RS65645B1

RS65645B1 - Postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija od adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija i indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene tim postupkom

Info

Publication number: RS65645B1
Application number: RS20240676A
Authority: RS
Inventors: Sang Yeon Lee; Won Ju Jung; Ho Bin Kim; Min Sun Oh; Kye Ho Lee
Original assignee: Bbhc Co Ltd
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-25
Publication date: 2024-07-31
Also published as: HRP20240827T1; JP2017518772A; PT3156481T; US11186828B2; EP3156481A4; KR20150143203A; US20170114328A1; PL3156481T3; KR101592401B1; ES2978902T3; DK3156481T3; LT3156481T; CN106661545B; SI3156481T1; HUE067104T2; WO2015190636A1; EP3156481B1; JP6596082B2; SMT202400243T1; FI3156481T3

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovo otkrivanje odnosi se na sastav podloge za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija od humanih adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija i postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija prilagođenih pacijentu pomoću nje.

POZADINA

[0002] Matične ćelije se, pre diferencijacije, zajednički nazivaju nediferenciranim ćelijama koje se mogu dobiti iz svakog tkiva. Matične ćelije u nediferenciranom stanju mogu kontinuirano praviti matične ćelije u toku prethodno određenog perioda, dok u odgovarajućim uslovima mogu postati razne ćelije koje sačinjavaju biološko tkivo.

[0003] Matične ćelije se, u velikoj meri, mogu podeliti na embrionalne matične ćelije i matične ćelije odraslih u zavisnosti od potencije i vremena nastajanja. Po drugoj podeli, matične ćelije se mogu deliti na pluripotentne, multipotentne i unipotentne matične ćelije u zavisnosti od potencije matičnih ćelija.

[0004] Matične ćelije odraslih mogu se podeliti na multipotentne ili unipotentne matične ćelije.

Reprezentativne matične ćelije odraslih uključuju mezenhimalne matične ćelije (MSC) i hematopoetske matične ćelije (HSC). MSC-ovi se diferenciraju u hondrocite, osteoblaste, adipocite, miocite i neurone, dok se HSC-ovi diferenciraju u krvna zrnca u krvi uključujući crvena krvna zrnca, bela krvna zrnca, trombocite i slične.

[0005] S druge strane, pluripotentne matične ćelije se nazivaju multifunkcionalnim matičnim ćelijama koje se mogu diferencirati u tri klicina lista koja sačinjavanju živo telo i mogu se diferencirati u sve ćelije ili sva tkiva organa ljudskog tela i obično embrionalne matične ćelije odgovaraju pluripotentnim matičnim ćelijama. Poznato je postoje razna etička pitanja jer se humane embrionalne matične ćelije dobijaju iz embriona koji se mogu pretvoriti u ljudski organizam, ali one imaju odličnu ćelijsku proliferaciju i potenciju u poređenju sa matičnim ćelijama odraslih. Manje etičkih pitanja imaju matične ćelije odraslih budući da se mogu dobijati iz koštane srži, krvi, mozga, kože itd., ali one imaju ograničenu potenciju u poređenju sa embrionalnim matičnim ćelijama.

[0006] Kao alternativa za rešavanje tih problema, pokušalo se sa raznim postupcima za proizvodnju prilagođenih pluripotentnih matičnih ćelija sličnih embrionalnim matičnim ćelijama pomoću reprogramiranja ćelija dobijenih od odrasle osobe. Kao reprezentativni postupci navode se postupak za fuziju sa ES ćelijama, postupak za nuklearni transfer somatskih ćelija, postupak za reprogramiranje genetskim faktorom i slični. Postupak za fuziju sa ES ćelijama ima problem u pogledu stabilnosti ćelija jer indukovane ćelije imaju dodatna dva para gena, dok postupak za nuklearni transfera somatskih ćelija ima problem u pogledu velikog broja potrebnih jajnih ćelija i previše niske efikasnosti. Nadalje, postupak za reprogramiranje genetskim faktorom predstavlja postupak u kom se virus koji sadrži onkogene koristi da bi se umetanjem specifičnog gena indukovalo reprogramiranje i ima problem u pogledu mogućnosti razvoja agensa za ćelijsku terapiju usled visokog rizika od pojave kancera, niske efikasnosti i poteškoća u aspektu postupka.

[0007] Kako bi se uspešno dobila velika količina pluripotentnih matičnih ćelija, kompozicija za uzgajanje je veoma važna u fazi uzgajanja izolovanih adipoznih monocita i stoga su neophodna istraživanja za proizvodnju veće količine pluripotentnih matičnih ćelija pomoću visokoefikasnog postupka za indukovanje.

[0008] U međuvremenu se u nekim slučajevima Ecklonia cava koristila u kompoziciji za lečenje ili prevenciju atopične bolesti (objava korejske patentne prijave br.2009-0043115), kompoziciji farbe za kosu koja služi za oksidaciono farbanje (objava korejske patentne prijave br.2012-0126148) ili za stimulaciju rasta kose proliferacijom DPC-a i/ili inhibicijom dejstva 5α-reduktaze (Kang et al., Int. J. Mol. Sci.2012, 13: 6407-6423), ali se nikada nije koristila za reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije.

[0009] Detalji opisani u gorenavedenoj pozadini su tu samo radi boljeg razumevanja pozadine ovog otkrivanja i samim tim mogu sadržati informacije koje ne čine stanje tehnike već poznato stručnjaku iz ove oblasti u toj državi.

KRATAK SADRŽAJ

[0010] Pronalazači su nastojali da pronađu visokoefikasni postupak za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija radi primene u razvoju agensa za ćelijsku terapiju koji je bezbedan i ima visoku efikasnost proizvodnje. Tako su pronalazači potvrdili da se, nakon dodavanja ekstrakta Ecklonia cava-e kao bezbednog prirodnog ekstrakta u podlogu za uzgajanje ćelija, indukovane pluripotentne matične ćelije mogu proizvoditi pomoću adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija bezbedno i uz visoku efikasnost.

[0011] Prema tome, ovo otkrivanje je nastalo u pokušaju da se obezbedi podloga za reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije, čiji sastav sadrži ekstrakt Ecklonia cava-e.

[0012] Ovo otkrivanje je takođe izvedeno u nastojanju da se obezbedi postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija koji uključuje fazu reprogramiranja adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u podlozi koja sadrži ekstrakt Ecklonia cava-e.

[0013] Stoga se, u jednom aspektu, ovaj pronalazak odnosi na postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata: dodavanje ekstrakta Ecklonia cava-e u količini od 10 do 400 µg/ml u podlogu za uzgajanje ćelija i reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u toj podlozi.

[0014] U drugom se aspektu ovaj pronalazak odnosi na upotrebu podloge čiji sastav sadrži ekstrakt Ecklonia cava-e u količini od 10 do 400 µg/ml za reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije. U jednom se načinu ostvarivanja ekstrakt Ecklonia cava-e uključuje u podlogu odabranu iz grupe koju čine Dulbekova modifikovana Iglova podloga (DMEM), minimalna esencijalna podloga (MEM), Iglova osnovna podloga (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-minimalna esencijalna podloga (α-MEM), Glazgovska minimalna esencijalna podloga (G-MEM), Iskovljeva modifikovana Dulbekova podloga (IMDM), Makojeva 5A podloga, AmnioMax, AminoMax II kompletna podloga i Čangova podloga MesemCult-XF podloga. U drugom se načinu ostvarivanja ekstrakt Ecklonia cava-e ekstrahuje vodom i uključuje sa 20 do 50 µg/ml u zavisnosti od sastava podloge. U daljem načinu ostvarivanja, sastav podloge obuhvata i 0,01 do 10 vol. % prečišćene dejonizovane vode koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O i LiO.

[0015] Ovde su takođe opisane indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene postupkom za proizvodnju.

[0016] Ovde je opisana i kompozicija za terapiju ćelijama prilagođenim pacijentu koja uključuje indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene postupkom za proizvodnju uz izolovanje matičnih ćelija iz adipoznog tkiva pacijenta.

[0017] Drugi predmeti i druge prednosti ovog otkrivanja biće jasniji nakon čitanja detaljnog opisa ovog otkrivanja, patentnih zahteva i nacrta u nastavku.

[0018] Pronalazači su nastojali da pronađu visokoefikasni postupak za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija radi primene u razvoju agensa za ćelijsku terapiju bez etičkih pitanja oko uništavanja embriona, bez rizika od obrazovanja ćelija kancera, bez upotrebe virusa i uz visoku bezbednost i efikasnost proizvodnje. Tako je potvrđeno da se, nakon dodavanja ekstrakta Ecklonia cava-e kao bezbednog prirodnog ekstrakta u podlogu za uzgajanje ćelija, indukovane pluripotentne matične ćelije mogu proizvoditi uz značajno visoku efikasnost.

[0019] Ecklonia cava koja je aktivna supstanca uključena u sastav podloge ovog otkrivanja predstavlja višegodišnju algu iz grupe mrkih algi porodice laminariaceae reda laminariales koja uglavnom živi na južnoj obali, obali ostrva Čedžu i obali ostrva Uleungdo, uglavnom je hrana za abalone, turbane i slične a koristi se kao glavna sirovina za pravljenje algininske kiseline ili kalijumjodida ili za prehrambene proizvode.

[0020] Ekstrakt Ecklonia cava-e uključen u ovo otkrivanje može se ekstrahovati vodom i organskim rastvaračima koji uključuju (a) anhidrovani ili niži alkohol koji sadrži vodu sa 1 atomom do 4 atoma ugljenika (metanol, etanol, propanol, butanol, n-propanol, izo-propanol, n-butanol itd.), (b) smešu rastvarača nižeg alkohola i vode, (c) aceton, (d) etilacetat, (e) hloroform, (f) 1,3-butilen glikol, (g) heksan, (h) dietiletar i slične a poželjno se može ekstrahovati smešom rastvarača metanola ili etanola i vode ili njihovom pojedinačnom primenom. U slučaju ekstrakcije ekstrakta Ecklonia cava-e smešom rastvarača, sadržaj metanola ili etanola može poželjno biti 50 do 80 vol.%.

[0021] Trenutno su u porastu slučajevi u kojima se ekstrakt Ecklonia cava-e prijavljuje za kompozicije za kožu kao što su kozmetički proizvodi (vidi objave korejskih patentnih prijava br.2013-0017159, 2012-0040488 i 2010-0097293 itd.), ali ne postoji slučaj u kom se ekstrakt Ecklonia cava-e razvija za podloge koje služe za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija.

[0022] Pojam „embrionalne matične ćelijeˮ koji se koristi u ovom otkrivanju označava ćelije koje imaju pluripotenciju kao ćelije koje su izolovane i uzgajane iz unutrašnje ćelijske mase blastocista u ranim danima njegovog razvoja nakon oplodnje. Pojam „pluripotentne matične ćelijeˮ koji se koristi u ovom otkrivanju označava pluripotentne matične ćelije koje se mogu diferencirati u tri klicina lista koja sačinjavaju živo telo, to jest, endoderm, mezoderm i ektoderm.

[0023] Pojam „diferencijacijaˮ koji se koristi u ovom otkrivanju znači da se, dok se ćelije dele, proliferuju i rastu, njihove strukture ili funkcije specijalizuju, to jest, menjaju im se oblici ili funkcije kako bi se izvodili zadaci koji se daju ćelijama, tkivima i sličnima u organizmu.

[0024] Pojam „agens za ćelijsku terapijuˮ prema ovom otkrivanju, kao lek koji se koristi za lečenje, dijagnostikovanje i prevenciju pomoću ćelija i tkiva proizvedenih izolovanjem iz čoveka, kulture i posebnom manipulacijom, označava lek koji se koristi za lečenje, dijagnostikovanje i prevenciju kroz niz radnji kao što su proliferacija i skrining homogenih ili heterogenih ćelija radi vraćanja funkcije ćelija ili tkiva, menjanja bioloških karakteristika ćelija drugim postupkom i slično. Agensi za ćelijsku terapiju se uglavnom dele na agense za terapiju somatskim ćelijama i agense za terapiju matičnim ćelijama spram stepena diferencijacije ćelija a ovo se otkrivanje odnosi na agense za terapiju matičnim ćelijama.

[0025] „Mezenhimalne matične ćelijeˮ ovog otkrivanja predstavljaju ćelije izolovane iz embrionalnih matičnih ćelija ili matičnih ćelija odraslih dobijenih od sisara, poželjno adipozne mezenhimalne matične ćelije a poželjnije humane adipozne mezenhimalne matične ćelije. Adipozne matične ćelije mogu se ekstrahovati i dobiti iz adipoznog tkiva ljudskog tela. Ekstrakcija mezenhimalnih matičnih ćelija iz adipoznog tkiva može se izvoditi primenom raznih postupaka, pa se, na primer, radi izolovanja monocita iz adipoznog tkiva, to adipozno tkivo ekstrahuje iz ljudskog tela i ispira Dulbekovim fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (DPBS) dok krv ne prestane da teče, a isprano adipozno tkivo se seče hirurškim sečivom i inkubira na 37°C kako bi se dobio rastvor koji sadrži monocite.

[0026] Pojam „podlogaˮ koji se koristi u ovom otkrivanju označava mešavinu za in vitro uzgajanje ili diferencijaciju ćelija kao što su matične ćelije, koja sadrži elemente neophodne za rast i proliferaciju ćelije uključujući šećere, aminokiseline, razne nutrijente, serume, faktore rasta, minerale i slične.

[0027] Podloga ovog otkrivanja konkretno predstavlja podlogu za uzgajanje mezenhimalnih matičnih ćelija. U tom slučaju, mezenhimalne matične ćelije predstavljaju ćelije izolovane iz embrionalnih matičnih ćelija ili matične ćelije odraslih dobijene od sisara i ćelije sa neograničenom sposobnosti proliferacije i diferencijacije u različite ćelijske oblike (na primer, adipocite, hondrocite, miocite, osteocite itd.). U ovom se otkrivanju koriste i multipotentne mezenhimalne matične ćelije sa imunofenotipima koji imaju pozitivnu reakciju na antitela za CD44, CD73 i CD90, a negativnu reakciju na antitela za CD34 i CD45.

[0028] U tehnici su komercijalizovane razne podloge i mogu se veštački proizvoditi te koristi. Na primer, u komercijalizovane podloge spadaju Dulbekova modifikovana Iglova podloga (DMEM), minimalna esencijalna podloga (MEM), Iglova osnovna podloga (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-minimalna esencijalna podloga (α-MEM), Glazgovska minimalna esencijalna podloga (G-MEM), Iskovljeva modifikovana Dulbekova podloga (IMPM), AmnioMax, AminoMax II kompletna podloga (Gibco, Njujork, SAD) i Čangova podloga MesemCult-XF podloga (STEMCELL Technologies, Vankuver, Kanada) i slične i mogu se koristiti kao osnovna podloga koja je uključena u sastav podloge ovog otkrivanja pored podloge koja se može veštački proizvesti.

[0029] U osnovnu podlogu mogu se dodati komponente seruma (na primer, fetalni goveđi serum (FBS)), antibiotici (na primer, penicilin i streptomicin) koje se obično dodaju i slične. Koncentracija komponente seruma ili komponente antibiotika koja se dodaje u osnovnu podlogu može se modifikovati unutar opsega koji može da postigne efekat ovog otkrivanja a poželjno se može dodati 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina, 50 µg/ml streptomicina i slični.

[0030] Podloga ovog otkrivanja dodatno može uključivati i mešavinu nutrijenata. Ta mešavina nutrijenata je mešavina koja sadrži razne aminokiseline, vitamine, neorganske soli i slične koje se obično koriste u uzgajanju ćelija, a može se koristiti i mešavina nutrijenata proizvedena mešanjem aminokiselina, vitamina, neorganskih soli i sličnih ili proizvedena komercijalno. Komercijalno proizvedena mešavina nutrijenata može, primera radi, uključivati M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 i slične, ali nije ograničena na njih.

[0031] Podloga ovog otkrivanja može dodatno uključivati i energetsku vodu za indukovanje i stabilizovanje pluripotentnih matičnih ćelija. Energetska voda se poželjno dodaje sa 0,01 do 10 vol.% a poželjnije 0,05 do 0,5 vol.%.

[0032] Sastav podloge ovog otkrivanja čini posebna podloga za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija i može se postići dodavanjem ekstrakta Ecklonia cava-e u osnovnu podlogu a može uključivati i ekstrakt Ecklonia cava-e pri koncentraciji od poželjno 10 do 400 µg/ml u odnosu na celokupni sastav podloge.

[0033] Prema drugom aspektu ovog otkrivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija koji uključuje: dodavanje ekstrakta Ecklonia cava-e u količini od 10 do 400 µg/ml u podlogu za uzgajanje ćelija i reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u toj podlozi.

[0034] Prema primernom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja potvrđeno je da se u 8. do 10. danu obrazuju kolonije pluripotentnih matičnih ćelija (vidi FIG.2 i 3) kada se podloga u čiji je sastav uključen ekstrakt Ecklonia cava-e ovog otkrivanja koristila kao eksperimentalna grupa (podloga koja sadrži ekstrakt Ecklonia cava-e i energetsku vodu u DMEM F-12 podlozi), za razliku od slučaja kada se kao kontrolna grupa koristila samo DMEM F-12 podloga.

[0035] Ovde su opisane i indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene postupkom za proizvodnju.

[0036] Indukovane pluripotentne matične ćelije ovog otkrivanja imaju istu potenciju kao embrionalne matične ćelije i skoro su iste kao embrionalne matične ćelije čak i u pogledu oblika ćelija (vidi FIG.2 i 3). Prema primernom načinu ostvarivanja ovog otkrivanja potvrđeno je da se geni i proteini u pluripotentnim matičnim ćelijama indukovanim pomoću ovog otkrivanja eksprimuju kao u embrionalnim matičnim ćelijama (vidi FIG.4 i 5) zahvaljujući ispitivanju da li se specifični geni Oct4 i Sox-2 i protein SSEA-4 eksprimuju u embrionalnim matičnim ćelijama.

[0037] Prema drugom primernom načinu ostvarivanja, nizak je nivo ekspresije specifičnih gena OCT4, SOX2 i Nanog pluripotentnih matičnih ćelija u mezenhimalnim matičnim ćelijama (MSC) bez indukovanja, dok se ti specifični geni značajno više eksprimuju u pluripotentnim matičnim ćelijama indukovanim postupkom ovog otkrivanja (eksperimentalni primer 1-1: EtOH EPN, eksperimentalni primer 1-2: sonični EPN) (vidi FIG.6 i 7).

[0038] Ovde je opisana i kompozicija za ćelijsku terapiju koja sadrži indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene pomoću postupka za proizvodnju.

[0039] Kompozicija se može davati bilo kojim načinom davanja, određenije postupkom kao što je davanje u peritonealnu ili torakalnu šupljinu, potkožno davanje, intravensko ili endovaskularno davanje, intramuskularno davanje, lokalno davanje injekcijom ili slično.

[0040] Kompozicija se može davati u obliku kao što su injekcije, suspenzije i emulzije u skladu sa opštim postupkom i po potrebi se može suspendovati u adjuvansu kao što je kompletni Frojndov adjuvans ili davati zajedno sa materijalom koji ima dejstvo adjuvansa kao što je BCG. Kompozicija se može sterilisati ili sadržati adjuvanse koji uključuju stabilizatore, akceleratore kvašenja ili emulgovanja, soli ili pufere za podešavanje osmotskog pritiska i slične kao i druge terapijski dostupne materijale.

[0041] Ovde opisana kompozicija za ćelijsku terapiju može se primenjivati za artritis, neurološke poremećaje, endokrine poremećaje, bolesti jetre i slične te ima mogućnost za alogeni terapijski agens za ljudsko biće u skladu sa rezultatima kasnijeg kliničkog ispitivanja za ljudska bića.

[0042] Karakteristike i prednosti ovog otkrivanja su sledeće.

(i) Ovo otkrivanje obezbeđuje podlogu za reprogramiranje indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija čiji sastav sadrži ekstrakt Ecklonia cava-e. Jedan aspekt ovog pronalaska je upotreba podloge čiji sastav sadrži ekstrakt Ecklonia cava-e u količini od 10 do 400 µg/ml za reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije.

(ii) Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija pomoću kompozicije podloge. Drugi aspekt ovog pronalaska je postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata: dodavanje

ekstrakta Ecklonia cava-e u količini od 10 do 400 µg/ml u podlogu za uzgajanje ćelija i reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u toj podlozi.

(iii) Indukovane pluripotentne matične ćelije efikasno se mogu proizvoditi pomoću adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija uz upotrebu kompozicije podloge prema ovom otkrivanju a proizvedene pluripotentne matične ćelije mogu se diferencirati u razne ćelije kako bi bile korisne kao agens za ćelijsku terapiju.

(iv) U ovom se otkrivanju proizvode pluripotentne matične ćelije sa istom potencijom kao embrionalne matične ćelije pa se samim tim mogu proizvoditi bezbedne pluripotentne matične ćelije bez etičkih pitanja oko uništavanja embriona, bez korišćenja embrionalnih matičnih ćelija i bez rizika od obrazovanja ćelija kancera, bez upotrebe virusa koji može izazvati kancer.

(v) Pluripotentne matične ćelije se takođe mogu proizvoditi veoma lako i uz značajno visoku efikasnost u poređenju sa postojećim postupkom pomoću prirodnog ekstrakta i očekuje se da će se upotrebom mezenhimalnih matičnih ćelija izolovanih iz adipocita pacijenta ubrzati primena agensa za terapiju matičnim ćelijama koje su prilagođene pacijentu. Smatra se da će ovo otkrivanje u velikoj meri doprineti lečenju raznih upornih bolesti kao što su neurološke bolesti i imunološke bolesti.

[0043] Pored goreopisanih ilustrativnih aspekata, načina ostvarivanja i karakteristika, dalji aspekti, načini ostvarivanja i dalje karakteristike biće jasniji uz pozivanje na nacrt i sledeći detaljni opis.

KRATAK OPIS NACRTA

[0044]

FIG.1 je dijagram koji prikazuje da se ubrizgavanjem i uzgajanjem podloge sa ekstraktom Ecklonia cava-e u adipoznim mezenhimalnim matičnim ćelijama indukuju pluripotentne matične ćelije suštinski iste kao embrionalne matične ćelije.

FIG.2 prikazuje obrazovanje kolonija pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih u skladu sa koncentracijom ekstrakta Ecklonia cava-e (ekstrahovanog etanolom) pomoću postupka (primer 1-1) ovog otkrivanja.

FIG.3 prikazuje obrazovanje kolonija pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih u skladu sa koncentracijom ekstrakta Ecklonia cava-e (ekstrahovanog vodom) pomoću postupka (primer 1-2) ovog otkrivanja.

FIG.4, pomoću ekspresije specifičnog proteina, potvrđuje da pluripotentne matične ćelije indukovane postupkom (eksperimentalni primer 1-1) ovog otkrivanja predstavljaju pluripotentne matične ćelije.

FIG.5, pomoću ekspresije specifičnog proteina, potvrđuje da pluripotentne matične ćelije indukovane postupkom (eksperimentalni primer 1-2) ovog otkrivanja predstavljaju pluripotentne matične ćelije.

FIG.6 pomoću grafika prikazuje ekspresiju gena pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih postupkom (eksperimentalni primer 1-1) ovog otkrivanja.

FIG.7 pomoću grafika prikazuje ekspresiju gena pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih postupkom (eksperimentalni primer 1-2) ovog otkrivanja.

EKSPERIMENTALNI DEO

[0045] U sledećem se odeljku poziva na pridruženi nacrt, koji čini deo ove specifikacije. Načini ostvarivanja opisani u njemu dalje ilustruju ovaj pronalazak.

[0046] Sledeći primerni načini ostvarivanja opisani su kako bi se stručnjacima iz ove oblasti omogućilo ostvarivanje i izvođenje ovog otkrivanja.

Primeri

Primer 1: Priprema ekstrakta Ecklonia cava-e

Primer 1-1: Priprema ekstrakta Ecklonia cava-e pomoću etanolskog rastvarača

[0047] Uzorci biljnog leka korišćeni u eksperimentu kupljeni su na ostrvu Čedžu, tačno procenjeni od strane stručnjaka i upotrebljeni u eksperimentu. U 1 L 70% etanola dodato je 100 g osušenog uzorka biljnog leka, ekstrahovano etanolom pod refluksom 16 sati i filtrirano pomoću filtera. Filtrat je koncentrovan u rotacionom dekompresionom isparivaču i odmah liofilizovan.

Primer 1-2: Priprema ekstrakta Ecklonia cava-e pomoću vode

[0048] Uzorci biljnog leka korišćeni u eksperimentu kupljeni su na ostrvu Čedžu, tačno procenjeni od strane stručnjaka i upotrebljeni u eksperimentu. U 1 L vode dodato je 100 g osušenog uzorka biljnog leka, ekstrahovano vodom 16 sati uz upotrebu ultrazvučnog ekstraktora i filtrirano pomoću filtera. Filtrat je koncentrovan u rotacionom dekompresionom isparivaču i odmah liofilizovan.

Primer 2: Izolacija i inkubacija mezenhimalnih matičnih ćelija iz humanog adipoznog tkiva

Primer 2-1: Ekstrakcija humanog adipoznog tkiva

[0049] Adipozno tkivo je sakupljeno odmah nakon liposukcije. Pre prenošenja uzorka u laboratoriju, sakupljeno je adipozno tkivo usisano u sterilnu staklenu bocu od 500 ml. Zatim je sterilna staklena boca zaptivena i preneta u laboratoriju. U laboratoriji su mezenhimalne matične ćelije ekstrahovane u protočnom digestoru klase 100 u sterilnim uslovima. Uzorak je prvo prebačen u sterilnu posudu od nerđajućeg čelika. Uzorak je nekoliko puta ispran PBS-om pa je zatim uzorak adipoznog tkiva isečen na dužinu od 2 cm i prebačen u epruvetu od 50 ml te u njoj dodatno ispran i tretiran 70% etanolom radi dezinfekcije i potom je nekoliko puta ispran PBS-om dopunjenim mešavinom antibiotika (50 IU/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina (kupljeni od Invitrogena)) dok rastvor nije bio očišćen.

Primer 2-2: Izolovanje i inkubacija mezenhimalnih matičnih ćelija iz humanog adipoznog tkiva

[0050] Izolovano adipozno tkivo isprano je PBS-om i sitno isečeno, protreseno jednom u 10 min na 37°C uz upotrebu DMEM podloge dopunjene kolagenazom tipa 1 (1 mg/ml) i digestirano 1 h. Potom je adipozno tkivo isprano PBS-om i centrifugirano 5 min na 1000 o/min. Supernatant je usisan, dok je pelet koji je ostao na dnu ispran PBS-om i centrifugiran 5 min na 1000 o/min. Filtriran je pomoću filtera sa veličinom oka od 100 µm i ispran PBS-om nakon uklanjanja ostataka.

[0051] Kako bi se mezenhimalne matične ćelije izolovale/inkubirale, eksplantirano tkivo je uronjeno u 5 ml Dulbekove modifikovane Iglove podloge (DMEM) F-12 (Gibco) dopunjene sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Hyclone), 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina i održavano na 37°C u inkubatoru ćelija sa azotom na 95% i ugljendioksidom na 5%, pa su sve ćelije osim matičnih ćelija

1

bile ubijene, uz održavanje stanja hipoksije kako bi se povećala čistoća mezenhimalnih matičnih ćelija. Podloga je menjana svaka 3 ili 4 dana. Prerastanje ćelija je praćeno optičkim mikroskopom. Prerasle ćelije su tretirane tripsinom (0,125% tripsina/0,05% EDTA-e) radi dodatnog širenja i hlađenja (pomoću DMEM-a/10% FBS-a).

[0052] Za ekstrakciju mezenhimalnih matičnih ćelija, peleti ćelija su ponovno suspendovani i izbrojani u podlozi DMEM F-12 (Gibco), 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina te inokulisani u posudi za uzgajanje tkiva od 10 cm pri gustini od 1 × 10<6>ćelija/posuda. Podloga je menjana svaka 3 ili 4 dana. Rast i formiranje kolonija ćelija praćeni su optičkim mikroskopom. U približno 90% broja ćelija (konfluencije), ćelije su supkultivisane kao što je prethodno opisano.

Eksperimentalni primer 1: Indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija od adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija

Eksperimentalni primer 1-1: Proizvodnja pluripotentnih matičnih ćelija od humanih adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u skladu sa koncentracijom ekstrakta Ecklonia cava-e u primeru 1-1

[0053] Kao eksperiment za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija od humanih adipoznih matičnih ćelija u skladu sa koncentracijom ekstrakta Ecklonia cava-e sa Čedžua, u kontrolnoj grupi su korišćene DMEM F-12 (Gibco) kao određena podloga za MSC, 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina kao osnovna podloga, dok su u eksperimentalnoj grupi korišćene humane adipozne mezenhimalne matične ćelije koje su podvrgnute trima supkultivisanjima a u podlogu su dodati ekstrakt Ecklonia cava-e sa Čedžua koji ima sledeće koncentracije: normalnu, 1 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 400 µg/ml, 800 µ/ml i 1 mg/ml te 0,1 vol.% energetske vode (prečišćene dejonizovane vode koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O i LiO, STC nara) (vidi FIG.1). Humane adipozne mezenhimalne matične ćelije izolovane su i isprane a monociti su inokulisani u pločici (posudi) sa 6 bazenčića sa 1 × 10<4>ćelija te održavane i inkubirane na 37°C i 5% CO2.

[0054] Tako je, u eksperimentalnoj grupi, primećeno da su kolonije obrazovale nakon 10 dana (vidi FIG.

2) samo kada je koncentracija ekstrakta Ecklonia cava-e sa Čedžua iznosila od 100 do 400 µg/m i u tom je slučaju uvećanje mikroskopa bilo na uvećanju od 200 x.

Eksperimentalni primer 1-2: Proizvodnja pluripotentnih matičnih ćelija od humanih adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u skladu sa koncentracijom ekstrakta Ecklonia cava-e u primeru 1-2

[0055] Eksperimentalni primer 1-2 izveden je pomoću istog postupka kao eksperimentalni primer 1-1 i korišćen je ekstrakt Ecklonia cava-e sa Čedžua pripremljen u primeru 1-2. Tako je, u eksperimentalnoj grupi, primećeno da su se kolonije obrazovale nakon 10 dana (vidi FIG.3) samo kada je koncentracija ekstrakta Ecklonia cava-e sa Čedžua iznosila od 20 do 50 µg/ml i u tom je slučaju uvećanje mikroskopa bilo na uvećanju od 200 x.

Eksperimentalni primer 1-3: Analiza imunohemijskog bojenja pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih pomoću postupka ovog otkrivanja

[0056] Što se tiče pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih pomoću postupaka iz eksperimentalnih primera 1 i 2, analizirano je da li su se u embrionalnim matičnim ćelijama eksprimovali specifični geni OCT4 i SOX2 te protein embrionskog antigena-4 specifičan za određenu fazu (SSEA-4) pomoću njihovih antitela i analizirano je da li je eksprimovan protein pomoću postupka za imunohemijsko bojenje.

[0057] U postupku za bojenje, ćelije su prvo fiksirane pomoću 4% paraformaldehida pa isprane PBS-om i blokirane 1% BSA rastvorom. Ćelije su tretirane primarnim antitelima za OCT4, SOX3 i SSEA-4 te reagovane na 4°C 18 sati pa zatim isprane PBS-om, tretirane sekundarnim antitelima sa fluorescentnim pigmentom (fluoresceinizotiocijanatom, FITC) do primarnih antitela i reagovane na sobnoj temperaturi 1 sat.

[0058] Ćelije su isprane PBS-om, a zatim je analizirana ekspresija pomoću fluorescentnog mikroskopa a njeni rezultati su prikazani na FIG.4 i 5. BF označava svetlo polje, a drugi dijagram označava rezultat bojenja za svaku ekspresiju proteina, dok treći dijagram prikazuje jedro ćelije obojeno DAPI-jem.

[0059] Tako je, i u ekstraktu Ecklonia cava-e ekstrahovanom etanolom (eksperimentalni primer 1-1) i ekstraktu Ecklonia cava-e ekstrahovanom vodom (eksperimentalni primer 1-2), potvrđeno da pluripotentne matične ćelije imaju pozitivnu reakciju samo u koloniji OCT4, SOX2 i SSEA-4 kao markeri specifični za pluripotentne matične ćelije (vidi FIG.4 i 5).

Eksperimentalni primer 1-4: Poređenje analize gena pluripotentnih matičnih ćelija

[0060] Kada su pluripotentne matične ćelije proizvedene u eksperimentalnim primerima 1-1 i 1-2 uočene mikroskopom, pipetom od 200 µl uzeta je samo kolonija pa je zatim ukupna RNK izolovana pomoću TRIzol reagensa (kog proizvodi Invitrogen Corporation). Pomoću reakcije lančane polimeraze kojoj prethodi reverzna transkripcija (RT-PCR) sintetisana je cDNK a PCR je izveden pomoću prajmera specifičnog za OCT4, Sox-2 i Nanog gene i gena gliceraldehid 3-fosfatdehidrogenaze (GAPDH) kao kontrolnog gena. Nanog, OCT4 i Sox-2 su specifični geni u embrionalnim matičnim ćelijama. PCR produkti su analizirani agaroznom gel-elektroforezom a rezultati koji potvrđuju ekspresiju tih gena prikazani su na FIG.6 i 7.

[0061] Tako je, kao što je prikazano na FIG.6 i 7, u mezenhimalnim matičnim ćelijama (MSC, kontrolna

Claims

grupa) bez postupka za indukovanje, nivo ekspresije OCT4, SOX2 i Nanog kao gena specifičnih za pluripotentne matične ćelije nizak, dok su ti specifični geni značajno više eksprimovani u pluripotentnim matičnim ćelijama proizvedenim pomoću pluripotentnih matičnih ćelija (eksperimentalni primer 1-1 (obeležene sa EtOH EPN) i eksperimentalni primer 1-2 (obeležene sa Sonični EPN) indukovanih postupkom ovog otkrivanja. Nivo ekspresije OCT4, SOX2 i Nanog kao gena matičnih ćelija može se jasno potvrditi pomoću grafika sa FIG.6 i 7.

[0062] Podrazumeva se da su u gorenavedenom opisani razni načini ostvarivanja ovog otkrivanja samo ilustracije radi.

Patentni zahtevi

1. Upotreba podloge čiji sastav sadrži ekstrakt Ecklonia cava-e u količini od 10 do 400 µg/ml za reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije.
2. Upotreba prema zahtevu 1, pri čemu se ekstrakt Ecklonia cava-e uključuje u podlogu odabranu iz grupe koju čine Dulbekova modifikovana Iglova podloga (DMEM), minimalna esencijalna podloga (MEM), Iglova osnovna podloga (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-minimalna esencijalna podloga (α-MEM), Glazgovska minimalna esencijalna podloga (G-MEM), Iskovljeva modifikovana Dulbekova podloga (IMDM), Makojeva 5A podloga, AmnioMax, AminoMax II kompletna podloga i Čangova podloga MesemCult-XF podloga.
3. Upotreba prema zahtevu 1, pri čemu se ekstrakt Ecklonia cava-e ekstrahuje vodom i uključuje sa 20 do 50 µg/ml u zavisnosti od sastava podloge.
4. Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu sastav podloge obuhvata i 0,01 do 10 vol. % prečišćene dejonizovane vode koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O i LiO.
5. Postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata: dodavanje ekstrakta Ecklonia cava-e u količini od 10 do 400 µg/ml u podlogu za uzgajanje ćelija i reprogramiranje adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u toj podlozi.