RS65553B1

RS65553B1 - Faktor 1 protein za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti

Info

Publication number: RS65553B1
Application number: RS20240548A
Authority: RS
Inventors: Kai Christoph Wollert; Mortimer Korf-Klingebiel
Original assignee: Medizinische Hochschule Hannover
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2024-06-28
Also published as: FI2945642T3; HUE068364T2; WO2014111458A3; CN104968361A; US10369198B2; CN110922468A; PL2945642T3; CN111100197A; JP2016506911A; CN104968361B; LT2945642T; JP7685737B2; EP2945642B1; HRP20240623T1; PT2945642T; JP2020203894A; HK1215540A1; DK2945642T3; ES2986021T3; CN110922467A

Description

OBLAST TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na proteine koji sadrže sekvence aminokiselina kodirane nukleinskim kiselinama izvedenim iz ljudskog hromozomskog regiona C19Orf10, nazvanog Faktor 1, za upotrebu kao lek.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Akutni miokardijalni infarkt (AMI) je vodeći uzrok morbiditeta i mortaliteta širom sveta. Samo u Nemačkoj incidencija je oko 280.000 slučajeva godišnje. Lečenje pacijenta koji je doživeo AMI obuhvata otvaranje okludirane koronarne arterije reperfuzijskom terapijom u kombinaciji sa primenom inhibitora agregacije trombocita i koagulacionih inhibitora kako bi se sprečilo ponovno zatvaranje sudova. Dalje, puls i krvni pritisak mogu se smanjiti primenom beta-blokatora i ACE inhibitora. Takođe je uobičajena upotreba statina za smanjenje nivoa holesterola. Medicinski pristup direktnoj popravci srčanog mišića trenutno je ograničen na eksperimentalnu upotrebu sopstvenih koštanih ćelija pacijenta. Postoji velika potreba za lekovima sa sličnim efektom bez upotrebe koštanih ćelija.

[0003] Tkivna nekroza koja nastaje tokom AMI pokreće odgovor na zarastanje rane, koji dovodi do zamene nekrotičnog područja granulacionim tkivom, a kasnije i ožiljkom bogatim kolagenom. Monociti se regrutuju iz koštane srži u infarktovani miokardijum i imaju važnu ulogu tokom zarastanja rane nakon AMI. Odgovor monocita u miokardijumu je vremenski dvofazan. Pro-upalni monociti se pojavljuju ranije i promovišu digestiju infarktovanog tkiva i uklanjanje nekrotičnih ostataka, dok reparativni monociti dominiraju kasnije i podstiču angiogenezu i popravku. Ekspresija receptora za hemokin CXCR4 na površini ćelij adentifikuje podskup reparativnih monocita kod miševa i ljudi. Misli se da pro-angiogene i pro-lečive efekte CXCR4+ mijeloidnih ćelija posreduju sekretovani proteini koji deluju na parakrin način, ali identitet ovih faktora je uglavnom bio nepoznat. Stoga su pronalazači sproveli bioinformatičku analizu sekretoma na ljudskim CXCR4+ ćelijama koštane srži kako bi identifikovali nove sekretovane proteine koji kontrolišu zarastanje infarkta i pokazuju terapeutski potencijal nakon AMI.

[0004] Ove studije su identifikovale dva različita polipeptida koji ispoljavaju pro-angiogene i/ili citoprotektivne efekte, koje su pronalazači nazvali proteinima Faktor 1 i Faktor 2.

[0005] Oba faktora su opisana u nekoliko naučnih publikacija koje se odnose na biološki kontekst koji ne obuhvata pro-angiogene i/ili citoprotektivne efekte ovih faktora u netransformisanim ćelijama ili netransformisanim tkivima. Nijedna od studija ne otkriva dokaze za funkciju ovih faktora ili čak nagoveštaj značajne korelacije nekog od faktora sa bolešću ili stanjem koje je isključivo povezano sa netransformisanim ćelijama ili tkivima.

[0006] Aminokiselinska sekvenca humanog Faktora 1 kodirana je u otvorenom čitačkom okviru 10 na ljudskom hromozomu 19 (C19Orf10). Protein je opisan 2007. godine u proteom-analizi takozvanih fibroblastima sličnih sinoviocita (FLS-ćelije) kao novi sekretovani faktor u sinovijumu. Pretpostavljena je korelacija između sekrecije proteina i inflamatornih bolesti zglobova bez ikakvih eksperimentalnih ili statističkih dokaza (Weiler i dr., Arthritis Research and Therapy 2007, Identifikacija i karakterizacija novog proteina, c19orf10, u sinovijumu). Odgovarajuća patentna prijava tvrdi da je protein terapeutski agens za lečenje zglobova i za dijagnozu tkiva koje prolazi kroz promenjeni rast kao i praćenje promena u tkivu (US 2008/0004232 A1, Karakterizacija c19orf10, novog sinovijalnog proteina). Druga naučna publikacija opisuje povećanu ekspresiju proteina u ćelijama hepatocelularnog karcinoma (Sunagozaka i dr., International Journal of Cancer, 2010, Identifikacija sekretornog proteina c19orf10 aktiviranog u hepatocelularnom karcinomu). Rekombinantni protein pokazao je efekat koji pojačava proliferaciju na kultivisanim ćelijama hepatocelularnog karcinoma. Napomenuto je da je C19Orf10 takođe bio nazivan IL-25, IL-27 i IL-27W jer se prvobitno smatrao interleukinom. Međutim, termini "IL-25" i "IL-27" korišćeni su nekonzistentno u stručnoj literaturi i označavali su različite proteine. Na primer, US 2004/0185049 se odnosi na protein kao IL-27 i otkriva njegovu upotrebu u modulaciji imunološkog odgovora. Ovaj protein je strukturno različit od Faktora 1 (uporediti aminokiselinsku sekvencu Faktora 1 prema SEKV ID BR: 1 sa aminokiselinskom sekvencom "IL-27" prema UniProt: Q8NEV9). Slično, EP 2130547 A1 se odnosi na protein kao IL-25 i otkriva njegovu upotrebu u lečenju inflamacije. Ovaj protein je takođe bio nazivan u stručnoj literaturi kao IL-17E i strukturno je različit od Faktora 1 (uporediti aminokiselinsku sekvencu Faktora 1 prema SEKV ID BR: 1 sa aminokiselinskom sekvencom "IL-25" prema UniProt: Q9H293).

[0007] Aminokiselinska sekvenca humanog Faktora 2 kodirana je u otvorenom čitačkom okviru 63 na ljudskom hromozomu 19 (C19Orf63). Protein je opisan 2009. godine kao novi sekretovani faktor INM02 (Wang i sar., Journal of Endocrinology 2009, Molekularno kloniranje novog sekretovanog peptida, INM02, i regulacija njegove ekspresije glukozom). Prisustvo proteina pokazano je u humanom serumu pomoću poliklonskih antitela. Dalje, pokazana je korelacija između ekspresije proteina u kultivisanim MIN6 (beta-ćelije) kao i u izolovanim pankreatičnim ostrvcima pacova i koncentracije glukoze u medijumu. Analiza korelacije između dijabetesa i ekspresije INM2 nije dala značajne rezultate. Odgovarajuća patentna prijava tvrdi proizvodnju poliklonskih antitela protiv proteina i njihovu upotrebu za lečenje dijabetesa melitusa (CN 200910055490, Novo poliklonsko antitelo sekretornog peptida INM02 i metoda pripreme istog).

[0008] Druga naučna publikacija opisuje protein kao novi sekretovani faktor hHSS1 (sekretovani humani hematopoetski signal koji sadrži peptid) (Junes-Gill i dr., J Neurooncol, 2011, hHSS1: novi sekretovani faktor i supresor rasta glioma lociran na hromozomu 19q13.33). Objavljeni podaci pokazuju ekspresiju hHSS1 u matičnim ćelijama hematopoetskog sistema i sugerišu funkciju kao tumor-supresor u genezi određenih tumora mozga (glioma). Odgovarajuća patentna prijava tvrdi upotrebu hHSS1 u lečenju tumora mozga (WO2011/094446 A1, Metod za lečenje raka mozga koristeći novi gen supresora tumora i sekretovani faktor).

[0009] US 2004/185049 A1 se odnosi na metode za modulaciju imunološkog odgovora kod životinja primenom agensa koji interaguje sa WSX-1 receptorom na CD-4+ i CD-8+ T ćelijama. Ova patentna prijava se ne odnosi na protein SEKV ID BR: 1 ili 2 kako je ovde otkriveno.

[0010] EP 2130547 A1 se odnosi na lečenje bolesti povezanih sa inflamatornim citokinskim odgovorom koji proizlazi iz CD-14+ ćelija i pokazuje da monociti reaguju na IL-25 smanjujući ekspresiju inflamatornih citokina indukovanih različitim inflamatornim stimulusima. Ova patentna prijava se ne odnosi na protein SEQ ID NO: 1 ili 2 kako je ovde otkriveno.

[0011] WO 02/081681 A1 ne otkriva nikakve biološke podatke o navedenim indikacijama i pretpostavljena sposobnost za pojačavanje proliferacije limfoidnih ćelija kasnije nije pokazana kao reproduktivna.

[0012] KR 2012/0095063 se odnosi na sastav koji obuhvata p53 i IL-27 za upotrebu u sprečavanju ili lečenju imunskih bolesti. Protein IL-27 koji se koristi nema sličnost sa predmetnim SEQ ID NO: 1.

[0013] US 2004/214229 otkriva peptid identifikovan nakon pokretanja veštačke sepse kod babuna, ali ne otkriva nikakve eksperimentalne podatke o bilo kojoj medicinskoj primeni navedenog peptida.

[0014] WO 98/11217 A1 otkriva proteine koji imaju sekretorne signalne sekvence, koje se navodno mogu koristiti za veliki broj primena. Međutim, ova publikacija se ne poklapa sa polipeptidom predmetnog SEQ ID NO: 1 jer otkriva pretpostavljeni signal koji je analogan KDEL za navedeni protein.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0015] Pronalazak je definisan u priloženom setu zahteva. Konkretno, u prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili fragment ili varijantu iste za upotrebu kao lek. Navedeni fragment ili varijanta ima najmanje 90% podudarnost sa SEQ ID NO: 1 preko cele dužine SEQ ID NO: 1, a fragment ili varijanta pokazuje anti-apoptotički potencijal i štiti ćelije ili tkivo od apoptoze, pri čemu je antiapoptotički potencijal najmanje 50% od onog koji ima protein sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 1.

[0016] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju proteine prema prvom aspektu za upotrebu kao lek.

[0017] U trećem aspektu, pronalazak obezbeđuje vektore koji sadrže nukleinsku kiselinu iz drugog aspekta za upotrebu kao lek.

[0018] U četvrtom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije za upotrebu kao lek, a navedena kompozicija sadrži protein za upotrebu kao što je ovde definisano, nukleinsku kiselinu za upotrebu kao što je ovde definisano ili vektor za upotrebu kao što je ovde definisano, i opcionalno odgovarajući farmaceutski pomoćni sastojak.

[0019] Drugi aspekti i rešenja su otkriveni u priloženom setu zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020]

Slika 1: Endotelne ćelije koronarne arterije kod ljudi (HCAEC) i endotelne ćelije ljudske pupčane vene (HUVEC) kultivisane su 24 sata u minimalnom medijumu u odsustvu (kontrola) ili prisustvu 10% FCS, humanog rekombinantnog VEGF-A (R&D Systems), ili različitih koncentracija rekombinantnog humanog Faktora 1 (aminokiselinska sekvenca prema SEQ ID NO: 2) ili Faktora 2 (aminokiselinska sekvenca prema SEQ ID NO: 4), kao što je navedeno. (A) Proliferacija HCAEC-a merena je inkorporacijom bromodeoksiuridina. (B) Migracija HCAEC-a je procenjena nakon povrede monosloja endotelnih ćelija pipetom. (C) Formiranje mreže HUVEC-a procenjeno je kod ćelija kultivisanih na Matrigelu sa smanjenim faktorima rasta. N = 3-5 nezavisnih eksperimenata po uslovu; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 u odnosu na kontrolu.

Slika 2: Ventrikularni kardiomiociti izolovani su od Sprague-Dawley pacova starih 1-3 dana pomoću centrifugiranja na gradijentu gustine Percoll-a. Kardiomiociti su izloženi simuliranoj ishemiji 180 minuta (medijum bez glukoze koji sadrži 2-deoksiglukoze u atmosferi sa 5% CO2/95% N2) praćeno simuliranom reperfuzijom od 60 minuta (povratak u medijum koji sadrži glukozu sa 5% CO2/95% sobnog vazduha) u odsustvu (kontrola) ili prisustvu rekombinantnog humanog GDF-15 ili različitih koncentracija rekombinantnog mišijeg Faktora 1 (aminokiselinska sekvenca prema SEQ ID NO: 13), kao što je navedeno. Smrt ćelija je procenjena pomoću TdT-posredovanog in situ označavanja krajeva (TUNEL). N = 3 nezavisna eksperimenta po uslovu; *P < 0,05 u odnosu na kontrolu.

Slika 3: cDNK mišjeg Faktora 1 ili Faktora 2 (nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 7 i 10) su klonirane u adenoviruse sa smanjenom sposobnošću replikacije. Kao kontrola je korišćen adenovirus sa smanjenom sposobnošću replikacije koji kodira beta-galaktozidazu (lacZ). Muški C57BL/6 miševi stari 10-12 nedelja su anestezirani i ventilirani izofluranom, a zatim podvrgnuti trajnoj ligaciji leve prednje descendentne koronarne arterije (LAD). Virusi su ubrizgani u levu komoru (LV) odmah nakon ligacije LAD-a. (A) Sistolička funkcija leve komore (promena frakcione površine, FAC) je procenjena transtorakalnom ehokardiografijom 28 dana nakon ligacije LAD-a. (B) Gustina kapilara pozitivnih na izolektin u zoni graničnog infarkta kvantifikovana je fluorescentnom mikroskopijom 28 dana nakon ligacije LAD-a. *P < 0,05, **P < 0,01 u poređenju sa Ad. lacZ kontrolom.

Slika 4: Muški C57BL/6 miševi stari 10-12 nedelja su anestezirani i ventilirani izofluranom i podvrgnuti privremenoj ligaciji leve prednje descendentne koronarne arterije na 1 sat, nakon čega je usledila reperfuzija tokom 28 dana. Miševi su primili jednu potkožnu (s.c.) injekciju rekombinantnog mišjeg Faktora 1 (aminokiselinska sekvenca prema SEQ ID NO: 13) ili Faktora 2 (aminokiselinska sekvenca prema SEQ ID NO: 24) u vreme reperfuzije. Nakon toga usledila je kontinuirana 7-dnevna s.c. infuzija rekombinantnog Faktora 1 ili Faktora 2. Kontrolni miševi su infuzirani PBS-om. (A) Sistolička funkcija leve komore (promena frakcione površine, FAC) procenjena je transtorakalnom ehokardiografijom 28 dana nakon reperfuzije. (B) Gustina kapilara pozitivnih na izolektin u zoni graničnog infarkta kvantifikovana je fluorescentnom mikroskopijom 28 dana nakon reperfuzije. *P < 0,05, **P < 0,01 u poređenju sa PBS kontrolom.

Slika 5: Muški C57BL/6 miševi stari 10-12 nedelja su anestezirani i ventilirani izofluranom (1-2%) i podvrgnuti privremenoj ligaciji leve prednje descendentne koronarne arterije na 1 sat, nakon čega je usledila reperfuzija tokom 28 dana. Miševi su primili jednu potkožnu injekciju rekombinantnog mišjeg Faktora 1 ili Faktora 2 (SEQ ID NO: 13 i 24, respektivno) u vreme reperfuzije (PBS je ubrizgan u kontrolne miševe). Nakon toga usledila je kontinuirana 7-dnevna s.c. infuzija rekombinantnog Faktora 1 ili Faktora 2. Kontrolni miševi su infuzirani PBS-om. Miševi su pregledani svakodnevno tokom 28 dana kako bi se procenilo preživljavanje nakon infarkta.

Slika 6: Sekvence homologne proteinu kodiranom ljudskim genom C19Orf10 tražene su pomoću BLASTP algoritma. Od identifikovanih sekvenci, izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i po jedan primer iz vodozemaca, ptica i riba. Izabrane aminokiselinske sekvence su poravnate korišćenjem CLUSTALW2 algoritma. Identiteti među svim poravnatim vrstama označeni su sa "*", najviše očuvane pozicije aminokiselina, tj. koje pokazuju samo konzervativne zamene, označene su sa ":", a visoko očuvane pozicije aminokiselina označene su sa ".".

Slika 7: Sekvence homologne proteinu kodiranom ljudskim genom C19Orf10 tražene su pomoću BLASTP algoritma. Od identifikovanih sekvenci, izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i po jedan primer iz vodozemaca, ptica i riba. Izabrane aminokiselinske sekvence sisara su poravnate pomoću CLUSTALW2 algoritma. Identiteti među svim poravnatim vrstama označeni su sa "*", najviše očuvane pozicije aminokiselina, tj. koje pokazuju samo konzervativne zamene, označene su sa ":", a visoko očuvane pozicije aminokiselina označene su sa ".".

Slika 8: Sekvence homologne proteinu kodiranom splice varijantom HSS 1 ljudskog gena C19Orf63 tražene su pomoću BLASTP algoritma. Od identifikovanih sekvenci, izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i po jedna sekvenca iz vodozemaca i riba. Izabrane aminokiselinske sekvence su poravnate pomoću CLUSTALW2 algoritma.

Identiteti među svim poravnatim vrstama označeni su sa "*", najviše očuvane pozicije aminokiselina, tj. koje pokazuju samo konzervativne zamene, označene su sa ":", a visoko Rčuvane pozicije aminokiselina označene su sa ".".

Slika 9: Sekvence homologne proteinu kodiranom splice varijantom HSS 1 ljudskog gena C19Orf63 tražene su pomoću BLASTP algoritma. Od identifikovanih sekvenci, izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i po jedna sekvenca iz vodozemaca i riba. Izabrane aminokiselinske sekvence sisara su poravnate pomoću CLUSTALW2 algoritma. Identiteti među svim poravnatim vrstama označeni su sa "*", najviše očuvane pozicije aminokiselina, tj. koje pokazuju samo konzervativne zamene, označene su sa ":", a visoko Rčuvane pozicije aminokiselina označene su sa ".".

Slika 10: Sekvence homologne proteinu kodiranom splice varijantom HSM1 ljudskog gena C19Orf63 tražene su pomoću BLASTP algoritma. Od identifikovanih sekvenci, izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i po jedna sekvenca iz vodozemaca i riba. Izabrane aminokiselinske sekvence su poravnate pomoću CLUSTALW2 algoritma.

Slika 11: Sekvence homologne proteinu kodiranom splice varijantom HSM1 ljudskog gena C19Orf63 tražene su pomoću BLASTP algoritma. Od identifikovanih sekvenci, izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i po jedna sekvenca iz vodozemaca i riba. Izabrane aminokiselinske sekvence sisara su poravnate pomoću CLUSTALW2 algoritma. Identiteti među svim poravnatim vrstama označeni su sa "*", najviše očuvane pozicije aminokiselina, tj. koje pokazuju samo konzervativne zamene, označene su sa ":", a visoko Rčuvane pozicije aminokiselina označene su sa ".".

Slika 12: Prikazuje efekat specifičnih antitela za Faktore 1 i 2 na proliferaciju HCAEC-a stimulisanih rekombinantnim Faktorom 1 (panel A) i rekombinantnim Faktorom 2 (panel B). Podaci su dati kao srednja vrednost ± SEM iz 3-6 eksperimenata. Panel A: #P<0,05, ##P<0,01 u poređenju sa nestimulisanom kontrolom (kolona s leve strane), *P<0,05, **P<0,01 u poređenju sa Faktorom 1 bez antitela; Panel B: ##P<0,01 u poređenju sa nestimulisanom kontrolom (kolona s krajnje leve strane), *P<0,05, **P<0,01 u poređenju sa Faktorom 2 bez antitela.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Pre nego što se predmetni pronalazak detaljno opiše u nastavku, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene metodologije, protokole i reagense opisane ovde, jer oni mogu varirati. Takođe, treba razumeti da je terminologija koja se koristi ovde namenjena isključivo za opisivanje određenih primera i nije namenjena da ograniči obim predmetnog pronalaska, koji će biti ograničen samo priloženim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja koja su uobičajena za stručne osobe u ovoj oblasti.

DEFINICIJE

[0022] Poželjno, termini korišćeni ovde su definisani kao u "Višejezičnom rečniku biotehnoloških termina: (IUPAC preporuke)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, i H. Kölbl, ur., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Švajcarska, (1995).

[0023] Za primenu predmetnog pronalaska, osim ako nije drugačije navedeno, koriste se konvencionalne metode hemije, biohemije, ćelijske biologije i rekombinantne DNK tehnike, koje su objašnjene u literaturi iz ove oblasti (vidi, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje, ur. J. Sambrook i dr., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989). Takođe se koriste konvencionalne metode kliničke kardiologije koje su objašnjene u literaturi iz ove oblasti (vidi, npr., Braumvald's Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, 9. izdanje, ur. P. Libby i dr., Saunders Elsevier Philadelphia, 2011).

[0024] Kroz ovaj opis i priložene zahteve, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrži" i varijacije poput "sadrži" i "koji sadrže" podrazumevaju uključivanje navedenog elementa ili koraka ili grupe elemenata ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog elementa ili koraka ili grupe elemenata ili koraka. Kako se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici u jednini "jedan", "neki" i "taj" uključuju upućivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0025] Nukleinske kiseline se shvataju kao polimerni makromolekuli nastali od nukleotidnih monomera. Nukleotidni monomeri se sastoje od nukleobaze, šećera sa pet ugljenikovih atoma (kao što su, ali nisu ograničeni na ribozu ili 2'-deoksiribozu) i jedne do tri fosfatne grupe.

Tipično, polinukleotid se formira putem fosfodiestarskih veza između pojedinačnih nukleotidnih monomera. U kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na nukleinske kiseline uključujući, ali ne ograničavajući se na ribonukleinsku kiselinu (RNK) i dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK). Pojmovi "polinukleotid" i "nukleinska kiselina" se ovde koriste kao sinonimi.

[0026] Termin „otvoreni čitački okvir“ (ORF) odnosi se na sekvencu nukleotida koja se može prevesti u aminokiseline. Tipično, takav ORF sadrži startni kodon, naredni region koji obično ima dužinu koja je multiplikacija 3 nukleotida, ali ne sadrži stop kodon (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA ili UGA) u datom čitačkom okviru. ORF se obično pojavljuje prirodno ili se veštački konstruiše, tj. putem genetske tehnologije. ORF kodira protein gde aminokiseline u koje se može prevesti formiraju lanac povezan peptidnim vezama.

[0027] Termini „protein“ i „polipeptid“ ovde se koriste kao sinonimi i odnose se na bilo koji lanac aminokiselina povezan peptidnim vezama, bez obzira na dužinu ili posttranslacionu modifikaciju. Proteini koji se mogu koristiti u ovom pronalasku (uključujući derivate proteina, varijante proteina, fragmente proteina, segmente proteina, epitope proteina i domene proteina) mogu se dodatno modifikovati hemijskim putem. To znači da takav hemijski modifikovan polipeptid sadrži i druge hemijske grupe osim 20 prirodnih aminokiselina. Primeri takvih drugih hemijskih grupa uključuju, bez ograničenja, glikozilovane i fosforilovane aminokiseline.

Hemijske modifikacije polipeptida mogu pružiti povoljnija svojstva u poređenju s izvornim polipeptidom, na primer jedno ili više poboljšanja stabilnosti, povećan biološki poluživot ili povećanu rastvorljivost u vodi. Hemijske modifikacije koje se mogu primeniti na varijante koje se koriste u ovom pronalasku uključuju, bez ograničenja: PEGilaciju, glikozilaciju izvornog neglikozilovanog polipeptida, kovalentno vezivanje za terapeutske male molekule, kao što su agonisti peptida 1 sličnog glukagonu, uključujući eksenatid, albiglutid, taspoglutid, inhibitore DPP4, inkretin i liraglutid, ili modifikaciju obrasca glikozilacije prisutne u izvornom polipeptidu. Takve hemijske modifikacije varijanti koje se mogu koristiti u ovom pronalasku mogu se pojaviti ko- ili posttranslaciono.

[0028] Termin „aminokiselina“ obuhvata prirodne aminokiseline kao i njihove derivate.

Hidrofobna nearomatična aminokiselina u kontekstu predmetnog pronalaska je poželjno svaka aminokiselina koja ima Kyte-Doolittle indeks hidrofobnosti viši od 0,5, još poželjnije viši od 1,0, a najpoželjnije viši od 1,5 i koja nije aromatična. Poželjno je da hidrofobna nearomatična aminokiselina u kontekstu predmetnog pronalaska bude izabrana iz grupe koja se sastoji od aminokiselina alanin (Kyte-Doolittle indeks hidrofobnosti 1,8), metionin (Kyte-Doolittle indeks hidrofobnosti 1,9), izoleucin (Kyte-Doolittle indeks hidrofobnosti 4,5), leucin (Kyte-Doolittle indeks hidrofobnosti 3,8) i valin (Kyte-Doolittle indeks hidrofobnosti 4,2), ili njihovih derivata sa Kyte-Doolittle indeksom hidrofobnosti definisanim gore.

[0029] Termin „posttranslaciono“ koji se ovde koristi odnosi se na događaje koji se dešavaju nakon translacije nukleotidnog tripleta u aminokiselinu i formiranja peptidne veze sa prethodnom aminokiselinom u sekvenci. Takvi posttranslacioni događaji se mogu desiti nakon što je ceo polipeptid formiran ili već tokom procesa translacije na onim delovima polipeptida koji su već translirani. Posttranslacioni događaji obično menjaju ili modifikuju hemijska ili strukturna svojstva nastalog polipeptida. Primeri posttranslacionih događaja uključuju, ali se ne ograničavaju na, događaje kao što su glikozilacija ili fosforilacija aminokiselina, ili cepanje peptidnog lanca, npr. endopeptidazom.

[0030] Termin „kotranslaciono“ koji se ovde koristi odnosi se na događaje koji se dešavaju tokom procesa translacije nukleotidnog tripleta u lanac aminokiselina. Ti događaji obično menjaju ili modifikuju hemijska ili strukturna svojstva nastalog lanca aminokiselina. Primeri kotranslacionih događaja uključuju, ali se ne ograničavaju na događaje koji mogu potpuno zaustaviti proces translacije ili prekinuti formiranje peptidne veze, što rezultira u dva odvojena proizvoda translacije.

[0031] Termin „varijanta“ se ovde koristi da označi polipeptid koji se razlikuje u poređenju sa polipeptidom ili njegovim fragmentom od koga je izveden, zbog jedne ili više promena u aminokiselinskoj sekvenci. Polipeptid od koga je izvedena varijanta proteina poznat je i kao izvorni polipeptid. Isto tako, fragment od koga je izvedena varijanta fragmenta proteina poznat je kao izvorni fragment. Tipično, varijanta se veštački konstruiše, poželjno metodama genetske tehnologije. Tipično, izvorni polipeptid je protein divljeg tipa ili domen proteina divljeg tipa. Nadalje, varijante koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku mogu biti izvedene iz homologih, ortologih ili paralogih izvornog polipeptida ili iz veštački konstruisanih varijanti, pod uslovom da varijanta pokazuje bar jednu biološku aktivnost izvornog polipeptida. Promene u aminokiselinskoj sekvenci mogu biti zamene, umetanja, delecije, N-terminalne ili C-terminalne skraćenice, ili bilo koja kombinacija tih promena, koje se mogu pojaviti na jednoj ili više lokacija. Varijanta koja se može koristiti u predmetnom pronalasku pokazuje ukupno do 100 (do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 100) promena u aminokiselinskoj sekvenci (tj. zamene, umetanja, delecije, N-terminalne i/ili C-terminalne skraćenice). Zamene aminokiselina mogu biti konzervativne, polukonzervativne ili nekonzervativne. Varijanta koja se može koristiti u predmetnom pronalasku može se razlikovati od proteina ili domena od koga je izvedena po do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 zamena aminokiselina, poželjno konzervativnih izmena aminokiselina.

[0032] Tipične zamene su između alifatičnih aminokiselina, između aminokiselina sa alifatičnim hidroksilnim bočnim lancem, između aminokiselina sa kiselim ostatkom, između amida derivata, između aminokiselina sa baznim ostatkom ili aminokiselina sa aromatičnim ostatkom. Tipične polukonzervativne i konzervativne zamene su:

Aminokiseline Konzervativne supstitucije Polu-konzervativne A G; S; T N; V; C

C A; V; L M; I; F; G

D E; N; Q A; S; T; K; R; H

E D; Q; N A; S; T; K; R; H

F W; Y; L; M; H I; V; A

G A S; N; T; D; E; N; Q

H Y; F; K; R L; M; A

I V; L; M; A F; Y; W; G

K R; H D; E; N; Q; S; T; A

L M; I; V; A F; Y; W; H; C

M L; I; V; A F; Y; W; C;

N Q D; E; S; T; A; G; K; R

P V; I L; A; M; W; Y; S; T; C; F

Q N D; E; A; S; T; L; M; K; R

R K; H N; Q; S; T; D; E; A

S A; T; G; N D; E; R; K

T A; S; G; N; V D; E; R; K; I

V A; L; I M; T; C; N

W F; Y; H L; M; I; V; C

Y F; W; H L; M; I; V; C

[0033] Promena sa A, F, H, I, L, M, P, V, W ili Y na C je polukonzervativna ako novi cistein ostane kao slobodan tiol. Nadalje, stručnoj osobi će biti jasno da glicini na pozicijama koje zahtevaju prostor ne treba da budu supstituisani i da se P ne sme uvesti u delove proteina koji imaju alfa-helikalnu ili beta-pločastu strukturu.

[0034] Alternativno ili dodatno, „varijanta“, kako se ovde koristi, može se karakterisati određenim stepenom sličnosti sekvence sa izvornim polipeptidom ili izvornim polinukleotidom od kojeg je izvedena. Tačnije, varijanta proteina u kontekstu predmetnog pronalaska pokazuje najmanje 90% podudarnosti u sekvenci sa svojim izvornim polipeptidom. Termin „najmanje 90% podudarnosti u sekvenci“ koristi se kroz opis u vezi sa poređenjem sekvenci polipeptida i polinukleotida. Ovaj termin se poželjno odnosi na podudarnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% sa odgovarajućim referentnim polipeptidom ili sa odgovarajućim referentnim polinukleotidom.

[0035] Fragmenti proteina sadrže delecije aminokiselina, što može uključivati N-terminalne skraćenice, C-terminalne skraćenice ili interne delecije, ili bilo koju kombinaciju ovih. Takve varijante koje uključuju N-terminalne skraćenice, C-terminalne skraćenice i/ili interne delecije nazivaju se „fragmentima“ u kontekstu ove prijave. Fragment može biti prirodno prisutan (npr. splice varijante) ili se može veštački konstruisati, poželjno metodama genetske tehnologije. Poželjno je da fragment (ili varijanta s delecijom) ima deleciju od do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina na svom N-terminusu i/ili C-terminusu i/ili interno u poređenju sa izvornim polipeptidom, poželjno na svom N-terminusu, na svom N- i C-terminusu ili na svom C-terminusu.

[0036] U slučaju kada se upoređuju dve sekvence, a referentna sekvenca nije precizirana u poređenju sa kojom se treba izračunati procenat sličnosti sekvence, sličnost sekvence se izračunava u odnosu na dužu od dve sekvence koje se upoređuju, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0037] Sličnost nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci, tj. procenat podudarnosti sekvenci, može se utvrditi pomoću poravnanja sekvenci. Takva poravnanja mogu se izvesti koristeći nekoliko algoritama poznatih u stručnoj literaturi, poželjno matematički algoritam Karlina i Altschula (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), hmmalign (HMMER paket, http://hmmer.wustl.edu/) ili algoritam CLUSTAL (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res.22, 4673-80) ili algoritam CLUSTALW2 (Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948.), koji su dostupni npr. na http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html ili na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Poželjno je da se koristi algoritam CLUSTALW2 na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, pri čemu se koriste zadati parametri postavljeni na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html: Alignment type = Slow, protein weight matrix = Gonnet, gap open = 10, gap extension = 0.1 za opcije sporog uparivanja, protein weight matrix = Gonnet, gap open = 10, gap extension = 0.20, gap distances = 5, No end gaps = no, Output options: format = Aln w/numbers, Order = aligned.

[0038] Stepen podudarnosti sekvenci (sekvencno poklapanje) može se izračunati koristeći npr. BLAST, BLAT ili BlastZ (ili BlastX). Sličan algoritam je ugrađen u programe BLASTN i BLASTP Altschul-a i dr. (1990) J. Mol. Biol.215: 403-410. BLAST pretrage proteina se izvode pomoću programa BLASTP, dostupnog npr. na http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PA GE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome. Poželjni parametri algoritma koji se koriste su zadati parametri postavljeni na http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PA GE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome: Expect threshold = 10, word size = 3, max matches in a query range = 0, matrix = BLOSUM62, gap costs = Existence: 11 Extension: 1, compositional adjustments = conditional compositional score matrix adjustment zajedno sa bazom podataka neredundantnih proteinskih sekvenci (nr) kako bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne polipeptidima Faktora 1 i Faktora 2.

[0039] Za dobijanje poravnanja sa prekidima u svrhu poređenja koristi se Gapped BLAST, kao što je opisano u Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25: 3389-3402. Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST, koriste se zadati parametri odgovarajućih programa.

Analiza sekvencnog poklapanja može se dopuniti ustanovljenim tehnikama mapiranja homologije kao što su Shuffle-LAGAN (Brudno M.) ili Markovljeva slučajna polja. Kada se u ovoj prijavi pominju procenti podudarnosti sekvence, ovi procenti se izračunavaju u odnosu na celokupnu dužinu duže sekvence, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0040] Termin „ćelija domaćin“ koji se ovde koristi odnosi se na ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu iz ovog pronalaska (npr. plazmid ili virus). Takva ćelija domaćin može biti prokariotska (npr. bakterijska ćelija) ili eukariotska ćelija (npr. ćelija gljiva, biljaka ili životinja). ûelija može biti transformisana ili netransformisana. ûelija može biti izolovana, na primer u ćelijskoj kulturi ili deo tkiva, koje samo može biti izolovano ili deo složenije organizacije kao što je organ ili pojedinac.

[0041] Termini „Faktor 1“, „Faktor 1 protein“ ili „Faktor 1 polipeptid“ se koriste kao sinonimi i odnose se na protein naveden u NCBI referentnoj sekvenci NM_019107.3 (humani homolog), kao i na njegove homologe kod sisara, posebno kod miša ili pacova. Aminokiselinska sekvenca humanog homologa kodirana je u otvorenom čitačkom okviru 10 na ljudskom hromozomu 19 (C19Orf10). Poželjno je da Faktor 1 protein se odnosi na protein koji u osnovi sadrži ili se sastoji od ključnog segmenta humanog Faktora 1 sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 1. U još poželjnijoj varijanti, Faktor 1 protein ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2.

[0042] Termini „Faktor 2“, „Faktor 2 protein“ ili „Faktor 2 polipeptid“ se koriste kao sinonimi i odnose se na protein naveden u NCBI referentnoj sekvenci NM_175063.4 (humani homolog), kao i na njegove homologe kod sisara, posebno kod miša ili pacova. Aminokiselinska sekvenca humanog Faktora 2 kodirana je u otvorenom čitačkom okviru 63 na ljudskom hromozomu 19 (C19Orf63). Poželjno je da se Faktor 2 protein odnosi na protein koji u osnovi sadrži ili se sastoji od ključnog segmenta humanog Faktora 2 sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 3. Faktor 2 protein može imati aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 4 i 5, respektivno. Konkretno, Faktor 2 protein je sekretorni oblik, poželjno sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 4.

[0043] Termini „netransformisano tkivo“ ili „netransformisane ćelije“ odnose se na tkivo i ćelije koje pokazuju fiziološke parametre uporedive sa netumorskim ili nekancerogenim ćelijama ili tkivom. Takvi parametri su, na primer, ali nisu ograničeni na: kontrola ćelijskog ciklusa, stopa ćelijske deobe, inhibicija kontakta, rast bez oslonca ili metabolizam. Uporedive netumorske ili nekancerogene ćelije ili tkivo mogu biti zdravi, oštećeni ili bolesni.

[0044] Termin „zarastanje“ obuhvata regeneraciju i popravku živih ćelija, tkiva, organa i biološkog sistema u celini, kao i delimični ili potpuni povratak normalnog funkcionisanja. U slučaju tkiva, organa ili biološkog sistema u celini, to obuhvata proces kojim se ćelije u telu regenerišu i obnavljaju kako bi smanjile veličinu oštećenog ili nekrotičnog područja i zamenile ga novim živim tkivom. Zamena se može desiti, na primer, regeneracijom, pri čemu se nekrotične ćelije zamenjuju novim ćelijama koje formiraju slično tkivo kao što je izvorno bilo; ili popravkom, pri čemu se oštećeno tkivo zamenjuje ožiljnim tkivom. Kako regeneracija predstavlja proces koji rezultira delimičnim ili potpunim povratkom normalnog funkcionisanja, ona je poželjna varijanta u procesu zarastanja. Stoga, termin zarastanje u kontekstu ovog pronalaska obuhvata sve procese koje bi osoba stručna u oblasti povezala s ovim pojmom, ali bi poželjno trebalo podsticati regenerativne procese umesto procesa koji vode do stvaranja nefunkcionalnog tkiva, poput ožiljnog tkiva. Termin zarastanje u kontekstu predmetnog pronalaska takođe se poželjno odnosi na podsticanje proliferacije, migracije, formiranja mreže i angiogeneze.

[0045] Termin „povećanje proliferacije“ odnosi se na povećanje stope deobe ćelija jedne ćelije ili grupe ćelija u poređenju sa ćelijama ili grupama ćelija koje nisu tretirane proteinima, nukleinskim kiselinama, vektorima ili farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska. Dobro je poznato u stručnoj literaturi kako se meri stopa deobe ćelija, npr. brojanjem mitotskih ćelija pomoću FACS-a.

[0046] Termin „inhibicija apoptoze“ odnosi se na sposobnost proteina, nukleinskih kiselina, vektora ili farmaceutskih kompozicija iz pronalaska da spreče ćeliju ili grupu ćelija da uđu u apoptozu u uslovima u kojima kontrolne ćelije ili grupe ćelija ulaze u apoptozu. Osoba stručna u oblasti dobro zna kako da izmeri da li ćelija prolazi kroz apoptozu, npr. pomoću TUNEL testa.

[0047] Opis rešenja obuhvata dalje definicije i objašnjenja termina korišćenih u prijavi. Ovi opisi i definicije važe za celu prijavu, osim ako nije drugačije navedeno.

REŠENJA

[0048] U nastavku će biti opisani elementi iz predmetnog pronalaska. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima, ali treba razumeti da se mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kojem broju kako bi se kreirali dodatni primeri. Različiti opisani primeri i preferirani oblici ne treba da se tumače kao ograničenje predmetnog pronalaska samo na eksplicitno opisane oblike. Ovaj opis treba shvatiti kao podršku i obuhvatanje rešenja koja kombinuju eksplicitno opisana rešenja sa bilo kojim brojem objavljenih i/ili preferiranih elemenata. Dalje, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati objavljenim opisom ove prijave, osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.

[0049] U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje protein koji sadrži Faktor 1 protein sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 1 ili fragment ili varijantu toga, koji ima najmanje 90% podudarnosti sekvenci sa SEQ ID NO: 1 preko cele dužine SEQ ID NO: 1, za upotrebu kao lek. U posebno poželjnom rešenju iz pronalaska, protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili njen fragment. Poželjno je da protein ima najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% podudarnosti sa SEQ ID NO: 1.

[0050] U poželjnom rešenju iz ovog aspekta pronalaska, protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. Preferirani fragmenti SEQ ID NO: 2 ne sadrže N-terminalni signalni sekvens MAAPSGGWNGVGASLWAALLLGAVALRPAEA (SEQ ID NO: 35). Osoba stručna u oblasti može bez preteranog napora odlučiti koje pozicije u izvornom polipeptidu mogu biti mutirane do koje mere i koje pozicije moraju biti očuvane kako bi se sačuvala funkcionalnost polipeptida. Takve informacije se, na primer, mogu dobiti iz homolognih sekvenci koje se mogu identifikovati, poravnati i analizirati pomoću bioinformatičkih metoda dobro poznatih u struci. Takve analize su primereno opisane u primeru 7, a rezultati su prikazani na Slikama 6 i 7.

Mutacije se poželjno uvode u one regione proteina, koji nisu potpuno očuvani između vrsta, poželjno sisara, tj. mutirane su jedna ili više tih aminokiselinskih pozicija koje nisu označene sa "*". Prema jednom specifičnom primeru, menjaju se samo one aminokiseline koje nisu potpuno Rčuvane (označene sa "*") ili su očuvane u manjem obimu (označene sa ":" ili "."). U posebno poželjnom rešenju iz pronalaska, protein Faktor 1 sadrži, suštinski se sastoji ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2.

[0051] Takve mutacije mogu biti prisutne u punoj dužini proteina prema SEQ ID NO: 2 ili u proteinu koji nema N-terminalni signalnu sekvencu prema SEQ ID NO: 1.

[0052] Varijantama sa N-terminalnom delecijom pored N-terminalnog signala mogu nedostajati jedna ili više aminokiselina od pozicije aminokiseline 32 do 55 (na osnovu SEQ ID NO: 2), tj. iz N-terminalno očuvane regije. Shodno tome, N-terminus izbrisanog proteina Faktor 1 može biti na poziciji 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55. ili 56 dodatno ili alternativno izbrisanom proteinu Faktor 1 može nedostajati jedna ili više pozicija aminokiselina 146 do 173 (na osnovu SEQ ID NO: 2, tj. iz C-terminalno očuvane regije). Shodno tome, C-terminus izbrisanog proteina Faktor 1 može biti na poziciji 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, ili 172.

[0053] Protein iz prvog aspekta predmetnog pronalaska može dalje sadržati dodatne aminokiselinske sekvence, npr. za stabilizovanje ili prečišćavanje rezultujućeg proteina. Primeri takvih aminokiselina su His6-tagovi (SEQ ID NO: 36), myc-tagovi, ili FLAG-tagovi.

[0054] Može biti poželjno mutirati mesta sečenja proteazom unutar proteina iz prvog aspekta predmetnog pronalaska kako bi se stabilizovao protein (vidi Segers et al. Circulation 2007, 2011). Osoba stručna u oblasti zna kako odrediti potencijalna mesta sečenja proteolitičkog sečnja unutar proteina. Na primer, sekvence proteina mogu biti poslate na web stranice koje obezbeđuju takvu analizu, kao što su npr. http://web.expasy.org/peptide_cutter/ ili http://pmap.burnham.org/proteases. Ako se sekvenca proteina prema SEQ ID NO: 2 pošalje na http://web.expasy.org/peptide_cutter/, određuju se sledeća mesta sečenja sa nižom frekvencijom (manje od 10):

Tabela 1

Proteaza 8čestalost Pozicija (sa referencom na SEQ ID NO: 2) Arg-C proteinaza 7 27 43 96 113130 151 170

Asp-N endopeptidaza 4 40 58 85 132

Clostripain 7 27 43 96 113130 151 170

LysN 9 59 99 108124 136 144 155 160 166 Prolin-endopeptidaza 4 2844 97 152

[0055] Ova mesta mogu biti promenjena da bi se uklonila sekvenca prepoznavanja/sečenja identifikovane proteaze kako bi se povećalo poluvreme proteina u serumu.

[0056] Faktor 1 i Faktor 2 su pokazali aktivnost koja pojačava proliferaciju, posebno u pogledu pojačavanja angiogeneze. Protein prema prvom aspektu može se koristiti za pojačavanje proliferacije netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija, poželjno angiogeneze. Stoga, poželjno je da se Faktor 1 koristi u lečenju bolesti koje mogu imati koristi od pojačane angiogeneze. Nekoliko primera takvih bolesti dodatno je objašnjeno u nastavku.

[0057] Pojačavanje proliferacije uključuje svaki stepen pojačanja proliferacije ćelije ili tkiva u poređenju sa kontrolnom ćelijom ili kontrolnim tkivom bez primene proteina iz pronalaska. Proliferacija ćelije može, na primer, biti merena kroz inkorporaciju bromdeoksiuridina kako je opisano u primeru 2. Pojačana proliferacija tkiva može, na primer, biti određena merenjem povećanja težine ili veličine odgovarajućeg tkiva kao i pomoću histoloških metoda. Takve metode su dobro poznate u struci jer mnoge od njih su standardne metode za kliničku primenu.

[0058] U još jednom poželjnom rešenju, protein prema prvom aspektu je za upotrebu u lečenju indikacija navedenih u zahtevu 2.

[0059] Protein prema prvom aspektu može takođe biti korišćen za inhibiciju apoptoze netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija. Dakle, protein iz predmetnog pronalaska pokazuje anti-apoptotički potencijal i štiti ćelije ili tkivo od apoptotske smrti ćelija. „Zaštita“ ili „citoprotektivni efekat“ u ovom kontekstu znači da je stepen apoptotske smrti ćelija smanjen u ćelijama tretiranim proteinom Faktor 1 prema aktuelnom pronalasku u poređenju sa kontrolom za najmanje 20%, poželjno za najmanje 30%, još poželjnije za najmanje 40%, i još poželjnije za najmanje 50%, i najpoželjnije za najmanje 60%. Osoba stručna u oblasti je sposobna da proceni smrt ćelija, na primer pomoću in situ TdT-posredovane dUTP nik kraj-etiketiranja (TUNEL) kako je opisano u primeru 3. Drugi pokazatelji za apoptozu su, na primer, fragmentirani genom koji može biti ispitan, npr. pomoću DNK laddering (Liu et al., 2005, Circulation 111:90-96), oslobađanje citohroma-c, ili aktivnost kaspaze 3 (Most et al., 2003, J. Biol. Chem.278:48404-48412). Anti-apoptotički efekat peptida može biti procenjen in vivo u nekom eksperimentalnom modelu životinje sa srčanom insuficijencijom. Na primer, miševi sa postishemijskom kontraktilnom disfunkcijom mogu biti tretirani proteinom, a srčano tkivo tretiranih i kontrolnih miševa može biti procenjeno za stepen apoptotskih kardiomiocita. Peptid se može poželjno davati parenteralno, kao što je intraperitonealno, intravenski ili potkožno. Fragmenti i varijante proteina Faktor 1 uključeni u ovaj pronalazak pokazuju anti-apoptotički potencijal i štite ćelije ili tkivo od apoptotske smrti ćelija koja je najmanje 50%, poželjno 60%, poželjno 70%, poželjno 80%, poželjno 90% i najpoželjnije najmanje 100% od one kod proteina sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 1.

[0060] Takođe je otkriven, ali ne čini deo pronalaska, protein koji sadrži, sastoji se uglavnom ili potpuno sastoji od proteina Faktor 2, sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 3 ili fragmentom ili varijantom toga, koji ima najmanje 80% podudarnosti sekvenci sa SEQ ID NO: 3 za upotrebu u pojačavanju proliferacije i/ili zarastanja netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija. Protein Faktor 2 može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, fragment ili varijantu toga, koji ima najmanje 80% podudarnosti sa SEQ ID NO: 3. Osoba stručna u oblasti može bez preteranog napora odlučiti koje pozicije u polipeptidu mogu biti mutirane do koje mere i koje pozicije moraju biti očuvane kako bi se sačuvala funkcionalnost polipeptida. Takve informacije se, na primer, mogu dobiti iz homolognih sekvenci koje se mogu identifikovati, poravnati i analizirati pomoću bioinformatičkih metoda dobro poznatih u struci. Odnosni protein može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili njen fragment. Poželjno je da protein ima najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% podudarnosti sekvenci sa SEQ ID NO: 3.

[0061] Ovaj protein može dalje sadržati dodatne aminokiselinske sekvence, na primer, za stabilizaciju ili prečišćavanje rezultujućeg proteina.

[0062] Poželjno je mutirati mesta sečenja proteaza unutar proteina prema prvom aspektu iz predmetnog pronalaska kako bi se stabilizovao protein. Odgovarajuća mesta proteolitičkog sečenja mogu se identifikovati kako je opisano iznad.

[0063] Takođe je otkriven, ali ne čini deo predmetnog pronalaska, protein koji sadrži, uglavnom se sastoji ili potpuno sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, fragmenta ili varijante toga, koji ima najmanje 80% identiteta sa SEQ ID NO: 4. Preferirani fragmenti ne sadrže Nterminalne signalne sekvence MAAASAGATRLLLLLLMAVAA PSRARG' (SEQ ID NO: 37). Osoba stručna u oblasti može bez preteranog napora odlučiti koje pozicije u polipeptidu mogu biti mutirane do koje mere i koje pozicije moraju biti očuvane kako bi se sačuvala funkcionalnost polipeptida. Takve informacije se, na primer, mogu dobiti iz homolognih sekvenci koje se mogu identifikovati, poravnati i analizirati pomoću bioinformatičkih metoda dobro poznatih u struci. Takve analize su primereno opisane u primeru 8, a rezultati su prikazani na Slikama 8 i 9.

Mutacije se poželjno uvode samo u one regione proteina, koji nisu potpuno očuvani između vrsta, poželjno sisara, tj. mutirane su jedna ili više onih aminokiselinskih pozicija koje nisu označene sa "*". Prema jednom specifičnom primeru, menjaju se samo aminokiseline koje nisu potpuno očuvane (označene sa "*") ili su očuvane u manjoj meri (označene ili sa ":" ili sa "."). Posebno je poželjno da protein Faktor 2 obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili njen fragment. Poželjno je da protein ima najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identiteta sa SEQ ID NO: 4.

[0064] Takve mutacije mogu biti prisutne u celokupnom proteinu prema SEQ ID NO: 4 ili u proteinu koji nema N-terminalnu signalnu sekvencu.

[0065] N-terminalnom varijantama sa delecijom pored N-terminalnog signala mogu nedostajati jedna ili više aminokiselina od aminokiselinske pozicije 27 do 73 (na osnovu SEQ ID NO: 4), tj. iz N-terminalno očuvane regije. Shodno tome, N-terminus izbrisanog proteina Faktor 2 može biti na poziciji 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ili 56 dodatno, ili alternativno izbrisanom proteinu Faktor 1 može nedostajati jedna ili više od aminokiselinskih pozicija 190 do 254 (na osnovu SEQ ID NO: 4, tj. iz C-terminalno očuvane regije). Shodno tome, C-terminus izbrisanog proteina Faktor 2 može biti na poziciji 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, ili 253.

[0066] Takođe je otkriven, ali ne čini deo predmetnog pronalaska, protein koji sadrži, uglavnom se sastoji ili potpuno sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 5, fragmenta ili varijante toga, koji ima najmanje 80% identiteta sa SEQ ID NO: 5. Poželjni fragmenti ne sadrže Nterminalne signalne sekvence MAAASAGATRLLLLLLMAVAAPSRARG (SEQ ID NO: 37). Osoba stručna u oblasti može bez preteranog napora odlučiti koje pozicije u polipeptidu mogu biti mutirane do koje mere i koje pozicije moraju biti očuvane kako bi se sačuvala funkcionalnost polipeptida. Takve informacije se, na primer, mogu dobiti iz homolognih sekvenci koje se mogu identifikovati, poravnati i analizirati pomoću bioinformatičkih metoda dobro poznatih u struci. Takve analize su primereno opisane u primeru 9, a rezultati su prikazani na Slikama 10 i 11. Mutacije se poželjno uvode samo u one regione proteina, koji nisu potpuno očuvani između vrsta, poželjno sisara, tj. mutirane su jedna ili više onih aminokiselinskih pozicija koje nisu označene sa "*". Prema jednom specifičnom primeru, menjaju se samo aminokiseline koje nisu potpuno očuvane (označene sa "*") ili su očuvane u manjoj meri (označene ili sa ":" ili sa "."). Posebno je poželjno da protein Faktor 2 obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 ili njen fragment. Poželjno je da protein ima najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identiteta sa SEQ ID NO: 5.

[0067] Takve mutacije mogu biti prisutne u celokupnom proteinu prema SEQ ID NO: 5 ili u proteinu koji nema N-terminalne signalne sekvence.

[0068] N-terminalnim varijantama s delecijom pored N-terminalnog signala mogu nedostajati jedna ili više aminokiselina od aminokiselinske pozicije 27 do 73 (na osnovu SEQ ID NO: 4), tj. iz N-terminalno očuvane regije. Shodno tome, N-terminus izbrisanog proteina Faktor 2 može biti na poziciji 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55. ili 56 dodatno, ili alternativno izbrisanom proteinu Faktor 1 može nedostajati jedna ili više od aminokiselinskih pozicija 190 do 262 (na osnovu SEQ ID NO: 4), tj. iz C-terminalno očuvane regije. Shodno tome, C-terminus izbrisanog proteina Faktor 2 može biti na poziciji 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, ili 261.

[0069] Fragmenti i varijante proteina otkriveni ovde pokazuju anti-apoptotički potencijal i štite ćelije ili tkivo od apoptotske smrti ćelija koja je najmanje 50%, poželjno 60%, poželjno 70%, poželjno 80%, poželjno 90% i najpoželjnije najmanje 100% od one kod proteina sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 5, najpoželjnije SEQ ID NO: 3.

[0070] Protein se može koristiti za pojačavanje proliferacije netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija. Pojačavanje proliferacije uključuje svaki stepen poboljšanja u poređenju sa kontrolnom ćelijom ili tkivom bez primene proteina. Eksperimentalne metode za merenje proliferacije su opisane iznad. Merenje proliferacije za takav protein može se proceniti ugradnjom bromdeoksiuridina, što je takođe opisano u primeru 2.

[0071] Protein se može koristiti za zarastanje netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija. Protein može ispoljiti obe gore navedene funkcije, tj. pojačavanje proliferacije i zarastanje netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija.

[0072] Protein iz prvog aspekta može se primeniti in vivo, ex vivo ili in vitro, poželjno je in vivo. Jedan primer gde se protein iz prvog aspekta iz pronalaska primenjuje ex vivo ili in vitro je pojačavanje proliferacije i/ili zarastanja i/ili inhibicija apoptoze u svrhu inženjeringa tkiva gde se tkivo proizvodi za transplantaciju u nekog pojedinca. ûelije koje se koriste za inženjering tkiva mogu biti izvedene od istog pojedinca, ali takođe i od drugog pojedinca iste vrste ili druge vrste. Proces uklanjanja pomenutih ćelija ili tkiva i transplantacija novog tkiva u nekog pojedinca nije obuhvaćen pronalaskom.

[0073] Netransformisane ćelije mogu biti matične ćelije. Takve matične ćelije mogu biti embrionalne matične ćelije ili adultne matične ćelije, kao i progenitorske ćelije. ûelije mogu biti omnipotentne matične ćelije kao i pluripotentne matične ćelije.

[0074] Netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo mogu biti bolesni. Alternativno, netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo su oštećeni. Prema jednom primeru, netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo su oštećeni i bolesni.

[0075] Netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo mogu biti mišićne ćelije ili mišićno tkivo. Mišić obuhvata sve tipove mišića koje poznaje osoba stručna u ovoj oblasti. Takvi mišići su, na primer, skeletni, glatki ili srčani mišić. U posebno poželjnom obliku, mišić je srčani mišić.

Alternativno, netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo su epitelne ćelije ili epitelno tkivo, ili netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo su nervne ćelije ili nervno tkivo.

[0076] Netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo mogu pripadati cirkulatornom sistemu pojedinca.

[0077] Netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo mogu pripadati ili biti izvedeni iz definisanog sistema iz tela pojedinca izabranih iz grupe koja obuhvata digestivni, endokrini, ekskretorni, imunološki, integumentarni, mišićni, nervni, reproduktivni, respiratorni ili skeletni sistem. ûelije mogu potpadati pod dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili svim navedenim sistemima nekog pojedinca.

[0078] Netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo mogu alternativno pripadati ili biti izvedeni iz određenog dela ili organa tela pojedinca izabranih iz grupe koja uključuje: kožu, kost, srce, hrskavicu, krvni sud, jednjak, želudac, crevo, žlezdu, jetru, bubrege, pluća, mozak i slezinu. Specifično, netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo pripadaju ili mogu biti izvedeni iz srca.

[0079] U slučaju oštećene netransformisane ćelije ili netransformisanog tkiva, oštećenje može biti uzrokovano genetskom/naslednom bolešću ili stečenom bolešću koja je rezultat, na primer, ishemije, povrede pri reperfuziji, upale, infekcije, traume, mehaničkog preopterećenja, trovanja ili operacije. Poželjno je da oštećenje bude uzrokovano ishemijom ili povredom pri reperfuziji.

[0080] U slučaju bolesne ili oštećene ćelije ili tkiva, oštećenje je poželjno uzrokovano bolešću koja je povezana s atrofijom, hipoplazijom, upalom, povredom ili ranjavanjem. Posebno je poželjno da bolest bude povezana s povredom. Takođe je posebno poželjno da bolest bude povezana s ranjavanjem.

[0081] U poželjnom rešenju predmetnog pronalaska, bolest je poremećaj skeletnih mišića izabrana iz grupe koja uključuje mišićnu distrofiju, slabost mišića, mišićnu atrofiju, miozitis, bolest centralnog jezgra, nemalin (štapna) miopatiju, centronuklearnu miopatiju, miotubularnu miopatiju, centronuklearnu miotubularnu miopatiju, oftalmoplegiju oka i mitohondrijalnu miopatiju. Mišićna distrofija može biti izabrana iz grupe koja uključuje Bekerovu mišićnu distrofiju, kongenitalnu mišićnu distrofiju, Duheneovu mišićnu distrofiju, distalnu mišićnu distrofiju, Emery-Dreifuss mišićnu distrofiju, facioskapulohumeralnu mišićnu distrofiju, mišićnu distrofiju udova i trupa, miotoničnu mišićnu distrofiju i okulofaringealnu mišićnu distrofiju. Miozitis može biti izabran iz grupe koja uključuje miozitis osifikans, fibromiozitis, idiopatske inflamatorne miopatije (kao što su dermatomiozitis, polimiozitis i miozitis inkluzionih telašca) i piomiozitis.

[0082] U još jednom poželjnom rešenju pronalaska, bolest je primarna ili stečena kardiomiopatija. Primarna kardiomiopatija je izabrana iz nasleđene kardiomiopatije i kardiomiopatije uzrokovane spontanim mutacijama. Kardiomiopatije su, na primer, ali ne ograničeno na hipertrofičnu kardiomiopatiju (HCM ili HOCM), aritmogeničnu desnu ventrikularnu kardiomiopatiju (ARVC), izolovanu ventrikularnu nekompakciju, mitohondrijalnu miopatiju, dilatiranu kardiomiopatiju (DCM), restriktivnu kardiomiopatiju (RCM), Takotsubo kardiomiopatiju, Loeflerov endokarditis, dijabetičku kardiomiopatiju, alkoholnu kardiomiopatiju, kardiomiopatiju povezanu s gojaznošću.

[0083] U kontekstu pronalaska, poželjno je da se izabere stečena kardiomiopatija uzrokovana aterosklerotskom ili drugom bolešću koronarnih arterija, kardiomiopatija uzrokovana infekcijom ili intoksikacijom miokarda, hipertenzivna srčana bolest uzrokovana plućnom arterijskom hipertenzijom i/ili arterijskom hipertenzijom i bolestima srčanih zalistaka, pri čemu je posebno poželjna ishemična kardiomiopatija uzrokovana aterosklerotskom ili drugom bolešću koronarnih arterija.

[0084] Netransformisane ćelije ili netransformisano tkivo koje je oštećeno usled ishemije ili povrede pri reperfuziji poželjno pripada srcu. Shodno tome, poželjno je da bolest koja se leči bude izabrana iz grupe koja se sastoji od infarkta miokarda, angine pektoris i srčane insuficijencije, pri čemu je posebno poželjan infarkt miokarda. Termin "infarkt miokarda" u kontekstu pronalaska obuhvata akutni infarkt miokarda (AMI).

[0085] Medicinska upotreba proteina prema prvom aspektu pronalaska obuhvata primenu kod pojedinca nakon infarkta miokarda i zarastanje obuhvata poboljšanje sistolne funkcije leve komore i može biti povezano sa povećanjem gustine kapilara u zoni granice infarkta. Dodatno, protein za upotrebu prema prvom aspektu pronalaska može smanjiti smrtnost nakon infarkta miokarda. Metode koje se mogu koristiti za određivanje parametara kao što su poboljšanje sistolne funkcije leve komore, povećanje gustine kapilara u zoni granice infarkta i smanjenje smrtnosti nakon infarkta miokarda su dobro poznate u struci i primereno opisane u primerima 4-6.

[0086] Proteini Faktora 1, fragmenti ili varijante opisani iznad, na primer, koriste se za lečenje ili ublažavanje atrofije; hipoplazije; upale, povrede; ranjavanja, ishemije; povrede pri reperfuziji; upale; infekcije; traume; mehaničkog preopterećenja; trovanja; primarne ili stečene kardiomiopatije, poželjno nasleđene kardiomiopatije i kardiomiopatije uzrokovane spontanim mutacijama. Kardiomiopatije su, na primer, ali ne ograničeno na hipertrofičnu kardiomiopatiju (HCM ili HOCM), aritmogeničnu ventrikularnu desnu kardiomiopatiju (ARVC), izolovanu nekompakciju ventrikula mitohondrijalnu miopatiju, dilatiranu kardiomiopatiju (DCM), restriktivnu kardiomiopatiju (RCM), Takotsubo kardiomiopatiju, Loeflerov endokarditis, dijabetičku kardiomiopatiju, alkoholnu kardiomiopatiju ili kardiomiopatiju povezanu s gojaznošću; infarkt miokarda ili poboljšanje sistolne funkcije leve komore.

[0087] Takođe je otkrivena, ali ne čini deo pronalaska, upotreba proteina Faktora 1 i Faktora 2, fragmenta ili varijanti opisanih iznad za metode lečenja odgovarajuće indikovanih stanja i bolesti.

[0088] U drugom aspektu pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju proteine prema prvom aspektu za upotrebu kao lek.

[0089] Termini "pojačavanje proliferacije i/ili zarastanja i/ili inhibicija apoptoze netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija" imaju značenja i preferirana značenja definisana iznad.

[0090] Sekvence nukleinske kiseline mogu biti optimizovane u cilju pojačanja ekspresije u ćeliji domaćinu. Parametri koji se razmatraju uključuju C:G sadržaj, preferirane kodone i izbegavanje inhibirajuće sekundarne strukture. Ovi faktori mogu biti kombinovani na različite načine u pokušaju da se dobiju sekvence nukleinske kiseline sa pojačanom ekspresijom u određenom domaćinu (videti npr. Donnelly et al., International Publication Number WO 97/47358).

Sposobnost određene sekvence da ima pojačanu ekspresiju u određenom domaćinu uključuje neko empirijsko eksperimentisanje. Takvo eksperimentisanje uključuje merenje ekspresije potencijalne sekvence nukleinske kiseline i, ako je potrebno, izmenu sekvence. Počevši od određene aminokiselinske sekvence i poznate degeneracije genetskog koda, može se dobiti veliki broj različitih kodirajućih sekvenci nukleinske kiseline. Degeneracija genetskog koda nastaje zato što gotovo sve aminokiseline kodiraju različite kombinacije nukleotidnih tripleta ili "kodona". Prevođenje određenog kodona u određenu aminokiselinu je dobro poznato u struci (vidi, na primer, Lewin GENES IV, str.119, Oxford University Press, 1990).

[0091] Nukleinska kiselina može dalje sadržati element za kontrolu transkripcije ili sekvence za kontrolu ekspresije pozicionirane tako da kontrolišu ekspresiju proteina. Takva nukleinska kiselina zajedno sa kontrolnim elementima često se naziva ekspresioni sistem. Termin "ekspresioni sistem" kako se ovde koristi odnosi se na sistem dizajniran za proizvodnju jednog ili više genetskih proizvoda od interesa. Tipično, takav sistem je "veštački" dizajniran, tj. pomoću genotehnoloških sredstava upotrebljivih za proizvodnju genetskog proizvoda od interesa in vivo, in vitro ili ex vivo. Termin "ekspresioni sistem" dalje obuhvata ekspresiju genetskog proizvoda od interesa koji uključuje transkripciju polinukleotida, splicing iRNK, prevođenje u polipeptid, ko- i post-translacione modifikacije polipeptida ili proteina, kao i usmeravanje proteina u jedan ili više kompartmana unutar ćelije, sekreciju iz ćelije i preuzimanje proteina u istoj ili drugoj ćeliji. Ovaj opšti opis odnosi se na ekspresione sisteme za upotrebu u eukariotskim ćelijama, tkivima ili organizmima. Ekspresioni sistemi za prokariotske sisteme mogu se razlikovati, pri čemu je dobro poznato u struci kako se konstruiše ekspresioni sistem za prokariotske ćelije.

[0092] Regulatorni elementi prisutni u kaseti za ekspresiju gena generalno uključuju: (a) promotor transkripciono povezan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid, (b) 5' ribozomsko vezno mesto funkcionalno povezano sa nukleotidnom sekvencom, (c) terminator spojen na 3' kraj nukleotidne sekvence, i (d) 3' poliadenilacioni signal funkcionalno povezan sa nukleotidnom sekvencom. Dodatni regulatorni elementi korisni za pojačavanje ili regulisanje ekspresije gena ili obrade polipeptida takođe mogu biti prisutni. Promoteri su genetski elementi koje prepoznaje RNK polimeraza i posreduju transkripciju nizvodnih regija. Poželjni promoteri su snažni promoteri koji omogućavaju povećane nivoe transkripcije. Primeri snažnih promotera su promoteri neposredno ranog humanog citomegalovirusa (CMV), i CMV sa intronom A (Chapman et al, Nucl. Acids Res.19:3979-3986, 1991). Dodatni primeri promotera uključuju prirodno prisutne promotere kao što su EF1 alfa promoter, mišji CMV promoter, promoter Rous sarkoma virusa, i SV40 rani/kasni promoteri i [beta]-aktin promoter; i veštački promoteri kao što je sintetički specifični promoter za mišiće i himerički specifični za mišiće/CMV promoter (Li et al., Nat. Biotechnol.17:241-245, 1999, Hagstrom et al., Blood 95:2536-2542, 2000).

[0093] Ribozomsko vezno mesto se nalazi na ili blizu inicijacionog kodona. Primeri poželjnih ribozomskih veznih mesta uključuju CCACCAUGG, CCGCCAUGG, i ACCAUGG, gde je AUG inicijacioni kodon (Kozak, Cell 44:283-292, 1986). Poliadenilacioni signal je odgovoran za sečenje transkribovane RNK i dodavanje poli (A) repa na RNK. Poliadenilacioni signal kod viših eukariota sadrži sekvencu AAUAAA otprilike 11-30 nukleotida od mesta dodavanja poliadenilacije. Sekvenca AAUAAA učestvuje u signalizaciji sečenja RNK (Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY, 1990). Poli (A) rep je važan za obradu, izvoz iz jezgra, prevođenje i stabilnost iRNK.

[0094] Poliadenilacioni signali koji se mogu koristiti kao deo kasete za ekspresiju gena uključuju minimalni zečiji [beta]-globin poliadenilacioni signal i poliadenilacioni signal goveđeg hormona rasta (BGH) (Xu et al., Gene 272:149-156, 2001, Post et al., U.S. Patent U.S.5,122,458).

[0095] Primeri dodatnih regulatornih elemenata korisnih za pojačavanje ili regulisanje ekspresije gena ili obrade polipeptida koji mogu biti prisutni uključuju pojačivač, vođenu sekvencu i operator. Region pojačivača povećava transkripciju. Primeri regiona pojačivača uključuju CMV pojačivač i SV40 pojačivač (Hitt et al., Methods in Molecular Genetics 7: 13-30, 1995, Xu, et al., Gene 272: 149-156, 2001). Region pojačivača može biti povezan s promotorem.

[0096] Ekspresija proteina prema prvom aspektu pronalaska može biti regulisana. Takva regulacija može biti ostvarena u mnogim koracima ekspresije gena. Mogući koraci regulacije su, na primer, ali ne ograničeni na, inicijaciju transkripcije, čišćenje promotera, produžetak transkripcije, splicing, izvoz iz jezgra, stabilnost iRNK, inicijaciju prevođenja, efikasnost prevođenja, produžetak translacije i preklapanje proteina. Drugi koraci regulacije, koji utiču na koncentraciju polipeptida Faktora 1 ili Faktora 2 unutar ćelije, utiču na poluživot proteina. Takav korak regulacije je, na primer, regulisana degradacija proteina. Budući da proteini iz pronalaska obuhvataju sekretirane proteine, protein može biti usmeren u sekretorni put domaćinske ćelije. Efikasnost sekrecije zajedno sa regulatornim koracima koji se odnose na ekspresiju i stabilnost proteina reguliše koncentraciju odgovarajućeg proteina izvan ćelije. Izvan ćelije može se odnositi, na primer, ali bez ograničenja na, kultivacioni medijum, tkivo, intracelularnu matricu ili prostor ili telesnu tečnost kao što su krv ili limfa.

[0097] Kontrola regulatornih koraka pomenutih iznad može biti, na primer, nezavisna od tipa ćelije ili tkiva ili specifična za tip ćelije ili tkiva. Kontrola regulatornih koraka može biti specifična za tip ćelije ili tkiva. Takva regulacija specifična za tip ćelije ili tkiva se poželjno postiže kroz regulatorne korake koji se odnose na transkripciju nukleinske kiseline. Ova transkripcijska regulacija može se postići upotrebom promoterskih sekvenci specifičnih za tip ćelije ili tkiva. Rezultat ove regulacije specifične za tip ćelije ili tkiva može imati različite stepene specifičnosti. To znači da je ekspresija odgovarajućeg polipeptida pojačana u odgovarajućoj ćeliji ili tkivu u poređenju sa drugim tipovima ćelija ili tkiva ili da je ekspresija ograničena na odgovarajući tip ćelija ili tkiva. Promoterske sekvence specifične za tip ćelija ili tkiva su dobro poznate u struci i dostupne su za širok spektar tipova ćelija ili tkiva.

[0098] Ekspresija ne mora biti specifična za tip ćelije ili tkiva, već može zavisiti od fizioloških uslova. Takvi uslovi su, na primer, upala ili rana. Takva ekspresija specifična za fiziološki uslov takođe se može postići regulacijom na svim gore pomenutim regulatornim koracima. Poželjni način regulacije za ekspresiju specifičnu za fiziološki uslov je transkripcijska regulacija. U tu svrhu može se koristiti promoter specifičan za rane ili upale. Odgovarajući promoteri su, na primer, prirodno prisutne sekvence, koje se mogu, na primer, izvesti iz gena koji su specifično eksprimirani tokom imunološke reakcije i/ili regeneracije rane tkiva. Druga mogućnost je upotreba veštačkih promotorskih sekvenci, koje su, na primer, konstruisane kombinovanjem dve ili više prirodno prisutnih sekvenci.

[0099] Regulacija može biti specifična za tip ćelije ili tkiva i specifična za fiziološki uslov.

Poželjno je da ekspresija bude specifična za srce. Posebno je poželjo da ekspresija bude specifična za srce i rane.

[0100] Još jedna mogućnost za regulaciju ekspresije proteina prema prvom aspektu iz pronalaska je uslovna regulacija ekspresije gena. Da bi se postigla uslovna regulacija, može se koristiti sekvenca operatora. Na primer, Tet operator sekvenca može se koristiti za potiskivanje ekspresije gena. Uslovna regulacija ekspresije gena pomoću Tet operatora zajedno sa Tet represorom je dobro poznata u struci i mnogi odgovarajući sistemi su uspostavljeni za širok spektar prokariotskih i eukariotskih organizama. Osoba stručna u oblasti zna kako da odabere odgovarajući sistem i prilagodi ga specijalnim potrebama određene primene.

[0101] Upotreba nukleinske kiseline prema pronalasku poželjno obuhvata primenu na pojedincu nakon infarkta miokarda, a zarastanje poželjno obuhvata poboljšanje sistolne funkcije leve komore i može biti povezano sa povećanjem gustine kapilara u zoni granice infarkta. Takođe, može smanjiti smrtnost nakon infarkta miokarda. Metode koje se mogu koristiti za određivanje parametara kao što su poboljšanje sistolne funkcije leve komore, povećanje gustine kapilara u zoni granice infarkta i smanjenje smrtnosti nakon infarkta miokarda su dobro poznate u struci i primereno opisane u primerima 4-6.

[0102] Nukleinske kiseline koje kodiraju proteine Faktor 1 i Faktor 2, fragmente ili varijante opisane iznad poželjno se koriste u lečenju ili ublažavanju atrofije; hipoplazije; upale, povrede; ranjavanja, ishemije; povrede pri reperfuziji; upale; infekcije; traume; mehaničkog preopterećenja; trovanja; primarne ili stečene kardiomiopatije, poželjno nasleđene kardiomiopatije i kardiomiopatije uzrokovane spontanim mutacijama. Kardiomiopatije su, na primer, ali ne ograničeno usmerene na hipertrofičnu kardiomiopatiju (HCM ili HOCM), aritmogeničnu desno ventrikularnu kardiomiopatiju (ARVC), izolovanu ventrikularnu nekompakcionu mitohondrijalnu miopatiju, dilatiranu kardiomiopatiju (DCM), restriktivnu kardiomiopatiju (RCM), Takotsubo kardiomiopatiju, Loeflerov endokarditis, dijabetičku kardiomiopatiju, alkoholnu kardiomiopatiju ili kardiomiopatiju povezanu s gojaznošću; infarkt miokarda ili poboljšanje sistolne funkcije leve komore.

[0103] U trećem aspektu, pronalazak obezbeđuje vektore koji obuhvataju nukleinsku kiselinu ili ekspresioni sistem drugog aspekta za upotrebu kao lek.

[0104] Termini "pojačavanje proliferacije i/ili zarastanja i/ili inhibicije apoptoze netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija" imaju značenje i poželjna značenja definisana iznad.

[0105] Kako se ovde koristi, termin "vektor" odnosi se na protein ili polinukleotid ili njihovu mešavinu koji su sposobni da budu uneti ili da unesu proteine i/ili nukleinske kiseline sadržane u njima u ćeliju. U kontekstu predmetnog pronalaska, poželjno je da geni od interesa kodirani unetim polinukleotidom budu eksprimirani unutar ćelije domaćina nakon unosa vektora ili više vektora. Primeri odgovarajućih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na plazmidske vektore, kosmidne vektore, fagne vektore kao što su lambda fag, filamentozne fagne vektore, virusne vektore, virusne čestice slične virusima i bakterijske spore.

[0106] Poželjno je da vektor je virusni vektor. Odgovarajući virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na adenovirusne vektore, adeno-asocirane virusne (AAV) vektore, alfaviralne vektore, herpes virusne vektore, morbilske virusne vektore, virusne vektore boginja, virusne vektore vezikularnog stomatitisa, retrovirusne vektore i lentivirusne vektore.

[0107] U posebno poželjnom rešenju iz pronalaska, vektor je adenovirusni ili adeno-asocirani virusni (AAV) vektor.

[0108] Nukleinska kiselina koja kodira jedan ili više proteina iz prvog aspekta pronalaska može biti uneta u ćeliju domaćina, tkivo ili pojedinca koristeći vektore pogodne za terapeutsku primenu. Odgovarajući vektori mogu poželjno dostaviti nukleinske kiseline u ciljanu ćeliju bez izazivanja neprihvatljivih sporednih efekata.

[0109] Upotreba vektora prema pronalasku može obuhvatati primenu na pojedincu nakon infarkta miokarda i zarastanje obuhvata poboljšanje sistolne funkcije leve komore i može biti povezano sa povećanjem gustine kapilara u zoni granice infarkta. Dodatno, može smanjiti smrtnost nakon infarkta miokarda. Metode koje se mogu koristiti za određivanje parametara kao što su poboljšanje sistolne funkcije leve komore, povećanje gustine kapilara u zoni granice infarkta i smanjenje smrtnosti nakon infarkta miokarda su dobro poznate u struci i primereno opisane u primerima 4-6.

[0110] Vektori koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju proteine Faktor 1 i Faktor 2, fragmente ili varijante opisane iznad poželjno se koriste u lečenju ili ublažavanju atrofije; hipoplazije; upale, povrede; ranjavanja, ishemije; povrede pri reperfuziji; upale; infekcije; traume; mehaničkog preopterećenja; trovanja; primarne ili stečene kardiomiopatije, poželjno je da su nasleđene kardiomiopatije i kardiomiopatije uzrokovane spontanim mutacijama.

Kardiomiopatije su, na primer, ali bez ograničavanja usmerene na hipertrofičnu kardiomiopatiju (HCM ili HOCM), aritmogeničnu desno ventrikularnu kardiomiopatiju (ARVC), izolovanu ventrikularnu nekompakcionu mitohondrijalnu miopatiju, dilatiranu kardiomiopatiju (DCM), restriktivnu kardiomiopatiju (RCM), Takotsubo kardiomiopatiju, Loeflerov endokarditis, dijabetičku kardiomiopatiju, alkoholnu kardiomiopatiju ili kardiomiopatiju povezanu s gojaznošću; infarkt miokarda ili poboljšanje sistolne funkcije leve komore.

[0111] U četvrtom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije za upotrebu kao lek, pri čemu kompozicija sadrži protein za upotrebu kako je ovde definisano i/ili nukleinsku kiselinu za upotrebu kako je ovde definisano i/ili vektor za upotrebu kako je ovde definisano, i po mogućnosti nosač.

[0112] Termini "pojačavanje proliferacije i/ili zarastanja i/ili inhibicija apoptoze netransformisanog tkiva ili netransformisanih ćelija" imaju značenje i poželjna značenja definisana iznad.

[0113] Termin "nosač", kako se ovde koristi, odnosi se na farmakološki neaktivnu supstancu kao što su, ali ne ograničeno na, razređivač, ekscipijent, surfaktante, stabilizatore, fiziološke pufer rastvore ili nosače sa kojima se terapeutski aktivni sastojak primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti tečni ili čvrsti. Tečni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na sterilne tečnosti, kao što su rastvori soli u vodi i ulja, uključujući, ali ne ograničeno na, ona naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su kikirikijevo ulje, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Rastvori soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za injekcione rastvore. Rastvor soli je poželjno nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski. Primeri odgovarajućih farmaceutskih nosača su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences" od E. W. Martina. Nosač je poželjno odgovarajući farmaceutski ekscipijent. Odgovarajući farmaceutski "ekscipijenti" obuhvataju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, ječam, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, osušeno obrano mleko, glicerol, propilen glikol, vodu, etanol i slično. Takvi odgovarajući farmaceutski ekscipijenti su poželjno farmaceutski prihvatljivi.

[0114] "Farmaceutski prihvatljivo" znači odobreno od strane regulatorne agencije federalne ili državne vlade ili kako je navedeno u Američkoj farmakopeji ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi.

[0115] Termin "kompozicija" je namenjen da uključuje formulaciju aktivne supstance sa materijalom za kapsuliranje koji služi kao nosač, koji obezbeđuje kapsulu u kojoj je aktivna komponenta sa ili bez drugih nosača, okružena je nosačem, koji je tako u asocijaciji sa aktivnom supstancom.

[0116] Termin "aktivni sastojak" odnosi se na supstancu u farmaceutskoj kompoziciji ili formulaciji koja je biološki aktivna, tj. koja obezbeđuje farmaceutsku vrednost. U kontekstu pronalaska, aktivni sastojak je protein iz prvog aspekta i/ili nukleinska kiselina iz drugog aspekta i/ili vektor iz trećeg aspekta. Farmaceutska kompozicija može sadržati jedan ili više aktivnih sastojaka koji mogu delovati zajedno ili nezavisno jedan od drugog. Aktivni sastojak može biti formulisan kao neutralni ili u obliku soli. Forma soli je poželjno farmaceutski prihvatljiva so.

[0117] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se, na primer, ali ne ograničeno na, so polipeptida iz predmetnog pronalaska. Odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli nastale dodavanjem kiseline koje se mogu, na primer, formirati mešanjem rastvora polipeptida iz predmetnog pronalaska sa rastvorom farmaceutski prihvatljive kiseline kao što su hlorovodična kiselina, sumporna kiselina, fumarinska kiselina, maleinska kiselina, sukcinilna kiselina, sirćetna kiselina, benzojeva kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, ugljenična kiselina ili fosforna kiselina. Dalje, kada peptid nosi kiselu grupu, odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli mogu uključivati soli alkalnih metala (npr. natrijumove ili kalijumove soli); soli zemnoalkalnih metala (npr. kalcijumove ili magnezijumove soli); i soli formirane sa odgovarajućim organskim ligandima (npr. amonijum, kvaternarni amonijum i aminski katjoni formirani koristeći kontraanjone kao što su halid, hidroksid, karboksilat, sulfat, fosfat, nitrat, alkil sulfonat i aril sulfonat). Ilustrativni primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ograničeni na, acetat, adipat, alginat, askorbat, aspartat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bisulfat, bitartrat, borat, bromid, butirat, kalcijum edetat, kamforat, kamforsulfonat, kamsilat, karbonat, hlorid, citrat, klavulanat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dihidrohlorid, dodecilsulfat, edetat, edisilat, estolat, esilat, etansulfonat, format, fumarat, gluceptat, glukoheptonat, glukonat, glutamat, glicerofosfat, glicerilarzanilat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, heksilresorcinat, hidrabamin, hidrobromid, hidrohlorid, hidrojodid, 2-hidroksi-etansulfonat, hidroksinaftoat, jodid, izotionat, laktat, laktobionat, laurat, lauril sulfat, malat, maleat, malonat, mandelat, mezilat, metansulfonat, metil sulfat, mukat, 2-naftalensulfonat, napsilat, nikotinat, nitrat, N-metilglukamin amonijumova so, oleat, oksalat, pamoat (embonat), palmitat, pantotenat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, fosfat/difosfat, pikrat, pivalat, poligalakturonat, propionat, salicilat, stearat, sulfat, subacetat, sukcinat, tanat, tartrat, teoklat, tozilat, trijodid, undekanoat, valerat i slično (cf. npr. S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, str.1-19 (1977)).

[0118] Aktivni sastojak se daje ćeliji, tkivu ili pojedincu u efektivnoj količini. "Efektivna količina" je količina aktivnog sastojka dovoljna da se postigne željena svrha. Aktivni sastojak može biti terapeutski agens. Efektivna količina datog aktivnog sastojka će varirati u zavisnosti od faktora kao što su priroda sastojka, način primene, veličina i vrsta pojedinca kojem se daje aktivni sastojak, i svrha primene. Efektivna količina u svakom pojedinačnom slučaju može se empirijski odrediti od strane stručne osobe prema uspostavljenim metodama u struci. Kako se koristi u kontekstu pronalaska, "davanje" uključuje in vivo primenu na pojedincu, kao i direktno davanje ćelijama ili tkivu in vitro ili ex vivo.

[0119] Farmaceutske kompozicije mogu biti prilagođene za lečenje bolesti ili poremećaja. Kako se ovde koristi, "lečiti", "koji leči" ili "lečenje" bolesti ili poremećaja znači postizanje jednog ili više od sledećeg: (a) smanjenje težine poremećaja; (b) ograničavanje ili sprečavanje razvoja simptoma karakterističnih za poremećaj(e) koji se leče; (c) inhibiranje pogoršanja simptoma karakterističnih za poremećaj(e) koji se leče; (d) ograničavanje ili sprečavanje ponovnog pojavljivanja poremećaj(a) kod pacijenata koji su ranije imali poremećaj(e); (e) ograničavanje ili sprečavanje ponovnog pojavljivanja simptoma kod pacijenata koji su ranije bili simptomatični za poremećaj(e); (f) smanjenje smrtnosti nakon pojave bolesti ili poremećaja; (g) zarastanje; i (h) profilaksa bolesti. Kako se ovde koristi, "sprečavanje", "sprečiti", "prevencija", ili "profilaksa" bolesti ili poremećaja znači sprečavanje da se takva bolest ili poremećaj pojavi kod pacijenta.

[0120] Takođe je otkriveno, ali ne čini deo pronalaska, da lečenje farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku, zarastanje, obuhvata tretman pojedinca nakon infarkta miokarda i zarastanje obuhvata poboljšanje sistolne funkcije leve komore i može biti povezano sa povećanjem gustine kapilara u zoni granice infarkta. Dodatno, može smanjiti smrtnost nakon infarkta miokarda. Metode koje se mogu koristiti za određivanje parametara kao što su poboljšanje sistolne funkcije leve komore, povećanje gustine kapilara u zoni granice infarkta i smanjenje smrtnosti nakon infarkta miokarda su dobro poznate u struci i primereno opisane u primerima 4-6.

[0121] Farmaceutska kompozicija predviđena predmetnim pronalaskom može biti formulisana na razne načine što je poznato osobi stručnoj u oblasti. Na primer, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti u tečnom obliku kao što su rastvori, emulzije ili suspenzije. Poželjno je da farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska je formulisana za parenteralnu primenu, poželjno za intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, potkožnu, transdermalnu, intrapulmonalnu, intraperitonealnu, intrakoronarnu, intrakardijalnu primenu, ili primenu preko sluzokože, poželjno za intravensku, potkožnu ili intraperitonealnu primenu. Priprema za oralnu ili analnu primenu je takođe moguća. Poželjno je da farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska je u obliku sterilnog vodenog rastvora koji može sadržati druge supstance, na primer, dovoljno soli ili glukoze da rastvor bude izotoničan sa krvlju.

Vodeni rastvori treba da budu odgovarajuće puferisani (poželjno na pH od 3 do 9, poželjnije na pH od 5 do 7), ako je potrebno. Farmaceutska kompozicija je poželjno u formi dozne jedinice. U takvom obliku farmaceutska kompozicija je podeljena na dozne jedinice koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Forma dozne jedinice može biti pakovana priprema, pakovanje sadrži diskretne količine farmaceutske kompozicije kao što su bočice ili ampule.

[0122] Primena farmaceutske kompozicije se poželjno primenjuje kroz intravenski, intraarterijski, intramuskularni, potkožni, transdermalni, intrapulmonalni, intraperitonealni, intrakoronarni ili intrakardijalni put pri čemu su takođe obuhvaćeni i drugi putevi primene poznati u struci.

[0123] U slučaju da se farmaceutska kompozicija koristi kao lečenje za pojedinca, upotreba farmaceutske kompozicije može zameniti standardno lečenje za odgovarajuću bolest ili stanje ili se može primeniti dodatno standardnim lečenjem. U slučaju dodatne upotrebe farmaceutske kompozicije, farmaceutska kompozicija može biti primenjena pre, istovremeno ili nakon standardne terapije. Standardna terapija može biti terapija reperfuzijom i farmaceutska kompozicija može biti primenjena pre, istovremeno ili nakon terapije reperfuzijom.

[0124] Dalje je poželjno da se farmaceutska kompozicija primeni jednom ili više puta. To obuhvata 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 puta. Vremenski period za primenu farmaceutske kompozicije nije ograničen. Poželjno je da primena ne prelazi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 nedelja.

[0125] Jedna doza farmaceutske kompozicije, nezavisno od ukupne količine primenjenih doza ili odgovarajućeg vremenskog perioda primene, može se primeniti kao jedna ili više injekcija u obliku bolusa i/ili infuzija.

[0126] Prvi do četvrti aspekt iz predmetnog pronalaska zasniva se na opservacijama aktuelnih pronalazača da su Faktor 1 (i Faktor 2) potentni pro-angiogeni molekuli in vitro i in vivo. Shodno tome, proteini, nukleinske kiseline i vektori opisani iznad su takođe predviđeni za upotrebu ex vivo, što može biti terapeutska, npr. za ex vivo stimulaciju gore navedenih ćelija ili za upotrebu u aplikacijama kultura ćelija.

[0127] Međutim, opservacija pro-angiogene aktivnosti Faktora 1 i 2 navela je pronalazače da istraže da li su Faktor 1 i Faktor 2, redom, mete za anti-angiogenu terapiju. Pronalazači su uspeli da dokažu da inhibicija Faktora 1 ili inhibicija Faktora 2 mogu biti korišćene za inhibiranje angiogeneze.

[0128] Anti-angiogene strategije se koriste za lečenje kancerogenih stanja i drugih poremećaja, kao što je senilna degeneracija makule, gde angiogeneza doprinosi progresiji bolesti (vidi, npr. Ferrara N i Kerbel RS (2005) Nature: 438:967-974 ili Potente M, et al. (2011) Cell.146(6):873-887). Shodno tome, otkrivene su anti-angiogene osobine inhibitora Faktora 1 i Faktora 2. U ovim slučajevima definicije navedene iznad u odeljku definicija jednako se primenjuju. Dodatno, specifične definicije navedene u opisu od prvog do četvrtog aspekta kao i poželjne varijante, npr. termina "vektor" i poželjni vektori takođe se primenjuju na sledeće slučajeve osim ako kontekst njihove upotrebe jasno ne ukazuje drugačije.

[0129] Takođe je otkriven, ali ne čini deo predmetnog pronalaska, da inhibitor proteina Faktor 1 i/ili 2 za medicinsku upotrebu, je poželjan u lečenju ili sprečavanju bolesti u kojoj angiogeneza doprinosi razvoju ili progresiji bolesti. Termin "inhibitor" široko se koristi za označavanje jedinjenja koja ometaju pro-angiogenu aktivnost Faktora 1 ili Faktora 2. Inhibitor može delovati na transkripciju i/ili translaciju iRNK koja kodira Faktor 1 ili Faktor 2, time sprečavajući njihovu ćelijsku produkciju i, samim tim, sekreciju u cirkulaciju i/ili na mestu razvoja ili progresije bolesti. Inhibitor može takođe delovati specifičnim vezivanjem za protein Faktor 1 ili Faktor 2 ili za ćelijske proteine za koje se Faktor 1 ili Faktor 2 specifično vezuju, poželjno za njihove ćelijske receptore. Takvo vezivanje može sprečiti ili poremetiti prirodnu interakciju Faktora 1 ili Faktora 2 sa drugim ćelijskim proteinima, poželjno sa njihovim odgovarajućim ćelijskim receptorima. Osoba stručna u oblasti je dobro upoznata kako ometati vezivanje između receptora i njegovog agonista i može koristiti ovo znanje za dizajniranje odgovarajućih inhibitora Faktora 1 i Faktora 2. Štaviše, inhibitor može biti izveden iz samog proteina Faktora 1 ili Faktora 2 brisanjem ili mutiranjem onih delova proteina Faktora 1 i Faktora 2, koji vrše pro-angiogenu funkciju Faktora 1 i Faktora 2. Takvi neaktivni mutirani ili izbrisani Faktor 1 ili Faktor 2 će se takmičiti sa divljim tipom Faktora 1 i Faktora 2 za njihove prirodne partnere za vezivanje.

Jedinjenje koje ometa pro-angiogenu aktivnost Faktora 1 ili Faktora 2 smanjuje aktivnost za najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, još poželjnije najmanje 40%. U kontekstu inhibitora koji se specifično vezuju za Faktor 1 ili Faktor 2 ili koji se sastoje, suštinski sastoje ili sastoje od mutanata ili fragmenata Faktora 1 i Faktora 2, poželjno je da vrše ovaj nivo inhibicije proteina Faktora 1 ili Faktora 2 na ekvimolarnoj koncentraciji. Poželjan test, koji se može koristiti za određivanje inhibicije pro-angiogene aktivnosti, opisan je u Primeru 10 ovde. Da bi se utvrdilo da li dati inhibitor ima ovu aktivnost na ekvimolarnoj količini, moraju se odrediti molarni iznosi Faktora 1 i 2, odnosno i odgovarajućeg inhibitora. Faktor 1 prema SEQ ID NO: 1 ima molekulsku težinu od 15,84 kDa i Faktor 2 prema SEQ ID NO: 3 ima molekulsku težinu od 21,57 kDa i IgG ima približnu molekulsku težinu od 150 kDa. Dakle, 100 ng Faktora 1 i 947 ng IgG specifičnog za Faktor 1 su približno ekvimolarni i 100 ng Faktora 2 i 695 ng IgG specifičnog za Faktor 2 su približno ekvimolarni. Iz Fig.12 Panela A i B, redom, jasno je da su antitela specifična za Faktor 1 i Faktor 2 navedena ovde inhibitori proteina Faktora 1 ili Faktora 2 u tom smislu. Ako je kontekst inhibitora koji ometaju transkripciju i/ili translaciju iRNK koji kodira Faktor 1 ili Faktor 2, nivo inhibicije se poželjno meri na osnovu proteina proizvedenog u ćeliji koja prirodno proizvodi Faktor 1 ili Faktor 2. Osoba stručna u oblasti je dobro upoznata sa velikim brojem metoda za merenje količina iRNK koji kodira Faktor 1 ili Faktor 2, kao i proteina Faktora 1 ili Faktora 2, koje se mogu koristiti pri proceni sposobnosti jedinjenja da ometa transkripciju i/ili translaciju iRNK koji kodira Faktor 1 ili Faktor 2. Poželjno je da protein Faktora 1 obuhvata, suštinski se sastoji ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 1, a Faktor 2 obuhvata, suštinski se sastoji ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 3 ili varijante iste, koja ima najmanje 80% identiteta sekvenci prema SEQ ID NO: 1 ili 3.

[0130] Poželjno je da, inhibitor otkriven ovde je protein koji obuhvata, suštinski se sastoji ili se sastoji od inhibitornog fragmenta ili inhibitornog mutanta aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 1 ili 3 ili varijante iste, koja ima najmanje 80% identiteta sekvenci prema aminokiselinskoj sekvenci prema SEQ ID NO: 1 ili 3. Dobro je poznato je u struci da proteini koji vrše svoju funkciju interakcijom protein-protein preko receptora sadrže domene koji su neophodni za vezivanje za receptor i domene koji izazivaju receptor da prenese signal u ćeliju. Dakle, osoba stručna u oblasti je dobro upoznata kako generisati inhibitorne fragmente ili mutante takvih proteina koji se vezuju za receptor. Na primer, serija N- i/ili C-terminalno skraćenih proteina Faktora 1 ili Faktora 2 može biti generisana i testirana za njihovu proangiogenu aktivnost u testu kako je opisano u Primeru 2. Oni fragmenti koji više ne pokazuju pro-angiogenu aktivnost zatim se testiraju u testu kako je opisano u Primeru 10 za njihovu sposobnost da inhibiraju pro-angiogenu aktivnost proteina Faktora 1 ili 2. Mutanti Faktora 1 i 2 mogu biti generisani kako je dobro poznato u struci, npr. pomoću mutageneze skeniranja alaninom. U mutagenezi skeniranja alaninom generiše se serija mutanata u kojoj svaki mutant sadrži 1, 2, 3 ili više aminokiselina, koje su mutirane u alanin (takozvane kasete) i gde se mutanti razlikuju po pozicijama kasete unutar Faktora 1 ili 2. Mutanti Faktora 1 ili 2 koji su izgubili svoju pro-angiogenu aktivnost mogu ponovo biti identifikovani kako je opisano u Primeru 2. Inhibitorni mutanti mogu naknadno biti identifikovani korišćenjem testa kako je opisano u Primeru 10.

[0131] Inhibitor može biti ligand koji se specifično vezuje za amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 3 ili varijantu iste, koja ima najmanje 80% identiteta sekvenci prema amino kiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 1 ili 3 ili za receptor koji prirodno interaguje sa Faktorom 1 ili 3 ili varijantom istog, koja ima najmanje 80% identiteta sekvenci prema amino kiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO: 1 ili 3. Termin "ligand" kako se ovde koristi može se odnositi na hemijski entitet koji se specifično vezuje za navedeni antigen. Poželjni ligandi su ligandi zasnovani na aminokiselinama, kao što su imunoglobulini, poželjno antitela ili fragmenti antitela koji se vezuju za antigen i proteini slični antitelima. Alternativno, ligandi mogu biti peptidomimetici.

[0132] Termin "imunoglobulin (Ig)" ovde se koristi za označavanje glikoproteina koji daju imunitet iz superfamilije imunoglobulina. "Površinski imunoglobulini" su pričvršćeni za membranu efektorskih ćelija preko svoje transmembranske regije i obuhvataju molekule kao što su, ali ne ograničavajući se na, B-ćelijske receptore, T-ćelijske receptore, proteine klase I i II glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), beta-2 mikroglobulin (ȕ2M), CD3, CD4 i CD8. Tipično, termin "antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na sekretovane imunoglobuline koji nemaju transmembransku regiju i stoga mogu biti oslobođeni u krvotok i telesne šupljine.

Antitela su grupisana u različite izotipove na osnovu teškog lanca koji poseduju. Postoji pet tipova teških lanaca ljudskih Ig označenih grčkim slovima: Į, į, İ, Ȗ, i µ. Tip teškog lanca definiše klasu antitela, tj. ovi lanci se nalaze u IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitelima, respektivno, svaki obavlja različite uloge i usmerava odgovarajući imuni odgovor protiv različitih tipova antigena. Različiti teški lanci se razlikuju po veličini i sastavu; Į i Ȗ sadrže približno 450 amino kiselina, dok µ i İ imaju približno 550 amino kiselina (Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science). Antitela se sastoje od četiri polipeptidna lanca, naime dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od promenljive regije teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantne regije teškog lanca.

Konstantna regija teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od promenljive regije lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantne regije lakog lanca. Konstantna regija lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. VH i VL regije mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regije koje određuju komplementarnost (CDR), međusobno razmaknute sa regionima koji su više konzervirani, nazvani okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR za teške i lake lance može se odrediti kako je dobro poznato u struci. Na primer, sledeći set pravila može se koristiti za pronalaženje CDR-a unutar sekvence lakog i teškog lanca antitela, respektivno:

Laki lanac CDR-1: Početak: približno ostatka 24, ostatak pre CDR-1 uvek Cys, ostatak posle CDR1 uvek Trp. Tipično Trp-Tyr-Gln, ali takođe, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu; dužina: 10 do 17 ostatka

Laki lanac CDR-2: Početak: uvek 16 ostatka posle kraja L1, ostaci pre generalno Ile-Tyr, ali takođe, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe, Dužina uvek 7 ostatka;

Laki lanac CDR-3: Početak: uvek 33 ostatka posle kraja CDR-2; ostatak pre uvek Cys, ostaci posle uvek Phe-Gly-XXX-Gly, dužina: 7 do 11 ostatka

Teški lanac CDR-1: Početak: približno ostatka 26 uvek 4 posle Cys (na osnovu Chothia AbM definicije, Kabat definicija počinje 5 ostatka kasnije); ostaci pre uvek Cys-XXX-XXX-XXX; ostaci posle uvek Trp. Tipično Trp-Val, ali takođe, Trp-Ile, Trp-Ala, dužina: 10 do 12 ostatka [AbM definicija, Chothia definicija isključuje poslednja 4 ostatka);

Teški lanac CDR-2: Početak: uvek 15 ostatka posle kraja Kabat / AbM definicije, teškog lanca CDR-1; ostaci pre: tipično Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, ali brojne varijacije, ostaci posle Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala, dužina Kabat definicija 16 do 19 ostatka (definicija prema AbM; Chothia definicija završava 7 ostatka ranije)

Teški lanac CDR-3: Početak: uvek 33 ostatka posle kraja teškog lanca CDR-2 (uvek 2 aminokiseline posle Cys); ostaci pre uvek Cys-XXX-XXX (tipično Cys-Ala-Arg); ostaci posle uvek Trp-Gly-XXX-Gly; dužina: 3 do 25 ostatka. Ovaj set pravila je poznat stručnoj osobi i može se takoođe naći na http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid.

[0133] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, namerava da uključi antitela koja imaju promenljive i konstantne regije izvedene iz humanih linija zametka imunoglobulinskih sekvenci. Humani mAb mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim linijama zametka imunoglobulinskih sekvenci (npr., mutacije uvedene slučajnim ili ciljanim mutagenezama in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima. Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije nameravan da uključi "humanizovana antitela" u kojima su CDR sekvence izvedene iz linija zametka druge vrste sisara (npr., miša), koje su graftovane na humane FR sekvence. Humana antitela takođe uključuju antitela izolovana iz humanih imunoglobulinskih biblioteka ili iz životinja transgeničnih za jednu ili više humanih imunoglobulinskih gena i koje ne eksprimiraju endogene imunoglobuline.

[0134] Termin "monoklonsko antitelo" ovde se koristi da označi pripremu molekula antitela jedinstvene molekularne kompozicije. Monoklonsko antitelo pokazuje jedinstvenu specifičnost i afinitet vezivanja za određeni epitop. Monoklonska antitela mogu se proizvesti pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu od životinje koja nije čovek, npr. miša, spojenu s ćelijom koja je besmrtna. Termin "rekombinantno antitelo", kako se ovde koristi, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su (a) antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja je transgenična ili transhromozomska u pogledu gena za imunoglobulin ili hibridoma pripremljenog od nje, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da izrazi antitelo, npr. iz transfektome, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim sredstvima koja uključuju spajanje sekvenci gena za imunoglobulin s drugim DNK sekvencama. Kako se ovde koristi, "heterologno antitelo" je definisano u odnosu na transgenični organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin se odnosi na antitelo koje ima amino kiselinsku sekvencu ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj koja se nalazi u organizmu koji nije sastavljen od transgeničnog organizma i uglavnom je izvedeno iz vrste koja nije transgenični organizam. Kako se ovde koristi, "heterohibridno antitelo" se odnosi na antitelo koje ima lake i teške lance poreklom iz različitih organizama. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan s mišjim lakim lancem je heterohibridno antitelo.

[0135] Termin "antigen vezujući fragmenti" odnosi se na fragmente antitela koji zadržavaju funkciju specifičnog vezivanja za antigen ili antigenski protein, ali koji nemaju neka ili sva druga strukturna svojstva antitela ili veštačkih konstrukcija koje uključuju delove antitela. Poželjni primeri fragmenata koji se vezuju za antigen uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: Fab fragmente, Fc fragment, Fab' fragment, F(ab')2, jednodomenska antitela (sdAb), nanotela, jednolančane Fv, divalentne fragmente jednolančane varijable (di-scFvs), tandem scFvs, diatela, jednolančana diatela (scDB), triatela, dvospecifične T-ćelijske angažere (BiTEs) ili dvostruko afinitivne preusmeravajuće molekule (DART molekule).

[0136] "Fab fragmenti" (takođe poznati kao "Fab deo" ili "Fab regija") svaki sa jednim mestom vezivanja za antigen, i preostali "Fc fragment" (takođe poznat kao "Fc deo" ili "Fc regija") čije ime odražava njegovu sposobnost da se lako kristalizuje. "Fab' fragment", koji se odnosi na Fab fragment koji dodatno obuhvata region šarke nekog molekula Ig dok se "F(ab')2 fragmenti" razumeju da obuhvataju dva Fab' fragmenta koji su hemijski povezani ili povezani preko disulfidne veze. Dok sdAb (Desmyter et al.1996) i "nanotela" obuhvataju samo jedan VH domen, "jednolančani Fv (scFv)" fragmenti obuhvataju domen varijable teškog lanca povezan preko kratkog povezujućeg peptida s domenom varijable lakog lanca (Huston et al.1988). discFvs se mogu inženjerski dizajnirati povezivanjem dva scFvs (scFvA-scFvB). To se može Xčiniti proizvodnjom jednog peptidnog lanca sa dva VHi dva VLregiona, što rezultira "tandemskim scFvs" (VHA-VLA-VHB-VLB). Druga mogućnost je kreiranje scFvs sa poveznicima koji su prekratki da dva varijabilna regiona mogu da se slože zajedno, terajući scFvs da dimerizuju. Obično se koriste poveznici dužine 5 ostatak za generisanje ovih dimera. Ovaj tip je poznat kao "diatela". Još kraći poveznici (jedna ili dve amino kiseline) između VH i VL domena dovode do formiranja monospecifičnih trimera, tzv. "triatela" ili "tritela". Bispecifična diatela se formiraju eksprimiranje dva lanca sa rasporedom VHA-VLB i VHB-VLA ili VLA-VHB i VLB-VHA, respektivno. Jednolančana diatela (scDb) obuhvataju VHA-VLB i VHB-VLA fragment koji je povezan povezujućim peptidom (P) od 12-20 amino kiselina, poželjno je od 14 amino kiselina, (VHA-VLB-P-VHB-VLA). "Bispecifični T-ćelijski angažeri (BiTEs)" su fuzijski proteini koji se sastoje od dva scFvs različitih antitela gde jedan od scFvs vezuje za T ćelije preko CD3 receptora, a drugi za tumorsku ćeliju preko specifičnog molekula za tumor (Kufer et al.2004)). Dvostruko afinitivni preusmeravajući molekuli ("DART" molekuli) su diatela dodatno stabilizovana preko C-terminalne disulfidne veze.

[0137] Termin "antitelu-sličan protein" odnosi se na protein koji ima slična svojstva kao antitelo u tome što se vezuje za antigen ili antigenski protein bez nužno posedovanja strukturnih osobina antitela. Antitelu-slični proteini mogu se prirodno pojavljivati ili mogu biti veštački dizajnirani, npr. biotehnološki. Primeri prirodno pojavnih antitelu-sličnih proteina uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine koji se vezuju za antigen kao npr. familija lipokalina, koji predstavljaju familiju različitih proteina koji obično služe za skladištenje ili transport fiziološki važnih jedinjenja. Oni dele konzervirani motiv barela od osam antiparalelnih ȕ-struktura kao svoj centralni motiv savijanja i obuhvataju na jednom kraju ove barel strukture šest hipervarijabilnih petlji koje su povezane sa svakim parom ȕ-struktura. Ove petlje formiraju ulaz u vezujući džep. Strukturna raznolikost među članovima familije lipokalina odražava različite oblike i hemijske osobine njihovih vezujućih partnera. Dakle, iako su sastavljeni od jednog polipeptidnog lanca i mnogo su manji od imunoglobulina, oni pokazuju ogroman potencijal za vezivanje antigena različitih specifičnosti. Primeri veštački dizajniranih antitelu-sličnih proteina uključuju proteinske skelete koji su generisani spajanjem peptida sa poznatom afinitetom prema određenom cilju ili umetanjem takvih peptida u proteinski skelet kako bi se kombinovale vezujuće osobine peptida sa željenim povoljnim karakteristikama nosača skeleta. Stručnoj osobi je poznat veliki broj takvih proteinskih skeleta. Termin "proteinski skelet" kako se ovde koristi odnosi se na protein koji poseduje strukturnu čvrstinu, tj. savija se u stabilnu tercijarnu strukturu. Amino kiseline proteinskog skeleta verovatno zauzimaju definisanu trodimenzionalnu poziciju unutar proteinskog skeleta. Dakle, ako se jedna ili više amino kiselina proteinskog skeleta zameni polipeptidom odgovarajuće dužine, polipeptid će zauzeti slične pozicije kao one koje su zamenjene. To omogućava pozicioniranje datog polipeptida na definisanu trodimenzionalnu lokaciju i/ili orijentaciju unutar proteinskog skeleta. Stoga se proteinski skeleti mogu koristiti kao alternativa antitelima za molekularno prepoznavanje (vidi, npr. Skerra A.: (2007) Curr. Opin. Biotechnol.2007, 18:295-304 ili Skerra A. (2000) J. Mol. Recognit.2000, 13:167-187). Jedan primer takvog proteinskog skeleta je Fyn SH3 domen, koji obuhvata dva domena koja mogu biti mutirana da prenesu novu specifičnost vezivanja SH3 domenu. Metode za selekciju Fyn SH3 domena koji se specifično vezuju za dati antigen su objavljene, npr. u WO 2000/072742 ili WO 2008/022759.

[0138] U kontekstu predmetnog otkrića, termin "peptidomimetici" se koristi za bilo koji molekul čiji su esencijalni elementi (farmakofore) dizajnirani da oponašaju prirodni peptid ili protein u 3D prostoru i koji zadržavaju sposobnost interakcije sa biološkom metom i proizvodnje istog biološkog efekta. Peptidomimetici uključuju male proteinske lance dizajnirane da oponašaju peptid, koji se obično dobija ili modifikacijom postojećeg peptida, ili dizajniranjem sličnih sistema koji oponašaju peptide, kao što su npr. peptoidi i ȕ-peptidi. Bez obzira na pristup, izmenjena hemijska struktura je dizajnirana da povoljno prilagodi molekularne osobine, tako što npr. povećava ili smanjuje stabilnost ili biološku aktivnost. Takve modifikacije uključuju promene u peptidu koje se prirodno ne dešavaju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, promenjene osnove i uključivanje neprirodnih amino kiselina.

[0139] Termini "specifično vezivanje" ili "specifično se vezuje" za antigen, npr. Faktor 1 ili Faktor 2, odnose se na sposobnost liganda da se veže za antigenu determinantu nekog antigena sa visokim afinitetom. U tom kontekstu "visok afinitet" znači da je Kdza interakciju ispod 1 × 10<-5>M, poželjno ispod 1 × 10<-6>M, još poželjnije ispod 1 × 10<-7>M, čak i poželjnije ispod 1 × 10<-8>M i najpoželjnije ispod 1 × 10<-9>M.

[0140] Poželjna antitela za upotrebu su monoklonska antitela, poželjno humana ili humanizovana antitela.

[0141] Inhibitor može biti nukleinska kiselina koja inhibira ili sprečava transkripciju i/ili translaciju iRNK koja kodira protein koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 3 ili varijantu toga, koja ima najmanje 80% identiteta sekvenci sa amino kiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 1 ili 3. Osoba stručna u oblasti dobro zna kako da odredi sekvencu takvih nukleinskih kiselina na osnovu genomskog sekvenciranja proteina koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 3. Jedan primer takvih inhibitornih nukleinskih kiselina su siRNK specifične za iRNK koje kodiraju Faktor 1 ili Faktor 2.

[0142] U onim slučajevima kada je inhibitor protein koji može biti kodiran nukleinskom kiselinom, predviđa se da se inhibitor primenjuje obezbeđivanjem nukleinske kiseline koja kodira inhibitor. Stoga, takođe otkriveno ovde, ali ne čini deo predmetnog pronalaska, je da je nukleinska kiselina koja kodira inhibitor, kako je otkriveno gore, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju bolesti u kojima angiogeneza doprinosi razvoju ili progresiji bolesti. Nukleinska kiselina može dalje obuhvatati bilo koji od elemenata opisanih u kontekstu drugog aspekta iz ovog pronalaska.

[0143] Stoga, takođe je otkriveno, ali ne čini deo predmetnog pronalaska, je vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu kako je otkriveno gore, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju bolesti u kojima angiogeneza doprinosi razvoju ili progresiji bolesti. Termin "vektor" u ovom kontekstu ima isto značenje kao što je opisano gore.

[0144] Vektor može biti virusni vektor. Prikladni virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, adenovirusne vektore, adeno-asocirane virusne (AAV) vektore, alfaviralne vektore, herpes virusne vektore, morbiline virusne vektore, virusne vektore boginja, vektore virusa vesikularnog stomatitisa, retrovirusne vektore i lentivirusne vektore. Dalje, takođe je otkriveno, ali ne čini deo predmetnog pronalaska, da farmaceutska kompozicija obuhvata inhibitor kako je otkriveno gore, odgovarajuću nukleinsku kiselinu ili odgovarajući vektor i po potrebi odgovarajući farmaceutski ekscipijent, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju bolesti u kojima angiogeneza doprinosi razvoju ili progresiji bolesti. Ova farmaceutska kompozicija takođe može obuhvatati bilo koji od sastojaka navedenih gore.

[0145] Termin "bolest u kojoj angiogeneza doprinosi razvoju ili progresiji bolesti" kako se koristi u gore navedenom kontekstu odnosi se na bolesti u kojima se proliferacija ćelija koje formiraju krvne sudove dešava na početku, tokom razvoja i/ili tokom progresije bolesti. ûelije koje formiraju krvne sudove i koje mogu proliferirati uključuju endotelske ćelije koje oblažu unutrašnjost krvnog suda i glatke mišićne ćelije koje formiraju zid krvnog suda. Ni endotelske ćelije ni glatke mišićne ćelije ne proliferiraju u zdravom sudu. Ove ćelije proliferiraju, npr. kao odgovor na povredu ili hemijske signale kao što su npr. VEGF. Angiogeneza se takođe naziva neovaskularizacija i karakteriše proces formiranja novih krvnih sudova iz postojećih sudova. U nekim bolestima kao što su bolesti okularne angiogeneze, abnormalno formiranje krvnih sudova je uzrok bolesti i u nekim bolestima kao što su benigni ili maligni tumori. Angiogeneza se dešava tokom progresije bolesti i podržava rastuću tumorsku masu kiseonikom i hranljivim materijama. U tim bolestima angiogeneza nije uzrok bolesti, ali olakšava progresiju bolesti. Neovaskularizacija malignih tumora takođe doprinosi progresiji bolesti tako što obezbeđuje ćelijama tumora put za beg iz tumorske mase, čime se pomaže metastaziranje.

[0146] Poželjno je da bolest u kojoj angiogeneza doprinosi razvoju ili progresiji bolesti bude proliferativna bolest. Poželjne proliferativne bolesti su odabrane iz grupe koja uključuje benigne tumore, maligne tumore, reumatoidni artritis, psorijazu, bolesti okularne angiogeneze, Osier-Veber sindrom, neovaskularizaciju plaka, stenozu transplantata i post-angioplastičnu stenozu, telangiektaziju, hemofilične zglobove, angiofibrom, granulaciju rana, intestinalne adhezije, ateriosklerozu, sklerodermu, hipertrofične ožiljke, bolest mačje ogrebotine i ulkuse, posebno degeneraciju makule, rak nadbubrežne žlezde, rak bešike, rak kostiju, rak mozga, rak dojke, rak grlića materice, rak debelog creva, rak kolorektuma, rak endometrija, rak jednjaka, rak oka, rak žučne kesice, rak želuca, rak glave i vrata, rak grkljana, rak jetre, rak pluća, melanom, mijeloproliferativni poremećaji, rak vrata, rak kože koji nije melanom, rak jajnika, rak prostate, benigna hiperplazija prostate, rak pankreasa, rak rektuma i rak testisa. Poželjne bolesti za lečenje su benigni tumori, maligni tumori i bolesti okularne angiogeneze.

[0147] Sadašnji istraživači su identifikovali da antitela usmerena protiv određenih epitopa Faktora 1 i Faktora 2 ometaju pro-angiogeničnu funkciju Faktora 1 i Faktora 2, redom, tj. da su antagonska antitela. Stoga su takođe otkriveni, ali ne čine deo predmetnog pronalaska, ligandi Faktora 1 i Faktora 2 koji inhibiraju pro-angiogeničnu aktivnost Faktora 1 i Faktora 2, redom. Posebno su poželjna antitela ili njihovi fragmenti koji inhibiraju pro-angiogeničnu aktivnost Faktora 1 i Faktora 2, redom. Sadašnji istraživači su uspešno pružili primere takvih inhibitornih antitela stvarajući antitela koja se specifično vezuju za površinski izložene domene Faktora 1 i 2. Takođe su otkriveni ligandi koji su sposobni da se specifično vežu za ove fragmente iz Faktora 1 i 2, redom. U kontekstu ovih, definicije koje su obezbeđene u opštem delu definicija i specifične definicije u datom kontekstu jednako su primenljive.

[0148] Stoga, takođe je otkriven, ali ne čini deo ovog pronalaska, ligand, poželjno antitelo ili njegov fragment, ili antitelu-sličan protein koji se specifično veže za epitop humanog proteina Faktora 1 koji obuhvata amino kiseline od 61 do 76 prema SEQ ID NO: 1 ili za region drugog proteina Faktora 1 koji odgovara ovom epitopu.

[0149] Takođe je otkriven, ali ne čini deo ovog pronalaska, ligand, poželjno antitelo ili njegov fragment, ili antitelu-sličan protein koji se specifično veže za epitop humanog proteina Faktora 2 koji obuhvata amino kiseline od 181 do 195 prema SEQ ID NO: 3 ili za region drugog proteina Faktora 2 koji odgovara ovom epitopu.

[0150] Termin "region drugog proteina Faktora 1 ili 2 koji odgovara ovom epitopu" može se odnositi na amino kiselinsku sekvencu drugog proteina Faktora 1 ili 2 koja se poklapa sa navedenim amino kiselinskim sekvencama Faktora 1 ili 2 kada se koriste standardni alati za poravnanje, kao što je npr. ClustalW i standardni parametri kako je gore opisano. Slike 6 do 11 prikazuju nekoliko takvih poravnanja proteina Faktora 1 i 2. Osoba stručna u oblasti može lako identifikovati segment SEQ ID NO: 2 koji ima aminokiselinsku sekvencu CTIWRPQGKSYLYFTQ (SEQ ID NO: 38) i odrediti odgovarajuće amino kiseline iz drugog proteina Faktora 1.

PRIMERI

[0151] Primeri su dizajnirani kako bi dodatno ilustrovali ovaj pronalazak i omogućili bolje razumevanje. Ne treba ih shvatiti kao ograničenje opsega pronalaska na bilo koji način.

Primer 1:

[0152] U više-centričnom, placebo-kontrolisanom kliničkom ispitivanju testirani su efekti intrakoronarne infuzije autolognih koštanih ćelija kod pacijenata sa AMI, što je uradio jedan od pronalazača (BOOST-2, Controlled Trials Identification No. ISRCTN17457407). U okviru ovog ispitivanja, aspirati koštane srži su dobijeni od pacijenata sa AMI u svrhe istraživanja. CXCR4+ ćelije koštane srži su izolovane magnetnom separacijom ćelija (MiniMACS™, Miltenyi Biotec). Nakon dva koraka prečišćavanja, dobijena je obogaćena populacija ćelija CXCR4+ (>95% čistoće potvrđene tokom citometrije). Zatim je izolovana RNK iz ovih ćelija i korišćena u mikrtest analizi (Affymetrix GeneChip HG_U133 Plus 2.0). U naknadnoj bioinformatičkoj analizi, pregledano je 4000 ekspresionih sekvenci (ESTs) koje su najjače eksprimirane od strane CXCR4+ ćelija koštane srži u mikrotestu. Serija bioinformatičkih alata je korišćena za identifikaciju potencijalnih sekretovanih faktora među tim EST-ovima koji su karakterisani N-terminalnim signalnim peptidom, odsustvom mitohondrijskih ili nuklearnih signalnih peptida, odsustvom endoplazmatskog zadržavajućeg niza i odsustvom transmembranskih domena.

Ukupno je identifikovano 283 potencijalna sekretovana faktora; za 117 od njih je pronađeno u NCBI Blast-u da ima mišji homolog. cDNKs ljudskih homologa su klonirane u ekspresione plazmide koje su zatim pojedinačno transficirane u ljudske embrionske bubrežne (HEK) ćelije. Transficirane HEK ćelije su gajene u medijumu bez seruma da bi se dobili kondicionirani kultivacioni supernatanti nakon 30 sati. Kondicionirani supernatanti HEK ćelija su pojedinačno testirani za pro-angiogene efekte u minijaturizovanim angiogenim testovima i za citoprotektivne efekte u testovima smrti kardiomiocita. Ovim pregledom identifikovana su 2 sekretovana proteina; 'Faktor 1' je pokazao pro-angiogene i citoprotektivne efekte u gore navedenim testovima; 'Faktor 2' je pokazao pro-angiogene efekte u gore navedenim testovima.

[0153] Sekvence identifikovane u pregledu i odgovarajući mišji ili humani homolozi su:

Faktor 1:

[0154] Humani Faktor 1 je identifikovan u pregledu i korišćen u Primeru 2 i Slici 1:

Homo sapiens hromozom 19 otvoreni čitalački okvir 10 (C19Orf10)

Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani Faktor 1 je dostupna pod NCBI Referentnom Sekvencom: NM_019107.3 (SEQ ID NO: 6). Aminokiselinska sekvenca humanog Faktora 1 je prikazana na Slici 6 (SEQ ID NO: 2).

[0155] Mišji homolog je korišćen u Primerima 3-6 i Slikama 2-5:

Mus musculus DNK segment, Chr 17, Wayne State University 104, eksprimiran (D17Wsu104e) Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji Faktor 1 je dostupna pod NCBI Referentnom Sekvencom: NM_080837.2 (SEQ ID NO: 7). Amino kiselinska sekvenca mišjeg Faktora 1 je prikazana na Slici 6 (SEQ ID NO: 13).

Faktor 2:

[0156] Humani Faktor 2 u njegovom sekretovanom obliku je identifikovan u pregledu i korišćen u Primeru 2 i Slici 1:

Homo sapiens hromozom 19 otvoreni čitalački okvir 63 (C19orf63), transkriptna varijanta HSS1. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani Faktor 2 je dostupna pod NCBI Referentnom Sekvencom: NM_175063.4 (SEQ ID NO: 8). Aminokiselinska sekvenca sekretovanog oblika humanog Faktora 2 je prikazana na Slici 8 (SEQ ID NO: 4).

[0157] Humani Faktor 2 u njegovim transmembranskim oblicima:

Homo sapiens hromozom 19 otvoreni čitalački okvir 63 (C19orf63), transkriptna varijanta HSM1. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski oblik humanog Faktora 2 je dostupna pod NCBI Referentnom Sekvencom: NM_206538.2 (SEQ ID NO: 9). Amino kiselinska sekvenca transmembranskog oblika humanog Faktora 2 je prikazana na Slici 10 (SEQ ID NO: 5).

[0158] Amino kiselinska sekvenca varijante transmembranskog oblika humanog Faktora 2 je dostupna u GenBank: AY358710.1 (SEQ ID NO: 34).

[0159] Mišji homolog sekretovanog oblika je korišćen u Primerima 4-6 i Slikama 3-5:

Mus musculus hematopoetični signal koji sadrži peptid sekretovan 1 (2310044H10Rik) iRNK, kompletni cds, alternativno splicovan. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski oblik mišjeg Faktora 2 je dostupna u GenBank: AY761096.1 (SEQ ID NO: 10) Amino kiselinska sekvenca sekretovanog oblika mišjeg Faktora 2 je prikazana na Slici 8 (SEQ ID NO: 24).

[0160] Mišji homolog transmembranskog oblika:

Mus musculus RIKEN cDNK 2310044H10 gen (2310044H10Rik). Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski oblik mišjeg Faktora 2 je dostupna pod NCBI Referentnom Sekvencom: NM_197991.2 (SEQ ID NO: 11). Amino kiselinska sekvenca transmembranskog oblika mišjeg Faktora 2 je prikazana na Slici 10 (SEQ ID NO: 29).

Primer 2:

[0161] Da bi potvrdili pro-angiogene aktivnosti uočene u pregledu, oba faktora (humani homolozi kodirani sekvencama nukleinske kiseline prikazanim u SEQ ID NO: 6 i 8) proizvedena su u COS7 ćelijama kao rekombinantni proteini označeni His-tagom. Kako je prikazano na Slici 1, rekombinantni Faktor 1 i rekombinantni Faktor 2 promovisali su dozno-zavisne pro-angiogene efekte na kultivisanim humanim endotelnim ćelijama.

[0162] Humane endotelijske ćelije koronarne arterije (HCAEC) i humane endotelijske ćelije pupčane vene (HUVEC) su kupljene od Provitro (Berlin, Nemačka). ûelije su kultivisane 24 sata u minimalnom medijumu u odsustvu (kontrola) ili prisustvu 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), humanog rekombinantnog VEGF-A (R&D Systems), ili različitih koncentracija rekombinantnog humanog Faktora 1 (SEQ ID NO: 2) ili Faktora 2 (SEQ ID NO: 4), kako je naznačeno. (A) Proliferacija HCAEC je merena inkorporacijom bromodeoksiuridina. (B) Migracija HCAEC je procenjena nakon ranjavanja konfluentnog monosloja endotelijalnih ćelija pipetnim vrhom. (C) Formiranje mreže HUVEC je procenjeno u ćelijama kultivisanim na Matrigel-u sa smanjenim faktorom rasta. N = 3-5 nezavisnih eksperimenata po uslovu; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 u odnosu na kontrolu (vidi Sliku 1).

Primer 3:

[0163] Da bi potvrdili kardiomiocit-zaštitne efekte Faktora 1 uočene u pregledu, neonatalni kardiomiociti pacova iz ventrikula bili su izloženi simuliranoj ishemijsko-reperfuzijskoj povredi u prisustvu ili odsustvu rekombinantnog Faktora 1. Faktor 1 (mišji homolog kodiran sekvencom nukleinske kiseline prikazanom u SEQ ID NO: 7) je proizveden u COS7 ćelijama kao rekombinantni protein označen His-tagom. Kako je prikazano na Slici 2, rekombinantni Faktor 1 promovisao je dozno-zavisne anti-apoptotske efekte na kultivisanim kardiomiocitima.

[0164] Kardiomiociti iz ventrikula izolovani su od 1 do 3 dana starih pacova Sprague-Dawley pomoću centrifugiranja na gradijentu gustine Perkol. Kardiomiociti su bili izloženi simuliranoj ishemiji 180 minuta (medijum bez glukoze koji sadrži 2-deoksiglukozu u atmosferi 5% CO2/ 95% N2) nakon čega je usledila simulirana reperfuzija 60 minuta (povratak u medijum sa glukozom u 5% CO2/ 95% sobnog vazduha) u odsustvu (kontrola) ili prisustvu rekombinantnog humanog GDF-15 (R&D Systems, poznati anti-apoptotski citokin) ili različitih koncentracija rekombinantnog mišjeg Faktora 1, kako je naznačeno. Smrt ćelija je procenjena in situ TdT-posredovanom dUTP nick end-označavanjem (TUNEL). N = 3 nezavisna eksperimenta po uslovu; *P < 0.05 u odnosu na kontrolu.

Primer 4:

[0165] Da bi se istražio terapeutski potencijal Faktora 1 i Faktora 2 u okolnosti AMI, adenovirusi koji kodiraju mišje homologe Faktora 1 ili Faktora 2 (sekvence nukleinske kiseline prikazane u SEQ ID NO: 7 i 10) su generisani i testirani u mišjem modelu AMI. Adenoviralna ekspresija oba faktora rezultirala je poboljšanjem sistoličke funkcije leve komore 28 dana nakon infarkta. To je bilo povezano sa povećanjem gustine kapilara u zoni granice infarkta (Slika 3).

[0166] cDNK Faktora 1 ili Faktora 2 miša su klonirane u replikaciono-deficitne adenoviruse koristeći AdEasy XL Vector System (Stratagene). Replikaciono-deficitni adenovirus koji kodira -galaktozidazu (lacZ) korišćen je kao kontrola. Virus je prečišćen pomoću Adeno-X Virus Purification Kit (BD Biosciences). Mužjaci miševa C57BL/6 starosti 10 do 12 nedelja su anestezirani i ventilirani izofluranom (1-2%) i podvrgnuti su stalnoj ligaciji leve prednje silazne koronarne arterije (LAD). Virus (5 × 109 p.f.u.) je ubrizgan u šupljinu leve komore (LV) odmah nakon ligacije LAD. (A) Sistolička funkcija leve komore (promena frakcionalne površine, FAC) je procenjena transtorakalnom ehokardiografijom (Visualsonics) 28 dana nakon ligacije LAD (N = 10-12 miševa po grupi). (B) Gustina kapilara pozitivnih na izolektin u zoni granice infarkta je kvantifikovana fluorescentnom mikroskopijom 28 dana nakon ligacije LAD (N = 3 miša po grupi). *P < 0.05, **P < 0.01 u odnosu na Ad. lacZ kontrolu.

Primer 5:

[0167] Da bi se istražio terapeutski potencijal Faktora 1 i Faktora 2 kada se primenjuju kao rekombinantni proteini u kontekstu reperfuziranog AMI (simulirajući kliničku situaciju kod pacijenata sa AMI koji primaju terapiju reperfuzijom), mužjaci miševa C57BL/6 starosti 10 do 12 nedelja podvrgnuti su ligaciji koronarne arterije na 1 sat (ishemija) nakon čega je usledila reperfuzija u trajanju od 28 dana. Miševi su tretirani s.c. sa oba faktora tokom prvih 7 dana nakon reperfuzije. Faktor 1 i Faktor 2 (mišji homolozi; amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 13 i 24) proizvedeni su u ćelijama HEK293 kao His-tagovani rekombinantni proteini. Tretman rekombinantnim Faktorom 1 ili rekombinantnim Faktorom 2 rezultirao je značajnim poboljšanjem sistoličke funkcije leve komore 28 dana nakon infarkta. To je bilo povezano sa značajnim povećanjem gustine kapilara u zoni granice infarkta (Slika 4).

[0168] Mužjaci miševa C57BL/6 starosti 10 do 12 nedelja bili su anestezirani i ventilirani izofluranom (1-2%) i podvrgnuti su privremenoj ligaciji leve prednje silazne koronarne arterije na 1 sat nakon čega je usledila reperfuzija tokom 28 dana. Miševi su primili jednu s.c. injekciju rekombinantnog Faktora 1 ili Faktora 2 (10 µg svaki) u vreme reperfuzije (kontrolnim miševima je injektiran PBS). Nakon toga je usledila kontinuirana s.c. infuzija rekombinantnog Faktora 1 ili Faktora 2 pomoću Alzet minipumpi (10 µg/dan). Kontrolni miševi su infuzirani sa PBS. (A) Sistolička funkcija leve komore (promena frakcionalne površine, FAC) procenjena je transtorakalnom ehokardiografijom 28 dana nakon reperfuzije (N = 10-13 miševa po grupi). (B) Gustina kapilara pozitivnih na izolektin u zoni granice infarkta kvantifikovana je fluorescentnom mikroskopijom 28 dana nakon reperfuzije (N = 6 miševa po grupi). *P < 0.05, **P < 0.01 u odnosu na PBS kontrolu.

Primer 6:

[0169] Da bi se istražilo da li Faktor 1 i Faktor 2, kada se primenjuju kao rekombinantni proteini, mogu poboljšati preživljavanje nakon reperfuziranog AMI, miševi su podvrgnuti ligaciji koronarne arterije na 1 sat nakon čega je usledila reperfuzija tokom 28 dana. Miševi su tretirani s.c. sa oba faktora tokom prvih 7 dana nakon reperfuzije. Faktor 1 i Faktor 2 (mišji homolozi; SEQ ID NO: 7 i 10) proizvedeni su u ćelijama HEK293 kao His-tagovani rekombinantni proteini. Tretman rekombinantnim Faktorom 1 ili Faktorom 2 rezultirao je značajnim poboljšanjem preživljavanja tokom prvih 28 dana nakon infarkta (Slika 5).

[0170]Mužjaci miševa C57BL/6 starosti 10 do 12 nedelja bili su anestezirani i ventilirani izofluranom (1-2%) i podvrgnuti su privremenoj ligaciji leve prednje silazne koronarne arterije na 1 sat nakon čega je usledila reperfuzija tokom 28 dana. Miševi su primili jednu s.c. injekciju rekombinantnog Faktora 1 ili Faktora 2 (10 µg svaki) u vreme reperfuzije (kontrolnim miševima je injektiran PBS). Nakon toga je usledila kontinuirana s.c. infuzija rekombinantnog Faktora 1 ili

[0171] Faktora 2 pomoću Alzet minipumpi (10 µg/dan). Kontrolni miševi su infuzirani sa PBS. Miševi su dnevno pregledani tokom 28 dana radi procene preživljavanja nakon infarkta. N = 29 miševa tretiranih sa PBS; N = 25 miševa tretiranih sa Faktorom 1; N = 15 miševa tretiranih sa Faktorom 2.

Primer 7:

[0172] Homologne sekvence proteina kodiranog humanim C19Orf10 identifikovane su pomoću BLASTP algoritma na http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PA GE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome. SEQ ID NO: 2 je korišćen kao matrica.

[0173] Korišćeni parametri su podrazumevani parametri: 11 ekstenzija: 1, kompoziciona prilagođavanja = uslovna kompoziciona matrica ocena prilagođavanja zajedno sa bazom podataka neredundantnih proteinskih sekvenci (nr).

[0174] Iz identifikovanih sekvenci izabrani su primeri iz različitih vertebrata, uglavnom sisara, ali i jedna sekvence iz amfibija, ptica i riba. Ove sekvence su navedene u Tabeli 1.

[0175]Odabrane amino kiselinske sekvence su poravnate koristeći CLUSTALW2 algoritam na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Korišćeni parametri su podrazumevani parametri: Tip poravnanja = Sporo, matrica težine proteina = Gonnet, otvaranje praznine = 10, produžetak praznine = 0,20, razmak praznina = 5, bez završnih praznina = ne, Opcije ispisa: format = Aln s/brojevima, Redosled = poravnato. Dobijena višestruka poravnanja prikazana su na Slici 6 za sve sekvence i na Slici 7 za sekvence sisara.

Tabela 1: Homologne amino kiselinske sekvence humanog Faktora 1 identifikovane BLASTP algoritmom. Sekvence Homo sapiens su korišćene kao matrica.

Primer 8:

[0176] Homologne sekvence proteina kodiranog humanom C19Orf63 splice varijantom HSS1 pretraživane su pomoću BLASTP algoritma na http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PA GE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome. SEQ ID NO: 4 je korišćena kao matrica.

[0177] Korišćeni parametri su podrazumevani parametri: 11 ekstenzija: 1, kompoziciona prilagođavanja = uslovna kompoziciona matrica ocena prilagođavanja zajedno sa bazom podataka neredundantnih proteinskih sekvenci (nr).

[0178] Iz identifikovanih sekvenci izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i jedna sekvence iz amfibija i ribe. Te sekvence su navedene u tabeli 2.

[0179] Odabrane amino kiselinske sekvence su poravnate koristeći CLUSTALW2 algoritam na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Korišćeni parametri su podrazumevani parametri: Tip poravnanja = Sporo, matrica težine proteina = Gonnet, otvaranje praznine = 10, produžetak praznine = 0,20, razmak praznina = 5, bez završnih praznina = ne, Opcije ispisa: format = Aln s/brojevima, Redosled = poravnato. Dobijena višestruka poravnanja prikazana su na Slici 8 za sve sekvence i na Slici 9 za sekvence sisara.

Tabela 2: Homologne amino kiselinske sekvence sekretirane forme humanog Faktora 2 identifikovane sa BLASTP algoritmom. Sekvence Homo sapiens su korišćene kao matrica.

Primer 9:

[0180] Homologne sekvence proteina kodiranog humanim C19Orf63 splice varijantom HSM1 pretraživane su pomoću BLASTP algoritma na http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PA GE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome. SEQ ID NO: 5 je korišćena kao matrica.

[0181] Korišćeni parametri su podrazumevani parametri: 11 ekstenzija: 1, kompoziciona prilagođavanja = uslovna kompoziciona matrica ocena prilagođavanja zajedno sa bazom podataka neredundantnih proteinskih sekvenci (nr).

[0182] Iz identifikovanih sekvenci izabrani su primeri iz različitih vrsta kičmenjaka, uglavnom sisara, ali i jedna sekvenca iz amfibija i ribe. Te sekvence su navedene u tabeli 3.

[0183] Odabrane amino kiselinske sekvence su poravnate koristeći CLUSTALW2 algoritam na http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Korišćeni parametri su podrazumevani parametri: Tip poravnanja = Sporo, matrica težine proteina = Gonnet, otvaranje praznine = 10, produžetak praznine = 0,20, razmak praznina = 5, bez završnih praznina = ne, Opcije ispisa: format = Aln s/brojevima, Redosled = poravnato. Dobijena višestruka poravnanja prikazana su na Slici 10 za sve sekvence i na Slici 11 za sekvence sisara.

Tabela 3: Homologne amino kiselinske sekvence transmembranske forme humanog Faktora 2 identifikovane BLASTP algoritmom. Sekvence Homo sapiens su korišćene kao matrica.

Primer 10:

[0184] ûelije humanih koronarnih arterijskih endotela (HCAECs, od Provitro) su gajene u T75 bocama u EGM-2 medijumu (Lonza) dopunjenom sa 10% FCS (Biochrom). Koristile su se ćelije od 3-6 pasaža. Pre stimulacije različitim agensima, ćelije su kultivisane preko noći u MCDB131 medijumu (Life Technologies) koji sadrži 2% FCS. HCAECs su zatim posejane u ploče sa 96 bunarčLća (5 × 10<3>ćelija po bunarčLću), i stimulisane su rekombinantnim humanim Faktorom 1, rekombinantnim humanim Faktorom 2, ili VEGF-om (pozitivna kontrola) u prisustvu ili odsustvu različitih koncentracija antitela protiv Faktora 1 kunića, antitela protiv Faktora 2 kunića, ili kontrolnog IgG tokom 16 sati. Antitela su proizvedena od strane Eurogentec i bila su usmerena protiv polipeptida sadržanih u humanom Faktoru 1 (CTIWRPQGKSYLYFTQ, SEQ ID NO: 38, tj. aminokiseline 61 do 76 SEQ ID NO: 1) ili Faktoru 2 (CEQAQKAKNPQEQKSF; SEQ ID NO: 39, tj. aminokiseline 181 do 195 SEQ ID NO: 3 plus N-terminalni Cys).

Proliferacija ćelija je merena kolorimetrijskim BrdU inkorporacionim imunoesejom (Roche). Podaci su prikazani na Slici 12 (panel A Faktor 1; panel B Faktor 2; podaci su prosečne vrednosti ± SEM iz 3-6 eksperimenata).

Claims

Patentni zahtevi

1. Protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1, ili fragment ili varijantu te sekvence, za upotrebu kao lek,

pri čemu fragment ili varijanta (i) ima najmanje 90% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 1 duž cele dužine SEQ ID NO: 1, i pri čemu fragment ili varijanta (ii) pokazuje anti-apoptotski potencijal i štiti ćelije ili tkivo od apoptotske smrti ćelija, pri čemu je anti-apoptotski potencijal najmanje 50% od onog kod proteina sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 1.

2. Protein ili fragment ili varijanta za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je lek namenjen za (i) lečenje bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od atrofije, hipoplazije, povrede, rana, ishemije, poželjno ishemije srca, povrede reperfuzije, poželjno povrede reperfuzije srca, traume, mehaničkog preopterećenja, trovanja, operacije, primarne ili stečene kardiomiopatije, postishemične kontraktilne disfunkcije, infarkta miokarda, poželjno akutnog infarkta miokarda, angine pektoris, zatajenja srca, upale srca, i poremećaja skeletnih mišića, pri čemu je poremećaj skeletnih mišića izabran iz grupe koja se sastoji od mišićne distrofije, mišićne slabosti, mišićne atrofije, miozitisa, centralne bolesti jezgra, nemalinske (šipkaste) miopatije, centronuklearne miopatije, miotubularne miopatije, centronuklearne miotubularne miopatije, oftalmoplegije oka, i mitohondrijske miopatije;

(ii) poboljšanje sistoličke funkcije leve komore nakon infarkta miokarda; ili

(iii) zaštitu kardiomiocita od apoptoze kod pacijenta.

3. Protein za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu protein sadrži SEQ ID NO: 2 ili fragment SEQ ID NO: 2 koji ima deleciju do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 aminokiselina, poželjno gde je delecija na N-terminusu.

4. Protein za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu protein sadrži SEQ ID NO: 1.

5. Protein za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu se protein sastoji od SEQ ID NO: 1.

6. Protein ili fragment ili varijanta za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je lek namenjen za lečenje primarne kardiomiopatije, poželjno nasledne kardiomiopatije ili kardiomiopatije uzrokovane spontanim mutacijama.

7. Protein ili fragment ili varijanta za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5 ili fragment ili varijanta istih, za upotrebu u lečenju stečene kardiomiopatije, poželjno ishemijske kardiomiopatije uzrokovane aterosklerotičnim ili drugim bolestima koronarnih arterija, kardiomiopatije uzrokovane infekcijom ili trovanjem miokarda, hipertenzivne srčane bolesti uzrokovane plućnom arterijskom hipertenzijom i/ili arterijskom hipertenzijom i bolestima srčanih zalistaka.

8. Protein ili fragment ili varijanta za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je kardiomiopatija izabrana iz grupe koja se sastoji od hipertrofične kardiomiopatije (HCM ili HOCM), aritmogene desne ventrikularne kardiomiopatije (ARVC), izolovane ventrikularne nekompakcione mitohondrijske miopatije, dilatativne kardiomiopatije (DCM), restriktivne kardiomiopatije (RCM), Takotsubo kardiomiopatije, Loeflerovog endokarditisa, dijabetičke kardiomiopatije, alkoholne kardiomiopatije ili kardiomiopatije povezane sa gojaznošću.

9. Nukleinska kiselina koja kodira protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1, ili fragment ili varijantu iste, za upotrebu kao lek,

pri čemu fragment ili varijanta (i) ima najmanje 90% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 1 duž cele dužine SEQ ID NO: 1, i gde fragment ili varijanta (ii) pokazuje anti-apoptotski potencijal i štiti ćelije ili tkivo od apoptotske smrti ćelija, pri čemu je anti-apoptotski potencijal najmanje 50% od onog kod proteina sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 1.

10. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1, ili fragment ili varijantu iste, za upotrebu kao lek,

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu kao lek, gde navedena kompozicija obuhvata:

(i) protein ili fragment ili varijantu kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 8, (ii) nukleinsku kiselinu kako je definisano u zahtevu 9, ili

(iii) vektor kako je definisano u zahtevu 10, i

po izboru pogodan farmaceutski ekscipient.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu je navedena farmaceutska kompozicija formulisana za primenu putem oralnog, intravenskog, intramukoznog, intraarterijskog, intramuskularnog ili intrakoronarnog puta.

13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 11 do 12, formulisana za primenu pre, istovremeno ili posle terapije reperfuzijom.

14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 12 do 13, pri čemu primena je putem jedne ili više bolusne(ih) injekcije(a) i/ili infuzije(a).