripremljena pomoću sledeće dve metode:>

<7.8 Pribl. 100 mg 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona, rastvoren u 2000 μL dihlorometana, je brzo isparen pod vakuumom na RT (pribl. 20-25 °C) da bi se dobio prah.>

7.9 Pribl. 20 mg 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-on, rastvoren u 1000 μL acetona na 50 °C, je dodat sa 1 eq. benzoeve kiseline. Rastvor je ohlađen do RT (pribl. 20-25 °C). Rastvor je zatim podvrgnut difuznoj kristalizaciji pare na RT (pribl. 20-25 °C) korišćenjem rezervoara n-pentana, sporom difuzijom u rastvor preko difuzije gasne faze. Posle nekoliko dana kristalizovana je čvrsta supstanca, koja je odvojena centrifugiranjem i blago osušena pod azotom da bi se dobio prah.

E. Priprema Čvrstog Hidrata Forme H1

<Čvrsta forma H hidrata Jedinjenja 1 je dobijena pomoću sledeće dve metode:>

<7.10 Pribl.12-13 mg 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona čvrsti materijal, koji predstavlja alternativni morfnu formu različitu od H1, najpoželjnije formu A2, dispergovan je u pribl. 200 μL>metanola, i mešano na RT (20-25 °C) tokom 5 dana. Dobijena čvrsta supstanca je odvojena centrifugiranjem i blago osušena u ambijentalnim uslovima da bi se dobio prah.

7.11 Pribl.12 mg 8-(1,3-Dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona, rastvoren u 750 μL 1-propanola, isparen je na RT (približno 20-25 °C) da bi se dobio prah.

<F. Priprema Čvrstog Hidrata Forme H2>

<7.12 Pribl.19 g 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona čvrsti materijal, koji predstavlja alternativnu morfnu formu osim H2, najpoželjnije predstavlja formu A2, dispergovan je u pribl. 80 mL DI vode, i mešan na>RT (20-25 °C) pribl. 4 dana. Dobijena čvrsta supstanca je odvojena vakuum filtracijom, i osušena na 50 °C pod pročišćavanjem azotom da bi se dobio prah.

7.13 Pribl.13-14 mg 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piridin-4-il)-7-metoksi-3-metil-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona, rastvoren u 250 μL THF, brzo se sipa u rezervoar od 1500 μL DI vode na RT (približno 20-25 °C) uz turbulentno mešanje. Dobijeni talog je odvojen centrifugiranjem, i lagano osušen u ambijentalnim uslovima da bi se dobio prah.

<G. Priprema Čvrste Forme NF19>

<7>

3<.>

-<1>

m<4>

e<P>

ti<r>

l<i>

-<b>

1<l.48 mg 8-(1,3-dimetil-1H-pirazol-4-il)-1-(Sa)-(3-fluoro-5-metoksi-piri>

,3-dihidro-imidazo[4,5-c]hinolin-2-ona, rastvoren u 1500 μL me<din-4-il)-7-metoksi->tanola, isparen je na 50 °C da bi se dobio prah.

PRIMER 8: Kombinacija sa radioterapijom

<U in vivo farmakološkoj studiji (FaDu SSCHN tumorski model), kombinovani tretman konkomitantnog Jedinjenja 1 i frakcionisanog zračenja tokom 6 nedelja (6 x 5 dana, 2 Gy po frakciji), snažno je poboljšao efikasnost IR (zračenje) na dozno-zavisan način u skladu sa nivoom ciljnog angažovanja, kao što je prikazano na Slici 20. Detaljno:>

<Anti-tumorska efikasnost jedinjenja 1 inhibitora ATM je procenjena u kombinaciji sa zračenjem (IR) kod NMRI nu/nu miševa koji nose ksenotransplantate ljudske skvamozne ćelije modela FaDu glave i vrata.>

<Jedna od kontrolnih grupa je tretirana samo vehikulumom. Druga kontrolna grupa je lečena sa IR samo u 30 frakcija IR od 2 Gy u rasporedu od 5 dana/2 dana odmora i tokom perioda od 6 nedelja. Dve grupe su tretirane kombinacijom IR (kao u samo IR kontroli) i jedinjenja 1 oralnom dozom od 10 mg/kg, ili 25 mg/kg 30 minuta pre svake IR frakcije.>

<PRIMER 9: Kombinacija sa PARP inhibicijom>

Efikasnost Jedinjenja 1 u kombinaciji sa olaparibom je demonstrirana u HBCx-10 modelu ksenografta trostruko negativnog karcinoma dojke dobijenog od pacijenata, razvijenom kod imunodeficijentnih ženki miševa, čiji su rezultati prikazani na Slici 21.

Sedamdeset (70) miševa sa subkutano rastućim tumorom HBCx-10 (P20.1.4/0) između 62.5 i 196.0 mm3 dodeljeno je tretmanu kada su njihova srednja zapremina tumora dostigla 131.16 i 126.00 mm3 respektivno.

Studija je obuhvatala različite grupe od po 10 miševa:

- U grupi 1, vehikulum olaparib je davan u dozi od 10 ml/kg p.o. qd x 28 u kombinaciji sa metocelom vehikuluma primenjenim u dozi od 10 ml/kg p.o. (3d uključeno/4d isključeno)x4; - U grupi 2, olaparib je doziran na 50 mg/kg p.o. qd x 49;

- U grupi 3, komparativni ATM inhibitor sam ATMix je davan p.o. (3d uključeno/4d isključeno)x5; - U grupi 4, olaparib je doziran na 50 mg/kg p.o. qd x 49 u kombinaciji sa ATMix p.o. (3d<uključeno/4d isključeno) x 7;>

<- U grupi 5, olaparib je doziran na 50 mg/kg p.o. qd x 49 kombinovano sa Jedinjenjem 1 pri 100>mg/kg p.o. (3d uključeno/4d isključeno) x 7.

Tumori su mereni svake dve nedelje tokom perioda lečenja i jednom nedeljno tokom perioda<praćenja.>

p.o. peroralno - d dan - qd quaque die - jedan dnevno

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje, predstavljeno sledećom formulom

   koje može uključivati jedan ili više izotopski obogaćenih atoma, ili njihovu farmaceutski prihvatljivuso.
2. 2. Jedinjenje, predstavljeno sledećom formulom

   koje može uključivati jedan ili više izotopski obogaćenih atoma, ili njihovu farmaceutski prihvatljivuso.
3. 3. Čvrsti anhidrovani oblik Jedinjenja 1 prema zahtevu 1. <
4. 4. Čvrsti anhidrovani oblik Jedinjenja 1 prema zahtevu 3, koji se karakteriše jednim ili više pikova u>dijagramu rendgenske difraktometrije praha koji se bira između onih na oko 7.3, oko 9.6, oko 11.1,oko 12.0, oko 12.7 i oko 16.2 stepena 2-teta ± 0.2 stepena 2-teta. <
5. 5. Čvrsti an> s<h> te<idrovani oblik Jedinjenja 1 prema zahtevu 3 ili 4, naznačen time što ima monoklinični>kristalni si m i P21 prostornu grupu i/ili sledeće parametre svoje jedinične ćelije:
6. 6. Deuterisani derivat jedinjenja prema zahtevu 1 ili 2, izabran od:

   i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. <
7. 7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje, njegovu farmaceutski prihvatljivu so,>deuterisani derivat ili čvrsta anhidrovana forma prema bilo kom od zahteva 1 do 6, i farmaceutskiprihvatljiv ekscipijent.
8. 8. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, deuterisani derivat ili čvrsta anhidrovana formaprema bilo kom od zahteva 1 do 6, za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora. <9. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, deuterisani derivat ili čvrsta anhidrovana forma>za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora prema zahtevu 8, pri čemu je tretman u kombinaciji saradioterapijom. <10. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, deuterisani derivat ili čvrsta anhidrovana forma>za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora prema zahtevu 8, pri čemu je tretman u kombinaciji saagensom koji oštećuje DNK. <11. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, deuterisani derivat ili čvrsta anhidrovana forma za upotrebu u lečenju prema zahtevu 10, naznačeno time što je agens koji oštećuje DNK agens za>alkilovanje, jedinjenje platine, inhibitor topoizomeraze, inhibitor poli-(ADP-riboze)-polimeraze(PARP), ATR (ataksija telangiektazija i Rad3 povezan) inhibitor, agens za modifikaciju DNK, antibiotik protiv kancera ili alfa emiter. <12. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, deuterisani derivat ili čvrsta anhidrovana forma za upotrebu u lečenju prema zahtevu 10, gde je agens koji oštećuje DNK izabran između altretamina, bendamustina, busulfana, karmustina, hloroambucila, hlorometina, ciklofosfamida, dakarbazina, ifosfamida, improsulfan tozilata, lomustina, melfalana, mitobronitola, mitolaktola, nimustina, ranimustina, temozolomida, tiotepe, treosulfana, mehloretamina, karbokvona, apazikvona, fotemustina, glufosfamida, palifosfamida, pipobromana, trofosfamida, uramustina, karboplatina, cisplatina, eptaplatina, miriplatin hidrata, oksaliplatina, lobaplatina, nedaplatina, pikoplatina, satraplatina, irinotekana, SN38, topotekana, kamptotecina, rubitekana, belotekana, etopozida, daunorubicina, doksorubicina, aklarubicina, epirubicina, idarubicina, amrubicina, pirarubicina,>valrubicina, zorubicina, amsakrina, olapariba, nirapariba, velipariba, 3-[3-(4-Metilaminometilfenil)-izoksazol-5-il]-5-[4-(propan-2-sulfonil)-fenil]-pirazin-2-ilamin), 2-Amino-6-fluoro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina [5'-fluoro-4-(4-oksetan-3-il-piperazin-1-karbonil)-3,4,5,6-tetrahidro-2H-[1,4']bipiridinil-3'-il]-amid, 4-[4-[1-[[S(R)]-S-metilsulfonimidoil]ciklopropil]-6-[(3R)-3-metil-4-morfolinil]-2-pirimidinil]-1H-pirolo[2,3-b]piridin, 2-[(3R)-3-metilmorfolin-4-il]-4-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-8-(1H-pirazol-5-il)-1,7-naftiridin, amrubicina, bisantrena, decitabina, mitoksantrona, prokarbazina, trabektedina, klofarabina, amsakrina, brostalicina, piksantrona, laromustina, bleomicina, daktinomicina, doksorubicina, epirubicina, idarubicina, levamisola,<miltefosina, mitomicina C, romidepsina, streptozocina, valrubicina, zinostatina, zorubicina,>daunurobicina, plikamicina, aklarubicina, peplomicina, pirarubicina, alfaradina (223Ra dihlorid, Xofgio), 211AT, 213Bi, 225Ac i 227Th. <13. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, deuterisani derivat ili čvrsta anhidrovana forma za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora prema zahtevima 8 do 12, gde je tumor izabran iz grupe>bolesti skvamoznog epitela, bešike, želuca, bubrega, glave, vrata, jednjaka, grlića materice, štitnežlezde, creva, kostiju, jetre, mozga, prostate, urogenitalnog trakta, limfnog sistema, larinksa, pluća, kože, krvnog i imunog sistema, i/ili gde je kancer izabran od monocitne leukemije, adenokarcinoma<pluća, karcinoma malih ćelija, karcinoma pankreasa, glioblastoma, karcinoma creva, karcinoma>dojke, akutne mijeloične leukemije, hronične mijeloične leukemije, akutne limfatične leukemije, hronične limfatične leukemije, Hodgkinovog limfoma i ne-Hodgkinovog limfoma. <14. Kombinacija jedinjenja, njegove farmaceutski prihvatljive soli, deuterisanog derivata ili čvrste anhidrovane forme prema bilo kom od zahteva 1 do 6 i agensa koji oštećuje DNK izabran od agensa>za alkilovanje, jedinjenja platine, inhibitora topoizomeraze, inhibitora poli-(ADP-riboze)-polimeraze(PARP), ATR (ataksija telangiektazija i Rad3 povezan) inhibitora, agensa za modifikaciju DNK, antibiotika protiv kancera i alfa emitera za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora.