RS65559B1

RS65559B1 - Sastav il-1beta inhibitora i njegova upotreba

Info

Publication number: RS65559B1
Application number: RS20240597A
Authority: RS
Inventors: Yan Lavrovsky; Ting Xu; Alexey Repik; Tao Xu; Vasily Ignatiev; Mikhail Samsonov
Original assignee: R Pharm International Llc
Priority date: 2013-02-15
Filing date: 2013-02-15
Publication date: 2024-06-28
Also published as: MX390047B; ES2990881T3; LT2956471T; AU2013378122A1; CN105431448A; EA033269B1; PH12015501796B1; BR112015019729B1; JP2016513106A; KR101989551B1; SMT202400191T1; MX2015010438A; PT2956471T; PL2956471T3; SG11201506389YA; HUE067221T2; IL240553B; EP2956471A1; IL240553A0; JP6225197B2

Description

Opis

Oblast pronalaska

Generalno, pronalazak se odnosi na oblast bioloških farmaceutskih proizvoda kao i na njihovu upotrebu u stanjima koja su povezana sa inflamatornim poremećajima (npr. reumatoidni artritis, Kronova bolest itd.), dijabetesom, kardiovaskularnim oboljenjima i gihtom. Tačnije, pronalazak se odnosi na heterodimerni sastav izveden iz IL-1R1/IL-1RAcP koji je sposoban da inhibira IL-1β citokin.

Pozadina

Porodica citokina interleukina-1 (IL-1) obuhvata 11 proteina (IL-1F1 do IL-1F11) kodiranih sa 11 različitih gena kod ljudi i miševa. Citokini tipa IL-1 su glavni posrednici urođenih imunih reakcija, i blokada osnovnih članova IL-1 ili IL-1β od strane antagonista receptora interleukina-1 (IL-1RA) je pokazala centralnu ulogu IL-1 u nekoliko ljudskih autoinflamatornih bolesti. IL-1 ili IL-1β brzo povećavaju ekspresiju glasničke RNK stotina gena u više različitih tipova ćelija. Snažne proinflamatorne aktivnosti IL-1 i IL-1β su ograničene na tri glavna nivoa: (i) sinteza i oslobađanje, (ii) membranski receptori, i (iii) transdukcija intracelularnog signala. Ovaj put sažima ekstracelularnu i intracelularnu signalizaciju IL-1 ili IL-1β, uključujući mehanizme pozitivne i negativne povratne sprege koji pojačavaju ili prekidaju odgovor IL-1. Kao odgovor na vezivanje liganda na receptor, složena sekvenca kombinatornih događaja fosforilacije i ubikvitinacije rezultuje aktivacijom signalizacije nuklearnog faktora kapa-B i puteva mitogenom aktiviranih proteinskih kinaza JNK i p38, koji zajedno indukuju ekspresiju kanonskih IL-1 ciljnih gena (kao što su IL-6, IL-8, MCP-1, COX-2, IB, IL-1, IL-1β, MKP-1) transkripcionim i posttranskripcionim mehanizmima. Treba napomenuti da većina intracelularnih komponenti koje učestvuju u ćelijskom odgovoru na IL-1 takođe posreduju u odgovorima na druge citokine (IL-18 i IL-33), receptore slične Tollu (TLR-i) i mnoge oblike citotoksičnog stresa (videti Veber A., et al., Sci Signal., 2010, 19. januar; 3(105)).

IL-1 i IL-1β nezavisno vezuju IL-1 receptor tipa I (IL-1R1), koji je sveprisutno eksprimovan. Treći specifični ligand, antagonist IL-1 receptora (IL-1RA), vezuje IL-1RI sa sličnom specifičnošću i afinitetom, ali ne aktivira receptor i ne pokreće nizvodnu signalizaciju. Dodatni protein receptora IL-1 (IL-1RAcP) služi kao ko-receptor koji je neophodan za transdukciju signala kompleksa IL-1/IL-1RI, i ovaj ko-receptor je takođe neophodan za aktivaciju IL-1R1 drugim članovima porodice IL-1, posebno IL-18 i IL-33. IL-1 receptor tipa II (IL-1R2) vezuje IL-1 i IL-1β, ali mu nedostaje citosolni deo koji ima sposobnost signalizacije i stoga služi kao receptor-mamac. II,-1RA, IL-1R2 usidrena u plazmatsku membranu, i prirodni domeni „odbacivanja“ svakog od ekstracelularnih lanaca IL-1 receptora (nazvanih sIL-1RI, sIL-1RII i sIL-1RAcP, gde je „s“ označava rastvorljivost) obezbeđuju inducibilne negativne regulatore IL-1 signalizacije u ekstracelularnom prostoru čije obilje, koje je regulisano kombinacijom povećane transkripcije i kontrolisanog oslobađanja, može ograničiti ili prekinuti efekte IL-1.

Početni korak u transdukciji IL-1 signala je konformaciona promena indukovana ligandom u prvom ekstracelularnom domenu IL-1RI koja olakšava regrutovanje IL-1RacP. Kroz očuvane citosolne regione zvane domeni slični Tollu i IL-1R-u (TIR), trimerni kompleks brzo sklapa dva intracelularna signalna proteina, gen primarnog odgovora mijeloične diferencijacije 88 (MYD88) i interleukin-1 receptor-aktiviranu proteinsku kinazu (IRAK) 4. Miševi kojima nedostaje MYD88 ili IRAK4 pokazuju ozbiljne defekte u signalizaciji IL-1. Slično, ljudi sa mutacijama u genu IRAK4 imaju defekte u signalizaciji receptora sličnih IL-1RI-u i Tollu (TLR). IL-1, IL-1RI, IL-RAcP, MYD88 i IRAK4 formiraju stabilan IL-1-indukovani prvi signalni modul. Uporedna ovome je (auto)fosforilacija IRAK4, koji potom fosforiliše IRAK1 i IRAK2, i zatim sledi regrutovanje i oligomerizacija faktora povezanog sa faktorom tumorske nekroze (TRAF) 6. IRAK1 i 2 funkcionišu i kao adapterski proteini i kao proteinske kinaze za prenos nizvodnih signala. Kompleksi IRAK1, IRAK2 i TRAF6 se odvajaju od početnog receptorskog kompleksa, i ćelije kojima nedostaju ovi proteini imaju narušenu aktivaciju faktora transkripcije nuklearnog faktora kapa-B (NF-kappa-B) i aktivatorskog proteina 1 (AP-1).

Prekomerna proizvodnja IL-1 je uzrok mnogih inflamatornih poremećaja. Na primer, IL-1 je povezan sa patologijom dijabetesa, kardiovaskularnih bolesti, gihta i određenih vrsta artritisa (npr. reumatoidni artritis (RA)).

Rilonacept je antagonist IL-1 koji uključuje IL-1-specifičan fuzioni protein koji sadrži IL-1 vezujući deo ekstracelularnog domena humanog IL1-RAcP, IL-1 vezujući deo ekstracelularnog domena humanog IL-1RI, i multimerizujuću komponentu. Ovaj IL-1-specifičan fuzioni protein je opisan u US patent br.

6,472,179, US patentna publikacija br.2003/0143697, objavljena 31. jula 2003., US patent br.7,361,350 i US patentna publikacija br.2005/0197293, objavljena 8. septembra 2005.

Rilonacept pod trgovačkim imenom ARCALYST je odobrila Američka administracija za hranu i lekove (FDA) za lečenje periodičnih sindroma povezanih sa kriopirinom (CAPS), uključujući porodični auto-inflamatorni sindrom (FCAS) i Muckle-Wells sindrom (MWS) kod odraslih i dece od 12 i više godina. Dalja klinička ispitivanja rilonacepta su trenutno u toku, tj. za giht.

Članak ECONOMIDES A.N. et al., „Citokine traps: multi-component, high-affiniti blockers of citokine action“, NATURE MEDICINE, NATURE PUB. CO, NEW YORK, svezak 9, br.1, (2003-01-01), strane 47-52, XP002256034, otkriva projektovanje odvojenih konstrukata koji kodiraju ekstracelularni domen IL6Ra ili gp130 fuzionisan sa Fc delom humanog imunoglobulina 1. Članak takođe izveštava o dizajnu druge generacije citokinskih zamki, naznačen time što se ekstracelularni domeni dva različita receptora fuzionišu u liniju, a zatim fuzionišu sa Fc delom humanog LgG1.

Sažetak pronalaska

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje heterodimerni proteinski sastav sposoban da veže humani IL-1β (GenBank:

AAH08678.1). Proteinski sastav sadrži prvi polipeptid koji uključuje prvu sekvencu aminokiselina koja sadrži aminokiseline od 18 do 333 humanog IL1-R1 (GenBank: AAM88423.1), i drugu sekvencu aminokiselina koja sadrži prvi mutant Fc dela humanog imunoglobulina gama-1 Fc (GenBank: J00228.1). Proteinski sastav takođe sadrži drugi polipeptid koji uključuje drugu prvu sekvencu aminokiselina koja sadrži aminokiseline od 21 do 358 humanog II,1-RAcP (GenBank:

BAA25421.1), i drugu drugu sekvencu aminokiselina koja sadrži drugi mutant Fc dela humanog imunoglobulina gama-1 Fc. U proteinskom sastavu, prvi i drugi mutanti su odabrani tako da favorizuju heterodimerni sklop između prvog i drugog mutanata u odnosu na bilo koji homodimerni sklop. U proteinskom sastavu, prvi polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.1, i drugi polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2. Proteinski sastav može biti sposoban da pokaže aktivnost vezivanja humanog IL-1β u ELISA testu sa EC50 od oko

50 ng/ml.

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje terapijski sastav. Terapijski sastav sadrži heterodimerni proteinski sastav sposoban da veže humani IL-1β. Proteinski sastav sadrži prvi polipeptid koji uključuje prvu sekvencu aminokiselina koja sadrži aminokiseline od 18 do 333 humanog IL1-R1, i drugu sekvencu aminokiselina koja sadrži prvi mutant Fc dela humanog imunoglobulina gama-1 Fc. Proteinski sastav takođe sadrži drugi polipeptid koji uključuje drugu prvu sekvencu aminokiselina koja sadrži aminokiseline od 21 do 358 humanog IL1-RAcP, i drugu drugu sekvencu aminokiselina koja sadrži drugi mutant Fc dela humanog imunoglobulina gama-1 Fc. U proteinskom sastavu, prvi i drugi mutanti su odabrani tako da favorizuju heterodimerni sklop između prvog i drugog mutanata u odnosu na bilo koji homodimerni sklop.

U proteinskom sastavu, prvi polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.1, i drugi polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2.

Terapijski sastav može da pokaže poluvreme eliminacije heterodimernog proteinskog sastava u sistemskoj cirkulaciji kod miševa nakon subkutane primene u dozi od 5 mg/kg od najmanje oko 88 sati, analizirano humanim Fc ELISA testom.

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEK ID BR.1, SEK ID BR.2, SEK ID BR.3 i SEK ID BR.5.

Upotreba kodona nukleinske kiseline može se optimizovati za visoku ekspresiju polipeptida u ćeliji sisara.

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.3 i koja sadrži sekvencu SEK ID BR.4, ili izolovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.5 i koji sadrži sekvencu SEK ID BR.6.

Nukleinska kiselina može da sadrži vektor ekspresije.

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu SEK ID BR.7.

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje heterologni sistem ekspresije. Sistem ekspresije sadrži vektor ekspresije koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.3 i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.4. Vektor ekspresije sistema eskpresije može biti sadržana u ćeliji sisara. Ćelija sisara može biti CHO ćelija. Sistem expresije može biti sposoban da eksprimuje heterodimerni protein koji sadrži prvi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.1 i drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2. Nivo ekspresije heterodimernog proteina može biti najmanje 300 mg po litru ćelijske kulture.

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje supstancu za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povezane sa modulacijom aktivnosti humanog IL-1β. Supstanca sadrži heterodimerni protein koji sadrži prvi polipeptida koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.1 i drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2. Bolest povezana sa modulacijom aktivnosti humanog IL-1β može biti artritis, giht, reumatoidni artritis, periodični sindromi povezani sa kriopirinom (CAPS), skleroderma, dijabetes, ateroskleroza, bolest suvog oka, očna alergija ili uveitis.

U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje heterodimerni proteinski sastav sposoban za humano vezivanje, naznačen time što navedeni heterodimerni sastav sadrži prvi polipeptid koji sadrži SEK ID BR.1 i drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2. Proteinski sastav je sposoban da inhibira proizvodnju humanog IL-6 u humanim plućnim fibroblastima kao odgovor na lečenje fibroblasta sa humanim IL-1β. Inhibiciju karakteriše IC50 vrednost od oko 2,3 pM.

Kratak opis crteža

Sledeći crteži i opisi su obezbeđeni da pomognu u

razumevanju pronalaska:

Slika 1 ilustrativno prikazuje heterodimerni proteinski sklop predmetnih učenja koji sadrži ekstracelularni deo IL1-R1 fuzionisan sa IgG-Fc domenom (Fc-II) preko fleksibilnog linkera i ekstracelularni deo IL1-RAcP fuzionisan sa drugim IgG-Fc domenom (Fc-V) preko drugog fleksibilnog linkera;

Slika 2 šematski prikazuje mapu PKN012 plazmida i obeleženu sekvencu koja se koristi u kloniranju polipeptida predmetnog pronalaska;

Slika 3 prikazuje reprezentativnu krivulju rasta transfekcije dobijenu u procesu generisanja stabilnih ćelijskih linija za eksprimovanje polipeptida predmetnog pronalaska;

Slika 4 prikazuje analitički HPLC hromatogram uzorka sa isključenjem po veličini koji sadrži heterodimere koji sadrže polipeptid SEK ID BR.1 i polipeptid SEK ID BR.2 nakon koraka prečišćavanja anjonsko-izmenjivačkom hromatografijom;

Slika 5 prikazuje SDS-PAGE analizu uzorka koji sadrži heterodimere koji sadrže polipeptid SEK ID BR.1 i polipeptid SEK ID BR.2 nakon koraka prečišćavanja anjonsko-izmenjivačkom hromatografijom;

Slika 6 prikazuje tipičnu krivulju vezivanja prečišćenog uzorka koji sadrži heterodimere koji sadrže polipeptid SEK ID BR.1 i polipeptid SEK ID BR.2 u ELISA testu korišćenjem komercijalno dostupnog humanog IL-1β;

Slika 7 prikazuje kalibracionu krivulju dobijenu u IL-1 antitelom posredovanom inhibicijom analitičkom eksperimentu proizvodnje IL-6;

Slika 8 prikazuje rezultate IL-1β posredovane proizvodnje IL-6 i izdvajanja IL-6 iz medijuma kulture gde su ćelije MRC5 inkubirane 24 sata sa IL-1β u konačnoj koncentraciji od 50 pg/ml (samo IL-1 ) ili ostavljene netretirane (Ćelije Kontrola) dok je medijumu kulture koji nije bio izložen ćelijama dodavan IL-6 u konačnoj koncentraciji od 20 pg/ml da bi se procenilo izdvajanje IL-6;

Slika 9 prikazuje rezultate IL-1β posredovane proizvodnje IL-6 i izdvajanja IL-6 iz medijuma kulture gde su ćelije MRC5 inkubirane 24 sata sa IL-1β u konačnoj koncentraciji od 50 pg/ml (samo IL-1 ) ili ostavljene netretirane (Ćelije Kontrola). Medijumu za kulturu koji nije bio izložen ćelijama je dodavan IL-6 u konačnoj koncentraciji od 20 pg/ml da bi se procenilo izdvajanje IL-6;

Slika 10 prikazuje kalibracionu krivulju dobijenu u analizi inhibicije proizvodnje IL-6 sprovedenoj sa IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimerom prema predmetnim učenjima;

Slika 11 prikazuje rezultate merenja inhibicije IL-1β posredovane proizvodnje IL-6 sa IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimerom i izdvajanja IL-6 iz medijuma kulture gde su ćelije MRC5 inkubirane 24 sata sa IL-1β u konačnoj koncentraciji od 50 pg/ml (samo IL-1) ili ostavljene netretirane (Ćelije Kontrola) dok je medijumu kulture koji nije bio izložen ćelijama dodavan IL-6 u konačnoj koncentraciji od 30 pg/ml da bi se procenilo izdvajanje IL-6 ( RPH-10 30 pg/ml IL6); da bi se obezbedila konzistentnost između dve ploče ćelijske kulture koje su korišćene za ovaj eksperiment, upoređeni su efekti IL-1 na proizvodnju IL-6 sa obe ploče (samo IL-1 i samo IL1 Ploča 2, za Ploče 1 i 2 respektivno); takođe je testiran efekat najveće koncentracije (20 µg/ml) II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimera na proizvodnju IL-6 (samo RPH-10); Razblaženje IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera koje odgovara konačnoj koncentraciji od 204,8 ng/ml je takođe uključeno da bi se demonstrirala ujednačenost podataka između dve ploče (RPH10 Ploča 2); i

Slika 12 prikazuje rezultate merenja krivulje titracije za eksperiment L1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera gde su MRC5 ćelije inkubirane sa IL-1β ili IL-1β prethodno pomešanim sa različitim koncentracijama L1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera; Proizvodnja IL-6 je merena Kuantakine ELISA i podaci su analizirani korišćenjem 4-parametarskog algoritma za uklapanje; koeficijent C u rezultujućoj jednačini je numerički jednak IC50 vrednosti od 0,3 ng/ml ili oko 2,4 pM.

Detaljan opis pronalaska

Učenja koja su ovde otkrivena su delimično zasnovana na projektovanju heterodimernog proteinskog sklopa koji je sposoban da se veže za humani IL-1 β i da oslabi njegovu funkciju. Heterodimerni proteinski sklop ovih učenja sadrži ekstracelularne delove IL1-R1 (GenBank: AAM88423.1) i IL-1RAcP (GenBank: BAA25421.1) ili njihovi funkcionalni fragmenti. Svaki, deo IL1-R1 i deo IL-1RAcP, fuzionisan je sa različitim mutantom Fc dela humanog Ig Gama-1 (GenBank: J00228.1). Dva različita Fc mutanta u heterodimernom proteinskom sklopu su projektovana tako da favorizuju formiranje heteromernog dimera između dva Fc mutanta u odnosu na bilo koji homomerni sklop. Da bi se omogućila rekombinantna proizvodnja heterodimernog proteinskog sklopa prema predmetnim učenjima, konstruisan je vektor ekspresije DNK za prekomernu proizvodnju heterodimernog proteinskog sklopa u heterolognom sistemu ekspresije proteina, i pripremljene su ćelije sisara koje stabilno eksprimuju heterodimerni proteinski sklop do visokog nivoa ekspresije. Osmišljena je procedura prečišćavanja proteina koja omogućava dobijanje fiziološki relevantnog suštinski čistog preparata heterodimernog proteinskog sklopa prema predmetnim učenjima. Ovako prečišćeni proteinski molekul pokazuje visok stepen specifične aktivnosti u in vitro testu imunosorbenata povezanih sa enzimima (ELISA) korišćenjem humanog IL-1β (GenBank: AAH08678.1). Neočekivano, proteinski molekul pokazuje prihvatljiv farmakokinetički profil nakon subkutane primene na životinjama, ne dovodeći do gubitka telesne težine ili neželjenih kliničkih događaja.

Termini korišćeni u ovoj specifikaciji generalno imaju svoja uobičajena značenja u tehnici, u kontekstu ovog pronalaska i u specifičnom kontekstu u kojem se svaki termin koristi. Određeni termini su razmotreni u nastavku ili drugde u specifikaciji, kako bi se pružile dodatne smernice delatniku u opisivanju sastava i postupak pronalaska i kako da ih napravi i koristi. Obim ili značenje bilo koje upotrebe termina biće očigledni iz specifičnog konteksta u kojem se termin koristi. „Oko“ i „približno“ će generalno značiti prihvatljiv stepen greške za merenu količinu s obzirom na prirodu ili preciznost merenja. Tipično, primerni stepeni greške su unutar 20 procenata (%), poželjno unutar 10%, i poželjnije unutar 5% date vrednosti ili raspona vrednosti. Alternativno, i posebno u biološkim sistemima, termini „oko“ i „približno“ mogu značiti vrednosti koje su unutar reda veličine, poželjno unutar 5 puta i još poželjnije unutar 2 puta date vrednosti. Ovde date numeričke količine su približne osim ako nije drugačije navedeno, što znači da se termin „oko“ ili „približno“ može pretpostaviti kada nije izričito naveden.

Postupci koji su ovde otkriveni mogu uključivati korake međusobnog upoređivanja sekvenci, uključujući sekvencu divljeg tipa sa jednim ili više mutanata (varijante sekvenci). Takva poređenja obično sadrže poravnanje polimernih sekvenci, npr. korišćenjem programa i/ili algoritama za poravnanje sekvenci koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti (na primer, BLAST, FASTA i MEGALIGN, da spomenemo samo neke). Stručnjak u predmetnoj oblasti može lako shvatiti da, u takvim poravnanjima, gde mutacija sadrži umetanje ili deleciju ostatka, poravnanje sekvence će uvesti „jaz“ (obično predstavljenu crticom ili „A“) u sekvenci polimera koja ne sadrži umetnuti ili deletiran ostatak.

Ovde otkriveni postupci mogu uključivati statističke proračune, npr. određivanje IC50 ili EC50 vrednosti itd. Stručnjak u predmetnoj oblasti može lako da proceni da se to može izvesti korišćenjem raznih komercijalno dostupnih softvera, npr. PRISM (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, SAD) ili slično.

„Homologno“, u svim svojim gramatičkim oblicima i pravopisnim varijacijama, odnosi se na odnos između dva proteina koji imaju „zajedničko evoluciono poreklo“, uključujući proteine iz superfamilija u istoj vrsti organizma, kao i homologne proteine iz različitih vrsta organizma. Takvi proteini (i njihove nukleinske kiseline koje ih kodiraju) imaju homologiju sekvenci, što se ogleda u sličnosti njihovih sekvenci, bilo u smislu procentualne identičnosti ili prisustva specifičnih ostataka ili motiva i očuvanih pozicija. Međutim, u uobičajenoj upotrebi i u trenutnoj primeni, termin „homologan“, kada je modifikovan prilogom kao što je „visoko“, može se odnositi na sličnost sekvenci i može, ali ne mora da se odnosi na zajedničko evoluciono poreklo.

Termin „sličnost sekvenci“, u svim njegovim gramatičkim oblicima, odnosi se na stepen identičnosti ili korespondencije između sekvenci nukleinske kiseline ili aminokiselina koje mogu, ali ne moraju imati zajedničko evoluciono poreklo.

Termini „protein“ i „polipeptid“ se koriste istoznačno. Ovde opisani polipeptidi mogu da sadrže više od jednog susednog lanca aminokiseline, formirajući tako dimere ili druge oligomerne formacije. Generalno, polipeptidi opisani ovde za upotrebu kod sisara su eksprimovani u ćelijama sisara koje omogućavaju odgovarajuće post-translacione modifikacije, kao što su ćelijske linije CHO ili HEK293, iako se očekuje da će i druge ekspresione ćelijske linije sisara biti korisne. Zbog toga se očekuje da ovde opisani polipeptidi mogu biti posttranslaciono modifikovani bez da suštinski utiče na njihovu biološku funkciju.

U određenim aspektima, funkcionalne varijante heterodimernih proteinskih sklopova opisanih ovde uključuju fuzione proteine koji imaju najmanje biološki aktivni deo humanog IL1-R1 ili IL-1RAcP ili funkcionalni fragment istog, i jedan ili više fuzionih domena. Dobro poznati primeri takvih fuzionih domena uključuju, ali nisu ograničeni na, polihistidin, Glu-Glu, glutation S transferazu (GST), tioredoksin, protein A, protein G, konstantni region teških lanaca imunoglobulina (npr. Fc), protein koji vezuje maltozu (MBP), ili humani serumski albumin. Fuzioni domen može biti izabran tako da daje željeno svojstvo. Na primer, delovi polipeptida IL1-R1 ili IL-1RAcP mogu biti fuzionisani sa domenom koji stabilizuje IL1-R1 ili IL-1RAcP peptide in vivo (domen „stabilizator“), opciono preko odgovarajućeg peptidnog linkera. Termin „stabilizujući“ označava sve što povećava poluvreme eliminacije polipeptida u sistemskoj cirkulaciji, bez obzira da li je to zbog smanjene destrukcije, smanjenog klirensa ili drugog farmakokinetičkog efekta. Poznato je da fuzije sa Fc delom imunoglobulina daju poželjna farmakokinetička svojstva određenim proteinima. Takođe, fuzije sa humanog serumskog albumina mogu dati poželjna svojstva. Drugi tipovi fuzionih domena koji se mogu izabrati uključuju multimerizujuće domene (npr. dimerizujuće, tetramerizujuće) i funkcionalne domene koji daju dodatnu biološku funkciju, npr. podsticanje akumulacije na ciljanom mestu delovanja in vivo.

U određenim aspektima, heterodimerni proteinski sklopovi koji su ovde opisani sadrže ekstracelularni deo IL1-R1, ili njegov funkcionalni fragment, fuzionisan sa IgG-Fc domenom, i ekstracelularni deo IL-1RAcP, ili njegov funkcionalni fragment, fuzionisan sa drugim IgG-Fc domenom. IgG-Fc domen i drugi IgG-Fc domen se biraju tako da favorizuju heterodimerni proteinski sklop u odnosu na bilo koji homodimerni proteinski sklop. Ekstracelularni deo IL1-R1 može biti fuzionisan sa IgG-Fc domenom preko fleksibilnog linkera, dok IL-1RAcP, ili njegov funkcionalni fragment, može biti fuzionisan sa drugim IgG-Fc domenom preko fleksibilnog linkera iste sekvence aminokiselina ili preko drugog fleksibilnog linkera.

U primernom otelotvorenju, ilustrativno prikazanom na Slici 1, ekstracelularni deo IL1-R1 fuzionisan sa IgG-Fc domenom (Fc-II) preko fleksibilnog linkera može da sadrži sekvencu aminokiselina SEK. ID BR.1, dok IL-1RAcP fuzionisan sa drugim IgG-Fc domenom (Fc-V) preko fleksibilnog linkera može da sadrži sekvencu aminokiselina SEK. ID BR.2.

HIL1-R1-hIgG1-Fc polipeptid (SEK ID BR.1)

U određenim aspektima, predmetna učenja obezbeđuju rekombinantni DNK molekul koji ima otvoreni okvira čitanja koji kodira za polipeptid koji sadrži vodeće 333 aminokiseline ljudskog IL1-R1 spojene sa IgG-Fc domenom (Fc-II) preko fleksibilnog linkera, i za drugi rekombinantni molekul DNK koji ima otvoreni okvira čitanja koji kodira za drugi polipeptid koji sadrži vodećih 358 aminokiseline humanog IL-1RAcP fuzionisanih sa drugim IgG-Fc domenom (Fc-V) preko fleksibilnog linkera.

U primernom otelotvorenju, polipeptid koji sadrži vodeće 333 aminokiseline humanog IL1-R1 fuzionisan sa IgG-Fc domenom (Fc-II) preko fleksibilnog linkera sadrži sekvencu aminokiselina SEK. ID BR.3. Njemu odgovarajući DNK molekul može da sadrži sekvencu nukleotida SEK ID BR.4. Drugi polipeptid koji sadrži vodećih 358 aminokiselina humanog IL-1RAcP fuzionisanih sa drugim IgG-Fc domenom (Fc-V) preko fleksibilnog linkera može da sadrži sekvencu aminokiselina SEK. ID BR.5. Njemu odgovarajući DNK molekul može da sadrži sekvencu nukleotida SEK ID BR.6.

HIL1-R1-hIgG1-Fc polipeptid (SEK ID BR.3)

HIL1-R1-hIgG1-Fc DNA (SEK ID BR.4) Ċ

hIL-1RAcP-hIgG1-Fc polipeptid (SEK ID BR.5)

U određenim aspektima, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantni plazmid ekspresije sisara za visoku ekspresiju polipeptida koji sadrži vodeće 333 aminokiseline humanog IL1-R1 spojenih sa IgG-Fc domenom (Fc-II) preko fleksibilnog linkera, i za drugi rekombinantni molekul DNK koji ima otvoreni okvir čitanja koji kodira za drugi polipeptid koji sadrži vodećih 358 aminokiselina humanog IL-1RAcP fuzionisanih sa drugim IgG-Fc domenom (Fc-V) preko fleksibilnog linkera. Ovaj plazmid sadrži dva citomegalovirusa (CMV) promotera za pokretanje transkripcije dva gena koji kodiraju navedeni polipeptid i navedeni drugi polipeptid, svaki praćen sekvencom terminacije transkripcije i sekvencom poliadenilacije. Plazmid takođe sadrži poreklo replikacije i gen koji daje otpornost na ampicilin, za podršku propagaciji i selekciji plazmida u bakterijama. Plazmid dalje sadrži gen za glutaminsku sintetazu, selektivni marker koji se široko upotrebljava za uspostavljanje stabilnih CHOK1 i NSO ćelijskih linija. Plazmid predmetnog obelodanjivanja je ilustrativno prikazan na slici 2.

U primernom otelotvorenju, plazmid ekspresije sisara prema predmetnim učenjima sadrži sekvencu nukleotida SEK ID BR.7.

HIL1-R1-hIgG1-Fc-II / IL-1RAcP- hIgG1-Fc-V expresijski plasmid (SEK ID BR.7)

U određenim aspektima, predmetna učenja obezbeđuju sistem ekspresije sisara za proizvodnju heterodimernog proteinskog sklopa koji sadrži polipeptid koji sadrži ostatke aminokiselina 18 do 333 humanog IL1-R1 fuzionisanog sa IgG-Fc domenom (Fc-II) preko fleksibilnog linkera, i drugi polipeptid koji sadrži ostatke aminokiselina 21 do 358 humanog IL-1RAcP spojenog sa drugim IgG-Fc domenom (Fc-V) preko fleksibilnog linkera.

U primernom otelotvorenju, sistem ekspresije sisara iz predmetnog pronalaska sadrži ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO-K1) koje sadrže plazmid koji sadrži sekvencu nukleotida SEK ID BR.7.

Primeri

Sledeći primeri ilustruju prethodne aspekte i druge aspekte predmetnih učenja. Ovi neograničavajući primeri su izneti da bi osobama sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti pruže ilustrativna otelotvorenja o tome kako se jedinjenja, sastavi, artikli, uređaji i/ili postupci patentno zahtevani ovde prave i vrednuju.

Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu korišćenih brojeva (npr. količine, temperature itd.), ali treba uračunati određene greške i odstupanja.

Primer 1: Konstrukcija plazmida za ekspresiju polipeptida predmetnog pronalaska.

Optimizovane sekvence gena koje sadrže sekvence koje kodiraju ostatke aminokiselina 1 do 333 IL-1R1 ili ostatke 1 do 358 IL-1RAcP su hemijski sintetizovane. Dobijeni fragmenti su klonirani u okviru u primajuće intermedijarne vektore koji sadrže sekvence koje kodiraju za Fc-V ili Fc-II, preko HindIII i BspEI restrikcijskih mesta. Dobijeni pozitivni klonovi su verifikovani sekvenciranjem DNK. Dobijene konstrukcije su nazvane PKN001'-IL-1R-FcV i PKN001'-RAcP-FcII, respektivno.

Gen koji kodira IL-1R1-Fc-V je zatim kloniran u drugi intermedijarni vektor, nazvan PKN002, preko HindIII i EcoRI restrikcionih mesta. Pozitivni klonovi su pregledani dvostrukom digestijom i inserciona sekvenca ispravnih plazmida je verifikovana sekvenciranjem DNK. Dobijene konstrukcije su nazvane PKN002-IL-1R-FcV.

Konačno, ekspresiona kaseta za RAcP-FcII iz PKN001 '-RAcP-FcII je integrisana u PKN002-II,-1R-FcV plazmid preko NotI i SalI restrikcijskih mesta i dala je novu rekombinantnu konstrukciju koja je sadržala elemente ekspresije za RAcP-FcII i IL-1R-FcV. Dobijeni klonovi su pregledani pomoću NotI i SalI dvostruke digestije praćene elektroforezom u DNK gelu, ispravni klonovi su pokazivali da jedna traka migrira približno kao fragment DNK od 8 kb i druga traka migrira približno kao fragment DNK od 4 kb. Konačni plazmid je nazvan PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII.

Rekombinantni plazmid PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII kombinuje ekspresione kasete za RAcP-FcII i IL-1R-FcV. Plazmid se može koristiti za koekspresiju proteina RAcP-FcII i IL-1R-FcV u odnosu 1 prema 1 pod kontrolom CMV promotera. Većina ova dva fuziona proteina bi zatim formirala IL1R-FcV / RAcP FcII heterodimere nakon sekrecije. Plazmid takođe eksprimuje protein glutamin sintetaze (GS) preko SV40 promotera, koji se može koristiti kao selektivni marker za stvaranje stabilnih ćelijskih linija za proizvodnju IL1R-FcV / RAcP-FcII heterodimera. Mapa plazmida za PKN012-II,1R-FcV-RAcP-FcII je ilustrativno prikazana na Slici 2.

Primer 2: Generisanje stabilnih ćelijskih linija za ekspresiju polipeptida predmetnog pronalaska.

Stabilni klon CHO-K1 ćelija koji ko-eksprimuje hIL1-R1-hIgG1-Fc polipeptid SEK ID BR.1 i hIL-IRAcP-hIgGI-Fc polipeptid SEK ID BR.2 je generisan kroz standardne protokole ćelijske biologije. Ekspresioni plazmid PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII opisan u primeru 1 je korišćen za generisanje stabilnih ćelijskih linija za visoku ekspresiju navedenih polipeptida. Nivoi ekspresije navedenih polipeptida u velikom broju klonova bili su oko ili preko 100 mg/L u 7-dnevnoj šaržnoj kulturi. Jedna klonska ćelijska linija je pokazala nivoe ekspresije od oko ili preko 300 mg/L u šaržnoj kulturi u Erlenmajerovoj boci.

Materijali

Ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO-K1) su dobijene kao zamrznute sirovine od ATCC (CCL-61<™>). Ćelije su adaptirane interno u CD CHO medijum. Medij i reagens su dobijeni iz komercijalnih izvora. Nakon potpune adaptacije, ćelije su uzgajane do visoke gustine tokom nekoliko prolaza. Dobijene ćelije su subklonirane. Jedan od rezultujućih klonova sa vremenom udvostručavanja ispod 20 sati i dobrom morfologijom izabran je kao roditeljska ćelijska linija.

Postupci

CHO-K1 ćelije u prolazu 4 su kultivisane u CD-CHO hemijski definisanom medijumu (Invitrogen) koji sadrži 6 mM L-glutamina. Ćelije su održavane podelom 1:3 nakon postizanja gustine ćelija od 4 × 10<6>ćelija/ml. Ćelije su razvučene centrifugiranjem i ponovo suspendovane u 1 ml CD-CHO hemijski definisanog medijuma (Invitrogena).

Korišćen je sledeći protokol elektroporacije:

• 40 ug plazmidne DNK u 100 ul sterilizovanog TE pufera je korišćeno za elektroporaciju; na dan transfekcije vitalnost ćelija je bila najmanje 95%;

• ćelije su centrifugirane na 800 o/min tokom 5 min; supernatant je uklonjen i ćelije su ponovo suspendovane u 10 ml CD CHO medijuma i ponovo centrifugirane;

• supernatant je uklonjen i ćelije su ponovo suspendovane u maloj zapremini CD CHO medijuma do 1,43 × 10<7>ćelija/ml;

• 0,7 ml ćelija (10<7>ćelija) je dodano DNK i pažljivo smešano pipetiranjem, izbegavajući generisanje mehurića;

• ćelije su odmah elektroporisane dovodom jednog pulsa of 300 volta, 900 uF do svake kivete;

• 50 ml CD CHO (bez L-glutamina) je odmah dodano elektroporisanim ćelijama i pažljivo smešano;

• ćelijska suspenzija je raspoređena u deset ploča sa 96 bunarića pri 50 ul/bunariću; sledećeg dana, 150 ul CD CHO koji sadrže 33,3 uM MSX je dodato u svaki bunarić.

Izvestan broj transfekcija je sproveden u CHO-K1 ćelijama u procesu stvaranja potencijalne ćelijske linije ekspresije IL1R-FcV-RAcP-FcII; reprezentativna krivulja rasta transfekcije je prikazana na Slici 3 i podaci su prikazani u tabeli 1. Nivoi ekspresije proteina su analizirani pomoću SDS-PAGE. Ćelijske linije sa visokim nivoom prekomerne ekspresije proteina pokazuju jaku traku sa prividnom molekulskom težinom od oko 180 kDa. Na osnovu preliminarne analize izabrana su četiri klona za dalju analizu, u kojoj su nivoi ekspresije dalje procenjeni pomoću SDS-PAGE i ELISA. Klonovi sa dobrom ekspresijom su inokulisani u Erlenmajerove boce od 125 ml, ćelije su proširene i zamrznute.

Izabrana ćelijska linija najviše proizvodnje je odabrana i odmrznuta u CD-CHO. Krivulje rasta na ćelijskoj liniji su procenjene i sakupljani su dnevni uzorci za broj ćelija, vitalnost ćelija i produktivnost IL1R-FcV-RAcP-FcII. Na osnovu ovih studija, utvrđeno je da je odabrana ćelijska linija najveće produktivnosti eksprimirala IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimer u CD-CHO mediju u količinama neophodnim da bi podržavala komercijalnu proizvodnju. Prinos heterodimera nakon prečišćavanja bio je najmanje oko 300 mg/L (bez ikakve optimizacije proizvodnje).

Tabela 1: Reprezentativna krivulja rasta klonske ćelijske linije Period kultivisanja Gustina ćelija Hranjenje (DAN) (10<6>ćelija/ml)

0 0,5

1 1,09

2 1,93

3 2,97 10% hrana B 5 4,13

6 4,55 10% hrana B 7 4,6

8 5,46 10% hrana B 9 4,86

10 2,4

11 1

Primer 3: Prečišćavanje polipeptida predmetnog pronalaska.

HIL1-R1-hIgG1-Fc polipeptid SEK ID BR.1 i hIL-1RAcP-hIgG1-Fc polipeptid SEK ID BR.2 su ko-eksprimirani u CHO-K1 suštinski kao što je opisano u prethodnom primeru 2. Ćelije su sakupljene i lizirane korišćenjem dobro etabliranih protokola. Nakon bistrenja ćelijskog lizata, supernatant sa koncentracijom proteina od oko 0,4 mg/ml, koji sadrži eksprimirane HIL1-R1-hIgG1-Fc/hIL-IRAcP-hIgGI-Fc polipeptide, nanesen je na afinitetnu kolonu za protein A. Korak afinitetnog prečišćavanja je sproveden u skladu sa procedurom prikazanom u tabeli 2. Eluat proteina A koji sadrži HIL1-R1-hIgG1-Fc / hIL-1RAcP-hIgG1-Fc na pH od oko 3,5–3,7 inkubiran je 45–60 minuta da bi se inaktivirao potencijalno postojeći u kontaminirajućim materijalima.

Posle inkubacije materijala u trajanju od oko 45 minuta na pH 3,6 na sobnoj temperaturi njegov pH je podešen na oko 7,9–8,1 sa 2 M Tris-HCl pH 9,5 (~ 3,5% v/v razblaženog eluata proteina A). Tretirani eluat proteina A sa niskim pH je podešen na pH od oko 8,0 korišćenjem 1 M Tris-HCl, pH 9,0. Provodljivost je podešen na oko 5,5 mS/cm dejonizovanom vodom (dH2O) ako je potrebno.

Da bi se smanjio sadržaj DNK, HCP, endotoksina i potencijalnih virusnih kontaminanata, eluat kolone proteina A sa podešenim pH je dalje prečišćen hromatografijom sa izmenom anjona (AIEX) korišćenjem smole Q Sepharose. AIEX korak se izvršava prema proceduri postepenog eluiranja prikazanoj u tabeli 3. Skupljene frakcije vršnog eluiranja su koncentrovane mikrofiltracijom do koncentracije od oko 20 mg/ml, praćeno dodavanjem 20% osnovnog rastvora saharoze do konačne koncentracije saharoze od oko 1% (v/v) i zamrzavanje na -80°C.

Uzorak tako prečišćenog proteina je analiziran HPLC-om sa isključenjem po veličini (SEC-HPLC) i SDS-PAGE-om (redukcionim i neredukcionim). Rezultati analize su prikazani na Slici 4 i Slici 5, respektivno. Na Slici 5, trake 1, 3 prikazuju SDS-PAGE za hIL1-R1-hIgG1-Fc/ hIL-1RAcP-hIgG1-Fc pod neredukcionim uslovima, a trake 4, 6 – u redukcionim uslovima. Trake 2, 5 prikazuju markere molekulske težine. hIL1-R1-hIgG1-Fc/hIL-1RAcPhIgG1-Fc heterodimer ima prividnu molekulsku težinu od oko 180 kDa, koja sadrži dva disulfidno povezana monomera, prividne molekulske težine svakog od oko 90 kDa.

Operativna procedura SEC-HPLC prikazana je u tabeli 4. Uzorak za punjenje je razblažen mobilnom fazom da bi se postigla koncentracija proteina od oko 5 mg/ml. Biološki relevantan oblik hIL1-R1-hIgG1-Fc / hIL-IRAcP-hIgGI-Fc heterodimera je predstavljen glavnim vrhom sa vremenom zadržavanja RT = 14,979 min.

Tabela 2: Operativna procedura afinitetne hromatografije proteina A

Korak Pufer Vol CV Tok cm/h Ispiranje pre upotrebe dH2O 3 150 Ekvilibracija 10 mM NaPh, pH 6,0 5 150 Unos uzorka Dobijene ćelije 150 Pranje 1 10 mM NaPh, pH 6,0 3 150 Pranje 2 25 mM NaPh, 0,5 MNaCl, 5% 5 150 izopropanol pH 7,0

Ponovna ekvilibracija 10 mM NaPh, pH 6,0 3 150 Elucija 20 mM Na-citrat, pH 3,4 4 150 Ponovna ekvilibracija 10 mM PB, pH 6,0 3 150 CIP 0,1 M NaOH (vreme kontakta 15 min), 3 100 obrnuti tok, CIP svakih 5 ciklusa

Ispiranje sa NaCl 1M NaCl 3 150 Ispiranje nakon dH2O 3 150 upotrebe

Skladištenje 20% (v/v) etanol, 20 mM NaPh, pH 3 150

7,0

Tabela 3: Operativni postupak AIEX-a

Korak Pufer Vol CV Tok cm/h Ispiranje pre upotrebe dH2O 3 150

Korak Pufer Vol CV Tok cm/h Ponovno punjenje 10 mM Tris-HCl, 1 M 3 150

NaCl, pH 8

Ekvilibracija 10 mM Tris-HCl, 50 mM 3 150

NaCl, pH 8

Unos uzorka Unos pripremljenog Q - 150 Pranje 10 mM Tris-HCl, 50 mM 3 150

NaCl, pH 8

Elucija 10 mM Tris-HCl, 0,35 M 3 150

NaCl, pH 8,0

CIP 1 M NaOH (vreme 3 40

kontakta 1 sat), obrnuti

tok

Regeneracija 10 mM Tris-HCl, 1 M 3 150

NaCl, pH 8,0

Ispiranje nakon dH2O 3 150 upotrebe

Skladištenje 20% (v/v) etanol 3 150

Tabela 4: Operativna procedura SEC-HPLC-a

Mobilna faza: 20 mM fosfat, 300 mM NaCl, pH 7,4

Protok: 0,5 ml/min

Kolona: G2000 SWxl, 7,8 mm × 300 mm, TOSOH Bioscience Zaštitna kolona: TSK Guard SWxl, 6,0 mm × 40 mm, TOSOH Bioscience Temperatura kolone: 25°C

Temperatura Sobna temperatura

izuzimača uzorka:

Zapremina 10 µL

ubrizgavanja:

Talasna dužina 280 nm

detektora:

Vreme rada: 30 min;

Aktivnost ovako prečišćenog uzorka, koji je eksprimiran i prečišćen suštinski kao što je opisano u ovom primeru, testirana je u standardnom ELISA testu korišćenjem komercijalno dostupnog humanog IL-1β (PrimGene, Šangaj, Kina; Kat. br.: 101-01B). Tipična krivulja vezivanja dobijena u testu je prikazana na Slici 6. Na osnovu analize krivulje, izračunata vrednost EC50 je oko 50 ng/ml.

Primer 4: Karakterizacija inhibicije IL-1β-indukovane proizvodnje IL-6 sa IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimerom u ljudskim ćelijama.

Predmetni primer pokazuje snažna funkcionalna (inhibitorna) svojstva IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera u ciljanju humanog IL-1β. Kao funkcionalni komparator, korišćena su prethodno karakterisana mišja monoklonska antitela protiv IL-1β. Humani plućni fibroblasti MRC5 proizvode IL-6 kao odgovor na tretiranje sa IL-1β. Kvantifikacija IL-1β-indukovane proizvodnje IL-6 u MRC5 ćelijama korišćena je kao funkcionalni rezultat testa. Inhibicija proizvodnje IL-6 pomoću IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera i kontrolnog anti IL-1β antitela obezbeđuje kvantitativnu meru inhibitornih svojstava preparata IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera.

Polipeptidi II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimera (SEK ID BR.1 i SEK ID BR. 2) su ko-eksprimirani i prečišćeni suštinski kao što je opisano u prethodnim primerima. Koncentracija proteina suštinski čistog IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera u korišćenom uzorku bila je 0,9 mg/ml u 100 mM NaCl, 25 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 25 mM arginin hidrohlorida, 1% saharoze; pH = 6.3.

U testu su korišćeni sledeći materijali:

Ćelije: MRC5 ćelije, humani plućni fibroblasti, ATCC kat. br. CCL-171, lot br.59474707.

Medijum: DMEM, Dulbeccova modifikacija Eaglovog medijuma, visok nivo glukoze (4,5 g/L), Mediatech, kat. br.10-017-CM, lot br.10017204, dopunjen sa L-glutaminom i 1× penstrep i 10% fetalnog goveđeg seruma, Omega Scientific, kat. br. FB-05, lot br.105104

Reagensi: IL-1β, humani rekombinantni, E. coli-izveden, Ala117-Ser269, Pristupni br. NP_000567, R&D systems, kat. br.201-LB, lot br.

ADM1411062; Monoklonska antitela protiv humanog IL-1β, klon br.8516, R&D systems, kat. br. MAB201, lot br. AWE1011081;

Humani IL-6 kvantakinski imunoanaliza, R&D systems, kat. br. D6050, lot br.300070.

U testu su korišćene sledeće procedure:

Održavanje ćelije:

1. Propagirati MRC5 ćelije u DMEM koji sadrži 10% FBS na T75 bocama prema preporukama proizvođača. Zabeležiti broj prolaza;

2. Tripsinizirati ćelije, ponovo suspendovati u DMEM koji sadrži 10% FBS;

3. Testirati vitalnost ćelije korišćenjem Guava ViaCount reagensa. Standardna održivost treba da bude >85%, ako je manja, ne koristiti ovu seriju ćelija;

4. Pripremiti razblaženja ćelija za postavljanje na pločice sa željenom gustinom od 2 × 103 ćelija/bunariću po bunariću ploče sa 48 bunarčića ili 5 × 103 po ml;

5. Ostaviti ćelije da se pričvrste 16–24 sata na 37°C, 5% CO2, zatim ukloniti medijum;

6. Zamenite svežim DMEM medijumom sa dodatkom 10% FBS, 0,4 ml/bunariću za ploču sa 48 bunarčića, inkubirajte 5–10 minuta i ponovo zamenite medijum istom zapreminom;

7. Dodati u bunariće IL-1β, testne supstance prethodno pomešane sa IL-1β i odgovarajuće kontrole;

8. Inkubirati ćelije nakon tretiranja 24 sata, a zatim

sakupiti supernatante;

9. Centrifugirati supernatante na 300 × g tokom 10 minuta, sakupiti očišćene supernatante i upotrebiti ih za ELISA ili direktno ili sa 1/3 razblaženjem ako je prigodno;

ELISA protokol:

Princip testa: test koristi kvantitativni sendvič test imunoanalize enzima. Mikrotitarska ploča je prethodno obložena monoklonskim antitelom specifičnim za IL-6.

Standardi i uzorci se pipetiraju u otvore mikrotitarske ploče i svaki prisutni IL-6 se vezuje za imobilizovana antitela. Nakon ispiranja svih nevezanih supstanci, enzimsko vezano poliklonsko antitelo specifično za IL-6 se dodaje u bunariće. Nakon pranja radi uklanjanja bilo kakvog nevezanog reagensa antiteloenzim, rastvor supstrata se dodaje u bunariće i boja se razvija proporcionalno količini vezanog IL-6. Razvoj boje se zaustavlja i meri se intenzitet boje.

Procedura analize:

1. Pripremite sve reagense i radne standarde kako je opisano u priručniku proizvođača (http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=D6050)

2. Uklonite višak traka mikrotitarske ploče iz okvira ploče, vratite ih u kesicu od folije koja sadrži pakovanje sredstva za sušenje i ponovo zatvorite.

3. Dodajte 100 µL razblaživača za analizu RD1W u svaki bunarić.

4. Dodajte 100 µL standarda, uzorka ili kontrole po bunariću. Pokrijte obezbeđenom lepljivom trakom. Inkubirajte 2 sata na sobnoj temperaturi.

Obezbeđen je raspored ploča za bilježenje analiziranih standarda i uzoraka.

5. Aspirirajte i operite svaki bunarić, ponavljajući proces tri puta za ukupno četiri pranja. Operite tako što ćete napuniti svaki bunarić puferom za pranje (400 µL) pomoću boce za prskanje, razvodnog dozatora ili mašine za pranje. Potpuno uklanjanje tečnosti u svakom koraku je od suštinskog značaja za dobar učinak. Nakon poslednjeg pranja, uklonite sav preostali pufer za pranje aspiracijom ili dekantacijom. Okrenite ploču i obrišite je o čiste papirne ubruse.

6. Dodajte 200 µL IL-6 konjugata u svaki bunarić. Pokrijte novom lepljivom trakom. Inkubirajte 2 sata na sobnoj temperaturi.

7. Ponovite aspiraciju/pranje kao u koraku 5.

8. Dodajte 200 µL rastvora supstrata u svaki bunarić. Inkubirajte 20 minuta na sobnoj temperaturi. Zaštititi od svetlosti.

9. Dodajte 50 µL zaustavnog rastvora u svaki bunarić. Boja u bunarićima treba da se promeni iz plave u žutu. Ako je boja u bunarićima zelena ili se promena boje ne čini ujednačenom, nežno kuckajte po ploči da biste obezbedili temeljno mešanje.

10. Odredite optičku gustinu svakog ležišta unutar 30 minuta, koristeći čitač mikrotitarske ploče podešen na 450 nm. Ako je dostupna ispravka talasne dužine, podesite na 540 nm ili 570 nm. Ako ispravka talasne dužine nije dostupna, oduzmite očitavanja na 540 nm ili 570 nm od očitavanja na 450 nm. Ovo oduzimanje će ispraviti optičke nesavršenosti na ploči. Očitavanja napravljena direktno na 450 nm bez ispravke mogu biti više i manje tačna.

U nastavku su dobijeni eksperimentalni podaci:

Inhibicija proizvodnje IL-6 kontrolnim anti-LL-1β antitelima:

1. MRC5 ćelije (Prolaz 5) su postavljene na ploču sa 48 bunarića (Costar, kat. br.3548) sa 2 × 10<3>ćelija po otvoru, 0,4 ml po otvoru, i inkubirane 24 sata;

2. Na dan testa, medijum iz bunarića je aspiriran i zamenjen sa 0,4 ml DMEM-a sa dodatkom 10% FBS-a, inkubiran 10–15 minuta i ponovo zamenjen istom količinom istog svežeg medijuma;

3. IL-1β je korišćen u konačnoj koncentraciji od 50 pg/ml tokom eksperimenta;

4. Anti-humana IL-1β antitela su korišćena u konačnim koncentracijama od 0,192, 0,96, 4,8, 24, 120 i 600 ng/ml;

5. IL-1β kao i anti-humana IL-1β antitela su pripremljena kao 10 × koncentrovani rastvori;

6. Pre dodavanja testnih supstanci ćelijama, 55 ul 10 × IL-1β je pomešano sa 55 ul 10 × odgovarajućeg rastvora anti-humanog IL-1β antitela (ili odgovarajuće kontrole) i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 min;

7. Posle inkubacije, 100 ul svake smeše je dodato u bunariće koji sadrže 0,4 ml medijuma za rast;

8. Ćelije su inkubirane u prisustvu ispitivanih supstanci tokom 24 sata i supernatanti su sakupljeni, centrifugirani na 300 × g tokom 10 minuta i korišćeni za IL-6 ELISA test;

9. Za testiranje oporavka IL-6 u prisustvu anti-IL-1β antitela, potonje je korišćeno u konačnoj koncentraciji od 600 ng/ml i dodat im je IL-6 standard do konačne koncentracije od 20 pg/ml.

Kalibraciona krivulja dobijena u testu IL-1 antitelom posredovane inhibicije proizvodnje IL-6 prikazana je na Slici 7. Rezultati merenja IL-1 βposredovane proizvodnje IL-6 i izdvajanja IL-6 iz medijuma kulture u eksperimentu prikazani su na Slici 8 i Slici 9. Dobijene numeričke vrednosti za proizvodnju IL-6 sa njihovim standardnim devijacijama prikazane su u tabeli 5.

Tabela 5: Sažetak proizvodnih vrednosti IL-6.

Prethodni eksperiment je otkrio da je: (1) kontrolno anti-IL-1β antitelo veoma moćan inhibitor IL-1β signalnog puta sa IC50 od oko 2,1 ng/ml ili oko 14 pM; (2) gustina nanošenja ćelija od 2 × 10<3>ćelija po bunariću 24 sata pre postavljanja testa adekvatna; (3) izdvajanje IL-6 dodanog u medijum kulture u konačnoj koncentraciji od 20 pg/ml je oko 114%.

Inhibicija proizvodnje IL-6 preparatom IL1R-FcV-RAcP-FeII heterodimera:

1. MRC5 ćelije (Prolaz 6) su postavljene na ploču sa 48 bunarića (Costar, kat. br.3548) sa 2 × 103 ćelije po bunariću, 0,4 ml po bunariću i inkubirane 24 sata;

2. Postavljanje na mikrotitarske ploče za ovaj eksperiment je izvedeno u duplikatima. Svaki duplikat mikrotitarske ploče je meren u paru na ELISA ploči, što je rezultiralo sa 4 eksperimentalne tačke po tretmanu

3. Na dan testa, medijum iz bunarića je aspiriran i zamenjen sa 0,4 ml DMEM-a sa dodatkom 10% FBS-a, inkubiran 10–15 minuta i ponovo zamenjen istom količinom istog svežeg medijuma;

4. IL-1β je korišćen u konačnoj koncentraciji od 50 pg/ml tokom eksperimenta;

5. II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimer je korišćen u konačnim koncentracijama od 0,0536, 0,134, 0,335, 0,839, 2,097, 5,24, 13,1, 32,8, 81,9, 204,8, 512, 1280, 3200 i 20000 ng/ml;

6. IL-1β kao i IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimer su pripremljeni kao 10 × koncentrovani rastvori;

7. Pre dodavanja testnih supstanci ćelijama, 120 µL 10 × IL-1β/IL-1F2 je pomešano sa 120 µL 10 × odgovarajućeg rastvora II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimera (ili odgovarajuće kontrole) i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 min;

8. Posle inkubacije, 100 ul svake smeše je dodato u bunariće koji sadrže 0,4 ml medijuma za rast;

9. Ćelije su inkubirane u prisustvu testnih supstanci tokom 24 sata i supernatanti su sakupljeni, centrifugirani na 300 × g tokom 10 minuta i korišćeni za IL-6 ELISA test.

Kalibraciona krivulja dobijena u testu II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimerom posredovane inhibicije proizvodnje IL-6 je prikazana na Slici 10. Rezultati merenja IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimerom posredovane proizvodnje IL-6 i izdvajanja IL-6 iz medijuma kulture u eksperimentu prikazani su na Slici 11 i Slici 12. Dobijene numeričke vrednosti za proizvodnju IL-6 sa njihovim standardnim devijacijama prikazane su u tabeli 6.

Tabela 6: Sažetak proizvodnih vrednosti IL-6.

Svaka eksperimentalna tačka je postavljena na ploče u duplikatu i produkcija IL-6 je dalje merena u paru, što je rezultiralo sa 4 eksperimentalna očitavanja po tački koncentracije. Dobijeni podaci su pokazali visoku ponovljivost eksperimentalne procedure i testa. Prethodni eksperiment je otkrio da je IC50 vrednost za IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimer u ovom eksperimentu bila oko 0,3 mg/ml ili oko 2,4 pM.

Primer 5: Farmakokinetika (PK) IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera nakon subkutane primene kod miševa.

Polipeptidi II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimera (SEK ID BR.1 i SEK ID BR. 2) su ko-eksprimirani i prečišćeni suštinski kao što je opisano u prethodnim primerima. Za primenu na životinje, polipeptidi su formulisani u sledećem puferu: 1% v/v saharoze, 100 mM natrijum hlorida, 20 mM L-arginin hidrohlorida, 25 mM natrijum bikarbonata, pH 6,3. Korišćena osnovna koncentracija za doziranje bila je 0,5 mg/ml polipeptida.

Četrnaest ženki Balb/c nu/nu miševa je randomizirano na osnovu telesne težine u sedam grupa od po dve životinje 0. dana studije. Jedan tretman polipeptida (5 mg/kg) je primenjen subkutano (dorzalno) 0. dana na sve grupe osim miševa u grupi 1, kojima je puštena krv putem srčane punkcije za pripremu plazme 0. dana studije. Uzorci krvi su sakupljani preko orbitalnog sinusa od miševa u ostalim grupama u različitim vremenima tokom studije za pripremu plazme.

Telesne težine su zabeležene za sve životinje na dan tretiranja (dan 0), i zatim tri puta nedeljno, uključujući dan terminacije svake grupe.

Grupe miševa su usmrćivane u određenim vremenskim tačkama za pripremu plazme. Promene telesne težine nisu merene u grupama koje su izdvojene za uzimanje uzoraka u 0 sati i u roku od 36 sati od primene doze. Svi ostali miševi su dobili na telesnoj težini i nisu prijavljeni nikakvi štetni klinički znaci tokom perioda studije.

Nakon in-vivo faze studije, uzorci plazme su analizirani ELISA testom na Hu-Fc proteine. Kvantifikacija Hu-Fc u uzorcima mišje plazme pomoću ELISA testa korišćena je kao očitavanje nivoa cirkulišućih polipeptida. Test je izveden na uzorcima od svih miševa u studiji.

Polipeptidi su detektovani u plazmi životinja 1 sat nakon primene. Jednačina jednofaznog modela propadanja korišćenjem Prism 5.0c (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, SAD) je zatim korišćena za određivanje farmakokinetike polipeptida kao što je detektovano Hu-Fc ELISA testom.

Utvrđeno je da je vršni cirkulacioni nivo Hu-Fc (Cmax) 1,65 µg/ml, i da je vreme do vršnog cirkulacionog nivoa (Tmak) bilo 36 sati nakon tretiranja. Poluvreme eliminacije (T1/2) je bilo 88,15 sati i konstanta brzine (K) je bila 0,0079 h-1. Nivoi Hu-Fc su bili zanemarljivi u plazmi netretiranih životinja grupe 1. Rezultati studije su sažeti u tabeli 7.

Tabela 7: Srednja koncentracija humanog Fc proteina ± SEM (µg/ml) u svakom periodu nakon primene

Grupa Tretman C Raspored Srednja SEM puštanja krvi koncentracija

(vreme humanog Fc

nakon proteina

primene) [µg/ml]

1 Bez tretiranja; 0 sati 0,00 --* ;2 30 minuta 0,02 0,01 ;3 1 sat^ 0,12 0,00 ;4 2 sata^ 0,24 0,09 ;5 4 sata^ 0,76 0,03 ;6 8 sati^ 1,11 0,10 ;7 polipeptid SEK ID 10 sati^ 1,53 0,08 ;BR. 1 i BR.2 (5 mg/kg, ;2 samo jednom, s.c.) 24 sata<#>1,47 0,14 ;3 36 sati<#>1,65 0,11 ;4 96 sati<#>1,27 0,01 ;5 7 dana<#>0,43 0,01 ;6 14 dana<#>0,13 0,07 ;7 21 dan<#>0,06 0,04 *SEM nije mogao da se izračuna jer je nivo Hu-Fc bio ispod granice detekcije ELISA testa za jedan od uzoraka u grupi.

Koncentracija humanog Fc proteina je određena pomoću Prism Softwarea na osnovu srednje apsorbancije triplikatnih uzoraka.

Puštanje krvi preko orbitalnog sinusa

<#>Puštanje krvi preko terminalne srčane punkcije

Primer 6: Vrednovanje toksičnosti II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimera nakon 28-dnevnog ponovljenog doziranja kod C57BL6 miševa.

Sledi sažetak rezultata studije vrednovanja toksičnosti ponovljenih doza kod miševa. Tretiranje C57BL6 miševa polipeptidima II,1R-FcV-RAcP-FcΠ heterodimera (SEK ID BR.1 i SEK ID BR.2) testnog artikla subkutanom injekcijom dva puta nedeljno u dozama od 10, 30 i 100 mg/kg bilo je dobro tolerisano u studiji. Nije bilo neplaniranih smrti pre zaključivanja studije. Tretiranje testnim artiklom nije bilo povezano sa morbiditetom ili kliničkim znacima toksičnosti. Nije bilo doslednog uticaja na telesnu težinu vezanog za pol ili tretman. Postojao je nalaz povećane potrošnje hrane što se smatralo mogućim efektom lečenja, ali se to nije smatralo štetnim.

Iako su postojali dokazi o funkcionalnim promenama u parametrima vezanim za kliničku biohemiju, oni se nisu smatrali toksikološki značajnim jer je postojao dokaz reverzibilnosti kod većine ovih parametara, iako u nekima nije bila potpuna. U odsustvu toksikokinetičkog vrednovanja nije bilo moguće proceniti značaj prividne nereverzibilnosti nekih od ovih razlika. Međutim, nijedna od razlika nije bila povezana sa histopatološkom promenom ili se smatrala nepovoljnom. Uočene razlike bile su tipa koji je tipično reverzibilan i moguće je da period reverzibilnosti nije bio dovoljan da se to pokaže.

Zaključeno je da se stoga smatra da je nivo bez uočenih neželjenih efekata (NOAEL) u 28-dnevnoj studiji doziranja IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimera u mišu 100 mg/kg.

Puni obim pronalaska treba da se odredi pozivanjem na patentne zahteve i specifikaciju.

_____________________

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Heterodimerni proteinski sastav sposoban da vezuje humani IL-1β, navedeni proteinski sastav sadrži:

prvi polipeptid koji sadrži

prvu sekvencu aminokiselina koja sadrži aminokiseline od 18 do 333 humanog IL1 -R 1, i

drugu sekvencu aminokiselina koja sadrži prvi mutant Fc dela humanog imunoglobulina gama-1 Fc;

drugi polipeptid koji sadrži

drugu prvu sekvencu aminokiselina koja sadrži aminokiseline od 21 do 358 humanog ILl-RAcP, i

drugu drugu sekvencu aminokiselina koja sadrži drugi mutant Fc dela humanog imunoglobulina gama-1 Fc; i

naznačen time što su navedeni prvi i drugi mutanti odabrani tako da favorizuju heterodimerni sklop između navedenog prvog i drugog mutanata u odnosu na bilo koji homodimerni sklop,

naznačen time što prvi polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR. 1, a drugi polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2.

2. Proteinski sastav prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što navedeni proteinski sastav pokazuje aktivnost vezivanja humanog IL-1β u ELISA testu sa EC50 od 50 ng/ml.

3. Terapijski sastav, sastav sadrži heterodimerni proteinski sastav sposoban da veže humani IL-1β, navedeni heterodimerni proteinski sastav sadrži:

prvi polipeptid koji sadrži

drugi polipeptid koji sadrži

4. Terapijski sastav prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što je poluvreme eliminacije navedenog heterodimernog proteinskog sastava u sistemskoj cirkulaciji kod miševa nakon subkutane primene u dozi od 5 mg/kg najmanje 88 sati, analizirano humanim Fc ELISA testom.

5. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEK ID.1, SEK ID BR.2, SEK ID BR.3, i SEK ID BR.5.

6. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što je upotreba kodona optimizovana za visoku ekspresiju navedenog polipeptida u ćeliji sisara.

7. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što sekvenca nukleinske kiseline kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.3 i sadrži sekvencu SEK ID BR.4, ili naznačena time što sekvenca nukleinske kiseline kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR. 5 i sadrži sekvencu SEK ID BR.6.

8. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što navedena nukleinska kiselina sadrži vektor ekspresije.

9. Izolovana nukleinska kiselina SEK ID BR.7.

10. Heterologni sistem ekspresije, sistem ekspresije sadrži vektor ekspresije koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.3 i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.5.

11. Sistem ekspresije prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što je navedeni vektor ekspresije sadržan u ćeliji sisara, poželjno naznačen time što je navedena ćelija sisara CHO ćelija.

12. Sistem ekspresije prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što je navedeni sistem ekspresije sposoban da eksprimuje heterodimerni protein koji sadrži prvi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.1 i drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR. 2, i naznačen time što je nivo ekspresije navedenog heterodimernog proteina najmanje 300 mg po litru ćelijske kulture.

13. Heterodimerni protein koji sadrži prvi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.1 i drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2 za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povezane sa modulacijom aktivnosti humanog IL-1β, naznačen time što je navedena bolest artritis, ili naznačen time što je navedena bolest giht, ili naznačen time što je navedena bolest reumatoidni artritis, ili naznačen time što je navedena bolest periodični sindromi povezani sa kriopirinom (CAPS), ili naznačen time što je navedena bolest skleroderma, ili naznačen time što je navedena bolest dijabetes, ili naznačen time što je navedena bolest ateroskleroza, ili naznačen time što je navedena bolest bolest suvog oka, ili naznačen time što je navedena bolest očna alergija, ili naznačen time što je navedena bolest uveitis.

14. Heterodimerni proteinski sastav koji je sposoban da veže humani IL-1β, navedeni proteinski sastav je sposoban da inhibira proizvodnju humanog IL-6 u humanim plućnim fibroblastima kao odgovor na tretiranje fibroblasta sa humanim IL-1β, navedena inhibicija ima IC50 vrednost od 2,3 pM, naznačen time što heterodimerni proteinski sastav sadrži prvi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.1 i drugi polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR.2.