RS65606B1 - Kompozicija rastvorljive hijaluronidaze - Google Patents

Description

Opis pronalaska

OBLAST PRONALASKA

[0001] Obezbeđeni su postupci za proizvodnju rekombinantnog humanog proteina velikog obima.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Hijaluronidaze su familija enzima koje razlažu hijaluronsku kiselinu (takođe poznate kao hijaluronan ili hijaluronat), esencijalna komponenta vanćelijskog matriksa i glavna komponenta intersticijalne barijere. Katalizovanjem hidrolize hijaluronske kiseline, hijaluronidaze snižavaju viskozitet hijaluronske kiseline, time povećavaju permeabilnost tkiva. Kao takve, hijaluronidaze se koriste, na primer, kao sredstvo za širenje ili raspršivanje zajedno sa drugim agensima, lekovima i proteinima da pojačaju njihovo raspršivanje i isporuku. Hijaluronidaze takođe imaju druge terapeutske i kozmetičke primene. Zbog povećane upotrebe hijaluronidaza u terapeutske i kozmetičke svrhe, postoji potreba za velikom količinom prečišćenih hijaluronidaza. Stoga, među ciljevima ovde, je cilj da se obezbede postupci za proizvodnju i prečišćavanje hijaluronidaza.

[0003] SAD 2004/268425 otkriva rastvorljiv hijaluronidaza glikoprotein (sHASEGP), postupak za pripremu istog, upotrebu i farmaceutske kompozicije koje se sastoje od njih.

SAŽETAK

[0004] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.

[0005] Naročito, ovaj pronalazak se odnosi na:

Kompoziciju koja sadrži smešu polipeptida, nazvanih smeša koja sadrži polipeptide prikazanih u SEQ ID NOS: 4-8, pri čemu se kompozicija može dobiti sledećim postupkom: a) inokulacijom ćelijskog medijuma u bioreaktoru sa inokulumom ćelija koje kodiraju rastvorljiv rekombinantni humani PH20 (rHuPH20) da bi se proizvela ćelijska kultura, pri čemu:

ćelije sadrže između 150 i 300 kopija nukleinske kiseline koja kodira rastvorljivi rHuPH20;

bioreaktor koji sadrži najmanje 100 litara ćelijske kulture;

10<10>– 10<11>ćelija koje su inokulirane na 100 litara ćelijske kulture; i ćelije koje su kultivisane na podešenoj temperaturi;

b) hranjenje ćelija sa prvim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, humani insulin i ekstrakt kvasca u količinama dovoljnim da povećaju ćelijski rast i da se dostigne pik gustine ćelija, i povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20, pri čemu se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 0.5% do 20% zapremine kulture ćelija;

c) hranjenje ćelija sa sekundarnim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20 i indukuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa; i snižavanje temperature u poređenju sa temperaturom u koraku a) na temperaturu dovoljnu da poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljivu hijaluronidazu; pri čemu:

količina L-alanil-L-glutamin je smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamin u koraku b);

količina ekstrakta kvasca je povećana u poređenju sa količinom ekstraktom kvasca u koraku b); i

hranljivi medijum je dodat u kulturu u zapremini od 0.5% do 20% zapremine ćelijske kulture;

d) hranjenje ćelija sa trećim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da se poveća sinteza rastvorljivog rHuPH20 i da se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, i snižavanje temperature u poređenju sa temperaturom u koraku c) do temperature dovoljne sa se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljiva hijaluronidaza; pri čemu:

količina L-alanil-L-glutamina je smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamina u koraku c);

količine ekstrakta kvasca, glukoze i natrijum butirata su povećane u poređenju sa količinama ekstrakta kvasca, glukoze i natrijum butirata u koraku c); i

hranljivi medijum je dodat u kulturu u zapremini od 0.5% do 20% zapremine ćelijske kulture;

e) hranjenje ćelija sa četvrtim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da se poveća sinteza rastvorljivog rHuPH20 i da se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, i snižavanje temperature u poređenju sa temperaturom u koraku d) do temperature dovoljne sa se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljiva hijaluronidaza; pri čemu:

količina L-alanil-L-glutamina i glukoze je smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamina i glukoze u koraku d);

količina natrijum butirata je smanjena u poređenju sa količinom natrijum butirata u koraku d); i

hranljivi medijum je dodat u kulturu u zapremini od 0.5% do 20% zapremine ćelijske kulture;

f) nastavljanje sa kultivisanjem ćelija dok vijabilnost ne padne ispod najmanje 50 %; g) dobijanje tečnosti sakupljene kulture ćelija; i

h) prečišćavanje rHuPH20 iz tečnosti sakupljene kulture ćelija,

pri čemu je rastvorljiv rHuPH20 rastvorljiv oblik humanog PH20 koji je rekombinantno eksprimiran u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0006] Ovde su obezbeđeni postupci za proizvodnju i prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20. Postupci kao takvi nisu u patentnim zahtevima. Ovde su takođe obezbeđeni ćelijski medijum i tečnost sakupljene kulture ćelija koja sadrži rastvorljivi rHuPH20. Postupci koji su ovde obezbeđeni mogu se koristiti za proizvodnju i prečišćavanje bilo koje količine rastvorljivog rHuPH20. Na primer, postupci i koraci obezbeđeni ovde mogu se menjati za povećanje ili smanjenje, što bi bilo očigledno stručnjaku u tehnici.

[0007] Postupci obezbeđeni ovde mogu se koristiti za proizvodnju i prečišćavanje velike količine rastvorljivog rHuPH20. Postupci obezbeđeni ovde za proizvodnju rastvorljivog rHuPH20 mogu uključivati a) inokulaciju ćelijskog medijuma u bioreaktoru sa inokulumom ćelija koje kodiraju rastvorljiv rHuPH20 da bi se proizvela ćelijska kultura, pri čemu ćelije sadrže između 150 i 300 kopija nukleinske kiseline koja kodira rastvorljivi rHuPH20, bioreaktor koji sadrži najmanje 100 litara ćelijske kulture i oko 10<10>– 10<11>ćelija koje su inokulirane na 100 litara ćelijske kulture i ćelije koje su kultivisane na podešenoj temperaturi; b) hranjenje ćelija sa prvim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, humani insulin i ekstrakt kvasca u količinama dovoljnim da povećaju ćelijski rast i da se dostigne pik gustine ćelija, i povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20, pri čemu se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 4% zapremine kulture ćelija; c) hranjenje ćelija sa sekundarnim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstraktom kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20 i indukuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa, pri čemu je količina L-alanil-L-glutamina smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamin u drugom koraku, i količina ekstrakta kvasca je povećana u poređenju sa količinom ekstraktom kvasca u koraku b), i hranljivi medijum je dodat u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture i temperatura je snižena u poređenju sa temperaturom u koraku a) do temperature koja je dovoljna da poveća zaustavljanje ćelijskog rasta, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljivu hijaluronidazu; d) hranjenje ćelija sa trećim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da se poveća sinteza rastvorljivog rHuPH20 i da se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, pri čemu se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture, količina L-alanil-L-glutamina i glukoze je smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamina i glukoze u koraku c); i količine ekstrakta kvasca i natrijum butirata je povećana u poređenju sa količinom ekstrakta kvasca i natrijum butirata u koraku c), i temperatura je snižena u poređenju sa temperaturom u koraku c) do temperature dovoljne sa se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljiva hijaluronidaza; e) hranjenje ćelija sa četvrtim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da se poveća sinteza rastvorljivog rHuPH20 i da se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, pri čemu je količina L-alanil-L-glutamina i glukoze smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamina i glukoze u koraku d), količina natrijum butirata je smanjena u poređenju sa količinom natrijum butirata u koraku d), temperatura je snižena u poređenju sa temperaturom u koraku d) do temperature dovoljne sa se poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljiva hijaluronidaza i hranljivi medijum je dodat u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture; f) kultivisanje ćelija dok vijabilnost ne padne ispod najmanje ili oko 50 %; g) dobijanje tečnosti sakupljene kulture ćelija; i h) rastvorljivi rHuPH20 je prečišćen iz tečnosti sakupljene kulture ćelija.

[0008] Tečnost sakupljene kulture ćelija može biti filtrirana pre prečišćavanja. U nekim primerima, temperatura u koraku a) je 37 °C, temperatura u koraku c) je 36.5 °C, temperatura u koraku d) je 36 °C i temperatura u koraku d) je 35.5 °C. Prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 se može vršiti hromatografijom na koloni, kao što je hromatografija na koloni sa agaroznim kuglicama, hromatografija na koloni sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, hromatografija na koloni sa amino fenil boronatom i hromatografija na koloni sa hidroksiapatitom.

[0009] U jednom primeru, postupak za proizvodnju rastvorljivog rHuPH20, uključuje korake a) inokulaciju ćelijskog medijuma u bioreaktoru sa inokulumom ćelija koje kodiraju rastvorljiv rHuPH20 da bi se proizvela ćelijska kultura, pri čemu ćelije sadrže između 150 i 300 kopija nukleinske kiseline koja kodira rastvorljivi rHuPH20, bioreaktor koji sadrži najmanje 100 litara ćelijske kulture, gustina inokuliranih ćelija je na ili oko 4 × 10<5>ćelija/mL i ćelije su kultivisane na 37 °C; b) hranjenje ćelija sa prvim hranljivim medijumom koji sadrži na ili oko 33 g/L glukoze, 32 mM L-alanil-L-glutamina, 16.6 g/L ekstrakta kvasca i 33 mg/L insulina, pri čemu se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 4% zapremine kulture ćelija; c) hranjenje ćelija sa sekundarnim hranljivim medijumom koji sadrži na ili oko 33 g/L glukoze, 16 mM L-alanil-L-glutamina, 33.4 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, pri čemu je hranljivi medijum dodat u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture i temperatura je snižena na 36.5 °C; d) hranjenje ćelija sa trećim hranljivim medijumom koji sadrži na ili oko 50 g/L glukoze, 10 mM L-alanil-L-glutamina, 50 g/L ekstrakta kvasca i 1.8 g/L natrijum butirata, pri čemu se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture i temperatura je snižena na 36 °C; e) hranjenje ćelija sa četvrtim hranljivim medijumom koji sadrži na ili oko 33 g/L glukoze, 6.6 mM L-alanil-L-glutamina, 50 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, pri čemu je hranljivi medijum je dodat u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture i temperatura je snižena na 36 °C; f) nastavljeno je kultivisanje ćelija dok vijabilnost nije pala ispod najmanje ili oko 50 %; g) dobijanje tečnosti sakupljene kulture ćelija; h) filtriranje tečnosti sakupljene kulture ćelija; i i) prečišćavanje rHuPH20 iz tečnosti sakupljene kulture upotrebom hromatografije na koloni sa agaroznim kuglicama, hromatografija na koloni sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, hromatografija na koloni sa amino fenil boronatom i hromatografija na koloni sa hidroksiapatitom.

[0010] U drugom primeru, postupak za proizvodnju rastvorljivog rHuPH20, uključuje korake a) inokulaciju ćelijskog medijuma u bioreaktoru sa inokulumom ćelija koje kodiraju rastvorljiv rHuPH20 da bi se proizvela ćelijska kultura, pri čemu ćelije sadrže između 150 i 300 kopija nukleinske kiseline koja kodira rastvorljivi rHuPH20; bioreaktor sadrži najmanje 100 litara ćelijske kulture; gustina inokuliranih ćelija je na ili oko 4 × 10<5>ćelija/mL; i ćelije su kultivisane na ili oko 37 °C; b) hranjenje ćelija sa prvim hranljivim medijumom koji sadrži ili sadrži oko 33 g/L glukoze, 32 mM L-alanil-L-glutamina, 83.3 g/L ekstrakta kvasca i 33 mg/L insulina, pri čemu se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 4% ili oko 4% zapremine kulture ćelija; c) hranjenje ćelija sa sekundarnim hranljivim medijumom koji sadrži ili sadrži oko 33 g/L glukoze, 13 mM L-alanil-L-glutamina, 166.7 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, pri čemu je hranljivi medijum dodat u kulturu u zapremini od ili oko 4% zapremine ćelijske kulture i temperatura je snižena na 36.5 °C; d) hranjenje ćelija sa trećim hranljivim medijumom koji sadrži ili sadrži oko 50 g/L glukoze, 10 mM L-alanil-L-glutamina, 250 g/L ekstrakta kvasca i 1.8 g/L natrijum butirata, pri čemu se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 4% ili oko 4% zapremine ćelijske kulture i temperatura je snižena na 36 °C; e) hranjenje ćelija sa četvrtim hranljivim medijumom koji sadrži ili sadrži oko 33 g/L glukoze, 6.7 mM L-alanil-L-glutamina, 250 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, pri čemu je hranljivi medijum je dodat u kulturu u zapremini od 4% ili oko 4% zapremine ćelijske kulture i temperatura je snižena na 36 °C; f) nastavljeno je kultivisanje ćelija dok vijabilnost nije pala ispod najmanje ili oko 50%; g) dobijanje tečnosti sakupljene kulture ćelija; h) filtriranje tečnosti sakupljene kulture ćelija; i i) prečišćavanje rHuPH20 iz tečnosti sakupljene kulture upotrebom hromatografije na koloni sa agaroznim kuglicama, hromatografija na koloni sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, hromatografija na koloni sa amino fenil boronatom i hromatografija na koloni sa hidroksiapatitom.

[0011] U nekim primerima, zapremina ćelijske kulture u bioreaktoru je ili je oko 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 ili 3500 litara. U nekim primerima, količina rastvorljivog rHuPH20 se proizvodi na 100 L ćelijske kulture upotrebom postupaka obezbeđenih ovde najmanje ili oko 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ili 40 grama rastvorljivog rHuPH20. Specifična aktivnost rastvorljivog rHuPH20 može biti najmanje ili oko 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 ili 180000 jedinica/mg. Ćelije koje kodiraju rastvorljivi rHuPH20 mogu, u nekim slučajevima, biti DG44 CHO ćelije. Dalje, rHuPH20 mogu biti kodirane nukleinskom kiselinom koja je prikazana u SEQ ID NO:47.

[0012] Ovde su obezbeđene medijumi ćelijske kulture koji sadrže rastvorljivi rHuPH20 sa enzimskom aktivnošću većom od 5000 jedinica/mL, kao što je 10 000, 12 000, 14 000, 16 000, 18000, 20 000, 22000 ili 24000 jedinica/mL. Takođe ovde su obezbeđene tečnosti sakupljene ćelijske kulture koje sadrže rastvorljiv rHuPH20 sa enzimskom aktivnošću većom od 5000 jedinica/mL, kao što je 10000, 12000, 14 000, 16000, 18 000, 20000, 22 000 ili 24 000 jedinica/mL. Patentno zahtevani pronalazak međutim odnosi se na kompoziciju kako je definisano u patentnim zahtevima 1 do 16. Tako, takođe u sledećoj sekciji detaljnog opisa pronalaska, postupci, terapeutska upotreba, ćelije koje eksprimiraju hijaluronidaze, širenje ćelijske kulture itd. su korisni za razumevanje pronalaska ali nisu patentno zahtevani kao takvi.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Kratak pregled

[0013]

A. Definicije

B. Pregled

C. Hijaluronidaza

1. Struktura i funkcija

2. PH20

3. Terapeutska upotreba hijaluronidaza

a. Upotreba kao sredstvo za raspršivanje

b. Upotreba u hipodermoklizi

c. Upotreba u vitrektomiji i oftalmološkim poremećajima i stanjima d. Upotreba u genetičkoj terapiji

e. Upotreba u kozmetici

f. Upotreba u transplantaciji organa

g. Upotreba u lečenju kancera

h. Upotreba u lečenju akumulacije glikozaminoglikana u mozgu

i. Upotreba u lečenju akumulacije glikozaminoglikana kod kardiovaskularnih bolesti

j. Upotreba kod plućnih bolesti

k. Druge upotrebe

D. Ćelije u kojima se eksprimiraju hijaluronidaze

a. 3D35M ćelije

b. 2B2 ćelije

E. Širenje ćelijske kulture

F. Proizvodnja proteina

G. Koncentracija proteina i zamena pufera

H. Prečišćavanje

1. Kolona sa agaroznim kuglicama

2. Kolona sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama 3. Kolona sa amino fenil boronatom

4. Kolona sa hidroksiapatitom

6. Uklanjanje virusa, koncentracija proteina i razmena pufera

I. Punjenje

J. Praćenje i analize

1. Uslovi praćenja

2. Praćenje proizvodnje rastvorljivog rHuPH20

K. Primeri

A. DEFINICIJE

[0014] Ukoliko drugačije nije naznačeno, svi tehnički i naučni termini koji su upotrebljeni ovde imaju isto značenje koje je uobičajeno razumljivo stručnjaku iz tehnike kojoj pronalazak (pronalasci) pripadaju.

[0015] U slučaju da postoji više definicija za termine koji su ovde upotrebljeni, oni u ovom odeljku imaju prednost. Gde je pozivano na URL ili druge takve identifikatore ili adrese, podrazumeva se da se takvi identifikatori mogu menjati i određene informacije na internetu se mogu pojaviti i nestati, ali ekvivalentne informacije se mogu pronaći traženjem na internetu. Pozivanje na to dokazuje dostupnost i javnu diseminacija takvih informacija.

[0016] Kako je upotrebljena ovde, hijaluronidaza se odnosi na enzim koji razgrađuje hijaluronsku kiselinu, Hijaluronidaze uključuju bakterijske hijaluronidaze (EC 4.2.99.1), hijaluronidaze iz pijavica, drugih parazita, i rakova (EC 3.2.1.36) i hijaluronidaza kod sisara (EC 3.2.1.35). Hijaluronidaze takođe uključuju bilo koje bez humanog porekla uključujući, ali neograničavajući se na, mišje, pseće, mačje, zečje, ptičje, goveđe, ovčje, svinjsko, konjski, riblje, žablje, bakterijsko, i bilo koje od pijavica, drugih parazita, i rakova. Ogledne nehumane hijaluronidaze uključuju, hijaluronidaze iz krava (SEQ ID NO:10), obična osa (SEQ ID NOS:11 i 12), pčela (SEQ ID NO:13), beloliki stršljen (SEQ ID NO:14), papirne ose (SEQ ID NO:15), miš (SEQ ID NOS:16-18, 29), svinja (SEQ ID NOS:19-20), pacov (SEQ ID NOS: 21-23, 28), zec (SEQ ID NO:24), ovca (SEQ ID NO:25), orangutan (SEQ ID NO:26), makaki rakojed (SEQ ID NO:27), morsko prase (SEQ ID NO:30), Staphylococcus aureus (SEQ ID NO:31), Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:32), i Clostridium perfringens (SEQ ID NO:33). Ogledne humane hijaluronidaze uključuju HYAL1 (SEQ ID NO:34), HYAL2 (SEQ ID NO:35), HYAL3 (SEQ ID NO:36), HYAL4 (SEQ ID NO:37), i PH20 (SEQ ID NO:1). Takođe su među hijaluronidaze uključeni rastvorljivi PH20 i rastvorljivi rHuPH20.

[0017] Pozivanje na hijaluronidaze uključuje prekurskora polipeptida hijaluronidaza i zrele polipeptide hijaluronidaza (kao što su one u kojima su signalne sekvence uklonjene), njihove skraćene oblike koji su aktivni, i uključuju alelske varijante i varijante vrsta, varijante koje su kodirane varijantama splajsovanja, i drugim varijantama.

[0018] Na primer, pozivanje na hijaluronidazu takođe uključuje varijante humanog PH20 prekursora polipeptida prikazane u SEQ ID NOS: 48-49. Hijaluronidaze takođe uključuju one koje sadrže hemijske ili posttranslacione modifikacije i one koje ne sadrže hemijske ili posttranslacione modifikacije. Takve modifikacije uključuju, ali se ne ograničavaju na, pegilaciju, albuminaciju, glikozilaciju, farnesilaciju, karboksilaciju, hidroksilaciju, fosforilaciju, i druge modifikacije polipeptida poznate u tehnici.

1

[0019] Kako je upotrebljen ovde, rastvorljivi humani PH20 ili sHuPH20 uključuje zrele polipeptide kojima u potpunosti ili delimično nedostaje glikosilfospatidil inositol (GPI) mesto vezivanja na C kraju tako da su nakon ekspresije polipeptidi rastvorljivi. Ogledni sHuPH20 polipeptidi uključuju zrele polipeptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu prikazanu u bilo kom od SEQ ID NOS: 4-9 i 45-46. Prekursor polipeptida kao što su ogledni sHuPH20 polipeptidi uključuju signalnu sekvencu, Ogledni prekursori su oni prikazani u SEQ ID NOS:3 i 38-44, svaki koji sadrži signalnu sekvencu od 35 aminokiselina na pozicijama aminokiselina 1-35. Rastvorljivi HuPH20 polipeptidi takođe uključuju one degradirane tokom ili posle postupaka proizvodnje i prečišćavanja koji su ovde opisani.

[0020] Kako je upotrebljen ovde, rastvorljivi rHuPH20 odnosi se na rastvorljivu formu humanog PH20 koji se rekombinantno eksprimira u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO). Rastvorljivi rHuPH20 je kodiran nukleinskom kiselinom koja uključuje signalnu sekvencu i prikazana je u SEQ ID NO:47. Takođe uključeni su DNK molekuli i njegove alelske varijante i druge rastvorljive varijante. Nukleinska kiselina koja kodira rastvorljivi rHuPH20 se eksprimira u CHO ćelijama koje luče zrele polipeptide. Pošto se proizvode u medijumu kulture postoji heterogenost na C kraju tako da proizvodi uključuju smešu vrsta koje mogu uključivati jednu ili više SEQ ID NOS 4-8 različite zastupljenosti. Uključene su odgovarajuće alelske varijante.

[0021] Kako je upotrebljen ovde, „ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20“ odnose se na bilo koje CHO ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20. Ogledne ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 uključuju 2B2 i 3D35M ćelije. Ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 su CHO ćelije unutar kojih je uvedena nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:55.

[0022] Kako je upotrebljena ovde, aktivnost hijaluronidaze odnosi se na bilo koju aktivnost ispoljenu od polipeptida hijaluronidaze. Takve aktivnosti mogu biti testirane in vitro i/ili in vivo i uključuju, ali se ne ograničavaju na, enzimsku aktivnost, kao što je efekat cepanja hijaluronske kiseline, sposobnosti da deluje kao agens za raspršivanje i širenje i antigenost. Aktivnost hijaluronidaze se odnosi na bilo koju aktivnost ispoljenu od peptida hijaluronidaze.

[0023] Kako je upotrebljena ovde, enzimska aktivnost se odnosi na aktivnost hijaluronidaze, procenjena u in vitro enzimskim testovima, za cepanje supstrata, kao što je hijaluronska kiselina. In vitro analize određuju enzimsku aktivnost hijaluronidaza, kao što je rastvorljivi rHuPH20, poznat u tehnici i opisan ovde. Ogledne analize uključuju analizu mikrozamućemnosti koja je opisana u nastavku teksta (videti npr. primer 9 i odeljak 1) kojom se meri cepanje hijaluronske kiseline hijaluronidazom indirektno uočavanjem nerastvorljivog taloga koji se formira kada se nerascepana hijaluronska kiselina veže za serum albumin.

[0024] Kako je upotrebljena ovde, specifična aktivnost se poziva na enzimsku aktivnost rastvorljivog rHuPH20 u odnosu na količinu rastvorljivog rHuPH20. Specifična aktivnost se računa deljenjem enzimske aktivnosti (jedinice/mL) koncentracijom proteina (mg/mL).

[0025] Kako je upotrebljen ovde, „ispoljava najmanje jednu aktivnost“ ili „zadržava najmanje jednu aktivnost“ odnosi se na aktivnost ispoljenu od varijante rastvorenog rHuPH20 u poređenju sa bilo kojom rastvorenom rHuPH20 prikazanom u SEQ ID NOS:4-9 pod istim uslovima. Tipično, varijanta rastvorenog rHuPH20 koji zadržava ili ispoljava najmanje jednu aktivnost rastvorljivog rHuPH20 prikazanog u SEQ ID NOS:4-9 zadržava na ili oko 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%,18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ili više aktivnosti rastvorljivog rHuPH20 prikazanog u SEQ ID NOS:4-9. Ogledne aktivnosti uključuju, ali se ne ograničavaju na, aktivnost hijaluronidaze i enzimsku aktivnost.

[0026] Kako je upotrebljena ovde, hromatografija na koloni sa agaroznim kuglicama odnosi se na hromatografiju koja koristi kolonu upakovanu sa agaroznim kuglicama. Ogledna agarozna kuglica je Q Sepharose<TM>.

[0027] Kako je upotrebljena ovde, hromatografija na koloni sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama odnosi se na hromatografiju koja koristi kolonu upakovanu sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama. Ogledni primer fenil supstituisanih agaroznih kuglica je Phenyl Sepharose<TM>.

[0028] Kako je upotrebljena ovde, hromatografija na koloni sa amino fenil boronatom odnosi se na hromatografiju koja koristi kolonu upakovanu sa amino fenil boronat agarozom.

[0029] Kako je upotrebljena ovde, hromatografija na koloni sa hidroksiapatitom odnosi se na hromatografiju koja koristi kolonu upakovanu sa hidroksiapatitom.

[0030] Kako je upotrebljena ovde, tečnost sakupljene ćelijske kulture ili tečnost sakupljene kulture ćelija (HCCF) odnosi se na tečnost dobijenu nakon sakupljanja ćelija iz bioreaktora i razdvajanja medijuma ćelijske kulture od ćelija, ostataka ćelija i ostalih agregata. Ćelijska kultura koja je pokupljena iz bioreaktora može se filtrirati da bi se razbistrila kultura, uklonile ćelije, ćelijski ostaci i drugi agregati da bi ostala tečnost sakupljene ćelijske kulture.

[0031] Kako je upotrebljena ovde, gustina ćelija se odnosi na broj ćelija u datoj zapremini medijuma.

[0032] Kako je upotrebljena ovde, ćelijska kultura ili kultura odnosi se na populaciju ćelija koja je suspendovana u medijumu pod odgovarajućim uslovima da se održi vijabilnost ćelija ili rast ćelija.

[0033] Kako je upotrebljen ovde, medijum, ćelijski medijum ili medijum ćelijske kulture odnosi se na rastvor koji sadrži nutrijente dovoljne da pospešuju rast ćelija u kulturi. Tipično, ovi rastvori sadrže esencijalne i ne esencijalne aminokiseline, vitamine, izvore energije, lipide i/ili tragove elemenata. Medijum takođe može da sadrži dodatne suplemente, kao što su hormoni, faktori rasta i inhibitori rasta. Uključeno je pozivanje na medijum ćelijske kulture.

[0034] Kako su upotrebljeni ovde, ostaci prirodno nastalih α-aminokiselina su ostaci onih aminokiselina koje se nalaze u prirodi koji su inkorporirani u protein specifičnim prepoznavanjem naelektrisanog molekula tRNK sa njegovim srodnim mRNK kodonom kod ljudi.

[0035] Kako je upotrebljeno ovde, „u količinama dovoljnim da poveća“ kada se odnosi na supstancu koja povećava parametre kao što su stopa ćelijskog rasta, pik gustine ćelija, sinteza proteina ili zaustavljanje ćelijskog ciklusa odnosi se na količinu supstance koja utiče na povećavanje u jednom od ovih parametara u poređenju sa onim uočenim u odsustvu supstance. Parametri mogu biti procenjeni u prisustvu i odsustvu supstance, i može biti određena količina supstance koja povećava paramatar (kao što je stopa ćelijskog rasta, pik gustine ćelija, sinteza proteina ili zaustavljanje ćelijskog ciklusa) u poređenju sa odsustvom supstance. Stopa rasta, pik gustine ćelija, sinteza proteina ili zaustavljanje ćelijskog ciklusa u prisustvu supstance mogu biti povećani za ili oko 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ili više u poređenju sa stopom rasta, pikom gustine ćelija, sintezom proteina ili zaustavljanjem ćelijskog ciklusa u odsustvu supstance.

[0036] Kako su upotrebljene ovde, nukleinske kiseline DNK, RNK i njihovi analozi, koji uključuju peptide nukleinskih kiselina (PNK) i njihove smeše. Nukleinske kiseline mogu biti jedno ili dvolančane. Kada se odnosi na probe ili prajmere, koji su izborno označeni, kao što je uočljiva oznaka, kao što je fluorescentna ili radioaktivna oznaka, posmatraju se jednolančani molekuli. Takvi molekuli su obično takve dužine da je njihovo ciljano delovanje statistički jedinstveno ili sa malim brojem kopija (obično manje od 5, generalno manje od 3), za biblioteku proba i prajmera. Generalno proba ili prajmer sadrže najmanje 14, 16 ili 30 susednih nukleotida komplementarne sekvence sa ili identične sa genom od interesa. Probe i prajmeri mogu biti dugi 10, 20, 30, 50, 100 ili više nukleinskih kiselina.

1

[0037] Kako je upotrebljen ovde, peptid se odnosi na polipeptid koji je dugačak od 2 do 40 aminokiselina.

[0038] Kako su upotrebljene ovde, aminokiseline koje se pojavljuju u različitim sekvencama aminokiselina koje su ovde obezbeđene su identifikovane prema njihovim poznatim, troslovnim ili jednoslovnim skraćenicama (Tabela 1). Nukleotidi koji se nalaze u različitim fragmentima nukleinskih kiselina su naznačeni sa standardnim jednoslovnim naznakama koje se standardno koriste u tehnici.

[0039] Kako je upotrebljena ovde, „aminokiselina“ je organsko jedinjenje koje sadrži amino grupu i grupu karboksilne kiseline. Polipeptid sadrži dve ili više aminokiselina. Za svrhe ovde, aminokiseline uključuju dvadeset aminokiselina koje se nalaze u prirodi, aminokiselina koje se ne nalaze u prirodi i analoge aminokiselina (tj., aminokiselina pri čemu α-ugljenik ima bočni lanac).

[0040] Kako je upotrebljen ovde, „aminokiselinaski ostatak“ se odnosi na aminokiselinu formiranu nakon hemijske digestije (hidrolize) polipeptida na svojim peptidnim vezama. Ostaci aminokiselina opisani ovde pretpostavlja se da su u „L“ izomernoj formi. Ostaci u „D“ izomernoj formi, koji su nakođe naznačeni, mogu biti supstituisani bilo kojim ostatkom L-aminokiseline sve dok polipeptid zadržava željeno funkcionalno svojstvo. NH2odnosi se na slobodnu amino grupu prisutnu na amino kraju polipeptida. COOH se odnosi na slobodnu grupu karboksilne kiseline koja se nalazi na karboksilnom kraju polipeptida. U skladu sa standardnom nomenklaturom polipeptida opisanom u J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969), i prihvaćene 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, skraćenice za ostatke aminokiselina su prikazane u Tabeli 1:

Tabela 1 – Tabela korespondencije

[0041] Trebalo bi naglasiti da su sekvence svih ostataka aminokiselina prikazane ovde sa formulama koje imaju orijentaciju sa leva na desno u konvencionalnom pravcu od amino kraja ka karboksilnom kraju. Dodatno, fraza „ostatak aminokiseline“ je široko definisan da uključi aminokiseline nabrojane u Tabeli korespondencije (Tabela 1) i modifikovane i neuobičajene aminokiseline, kao one na koje se poziva u 37 C.F:R: §§ 1.821-1.822. Štaviše, trebalo bi naglasiti da crtica na početku ili na kraju sekvence aminokiselinskog ostatka ukazuje na peptidnu vezu sa sledećom sekvencom jednog ili više aminokiselinskih ostataka, sa grupom na amino kraju kao što je NH2ili sa grupom na karboksilnom kraju kao što je COOH.

[0042] Kako su upotrebljene ovde, „aminokiseline koje se prirodno pojavljuju“ odnosi se na 20 L-aminokiselina koje se pojavljuju u polipeptidima.

[0043] Kako su upotrebljene ovde, „aminokiseline koje se prirodno ne pojavljuju“ odnosi se na organsko jedinjenje koje ima strukturu sličnu sa prirodnom aminokiselinom ali je strukturno modifikovana do oponašanja strukture i reaktivnosti prirodne aminokiseline. Aminokiseline koje se ne pojavljuju u prirodi tako uključuju, na primer, aminokiseline ili analoge aminokiselina drugih od 20 aminokiselina koje se pojavljuju u prirodi i uključuju, ali

1

se ne ograničavaju na, D-izostereomere aminokiselina. Ogledne aminokiseline koje se ne pojavljuju u prirodi su ovde opisane i poznate su stručnjacima u tehnici.

[0044] Kako je upotrebljen ovde, DNK konstrukt je jednolančani ili dvolančani, linearni ili cirkularni DNK molekul koji sadrži kombinovane i suprostavljenje segmente DNK koji se ne nalaze u prirodi. DNK konstrukti su nastali kao rezultat manipulacije ljudi, i uključuje klonove i druge kopije manipulisanih molekula.

[0045] Kako je upotrebljena ovde, „sličnost“ između dva proteina ili nukleinske kiseline se odnosi na srodnost između sekvenci aminokiselina proteina ili nukleotidnih sekvenci nukleinskih kiselina. Sličnost može biti bazirana na stepenu identičnosti i/ili homologiji sekvenci ostataka i ostataka sadržanih u njima. Postupci za opisivanje stepena identičnosti između proteina ili nukleinskih kiselina su dobro poznati stručnjacima u tehnici. Na primer, u jednom postupku procene sličnosti sekvenci, dve aminokiselinske ili nukleotidne sekvence su poravnanje na način da se dobije maksimalni nivo identičnosti između sekvenci. „Identičnost“ se odnosi na to u kojoj meri su aminokiselinske ili nukleotidne sekvence nepromenljive. Poravnanje aminokiselinskih sekvenci, i donekle nukleotidnih sekvenci, takođe može uzeti u obzir konzervativne razlike i/ili česte supstitucije u aminokiselinama (ili mukleotidima). Konzervativne razlike su one koje čuvaju fizičko-hemijske karakteristike uključenih ostataka. Poravnanja mogu biti globalna (poravnanje upoređenih sekvenci celom dužinom sekvenci i uključujući sve ostatke) ili lokalna (poravnanje dela sekvenci koje uključuju samo najsličniji region ili regione).

[0046] „Identičnost“ samo po sebi ima prepoznato značenje u tehnici i može se izračunati korišćenjem objavljenih tehnika. (Videti, na primer: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Iako postoje brojni postupci za merenje identičnosti između dva polinukleotida ili polipeptida, termin „identičnost“ je dobro poznat stručnjacima u tehnici (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).

[0047] Kako je upotrebljeno ovde, homologo (u odnosu na sekvence nukleinske kiseline i/ili aminokiseline) odnosi se na veće od ili jednako 25% homologije sekvence, obično više od ili jednako 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ili 95% homologije sekvence; precizni procenat može biti određen ako je neophodno. Za svrhe ovde termini „homologija“ i

1

„identičnost“ se često naizmenično koriste ukoliko nije drugačije naglašeno. Uopšteno, za određivanje procenta homologije ili identičnosti, sekvence se poravnaju da se dobije najveći red podudarnosti (videti, npr.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Po homologiji sekvence, broj konzerviranih aminokiselina je određen standardnim programima sa algoritmima poravnanja, i može se koristiti sa unapred definisanim kaznama za razmake koje utvrđuje svaki dobavljač. Suštinski molekuli homologih nukleinskih kiselina bi hibridizovali tipično umerenom strogošću ili visokom strogošću duž cele dužine nukleinske kiseline od interesa. Takođe, razmatrani su molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže degenerativne kodone umesto kodona u hibridizujućem molekulu nukleinske kiseline.

[0048] Bilo koja dva molekula koja imaju nukleotidne sekvence ili aminokiselinske sekvence koje su najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% „identična“ ili „homologa“ mogu biti determinisana koristeći poznate kompijuterske algoritme kao što je „FASTA“ program, koristeći na primer, uobičajene parametre kao u Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (drugi programi uključuju GCG programski paket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 275:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Na primer, BLAST funkcija baze podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije može se koristiti za određivanje identičnosti. Ostali komercijalni ili objavljeni dostupni programi uključuju, DNAStar „MegAlign“ program (Madison, WI) and the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) „Gap“ program (Madison WI). Procenat homologije ili identičnosti proteina i/ili molekula nukleinskih kiselina mogu se odrediti, na primer, poređenjem informacija sekvenci koristeći GAP kompijuterski program (npr., Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol.48:443, as revised by Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Ukratko, GAR program definiše sličnost kao broj poravnjanih simbola (tj. nukleotida ili aminokiselina), koji su slični, podeljeno sa ukupnim brojem simbola u kraćoj od dve sekvence. Uobičajeni parametri za GAP program mogu uključiti: (1) unarnu matricu poređenja (sadrži vrednost 1 za identičnost i 0 za ne-identičnost) i ponderisanu

1

matricu poređenja od Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, kako su opisali Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STR UCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) kaznu od 3.0 za svaki razmak i dodatno 0.10 kaznu za svaki simbol u svakom razmaku; i (3) nema kazne za razmake na kraju.

[0049] Stoga, kako je upotrebljen ovde, termin „identičnost“ ili „homologija“ predstavljaju poređenja između testiraog i referentnog polipeptida ili polinukleotida. Kako je upotrebljen ovde, termin najmanje „90% identičan sa“ odnosi se na procenat identičnosti od 90 do 99.99 u odnosu na referentnu sekvencu nukleinske kiseline ili aminokiseline polipeptida. Identičnost na nivou 90% ili više ukazuje na činjenicu da se, pod pretpostavkom svrhe ogleda, porede testirani i referentni polipeptid dužine 100 aminokiselina. Ne više od 10% (tj., 10 od 100) aminokiselina u testiranom polipeptidu se razlikuje od referentnog polipeptida. Slična poređenja se mogu raditi između testiranih i referentnih polinukleotida. Takve razlike mogu biti predstavljene kao tačkaste mutacije nasumično raspoređene celom dužinom polipeptida ili mogu biti grupisane u jednom ili više lokacija različitih dužina do maksimalno dozvoljenih, npr. 10/100 aminokiselinskih razlika (približno 90% identičnosti). Razlike su definisane kao supstitucije, insercije ili delecije nukleinskih kiselina ili aminokiselina. Na nivou homologije ili identičnosti iznad oko 85-90%, rezultati bi trebalo da su nezavisni od programa i seta parametara razmaka; takvi visoki nivoi identičnosti mogu se lako proceniti, često manuelnim poravnanjem bez oslanjanja na softver.

[0050] Kako je upotrebljena ovde, poravnata sekvenca odnosi se na upotrebu homologije (sličnost i/ili identičnost) za poravnanje odgovarajućih pozicija u sekvenci nukleotida ili aminokiselina. Tipično, dve ili više sekvenci koje su 50% ili više identične su poravnate. Set poravnatih sekvenci se odnosi na 2 ili više sekvenci koje su poravnate na odgovarajućim pozicijama i mogu uključiti sekvence za poravnanje dobijene od RNK, kao što su EST i druge cDNK, poravnate sa genomskom DNK sekvencom.

[0051] Kako je upotrebljen ovde, „prajmer“ odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji deluje kao tačka inicijacije sinteze DNK na osnovu šablona pod odgovarajućim uslovima (npr., u prisustvu četiri različite nukleozidne trifosfataze i agensa polimerizacije, kao što je DNK polimeraza, RNK polimeraza ili reverzna transkriptaza) u odgovarajućem puferu i na pogodnoj temperaturi. Cenilo bi se da određeni molekul nukleinskih kiselina služi kao „proba“ i kao „prajmer“. Prajmer, međutim, ima 3’ hidroksilnu grupu za ekstenziju. Prajmer može biti korišćen u različitim postupcima, uključujući na primer, lančanu reakciju polimeraze (PCR), reverznu transkriptazu (RT)-PCR, RNK, PCR, LCR, multipleks PCR,

1

panhadle PCR, capture PCR, expression PCR, 3’ i 5’ RACE, in situ PCR, PCR posredovan ligacijom i drugi protokoli amplifikacije.

[0052] Kako je upotrebljen ovde, alelska varijanta ili alelska varijacija poziva se na bilo koje dve ili više alternativnih formi gena koji se nalaze na istom hromozomskom lokusu. Varijacije alela se prirodno povećavaju mutacijama, što može dovesti do fenotipskog polimorfizma unutar populacije. Genske mutacije mogu bite tihe (nema promena u kodiranju polipeptida) ili mogu kodirati polipeptide koji imaju zamenjenu sekvencu aminokiselina. Termin „alelska varijanta“ takođe se koristi ovde da označi da su proteini kodirani alelskom varijantom gena. Tipično referentna forma gena kodira divlji tip forme i/ili predominantnu formu polipeptida iz populacije ili pojedinačnog referentnog člana vrste. Tipično, alelske varijante koje uključuju varijante između i među vrstama obično imaju najmanje 80%, 90% ili više identičnosti aminokiselina sa divljim tipom i/ili predominantnom formom iz iste vrste; stepen identičnosti zavisi od gena i da li je poređenje između ili unutar vrsta. Generalno, alelske varijante unutar vrste imaju najmanje oko 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti ili više sa divljim tipom i/ili predominantnom formom, uključujući 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sa divljim tipom i/ili predominantnom formom polipeptida. Pozivanje na alelsku varijantu ovde, generalno se odnosi na varijacije u proteinima među članovima iste vrste.

[0053] Kako je upotrebljen ovde, „alel“, koji se ovde naizmenično koristi sa „alelska varijanta“ odnosi se na alternativne forme gena ili njegovih delova. Aleli se nalaze na istom lokusu ili poziciji na homologim hromozomima. Kada subjekt ima dva identična alela gena, subjekt se označava kao homozigotan za taj gen ili alel. Kada subjekt ima dva različita alela gena, subjekt se označava kao heterozigotan za taj gen. Aleli specifičnog gena se mogu razlikovati međusobno u jednom nukleotidu ili nekoliko nukleotida, i mogu uključivati supstitucije, delecije i insercije nukleotida. Alel gena takođe može da formira gen koji sadrži mutaciju.

[0054] Kako su upotrebljene ovde, varijante vrste se odnose na varijante u polipeptidima među različitim vrstama, uključujući različite vrste sisara, kao što su miš i čovek.

[0055] Kako je upotrebljena ovde, varijanta splajsovanja odnosi se na varijantu proizvedenu različitim postupcima primarnog transkripta genomske DNK što rezultuje u više od jednog tipa mRNK.

[0056] Kako je upotrebljena ovde, modifikacija je u odnosu na modifikaciju sekvence aminokiselina polipeptida ili sekvence nukleotida u molekulu nukleinske kiseline i uključuje delecije, insercije, i zamene aminokiselina i nukleotida, po redu. Postupci modifikacije

1

polipeptida su rutinski za stručnjake iz tehnike, kao što je korišćenje rekombinantnih DNK postupaka.

[0057] Kako je upotrebljen ovde, termin promotor se odnosi na deo gena koji sadrži DNK sekvence koje obezbeđuju vezivanje RNK polimeraze i inicijaciju transkripcije. Sekvence promotora se uobičajeno, ali ne uvek, nalaze u 5’ ne-kodirajućem regionu gena.

[0058] Kako je upotrebljen ovde, izolovani ili prečišćeni polipeptid ili protein ili biološki aktivni njegov deo je suštinski slobodan ćelijski materijal ili drugi koji sadrži proteine iz ćelije ili tkiva odakle je protein isporučen, ili je suštinski slobodan iz hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada se hemijski sintetišu. Preparati mogu biti određeni kao suštinski slobodni ako se ne pojavljuju nečistoće koje se lako mogu uočiti što se određuje pomoću standardnih postupaka analiza, kao što je hromatografija tankog sloja (TLC), gel elektroforeza i tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) korišćenih od strane stručnjaka u tehnici da bi se procenila takva čistoća, ili dovoljna čistoća takva da dalje prečišćavanje ne bi primetno promenilo fizička i hemijska svojstva, kao što su enzimske i biološke aktivnosti, supstance. Postupci prečišćavanja jedinjenja da se proizvedu suštinski hemijski čista jedinjenja su poznata stručnjacima u tehnici. Suštinski hemijski čisto jedinjenje, međutim, može biti smeša stereoizomera. U takvim slučajevima, dalje prečišćavanje može povećati specifičnu aktivnost jedinjenja.

[0059] Termin suštinski slobodan ćelijski materijal uključuje pripreme proteina u kojima se protein odvaja od ćelijskih komponenti ćelija iz kojih je izolovan ili rekombinantno proizveden. U jednom primeru izvođenja, termin suštinski slobodan ćelijski materijal uključuje pripreme proteina enzima koji imaju manje od oko 30% (po suvoj težini) neenzimskih proteina (takođe označen ovde kao kontaminirajući protein), generalno manje od oko 20% ne-enzimskih proteina ili 10% ne-enzimskih proteina ili manje od oko 5% neenzimskih proteina. Kada je protein enzim rekombinantno proizveden, on je takođe suštinski slobodan od medijuma kulture, tj., medijum kulture predstavlja manje od oko ili 20%, 10%, ili 5% zapremine preparata proteina enzima.

[0060] Kako je upotrebljen ovde, termin suštinski slobodni hemijski prekurskori ili druge hemikalije uključuju preparate proteina enzima u kojima je protein razdvojen od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezu proteina. Termin uključuje preparate proteina enzima koji imaju manje od oko 30% (po suvoj težini) 20%, 10%, 5% ili manje hemijskih prekursora ili ne-enzimskih hemikalija ili komponenti.

[0061] Kako je upotrebljen ovde, sintetički, sa pozivanjem na, na primer, sintetički molekul nukleinske kiseline ili sintetički gen ili sintetički peptid odnosi se na molekul nukleinske

2

kiseline ili polipeptidni molekul koji se proizvodi rekombinantnim postupkom i/ili postupcima hemijske sinteze.

[0062] Kako je upotrebljen ovde, ekspresioni vektor uključuje vektore sposobne da eksprimiraju DNK koji je operativno povezan sa regulatornim sekvencama, kao što su regioni promotora, koji su sposobni da efektivno eksprimiraju takve DNK fragmente. Takvi dodatni fragmenti mogu uključivati sekvence promotora i terminatora, i izborno mogu uključiti jedno ili više porekla replikacije, jedan ili više selektivnih markera, pojačivač, signal poliadenilacije i slično. Ekspresioni vektori su generalno dobijeni iz plazmida ili virusne DNK, ili mogu sadržati oba elementa. Tako, ekspresioni vektor se odnosi na rekombinantni DNK ili RNK konstrukt, kao što je plazmid, fag, rekombinantni virus ili drugi vektor koji nakon ubacivanja u odgovarajuću ćeliju domaćina, rezultuje ekspresijom klonirane DNK. Odgovarajući ekspresioni vektori su dobro poznati stručnjacima u tehnici i uključuju one koje se mogu replicirati u eukariotskim ćelijama i/ili prokariotskim ćelijama i one koje ostaju epizomalne ili one koje se integrišu u genom ćelije domaćina.

[0063] Kako je upotrebljen ovde, vektor takođe uključuje „vektore virusa“ ili „virusne vektore“. Virusni vektori su projektovani virusi koji se operativno povezuju sa egzogenim genima da bi se transferovali (kao sredstva ili šatlovi) egzogeni geni unutar ćelija.

[0064] Kako je upotrebljen ovde termin procenjivanje je namenjen da uključi kvantitativnu i kvalitativnu determinaciju u smislu dobijanja apsolutne vrednosti za aktivnost proteaze, ili njegovog domena, prisutnog u uzorku, i takođe dobijanja indeksa, odnosa, procenta, vizuelne ili druge vrednosti pokazatelja nivoa aktivnosti. Procenjivanje može biti direktno ili indirektno i hemijska vrsta stvarno otkrivena naravno ne mora biti proizvod proteolize, ali može na primer biti njihov derivat ili neka druga supstanca. Na primer, detekcija proizvoda cepanja komplementarnog proteina, kao što je SDS-PAGE i proteina obojenog sa Coomasie plavom.

[0065] Kako je upotrebljena ovde, kompozicija se odnosi na bilo koju smešu. Može biti rastvor, suspenzija, tečnost, prah, pasta, vodena, ne-vodena ili bilo koja njihova kombinacija. Kako je upotrebljen ovde, kit je upakovana kombinacija koja izborno uključuje druge elemente, kao što su dodatni reagensi i instrukcije za upotrebu kombinacije ili njegovih elemenata.

[0066] Kako je upotrebljena ovde, „bolest ili poremećaj“ odnosi se na patološko stanje u organizmu kao rezultat uzroka ili stanja koji uključuju, ali se ne ograničavaju na, infekcije, stečene uslove, genetičke uslove, i karakterišu se prepoznatljivim simptomima.

[0067] Kako je upotrebljeno ovde „lečenje“ subjekta sa bolešću ili stanjem odnosi se na to da su simptomi subjekta delimično ili u potpunosti ublaženi, ili ostaju statični nakon lečenja.

Stoga lečenje obuhvata profilaksu, terapiju i/ili izlečenje. Profilaksa se odnosi na prevenciju potencijalne bolesti i/ili prevenciju pogoršanja simptoma ili progresiju bolesti. Lečenje takođe obuhvata bilo koju farmaceutsku upotrebu modifikovanog interferona i kompozicija obezbeđenih ovde.

[0068] Kako je upotrebljen ovde, farmaceutski efektivni agens, uključuje bilo koji terapeutski agens ili bioaktivni agens, uključujući, ali ne ograničavajući se na, na primer, anestetike, vazokonstriktore, sredstva za dispergovanje, konvencionalne terapeutske lekove, uključujući lekove malih molekula i terapeutskih proteina.

[0069] Kako je upotrebljeno ovde, lečenje se odnosi na bilo koji način kada se simptomi stanja, poremećaja ili bolesti ili drugih indikacija, ublaže ili na drugi način blagotvorno izmene.

[0070] Kako je upotrebljen ovde, pacijent se odnosi na humani subjekt.

[0071] Kako je upotrebljena ovde, efektivna količina je kvantitet terapeutskog sredstva neophodnog za prevenciju, izlečenje, ublažavanje, zaustavljanje ili delimično zaustavljanje simptoma bolesti ili poremećaja.

[0072] Kako je upotrebljena ovde, životinja uključuje bilo koju životinju, kao što su, ali ne ograničavajući se na primate uključujući ljude, gorile i majmune; glodare, kao što su miševi i pacovi; živina, kao što su kokoške; preživari, kao što su koze, krave, jeleni, ovce; ovčji, kao što su svinje i druge životinje. Ne-humane životinje isključuju ljude kao životinje za posmatranje. Mnogi enzimi su poreklom od životinja, uključujući poreklo od sisara.

[0073] Kako je upotrebljena ovde, kontrola se odnosi na uzorak koji je suštinski identičan sa testiranim uzorkom, osim što on nije tretiran sa testiranim parametrom, ili ako je to uzorak plazme, onda je iz normalnog volontera koji nema stanje od interesa. Kontrola takođe može biti interna kontrola.

[0074] Kako su upotrebljeni ovde, oblici u jednini „a“, „an“ i „the“ uključuju množinu referenata osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pozivanje na jedinjenje, koje sadrži „vanćelijski domen“ uključuje jedinjenja sa jednim ili mnoštvo vanćelijskih domena.

[0075] Kako su upotrebljeni ovde, opsezi i količine mogu biti izražene kao „oko“ određene vrednosti ili opsega. Oko takođe uključuje tačnu količinu. Stoga „oko 5 mM“ označava „oko 5 mM“ i takođe „5 mM“.

[0076] Kako su upotrebljene ovde, skraćenice bilo koje protektivne grupe, aminokiselina i drugih jedinjenja, su, ukoliko nije drugačije naznačeno, u skladu sa uobičajenom upotrebom, prepoznatljivim skraćenicama, ili IUPAC-IUB Komisijom za biohemijsku nomenklaturu (videti, (1972) Biochem., 11:1726).

B. PREGLED

[0077] Ovde su obezbeđeni postupci za proizvodnju rastvorljivog rHuPH20 velikog obima. Postupci primene bioreaktora na ćelijske kulture da se proizvede rastvorljivi rHuPH20, konkretno CHO ćelije (npr. DG44 CHO ćelije). Ogledne takve ćelije su 2B2 ćelije, koje proizvode rastvorljivi rHuPH20. Zapremina ćelijske kulture u bioreaktoru obično je ili je oko 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 ili 3500 litara. Pre inokulacije bioreaktora, ćelije su proširene serijom povećavanja zapremina ćelijskih kultura da bi se generisao potreban broj ćelija za zasejavanje bioreaktora. Ćelijske kulture u bioreaktoru su inokulirane sa 10<10>–10<11>na 100 litara ćelijske kulture.

[0078] Ćelije su onda inkubirane u bioreaktoru 7, 8, 9.10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili više dana.

[0079] Tokom inkubacije, hranljivi medijum je dodat ćelijskoj kulturi da bi se snabdela dodatnim nutrijentima i suplementima. Ogledni suplementi ili nutrijenti koji mogu biti uključeni u hranljivi medijum uključuju, ali se ne ograničavaju na, glukozu, glutamin ili supstituisan glutamin, kao što je L-alanil-L-glutamin, insulin i natrijum butirat. Tip i količina dodatih suplemenata može uticati na rast ćelija i proizvodnju proteina, Na primer, insulin i supstituisan glutamin su inkorporirani unutar prvog hranljivog medijuma i dodati ćelijskoj kulturi da bi se povećao ćelijski rast i pik gustine ćelija. Sledeći hranljivi medijumi su dizajnirani tako da pospešuju proizvodnju proteina više nego ćelijski rast. Suplementi kao što je insulin su isključeni i suplementi kao što je supstituisani glutamin, kao što je L-alanil-L-glutamin su količinski redukovani. Nasuprot tome, suplementi kao što je ekstrakt kvasca koji pojačava sintezu proteina su količinski povećani. Dodatno, natrijum butirat koji pojačava zaustavljanje ćelijskog ciklusa i, stoga, povećava proizvodnju proteina, je takođe uključen.

[0080] Nakon proizvodnje proteina u bioreaktoru, ćelije su sakupljene i rastvorljivi rHuPH20 koji je izlučen u medijum ćelijske kulture je koncentrovan pre inicijacije postupka prečišćavanja. Rastvorljivi rHuPH20 je onda prečišćen iz koncentrovanog rastvora proteina koristeći serije koraka prečišćavanja. Ogledni postupci prečišćavanja koji su korišćeni za postupke ovde je kombinacija jonsko-izmenjivačke hromatografije, hromatografije hidrofobnih interakcija i afinitetne hromatografije. Prečišćeni protein je onda koncentrovan i dijafiltriran.

2

[0081] Upotrebljavajući postupke opisane ovde, između oko 0.5-50 grama rastvorljivog rHuPH20 je proizvedeno na 100 L ćelijske kulture. U nekim primerima, količina rastvorljivog rHuPH20 proizvedenog na 100 L kulture je ili je oko 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, ili 40 grama ili više. U nekim primerima, prinos rastvorljivog rHuPH20 nakon prečišćavanja može biti u opsegu od između ili između oko 10% do 50% količine proizvedene pre prečišćavanja. Na primer, prinos nakon prečišćavanja može biti ili je oko 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ili 50% količine proizvedene pre prečišćavanja. Generalno, specifična aktivnost rastvorljivog rHuPH20 proizvedenog koristeći postupke ovde je najmanje ili oko 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 ili 180000 jedinica/mg.

C. HIJALURONIDAZE

[0082] Hijaluronidaze su familija enzima koje razlažu hijaluronsku kiselinu (takođe poznate kao hijaluronan ili hijaluronat), esencijalna komponenta vanćelijskog matriksa i glavna komponenta intersticijalne barijere. Katalizovanjem hidrolize hijaluronske kiseline, hijaluronidaze snižavaju viskozitet hijaluronske kiseline, time povećavaju permeabilnost tkiva. Kao takve, hijaluronidaze se koriste, na primer, kao sredstvo za širenje ili raspršivanje zajedno sa drugim agensima, lekovima i proteinima da pojačaju njihovo raspršivanje i isporuku.

1. Struktura i funkcija hijaluronidaza

[0083] Postoje tri glavne klase hijaluronidaza; hijaluronidaze sisara, bakterijske hijaluronidaze i hijaluronidaze od pijavica, drugih parazita i rakova. Tip hijaluronidaza kod sisara (EC 3.2.1.35) su endo-ß-N-acetil-heksosaminidaze koje hidrolizuju ß1 → 4 glikozidne veze hijaluronske kiseline u različite dužine oligosaharida kao što su tetrasaharidi i heksasaharidi. Oni imaju i hidrolitičke i transglikozidne aktivnosti i mogu razgraditi hijaluronsku kiselinu i hondroitin sulfate, kao što su C4-S i C6-S. Hijaluronidaze ovog tipa uključuju, ali se ne ograničavaju na, hijaluronidaze iz krava (SEQ ID NO:10), obične ose (SEQ ID NOS:11 i 12), pčele (SEQ ID NO:13), belolikog stršljena (SEQ ID NO:14), papirne ose (SEQ ID NO:15), miša (SEQ ID NOS:16-18, 29), svinje (SEQ ID NOS:19-20), pacova (SEQ ID NOS: 21-23, 228), zeca (SEQ ID NO:24), ovce (SEQ ID NO:25), orangutana (SEQ ID NO:26), makaki rakojeda (SEQ ID NO:27), morskog praseta (SEQ ID NO:30) i humanih hijaluronidaza.

[0084] Postoji šest hijaluronidazama-sličnih gena u humanom genomu: HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 i PH20/SPAM1. HYALP1 je pseudogen, i HYAL3 (SEQ ID NO:36) nije pokazao da poseduje enzimsku aktivnost prema bilo kom poznatom supstratu. HYAL4 (prekursor polipeptida prikazan u SEQ ID NO:37) je hondroitinaza i pokazuje malu aktivnost prema hijaluronskoj kiselini. HYAL1 (prekursor polipeptida prikazan u SEQ ID NO:34) je prototipski kiselinsko-aktivni enzim i PH20 (prekursor polipeptida prikazan u SEQ ID NO:1) je prototipski neutralno-aktivan enzim. Kiselinsko-aktivnim hijaluronidazama, kao što su HYAL1 i HYAL2 (prekursor polipeptida prikazan u SEQ ID NO:35) generalno nedostaje katalitička aktivnost na neutralnom pH (tj. pH 7). Na primer, HYAL1 ima malu katalitičku aktivnost in vitro preko pH 4.5 (Frost et al. (1997) Anal Biochemistry 251:263-269). HYAL2 je kiselinsko-aktivan enzim sa veoma niskom specifičnom aktivnosti in vitro. Hijaluronidazama-slični enzimi takođe mogu biti okarakterisani oni koji su generalno zaključani za plazma membranu preko usidrenog glikozilfosfatidil inozitola kao što je humani HYAL2 i humani PH20 (Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA.

100(8):4580-5), i oni koji su generalno rastvorljivi kao što je humani HYAL1 (Frost et al, (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5). Katalizovanjem hidrolize hijaluronske kiseline, glavna komponenta intersticijalne barijere, hijaluronidaza snižava viskozitet hijaluronske kiseline, time povećava permeabilnost tkiva. Takođe je pokazano da pokazuju aktivnosti protiv kancera i anti-kancerogene aktivnosti.

[0085] N-vezana glikozilacija nekih hijaluronidaza može biti veoma važna za njihovu katalitičku aktivnost i stabilnost. Dok promena tipa glikana koja modifikuje glikoprotein može imati dramatične efekte na proteinsku antigenost, strukturno preklapanje, rastvorljivost i stabilnost, smatra se da mnogi enzimi ne zahtevaju glikozilaciju za optimalnu enzimsku aktivnost. Hijaluronidaze su, stoga, jedinstvene u tom pogledu, po tome što uklanjanje N-vezane glikozilacije može dovesti do skoro potpune inaktivacije aktivnosti hijaluronidaze. Za takve hijaluronidaze, prisustvo N-vezanog glikana je kritično za generisanje aktivnosti enzima.

[0086] Postoji sedam potencijalnih mesta za N-vezivanje glikozilacije na N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 humanog PH20 oglednim primerom u SEQ ID NO: 1. Disulfidne veze se formiraju između ostataka cisteina C60 i C351 i između C224 i C238 da bi se formiralo jezgro domena hijaluronidaze. Međutim, dodatni cisteini su neophodni na karboksi kraju za neutralnu katalitičku aktivnost enzima tako da aminokiseline 36 do 464 SEQ ID NO:1 sadrže minimalno aktivni domen humane PH20 hijaluronidaze. Tako, N-vezana glikozilacija mesta N490 nije neophodna za odgovarajuću aktivnost hijaluronidaze.

2

[0087] N-vezana glikozilacija oligosaharida spada u nekoliko glavnih tipova (oligomanoza, kompleks, hibrid, sulfatisan), svih koji imaju (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-jezgro prikačeno preko amidnog azota ostataka Asn koji se nalazi unutar-Asn-Xaa-Thr/Ser-sekvenci (pri čemu Xaa nije Pro). Glikozilacija na Asn-Xaa-Cys mestu je prijavljena za koagulacioni protein C. U nekim slučajevima, hijaluronidaze mogu sadržati i N-glikozidna i O-glikozidna povezivanja. Na primer, rHuPH20 (proizveden u postupcima koji su ovde opisani) ima O-povezane oligosaharide kao i N-povezane oligosaharide.

[0088] Postupci opisani ovde obezbeđuju postupak za proizvodnju i prečišćavanje velike količine rastvorljivih preparata humanih PH20 preparata hijaluronidaza.

2. PH20

[0089] Humani PH20 (takođe poznat kao površinski protein sperme PH20), kako je prethodno naglašeno, je prototipski neutralno-aktivni enzim koji je generalno zaključan za plazma membranu preko usidrenog glikozilfosfatidil inozitola (GPI). Prirodno je uključen u adheziju sperme-jajne ćelije i pomaže penetraciju sperme u sloj kumulusnih ćelija digestijom hijaluronske kiseline. mRNK transkript PH20 je normalno translatiran da bi se generisala 509 aminokiselina proteina prekursora koji sadrži signalnu sekvencu od 35 aminokiselina na N-kraju (pozicije ostataka aminokiselina 1-35). Zreli PH20 polipeptid je, stoga, polipeptid sa 474 aminokiseline sa aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID NO:2.

[0090] Rastvorljiv oblik humanog PH20 (sHuPH20) može se proizvesti i prečistiti korišćenjem postupaka koji su ovde opisani. Stvaranje sHuPH20 je opisano u srodnoj SAD patentnoj prijavi br. 10/795,095, 11/065,716 i 11/238,171 (takođe se označavaju u ovim prijavama kao sHASEGP ili rHuPH20), i u Primerima 1 i 4, u nastavku teksta. Rastvorljivi oblici se proizvode ekspresijom nukleinskih kiselina koje kodiraju skraćenja C-kraja zrelih PH20 polipeptida kojima nedostaju mesta za prikačinjanje GPI.

[0091] Rastvorljivi oblik humanog PH20, rHuPH20 se proizvodi i prečišćava korišćenjem postupaka koji su ovde obezbeđeni.

3. Terapeutska upotreba hijaluronidaza

[0092] Različiti oblici hijaluronidaza se pripremaju i odobravaju za terapeutsku upotrebu kod ljudi. Na primer, preparati hijaluronidaze koji su životinjskog porekla uključuju Vitrase<®>(ISTA Pharmaceuticals), prečišćena hijaluronidaza testisa ovaca, i Amphadase<®>(Amphastar

2

Pharmaceuticals), hijaluronidaza goveđih testisa. Hylenex<®>(Halozyme Therapeutics) je humana rekombinantna hijaluronidaza nastala genetički projektovanim u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira rastvorljivi rHuPH20. Odobrena terapeutska upotreba hijaluronidaza uključuje upotrebu kao adjuvansa da bi se povećala absorpcija i disperzija drugih ubrizganih lekova, za hipodermoklizu (potkožna tečna primena), i kao adjuvans u potkožnoj urografiji za poboljšanje resorpcije radiopropusnih sredstava. Pored ovih indikacija, hijaluronidaze, uključujući sHuPH20, mogu se koristiti kao terapeutsko ili kozmetičko sredstvo za lečenje dodatnih bolesti i stanja.

[0093] Kao što je prethodno naglašeno, hijaluronidaza je supstanca koja se širi ili difunduje koja modifikuje permeabilnost povezanih tkiva kroz hidrolizu hijaluronske kiseline, polisaharid pronađen u međućelijskoj osnovnoj supstanci povezanih tkiva, i određena specijalizovana tkiva, kao što su pupčana vrpca i staklasto telo. Kada nije prisutan faktor širenja, materijal se ubrizgava potkožno, kao što su lekovi, proteini ili nukleinske kiseline, koje se šire veoma sporo. Ko-ubrizgavanje sa hijaluronidazom, međutim, može uzrokovati brzo širenje. Stopa difuzije je proporcionalna količini enzima, obim difuzije je proporcionalan zapremini rastvora. Apsorpcija i disperzija ubrizganih lekova i agenasa može biti pojačana dodavanjem 10-1000 jedinica hijaluronidaze u rastvor za ubrizgavanje. U nekim primerima, 150 U hijaluronidaze je dodato. Hijaluronidaze imaju višestruke upotrebe uključujući i dodatno njihovu upotrebu kao agensa za širenje. Hijaluronidaza se obično koristi, na primer, za peribulbalni blok u lokalnoj anesteziji pre oftalmološke operacije. Prisustvo enzima sprečava potrebu za dodatnim blokovima i ubrzava vreme do pojave akinezije (gubitak pomeranja oka). Peribulbalni i sub-Tenon-ov blok su najčešće primene hijaluronidaze za oftalmološke postupke. Hijaluronidaze takođe mogu da pospeše akineziju u kozmetičkim operacijama, kao što su blefaroplastike i lifting lica. Ogledne terapeutske i kozmetičke upotrebe hijaluronidaza su opisane u nastavku teksta.

a. Upotreba kao sredstva za raspršivanje

[0094] Rastvorljivi rHuPH20 proizveden korišćenjem postupaka koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni da se pospeši ili pojača isporuka agenasa i molekula u bilo koju varijantu tkiva sisara in vivo. Može biti korišćeno da olakša difuziju i, stoga, promoviše isporuku, malih molekula farmaceutskih agenasa kao i velikih molekula farmaceutskih agenasa, kao što su proteini, nukleinske kiseline i ribonukleinske kiseline, i makromolekularne kompozicije koje mogu da sadrže kombinaciju komponenti uključujući, ali se ne ograničavajući na, nukleinske

2

kiseline, proteine, ugljene hidrate, lipide, molekule bazirane na lipidima i lekove. Na primer, molekuli i makromolekularni kompleksi u opsegu od oko 10 nm do oko 500 nm u dijametru, mogu pokazati dramatična poboljšanja u isporuci kroz intersticijalne prostore kada je intersticijalni prostor bio prethodno, ili je slučajno, izložen hijaluronidazi (videti npr. SAD Patentne Prijave br.10/795,095, 11/065,716 i 11/238,171).

[0095] Primeri farmaceutskih, terapeutskih i kozmetičkih agenasa i molekula koji mogu biti primenjeni sa rHuPH20 uključuju, ali se ne ograničavaju na, anestetike; anti-metabolite; antineoplastike i druge agense protiv kancera; anti-viralna; anti-infektivna; uključujući antibakterijske i druge antibiotike, anti-fungalne i druge anti-infektivne; imunomodulatorne agente; steroidne i ne-steroidne anti-inflamatorne; beta blokatore; simpatomimetike; dukozanoide, prostaglandine i analoge prostglandina; miotike, holinergike i antiholinasteraze; anti-alergetike i dekongestive; hormonske agente; faktore rasta; imunosupresive; vakcine i toksoide; imuni serumi; antibiotike; i bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom primeru, rastvorljivi rHuPH20 se primenjuje sa katepsinom, kao što je katepsin L.

b. Upotreba u hipodermoklizi

[0096] Hipodermokliza, infuzija tečnosti i elektrolita unutar hipodermisa kože, je korisna i prosta tehnika hifratacije pogodna za blagu do umerenu dehidrataciju odraslih pacijenata, pogotovu starijih. Iako se smatra bezbednom i efektivnom, najučestaliji negativni efekat je blaži potkožni edem koji se može lečiti lokalnom masažom ili sistemskim diureticima. Otprilike 3 L se može davati na period od 24 časa na dva odvojena mesta. Uobičajena mesta infuzije uključuju grudi, abdomen, butine i nadlaktice. Rastvori uključeni u hipodermoklizu uključuju, na primer, normalni slani rastvor, polu-normalni slani rastvor, glukozu sa slanim rastvorom i 5% glukoze. Kalijum hlorid se takođe može dodati u rastvor. Dodavanje hijaluronidaze u rastvor može pojačati apsorpciju tečnosti i povećati ukupnu stopu primene.

c. Upotreba u vitrektomiji i oftalmološkim poremećajima i stanjima

[0097] Hijaluronidaze se mogu koristiti da minimalizuju odvajanje ili kidanje retine tokom vitrektomije. Ovo može uzrokovati, na primer, da staklasto telo počinje da se razdvaja ili „odvaja“ od mrežnjače, pre uklanjanja staklastog tela. Takvo odvajanje ili razdvajanje

2

staklastog tela može da minimalizuje verovatnoću da će se dalja kidanja ili odvajanja mrežnjače dešavati jer je staklasto telo uklonjeno.

[0098] Hijaluronidaze se mogu koristi za različite oftalmološke primene, uključujući vitrektomiju dopunjena prijava opisana u SAD Pat. br.5,292,509. Upotreba visoko prečišćene hijaluronidaze, kao što je rastvorljiva rHuPH20 proizvedene i prečišćene postupcima koji su ovde opisani, je poželjna za intraokularne postupke da bi se minimalizovala imunogenost i toksičnost. U nekim primerima, pegilirana hijaluronidaza se može koristiti da se produži boravak u staklastom telu i spreči lokalizovano uzimanje.

[0099] Hijaluronifaze se mogu koristiti za lečenje i/ili sprečavanje oftalmoloških poremećaja sa, na primer, sprečavanjem neovaskularizacije i povećavanjem stope klirensa materijala toksičnog za mrežnjaču iz staklastog tela. Hijaluronidaze se mogu primenjivati u efektivnoj količini da bi rastopile staklasto telo oka bez izazivanja toksičnih oštećenja oka. Rastapanje staklastog tela povećava stopu razmene tečnosti iz staklaste komore. Ovo povećanje u razmeni uklanja kontaminirani materijal čije prisustvo može uzrokovati oftalmološko oštećenje i oštećenje mrežnjače.

[0100] Hijaluronidaze se takođe mogu koristiti da smanje postoperativni pritisak. Hijaluronska kiselina se može koristiti u očima primarno kao odstojnik u hirurškim procedurama katarakte i intraokularnog sočiva. Takođe se može koristiti u drugim hirurškim postupcima očiju kao što je glaukom, operacija staklastog tela i mrežnjače i transplantacija rožnjače. Uobičajeni neželjeni efekat koji se pojavljuje nakon operacije pacijenata sa kataraktom je značajno rano, i povremeno produženo, povećanje intraokularnog pritiska. Takvo stanje je ponekada ozbiljno. Pogotovu kod pacijenata sa glaumatoznom promenom optičkog diska. Hijaluronidaze mogu biti primenjene zajedno sa hijaluronskom kiselinom na očima pre operacije da bi se smanjio post operativni pritisak u očima. Hijaluronidaza se primenjuje u efektivnoj količini da bi smanjila intraokularni pritisak na nivoe pre operacije razlaganjem hijaluronske kiseline bez smanjivanja efikasnosti tokom operacije i uzrokovanja neželjenih efekata kod pacijenta (SAD Prijava br.6,745,776).

[0101] Hijaluronidaze se takođe mogu primeniti kod pacijenata sa glaukomima bi se uklonili glikozaminoglikani iz trabekularne mreže i smanjio intraokularni pritisak, i može se primeniti na staklasto telo da bi se pospešilo rešavanje krvarenje u staklastom telu (tj. ekstravazacija krvi unutar staklastog tela), koje se mogu pojaviti u vezi sa stanjima kao što je dijabetička retinopatija, neovaskularizacija mrežnjače, okluzija vene mrežnjače, posteriorno odvajanje staklastog tela, kidanje mrežnjače, traume oka i slično. Prisustvo krvarenja u staklastom telu, koje se obično sporo rešava, može da odloži, zakomplikuje ili spreči postupke koji zahtevaju

2

da mrežnjača bude vizualizovana kroz staklasto telo za dijagnostiku i/ili postupke lečenja kao što je laserska fotokoagulacija i slično koje su često primarni tretmani za stanja kao što je proliferativna dijabetička retinopatija.

d. Upotreba u genetičkoj terapiji

[0102] Efikasnost mnogih gena isporučenih sredstava in vivo ne odgovaraju efikasnosti koja je pokazana in vitro. Glikozaminoglikani mogu ometati transfer i difuziju DNK i virusnih vektora unutar mnogih tipova ćelija. Nivoi takvih vanćelijskih materijala matriksa mogu ometati postupak značajno. Primenom hijaluronidaze mogu se otvoriti kanali u vanćelijskom matriksu, tako pojačavajući isporuku genetičke terapije. Na primer, hijaluronidaze se mogu primenjivati sa kolagenazama sa bi se olakšala transdukcija DNK in vivo (Dubensky et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81(23):7529-33). Hijaluronidaze takože mogu pojačati genetičku terapiju upotrebom adeno-povezanih virusa (Favre et al, (2000) Gene Therapy 7(16):1417-20). Otvoreni kanali nakon primene hijaluronidaze su veličine koja obično pojačava difuziju malih molekula kao što su retrovirusi, adenovirusi, adeno-povezani virusi i DNK kompleksi (kao i drugi terapeutski i farmaceutski agensi od interesa). Pore nisu tako velike, međutim, da bi podstakle dislokaciju i pomeranje ćelija.

[0103] U nekim primerima, virusi mogu biti projektovani da eksprimiraju hijaluronidaze da bi se olakšala njihova replikacija i širenje unutar ciljanog tkiva. Ciljano tkivo može biti, na primer, kancerogeno tkivo pri čemu je virus sposoban za selektivnu replikaciju unutar tumora. Virus takođe može biti ne-litički virus pri čemu se virus selektivno replikuje pod promotorom specifičnog tkiva. Kako se virusi umnožavaju, ko-ekspresija hijaluronidaze sa genima virusa može olakšati širenje virusa in vivo.

e. Upotreba u kozmetici

[0104] Hijaluronidaze mogu biti primenjene da bi se uklonili glikozaminoglikani uključeni u akumulaciju celulita i da bi se promovisao limfni tok. U nekim primerima, humane hijaluronidaze, kao što je na primer, rastvorljivi rHuPH20, se koristi za lečenje celulita. Hijaluronidaze se mogu primeniti kroz ponovljena potkožna ubrizgavanja, kroz transdermalnu isporuku u obliku masti ili krema ili upotrebom formulacija koje se ubrizgavanjem slabo oslobađaju da bi promovisali kontinuiranu degradaciju glikozaminoglikana i sprečili njegovo vraćanje.

[0105] Hijaluronidaze takođe mogu da se primene za lečenje stanja kao što je „pigskin“ edem ili „orange peel“ edem. Hijaluronidaze mogu uticati na depolimerizaciju dugačkih mukopolisaharidnih lanaca koji mogu da se akumuliraju u dermisu i koji su odgovorni za zadržavanje vezane vode i za usporavalje, kapilarnom kompresijom, difuzije organskih tečnosti, kojima se eliminiše metabolički otpad. Takva retepcija vode i otpada povezana sa debljinom preopterećivanjem lipocita, predstavlja klasičan „pigskin“ edem ili „orange peel“ edem. Depolimerizacijom se mogu iseći dugi lanci mukopolisaharida na kraće lance, rezultujući u eliminaciji vezane vode i otpada i obnovom venske i limfne cirkulacije, kulminirajući nestankom lokalnog edema.

f. Upotreba u transplantaciji organa

[0106] Sadržaj hijaluronske kiseline u organima se može povećati sa inflamacijom. Povećana koncentracija hijaluronske kiseline može se uočiti u tkivima iz različitih organa karakterističnih po inflamatorno-imunološkoj povredi kao što je alveolitis (Nettelbladt et al. (1991) Am. Rev. Resp. Dis. 139: 759-762) i infarkt miokarda (Waldenstrom et al. (1991) J. Clin. Invest. 88(5): 1622-1628). Drugi primeri uključuju odbacivanje alografta posle translantacije bubrega (Ha’llgren et al. (1990) J. Exp. Med. 171: 2063-2076; Wells et al. (1990) Transplantation 50: 240-243), tankog creva (Wallander et al. (1993) Transplant. Int.6: 133-137) ili srca (Haellgren et al. (1990) J Clin Invest 185:668-673); ili inflamaciju miokarda virusnog porekla (Waldenstrdm et al. (1993) Eur. J. Clin. Invest. 23: 277-282). Pojavljivanje interstinalnih edema zajedno sa graftovanim organom predstavlja ozbiljan problem na polju operacija translantacije. Graftovi sa intersticijalnim edemima mogu nabubriti do takvog stepena da im se privremeno gubi funkcija. U nekim slučajevima, bubrenje može uzrokovati remećenje bubrega, rezultujući u masivnom krvarenju. Hijaluronidaze se mogu koristiti da razgrade akumulirane glikozaminoglikane u trasplantiranom organu. Uklanjanje takvih glikozaminoglikana pospešuje uklanjanje vode iz grafta i tako pojačava funkciju organa.

g. Upotreba u lečenju kancera

[0107] Hijaluronidaze imaju direktne antikancerogene efekte. Hijaluronidaze sprečavaju rast tumora transplantiranih u miševe (De Maeyer et al., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660) i inhibira formiranje tumora nakon izlaganja kancerogenima (Pawlowski et al. (1979) Int. J. Cancer 23:105-109). Hijaluronidaza je efikasna kao jedini terapeutski agens u lečenju kancera

1

mozga (glioma) (WO198802261). Pored ovih efekata, hijaluronidaze takođe mogu biti korišćene da pojačaju penetraciju hemoterapeutskih agenasa u čvrste tumore. Oni mogu biti ubrizgani intratumoralno sa anti-kancerogenom agensima ili intravenozno za rasprostranjene kancere ili teško dostupne tumore. Antikancerogeni agens može biti hemoterapeutik, antitelo, peptid, ili vektor genetičke terapije, virus ili DNK. Dodatno, hijaluronidaze se mogu koristiti da bi se regrutovale tumorske ćelije u cikličnom pulu za senzibilizaciju kod prethodno hemorefraktornih tumora koji su stekli višestruku rezistenciju na lekove (St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44). Hijaluronidaze, kao što je, na primer rastvorljiva rHuPH20, takođe može da pojača biološku isporuku kao što su monoklonska antitela, citokini i ostali lekovi kod tumora gde se akumuliraju glikozaminoglikani.

[0108] Hijaluronidaze takođe mogu biti korišćene za povećavanje osetljivosti tumora koji su rezistentni na konvencionalnu hemoterapiju. Na primer, hijaluronidaza, kao što je rastvorljivi rHuPH20, može se primeniti kod pacijenata koji imaju tumor povezan sa HYAL1 defektom u efektivnoj količini da bi se povećala difuzija oko mesta tumora (npr., da bi se olakšala cirkulacija i/ili koncentracije hemoterapeutskih agenasa u i oko mesta tumora), inhibirala pokretljivost tumorskih ćelija, kao što je degradacijom hijaluronske kiseline, i/ili da bi se snizio prag apoptoze tumorskih ćelija. Ovo može dovesti tumorsku ćeliju (ćelije) do stanja anoikis, što tumorske ćelije čini podložnijim delovanju hemoterapeutskih agenasa. Primena hijaluronidaza može indukovati odgovor prethodno rezistentnih na hemoterapiju tumora pankreasa, stomaka, debelog creva, jajnika i grudi (Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1 :55-58; Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390).

[0109] U jednom primeru, hijaluronidaze se koriste u lečenju metastaziranih i nemetastaziranih kancera, uključujući one koji smanjuju endogenu aktivnost hijaluronidaze u odnosu na ne-kancerogene ćelije. Hijaluronidaze se mogu koristiti kao hemoterapeutski agens samostalno ili u kombinaciji sa drugim hemoterapeuticima. Ogledni kanceri uključuju, ali se ne ograničavaju na, karcinom malih ćelija pluća, skvamozni karcinom ćelija pluća i kancere grudi, jajnika, glave i vrata, ili bilo koji kancer povezan sa smanjenim nivoima aktivnosti hijaluronidaze ili smanjenim metabolizmom hijaluronske kiseline.

h. Upotreba u lečenju akumulacije glikozaminoglikana u mozgu

[0110] Nivoi hujaluronske kiseline se povećavaju u brojnim cerebrospinalnim patološkim stanjima. Nivoi cerebrospinalne hijaluronske kiseline su normalno manji od 200 µg/L kod odraslih (Laurent et al. (1996) Acta Neurol Scand September 94(3):194-206), ali mogu se

2

podići do nivoa preko 8000 µg/L kod bolesti kao što su meningitis, spinalna stenoza, povreda glave i cerebralni infarkt. Hijaluronidaze, kao što je, na primer, rastvorljivi rHuPH20, mogu se koristiti da se razgrade kritički visoki nivoi supstrata.

[0111] Odsustvo efikasne limfe u mozgu takođe može dovesti do edema opasnog po život nakon traume glave. Akumulacija hijaluronske kiseline je rezultat povećane sinteze hijaluronske kiseline i smanjene degradacije. Inicijalno akumulacija hijaluronske kiseline može imati korisnu svrhu povećavajući sadržaj vode u oštećenim tkivima da bi se olakšala ekstravazacija leukocita, ali kontinuirana akumulacija može biti letalna. Primena hijaluronidaza, kao što je intratekalno ili intavenozno, na pacijentu koji pati od traume glave može poslužiti da se ukloni akumulirana hijaluronska kiselina i voda koja je povezana sa njom u tkivu.

[0112] Hijaluronidaze se takođe mogu koristiti u lečenju edema povezanog sa tumorima mozga, pogotovu onih povezanih sa multiformnim glioblastomom. Edem povezan sa tumorima mozga rezultat je akumulacije hijaluronske kiseline u ne-kancerogenim delovima mozga pored tumora. Primena hijaluronske kiseline na mestima akumulacija hijaluronske kiseline (npr., intravenoznim ubrizgavanjem ili preko šanta) može ublažiti edem povezan sa takvim malignitetima degradiranjem hijaluronske kiseline na tim mestima.

i. Upotreba u lečenju akumulacije glikozaminoglikana kod kardiovaskularnih bolesti

[0113] Hijaluronidaze se mogu koristiti u lečenju nekih kardiovaskularnih bolesti. Primenom hijaluronidaza na animalnim modelima nakon eksperimentalnog infarkta miokarda može se smanjiti veličina infarkta (Maclean, et al (1976) Science 194(4261): 199-200). Jedan predloženi mehanizam kojim ovo može da se dogodi je smanjivanje akumulacije hijaluronske kiseline koja se dešava nakon reperfuzije ishemije. Veruje se da smanjenje veličine infarkta nastaje usled povećane limfne drenaže i povećane oksidacije tkiva i smanjivanja sadržaja vode miokarda.

[0114] Hijaluronidaze se takođe mogu koristiti da ograniče koronarne plake kod arteroskleroze. Takve plake akumuliraju glikozaminoglikaze i posreduju u adheziji makrofaga i penastih ćelija (Kolodgie et al. (2002) Arterioscler Thromb Vase Biol.22(10): 1642-8).

j. Upotreba kod pulmonalnih bolesti

[0115] Nivoi hijaluronske kiseline u bronhioalveolarnim lavažima (BAL) su kod normalnih jedinki generalno ispod 15 ng/ml. Međutim, nivoi hijaluronske kiseline u BAL dramatično rastu u stanjima respiratornih pogoršanja (Bjermer et al.(1987) Br Med J (Clin Res Ed) 295(6602):803-6). Povećavanje hijaluronske kiseline u plućima može sprečiti difuziju kiseonika i razmenu gasova kao i aktivirati odgovore neutrofila i makrofaga. Prečišćeni preparati rastvorljivog rHuPH20, kao što su oni proizvedeni upotrebom postupaka koji su ovde obezbeđeni, mogu se isporučiti ili pulmonalnom ili intravenoznom isporukom pacijentima koji imaju ovakva stanja da bi se smanjili nivoi hijaluronana. Hijaluronidaze takođe mogu biti primenjene na pacijentima koji pate od drugih pulmonalnih komplikacija koja su povezana sa povećanjem glukozaminoglikana ili sa pojačavanjem isporuke drugih ko isporučenih molekula u plućima.

k. Druge upotrebe

[0116] U daljim primerima njihove terapeutske upotrebe, hijaluronidaze mogu da se koriste u takve svrhe kao antidoti za lokalnu nekrozu od paravenoznog ubrizgavanja nekrotičnih supstanci kao što su vinka alkaloidi (Few et al. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12, 23-26), lečenje ganglijskih cista (Paul et al. (1997) J Hand Surg.22 (2): 219-21) i lečenje nekroze tkiva usled venske insuficijencije (Elder et al. (1980) Lancet 648-649). Hijaluronidaze takođe mogu da se koriste za lečenje ganglijskih cista (takođe poznate kao cista zgloba, Biblijska cista, cista dorzalne tetive), koje su najčešće na mekoj masi tkiva ruke i šupljinama ispunjenim tečnošću koje se mogu osetiti ispod kože.

[0117] Hijaluronidaze mogu da se korist u lečenju oštećenja kičmene moždine razlaganjem hondroitin sulfat proteoglikana (CSPGs). Nakon oštećenja kičmene moždine glijalni ožiljci sadrže CSPGs koji su produkovale astrocite. CSPGs imaju ključnu ulogu u inhibiciji rasta aksona. Dodatno, pokazano je da raste ekspresija CSPG nakon oštećenja centralnog nervnog sistema (CNS). Hijaluronidaze takođe mogu da se koriste za lečenje hernije diska u postupku poznatom kao hemonukleoliza. Hondroitinaza ABC, enzim koji cepa slične supstrate kao hijaluronidaze, može indukovati smanjenje intradiskalnog pritiska u lumbalnom delu kičme. Postoji tri tipa povrede diska. Protrudirani disk je onaj koji je intaktan ali je ispupčen. U ekstrudiranom disku, vlaknasti omotač je pocepan i NP curi, ali je još uvek povezan sa diskom. Kod sekvestriranog diska, fragment NP se odvojio od diska i slobodan je u kičmenom kanalu. Hemonukleoliza je obično efikasna kod povreda protrudiranih i ektrudiranih diskova, ali ne kod sekvestriranog diska.

4

D. Ćelije kojima se eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20

[0118] Postupci opisani ovde mogu se koristiti da se generiše i prečisti velika količina rastvorljivog rHuPH20. Rastvorljivi rHuPH20 se eksprimira u CHO ćelijama koje rastu u masovnim ćelijskim kulturama. Ekspresija je efikasna korišćenjem ekspresionog vektora koji sadrži sekvencu nukleotida koja kodira sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO:3 (koji odgovaraju aminokiselinama 1 do 482 prekursora humanog PH20 polipeptida prikazanog u SEQ ID NO:1).Nakon translacije, signalna sekvenca od 35 aminokiselina se cepa i rastvorljivi rHuPH20 je izlučuje u medijum. Vektor takođe sadrži IRES nizvodno od rastvorljivog rHuPH20 koji kodira region, gen koji kodira dihidrofolat reduktazu kod miševa i SV40 pA sekvencu. Ekspresioni vektor se uvodi u DG44 ćelije, koje su deficitarne sa dihidrofolat reduktazom (dhfr-) koje su adaptirane da rastu u suspenziji kulture u hemijski definisanom, medijumu bez životinjskih produkata. Nastale ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 uključuju one opisane u Primerima 1 i 4, u nastavku teksta, i uključuju označene ćelije 3D35M, 2B2, 3E10B, 1B3, 5C1, 1G11 i 2G10 ćelije.

[0119] Ostale ćelije mogu se koristiti za proizvodnju hijaluronidaza sličnih sa rHuPH20. Generalno, koriste se sistemi ekspresije proteina pogodni za ubacivanje kritičnih ostataka N-povezanih glikozilacijom. Takve ćelije uključuju, na primer, ćelije kvasca, ćelije gljiva, biljne ćelije, ćelije insekata i ćelije sisara. Mnoge ćelijske linije su dostupne za ekspresiju kod sisara uključujući ćelije miševa, pacova, ljudi, majmuna, kokošaka i hrčka. Ogledne ćelijske linije uključuju ali se ne ograničavaju na CHO (uključujući DG44 ćelije i CHO-S ćelije), Balb/3T3, HeLa, MT2, mišje NS0 (bez izlučivanja) i druge ćelijske linije mijeloma, hibridoma i heterohibridoma ćelijske linije limfocita, fibroblasta, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, i HKB ćelije. Ćelijske linije su takođe dostupno adaptirane na medijum bez seruma, koji olakšava prečišćavanje izlučenih proteina iz medijuma ćelijske kulture.

a. 3D35M ćelije

[0120] Ogledne ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 su 3D35M ćelije, opisane u Primeru 1, u nastavku teksta, i SAD Patentnoj prijavi Nos., 20040268425, 20050260186 i 20060104968. 3D35M ćelije su deficitarne sa dihidrofolat reduktazom (dhfr-) DG44 CHO ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20. Ćelije su transformisane sa HZ24 ekspresionim vektorom koji ima nukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:50. Ovaj vektor sadrži CMV promotor koji vodi ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid od 482 aminokiseline (SEQ ID NO:3) koja odgovara pozicijama aminokiselina od 1 do 482 cele dužina humanog PH20 prikazano u SEQ ID NO:1. To uključuje 35 aminokiselina na N kraju signalne sekvence. Vektor takođe sadrži unutrašnje mesto ulaska ribozoma (IRES) posle sekvence koja kodira PH20, zatim gen koji kodira dihidrofolat reduktaze miša i SV40 sekvenca poliadenilacije. Nakon translacije, polipeptida od 482 aminokiseline se obrađuje da bi se uklonile 35 aminokiseline signalne sekvence, rezultujući sekrecijom rastvorljivog rHuPH20.

[0121] Karakterizacija 3D35M ćelija ukazuje da je region nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivi rHuPH20 prisutan u ćelijama u broju kopija otprilike 318 kopija/ćelijama. Rastvorljivi rHuPH20 proizveden od 3D35M ćelija postupcima ovde je smeša vrsta koja može uključiti jednu ili više polipeptida koji imaju sekvence prikazane u SEQ ID NOS:4-8. U oglednoj karakterizaciji ovih vrsta (opisano u Primeru 11), vrsta prikazana u SEQ ID NO:4 je zastupljena 0.2%, vrsta prikazana u SEQ ID NO:5 (odgovara aminokiselinama 1 do 446 SEQ ID NO:4) je zastupljena 18.4%, vrsta prikazana u SEQ ID NO:6 (odgovara aminokiselinama 1 do 445 SEQ ID NO:4) je zastupljena 11.8%, vrsta prikazana u SEQ ID NO:7 (odgovara aminokiselinama 1 do 444 SEQ ID NO:4) je zastupljena 56.1%, i vrsta prikazana u SEQ ID NO:8 (odgovara aminokiselinama 1 do 443 SEQ ID NO:4) je zastupljena 13.6%. Takva heterogenost u rastvorljivom rHuPH20 preparatu je verovatno rezultat cepanja na C kraju peptidazama prisutnim tokom postupaka proizvodnje i prečišćavanja koji su obezbeđeni ovde.

[0122] 3D35M ćelije mogu da rastu u medijumu ćelijske kulture sa ili bez metotreksata. Dodatni suplementi, kao što je glutamin, takođe se može dodati, U nekim primerima, ćelije su rasle u medijumu ćelijske kulture koji sadrži, na primer, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 µM ili 2 µM metotreksata u odsustvu hipoksantina i timidina. U jednom primeru, 3D35M ćelije su kultivisane na 37 °C u 5-7% CO2u medijumu kulture (kao što je CD CHO Medium, Invitrogen) bez hipoksantina i timidina i sa 100 nM metotreksata i glutamina ili supstrata glutamina, kao što je L-Alanil-L-glutamin, stabilizovana, dipeptidna forma L-glutamina. Drugi medijumi ćelijskih kultura odgovarajući za CHO ćelije mogu se koristiti da se kultivišu 3D35M ćelije uključujući, ali se ne ograničavajući na, Dulbecco-ov modifikovani Eagle-ov medijum (DMEM), Eagle-ov minimalni esencijalni medijum (EMEM), Iscove-ov modifikovan Eagle-ov medijum (IMEM), F12 i RPMI. 3D35M ćelije rastu pod takvim uslovima u balonima za trešenje da mogu proizvesti više od 1000 jedinica/mL aktivnosti hijaluronidaze. Kada se kultivišu u bioreaktoru, kako je opisano u Komparativnom Primeru 3, u nastavku teksta, 3D35M ćelije mogu proizvesti rastvorljivi rHuPH20 sa enzimskom aktivnosti preko 2000 jedinica/mL.

b. 2B2 ćelije

[0123] Ogledne ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 za proizvodnju rHuPH20 u postupcima obezbeđenim ovde su opisane u Primeru 4 i označene kao 2B2 ćelije. 2B2 ćelije su generisane adaptiranjem 3D35M ćelija na veće nivoe metotreksata (tj. 20 µM) i selektivnim odabirom klonova koji su rasli na višim koncentracijama metotreksata. Ovo adaptiranje povećava aktivnost hijaluronidaze produkovanih u ćelijama. DG44 ćelije su deficitarne sa dihidrofolat reduktazom (dhfr-) i stoga ne mogu da se prave nukleozidi. Ekspresioni vektor prisutan u 3D35M i 2B2 ćelijama sadrži, pored gena koji kodira PH20, kodirajuću sekvencu mišje dihidrofolat reduktaze. Metotreksat je jak kompetittivni inhibitor dihidrofolat reduktaze. Stoga, povećavanjem koncentracije metotreksata u medijumu kulture, ćelije koje eksprimiraju hijaluronidazu moraju da proizvedu više mišje dihidrofolat reduktaze da bi ostale vijabilne. Na ovo može uticati, na primer, amplifikacija gena ili rearanžmani integrisane DNK da se dobiju stabilniji i produktivnija preuređenja. Tako, nužna proizvodnja mišje dihidrofolat reduktaze takođe može rezultovati povećanje proizvodnje sHuPH20. Poređenje enzimske aktivnosti rastvorljivog rHuPH20 proizvedenog sa 2B2 ćelijama i 3D35M ćelijama pokazuje da je aktivnost tipično između 80% i 100% veća u 2B2 ćelijama (videti npr. Primer 5, u nastavku teksta) u poređenju sa 3D35M ćelijama.

[0124] 2B2 ćelije su odabrane među ćelijskim klonovima izolovanim nakon selekcije sa 20 µM metotreksata, jer su ćelijske linije koje su produkovale rastvorljivi rHuPH20 koji je imao najveću enzimsku aktivnost (videti, npr. Primer 4). Kada je karakterisano, uočeno je da region koji kodira rastvorljivu rHuPH20 postoji u 2B2 ćelijama u broju kopija otprilike 206 kopija/ćeliji. Southern blot analiza genomski skraćene DNK 2B2 ćelija sa Spe I-, Xba I- i BamH I/Hind III korišćene kao specifična proba za region nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivi rHuPH20 otkrila je sledeći skraćeni restrikcioni profil: jednu veliku hibridizujuću traku od ~7.7 kb i četiri manje hibridizujuće trake (~13.9, ~6.6, ~5.7 i ~4.6 kb) sa DNK skraćenim sa Spe I; jedna velika hibridizujuća traka ~5.0 kb i dve manje hibridizujuće trake (~13.9 i ~6.5 kb) sa DNK skraćenom sa Xba I; i jedna pojedinačna hibridizujuća traka ~1.4 kb uočena korišćenjem 2B2 DNK skraćene sa BamH I/Hind III.

[0125] 2B2 ćelije mogu da rastu u medijumu ćelijske kulture sa ili bez metotreksata. Dodatni suplementi, kao što je glutamin, insulin i ekstrakt kvasca takođe se mogu dodati. U nekim primerima, ćelije su rasle u medijumu ćelijske kulture koji sadrži, na primer, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM ili više metotreksata u odsustvu hipoksantina i timidina. U jednom primeru, 2B2 ćelije su kultivisane na 37 °C u 5-7% CO2u medijumu kulture (kao što je CD CHO Medium, Invitrogen) bez hipoksantina i timidina i sa 20 µM metotreksata i glutamina ili L-alanil-L-glutamina, stabilizovana, dipeptidna forma L-glutamina. Drugi medijumi ćelijskih kultura odgovarajući za CHO ćelije mogu se koristiti da se kultivišu 2B2 ćelije uključujući, ali se ne ograničavajući na, Dulbecco-ov modifikovani Eagle-ov medijum (DMEM), Eagle-ov minimalni esencijalni medijum (EMEM), Iscove-ov modifikovan Eagle-ov medijum (IMEM), F12 i RPMI. 2B2 ćelije rastu pod takvim uslovima u balonima za trešenje da mogu proizvesti više od 3000 jedinica/mL aktivnosti hijaluronidaze. Kada se kultivišu u bioreaktoru, kako je opisano u Primeru 8, u nastavku teksta, 2B2 ćelije mogu proizvesti rastvorljivi rHuPH20 sa enzimskom aktivnosti preko 17000 jedinica/mL aktivnosti hijaluronidaze.

[0126] Rastvorljivi rHuPH20 proizveden od 2B2 ćelija postupcima ovde je smeša vrsta polipeptida koji imaju sekvence prikazane u SEQ ID NOS:4-8. U oglednoj karakterizaciji rastvorljivog rHuPH20 produkta proizvedenog 2B2 ćelijama (opisano u Primeru 11), vrsta prikazana u SEQ ID NO:4 je zastupljena 1.9%, vrsta prikazana u SEQ ID NO:5 (odgovara aminokiselinama 1 do 446 SEQ ID NO:4) je zastupljena 46.7%, vrsta prikazana u SEQ ID NO:6 (odgovara aminokiselinama 1 do 445 SEQ ID NO:4) je zastupljena 16.7%, vrsta prikazana u SEQ ID NO:7 (odgovara aminokiselinama 1 do 444 SEQ ID NO:4) je zastupljena 27.8%, i vrsta prikazana u SEQ ID NO:8 (odgovara aminokiselinama 1 do 443 SEQ ID NO:4) je zastupljena 6.9%. Napomenuto je za rastvorljivi rHuPH20 proizveden od 3D35M ćelija, da je heterogenost u rastvorljivom rHuPH20 preparatu iz 2B2 ćelija verovatno rezultat cepanja na C kraju peptidazama prisutnim tokom postupaka proizvodnje i prečišćavanja koji su obezbeđeni ovde.

E. Širenje ćelijske kulture

[0127] Postupci opisani ovde uključuju bioreaktore za rast velike zapremine ćelijske kulture da bi se proizvela velika količina rastvorljivog rHuPH20. Kako je detaljno opisano u nastavku teksta, ovi postupci uključuju fazu ekspanzije ćelije, fazu proizvodnje proteina, fazu koncentracije proteina i razmenu pufera, i fazu prečišćavanja. Ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20, kao što su 2B2 ćelije, se inicijalno šire od originalnog inokuluma, kao što je alikvot ćelija iz radne banke ćelija (WCB) ili master banke ćelija (MCB), do većih zapremina pre kultivisanja u bioreaktoru za fazu proizvodnje, Konačna zapremina kulture u fazi ekspanzije je direktno proporcionalna zapremini bioreaktora koji se koristi u sledećoj fazi proizvodnje. Tipično, veći bioreaktor je inokulisan upotrebom veće zapremine konačne kulture iz faze ekspanzije od manjih bioreaktora.

[0128] Ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 su proširene kroz seriju kultura, u svakoj se povećava zapremina u odnosu na prethodnu, i svaka se koristi kao inokulum za sledeću kulturu. Ogledno takve ćelije su 2B2 ćelije. Originalni inokulum je tipično onaj u kome su određeni čistoća i identičnost ćelija i broj ćelija. Ove ćelije se mogu čuvati zamrznute, kao što je na -20 °C, -70 °C, ili -80 °C, ili mogu biti održavane u tečnim medijumima na, na primer, 4 °C, ili održavani u kulturi na, na primer, 37 °C. U nekim slučajevima, originalni inokulum je alikvot master banke ćelija ili radne banke ćelija koji se čuva zamrznut. U takvim slučajevima, inokulum se odmrzava, kao što je 37 °C u vodenom kupatilu. Originalni inokulum ćelije se tipično centrifugira i ćelije se resuspenduju u odgovarajućim medijumima ćelijskih kultura. Na primer, 2B2 ćelije se mogu resuspendovati u, i nakon toga kultivisati u, bazalnim medijumima, kao što su CD CHO medijumi (Invitrogen), ili rekonstituisanim CD CGO AGT<TM>medijumima u prahu (Invitrogen), dopunjenim sa 8 mM glutamina ili L-alanil-L-glutamina i 20 µM metotreksata. U drugom primeru, ćelije mogu da rastu u bazalnim medijumima dopunjenim sa 8 mM glutamina ili L-alanil-L-glutamina i 100 mM metotreksata. Bilo koji drugi pogodni medijumi ćelijskih kultura takođe se mogu koristiti da se prošire ćelije koje eksprimiraju hijaluronidaze. Na primer, ćelije se mogu kultivisati u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM), Eagle-ovom minimalnom esencijalnom medijumu (EMEM), Iscove-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (IMEM), F12, RPMI ili drugim hemijski definisanim ili nedefinisanim medijumima, sa ili bez dodatnih suplemenata. Tipično, ćelije su rasle u medijumima bez seruma, ali takođe mogu rasti u medijumima koji sadrže serum. Stručnjak u tehnici može pripremiti medijume ćelijskih struktura koristeći druge bazalne medijume ćelijskih kultura u koje se različiti nutrijenti mogu dodati da bi se napravili medijumi ćelijskih kultura u kojima se ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 kultivišu.

[0129] Inokulum ćelije se dodaje u prvu od serija povećanja zapremina medijuma ćelijskih kultura, tako proširujući ćelijsku kulturu. Nakon inicijalne inokulacije, ćelije se proširuju u vlažnom inkubatoru ili bioreaktoru na odgovarajućoj temperaturi sa odgovarajućom količinom CO2. Tipično, količina CO2je između 4% i 9%, tipično između 6.0% i 8.0%, tako da je 7.0% i temperatura je između 35 °C i 39 °C, tipično između 36 °C i 38 °C, tako da je 37 °C. Na primer, 2B2 i 3D35M ćelije mogu da rastu na 37 °C u vlažnom inkubatoru sa 7% CO2.

Kultura može biti protrešena, tako što je 90-130 rpm, tokom ovog postupka. Kada ćelije dostignu željenu gustinu, kao što je, na primer, više od 1.0 × 10<6>ćelija/mL (npr. između 1.5 × 10<6>ćelija/mL i 2.5 × 10<6>ćelija/mL), ćelijska kultura se koristi da bi se inokulirala velika zapremina svežih medijuma ćelijskih kultura. Na primer, ćelije mogu biti inokulirane unutar sledeće kulture na gustini od 4 × 10<4>do 4 × 10<6>ćelija/mL, obično 2 × 10<5>do 6 × 10<5>ćelija/mL, kao što je 4 × 10<5>ćelija/mL. Postupak se ponavlja dok se ćelije ne prošire do željene zapremine i ćelijske gustine za zasejavanje od, na primer, 4 × 10<4>do 4 × 10<6>ćelija/mL unutar bioreaktora.

[0130] U jednom primeru, ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20, kao što su 2B2 ćelije, su inicijano dodate u otprilike 20 mL svežih medijuma ćelijskih kultura u 125 mL balonima za trešenje, rezultujući zapreminom kulture 20-30 mL, tipično 25 mL. Nakon inkubacije na 37 °C, 7% CO2i ekspanzije ćelija do gustine veće od 1.5 × 10<6>ćelija/mL, svež medijum je dodat u tubice da bi se proširila ćelijska kultura do 40 mL. Ćelije su inkubirane opet dok gustina nije bila veća od 1.5 × 10<6>ćelija/mL, nakon čega je kompletna ćelijska kultura (otprilike 40 mL) dodata u svež medijum da bi se napravilo 100 mL zapremine kulture u 125 mL balonu za trešenje. Ovaj postupak se ponavlja transferovanjem kompletne ćelijske strukture (otprilike 100 mL) u 250 mL balona za trešenje koje sadrže dovoljno svežeg medijuma da se napravi kultura zapremine 200 mL, zatim 1 L balona za trešenje koje sadrže dovoljno svežeg medijuma da se napravi kultura zapremine 800 mL, zatim 6 L balona za trešenje koje sadrže dovoljno svežeg medijuma da se napravi kultura zapremine 5 L, i konačno zatim 36 L balona za trešenje koje sadrže dovoljno svežeg medijuma da se napravi kultura zapremine 32 L. Između svakog transfera, ćelije se inkubiraju dok kultura ne dostigne gustinu veću od 1.5 × 10<6>ćelija/mL. U nekim primerima, veća gustina ćelija se postiže nakon inkubacije konačnih 36 L balona za trešenje. Na primer, ćelije u 36 L balonima za trešenje mogu se proširiti do gustine ćelija 3.55 × 10<6>ćelija/mL do 6.05 × 10<6>ćelija/mL. Ovaj postupak se može koristiti da se prošire ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 pre ubacivanja u bioreaktora od 400 L (300 L zapremine kulture) za fazu proizvodnje proteina (videti, npr. Primer 8).

[0131] Ovaj postupak, slično kao bilo koji postupak opisan ovde, može biti proširen od strane stručnjaka u tehnici za uvođenje ćelija u bioreaktor sa zapreminom kulture većom od 300 L. Na primer, postupak može biti proširen uvođenjem ćelija unutar bioreaktora sa 2500 L zapremine kulture, kako je opisano u Primeru 12. Tako, u jednom primeru postupka koji je opisan ovde, nakon odmrzavanja, ćelije se serijski proširuju kroz 125 mL balone za trešenje (radna zapremina 20-30 mL, kao što je 25 mL), 250 mL balone za trešenje (radna zapremina

4

45-55 mL, kao što je 50 mL), 1 L balone za trešenje (radna zapremina 190-210 mL, kao što je 200 mL), dva 2L balone za trešenje (radna zapremina 350-450 mL po balonu, kao što je 400 mL po balonu), šest 2L balona za trešenje (radna zapremina 350-450 mL po balonu, kao što je 400 mL po balonu), 25 L talasni bioreaktor (radna zapremina 14-16 L, kao što je 15 L), 100 L talasni bioreaktor (radna zapremina 75-85 L, kao što je 80 L), i 600 L bioreaktor za zasejavanje (radna zapremina 440-520 L, kao što je 480 L).

F. Proizvodnja proteina

[0132] Nakon ekspanzije ćelija, ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 se transferuju u bioreaktor za fazu proizvodnje, tokom kojeg se velika količina rastvorljivog rHuPH20 izlučuje u ćelijski medijum. Ova faza tipično je dizajnirana tako da je rast ćelija maksimalan u prvoj polovini rada bioreaktora, i proizvodnja rastvorljivog rHuPH20 je maksimalna u drugoj polovini rada bioreaktora. Ćelije su obezbeđene sa serijom hranljivih medijuma u određenim vremenskim tačkama tokom proizvodnje da bi se regulisao ovaj postupak. Uslovi bioreaktora su takođe tipično praćeni da bi se obezbedilo održavanje optimalnih uslova tokom postupka. Postupci za protein opisani ovde mogu se proširiti ili skratiti od strane stručnjaka u tehnici. Dalje, modifikovani su, na primer, ćelijski medijumi, vremena inokulacije, protokoli hranjenja. Stručnjak u tehnici može empirijski da odredi odgovarajuće uslove za proizvodnju proteina za bilo koji dati bioreaktor i tip ćelije.

[0133] U postupcima ovde mogu se koristiti bioreaktori različitih veličina i dizajna. U nekim primerima, u postupcima ovde koriste se bioreaktori od 125 L, 400 L ili 3500 L da bi se kultivisale ćelije u zapreminama otprilike 100 L, 300 L i 2500 L, po redu. Tipično, bioreaktor je sterilisan pre dodavanja medijuma ćelijske kulture ili ćelija. Sterilizacija se može izvršiti pomoću autoklaviranja ili drugog tretiranja sa parom za neke bioreaktore, ili pomoću tretiranja sa sterilisanim rastvorom, kao što je razblažen natrijum hidroksid, razblažena azotna kiselina ili natriijum hipohlorit. U nekim primerima, bioreaktor je sterilisan parom na 121 °C, 20 PSI 30 minuta. Naon sterilizacije, medijum ćelijske kulture može biti dodat u bioreaktor i onda biti procenjena kontaminacija, kao što je mikrobijalna kontaminacija, nakon perioda vremena da se osigura da je postupak sterilizacije efikasan.

[0134] Ćelijska kultura iz faze ekspanzije, koja je objašnjena u prethodnom tekstu, se dodaje u sterilisan bioreaktor koji sadrži svež medijum ćelijske kulture. Ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 su inokulirane unutar svežeg medijuma ćelijske kulture na gustini ćelija 10<5>do 10<6>ćelija/mL.

[0135] U jednom primeru ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 su inokulirane na gustini ćelija 4 × 10<5>ćelija/mL. Ukupan broj ćelija nakon inokulacije zavisio je od veličine bioreaktora i gustine ćelija. Na primer, zapremina ćelijske kulture od 100 L može imati gustinu ćelija nakon inkubacije otprilike 10<10>ili 10<11>ćelija.

[0136] Zapremine inokulisanih ćelijskih kultura i svežeg ćelijskog medijuma su zavisile od veličine bioreaktora i gustine ćelije inokuluma. Na primer, otprilike 30 L ćelija koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20, kao što su 2B2 ćelije, mogu se dodati u 400 L bioreaktora koji sadrži 230 L svežeg medijuma ćelijskih kultura za ukupnu zapreminu otprilike 260 L i inokulaciju gustine ćelija 4 × 10<5>ćelija/mL (ukupan broj ćelija je otprilike 10<11>ćelija). Ovo se može proširiti ili suziti ako je neophodno, u zavisnosti od bioreaktora.

[0137] U jednom primeru, za proizvodnju u 3500 L bioreaktoru, 2B2 ćelije su dodate u svež medijum ćelijske kulture za ukupnu zapreminu ćelijske kulture 1900-2300 L, kao što je 2100 L.

[0138] Svež medijum ćelijske kulture sadrži odgovarajuće suplemente da bi se obezbedili neophodni nutrijenti za ćeliju da pospeši rast ćelije. Suplementi koji se mogu dodati u bazalni medijum ćelija uključuju, ali se ne ograničava na, glukozu, insulin, natrijum butirat, ekstrakt kvasca i glutamin ili supstituisan glutamin, kao što je L-alanil-L-glutamin. U nekim slučajevima, bazalni mediju sadrži dovoljno glukoze da dalje dodavanje nije potrebno. U drugim slučajevima, glukoza se dodaje u medijum kasnije u postupku proizvodnje, kao što je u narednom hranljivom medijumu. Dodavanje insulina u medijum može pospešiti ćelijski rast i povećati pik gustine ćelija. Glutamin ili supstituisan glutamin, kao što je L-alanil-L-glutamin, može podržati progresiju ćelijskog ciklusa i takođe pojačati rast ćelija. Stručnjak u tehnici može empirijski da odredi količinu i kvalitet nutrijenata koji se mogu dodati u bazalni medijum, U nekim primerima, glutamin ili supstituisan glutamin se dodaje u bazalni medijum ćelijske kulture na 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM ili 20 mM. Insulin se može dodati u medijum ćelijske kulture na, na primer, 0.5 mg/L do 50 mg/L, kao što je 1 mg/L do 40 mg/L, 2 mg/L do 30 mg/L, ili 5 mg/L do 20 mg/L. Na primer, bazalni medijum ćelijske kulture obogaćen sa 5 mg/L insulina i 8 mM L-alanil-L-glutamina može se koristiti kao svež medijum ćelijske kulture unutar kojeg su ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 inokulisane. Dodatni suplementi, kao što su antibiotici, sredstva protiv gljivica, indikatori, soli, vitamini, aminokiseline i faktori rasta takođe se mogu dodati.

[0139] Individualni parametri bioreaktora mogu se podesiti da održavaju optimalne uslove tokom postupka proizvodnje proteina. Specifični parametri koji se mogu podesiti zavise od bioreaktora koji se koristi, i mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na, temperaturu, pH, rastvoren kiseonik, brzinu radnog kola, pritisak posude, prskanje vazduha i preklapanje vazduha. U jednom primeru, uslovi 125 L bioreaktora koji sadrže 100 L ćelijske kulture 3D35M ćelija su podešeni na; temperaturu: 37°C; rastvoreni kiseonik: 25% ± 10%; brzinu radnog kola: 50 RPM; pritisak posude: 3 psi; prskanje vazduha: 1 L/minutu; preklapanje vazduha: 1 L/minutu, pH:7.2. U drugom primeru, uslovi 400 L bioreaktora koji sadrži inicijalnu zapreminu ćelijske kulture od 260 L su podešeni na; temperaturu: 37 °C; brzinu radnog kola: 40-55 RPM; pritisak posude: 3 psi; prskanje vazduha: 0.5-1.5 L/minutu; preklapanje vazduha: 1 L/minutu. U daljem primeru, uslovi 3000 L bioreaktora koji sadrži inicijalnu zapreminu kulture od 2100 L su podešeni na; temperaturu: 37 °C (ili između 36.5 °C i 37.5°C; brzinu radnog kola: 35 RPM (ili 70-80 RPM); pritisak posude: 5 psi (ili 3-7 psi); prskanje vazduha: 12 L/minutu (ili 11-13 L/minutu); rastvoren kiseonik: 25%, ili > 25%; pH pre inokulacije: 7.2 (ili pH 7.1-7.3); pH posle inokulacije: ≤7.2 (ili ≤7.3). Stručnjak u tehnici može empirijski da odredi odgovarajuće uslove za rast određene ćelije koja eksprimira rastvorljivi rHuPH20 u određenom bioreaktoru.

[0140] Ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 su tipično kultivisane u bioreaktoru između 10 i 25 dana. U nekim primerima, ćelije koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 su kultivisane u bioreaktoru 12, 13, 14, 15 ili 16 dana pre sakupljanja. U drugim primerima, ćelije su sakupljene kada je broj vijabilnih ćelija (VCC) pao na određeni nivo, kao što je, na primer, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 70%.. U jednom primeru, ćelije su sakupljene kada je VCC između 30% i 35%. U drugom primeru, ćelije su sakupljene unutar 24 sata od padanja VCC ispod 50%.

[0141] Tokom kulture bioreaktora,

ćelije su rasle kao dolivne kulture i obezbeđene su serijom hranljivih medijuma u određenim vremenskim tačkama sa dodatnim nutrijentima i glukozom tokom čitavog postupka. U nekim slučajevima, nutrijenti obezbeđeni u medijumu ćelijske kulture unutar kojih su ćelije inokulirane su potrošeni 3, 4, 5, 6, 7 dana ili duže posle inokulacije. Tako, obezbeđivanje dodatnih nutrijenata ili suplemenata može proizvesti veće prinose proteina nego šaržnim kulturama. U jednom primeru, ćelije su obezbeđene sa hranljivim medijumom na dane 6, 9 i 11 posle inokulacije. U drugom primeru, ćelije su obezbeđene sa hranljivim medijumom na dane 7, 9 i 11 posle inokulacije. U daljem primeru, ćelije su obezbeđene sa hranljivim medijumom na dane 5, 7, 9 i 11 posle inokulacije. Zapremina hranljivog medijuma dodatog u bioreaktor kulture može da bude u opsegu između, na primer, 0.5% i 20%, tako da je 1-20%,

4

2-15%, 3-10% ili 4-5% zapremine ćelijske kulture. U nekim slučajevima, hranljivi medijum je dodat u zapreminu ekvivalentnu 4% zapremine ćelijske kulture.

[0142] Dodavanje različitih suplemenata u hranljivi medijum se koristi da bi se regulisao rast i/ili ćelijski ciklus ćelija. Nutrijenti i suplementi koji su uključeni u hranljivi medijum uključuju, ali se ne ograničavaju na, glutamin ili supstituisan glutamin, kao što je L-Alanil-L-glutamin, insulin, ekstrakt kvasca, glukozu i natrijum butirat ili natrijum butirat. Štaviše, bazalni medijum korišćen u hranljivom medijumu takođe može biti koncentrovan, čime se obezbeđuju dodatni nutrijenti, kao što su esencijalne aminokiseline, koje mogu biti potrošene tokom ćelijske kulture. Bazalni medijum u hranljivom medijumu može biti 2×, 3×, 4×, 5×, 6× ili više koncentrovan. U drugim primerima, bazalni medijum je manje koncentrovan, ili isto koncentrovan kao medijum ćelijske kulture u bioreaktoru.

[0143] Suplementi uključeni u hranljivi medijum mogu biti uključeni da bi regulisali ćelijski rast i proizvodnju proteina. Prvi hranljivi medijum koji se dodaje u ćelijsku kulturu može uključivati nutrijente koji pojačavaju progresiju ćelijskog ciklusa, ćelijski rast i pik gustine ćelija. Sledeći hranljivi medijum pospešuje zaustavljanje ćelijskog rasta i/ili sinteze proteina. Količina svakog suplementa u svakom hranljivom medijumu može da varira, kao što je povećanjem ili smanjivanjem od jednog hranljivog medijuma do sledećeg, ili može biti isti od jednog medijuma do sledećeg. U nekim primerima, količina suplementa je u porastu od jednog hranljivog medijuma do sledećeg, kao što je po 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ili više. U drugim primerima, količina suplemenata suplementa je u opadanju od jednog hranljivog medijuma do sledećeg, kao što je po 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više. U jednom primeru, suplement je izostavljen iz hranljivog medijuma. U drugim primerima, količina suplementa u hranljivom medijumu ostaje ista. Stručnjak u tehnici može empirijsku da odredi optimalnu količinu svakog suplementa za svaki hranljivi medijum da bi se pospešila željena količina ćelijskog rasta i proizvodnje proteina.

[0144] Suplementi ili nutrijenti koji su uključeni u hranljivi medijum uključuju, ali se ne ograničavaju na, glukozu, glutamin ili supstituisan glutamin, kao što je L-Alanil-L-Glutamin, insulin i natrijum butirat. Tip i količina dodatih suplemenata može da utiče na ćelijski rast i proizvodnju proteina. Insulin i supstituisan glutamin L-alanil-L-glutamin su inkorporirani unutar prvog hranljivog medijuma dodatog u ćelijsku kulturu da bi se povećao ćelijski rast i pik gustine ćelija.

Sledeći hranljivi medijumi su dizajnirani da pospešuju proizvodnju proteina više nego ćelijski rast. Suplement insulin je isključen i redukovana je količina L-Alanil-L-Glutamina. Nasuprot tome, povećana je količina suplementa ekstrakt kvasca koji pojačava sintezu proteina. Takođe je uključen natrijum butirat koji pojačava zaustavljanje ćelijskog ciklusa i, stoga, povećava proizvodnju proteina.

[0145] Dodavanje insulina može povećati pik gustine ćelija po, na primer, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ili više.

Insulin se dodaje rano u hranljivi medijum, tj., prvi hranljivi medijum, da bi se pospešio maksimalan ćelijski rast u inicijalnoj fazi rada reaktora. Na primer, prvi hranljivi medijum, može da sadrži količinu insulina na ili oko 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 25 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 mg/L, 45 mg/L, 50 mg/L, 55 mg/L, 60 mg/L ili više.

[0146] Supstituisani glutamin L-Alanil-L-Glutamin je takođe dodaje u hranljivi medijum.

[0147] Količina supstituisanog glutamina dodata u prvi hranljivi medijum je veća od količine supstituisanog glutamina dodatog u sledeći hranljivi medijum. Količina supstituisanog glutamina dodatog u svaki sledeći hranljivi medijum je manja u poređenju sa dodatom količinom u prethodnom hranljivom medijumu. Stručnjak u tehnici može empirijski odrediti optimalnu količinu koja se dodaje u svaki hranljivi medijum i može uključiti, na primer, koncentracije supstituisanog glutamina na ili oko 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM ili više.

[0148] Tipično, bazalni medijum korišćen u hranljivom medijumu takođe je obogaćen sa glukozom. Količina glikoze dodate u svaki hranljivi medijum može se povećati ili smanjiti u odnosu na prethodni hranljivi medijum, ili može ostati približno konstantna. U nekim primerima, količina dodate glukoze u hranljivi medijum je ili je oko 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 75 g/L, 80 g/L ili više.

[0149] Dodatno, suplementi koji pospešuju sintezu proteina su takođe uključeni. Takvi nutrijenti uključuju ekstrakt kvasca. U nekim slučajevima, količina ekstrakta kvasca uključenog u hranljivi medijum se povećava tokom rada bioreaktora. Na primer, količina ekstrakta kvasca u trećem hranljivom medijumu može se povećati u poređenju sa količinom u sekundarnom hranljivom medijumu, koja može biti uvećana u poređenju sa količinom u sekundarnom hranljivom medijumu. U nekim primerima, količina dodatog ekstrakta kvasca u hranljivi medijum je između 5 i 1000 g/L, kao što je ili kao što je oko 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 75 g/L, 100 g/L, 125 g/L, 150 g/L, 175 g/L, 200 g/L, 250 g/L, 300 g/L, 350 g/L, 400 g/L ili više.

[0150] Suplementi koji pojačavaju zaustavljanje ćelijskog ciklusa i, stoga, povećavaju proizvodnju proteina, su takođe uključeni, tj. natrijum butirat. Tipično, takav suplement je uključen u hranljivi medijum koji je dodat u bioreaktor kasnije tokom rada i nije uključen u

4

prvi hranljivi medijum. Natrijum butirat koji pojačava zaustavljanje ćelijskog ciklusa je dodat u sekundarni hranljivi medijum i naredne medijume.

[0151] U nekim primerima, količina natrijum butirata dodatog u hranljivi medijum je između 0.1 g/L i 10 g/L, kao što je ili je oko 0.2 g/L, 0.3 g/L, 0.4 g/L, 0.5 g/L, 0.6 g/L, 0.7 g/L, 0.8 g/L, 0.9 g/L, 1.0 g/L, 1.1 g/L, 1.2 g/L, 1.3 g/L, 1.4 g/L, 1.5 g/L, 1.6 g/L, 1.7 g/L, 1.8 g/L, 1.9 g/L, 2.0 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.5 g/L ili više.

[0152] Dalje, bilo koji od ili više uslova bioreaktora mogu se promeniti tokom faze proizvodnje da bi se optimizovala proizvodnja proteina. Temperatura je snižena. To može služiti pospešivanju zaustavljanja ćelijskog ciklusa, produžene vijabilnosti ćelija (čime se povećava ukupna proizvodnja proteina), i pomaže stabilizaciji hijaluronidaza koje se izlučuju. Na primer, temperatura bioreaktora se može sniziti na svakom, hranjenju, kao što je od 37 °C do 36.5 °C na sekundarnom hranjenju, do 36 °C na trećem hranjenju i do 35.5 °C na četvrtom hranjenju. Stručnjak u tehnici može empirijski da odredi odgovarajući hranljivi medijum i vreme na kome se obezbeđuje hranjenje kao i odgovarajuće uslove u bioreaktoru.

[0153] U jednom primeru, obezbeđene su ćelije sa hranljivim medijumom na dane 6, 9 i 11 posle inokulacije. U drugom primeru, ćelije su obezbeđene sa hranljivim medijumom na dane 7, 9 i 11 posle inokulacije. U daljem primeru, ćelije su obezbeđene sa hranljivim medijumom na dane 5, 7, 9 i 11 posle inokulacije. Obezbeđeni hranljivi medijum u svakoj vremenskoj tački se razlikuje, i može uključivati suplemente kao što su, ali ne ograničavajući se na, glukozu, natrijum butirat, insulin, glutamin ili supstituisan glutamin i ekstrakt kvasca kako je definisano patentnim zahtevima. Na primer, 2B2 ćelije koje rastu u 260 L kulture u 400 L bioreaktora mogu se obezbediti sa prvim hranjenjem na dan 5 koji sadrži 10.4 L 4 × bazalnog medijuma (npr. CD CHO medijum) sa 33 g/L Glukoze, 32 mM L-alanil-L-glutamina, 16.6 g/L Ekstrakta kvasca i 33 mg/L Insulina, drugim hranjenjem na dan 7 koji sadrži 10.8 L 2 × bazalnog medijuma (npr. CD CHO medijum), 33 g/L Glukoze, 16 mM L-alanil-L-glutamina, 33.4 g/L Ekstrakta kvasca i 0.92 g/L Natrijum butirata, trećim hranjenjem na dan 9 koji sadrži 10.8 L 1 × bazalnog medijuma (npr. CD CHO medijum), 50 g/L Glukoze, 10 mM L-alanil-L-glutamina, 50 g/L Ekstrakta kvasca i 1.80 g/L Natrijum butirata, i četvrtim hranjenjem na dan 11 koji sadrži 1 × bazalnog medijuma (npr. CD CHO medijum), 33 g/L Glukoze, 6.6 mM L-alanil-L-glutamina, 50 g/L Ekstrakta kvasca i 0.92 g/L Natrijum butirata. Ovo može biti prošireno ili suženo od strane stručnjaka u tehnici za proizvodnju rHuPH20 u većim ili manjim bioreaktorima, po redu. Dalje, stručnjak u tehnici može promeniti količinu tipa još jednog suplementa dodatih u medijum da bi se pojačao ćelijski rast i/ili proizvodnja proteina.

4

[0154] U drugom primeru, sledeći hranljivi medijumi su obezbeđeni ćelijama na dane 5, 7, 9 i 11: Hranljivi medijum #1: bazalni medijum 33 g/L Glukoze 26.6 mM L-alanil-L-glutamin 83.3 g/L Ekstrakt kvasca 33 mg/L rHuInsulin; Hranljivi medijum #2: bazalni medijum 33 g/L Glukoze 13.4 mM L-alanil-L-glutamin 166.7 g/L Ekstrakt kvasca 0.92 g/L Natrijum butirat; Hranljivi medijum #3: bazalni medijum 50 g/L Glukoze 10 mM L-alanil-L-glutamin 250 g/L Ekstrakt kvasca 1.8 g/L Natrijum butirat; Hranljivi medijum #4: bazalni medijum 33.3 g/L Glukoze 6.7 mM L-alanil-L-glutamin 250 g/L Ekstrakt kvasca 0.92 g/L Natrijum butirat.

G. Skupljanje ćelijske kulture, koncentracija proteina i razmena pufera

[0155] Nakon faze proizvodnje proteina, ćelije su sakupljene i rastvorljivi rHuPH20 koji se izlučuje unutar medijuma ćelijske kulture je koncentrovan pre inicijacije postupka prečišćavanja. Pored koncentrovanja proteina, medijum ćelijske kulture može se zameniti da odgovarajućim puferom u to vreme. Višestruki sistemi i postupci za efikasno koncentrovanje proteina i razmenu pufera poznati su u tehnici i mogu se koristiti u postupcima ovde. Opisani su u nastavku teksta takvi ogledni postupci, i stručnjak u tehnici će prepoznati da ovi postupci mogu biti modifikovani ili supstituisani sa drugim efikasnim postupcima da bi se postigao zadovoljavajući nivo koncentracije proteina i razmene pufera.

[0156] Ćelije su sakupljene iz bioreaktora i obrađene kroz sistem uklanjanja i bistrenja ćelija da bi se tečna ćelijska kultura koja sadrži hijaluronidaze razdvojila od ćelija i ćelijskih ostataka. Primer takvog sistema je jedan koji sadrži serije filtera koji dopuštaju jedino proteinima da prođu i budu prikupljeni. Bilo koji filter ili serija filtera sposobna da razdvoji hijaluronidaze od ćelija i ćelijskih ostataka mogu se koristiti. Na primer, sakupljanje ćelijske kulture može proći kroz serije filter kapsula, kao što su polietersulfonski filteri. Oni mogu imati smanjene veličine pora do postepenog uklanjanja, na primer, ćelija, ćelijskih ostataka i manjih čestica, kao što su virusi. U nekim primerima, serija četiri filtera sa veličinama pora od 8.0 µm, 0.65 µm, 0.22 µm i 0.22 µm je korišćena da se izbistri ćelijska kultura da bi se dobila tečnost sakupljene ćelijske kulture (HCCF). Drugi primer sistema uklanjanja i bistrenja ćelija koji se može koristiti u postupcima ovde je serija filtera koji u prvom stadijumu sadrži paralelno četiri modula, svaki sadrži sloj dijatomejske zemlje gradusa do 4-8 µm i sloj dijatomejske zemlje gradusa do 1.4-1.1 µm, praćeno celuloznom membranom. Drugi stadijum sadrži pojedinačne module koji sadrže sloj dijatomejske zemlje gradusa do 0.1-0.11 µm i sloj

4

dijatomejske zemlje gradusa do <0.1 µm praćeno celuloznom membranom i treći stadijum je 0.22 µm polietersulfon filter kapsula.

[0157] Jednom kada su ćelije i ćelijski ostaci odvojeni od HCCF, protein u HCCF je tipično koncentrovan i zamenjen je medijum ćelijske kulture sa odgovarajućim puferom. Protein može biti koncentrovan 2 ×, 3 ×, 4 ×, 5 ×, 6 ×, 7 ×, 8 ×, 9 ×, 10 ×, 11 ×, 12 ×, 13 × ili više. U nekim primerima, protein je koncentrovan 10 ×. U drugim primerima, protein je koncentrovan 6 ×.Može se koristiti bilo koji postupak za koncentrovanje proteina koji je poznat u tehnici. Ogledno takvi postupci uključuju koncentrovanje koristeći sisteme protočne filtracije (TTF) sa filterima za graničnu molekulsku masu (MWCO). Na primer, izbistreni HCCF može proći kroz seriju od dva 30kDa MWCO spiralnih polietersulfonskih filtera da bi se protein koncentrovao 10 ×. U drugom primeru, HCCF prolazi kroz seriju četiri 30kDa MWCO filtera. Za proizvodnju hijaluronidaza velikog obima, kao što je, na primer, 100 L i 300 L kultura, tipično se za tu svrhu koriste filteri sa površinom od između 0.5 i 5 metara kvadratnih. U nekim primerima, koriste se filteri sa površinom od 1.2 metra kvadratna ili 2.8 metra kvadratna.

[0158] Razmena pufera je izvršena nakon koncentrovanja proteina. Stručnjak u tehnici može empirijski da odredi odgovarajući pufer. Ogledni pogodni pufer je 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0 pufer, ili 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 pufer. Nakon sakupljanja, koncentrovanja i razmene pufera, koncentrovani rastvor proteina tipično prolazi kroz drugi filter, kao što je 0.22 µm filter kapsula, pre skladištenja u sterilnim kesicama za skladištenje.

[0159] U nekim primerima, koncentrovani rastvor proteina se tretira da bi se inaktivirala bilo koja zaostala kontaminacija virusima. Inaktivacija virusa može biti izvršena bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, rastvor koncentrovanog proteina može se pomešati sa 10 % Triton X-100, 3% tri (n-butil) fosfata (TNBP), do finalne koncentracije od 1 % Triton X-100, 0.3% TNBP, na sobnoj temperaturi između 15 i 75 minuta. U nekim primerima, protein je izložen rastvoru za inaktivaciju virusa 30-45 minuta.

H. Prečišćavanje

[0160] Rastvorljivi rHuPH20 je prečišćen iz koncentrovanog rastvora proteina serijom koraka prečišćavanja. Mnoge tehnike prečišćavanja su poznate u tehnici i mogu se koristiti u postupcima ovde. Takvi postupci uključuju, ali se ne ograničavaju na postupke hromatografije, postupke kao što su jonsko-izmenjivačka hromatografija, hromatografija isključene veličine, afinitetna hromatografija (AC), tečna hromatografija visokih performansi

4

(HPLC), hromatografija reverzne faze (RPC) i hromatografija hidrofobnih interakcija (HIC), i postupci gel filtracije, ili bilo koja njihova kombinacija.

[0161] Ogledni postupci prečišćavanja koji su korišćeni za postupke ovde je kombinacija jonsko-izmenjivačke hromatografije, hromatografije hidrofobnih interakcija i afinitetne hromatografije. U jonsko-izmenjivačkoj hromatografiji proteini se razdvajaju iz kompleksnog rastvora ili smeše bazirane na elektrostatičkim silama između naelektrisanih funkcionalnih grupa proteina i naelektrisanih funkcionalnih grupa matriksa kolone hromatografije. Katjonizmenjene smole imaju negativno naelektrisane funkcionalne grupe koje privlače pozitivno naelektrisane funkcionalne grupe proteina, a anjon-izmenjene smole imaju pozitivno naelektrisane funkcionalne grupe koje privlače negativno naelektrisane funkcionalne grupe proteina. Proteini vezani za matriks elektrostatičkim silama mogu eluirati povećanje, jonske snage rastvora pufera unutar kolone hromatografije tokom vremena. U hromatografiji hidrofobnih interakcija protein može biti odvojen od kompleksnog rastvora ili smeše na osnovu njegove hidrofobnosti. Kompleksni rastvor koji sadrži protein je stavljen na kolonu hromatografije ekvilibrisanu sa puferom koji ima visok sadržaj soli da bi se olakšalo vezivanje proteina za smolu. Mobilna faza sa gradijentom soli i smanjenom jonskom snagom je onda ubačena u kolonu hromatografije da bi se oslobodili vezani proteini iz matriksa. Alternativno, hromatografijom hidrofobnih interakcija mogu se odvojiti monomerni proteini iz kompleksnog rastvora ili smeše vezivanjem hidrofobnih nečistoća, uključujući inaktivne dimere i agregate proteina, dok dozvoljava monomernim proteinima da protiču kroz kolonu hromatografije relativno neometano. U afinitetnoj hromatografiji, proteini se mogu odvojiti od kompleksnog rastvora na osnovu afiniteta proteina za ligand ili entitet koji vezuje ligand koji je konvencionalno povezan sa matriksom. Drugi proteini u kompleksnom rastvoru ili smeši sa slabim afinitetom, ili bez afiniteta, za ligand ili entitet koji vezuje ligand protiču kroz kolonu hromatografije neometano, ostavljajući proteine od interesa vezane za matriks. Protein onda može biti eluiran iz kolone hromatografije promenom uslova pufera da bi se smanjio afinitet za ligand ili entitet koji vezuje ligand.

[0162] U jednom primeru, rastvorljivi rHuPH20 je prečišćen iz koncentrovanog rastvora proteina sekvencijalnim prečišćavanjem kroz kolonu sa agaroznim kuglicama, kao što je Q Sepharose<TM>kolona (jonsko-izmenjivačka hromatografija), kolonu sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, kao što je Phenyl Sepharose<TM>kolona (hromatografija hidrofobnih interakcija), kolona sa Amino Fenil Boronatom (afinitetna hromatografija) i konačno kroz kolonu sa Hidroksiapatitom (jonsko-izmenjivačka hromatografija). Svaka od ovih kolona pokazuje različita svojstva vezivanja koja se odnose na hijaluronidaze, tako da je kolona sa

4

agaroznim kuglicama (npr. Q Sepharose<TM>kolona) u koraku hvatanja (tj. rastvorljivi rHuPH20 se vezuje za smolu dok drugi proteini protiču), kolona sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama (npr. Phenyl Sepharose<TM>kolona) je u koraku proticanja (tj. rastvorljivi rHuPH20 protiče kroz kolonu dok neki drugi ostaju zarobljeni), kolona sa Amino Fenil Boronatom je u koraku drugog hvatanja, i kolona sa Hidroksiapatitom je u koraku poliranja da bi se dalje prečistio rastvorljivi rHuPH20.

[0163] Pre upotrebe, kolone se tipično sterilišu i ekvilibrišu. Sterilizacija može biti efikasna bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sterilizaciju sa 1.0 M NaOH. Kalibracija može biti efikasna dodavanjem odgovarajućeg pufera na kolonu, kao što je pufer sličan ili isti kao pufer koji se koristi za naknadno ispiranje kolone ili pufer u kome se protein nalazi pre stavljanja. Stručnjak u tehnici može lako odrediti pogodne pufere za upotrebu u ekvilibrisanju svake kolone. Ogledni puferi su obezbeđeni u nastavku teksta. Između svakog koraka hromatografije, eluirani protein može biti filtriran, kao što je kroz 0.22 µm filter, da bi se uklonili bilo kakvi kontaminirajući mikroorganizmi ili veliki agregati. U nekim primerima, filtrirani eluat je skladišten, kao što su sterilne kesice za skladištenje, pre upotrebe u sledećem koraku. Nakon hromatografije kolone, prečišćene hijaluronidaze mogu zatim biti podvrgnute koraku uklanjanja virusa, zatim koncentrovanju proteina i razmeni pufera do finalne formulacije. Ogledni postupci prečišćavanja su opisani detaljno u nastavku teksta.

1. Kolona sa agaroznim kuglicama

[0164] Koncentrovani protein dobijen iz tečnosti sakupljene ćelijske kulture (HCCF) može da se stavi na kolonu sa agaroznim kuglicama, kao što je, na primer, Q Sepharose™ kolona, koja je jak izmenjivač anjona i hvata rastvorljivi rHuPH20 dok dozvoljava drugim proteinima da protiču. Vezani rastvorljivi rHuPH20 se zatim može eluirati korišćenjem odgovarajućeg pufera. Dimenzije korišćene kolone obično zavise od zapremine koncentrovanog proteina dobijenog iz HCCF. Na primer, koncentrovani protein dobijen iz kulture ćelija koje eksprimiraju hijaluronidazu u kulturi bioreaktora od 100 L može se staviti na kolonu koja je visoka 20 cm, prečnika 14 cm i sadrži 3 L smole. U drugom primeru, koncentrovani protein dobijen iz kulture ćelija koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 u kulturi bioreaktora od 300 L može se staviti na kolonu koja je visoka 29 cm, prečnika 20 cm i sadrži 9 L smole. Ovo se može povećati ili smanjiti po potrebi, u zavisnosti od zapremine koncentrovanog rastvora proteina i očekivane količine proteina. Na primer, koncentrovani protein dobijen iz kulture ćelija koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 u kulturi bioreaktora od 20 L može se staviti na Q Sepharose™ kolonu koja je visoka 28 cm, prečnika 7 cm i sadrži 1.1 L smole i koncentrovani protein dobijen iz kulture ćelija koje eksprimiraju rastvorljivi rHuPH20 u kulturi bioreaktora od 2500 L može se staviti na Q Sepharose™ kolonu koja je visoka 26 cm, prečnika 63 cm i sadrži 81 L smole.

[0165] Pre stavljanja proteina, kolona je tipično ekvilibrisana. Ekvilibracija se može izvršiti propuštanjem kroz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više zapremina pufera kolona. U nekim primerima, 5 zapremina pufera kolone je propušteno kroz kolonu za ekvilibraciju. Puferi pogodni za ekvilibraciju uključuju one koji su slični puferima koji će se koristiti za ispiranje kolone nakon stavljanja proteina. Na primer, kolona sa agaroznim kuglicama, kao što je Q Sepharose™ kolona, može se ekvilibrisati sa 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.5. Mogu se koristiti i drugi neutralni pH puferi, što će prepoznati stručnjak u tehnici.

[0166] Nakon stavljanja proteinskog koncentrata, kolona je isprana i protein eluiran. Pogodni puferi za ispiranje takvih kolona koji sadrže vezani rastvorljivi rHuPH20 uključuju, na primer, 10 mM Hepes, 25 mL NaCl, pH 7.0; 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0; i 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5. Kolona se može isprati sa jednim ili više vrsta pufera. Na primer, kolona se može isprati sa 20 mM Na2SO4, pH 7.5 i 10 mM Hepesa, 50 mM NaCl, pH 7.0. Tipično, ispiranje se vrši propuštanjem kroz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više zapremina pufera kolona. U nekim primerima, 5 zapremina pufera kolone se koristi za ispiranje kolone. Rastvorljivi rHuPH20 se zatim eluira korišćenjem pufera sa višom koncentracijom soli, kao što je na primer, 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0. U nekim primerima, prati se apsorbanca na A280da bi se odredilo kada treba sakupiti eluat, pošto svaka apsorbanca tokom ovog postupka generalno ukazuje na prisustvo rastvorljivog rHuPH20. Tako, u jednom primeru, eluat se sakuplja kada apsorbanca koja počinje da se očitava iznosi 0.025. Tipično, eluat se filtrira kroz odgovarajući filter, kao što je filter od 0.22 µm, pre skladištenja, kao što je u sterilnoj kesici za skladištenje.

2. Kolona sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama

[0167] Nakon prečišćavanja kroz kolonu sa agaroznim kuglicama, rastvor proteina se može podvrgnuti hromatografiji hidrofobnih interakcija korišćenjem kolone sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, kao što je Phenyl Sepharose™ kolona, u kojoj rastvorljivi rHuPH20 protiče kroz kolonu dok su drugi kontaminirajući proteini zarobljeni. Kolona koja se koristi u postupcima ovde može da varira u veličini, u zavisnosti od zapremine i količine proteina koji

1

se kroz nju prečišćava. Ogledne veličine uključuju kolone koje su visoke 29 cm, prečnika 20 cm sa 9 L smole za upotrebu u prečišćavanju rastvorljivog rHuPH20 iz ćelija gajenih u kulturi bioreaktora od 100 L, kolone koje su visoke 29 cm, 30 cm u prečniku sa 19-21 L smole za upotrebu u prečišćavanju hijaluronidaze iz ćelija gajenih u kulturi bioreaktora od 300 L i kolone koje su visoke 35 cm, prečnika 80 cm sa 176 L smole za upotrebu u prečišćavanju rastvorljivog rHuPH20 iz ćelija gajenih u 2500 L kulture bioreaktora. Stručnjak u tehnici može da poveća ili smanji po potrebi.

[0168] Sterilizovana kolona sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, kao što je Phenyl Sepharose™ kolona, može da se ekvilibriše pre stavljanja proteina sa odgovarajućim puferom, kao što je, na primer, 5 mM kalijum fosfat, 0.5 M amonijum sulfat, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Proteinski eluat iz prečišćavanja Q Sepharose kolone je takođe dopunjen amonijum sulfatom, kalijum fosfatom i CaCl2. Oni se mogu dodati proteinu do konačnih koncentracija, na primer, oko 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Nakon stavljenja proteina, 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i 0.1 mM CaCl2, pH 7.0 se takođe dodaje u kolonu i ono što protiče kroz filtriranjem se sakuplja, kao što je u sterilnoj kesici.

3. Kolona sa amino fenil boronatom

[0169] Nakon hromatografije hidrofobnih interakcija, protein prečišćen kolonom može da se unese u kolonu sa amino fenil boranatom da bi se dalje prečistio. Hromatografija posredovana ligandom amino fenil boranatom razlikuje se od mnogih drugih liganada koji se koriste za afinitetnu hromatografiju. Dok se većina liganada vezuje za određeno mesto vezivanja na proteinu smešom nekovalentnih interakcija, fenil boronat reaguje pretežno formiranjem privremene kovalentne veze sa 1,2-cis-diol grupama. Ligand boronat će se vezati za bilo koji molekul koji sadrži odgovarajuću grupu, uključujući rastvorljivi rHuPH20, koji je visoko glikoziliran.

[0170] Kolona sa amino fenil boronatom koja se koristi u ovim postupcima može da varira u veličini, u zavisnosti od zapremine i količine proteina koji se kroz nju prečišćava. Ogledne veličine uključuju kolone visine 29 cm, prečnika 20 cm sa 6.3 L smole za upotrebu u prečišćavanju hijaluronidaze iz ćelija gajenih u kulturi bioreaktora od 100 L, kolone koje su visoke 29 cm, 30 cm u prečniku sa 19-21 L smola za upotrebu u prečišćavanju hijaluronidaze iz ćelija gajenih u kulturi bioreaktora od 300 L, i, i kolone koje su visoke 35 cm, prečnika 80 cm sa 176 L smole od za upotrebu u prečišćavanju hijaluronidaze iz ćelija gajenih u 2500 L kulture bioreaktora. Stručnjak u tehnici može da poveća ili smanji po potrebi. Puferi pogodni

2

za ekvilibraciju kolone sa amino fenil boronatom uključuju, na primer, pufere koji sadrže 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfat, pH 7.0.

[0171] Nakon stavljanja proteina prečišćenog na koloni Phenyl Sepharose na kolonu sa Amino Fenil Boronatom, kolona je isprana odgovarajućim puferima za ispiranje. Ogledni puferi za ispiranje uključuju, ali se ne ograničavaju na, 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0 i 20 mM bicina, 0.5 M amonijum sulfata, pH 9.0 i 20 mM bicina, 100 mM NaCl, pH 9.0. U jednom primeru, kolona sa Amino Fenil Boronatom sa vezanom hijaluronidazom se prvo ispere sa 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0, zatim sa 20 mM bicina, 0.5 M amonijum sulfata, pH 9.0 i na kraju sa 20 mM bicina, 100 mM NaCl, pH 9.0. Vezana hijaluronidaza se zatim može eluirati, kao što je sa 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0. Stručnjak u tehnici može da modifikuje jedan ili više pufera da bi na sličan način sproveo prečišćavanje. Tipično, eluirani rastvorljivi rHuPH20 se takođe filtrira da bi se uklonila svaka mikrobna kontaminacija ili veliki agregati.

4. Kolona sa hidroksiapatitom

[0172] Nakon hromatografije na koloni sa Fenil Boronatom, rastvor proteina koji sadrži rastvorljivi rHuPH20 može se staviti na kolonu sa hidroksiapatitom u završnom koraku poliranja. Hidroksiapatit je kristalni oblik kalcijum fosfata sa molekulskom formulom Ca10(PO4)6(OH)2. Može se koristiti kao korak poliranja za razdvajanje proteina koji se blisko ko-prečišćavaju, koji funkcionišu mešovitim režimom jonske razmene zbog uključivanja i pozitivno i negativno naelektrisanih grupa. Različiti medijumi za hromatografiju sa hidroksiapatitom su komercijalno dostupni, i bilo koji raspoloživi oblik materijala može se koristiti u postupcima ovde. Primeri hidroksiapatita uključuju, ali se ne ograničavaju na, one koji su aglomerisani da formiraju čestice i sinterovani na visokim temperaturama u stabilnu poroznu keramičku masu. Veličina čestica može varirati, tako da je u opsegu od oko 1 µm do oko 1.000 µm u prečniku. Poroznost takođe može da varira, kao što je od oko 100 A do oko 10.000 A.

[0173] Kolona sa hidroksiapatitom koja se koristi u ovim postupcima može biti u rasponu veličine, u zavisnosti od zapremine i količine proteina koji se kroz nju prečišćava. Ogledne veličine uključuju kolone visine 20 cm, prečnika 30 cm sa 13 L smole za upotrebu u prečišćavanju hijaluronidaze iz ćelija gajenih u kulturi bioreaktora od 300 L, i kolone koje su visoke 23 cm, 80 cm u prečniku sa 116 L smola za upotrebu u prečišćavanju hijaluronidaze iz ćelija gajenih u kulturi bioreaktora od 2500 L. Stručnjak u tehnici može da poveća ili smanji po potrebi.

[0174] Za postupke opisane ovde, kolona sa Hidroksiapatitom može se ekvilibriše sa 5 mM kalijum fosfata, 200 mM NaCl ili 5 mM kalijum fosfata, 200 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Ekvilibracija korišćenjem rastvora kao što su oni koji čine kolonu kompatibilnom sa delimično prečišćenom hijaluronidazom, koja je sama dopunjena kalijum fosfatom i CaCl2do konačnih koncentracija od 5 mM i 0.1 mM, po redu. Nakon stavljanja proteina na kolonu, kolona se može isprati sa, na primer, 10 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0, da bi se uklonili svi nevezani kontaminirajući proteini. Vezani rastvorljivi rHuPH20 se onda može eluirati odgovarajućim puferom za eluiranje. Na primer, eluiranje se može izvršiti dodavanjem 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0. U nekim primerima, eluat se filtrira, kao što je kroz 0.22 µm filter.

6. Uklanjanje virusa, koncentrovanje proteina i razmena pufera

[0175] Rastvorljivi rHuPH20 dobijeni hromatografijom na protočnoj koloni može se podvrgnuti koracima post-prečišćavanja koji služe za formulisanje proteina u željenom puferu u željenoj koncentraciji. Protein takođe može biti podvrgnut koraku uklanjanja virusa da bi se osiguralo da nema kontaminacije i da je pogodan za upotrebu kao terapeutik. Uklanjanje virusa se obično vrši upotrebom filtera koji dozvoljava samo rastvorljivom proteinu da prođe dok hvata sve viruse (i druge zagađivače koji su po veličini jednaki ili veći od virusa). Takvi filteri su dostupni komercijalno, i svaki se može koristiti u postupcima ovde. Veličine pora filtera korisnih za uklanjanje virusa uključuju, ali se ne ograničavaju na, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 75 nm i 100 nm. U jednom primeru, prečišćena hijaluronidaza se filtrira kroz filter koji sadrži pore od 20 nm. Protein se može pumpati u filter pomoću, na primer, peristaltičke pumpe ili pomoću rezervoara pod pritiskom

[0176] Nakon uklanjanja virusa, rastvorljivi rHuPH20 se može koncentrovati i podvrgnuti razmeni pufera. Rastvorljivi rHuPH20 može biti koncentrovan 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 11×, 12×, 13× ili više. U nekim primerima, protein je koncentrovan približno 6×. Ovo može rezultovati, na primer, koncentracijom između 0.1 mg/mL i 50 mg/mL. U nekim primerima, prečišćena hijaluronidaza je koncentrovana do približno 1 mg/mL. U drugim primerima, prečišćena hijaluronidaza je koncentrovana na približno 10 mg/mL. Može se koristiti bilo koji postupak za koncentrovanje proteina koji je poznat u tehnici. Ogledni takvi postupci uključuju koncentrovanje korišćenjem sistema filtracije tangencijalnog protoka

4

(TFF) sa filterima za graničnu molekulsku masu. Na primer, prečišćena hijaluronidaza može biti propuštena kroz 10 kDa MWCO spiralne polietersulfonske filtere da bi se koncentrovao protein 10×. U drugom primeru, protein se propušta kroz seriju od četiri 30 kDa MWCO filtera. Za proizvodnju hijaluronidaze velikog obima, kao što su, na primer, kulture od 100 L i 300 L, obično se koriste filteri površine između 0.5 i 5 kvadratnih metara. U nekim primerima se koriste filteri površine 1.2 kvadratna metra ili 2.8 kvadratnih metara.

[0177] Razmena pufera se generalno vrši nakon koncentrovanja proteina da bi se formulisao protein u željenom puferu za naknadnu upotrebu, na primer, kao terapeutik. Stručnjak u tehnici može empirijski da odredi odgovarajući pufer. Ogledni pogodni puferi su slani puferi, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 10 mM Hepes, 130 mM NaCl, pH 7.0 i 10 mM Histidin, 130 mM NaCl, pH 6.0. Prečišćena hijaluronidaza može, u nekim primerima, da prođe kroz drugi filter, kao što je filter kapsula od 0.22 µm, pre skladištenja u sterilnom okruženju.

I. Punjenje

[0178] Ovde opisani postupci za proizvodnju i prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 takođe mogu uključiti korak punjenja, u kome se prečišćeni protein aseptično puni u manje posude za dugotrajno skladištenje i upotrebu. Rastvorljivi rHuPH20 se može puniti u posude kao tečna formulacija, ili kao prah, kao što je nakon liofilizacije. Za proizvodnju velikog obima, obično se koriste i široko su dostupni automatizovani sistemi za punjenje koji uključuju, na primer, pumpe za prenos proteina u posude i ponderisane stanice za merenje zapremine punjenja. Međutim, može se izvršiti i ručno ili kombinacija automatskog i ručnog punjenja posuda. Pogodne posude uključuju, ali se ne ograničavaju na, staklene ili plastične vijalice, blister pakovanja, boce, tube, inhalatore, pumpe, kese, špriceve, boce ili bilo koju drugu odgovarajuću posudu. Odgovarajući zatvarači ili poklopci se takođe mogu koristiti za zatvaranje posuda. Postupak punjenja može uključiti prvo propuštanje rastvorljivog rHuPH20 kroz filter pre punjenja da bi se uklonio mikrobni zagađivač i veći agregati ili sediment. Na primer, protein se može filtrirati kroz filter od 0.22 µm pre nego što se alikvotiraju u odgovarajuće posude. Stručnjak u tehnici može da odredi odgovarajuću zapreminu punjenja i može uključiti, na primer, zapremine u rasponu od 0.1 mL do 100 mL. U nekim primerima, vijalice su aseptično napunjene sa 1 mL, 5 mL ili 20 mL rastvorljivog rHuPH20. Nakon poklapanja ili zatvaranja posude, posude se mogu čuvati na odgovarajućoj temperaturi. U nekim primerima, posude se brzo zamrzavaju i čuvaju na između -15°C i -35°C. U drugim primerima, posude se čuvaju u frižideru, na primer na između 3°C i 15°C. Obično je dugotrajno skladištenje tečnosti na nižim temperaturama da bi se degradacija svela na minimum. Rastvorljivi rHuPH20 u obliku praha može se čuvati duže vreme na sobnoj temperaturi bez značajne degradacije.

J. Praćenje i analize

[0179] Ovde opisani postupci mogu se pratiti u jednom ili više koraka, merenjem jednog ili više uslova, parametara ili proizvoda u svakoj tački. Ovo može osigurati da se optimalni uslovi održavaju tokom čitavog perioda, a takođe se može koristiti za procenu efikasnosti i produktivnosti postupka. Praćenje se može desiti, na primer, jednom ili više puta tokom faze ekspanzije ćelije, faze proizvodnje proteina (tj. u bioreaktoru) i/ili faze prečišćavanja proteina, kao i bilo koje vreme između, pre ili posle, kao što je tokom postupaka koncentrovanja/razmene pufera ili punjenja. Praćenje može uključiti, ali se ne ograničava na, merenje pH, temperature, zapremine, kontaminacije, čistoće, koncentrovanja proteina, aktivnosti enzima, vijabilnosti ćelije i broja ćelija. Pored praćenja uslova, parametara ili proizvoda tokom postupka, prečišćeni rastvorljivi rHuPH20 proizveden kao krajnji proizvod takođe se može proceniti i okarakterisati u pogledu, na primer, koncentrovanja proteina, aktivnosti enzima, nečistoća, kontaminacije, osmolarnosti, degradacije, posttranslacionih modifikacija i sadržaja monosaharida.

1. Praćenje uslova

[0180] Uslovi tokom jednog ili više koraka u postupcima obezbeđenim ovde mogu se pratiti da bi se obezbedilo održavanje optimalnih uslova tokom celog postupka. Ako praćenje pokaže da uslovi nisu u optimalnom opsegu, onda se uslovi mogu promeniti. Uslovi koji se mogu pratiti razlikuju se za svaki postupak. Na primer, tokom faza ćelijske kulture (tj. ekspanzije ćelije i proizvodnje proteina u bioreaktoru), uslovi koje treba pratiti uključuju, ali se ne ograničavaju na, temperaturu, pH ćelijske kulture, hranljive materije ćelijske kulture (npr. glukozu), nivoe CO2i O2nivoa. Obično se uslovi automatski prate korišćenjem ugrađenih sistema u, na primer, inkubator ili bioreaktor.

[0181] Tokom faze prečišćavanja proteina, uslovi koji se mogu pratiti uključuju, ali se ne ograničavaju na, pH, provodljivost i brzinu protoka. Ovi uslovi se mogu pratiti pre, tokom i/ili posle jednog ili više koraka hromatografije kolone. Na primer, mogu se pratiti puferi koji se koriste za ekvilibraciju, ispiranje ili eluiranje kolone. Ovo se može izvršiti pre nego što se pufer ubaci ili nakon što pufer prođe kroz kolonu.

2. Praćenje proizvodnje rastvorljivog rHuPH20

[0182] Proizvodnja rastvorljivog rHuPH20, i parametri povezani sa proizvodnjom rastvorljivog rHuPH20, takođe se mogu pratiti tokom postupka. Ovo uključuje, ali se ne ograničava na, broj ćelija, vijabilnost ćelija, kontaminaciju, koncentrovanje proteina, aktivnost enzima, čistoću, osmolarnost, post-translacione modifikacije. Za procenu ovih parametara može se koristiti bilo koji postupak. Na primer, vijabilnost ćelija sisara može se proceniti uzimanjem malog alikvota ćelijske kulture i bojenjem tripan plavim, koje prožima samo oštećene ćelijske membrane, čime se boje samo mrtve ćelije. Ćelije se mogu vizualizovati pod mikroskopom i prebrojati pomoću, na primer, hemocitometra. Drugi postupci uključuju procenu vijabilnosti ćelije merenjem metaboličke aktivnosti. Na primer, alikvot ćelijske kulture može da se inkubira sa tetrazolijumovom soli (npr. MTT, XTT ili WST-1) koji se metabolički aktivnim ćelijama cepa u obojeni formazan proizvod.

[0183] Koncentrovanje rastvorljivog rHuPH20 u određenom uzorku može se proceniti postupcima dobro poznatim u tehnici, uključujući, ali ne ograničavajući se na, enzimsku imunosorbantu analizu (ELISA); SDS-PAGE; Bradford, Lowry i/ili BCA postupci; UV apsorbancija i druge postupke obeležavanja proteina koji se mogu kvantifikovati, kao što su, ali ne ograničavajući se na, imunološki, radioaktivni i fluorescentni postupci i srodni postupci. Pored toga, prisustvo i stepen razgradnje se može meriti standardnim tehnikama kao što su elektroforeza na natrijum dodecil sulfatu u poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE), Western blot uzoraka koji sadrže hijaluronidazu podvrgnutu elektroforezi i hromatografija, kao što je, na primer, RPHPLC. Čistoća uzorka koji sadrži hijaluronidazu može se proceniti, na primer, SDS-PAGE, RP-HPLC, hromatografijom isključene veličine, anjon-izmenjivačkom hromatografijom i izoelektričnim fokusiranjem (IEF). Rastvorljivi uzorci koji sadrže rHuPH20, kao što su uzorci koji sadrže prečišćenu hijaluronidazu, mogu se dalje okarakterisati procenom sadržaja sijalinske kiseline i monosaharida. Ovo se može postići, na primer, hidrolizom uzorka sa 40% trifluorosirćetne kiseline, fluorescentnim obeležavanjem oslobođenih monosaharida i njihovim razdvajanjem korišćenjem RP-HPLC (videti Primer 10).

[0184] Rastvorljivim rHuPH20 proizvedenim i prečišćenim korišćenjem postupaka obezbeđenih ovde takođe se može proceniti prisustvo post-translacionih modifikacija. Takve analize su poznate u tehnici i uključuju analize za merenje glikozilacije, hidroksilacije i karboksilacije. U oglednoj analizi za glikozilaciju, analiza ugljenih hidrata se može izvesti, na primer, sa SDS page analizom rastvorljivog rHuPH20 izloženog hidrazinolizi ili tretmanu endoglikozidazom. Hidrazinoliza oslobađa N- i O-vezane glikane iz glikoproteina inkubacijom sa anhidrovanim hidrazinom, dok oslobađanje endoglikozidaze uključuje PNGazu F, koja oslobađa većinu N-glikana iz glikoproteina. Hidrazinoliza ili tretman endoglikozidazom rastvorljivih rHuPH20 polipeptida generiše skraćeni kraj koji može biti obeležen oznakom fluorofora ili hromofora. Obeleženi rastvorljivi rHuPH20 polipeptidi se mogu analizirati elektroforezom ugljenih hidrata uz pomoć fluorofora (FACE). Fluorescentni obeleživač za glikane takođe se može koristiti za analizu monosaharida, profilisanje ili fingerprinting složenih obrazaca glikozilacije pomoću HPLC. Primeri HPLC postupka uključuju hromatografije hidrofilnih interakcija, elektronska interakcija, razmena jona, hidrofobna interakcija i hromatografija isključene veličine. Ogledne probe glikana uključuju, ali se ne ograničavaju na, 3-(acetilamino)-6-aminoakridin (AA-Ac) i 2-aminobenzojevu kiselinu (2-AA). Grupe ugljenih hidrata se takođe mogu detektovati upotrebom specifičnih antitela koja prepoznaju glikozilovani polipeptid hijaluronidaze.

[0185] Ogledna analiza za merenje ß-hidroksilacije obuhvata HPLC analizu reverzne faze rastvorljivih rHuPH20 polipeptida koji su bili podvrgnuti alkalnoj hidrolizi (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860). Karboksilacija i γ-karboksilacija polipeptida hijaluronidaze može se proceniti korišćenjem masene spektrometrije uz pomoć analize matricom potpomognute laserske desorpcije/jonizacije vreme preleta (MALDI-TOF), kao što je opisano u tehnici (videti, npr. Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, Maum et al. Prot Sci 14:1171-1180).

[0186] Enzimska aktivnost rastvorljivog rHuPH20 u uzorku može se proceniti u bilo kom trenutku tokom ovde opisanih postupaka. U jednom primeru, aktivnost se meri korišćenjem analize mikrozamućenosti (videti npr. Primer 10). Ovo se zasniva na formiranju nerastvorljivog taloga kada se hijaluronska kiselina veže sa serumskim albuminom. Aktivnost se meri inkubacijom rastvorljivog rHuPH20 sa natrijum hijaluronatom (hijaluronskom kiselinom) tokom određenog vremenskog perioda (npr. 10 minuta), a onda taloženjem nesvarenog natrijum hijaluronata uz dodatak zakiseljenog serumskog albumina. Zamućenost dobijenog uzorka se meri na 640 nm nakon dodatnog perioda razvića. Smanjenje zamućenosti koje je rezultat aktivnosti enzima na supstratu natrijum hijaluronata je mera enzimske aktivnosti rastvorljive rHuPH20. U drugom primeru, enzimska aktivnost se meri korišćenjem mikrotitarske analize u kojoj se meri rezidualna biotinilovana hijaluronska kiselina nakon inkubacije sa uzorkom koji sadrži rastvorljivi rHuPH20 (videti npr. Frost and Stem (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, U.S. Patent Publication No. 20050260186). Slobodne karboksilne grupe na ostacima glukuronske kiseline hijaluronske kiseline su biotinilovane, a biotinilovani supstrat hijaluronske kiseline je kovalentno kuplovan sa mikrotitarskom pločom. Posle inkubacije sa uzorkom koji sadrži rastvorljivi rHuPH20, rezidualni supstrat biotinilovane hijaluronske kiseline se detektuje primenom reakcije avidin-peroksidaze i upoređuje sa onim dobijenim posle reakcije sa standardnim hijaluronidazama poznate aktivnosti. Druge analize za merenje enzimske aktivnosti takođe su poznati u tehnici i mogu se koristiti u potupcima ovde (videti npr. Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem.322:257-263).

[0187] Takođe se može pratiti prisustvo bilo koje kontaminacije. Kontaminacija može uključiti, ali se ne ograničava na, mikrobnu kontaminaciju (npr. virusi, bakterije i mikoplazma), kontaminaciju mikrobnim proizvodima (npr. endotoksin) ili druge nečistoće povezane sa postupkom. Može se koristiti bilo koji odgovarajući postupak ili test. Na primer, virusi i bakterije se mogu kultivisati korišćenjem postupaka dobro poznatih u tehnici da bi se utvrdilo da li su prisutni ili ne u uzorku, i ako jesu, u kojim količinama. Mikroskopija se takođe može koristiti za otkrivanje mikrobne kontaminacije. Na primer, uzorak se može proceniti na prisustvo virusa ili bakterija korišćenjem transmisione elektronske mikroskopije (TEM). Detekcija mikoplazme se može izvršiti korišćenjem, na primer, biohemijskih ili molekularnih tehnika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, PCR za amplifikaciju nukleinske kiseline specifične za mikoplazmu, biohemijske analize za otkrivanje enzima mikoplazme i fluorescenciju zasnovanu na ćelijama za otkrivanje antigena ili nukleinske kiseline mikoplazme.

[0188] Prisustvo mikrobnih proizvoda, kao što su bakterijski endotoksini, takođe se može pratiti. Primer pogodne analize za otkrivanje prisustva endotoksina je analiza Limulus Amebocitnog Lizata (LAL). Mogu se koristiti dve vrste LAL analiza: gel ugrušak i fotometrijski (hromogeni i turbometrijski). LAL je vodeni ekstrakt krvnih zrnaca (amebocita) iz potkovice. Endotoksin pokreće kaskadu enzimskih reakcija, koje rezultuju aktiviranjem enzima zgrušavanja. U prisustvu bakterijskih endotoksina, na povišenoj temperaturi, LAL reagens će se zgrušati nakon dodavanja reagensa. Formiranje gel ugruška je proporcionalno koncentraciji endotoksina. U kinetičkoj analizi, proenzim u LAL se aktivira kada je u kontaktu sa endotoksinima koje proizvode gram negativne bakterije. Stopa aktivacije je direktno proporcionalna koncentraciji prisutnog endotoksina. Nivo aktivacije se može meriti kroz sledeću reakciju supstrata koja se meri spektrofotometrijski.

K. PRIMERI

PRIMER 1

Generisanje ćelijske linije koja eksprimira rastvorljivi rHuPH20

[0189] HZ24 plazmid (prikazan u SEQ ID NO: 50) je korišćen za transfekciju jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (videti, na primer, srodnu prijavu br. 10,795,095, 11/065,716 i 11/238,171). HZ24 plazmid ekspresioni vektor rastvorljivog rHuPH20 sadrži osnovu pCI vektora (Promega), DNK koja kodira aminokiseline 1-482 humane PH20 hijaluronidaze (SEQ ID NO:47), unutrašnje ribozomalno ulazno mesto (IRES) iz ECMV virusa (Clontech) i gen koji kodira mišju dihidrofolat reduktaze (DHFR). Osnova pCI vektora takođe uključuje DNK koja kodira gen otpornosti na beta-laktamazu (AmpR), fl poreklo replikacije, region neposrednog pojačivača/promotora Citomegalovirusa (CMV), himerni intron i signal kasne poliadenilacije SV40 (SV40). DNK koja kodira rastvorljivi rHuPH20 konstrukt sadrži NheI mesto i Kozak konsenzus sekvencu pre DNK koja kodira metionin na poziciji 1 aminokiseline nativne signalne sekvence od 35 aminokiselina humanog PH20, i stop kodon koji sledi DNK koji kodira tirozin koji odgovara poziciji 482 aminokiseline humane PH20 hijaluronidaze prikazane u SEQ ID NO:1), nakon čega sledi BamHI restrikciono mesto. Prema tome, konstrukt pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24) dovodi do jedne vrste mRNK koju pokreće CMV promotor koji kodira aminokiseline 1-482 humanog PH20 (prikazanog u SEQ ID NO:3) i aminokiseline 1-186 mišje dihidrofolat reduktaze (prikazane u SEQ ID NO: 51), odvojene unutrašnjim ribosomskim ulaznim mestom (IRES).

[0190] Ne-transfektovane DG44 CHO ćelije koje rastu u GIBCO modifikovanom CD-CHO medijumu za DHFR(-) ćelije, dopunjene sa 4 mM Glutamina i 18 ml/L Plurionic F68/L (Gibco), zasejane su na 0.5 × 10<6>ćelija/ml u balonu za trešenje u pripremi za transfekciju. Ćelije su gajene na 37°C u 5% CO2u vlažnom inkubatoru, tresući se na 120 rpm. Eksponencijalno rastuće ne-transfektovane ćelije DG44 CHO su testirane na vijabilnost pre transfekcije.

[0191] Šezdeset miliona vijabilnih ćelija ne-transficirane DG44 CHO ćelijske kulture je peletirano i resuspendovano do gustine od 2 × 10<7>ćelija u 0.7 mL 2× transfekcionog pufera (2× HeBS: 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCI, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM dekstroze). Svakom alikvotu resuspendovanih ćelija dodato je 0.09 mL (250 µg) linearnog HZ24 plazmida (linearizovanog digestijom preko noći sa Cla I (New England Biolabs), a rastvori ćelija/DNK su prebačeni u 0.4 cm gap BTX (Centronics) kivete za elektroporaciju na sobnoj temperaturi. Izvedena je negativna kontrolna elektroporacija bez plazmidne DNK pomešane sa ćelijama. Mešavine ćelija/plazmida su elektroporisane sa kondenzatorskim pražnjenjem od 330 V i 960 µF ili na 350 V i 960 µF.

[0192] Ćelije su uklonjene iz kiveta nakon elektroporacije i prebačene u 5 mL modifikovanog CD-CHO medijuma za DHFR(-) ćelije, dopunjenog sa 4 mM Glutamina i 18 ml/L Plurionic F68/L (Gibco), i dozvoljeno im je da rastu u udubljenju ploče za kulturu tkiva sa 6 udubljenja bez selekcije tokom 2 dana na 37°C u 5% CO2u vlažnom inkubatoru.

[0193] Dva dana nakon elektroporacije, 0.5 mL medijuma za kulturu tkiva je uklonjeno iz svakog udubljenja i testirano na prisustvo aktivnosti hijaluronidaze, korišćenjem analize mikrozamućenosti opisane u Primeru 9.

[0194] Ćelije iz Transfekcije 2 (350V) su sakupljene iz udubljenja za kulturu tkiva, izbrojane i razblažene na 1 × 10<4>do 2 × 10<4>vijabilnih ćelija po mL. 0.1 mL alikvota ćelijske suspenzije je prebačeno u svako udubljenje od pet, ploča za kulturu tkiva sa 96 udubljenja sa okruglim dnom. Sto mikrolitara CD-CHO medijuma (GIBCO) koji sadrži 4 mM GlutaMAX™-I suplementa (GIBCO™, Invitrogen Corporation) i bez suplemenata hipoksantina i timidina dodato je u udubljenja koja sadrže ćelije (konačna zapremina 0.2 mL).

[0195] Deset klonova je identifikovano iz 5 ploča gajenih bez metotreksata.

Tabela 2. Aktivnost hijaluronidaze identifikovanih klonova

1

[0196] Šest HZ24 klonova je prošireno u kulturi i prebačeno u balone za trešenje kao suspenzije pojedinačnih ćelija. Klonovi 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 i 4D10 su postavljeni u ploče za kulturu tkiva sa 96 udubljenja sa okruglim dnom koristeći dvodimenzionalnu strategiju beskonačnog razblaživanja u kojoj su ćelije razblažene 1:2 niz ploču, i 1:3 preko ploče, počevši od 5000 ćelija u gornjem levom udubljenju. Razblaženi klonovi su gajeni u pozadini od 500 ne-transfektovanih DG44 CHO ćelija po udubljenju, da bi se obezbedili neophodni faktori rasta za početne dane kulture. Deset ploča je napravljeno po subklonu, sa 5 ploča koje sadrže 50 nM metotreksata i 5 ploča bez metotreksata.

[0197] Klon 3D3 je proizveo 24 vizuelna subklona (13 iz tretmana bez metotreksata i 11 iz tretmana sa 50 nM metotreksata. Značajna aktivnost hijaluronidaze je izmerena u supernatantima iz 8 od 24 subklona (>50 Jedinica/mL), a ovih 8 subklonova je prošireno u balonima za kulturu tkiva T-25. Klonovi izolovani iz protokola za tretiranje metotreksatom su prošireni u prisustvu 50 nM metotreksata. Klon 3D35M je dalje proširen u 500 nM metotreksata dovodeći do nastanka klonova koji proizvode više od 1000 jedinica/ml u balonima za trešenje (klon 3D35M; ili Gen1 3D35M). Zatim je pripremljena glavna banka ćelija (MCB) 3D35M ćelija.

PRIMER 2

Određivanje broja kopija regiona nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivi rHuPH20 u 3D35M ćelijama

[0198] Broj kopija regiona nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivi rHuPH20 u 3D35M ćelijama određen je kvantitativnim PCR-om. Ukupna genomska DNK je ekstrahovana iz 3D35M ćelija iz MCB. Pripremljeno je šest nezavisnih razblaženja DNK za analizu u duplikatu, od kojih je svaki sadržao približno 6.6 ng DNK (ekvivalentno približno 100 ćelija).

2

Pripremljene su i negativne kontrole koje ne sadrže šablon, kao i pozitivne kontrole koje sadrže plazmid i DNK ekvivalent od 1000 CHO ćelija (6.6 ng). Reakcije su sastavljene prema TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol (Applied Biosystems) i pokrenute u duplikatu. Standardna kriva je generisana korišćenjem osam razblaženja HZ24 plazmida, što predstavlja opseg od približno 5 × 10<6>do 49 kopija plazmidne DNK. Standard je razblažen u CHO kontrolnoj genomskoj DNK (ekvivalent od 100 ćelija). Reakcije su sastavljene u skladu sa TaqMan™ Univeral PCR Master Mix Protocol (Applied Biosystems) koristeći prednji prajmer HZM3.P 1 i HZM3.P2 reverzni prajmer (prikazani u SEQ ID NOS: 52 i 53, po redu) i HZM3 probe (SEQ ID NO:54), koja je sadržala fluorescentne boje 6FAM (6-karboksifluorescin) i TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin). Reakcije su izvedene u duplikatu korišćenjem sledećih uslova ciklusa: 50°C tokom 2 minuta, 95°C tokom 10 minuta, nakon čega je usledilo 40 ciklusa na 95°C tokom 15 sekundi i 60°C tokom 1 minuta. Takođe je izvedena standardna kvantitativna PCR reakcija za analizu GAPDH kopija za svaki uzorak DNK. Podaci su prikupljeni pomoću softvera ABI Prism 7700™ Sequence Detection System verzije 1.9 (Applied Biosystems).

[0199] Broj kopija gena sa ciljanim delovanjem po ćeliji je izračunat kao odnos ciljanih kopija (rastvorljivi rHuPH20) prema normalizovanim kopijama (GAPDH) za šest razblaženja 3D35M genomske DNK. Statistički test Dixon Q Outlier je primenjen na skup podataka. Utvrđeno je da je broj kopija sHuPH20 regiona u 3D35M ćelijama 317.87 ± 11.64.

PRIMER 3 (KOMPARATIVNI)

Proizvodnja i Prečišćavanje Gent rastvorljivog rHuPH20

A. Postupak u bioreaktoru od 5 L

[0200] Vijalica sa 3D35M je odmrznuta i proširena iz T-25 balona kroz 1 L balon za centrifugiranje u CD CHO (Invitrogen, Carlsbad Kalifornija) sa dodatkom 100 nM Metotreksata i 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen; 200 mM osnovnog rastvora) . Ćelije su prenete iz balona za centrifugiranje u bioreaktor od 5 L (Braun) pri gustini inokulacije od 4 × 10<5>vijabilnih ćelija po ml u medijumu od 5 L. Parametri su bili Zadata temperatura 37°C, pH 7.2 (početna Zadata tačka), sa Zadatom tačkom Rastvorenog Kiseonika 25% i preklapanjem vazduha od 0-100 cc/min. Na 168 satu, dodato je 250 ml Hranljivog medijuma #1 (CD CHO sa 50 g/L Glukoze). Na 216 sati, dodato je 250 ml Hranljivog medijuma #2 (CD CHO sa 50 g/L Glukoze i 10 mM Natrijum Butirata), a na 264 sata je dodato 250 ml Hranljivog medijuma #2. Ovaj postupak je rezultovao konačnom produktivnošću od 1600 Jedinica po ml sa maksimalnom gustinom ćelija od 6 × 10<6>ćelija/ml. Dodavanje natrijum butirata trebalo je da poboljša proizvodnju rastvorljivog rHuPH20 u završnim fazama proizvodnje.

[0201] Kondicionirani medijum iz 3D35M klona je bistren dubinskom filtracijom i tangencijalnom dijafiltracijom protoka u 10 mM Hepes pH 7.0. Rastvorljivi rHuPH20 je zatim prečišćen sekvencijalnom jonsko-izmenjivačkom hromatografijom na Q Sepharose (Pharmacia), hromatografijom hidrofobnih interakcija Phenyl Sepharose (Pharmacia), Amino fenil boronatom (Pro-Medics) i hromatografijom na Hidroksiapatitu (Biorad, Richmond, CA).

[0202] Rastvorljivi rHuPH20 se vezuje za Q Sepharose i eluira sa 400 mM NaCl u istom puferu. Eluat je razblažen sa 2M amonijum sulfatom do konačne koncentracije od 500 mM amonijum sulfata i propušten kroz Phenyl Sepharose (nisku pod) kolonu, nakon čega je usledilo vezivanje pod istim uslovima za fenil boronatnu smolu. Rastvorljivi rHuPH20 je eluiran iz smole Phenyl Sepharose u Hepes pH 6.9 nakon ispiranja na pH 9.0 u 50 mM bicinu bez amonijum sulfata. Eluat je stavljen na keramičku hidroksiapatitnu smolu pri pH 6.9 u 5 mM kalijum fosfat i 1 mM CaCl2i eluiran sa 80 mM kalijum fosfata, pH 7.4 sa 0.1 mM CaCl2.

[0203] Dobijeni rastvorljivi rHuPH20 je posedovao specifičnu aktivnost veću od 65 000 jedinica/mg proteina pomoću analize mikrozamućenosti (videti Primer 9). Prečišćeni rastvorljivi rHuPH20 je eluiran kao pojedinačni pik od 24 do 26 minuta iz Pharmacia 5RPC stiren divinilbenzenske kolone sa gradijentom između 0.1% TFA/H2O i 0.1% TFA/90% acetonitrila/10% H20 i razdvojen kao pojedinačna široka traka 61 kDa SDS elektroforezom koja je smanjila na oštru 51 kDa traku nakon tretmana sa PNGASE-F. Sekvenciranjem N-kraja aminokiselina je otkriveno da je vodeći peptid efikasno uklonjen.

B. Postupak ekspanzije uzvodne ćelijske kulture u 100 L ćelijske kulture u bioreaktoru

[0204] Prošireni postupak je korišćen za odvojeno prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 iz četiri različite vijalice 3D35M ćelije da bi se dobile 4 odvojene serije sHuPH20; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C i HUA0420C. Svaka vijalica je odvojeno proširena i kultivisana kroz bioreaktor od 125 L, a zatim prečišćena hromatografijom na koloni. Uzorci su uzimani tokom postupka da bi se procenili parametri kao što je prinos enzima. Opis postupka koji je obezbeđen u nastavku prikazuje reprezentativne specifikacije za takve stvari kao što su zapremine pokretanja bioreaktora i hranljivg medijuma, gustine transferovanih ćelija i

4

zapremine ispiranja i eluiranja. Tačni brojevi se neznatno razlikuju za svaku seriju, a detaljno su navedeni u Tabelama 3 do 10.

[0205] Četiri vijalice 3D35M ćelija su odmrznute u vodenom kupatilu na 37°C, dodat je CD CHO koji sadrži 100 nM metotreksata i 40 mL/L GlutaMAX™-I i ćelije su centrifugirane. Ćelije su ponovo suspendovane u balonu od 125 mL sa 20 mL svežeg medijuma i stavljene u inkubator na 37°C, 7% CO2. Ćelije su proširene do 40 mL u balonu za trešenje od 125 mL. Kada je gustina ćelija bila 1.5 – 2.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balon za centrifugiranje od 125 mL u zapremini kulture od 100 mL. Balon je inkubiran na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila 1.5 – 2.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balon za centrifugiranje od 250 mL u zapremini kulture od 200 mL, a balon je inkubiran na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila 1.5 – 2.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 1 L u zapremini kulture od 800 mL i inkubirana na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila 1.5 – 2.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 6 L u zapremini kulture od 5 L i inkubirana na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila 1.5 – 2.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 36 L u zapremini kulture od 20 L i inkubirana na 37°C, 7% CO2.

[0206] Reaktor od 125 L je sterilisan parom na 121°C, 20 PSI i dodato je 65 L CD CHO medijuma. Pre upotrebe, reaktor je proveren na kontaminaciju. Kada je gustina ćelija u balonima za centrifugiranje od 36 L bila 1.8 -2.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura ćelija od 20 L je prebačena iz balona za centrifugiranje od 36 L u bioreaktor od 125 L (Braun), što je rezultovalo konačnom zapreminom od 85 L i zasejavanjem gustine od približno 4 × 10<5>ćelija/mL. Parametri su bili podešena temperatura, 37°C; pH: 7.2; Rastvoren kiseonik: 25% ± 10%; Brzina radnog kola 50 rpm; Pritisak posude 3 psi; Raspršivanje vazduha 1 L/min.; Preklapanje vazduha: 1 L/min. Uzorci iz reaktora su svakodnevno uzimani za brojanje ćelija, verifikaciju pH vrednosti, analizu medijuma, proizvodnju i zadržavanje proteina. Hranjivi nutrijenti su dodati tokom rada. Dana 6, dodato je 3.4 L Hranljivog medijuma #1 (CD CHO 50 g/L Glukoze 40 mL/L GlutaMAX™-I) i temperatura kulture je promenjena na 36.5°C. Dana 9, dodato je 3.5 L Hranljivog medijuma #2 (CD CHO 50 g/L Glukoze 40 mL/L GlutaMAX™-I 1.1 g/L Natrijum Butirata) i temperatura kulture je promenjena na 36°C. Dana 11, dodato je 3.7 L Hranljivog medijuma #3 (CD CHO 50 g/L Glukoze 40 mL/L GlutaMAX™-I 1.1 g/L Natrijum Butirata) i temperatura kulture je promenjena na 35.5°C. Reaktor je sakupljen 14 dana ili kada je vijabilnost ćelija pala ispod 50%. Postupak je rezultovao proizvodnjom rastvorljivog rHuPH20 sa enzimskom aktivnošću od 1600 Jedinica/ml sa maksimalnom gustinom ćelija od 8 miliona ćelija/ml. Prilikom sakupljanja, kultura je uzorkovana na mikoplazmu, bioopterećenje, endotoksin i virus in vitro i in vivo, transmisionu elektronsku mikroskopiju (TEM) za virusne čestice i aktivnost enzima.

[0207] Sakupljena ćelijska kultura bioreaktora od sto litara je filtrirana kroz seriju filter kapsula za jednokratnu upotrebu koji imaju polietersulfonski medijum (Sartorius): prvo kroz kapsulu dubine 8.0 µm, kapsulu dubine 0.65 µm, kapsulu od 0.22 µm i na kraju kroz filter od 0.22 µm Sartopore 2000 cm<2>i u sterilnu kesu za skladištenje od 100 L. Kultura je koncentrovana 10× korišćenjem dva TFF sa spiralnim polietersulfonskim 30 kDa MWCO filterima (Millipore), nakon čega je usledila zamena pufera 6× sa 10 mM HEPES, 25 mM Na2SO4, pH 7.0 u finalni filter od 0.22 µm u sterilnu kesi za skladištenje od 20 L. Tabela 3 obezbeđuje podatke praćenja koji se odnose na ćelijsku kulturu, sakupljanje, koncentraciju i korake razmene pufera.

Tabela 3. Praćenje podataka za ćelijsku kulturu, sakupljanje, koncentraciju i korake razmene pufera.

[0208] Pripremljena je Q Sepharose (Pharmacia) kolona za jonsku razmenu (3 L smole, Visina = 20 cm, Prečnik = 14 cm). Isprani uzorci su sakupljeni za analizu određivanja pH vrednosti, provodljivosti i endotoksina (LAL). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone od 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5. Koncentrovano, dijafiltrirano sakupljanje je stavljeno na Q kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Kolona je isprana sa 5 zapremina kolone 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 i 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0. Protein je eluiran sa 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 i filtriran kroz finalni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu.

[0209] Zatim je izvedena hromatografija hidrofobnih interakcija Phenyl-Sepharose (Pharmacia). Pripremljena je kolona Phenyl-Sepharose (PS) (9.1 L smole, Visina = 29 cm, Prečnik = 20 cm). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Proteinski eluat prethodno pomenut je dopunjen sa 2M amonijum sulfatom, 1M kalijum fosfatom i 1M osnovnim rastvorima CaCl2do konačnih koncentracija od 5 mM, 0.5 M i 0.1 mM, po redu. Protein je stavljen na PS kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Dodato je 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i 0.1 mM CaCl2pH 7.0 na 100 cm/h. Protok je propušten kroz finalni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu.

[0210] PS-prečišćeni protein je stavljen na kolonu aminofenil boranata (ProMedics) (6.3 L smole, Visina = 20 cm, Prečnik = 20 cm) koja je bila ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijuma sulfata. Protein je propušten kroz kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h, i kolona je isprana sa 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0. Kolona je zatim isprana sa 20 mM bicina, 100 mM NaCl, pH 9.0 i protein je eluiran sa 50 mM Hepes, 100 mM NaCl pH 6.9 kroz sterilni filter i u sterilnu kesu od 20 L. Eluat je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0211] Kolona sa hidroksiapatitom (HAP) (BioRad) (1.6 L smole, Visina = 10 cm, Prečnik = 14 cm) je ekvilibrisana sa 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2pH 7.0. Isprani uzorci su sakupljeni i testirani na pH, provodljivost i endotoksin (LAL analiza). Protein prečišćen aminofenil boronatom je dopunjen kalijum fosfatom i CaCl2da bi se dobile konačne koncentracije od 5 mM kalijum fosfata i 0.1 mM CaCl2i stavljen je na HAP kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Kolona je isprana sa 5 mM kalijum fosfata pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, zatim 10 mM kalijum fosfata pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2pH. Protein je eluiran sa 70 mM kalijum fosfata pH 7.0 i filtriran kroz filter od 0.22 µm u sterilnu kesu za skladištenje od 5 L. Eluat je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0212] HAP-prečišćen protein je zatim pumpan kroz 20 nM filter za uklanjanje virusa preko rezervoara pod pritiskom. Protein je dodat u rezervoar pod pritiskom i filter DV20 (Pall Corporation), prolazeći kroz Ultipor DV20 Filter sa 20 nm porama (Pall Corporation) u sterilnu kesu za skladištenje od 20 L. Filtrat je testiran na koncentraciju proteina, aktivnost enzima, profilisanje oligosaharida, monosaharida i sijalinske kiseline i nečistoće u vezi sa postupkom. Protein u filtratu je zatim koncentrovan do 1 mg/mL korišćenjem 10 kD granične molekulske mase (MWCO) Sartocon Slice sistema filtracije tangencijalnog protoka (TFF) (Sartorius). Filter je prvo pripremljen ispiranjem sa Hepes/fiziološkim rastvorom (10 mM Hepes, 130 mM NaCl, pH 7.0) i permeat je uzorkovan na pH i provodljivost. Nakon koncentrovanja, koncentrovani protein je uzorkovan i testiran na koncentraciju proteina i aktivnost enzima. Izvršena je razmena pufera od 6× na koncentrovanom proteinu u konačnom puferu: 10 mM Hepes, 130 mM NaCl, pH 7.0, Koncentrovani protein je propušten kroz filter od 0.22 µm u sterilnu kesu za skladištenje od 20 L. Protein je uzorkovan i testiran na koncentraciju proteina, aktivnost enzima, slobodne sulfhidrilne grupe, profilisanje oligosaharida i osmolarnost.

[0213] Tabele 4 do 10 obezbeđuju podatke praćenja koji se odnose na svaki od prethodno opisanih koraka prečišćavanja, za svaku partiju 3D35M ćelija.

Tabela 4. Podaci kolone Q sepharose

Tabela 5. Podaci kolone Phenyl Sepharose

Tabela 6. Podaci kolone sa amino fenil boronatom

Tabela 7. Podaci kolone sa hidroksiapatitom

Tabela 8. Podaci filtracije DV20

Tabela 9. Podaci konačnih koncentracija

1

Tabela 10. Podaci o razmeni pufera u konačnoj formulaciji

[0214] Sterilne vijalice sa zapreminama punjenja od 5 mL i 1 mL su aseptično napunjene prečišćenim i koncentrovanim rastvorljivim proteinom rHuPH20. Protein je propušten kroz filter od 0.22 µm do pumpe koju kontroliše operater koja je korišćena za punjenje vijalica korišćenjem gravimetrijskog očitavanja. Vijalice su zatvorene čepovima i osigurane sa naboranim poklopcima. Zatvorene vijalice su vizuelno pregledane da li ima stranih čestica i zatim obeležene. Nakon obeležavanja, vijalice su brzo zamrznute potapanjem u tečni azot ne duže od 1 minuta i čuvane na ≤15°C (-20 ± 5 °C). Proizvodnja i prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 ovim postupkom dalo je približno 400-700 mg rastvorljivog rHuPH20 sa specifičnom aktivnošću od 96000 jedinica/mg do 144000 jedinica/mg.

PRIMER 4

Proizvodnja Gen2 rastvorljivog rHuPH20

2

[0215] Prethodno opisana ćelijska linija Gen1 3D35M je prilagođena višim nivoima metotreksata za proizvodnju Gen2 klonova. 3D35M ćelije su zasejane iz utvrđenih kultura koje sadrže metotreksat u CD CHO medijum koji sadrži 8 mM GlutaMAX™-I i 1.0 µM metotreksata. Ćelije su prilagođene na viši nivo metotreksata gajenjem i njihovim prolaskom 9 puta tokom perioda od 46 dana u vlažnom inkubatoru na 37°C, 7% CO2. Amplifikovana populacija ćelija je klonirana ograničenim razblaženjem u pločama za kulturu tkiva sa 96 udubljenja koje sadrže medijum sa 2.0 µM metotreksata. Posle otprilike 4 nedelje, klonovi su identifikovani i klon 3E10B je odabran za ekspanziju. Ćelije 3E10B su gajene u CD CHO medijumu koji sadrži 8 mM GlutaMAX™-I i 2.0 µM metotreksata za 20 prolazaka, uz testiranje vijabilnosti ćelija bojenjem tripan plavim i brojanjem sa hemocitometrom, i aktivnosti enzima pomoću testa mikrozamućenosti (opisanog u nastavku u Primeru 9). U glavnoj banci ćelija (MCB) kreirane su ćelijske linije 3E10B i zamrznute i korišćene za naredne studije.

[0216] Amplifikacija ćelijske linije je nastavljena kultivisanjem 3E10B ćelija u CD CHO medijumu koji sadrži 8 mM GlutaMAX™-I i 4.0 µM metotreksata. Posle 12-og prolaska, ćelije su zamrznute u vijalicama kao istraživačka banka ćelija (RCB). Jedna vijalica RCB je odmrznuta i kultivisana u medijumu koji sadrži 8.0 µM metotreksata. Posle 5 dana, koncentracija metotreksata u medijumu je povećana na 16.0 µM, zatim 20.0 µM 18 dana kasnije. Ćelije iz 8-og prolaska u medijumu koji sadrži 20.0 µM metotreksata su klonirane ograničenim razblaženjem u pločama za kulturu tkiva sa 96 udubljenja koje sadrže CD CHO medijum koji sadrži 4 mM GlutaMAX™-I i 20.0 µM metotreksata. Klonovi 1B3, 2B2 i 5C1 su identifikovani 5-6 nedelja kasnije. Ćelije 3D35M iz 9-og prolaza su takođe klonirane graničnim razblaženjem u pločama za kulturu tkiva sa 96 udubljenja sa CD CHO medijumom koji sadrži 8 mM GlutaMAX™-I i 20.0 µM metotreksata, a identifikovani su klonovi 1G11, 2E10 i 2G10.

[0217] Ćelijske kulture svake od 1B3, 2B2, 5C1, 1G11, 2E10 i 2G10 su zasejane na gustini od 4 × 10<5>ćelija/mL u zapremini od 50 mL u balone za trešenje od 250 mL. Kulture su ostavljene da rastu i opadaju bez dodatne hrane tokom 10-14 dana da bi se odredila stopa rasta i produktivnost ćelija. Uzorci su uzimani periodično i ispitivani na aktivnost hijaluronidaze (Tabele 11 i 12).

Tabela 11. Aktivnost hijaluronidaze 1B3, 2B2 i 5C1 ćelija

Tabela 12. Aktivnost hijaluronidaze 1B3, 2B2 i 2E10 ćelija

[0218] Četiri ćelijske linije (2B2, 2G10, 1G11 i 2E10) su upoređene u studiji u kojoj su sve zasejane na gustini od 4 × 10<5>ćelija/mL u zapremini od 50 mL u balonu za trešenje od 250 mL. Svi su dobijali 10% (zapr./zapr.) hrane 8. dana i 5% hrane sa hranljivim medijumima koja sadrži CD CHO medijum sa dodatkom 50 g/L glukoze, 40 g/L ekstrakta kvasca i 1.1 g/L natrijum butirata. Ćelije su sakupljene 15. dana. Uzorci su uzimani periodično i ispitivani na enzimsku aktivnost rastvorljivog rHuPH20 (Tabela 13).

4

Tabela 13. Aktivnost hijaluronidaze 2E10, 1G11, 2G10 i 2B2 ćelija

[0219] I u šaržnim i u dolivnim uslovima, kultura 2B2 ćelija je pokazala veću enzimsku aktivnost, iako su druge ćelije (npr.2G10 ćelije) takođe pokazale dobru produktivnost enzima, stoga je ćelijska linija 2B2 odabrana za ekspanziju u medijumu koji sadrži 20.0 µM metotreksata. Posle 11-tog prolaska, 2B2 ćelije su zamrznute u vijalicama kao istraživačka banka ćelija (RCB).

PRIMER 5

Enzimska aktivnost rastvorljivog rHuPH20 proizvedenog u 3E10B i 2B2 ćelijama

[0220] Ispitana je enzimska aktivnost rastvorljivg rHuPH20 koji je proizveden u 3E10B i 2B2 ćelijama korišćenjem analize mikrozamućenosti (Primer 9). Zamrznute vijalice sa 3E10B i 2B2 bankama ćelija su odmrznute i ćelije su kultivisane odvojeno za dva prolaza u medijumu za rast (CD CHO medijum sa 8 mM GlutaMAX™-I i 2.0 µM metotreksata za ćelije 3E10B, ili 20.0 µM metotreksata za ćelije 2B2) na 37°C, 6% CO2u vlažnom inkubatoru. Ćelije su inokulisane u 20 mL medijuma za rast u erlenmajerovim balonima od 125 mL (Corning) na 5 × 10<5>ćelija/mL i gajene 8 dana na 37°C, 6% CO2u vlažnom inkubatoru sa platformom za mešanje koja se rotira na približno 100 rpm. Osmog i 10-og dana, kulture su dobile 5% zapr./zapr. hranljivog medijuma koji je sadržao CD CHO medijum dopunjen sa 50 g/L glukoze, 50 g/L ekstrakta Kvasca i 2.2 g/L (20 mM) natrijum butirata da bi se započela faza proizvodnje. Kulture su uzorkovane tokom faze proizvodnje 8. dana (190 sati), 10. dana (240 sati), 14. dana (332 sata), 15. dana (258 sati), 16. dana (382 sata) i 18. dana (427 sati) , i dozvoljeno je da vijabilnost padne na nulu. Uzorci su zatim analizirani na aktivnost hijaluronidaze.

[0221] Tabele 14 i 15 prikazuju vijabilnost (gustina živih ćelija (VCD) i procenat vijabilnosti) i aktivnost (jedinice/balon) ćelija 3E10B i 2B2 u svakoj vremenskoj tački. Enzimska aktivnost rastvorljivog rHuPH20 koju proizvode ćelije 2B2 bila je konstantno veća od one koju proizvode ćelije 3E10B. Na primer, 8. dana, enzimska aktivnost rastvorljivog rHuPH20 koji proizvode ćelije 2B2 bila je 69% veća od one koju proizvode ćelije 3E10B (2484 jedinice/mL u poređenju sa 1469 jedinica/mL). Sličan trend je primećen tokom cele faze proizvodnje. Vijabilnost ćelijskih kultura je opala sličnom brzinom. Kada je izračunata stopa proizvodnje ćelija, primećeno je da ćelije 3E10B proizvode 0.23 pikograma rastvorljivog rHuPH20 po ćeliji dnevno (pcd) 8. dana i 0.38 pcd 15. dana. Poređenja radi, 2B2 ćelije proizvode 0.46 pikograma rastvorljivog rHuPH20 pcd 8. dana i 0.69 pcd 15. dana, što je bilo 100% i 82% više od proizvodnje 3E10B ćelija 8. i 15. dana, po redu. Glavna banka ćelija (MCB) od 2B2 ćelija je zatim pripremljena za naredne studije.

Tabela 14. Vijabilnost i aktivnost Klona 3E10B

Tabela 15. Vijabilnost i aktivnost Klona 2B2

PRIMER 6

Genetička stabilnost testiranih 2B2 ćelija

A. Određivanje broja kopija regiona nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivi rHuPH20 u 2B2 ćelijama

[0222] Broj kopija regiona nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivi rHuPH20 u 2B2 ćelijama je određen PCR-om. Ukupna genomska DNK je ekstrahovana iz 2 × 10<7>2B2 ćelija iz MCB pomoću QIAamp DNeasy kita (Qiagen). Genomska DNK je takođe ekstrahovana iz DG-44 CHO ćelija kao negativna kontrola. Čistoća ekstrahovane DNK je proverena elektroforezom na agaroznom gelu i UV spektrofotometrijom. Da bi se generisali fragmenti DNK (u odnosu na DNK visoke molekulske težine), genomska DNK je rezana sonikacijom. Ovim je obezbeđeno preciznije pipetiranje i pristupačnost šablona. Šest nezavisnih razblaženja genomske DNK (do količina razblaženja ekvivalentnih približno 1000 ćelija/µl) iz 2B2 i DG-44 ćelija je pripremljeno i analizirano u duplikatu u dve analize; ciljana analiza, kojom se ciljano i amplificirala sekvenca specifična za region nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivu rHuPH20 plazmidne DNK, i endogena kontrola, kojom se ciljano i amplificirala GAPDH sekvenca. Endogena kontrola je korišćena za normalizaciju rezultata. Ciljana analiza je uključivala standardnu krivu generisanu iz serijskog razblaženja poznatih količina HZ24 plazmida pomešanog u DG-44 CHO genomsku DNK. Endogena kontrola je uključivala standardnu krivu generisanu iz serijskih razblaženja DG-44 CHO genomske DNK pomešane sa HZ24 plazmidnom DNK. Pretpostavlja se da je veličina genoma sisara 3 × 10<9>baznih parova. Svaka analiza je uključivala negativnu kontrolu (bez šablona) i pozitivnu kontrolu (HZ24 plazmidna DNK za ciljanu analizu i DNK ćelije domaćina za analizu normalizacije endogene kontrole). Reakcije su pripremljene korišćenjem HZM3.Pl prednjeg prajmera i HZM3.P2 reverznog prajmera (prikazani u SEQ ID NOS: 52 i 53, po redu) i HZM3 probe (SEQ ID NO: 54), koji je sadržao fluorescentne boje 6FAM (6-karboksifluorescin) i TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin). Uzorci su amplifikovani korišćenjem Applied Biosystems Prism<®>7900 sistema za detekciju sekvenci sa standardnim uslovima ciklusa (50 °C tokom 2 minuta, 95 °C 10 minuta, 95 °C 15 sekundi i 60 °C tokom 1 min tokom 40 ciklusa).

[0223] Broj kopija ciljanog gena po ćeliji je izračunat kao odnos ciljanih kopija prema normalizovanim kopijama (GAPDH) za šest razblaženja 2B2 genomske DNK. Statistički test Dixon Q Outlier je primenjen na skup podataka. Utvrđeno je da je broj kopija regiona nukleinske kiseline koji kodira rastvorljivi rHuPH20 plazmida u 2B2 ćelijama 206.61 ± 8.35.

B. Analiza mRNK sekvence

[0224] Određena je sekvenca iRNK PH20 generisane iz HZ24 plazmida u 2B2 ćelijama. RNK je ekstrahovana iz 2 × 10<7>2B2 ćelija iz MCB koristeći RNeasy Mini Kit (Qiagen). Uzorak je tretiran sa DNazom I da bi se uklonila kontaminirajuća DNK, a čistoća RNK je verifikovana elektroforezom na agaroznom gelu i UV spektrofotometrijom. Reakcija reverzne transkripcije korišćenjem SuperScript™ reverzne transkriptaze (Invitrogen) i kontrolna reakcija bez reverzne transkriptaze izvedene su korišćenjem ekstrahovane RNK i oligo d(t) i nasumičnih prajmera. Dobijeni cDNK proizvodi su zatim korišćeni kao šabloni u PCR amplifikacijama. Korišćena su dva različita seta parova prajmera; AP01/AP03 i AP10/AP12. AP01/AP03 je dizajniran da amplificira region od 1719 baznih parova, dok je par prajmera AP10/AP12 dizajniran da amplificira veći region (1811 baznih parova) da bi se dobila sekvenca obrnutog lanca 3’ kraja. Tabela 5 prikazuje sekvence prajmera. Svaka PCR reakcija je uključivala kontrole sa jednim prajmerom, negativnu kontrolu koja koristi kontrolu bez reverzne transkriptaze (prethodno opisanu) kao šablon, i pozitivnu kontrolu sa kontrolnim prajmerima i kontrolnim šablonom. Proizvodi amplifikacije su vizuelizovani elektroforezom na agaroznom gelu i potvrđeno je da su očekivane veličine, a zatim su prečišćeni da bi se uklonio višak prajmera i dNTPs ekstrakcijom gela ili EXOSAP-om (USB).

[0225] Prečišćeni proizvodi su sekvencionirani korišćenjem BigDye<®>Terminator v1.1 kompleta za ciklusno sekvenciranje (Applied Biosystems) i prajmera prikazanih u Tabeli 16. Podaci o sekvenci su sastavljeni i izvedena konsenzus sekvenca (SEQ ID NO:55) je upoređena sa referentnom sekvencom pomoću Sequencher softvera verzije 4.1.2 (Gene Code Corporation). Ukupno je generisano 1449 baznih parova sekvenci u podacima. Utvrđeno je da je sekvenca identična referentnoj sekvenci (SEQ ID NO:47) osim razlike jednog baznog para na poziciji 1131, za koju je uočeno da je timidin (T) umesto očekivanog citozina I. Ovo je tiha mutacija., bez uticaja na sekvencu aminokiselina.

Tabela 16. Prajmeri za PCR amplifikaciju i sekvencioniranje

C. Southern blot analiza 2B2 ćelija

[0226] Urađena je Southern blot analiza na 2B2 ćelijama da bi se dobila strukturna mapa. Ukupna DNK je ekstrahovana iz 1 × 10<7>2B2 ćelija i 1 × 10<7>kontrolnih DG-44 ćelija korišćenjem Maxwell 16<®>sistema (Promega). Ekstrahovana DNK i kontrolni konstrukt plazmida HZ24 su procenjeni na čistoću elektroforezom na agaroznom gelu. DNK iz 2B2 ćelija, DG-44 ćelija i HZ24 plazmidne kontrole su digestirani sa Spe I, Xba I i dvostrukim digestijom koristeći BamH I/Hind III. Drugi BamH I/Hind digest je izveden na kontroli HZ24 plazmida i približno 1.4 kb je prečišćeno ekstrakcijom gela i radioaktivno je obeleženo saα-<32>P da bi se stvorila obeležena proba. Otprilike 10 µg digestirane 2B2 DNK i DG-44 DNK, i 10 µg DG-44 DNK sa 250 pg HZ24 plazmidne DNK, podvrgnuto je elektroforezi na agaroznom gelu. Slika je napravljena na gelu nakon elektroforeze, a zatim je izvršen Southern blot transfer. Najlonska membrana je hibridizovana sa obeleženom probom, zatim isprana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, a zatim dva puta na 55°C tokom 30 minuta. Početni autoradiograf je izložen 24 sata i vizuelno pregledan. Utvrđeno je da je potrebno duže izlaganje, pa je drugi autoradiograf izložen 3 dana za tamnije izlaganje hibridizovanih traka. Nakon razvijanja filma, veličine traka su određene pomoću AlphaImager<®>(Alpha Innotech).

[0227] Nisu primećene hibridne trake za DG-44 negativnu kontrolu, a pojedinačne hibridizujuće trake očekivane veličine su primećene u HZ24 digestima (BamH I/Hind III digest: ~1.4 kb; Spe I digest: ~6.6 kb; Xba I digest: ~6.5 kb). Postojala je jedna glavna hibridizujuća traka od ~7.7 kb i četiri manje hibridne trake (-13.9, ~6.6, ~5.7 i ~4.6 kb) primećene korišćenjem 2B2 DNK digestirane sa Spe I, jedna glavna hibridizujuća traka od ~5.0 kb i dve manje hibridizujuće trake (-13.9 i ~6.5 kb) primećene korišćenjem 2B2 DNK digestirane sa Xba I, i jedna pojedinačna hibridizujuća traka od ~1.4 kb primećena korišćenjem 2B2 DNK digestirane sa BamH I/Hind III. Prisustvo jedne hibridizirajuće trake od ~1.4 kb u BamH I/Hind III ukazuje na to da nije bilo velikih insercija ili delecija u okviru ispitivanog regiona. Rezultati pojedinačnih Xba I i Spe I digesta ukazuju da postoji više mesta integracije HZ24 plazmida u genomu ako su ćelije 2B2.

PRIMER 7

Proizvodnja Gen2 rastvorljivog rHuPH20 u ćelijskoj kulturi bioreaktora od 30 L

[0228] Rastvorljivi rHuPH20 je proizveden i prečišćen iz 2B2 ćelija korišćenjem bioreaktora od 36 L (30 L zapremine kulture) da bi se odredili optimalni postupci za povećanje bioreaktora do 400 L (300 L zapremine kulture). Četiri odvojena rada bioreaktora od 36 L su detaljno opisana u nastavku u odeljcima A do D.

A. Proizvodnja i karakterizacija rastvorljivog rHuPH20 partije 056-099 i 056-100

[0229] Vijalica sa 2B2 (1 × 10<7>ćelija) je odmrznuta i kultivisana na 37°C, 7% CO2za 8 prolaza u CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija) sa dodatkom 20 µM metotreksata i 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen), nakon čega je proširena na 600 mL. Nedelju dana kasnije, kultura je proširena na 5L u medijumu CD CHO sa dodatkom 40 mL/L GlutaMAX™-I i bez metotreksata. Bioreaktor od 36 L koji sadrži 25 L CD CHO medijuma sa dodatkom 1 L GlutaMAX™-I i 30 mL gentamicin sulfata je inokulisan sa 5 L kulturom na početnoj gustini zasejavanja od 3.6 × 10<5>ćelija/mL. Zadata tačka mešanja bioreaktora je podešena na 75 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7.15; rastvoreni kiseonik: 30%. Bioreaktor je primio filtrirani preklopljeni vazduh i raspršen vazduh/kiseonik/CO2, što je kontrolisano od strane Applikon kontrolora.

[0230] Hranljive materije su stavljane u kulturu 7 puta tokom rada bioreaktora, na 161, 184, 237, 256, 280, 304 i 328 sati nakon inokulacije. Hranljivi medijum je filtriran u bioreaktoru preko peristaltičke pumpe. Sadržaj svakog hranljivog medijuma i hranljivih parametara bioreaktora tokom njegovog rada obezbeđeni su u Tabelama 17 i 18, po redu.

Tabela 17. Formulacije hranljivih medijuma

Tabela 18. Parametri bioreaktora

1

[0231] Sakupljena je ćelijska kultura bioreaktora i filtrirana kroz sistem koji sadrži seriju filter kapsula (Sartorius) sa porama veličine od 8 µm, 0.65 µm, 0.45 µm i 0.22 µm, po redu. Sakupljanje je obavljeno pomoću peristaltičke pumpe i završeno je za približno 5 sati, dajući približno 32 L tečnosti sakupljene ćelijske kulture (HCCF). HCCF je dopunjen sa EDTA i Tris do konačnih koncentracija svake od 10 mM, pH 7.6. HCCF je zatim skladišten na 2-8°C pre nego što je koncentrovan i podvrgnut razmeni pufera.

2

[0232] Da bi se protein koncentrovao, 2.5 ft<2>Millipore spiralno namotani kertridž sa 30 kDa MWCO je prvo ekvilibrisan u 150 mM NaCl, 10 mM Hepes, 10 mM EDTA, pH 7.5. Petnaest L od HCCF je koncentrovano 15× do 1 L. Koncentrat je bio 10× zamenjen puferima sa 150 mM NaCl, 10 mM Hepes, 10 mM EDTA, pH 7.5 puferom, a retentat je filtriran kroz kapsulu od 0.2 µm L u kesicu za skladište od 2 L vreću, za konačnu zapreminu od 1.1 L. Retentat je zatim skladišten na 2-8°C.

[0233] Koncentrovani i puferski zamenjeni rastvor proteina je zatim prečišćen hromatografijom na koloni kroz Q Sepharose kolonu, Phenyl Sepharoze kolonu, Amino Fenil kolonu i kolonu sa hidroksiapatitom. Jedinice hijaluronidaze u rastvoru proteina pre i posle svakog koraka hromatografije su procenjene i korišćene za određivanje prinosa za svaki korak.

[0234] Ukratko, Q sepharose kolona sa slojem kolone od 1.1 L je dezinfikovana sa 2.8 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je očišćena sa 2.5 L 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0, isprana u 4.1 L sterilne vode za ubrizgavanje (SWFI) i ekvilibrisana sa 2.5 L 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0. Protein sa razmenjenim puferima (1 L na 170, 160 jedinica/mL) je stavljen na kolonu. Protok je bio 1.0 L na 479 jedinica/mL, što ukazuje da se skoro sav proizvod vezan za smolu. Kolona je isprana sa 4 L 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0, i 4.2 L 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0. Proizvod je zatim eluiran u 3.0 L 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0, dajući 3 L na 49940 jedinica/mL, i filtriran kroz filter od 0.2 µm.

[0235] Phenyl Sepharose kolona sa 2.1 L slojem kolone dezinfikovana je sa 4.8 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je isprana sa 5.0 L SWFI i očišćena sa 4.6 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i ponovo isprana sa 6.8 L SWFI. Kolona je zatim ekvilibrisana u 5.5 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata. U eluat iz Q Sepharose kolone, dodato je 10.3 mL 1 M monobaznog kalijum fosfata, 10.3 mL 1 M dvobaznog kalijum fosfata i 0.42 mL 1 mL CaCl2. Ovo je zatim stavljeno na kolonu i sakupljen je protok i pokretački pufer (1 L 5 mM kalijum fosfat, 0.5 mM amonijum sulfat), dajući 7.4 L na 20030 jedinica/mL. Proizvod je filtriran kroz filter od 0.2 µm.

[0236] Kolona sa amino fenil boranatom sa slojem kolone od 1.8 L je dezinfikovana sa 4.5 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je isprana sa 3.9 L SWFI, očišćena sa 4.2 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i ponovo isprana sa 4.0 L SWFI. Kolona je zatim ekvilibrisana sa 7.5 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata. Protok kroz materijal iz Phenyl Sepharose kolone je stavljen u kolonu amino fenil boronata nakon što je dopunjen sa amonijum sulfatom do konačne koncentracije od 0.5 M. Kolona je isprana sa 6.5 L 5 mM kalijum fosfatom pH 7.0, zatim sa 7.8 L 20 mM bicina, pH 9.0 zatim sa 9.0 L 20 mM bicina, 100 mM NaCl, pH 9.0. Proizvod je eluiran sa 4.8 L 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0, što je rezultovalo sa 4.8 L na 22940 jedinica/mL, i filtrirano kroz filter od 0.2 µm.

[0237] Kolona sa hidroksiapatitom sa slojem kolone od 0.8 L je dezinfikovana sa 2.7 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Kolona je neutralizovana sa 2.1 L 200 mM kalijum fosfata, pH 7.0, a zatim je ekvilibrisana u 2.2 L 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl. U eluat iz kolone sa amino fenil boranatom dodato je 9.1 mL 1 M monobaznog kalijum fosfata, 9.1 mL 1 M dvobaznog kalijum fosfata i 0.452 mL 1 mL CaCl2. Ovo je zatim stavljeno na kolonu i protok je bio 4.5 L na 10 jedinica/mL, što ukazuje na dobro vezivanje rastvorljivog HuPH20. Kolona je isprana sa 3.3 L 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0, zatim sa 2.9 L 10 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0. Proizvod je eluiran sa 1.0 L 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0, što je rezultovalo 1 L na 130000 jedinica/mL, i filtrirano kroz filter od 0.2 µm.

[0238] Prečišćeni proizvod se koncentrovao koristeći 2.5 ft<2>Millipore 30 kDa MWCO kertridž koji je prvo ekvilibrisan u 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0. Proizvod je koncentrovan 74 mL, a pufer je zamenjen 10× sa 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 puferom, a zatim filtriran kroz filter od 0.2 µm. Izvršena su merenja A280i pokazala su da je koncentracija proteina bila 11.3 mg/mL. Dodato je dodatnih 9.6 mL 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 pufera da bi se koncentracija proteina dovela do 10 mg/mL (Partija 056-99). Deset mL rastvora proteina od 10 mg/mL je razblaženo u puferu da bi se dobio rastvor od 1 mg/mL (Partija 056-100. Oba rastvora su filtrirana kroz filter od 0.2 µm.

[0239] Staklene vijalice od 10 mL i 1 mL su napunjene formulisanim proizvodom, od čega je ukupan prinos 761 mg rastvorljivog rHuPH20. Vijalice su zamrznute na -80°C, a zatim prebačene na -20°C radi skladištenja. Partije 056-99 i 056-100 su zatim okarakterisane u pogledu aktivnosti i čistoće. Partije 056-99 i 056-100 su pokazale aktivnost enzima od 1 350 786 jedinica/mL i 129982 jedinica/mL i specifičnu aktivnost od 130 00 jedinica/mg i 124 00 jedinica/mg (izračunato na osnovu aktivnosti enzima i koncentracije proteina). Čistoća uzoraka rastvorljivih rHuPH20 određena je pomoću SDS-PAGE, IsoElectric Focusing (IEF), reverzno-fazne tečne hromatografije pod visokim pritiskom (RP-HPLC), hromatografije isključene veličine (SEC) i anjon-izmenjivačke hromatografije. Kako je utvrđeno pomoću RP-HPLC, uočeno je da je čistoća dve Partije približno 95%. Kako je utvrđeno pomoću SEC, primećeno je da je čistoća dve Partije približno 99%. Pokazano je da su nivoi endotoksina

4

≤0.5 EU/mL i 0.1 EU/mL za partije 056-99 i 056-100, po redu. Osmolarnost je izmerena na 271 mOsm/kg i 291 mOsm/kg za partije 056-99 i 056-100, po redu.

B. Modifikacije za povećanje proizvodnje rastvorljivog rHuPH20: šaržne 2B2-20K.5 u bioreaktoru

[0240] Izvršene su modifikacije postupka prethodno opisanog u odeljku A. Ove modifikacije su imale za cilj da povećaju prinos proizvoda i poboljšaju efikasnost i prilagodljivost proizvodnji. Koraci proizvodnje opisani u nastavku uključuju odmrzavanje zamrznutih ćelija iz banke istraživačkih ćelija, ekspanziju ćelija u kontinuiranoj kulturi, rad dolivnog sistema bioreaktora, sakupljanje i bistrenje tečnosti ćelijske kulture i koncentrovanje i razmenu pufera masivnog proizvoda. Modifikacije uključuju, na primer, dodavanje rekombinantnog humanog insulina u medijum bioreaktora da bi se povećala stopa rasta i nivoi ekspresije proizvoda u ćelijama. Takođe, broj hranjenja je smanjen sa 7 na 5. Takođe su napravljene i druge modifikacije prethodno opisanih postupaka.

[0241] Vijalica sa 2B2 (1 × 10<7>ćelija) je odmrznuta i kultivisana u CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija) sa dodatkom 20 µM metotreksata i 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen), nakon čega je proširena na 100 mL, 450 ml zatim do 4.5 L u CD CHO medijumu sa dodatkom 40 mL/L GlutaMAX™-I i bez metotreksata. Bioreaktor od 36 L koji je sadržao 20 L CD CHO medijuma sa dodatkom 800 L GlutaMAX™-I, 30 mL gentamicin sulfata i 100 mg rekombinantnog humanog insulina je inokulisan sa 3.6 L 2B2 kulture pri početnoj gustini zasejavanja od 4.3 × 10<5>ćelija/mL. Zadata tačka mešanja bioreaktora je podešena na 80 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7.15; rastvoreni kiseonik: 25%. Bioreaktor je primio filtrirani preklopljeni vazduh i raspršen vazduh/kiseonik/CO2, što je kontrolisano od strane Applikon kontrolora.

[0242] Hranljive materije su stavljane u kulturu 5 puta tokom 13 dana rada bioreaktora, na 117, 143, 196, 235 i 283 sata nakon inokulacije. Hranljivi medijum je filtriran u bioreaktoru preko peristaltičke pumpe. Sadržaj svakog hranljivog medijuma i hranljivih parametara bioreaktora tokom rada obezbeđeni su u Tabelama 19 i 20, po redu.

Tabela 19. Formulacije hranljivih medijuma

Tabela 20. Parametri bioreaktora.

[0243] Bioreaktor je sakupljen i filtriran kroz sistem koji je sadržao seriju Millipore Pod filtera D0HC (0.5 m<2>) i A1HC naslaga, koji sadrže slojeve dijatomejske zemlje graduisanih pora, nakon čega je usledila konačna filtracija kroz filter kapsula (Sartorius Sartobran 300) u kesi za skladištenje od 50 L. Sakupljanje je obavljeno pomoću peristaltičke pumpe i završeno je za otprilike 2 sata, dajući približno 30 L tečnosti sakupljene ćelijske kulture (HCCF). Dvadeset osam L HCCF je dopunjeno sa EDTA i Tris do konačnih koncentracija od 10 mM svaka, i pH 7.5. Preostalih 21 HCCF je ostavljeno bez Tris/EDTA, da bi se procenio efekat dodavanja Tris/EDTA na korak koncentrovanja/razmene pufera. HCCF je zatim skladišten na 2-8°C pre nego što je koncentrovan i podvrgnut razmeni pufera.

[0244] Da bi se protein koncentrovao, 0.1 m<2>Millipore Pellicon 2 biomax A ekran kaseta sa 30 kDa MWCO je prvo ekvilibrisana u 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5. 2L HCCF sa i bez Tris/EDTA je koncentrovano 10× i pufer je zamenjen 10× sa 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 puferom. Nivoi proteina su mereni apsorbancijom na A260. Preostali HCCF (približno 26.5 L) je zatim koncentrovan i podvrgnut razmeni pufera. Dve 0.1 m<2>Millipore Pellicon 2 biomax A ekran kasete sa 30 kDa MWCO su sastavljene u TFF sistemu i ekvilibrisane u 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5. HCCF je koncentrovan približno 10× do 2.5 L, a pufer je zamenjen 10× sa 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5. Retentat je filtriran kroz vakuum filter od 0.2 µm u kese za skladištenje od 1 L i 500 mL, za konačnu zapreminu od 2.6 L. Retentat je zatim skladišten na 2-8°C. Uzorci uzeti tokom postupka koncentrovanja i razmene pufera analizirani su pomoću RP-HPLC da bi se odredio efekat dodavanja Tris/EDTA uzorku. Primećeno je da je dodavanje Tris/EDTA olakšalo efikasnije korake tokom postupka.

C. Proizvodnja i karakterizacija rastvorljivog rHuPH20 Partije 056-122 i 056-123 (šaržne 2B2-20K.6 u bioreaktoru).

[0245] Modifikacije prethodno opisane u odeljku C su ugrađene u korake proizvodnje da bi se proizvele i prečistile dve partije rastvorljivog rHuPH20; Partije 056-122 i 056-123. Postupak opisan u nastavku uključuje odmrzavanje zamrznutih ćelija iz istraživačke banke ćelija HZ24-2B2; ekspanziju ćelija u kontinuiranoj kulturi; rad 36 L sistema dolivnog bioreaktora na skali od 30 L; uklanjanje ćelija, bistrenje i razmenu pufera masivnog proizvoda; 4-stepenu hromatografiju kolone; i formulaciju, punjenje i završne radove.

[0246] Vijalica sa 2B2 (1 × 10<7>ćelija) je odmrznuta i kultivisana na 37°C, 7% CO2u CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija) sa dodatkom 20 µM metotreksata i 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen), nakon čega je proširena na 400 mL, zatim 4.4 L u CD CHO medijumu sa dodatkom 40 mL/L GlutaMAX™-I i bez metotreksata. Bioreaktor od 36 L (Bellco 1964 serija) koji sadrži 20 L CD CHO medijuma sa dodatkom 800 L GlutaMAX™-I, 100 mg rekombinantnog humanog insulina i 30 mL gentamicin sulfata inokulisan je sa 4 L kulture na početnoj gustini zasejavanja od 4.9 × 10<5>ćelija/mL. Zadata tačka mešanja bioreaktora je podešena na 80 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7.15; rastvoreni kiseonik: 25%. Bioreaktor je primio filtrirani preklopljeni vazduh i raspršen vazduh/kiseonik/CO2, što je kontrolisano od strane Applikon ADI 1030 kontrolora.

[0247] Nutritivne materije su dodate u kulturu 4 puta tokom 13 dana rada bioreaktora, na 127, 163, 208 i sati nakon inokulacije. Hranljivi medijum je filtriran u bioreaktoru preko peristaltičke pumpe. Podešena temperatura bioreaktora smanjena je sa 37°C na 36.5°C na dan 7, na 36.0°C na dan 9 i konačno na 35.5°C na dan 11. Sadržaj svakog hranljivog medijuma i hranljivi parametri bioreaktora tokom rada su obezbeđeni u Tabelama 21 i 22, po redu.

Tabela 21. Formulacije hranljivih medijuma

Tabela 22. Parametri bioreaktora.

[0248] Bioreaktor je sakupljen i filtriran kroz sistem koji je sadržao seriju Millipore Pod filtera D0HC (0.5 m<2>) i A1HC naslaga (0.1 m<2>), koji sadrže slojeve dijatomejske zemlje graduisanih pora, nakon čega je usledila konačna filtracija kroz filter kapsula (Sartorius Sartobran 300) u kesi za skladištenje od 20 L. Sakupljanje je obavljeno pomoću peristaltičke pumpe i završeno je za otprilike 1 sat, dajući približno 34 L tečnosti sakupljene ćelijske kulture (HCCF). Ovo uključuje 29 L zapremine bioreaktora i otprilike 5 L PBS pokretačkog pufera. HCCF je dopunjena sa EDTA i Tris do konačnih koncentracija od 10 mM svaka, i konačni pH je 7.5. HCCF je zatim skladišten na 2-8°C pre nego što je koncentrovan i podvrgnut razmeni pufera.

[0249] Da bi se protein koncentrovao, 7.0 ft<2>Sartorius Sartocon 2 kaseta sa poprečnim protokom sa 30 kDa MWCO je prvo ekvilibrisana u 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5.

34L HCCF je koncentrovano 10× do 3L i pufer je zamenjen 10× sa 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 puferom. Retentat je filtriran kroz filter kapsula od 0.2 µm u kese za skladištenje od 5 L za konačnu zapreminu od 3.0 L. Retentat je zatim skladišten na 2-8°C.

[0250] Koncentrovani i puferski zamenjeni rastvor proteina je zatim prečišćen hromatografijom na koloni kroz Q Sepharose kolonu, Phenyl Sepharose kolonu, kolonu sa amino fenilom i kolonu sa hidroksiapatitom. Jedinice hijaluronidaze u rastvoru proteina pre i posle svakog koraka hromatografije su procenjene i korišćene za određivanje prinosa za svaki korak.

[0251] Ukratko, Q sepharose kolona sa slojem kolone od 1.1 L, prečnika 7 cm, visine 28 cm je dezinfikovana sa 2.1 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je očišćena sa 2.5 L 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0, isprana u 4.5 L sterilne vode za ubrizgavanje (SWFI) i ekvilibrisana sa 4.3 L 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0. Protein sa razmenjenim puferima (3 L na 94 960 jedinica hijaluronidaze/mL) je stavljen na kolonu. Protok i prvo ispiranje je bilo 5830 mL na 75 jedinica hijaluronidaze/mL, što ukazuje da se skoro sav proizvod (99.8%) vezao za smolu. Kolona je isprana sa 4.2 L 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0, i 4.6 L 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0. Proizvod je zatim eluiran u 2.9 L 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0, dajući 2880 mL na 96080 jedinica/mL, i filtriran kroz filter od 0.2 µm.

[0252] Phenyl Sepharose kolona sa 2.2 L slojem kolone (visina 28 cm, prečnik 10 cm) dezinfikovana je sa 5.0 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je isprana sa 4.5 L SWFI i očišćena sa 4.6 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i ponovo isprana sa 6.8 L SWFI. Kolona je zatim ekvilibrisana u 4.6 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 mM amonijum sulfata. U eluat iz Q Sepharose kolone, dodato je 9.6 mL 1 M monobaznog kalijum fosfata, 9.6 mL 1 M dvobaznog kalijum fosfata i 0.4 mL 1 mL CaCl2. Ovo je zatim stavljeno na kolonu i sakupljen je protok i pokretački pufer (5 mM kalijum fosfat, 0.5 mM amonijum sulfat), dajući 6905 mL na 36280 jedinica/mL. Proizvod je filtriran kroz filter od 0.2 µm.

[0253] Kolona sa amino fenil boranatom sa slojem kolone od 2.2 L (visina 29 cm, prečnik 10 cm) je dezinfikovana sa 3.8 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je isprana sa 5.0 L SWFI, očišćena sa 5.0 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i ponovo isprana sa 5.0 L SWFI. Kolona je zatim ekvilibrisana sa 5.0 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata. Protok kroz materijal iz Phenyl Sepharose kolone je stavljen u kolonu amino fenil boronata. Kolona je isprana sa 9.9 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5M amonijum sulfata, pH 7.0, zatim sa 9.7 L 20 mM bicina, 0.5 M amonijum sulfata, pH 9.0 zatim sa 9.9 L 20 mM bicina, 100 mM NaCl, pH 9.0. Proizvod je eluiran sa 5.0 L 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0, što je rezultovalo sa 4460 mL na 48 400 jedinica/mL, i filtrirano kroz filter od 0.2 µm.

[0254] Kolona sa hidroksiapatitom sa slojem kolone od 1.1 L (prečnik 7 cm, visina 28 cm) je dezinfikovana sa 2.7 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Kolona je neutralizovana sa 2.1 L 200 mM kalijum fosfata, pH 7.0, a zatim je ekvilibrisana u 2.2 L 5

1

mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl. U eluat iz kolone sa amino fenil boranatom dodato je 11.2 mL 1 M monobaznog kalijum fosfata, 11.2 mL 1 M dvobaznog kalijum fosfata i 0.45 mL 1 mL CaCl2. Ovo je zatim stavljeno na kolonu i naknadno isprano sa 3.5 L 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0, zatim sa 3.5 L 10 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0. Proizvod je eluiran sa 1.4 L 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0, što je rezultovalo u 1260 mL na 152560 jedinica/mL, i filtrirano kroz filter od 0.2 µm.

[0255] Prečišćeni proizvod se koncentrovao koristeći 0.05 ft<2>Millipore 30 kDa MWCO kertridž koji je ekvilibrisan u 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0. Proizvod je koncentrovan iz 1250 mL na 1.04/mg/mL do 120 mL i pufer je zamenjen 10× sa 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 puferom, a zatim filtriran kroz filter od 0.2 µm. Izvršena su merenja A280i pokazala su da je koncentracija rastvorljivog rHuPH20 preostalih 118 ml bila 11.45 mg/mL. Dodato je dodatnih 17 mL 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 pufera da bi se koncentracija proteina dovela do 10 mg/mL (Partija 056-122). Deset mL rastvora proteina od 10 mg/mL je razblaženo u puferu da bi se dobio rastvor od 1 mg/mL (Partija 056-123. Oba rastvora su filtrirana kroz filter od 0.2 µm.

[0256] Staklene vijalice od 10 mL i 1 mL su napunjene formulisanim proizvodom, od čega je ukupan prinos 1308 mg rastvorljivog rHuPH20. Vijalice su zamrznute na -80°C, a zatim prebačene na -20°C radi skladištenja. Partije 056-122 i 056-123 su zatim okarakterisane u pogledu aktivnosti i čistoće. Partije 056-122 i 056-123 su pokazale aktivnost enzima od 1 376 992 jedinica/mL i 129412 jedinica/mL i specifičnu aktivnost od 136900 jedinica/mg i 124 400 jedinica/mg (izračunato na osnovu aktivnosti enzima i koncentracije proteina). Čistoća uzoraka rastvorljivih rHuPH20 određena je pomoću SDS-PAGE, IsoElectric Focusing (IEF), reverzno-fazne tečne hromatografije pod visokim pritiskom (RP-HPLC), hromatografije isključene veličine (SEC) i anjon-izmenjivačke hromatografije. Kako je utvrđeno pomoću RP-HPLC, uočeno je da je čistoća dve Partije približno 96.2%. Kako je utvrđeno pomoću SEC, primećeno je da je čistoća dve Partije približno 99%. Pokazano je da su nivoi endotoksina ≤0.8 EU/mL i 0.09 EU/mL za partije 056-122 i 056-123, po redu. Osmolarnost je izmerena na 265 mOsm/kg i 256 mOsm/kg za partije 056-122 i 056-123, po redu. pH za svaku je bio 7.2.

D. Reproducibilnost postupka proizvodnje Gen2 rastvorljivog rHuPH20 u ćelijskoj kulturi bioreaktora od 30 L

2

[0257] Prethodno opisan postupak za Šaržnu 2B2-20K.6 je korišćen za sledeću šaržnu da bi se prikazala ponovljivost postupka. Postupak je malo modifikovan ugradnjom koraka virusne inaktivacije neposredno pre koraka hromatografije na koloni.

[0258] Vijalica sa 2B2 ćelijama (1 × 10<7>ćelija) je odmrznuta i kultivisana na 37°C, 7% CO2za 7 prolaza u CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija) sa dodatkom 20 µM metotreksata i 40 mL/L GlutaMAX™-I (Invitrogen), nakon čega je proširena na 400 mL zatim 4.4 L u CD CHO medijumu sa dodatkom 40 mL/L GlutaMAX™-I i bez metotreksata. Bioreaktor od 36 L (Bellco 1964 serija) koji sadrži 20 L CD CHO medijum dopunjen sa 800 mL GlutaMAX™-I, 100 mg rekombinantnog humanog insulina i 300 mg gentamicin sulfata je inokulisan sa 3 L kulture pri početnoj gustini zasejavanja od 4.7 × 10<5>ćelija/mL. Zadata tačka mešanja bioreaktora je podešena na 80 RPM; temperatura: 37°C; pH: 7.15; rastvoreni kiseonik: 25%. Bioreaktor je primio filtrirani preklopljeni vazduh i raspršen vazduh/kiseonik/CO2, što je kontrolisano od strane Applikon ADI 1030 kontrolora.

[0259] Nutritivne materije su stavljane u kulturu 4 puta tokom 13 dana rada bioreaktora, na 127, 163, 208 i sati nakon inokulacije. Hranljivi medijum je filtriran u bioreaktoru preko peristaltičke pumpe. Podešena temperatura bioreaktora smanjena je sa 37°C na 36.5°C na dan 7, na 36.0 °C na dan 9 i konačno na 35.5°C na dan 11. Sadržaj svakog hranljivog medijuma i hranljivi parametri bioreaktora tokom rada su obezbeđeni u Tabelama 23 i 24, po redu.

Tabela 23. Formulacije hranljivih medijuma

Tabela 24. Parametri bioreaktora.

4

[0260] Bioreaktor je sakupljen i filtriran kroz sistem koji je sadržao seriju Millipore Pod filtera D0HC (0.5 m<2>) i A1HC naslaga (0.1 m<2>), koji sadrže slojeve dijatomejske zemlje graduisanih pora, nakon čega je usledila konačna filtracija kroz filter kapsula (Sartorius Sartobran 300) u kesi za skladištenje od 20 L. Sakupljanje je obavljeno pomoću peristaltičke pumpe i završeno je za otprilike 75 minuta, dajući približno 30 L tečnosti sakupljene ćelijske kulture (HCCF). Ovo uključuje 28 L zapremine bioreaktora i otprilike 2 L PBS pokretačkog pufera. HCCF je dopunjena sa EDTA i Tris do konačnih koncentracija od 10 mM svaka, i konačni pH je 7.5. HCCF je zatim skladišten na 2-8°C pre nego što je koncentrovan i podvrgnut razmeni pufera.

[0261] Da bi se protein koncentrovao, Sartorius Slice sistem sa 3 × 1.0 ft<2>Sartocon Slice kaseta sa poprečnim protokom (30 kDa MWCO) je prvo ekvilibrisana u 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5. Trideset L HCCF je koncentrovano 10× do 3L i pufer je zamenjen 10× sa 20 mM Na2SO4, 10 mM Tris, pH 7.5 puferom. Prosečna brzina protoka tokom koncentrovanja bila je 115 mL/min., a prosečni transmembranski pritisak je bio 16 psig. Prosečna brzina protoka tokom dijafiltracije bila je 150 mL/min., a prosečan transmembranski pritisak je bio 15 psig. Retentat je filtriran kroz sisteme vakum filtera od 0.2 µm unutar kesa za skladištenje od 5 L za konačnu zapreminu od 3.0 L. Retentat je zatim skladišten na 2-8°C.

[0262] Inaktivacija virusa je izvedena mešanjem 235 mL filtriranog rastvora 10% tež./tež. Triton X-100, 35 tež./tež. tributil fosfata u SWFI sa 2.15 L koncentrovanog proteina na sobnoj temperaturi i zamenjenog puferom u staklenom balonu za centrifugiranje uz mešanje na 30-40 rpm. Posle 45 minuta, rastvor proteina je stavljen na kolonu Q sepharose (kao što je opisano u nastavku). Stajanje je trajalo 24 minuta, što je rezultovalo ukupnim vremenom izlaganja rastvoru deterdženta od 69 minuta.

[0263] Q sepharose kolona sa slojem kolone od 1.1 L, prečnika 7 cm, visine 28 cm je dezinfikovana sa 2.1 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je očišćena sa 2.5 L 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0, isprana u 4.5 L sterilne vode za ubrizgavanje (SWFI) i ekvilibrisana sa 4.5 L 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0. Protein sa razmenjenim puferima, virusno inaktivirani protein (2385 mL na 133 040 jedinica hijaluronidaze/mL) je stavljen na kolonu. Kolona je isprana sa 4.5 L 10 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.0, i 4.5 L 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0. Proizvod je zatim eluiran u 2.5 L 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0, dajući 2500 mL na 133680 jedinica/mL, i filtriran kroz filter od 0.2 µm.

[0264] Phenyl Sepharose kolona sa 2.2 L slojem kolone (visina 28 cm, prečnik 10 cm) dezinfikovana je sa 5.0 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je isprana sa 6.0 L SWFI i ekvilibrisana u 4.6 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 mM amonijum sulfata. U eluat kolone, dodato je 9.6 mL 1 M monobaznog kalijum fosfata, 9.6 mL 1 M dvobaznog kalijum fosfata i 0.4 mL 1 mL CaCl2. Ovo je zatim stavljeno na kolonu i sakupljen je protok i pokretački pufer (5 mM kalijum fosfat, 0.5 mM amonijum sulfat), dajući 6450 mL na 43840 jedinica/mL. Proizvod je filtriran kroz filter od 0.2 µm.

[0265] Kolona sa amino fenil boranatom sa slojem kolone od 2.2 L (visina 29 cm, prečnik 10 cm) je dezinfikovana sa 3.5 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Zatim je isprana sa 5.0 L SWFI i ekvilibrisana sa 9.0 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata. Protok kroz materijal iz Phenyl Sepharose kolone je stavljen u kolonu sa amino fenil boronatom. Kolona je isprana sa 9.9 L 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0, zatim sa 9.9 L 20 mM bicina, 0.5 M amonijum sulfata, pH 9.0.Proizvod je eluiran sa 4.4 L 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0, što je rezultovalo prinosom od 4389 mL na 33840 jedinica/mL, i filtrirano kroz filter od 0.2 µm.

[0266] Kolona sa hidroksiapatitom sa slojem kolone od 1.1 L (prečnik 7 cm, visina 28 cm) je dezinfikovana sa 2.1 L 1.0 N NaOH i skladištena u 0.1 N NaOH pre upotrebe. Kolona je neutralizovana sa 3.6 L 200 mM kalijum fosfata, pH 7.0, a zatim je ekvilibrisana u 3.2 L 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl. U eluat iz kolone sa amino fenil boranatom dodato je 11 mL 1 M monobaznog kalijum fosfata, 11 mL 1 M dvobaznog kalijum fosfata i 0.44 mL 1 mL CaCl2. Ovo je zatim stavljeno na kolonu i naknadno isprano sa 4.8 L 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0, zatim sa 3.8 L 10 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.5 M amonijum sulfata, pH 7.0. Proizvod je eluiran sa 1.5 L 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0, što je rezultovalo u 1500 mL na 114320 jedinica/mL, i filtrirano kroz filter od 0.2 µm.

[0267] Prečišćeni proizvod je koncentrovan koristeći 0.05 ft<2>Millipore 30 kDa MWCO kertridž koji je ekvilibrisan u 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0. Proizvod je koncentrovan od 1500 mL na 0.961 mg/mL do 125 mL, a pufer je zamenjen 10× sa 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 puferom, a zatim filtriran kroz filter od 0.2 µm. Izvršena su merenja A280i pokazala su da je koncentracija proteina preostalih 122 ml bila 11.431 mg/mL. Dodato je dodatnih 17.5 mL 130 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 7.0 pufera da bi se koncentracija proteina dovela do 10 mg/mL (Partija 056-135). Deset mL rastvora proteina od 10 mg/mL je razblaženo u puferu da bi se dobio rastvor od 1 mg/mL (Partija 056-136). Oba rastvora su filtrirana kroz filter od 0.2 µm.

[0268] Staklene vijalice od 5 mL i 1 mL su napunjene formulisanim proizvodom, od čega je ukupan prinos 1324 mg rastvorljivog rHuPH20. Vijalice su zamrznute na -80°C, a zatim prebačene na -20°C radi skladištenja. Partije 056-135 i 056-136 su zatim okarakterisane u pogledu aktivnosti i čistoće. Partije 056-135 i 056-136 su pokazale aktivnost enzima od 1 301 010 jedinica/mL i 127661 jedinica/mL i specifičnu aktivnost od 121600 jedinica/mg i 127 700 jedinica/mg (izračunato na osnovu aktivnosti enzima i koncentracije proteina). Čistoća uzoraka rastvorljivih rHuPH20 određena je pomoću SDS-PAGE, IsoElectric Focusing (IEF), reverzno-fazne tečne hromatografije pod visokim pritiskom (RP-HPLC), hromatografije isključene veličine (SEC) i anjon-izmenjivačke hromatografije. Kako je utvrđeno pomoću RP-HPLC, uočeno je da je čistoća dve Partije između 93.5% i 93.7%. Kako je utvrđeno pomoću SEC, primećeno je da je čistoća dve Partije veća od 99%. Pokazano je da su nivoi endotoksina ≤0.84 EU/mL i 0.09 EU/mL za partije 056-135 i 056-136, po redu. Osmolarnost je izmerena na 255 mOsm/kg i 260 mOsm/kg za partije 056-135 i 056-136, po redu. pH za svaku je 7.2.

PRIMER 8

A. Proizvodnja Gen2 rastvorljivog rHuPH20 u ćelijskoj kulturi bioreaktora od 300 L

[0269] Postupci proizvodnje i prečišćavanja koji su detaljno opisani u Primeru 7, prethodno, su povećani za proizvodnju korišćenjem bioreaktora od 400 L. Vijalica sa 2B2 ćelija (1 × 10<7>ćelija) je odmrznuta i proširena iz balona za trešenje kroz balone za centrifugiranje od 36 L u CD CHO (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija) sa dodatkom 20 µM metotreksata i 8 mM GlutaMAX™-I (Invitrogen). Ukratko, vijalica sa ćelijama je odmrznuta u vodenom kupatilu na 37°C, dodat je medijum i ćelije su centrifugirane. Ćelije su resuspendovane u balonu od 125 mL sa 20 mL svežeg medijuma i stavljene u inkubator na 37°C, 7% CO2. Ćelije su proširene do 40 mL u balonu za trešenje od 125 mL. Kada je gustina ćelija bila veća od 1.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 125 mL u zapremini kulture od 100 mL. Balon je inkubiran na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila veća od 1.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 250 mL u zapremini kulture od 200 mL, a balon je inkubiran na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila veća od 1.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 1 L u zapremini kulture od 800 mL i inkubirana na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila veća od 1.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 6 L u zapremini kulture od 5000 mL i inkubirana na 37°C, 7% CO2. Kada je gustina ćelija bila veća od 1.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura je proširena u balonu za centrifugiranje od 36 L u zapremini kulture od 32 L i inkubirana na 37°C, 7% CO2.

[0270] Reaktor od 400 L je sterilisan parom na 121°C tokom 30 minuta i dodato je 230 mL CD CHO medijuma sa dodatkom 8 mM GlutaMAX™-I i 5 mg/L rHuInsulina. Pre upotrebe, reaktor je proveren na kontaminaciju. Približno 30 L ćelija je prebačeno iz 36 L balona za centrifugiranje u bioreaktor od 400 L (Braun) na gustini inokulacije od 4.0 × 10<5>vijabilnih ćelija po ml i ukupnoj zapremini od 260L. Parametri su bili podešena temperatura, 37°C; Brzina radnog kola 40-55 RPM; Pritisak posude: 3 psi; Raspršivanje vazduha 0.5- 1.5 L/Min.; Preklapanje vazduha: 3 L/ min. Uzorci reaktora su svakodnevno uzimani za brojanje ćelija, verifikaciju pH vrednosti, analizu medijuma, proizvodnju i zadržavanje proteina. Takođe, tokom rada dodate su hranljive materije. Na 120 sati (dan 5), dodato je 10.4L hranljivog medijuma #1 (4× CD CHO 33 g/L Glukoze 160 mL/L GlutaMAX™-I 16.6 g/L Ekstrakta kvasca 33 mg/L rHuInsulina). Na 168 sati (dan 7), dodato je 10.8 L hranljivog medijuma #2 (2× CD CHO 33 g/L Glukoze 80 mL/L GlutaMAX™-I 33.4 g/L Ekstrakta kvasca 0.92 g/L Natrijum butirata), a temperatura kulture je promenjena na 36.5°C. Na 216 sati (dan 9), dodato je 10.8 L hranljivog medijuma #3 (1 × CD CHO 50 g/L Glukoze 50 mL/L GlutaMAX™-I 50 g/L Ekstrakta kvasca 1.80 g/L Natrijum butirata), a temperatura kulture je promenjena na 36° C. Na 264 sata (dan 11), dodato je 10.8 L hranljivog medijuma #4 (1 × CD CHO 33 g/L Glukoze 33 mL/L GlutaMAX™-I 50 g/L Ekstrakta kvasca 0.92 g/L Natrijum butirata) i temperatura kulture je promenjena na 35.5°C. Primećeno je da dodavanje hranljivog medijuma dramatično pojačava proizvodnju rastvorljivog rHuPH20 u završnim stadijumima proizvodnje. Reaktor je sakupljen 14 dana ili kada je vijabilnost ćelija pala ispod 40%. Postupak je rezultovao konačnom produktivnošću od 17000 jedinica po ml sa maksimalnom gustinom ćelija od 12 miliona ćelija/mL. Prilikom sakupljanja, kultura je uzorkovana na mikoplazmu, bioopterećenje, endotoksin i viruse in vitro i in vivo, TEM na virusne čestice i aktivnost enzima.

[0271] Kultura je pumpana peristaltičkom pumpom kroz četiri modula Millistak-ovog sistema filtracije (Millipore) paralelno, od kojih svaki sadrži sloj dijatomejske zemlje gradusa 4-8 µm i sloj dijatomejske zemlje gradusa 1.4-1.1 µm, zatim celulozu membranu, zatim kroz drugi pojedinačni Millistak sistem filtracije (Millipore) koji sadrži sloj dijatomejske zemlje gradusa 0.4-0.11 µm i sloj dijatomejske zemlje gradusa na <0.1 µm, zatim celuloznu membranu, a zatim kroz završni filter od 0.22 µm u sterilnu fleksibilnu kesu za jednokratnu upotrebu kapaciteta 350 L. Tečnost sakupljene ćelijske kulture je dopunjena sa 10 mM EDTA i 10 mM Tris do pH 7.5. Kultura je koncentrovana 10× sa modelom aparata za filtraciju tangencijalnog protoka (TFF) koristeći četiri Sartoslice TFF 30 kDa polieter sulfonskih (PES) filtera (Sartorius) granične molekulske mase (MWCO), nakon čega je usledila zamena pufera 10× sa 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 u završni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu za skladištenje od 50 L.

[0272] Virusi su inaktivirani u koncentrovanom, dijafiltriranom sakupljanju. Pre inaktivacije virusa, pripremljen je rastvor 10% Triton X-100, 3% tri (n-butil) fosfata (TNBP). Koncentrovano, dijafiltrirano sakupljanje je izloženo 1% Triton X-100, 0.3% TNBP tokom 1 sata u reakcionoj posudi od nerđajućeg čelika od 36 L neposredno pre prečišćavanja na Q koloni.

B. Prečišćavanje Gen2 sHuPH20

[0273] Pripremljena je Q Sepharose (Pharmacia) kolona za jonsku razmenu (9 L smole, H= 29 cm, D= 20 cm). Isprani uzorci su sakupljeni za određivanje pH vrednosti, provodljivosti i analize endotoksina (LAL). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone od 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5. Nakon inaktivacije virusa, koncentrovano, dijafiltrirano sakupljanje je stavljeno na Q kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Kolona je isprana sa 5 zapremina kolone 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 i 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0. Protein je eluiran sa 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 u završni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Uzorak eluata je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima. Očitavanje apsorbancije A280je obavljeno na početku i na kraju razmene.

[0274] Zatim je izvedena hromatografija hidrofobnih interakcija Phenyl-Sepharose (Pharmacia). Pripremljena je kolona Phenyl-Sepharose (PS) (19-21 L smole, H = 29 cm, D = 30 cm). Isprani uzorci su sakupljeni za određivanje pH vrednosti, provodljivosti i endotoksina (LAL analiza). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Proteinski eluat prethodno pomenut je dopunjen sa 2M amonijum sulfatom, 1M kalijum fosfatom i 1M osnovnim rastvorima CaCl2da bi se dobile konačne koncentracije od 5 mM, 0.5 M i 0.1 mM, po redu. Protein je stavljen na PS kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Dodato je 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i 0.1 mM CaCl2pH 7.0 na 100 cm/h. Protok je propušten kroz finalni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Protok je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0275] Pripremljena je kolona aminofenil boranata (ProMedics; 21 L smole, H = 29 cm, D = 30 cm). Isprani uzorci su sakupljeni za određivanje pH vrednosti, provodljivosti i endotoksina (LAL analiza). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijuma sulfata. PS prečišćeni protein je stavljen na kolonu od aminofenil boranata pri brzini protoka od 100 cm/h. Kolona je isprana sa 5 mM kalijum fosfatom, 0.5 M amonijum sulfatom, pH 7.0. Kolona je isprana sa 20 mM bicina, 0.5 M amonijum sulfata, pH 9.0. Kolona je isprana sa 20 mM bicina, 100 mM natrijum hlorida, pH 9.0. Protein je eluiran sa 50 mM Hepes, 100 mM NaCl pH 6.9 i pušten kroz sterilni filter u sterilnu kesu. Uzorak eluata je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0276] Pripremljena je kolona sa hidroksiapatitom (HAP) (BioRad; 13 L smole, H =20 cm, D = 30 cm). Isprani uzorci su sakupljeni za određivanje pH vrednosti, provodljivosti i endotoksina (LAL analiza). Kolona je ekvilibrisana sa 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2pH 7.0. Protein prečišćen aminofenil boronatom je dopunjen do konačnih koncentracija sa 5 mM kalijum fosfatom i 0.1 mM CaCl2i stavljen je na HAP kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Kolona je isprana sa 5 mM kalijum fosfata pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2. Kolona je zatim ponovo isprana sa 10 mM kalijum fosfatom pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2. Protein je eluiran sa 70 mM kalijum fosfata pH 7.0 i filtriran kroz sterilni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Uzorak eluata je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0277] HAP prečišćeni protein je zatim propušten kroz filter za uklanjanje virusa. Sterilizovani Virosart filter (Sartorius) je prvo pripremljen ispiranjem sa 2 L 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0. Pre upotrebe, filtrirani pufer je uzorkovan na pH i provodljivost. HAP prečišćeni protein je pumpan preko peristaltičke pumpe kroz 20 nM filter za uklanjanje virusa. Filtrirani protein u 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0 je propušten kroz završni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Uzorak filtriran od virusa je testiran na koncentraciju proteina, aktivnost enzima, profilisanje oligosaharida, monosaharida i sijalinske kiseline (kao što je opisano u Primerima 9 do 10, u nastavku).

[0278] Protein u filtratu je zatim koncentrovan do 10 mg/mL korišćenjem 10 kD granične molekulske mase (MWCO) Sartocon Slice sistema filtracije tangencijalnog protoka (TFF). Filter je prvo pripremljen ispiranjem sa 10 mM histidinom, 130 mM NaCl, pH 6.0, a permeat je uzorkovan na pH i provodljivost. Nakon koncentrovanja, koncentrovani protein je uzorkovan i testiran na koncentraciju proteina i aktivnost enzima. Izvršena je 6× razmena pufera na koncentrovanom proteinu u konačni pufer: 10 mM histidin, 130 mM NaCl, pH 6.0. Nakon razmene pufera, koncentrovani protein je propušten kroz filter od 0.22 µm u sterilnu kesu za skladištenje od 20 L. Protein je uzorkovan i testiran na koncentraciju proteina,

1

aktivnost enzima, slobodne sulfhidrilne grupe, profilisanje oligosaharida i osmolarnost (kao što je opisano u Primerima 9 do 10, u nastavku).

[0279] Sterilno filtrirani masivni protein je zatim aseptično podeljen na 20 mL u sterilne Teflon vijalice od 30 mL (Nalgene). Vijalice su zatim brzo zamrznute i skladištene na -20 ± 5°C. Proizvodnja i prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 ovim postupkom dalo je približno 11 i 15 grama, sa specifičnom aktivnošću od 95000 jedinica/mg do 120000 jedinica/mg.

C. Poređenje proizvodnje i prečišćavanja Gen1 i Gen2 sHuPH20

[0280] Proizvodnja i prečišćavanje Gen2 rastvorljivog rHuPH20 u ćelijskoj kulturi bioreaktora od 300L sadržali su neke promene u protokolima u poređenju sa proizvodnjom i prečišćavanjem Gen1 rastvorljivog rHuPH20 u kulturi ćelija bioreaktora od 100L (opisano u Primeru 4). Tabela 25 prikazuje ogledne razlike, pored jednostavnih promena povećanja, između postupaka.

Tabela 25. Ogledne razlike između proizvodnje i prečišćavanja Gen1 i Gen2 rastvorljivih rHuPH20 korišćenjem postupaka sa ćelijskim kulturama bioreaktora od 100L i 300L

1 1

12

1

PRIMER 9

Određivanje aktivnosti enzima rastvorljivog rHuPH20

[0281] Enzimska aktivnost rastvorljivog rHuPH20 u uzorcima kao što su ćelijske kulture, frakcije za prečišćavanje i prečišćeni rastvori je određena korišćenjem turbidometrijske analize, koji se zasniva na formiranju nerastvorljivog precipitata kada se hijaluronska kiselina veže sa serumskim albuminom. Aktivnost se meri inkubacijom rastvorljivog rHuPH20 sa natrijum hijaluronatom (hijaluronskom kiselinom) tokom određenog vremenskog perioda (10 minuta), a zatim precipitacijom nedigestovanog natrijum hijaluronata uz dodatak zakiseljenog serumskog albumina. Zamućenost nastalog uzorka se meri na 640 nm posle perioda razvoja od 30 minuta. Smanjenje zamućenosti koje je rezultat aktivnosti enzima na supstratu natrijum hijaluronata je mera rastvorljive enzimske aktivnosti rHuPH20. Postupak se izvodi korišćenjem kalibracione krive generisane razblaženjima radnog referentnog standarda za analizu rastvorljivog rHuPH20, a merenja aktivnosti uzorka se vrše u odnosu na ovu kalibracionu krivu.

[0282] Razblaženja uzorka su pripremljena u rastvorima Razblaživača Enzima. Rastvor Razblaživača Enzima je pripremljen rastvaranjem 33.0 ± 0.05 mg hidrolizovanog želatina u 25.0 mL 50 mM PIPES Reakcionog Pufera (140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) i 25.0 mM SWFI i razblaženog 0.2 mL 25% rastvora buminata u smeši i vorteksovanjem 30 sekundi. Ovo je obavljeno u roku od 2 sata od upotrebe i skladišteno na ledu dok nije bilo

1 4

potrebno. Uzorci su razblaženi do procenjenih 1-2 U/mL. Generalno, maksimalno razblaživanje po koraku nije prelazilo 1:100 i početna veličina uzorka za prvo razblaživanje nije bila manja od 20 µL. Minimalne zapremine uzorka potrebne za izvođenje analize bile su: Uzorci u postupku, FPLC frakcije: 80 µL; Supernatanti kulture tkiva: 1 mL; Koncentrovani materijal 80 µL; Prečišćeni ili konačni materijal: 80 µL. Razblaženja su napravljena u tri primerka na ploči sa 96 udubljenja sa niskim stepenom vezivanja proteina, a 30 µL svakog razblaženja je prebačeno na Optilux ploče sa crnim/providnim dnom (BD BioSciences).

[0283] Razblaženja poznatog rastvorljivog rHuPH20 sa koncentracijom od 2.5 U/mL su pripremljena u Rastvoru Razblaživača Enzima za da bi se dobila standardna kriva i dodata su na Optilux ploču u tri primerka. Razblaženja su uključivala 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL i 2.5 U/mL. „Prazna reagens“ udubljenja koji su sadržala 60 µL rastvora enzima za razblaživanje su uključena u ploču kao negativna kontrola. Ploča je zatim pokrivena i zagrejana na toplotnom bloku 5 minuta na 37°C. Poklopac je uklonjen i ploča je trešena 10 sekundi. Nakon trešenja, ploča je vraćena na ploču do toplotnog bloka, a MULTIDROP 384 uređaj za rukovanje tečnostima je napunjen sa 0.25 mg/mL toplog rastvora natrijum hijaluronata (pripremljenog rastvaranjem 100 mg natrijum hijaluronata (LifeCore Biomedical) u 20 mL SWFI. Ovo je mešano blagim rotiranjem i/ili ljuljanjem na 2-8°C tokom 2-4 sata, ili dok se potpuno ne rastvori). Reakciona ploča je prebačena u MULTIDROP 384 i reakcija je pokrenuta pritiskom na taster za pokretanje da bi se u svako udubljenje stavilo 30 µL natrijum hijaluronata. Ploča je zatim uklonjena iz MULTIDROP 384 i protrešena 10 sekundi pre nego što je prebačena u toplotni blok sa zamenjenom poklopljenom pločom. Ploča je inkubirana na 37°C tokom 10 minuta.

[0284] MULTIDROP 384 je pripremljen da zaustavi reakciju punjenjem mašine sa Serumskim Radnim Rastvorom i promenom podešavanja zapremine na 240 µL. (25 mL Osnovnog Rastvora Seruma [1 zapremina Konjskog Seruma (Sigma) je razblažena sa 9 zapremina rastvora acetatnog pufera od 500 mM i pH je podešen na 3.1 sa hlorovodoničnom kiselinom] u 75 mL 500 mM rastvora acetatnog pufera). Ploča je uklonjena sa toplotnog bloka i stavljena na MULTIDROP 384 i 240 µL Radnog Rastvora seruma je stavljeno u udubljenja. Ploča je uklonjena i trešena na čitaču ploča 10 sekundi. Posle dodatnih 15 minuta, zamućenost uzoraka je izmerena na 640 nm i aktivnost enzima (u U/mL) svakog uzorka je određena prilagođavanjem standardnoj krivi.

[0285] Specifična aktivnost (Jedinice/mg) je izračunata deljenjem aktivnosti enzima (U/ml) sa koncentracijom proteina (mg/mL).

1

Primer 10

Određivanje sadržaja sijalinske kiseline i monosaharida

[0286] Sadržaj sijalinske kiseline i monosaharida u rastvorljivom rHuPH20 može se proceniti reverzno-faznom tečnom hromatografijom (RPLC) nakon hidrolize sa trifluorosirćetnom kiselinom. U jednom primeru, određen je sadržaj sijalinske kiseline i monosaharida u partiji prečišćene hijaluronidaze # HUB0701E (1.2 mg/mL; proizvedeno i prečišćeno u suštini kao što je opisano u Primeru 8). Ukratko, uzorak od 100 µg je hidrolizovan sa 40% (zapr./zapr.) trifluorosirćetne kiseline na 100°C tokom 4 sata u duplikatu. Nakon hidrolize, uzorci su osušeni i resuspendovani u 300 µL vode. Alikvot od 45 µL iz svakog resuspendovanog uzorka je prebačen u novu epruvetu i osušen, a svakom je dodato 10 µL rastvora natrijum acetata od 10 mg/mL. Oslobođeni monosaharidi su fluorescentno obeleženi dodavanjem 50 µL rastvora koji sadrži 30 mg/mL 2-aminobenzojeve kiseline, 20 mg/mL natrijum cijanoborhidrida, približno 40 mg/mL natrijum acetata i 20 mg/mL borne kiseline u metanolu. Smeša je inkubirana 30 minuta na 80 °C u mraku.

Reakcija derivitizacije je ugašena dodavanjem 440 µL mobilne faze A (0.2% (zapr./zapr.) nbutilamina, 0.5% (zapr./zapr.) fosforne kiseline, 1% (zapr./zapr.) tetrahidrofurana). Matrična prazna vode je takođe hidrolizovana i izvedena kao što je opisano za uzorak hijaluronidaze kao negativne kontrole. Oslobođeni monosaharidi su razdvojeni pomoću RPLC korišćenjem Oktadecil (C18) reverzno-fazne kolone (4.6 × 250 mm, veličina čestica 5 µm; J.T. Baker) i praćeni detekcijom fluorescencije (360 nm ekscitacija, 425 nm emisija). Kvantifikacija sadržaja monosaharida izvršena je poređenjem hromatograma iz uzorka hijaluronidaze sa hromatogramima standarda monosaharida uključujući N-D-glukozamin (GlcN), N-D-galaktozamin (GaIN), galaktozu, fukozu i manozu. Tabela 26 predstavlja molarni odnos svakog monosaharida po molekulu hijaluronidaze.

Tabela 26. Sadržaj monosaharida rastvorljivog rHuPH20

1

PRIMER 11

Heterogenost C-kraja rastvorljivog rHuPH20 iz 3D35M i 2B2 ćelija

[0287] Sekvenciranje C-kraja je izvedeno na dve partije sHuPH20 proizvedenih i prečišćenih iz 3D35M ćelija u zapremini bioreaktora od 100 L (Partija HUA0505MA) i 2B2 ćelija u zapremini bioreaktora od 300 L (Partija HUB0701EB). Partije su odvojeno digestirane sa endoproteinazom Asp-N, koja specifično cepa peptidne veze na N-kraju na asparaginskoj i cisteinskoj kiselini. Ovo oslobađa deo C-kraja rastvorljivog rHuPH20 na asparaginskoj kiselini na poziciji 431 SEQ ID NO:4. Fragmenti C-kraja su razdvojeni i okarakterisani da bi se odredila sekvenca i zastupljenost svake populacije u Partiji HUA0505MA i Partiji HUB0701EB.

[0288] Primećeno je da preparati rastvorljivog rHuPH20 iz 3D35M ćelija i 2B2 ćelija pokazuju heterogenost i da sadrže polipeptide koji se razlikuju jedan od drugog po svojoj sekvenci C-kraja (Tabele 27 i 28). Ova heterogenost je verovatno rezultat cepanja C-kraja ekspresiranog polipeptida od 447 aminokiselina (SEQ ID NO:4) pomoću peptidaza prisutnih u medijumu ćelijske kulture ili drugim rastvorima tokom postupka proizvodnje i prečišćavanja. Polipeptidi u preparatima rastvorljivih rHuPH20 imaju sekvence aminokiselina koje odgovaraju aminokiselinama 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 i 1-443 sekvencama rastvorljivog rHuPH20 prikazanih u SEQ ID NO:4. Potpuna sekvenca aminokiselina svakog od ovih polipeptida je prikazana u SEQ ID NOS: 4 do 8, po redu. Kao što je navedeno u tabelama 27 i 28, zastupljenost svakog polipeptida u preparatima rastvorljivih rHuPH20 iz 3D35M ćelija i 2B2 ćelija se razlikuje.

Tabela 27. Analiza C-kraja fragmenata iz partije HUA0505MA

1

Tabela 28. Analiza C-kraja fragmenata iz Partije HUB0701EB

1

PRIMER 12

Proizvodnja i prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 u ćelijskoj kulturi bioreaktora od 2500 L

[0289] Proizvodnja i prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 može se povećati od postupka bioreaktora od 300 L sa dolivnom kulturom (opisanog u Primeru 8) na postupak bioreaktora od 2500 L sa dolivnom kulturom. Kao i proizvodnja rHuPH20 u ćelijskoj kulturi bioreaktora od 300 L, proizvodnja rHuPH20 u ćelijskoj kulturi bioreaktora od 2500 L se izvodi tako što se prvo odmrzavaju i šire vijalice sa 2B2 ćelijama, kultivišu u bioreaktoru, sakupljaju i bistre kulture, koncentruju i sakupljaju pufer-razmenjeni, zatim se inaktivišu virusi. rHuPH20 se zatim prečišćava iz koncentrata korišćenjem serije koraka prečišćavanja koji koriste Q sefarozu, fenil sefarozu, aminofenil boronat i hidroksiapatit boronat, nakon čega sledi filtracija virusa.

1. Širenje ćelijske kulture

[0290] Da bi se stvorio veći broj ćelija koji je potreban za zasejavanje ćelijske kulture bioreaktora od 2500 L u poređenju sa kulturom od 300 L, ćelijska kultura se serijski proširuje kroz balon za trešenje od 125 mL, šejker od 250 mL, balon za trešenje od 1 L, dva balona za trešenje od 2 L, šest balona za trešenje od 2 L, 25 L WAVE Bioreactor™ (GE Healthcare Life Sciences), 100 L WAVE Bioreactor™ i bioreaktor za zasejavanje sa rezervoarom za mešanje od 600 L (ABEC, Inc. Bethlehem, PA; Stainless Technology division). Prilikom svakog

1

širenja, ciljana gustina zasejavanja je 4 × 10<5>ćelija/mL. Temperatura tokom ekspanzije je 37°C (ili između 36°C i 38°C) sa 7% CO2(ili između 6-8 % CO2). Baloni su trešeni na približno 110 RPM (ili 90-130 RPM), 25 L i 100 L WAVE Bioreactor™ su protrešeni na 20 RPM (ili 15-25 ili 18-22 RPM, po redu), a bioreaktor za zasejavanje od 600 L je protrešen na 90 RPM (ili 85-95 RPM).

[0291] Prvo, vijalica sa 2B2 ćelijama (1 × 10<7>ćelija) iz radne banke ćelija se odmrzava u vodenom kupatilu na 37°C otprilike 2 minuta (poželjno ne više od 5 minuta) pre nego što se doda medijum i ćelije se centrifugiraju. Ćelije se resuspenduju do približno 25 mL (ili između 20-30 mL) sa svežim medijumom (CD CHO AGT™ sa 40 mL/L (8 mM) GlutaMAX™-I i 20 µM metotreksata u balonu za trešenje od 125 mL i stavljaju u inkubator na 37°C, 7% CO2. Kada gustina ćelija dostigne približno 8 × 10<5>ćelija/mL, kultura se prebacuje u balon za trešenje od 250 mL u zapremini kulture od 50 mL (ili 45-55 mL). Nakon inkubacije, kada gustina ćelija dostigne približno 1.6 × 10<6>ćelija/mL, kultura se proširi u balonu od 1 L u zapremini kulture od 200 mL (ili 190-210 mL) i inkubira. Kada gustina ćelija u balonu od 1 L dostigne približno 1.6 × 10<6>ćelija/mL, kultura se širi u 2 × 2 L balonima, svaki sa ukupnom zapreminom kulture od približno 400 mL (ili između 350-450 mL po balonu), i inkubira. Kada gustina ćelija u balonima od 2 L dostigne približno 1.2 × 10<6>ćelija/mL, kultura se širi u 6 × 2 L balonima, svaka sa ukupnom zapreminom kulture od približno 400 mL (ili između 350-450 mL po balonu), i inkubira. Kada gustina ćelija u balonu od 2 L dostigne približno 2.5 × 10<6>ćelija/mL, kultura se širi u 25 L WAVE Bioreactor™, sa ukupnom zapreminom kulture od približno 15 L (ili između 14-16 L) i inkubira se sa protokom vazduha od 1.5 L/minut.

[0292] Kada gustina ćelija u 25 L WAVE Bioreactor™ dostigne približno 2.2 × 10<6>ćelija/mL, kultura se širi u 100 L WAVE Bioreactor™, sa ukupnom zapreminom kulture od približno 80 L (ili između 75-85 L), koristeći CD-CHO AGT™ medijum koji je dopunjen sa 3.6 g/L metotreksata, 40 mL/L GlutaMAX™-I i 1 mL/L 1N NaOH, i inkubiran sa protokom vazduha od 1.5L/min. Kada gustina ćelija u 100 L WAVE Bioreactor™ dostigne približno 2.6 × 10<6>ćelija/mL, kultura se širi u bioreaktoru za zasejavanje od 600 L ABEC, Inc. Bethlehem, PA; Stainless Technology division) sa ukupnom zapreminom kulture od približno 480 L (ili između 440-520 L) koristeći CD-CHO AGT™ medijum koji je dopunjen sa 40 mL/L GlutaMAX™-I i inkubiran dok gustina ćelija u bioreaktoru od 600 L ne dostiže približno 1.6 × 10<6>ćelija/mL.

2. Proizvodnja rHuPH20

11

[0293] Bioreaktor od 3500 L sa ukupnom zapreminom od 3523 L i radnom zapreminom od 500-2500 L (ABEC, Inc, Bethlehem, PA) koristi se za proizvodnju visokog prinosa rHuPH20. Nakon sterilizacije, u bioreaktor se dodaje približno 1800-2000 L CD-CHO AGT™ medijuma koji sadrži 24.3 g/L CD-CHO AGT™ u prahu, sa dodatkom 40 mL/L GlutaMAX™-I i 5 mg/L rHuInsulina. Parametri su podešeni na: podešenu temperaturu, 37°C; Brzina radnog kola 75 RPM; Pritisak posude: 5 psi; Raspršivanje vazduha 18 L/min; rastvoreni kiseonik: 25%; pH ≤7.2. Pre upotrebe, reaktor se proverava na kontaminaciju. Približno između 300-500 L ćelija (u zavisnosti od broja ćelija) iz zasejane kulture bioreaktora od 600 L se inokuliše u medijum ćelijske kulture u bioreaktoru od 3500 L na gustini inokulacije od 4.0 × 10<5>vijabilnih ćelija po ml, da bi se postigla ukupna zapremina od 2100 L. Tokom 14 dana inkubacije ćelija, bioreaktor se svakodnevno uzorkuje na vijabilnost ćelija, gustinu ćelija, verifikaciju pH vrednosti i enzimsku aktivnost. Temperatura i rastvoreni kiseonik se takođe pažljivo prate.

[0294] Hranjive materije se dodaju tokom 14 dana rada bioreaktora, svaki sa približno 4% zapr./zapr. Petog dana, približno je dodato 84 L (ili 4% zapr./zapr.) hranljivog medijuma #1 (81 g/L CD CHO AGT™ u prahu 33 g/L Glukoze 13.3 mL/L GlutaMAX™-I 83.3 g/L Ekstrakta kvasca 33 mg/L rHuInsulina). Sedmog dana, približno je dodato 87 L (ili 4% zapr./zapr.) hranljivog medijuma #2 (40.5 g/L CD CHO AGT™ u prahu 33 g/L Glukoze 66.7 mL/L GlutaMAX™-I 166.7 g/L Ekstrakta kvasca 0.92 g/L Natrijum butirata), a temperatura kulture je promenjena na 36.5°C. Devetog dana, približno je dodato 91 L (ili 4% zapr./zapr.) hranljivog medijuma #3 (20.3 g/L CD CHO AGT™ u prahu 50 g/L Glukoze 50 mL/L GlutaMAX™-I 250 g/L Ekstrakta kvasca 1.8 g/L Natrijum butirata), a temperatura kulture je promenjena na 36° C. Jedanaestog dana, približno je dodato 94 L (ili 4% zapr./zapr.) hranljivog medijuma #4 (20.3 g/L CD CHO AGT™ u prahu 33.3 g/L Glukoze 33.3 mL/L GlutaMAX™-I 250 g/L Ekstrakta kvasca 0.92 g/L Natrijum butirata) i temperatura kulture je promenjena na 35.5°C. Reaktor se sakuplja na dan 14, dajući 2400-2600 L sakupljanja (obično približno 2500 L).

[0295] Kultura je prenosi pod pritiskom kroz 20 modula Millistak-ovog sistema filtracije (Millipore) paralelno, od kojih svaki sadrži sloj dijatomejske zemlje gradusa 4-8 µm i sloj dijatomejske zemlje gradusa 1.4-1.1 µm, zatim celulozu membranu, zatim kroz drugi Millistak sistem filtracije (Millipore) koji sadrži 10 modula, od kojih svaki sadrži sloj dijatomejske zemlje gradusa 0.4-0.11 µm i sloj dijatomejske zemlje gradusa na <0.1 µm, zatim celuloznu membranu, a zatim kroz završni filter od 0.22 µm u sterilnu fleksibilnu kesu za jednokratnu upotrebu kapaciteta 350 L. Tečnost sakupljene ćelijske kulture je dopunjena sa 10 mM EDTA i 10 mM Tris, pH 8.4, do ciljanog pH 7.5. Kultura je koncentrovana 10× sa aparatom (Pall) za filtraciju tangencijalnog protoka (TFF) koristeći 18-21 m<2>Sartoslice TFF 30 kDa polieter sulfonskih (PES) filtera (Sartorius) granične molekulske mase (MWCO), nakon čega je usledila zamena pufera 10× sa 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 u završni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu za skladištenje od 350 L.

[0296] Virusi su inaktivirani u koncentrovanom, dijafiltriranom sakupljanju. Pre inaktivacije virusa, pripremljen je rastvor 10% Triton X-100, 3% tri (n-butil) fosfata (TNBP). Koncentrovano, dijafiltrirano sakupljanje je izloženo 1% Triton X-100, 0.3% TNBP tokom 2 sata u reakcionoj posudi od nerđajućeg čelika od 500 L neposredno pre prečišćavanja na Q koloni.

B. Prečišćavanje Gen2 rHuPH20

[0297] Pripremljena je Q Sepharose (Pharmacia) kolona za jonsku razmenu (81 L smole, H= 26 cm, D= 63 cm). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone od 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5. Nakon inaktivacije virusa, koncentrovano, dijafiltrirano, virusno inaktivirano sakupljanje od približno 250 L je stavljeno na Q kolonu pri brzini protoka od 150 cm/h. Kolona je isprana sa 5 zapremina kolone 10 mM Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 i 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0. Protein je eluiran sa 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0 u završni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Uzorak eluata je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima. Očitavanje apsorbancije A280je obavljeno na početku i na kraju razmene.

[0298] Zatim je izvedena hromatografija hidrofobnih interakcija Phenyl-Sepharose (Pharmacia). Pripremljena je kolona Phenyl-Sepharose (PS) (176 L smole, H = 35 cm, D = 80 cm). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Proteinski eluat prethodno pomenut je dopunjen sa 2M amonijum sulfatom, 1M kalijum fosfatom i 1M osnovnim rastvorima CaCl2da bi se dobile konačne koncentracije od 5 mM, 0.5 M i 0.1 mM, po redu. Protein je stavljen na PS kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Dodato je 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijum sulfata i 0.1 mM CaCl2pH 7.0 na 100 cm/h. Protok je propušten kroz konačni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Protok je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0299] Pripremljena je kolona aminofenil boranata (ProMedics; 176 L smole, H = 35 cm, D = 80 cm). Kolona je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 5 mM kalijum fosfata, 0.5 M amonijuma sulfata. PS prečišćeni protein je stavljen na kolonu od aminofenil boranata pri brzini protoka od 50 cm/h. Brzina protoka je povećana na 100 cm/h u ostatku postupka. Kolona je prvo isprana sa 5 mM kalijum fosfatom, 0.5 M amonijum sulfatom, pH 7.0, onda sa 20 mM bicinom, 0.5 M amonijum sulfatom, pH 9.0, i onda sa 20 mM bicinom, 100 mM natrijum hloridom, pH 9.0. Protein je eluiran sa 50 mM Hepes, 100 mM NaCl pH 6.9 i pušten kroz sterilni filter u sterilnu kesu. Uzorak eluata je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0300] Pripremljena je kolona sa hidroksiapatitom (HAP) (BioRad; 116 L smole, H =23 cm, D = 80 cm). Kolona je ekvilibrisana sa 5 mM kalijum fosfata, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0. Protein prečišćen aminofenil boronatom je dopunjen do konačnih koncentracija sa 5 mM kalijum fosfatom i 0.1 mM CaCl2i stavljen je na HAP kolonu pri brzini protoka od 100 cm/h. Kolona je prvo isprana sa 5 mM kalijum fosfatom, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, onda sa 10 mM kalijum fosfatom, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2. Protein je eluiran sa 70 mM kalijum fosfatom, pH 7.0 i filtriran kroz sterilni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Uzorak eluata je testiran na bioopterećenje, koncentraciju proteina i aktivnost enzima.

[0301] HAP prečišćeni protein je zatim propušten kroz filter za uklanjanje virusa. Sterilizovani Virosart filter (Sartorius) je prvo pripremljen ispiranjem sa 2 L 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0. HAP prečišćeni protein je pumpan preko peristaltičke pumpe kroz 20 nM filter za uklanjanje virusa. Filtrirani protein u 70 mM kalijum fosfata, pH 7.0 je propušten kroz završni filter od 0.22 µm u sterilnu kesu. Uzorak filtriran od virusa je testiran na koncentraciju proteina, aktivnost enzima, profilisanje oligosaharida, monosaharida i sijalinske kiseline (kao što je opisano u Primerima 9 do 10, u nastavku).

[0302] Protein u filtratu je zatim koncentrovan 8-12× korišćenjem tri 10 kD Sartocon PES kasete granične molekulske mase (MWCO), svaka sa površinom filtera od 0.7 m<2>, za ukupnu površinu od 2.1 m<2>. Nakon koncentrovanja, koncentrovani protein je uzorkovan i testiran na koncentraciju proteina i aktivnost enzima. Zatim se vrši 10× dijafiltracija na koncentrovanom proteinu. Ovo se može izvesti na jedan od dva načina: 1) korišćenjem 20 mM histidina, 130 mM NaCl, pH 6.5 pufera i 1% polisorbata 80; ili 2) korišćenjem pufera od 10 mM histidina, 130 mM NaCl, pH 6.5 pufer. Koncentrovani, dijafiltrirani masivni protein je na koncentraciji od približno 10 mg/mL. Nakon razmene pufera, koncentrovani protein se propušta kroz filter od 0.22 µm u sterilnu kesu za skladištenje od 20 L.

[0303] Sterilno filtrirani masivni protein se zatim aseptično dozira u količini od 400 mL u 1 L sterilne PFA Nalgene boce. Boce se zatim brzo zamrzavaju u kupatilu sa tečnim azotom i skladište na manje od -20 °C za masivni protein koji ne sadrži polisorbat 80, i manje od -70 °C za masivni protein koji sadrži polisorbat 80.

11

[0304] Tabela 29 prikazuje neke ogledne razlike između proizvodnje rHuPH20 u kulturi bioreaktora od 300 L i 2500 L

Tabela 29. Ogledne razlike između proizvodnje rHuPH20 u kulturi bioreaktora od 300

L i 2500 L

11

11

LISTA SEKVENCI

11

<400> 1

11

<211> 474

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Zreli PH20 <400> 2

11

<211> 482

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor rastvorljivog rHuPH20

12

<400> 3

Ċ

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> rastvorljivi rHuPH201-447 <400> 4

<211> 446

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> rastvorljivi rHuPH201-446 <400> 5

12

<211> 445

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> rastvorljivi rHuPH201-445 <400> 6

<211> 444

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> rastvorljivi rHuPH201-444 <400> 7

12

<211> 443

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> rastvorljivi rHuPH201-443

12

<210> 9 <211> 442

12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> rastvorljivi rHuPH201-442 <400> 9

12

<211> 450

<212> PRT

<213> Bos taurus <220>

<223> hijaluronidaza <400> 10

12

<211> 331

<212> PRT

<213> Vespula vulgaris <220>

<223> hijaluronidaza A <400> 11

1

<211> 340

<212> PRT

<213> Vespula vulgaris <220>

<223> hijaluronidaza B <400> 12

1 1

<211> 382

<212> PRT

<213> Apis mellifera <220>

<223> hijaluronidaza <400> 13

1 2

<211> 331

<212> PRT

<213> Dolichovespula maculata <220>

<223> hijaluronidaza

<400> 14

1

<211> 367

<212> PRT

<213> Polistes annularis <220>

<223> hijaluronidaza <400> 15

1 4

<211> 462

<212> PRT

<213> Mus musculus <220>

<223> hijaluronidaza <400> 16

1

<211> 473

<212> PRT

<213> Mus musculus <220>

<223> Hijaluronidaza 2 <400> 17

1

<211> 412

<212> PRT

<213> Mus musculus

1

<223> hijaluronidaza 3 <400> 18

<210> 19

<211> 435

1

<212> PRT

<213> Sus scrofa <220>

<223> hijaluronidaza <400> 19

1

<211> 419

<212> PRT

<213> Sus scrofa <220>

<223> hijaluronidaza 3 <400> 20

14

<211> 449

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <220>

<223> hijaluronidaza 1 <400> 21

<211> 473

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <220>

<223> hijaluronidaza 2 <400> 22

<211> 412

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

14

<223> hijaluronidaza 3 <400> 23

<210> 24

<211> 545

<212> PRT

<213> Oryctolagus cuniculus <220>

<223> PH20

<400> 24

14

<211> 476

<212> PRT

<213> Ovis aries <220>

<223> hijaluronidaza 2 <400> 25

14

<211> 414

<212> PRT

<213> Pongo pygmaeus <220>

<223> hijaluronidaza 3

14

<210> 27

<211> 510

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

14

<223> PH20 <400> 27

14

<211> 529

<212> PRT

<213> Cavia porcellus <220>

<223> PH20

<400> 28

1

<211> 512

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <220>

<223> PH20

<400> 29

1 1

<211> 512

<212> PRT

<213> Mus musculus

12

<223> PH20 <400> 30

1

<211> 807

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus <220>

<223> hijaluronidaza <400> 31

1 4

�

<211> 371

<212> PRT

<213> bakteriofag H4489A Streptococcus pyogenes <220>

<223> hijaluronidaza

<400> 32

1

<211> 1628

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens <220>

<223> hijaluronidaza

<400> 33

1

�

�

�

<211> 435

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Hijaluronidaza-1 [Prekursor] <400> 34

1 1

<211> 473

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Hijaluronidaza-2 [Prekursor] <400> 35

1 2

<211> 417

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Hijaluronidaza-3 [Prekursor] <400> 36

1

<211> 481

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Hijaluronidaza-4

1 4

<400> 37

1

<211> 467

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor sHuPH20 1-467 <400> 38

1

<211> 477

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor sHuPH20 1-477 <400> 39

1

<211> 478

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor sHuPH20 1-478

1

<210> 41 <211> 479

1

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor sHuPH20 1-479 <400> 41

1

<211> 480

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor sHuPH20 1-480 <400> 42

1 1

<211> 481

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor sHuPH20 1-481 <400> 43

1 2

<211> 483

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor sHuPH20 1-483

1

<400> 44

14

<211> 432

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> zreli sHuPH2036-467 <400> 45

1

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> zreli sHuPH2036-483 <400> 46

1

<211> 1446

<212> DNK

<213> Homo sapiens

<220>

<223> DNK koja kodira „prekursor“ rastvorljivog rHuPH20 <400> 47

1

<211> 509

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> varijanta P48A PH20 <400> 48

1

<211> 509

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> prekursor varijante L499W PH20 <400> 49

1

<211> 6630

1

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> vektor HZ24 <400> 50

1 1

��

<211> 186

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<223> dihidrofolat reduktaza <400> 51

<210> 52

<211> 23

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> direktni prajmer HZM3.P1 <400> 52

tttgaacact cagcagtctc ctg 23 <210> 53

<211> 20

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> reverzni prajmer HZM3.P2

1

aactctgatg gcttcccgaa 20

<210> 54

<211> 28

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> proba HZM3

<400> 54

agctgctaca ctctatgtgc gcaatcga 28

<210> 55

<211> 1449

<212> DNK

<213> Homo sapiens

<220>

<223> sekvenca iRNK PH20 iz ćelija 3D35M <400> 55

<210> 56

<211> 17

1 4

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP01

<400> 56

ttctctccac aggtgtc 17 <210> 57

<211> 18

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP02

<400> 57

aagatttcct tacaagac 18 <210> 58

<211> 18

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP03

<400> 58

tggcgagagg ggaaagac 18 <210> 59

<211> 18

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP04

<400> 59

ccatttattt gaacactc 18 <210> 60

<211> 18

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

1 <223> AP06

<400> 60

ccgaactcga ttgcgcac 18 <210> 61

<211> 18

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP07

<400> 61

agccattccc aaattgtc 18 <210> 62

<211> 18

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP08

<400> 62

ctcccagttc aattacag 18 <210> 63

<211> 18

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP09

<400> 63

cgttagctat ggatcctc 18 <210> 64

<211> 22

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> AP10

1 cgagacagag aagactcttg cg 22

<210> 65

<211> 22

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> AP12

<400> 65

cattcaacag accttgcatt cc 22

<210> 66

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> C-terminalni peptid isečen iz rastvorljivog rHuPH20 ak 431-447 <400> 66

<210> 67

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> C-terminalni peptid isečen iz rastvorljivog rHuPH20 ak 431-446 <400> 67

<210> 68

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> C-terminalni peptid isečen iz rastvorljivog rHuPH20 ak 431-445

1

<210> 69

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> C-terminalni peptid isečen iz rastvorljivog rHuPH20 ak 431-444 <400> 69

<210> 70

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> C-terminalni peptid isečen iz rastvorljivog rHuPH20 ak 431-443 <400> 70

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> C-terminalni peptid isečen iz rastvorljivog rHuPH20 ak 431-442 <400> 71

1

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži smešu polipeptida, gde navedena smeša sadrži polipeptide prikazane u SEQ ID NOS: 4-8, naznačena time što se kompozicija može dobiti sledećim postupkom:

a) inokulacijom ćelijskog medijuma u bioreaktoru sa inokulumom ćelija koje kodiraju rastvorljivi rekombinantni humani PH20 (rHuPH20) za proizvodnju ćelijske kulture, pri čemu:

ćelije sadrže između 150 i 300 kopija nukleinske kiseline koja kodira rastvorljivi rHuPH20;

bioreaktor sadrži najmanje 100 litara ćelijske kulture;

10<10>- 10<11>ćelija je inokulisano na 100 litara ćelijske kulture; i

ćelije se kultivišu na podešenoj temperaturi;

b) hranjenje ćelija prvim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, humani insulin i ekstrakt kvasca u količinama dovoljnim da povećaju rast ćelija i pik ćelijske gustine, i da povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20, pri čemu se hranljivi medijum dodaje kulturi u zapremini od 0.5% do 20% zapremine ćelijske kulture;

c) hranjenje ćelija drugim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20 i indukuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa; i snižavanje temperature u poređenju sa temperaturom u koraku a) na temperaturu dovoljnu da poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelije i stabilizuje rastvorljivu hijaluronidazu; pri čemu:

količina L-alanil-L-glutamina je smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamina u koraku b);

količina ekstrakta kvasca je povećana u poređenju sa količinom ekstrakta kvasca u koraku b); i

hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 0.5% do 20% zapremine ćelijske kulture;

d) hranjenje ćelija trećim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20 i povećaju zaustavljanje ćelijskog ciklusa, i snižavanje temperature u poređenju sa temperaturom u koraku c) do temperature dovoljne da poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljivu hijaluronidazu; pri čemu:

količina L-alanil-L-glutamina je smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamina u koraku c);

količine ekstrakta kvasca, glukoze i natrijum butirata su povećane u poređenju sa količinama ekstrakta kvasca, glukoze i natrijum butirata u koraku c); i

hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 0.5% do 20% zapremine ćelijske kulture;

e) hranjenje ćelija četvrtim hranljivim medijumom koji sadrži glukozu, L-alanil-L-glutamin, ekstrakt kvasca i natrijum butirat u količinama dovoljnim da povećaju sintezu rastvorljivog rHuPH20 i povećaju zaustavljanje ćelijskog ciklusa, i snižavanje temperature u poređenju sa temperaturom u koraku d) do temperature dovoljne da poveća zaustavljanje ćelijskog ciklusa, poveća vijabilnost ćelija i stabilizuje rastvorljivu hijaluronidazu; pri čemu:

količina L-alanil-L-glutamina i glukoze je smanjena u poređenju sa količinom L-alanil-L-glutamina i glukoze u koraku d);

količina natrijum butirata je smanjena u poređenju sa količinom natrijum butirata u koraku d); i

hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 0.5% do 20% zapremine ćelijske kulture;

f) nastavak kultivisanja ćelija sve dok vijabilnost ne padne ispod najmanje 50%;

g) dobijanje tečnosti sakupljene ćelijske kulture; i

h) prečišćavanje rHuPH20 iz tečnosti sakupljene ćelijske kulture,

1

pri čemu je rastvorljivi rHuPH20 rastvorljivi oblik humanog PH20 koji je rekombinantno eksprimiran u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO).

2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je temperatura u koraku a) 37 °C.

3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što je temperatura u koraku c) 36.5 °C.

4. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-3, naznačena time što je temperatura u koraku d) 36 °C.

5. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-4, naznačena time što je temperatura u koraku e) 35.5 °C.

6. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-5, naznačena time što se tečnost sakupljene ćelijske kulture filtrira pre prečišćavanja.

7. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-6, naznačena time što se prečišćavanje rastvorljivog rHuPH20 vrši hromatografijom na koloni.

8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što hromatografija na koloni obuhvata hromatografiju na koloni sa agaroznim kuglicama, hromatografiju na koloni sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, hromatografiju na koloni sa amino fenil boronatom i hromatografiju na koloni sa hidroksiapatitom.

9. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-8, naznačena time što se hranljivi medijum dodaje u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture.

10. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što:

u koraku a) ćelije se kultivišu na 37 °C;

1 1

u koraku b) prvi hranljivi medijum sadrži 33 g/L glukoze, 32 mM L-alanil-L-glutamina, 16.6 g/L ekstrakta kvasca i 33 mg/L insulina, a hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture;

u koraku c) drugi hranljivi medijum sadrži 33 g/L glukoze, 16 mM L-alanil-L-glutamina, 33.4 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, a hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture; i

temperatura se spušta na 36.5 °C;

u koraku d) treći hranljivi medijum sadrži 50 g/L glukoze, 10 mM L-alanil-L-glutamina, 50 g/L ekstrakta kvasca i 1.8 g/L natrijum butirata, a hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremina od 4% zapremine ćelijske kulture; i

temperatura se spušta na 36 °C;

u koraku e) četvrti hranljivi medijum sadrži 33 g/L glukoze, 6.6 mM L-alanil-L-glutamina, 50 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, a hranljivi medijum se dodaje u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture; i

temperatura se spušta na 35.5 °C; dalje sadrži filtriranje tečnosti sakupljene ćelijske kulture dobijene u koraku g) i

u koraku h) prečišćavanje rHuPH20 iz tečnosti sakupljene kulture korišćenjem hromatografije na koloni sa agaroznim kuglicama, hromatografije na koloni sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, hromatografije na koloni sa amino fenil boronatom ili hromatografije na koloni sa hidroksiapatitom.

11. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što:

u koraku a) ćelije se inokulišu na gustini ćelija od 4 × 10<5>ćelija/mL; i

ćelije se kultivišu na 37 °C;

u koraku b) prvi hranljivi medijum sadrži 33 g/L glukoze, 32 mM L-alanil-L-glutamina, 83.3 g/L ekstrakta kvasca i 33 mg/L insulina, a hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture;

u koraku c) drugi hranljivi medijum sadrži 33 g/L glukoze, 13 mM L-alanil-L-glutamina, 166.7 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, a hranljivi medijum se dodaje u kulturu u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture; i temperatura se spušta na 36.5 °C;

1 2

u koraku d) treći hranljivi medijum sadrži 50 g/L glukoze, 10 mM L-alanil-L-glutamina, 250 g/L ekstrakta kvasca i 1.8 g/L natrijum butirata, a hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture; i

temperatura se spušta na 36 °C;

u koraku e) četvrti hranljivi medijum sadrži 33 g/L glukoze, 6.7 mM L-alanil-L-glutamina, 250 g/L ekstrakta kvasca i 0.92 g/L natrijum butirata, a hranljivi medijum se dodaje kulturi u zapremini od 4% zapremine ćelijske kulture; i

temperatura se spušta na 35.5 °C; dalje sadrži

filtriranje tečnosti sakupljene ćelijske kulture dobijene u koraku g) i

u koraku h) prečišćavanje rHuPH20 iz tečnosti sakupljene kulture korišćenjem hromatografije na koloni sa agaroznim kuglicama, hromatografije na koloni sa fenil supstituisanim agaroznim kuglicama, hromatografije na koloni sa amino fenil boronatom ili hromatografije na koloni sa hidroksiapatitom.

12. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-11, naznačena time što se najmanje 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ili 40 grama rastvorljivog rHuPH20 proizvodi na 100 L ćelijske kulture.

13. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-12, naznačena time što je specifična aktivnost rastvorljivog rHuPH20 najmanje 80000, 100000, 120000, 140000, 160000 ili 180 000 jedinica/mg.

14. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-13, naznačena time što je zapremina ćelijske kulture u bioreaktoru 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 ili 3500 litara.

15. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-14, naznačena time što su ćelije koje kodiraju rastvorljivi rHuPH20 ćelije DG44 CHO.

16. Kompozicija prema bilo kom patentnom zahtevu 1-15, naznačena time što je rHuPH20 kodiran nukleinskom kiselinom prikazanom u SEQ ID NO:47.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5

1