RS65644B1

RS65644B1 - Kompozicije i postupci za lečenje kit- i pdgfra-posredovanih bolesti

Info

Publication number: RS65644B1
Application number: RS20240664A
Authority: RS
Inventors: Joseph L Kim; Thomas A Dineen; Timothy Guzi
Original assignee: Blueprint Medicines Corp
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2024-07-31
Also published as: US20260138986A1; CN113939515A; SMT202400229T1; WO2020210293A1; FI3953357T3; CL2021002656A1; TWI857043B; CA3136802A1; HUE067299T2; MY209048A; EP3953357A1; KR102875260B1; EP4424312A2; US20220153748A1; IL287168B1; AU2020272743A1; HRP20240702T1; PE20212331A1; PH12021552568A1; TW202104231A

Description

[001] Ova prijava se poziva na prioritet SAD privremene prijave br. 62/833,529, podnete 12 aprila, 2019; SAD privremene prijave br. 62/911,016, podnete 4 oktobra, 2019; i SAD privremene prijave br.62/930,240, podnete 4 novembra, 2019.

[002] Ovo otkriće se odnosi na nova jedinjenja pirolotriazina i njihovu upotrebu kao selektivnih inhibitora aktiviranih mutiranih KIT i PDGFRĮ protein kinaza. Jedinjenja koja su ovde otkrivena su korisna u farmaceutskim kompozicijama, kao što je, npr., za lečenje hroničnih poremećaja. KIT receptor pripada familiji receptora tirozin kinaze klase III, koja takođe uključuje strukturno povezani protein PDGFRĮ. Normalno, faktor matičnih ćelija se vezuje i aktivira KIT indukovanjem dimerizacije i autofosforilacije, što izaziva inicijaciju nizvodne signalizacije. U nekoliko tipova tumora, međutim, somatske mutacije u KIT pokreću ligand-nezavisnu konstitutivnu aktivnost onkogena, uključujući tipove tumora kao što su akutna mijeloidna leukemija, melanom, interkranijalni tumori germinativnih ćelija, medijastinalni B-ćelijski limfom, seminom i gastrointestinalni tumori. Takođe je poznato da KIT mutant ima ulogu u aktivaciji mastocita, što je uobičajeno i eventualno neophodno za održavanje. Poremećena aktivacija mastocita nastaje kada se mastociti patološki prekomerno proizvode ili ako je njihova aktivacija nestrazmerna uočenom narušavanju homeostaze. Sindrom aktivacije mastocita odnosi se na grupu poremećaja sa različitim uzrocima koji predstavljaju epizodne multisistemske simptome kao rezultat oslobađanja posrednika mastocita. Mastocitoza je jedan tip sindroma aktivacije mastocita. Svetska zdravstvena organizacija (WHO) klasifikuje mastocitozu u 7 različitih kategorija: kutana mastocitoza, indolentna sistemska mastocitoza (ISM), tinjajuća sistemska mastocitoza (SSM), mastocitoza sa povezanom hematološkom neoplazmom (SM-AHN), agresivna sistemska mastocitoza (ASM), leukemija mastocita (MCL) i sarkom mastocita

[003] Sistemska mastocitoza je klonalni poremećaj mastocita koji se karakteriše povećanim opterećenjem mastocita, sa fokalnim i/ili difuznim infiltratima neoplastičnih mastocita u koži, koštanoj srži, slezini, jetri, gastrointestinalnom traktu i drugim organima i povećanim oslobađanjem posrednika mastocita. SM uključuje 5 podtipova mastocitoze: indolentni SM (ISM), tinjajući SM (SSM), SM sa pridruženom hematološkom neoplazmom ne-MC loze (SM-AHN), agresivnog SM (ASM) i MC leukemije (MCL). Ove tri pod-klasifikacije su povezane sa smanjenim ukupnim preživljavanjem i grupisane su zajedno kao napredni SM (NapSM). ISM je hronični poremećaj povezan sa normalnim ili skoro normalnim očekivanim životnim vekom i prognoza SSM je osrednja. ISM i SSM se grupišu zajedno kao ne-napredni SM (ne-Nap SM).

[004] U svim podtipovima SM, a kod većine obolelih pacijenata, neoplastične mastocite ćelije imaju mutaciju na poziciji D816 u egzonu 17 KIT, što rezultuje ligand-nezavisnom aktivacijom aktivnosti KIT kinaze. Mastociti divljeg tipa zahtevaju aktivnost KIT za njihovu diferencijaciju i preživljavanje, a smatra se da je konstitutivno aktiviranje KIT kroz D816V mutaciju patogeni pokretač SM. Konkretno, KIT D816V mutacije nalaze se u 90% do 98% pacijenata sa SM, sa retkim KIT D816Y, D816F i D816H identifikovanim varijantama. Na osnovu ovih pronalazaka, KIT D816V se smatra glavnim terapeutskim ciljem u SM.

[005] Hronični poremećaji indolentni SM i SSM se karakterišu teškim simptomima, uključujući svrab, ispiranje, gastrointestinalne grčeve, proliv, anafilaksu, bolove u kostima, i osteoporozu. Ovi simptomi mogu biti ozbiljno iscrpljujući, što negativno utiče na kvalitet života. Još uvek nema odobrenih terapija za ISM ili SSM. Tako, otkrivanje novih tretmana koji ciljano deluju na ISM ili SSM bilo bi korisno.

[006] Jedinjenja pirolotriazina koja imaju inhibitornu aktivnost na mutiran KIT i PDGFRĮ prijavljena su u WO2015/057873. Konkretno, određena jedinjenja koja nose N-alkil pirazol su služila za primer u WO2015/057873 i imaju inhibitornu aktivnost na mutiran KIT i PDGFRĮ, npr., jedinjenje 63 sa N-etil pirazolom. Hemijske strukture ovih N-alkil pirazol jedinjenja koja su služila za primer u WO2015/057873 se razlikuju od onih jedinjenja prema ovom pronalasku.

[007] Štaviše, iako su jedinjenja pirolotriazina koja imaju inhibitornu aktivnost na mutirani KIT i PDGFRĮ otkrivena u WO2015/057873, svojstva ovih jedinjenja se dosta razlikuju od onih jedinjenja prema ovom pronalasku.

[008] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi nova jedinjenja sa visoko selektivnim, snažnim aktivnostima nasuprot mutiranih KIT i PDGFRĮ kinaza za bezbedno i efikasno lečenje hroničnih poremećaja, kao što su ISM i SSM, kao i drugih bolesti posredovanih mutiranim KIT ili PDGFRA. U lečenju ovih poremećaja, posebno hroničnih poremećaja kao što su ISM i SSM, svaku novu terapiju treba dobro podneti. Posebno, postoji potreba za novim jedinjenjima usmerenim na mutirane KIT i PDGFRĮ kinaze koji imaju smanjene nivoe nepoželjnih neželjenih efekata na CNS koji su povezani sa drugim poznatim jedinjenjima pirolotriazina.

[009] Sadašnji pronalazači su otkrili nova jedinjenja koja imaju visoku selektivnost i potenciju nasuprot mutiranih KIT i PDGFRĮ kinaza koji, istovremeno, poseduju dodatne poželjne osobine, kao što je, npr., malo ili nikakvo prodiranje u CNS, niske koncentracije ne-vezane za mozak i visoke nivoe ili aktivni transport iz mozga, tj., visoki odnosi efluksa iz CNS. S obzirom na ovu poželjnu ravnotežu svojstava, jedinjenja prema ovom pronalasku su posebno pogodna za tretman na periferiji, posebno za hronični tretman na periferiji, dok su neželjeni efekti u CNS smanjeni ili minimizirani.

[0010] Stoga, jedinjenja prema ovom pronalasku imaju za cilj da obezbede tretmane koji imaju poželjnu efikasnost, bezbednost i farmaceutske osobine za lečenje KIT- i PDGFRA-posredovanih bolesti. Tačnije, jedinjenja prema ovom pronalasku pokazuju konstelaciju korisnih svojstava uključujući smanjeni nivo prodiranja u mozak, uz održavanje efikasnosti i drugih poželjnih farmaceutskih svojstava u odnosu na poznata jedinjenja pirolotriazina koja imaju inhibitornu aktivnost na mutirani KIT i PDGFRĮ.

Skraćenice i definicije

[0011] Sledeće skraćenice i termini imaju naznačena značenja kroz ceo tekst:

[0012] Termin "KIT" se odnosi na humanu tirozin kinazu koja se može nazvati receptorom faktora rasta mastocita/matičnih ćelija (SCFR), proto-onkogen c-KIT, tirozin-protein kinaza Kit ili CD117. Kako je upotrebljen ovde, termin "KIT nukleotid" obuhvata KIT gen, KIT iRNK, KIT cDNK i proizvode za njihovu amplifikaciju, mutacije, varijacije i fragmente. "KIT gen" se koristi za označavanje gena koji kodira polipeptid sa aktivnošću KIT kinaze, npr., čija se sekvenca nalazi između 55,524,085 i 55,606,881 nukleotida hromozoma 4 referentnog humanog genoma hg 19. "KIT transkript" se odnosi na proizvod transkripcije KIT gena, čiji jedan primer ima sekvencu NCBI referentne sekvence NM_000222.2. Termin "KIT protein" se odnosi na sekvencu polipeptida koja je nastala translacijom KIT nukleotida ili njegovog dela.

[0013]Termin "PDGFRA" se odnosi na humanu tirozin kinazu koja se može nazvati alfa faktorom rasta izvedenim iz trombocita. Kako je upotrebljen ovde, termin "PDGFRA nukleotid" obuhvata PDGFRA gen, PDGFRA iRNK, KIT cDNK i proizvode za njihovu amplifikaciju, mutacije, varijacije i fragmente. "PDGFRA gen" se koristi za označavanje gena koji kodira polipeptid sa aktivnošću PDGFRA kinaze, npr., čija se sekvenca nalazi između 54,229,089 i 54,298,247 nukleotida hromozoma 4 referentnog Homo sapiens Annotation Release 109, GRCh38.p12. "PDGFRA transkript" se odnosi na proizvod transkripcije PDGFRA gena, čiji jedan primer ima sekvencu NCBI referentne sekvence NM_006206.6. Termin "PDGFRA protein" ili “PDGFRĮ” se odnosi na sekvencu polipeptida koja je nastala translacijom PDGFRA nukleotida ili njegovog dela.

[0014] Kako je upotrebljena ovde, "maligna bolest" se odnosi na bolest u kojoj se abnormalne ćelije dele bez kontrole i mogu da napadnu obližnja tkiva. Maligne ćelije mogu se proširiti i na druge delove tela putem krvi ili limfnog sistema. Neograničavajući primeri malignih bolesti su karcinom, sarkom, leukemija i limfom. Kancer je neograničavajući primer maligne bolesti. U nekim primerima izvođenja pronalaska, sistemska mastocitoza je neograničavajući primer maligne bolesti.

[0015] Neograničavajući primeri kancera uključuju gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), AML (akutnu mijeloidnu leukemiju), melanom, seminom, interkranijalne tumore germinativnih ćelija, i medijastinalni B-ćelijski limfom.

[0016] Kako je upotrebljen ovde, "eozinofilni poremećaj" se odnosi na poremećaj pri čemu se eozinofili nalaze u količini iznad normalne u raznim delovima tela i/ili kada postoji veći od normalnog odnosa hipodenznih naspram normodenznih eozinofila (npr., veći od 30%). Eozinofilni poremećaj opisan ovde se karakteriše preteranom količinom eozinofila (eozinofilija). Povećan broj eozinofila dovodi do zapaljenja tkiva i uzrokuje oštećenje organa. Najčešće su pogođeni srce, pluća, koža i nervni sistem, ali bilo koji organ može biti oštećen.

[0017] Eozinofilni poremećaji se dijagnostikuju prema lokaciji na kojoj su povišeni nivoi eozinofila:

Eozinofilna pneumonija (pluća)

Eozinofilna kardiomiopatija (srce)

Eozinofilni ezofagitis (jednjak - EoE)

Eozinofilni gastritis (stomak - EG)

Eozinofilni gastroenteritis (želudac i tanko crevo - EGE)

Eozinofilni enteritis (tanko crevo)

Eozinofilni kolitis (debelo crevo - EC)

Hipereozinofilni sindrom (krv i bilo koji organ - HES)

[0018] Kako je upotrebljen ovde, termin "subjekat" ili "pacijent" se odnosi na organizme koji se leče postupcima prema ovom pronalasku. Takvi organizmi uključuju, ali se ne ograničavaju na, sisare (npr., miševe, majmune, konje, goveda, svinje, pse, mačke i slično), a u nekim primerima izvođenja pronalaska, ljude.

[0019] Kako je upotrebljena ovde, fraza "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu aktivnog agensa dovoljnu za korisne ili željene rezultate. Terapeutski efektivna količina može da se primeni u jednoj ili više primena, aplikacija, ili doza i nije namenjeno da bude ograničena na određenu formulaciju ili put primene.

[0020] Kako je upotrebljena ovde, fraza "težina ekvivalentna njegovoj farmaceutski prihvatljivoj soli" u odnosu na određeno jedinjenje uključuje težinu i jedinjenja i povezane soli.

[0021] Kako je upotrebljena ovde, fraza "njegova farmaceutski prihvatljiva so", ako se koristi u odnosu na aktivni agens distribuiran u obliku soli, odnosi se na bilo koji farmaceutski prihvatljiv oblik soli aktivnog agensa.

[0022] Kako je upotrebljen ovde, termin "lečenje" uključuje bilo kakav efekat, npr., umanjenje, smanjivanje, modulisanje, poboljšanje ili eliminisanje, što rezultuje poboljšanjem stanja, bolesti, poremećaja, i slično, ili ublažavanjem njegovih simptoma.

[0023] Iako je moguće da se aktivni agens primenjuje sam, u nekim primerima izvođenja pronalaska, aktivni agens se može primeniti kao farmaceutska formulacija, pri čemu se aktivni agens kombinuje sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom ili nosačem. Na primer, aktivni agens može biti formulisan za primenu na bilo koji pogodan način za upotrebu u humanoj ili veterinarskoj medicini. U određenim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenje uključeno u farmaceutski preparat može biti aktivno samo po sebi, ili može biti prolek, npr., sposoban da bude pretvoren u aktivno jedinjenje u fiziološkom okruženju.

[0024] Fraza "farmaceutski prihvatljiva" kako je ovde upotrebljena bi se odnosila na jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili oblike doza koje su, u okviru medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez preterane toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu korist/rizik.

[0025] Kako je upotrebljen ovde, "alkil" se odnosi na monovalentni radikal zasićenog pravolinijskog ili razgranatog ugljovodonika, kao što je pravolinijska ili razgranata grupa od 1-12, 1-10, ili 1-6 atoma ugljenika, koji se ovde označavaju kao C1-C12alkil, C1-C10alkil, i C1-C6alkil, po redu. Na primer, C1alkil je metil.

[0026] Kako je upotrebljen ovde, "halo" se odnosi na radikal bilo kog halogena, npr., -F, -Cl, -Br, ili -I.

[0027] Kako je upotrebljen ovde, "haloalkil" i "haloalkoksi" se odnose na alkil i alkoksi strukture koje su supstituisane sa jednom ili više halo grupa ili sa njihovim kombinacijama. Na primer, termini "fluoroalkil" i "fluoroalkoksi" uključuju haloalkil i haloalkoksi grupe, po redu, u kojima je halo fluor. "Haloalkilen" se odnosi na dvovalentni alkil, npr., -CH2-, -CH2CH2-, i -CH2CH2CH2-, u kome se jedan ili više atoma vodonika zamenjuje sa halo, a uključuje i alkil grupe u kojima su svi vodonici zamenjeni sa halo.

[0028] Kako je upotrebljen ovde, "cikloalkil" se odnosi na ciklične, biciklistične, triciklične ili policiklične nearomične grupe ugljovodonika koje imaju 3 do 12 ugljenika. Bilo koji atom u prstenu koji se može zameniti može biti supstituisan (npr., sa jednim ili više supstituenata). Cikloalkilne grupe mogu sadržati spojene ili spiro prstenove. Spojeni prstenovi su prstenovi koji dele zajednički atom ugljenika. Primeri cikloalkil grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, i cikloheksil.

[0029] Kako je upotrebljen ovde, "heterociklil" se odnosi na monovalentni radikal heterocikličnog sistema prstenova. Primeri heterocikla uključuju, ali se ne ograničavaju na, sisteme prstena u kojima je svaki prsten nearomatičan i najmanje jedan prsten sadrži heteroatom, npr., oksetanil, tetrahidrofuranil i tetrahidropiranil.

[0030] Kako je upotrebljena ovde, definicija svakog izraza, npr., alkil, m, n, itd., kada se pojavi više puta u bilo kojoj strukturi, namenjeno je da bude nezavisna od svoje definicije na drugim mestima u istoj strukturi.

[0031] Određena jedinjenja pronalaska mogu postojati u određenim geometrijskim ili stereoizomernim oblicima. Ovaj pronalazak razmatra sva takva jedinjenja, uključujući njihove cis- i trans-izomere, R- i S-enantiomere, diastereomere, (D)-izomere, (L)-izomere, racemske smeše i druge njihove smeše, što spada u okvir ovog pronalaska. Dodatni asimetrični atomi ugljenika mogu biti prisutni u supstituentu, kao što je, npr., alkil grupa. Svi takvi izomeri, kao i njihove smeše, treba da budu uključeni u ovaj pronalazak.

[0032] Ako se, na primer, poželi određeni enantiomer jedinjenja prema otkiću, može se pripremiti asimetričnom sintezom, ili derivacijom sa hiralnom pomoćnom supstancom, pri čemu se razdvaja dobijena dijastereomerna smeša i pomoćna grupa se cepa da bi se obezbedili čisti željeni enantiomeri. Alternativno, gde molekul sadrži osnovnu funkcionalnu grupu, kao što je, npr., amino, ili kiselu funkcionalnu grupu, kao što je, npr., karboksil, diastereometrijske soli se formiraju sa odgovarajućom optički aktivnom kiselinom ili bazom, nakon čega sledi rezolucija diastereomera, formiranih frakcionom kristalizacijom ili hromatografskim sredstvima koja su dobro poznata u tehnici, i naknadno oporavljanje čistih enantiomera.

[0033] Osim ako nije drugačije naznačeno, kada je jedinjenje prema pronalasku imenovano ili prikazano strukturom bez navođenja stereohemije i ima jedan ili više hiralnih centara, podrazumeva se da predstavlja sve moguće stereoizomere jedinjenja, kao i njihove smeše enantiomera.

[0034] "Enantiomerni višak" ili "% enantiomernog viška" kompozicije može se izračunati korišćenjem jednačine koja je prikazana u nastavku. U primeru prikazanom u nastavku, kompozicija sadrži 90% jednog enantiomera, npr., S enantiomera i 10% drugog enantiomera, tj., R enantiomera.

ee = (90-10)/100 = 80%.

[0035] Dakle, kaže se da kompozicija koja sadrži 90% jednog enantiomera i 10% drugog enantiomera ima enantiomerni višak od 80%.

[0036] Jedinjenja ili kompozicije opisane ovde mogu sadržati enantiomerni višak od najmanje 50%, 75%, 90%, 95%, ili 99% jednog oblika jedinjenja, npr., S-enantiomera. Drugim rečima, takva jedinjenja ili kompozicije sadrže enantiomerni višak S enantiomera u odnosu na R enantiomer.

[0037] Jedinjenja opisana ovde mogu takođe da sadrže neprirodne proporcije atomskih izotopa na jednom ili više atoma koji čine takva jedinjenja. Na primer, jedinjenja mogu biti radioaktivno označena radioaktivnim izotopima, kao što je, npr., deuterijum (<2>H), tricijum (<3>H), ugljenik-13 (<13>C) ili ugljenik-14 (<14>C). Sve izotopske varijacije jedinjenja koje su ovde otkrivene, bilo radioaktivne ili ne, su namenjene da budu obuhvaćene u okviru ovog pronalaska. Pored toga, svi automerni oblici jedinjenja opisani ovde treba da budu u okviru pronalaska.

[0038] Jedinjenja koja su ovde otkrivena mogu biti korisna u obliku slobodne baze ili soli. Reprezentativne soli uključuju soli hidrobromid, hidrohlorid, sulfat, bisulfat, fosfat, nitrat, acetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, benzoat, laktat, fosfat, tosilat, citrat, maleat, fumarat, sukcinat, tartarat, naftilat, mesilat, glukoheptonat, laktobionat, i laurilsulfonat i slično (Videti, npr., Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.66:1-19.)

[0039] Određena jedinjenja koja su ovde otkrivena mogu postojati u nerastvorenim oblicima kao i u rastvorenim oblicima, uključujući hidratisane oblike. Kako je upotrebljen ovde, termin "hidrat" ili "hidratisan" odnosi se na jedinjenje nastalo spajanjem vode sa matičnim jedinjenjem.

[0040] Generalno, rastvoreni oblici su ekvivalentni nerastvorenim oblicima i obuhvaćeni su u okviru ovog pronalaska. Određena jedinjenja otkrivena ovde mogu postojati u više kristalnih ili amorfnih oblika. Generalno, svi fizički oblici su ekvivalentni za razmatranu upotrebu prema pronalasku i namenjeni su da budu u okviru ovog pronalaska.

[0041] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja Formule I i njegove farmaceutski prihvatljive soli i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih. Neograničavajući primeri izvođenja pronalaska prema ovom pronalasku uključuju:

[0042] Primer izvođenja pronalaska 1. Jedinjenje Formule I:

njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od

prethodno pomenutih, pri čemu:

A je

R1je odabran od vodonika i metila;

R2je odabran od vodonika i metila; ili

R1i R2uzeti zajedno formiraju ciklopropil;

R3je odabran od vodonika i metila;

R4je odabran od vodonika i metila; ili

R3i R4uzeti zajedno formiraju ciklopropil;

R5je odabran od vodonika i metila;

R6je odabran od vodonika i metila; ili

R5i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil; ili

jedan od R2ili R4uzeti zajedno sa R6formira ciklobutil;

R7je vodonik, ili jedan od R2, R4, ili R6uzeti zajedno sa R7formiraju prsten odabran od oksetana, tetrahidrofurana, i tetrahidropirana, pri čemu je pomenuti tetrahidrofuran ili tetrahidropiran izborno supstituisan sa hidroksilom;

m je 0 ili 1; i

n je 0 ili 1.

[0043] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 1, pri čemu je m 0, R1i R2su odsutni. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 1, pri čemu je m 0, R3i R4su odsutni. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 1, m n = 1 ili m i n ne mogu biti 0.

[0044] Napominje se da u ovom pronalasku, kada bilo koje dve R grupe (npr., R1i R2) uzete zajedno formiraju strukturu prstena (npr., ciklopropil), namerava se uključivanje atoma ugljenika koji se nalaze među njima i/ili atoma kiseonika u istu strukturu prstena.

[0045] Primer izvođenja pronalaska 2. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu:

A je:

R3je odabran od vodonika i metila;

R4je odabran od vodonika i metila, ili R3i R4uzeti zajedno formiraju ciklopropil;

R5je odabran od vodonika i metila;

R6je odabran od vodonika i metila; ili

R4i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil; ili

R5i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil;

i R7je vodonik.

[0046] Primer izvođenja pronalaska 3. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 2, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu:

A je:

R3je odabran od vodonika i metila;

R5je odabran od vodonika i metila;

R6je odabran od vodonika i metila; ili

R5i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil;

i R7je vodonik.

[0047] Primer izvođenja pronalaska 4. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu:

A je

1

w je 1 ili 2;

t je 1 ili 2; i

s je 0 ili 1.

[0048] Primer izvođenja pronalaska 5. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-4, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima Kp< 0.39.

[0049] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 5, jedinjenje ima Kp< 0.39 kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 5, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21 i 22.

[0050] Primer izvođenja pronalaska 6. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-4, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima Kp 0.20.

[0051] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 6, jedinjenje ima Kp 0.20 kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 6, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 1, 3, 4, 5, 6, 9, 11, 13, 17, 18, 19, 20, 21, i 22.

[0052] Primer izvođenja pronalaska 7. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-6, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima Kp, uu 0.2 u homogenatu mozga pacova.

[0053] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 7, jedinjenje ima Kp, uu 0.2 u homogenatu mozga pacova kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 7, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, i 22.

[0054] Primer izvođenja pronalaska 8. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-7, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima Kp, uu< 0.1 u homogenatu mozga pacova.

[0055] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 8, jedinjenje ima Kp, uu< 0.1 u homogenatu mozga pacova kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 8, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 17, 18, 19, 20, i 22.

[0056] Primer izvođenja pronalaska 9. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-8, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima Kp, uu 0.05 u homogenatu mozga pacova.

[0057] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 9, jedinjenje ima Kp, uu 0.05 u homogenatu mozga pacova kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 9, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 1, 3, 4, 5, 6, 9, 17, 19, 20, i 22.

[0058] Primer izvođenja pronalaska 10. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-9, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima Kp, uu 0.1 u isečku mozga pacova.

[0059] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 10, jedinjenje ima Kp, uu 0.1 u isečku mozga pacova kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 10, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, i 22.

[0060] Primer izvođenja pronalaska 11. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-10, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima Kp, uu 0.05 u isečku mozga pacova.

[0061] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 11, jedinjenje ima Kp, uu 0.05 u isečku mozga pacova kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 11, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 20, i 22.

[0062] Primer izvođenja pronalaska 12. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-11, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima ne-vezani klirens (Clu) kod pacova od < 900 mL/min/kg.

[0063] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 12, jedinjenje ima Clukod pacova od < 900 mL/min/kg kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4.

U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 12, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 3, 4, 7, i 9.

[0064] Primer izvođenja pronalaska 13. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-12, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima ne-vezani klirens (Clu) kod pacova od < 750 mL/min/kg.

[0065] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 13, jedinjenje ima Clukod pacova od < 750 mL/min/kg kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 4. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 13, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je odabran od jedinjenja 4, 7, i 9.

[0066] Primer izvođenja pronalaska 14. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-12, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu jedinjenje ima IC50za CYP3A4 od < 10 ȝM.

[0067] U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 14, jedinjenje ima IC50za CYP3A4 od < 10 ȝM kako se meri prema proceduri opisanoj u primeru 5. U nekim primerima izvođenja pronalaska primera izvođenja pronalaska 14, jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih je jedinjenje 4.

[0068] Primer izvođenja pronalaska 15. Jedinjenje prema primeru izvođenja pronalaska 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

[0069] Primer izvođenja pronalaska 15-1. Jedinjenje prema primeru izvođenja pronalaska 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

1

[0070] Primer izvođenja pronalaska 16. Jedinjenje prema primeru izvođenja pronalaska 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

[0071] Primer izvođenja pronalaska 16-1. Jedinjenje prema primeru izvođenja pronalaska 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

[0072] Primer izvođenja pronalaska 17. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-3, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

[0073] Primer izvođenja pronalaska 18. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-3 ili 5, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

[0074] Primer izvođenja pronalaska 19. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-3 ili 5-6, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

[0075] Primer izvođenja pronalaska 20. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-3 ili 5-7, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je A odabran od

[0076] Primer izvođenja pronalaska 21. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-13, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je jedinjenje odabrano od 4, 7, i 9.

1

[0077] Primer izvođenja pronalaska 22. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-13, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je jedinjenje odabrano od 4 i 9.

[0078] Primer izvođenja pronalaska 23. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-13, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je jedinjenje

[0079] Primer izvođenja pronalaska 24. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-13, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je jedinjenje

[0080] Primer izvođenja pronalaska 25. Jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-13, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, pri čemu je jedinjenje

1

[0081] Primer izvođenja pronalaska 26. Farmaceutska kompozicija koja sadrži:

jedinjenje prema bilo kom primeru izvođenja pronalaska 1-25, njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih; i

farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0082] Primer izvođenja pronalaska 27. Jedinjenje prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 1-25, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja kod pacijenta kome je to potrebno pri čemu je bolest ili stanje odabrano od sistemske mastocitoze, gastrointestinalnih stromalnih tumora, akutne mijeloidne leukemije, melanoma, seminoma, interkranijalnih tumora germinativnih ćelija, medijastinalnog B-ćelijskog limfoma, Ewing-ovog sarkoma, difuznog krupnoćelijskog limfoma B ćelija, disgerminoma, mijelodisplastičnog sindroma, nazalnog NK/T-ćelijskog limfoma, hronične mijelomonocitne leukemije, i kancera mozga.

[0083] Primer izvođenja pronalaska 28. Jedinjenje prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 1-25, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja posredovanih mutiranim KIT ili PDGFRĮ kod pacijenta kome je to potrebno.

[0084] Primer izvođenja pronalaska 29. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 28, pri čemu je bolest ili stanje odabrano od sistemske mastocitoze, gastrointestinalnih stromalnih tumora, akutne mijeloidne leukemije, melanoma, seminoma, interkranijalnih tumora germinativnih ćelija, medijastinalnog B-ćelijskog limfoma, Ewing-ovog sarkoma, difuznog krupnoćelijskog limfoma B ćelija, disgerminoma, mijelodisplastičnog sindroma, nazalnog NK/T-ćelijskog limfoma, hronične mijelomonocitne leukemije, i kancera mozga.

1

[0085] Primer izvođenja pronalaska 30. Jedinjenje prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 1-25, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, za upotrebu kao lek u lečenju bolesti ili stanja kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu je bolest ili stanje odabrano od sistemske mastocitoze, gastrointestinalnih stromalnih tumora, akutne mijeloidne leukemije, melanoma, seminoma, interkranijalnih tumora germinativnih ćelija, medijastinalnog B-ćelijskog limfoma, Ewing-ovog sarkoma, difuznog krupnoćelijskog limfoma B ćelija, disgerminoma, mijelodisplastičnog sindroma, nazalnog NK/T-ćelijskog limfoma, hronične mijelomonocitne leukemije, i karcera mozga.

[0086] Primer izvođenja pronalaska 31. Jedinjenje prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 1-25, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu kao lek u lečenju bolesti ili stanja posredovanih mutiranim KIT ili PDGFRA kod pacijenta kome je to potrebno.

[0087] Primer izvođenja pronalaska 32. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 31, pri čemu je bolest ili stanje odabrano od sistemske mastocitoze, gastrointestinalnih stromalnih tumora, akutne mijeloidne leukemije, melanoma, seminoma, interkranijalnih tumora germinativnih ćelija, medijastinalnog B-ćelijskog limfoma, Ewing-ovog sarkoma, difuznog krupnoćelijskog limfoma B ćelija, disgerminoma, mijelodisplastičnog sindroma, nazalnog NK/T-ćelijskog limfoma, hronične mijelomonocitne leukemije, i kancera mozga.

[0088] Primer izvođenja pronalaska 33. Jedinjenje prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 1-25, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu u postupku lečenja eozinofilnog poremećaja, kod pacijenta kome je to potrebno.

[0089] Primer izvođenja pronalaska 34. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 33, pri čemu je eozinofilni poremećaj odabran od hipereozinofilnog sindroma, eozinofilije, eozinofilnog enterogastritisa, eozinofilne leukemije, eozinofilnog granuloma i Kimura-ove bolesti.

[0090] Primer izvođenja pronalaska 35. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 33, pri čemu je eozinofilni poremećaj hipereozinofilni sindrom.

[0091] Primer izvođenja pronalaska 36. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 33, pri čemu je eozinofilni poremećaj eozinofilna leukemija.

[0092] Primer izvođenja pronalaska 37. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 36, pri čemu je eozinofilna leukemija hronična eozinofilna leukemija.

1

[0093] Primer izvođenja pronalaska 38. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 33-37, pri čemu je eozinofilni poremećaj refraktoran na lečenje sa imatinibom, sunitinibom i ili regorafenibom.

[0094] Primer izvođenja pronalaska 39. Jedinjenje prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 1-25, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu kao lek za lečenje eozinofilnog poremećaja.

[0095] Primer izvođenja pronalaska 40. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 39, pri čemu je eozinofilni poremećaj odabran od hipereozinofilnog sindroma, eozinofilije, eozinofilnog enterogastritisa, eozinofilne leukemije, eozinofilnog granuloma i Kimura-ove bolesti.

[0096] Primer izvođenja pronalaska 41. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 39, pri čemu je eozinofilni poremećaj hipereozinofilni sindrom.

[0097] Primer izvođenja pronalaska 42. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 39, pri čemu je eozinofilni poremećaj eozinofilna leukemija.

[0098] Primer izvođenja pronalaska 43. Jedinjenje primera izvođenja pronalaska 42, pri čemu je eozinofilna leukemija hronična eozinofilna leukemija.

[0099] Primer izvođenja pronalaska 44. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 39-43, pri čemu je eozinofilni poremećaj refraktoran na lečenje sa imatinibom, sunitinibom i/ili regorafenibom.

[00100] Primer izvođenja pronalaska 45. Jedinjenje prema bilo kom od primera izvođenja pronalaska 1-25, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu u postupku lečenja poremećaja mastocita, kod pacijenta kome je to potrebno.

[00101] Primer izvođenja pronalaska 46. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 45, pri čemu je poremećaj mastocita posredovan mutiranim KIT ili PDGFRĮ.

[00102] Primer izvođenja pronalaska 46-1. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 45, pri čemu je poremećaj mastocita posredovan sa divljim tipom KIT ili PDGFRĮ.

[00103] Primer izvođenja pronalaska 47. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 46, pri čemu je poremećaj mastocita odabran od sindroma aktivacije mastocita (MCAS) i nasledne alfa triptasemije (HAT).

[00104] Primer izvođenja pronalaska 48. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 47, pri čemu je MCAS odabran od monoklonskog sindroma aktivacije mastocita (MMAS), sekundarnog MCAS i idiopatskog MCAS.

1

[00105] Primer izvođenja pronalaska 48-1. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 27, pri čemu je bolest ili stanje sistemska mastocitoza.

[00106] Primer izvođenja pronalaska 49. Jedinjenje za upotrebu primera izvođenja pronalaska 48, pri čemu je sistemska mastocitoza odabrana od indolentne sistemske mastocitoze i tinjajuće sistemske mastocitoze.

U Tabeli 1 se navode jedinjenja pripremljena sintetičkim postupcima koji su ovde opisani.

2

[00107] Jedinjenja prema pronalasku su selektivni KIT inhibitori. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja prema pronalasku su selektivni D816V KIT inhibitori. Jedinjenja prema pronalasku su selektivni PDGFRĮ inhibitori. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja prema pronalasku su selektivni PDGFRĮ egzon 18 inhibitori. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja prema pronalasku su selektivni PDGFRĮ D842V inhibitori. Kako je upotrebljen ovde, "selektivni KIT inhibitor" ili "selektivni PDGFRĮ inhibitor" se odnosi na jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih koji selektivno inhibira KIT protein kinazu ili PDGFRĮ protein kinazu u odnosu na druge protein kinaze i ispoljava najmanje dvostruku selektivnost za KIT protein kinazu ili PDGFRĮ protein kinazu u odnosu na drugu kinazu. Na primer, selektivni KIT inhibitor ili selektivni PDGFRA inhibitor pokazuje najmanje 9-struku selektivnost, 10-struku selektivnost; najmanje 15-struku selektivnost; najmanje 20-struku selektivnost; najmanje 30-struku selektivnost; najmanje 40-struku selektivnost; najmanje 50-struku selektivnost; najmanje 60-struku selektivnost; najmanje 70-struku selektivnost; najmanje 80-

2

struku selektivnost; najmanje 90-struku selektivnost; najmanje 100-struku, najmanje 125-struku, najmanje 150-struku, najmanje 175-struku, ili najmanje 200-struku selektivnost za KIT protein kinazu ili PDGFRĮ kinazu u odnosu na drugu kinazu. U nekim primerima izvođenja pronalaska, selektivni KIT inhibitor ili selektivni PDGFRĮ inhibitor pokazuje najmanje 150-struku selektivnost u odnosu na drugu kinazu, npr., VEGFR2 (receptor 2 faktora rasta vaskularnog endotela), SRC (ne-receptorski protein tirozin kinaza), i FLT3 (Fmssličan tirozin kinazi 3). U nekim primerima izvođenja pronalaska, selektivni KIT ili selektivni PDGFRĮ inhibitor pokazuje selektivnost u odnosu na PDGRFȕ, CSF1R (receptor 1 faktora stimulacije kolonija), i FLT3. U nekim primerima izvođenja pronalaska, selektivni KIT ili selektivni PDGFRĮ inhibitor pokazuje selektivnost u odnosu na LCK (specifičnu protein kinazu za limfocite), ABL (jedarnu protein tirozin kinazu), kinazu 5 (NEK5) povezanu sa nemitotičkim genom A (NIMA), i ROCK1 (protein kinazu 1 sa namotanom zavojnicom udruženu sa rho). U nekim primerima izvođenja pronalaska, selektivnost za KIT protein kinazu ili PDGFRĮ protein kinazu u odnosu na druge kinaze se meri u ćelijskoj analizi (npr., ćelijska analiza). U nekim primerima izvođenja pronalaska, selektivnost za KIT protein kinazu ili PDGFRĮ protein kinazu u odnosu na druge kinaze se meri u biohemijskoj analizi (npr., biohemijska analiza).

[00108] Jedinjenja prema pronalasku su selektivna u odnosu na jonske kanale. U nekim primerima izvođenja pronalaska, selektivni KIT ili selektivni PDGFRĮ inhibitor ima ograničen potencijal da inhibira humani voltažni natrijumski kanal (hNav 1.2).

[00109] Jedinjenja prema pronalasku su selektivna za mutirani KIT u odnosu na divlji tip KIT. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku su selektivna za egzon 17 mutiranog KIT u odnosu na divlji tip KIT.

[00110] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje bolesti ili stanja povezanih sa aktivnošću mutiranog KIT ili mutiranog PDGFRA kod ljudi ili ne-ljudi. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku su za upotrebu kao lek. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku su za upotrebu u terapiji. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku su za upotrebu u proizvodnji leka. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje tretmane za malignitete uzrokovane sa KIT, uključujući mastocitozu (SM), GIST (gastrointestinalne stromalne tumore), AML (akutnu mijeloidnu leukemiju), melanom, seminom, interkranijalne tumore germinativnih ćelija, i/ili medijastinalni B-ćelijski limfom. Pored toga, mutacije u KIT su povezane sa Ewing-ovim sarkomom, DLBCL (difuznim krupnoćelijskim limfomom B ćelija), disgerminom, MDS (mijelodisplastičnim sindromom), NKTCL (nazalnim NK/T-ćelijskim limfomom), CMML

2

(hroničnom mijelomonocitnom leukemijom) i kancerima mozga. U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje tretmane za Ewing-ov sarkom, DLBCL, disgerminom, MDS, NKTCL, CMML i/ili kancere mozga. KIT mutacije se takođe nalaze kod kancera štitne žlezde, kolorektalnog karcera, kancera endometrijuma, kancera bešike, NSCLC, i kancera dojke (AACR Project GENIE). U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje sindroma aktivacije mastocita (MCAS). Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje sistemske mastocitoze. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje uznapredovale sistemske mastocitoze. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje indolentnog SM i tinjajućeg SM. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje GIST.

[00111] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje bolesti ili stanja povezanih sa KIT mutacijama u Egzonu 9, Egzonu 11, Egzonu 14, Egzonu 17 i/ili Egzonu 18 sekvence gena KIT. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje bolesti ili stanja povezanih sa PDGFRA mutacijama u Egzonu 12, Egzonu 14, i/ili Egzonu 18 sekvence gena PDGFRA. U nekim primerima izvođenja pronalaska, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom KIT mutacijom u Egzonu 9, Egzonu 11, Egzonu 14, Egzonu 17 i/ili Egzonu 18 sekvence gena KIT. U nekim primerima izvođenja pronalaska, obezbeđeni su tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom PDGFRA mutacijom u Egzonu 12, Egzonu 14, i/ili Egzonu 18 sekvence gena PDGFRA.

[00112] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti aktivna nasuprot jednog ili više KIT protein kinaza sa mutacijama u Egzonu 17 sekvence gena KIT (npr., mutacije KIT proteina D816V, D816Y, D816F, D816K, D816H, D816A, D816G, D816E, D816I, D816F, D820A, D820E, D820G, D820Y, N822K, N822H, V560G, Y823D, i A829P), i mnogo manje aktivna nasuprot divljieg tipa KIT protein kinaze. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom KIT mutacijom, kao što su one odabrane od D816V, D816Y, D816F, D816K, D816H, D816A, D816G, D816E, D816I, D816F, D820A, D820E, D820G, D820Y, N822K, N822H, V560G, Y823D, i A829P. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom KIT mutacijom, kao što su, npr., one odabrane od C809, C809G, D816H, D820A, D820G, N822H, N822K, i Y823D.

[00113] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti aktivna nasuprot jedne ili više KIT protein kinaza sa mutacijama u Egzonu 11 sekvence gena KIT (npr., mutacije KIT proteina del557-559insF, V559G/D). U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom KIT mutacijom, kao što su, npr., one odabrane od

2

L576P, V559D, V560D, V560G, W557G, Del 554-558EVQWK, del557-559insF, Del EVQWK554-558, Del EVQWKVVEEINGNNYVYI554-571, Del KPMYEVQWK550-558, Del KPMYEVQW550-557FL, Del KV558-559, Del KV558-559N, Del MYEVQW552-557, Del PMYE551-554, Del VV559-560, Del WKVVE557-561, Del WK557-558, Del WKVV557-560C, Del WKVV557-560F, DelYEVQWK553-558, i insercija K558NP.

[00114] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti aktivna nasuprot jedne ili više KIT protein kinaza sa mutacijama u Egzonu 11/13 sekvence gena KIT (npr., mutacije KIT proteina V559D/V654A, V560G/D816V, i V560G/822K). U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa jednom ili više KIT mutacija u Egzonu 11/13).

[00115] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti aktivna nasuprot jedne ili više KIT protein kinaze sa mutacijama u Egzonu 9 sekvence gena KIT. U nekim primerima izvođenja pronalaska, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom KIT mutacijom u Egzonu 9.

[00116] U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku nisu aktivna nasuprot KIT protein kinaza sa mutacijama V654A, N655T, T670I, i/ili N680.

[00117] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti aktivna nasuprot jedne ili više PDGFRĮ protein kinaze sa mutacijama. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su ovde postupci za lečenje bolesti ili stanja povezana sa najmanje jednom PDGFRA mutacijom u Egzonu 12 sekvence gena PDGFRA, kao što je, npr., mutacija PDGFRĮ proteina V561D, Del RV560-561, Del RVIES560-564, Ins ER561-562, SPDGHE566-571R, SPDGHE566-571K, ili Ins YDSRW582-586. U nekim primerima izvođenja pronalaska, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom PDGFRA mutacijom u Egzonu 14 sekvence gena PDGFRA, kao što je, npr., mutacija PDGFRĮ proteina N659K. U nekim primerima izvođenja pronalaska, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom PDGFRA mutacijom u Egzonu 18 sekvence gena PDGFRA, kao što su, npr., mutacije PDGFRĮ proteina D842V, D842Y, D842I, DI842-843IM, D846Y, Y849C, Del D842, Del 1843, Del RD841-842, Del DIM842-845, Del DIMH842-845, Del IMHD843-846, Del MHDS844-847, RD841-842KI, DIMH842-845A, DIMH842-845V, DIMHD842-846E, DIMHD842-846S, DIMHD842-846N, DIMHD842-846G, IMHDS843-847T, IMHDS8843-847M, ili HDSN845-848P.

[00118] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti aktivni nasuprot jednog ili više PDGFRĮ protein kinaza sa mutacijama Egzona 18 u sekvenci gena PDGFRA (npr., mutacije proteina PDGFRĮ D842V, PDGFRĮ D842I, ili PDGFRĮ D842Y). U nekim primerima izvođenja pronalaska, obezbeđeni su ovde tretmani za bolest ili stanje povezano sa najmanje jednom PDGFRA mutacijom u Egzonu 18, kao što je, npr., mutacija proteina PDGFRĮ D842V.

[00119] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje eozinofilnog poremećaja. U nekim primerima izvođenja, eozinofilni poremećaj je posredovan mutiranim KIT ili PDGFRĮ. U nekim primerima izvođenja, eozinofilni poremećaj je posredovan divljim tipom KIT ili PDGFRĮ. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su ovde tretmani za eozinofilni poremećaj, koji sadrže primenu na subjektu terapeutski efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i/ili rastvarača bilo kog od prethodno pomenutih. U jednom primeru izvođenja pronalaska, eozinofilni poremećaj je odabran od hipereozinofilnog sindroma, eozinofilije, eozinofilnog enterogastritisa, eozinofilne leukemije, eozinofilnog granuloma i Kimura-ove bolesti.

[00120] U jednom primeru izvođenja pronalaska, eozinofilni poremećaj je odabran od hipereozinofilnog sindroma, eozinofilije, eozinofilnog enterogastritisa, eozinofilne leukemije, eozinofilnog granuloma i Kimura-ove bolesti. Drugi eozinofilni poremećaji uključuju eozinofilni ezofagitis, eozinofilni gastroenteritis, eozinofilni fasciitis i Churg-Strauss-ov sindrom.

[00121] U jednom primeru izvođenja pronalaska, eozinofilni poremećaj je hipereozinofilni sindrom. U specifičnom primeru izvođenja pronalaska, hipereozinofilni sindrom je idiopatski hipereozinofilni sindrom. U jednom primeru izvođenja pronalaska, eozinofilni poremećaj je eozinofilna leukemija. U specifičnom primeru izvođenja pronalaska, eozinofilna leukemija je hronična eozinofilna leukemija. U drugom primeru izvođenja pronalaska, eozinofilni poremećaj je refraktoran na lečenje sa imatinibom, sunitinibom i/ili regorafenibom. U specifičnom primeru izvođenja pronalaska, eozinofilni poremećaj je refraktoran na lečenje sa imatinibom.

[00122] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za smanjenje broja eozinofila kod subjekta kome je to potrebno. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su ovde tretmani za smanjenje broja eozinofila kod subjekta kome je to potrebno. koji sadrže primenu na subjektu terapeutski efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i/ili rastvarača bilo kog od prethodno pomenutih.

[00123] U jednom primeru izvođenja pronalaska, otkriveni tretmani smanjuju broj eozinofila u krvi, koštanoj srži, gastrointestinalnom traktu (npr., jednjaku, želucu, tankom crevu i debelom crevu), ili plućima. U drugom primeru izvođenja pronalaska, tretman koji je ovde otkriven smanjuje broj eozinofila u krvi. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, tretman

1

koji je ovde otkriven smanjuje broj eozinofila u plućima. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, tretman koji je ovde otkriven smanjuje broj prekursorskih ćelija eozinofila.

[00124] U drugom primeru izvođenja pronalaska, otkriveni tretmani smanjuju (nakon primene) broj eozinofila za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%; najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili najmanje oko 99%. U specifičnom primeru izvođenja pronalaska, tretman koji je ovde otkriven smanjuje broj eozinofila ispod granice detekcije.

[00125] U drugom primeru izvođenja pronalaska, otkriveni tretmani smanjuju (nakon primene) broj prekursora eozinofila za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%; najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili najmanje oko 99%. U specifičnom primeru izvođenja pronalaska, tretman koji je ovde otkriven smanjuje broj prekursora eozinofila ispod granice detekcije.

[00126] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje poremećaja mastocita. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje sistemske mastocitoze. Mastocitoza je podeljena u dve grupe poremećaja: (1) kožna mastocitoza (CM) opisuje oblike koji su ograničeni na kožu; i (2) sistemska mastocitoza (SM) opisuje oblike u kojima mastociti infiltriraju ekstrakutane organe, sa ili bez zahvatanja kože. SM je dalje podeljena u pet oblika: indolenta (ISM); tinjajuća (SSM); agresivna (ASM); SM povezana sa hemotološkom bolešću ne-mastocitnih ćelija (SM-AHNMD); i leukemija mastocita (MCL).

[00127] Dijagnoza SM se delom zasniva na histološkim i citološkim studijama koštane srži koje pokazuju infiltraciju mastocita često atipične morfologije, koje često abnormalno eksprimiraju ne-mastocitne markere (CD25 i/ili CD2). Dijagnoza SM se potvrđuje kada infiltracija mastocita koštane srži nastaje u jednom od sledećih konteksta: (1) abnormalna morfologija mastocita (ćelije u obliku vretena); (2) povišen nivo serumske triptaze iznad 20 ng/mL; ili (3) prisustvo aktivirajućih mutacija KIT proteina, kao što su, npr., egzon 17 mutacije kao što su D816 mutacije kao što je D816V.

[00128] Aktivirajuće mutacije na poziciji D816 nalaze se u većini slučajeva mastocitoze (90-98%), a najčešće mutacije su D816V, D816H i D816Y. D816V mutacija se nalazi u petlji aktivacije domena protein kinaze i dovodi do konstitutivne aktivacije KIT kinaze.

[00129] Ne postoje odobreni lekovi za ne-napredne oblike sistemske mastocitoze, ISM ili SSM. Trenutni pristupi lečenju ovih hroničnih bolesti uključuju nespecifične terapije usmerene na simptome koje imaju različite stepene efikasnosti i nemaju uticaja na preteranu

2

količinu mastocita. Citoreduktivne terapije, kao što su kladribin i interferon alfa, povremeno se koriste za neizlečive simptome. Na osnovu trenutnog prikaza tretmana, ostaje nezadovoljena medicinska potreba kod pacijenata sa ISM i SSM sa umerenim do ozbiljnim simptomima kojima se ne može adekvatno upravljati dostupnim terapijama usmerenim na simptome.

[00130] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje ISM ili SSM. U nekim primerima izvođenja pronalaska, pacijent sa ISM ili SSM ima simptome koji su neadekvatno kontrolisani najmanje jednim, najmanje sa dva, najmanje sa tri simptomatska tretmana. Simptomi se mogu proceniti korišćenjem alata za procenu ishoda koje je prijavio pacijent (PRO) npr., obrascem za procenu simptoma indolentne sistemske mastocitoze (ISM-SAF) (ISPOR Europe 2019, Copenhagen Denmark, 2-6 Nov 2019). Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za poboljšanje simptoma povezanih sa ISM ili SSM npr., smanjenjem ili uklanjanjem svraba, ispiranja, glavobolje, i/ili gastrointestinalnih događaja, kao što su povraćanje, proliv, i bol u stomaku. Poboljšanja u simptomima mogu se proceniti pomoću ISM-SAF.

[00131] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje drugih poremećaja mastocita, kao što je sindrom aktivacije mastocita (MCAS) i nasledna alfa triptasemija (HAT) (Picard Clin. Ther. 2013, May 35(5) 548; Akin J.Allergy Clin. Immuno. 140(2)349 62. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje poremećaja mastocita povezanih sa KIT i PDGFRĮ mutacijama. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje bolesti mastocita povezanih sa divljim tipom KIT i PDGFRĮ.

[00132] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje sindroma aktivacije mastocita (MCAS), što je imunološko stanje u kojem mastociti neadekvatno i prekomerno oslobađaju hemijske medijatore, što dovodi do niza hroničnih simptoma, ponekad uključujući anafilaksu ili napade blizu anafilakse. Za razliku od mastocitoze, gde pacijenti imaju abnormalno povećan broj mastocita, pacijenti sa MCAS imaju normalan broj mastocita koje nemaju odgovarajuće funkcionisanje i koje se definišu kao "hiperreaktivne". Tipovi MCAS uključuju primarni MCAS (monoklonski sindrom aktivacije mastocita (MMAS)), sekundarni MCAS (MCAS koji nastaje od druge bolesti) i idiopatski MCAS (MCAS koji isključuje primarni ili sekundarni MCAS).

[00133] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje nasledne alfa triptasemije (HAT)(preterana ekspresija TPSAB1 uzrokuje povišenu triptazu)).

[00134] Druge bolesti mastocita uključuju astmu posredovanu mastocitima, anafilaksu (uključujući idiopatsku, posredovanu sa Ig-E i ne-Ig-E), urtikariju (uključujući idiopatsku i hroničnu), atopijski dermatitis, oticanje (angioedem), sindrom iritabilnog creva, mastocitni gastroenteritis, mastocitni kolitis, pruritus, hronični pruritus, pruritus koji je posledica hronične insuficijencije bubrega i stanja srca, krvnih sudova, creva, mozga, bubrega, jetre, pankreasa, mišića, kostiju i kože povezanih sa mastocitima. U nekim primerima izvođenjima pronalaska, bolest mastocita nije povezana sa mutiranim KIT ili mutiranim PDGFRĮ.

[00135] KIT i PDGFRA mutacije su u velikoj meri proučene u GIST. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje GIST povezanog sa KIT mutacijama. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje neresektabilnog ili metastatskog GIST. Skoro 80% metastatskih GISTs ima primarnu mutaciju koja se aktivira u ekstracelularnom regionu (egzon 9) ili juksta-membranskom domenu (JM) (egzon 11) sekvence gena KIT. Mnogi mutirani KIT tumori reaguju na tretman sa ciljanom terapijom, kao što je imatinib, selektivni inhibitor tirozin kinaze koji specifično inhibira BCR-ABL, KIT, i PDGFRA proteine. Međutim, većina pacijenata sa GIST na kraju ima recidiv zbog sekundarne mutacije u KIT koja značajno smanjuje afinitet vezivanja imatiniba. Ove otporne mutacije uvek nastaju u džepu za vezivanje adenozina 5-trifosfata (ATP) (egzoni 13 i 14) ili petlji za aktivaciju (egzoni 17 i 18) gena kinaze. Od trenutno odobrenih agenasa za GIST, nijedan nije selektivni agens sa ciljanim delovanjem. Imatinib je trenutno odobren za lečenje GIST; inhibitori multikinaze se koriste nakon imatiniba. U mnogim slučajevima, ovi inhibitori multikinaze, kao što su, npr., sunitinib, regorafenib, i midostaurin, samo slabo inhibiraju mutante otporne na imatinib i/ili su inhibitori multikinaze ograničeni složenijim sigurnosnim profilom i malim terapeutskim prozorom. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje GIST kod pacijenata koji su lečeni imatinibom. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje GIST kao prva linija (1L), druga linija (2L), treća linija (3L) ili četvrta linija (4L) terapije.

[00136] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje GIST kada su određene mutacije u KIT odsutne ili prisutne. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku su sposobna da leče GIST kada su određene mutacije u KIT odsutne. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku nisu sposobna da leče GIST kada su određene mutacije u KIT prisutne. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja prema pronalasku ne pružaju kliničku korist kod pacijenata koji imaju skrivene KIT mutacije u džepu za koji se vezuje ATP (mutacije KIT proteina V654A, N655T, i/ili T670I).

[00137] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje GIST povezanog sa PDGFRA mutacijama. U 5 do 6% neresektabilnih metastatskih GIST pacijenata, aktivacija

4

mutacije u petlji u egzonu 18 sekvence gena PDGFRA u aminokiselini 842 proteina se javlja kao primarna mutacija.

[00138] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna za lečenje AML. AML pacijenati takođe imaju skrivene KIT mutacije, sa većinom ovih mutacija na poziciji D816 KIT proteina.

[00139] U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju na subjektu kome je to potrebno. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se primenjuju kao farmaceutska formulacija, pri čemu se jedinjenje kombinuje sa jednom ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača. Tako, u nekim primerima izvođenja pronalaska, ovde otkrivene kompozicije sadrže najmanje jedan entitet odabran od jedinjenja Formule I i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i/ili rastvarača bilo kog od prethodno pomenutih i izborno dalje sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[00140] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti formulisana za primenu na bilo koji pogodan način za upotrebu u humanoj ili veterinarskoj medicini. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja uključena u farmaceutske kompozicije mogu biti aktivna sama po sebi, ili mogu biti prolek, npr., sposoban da bude pretvoren u aktivno jedinjenje u fiziološkom okruženju.

[00141] Fraza "farmaceutski prihvatljiv" kako je upotrebljena ovde se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili oblike doza koje su, u okviru medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa humanim tkivima i tkivima životinja bez preterane toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu korist/rizik.

[00142] Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju: (1) šećere, kao što je, npr., laktoza, glukoza i saharoza; (2) skrob, kao što je, npr., kukuruzni skrob i krompirov skrob; (3) celulozu i njegove derivate, kao što su, npr., natrijum, karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; (4) tragakant u prahu; (5) slad; (6) želatin; (7) talk; (8) ekscipijense, kao što su, npr., kakao puter i voskovi za supozitorije; (9) ulja, kao što su, npr., kikirikijevo ulje, pamučno ulje, šafranovo ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; (10) glikole, kao što su, npr., propilen glikol; (11) poliole, kao što su, npr., glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; (12) estre, kao što su, npr., etil oleat i etil laurat; (13) agar; (14) sredstva za puferiranje, kao što su, npr., magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; (15) algininsku kiselinu; (16) vodu bez pirogena; (17) izotonični fiziološki rastvor; (18) Ringer-ov rastvor; (19) etil alkohol; (20) rastvore fosfatnog pufera; (21) ciklodekstrine, kao što su, npr., Captisol®; i (22) druge netoksične kompatibilne supstance koje se koriste u farmaceutskim formulacijama.

[00143] Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su, npr., askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfat, i slično; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su, npr., askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slično; i (3) metalne agense za heliranje, kao što su, npr., limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.

[00144] ývrsti oblici doza (npr., kapsule, tablete, pilule, dražeje, praškovi, granule i slično) mogu da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, kao što su, npr., natrijum citrat ili dikalcijum fosfat i/ili bilo šta od sledećeg: (1) punioce ili ekstendere, kao što su, npr., skrob, laktoza, saharoza, glukoza, manitol i/ili silicijumova kiselina; (2) veziva, kao što su, npr., karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza i/ili akacija; (3) humektante, kao što je, npr., glicerol; (4) agense za dezintegraciju, kao što su, npr., agar-agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, određeni silikati i natrijum karbonat; (5) agense za usporavanje rastvaranja, kao što je, npr., parafin; (6) akceleratore apsorpcije, kao što su, npr., kvaternerna amonijumova jedinjenja; (7) sredstva za vlaženje, kao što su, npr., cetil alkohol i glicerol monostearat; (8) apsorbente, kao što su, npr., kaolin i bentonitna glina; (9) lubrikante, kao što su, npr., talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat, i njihove smeše; i (10) sredstva za bojenje.

[00145] Tečni oblici doza mogu uključivati farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i eliksire. Pored aktivnog sastojka, tečni oblici doziranja mogu sadržati inertne razblaživače koji se obično koriste u tehnici, kao što su, npr., voda, ili drugi rastvarači, sredstva za rastvaranje, i emulgatori, kao što su, npr., etil, alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, ulja (kao što su, npr., seme pamuka, kikiriki, kukuruz, klica, maslina, ricinusovo i susamovo ulje), glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikoli i sorbitan estri masnih kiselina, i njihove smeše.

[00146] Suspenzije, pored aktivnih jedinjenja, mogu da sadrže agense za suspendovanje kao što su, npr., etoksilovani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitan estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar, tragakant i njihove smeše.

[00147] Masti, paste, kreme i gelovi mogu sadržati, pored aktivnog jedinjenja, ekscipijense, kao što su, npr., životinjske i biljne masti, ulja, voskovi, parafini, skrob, tragakant, celulozni derivati, polietilen glikoli, silikoni, bentoniti, silicijumska kiselina, talk, cink oksid, ili njihove smeše.

[00148] Puderi i sprejevi mogu da sadrže, pored aktivnog jedinjenja, ekscipijense kao što su, npr., laktoza, talk, silicijumska kiselina, aluminijum hidroksid, kalcijum silikati i poliamidni prah, ili smeše ovih supstanci. Sprejevi mogu dodatno da sadrže uobičajene propelante, kao što su, npr., hlorofluorougljovodonici i isparljivi nesupstituisani ugljovodonici, kao što su, npr., butan i propan.

[00149] Neograničavajući primeri oblika doza za topikalnu ili transdermalnu primenu jedinjenja prema pronalasku uključuju prahove, sprejeve, masti, paste, kreme, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalatore. Aktivno jedinjenje se može mešati pod sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i sa bilo kojim konzervansima, puferima ili propelantima koji mogu biti potrebni.

[00150] Kada se jedinjenje prema pronalasku primenjuje kao farmaceutsko sredstvo za ljude i životinje, jedinjenje se može dati samo po sebi ili kao farmaceutska kompozicija koja sadrži, na primer, 0.1 do 99.5% (kao što je 0.5 do 90%) aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[00151] Formulacije se mogu primenjivati topikalno, oralno, transdermalno, rektalno, vaginalno, parenteralno, intranazalno, intrapulmonalno, intraokularno, intravenozno, intramuskularno, intraarterijski, intratekalno, intrakapsularno, intradermalno, intraperitonealno, subkutano, subkutikularno ili inhalacijom.

[00152] Pored toga, jedinjenja prema pronalasku mogu se primeniti samostalno ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima, uključujući druga KIT- ili PDGFRĮ modulirajuća jedinjenja ili druge terapeutske agense. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenje prema pronalasku može se primeniti u kombinaciji sa ripretinibom. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenje prema pronalasku može se primeniti u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja odabranih od imatinib, sunitinib, regorafenib, kabozantinib, krenolanib, midostaurin, brentuksimab vedotin i mastitinib za lečenje bolesti ili stanja koja su ovde otkrivena.

[00153] Jedinjenja prema pronalasku mogu se primeniti na pacijentu koji je prethodno lečen drugim jedinjenjem ili jedinjenjima. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti korisna kao prva linija (1L), druga linija (2L), treća linija (3L) ili četvrta linija (4L) terapije.

[00154] U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenje prema pronalasku se primenjuje nakon prethodnog tretmana sa imatinibom.

[00155] Jedinjenja prema pronalasku mogu se primeniti na pacijentu koji se prethodno nije lečio sa midostaurinom. U nekim primerima izvođenja pronalaska, jedinjenja prema pronalasku mogu se primeniti na pacijentu koji je prethodno lečen sa midostaurinom.

PRIMERI

Opšti sintetički postupci i intermedijeri

Definicije

C Celzijus

Cs2CO3cezijum karbonat

DCM dihlorometan

DIPEA diizopropilamin

DMF dimetil formamid

DMSO dimetilsulfoksid

EA etil acetat

EDCI 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid

h sati

H2vodonik gas

H2O voda

HCl hlorovodonična kiselina

HOAc sirćetna kiselina

HOBT hidroksibenzotriazol

HPLC tečna hromatografija visokih performansi

IC50 inhibitorna koncentracija 50%

IPA izopropil alkohol

K2CO3kalijum karbonat

KOAc kalijum acetat

LCMS tečna hromatografija sa masenom spektrometrijom

LiAlH4litijum aluminijum hidrid

min. minuti

MsCl mezil hlorid

MTBE metil terc-butil etar

MeOH metanol

N2azotni gas

NaOH natrijum hidroksid

Na2SO4natrijum sulfat

NH4HCO3amonijum format

NMP N-metilpirolidinon

Pd/C paladijum na ugljeniku

Pd(dppf)Cl2[1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II)

PE petrol etar

RT sobna temperatura

TEA trietilamin

THF tetrahidrofuran

TsCl tozil hlorid

[00156] Postupci za pripremu jedinjenja prema pronalasku mogu se izvoditi u odgovarajućim rastvaračima koje lako može odabrati stručnjak u tehnici o organskoj sintezi. Pogodni rastvarači mogu biti suštinski ne-reaktivni sa početnim materijalima (reaktantima), intermedijarima ili proizvodima na temperaturama na kojima se sprovode reakcije, npr., temperature koje mogu da variraju od smrzavanja rastvarača do temperature ključanja rastvarača. Data reakcija se može izvesti u jednom rastvaraču ili smeši više od jednog rastvarača. U zavisnosti od konkretnog koraka reakcije, pogodni rastvarači za određeni korak u reakciji mogu biti odabrani od strane stručnjaka.

[00157] Priprema jedinjenja prema pronalasku može uključivati zaštitu i deprotekciju različitih hemijskih grupa. Potreba za zaštitom i deprotekcijom, kao i odabir odgovarajućih zaštitnih grupa, može se lako odrediti od strane stručnjaka u tehnici. Hemija zaštitnih grupa može se naći, na primer, u Wuts and Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, 5th ed., John Wiley & Sons: New Jersey, (2014), koji je ovde inkorporiran navođenjem u celosti.

[00158] Reakcije se mogu pratiti prema bilo kom pogodnom postupku poznatom u tehnici. Na primer, formiranje proizvoda može se pratiti spektroskopskim sredstvima, kao što su nuklearna magnetna rezonanca (NMR) spektroskopija (npr.,<1>H ili<13>C), infracrvena (IR) spektroskopija, spektrofotometrija (npr., UV-vidljivo), masena spektrometrija (MS), ili hromatografskim postupcima kao što su tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) ili hromatografija na tankom sloju (TLC).

Analitički instrumenti i postupci za karakterizaciju jedinjenja:

[00159] LC-MS: Ako nije drugačije naznačeno, svi podaci tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom (LC-MS) (uzorak analiziran za čistoću i identitet) su dobijeni sa Agilent model-1260 LC sistemom koristeći Agilent model 6120 masenog spektrometra koristeći ES-API jonizaciju opremljenu sa Agilent Poroshel 120 (EC-C18, 2.7 um veličinom čestica, 3.0 x 50mm dimenzije) kolonom sa reverznom fazom na 22.4 stepena Celzijusa. Mobilna faza se sastojala od smeše rastvarača 0.1% mravlje kiseline u H2O i 0.1% mravlje kiseline u acetonitrilu. Korišćen je konstantan gradijent od 95% vodenih/5% organskih do 5% vodenih/95% organskih mobilnih faza tokom 4 minuta. Brzina protoka je konstantna na 1 mL/min.

[00160] Prep LC-MS: Preparativni HPLC je izveden na Shimadzu Discovery VP® preparativnom sistemu opremljenom sa Luna 5u C18(2) 100A, upakovanom AXIA, 250 x 21.2 mm kolonom sa reverznom fazom na 22.4 stepeni Celzijusa. Mobilna faza se sastojala od smeše rastvarača 0.1% mravlje kiseline u H2O i 0.1% mravlje kiseline u acetonitrilu. Korišćen je konstantan gradijent od 95% vodenih/5% organskih do 5% vodenih/95% organskih mobilnih faza tokom 25 minuta. Brzina protoka je konstantna na 20 mL/min. Reakcije izvedene u mikrotalasnoj pećnici u mikrotalasnoj jedinici Biotage Initiator.

[00161] Hromatografija na silika gelu: Hromatografija na silika gelu je izvedena ili na Teledyne Isco CombiFlash® Rf jedinici ili na Biotage® Isolera četvrtoj jedinici.

[00162] Proton NMR: Osim ako nije drugačije naznačeno, svi<1>H NMR spektri su dobijeni sa Varian 400MHz Unity Inova 400 MHz NMR instrumentom (vreme akvizicije = 3.5 sekundi sa 1 sekundom kašnjenja; 16 do 64 skeniranja). Gde je okarakterisano, svi protoni su prijavljeni u DMSO-d6 rastvaraču kao delovi-po milionu (ppm) u odnosu na rezidualni DMSO (2.50 ppm).

[00163] Stručnjak u tehnici prepoznaće da su modifikacije gradijenta, dužine kolone i brzine protoka moguće i da neki uslovi mogu biti pogodniji za karakterizaciju jedinjenja od drugih, u zavisnosti od hemijskih vrsta koje se analiziraju.

Primer 1: Sintetički preparati

Priprema intermedijera

[00164] Priprema 1: (S)-1-(2-(4-(6-bromopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)-1-(4-fluorofenil)etan-1-amin (I-1)

4

[00165] Korak 1: Sinteza etil 2-(4-(terc-butoksikarbonil)piperazin-1-il)pirimidin-5-karboksilat (ii): Rastvoru terc-butil piperazin-1-karboksilata (i) (10.0 g, 53.7 mmol) i diizopropiletilamina (23.4 mL, 134.25 mmol) u dioksanu (80 mL) je dodat etil 2-hloropirimidin-5-karboksilat (10 g, 53.7 mmoL), a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 h. LCMS je pokazao da je reakcija završena. Reakciona smeša je koncentrovana da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (ii) (17 g, sirovo), koje je direktno korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. MS (ES+) C16H24N4O4zahteva: 336, pronađeno: 237, 281 [M -56+H]<+>.

[00166] Korak 2: Sinteza 2- (4-(terc-butoksikarbonil)piperazin-1-il)pirimidin-5-karboksilna kiselina (iii): Rastvoru etil 2-(4-(terc-butoksikarbonil)piperazin-1-il)pirimidin-5-karboksilat (ii) (17 g, sirovo) u THF/MeOH/H2O (300 mL) je dodat natrijum hidroksid (4.3g, 107.5 mmol), a reakciona smeša je mešana na 70 °C 2 h. LCMS je pokazao da je reakcija završena. Reakciona smeša je ohlađena na sobnoj temperaturi, zakiseljena do pH § 5-6 sa 1 M HCl i filtrirana. ývrsta supstanca je sakupljena i osušena da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (iii) (16 g, 96%) kao bela čvrsta supstanca, koja je direktno korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. MS (ES+) C14H20N4O4zahteva: 308, pronađeno: 253 [M -56+ H]<+>.

[00167] Korak 3: Sinteza terc-butil 4-(5-(metoksi(metil)karbamoil)pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilata (iv): U suspenziju 2-(4-(terc-butoksikarbonil)piperazin-1-il)pirimidin-5-karboksilna kiselina (iii) (13.8 g, 44.8 mmol), EDCI (12.8 g, 67.2 mmol) i HOBT (7.2 g, 53.7 mmol) u DCM (200 mL) dodata je TEA (25 mL, 179.2 mmol), a smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 h, zatim je dodat N,O-dimetilhidroksilamin (5 g, 53.7 mmol). Reakciona smeša je mešana 3 h. LCMS je pokazao da je reakcija završena. Reakciona smeša je isprana sa H2O(100 mL), a organski sloj je osušen, filtriran, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (petrol etar: etil acetat = 1:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (iv) (11.2 g, 67%) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C16H25N5O4zahteva: 351, pronađeno: 296 [M -56+ H]<+>.pronađeno: 296 [M -56+ H]<+>.

[00168] Korak 4: Sinteza terc-butil 4-(5-(4-fluorobenzoil)pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilata (v): Rastvoru terc-butil 4-(5-(metoksi(metil)karbamoil)pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilata (iv) (7.8 g, 22.22 mmol) u suvom THF (50 mL) je dodat C6H5MgFBr (1 M u THF, 50 mL) na 0 °C pod azotom, a smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 h. LCMS je pokazao da je reakcija završena. Reakciona smeša je ugašena sa 1 M HCl i ekstrahovana sa EA. Kombinovani organski slojevi su isprani sa H2O i fiziološkim rastvorom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (petrol etar:EA = 5:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (v) (7.2 g, 84%) kao žuta čvrsta supstanca. MS (ES+) C20H23FN4O3zahteva: 386, pronađeno: 331 [M- 56 H]<+>.

[00169] Korak 5: Sinteza terc-Butil (S,Z)-4-(5-(((terc-butilsulfinil)imino)(4-fluorofenil)metil)-pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilata (vi): terc-Butil 4-(5-(4-fluorobenzoil)pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilat (v) (20.0 g, 1.0 ekv.), (S)-(-)-2-metil-2-propansulfinamid (9.43 g, 1.5 ekv.), i LiOH (0.64 g, 0.5 ekv.) su dodati u reakcioni sud sa toluenom (160 mL). U ovu smešu je dodat titanijum(IV)izoproksid (18.42 g, 1.25 ekv.) i reakciona smeša je mešana na 50-60 °C 1 h. Reakciona smeša je zatim destilovana da bi se uklonilo 80 mL uz dodatno punjenje toluena (80 mL) na 40-60 °C. Reakciona smeša je ohlađena 20-30 °C i dodata u rastvor mononatrijum citrata (80 mL, 30% tež./tež. limunske kiseline na pH 3-4). Smeša je mešana 1.5 h na 45-55 °C, a zatim su se faze razdvojile. Organska faza je isprana kalijum bikarbonatom (40 mL, 25% -tež./tež. vodenim) i organska faza je destilovana da bi se uklonilo 40 mL. Proizvod rastvora (vi) je razblažen sa THF (30 mL) pre nego što je korišćen u sledećem koraku direktno kao rastvor (oko 15% tež./tež.).

[00170] Korak 6: Sinteza terc-Butil 4-(5-((S)-1-(((S)-terc-butilsulfinil)amino)-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilata (vii): U rastvor terc-butil (S,Z)-4-(5-(((terc-butilsulfinil)mino)(4-fluorofenil)metil)-pirimidin-2-il) piperazin-1-karboksilat (vi) u toluenu/THF (120 g, pripremljen u koraku 5) je dodat metil magnezijum hlorid (27.8 g, 22%-tež./tež. in THF, 2.0 ekv.) na 10 °C preko 2-3 h. Reakciona smeša je ostavljena da se meša 1.5 h da bi se došlo do završetka reakcije. Reakcija smeša je ugašena dodavanjem metanola (40 mL) zatim H2O (10 mL). Smeša je destilovana da bi se uklonilo 100-110 mL, a zatim isprana amonijum hloridom (80 mL, 20% -tež./tež. u H2O). Organska faza je isprana sa H2O (80 mL), razblažena toluenom (60 mL) i destilovana da bi se uklonio 60-80 mL destilata. Rastvor je na 50-60 °C napunjen sa n-heptanom (80 mL), a zatim ohlađen na 42 °C, pri čemu su dodata semena (25-50 mg). Rastvor je držan 30 minuta, a zatim je ohlađen na 0-10 °C tokom 30 minuta. ývrste supstance su izolovane filtracijom, isprane smešom n-heptana i toluena (1:1, 30 mL), nakon čega sledi n-heptan (30 mL). Proizvod je osušen da bi se dobilo 9 g sirovog proizvoda 96.4 do 97.2% dijastereomernog viška. (vii)

[00171] Korak 6a: Rekristalizacija sirovog terc-Butil 4-(5-((S)-1-(((S)-tercbutilsulfinil)amino)-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilata: terc-Butil 4-(5-((S)-1-(((S)-terc-butilsulfinil)amino)-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin -2-il) piperazin-1-karboksilat (10.0 g) je rastvoren u izopropanolu (100 mL) i zagrevan do 40-60 °C zatim prolazi kroz filter za bistrenje, pranje/ispiranje sa izopropanolom (20 mL). Dobijeni rastvor je destilovan u vakumu na 40-60 °C da bi se uklonio 60-70 mL. Smeša je razblažena vodom (45 mL) na 50-60 °C, a zatim ohlađena na 40 °C, pri čemu je zasejana sa 25-50 mg. Smeša je dalje ohlađena do 20-25 °C i dodata je voda (20 mL). ývrste supstance su izolovane filtracijom, isprane sa smešom izopropanol/voda (1:1, 20 ml), a zatim je suspenzija isprana sa izopropanol/voda (1:2, 30 mL). Sušenjem je dobijeno 8.5 g proizvoda >99.8% dijastereomernog viška (vii).

[00172] Korak 7: Sinteza (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etan-1-amin hidrohlorida (viii): terc-Butil-4-(5-((S)-1-(((S)-terc-butilsulfinil)amino)-1-(4-fluorofenil)-etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-karboksilat (vii) (50 g, 1 ekv.) pomešan sa etanolom (7.5 zapr.) i koncentrovanom hlorovodoničnom kiselinom (11.2 M, 5.6 ekv.). Reakciona smeša se zagrejala do temperature refluksna. Nakon završetka reakcije pomoću LCMS, smeša je koncentrovana na 5 zapr. pod atmosferskim pritiskom. Koncentrovanje je nastavljeno dodavanjem etanola da bi se održalo 5 zapr. do sadržaja H2O 3%. Koncentrovanje je konačno zaustavljeno na 2 zapr. nakon čega je usledilo hlađenje na 0-5 °C tokom 30 minuta.

4

Filtracija je praćena sušenjem pod vakuumom da bi se dobio proizvod iz naslova (viii) (92% prinos).

[00173] Korak 8: Sinteza (S)-1-(2-(4-(6-Bromopirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)-1-(4-fluorofenil)etanamina (I-1): Smeša komercijalno dostupnih 6-bromo-4-hloropirolo[2,1-f][1,2,4]triazin (4.00 g, 17.2 mmol)(npr., Sigma Aldrich), (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etanamin hidrohlorid (viii) (5.81 g, 17.2 mmol) i trietilamina (7.20 mL, 51.6 mmol) u dioksanu (50 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je koncentrovana, a zatim prečišćena fleš hromatografijom kolone (DCM/MeOH = 20/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (I-1) (8.0 g, 94% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C22H22BrFN8zahteva: 496, pronađeno: 497, 499 [M+H]<+>.

[00174] Priprema 2: (S)-1-(2-(4-(6-(1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)-1-(4-fluorofenil)etanamin (I-2)

[00175] Smeša I-1 (3.0 g, 6.05 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol (1.17 g, 6.05 mmol), Pd (dppf)Cl2(494 mg, 605 ȝmol) i K2CO3(2.50 g, 18.2 mmol) u DMF/H2O (40 mL/10 mL) je očišćena sa N2(g) za 10 min. i mešana na 70 °C 16 h sa N2. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (I-2) (2.0 g, 68% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. MS (ES+) C25H25FN10zahteva: 484, pronađeno: 485 [M+H]<+>.

[00176] Priprema 3: (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etanamin (I-3)

[00177] Smeša I-1 (1.0 g, 2.02 mmol), 4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-oktametil-2,2’-bi(1,3,2-dioksaborolan) (768 mg, 3.12 mmol), Pd(dppf)Cl2(165 mg, 202 ȝmol), dppf (167 mg, 303 ȝmol) i KOAc (395 mg, 4.04 mmol) u 1,4-dioksanu (30 mL) je očišćena sa N2(g) za 10 min i mešana na 80 °C 16 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 15/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (I-3) (700 mg) kao siva čvrsta supstanca. MS (ES+) C28H34BFN8O2 zahteva: 544, pronađeno: 545 [M+H]<+>.

[00178] Priprema jedinjenja

[00179] Primer 1: (S)-1-(4-(4-(4-(5-(1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)-2-metilpropan-2-ol (1)

[00180] Smeša I-2 (pripremljena prema pripremi 2) (200 mg, 0.412 mmol), CS2CO3(269 mg, 0.83 mmol) i 2,2-dimetiloksiran (89.3 mg, 1.24 mmol) u NMP (5 mL) je mešana na 120 °C 10 h. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc, isprana sa H2O i rastvorom soli, i osušena sa Na2SO4. Organski sloj je koncetrovan u vakuumu, a ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1) (74.5 mg, 32% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H33FN10O zahteva: 556, pronađeno: 557 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm

4

8.41 (s, 2H), 8.03 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.49-7.45 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.13-7.08 (m, 2H), 4.76 (s, 1H), 4.12-4.07 (m, 4H), 4.02 (s, 2H), 3.93-3.90 (m, 4H), 2.44 (s, 2H), 1.73 (s, 3H), 1.10 (s, 6H).

[00181] Primer 2: (S)-2-(4-(4-(4-(5-(1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)-2-metilpropan-1-ol (2)

[00182] Korak 1: Sinteza Metil 2-metil-2-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il) propanoata (xii) Rastvoru metil 2-bromo-2-metilpropanoata (x) (3.0 g, 16.7 mmol) i 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il) -1H-pirazola (xi) (3.23 g, 16.7 mmol) u NMP (20 mL) dodat je cezijum karbonat (16.2 g, 50 mmol) i natrijum jodid (3.1 g, 16.7 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je mešana na 120 °C 8 h. Reakciona smeša je razblažena sa DCM i isprana sekvencijalno sa H2O i slanim rastvorom. Organski sloj je koncentrovan u vakuumu, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar:etil acetat = 5/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xii) (1.5 g, 30% prinos) kao bezbojno ulje.

[00183] Korak 2: Sinteza Metil (S)-2-(4-(4-(4-(5-(1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)-2-metilpropanoata (xiii): Smeša metil 2-metil-2-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)propanoata (xii) (178 mg, 0.6 mmol), I-1 (300 mg, 0.6 mmol), Pd(dppf)Cl2(99 mg, 0.12 mmol) i K2CO3(251 mg, 1.8 mmol) u DMF/H2O (8 mL/2 mL) je mešana na 70 °C 4 h sa N2

4

(g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa DCM, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xiii) (240 mg, 68% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C30H33FN10O2zahteva: 584, pronađeno: 585 [M+H]<+>.

[00184] Korak 3: Sinteza (S)-2-(4-(4-(4-(5-(1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)-2-metilpropan-1-ol (2):

Rastvor (S)-metil 2-(4-(4-(4-(5-(1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)-2-metilpropanoat (xiii) (200 mg, 0.34 mmol) u THF (20 mL) je dodat LiAlH4(100 mg, 3.4 mmol) na 0 °C, a dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 6 h. Reakciona smeša je ugašena sa H2O (100 mL) i 10% NaOH H2O (300 mL) i zatim ekstrahovan sa EA. Organski sloj je koncetrovan u vakuumu, a ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2) (90.5 mg, 47% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H33FN10O zahteva: 556, pronađeno: 557 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.18 (s, 1H), 8.01 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.87 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.52-7.43 (m, 2H), 7.26 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.16-7.07 (m, 2H), 4.99 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.17-4.04 (m, 4H), 3.98-3.87 (m, 4H), 3.60 (d, 2H, J =5.6 Hz), 2.47 (s, 2H), 1.74 (s, 3H), 1.50 (s, 6H).

[00185] Primer 3: (R)1-{4-[4-(4-{5-[(S)-1-Amino-1-(4-fluoro-fenil)-etil]-pirimidin-2-il}-piperazin-1-il)-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-pirazol-1-il}-propan-2-ol (3)

[00186] Rastvoru I-2 (pripremljeno prema pripremi 2) (200 mg, 412 ȝmol) i (2R)-2-metiloksirana (xiv) (71.4 mg, 1.23 mmol) u NMP (3.0 mL) je dodat Cs2CO3(400 mg, 1.23 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je mešana na 120 °C 2 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, opran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril;

4

Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3) (90.0 mg, 40% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C28H31FN10O zahteva: 542, pronađeno: 543 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) į ppm 8.40 (s, 2H), 8.05 (s, 1H), 7.80 (d, 1H, J = 1.6Hz), 7.87 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.46 (dd, 2H, J = 8.8, 5.6 Hz), 7.24 (s, 1H), 7.10 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 4.96 (d, 1H, J = 4.8Hz), 4.11-4.08 (m, 4H), 4.02-3.95 (m, 3H), 3.92-3.89 (m, 4H), 2.45 (s, 2H), 1.73 (s, 3H), 1.05 (d, 3H, J = 5.6 Hz).

[00187] Primer 4: (S)-2-(4-(4-(4-(5-(1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)etanol (4)

[00188] Reakciona smeša I-1 (pripremljena prema pripremi 1) (500 mg, 1.00 mmol), komercijalno dostupna 2-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il) etanola (xv) (285 mg, 1.20 mmol)(npr., AstraTech), Pd (dppf)Cl2(219 mg, 300 ȝmol) i Na2CO3(317 mg, 3.00 mmol) u dioksanu/ H2O (20 mL/2 mL) je mešana na 100 °C preko noći sa N2(g). Slojevi su razdvojeni, a organski sloj je koncentrovan u vakuumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 15/1). Dobijeni materijal je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10ȝm 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4) (154.0 mg, 29% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C27H29FN10O zahteva: 528, pronađeno: 529 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.40 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.49-7.44 (m, 2H), 7.24 (s, 1H), 7.14-7.06 (m, 2H), 4.93 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 4.17-4.13 (m, 2H), 4.12-4.07 (m, 4H), 3.94-3.88 (m, 4H), 3.89-3.71 (m, 2H), 2.45 (br. S., 2H), 1.73 (s, 3H).

[00189] Primer 4A: (S)-2-(4-(4-(4-(5-(1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)etanol hidrohlorid

4

[00190] Rastvoru (S)-2-(4-(4-(4-(5-(1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)etanola (30 mg, 0.057 mmol) u MeOH (5 mL) je dodat HCl/dioksan (0.05 mL, 4.0 M) na sobnoj temperaturi. Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 16 h. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i proizvod je liofilizovan da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (36.0 mg, 100% prinos) kao bela čvrsta supstanca koja je osetljiva na vlagu. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 528, pronađeno: 529 [M+H]+. 1H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 9.47 (s, 3H, br), 8.45 (s, 2H), 8.14 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.53-7.50 (m, 2H), 7.44 (s, 1H), 7.31-7.28 (m, 2H), 4.16-4.14 (m, 6H), 4.00-3.89 (m, 4H), 3.76-3.74 (m, 2H), 2.03 (s, 3H).

[00191] Primer 5: (R)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil) pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (5)

[00192] Korak 1: Sinteza (S)-1-(benziloksi)propan-2-il 4-metilbenzensulfonata (xvii): Rastvoru (S)-1-(benziloksi)propan-2-ol (xvi)(5.0 g, 30.12 mmol) i TEA (9.17 g, 90.36 mmol) u DCM (80 mL) je dodat TsCl (6.30 g, 33.13 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 24 h. Rastvor je razblažen sa DCM, ispran je sa H2O i ispran je sa fiziološkim rastvorom. Organski sloj je koncentrovan, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar / etil acetat = 3/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xvii) (4.0 g, 42% prinos) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C17H20O4S zahteva: 320, pronađeno: 338 [M+18]<+>.

[00193] Korak 2: Sinteza (R)-1-(1-(Benziloksi)propan-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xviii): Smeša (S)-1-(benziloksi)propan-2-il 4-

4

metilbenzensulfonata (xvii) (2.0 g, 6.25 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xi) (1.22 g, 6.25 mmol) i CS2CO3(4.08 mg, 12.5 mmol) u NMP (12 mL) je ozračena na 110 °C u mikrotalasnoj pećnici 0.5 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i ispran je sa fiziološkim rastvorom. Organski sloj je koncentrovan, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 4/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xviii) (1.6 g, prinos 75% prinos) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C19H27BN2O3zahteva: 342, pronađeno: 343 [M+H]<+>.

[00194] Korak 3: Sinteza (R)-2-(4-(4,4,5,5-Tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (xix): Rastvoru (R)-1-(1-(benziloksi)propan-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xviii) (800 mg, 2.34 mmol) u MeOH (20 mL) je dodat Pd/C (800 mg) i HOAc (0.2 mL), pri čemu je rastvor prečišćen sa H2(g) 5 minuta i zatim je mešan na sobnoj temperaturi sa H2(g) 16 h. Nakon toga, smeša se filtrirala i filtrat je koncentrisan da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bezbojno ulje(xix) (300 mg, 51% prinos). MS (ES+) C12H21BN2O3zahteva: 252, pronađeno: 253 [M+H]<+>.

[00195] Korak 4: (R)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (5): Smeša ((R)-2-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (xix) (150 mg, 595 ȝmol), I-1 (295 mg, 595 ȝmol), Pd(dppf)Cl2(49 mg, 60 ȝmol) i K2CO3(250 mg, 1.79 mmol) in DMF/H2O (4 mL/1 mL) je prečišćena sa N2(g) 10 min. i mešana na 70 °C 16 h sa N2(g). Smeša je ekstrahovana sa EtOAc, i kombinovani organski ekstrakti su koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1). Dobijeni materijal je dalje prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (5) (148.1 mg, 46% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C28H31FN10O zahteva: 542, pronađeno: 543 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.11 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.48-7.44 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.14-7.08 (m, 2H), 4.98 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 4.36-4.32 (m, 1H), 4.10-4.08 (m, 4H), 3.92-3.90 (m, 4H), 3.69-3.61 (m, 2H), 2.45 (s, 2H), 1.73 (s, 3H), 1.41 (d, 3H, J = 6.8 Hz).

[00196] Primer 6: (S)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (6)

[00197] Korak 1: Sinteza (R)-1-(benziloksi)propan-2-il 4-metilbenzensulfonata (xxiii): Rastvoru (R)-1-(benziloksi)propan-2-ol (xxii) (3.0 g, 18 mmol) i TEA (5.48 g, 54.2 mmol) u DCM (30 mL) je dodat TsCl (4.13 g, 21.7 mmol). Dobijena smeša je mešana na 25 °C 16 h. Smeša je onda koncentrovana u vakumu, i ostatak je prečišćen prečišćavanjem pomoću fleš hromatografije kolone na silika gelu (petrol etar / etil acetat = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxiii) (2.30 g, 39% prinos) kao žuto ulje. MS (ES+) C17H20O4S zahteva: 320, pronađeno: 338 [M+18]<+>.

[00198] Korak 2: Sinteza (S)-1-(1-(Benziloksi)propan-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xxiv): Smeša (R)-1-(benziloksi)propan-2-il 4-metilbenzensulfonata (xxiii) (2.20 g, 6.87 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xi) (2.00 g, 10.3 mmol) i Cs2CO3(2.24 g, 6.87 mmol) u NMP (50 mL) je mešana na 110 °C pomoću mikrotalasne pećnice 16 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar / etil acetat = 5/1 do 4/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxiv) (1.80 g, 39% prinos) kao žuto ulje. MS (ES+) C19H27BN2O3zahteva: 342, pronađeno: 343[M+H]<+>.

[00199] Korak 3: Sinteza (S)-2-(4-(4,4,5,5-Tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (xxv): Smeši (S)-1-(1-(benziloksi)propan-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xxiv) (0.90 g, 2.6 mmol) u MeOH (20 mL) je dodat Pd/C (800 mg) i HOAc (0.2 mL). Dobijena smeša je prečišćena sa H2(g) 5 min., a zatim je mešana na sobnoj temperaturi sa H2(g) 16 h. Nakon toga, smeša je filtrirana i koncentrovana da bi se

1

dobilo jedinjenje iz naslova (xxv) kao žuto ulje (500 mg, 75% prinos). MS (ES+) C12H21BN2O3zahteva: 252, pronađeno: 253 [M+H]<+>.

[00200] Korak 4: Sinteza (S)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (6): Smeša (S)-2-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)propan-1-ol (xxv) (98 mg, 392 ȝmol), I-1 (130 mg, 261 ȝmol), K2CO3(200 mg, 227 ȝmol) i Pd(dppf)Cl2(20 mg, 27 ȝmol) u DMF/H2O (5 mL/1 ml) je mešana na 70 °C sa N2(g) 4 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3 ), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (6) (40.7 mg, 28% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C28H31FN10O zahteva: 542, pronađeno: 543 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.10 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.47 (dd, 2H, J = 8.8, 5.6 Hz), 7.24 (s, 1H), 7.11 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 4.96 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.38-4.35 (m, 1H), 4.11-4.08 (m, 4H), 3.92-3.90 (m, 4H), 3.70-3.60 (m, 2H), 2.43 (s, 1H), 1.73 (s, 3H), 1.41 (d, 3H, J = 6.8 Hz).

[00201] Primer 7: (S)-1-(4-Fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-(oksetan-3-il)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etan-1-amin (7)

[00202] Smeša 1-(oksetan-3-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola(xxvi) (600 mg, 2.4 mmol), I-1 (1.19 g, 2.4 mmol), Pd(dppf)Cl2(391 mg, 0.48 mmol) i K2CO3(994 mg, 7.2 mmol) u DMF/ H2O (16 mL/4 mL) je prečišćena sa N210 min. i mešana na 70 °C 3 h sa N2(g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Smeša je prečišćena fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1). Dobijeni materijal je prečišćen dalje pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.;

2

Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (7) (236.3 mg, 18% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C28H29FN10O zahteva: 540, pronađeno: 541 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.32 (s, 1H), 8.03 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.99 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.52-7.44 (m, 2H), 7.29 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.16-7.07 (m, 2H), 5.64-5.52 (m, 1H), 4.99-4.94 (m, 2H), 4.93-4.89 (m, 2H), 4.12-4.06 (m, 4H), 3.97-3.87 (m, 4H), 2.50 (br. s., 2H), 1.74 (s, 3H).

[00203] Primer 8: (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-(oksetan-3-ilmetil)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etan-1-amin (8)

[00204] Korak 1: Sinteza oksetan-3-ilmetil metansulfonata (xxviii): Rastvoru oksetan-3-ilmetanola (xxvii) (300 mg, 3.40 mmol) i TEA (1.03 g, 10.2 mmol) u DCM (10 mL) dodat je MsCl (429 mg, 3.75 mmol) na 0 °C. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 3 h, a zatim je razblažena sa DCM, isprana zasićenim rastvorom Na2CO3, i osušena sa anhidrovanim Na2SO4. Rastvarač je ispario u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxviii) (280 mg, 49% prinos) kao žuto ulje.

[00205] Korak 2: Sinteza 1-(oksetan-3-ilmetil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xxix): Smeša 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xi) (280 mg, 1.44 mmol), oksetan-3-ilmetil metansulfonat (xxviii) (275 mg, 1.66 mmol) i Cs2CO3(1.41 g, 4.33 mmol) u DMF (20 mL) je mešana na 70 °C 4 h, a zatim je razblažena sa DCM i isprana sa fiziološkim rastvorom. Organski sloj je ispario u vakuumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar / etil acetat = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxix) (320 mg, 71% prinos). MS (ES+) C13H21BN2O3zahteva: 264, pronađeno: 265 [M+H]<+>.

[00206] Korak 3: Sinteza (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-(oksetan-3-ilmetil)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etan-1-amina (8): Smeša I-1 (300 mg, 392 ȝmol), 1-(oksetan-3-ilmetil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xxix) (239 mg, 904 ȝmol), K2CO3(250 mg, 1.81 mmol) i Pd(dppf)Cl2(30 mg, 41 ȝmol) u DMF/H2O (10 mL / 2 ml) je mešana na 70 °C sa N2(g) 4 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A =H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (8) (40.2 mg, 12% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.09 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.47 (dd, 2H, J = 8.8, 5.6 Hz), 7.22 (s, 1H), 7.11 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 4.69-4.65 (m, 2H), 4.45-4.41 (m, 4H), 4.10-4.08 (m, 4H), 3.92-3.89 (m, 4H), 3.46-3.41 (m, 1H), 2.45 (s, 2H), 1.73 (s, 3H).

[00207] Primer 9: (S)-1-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil-pirimidin-2-il}-piperazin-1-il)-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-pirazol-1-il}-propan-2-ol (9)

[00208] Smeša I-2 (220 mg, 455 ȝmol), (S)-2-metiloksirana (xxx) (79 mg, 1.37 mmol) i Cs2CO3(445 mg, 1.37 mmol) u NMP (2 mL). Smeša je ozračena na 120 °C u mikrotalasnoj pećnici 1 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (9) (108 mg, 44% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C28H31FN10O zahteva: 542, pronađeno:

4

543 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.05 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.48-7.44 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.14-7.08 (m, 2H), 4.96 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 4.10-4.08 (m, 4H), 4.02-3.98 (m, 3H), 3.92-3.90 (m, 4H), 2.44 (s, 2H), 1.73 (s, 3H), 1.06 (d, 3H, J = 5.6 Hz).

[00209] Primer 10: cis-3-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol (10)

[00210] Korak 1: Sinteza trans-3-(benziloksi)ciklobutil 4-metilbenzensulfonata (xxxii): Rastvoru trans-3-(benziloksi)ciklobutanola (xxxi) (300 mg, 1.7 mmol) u DCM (20 mL) dodat je TsCl (389 mg, 2.0 mmol) i TEA (343 mg, 3.4 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Rastvor je razblažen sa DCM, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i onda je koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 5/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxxii) (315 mg, 56% prinos) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C18H20O4S zahteva: 332, pronađeno: 350 [M+18]<+>.

[00211] Korak 2: Sinteza cis-3-(benziloksi)ciklobutil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xxxiii): Smeša trans-3-(benzyloksi)ciklobutil 4-metilbenzensulfonata (xxxii) (315 mg, 0.95 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xi) (185 mg, 0.95 mmol), i Cs2CO3(619 mg, 1.9 mmol) u NMP (5 mL) je ozračena na 110 °C u mikrotalasnoj pećnici 0.5 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, i ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je koncentrovan u vakuumu, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 4/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxxiii) (190 mg, prinos 56% prinos) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C20H27BN2O3zahteva: 354, pronađeno: 355 [M+H]<+>.

[00212] Korak 3: Sinteza cis-3-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol(xxxiv): Rastvoru cis-3-(benziloksi)ciklobutil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xxxiii) (190 mg, 0.54 mmol) u MeOH (5 mL) je dodat Pd/C (200 mg) i HOAc (5 kapi), rastvor je prečišćen sa H2(g) 5 min. i mešan je na sobnoj temperaturi sa H2(g) 16 h. Smeša je filtrirana, a filtrat je ispario do suvoće u vakuumu da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxxiv) kao bezbojno ulje (85 mg, 60% prinos). MS (ES+) C13H21BN2O3zahteva: 264, pronađeno: 265[M+H]<+>.

[00213] Korak 4: Sinteza (cis-3-(4-(4-(4-(5-((S)-1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol (10): Smeša cis-3-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol (xxxiv) (55 mg, 0.21 mmol), I-1 (104 mg, 0.21 mmol), Pd(dppf)Cl2(18 mg, 0.021 ȝmol) i K2CO3(87 mg, 0.63) u DMF/H2O (4 mL/1 mL) je prečišćena sa N210 min. i mešana na 70 °C 16 h sa N2(g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen direktno fleš hromatografijom kolone (DCM/MeOH = 8/1). Dobijeni materijal je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm)) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (10) (14.6 mg, 13% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.17 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.87-7.86 (m, 2H), 7.49-7.45 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.19-7.13 (m, 2H), 5.33 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 4.38-4.31 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 4H), 3.99-3.96 (m, 1H), 3.94-3.88 (m, 4H), 2.79-2.71 (m, 2H), 2.34-2.31 (m, 2H), 1.73 (s, 3H).

[00214] Primer 11: trans-3-{4-[4-(4-{5-[1-Amino-1-(4-fluoro-fenil)-etil]-pirimidin-2-il}-piperazin-1-il)-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-pirazo1-1-il}-ciklobutanol (11)

[00215] Korak 1: Sinteza cis-toluen-4-sulfonske kiseline 3-benziloksi-ciklobutil estra (xxxvi): Rastvoru cis-3-benziloksi-ciklobutanola (xxxv) (500 mg, 2.81 mmol) i TEA (851 mg, 8.43 mmol) u DCM (10 mL) dodat je 4-metil-benzensulfonil hlorid (640 mg, 3.37 mmol), a dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Smeša je razblažena fiziološkim rastvorom i ekstrahovana sa DCM. Organski ekstrakt je koncentrovan. Ostatak je prečišćen direktno fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 11/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxxvi) (490 mg, 53% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. MS (ES+) C18H20O4S zahteva: 332, pronađeno: 350 [M+18]<+>.

[00216] Korak 2: Sinteza trans-1-(3-benziloksi-ciklobutil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xxxvii): Smeša cis-toluen-4-sulfonske kiseline 3-benziloksi-ciklobutil estra (xxxvi) (500 mg, 1.51 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (xi) (430 mg, 2.22 mmol), i CS2CO3(1.47 g, 4.51 mmol) u NMP (15 mL) je ozračena u mikrotalasnoj pećnici na 120 °C 2 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 1/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxxvii) (227 mg, 42% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. MS (ES+) C20H27BN2O3zahteva: 354, pronađeno: 355 [M+H]<+>.

[00217] Korak 3: Sinteza trans-3-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-pirazol-1-il]-ciklobutanola (xxxviii): Rastvoru trans-1-(3-benziloksi-ciklobutil)-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-1H-pirozola (xxxvii) (420 mg, 1.18 mmol) u MeOH (10 mL) je dodat Pd/C (200 mg) i koncentrovani HCl (0.5 mL). Dobijena smeša je mešana sa H2(g) na sobnoj temperaturi 16 h. Smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xxxviii) (250 mg, 80% prinos) kao čvrsta supstanca. MS (ES+) C13H21BN2O3zahteva: 264, pronađeno: 265 [M+H]<+>.

[00218] Korak 4: Sinteza trans-3-(4-[4-(4-(5-[1-amino-1-(4-fluoro-fenil)etil]-pirimidin-2-il}-piperazin-1-il)-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-pirazol-1-il)-ciklobutanola (11): Smeša trans-3-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-pirazol-1-il]-ciklobutanol (xxxviii) (200 mg, 0.76 mmol), I-1 (376 mg, 0.76 mmol), Pd(dppf)Cl2(61.8 mg, 0.076 mmol) i K2CO3(313 mg, 2.27 mmol) u dioksanu/H2O (4 mL/1 mL) je prečišćena sa N2(g) 10 min. i mešana na 70 °C 4 h sa N2(g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu. Dobijeni materijal je prečišćen dalje pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (11) (27.2 mg, 6% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.18 (s, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 7.87-7.85 (m, 2H), 7.49-7.45 (m, 2H), 7.24 (s, 1H), 7.15-7.08 (m, 2H), 5.24 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 4.92-4.89 (m, 1H,), 4.50-4.43 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 4H), 3.96-3.90 (m, 4H), 2.67-2.61 (m, 2H), 2.44 (s, 2H), 2.42-2.37 (m, 2H), 1.73 (s, 3H).

[00219] Primer 12: (S)-1-((4-(4-(4-(5-(1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)metil)ciklopropan-1-ol (12)

[00220] Korak 1: Sinteza etil 2-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)acetata (xl): Smeša 4-bromo-1H-pirazola (xxxix) (8.0 g, 55 mmol) i K2CO3(15.2 g, 110 mmol) u etil 2-hloracetatu (25 mL) je mešana na 80 °C 15 h. Reakciona smeša je ohlađena, razblažena sa EA i isprana sa H2O.

Organski sloj isparava, a ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 5:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xl) (8.5 g, 66% prinos) kao bledo žuto ulje. MS (ES+) C7H9BrN2O2zahteva: 232, pronađeno: 233 [M+H]<+>.

[00221] Korak 2: Sinteza etil 1-((4-bromo-1H-pirazol-1-il)metil)ciklopropan-1-ol (xli): Rastvoru etil 2-(4-bromo-1H-pirazol-1-il) acetata (xl) (7.0 g, 30 mmol) i titanijum tetraizopropanolata (4.26 g, 15 mmol) u anhidrovanom THF (60 mL) je dodat rastvor etil magnezijum bromida (3 M u heksanu, 30 mL, 90 mmol) kap po kap na 60 °C preko 2 h. Posle mešanja na istoj temperaturi tokom 2 h, reakciona smeša je razblažena sa EA i isprana sekvencijalno sa 1N ekv. HCl i H2O. Organski sloj isparava, a ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 20:1 do 3:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xli) (1.3 g, 20% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. MS (ES+) C7H9BrN2O zahteva: 216, pronađeno: 217 [M+H]<+>.

[00222] Korak 3: Sinteza 4-bromo-1-[1-(tetrahidro-piran-2-iloksi)-ciklopropilmetil]-1H-pirazola (xlii): Rastvoru 1-[(4-bromo-1H-pirazol-1-il)metil]ciklopropan-1-ol (xli) (300 mg, 1.38 mmol) i 3,4-dihidro-2H-piran (348 mg, 4.14 mmol) u DCM (8 mL) dodat je piridinijum para-toluen sulfonat (346 mg, 1.38 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 4 h, a zatim je razblažena sa fiziološkim rastvorom i isprana sa DCM. Organski sloj je koncentrovan, a ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (PE/EA = 10:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xlii) (200 mg, 48% prinos) kao bela čvrsta supstanca MS (ES+) C12H17BrN2O2zahteva: 300, pronađeno: 217 [M-THP+H]<+>.

[00223] Korak 4: Sinteza 1-(4-fluoro-fenil)-1-{2-[4-(6-{1-[1-(tetrahidro-piran-2-iloksi)-ciklopropilmetil]-1H-pirazol-4-il]-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)-piperazin-1-il]-pirimidin-5-il}-etilamin (xliii): Smeša 4-bromo 1-{[1-(oksan-2-iloksi)ciklopropil]metil}-1H-pirazola (xlii) (160 mg, 0.531 mmol), I-3 (577 mg, 1.06 mmol), Pd(dppf)Cl2(77.5 mg, 106 ȝmol) i Na2CO3(168 mg, 1.59 mmol) u smeši od 1,4-dioksana (3 ml), H2O (1 mL) i DMF (0.5 mL) je mešana na 80 °C 3h sa N2(g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (etil acetat / metanol = 4:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (270 mg, 50% prinos) kao smeđa čvrsta supstanca. MS (ES+) C34H39FN10O2zahteva: 621, pronađeno: 622 [M+H]<+>.

[00224] Korak 5: Sinteza 1-{4-[4-(4-{5-[1-amino-1-(4-fluoro-fenil)-etil]-pirimidin-2-il}-piperazin-1-il)-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-pirazol-1-ilmetil}-ciklopropanol (12): Rastvoru 1-(4-fluoro-fenil)-1-(2-[4-(6-{1-[1-(tetrahidro-piran-2-iloksi)-ciklopropilmetil]-1H-pirazol-4-il}-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)-piperazin-1-il]-pirimidin-5-il}-etilamina (xliii) (200 mg, 0.32 mmol) u MeOH (4 mL) je dodata p-toluensulfonska kiselina (180 mg, 1.04 mmol) na sobnoj temperaturi, a dobijena smeša je mešana 2 h. Reakciona smeša je koncentrovana, a ostatak je prečišćen Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (10 mM NH4HCO3& 0.025%NH3·H2O), B = acetonitril; Gradijent: 51-56% B 7 min., zaustavljeno na 15min; Kolona: Agela Durashell C18 (L) 21.2*250mm, 10 ȝm, 150 Å) zatim liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (12) (56 mg, 31% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) į ppm 8.40 (s, 2H), 8.10 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.48-7.44 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.13-7.08 (m, 2H), 5.57 (s, 1H), 4.17 (s, 2H), 4.13-4.05 (m, 4H), 3.95-3.85 (m, 4H), 1.73 (s, 3H), 0.69-0.66 (m, 4H).

[00225] Primer 13: (S)-(1-(4-(4-(4-(5-(1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklopropil)metanol (13)

[00226] Korak 1: Sinteza metil 1-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklopropankarboksilata (xiv): Rastvoru 4-bromo-1H-pirazola (xxxix) (2.0 g, 13.70 mmol) u THF (50 mL) dodat je NaH (1.20 g, 30.14 mmol) na 0 °C. Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 1 h, zatim je u rastvor dodat metil 2,4-dibrombutanoat (xliv) (3.53 g, 13.70 mmol). Smeša je mešana 16 h, a zatim razblažena sa EA. Organski sloj je ispran sa H2O, ispran sa fiziološkim rastvorom i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 2/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xiv) (570 mg, 17% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C8H9BrN2O2zahteva: 244, pronađeno: 245 [M+H]<+>.

[00227] Korak 2: Sinteza (1-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklopropil)metanol(xlvii): Rastvoru metil 1-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklopropankarboksilata (xiv) (550 mg, 2.25 mmol) u MeOH (15 mL) dodat je NaBH4(257 mg, 6.75 mmol), a dobijena smeša je mešana na 50 °C 36 h. Reakciona smeša je razblažena sa DCM i isprana sekvencijalno sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovana u vakumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 1/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xlvii) (300 mg, 62% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C7H9BrN2O zahteva: 216, pronađeno: 217 [M+H]<+>.

[00228] Korak 3: Sinteza (S)-(1-(4-(4-(4-(5-(1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklopropil)metanol (13): Smeša (1-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklopropil)metanol (xlvii) (100 mg, 463 ȝmol), I-3 (pripremljen kako je opisano u pripremi 3) (380 mg, 695 ȝmol), Pd(t-Bu3P)2(47 mg, 93 ȝmol) i CS2CO3(452 mg, 1.39 mmol) u THF/H2O (8 mL/2 mL) je prečišćena sa N2(g) 10 min. i mešana na 80 °C 12 h sa N2(g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone (DCM/MeOH = 10/1). Dobijeni materijal je prečišćen dalje pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (13) (57.3 mg, 22% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.15 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.87 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.48-7.44 (m, 2H), 7.27 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.14-7.08 (m, 2H), 5.00 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.10-4.08 (m, 4H), 3.92-3.90 (m, 4H), 3.66 (d, 2H, J = 5.6 Hz), 2.43 (s, 2H), 1.73 (s, 3H), 1.13-1.11 (m, 2H), 1.05-1.02 (m, 2H).

[00229] Primer 14: (S)-1-(4-Fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-((R)-tetrahidrofuran-3-il)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etanamin (14)

1

[00230] Korak 1: Sinteza (S) -tetrahidrofuran-3-il metansulfonata (xlix): Rastvoru tetrahidrofuran-3-ol (xlviii)(2.0 g, 22.7 mmol) i TEA (4.6 g, 45.4 mmol) u DCM (20 mL) je dodat MsCl (4.7 g, 25.0 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana na sobnoj teperaturi 16 h. Reakciona smeša je zatim razblažena sa DCM, isprana sekvencijalno sa H2O i fiziološkim rastvorom, osušena sa anhidrovanom Na2SO4, i koncentrovana do suvoće da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (xlix) (2.0 g, sirovo) kao žuto ulje.

[00231] Korak 2: Sinteza (R)-1-(tetrahidrofuran-3-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (l): Rastvoru (S)-tetrahidrofuran-3-il metansulfonata (xlviii) (1.9 g, 11.4 mmol) u NMP (50 mL) je dodat 4-(4,4,5,5 tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-1H-pirazol (xi) (3.3 g, 17.2 mmol) i CS2CO3(11.2 g, 34.3 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana na 120 °C 2 h. Rastvor je razblažen sa EA i ispran sekvencijalno sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan u vakumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 4/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (l) (2.3 g, 76% prinos) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C13H21BN2O3zahteva: 264, pronađeno: 265 [M+H]<+>.

[00232] Korak 3: Sinteza (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-((R)-tetrahidrofuran-3-il)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etanamina (14): Smeša (R)-1-(tetrahidro-furan-3-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (l) (80 mg, 0.3 mmol), I-1 (150 mg, 0.3 mmol), Pd(dppf)Cl2(50 mg, 0.06 mmol), i K2CO3(125 mg, 0.9 mmol) u DMF (2 mL) i H2O (0.5 mL) je mešana na 80 °C 16 h sa N2(g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 16/1). Dobijeni

2

materijal je zatim prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (14) (65 mg, 38% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.16 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.87 (s, 2H), 7.49-7.45 (m, 2H), 7.26(s,1H), 7.14-7.08 (m, 2H), 5.05-4.99 (m, 1H), 4.10-4.04 (m, 4H), 4.02-3.98 (m, 2H), 3.94-3.82 (m, 6H), 2.44-2.28 (m, 4H), 1.73 (s, 3H).

[00233] Primer 15: (S)-1-(4-Fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-((S)-tetrahidrofuran-3-il)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etanamin (15)

[00234] Korak 1: Sinteza (R)-tetrahidrofuran-3-il metansulfonata (lii): Rastvoru (R)-tetrahidrofuran-3-ol (li)(1.0 g, 11.4 mmol) i TEA (2.3 g, 23 mmol) u DCM (20 mL) dodat je MsCl (1.43 g, 12.5 mmol) na sobnoj temperaturi, a dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 6 h. Reakciona smeša je razblažena sa DCM, isprana sekvencijalno sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovana da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (lii) (1.4 g, sirovo) kao bezbojno ulje.

[00235] Korak 2: Sinteza (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-((S)-tetrahidrofuran-3-il)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f] [1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etanamina (15): Smeša I-2 (300 mg, 0.62 mmol), (R)-tetrahidrofuran-3-il metansulfonata (lii) (155 mg, 0.93 mmol) i CS2CO3(600 mg, 1.89 mmol) u NMP (10 mL) je mešana na 120 °C 16 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen direktno pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3 ), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (15) (133.5 mg, 39% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555[M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.17 (s, 1H), 8.02 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 7.88 (s, 2H), 7.52-7.44 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.11 (t, 2H, J = 17.6 Hz), 5.08-4.99 (m, 1H), 4.16-4.05 (m, 4H), 4.04-3.97 (m, 2H), 3.96-3.88 (m, 5H), 3.87-3.80 (m, 1H), 2.48-2.43 (m, 2H), 2.43-2.36 (m, 1H), 2.32-2.25 (m, 1H), 1.74 (s, 3H).

[00236] Primer 16: (S)-1-(4-Fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etan-1-amin (16)

[00237] Korak 1: Sinteza tetrahidro-2H-piran-4-il metansulfonata (liv): Rastvoru tetrahidro-2H-piran-4-ol (liii) (3.20 g, 31.3 mmol) i TEA (9.51 g, 94.0 mmol) u DCM (100 mL) je dodat MsCl (5.38 g, 47.0 mmol) na 0 °C. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 3 h, a zatim je razblažena sa DCM, isprana sa zasićenim ekv. Na2CO3rastvorom i osušena sa anhidrovanim Na2SO4. Rastvarač je uklonjen da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (liv) (3.2 g, sirovo) kao žuto ulje.

[00238] Korak 2: Sinteza 1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (lv): Smeša tetrahidro-2H-piran-4-il metansulfonata (liv) (3.20 g, 17.7 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (4.13 g, 21.3 mmol) i CS2CO3(8.68 g, 26.6 mmol) u NMP (50 mL) je mešana na 80 °C 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa DCM i isprana sa fiziološkim rastvorom. Organski sloj je ispario u vakuumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 5/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (lv) (1.2 g, 24% prinos). MS (ES+) C14H23BN2O3zahteva: 278, pronađeno: 279 [M+H]<+>.

4

[00239] Korak 3: Sinteza (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1H-pirazol-4-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etan-1-amina (16): Smeša I-1 (300 mg, 603 ȝmol), 1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1H-pirazola (lv) (210 mg, 754 ȝmol), K2CO3(104 mg, 754 ȝmol), i Pd(dppf)Cl2(30 mg, 41 ȝmol) u DMF/H2O (10 mL/2 ml) je mešana na 70 °C sa N2(g) 4 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 15%-95% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (16) (40.2 mg, 6% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C30H33FN10O zahteva: 568, pronađeno: 569 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.19 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.48-7.45 (m, 2H,), 7.24 (s, 1H), 7.13-7.09 (m, 2H), 4.42-4.37 (m, 1H), 4.12-4.40 (m, 4H), 3.99-3.96 (m, 2H), 3.92-3.90 (m, 4H), 3.52-3.46 (m, 2H), 2.43 (s, 2H), 2.05-1.92 (m, 4H), 1.73 (s, 3H).

[00240] Primer 17: (3R,4R)-4-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (17)

[00241] Korak 1: Sinteza rac-trans-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (lvii): Rastvor 3,6-dioksabiciklo[3.1.0]heksana (lvi) (5.2 g, 60.5 mmol), 4-bromo-1H-pirazola (xxxix) (8.8 g, 60.5 mmol) i CS2CO3(39.3 g, 121 mmol) u NMP (100 mL) je mešan na 120 °C 16 h. Rastvor je ohlađen i razblažen sa DCM, a zatim je ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 3/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (lvii) (10 g, 71% prinos) kao bezbojna čvrsta supstanca. MS (ES+) C7H9BrN2O2zahteva: 232, pronađeno: 233 [M+18]<+>.

[00242] Korak 2: Sinteza rac-cis-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-il 4-nitrobenzoata (lviii): Smeša rac-trans-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (lvii) (2.7 g, 11.6 mmol), 4-nitrobenzojeve kiseline (1.95 g, 11.6 mmol) diizopropil azodikarboksilata (3.53 mg, 17.4 mmol) i trifenilfosfina (4.57 g, 17.4 mmol) u THF (50 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Rastvor je razblažen sa EA, i ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 3/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (lviii) (4 g, 90% prinos) kao bezbojna čvrsta supstanca. MS (ES+) C14H12BrN3O5zahteva: 381, pronađeno: 382 [M+H]<+>.

[00243] Korak 3: Sinteza (3S,4S)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (lx) (Pik 1) i (3R,4R)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (lxi) (Pik 2): Smeša rac-cis-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-il 4-nitrobenzoata (lvii) (4 g, 10.5 mmol) i litijum hidroksida (2.2 g, 52.5 mmol) u MeOH/THF/H2O (30 mL/30 mL/30 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa EA i isprana sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovana u vakumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (PE/EA = 3/1= 3/1) da bi se dobio rac-cis-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (1.3 g, 53% prinos) kao bezbojna čvrsta supstanca. MS (ES+) C7H9BrN2O2zahteva: 232, pronađeno: 233 [M+H]<+>. Ovaj materijal je podvrgnut hiralnom odvajanju preko SFC (Kolona: AD 20*250mm, 10ȝm (Daicel); Mobilna faza: CO2/MeOH (0.2% amonijaka u metanolu) = 60/40; Stopa protoka: 80 g/min) da bi se dobio Pik 1 (lx) (500 mg) i Pik 2 (lxi) (500 mg). Pik 1 je proizvoljno dodeljen kao (3S,4S)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol i Pik 2 je proizvoljno dodeljen kao (3R,4R)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol.

[00244] Korak 4: Sinteza (3R,4R)-4-(4-(4-(4-(5-((S)-1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (17): Smeša (3R,4R)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (lxi) (70 mg, 0.3 mmol) (Pik 2 iz koraka 3), I-3 (328.3 mg, 0.6 mmol), Pd[(t-Bu)3P]2(31 mg 0.06 mmol) i Na2CO3(96 mg, 0.9 mmol) u dioksanu/H2O (8 mL/2 mL) je mešana na 90 °C 4 h. Nakon hlađenja, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (17) (106.3 mg, 62% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O2zahteva: 570, pronađeno: 571, 554 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.15 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.52-7.42 (m, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.17-7.10 (m, 2H), 5.33 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 4.92-4.83 (m, 1H), 4.46-4.38 (m, 1H), 4.21-4.05 (m, 6H), 4.01 (m, 1H), 3.95-3.85 (m, 4H), 3.73 (m, 1H), 2.45 (s, 2H), 1.73 (s, 3H).

[00245] Primer 18: (3R,4S)-4-(4-(4-(4-(5-((S)-1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (18)

[00246] Korak 1: Hiralno odvajanje rac-trans-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (lvii): rac-trans-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (1.1 g) (iz koraka 1 Primera 17) je podvrgnut hiralnom odvajanju preko SFC (Kolona: AD 20*250mm, 10ȝm (Daicel); Mobilna faza: CO2/MeOH (0.2% amonijaka u MeOH) = 80/20; Brzina protoka: 80 g/min.) da bi se dobio Pik 1 (lxiii) (400 mg) i Pik 2 (lxiv) (500 mg). Pik 1 je proizvoljno dodeljen kao (3R,4S)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol i Pik 2 je proizvoljno dodeljen kao (3S,4R)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol.

[00247] Korak 2: Sinteza (3R,4S)-4-(4-(4-(4-(5-((S)-1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (18): Smeša (3R,4S)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (70 mg, 0.3 mmol) (lxiii)(Pik 1 iz Koraka 1), I-3 (328.3 mg, 0.6 mmol), Pd[(t-Bu)3P]2(31 mg, 0.06 mmol) i Na2CO3(96 mg, 0.9 mmol) u dioksanu/H2O (8 mL/2 mL) je degasirana sa N2i mešana na 90 °C 4 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa DCM, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (18) (55.6 mg, 33% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O2zahteva: 570, pronađeno: 571, 554 [M+H]<+>, [M+H-NH3]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.15 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.51-7.43 (m, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.16-7.07 (m, 2H), 5.66 (d, 1H, J = 4 Hz), 4.75-4.67 (m, 1H), 4.51-4.42 (m, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.15-3.99 (m, 6H), 3.96-3.85 (m, 4H), 3.63 (m, 1H), 2.47 (s, 2H), 1.73 (s, 3H).

[00248] Primer 19: (3S,4R)-4-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (19)

[00249] Smeša (3S,4R)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (70 mg, 0.3 mmol) (lxiv) (Pik 2 iz Koraka 1 Primera 22), I-3 (328.3 mg, 0.6 mmol), Pd[(T-Bu)3P]2(31 mg, 0.06 mmol) i Na2CO3(96 mg, 0.9 mmol) u dioksanu/H2O (8 mL/2 mL) je degasirana sa N2i mešana na 90 °C 4 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (19) (51.9 mg, 31% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O2zahteva: 570, pronađeno: 571, 554 [M+H]<+>i [M+H-NH3]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.15 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.52-7.43 (m, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.19-7.06 (m, 2H), 5.66 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 4.75-4.66 (m, 1H), 4.51-4.41 (m, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.16-3.99 (m, 6H), 3.97-3.83 (m, 4H), 3.63 (dd, 1H, J = 9.6 Hz, J = 2.8 Hz), 2.54 (s, 2H), 1.73 (s, 3H).

[00250] Primer 20: (3S,4S)-4-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (20)

[00251] Smeša (3S,4S)-4-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)tetrahidrofuran-3-ol (lxiii) (50 mg, 0.22 mmol) (Pik 1 iz Koraka 3 Primera 21), I-3 (234.5 mg, 0.44 mmol), Pd[(t-Bu)3P]2(22 mg, 0.044 mmol) i Na2CO3(68 mg, 0.66 mmol) u dioksanu/H2O (8 mL/2 mL) je mešana na 90 °C 4 h. Nakon hlađenja, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (20) (74.6 mg, 61% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O2zahteva: 570, pronađeno: 571, 554 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.15 (s, 1H), 8.03 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.88 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.51-7.44 (m, 2H), 7.28 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 7.17-7.10 (m, 2H), 5.33 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 4.93-4.83 (m, 1H), 4.47-4.38 (m, 1H), 4.20-4.06 (m, 6H), 4.01 (m, 1H), 3.95-3.88 (m, 4H), 2.45 (s, 2H), 3.73 (m, 1H), 1.76 (s, 3H).

[00252] Primer 21: (1S,2S)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol (21)

[00253] Korak 1: Sinteza trans-2-(benziloksi)ciklobutanol i cis-2-(benziloksi)ciklobutanol: Rastvoru 2-(benziloksi)ciklobutanona (1.0 g, 5.7 mmol) u MeOH (20 mL) je dodat NaBH4(432 mg, 11.4 mmol) na 0 °C. Rastvor je mešan na sobnoj teperaturi 3 h. Smeša je razblažena sa EA, isprana sa vodom i fiziološkim rastvorom, zatim je organski sloj koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 5/1) da bi se dobilo 400 mg Pik 1 (proizvoljno dodeljen kao cis-2-(benziloksi)ciklobutanol) kao bezbojno ulje i 400 mg Pik 2 (proizvoljno dodeljen kao trans-2-(benziloksi)ciklobutanol) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C11H14O2zahteva: 178, pronađeno: 179 [M+H]<+>.

[00254] Korak 2: Sinteza cis-2-(benziloksi)ciklobutil metansulfonata: Rastvoru cis-2-(benziloksi)ciklobutanola (270 mg, 1.52 mmol) u DCM (10 mL) dodat je mezil hlorid (259 mg, 2.28 mmol) i trietilamin (459 mg, 4.56 mmol) na 0 °C. Smeša je mešana na sobnoj teperaturi 3 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa DCM, ispran vodom i fiziološkim rastvorom, osušen sa anhidrovanim Na2SO4, i koncentrovan da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (300 mg, 77% prinos) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C12H16O4S zahteva: 256, pronađeno: 274 [M+18]<+>.

[00255] Korak 3: Sinteza trans-2-(benziloksi)ciklobutil)-4-bromo-1H-pirazola: Smeša cis-2-(benziloksi)ciklobutil metansulfonata (300 mg, 1.17 mmol), 4-bromo-1H-pirazola (171 mg, 1.17 mmol) i Cs2CO3(1.15 g, 3.51 mmol) u DMF (8 mL) je mešana na 100 °C 16 h. Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa vodom i fiziološkim rastvorom, osušen sa anhidrovanim Na2SO4, koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom kolone (PE/EA = 5/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (170 mg, 47% prinos) kao bezbojno ulje. MS (ES+) C14H15BrN2O zahteva: 306, pronađeno: 307 [M+H]<+>. Hiralno odvajanje trans-2-(benziloksi)ciklobutil)-4-bromo-1H-pirazola: trans-2-(benziloksi)ciklobutil)-4-bromo-1H-pirazol (600 mg) je podvrgnut hiralnom odvajanju preko SFC (Kolona: IG 20*250mm, 10ȝm (Daicel); Mobilna faza: CO2/MeOH (0.2% amonijaka u metanolu) = 75/25; Brzina protoka: 4 g/min) da bi se dobio Pik 1 (250 mg) i Pik 2 (250 mg). Pik 1 je proizvoljno dodeljen kao 1-((1S,2S)-2-(benziloksi)ciklobutil)-4-bromo-1H-pirazol i pik 2 je proizvoljno dodeljen kao 1-((1R,2R)-2-(benziloksi)ciklobutil)-4-bromo-1H-pirazol.

[00256] Korak 4: Sinteza (1S,2S)-2-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklobutanola: Rastvor 1-((1S,2S)-2- (benziloksi)ciklobutil)-4-bromo-1H-pirazol (250 mg, 820 ȝmol) u TFA (2 mL) je mešan na 80 °C 16 h. Nakon toga, rastvor je koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 3/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (120 mg, 68% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C7H9BrN2O zahteva: 216, pronađeno: 217 [M+H]<+>.

[00257] Korak 5: Sinteza (1S,2S)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanola: Smeša (1S,2S)-2-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol (120 mg, 556 ȝmol), I-3 (362 mg, 667 ȝmol), Pd(t-Bu3P)2(50 mg, 99 ȝmol) i Cs2CO3(362 mg, 1.12 mmol) u dioksanu/H2O (8 mL/2 mL) je prečišćena sa N210 minuta i mešana na 90 °C 4 h sa N2. Nakon toga, rastvor je razblažen sa DCM, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1). Dobijeni materijal je prečišćen pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3 ), B = acetonitril; Gradijent: B = 32%-62% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (52.6 mg, 17% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.19 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.88 (s, 2H), 7.48-7.44 (m, 2H), 7.26 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.14-7.08 (m, 2H), 5.67 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 4.46-4.39 (m, 1H), 4.34-4.26 (m, 1H), 4.10-4.06 (m, 4H), 3.92-3.90 (m, 4H), 2.44 (s, 2H), 2.16-2.10 (m, 2H), 1.89-1.79 (m, 1H), 1.73 (s, 3H), 1.62-1.52 (m, 1H).

[00258] Primer 22: (1R,2R)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-Amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol (22)

[00259] Korak 1: Sinteza (1R,2R)-2-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklobutanola: Rastvor 1-((1R,2R)-2-(benziloksi)ciklobutil)-4-bromo-1H-pirazol (250 mg, 820 ȝmol) (iz Pika 2 u Koraku 3 Primera 21) u TFA (2 mL) je mešan na 80 °C 16 h. Nakon toga, rastvor je koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 3/1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (120 mg, 68% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C7H9BrN2O zahteva: 216, pronađeno: 217 [M+H]<+>.

[00260] Korak 2: Sinteza (1R,2R)-2-(4-(4-(4-(5-((S)-1-amino-1-(4-fluorofenil)etil)pirimidin-2-il)piperazin-1-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il)-1H-pirazol-1-il)ciklobutanola: Smeša (1R,2R)-2-(4-bromo-1H-pirazol-1-il)ciklobutanol (120 mg, 556 ȝmol), (S)-1-(4-fluorofenil)-1-(2-(4-(6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-il)piperazin-1-il)pirimidin-5-il)etanamin (362 mg, 667 ȝmol), Pd(t-Bu3P)2(50 mg, 99 ȝmol) i Cs2CO3(362 mg, 1.12 mmol) u dioksanu/H2O (8 mL/2 mL) je prečišćena sa N2(g) 10 min i mešana na 90 °C 4 h sa N2 (g). Nakon toga, rastvor je razblažen sa EA, ispran sa H2O i fiziološkim rastvorom, i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kolone na silika gelu (DCM/MeOH = 10/1). Dobijeni materijal je prečišćen dalje pomoću Prep-HPLC (Mobilna faza: A = H2O (0.1% NH4HCO3), B = acetonitril; Gradijent: B = 30%-60% 18 min.; Kolona: Xtimate™ 10um 150A 21.2×250mm) nakon čega je usledila liofilizacija da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (51.5 mg, 17% prinos) kao bela čvrsta supstanca. MS (ES+) C29H31FN10O zahteva: 554, pronađeno: 555 [M+H]<+>.<1>H-NMR (400 MHz, 6d-DMSO) į ppm 8.41 (s, 2H), 8.19 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.88 (s, 2H), 7.48-7.44 (m, 2H), 7.26 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.14-7.08 (m, 2H), 5.67 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 4.46-4.39 (m, 1H), 4.34-4.26 (m,

1

1H), 4.10-4.06 (m, 4H), 3.92-3.90 (m, 4H), 2.44 (s, 2H), 2.16-2.10 (m, 2H), 1.89-1.79 (m, 1H), 1.73 (s, 3H), 1.62-1.52 (m, 1H).

PRIMER 2: Biohemijske analize enzimske aktivnosti

[00261] Enzimska aktivnost PDGFRĮ i KIT je praćena korišćenjem platforme Perkin Elmer tehnologije elektroforetske promene mobilnosti, EZReader 2. Fluorescentno označeni supstrat peptida je inkubiran u prisustvu kinaze i ATP, i u prisustvu testiranog jedinjenja, tako da je svaka doza testiranog jedinjenja rezultovala reflektujućim delom peptida koji se fosforiliše.

[00262] U okviru linearne stabilne faze enzimske reakcije kinaze, smeša pulovanih fosforilizovanih (proizvod) i nefosforilizovanih (supstrat) peptida je puštena kroz mikrofluidni sistem PerkinElmer EZ Reader 2, sa primenjenom razlikom električnog potencijala. Prisustvo fosfatne grupe na proizvodu peptida obezbedila je razliku u masi i naelektrisanju između supstrata peptida, što rezultuje odvajanjem supstrata i pulova proizvoda u uzorku (Perrin et al., Expert Opin Drug Discovery 2010, Jan 5(1):51-63).

[00263] Kako smeša proizvoda i supstrata peptida prolazi lasere unutar instrumenta, ovi pulovi su otkriveni (Ȝex= 488 nm, Ȝem= 568 nm) i razdvojeni kao odvojeni pikovi. Odnos između ovih pikova odražava aktivnost jedinjenja na toj koncentraciji, u tom udubljenju, pod tim uslovima.

Inhibicija biohemijske enzimske aktivnosti mutiranog KIT (D816V) PDGFRĮ (D842V)

[00264] Svi testirani članovi su rastvoreni u 100% DMSO na osnovnoj koncentraciji od 10 mM. Napravljena su 100X, 10-tačaka, 4-struka serijska razblaživanja svih testiranih jedinjenja u 100% DMSO, počevši od relevantne koncentracije, obično 1 mM. Zapremina od 0.130 ȝL svake koncentracije je prebačena u relevantno udubljenje pločice za analizu sa 384 udubljenja (Greiner 781 201) pomoću TTPLabtech Mosquito nano-litarskog dozatora. Koristeći Multidrop, preostali sastojci reakcije su zatim dodati u 0.130 ȝL jedinjenja na sledeći način:

[00265] Analiza PDGFRĮ D842V na očiglednoj Michaelis-Menten konstanti (APPKM) za ATP: U svako udubljenje pločice za analizu sa 384 udubljenja, inkubirano je 7 nM netretiranog enzima u ukupno 13 ȝL pufera (100 mM HEPES pH 7.5, 0.015% Brij 35, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) sa 1 ȝM CSKtide (5-FAM-AHA-KKKKDDIYFFFG-NH2) i 25 ȝM ATP na 25 °C 90 minuta u prisustvu ili odsustvu dozirane serijske koncentracije jedinjenja (1% DMSO finalna koncentracija). Reakcija je zaustavljena dodavanjem 70 ȝl Stop pufera (100 mM HEPES pH 7.5, 0.015% Brij 35, 35 mM EDTA i 0.2% reagensa za oblaganje 3, Caliper Lifesciences). Pločica je pročitana na Caliper EZReader 2.

2

[00266] Analiza KIT D816V na APPKM za ATP: U svako udubljenje pločice za analizu sa 384 udubljenja, inkubirano je 0.3 nM netretiranog enzima u ukupno 13 ȝL pufera (100 mM HEPES pH 7.5, 0.015% Brij 35, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) sa 1 ȝM SRCtide (5-FAM-GEEPLYWSFPAKKK-NH2) i 20 ȝM ATP na 25 °C 60 minuta u prisustvu ili odsustvu dozirane serijske koncentracije jedinjenja (1% DMSO finalna koncentracija). Reakcija je zaustavljena dodavanjem 70 ȝl Stop pufera (100 mM HEPES pH 7.5, 0.015% Brij 35, 35 mM EDTA i 0.2% reagensa za oblaganje 3, Caliper Lifesciences). Pločica je pročitana na Caliper EZReader 2. Rezultati dobijeni u ovim eksperimentima za jedinjenja pripremljena prema primerima su sumirani u Tabeli 2 u nastavku. Za biohemijsku aktivnost D816V i D842V , sledeće oznake su korišćene: 0.30 nM = A; 0.31 i < 1 nM = B; i ND = nije određeno. Za ćelijsku aktivnost u HMC1.2 ćelijskoj liniji, sledeće oznake su korišćene: A se odnosi na < 4.5 nM; B se odnosi na 4.6 i <10 nM; i ND = nije određeno.

Tabela 2.

[00267] Za navođenje, hemijska struktura jedinjenja Primera 63 u WO2015/057873 je:

.

PRIMER 3: Analiza autofosforilacije HMC1.2

[00268] 10,000 HMC1.2 ćelija je inkubirano u 22 ȝL medijuma kulture (IMDM bez fenolcrvenog, bez seruma) u svakom udubljenju pločice sa 384 udubljenja i serumskim gladovanjem preko noći u inkubatoru za kulturu tkiva (5% CO2, 37 °C). Serije doznih koncentracija jedinjenja od 10 tačaka (2.5 ȝM-9.54 pM) su zatim dodate ćelijama u zapremini od 3.1 ȝL u svako udubljenje (0.25% DMSO finalna koncentracija). Nakon 90 minuta, 6 ȝL 5X AlphaLISA pufer za liziranje (Perkin Elmer) dopunjen koktelom inhibitora proteaze i fosfataze (Cell Signaling Technologies) dodat je u svako udubljenje i mućkan na 450 rpm 15 minuta na 4 °C. 10 ȝL fosfo-Y719 c-KIT i sva c-KIT antitela (15 nM konačna koncentracija, Cell Signaling Technologies) i 50 ȝg/mL AlphaLISA zečje akceptor kuglice (Perkin Elmer) su dodati u svako udubljenje i mućkani na 300 rpm na sobnoj temperaturi 2 h, 10 ȝL od 100 ȝg/mL streptavidin donatorskih kuglica (Perkin Elmer) dodato je u svako udubljenje, blokirano od svetlosti čvrstim crnim lepkom i mućkano na 300 rpm na sobnoj temperaturi 2 h. Fluorescentni signal je dobijen na Envision (Perkin Elmer) pomoću AlphaScreen 384 well HTS protokola. Podaci su normalizovani na 0% i 100% kontrola inhibicije, a IC50je izračunat pomoću četvoro parametarske logističke IC50krive poklapanja.

4

[00269] Tabela prikazuje aktivnost jedinjenja u ćelijskoj liniji leukemije mastocita, HMC 1.2. Ova ćelija linija sadrži mutiran KIT na pozicijama V560G i D816V što dovodi do konstitutivne aktivacije kinaze. Sledeća jedinjenja su testirana u analizi za merenje direktne inhibicije aktivnosti KIT D816V kinaze analizirajući KIT autofosforilaciju na tirozinu 719 na KIT proteinu. Rezultati ovih eksperimenata za jedinjenja pripremljena prema primerima su sumirani u Tabeli 2.

PRIMER 4: Procena penetracije u mozgu kod pacova odnosi mozga i plazme (Kp,mozak)

[00270] Da bi se razumela penetracija u mozgu, odnosi jedinjenja mozga i plazme su dobijeni od Sprague-Dawley (SD) pacova. In vivo ravnotežna distribucija između krvi i mozga kod prekliničkih vrsta kao što su pacovi je uobičajen parametar za procenu penetracije u mozgu. Kp,mozak je odnos koncentracija u mozgu i krvi (Cmozak/Cplazma). Karakteristike pasivne difuzije jedinjenja, njegov afinitet za membranske transportere na krvno-moždanoj barijeri (BBB), i razlike u relativnom afinitetu vezivanja lekova između proteina plazme i moždanog tkiva utiču na Kp,mozak. Jedinjenja sa Kp,mozak manjim od 0.1 imaju ograničen pristup CNS, dok se za jedinjenja sa Kp,mozak većim od 0.3-0.5 smatra da imaju dobru penetraciju u mozgu i jedinjenja sa Kp,mozak većim od 1 slobodno prelaze BBB (Expert Opin. Drug Delivery (2016) 13 (01): 85-92).

[00271] Penetracije u mozgu 4 i 63 su merene kod Sprague-Dawley pacova (3/jedinjenje). Životinje su dobile IV infuziju od 1 mg/kg/h jedinjenja tokom 24 sata putem jugularne kanulacije vena. Na 24 sata, krv je sakupljena putem krvarenja iz repne vene ili srčane punkcije (pod anestezijom) i centrifugirana za dobijanje uzoraka plazme. Tkivo mozga je sakupljeno i homogenizovano sa fiziološkim fosfatnim puferom (PBS). Koncentracije jedinjenja su dobijene u plazmi i homogenatima mozga pomoću LC-MS/MS analize. Tabela 3A u nastavku prikazuje rezultate koncentracija u plazmi i mozgu, kao i Kp,mozak za jedinjenje 4 pripremljeno prema primerima koji su opisani ovde i jedinjenje 63 WO2015/057873.

Tabela 3A.

[00272] Jedinjenje 4 ima veoma nizak Kp,mozak (Srednja vrednost=0.17) u poređenju sa 63 (Srednja vrednost=1.8).

[00273] Vezivanje proteina plazme pacova 4 i 63 procenjeno je in vitro pomoću postupka ravnotežne dijalize. Jedinjenje 4 (10 ȝM) je procenjeno u 100% plazme u bloku dijalize 5 h na 37 °C. Uzorci od donora i primaoca su analizirani pomoću LC-MS/MS. Frakcije vezanog i nevezanog proteina plazme su izračunate pomoću sledećih jednačina –

Frakcija vezanog (fb)*(%) = 100 x ([Donor]5h- [Primaoc]5h)/[Donor]5h(jednačina 1) Frakcija ne-vezanog (fu),p*(%) = 100 - % vezanog* (jednačina 2) pri čemu je: [Donor]5hizmerena koncentraciju donora na 5-sati; [Primaoc]5hizmerena koncentraciju primaoca na 5-sati; fb* je frakcija vezanog proteina određena iz plazme; fu,p* izračunata frakcija ne-vezanog proteina za plazmu. Varfarin i hinidin su korišćeni kao pozitivne kontrole.

[00274] FB za 4 i 63 je 97.92% i 99.8%, po redu. Tako su fu,p 4 i 632.08% i 0.2%, po redu.

[00275] Slično tome, procenjeno je vezivanje proteina 4 i 63 u mozgu pacova in vitro koristeći postupak ravnotežne dijalize. 1ȝM jedinjenja je procenjeno u homogenatu mozga u bloku dijalize 5 sati na 37 °C. Uzorci od donora i primaoca su analizirani pomoću LC-MS/MS. Frakcije vezanih i ne-vezanih proteina u mozgu su izračunate pomoću prethodno navedenih jednačina (Jednačine 1 i 2). Zbog velikog vezivanja proteina, 4 je dalje razblažen 4x za merenje homogenata mozga. Fu,mozak 4 i 63 su 0.29% i 0.1%, po redu.

Odnosi ne-vezanog mozga i plazme (Kpuu,mozak)

[00276] Na osnovu koncentracija u mozgu i plazmi prethodno dobijenih (Tabela 3A) i fu,mozak vrednosti prethodno dobijenih, odnosi ne-vezanog mozga i plazme (Kpuu, mozak) su izračunati za 4 i 63 na sledeći način:

[00277] Jedinjenje 4 ima visoko superiorno nizak Kp,uu,mozak (Srednja vrednost=0.024) u poređenju sa 63 (Srednja vrednost=0.84). Koncentracija ne-vezanog leka u tkivu je slobodan lek koji je dostupan za ispoljavanje svog farmakološkog efekta u delu tkiva. Pošto 4 ima veoma nisku Kp,uu,mozak u poređenju sa 63, to znači da je količina 4 dostupna u mozgu za ispoljavanje svog farmakološkog efekta veoma niska u poređenju sa 63.

[00278] Alternativno, procenjeni su proteini za vezivanje u mozgu kod pacova jedinjenjima 4 i 63 in vitro koristeći isečke mozga pacova debljine 300um (područje strijatuma) u inkubacionoj posudi. Po ovom postupku fu,mozak jedinjenja 4 i 63 su 0.329% i 0.057%, po redu. U tom slučaju, Kp,uu, mozak 4 i 63 su 0.028 i 0.044, po redu.

[00279] Rezultati Kp, Kp,uu (homogenat mozga) i Kp,uu (isečak mozga) su navedeni u Tabeli 3B za dodatna jedinjenja prema pronalasku pripremljena prema primerima. Rezultati u Tabeli 3B su dobijeni prema postupcima koji su prethodno opisani.

Tabela 3B.

* nije moguće merenje zbog visokog vezivanja proteina

Procena jedinjenja kao potencijalnih supstrata P-glikoproteina

[00280] Potencijal za jedinjenja pripremljena prema primerima da budu supstrati humanog P-glikoproteina (P-gp) je procenjen in vitro na Multidrug Resistance Mutation 1-Mardin-Darby Canine Kidney (MDR1-MDCK)) (Mardin-Darby Canine Kidney) monoslojevima ćelija koje prekomerno eksprimiraju P-gp gajen na propustljivim nosačima. Elakridar je korišćen kao pozitivni kontrolni inhibitor transporta hinidina posredovanog sa P-gp. Veći odnos efluksa P-gp znači da je jedinjenje potisnuto iz moždanog tkiva transporterom.

[00281] Procena farmakokinetike nakon jedne intravenske i oralne primene kod pacova: 3 Sprague-Dawley pacova su korišćena za svako jedinjenje za svaki način primene (iv ili oralno). Za iv primenu, 1 mg/kg (zapremina doze=5 mL/kg) svakog jedinjenja je primenjena intravenskim putem preko injekcije hrane u dorzalnu venu; dok je za oralni put, 2.5 mg/kg (zapremina doze=5mL/kg) primenjen preko oralne gavaže. Uzorci krvi dobijeni su putem repne vene pre doze, 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 i 8 h. Pored toga, uzorci krvi su takođe dobijeni na 24 sata putem srčane punkcije (pod anestezijom sa izofluranom) za terminalno krvarenje. Svi uzorci krvi su analizirani za koncentracije leka preko LC/MS-MS. Farmakokinetički parametri kao što su Cmax, Tmax, AUCprošli, AUCinf, MRTprošli, MRTinf, T1/2, Vssi CL su dobijeni pomoću ne-kompartmentalne analize (NCA). Dalje, ne-vezani klirens (CLu) je dobijen na sledeći način:

Clu= Cl / fu, plazma.

%F je izračunat na sledeći način:

%F = [AUCinf(oralno)/doza]/[AUCinf(iv)/Doza]*100

(Zhivkova & Doytchinova, Molecular Pharmaceuticals 10:3758-68 (2013)).

Tabela 3C.

PRIMER 5: Podaci CYP Inhibicije

[00282] In vitro studije u mikrozomima jetre ljudi su sprovedene prema standardnom postupku. Ukratko, sedam različitih koncentracija testiranog člana ili jedna koncentracija pozitivne kontrole su ko-inkubirani sa jednom koncentracijom supstrata probe za svaku od CYP450 enzima u pulovanim mikrozomima jetre ljudi 5-10 minuta, a onda su reakcije prekinute dodavanjem 0.1% mravlje kiseline u acetonitril. Uzorci su zatim analizirani pomoću LC-MS/MS za kvantifikaciju supstrata probe koja je ostala nakon reakcije i vrednosti IC50su određene nelinearnom regresijom. Supstrati za CYP2C9, CYP2D6, CYP3A4 su bili diklofenak, dekstrometorfan i midazolam/testosteron po redu. Podaci u Tabeli 4 prikazuju IC50s za CYP inhibiciju jedinjenja pripremljenih prema primerima za CYP2C9, CYP2D6, i CYP3A4.

Tabela 4.

PRIMER 6: Vezivanje proteina plazme majmuna pomoću infuzije iv, Majmun Kp, Majmun Kp,uu(homogenat/isečak mozga)

[00283] Jedna bolusna doza IV praćena 2 časovnom iv infuzijom jedinjenja primenjena je na majmunu (3 majmuna/jedinjenje). Krv je sakupljena iz femoralne vene pre doze, odmah posle primene bolusa i na kraju infuzije. Majmun je uspavan nakon infuzije i sakupljeno je moždano tkivo. Toksikokinetička evaluacija plazme (dobijena centrifugiranjem krvi) i mozga (homogenizovana u puferu) sprovedena je da bi se dobio odnos jedinjenja u mozgu i plazmi (Kp). Kpuu je izračunat uzimajući u obzir fu,plazmu i fu,mozak kako je prethodno navedeno.

Tabela 5.

PRIMER 7: Analize biohemijske aktivnosti za divlji tip KIT

Proliferacija UT-7 ćelija sa analizom SCF stimulacije kao merom aktivnosti divljeg tipa KIT

[00284] UT-7 ćelije su ćelijske linije humanih megakarioblastnih leukemija koje se mogu gajiti u kulturi u zavisnosti od faktora stimulacije granulocitno makrofagne kolonije (GM-CSF) ili faktora matičnih ćelija (SCF). UT-7 ćelije reaguju na stimulaciju SCF aktivacijom KIT receptora tirozin kinaze i naknadnom nizvodnom signalizacijom koja može podržati rast i proliferaciju ćelija (Kuriuet al, 1999; Komatsu et al, 1991; Sasaki et al, 1995). Analizirana je sposbnost testiranih jedinjenja da inhibiraju proliferaciju UT-7 ćelija stimulisanu sa SCF.

[00285] Inhibicija proliferacije UT-7 ćelija stimulisane sa SCF je procenjena korišćenjem analize CellTiter-Glo kojom se kvantifikuje količina prisutog adenozin trifosfata (ATP), što je Rčitavanje metabolički aktivnih ćelija i direktno je proporcionalno broju vijabilnih ćelija u kulturi. Sposobnost testiranih jedinjenja da inhibiraju proliferaciju UT-7 ćelija stimulisanu sa SCF određena je upotrebom krive doze od 10 tačaka u rasponu od 25 ȝM do 95.4 pM testiranog jedinjenja.

[00286] UT-7 ćelije su održavane u IMDM dopunjenim sa 10% FBS, 5 ng/mL GM-CSF i 100 jedinica/mL penicilin-streptomicina i gajene na 37 °C u inkubatoru za vlažnu kulturu tkiva. UT-7 ćelije su jednom isprane bez seruma, GM-CSF bez IMDM. ûelije su zatim resuspendirane u IMDM koji sadrži 4% FBS i 50 ng/mL SCF i zasejane na 2500 ćelija po udubljenju u zapremini od 22 ȝL u mikropločici sa 384 udubljenja. Serije koncentracija doze na 10 tačaka testiranog jedinjenja (25.0 ȝM do 95.4 pM) su zatim dodate ćelijama u zapremini od 3.1 ȝL u svako udubljenje (0.25% DMSO finalna koncentracija) i stavljene u inkubator kulture tkiva (5% CO2, 37°C) 72 h. Nakon 3 dana sa testiranim jedinjenjem, CellTiter-Glo reagens je pripremljen svež i dodato je 25 ȝL reagensa u svako udubljenje. Pločica je pomešana trešenjem 10 minuta na sobnoj temperaturi na 300 rpm u šejkeru za pločice. Pločica je pročitana na EnVision čitaču pločica koristeći Ultra Sensitive Luminescence protokol za pločicu sa 384 udubljenja. Podaci su normalizovani na 0% i 100% kontrole inhibicije, a IC50 je izračunat pomoću četvoro parametarske logističke IC50 krive poklapanja.

Analiza divljeg tipa KIT

[00287] Određivanje Kd. Za većinu analiza, uključujući divlji tip KIT kinaze, sojevi T7 faga označeni kinazom pripremljeni su u domaćinu E. coli dobijenom od BL21 soja. E. coli su rasli u log-fazi i zaraženi sa T7 fagom i inkubirani sa trešenjem na 32 °C do liziranja. Magnetne kuglice obložene streptavidinom su tretirane sa biotinilovanim malim molekulima liganada 30 minuta na sobnoj temperaturi da bi se generisao afinitet smola za analize kinaze. Kuglice sa ligandom su blokirane viškom biotina i isprane sa puferom za blokiranje (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0.05% Tween 20, 1 mM DTT) da bi se uklonili ne-vezani ligandi i da bi se smanjilo

1

ne-specifično vezivanje. Reakcije vezivanja su sastavljene kombinovanjem kinaza, kuglica sa afinitetom prema ligandima i testiranih jedinjenja u 1 × puferu za vezivanje (20% SeaBlock, 0.17× PBS, 0.05% Tween 20, 6 mM DTT). Testirana jedinjenja su pripremljena kao 111X osnovna koncentracija u 100% DMSO. Kds su utvrđene korišćenjem serija 11-tačaka 3-struko razblaženih jedinjenje sa tri DMSO kontrolne tačke. Sva jedinjenja za merenje Kd su distribuirana akustičnim prenosom (bezkontaktnim doziranjem) u 100% DMSO. Jedinjenja su zatim direktno razblažena u analizama tako da je konačna koncentracija DMSO bila 0.9%. Sve reakcije su izvedene u polipropilen pločicama sa 384 udubljenja. Svaka je konačne zapremine 0.02 ml. Pločice za analizu su inkubirane na sobnoj temperaturi sa trešenjem 1 h, a kuglice afiniteta su isprane su puferom za ispiranje (1× PBS, 0.05% Tween 20). Kuglice su zatim ponovo suspendovane u puferu za eluiranje (1× PBS, 0.05% Tween 20, 0.5 ȝM nebiotinilovanog afinitetnog liganda) i inkubirane na sobnoj temperaturi sa trešenjem 30 minuta. Koncentracija kinaze u eluatima je merena sa qPCR.

[00288] Konstante vezivanja (Kds). Konstante vezivanja (Kds) su izračunate sa standardnom krivom doza-odgovor koristeći Hill jednačinu: Odgovor = Pozadina Signal - Pozadina 1 (KdHill Nagib / DozaHill Nagib). Hill nagib je postavljen na -1. Krive su postavljene uklapanjem nelinearnih najmanjih kvadrata sa Levenberg-Marquardt algoritmom.

[00289] Dobijeni rezultati ovih eksperimenata na DIVLJEM TIPU KIT za jedinjenja pripremljena prema primerima sumirani su u Tabeli 7 u nastavku. Za vezivanje divljeg tipa KIT koriste se sledeće oznake: <10.0 nM = A; 10.1 nM i < 15 nM = B; 15.1 nM i < 20 nM = C. Za inhibiciju proliferacije koriste se sledeće oznake: <90.0 nM = A; 90.1 nM i < 150 nM = B; 150.1 nM i < 200 nM = C.

Tabela 7.

2

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje Formule I: njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što: A je

R1je odabran od vodonika i metila; R2je odabran od vodonika i metila; ili R1i R2uzeti zajedno formiraju ciklopropil; R3je odabran od vodonika i metila; R4je odabran od vodonika i metila; ili R3i R4uzeti zajedno formiraju ciklopropil; R5je odabran od vodonika i metila; R6je odabran od vodonika i metila; ili R5i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil; ili jedan od R2ili R4uzeti zajedno sa R6formiraju ciklobutil; R7je vodonik, ili jedan od R2, R4, ili R6uzeti zajedno sa R7formiraju prsten odabran od oksetana, tetrahidrofurana, i tetrahidropirana, pri čemu je pomenut tetrahidrofuran ili tetrahidropiran izborno supstituisan sa hidroksilom; m je 0 ili 1; i n je 0 ili 1. 4 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što: A je:

R3je odabran od vodonika i metila; R4je odabran od vodonika i metila, ili R3i R4uzeti zajedno formiraju ciklopropil; R5je odabran od vodonika i metila; R6je odabran od vodonika i metila; ili R4i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil; ili R5i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil; i R7je vodonik. poželjno pri čemu: A je:

R3je odabran od vodonika i metila; R4je odabran od vodonika i metila, ili R3i R4uzeti zajedno formiraju ciklopropil; R5je odabran od vodonika i metila; R6je odabran od vodonika i metila; ili R5i R6uzeti zajedno formiraju ciklopropil; i R7je vodonik. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što: A je

w je 1 ili 2; t je 1 ili 2; i s je 0 ili 1. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što je A odabran od: (i)

5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što je A odabran od

poželjno pri čemu je A odabran od

6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što, jedinjenje je:

7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6,

8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što, jedinjenje je:

9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 8

10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih, naznačeno time što, jedinjenje je:

11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 10,

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži: jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. 13. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, njegova farmaceutski prihvatljiva so, i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu kao lek u lečenju bolesti ili stanja kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu je bolest ili stanje odabrano od sistemske mastocitoze, gastrointestinalnih stromalnih tumora, akutne mijeloidne leukemije, melanoma, seminoma, interkranijalnih tumora germinativnih ćelija, medijastinalnog B-ćelijskog limfoma, Ewing-ovog sarkoma, difuznog krupnoćelijskog limfoma B ćelija, disgerminoma, mijelodisplastičnog sindroma, nazalnog NK/T-ćelijskog limfoma, hronične mijelomonocitne leukemije, i karcera mozga. 14. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time da je bolest ili stanje sistemska mastocitoza, poželjno pri čemu je sistemska mastocitoza odabrana od indolentne sistemske mastocitoze i tinjajuće sistemske mastocitoze. 15. Jedinjenje, njegova farmaceutski prihvatljiva so i/ili rastvarač bilo kog od prethodno pomenutih za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time da je bolest ili stanje sistemska mastocitoza, poželjno pri čemu je sistemska mastocitoza odabrana od agresivne sistemske mastocitoze, sistemske mastocitoze sa bolešću ne-mastocitnih ćelija i leukemije mastocita. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5